ES2938210T3

ES2938210T3 - Métodos, composiciones y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma

Info

Publication number: ES2938210T3
Application number: ES17743188T
Authority: ES
Inventors: Norzehan Abdul-Manan; David A Newsome; Jacque Zwahlen
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2023-04-05
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: MA45670A; US20220106615A1; US11124805B2; CA3030783A1; AU2021232813B2; AU2017295720A1; AU2021232813A1; EP3484870B1; CN109863143B; EP3484870A1; EP4219462A1; WO2018013840A1; US20190225990A1; JP2019521139A; AU2017295720B2; JP7033583B2; CN109863143A

Abstract

Métodos para editar regiones genómicas objetivo, métodos para reparar una rotura de ADN a través de una vía HDR, métodos para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN a través de una vía NHEJ y métodos para modificar la expresión de un gen o la(s) proteína(s) comprende(n) la administración a una o más células que incluyen una o más regiones genómicas diana, un sistema de edición del genoma y un inhibidor de proteína quinasa de ADN (DNAPK) descrito en el presente documento. Los kits y las composiciones para editar un gen diana comprenden un sistema de edición del genoma y un inhibidor de DNAPK descrito en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos, composiciones y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma

LISTADO DE SECUENCIAS

El contenido del archivo denominado "VPI_16-114WO_ST25.txt", que se creó el 29 de junio de 2017 y tiene un tamaño de 7 KB.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a métodos, composiciones y kits para aumentar la eficiencia de la edición del genoma mediante la administración de un inhibidor de proteína quinasa de ADN (ADNPK) y un sistema de edición del genoma a una célula o células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se necesitan tecnologías precisas de direccionamiento del genoma para permitir la ingeniería sistemática de variaciones genéticas. El uso de sistemas de edición del genoma, específicamente la tecnología de edición del genoma basada en endonucleasas CRISPR, ha crecido exponencialmente en los últimos años. El sistema inmunitario innato bacteriano CRISPR-Cas9 de tipo II se ha convertido en una herramienta eficaz de edición del genoma para la modificación dirigida del genoma humano (Wiedenheft, B. 2012; Hsu, P.D. et al. 2014). Recientemente, se han descrito sistemas de edición del genoma CRISPR-Cpf. La edición del genoma basada en la endonucleasa CRISPR depende, en parte, de las vías de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR) para reparar roturas de cadena doble de ADN. El mecanismo de reparación celular favorece NHEJ sobre HDR.

La WO 2015/058067 describe cocristales de (s)-n-metil-8-(1-((2'-metil-[4,5'-bipirimidin]-6-il)amino)propan-2-il)quinolina-4-carboxamida y derivados deuterados de la misma como inhibidores de ADN-PK.

La US 2013/281431 divulga inhibidores de ADN-PK.

Robert F et al. (Genome Medicine, 2015) analiza la inhibición farmacológica de la estimulación de ADN-PK de la edición del genoma mediada por Cas9

Rongxue Peng et al. (FEBS Journal, 2015) analiza los inconvenientes potenciales de la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9.

Aunque el logro de inserciones o eliminaciones (indeles) de NHEJ tiene hasta un 70% de eficiencia en algunos informes, la eficiencia de HDR sigue siendo un desafío, con tasas de menos del 1%.

Por consiguiente, hay una necesidad de aumentar la eficiencia de edición del genoma, en particular, la eficiencia de HDR.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

En particular, la presente invención proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural O'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^3-5, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 -2}.

Cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H.

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 -2}.

Cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}.

La una o más regiones genómicas objetivo se editan, opcionalmente en donde la eficiencia de la edición de las regiones genómicas objetivo en la una o más células se aumenta en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

La una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

La invención también proporciona un método para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de reparación dirigida por homología (HDR), opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una rotura de cadena doble de ADN (DSB), el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^{i -4}-cicloalquilo C^3-5, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 -2}.

Cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

Cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}.

El sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde la rotura del ADN se repara por lo menos en parte a través de una vía HDR, opcionalmente en donde la eficiencia de la reparación de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía HDR aumenta en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

La invención también proporciona un método para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía NHEJ, opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una DSB de ADN, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^{3 -5}, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^3-5, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 -2}.

Cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

Cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}.

El sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde se inhibe o suprime la rotura del ADN a través de una vía NHE^j, opcionalmente en donde la eficiencia de la inhibición o supresión de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía NHEJ se aumenta en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

La invención también proporciona un método para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, el método incluye administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.

X es N, CR^{A 5}.

Cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}.

El sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo de uno o más genes objetivo, lo que da como resultado la edición de la una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de uno o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociadas con el uno o más genes objetivo, opcionalmente la rotura del a Dn incluye una rotura de cadena doble de ADN (DSB).

La invención también proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de editar una o más regiones genómicas, el método comprendiendo:

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, en donde el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}.

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

R^B3es alquilo C(O)NHC^{1 -4}, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}; y

en donde se editan la una o más regiones genómicas objetivo, opcionalmente en donde la eficiencia de la edición de las regiones genómicas objetivo en la una o más células se aumenta en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; y

en donde las células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

La invención también proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas a través de una vía HDR, opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una DSB de ADN, el método comprendiendo:

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}; y

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde la rotura del ADN se repara por lo menos en parte a través de una vía HDR, opcionalmente en donde la eficiencia de la reparación de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía HDR aumenta en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; y

La invención también proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía NHEJ, opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una DSB de ADN, el método comprendiendo:

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde se inhibe o suprime la rotura del ADN a través de una vía NHEJ, opcionalmente en donde la eficiencia de la inhibición o supresión de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía NHEJ se aumenta en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

La invención también proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, el método comprendiendo:

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

R^B3es alquilo C(O)NHC^{1 -4}, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4};

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo de uno o más genes objetivo, lo que da como resultado la edición de la una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de una o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociados con el gen o genes objetivo, opcionalmente en donde una rotura de ADN comprende una DSB de ADN; y

La invención también proporciona un kit o composición para editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende:

un sistema de edición del genoma; y

un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

RB3 es alquilo C(O)NHCi-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de 2H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC1-2; y cada RB4 es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C1-4.

En algunas realizaciones, el compuesto es un cocristal que incluye un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I) o de Fórmula (I') y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico ácido o ácido benzoico.

En algunas realizaciones, el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (II), la Fórmula Estructural (II'), la Fórmula Estructural (II") o la Fórmula Estructural (II"):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o cocristal del mismo, en donde cada uno de R1 y R2 es independientemente hidrógeno o deuterio.

En algunas realizaciones, el compuesto es un cocristal que incluye un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II") o Fórmula (II'''); y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.

En algunas realizaciones, la eficiencia de editar las regiones genómicas objetivo en una o más células aumenta en comparación con la de una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

En algunas realizaciones, la eficiencia de la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía HDR aumenta en comparación con la de una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

En algunas realizaciones, la eficiencia de inhibir o suprimir la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía NHEJ aumenta en comparación con la de una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

En algunas realizaciones, la eficiencia aumenta por lo menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces en comparación con el de una célula o células por lo demás idénticas pero sin compuesto.

En algunas realizaciones, la eficiencia se mide por la frecuencia de la integración del polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, la eficiencia se mide por la frecuencia de la mutagénesis dirigida. En algunas realizaciones, la mutagénesis dirigida comprende mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones.

En algunas realizaciones, la expresión de uno o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociados con el gen o genes objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión de referencia en una o más células antes de la administración. Por ejemplo, dicha expresión se aumenta en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5-veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión de referencia en una o más células antes de la administración.

En algunas realizaciones, la expresión de un o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociados con el gen o genes objetivo se reduce en comparación con el nivel de expresión de referencia en una o más células antes de la administración. Por ejemplo, la expresión génica se reduce en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% en comparación con el nivel de expresión de referencia en una o más células antes de la administración.

En algunas realizaciones, se elimina sustancialmente la expresión de uno o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociados con el o los genes objetivo en una o más células.

En algunas realizaciones, la célula está sincronizada en la fase del ciclo celular S o G2.

En algunas realizaciones, la una o más células que se administran o se ponen en contacto con dicho compuesto tienen una supervivencia aumentada en comparación con una o más células que no se han administrado o puesto en contacto con dicho compuesto.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en la una o más células simultáneamente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en la una o más células secuencialmente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra en la una o más células antes del compuesto. En algunas realizaciones, el compuesto se administra en una o más células antes del sistema de edición del genoma.

En algunas realizaciones, la una o más células son células cultivadas. En algunas realizaciones, la una o más células son células in vivo dentro de un organismo. En algunas realizaciones, la una o más células son células ex vivo de un organismo.

En algunas realizaciones, el organismo es un mamífero. En algunas realizaciones, el organismo es un humano.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran por la misma vía. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran por una vía diferente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra por vía intravenosa y el compuesto se administra por vía oral.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores de tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en CRISPR. En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía que incluye: (i) un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; (ii) y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN direccionador o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que incluye una proteína Cas o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas.

En algunas realizaciones, el ARN direccionador y el ARN activador se fusionan como una sola molécula. En algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf y el sistema CRISPR-Cpf incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el ARN guía que incluye un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo; y (b) un elemento de proteína Cpf que incluye una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cpf.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra mediante uno o más vectores. En algunas realizaciones, el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc. En algunas realizaciones, los vectores virales se seleccionan de vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra mediante ARN sintético.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra mediante una nanoformulación. En algunas realizaciones, el compuesto es:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, el compuesto es un cocristal que incluye: (a) el Compuesto 1 o el Compuesto 2; y

(b) ácido adípico:

En algunas realizaciones, el compuesto es un cocristal que incluye: (a) el Compuesto (1); y (b) ácido adípico:

en donde la relación molar de ácido adípico al Compuesto (1) es de aproximadamente 2 a 1.

En algunas realizaciones, el compuesto es un cocristal que incluye: (a) el Compuesto (2); y (b) ácido adípico:

em donde la relación molar de ácido adípico a Compuesto (2) es de aproximadamente 2 a 1.

En algunas realizaciones, se proporciona un kit o una composición para editar una o más regiones genómicas objetivo. En algunas realizaciones, el kit o composición incluye un sistema de edición del genoma; y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición está representado por la Fórmula Estructural (II), la Fórmula Estructural (II'), la Fórmula Estructural (II") o la Fórmula Estructural (II"'):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un cocristal del mismo, en donde cada uno de R1 y R2 es hidrógeno o deuterio.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma del kit o composición es un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores de tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR, o un sistema basado en NgAgo. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma del kit o composición es un sistema basado en CRISPR. En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía que incluye: (i) un ARN direccionador que incluye un secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; (ii) y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN direccionador, o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que incluye una proteína Cas o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas.

En algunas realizaciones, la proteína Cas del kit o composición es una proteína Cas9 de tipo II. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 del kit o composición es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cpf, y en donde el sistema CRISPR-Cpf incluye: (a) un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo, o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; y (b) un elemento de proteína Cpf que incluye una proteína Cpf o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cpf.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma del kit o composición se incluye o empaqueta en uno o más vectores. En algunas realizaciones, el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc. En algunas realizaciones, los vectores virales se seleccionan del grupo que consiste en vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex.

En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición es:

0 una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición es un cocristal que incluye un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I) o Fórmula (II) y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.

En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición es un cocristal que incluye: (a) el Compuesto 1 o el Compuesto 2; y (b) ácido adípico:

En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición es un cocristal que incluye: (a) el Compuesto (1); y (b) ácido adípico:

En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición es un cocristal que incluye: (a) el Compuesto (2); y (b) ácido adípico:

en donde la relación molar de ácido adípico al Compuesto (2) es de aproximadamente 2 a 1.

Otras características, objetos y ventajas de la invención son evidentes en la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica realizaciones y aspectos de la invención, se proporciona únicamente a modo de ilustración, no de limitación. A partir de la descripción detallada serán evidentes para los expertos en la técnica varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las FIGS. 1A-1C son una serie de esquemas y secuencias relacionados con el uso de un ensayo de informador de semáforo usado para monitorizar la eficiencia de HDR.

La FIG. 1A representa el diseño de un constructo bicistrónico dirigido al locus AAVS1 humano (SBI).

La FIG. 1B representa la línea celular y la región del polinucleótido objetivo usadas en el ensayo de informador de semáforo para monitorizar la eficiencia de HDR.

La FIG. 1C es un esquema del flujo de trabajo experimental usado en el ensayo de informador de semáforo para monitorizar la eficiencia de HDR.

Las FIGS. 2A-2C son una serie de gráficos que representan que el inhibidor de ADNPK, el Compuesto 1, mejoró la eficiencia de la vía de reparación de HDR en la línea celular HEK293-EGIP según se cuantificó por citometría de flujo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

La FIG. 2A es una serie de gráficos de puntos FACS representativos de HEK293-EGIP después de la nucleofección. Los gráficos de puntos FACS representan las siguientes condiciones: nucleofección de ARNg-Cas9 de doble expresión únicamente, nucleofección de ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de reparación de donante, nucleofección de ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de donante y cultivo con un compuesto 1 inhibidor de ADNPK de molécula pequeña, y nucleofección con ARNg-Cas9 con plantilla de reparación de donante y cultivo de las células con el inhibidor de ligasa IV Scr7 supuesto. Los datos indicaron un aumento en las células positivas para GFP a partir de la transfección del vector de plantilla de reparación del donante y los plásmidos de expresión de ARNg-Cas9 en presencia de los inhibidores de NHEJ, Compuesto 1 y Scr7.

La FIG. 2B es un gráfico de barras que representa la cuantificación de la mejora de HDR después de la transfección del vector de plantilla de reparación del donante y los plásmidos de expresión de ARNg-Cas9 en presencia de los inhibidores de NHEJ, Compuesto 1 y Scr7.

La FIG. 2C es un gráfico de barras que representa los valores de HDR que muestran un aumento de varias veces en la mejora de HDR con respecto a los obtenidos para la transfección con ARNg-Cas9 más plantilla de donante sin compuesto.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra la cuantificación basada en PCR de la eficiencia de HDR en células HEK-293 EGIP nucleofectadas con plantilla de donante y Cas9-ARNsg y en contacto con Scr7 o Compuesto 1.

La FIG. 4 es una serie de diagramas de puntos de citometría de flujo que muestran la eficiencia de HDR según lo indicado por las células GFP+ HEK-EGIP después de la nucleofección de reactivos y condiciones específicas de cultivo celular seleccionados. Los gráficos de puntos de FACS representan las siguientes condiciones: nucleofección de ARNg-Cas9 de expresión dual únicamente, nucleofección de ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de reparación de donante, nucleofección de ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de donante y cultivo con un inhibidor de ADNPK de molécula pequeña, Compuesto 3, y nucleofección con ARNg-Cas9 con plantilla de reparación de donante y cultivo de las células con 10 qM de Scr7, y nucleofección con ARNg-Cas9 con plantilla de reparación de donante y cultivo de las células con 10 qM de Nu7026. Los datos indicaron un aumento de aproximadamente 4 veces en células positivas para GFP de la transfección del vector de plantilla de reparación del donante y plásmidos de expresión de ARNg-Cas9 en presencia de inhibidores de NHEJ, Compuesto 3, en comparación con la condición de ARNg-Cas9 solo.

La FIG. 5 es un gel de un gen SerpinaA1 amplificado que se aisló de células Huh7 que se nucleofectaron con ARNg con o sin plantilla de reparación del donante y proteína Cas9, en el que se usó la plantilla de reparación del donante para introducir un sitio de endonucleasa Kpn. Las células nucleofectadas se cultivaron o en el inhibidor de ADNPK, Compuesto 1, o en presencia de DMSO durante 3 días antes de la PCR de ADN genómico seguido de digestión con Kpn 1. Los datos muestran que el Compuesto 1 permitió la edición de genes en comparación con la condición de DMSO o la condición de plantilla de reparación sin donante de control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos usados en relación con esta divulgación tendrán los significados entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligonucleótidos o polinucleótidos descritas en la presente son bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Se usan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de esta divulgación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal descritas en la presente son bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar se usan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica, y tratamiento de pacientes. En general, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, y el Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed. 1994. Además, los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry," Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y "March’s Advanced Organic Chemistry," 5a Ed., Smith, M.B. y March, J., eds. John Wiley & Sons, Nueva York: 2001. Como se utilizan de acuerdo con esta divulgación, se entenderá que los términos definidos en esta divulgación, a menos que se indique lo contrario, tienen los significados definidos en la presente.

En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona métodos, composiciones y kits para editar una o más regiones genómicas objetivo. Tales métodos, composiciones y kits pueden aumentar la eficiencia de la edición del genoma mediante el uso de un inhibidor de ADNPK, como se reivindica.

Un sistema de edición genómica puede estimular o inducir la rotura o roturas de ADN, como DSB(s) en el locus deseado en el genoma (o región genómica objetivo). La creación de la escisión del ADN provoca que las enzimas celulares reparen el sitio de rotura a través de la vía NHEJ propensa a errores o a través de la vía HDR libre de errores. En NHEJ, la lesión del ADN se repara fusionando los dos extremos de la rotura del ADN en una serie de procesos enzimáticos que implican enzimas del heterodímero Ku70/80 y proteína quinasa dependiente del ADN (ADNPK). El mecanismo de reparación implica el anclaje y la alineación de dos extremos del ADN, la resección, la elongación y el ligamiento (Rouet et al.; Dexheimer T. DNA repair paths and connections. In: Mathews L, Cabarcas S, Hurt E, editores. DNA repair of cancer stem células Dordrecht: Springer, 2013, págs. 19-32) lo que da como resultado la formación de pequeñas mutaciones de inserción o deleción (indeles) en el sitio de rotura. Los indeles introducidos en la secuencia de codificación de un gen pueden provocar mutaciones prematuras en el codón de terminación o cambios en el marco de lectura que llevan a la producción de proteínas truncadas no funcionales. El mecanismo de la vía HDR se comprende menos e implica un conjunto diferente de proteínas de reparación, como Rad51, que estimulan la invasión de cadenas por una plantilla de reparación de donantes para la inserción de bases o el reemplazo de genes. Por lo tanto, HDR permite la introducción de una plantilla de ADN exógena para obtener el resultado deseado de la edición de ADN dentro de un genoma y puede ser una estrategia potente para el modelado de enfermedades traslacionales y la edición genómica terapéutica para restaurar la función del gen.

De las dos vías de reparación del ADN, la NHEJ se produce con una frecuencia mucho más alta y pueden lograrse informes de más del 70% de eficiencia incluso en neuronas (Swiech et al., "Interrogation in vivo of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9," Nat Biotechnol. enero 2015; 33(1):102-62014). Sin embargo, la corrección del gen de HDR se produce a muy baja frecuencia y durante las fases S y G2 cuando se ha completado la replicación del ADN y las cromátidas hermanas están disponibles para servir como plantillas de reparación (Heyer et al., Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics 44:113-139, 2010). Como NHEJ se produce a lo largo del ciclo celular, en competencia y se ve favorecido sobre HDR durante la fase S y G2, la inserción dirigida a través de la vía HDR sigue siendo un desafío y un foco de estudios continuos.

La proteína quinasa de ADN (ADNPK) desempeña un papel en varios procesos de reparación del ADN. ADNPK participa en la reparación de roturas de cadena doble del ADN a través de la activación de la vía de unión de extremos no homóloga (NHEJ). Se cree que NHEJ se desarrolla a través de tres pasos: el reconocimiento de las DSB, el procesamiento del ADN para eliminar los extremos no ligables u otras formas de daño en los extremos terminales y, finalmente, el ligamiento de los extremos del ADN. El reconocimiento del DSB se lleva a cabo uniendo del heterodímero Ku a los extremos del ADN irregulares, seguido del reclutamiento de dos moléculas de la subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (ADNPKcs) a los lados adyacentes de la DSB; esto sirve para proteger los extremos terminales rotos hasta que se recluten enzimas de procesamiento adicionales. Datos recientes respaldan la hipótesis de que ADNPKcs fosforila la enzima de procesamiento, Artemis, así como a sí mismo para preparar los extremos del ADN para un procesamiento adicional. En algunos casos, puede requerirse ADN polimerasa para sintetizar nuevos extremos antes del paso de ligamiento. Se cree que la autofosforilación de ADNPKcs induce un cambio conformacional que abre la cavidad central de unión al ADN, libera ADNPKcs del ADN y facilita el religamiento final de los extremos del ADN.

En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona métodos, composiciones y kits para reparar una rotura o roturas de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de la vía HDR, o inhibir o suprimir la reparación de rotura o roturas de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía NHEJ, en sistemas de edición de genomas, como se reivindica. Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría en particular, se cree que un sistema de edición del genoma administrado a una célula o células interactúa con un ácido nucleico o ácidos nucleicos del gen objetivo, lo que da como resultado o provoca una rotura del ADN; dicha rotura del ADN se repara mediante varias vías de reparación, por ejemplo, HDR, y un inhibidor de DNPK administrado a una célula o células inhibe, bloquea o suprime una vía de reparación de NHEJ, y puede aumentarse o promoverse la frecuencia o eficiencia de la vía de reparación de ADN de HDR.

La interacción entre un sistema de edición del genoma con uno o más ácidos nucleicos del gen objetivo puede ser la hibridación de por lo menos una parte del sistema de edición del genoma con el o los ácidos nucleicos del gen objetivo, o cualquier otro reconocimiento del ácido nucleico o los ácidos nucleicos del gen objetivo por el sistema de edición del genoma. En algunas realizaciones, dicha interacción es una interacción proteína-ADN o hibridación entre pares de bases.

En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células administrando a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica. La edición puede producirse simultáneamente o secuencialmente. La edición de una o más regiones genómicas objetivo incluye cualquier tipo de manipulación o ingeniería genética del genoma de una célula. En algunas realizaciones, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede incluir inserciones, deleciones o reemplazos de regiones genómicas en una célula o células. Las regiones genómicas comprenden el material genético en una célula o células, como ADN, ARN, polinucleótidos y oligonucleótidos. Las regiones genómicas en una célula o células también comprenden los genomas de las mitocondrias o cloroplastos contenidos en una célula o células.

En algunas realizaciones, las inserciones, deleciones o reemplazos pueden estar o en una región genómica codificante o no codificante, en regiones intrónicas o exónicas, o cualquier combinación de las mismas, incluyendo los segmentos superpuestos o no superpuestos de las mismas. Como se usa en la presente, una "región no codificante" se refiere a regiones genómicas que no codifican una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las regiones no codificantes incluyen intrones. Las regiones codificantes se refieren a regiones genómicas que codifican una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las regiones codificantes incluyen exones.

En algunas realizaciones, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede producirse en una cualquiera o más regiones objetivo en un genoma de una célula o células. En algunas realizaciones, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede producirse, por ejemplo, en un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, en una región promotora, una región potenciadora, una región silenciadora, una región aislante, un antirrepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (por ejemplo, poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión del factor de transcripción o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la administración a una célula o células con un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, y un sistema de edición genómica da como resultado una eficiencia de edición del genoma dirigida aumentada en comparación con las condiciones en las que no se administra un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición genómica a una célula o células. En algunas realizaciones, la eficiencia de edición aumentada es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADNPK a una célula o células. La eficiencia de la edición genómica puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante cualquier método que determine la frecuencia de integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de mutagénesis dirigida. Las integraciones de polinucleótidos dirigidos también pueden dar como resultado la alteración o el reemplazo de una secuencia en un genoma, cromosoma o una región de interés en la cromatina celular. Las integraciones de polinucleótidos dirigidos pueden dar lugar a mutaciones dirigidas que incluyen, pero no se limitan a, mutaciones puntuales (es decir, conversión de un solo par de bases en un par de bases diferente), sustituciones (es decir, conversión de una pluralidad de pares de bases en una secuencia diferente de idéntica longitud), inserciones de uno o más pares de bases, deleciones de uno o más pares de bases y cualquier combinación de las alteraciones de secuencia mencionadas anteriormente.

En algunas realizaciones, los métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células implican administrar a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK. En algunas realizaciones, la célula o células se sincronizan en la fase del ciclo celular S o G2. La sincronización de la célula o células en la fase del ciclo celular S o G2 puede lograrse mediante cualquier método conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, los agentes que pueden usarse para sincronizar una célula o células en la fase del ciclo celular S o G2 incluyen afidicolina, droxiurea, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina o cualquier combinación de los mismos. (Ver, Lin et al. al."Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery" Elife. 15 de diciembre de 2014;3). En algunas realizaciones, los agentes para la sincronización celular pueden administrarse en cualquier momento durante el proceso de edición de genes. En algunas realizaciones, una célula o células pueden sincronizarse en la fase S o G2 del ciclo celular antes, durante o después de administrar a una célula o células un sistema de edición del genoma y/o un inhibidor de ADNPK.

En algunas realizaciones, los métodos de edición de una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células administrando a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, dan como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con las condiciones en las que el sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK no se administraron a una célula o células, o en comparación con condiciones en las que solo un sistema de edición de genes se pone en contacto o se administra en una célula o células y no un inhibidor de ADNPK.

En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR. La administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, da como resultado una rotura del ADN de una región específica del genoma, y posteriormente se repara la rotura del ADN, por lo menos en parte, mediante una vía HDR. Estos métodos dan como resultado cantidades aumentadas de reparación mediada por HDR (por ejemplo, vía HDR) en la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una mayor eficiencia de la reparación mediada por HDR en comparación con las condiciones en las que no se administra un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición genómica a una célula o células. En algunas realizaciones, la eficiencia de la reparación mediada por la vía HDR de la rotura del ADN es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula o células un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADNPK. La eficiencia de la reparación mediada por la vía HDR puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, determinando la frecuencia de integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de mutagénesis dirigida.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente permiten reparar la rotura del ADN aumentando la eficiencia de la vía HDR.

La vía HDR puede ser "canónica" o "alternativa". "HDR" (reparación dirigida por homología) se refiere a una forma especializada de reparación del ADN que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de cadena doble o una muesca de ADN en una célula o células. La HDR de roturas de cadena doble generalmente se basa en la homología de la secuencia de nucleótidos, usa una molécula "donante" para la reparación de plantilla de una molécula "objetivo" (por ejemplo, la que experimentó la rotura de la cadena doble) y puede llevar a la transferencia de información genética del donante al objetivo. La HDR canónica de roturas de cadena doble generalmente se basa en BRCA2 y RAD51 y típicamente emplea una molécula donante de ADNdc. La HDR no canónica o "alternativa" es un mecanismo de HDR que es suprimido por BRCA2, RAD51 y/o genes relacionados funcionalmente. La HDR alternativa puede usar una molécula donante de ADNmc o ADNdc mellada. Ver, por ejemplo, la WO 2014172458.

En algunas realizaciones, los métodos para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR administrando a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, dan como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con las condiciones en las que un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK no se administran a una célula o células, o en comparación con condiciones en las que solo se administra un sistema de edición de genes a una célula o células y no un inhibidor de ADNPK.

En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células. En algunas realizaciones, la inhibición o supresión de la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN se realiza inhibiendo o suprimiendo la vía NHEJ. La vía NHEJ puede ser clásica ("canónica") o una vía NHEJ alternativa (alt-NHEJ, o unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)). La vía NHEJ o vla alt-NHEJ se suprime en una célula o células administrando a una célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica.

La vía de reparación de NHEJ clásica es una vía de reparación de roturas de cadena doble de ADN en la que los extremos de la rotura de cadena doble se ligan sin una homología amplia. La reparación de NHEJ clásica usa varios factores, incluyendo el heterodímero KU70/80 (KU), XRCC4, ligasa IV y la subunidad catalítica de proteína cinasa de ADN (ADNPKcs). Alt-NHEJ es otra vía para reparar roturas de cadena doble. Alt-NHEJ usa una secuencia microhomóloga de 5-25 pares de bases durante la alineación de los extremos rotos antes de unir los extremos rotos. Alt-NHEJ es en gran medida independiente del heterodímero KU70/80 (KU), XRCC4, Ligasa IV, subunidad catalítica de proteína quinasa de ADN (ADNPKcs), RAD52 y ERCC1. Ver, Bennardo et al., "Alternative-NHEJ is a Mechanistically Distinct Pathway of Mammalian Chromosome Break Repair", PLOS Genetics, 27 de junio de 2008.

En algunas realizaciones, los métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN a través de la vía NHEJ en una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células inhibiendo o suprimiendo la vía NHEJ mediante la administración a una célula o células de un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, da como resultado una mayor eficiencia en la inhibición o supresión de la reparación de la rotura del ADN mediada por NHEJ en comparación con una célula o células que no han recibido un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADNPK, o en comparación con una condición en la que una célula o células reciben un sistema de edición genómica y no un inhibidor de ADNPK. En algunas realizaciones, la eficiencia aumentada de inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN a través de la vía NHEJ al poner en contacto una célula o células con un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma no son administrado a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula o células un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADNPK. La eficiencia de la inhibición o supresión de la reparación de una rotura de ADN a través de la vía NHEJ puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, determinando la frecuencia de integración de polinucleótidos objetivo o midiendo la frecuencia de mutagénesis dirigida.

En algunas realizaciones, los métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células inhibiendo o suprimiendo la vía NHEJ mediante la administración a una célula o células de una edición genómica y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, dan como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con las condiciones en las que no se puso en contacto o administró un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK a una célula o células, o en comparación con las condiciones en las que solo se puso en contacto o administró un sistema de edición de genes a una célula o células y no un inhibidor de ADNPK.

La rotura del ADN puede ser una rotura de cadena doble (DSB) o dos roturas de cadena sencilla (por ejemplo, dos muescas de ADN). La DSB puede tener un extremo romo o tener un saliente de 5 'o 3', si las cadenas se escinden demasiado, los salientes continuarán apareándose entre sí y existirán como dos muescas, no como una DSB.

En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para modificar la expresión de uno o más genes (un gen o genes objetivo) y/o proteínas correspondientes o en sentido descendente, administrando a una o más células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear, por ejemplo, inserciones, deleciones, reemplazos, modificaciones o interrupciones en una región o regiones genómicas objetivo de un gen o genes objetivo de la célula o células, lo que da como resultado una expresión modificada del gen o genes objetivo. En algunas realizaciones, la inserción, deleción, reemplazo, modificación o interrupción pueden dar como resultado la expresión dirigida de una proteína específica, o grupo de proteínas, o de proteínas en sentido descendente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear inserciones, deleciones o reemplazos en regiones no codificantes o en regiones no codificantes. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear inserciones, deleciones, reemplazos, modificaciones o interrupciones en una región promotora, una región potenciadora y/o cualquier otro elemento regulador de genes, incluyendo un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, una región silenciadora, una región aislante, un antirrepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (por ejemplo, poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión del factor de transcripción o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear las inserciones, deleciones, reemplazos, modificaciones o interrupciones en más de una región objetivo, simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, la administración a una célula o células con un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK puede permitir la expresión génica modificada dirigida en la célula o células. Tal expresión génica modificada dirigida puede llevar a la expresión de proteínas específicas y proteínas en sentido descendente de las mismas.

En algunas realizaciones, la expresión de un gen y/o proteína en sentido descendente aumenta en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula o células un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADNPK.

En algunas realizaciones, la expresión génica de un gen y/o proteína en sentido descendente se reduce en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADNPK a una célula o células.

La célula de los métodos de la presente puede ser cualquier célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula de vertebrado. En algunas realizaciones, la célula de vertebrado es una célula de mamífero. En alguna realización, la célula de vertebrado es una célula humana.

La célula puede ser cualquier tipo de célula. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula diferenciada, una célula madre totipotente no humana, una célula madre pluripotente, una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria no humana, una célula madre adulta, una célula precursora, una célula madre pluripotente inducida o cualquier combinación de las mismas. Una célula diferenciada es una célula especializada que realiza una función específica en un tejido. Una célula madre totipotente es una célula indiferenciada de un embrión, feto o adulto que puede dividirse durante períodos prolongados y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de cualquiera de las tres capas germinales de un organismo. Una célula madre pluripotente es una célula indiferenciada de un embrión, feto o adulto que puede dividirse durante períodos prolongados y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de un organismo, excepto el tejido extraembrionario o la placenta. Una célula madre embrionaria es una célula madre indiferenciada que puede encontrarse en la masa celular interna de un embrión y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de cualquiera de las tres capas germinales. Una célula germinal embrionaria es una célula embrionaria que puede dar lugar a células reproductivas, como espermatozoides u óvulos. Una célula madre adulta es una célula indiferenciada que se encuentra en un tejido diferenciado, es capaz de autorrenovarse y puede diferenciarse en cualquiera de las células del tejido en el que reside. Una célula precursora o progenitora es una célula parcialmente diferenciada que típicamente sólo puede diferenciarse en un tipo de célula (por ejemplo, una célula unipotente). Una célula madre pluripotente inducida es un tipo de célula madre pluripotente que se genera a partir de una célula adulta diferenciada o parcialmente diferenciada. Ver, por ejemplo, la WO/2010/017562.

Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas. Por ejemplo, "una o más células" y "una células o células" se usan indistintamente en la presente. De manera similar, "una o más regiones genómicas objetivo" y "una región o regiones genómicas objetivo" se usan indistintamente en la presente.

Los términos, "aproximadamente" y "alrededor de" se usan indistintamente en la presente. El término "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente del contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).

Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos (ADN) o ribonucleótidos (ARN), o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir del análisis de enlace, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, A^rN ribosómico, ARN interferente corto (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), micro-ARN (ARNmi), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones a la estructura de nucleótidos pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, como mediante conjugación con un componente de marcado. El término "ADNmc" significa una molécula de ADN de cadena sencilla. El término "ODNmc" significa oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla.

El término "nucleótidos de origen natural" al que se hace referencia en la presente incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en la presente incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" al que se hace referencia en la presente incluye enlaces de oligonucleótidos como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleroato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonamidato y similares. Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si se desea.

El término "ARN sintético" se refiere al ARN que está manipulado o que no se produce de manera natural. Como se usa en la presente, el término "tipo salvaje" es un término de la técnica entendido por los expertos y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica tal como se presenta en la naturaleza, a diferencia de las formas mutantes o variantes.

Los términos "de origen no natural" o "manipulado" se usan indistintamente e indican la participación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos, significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido está por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente con el que está asociado de manera natural en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.

"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar enlaces de hidrógeno con otro ácido nucleico mediante Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, apareamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 siendo el 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementarios). "Perfectamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos serán enlaces de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácidos nucleicos. "Sustancialmente complementario" como se usa en la presente se refiere a un grado de complementariedad de por lo menos del 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 100% sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas.

Como se usa en la presente, "expresión" se refiere al proceso mediante el cual se transcribe un polinucleótido a partir de una plantilla de ADN (como en ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el proceso mediante el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas Los transcritos y los polipéptidos codificados pueden denominarse colectivamente "producto génico". Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de marcado. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y los isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.

El término "agente" se usa en la presente para indicar un compuesto químico, una molécula pequeña, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos.

Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente en la presente para referirse a un vertebrado, como un mamífero o un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, murinos, simios, humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas.

Como se usa en la presente, "tratamiento" o "tratar", o "paliar" o "mejorar" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen, pero no se limitan a, un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende cualquier mejora o efecto terapéuticamente relevante en una o más enfermedades, afecciones o síntomas bajo tratamiento. Para beneficio profiláctico, las composiciones pueden administrarse a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad, condición o síntoma particular, o a un sujeto que informa de uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, aunque la enfermedad, condición o síntoma puede que no se haya manifestado todavía. Estos términos también significan el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un humano, incluyendo (a) la inhibir la enfermedad, es decir, detener o impedir su desarrollo; (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado de enfermedad; o (c) curar la enfermedad.

El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de uno o más de: el sujeto y el estado patológico que se está tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad del estado patológico, la forma de administración y similares, que pueden ser determinados fácilmente por alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. El término también se aplica a una dosis que proporcionará una imagen para la detección mediante cualquiera de los métodos de imagenología descritos en la presente. La dosis específica puede variar dependiendo de uno o más de: el agente particular elegido, el régimen de dosificación a seguir, si se administra en combinación con otros compuestos, la cadencia de la administración, el tejido del que se van a obtener imágenes, y el sistema de administración físico en el que se transporta.

Como se usa en la presente, "administrar" se refiere a poner en contacto, inyectar, dispensar, suministrar o aplicar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADNPK a una célula o un sujeto. En algunas realizaciones, la administración es poner en contacto un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADNPK con una célula o células. En algunas realizaciones, la administración es suministrar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADNPK a una célula o células. En algunas realizaciones, la administración es aplicar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADNPK a una célula o células. En algunas realizaciones, la administración es inyectar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADNPK a una célula o células. La administración puede producirse in vivo, ex vivo o in vitro. La administración de un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADNPK a una célula o células puede realizarse simultánea o secuencialmente.

El término "adquirido" en referencia a una condición o enfermedad como se usa en la presente significa un trastorno o condición médica que se desarrolla después del feto; al contrario que un trastorno congénito, que está presente al nacer. Un trastorno congénito puede ser un antecedente de un trastorno adquirido.

Los términos afección o enfermedad "congénita" o "heredada" es un trastorno genético que se encuentra en el genoma de un sujeto que está presente en un sujeto al nacer. El "genoma", como se usa en la presente, incluye todo el material genético en el núcleo y el citoplasma, e incluye además el genoma mitocondrial y el genoma ribosómico. La congénita o hereditaria puede manifestarse en cualquier momento de la vida del sujeto, por ejemplo al nacer o en la edad adulta.

El término "trastorno genético" o "enfermedad genética" incluye mutaciones heredadas o adquiridas en el genoma de un sujeto que provoca o puede provocar una enfermedad.

Los términos "polimorfismos" o "variaciones genéticas" significan diferentes formas de un gen en un locus genético.

Un "vector viral" se define como un virus o partícula viral producido recombinantemente que comprende un polinucleótido para ser administrado en una célula huésped, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores virales del herpes simple y vectores virales quiméricos y similares. En algunas realizaciones en las que la transferencia de genes está mediada por un vector retroviral, un constructo de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma retroviral o parte del mismo.

Algunas realizaciones de la divulgación se refieren a sistemas de vectores que comprenden uno o más vectores, o vectores como tales. Los vectores pueden diseñarse para la expresión de transcritos de CRISPR (por ejemplo, transcritos de ácidos nucleicos, proteínas o enzimas) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los transcritos de CRISPR pueden expresarse en células bacterianas como Escherichia coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero.

Las células pueden ser células primarias, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre embrionarias (hESC), células madre adultas, células progenitoras o líneas celulares. Las "células primarias" son células tomadas directamente de tejido vivo y colocadas in vitro para su crecimiento. Las células primarias tienen pocas duplicaciones de población y tienen una esperanza de vida finita para duplicaciones de población in vitro. Las "células madre", las "células madre embrionarias" y las "células madre pluripotentes inducidas" son células no especializadas e indiferenciadas capaces de autorrenovarse y que tienen el potencial de diferenciarse en células de diferentes tipos con funciones especializadas. Las "líneas celulares" incluyen cultivos celulares que se derivan de un tipo de célula o un conjunto de células del mismo tipo que pueden proliferar indefinidamente. Los ejemplos no limitativos de líneas celulares de mamíferos pueden incluir células CD34, células 293, células HEK, células CHO, células BHK, células CV-1, células Jurkat, células HeLa, o cualquier variante de las mismas.

En algunas realizaciones, un vector es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 y pMT2PC. Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus de simio 40 y otros divulgados en la presente y conocidos en la técnica. Otros promotores pueden incluir, por ejemplo, el promotor EF1 o el promotor alfa EF1. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticas ver, por ejemplo, los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Como se usa en la presente, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de fracciones de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas y pueden usarse. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan as, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc,111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el posible impedimento estérico. El término "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.

Como se usa en la presente, "sustancialmente puro" significa que una especie en cuestión es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie en cuestión comprende por lo menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.

Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más del 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En algunas realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En algunas realizaciones, la especie en cuestión se purifica hasta la homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se detectan en la composición mediante métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

Sistema de edición del genoma

Pueden usarse varios tipos de sistemas de manipulación del genoma. Los términos "sistema de edición del genoma", "sistema de edición de genes" y similares, se usan indistintamente en la presente y se refieren a un sistema o tecnología que edita un gen objetivo o la función o expresión del mismo. Un sistema de edición del genoma comprende: por lo menos un componente de endonucleasa que permite la escisión de una región o regiones genómicas objetivo (o secuencia o secuencias objetivo); y por lo menos un elemento dirigido al genoma que lleva o dirige el componente de endonucleasa a una región o regiones genómicas objetivo. Los ejemplos de elementos de direccionamiento del genoma incluyen un dominio de unión a ADN (por ejemplo, proteína de unión a ADN con dedos de zinc o un dominio de unión a ADN TALE), elementos de guía de ARN (por ejemplo, ARN de guía de CRISPR) y elementos de guía de ADN (por ejemplo, ADN de guía NgAgo). Los elementos programables de endonucleasas y direccionamiento del genoma permiten la edición precisa del genoma introduciendo roturas de ADN, como roturas de cadena doble (DSB) en loci genómicos específicos. Posteriormente, las DSB reclutan maquinaria de reparación endógena para la unión final no homóloga (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR) en el sitio de DSB para mediar en la edición del genoma. El "componente de endonucleasa" comprende una endonucleasa o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dicha endonucleasa.

El término "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima de tipo salvaje, mutante, variante o manipulada capaz de catalizar la hidrólisis (escisión) de un enlace entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN. Las endonucleasas pueden reconocer y escindir una molécula de ADN o ARN en sus regiones genómicas objetivo. Los ejemplos de endonucleasas incluyen una endonucleasa dirigida; enzima de restricción como FokI; una nucleasa de dedos de zinc quimérica (ZFN) resultante de la fusión de dominios de dedos de zinc manipulados con el dominio catalítico de una enzima de restricción como FokI; enzimas cas y enzimas cpf. Las endonucleasas químicas en las que un escisor químico o peptídico se conjuga con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia objetivo específica, dirigiendo de este modo la actividad de escisión a una secuencia específica, están comprendidas en el término "endonucleasa". Los ejemplos de endonucleasas químicas incluyen nucleasas sintéticas como conjugados de ortopenantrolina, una molécula de escisión de ADN, y oligonucleótidos que forman tripletes (TFO).

Por "variante" se entiende una proteína recombinante obtenida mediante el reemplazo de por lo menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la proteína original con un aminoácido diferente.

En algunas realizaciones, las endonucleasas como ZFN, TALEN y/o meganucleasas comprenden un dominio de escisión y/o un semidominio de escisión. El dominio de escisión puede ser homólogo o heterólogo al dominio de unión al ADN. Por ejemplo, pueden usarse un dominio de unión a ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa o un dominio de unión a ADN de meganucleasa y un dominio de escisión de una nucleasa diferente. Los dominios de escisión heterólogos pueden obtenerse a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas ejemplares de las que puede derivarse un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y endonucleasas dirigidas. Ver, por ejemplo, la WO2013/130824. Se conocen enzimas adicionales que escinden el a Dn (por ejemplo, nucleasa S1; nucleasa de frijol mungo; DNasa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura; ver también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Pueden usarse una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.

Un semidominio de escisión puede derivarse de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se ha expuesto anteriormente, que requiere dimerización para la actividad de escisión. En algunas realizaciones, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. En algunas realizaciones, puede usarse una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. En algunas realizaciones, los dos semidominios de escisión pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma). En algunas realizaciones, cada semidominio de escisión puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios objetivo para las dos proteínas de fusión están preferentemente dispuestos, uno con respecto al otro, de tal manera que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios objetivo coloque los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permita que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, por ejemplo, mediante dimerización. Por tanto, en ciertas realizaciones, los bordes cercanos de los sitios objetivo están separados por 5-50 nucleótidos, 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Se observa que cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios objetivo (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En algunas realizaciones, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios objetivo.

Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse al ADN de manera específica de la secuencia (en un sitio de reconocimiento,) y escindir el ADN cerca o en el sitio de unión. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, tipo IIS) escinden el ADN en sitios eliminados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima tipo IIS Fok I cataliza la escisión de cadena doble del ADN. Ver, por ejemplo, las Patente de Estados Unidos N° 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982.

En algunas realizaciones, el componente de endonucleasa comprende una proteína o proteínas de fusión que incluyen un dominio de escisión (o semidominio de escisión) de por lo menos una enzima de restricción de Tipo IIS y uno o más dominios de unión a dedos de zinc, que pueden o no estar manipulados. Una enzima de restricción de Tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. La porción de la enzima Fok I usada en dichas proteínas de fusión se considera un semidominio de escisión. Por tanto, para la escisión dirigida de cadena doble y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones de dedos de zinc o TALE-Fok I, pueden usarse dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un semidominio de escisión FokI, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también puede usarse una única molécula polipeptídica que contiene un dominio de unión de dedos de zinc y dos semidominios de escisión Fok I.

Los enzimas de restricción de tipo IIS ejemplares se describen en la Publicación Internacional WO 07/014275, incorporada en la presente en su totalidad. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos se contemplan en la divulgación. Ver, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

En ciertas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión manipulados (también denominados mutantes de dominio de dimerización) que minimizan o evitan la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 20050064474 y 20060188987 y la WO 2013/130824. Los semidominios de escisión manipulados ejemplares de Fok I que forman heterodímeros obligados incluyen un par en el que un primer semidominio de escisión incluye mutaciones en los residuos de aminoácidos en las posiciones 490 y 538 de Fok I y un segundo semidominio de escisión incluye mutaciones en el aminoácido residuos 486 y 499. Ver, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2008/0131962 y 2011/0201055. Los semidominios de escisión manipulados descritos en la presente pueden prepararse usando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio de semidominios de escisión de tipo salvaje (Fok I) como se describe en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N220050064474 y 20080131962.

El término "editar", "edita", "que edita" y similares se refieren a cualquier tipo de manipulación, alteración, modificación o modulación (en cada caso incluye, pero no se limita a, por medio de la desactivación de genes, el etiquetado de genes, la interrupción de genes, la mutación de genes, la inserción de genes, la deleción de genes, la activación de genes, el silenciamiento de genes o la activación de genes).

Tal como se usa en la presente, "modificación genética", "edición del genoma", "modificación del genoma", "modificación de genes" y "edición de genes" se refieren a cualquier adición, deleción, inactivación, activación, etiquetado, mutación, activación, silenciamiento, modificación y/o alteración de los nucleótidos de una célula. La célula en este contexto puede ser in vitro, in vivo o ex vivo.

Por "región genómica objetivo", "gen objetivo", "objetivo de ADN", "secuencia objetivo de ADN", "secuencia objetivo", "secuencia de nucleótidos objetivo", "sitio objetivo", "objetivo", "sitio de interés", "sitio de reconocimiento", "sitio de reconocimiento de polinucleótidos", "secuencia de reconocimiento", "sitio de escisión" se entiende una secuencia de polinucleótidos que es reconocida y escindida por un sistema de edición del genoma. Estos términos se refieren a una localización distinta del ADN, preferiblemente una localización genómica, en la que el sistema de edición del genoma va a inducir una rotura (escisión) del ADN.

La edición mencionada anteriormente, incluyendo la manipulación, la alteración, la modificación y la modulación, puede producirse simultánea o secuencialmente. Puede usarse cualquier sistema de edición del genoma conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema basado en nucleasas basado en efector de tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo.

Los basados en meganucleasas, basados en ZFN y basados en TALEN comprenden cada uno por lo menos un dominio de unión al ADN o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifica el dominio de unión al ADN, y logran el direccionamiento o el reconocimiento específicos de una región o regiones genómicas objetivo a través de interacciones proteína-ADN. Un sistema basado en CRISPR comprende por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican el elemento de ARN guía, y logra el direccionamiento o el reconocimiento específicos de una región o regiones genómicas objetivo a través de pares de bases directamente con el ADN de la región o regiones genómicas objetivo. Un sistema basado en NgAgo comprende por lo menos un elemento de ADN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican el elemento guía de ADN, y logra el direccionamiento o reconocimiento específicos de una región o regiones genómicas objetivo a través de pares de bases directamente con el ADN de la región o regiones genómicas objetivo.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasas. Un sistema basado en meganucleasas emplea meganucleasas, que son endonucleasas con sitios de reconocimiento grandes (>14 pb), y sus dominios de unión al ADN también son responsables de la escisión de las secuencias objetivo. El dominio de unión al ADN de las meganucleasas puede tener una secuencia objetivo de ADN de cadena doble de 12 a 45 pb. En algunas realizaciones, la meganucleasa es o una enzima dimérica, en donde cada dominio de meganucleasa está en un monómero, o una enzima monomérica que comprende los dos dominios en un solo polipéptido. No solo se han generado meganucleasas de tipo salvaje sino también varias variantes de meganucleasas mediante manipulación de proteínas para cubrir una miríada de combinaciones de secuencias únicas. En algunas realizaciones, También pueden usarse meganucleasas quiméricas con un sitio de reconocimiento compuesto por un medio-sitio de meganucleasa A y un medio-sitio de proteína B. Ejemplos específicos de tales meganucleasas quiméricas comprenden los dominios proteicos de I-Dmol e I-Crel. Los ejemplos de meganucleasas incluyen endonucleasas dirigidas de la familia LAGLIDADG. La meganucleasa LAGLIDADG puede ser I-SceI, I-ChuI, I-CreI, I-CsmI, PI-SceI, PI-TliI, PI-MtuI, I-CeuI, I-SceII, I-SceIII, HO, PI-CivI, PI-CtrI, PI-AaeI, PI-BsuI, PIDhaI, PI-DraI, PI-MavI, PI-MchI, PI-MfuI, PI-MflI, PI-MgaI, PI-MgoI, PI-MinI, PI-MkaI, PI-MleI, PI-MmaI, PI-MshI, PIMsmI, PI-MthI, PI-MtuI, PI-MxeI, PI-NpuI, PI-PfuI, PI-RmaI, PI-SpbI, PI-SspI, PI-FacI, PI-MjaI, PI-PhoI, PI-TagI, PI-ThyI, PI-TkoI, PI-TspI, o I-MsoI; o puede ser un mutante funcional o una variante de la misma, ya sea homodimérica, heterodimérica o monomérica. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG es un derivado de I-CreI. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG comparte por lo menos un 80% de similitud con la meganucleasa LAGLIDADG I-CreI natural. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG comparte por lo menos un 80% de similitud con los residuos 1-152 de la meganucleasa LAGLIDADG I-CreI natural. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG puede consistir en dos monómeros que comparten por lo menos un 80% de similitud con los residuos 1-152 de la meganucleasa LAGLIDADG I-CreI natural unidos entre sí, con o sin un péptido conector.

La "meganucleasa LAGLIDADG" se refiere a una endonucleasa dirigida de la familia LAGLIDADG, como se define en Stoddard et al (Stoddard, 2005), o una variante manipulada que comprende un polipéptido que comparte por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más de identidad o similitud con dicha endonucleasa dirigida natural. Tales meganucleasas LAGLIDADG manipuladas pueden derivar de meganucleasas monoméricas o diméricas. Cuando se derivan de meganucleasas diméricas, tales meganucleasas LAGLIDADG manipuladas pueden ser endonucleasas de cadena sencilla o diméricas.

Por "I-CreI" se entiende la meganucleasa I-CreI de tipo salvaje natural que tiene la secuencia del código de registro de pdb 1g9y.

Las funciones de reconocimiento y escisión del ADN de las meganucleasas generalmente están entrelazadas en un solo dominio. A diferencia de las meganucleasas, los dominios de unión al ADN de los sistemas basados en ZFN y TALEN son distintos de la endonucleasa para la función de escisión. El sistema basado en ZFN comprende: por lo menos una proteína con dedos de zinc o una variante de la misma, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína más fina de zinc o una variante de la misma como su dominio de unión al ADN; y un elemento de endonucleasa, como nucleasa con dedos de zinc (ZFN) o dominio de escisión Fok1. La proteína de dedos de zinc (ZFP) no se produce de manera natural, ya que está manipulada para unirse a un sitio objetivo de elección. Ver, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.

20: 135-141 ; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan ei al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct Biol. 10:411-416; Patentes de Estados Unidos N2. 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; y Publicaciones de Patente de Estados Unidos N2 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

Un dominio de unión de dedo de zinc manipulado puede tener una especificidad de unión novedosa, en comparación con una proteína de dedo de zinc de origen natural. Los métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos con dedos de zinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos de triplete o cuádruple está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia de triplete o cuadruplete particular. Ver, por ejemplo, las Patente de Estados Unidos de titularidad compartida N° 6.453.242 y 6.534.261.

Pueden usar varios tipos de métodos de selección con los métodos de la presente. Los métodos de selección ejemplares, que incluyen la presentación en fagos y los sistemas de dos híbridos, se divulgan en las Patentes de Estados Unidos N25.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en las WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, en la WO 02/077227 se ha descrito, por ejemplo, la potenciación de la especificidad de unión para los dominios de unión a dedos de zinc. Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas con dedos de zinc de múltiples dedos pueden enlazarse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver, también, las Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. La selección de sitios objetivo; las ZFP y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y los polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen con detalle en las Patentes de Estados Unidos N° 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311 ; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas con dedos de zinc de múltiples dedos pueden enlazarse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver, también, las Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

Un sistema de nucleasas basado en efector de tipo activador de transcripción (TALEN) se refiere a un sistema de edición del genoma que emplea uno o más dominios de unión de ADN de efector de tipo activador de transcripción (TALE) y un elemento de endonucleasas, como el dominio de escisión Fok1. El dominio de unión ADN-TALE comprende una o más unidades de repetición TALE, cada una de las cuales tiene 30-38 (como 31,32, 33, 34, 35 o 36) aminoácidos de longitud. El dominio de unión a ADN-TALE puede emplear una proteína TALE de longitud completa o un fragmento de la misma, o una variante de la misma. El dominio de unión a ADN-TALE puede fusionarse o unirse al dominio de la endonucleasa mediante un conector.

Los términos "sistema basado en CRISPR", "sistema de edición de genes basado en CRISPR", "edición de genoma CRISPR", "edición de genes CRISPR", "edición de genoma basada en endonucleasa CRISPR" y similares se usan indistintamente en la presente, y se refieren colectivamente a un sistema de edición del genoma que comprende uno o más elementos de ARN guía; y uno o más elementos de endonucleasas guiadas por ARN. El elemento de ARN guía comprende un ARN direccionador que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador. El elemento de endonucleasa guiada por ARN comprende una endonucleasa que es guiada o llevada a una región o regiones genómicas objetivo por un elemento de ARN guía; o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dicha endonucleasa. Los ejemplos de tales sistemas de edición de genes basados en CRISPR incluyen el sistema basado en CRISPR que es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.

Como se usa en la presente, los términos "elemento de ARN guía", "ARN guía", "ARNg", "molécula de ARNg" y "ARN guía sintético" se usan indistintamente y se refieren a la secuencia de polinucleótidos que comprende un ARN direccionador que hibrida con una secuencia nucleica objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador. Un ARN direccionador de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos en una región genómica objetivo. La frase "sustancialmente complementario" significa un grado de complementariedad de por lo menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 99% o 100% en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que hibridan en condiciones estrictas.

Un elemento de ARN guía puede comprender además un ARN activador que es capaz de hibridar con el ARN direccionador, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador. El ARN activador y el ARN direccionador pueden estar separados o fusionados como un único ácido nucleico a través de una secuencia de giro conector para formar una única molécula de ARNg. Una molécula de ARNg puede comprender una serie de dominios. Por ejemplo, dicho ARNg comprende, por ejemplo, de 5' a 3': un dominio de direccionamiento (que es complementario a un ácido nucleico objetivo); un primer dominio de complementariedad; un dominio de enlace; un segundo dominio de complementariedad (que es complementario al primer dominio de complementariedad); un dominio proximal; y opcionalmente, un dominio de cola. Ver la WO2015048557.

Un "primer dominio de complementariedad" tiene una complementariedad sustancial con el segundo dominio de complementariedad y puede formar una región duplicada en por lo menos algunas condiciones fisiológicas.

Un "dominio de enlace" sirve para enlazar el primer dominio de complementariedad con el segundo dominio de complementariedad de un ARNg unimolecular. El dominio de enlace puede enlazar el primer y el segundo dominios de complementariedad covalentemente o no covalentemente.

Un "dominio proximal" puede tener 3-25 nucleótidos de longitud o 5-20 nucleótidos de longitud. El dominio proximal puede compartir homología o derivarse de un dominio proximal de origen natural.

Un "dominio de cola" puede estar ausente o tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud. El dominio de cola puede incluir secuencias que son complementarias entre sí y que, en por lo menos en algunas condiciones fisiológicas, forman una región duplicada.

El elemento de ARN guía puede formar un complejo con una endonucleasa del elemento de endonucleasas guiadas por ARN, como la endonucleasa Cas ("complejo de ARNg/nucleasa"). Un ejemplo de complejo ARNg/nucleasa es un complejo CRISPR como se describe a continuación con respecto a un sistema basado en CRISPR. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una endonucleasa de un sistema de endonucleasas guiadas por ARN que forma un complejo con el ARN direccionador. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una endonucleasa de un sistema de endonucleasas guiadas por ARN que forma un complejo con el ARN direccionador y el ARN activador.

El dominio de direccionamiento del ARN direccionador promueve el direccionamiento u orientación específicos de un complejo de ARNg/nucleasa a una secuencia de nucleótidos objetivo. En algunas realizaciones, el dominio de direccionamiento puede tener 10-30 pb, como 15-25 pb, 18-22 pb o 20 pb.

Los métodos para diseñar ARNg son conocidos en la técnica, incluyendo los métodos para seleccionar, diseñar y validar el dominio objetivo. Ver, por ejemplo, WO2015048577, Mali et al., 2013 SCIENCE 339(6121): 823 826; Hsu et al., 2013 NATBIOTECHNOL, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 NATBTOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 NAT METHODS 11 (2): 122-3. doi: l 0.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 BIOTNFORMATICS PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 BIOINFORMATICS Pub Med PMID: 24389662.

En algunas realizaciones, pueden usarse endonucleasas guiadas por ARN, como una enzima o proteína Cas (por ejemplo, proteína Cas9 de tipo II) o una enzima o proteína Cpf (por ejemplo, proteína Cpfl). En algunas realizaciones, también puede usarse una versión modificada de tal enzima o proteína Cas o Cpf.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas. El sistema CRISPR-Cas comprende: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el elemento de ARN guía comprendiendo un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo, y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN objetivo; y (b) un elemento de proteína Cas que comprende una proteína Cas o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas. El ARN direccionador y los ARN activadores pueden separarse o fusionarse en un único ARN.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR incluye sistemas CRISPR de Clase 1 y/o CRISPR de Clase 2. Los sistemas de Clase 1 emplean varias proteínas Cas junto con un ARN CRISPR (ARNcr) como ARN direccionador para construir una endonucleasa funcional. Los sistemas CRISPR de Clase 2 emplean una sola proteína Cas y un ARNcr como ARN direccionador. Los sistemas CRISPR de Clase 2, incluyendo el sistema basado en Cas9 de tipo II, comprenden una única proteína Cas para mediar en la escisión en lugar del complejo de múltiples subunidades empleado por los sistemas de Clase 1. El sistema basado en CRISPR también incluye un sistema CRISPR de Clase II, Tipo V que emplea una proteína Cpfl y un ARNcr como ARN direccionador.

La proteína Cas es una nucleasa de cadena doble asociada a CRISPR (Cas). En algunas realizaciones, el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 es SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A nickasa. El término "proteína Cas", como proteína Cas9, incluye proteína Cas de tipo salvaje o derivados funcionales de la misma (como versiones truncadas o variantes de la proteína Cas de tipo salvaje con una actividad de nucleasas).

En algunas realizaciones, pueden usarse proteínas Cas9 de especies distintas de S. pyogenes y S. thermophiles. Las especies de proteína Cas9 adicionales que pueden obtenerse y usarse en la presente incluyen: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp.,cycliphilus denitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus; Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus Puni ceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfingens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium dolichum, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, gamma proteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemoplzilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicohacter cinaedi, Helicobacter mustelae, llyobacter polytropus, Kingella kingae, lactobacillus crispatus, listeria ivanovii, listeria monocytogenes, listeríaceae bacterium, Methylocystis sp.,Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutells, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonaspalustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., o Verminephrobacter eiseniae.

En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema basado en CRISPR se derivan de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III.

En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema basado en CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, como Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Prevotella sp., Acidaminococcussp., y Lachnospiraceae sp. En general, un sistema basado en CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en las regiones genómicas objetivo o en el sitio de una secuencia objetivo (también denominado protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la cual se diseña una secuencia guía para que tenga una complementariedad sustancial, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente la complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia objetivo se localiza en el núcleo o citoplasma de una célula o células. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo puede estar dentro de un orgánulo de una o más células eucariotas, por ejemplo, una mitocondria o un cloroplasto.

A una secuencia o plantilla que puede usarse para la recombinación en el locus objetivo que comprende las secuencias objetivo se hace referencia como "plantilla de edición" o "polinucleótido de edición" o "secuencia de edición". A un polinucleótido plantilla exógeno puede hacerse referencia como plantilla de edición o plantilla donante. En algunas realizaciones, la recombinación es una recombinación homóloga.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas9. El ARN direccionador del sistema CRISPR-Cas9 comprende un ARN de direccionamiento de CRISPR (ARNcr) y el ARN activador del sistema CRISPR-Cas 9 comprende un ARN de CRISPR transactivador (ARNtrac). El elemento de proteína Cas del sistema CRISPR-Cas9 emplea una proteína Cas9. El ARNcr y el ARNtracr pueden separarse o combinarse en un solo constructo de ARN a través de una secuencia de giro conector. Este constructo de ARN combinado se denomina ARN de guía única (ARNsg; o ARN guía).

Con respecto a la información general sobre los sistemas CRISPR-Cas, los componentes de los mismos y la administración de dichos componentes, incluyendo los métodos, materiales, vehículos de administración, vectores, partículas, AAV, y elaboración y uso de los mismos, incluyendo las cantidades y formulaciones, puede encontrarse en: Patentes de Estados Unidos N° 8,999,641, 8,993,233, 8,945,839, 8,932,814, 8,906,616, 8,895,308, 8,889,418, 8,889,356, 8,871,445, 8,865,406, 8,795,965, 8,771,945 y 8,697,359; Publicaciones de Patente de Estados Unidos US 2014-0310830, US 2014-0287938 A1, US 2014-0273234 A1, US2014-0273232 A1, US 2014 0273231, US 2014-0256046 A1, US 2014-0248702 A1, US 2014-0242700 A1, US 2014-0242699 A1, US 2014 0242664 A1, US 2014-0234972 A1, US 2014-0227787 A1, US 2014-0189896 A1, US 2014-0186958, US 2014 0186919 A1, US 2014-0186843 A1, US 2014-0179770 A1 and US 2014-0179006 A1, US 2014-0170753; Patentes Europeas EP 2784 162 B1 y EP 2771 468 B1; Solicitudes de Patente Europea EP 2771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6), y EP 2784 162 (EP14170383.5); y Publicaciones de Patente de PCT WO 2014/093661, WO 2014/093694, WO 2014/093595, WO 2014/093718, WO 2014/093709, WO 2014/093622, WO 2014/093635, WO 2014/093655, WO 2014/093712, WO2014/093701, WO2014/018423, WO 2014/204723, WO 2014/204724, WO 2014/204725, WO 2014/204726, WO 2014/204727, WO 2014/204728, WO 2014/204729, y WO2016/028682.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf. El "sistema CRISPR-Cpf" comprende: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el ARN guía comprendiendo un ARN direccionador que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a un secuencia de nucleótidos en un locus del ácido nucleico objetivo; y (b) un elemento de proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de proteína Cpf.

Un ejemplo de un elemento de proteína Cpf incluye nucleasas Cpfl, como Francisella Cpfl (FnCpf1) y cualquier variante de la misma. Ver, por ejemplo, Zetsche et al., "Cpfl es una endonucleasa guiada por ARN individual de un sistema CRISPR-Cas de clase 2", Cell, 163(3): páginas 759-71; y Fonfara et al., "La enzima de escisión de ADN asociada a CRISPR Cpfl también procesa el ArN de CRISPR precursor", Nature 532 (7600): páginas, 517-21. El PAM preferido de Cpfl es 5'-TTN, que difiere del de Cas9 (3'-NGG) tanto en la localización genómica como en el contenido de GC. Es posible que el sistema CRISPR-Cpf no emplee un ARN activador (ARNtracr). Tanto Cpfl como sus ARN guía son, en general, más pequeños que sus homólogos de SpCas9. El locus de Cpfl contiene un dominio mixto alfa/beta, un RuvC-I seguido de una región helicoidal, un RuvC-II y un dominio tipo dedos de zinc. La proteína de Cpfl tiene un dominio de endonucleasas similar a RuvC que es similar al dominio RuvC de Cas9. Además, Cpfl no tiene un dominio de endonucleasa de HNH, y el extremo N-terminal de Cpfl no tiene el lóbulo de reconocimiento alfa-helicoidal de Cas9. Los loci de Cpfl codifican proteínas Cas1, Cas2 y Cas4 más similares a los tipos I y III que a los sistemas de tipo II. Las proteínas de la familia de Cpfl pueden encontrarse en muchas especies bacterianas.

Sin querer estar limitados por una teoría en particular, el sistema CRISPR-Cpf emplea un complejo Cpfl-ARNcr que escinde el ADN o el ARN objetivo mediante la identificación de un motivo adyacente al protoespaciador 5'-YTN-3 (donde "Y" es una pirimidina y "N" es cualquier nucleobase) o 5'-TTN-3 en contraste con el PAM rico en G dirigido por Cas9. Después de la identificación de ^pA^m, Cpfl introduce una rotura de cadena doble de ADN similar a un extremo pegajoso de 4 o 5 nucleótidos salientes.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en NgAgo. El sistema basado en NgAgo comprende por lo menos un elemento de ADN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican el elemento de ADN guía; y una endonucleasa guiada por ADN. El sistema basado en NgAgo emplea el ADN como elemento guía. Su principio de funcionamiento es similar al de la tecnología CRISPR-Cas9, pero su elemento guía es un segmento de ADN guía (ADNd) en lugar de ARNg en la tecnología CRISPR-Cas9. Un ejemplo de endonucleasa guiada por ADN es una endonucleasa Argonauta (NgAgo) de Natronobacterium gregoryi. Ver, por ejemplo, Feng Gao et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute," Nature Biotechnology, (2016): doi: 10.1038/nbt.3547.

Por "conector", "conector de péptidos", "conector peptídico" o "espaciador peptídico" se entiende una secuencia peptídica que permite la conexión de diferentes monómeros en una proteína de fusión y la adopción de la conformación correcta para dicha actividad de proteína de fusión y que no altera la actividad de ninguno de los monómeros. Los conectores peptídicos pueden ser de varios tamaños de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 a 50 aminoácidos como un intervalo indicativo no limitativo o cualquier valor intermedio dentro de este intervalo.

Inhibidores de ADNPK

En algunas realizaciones, se emplea un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.

X es N o CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^{3 -5}, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^ü-4-heterociclilo. En realizaciones, un heterociclilo se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo. Un alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está no sustituido o sustituido (por ejemplo, en realizaciones un alquilo, un cicloalquilo o un heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 -2}).

Cada R^A4es, independientemente, H o ²H (D o deuterio). Como se usa en la presente, el término "deuterio", "²H" y "D" se usan indistintamente.

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}. Un grupo alquilo está sustituido o no sustituido (por ejemplo, en realizaciones un alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de 2H).

R^B3es alquilo C(O)NHC^{i -4}. Un alquilo está sustituido o no sustituido (por ejemplo, un alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 -2}).

Cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}. Un alquilo está sustituido o no sustituido.

En realizaciones, X es N. En realizaciones, X es CR^A5(por ejemplo, CH).

En realizaciones, R^A1es alquilo C^{1 -4}. En realizaciones, R^A1es alquilo C^1-4sustituido. En realizaciones, R^A1es alquilo C^1-4no sustituido (por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo o sec-butilo).

En las realizaciones, un R^A4es H y el otro R^A4es ²H. En realizaciones, ambos R^A4son H. En realizaciones, ambos R^A4son ²H.

En realizaciones, cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}. En realizaciones, cada R^B4es hidrógeno.

En realizaciones, R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido. En realizaciones, un alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 -2}.

En realizaciones, R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo no está sustituido (por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo o sec-butilo).

En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la Fórmula Estructural (I).

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de la Fórmula Estructural (I).

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de la Fórmula Estructural (I) y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (I) es de aproximadamente 2:1. En las realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (I) es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye un compuesto de Fórmula Estructural (I) y un CCF en una relación que es (un compuesto de Fórmula Estructural (I))n:(CCF)m. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, n es aproximadamente 2 y m es aproximadamente 1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, se emplea un compuesto representado por la Fórmula Estructural (II),

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.

Cada uno de R1 y R2 es independientemente hidrógeno o deuterio.

En realizaciones, cada uno de R1 y R2 es hidrógeno. En realizaciones, cada uno de R1 y R2 es deuterio. En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la Fórmula Estructural (II).

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II).

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II) y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En las realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (II) es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (II) es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II) y un CCF en una relación que es (un compuesto de Fórmula Estructural (II))ⁿ:(CCF)^m. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, n es aproximadamente 2 y m es aproximadamente 1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, se emplea un compuesto representado por la Fórmula Estructural (II"),

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.

Cada uno de R1 y R2 es independientemente hidrógeno o deuterio.

En realizaciones, cada uno de R1 y R2 es hidrógeno. En realizaciones, cada uno de R1 y R2 es deuterio. En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la Fórmula Estructural (II").

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II").

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II") y un formador de cocristales (CCF).

En realizaciones, se emplea un compuesto representado por la siguiente estructura,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.

En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del Compuesto 1.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 1.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 1 y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En las realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) con el Compuesto 1 es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto 1 es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye el Compuesto 1 y un CCF en una relación que es (Compuesto 1)ⁿ:(CCF)^m. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, n es aproximadamente 2 y m es aproximadamente 1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.

En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del Compuesto 2.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 2.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 2 y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) con el Compuesto 2 es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la relación entre un formador de cocristales (CCF) con el Compuesto 2 es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye el Compuesto 2 y un CCF en una relación que es (Compuesto 2)ⁿ:(CCF)^m. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, n es aproximadamente 2 y m es aproximadamente 1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En algunas realizaciones, se emplea un compuesto representado por la siguiente estructura:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.

En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del Compuesto 3.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 3.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 3 y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, una composición o un cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente proporciona el compuesto en forma de un enantiómero individual que está por lo menos aproximadamente el 95%, por lo menos aproximadamente el 97% o por lo menos aproximadamente el 99% libre del enantiómero correspondiente.

En realizaciones, una composición o cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente proporciona el compuesto en forma de enantiómero (+), en donde la composición o cocristal está libre por lo menos en un 95% del enantiómero (-) correspondiente.

En realizaciones, una composición o cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente proporciona el compuesto en forma de enantiómero (+), en donde la composición o cocristal está libre por lo menos en un 97% del enantiómero (-) correspondiente.

En realizaciones, una composición o cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente proporciona el compuesto en forma de enantiómero (+), en donde la composición o cocristal está libre por lo menos en un 99% del enantiómero (-) correspondiente.

En realizaciones, una composición o cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente proporciona el compuesto en forma de enantiómero (-), en donde la composición o cocristal está libre por lo menos en un 95% del correspondiente (+)enantiómero.

En realizaciones, una composición o cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente proporciona el compuesto en forma de enantiómero (-), en donde la composición o cocristal está libre por lo menos en un 97% del enantiómero (+)correspondiente.

En realizaciones, una composición o cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente proporciona el compuesto en forma de enantiómero (-), en donde la composición o cocristal está libre por lo menos en un 99% del enantiómero (+) correspondiente.

En realizaciones, se emplea un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I'),

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo. En realizaciones, cada RA1, RA4, R, RB4, RB3, X y RA5 es independientemente como se describe para la Fórmula Estructural (I) en cualquier realización descrita en la presente.

Además, en cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de la Fórmula Estructural (I) puede reemplazarse con un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de Fórmula Estructural (I').

En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (I').

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (I'). En realizaciones, un cocristal incluye un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, la relación entre un compuesto de un formador de cocristales (CCF) con un compuesto de Fórmula Estructural (I') es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la relación entre un compuesto de un formador de cocristales (CCF) con un compuesto de Fórmula Estructural (I') es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye un compuesto de Fórmula Estructural (I') y un CCF en una relación que es (un compuesto de Fórmula Estructural (I'))ⁿ:(CCF)^m. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, n es aproximadamente 2 y m es aproximadamente 1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, se emplea un compuesto de Fórmula Estructural (I') representado por Fórmula Estructural (II'),

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.

En realizaciones, cada R1 y R2 es independientemente hidrógeno o deuterio.

En realizaciones, tanto R1 como R2 son hidrógeno. En realizaciones, tanto R1 como R2 son deuterio.

En realizaciones, se emplea un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de Fórmula Estructural (II').

En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (II').

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II'). En realizaciones, un cocristal incluye un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, la relación entre un compuesto de un formador de cocristales (CCF) con un compuesto de Fórmula Estructural (II') es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la relación entre un compuesto de un formador de cocristales (CCF) con un compuesto de Fórmula Estructural (II') es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II') y un CCF en una relación que es (un compuesto de Fórmula Estructural (II'))ⁿ:(CCF)^m. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, n es aproximadamente 2 y m es aproximadamente 1. En realizaciones, n es aproximadamente 1 y m es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

En realizaciones, se emplea un compuesto de Fórmula Estructural (I') representado por Fórmula Estructural (II'''),

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.

En realizaciones, cada R1 y R2 es independientemente hidrógeno o deuterio.

En realizaciones, se emplea un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de Fórmula Estructural (rn .

En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (II''').

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II'''). En realizaciones, un cocristal incluye un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.

Como se describe en la presente, los compuestos divulgados en la presente pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, como los que se han ilustrado de manera general anteriormente, o como se ejemplifica por clases, subclases y especies particulares. Se apreciará que la frase "opcionalmente sustituido" se usa indistintamente con la frase "sustituido o no sustituido". En general, el término "sustituido", ya sea precedido por el término "opcionalmente" o no, se refiere al reemplazo de uno o más radicales de hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente especificado. A menos que se indique lo contrario, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo. Cuando más de una posición en una estructura dada puede sustituirse con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser o el mismo o diferente en cada posición.

Cuando sea químicamente posible o químicamente estable, un grupo molecular descrito en la presente está no sustituido o sustituido (es decir, "opcionalmente sustituido"). Como se describe en la presente, cuando el término "opcionalmente sustituido" precede a una lista, dicho término se refiere a todos los grupos sustituibles posteriores en esa lista. Por ejemplo, si el grupo X es "halógeno; alquilo o fenilo opcionalmente sustituido;" entonces X puede ser o alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido. De igual manera, si el término "opcionalmente sustituido" sigue a una lista, dicho término también se refiere a todos los grupos sustituibles de la lista anterior a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo: si X es halógeno, alquilo C^1-4o fenilo, en donde X está opcionalmente sustituido por J^X, entonces tanto el alquilo C^1-4como el fenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por J^X. Como es evidente para los expertos en la técnica, los grupos como H, halógeno, NO², CN, NH², OH u OCF³no se incluirían porque no son grupos sustituibles. Como también es evidente para un experto en la técnica, un anillo heteroarilo o heterocíclico que contiene un grupo NH puede sustituirse opcionalmente reemplazando el átomo de hidrógeno con el sustituyente.

En realizaciones, un grupo (por ejemplo, un alquilo C^{1 -4}; cicloalquilo C^{3 -5}; un heterociclilo como oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo; un arilo como fenilo o un heteroarilo) no está sustituido.

En realizaciones, un grupo (por ejemplo, un alquilo C^{1 -4}; cicloalquilo C^{3 -5}; un heterociclilo como oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo; un arilo como fenilo o un heteroarilo) está sustituido. En realizaciones, un grupo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituyentes según lo permitan la valencia y la estabilidad química.

Las combinaciones de sustituyentes previstas en esta divulgación son preferiblemente aquellas que dan como resultado la formación de compuestos estables o químicamente viables. El término "estable", como se usa en la presente, se refiere a compuestos que no se alteran sustancialmente cuando se someten a condiciones que permiten su producción, detección y, preferiblemente, su recuperación, purificación y uso para uno o más de los propósitos divulgados en la presente. En realizaciones, un compuesto estable o un compuesto químicamente viable es uno que no se altera sustancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 40° C o menos, en ausencia de humedad u otras condiciones químicamente reactivas, durante por lo menos una semana.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x+/-10%.

El término "alquilo" o "grupo alquilo", como se usa en la presente, significa una cadena hidrocarbonada de cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, sustituida o no sustituida que está completamente saturada. A menos que se especifique lo contrario, los grupos alquilo tienen de 1 a 8 átomos de carbono (representados como "alquilo C^1-8"). En realizaciones, los grupos alquilo tienen de 1 a 6 átomos de carbono (representados como "alquilo C^1-6"). En realizaciones, los grupos alquilo tienen de 1 a 4 átomos de carbono (representados como "alquilo C^1-4"). En realizaciones, una entidad molecular descrita como "alquilo C^0-4" incluye un enlace covalente (por ejemplo, un "alquilo Co") o una cadena de alquilo C^1-4como se describe en la presente. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo.

El término "alquileno", como se usa en la presente, representa un grupo hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada divalente saturado y se ejemplifica con metileno, etileno, isopropileno y similares.

El término "alquilideno", como se usa en la presente, representa un grupo de enlace alquilo de cadena lineal divalente.

El término "alquenilo", como se usa en la presente, representa un grupo hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada que contiene uno o más enlaces dobles carbono-carbono.

El término "alquinilo", como se usa en la presente, representa un grupo hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada que contiene uno o más enlaces triples carbono-carbono.

El término "cicloalquilo" (o "carbociclo"), como se usa en la presente, se refiere a un hidrocarburo monocíclico C3-C8 o bicíclico C8-C12 que está completamente saturado y tiene un único punto de unión con el resto del molécula, y en donde cualquier anillo individual en dicho sistema de anillo bicíclico tiene 3-7 miembros. Los grupos cicloalquilo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.

El término "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalquilo" o "heterocíclico", como se usa en la presente, se refiere a un sistema de anillos monocíclico, bicíclico o tricíclico en el que por lo menos un anillo del sistema contiene uno o más heteroátomos, que es el igual o diferente, y que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de instauración, pero que no es aromático, y que tiene un único punto de unión con el resto de la molécula. En algunas realizaciones, el grupo "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalquilo" o "heterocíclico" tiene de tres a catorce miembros del anillo en los que uno o más miembros del anillo es un heteroátomo seleccionado independientemente de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo, y cada anillo en el sistema contiene de 3 a 8 miembros de anillo. Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes monociclos: 2-tetrahidrofuranilo, 3-tetrahidrofuranilo, 2-tetrahidrotiofenilo, 3 tetrahidrotiofenilo, 2-morfolino, 3-morfolino, 4-morfolino, 2-tiomorfolino, 3-tiomorfolino, 4-tiomorfolino, 1 -pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo, 3-pirrolidinilo, 1-tetrahidropiperazinilo, 2-tetrahidropiperazinilo, 3-tetrahidropiperazinilo, 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 1 -pirazolinilo, 3-pirazolinilo, 4-pirazolinilo, 5-pirazolinilo, 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-piperidinilo, 2-tiazolidinilo, 3-tiazolidinilo, 4-tiazolidinilo, 1 -imidazolidinilo, 2-imidazolidinilo, 4-imidazolidinilo, 5-imidazolidinilo; y los siguientes biciclos: 3-1H-bencimidazol-2-ona, 3-(1-alquil)-bencimidazol-2-ona, indolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, benzotiolano, benzoditiano y 1,3-dihidro-imidazol-2-ona.

El término "heteroátomo", como se usa en la presente, significa uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo, incluyendo cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre o fósforo; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico; o un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido).

El término "insaturado", como se usa en la presente, significa que una fracción que tiene una o más unidades de instauración.

El término "alcoxi" o "tioalquilo", como se usa en la presente, se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, unido a la cadena de carbono principal a través de un átomo de oxígeno ("alcoxi") o azufre ("tioalquilo").

Los términos "haloalquilo", "haloalquenilo" y "haloalcoxi", como se usan en la presente, significan alquilo, alquenilo o alcoxi, según sea el caso, sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "halógeno" significa F, Cl, Br o I.

El término "arilo", como se usa en la presente, solo o como parte de una fracción más grande como en "aralquilo", "aralcoxi" o "ariloxialquilo", se refiere a un sistema de anillo carbocíclico monocíclico, bicíclico o tricíclico que tiene un total de seis a catorce miembros de anillo, en donde dicho sistema de anillo tiene un único punto de unión al resto de la molécula, por lo menos un anillo en el sistema es aromático y en donde cada anillo en el sistema contiene de 4 a 7 miembros de anillo. El término "arilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo de arilo". Los ejemplos de anillos de arilo incluyen fenilo, naftilo y antraceno.

Como se usa en la presente, el término "heteroarilo", usado solo o como parte de una fracción más grande como en "heteroaralquilo" o "heteroarilalcoxi", se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico y tricíclico que tiene un total de cinco a catorce miembros en el anillo, en donde dicho sistema de anillo tiene un único punto de unión al resto de la molécula, por lo menos un anillo en el sistema es aromático, por lo menos un anillo en el sistema contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo, y en donde cada anillo del sistema contiene de 4 a 7 miembros de anillo. El término "heteroarilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo de heteroarilo" o el término "heteroaromático". Ejemplos adicionales de anillos de heteroarilo incluyen los siguientes monociclos: 2 furanilo, 3-furanilo, N-imidazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, 5 imidazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo, N-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, piridazinilo (por ejemplo, 3-piridazinilo), 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, tetrazolilo (por ejemplo, 5-tetrazolilo), triazolilo (por ejemplo, 2-triazolilo y 5-triazolilo), 2-tienilo, 3-tienilo, pirazolilo (por ejemplo, 2-pirazolilo), isotiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,3-triazolilo , 1,2,3-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, pirazinilo, 1,3,5-triazinilo y los siguientes biciclos: bencimidazolilo, benzofurilo, benzotiofenilo, indolilo (por ejemplo, 2-indolilo), purinilo, quinolinilo (por ejemplo, 2-quinolinilo, 3-quinolinilo, 4-quinolinilo) e isoquinolinilo (por ejemplo, 1-isoquinolinilo, 3-isoquinolinilo o 4-isoquinolinilo).

A menos que se represente o indique lo contrario, las estructuras enumeradas en la presente pueden incluir todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas, diastereoisómeras y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, los isómeros de doble enlace (Z) y (E) y los isómeros conformacionales (Z) y (E). Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos individuales así como las mezclas enantioméricas, diastereoisómeras y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del alcance de esta divulgación. Los compuestos que se han dibujado con centros estereoquímicos definidos, habitualmente mediante el uso de un enlace rayado o en negrita, son estereoquímicamente puros, pero con la estereoquímica absoluta aún sin definir. Tales compuestos pueden tener la configuración R o S. En aquellos casos en que se haya determinado la configuración absoluta, el centro o centros quirales están marcados con (R) o (S) en el dibujo.

A menos que se indique lo contrario, todas las formas tautoméricas de los compuestos divulgados en la presente están dentro del alcance de dicha divulgación. Además, a menos que se indique lo contrario, también se pretende que las estructuras representadas en la presente incluyan compuestos que difieren solo en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto por el reemplazo de hidrógeno por deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por un carbono enriquecido 13C o 14^cestán dentro del alcance de esta divulgación. Tales compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, sondas en ensayos biológicos o como inhibidores de ADNPK con un perfil terapéutico mejorado.

Sales farmacéuticamente aceptables

También se apreciará que ciertos compuestos divulgados en la presente pueden existir en forma libre o, cuando sea apropiado, como un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. Un derivado farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, profármacos, sales, ésteres, sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables o cualquier otro aducto o derivado que, tras su administración a un paciente con necesidad de el mismo, sea capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto como se describe de otro modo en la presente, o un metabolito o residuo del mismo.

Como se usa en la presente, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas.

Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Berge et al. describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, 1977. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos divulgados en la presente incluyen las derivadas de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas farmacéuticamente aceptables son las sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Otras sales ejemplares más incluyen adipato, benzoato, citrato, fumarato, maleato o succinato. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo C1-4)4.

En esta divulgación también se incluye la cuaternización de cualquier grupo básico que contenga nitrógeno de los compuestos divulgados en la presente. Mediante tal cuaternización pueden obtenerse productos solubles o dispersables en agua o en aceite. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato C1-8 y sulfonato de arilo.

Cocristales

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente (por ejemplo, un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), (II) o (II'')) y un formador de cocristales (CCF).

En realizaciones, un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), (II) o (II") y un CCF están ambos en estado sólido (por ejemplo, cristalino). En realizaciones, un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), (II) o (II") y un CCF están unidos no covalentemente (por ejemplo, mediante enlace de hidrógeno).

En realizaciones, un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) y un CCF (por ejemplo, ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico) es un sólido en temperatura ambiente. En realizaciones, un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) y un CCF (por ejemplo, ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico) interactúan mediante enlaces no covalentes.. En realizaciones, una interacción de enlace no covalente entre un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) y un CCF (por ejemplo, ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico) incluye enlaces de hidrógeno y/o interacciones de van der Waals.

En realizaciones, un formador de cocristales (CCF) es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.

En realizaciones, un cocristal es un cocristal que se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067.

En realizaciones, un cocristal incluye (5)-N-metil-8-(1-((2'-metil-[4,5'-bipirimidin]-6-il)amino)propan-2-il)quinolina-4-carboxamida. En realizaciones, el compuesto es el enantiómero (+). En realizaciones, el compuesto es el enantiómero (-).

En realizaciones, un cocristal incluye (5)-N-metil-8-(1-((2'-metil-4 6'-dideutero-[4,5'-bipirimidin]-6-il)amino)propano-2-il)quinolina-4-carboxamida. En realizaciones, el compuesto es el enantiómero (+). En las realizaciones, el compuesto es el enantiómero (-).

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) y ácido cítrico como CCF.

En realizaciones, la invención presenta un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) y ácido fumárico como CCF.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) y ácido maleico como CCF.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) y ácido succínico como CCF.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) y ácido benzoico como CCF.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) y ácido adípico como CCF.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 1 y ácido adípico. En realizaciones, la relación molar del Compuesto 1 al ácido adípico es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la relación molar del Compuesto 1 al ácido adípico es de aproximadamente 1:2.

En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye el Compuesto 2 y ácido adípico. En realizaciones, la relación molar del Compuesto 2 al ácido adípico es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la relación molar del Compuesto 2 al ácido adípico es de aproximadamente 1:2.

En realizaciones, un cocristal que incluye el Compuesto 1 y ácido adípico está en la Forma A polimórfica como se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067. En realizaciones, un cocristal que incluye el Compuesto 1 y el ácido adípico está en la Forma B polimórfica como se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067. En realizaciones, un cocristal que incluye el Compuesto 1 y ácido adípico es una mezcla de las Formas polimórficas A y B como se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067.

En realizaciones, un cocristal que incluye el Compuesto 2 y ácido adípico está en la Forma A polimórfica como se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067. En realizaciones, un cocristal que incluye el Compuesto 2 y el ácido adípico está en la Forma B polimórfica como se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067. En realizaciones, un cocristal que incluye el Compuesto 2 y el ácido adípico es una mezcla de las Formas polimórficas A y B como se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067.

En algunas realizaciones, se emplea un cocristal en donde dicho cocristal incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o (II) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) y un CCF descrito anteriormente en forma aislada, pura, o en una mezcla como una composición sólida cuando se mezcla con otros materiales, por ejemplo, la forma libre de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) o CCF libre.

En algunas realizaciones, se emplean composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2), un primer CCF (por ejemplo, como se describe en la presente) y uno o más CCF libres adicionales, que pueden ser iguales o diferentes al primer CCF. En algunas realizaciones, una composición incluye un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2), un primer CCF que es ácido adípico y ácido adípico adicional. En algunas realizaciones, la relación molar total de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) con el CCF (por ejemplo, CCF total que incluye un primer CCF (por ejemplo, como se describe en la presente y uno o más CCF libres adicionales) en tales composiciones varía entre aproximadamente 1:0,55 y aproximadamente 1:100. la relación molar total de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) con el CCF en dichas composiciones varía entre aproximadamente 1:0,55 y aproximadamente 1:50. En algunas realizaciones, la relación molar total del compuesto de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) con el CCF en tales composiciones está en un intervalo de aproximadamente 1:0,55 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relación en peso total del compuesto de fórmula I con el CCF en tales composiciones varía entre aproximadamente el 85% en peso:15% en peso y aproximadamente el 60% en peso:40% en peso. En algunas realizaciones, la relación en peso total del compuesto de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) con el CCF varía entre aproximadamente el 70% en peso:30% en peso y aproximadamente el 60% en peso:40% en peso.% En algunas realizaciones, la relación en peso total de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) (por ejemplo, el Compuesto 1 o el Compuesto 2) con el CCF es de aproximadamente el 65% en peso: 35% en peso.

Inhibidores de ADNPK para aumentar la eficiencia de la edición genómica

La eficiencia de la edición del genoma dirigida puede aumentarse mediante la administración a una célula o células con uno o más compuestos (por ejemplo, inhibidores de ADNPK) descritos en la presente y un sistema de edición del genoma. Los sistemas de edición del genoma adecuados para su uso incluyen, por ejemplo, un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efector de tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo. Los métodos, composiciones y kits de la divulgación proporcionan inhibidores de ADNPK y/o un sistema de edición del genoma para aumentar la eficiencia de la edición del genoma. En algunas realizaciones, se aumenta la eficiencia de edición del genoma de HDR después de la administración a una célula o células con un inhibidor de ADNPK, como se reivindica.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema de edición del genoma basado en CRISPR. El sistema de edición del genoma basado en CRISPR puede ser un sistema CRISPR-Cas o variantes del mismo. El sistema CRISPR-Cas puede usar cualquier endonucleasa Cas, como las endonucleasas Cas 9 y variantes de las mismas. Los ejemplos de endonucleasas Cas 9 incluyen endonucleasas Cas9 o variantes de las mismas, como SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o CasDIOA nickasea La endonucleasa Cas puede ser de tipo salvaje, manipulada o mutante de nickasa, o cualquier variación de la misma.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye una secuencia CRISPR, una secuencia cr de activación de trans (tracr), una secuencia guía y una endonucleasa Cas o cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye un ARN que comprende una secuencia CRISPR (ARNcr), un ARN que comprende una secuencia cr de activación de trans (tracr) (ARNtracr) y una endonucleasa Cas o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye una secuencia CRISPR, una secuencia guía y una endonucleasa Cas o una endonucleasa Cpf, o cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR es un sistema CRISPRCpf. La nucleasa Cpf es una endonucleasa del sistema CRISPR-Cas de clase 2. Cpf es una endonucleasa guiada por ARN individual. La nucleasa Cpf puede ser de tipo salvaje, manipulada o mutante de nickasa, o cualquier variación de la misma. Ver, por ejemplo, Zetsche et al., "CPF1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System," Cell, 163(3): 759-71. En algunas realizaciones, la nucleasa Cpf es una endonucleasa Cpf 1.

En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasas. La edición del genoma basada en meganucleasas usa endonucleasas específicas de secuencia que reconocen sitios objetivo de ADN grandes (por ejemplo, típicamente de aproximadamente >12 pb). Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 9.365.964. Las meganucleasas pueden escindir secuencias cromosómicas únicas sin afectar a la integridad general del genoma. En algunas realizaciones, la meganucleasa puede ser una endonucleasa dirigida. En algunas realizaciones, la meganucleasa puede ser una endonucleasa de intrones o una endonucleasa de inteínes. Las endonucleasas dirigidas pueden pertenecer a la familia LAGLIDADG. Las meganucleasas pueden ser de tipo salvaje, manipuladas o mutantes de nickasa.

En algunas realizaciones, el sistema de edición de genes es un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN). La ZFN es una enzima de restricción artificial diseñada en base a la fusión entre un dominio de unión a ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión de ADN. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 9.145.565.

En algunas realizaciones, el sistema de edición de genes es una nucleasa basada en efector de tipo activador de transcripción (TALEN). Las TALEN son enzimas de restricción manipuladas que se elaboran mediante la fusión de un dominio de unión al ADN del efector TAL con un dominio de escisión del ADN. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 9.181.535.

En algunas realizaciones, el sistema de edición de genes es un sistema basado en Argonauta. Los sistemas de edición de genes basados en Argonauta incluyen una endonucleasa derivada de Argonauta y un ADNmc fosforilado en 5'. En algunas realizaciones, el ADNmc fosforilado puede tener una longitud de 10-40 nucleótidos, de 15-30 nucleótidos o de 18-30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 24 nucleótidos). En algunas realizaciones, la endonucleasa Argonauta puede ser cualquier endonucleasa. En algunas realizaciones, la endonucleasa Argonauta se deriva de Thermus thermophiles (TtAgo), Pyrococcus furiosus (PfAgo) o Natronobacterium gregoryi (NgAgo). En algunas realizaciones, la Natrobacterium gregoryi (NgAgo) es la cepa 2 (es decir, N. gregoryi SP2). En algunas realizaciones, la endonucleasa de Argonauta es NgAgo. Ver, por ejemplo, "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute," Nature Biotechnology, mayo de 2016.

El inhibidor de ADNPK es un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I9 o la Fórmula Estructural (i') como se define en las reivindicaciones, o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo. En algunas realizaciones, los inhibidores de ADNPK son compuestos representados por la Fórmula Estructural I o la Fórmula Estructural II. En algunas realizaciones, los inhibidores de ADNPK son compuestos representados por la Fórmula Estructural I' o la Fórmula Estructural II'. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK es el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK es un cocristal que incluye el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 y el ácido adípico. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 5 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 4 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 3 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico al Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 2 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico al Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 2 a 1,0, o cualquier relación intermedia.

En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK es el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el inhibidor de NHEJ es el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3, o una combinación de los mismos.

Los ejemplos de inhibidor de NHEJ incluyen inhibidores de ADNPK. Los inhibidores de NHEJ son compuestos representados por la Fórmula Estructural I, I', II, II', II" o II". En algunas realizaciones, el inhibidor de NHEJ es el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el inhibidor de NHEJ es un cocristal que incluye el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 y ácido adípico. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 5 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con a cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 4 a 0,5 o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 3 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3 es de aproximadamente 2 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación de ácido adípico con cualquiera del Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3es de aproximadamente 2 a 1,0, o cualquier relación intermedia.

En algunas realizaciones, la eficiencia de edición del genoma aumentada es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra un sistema de edición del genoma a una célula o células y no se administra un inhibidor de ADNPK.

Uso de inhibidores de ADNPK y sistema de edición del genoma, kits y composiciones de los mismos

La edición del genoma, en la que se alteran con precisión regiones genómicas particulares, tiene un gran potencial terapéutico.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo, para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR, para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo, y para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas mediante la administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprenden administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo de un gen o genes objetivo, lo que da como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un gen o genes en sentido descendente y/o proteína o proteínas asociadas con el gen o genes objetivo.

El sistema de edición del genoma puede ser cualquier sistema de edición del genoma que pueda editar una región genómica objetivo en una célula o células. Los sistemas de edición del genoma ejemplares se han descrito con detalle anteriormente y pueden incluir, por ejemplo, un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efector del tipo activador de la transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR, o sistema basado en NgAgo

La edición de una o más regiones genómicas objetivo incluye cualquier tipo de manipulación o ingeniería genética del genoma de una célula. La edición de una o más regiones genómicas objetivo puede incluir inserciones, deleciones o reemplazos de regiones genómicas en una célula o células realizadas por una o más endonucleasas. Las regiones genómicas comprenden el material genético en una célula o células, como ADN, ARN, polinucleótidos y oligonucleótidos. Las regiones genómicas en una célula o células también comprenden los genomas de las mitocondrias o cloroplastos contenidos en una célula o células.

El inhibidor de ADNPK es un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (i') como se define en las reivindicaciones o una sal farmacéuticamente aceptable o cristal del mismo. En algunas realizaciones, los inhibidores de ADNPK son compuestos representados por la Fórmula Estructural I, la Fórmula Estructural II o la Fórmula Estructural II". En algunas realizaciones, los inhibidores de ADNPK son compuestos representados por la Fórmula Estructural I', la Fórmula Estructural II' o la Fórmula Estructural II'". En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK es el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK es un cocristal que incluye el Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 y ácido adípico. En algunas realizaciones, la relación entre el ácido adípico y cualquiera del Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 es de aproximadamente 5 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación entre el ácido adípico y cualquiera del Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 es de aproximadamente 4 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación entre el ácido adípico y cualquiera del Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 es de aproximadamente 3 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación entre el ácido adípico y cualquiera del Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 es de aproximadamente 2 a 0,5, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, la relación entre el ácido adípico y cualquiera del Compuesto 1, el Compuesto 2 o el Compuesto 3 es de aproximadamente 2 a 1,0, o cualquier relación intermedia. En algunas realizaciones, los inhibidores de NHEJ son compuestos representados por la Fórmula Estructural I, I', II, II', II'' II'", o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK para su uso como se definen en las reivindicaciones se usa en métodos para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células del sujeto, que comprende administrar a una o más células un sistema de edición genómica y un Inhibidor de ADNPK.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en la presente se usan para modificar la expresión de un gen, una molécula de ARN, una proteína, un grupo de proteínas, o proteínas en sentido descendente en una vía. Como se usa en la presente, el término "modificar" o "que modifica" incluye modular, potenciar, disminuir, aumentar, insertar, eliminar, anular, desactivar, activar y similares.

Un experto en la técnica entiende que las enfermedades, ya sean adquiridas o heredadas, u obtenidas de otro modo, implican una desregulación de los mecanismos homeostáticos, incluyendo la implicación de la función génica o proteica. Con este fin, un experto en la técnica puede usar los compuestos proporcionados en la presente para modular, modificar, potenciar, disminuir o proporcionar una función génica de otro modo en un sujeto.

La modificación de la expresión del gen y la consiguiente expresión de la proteína en una célula o células puede lograrse mediante los métodos proporcionados en la presente, por ejemplo, mediante la edición específica (por ejemplo, reemplazando, insertando o eliminando, cualquier combinación de los mismos) una secuencia de ácidos nucleicos en cualquiera de un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, una región promotora, una región potenciadora, una región silenciadora, una región aislante, un antirrepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (por ejemplo, poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión al factor de transcripción, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente se usan para tratar a un sujeto que tiene cáncer. La composición para su uso para tratar a un sujeto que tiene un cáncer o una afección relacionada con el cáncer comprende administrar a una célula o células del sujeto un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, y un sistema de edición del genoma. La administración del inhibidor de ADNPK y del sistema de edición del genoma puede ser in vivo o ex vivo.

El cáncer puede ser de cualquier tipo de cáncer. El cáncer incluye tumores sólidos como los de mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testículo, cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma y otros tumores de órganos tisulares y cánceres de las células sanguíneas, como linfomas y leucemias, incluyendo la leucemia mielógena aguda, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia linfocítica de células T y los linfomas de células B. Los cánceres pueden incluir melanoma, leucemia, astocitoma, glioblastoma, linfoma, glioma, linfoma de Hodgkins, leucemia linfocitaria crónica y cáncer de páncreas, mama, tiroides, ovario, útero, testículo, pituitaria, riñón, estómago, esófago y recto.

En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente se usan para tratar a un sujeto que tiene uno o más de los cánceres siguientes: leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer de ano, cáncer del apéndice, astrocitoma, cerebeloso o cerebral infantil, carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, extrahepático (ver colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno, tumor cerebral, ependimoma, tumor cerebral, meduloblastoma, tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor cerebral, glioma de vía visual e hipotalámico, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, infantil, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, primario, astrocitoma cerebeloso, infantil, astrocitoma cerebral/glioma maligno, infantil, cáncer de cuello uterino, cánceres infantiles, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, hemangioendotelioma epitelioide (EHE), cáncer de esófago, sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de las vías biliares extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular, cáncer ocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales: extracraneal, extragonadal u ovárico, tumor trofoblástico gestacional, glioma del tronco encefálico, glioma, astrocitoma cerebral infantil, glioma, vía visual infantil e hipotalámico, carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, glioma hipotalámico y de la vía visual, infantil, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias, leucemia linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), leucemia mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfomas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfomas de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (una clasificación antigua de todos los linfomas excepto el de Hodgkin), macroglobulinemia del sistema nervioso central primario, Waldenstrom, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma infantil, melanoma, intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma maligno en adultos, cáncer de cuello escamoso metastásico infantil con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda del adulto, mieloma agudo infantil, múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, mixoma crónico, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor del estroma epitelial superficial), tumor de células germinales de ovario, tumor de bajo potencial maligno de ovario, cáncer de páncreas, cáncer pancreático de células de los islotes, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), cáncer de pelvis y uréter renal, cáncer de células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel, células de Merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas - ver cáncer de piel (no melanoma), cáncer de cuello escamoso con primario oculto, metastásico, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma de células T, cutáneo (micosis fungoide y síndrome de Sezary), cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, tumor trofoblástico gestacional, carcinoma de sitio primario desconocido en adultos, cáncer de sitio primario desconocido, infantil, uréter y pelvis renal, cáncer de células de transición, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma hipotalámico y de la vía visual, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom o tumor de Wilms (cáncer de riñón).

En algunas realizaciones, los genes objetivo ejemplares asociados con el cáncer incluyen ABL1, ABL2, ACSL3, AF15Q14, AF1Q, AF3p21, AF5q31, AKAP9, A T1, AKT2, ALDH2, AL, AL017, APC, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC3, BLM, BMPRIA, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIPI, BTG1, BUB1B, C12orf9, C15orf21, C15orf55, C16orf75, C2orf44, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CBFA2T1, CBFA2T3, C.BFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD74, CD79A, CD79B, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CD N2A, CD N2a(p14), CD N2C, CDX2, CEBPA, CEPl, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHNl, CIC, Cin A, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1 Al, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CTNNB1, CYLD, D10S170, DAXX, DDB2, DDIT3, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, D1CER1, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBFI, ECT2L, EGFR, E1F4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6, EVIl, EWSR1, EXT1, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM22A, FAM22B, FAM46C, 1ANCA, EANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FBXOl 1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFRIOP, FGFR2, FGFR3, FTI, FIIIT, FIP1L1, FLU, FLJ27352, FLT3, FNBP1, FOXL2, FOXOIA, FOX03A, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, IICMOGT-1, IIEAB, HERPUD1, IIEY1, IIIP1, HIST1IT3B, IIIST1II4I, IILF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNRNPA2BI, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, IIRPT2, HSPCA, HSPCB, IDH1, IDH2, IGH, IGK, IGL, IKZF1, IL2, TL21R, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KRAS, KTN1, LAF4, LASPl, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LMOl, LM02, LPP, LRIG3, LYL1, MADH4, MAF, MAFB, MALT1, MAML2, MAP2KL MAP2K2, MAP2K4, MAX, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECTl, MED12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLIIl, MLL, MLL2, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NACA, NBS1, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2-1, NONO, NOTCH I, NOTCH2, NPM1, NR4A3, NRAS, NSDl, NT5C2, NTRK1, NTRK3, NUMAl, NUP214, NUP98, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB 2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PIIF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG 1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1 A, PRO1073, PSIP2, PTCH, PTEN, PTPN11, RAB5EP, RACl, RAD51L1, RAFl, RALGDS, RANBP17, RAPIGDSI, RARA, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RUNDC2A, RUNX1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SEPT6, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRGAP3, SRSF2, SSI8, SS18L1, SSH3BP1, SSX1, SSX2, SSX4, STAT3, STK11, STL, SUFU, SIJZ12, SYK, TAF15, TALI, TAL2, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1A, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIF1, TLX1, TLX 3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF6, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, USP6, VHL, VTUA, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WTX, WWTR1, XPA, XPC, XPOl, YWHAE, ZNF145, ZNF198, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2 o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en la presente se usan para tratar a un sujeto que tiene un trastorno heredado. El método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección genética o un trastorno heredado comprende administrar a una célula o células del sujeto un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición del genoma. La administración del inhibidor de ADNPK y del sistema de edición del genoma puede ser in vivo o ex vivo.

El trastorno heredado puede ser el resultado de mutaciones o duplicaciones en regiones cromosómicas (por ejemplo, de mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, cambios de marco, duplicaciones o deleciones cromosómicas). El trastorno heredado puede ser cualquier trastorno heredado.

En algunas realizaciones, el trastorno heredado es síndrome de deleción 22q11.2, síndrome de Angelman, enfermedad de Canavan, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, daltonismo, Cri du chat, síndrome de Down, distrofia muscular de Duchenne, hemocromatosis, hemofilia, síndrome de Klinefelter, neurofibromatosis, fenilcetonuria, enfermedad de poliquistosis renal, síndrome de Prader-Willi, enfermedad de células falciformes, atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinal, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Turner, una hemoglobinopatía o cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, el trastorno heredado es síndrome de deleción de 1p36, síndrome de deleción de 18p, deficiencia de 21-hidroxilasa, 47 XXX (síndrome de triple X), 47 XXY (síndrome de Klinefelter), porfiria por deficiencia de 5-ALA deshidratasa, deficiencia de ALA deshidratasa, porfiria por deficiencia de 5-aminolevulínico deshidratasa, síndrome de deleción de 5p, Cri du chat (también conocido como síndrome 5p-), ataxia telangiectasia (también conocida como A-T), deficiencia de alfa 1 -antitripsina (AAT), aceruloplasminemia, acondrogénesis tipo II (ACG2), acondroplasia (ACH), deficiencia de beta-glucosidasa ácida, enfermedad de Gaucher (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3), acrocefalosindactilia (Apert), síndrome de Apert, acrocefalosindactilia (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 5), síndrome de Pfeiffer, acrocefalia, enfermedad de Gaucher cerebral aguda, porfiria aguda intermitente, (AIP) deficiencia de ACY2, enfermedad de Alzheimer (EA), craneosinostosis tipo Adelaida, síndrome de Muenke, poliposis coli adenomatosa, poliposis adenomatosa familiar, poliposis adenomatosa del colon, poliposis adenomatosa familiar (ADP), deficiencia de adenilosuccinato liasa, trastornos de las glándulas suprarrenales, síndrome adrenogenital, adrenoleucodistrofia, síndrome de insensibilidad a los andrógenos (AIS), alcaptonuria (AKU), porfiria ALA deshidratasa, porfiria ALA-D, deficiencia de ALA deshidratasa, síndrome de Alagille, albinismo, alcaptonuria, alcaptonuria, enfermedad de Alexander, alcaptonuria, ocronosis alcaptonúrica, alcaptonuria, enfermedad por inhibidores de la proteinasa alfa-1, enfisema relacionado con alfa-1, deficiencia de alfagalactosidasa A, enfermedad de Fabry, síndrome de Alstrom, enfermedad de Alexander (ALX), amelogénesis imperfecta, deficiencia de deshidratasa de ácido aminolevulínico, deficiencia de aminoacilasa 2, enfermedad de Canavan, enfermedad de Anderson-Fabry, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, anemia, sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica y/o familiar ligada a X, angioqueratoma corporis diffusum, angioqueratoma difuso, angiomatosis retinae, enfermedad de von Hippel-Lindau, resistencia a APC, tipo Leiden, trombofilia del factor V Leiden, síndrome de Apert, deficiencia de AR, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (cualquier tipo, por ejemplo, CMT1, CMTX, CMT2, CMT4, CMT grave de aparición temprana), aracnodactilia, síndrome de Marfan, SRNAH, sordera no sindrómica (autosómica recesiva, autosómica dominante, ligada a x o mitocondrias), artrooftalmopatía, progresiva hereditaria, síndrome de Stickler (por ejemplo, COL2A1, COL11A1, COL11A2, COL9A1), artrocalasia múltiple congénita, síndrome de Ehlers-Danlos (por ejemplo, tipo hiperlaxitud, tipo artrocalasia, tipo clásico, tipo vascular, tipo cifoescoliosis, tipo dermatosparaxis), deficiencia de Asp, deficiencia de Aspa, deficiencia de aspartoacilasa, ataxia telangiectasia, síndrome de autismo-demencia-ataxiapérdida del uso intencional de la mano, síndrome de Rett, ELA juvenil autosómica dominante, Síndrome opitz G/BBB autosómico dominante, forma autosómica recesiva de ELA juvenil tipo 3, esclerosis lateral amiotrófica (cualquier tipo; por ejemplo, ALS1, ALS2, ALS3, ALS4, ALS5, ALS5, ALS6, ALS7, ALS8, ALS9, ALS10, ALS11, ALS12, ALS13, ALS14, ALS15, ALS16, ALS17, ALS18, ALS19, ALS20, ALS21, ALS22, FTDALS1, FTDALS2, FTDALS3, FTDALS4, FTDALS4, IBMPFD2), pérdida auditiva no sindrómica autosómica recesiva, deterioro auditivo neurosensorial autosómico recesivo y Goiter, síndrome de Pendred, enfermedad de Alexander (AxD), síndrome de Ayerza, hipertensión arterial pulmonar familiar, variante B de la hexosaminidasa GM2 gangliosidosis, enfermedad de Sandhoff, trastorno relacionado con BANF, neurofibromatosis (cualquier tipo, por ejemplo, NF1, NF2, schwannomatosis), síndrome de Beare-Stevenson cutis gyrata, peritonitis paroxística benigna, síndrome de Benjamin, beta-talasemia, deficiencia de BH4, deficiencia de tetrahidrobiopterina, neurofibromatosis acústica bilateral, deficiencia de biotinidasa, cáncer de vejiga, trastornos hemorrágicos, trombofilia del factor V de Leiden, síndrome de Bloch-Sulzberger, incontinentia pigmenti, síndrome de Bloom, enfermedades óseas, enfermedad de Bourneville, esclerosis tuberosa, enfermedades cerebrales, enfermedad priónica, cáncer de mama, síndrome de Birt-Hogg-Dubé, enfermedad de los huesos frágiles, osteogénesis imperfecta, pulgar ancho-síndrome de Hallux, síndrome de Rubinstein-Taybi, diabetes bronceada, hemocromatosis, cirrosis bronceada, atrofia muscular bulboespinal, atrofia muscular espinal y bulbar ligada al cromosoma X, síndrome de Burger-Grutz, deficiencia de lipoproteína lipasa, síndrome familiar de CADASIL, trastorno granulomatoso crónico CGD, displasia campomélica, síndrome de la familia del cáncer, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, cáncer de mama, cáncer de vejiga, deficiencia de carboxilasa, deficiencia múltiple de biotinidasa de aparición tardía, síndrome del llanto de gato, síndrome cardiofacial de Caylor, deficiencia de ceramida trihexosidasa, angiomatosis cerebelorretiniana, enfermedad de von Hippel-Lindau familiar, arteriopatía cerebral, síndrome de CADASIL, arteriopatía cerebral autosómica dominante, síndrome de CADASIL, hiperamonemia cerebroatrófica, síndrome de Rett, síndrome de lipidosis por cerebrósidos, enfermedad de Charcot, síndrome de CHARGE, condrodistrofia, síndrome de condrodistrofia, condrodistrofia con sordera neurosensorial, displasia otospondilomegaepifisaria, condrogénesis imperfecta, síndrome de hiperuricemia con automutilación de coreoatetosis, síndrome de Lesch-Nyhan, galactosemia clásica, galactosemia, labio leporino y paladar hendido, síndrome de Stickler, cráneo en hoja de trébol con enanismo tanatofórico, displasia tanatofórica (por ejemplo, tipo 1 o tipo 2), síndrome de Coffin-Lowry (CLS), síndrome de Cockayne, síndrome de Coffin-Lowry, colagenopatía tipos II y XI, sin poliposis familiar, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, cáncer de colon familiar, poliposis adenomatosa familiar, cáncer colorrectal, deficiencia completa de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia completa de hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, neuropatía por compresión, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, enfermedad del tejido conectivo, síndrome facial por anomalía conotruncal, anemia de Cooley, beta-talasemia, enfermedad de almacenamiento de cobre, enfermedad de Wilson, enfermedad de transporte de cobre, enfermedad de Menkes, coproporfiria, coproporfiria hereditaria, deficiencia de coproporfirinógeno oxidasa, síndrome de Cowden, deficiencia de CPX, disartrosis craneofacial, síndrome de Crouzon, disostosis craneofacial, síndrome de Crouzon, enfermedad de Crohn, fibroestenosante, síndrome de Crouzon, síndrome de Crouzon con acantosis nigricans, síndrome crouzonodermoesquelético, síndrome crouzonodermoesquelético, síndrome de Cockayne (CS), síndrome de Cowden, síndrome de Curschmann-Batten-Steinert, síndrome cutis gyrata de Beare-Stevenson, síndrome de cutis gyrata Beare-Stevenson, deficiencia de D-glicerato deshidrogenasa, hiperoxaluria, primaria, síndrome de metáfisis moteada, displasia espondiloepimetafisaria, tipo Strudwick, demencia tipo Alzheimer (DAT), hipercalciuria genética, enfermedad de Dent, distrofia muscular (por ejemplo, tipos Duchenne y Becker), sordera con bocio, síndrome de Pendred, síndrome de sordera-retinitis pigmentosa, síndrome de Usher, enfermedad por deficiencia, fenilalanina hidroxilasa, enfermedades nerviosas degenerativas, síndrome de De Grouchy 1, síndrome de De Jerine-Sottas, porfiria por deficiencia de deltaaminolevulinato deshidratasa, demencia, síndrome de CADASIL, leucodistrofia desmielinógena, enfermedad de Alexander, síndrome de Ehlers-Danlos de tipo dermatoparáctico, dermatoparaxis, discapacidades del desarrollo hereditarias, neuropatía motora hereditaria distal (dHMN), neuropatía motora hereditaria distal (por ejemplo, DHMN-V), deficiencia de DHTR, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, esclerosis difusa del cuerpo globoide, enfermedad de Krabbe, síndrome de Di George, deficiencia del receptor de dihidrotestosterona, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, neuropatía motora hereditaria distal, distrofia miotónica (tipo 1 o tipo 2), atrofia muscular espinal distal (cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 4, tipo 5, tipo 6), distrofia muscular de Duchenne/Becker, enanismo (cualquier tipo, por ejemplo, acondroplásico, acondroplasia, displasia tanatofórica), síndrome de enanismo-atrofia retiniana-sordera, síndrome de Cockayne, leucodistrofia dismielinógena, enfermedad de Alexander, distrofia miotónica, distrofia retinae pigmentosa-síndrome de disostosis, síndrome de Usher, enfermedad de Alzheimer familiar de aparición temprana (EOFAD), enfermedad de Alzheimer (incluyendo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 o tipo 4) enfermedad de Ekman-Lobstein, osteogénesis imperfecta, neuropatía por atrapamiento, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, protoporfiria eritropoyética (EPP), anemia eritroblástica, beta-talasemia, protoporfiria eritrohepática, deficiencia de 5-aminolevulinato sintetasa eritroide, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, cáncer de ojo, retinoblastoma FA -ataxia de Friedreich, ataxia de Friedreich, FA, anemia de fanconi, lesiones y trastornos faciales, trombofilia del factor V de Leiden, FALS, esclerosis lateral amiotrófica, neuroma acústico familiar, poliposis adenomatosa familiar, enfermedad de Alzheimer familiar (FAD), esclerosis lateral amiotrófica familiar, esclerosis lateral amiotrófica, disautonomía familiar, hipertrigliceridemia familiar inducida por grasa, deficiencia de lipoproteína lipasa, familiar, hemocromatosis familiar, hemocromatosis, deficiencia de LPL familiar, deficiencia de lipoproteína lipasa, familiar, cáncer de colon familiar sin poliposis, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, poliserositis paroxística familiar, PCT familiar, porfiria cutánea tardía, neuropatía sensible a la presión familiar, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, hipertensión pulmonar primaria familiar (FPPH), leucoencefalopatía vascular familiar, síndrome de CADASIL, FAP, poliposis adenomatosa familiar, FD, disautonomía familiar, deficiencia de ferroquelatasa, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2A, tipo 2B, tipo 3, tipo 4, hemocromatosis neonatal, acaeruloplasminemia, atransferrinemia congénita, síndrome de fiebre periódica (síndrome grácil), fiebre mediterránea familiar (FMF), síndrome de FG, sinostosis coronal asociada a FGFR3, degeneración fibrinoide de astrocitos, enfermedad de Alexander, enfermedad fibroquística del páncreas, enfermedad de Folling, síndrome de fra(X), síndrome de X frágil, Fragilitas ossium, osteogénesis imperfecta, síndrome de FRAXA, ataxia de Friedreich (FRDA), deficiencia de G6PD, enfermedad por deficiencia de galactoquinasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de galactosa-1-fosfato uridil-transferasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de galactosilceramidasa, enfermedad de Krabbe, lipidosis de galactosilceramida, enfermedad de Krabbe, deficiencia de galactosilcerebrosidasa, lipidosis de galactosilesfingosina, deficiencia de GALC, deficiencia de GALT, galactosemia, enfermedad similar a Gaucher, enfermedad de pseudo-Gaucher, deficiencia de GBA, trastornos cerebrales genéticos, enfisema genético, hemocromatosis genética, hemocromatosis, hepatitis de células gigantes, neonatal, hemocromatosis neonatal, deficiencia de GLA, glioblastoma, retiniano, retinoblastoma, glioma, retiniano, retinoblastoma, leucodistrofia de células globoides (GCL, GLD), enfermedad de Krabbe, leucoencefalopatía de células globoides, deficiencia de glucocerebrosidasa, glucocerebrosidosis, lipidosis de glucosil cerebrósidos, deficiencia de glucosilceramidasa, deficiencia de glucosilceramida beta-glucosidasa, lipidosis de glucosilceramida, aciduria glicérica, hiperoxaluria primaria, encefalopatía por glicina, hiperglicinemia no cetósica, aciduria glicólica, hiperoxaluria primaria, gangliosidosis GM2, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de bocio-sordera, síndrome de Pendred, síndrome de Graefe-Usher, síndrome de Usher, síndrome de Gronblad-Strandberg, pseudoxantoma elástico, hemocromatosis, hemocromatosis, síndrome de Hallgren, síndrome de Usher, ictiosis tipo arlequín, enfermedad de Hb S, hipocondroplasia (HCH), coproporfiria hereditaria (HCP), malformaciones de la cabeza y el cerebro, trastornos auditivos y sordera, problemas de audición en niños, HEF2A, HEF2B, hematoporfiria, porfiria, deficiencia de hemo sintetasa, hemocromatosis, enfermedad de la hemoglobina M, metahemoglobinemia tipo betaglobina, enfermedad de la hemoglobina S, hemofilia, porfiria hepatoeritropoyética (HEP), deficiencia hepática de AGT, hiperoxaluria primaria, síndrome de degeneración hepatolenticular, enfermedad de Wilson, artro-oftalmopatía hereditaria, síndrome de Stickler, lipidosis distópica hereditaria, hemocromatosis hereditaria (HHC), hemocromatosis, telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT), miopatía hereditaria con cuerpos de inclusión, regeneración del músculo esquelético, anemia por carga de hierro hereditaria, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, neuropatía motora y sensorial hereditaria, neuronopatía motora hereditaria, tipo V, neuropatía motora hereditaria distal, exostosis múltiple hereditaria, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, síndrome de fiebre periódica hereditario, poliposis coli hereditaria, poliposis adenomatosa familiar, enfisema pulmonar hereditario, resistencia hereditaria a la proteína C activada, trombofilia del factor V de Leiden, neuropatía sensorial y autonómica hereditaria tipo III, disautonomía familiar, paraplejía espástica hereditaria, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil, ataxia espinal hereditaria, ataxia de Friedreich, esclerosis espinal hereditaria, ataxia de Friedreich, anemia de Herrick, OSMED heterocigoto, síndrome de Weissenbacher-Zweymuller, displasia otospondilomegaepifisaria heterocigota, síndrome de Weissenbacher-Zweymiller, deficiencia de HexA, enfermedad de Tay-Sachs, deficiencia de hexosaminidasa A, enfermedad de Tay-Sachs, deficiencia de la subunidad alfa de hexosaminidasa (cualquier variante, por ejemplo, variante A, variante B), enfermedad de Tay-Sachs, hemocromatosis asociada a HFE, hemocromatosis, HGPS, progeria, enfermedad de Hippel-Lindau, enfermedad de von Hippel-Lindau, hemocromatosis (HLAH), neuropatía motora hereditaria distal (HMN V), cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión (HNPP), homocistinuria, deficiencia de oxidasa de ácido homogentísico, acidura homogentísica, alcaptonuria, porfiria cutánea homocigótica tardía, porfiria hepatoeritropoyética, hiperoxaluria primaria (HP1), hiperoxaluria (HP2), hiperfenilalaninemia (HPA), HPRT -deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, síndrome de Lesch-Nyhan, HSAN tipo III, disautonomía familiar, disautonomía familiar (HSAN3), neuropatía sensorial hereditaria (cualquier tipo, por ejemplo, HSN-1, HSN-II, HSN-III), disautonomía familiar, dermatosparaxis humana, enfermedad de Huntington, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford, progeria, hiperandrogenismo, tipo no clásico debido a deficiencia de 21-hidroxilasa, hiperquilomicronemia, deficiencia de lipoproteína lipasa familiar, familiar, hiperglicinemia con cetoacidosis y leucopenia, acidemia propiónica, hiperlipoproteinemia tipo I, deficiencia de lipoproteína lipasa, hiperoxaluria familiar, hiperfenilalaninemia primaria, hiperfenilalaninemia, hiperfenilalaninemia, hipocondrodisplasia, hipocondroplasia, hipocondrogénesis, hipocondroplasia, anemia hipocrómica, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, deficiencia de hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), síndrome de Lesch-Nyhan, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil (IAHSP), síndrome ICF, inmunodeficiencia, inestabilidad del centrómero y síndrome de anomalías faciales, hemocromatosis idiopática, hemocromatosis, tipo 3, hemocromatosis neonatal idiopática, hemocromatosis, neonatal, hipertensión pulmonar idiopática, trastornos del sistema inmunitario, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, incontinencia pigmenti, enfermedad de Gaucher cerebral infantil, enfermedad de Gaucher infantil, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio en la infancia, infertilidad, enfisema hereditario, tendencia heredada a las parálisis por presión, neuropatía hereditaria con predisposición a las parálisis por presión, síndrome de Insley-Astley, displasia otospondilomegaepifisaria síndrome de porfiria aguda intermitente, porfiria intermitente aguda, síndrome de poliposis intestinal-pigmentación cutánea, síndrome de Peutz-Jeghers, incontinentia pigmenti (IP), trastorno de almacenamiento de hierro, hemocromatosis, isodicéntrico 15, isodicéntrico 15, sordera aislada, sordera no sindrómica, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Joubert, esclerosis lateral primaria juvenil (JPLS), esclerosis lateral amiotrófica juvenil, gota juvenil, coreoatetosis, síndrome de retraso mental, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de hiperuricemia juvenil, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Jackson-Weiss (JWS), atrofia muscular espinal y bulbar, enfermedad de Kennedy, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia muscular espinal y bulbar de Kennedy, atrofia muscular espinal y bulbar, histiocitosis de querasina, lipoidosis de querasina, tesaurismosis de querasina, glicinemia cetósica, acidemia propiónica, hiperglicinemia cetósica, acidemia propiónica, enfermedades renales, hiperoxaluria, primaria, displasia de Kniest, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Kugelberg-Welander, atrofia muscular espinal, demencia lacunar, síndrome de CADASIL, acondrogénesis de Langer-Saldino, displasia de Langer-Saldino, enfermedad de Alzheimer de inicio tardío, enfermedad de Krabbe de inicio tardío (LOKD), Enfermedad de Krabbe, trastornos del aprendizaje, discapacidad de aprendizaje, lentiginosis perioral, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofias, leucodistrofia con fibras de Rosenthal, enfermedad de Alexander, leucodistrofia espongiforme, síndrome de Li-Fraumeni (LFS), síndrome de Li-Fraumeni, deficiencia de lipasa D, deficiencia de lipoproteína lipasa, deficiencia familiar de LIPD, deficiencia de lipoproteína lipasa, lipidosis familiar, cerebrósido, lipidosis, gangliósido, infantil, enfermedad de Tay-Sachs, histiocitosis lipoide (tipo querasina), deficiencia de lipoproteína lipasa, enfermedades hepáticas familiares, galactosemia, enfermedad de Lou Gehrig, síndrome de Louis-Bar, ataxia telangiectasia, síndrome de Lynch, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, deficiencia de lisilhidroxilasa, enfermedad de Machado-Joseph, ataxia espinocerebelosa (cualquier tipo, por ejemplo, SCA1, SCA2, SCA3, SCA18, SCA20, SCA21, SCA23, SCA26, SCA28, SCA29), cáncer de mama masculino, cáncer de mama, trastornos genitales masculinos, neoplasia maligna de mama, cáncer de mama, tumor maligno de mama, cáncer de mama, tumor maligno de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, cáncer mamario, cáncer de mama, síndrome de Marfan, síndrome de Marker X, síndrome de X frágil, síndrome de Martin-Bell, síndrome de X frágil, síndrome de McCune-Albright, síndrome de McLeod, síndrome de MEDNIK, anemia mediterránea, beta-talasemia, enanismo megaepifisario, displasia otospondilomegaepifisaria, síndrome de Menkea, enfermedad de Menkes, enfermedad de Menkes, retraso mental con anomalías osteocartilaginosas, síndrome de Coffin-Lowry, trastornos metabólicos, enanismo metatrópico tipo II, displasia de Kniest, displasia metatrópica de tipo II, displasia de Kniest, metahemoglobinemia (cualquier tipo, por ejemplo, congénita, tipo betaglobina, metahemoglobinemia congénita tipo II), acidemia metilmalónica, síndrome de Marfan (MFS), MHAM, síndrome de Cowden, microsíndrome, microcefalia, MMA, acidemia metilmalónica, enfermedad de Menkes (también conocida como MK o MNK), síndrome de monosomía 1p36, enfermedad de neuronas motoras, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos del movimiento, síndrome de Mowat-Wilson, mucopolisacaridosis (MPS I), mucoviscidosis, demencia multiinfarto, síndrome de CADASIL, deficiencia de carboxilasa múltiple, inicio tardío, deficiencia de biotinidasa, síndrome de hamartoma múltiple, síndrome de Cowden, neurofibromatosis múltiple, distrofia muscular (cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, tipo Duchenne y Becker), miotonía atrófica, distrofia miotónica, miotonía distrófica, síndrome de Nance-Insley, displasia otospondilomegaepifisaria, condrodisplasia de Nance-Sweeney, displasia otospondilomegaepifisaria, NBIA1, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, síndrome de Neill-Dingwall, síndrome de Cockayne, neuroblastoma, retiniano, retinoblastoma, neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro tipo 1, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, enfermedades neurológicas, trastornos neuromusculares, neuronopatía motora hereditaria distal, Niemann-Pick, enfermedad de Niemann-Pick, síndrome de Noack, hiperglicinemia no cetósica, encefalopatía por glicina, enfermedad de Gaucher no neuropática, hiperfenilalaninemia no fenilcetonúrica, deficiencia de tetrahidrobiopterina, sordera no sindrómica, síndrome de Noonan, enfermedad norbottniana de Gaucher, ocronosis, alcaptonuria, artritis ocronótica, alcaptonuria, síndrome de Ogden, osteogénesis imperfecta (OI), enfermedad de Osler-Weber-Rendu, telangiectasia hemorrágica hereditaria, OSMED, displasia otospondilomegaepifisaria, osteogénesis imperfecta, osteopsiatirosis, osteogénesis imperfecta, osteoesclerosis congénita, displasia oto-espondilo-megaepifisaria, displasia otospondilomegaepifisaria, displasia otospondilomegaepifisaria, oxalosis, hiperoxaluria primaria, oxaluria primaria, hiperoxaluria primaria, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, síndrome de Patau (trisomía 13), deficiencia de PBGD, porfiria intermitente aguda, deficiencia de PCC, acidemia propiónica, porfiria cutánea tardía (PCT), enfermedad PDM, síndrome de Pendred, enfermedad periódica, fiebre mediterránea, peritonitis periódica familiar, síndrome de lentiginosis periorificial, síndrome de Peutz-Jeghers, trastornos nerviosos periféricos, disautonomía familiar, neurofibromatosis periférica, atrofia muscular peronea, deficiencia de alanina:glioxilato aminotransferasa peroxisomal, hiperoxaluria, síndrome de Peutz-Jeghers primario, enfermedad por deficiencia de fenilalanina hidroxilasa, feocromocitoma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Pierre Robin con condrodisplasia fetal, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, cirrosis pigmentaria, hemocromatosis, síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa (PKAN), PKU, fenilcetonuria, plumboporfiria, porfiria por deficiencia de ALA, PMA, enfermedad renal poliquística, displasia fibrosa poliostótica, síndrome de McCune-Albright, poliposis adenomatosa familiar, poliposis intestinal hamartomatosa, síndrome de pólipos y manchas, síndrome de Peutz-Jeghers, deficiencia de porfobilinógeno sintasa, porfiria por deficiencia de ALA, trastorno de porfirina, deficiencia de PPDX, porfiria variegata, síndrome de Prader-Labhart-Willi, síndrome de Prader-Willi, demencia presenil y senil, discinesia ciliar primaria (PCD), hemocromatosis primaria, hemocromatosis, síndrome de hiperuricemia primaria, síndrome de Lesch-Nyhan, demencia degenerativa senil primaria, procolágeno tipo EDS VII, mutante, progeria, síndrome de progeria de Hutchinson Gilford, síndrome tipo progeria, síndrome de Cockayne, nanismo progeroide, síndrome de Cockayne, corea progresiva, hereditaria crónica (Huntington), enfermedad de Huntington, osteogénesis imperfecta progresivamente deformante con esclerótica normal, osteogénesis imperfecta (cualquier tipo, por ejemplo, tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V, tipo VI, tipo VII, tipo VIII), distrofia miotónica proximal (PROMM), acidemia propiónica, deficiencia de propionil-CoA carboxilasa, deficiencia de proteína C, deficiencia de proteína S, protoporfiria, deficiencia de protoporfirinógeno oxidasa, porfiria variegata, distrofia miotónica proximal, distrofia miotónica tipo 2, miopatía miotónica proximal, enfermedad de pseudo-Gaucher, pseudoxantoma elástico, psicosina lipidosis, enfermedad de Krabbe, hipertensión pulmonar arterial, hipertensión pulmonar, pseudoxantoma elástico (PXE), pseudoxantoma elástico, retinoblastoma (Rb), enfermedad de Recklinghausen, poliserositis recurrente, trastornos retinianos, síndrome de retinitis pigmentosa-sordera, síndrome de Usher, retinoblastoma, síndrome de Rett, RFALS tipo 3, síndrome de Ricker, síndrome de Riley-Day, disautonomía familiar, síndrome de Roussy-Levy, síndrome de Rubinstein-Taybi (RSTS), síndrome de Rett (RTS), síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sack-Barabas, enfermedad, de SADDAN, síndrome de la familia del sarcoma de Li y Fraumeni, síndrome de Li-Fraumeni, síndrome de SBLA (sarcoma, mama, leucemia y síndrome de la glándula suprarrenal), síndrome de Li-Fraumeni, atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), schwannoma, acústico, bilateral, tipo neurofibromatosis II, síndrome de Schwartz-Jampel, inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (SCIDX1), SED congénita, displasia espondiloepimetafisaria congénita, SED Strudwick, displasia espondiloepimetafisaria, tipo Strudwick, displasia espondiloepimetafisaria congénita (SEDc), displasia espondiloepimetafisaria (SEMD), SEMD tipo Strudwick, demencia senil, acondroplasia grave con retraso del desarrollo y acantosis nigricans, enfermedad de SADDAN, síndrome de Shprintzen, síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X de Siderius provocado por mutaciones en el gen PHF8, síndrome esqueleto-piel-cerebro, trastornos de la pigmentación de la piel, atrofia muscular espinal (SMA), displasia espondilo-meta-epifisaria (SMED) (cualquier tipo, por ejemplo, tipo Studwick, tipo 1), síndrome de Smith-Lemli-Opitz, síndrome de Smith Magenis, porfiria genética sudafricana, parálisis espástica ascendente de inicio infantil, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil, trastornos del habla y la comunicación, esfingolipidosis, Tay-Sachs, enfermedad de Tay-Sachs, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinal, tipo V distal, neuropatía motora hereditaria distal, atrofia muscular espinal distal con predominio de las extremidades superiores, neuropatía motora hereditaria distal, ataxia espinocerebelosa, displasia espondiloepifisaria congénita, displasia espondiloepifisaria, colagenopatía (cualquier tipo, por ejemplo, tipos II y XI), displasia espondiloepimetafisaria, displasia espondiloepimetafisaria (SMD), displasia espondiloepimetafisaria, degeneración esponjosa del sistema nervioso central, degeneración esponjosa del cerebro, degeneración esponjosa de la materia blanca en la infancia, hipertensión pulmonar primaria esporádica, síndrome de SSB, síndrome del cabello acerado, enfermedad de Menkes, enfermedad de Steinert, distrofia miotónica, síndrome de distrofia miotónica de Steinert, distrofia miotónica, síndrome de Stickler, ataque cerebral, síndrome de CADASIL, síndrome de Strudwick, enfermedad de Gaucher neuronopática subaguda, porfiria genética sueca, porfiria intermitente aguda, porfiria intermitente aguda, displasia del cartílago de queso suizo, displasia de Kniest, enfermedad de Tay-Sachs, TD - enanismo tanatofórico, displasia tanatofórica, TD con fémur recto y cráneo en trébol, displasia tanatofórica tipo 2, telangiectasia, cerebelooculocutánea, ataxia telangiectasia, síndrome de feminización testicular, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, deficiencia de tetrahidrobiopterina, síndrome de feminización testicular (TFM), síndrome de insensibilidad a los andrógenos, talasemia intermedia, beta-talasemia, talasemia mayor, beta-talasemia, displasia tanatofórica, trombofilia debida a deficiencia del cofactor de la proteína C activada, tipo Leiden, trombofilia por factor V de Leiden, enfermedad de tiroides, neuropatía tomaculosa, neuropatía hereditaria con propensión a parálisis por presión, deficiencia total de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia total de hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Treacher Collins, trias fragilitis ossium, síndrome de triple X, síndrome de Triplo X, trisomía 21, trisomía X, síndrome de Troisier-Hanot-Chauffard, hemocromatosis, enfermedad de Tay-Sachs (TSD), complejo de esclerosis tuberosa (TSC), esclerosis tuberosa, síndrome similar a Tumer, síndrome de Noonan, enfermedad por deficiencia de UDP-galactosa-4-epimerasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de UDP glucosa 4-epimerasa, galactosemia, deficiencia de UDP glucosa hexosa-1-fosfato uridililtransferasa, galactosemia, sordera indiferenciada, sordera no sindrómica, deficiencia de UPS, porfiria aguda intermitente, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, deficiencia de UROD, deficiencia de uroporfirinógeno descarboxilasa, deficiencia de uroporfirinógeno sintasa, porfiria aguda intermitente, síndrome de Usher, deficiencia de UTP hexosa-1-fosfato uridililtransferasa, galactosemia, síndrome de Van Bogaert-Bertrand, síndrome de Van der Hoeve, síndrome velocardiofacial, síndrome de VHL, enfermedad de von Hippel-Lindau, deficiencia visual y ceguera, síndrome de Alstrom, enfermedad de Von Bogaert-Bertrand, enfermedad de von Hippel-Lindau, enfermedad de Von Recklenhausen-Applebaum, hemocromatosis, enfermedad de von Recklinghausen, neurofibromatosis tipo I, enfermedad de Vrolik, osteogénesis imperfecta, síndrome de Waardenburg, síndrome de Warburg Sjo Fledelius, Micro síndrome, enfermedad de Wilson (WD), síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, atrofia muscular espinal, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wilson, síndrome de Wolf-Hirschhom, enfermedad periódica de Wolff, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller (WZS), xeroderma pigmentoso, retraso mental y macroorquidismo ligados al cromosoma X, síndrome de X frágil, hiperuricemia primaria ligada al cromosoma X, síndrome de Lesch-Nyhan, Inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, atrofia muscular espinal-bulbar ligada al cromosoma X, atrofia muscular espinal y bulbar, defecto de la enzima aciduria úrica ligada al cromosoma X, síndrome de Lesch-Nyhan, X-SCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica ligada a X (XLSA), X-SCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X (XLSA), XSCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, síndrome XXX, síndrome triple X, síndrome XXXX, síndrome XXXXX, XXXXX, síndrome XXY, trisomía XXY, síndrome de Klinefelter, síndrome XYY, trastornos de repetición de tripletes o cualquier combinación de los mismos.

En realizaciones, un modulador de control postranscripcional específico es el objetivo para la modulación, modificación, mejora o disminución de la actividad mediante la administración de un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición genómica. Por ejemplo, los moduladores del control postranscripcional pueden incluir PARN, PAN, CPSF, CstF, PAP, PABP, PAB2, C^fI, CFII, ARN trifosfatasa, ARN gluaniltransferasa, ARN metiltransferasa, SAM sintasa, enzima conjugadora de ubiquitina E2R, proteínas SR SFRS1 a través de SFR11, proteínas hnRNP (por ejemplo, HNRNPAO, HNRNPA1, HNRNPA1L1, HNRNPA1L2, HNRNPA2, HNRNPA2B1, HNRNPAB, HNRNPB 1, HNRNPC, HNRNPCL1, HNRNPD, HNRPDL, HNRNPF, HNRNHP1, HNRNPH2, HNRNPH3, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPLL, HNRNPM, HNRNPR, HNRNPU, HNRNPUL1, HNRNPUL2, HNRNPUL3, ADAR, Mex 67, Mtr2, Nab2, helicasa de Dead-box, elF4A, elF4B, elF4E, elF4G, GEF, GCN2, PKR, HRI, PERK, eEF1, eEF2, GCN, eRF3, proteínas de unión específica a ARE, EXRN1, DCP1, DCP2, RCK/p54, CPEB, eIF4E, microARNAs y ARNip, DICER, proteínas Ago, proteínas de descomposición del ARNm mediadas por antisentido, UPF3A, UPF3BeIF4A3, MLN51, Y14/MAGOH, MG-1, SMG-5, SMG-6, SMG-7, o cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, las rutas genéticas asociadas con el ciclo celular se modulan, potencian o disminuyen en actividad mediante la administración de un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición genómica. Las vías y genes ejemplares asociados con el ciclo celular incluyen ATM, PMS2, FAS-L, MRE11, MLH1, FasR, NBS1, MSH6, Trail-L, RAD50, MSH2, Trail-R, 53BP1, RFC, TNF-Ct, P53, PCNA, TNF-R1, CHKE, MSH3, FADD, E2F1, MutS, homólogo, TRADD, ^pM^l, MutL, homólogo, R1P1, FANCD2, exonucleasa, MyD88, SMC1, ADN, polimerasa, delta, IRAK, BLM1, (POLD1, POLD2, POLD3, NIL, b RcA1 y POLD4, -genes, IKK, H2AX, codificantes, subunidades), NFKp, ATR, topoisomerasa, 1, kpa, RPA, topoisomerasa, 2, IAP, ATRIP, ARNsaHl, Caspasa, 3, RAD9, Ligasa, 1, Caspasa, 6, RAD1, DⁿA, polimerasa, 1, Caspasa, 7, ^hU^s, DNA, polimerasa, 3, Caspasa, 8, RAD17, Primasa, Caspasa, 10, RFC, Helicasa, HDAC1, Ch K1, cadena sencilla, de unión, HDAC2, TLK1, proteínas, Citocromi, C, CDC25, Bxl-xL, STAT3, STAT5, DFF45, Vcl-2, ENDO-G, PI3K, Akt, Calpaina, Bad, Bax, proteolísis mediada por ubiquitina, Hipoxia, proliferación celular, HIF-loc, MAPK, E1, HerC1, TRAF6, HIFIp, MAPKK, E2, UBE2Q, MEKK1, Refl, MAPKKK, E3, UBE2R, COP!, HSP90, c-Met, UBLE1A, UBE2S, PIFH2, VEGF, HGF, UBLE1B, UBE2U, clAP, PAS, ER, Sl/2, UBLEIC, UBE2W, PIAS, ARNT, ATK, UBE2A, UBE2Z, SYVN, VHL, PKCs, UBE2B, AFC, LLC, N, NHLRC1, HLF, Paxilin, UBE2C, UBE1, AIRE, EPF, FAK, UBE2A, E6AP, MGRN1, VDU2, Adducina, UBE2E, UBE3B, BRCA1, SUMORESUME, PYK1, UBE2F, Smurf, FANCL, SENP1, RB, UBE2G1, Itch, MIDI, Calcineurina, A, RBI, UBE2G2, HERC2, Cdc20, RACK1, Raf-1, UBE2I, HERC3, Cdhl, PTB, A-Raf, UBE2J1, HERC4, Apcl, Hur, Braf, UBE2J2, UBE4A, Apc2, PHD2, MEK1/2, UBE2L3, UBE4B, Apc3, SSAT2, ERK1/2, UBE2L6, CHIP, Apc4, SSAT1, Ets, UBE2M, CYC4, Apc5, GSK3, Elkl, UBE2N, PPR19, Apc6, CBP, SAP1, UBE20, UIP5, Apc7, FOX04, cPLA2, WWPI, Mdm2, Apc8, F1H-1, WWP2, Parkin, Apc9, TRIP, 12, Trim32, Mono, 10, NEED4, Trim37, Mono, 11, ARF-BP1, SIAH-1, Mono, 12, EDD1, PML, Célula, supervivencia, célula, ciclo, detener, SMADI, P21, SMAD5, BAX, SAMD8, MDR, LEF1, DRAIL, IGFBP3, TCF3, GADD45, TCF4, P300, HAT1, PI3, Akt, GF1, o cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, los genes asociados con la angiogénesis se modulan, potencian o disminuyen en actividad mediante la administración de un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, y un sistema de edición genómica a una célula o células. Los genes y rutas genéticas ejemplares asociados con la angiogénesis y las condiciones relacionadas con la angiogénesis incluyen VEGF, VEGFR2, SHC, E2F7, VEGFB, VEGFR3, PI3, VEGFC, Nrp 1, PIP3, EGFDIP3, DAG, GRB2, SOS, Akt, PB, PKC, Ras, RAF1, DAG, eNOS, NO, ERK1, ER2, cPLA2, ME1, MEK2, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las rutas genéticas y/o los genes asociados con la función mitocondrial se modulan, potencian o disminuyen en actividad mediante la administración de un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición genómica a una célula o células. Los genes y las rutas genéticas ejemplares asociados con la función mitocondrial incluyen malato deshidrogenasa aminotransferasa, hidratasa, desacilasa, deshidrogenasa, carboxilasa, mutasa, oxidación de ácidos grasos Oxidación de leucina Trastornos de isoleucina (deficiencias de la vía de oxidación de la ruta enzimática) Aminotransferasa Aminotransferasa, OCTN2 Cadena ramificada Cadena ramificada, FATP1-6 aminotransferasa 2, aminotransferasa 2, CPT-1 mitocondrial mitocondrial, CACT Isobutytyl-CoA 2-metilbutitil-CoA, CPT-II deshidrogenasa Deshidrogenasa, SCAD (cadena ramificada (cadena ramificada, MCAD cetoácido cetoácido, VLCAD deshidrogasa deshidrogenasa, complejo ETF-DH) Complejo), Alfa-ETF Hidratasa Hidratasa, Beta-ETF HMG-CoA liasa 2-metil-3-OH-SCHAD butiril-CoA, LCHAD deshidrogenasa, MTP 3-oxotiolasa, LKAT, DECR 1, HMGCS2, HMGCL o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, se modulan, potencian o disminuyen en actividad las rutas genéticas y/o los genes asociados con el daño del ADN o la inestabilidad genómica. Los genes y las rutas genéticas ejemplares asociados con rutas y/o genes relacionados con el daño del ADN y la inestabilidad genómica incluyen 53BP1, BLM, MBD2, DNA, ligase, 4, MDC1, H2AX, XLF, SMC1, 53BP1, Rad50, P53, P53, Artemis, Rad27, TdT, APE1, PMS2, APE2, UvrA, RecA, MLH1, NEIL1, UvrB, SSB, MSH6, NEIL2, UvrC, Mrell, MSH2, NEIL3, XPC, Rad50, RFC, XRCC1, Rad23B, Nbsl, PCNA, PNKP, CEN2, CtIP, MSH3, Tdpl, DDB1, RPA, MutS, APTX, XPE, Rad51, MutL, ADN, polimerasa p CSA, Rad52, ADN polimerasa 5, CSB, Rad54, topoisomerasa, 1, ADN, TFT1H, BRCA1, topoisomerasa, 2, ^pCⁿA, X^pB, BRCA2, RNAsaH1, F^eN1, X^pD, Exol, Ligasa 1, RFC, XPA, B^lM, ADN, polimerasa, 1, PAR, 1, RPA, Topllla, ANA, Ligl, XPG, GEN1, Primasa, Lig3, ERCC1 Yenl Helicasa, UNG, XPF, Slxl, SSBs, MUTYDNA polimerasa 5, Slx4, SMUG DNA polimerasa £, Mus8, MBD4, Emel, Dssl, ASH1L, SETD4, DQT1L, SETD5, EHMT1, SETD6, EHMT2, SETD7, EZH1, SETD8, EZH2, SETD9, MLL, SETDB1, MLL2, SETDB2, MLL3, SETMAR, MLL4, SMYD, 1, MLL5, SMYD2, NSD, 1, SMYD3, PRDM2, SMYD4, SET, SMYD5, SETBP1, SUV39H1, SETD 1A, SUV39H2, SEt D 1B, SUV420H1, SETD2, SUV420 H2, SETD3, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, los genes que codifican factores de transcripción de mamíferos se modulan, potencian, disminuyen o proporcionan a una célula. Los factores de transcripción humanos ejemplares incluyen AFF4, AFF3, AFF2, AFF1, AR, TFAP2B, TFAP2D, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, JARID2, KDM5D, ARID4A, ARID4B, KDM5A, ARID3A, KDM5B, KDM5C, ARID5B, ARID3B, ARID2, ARID5A, ARID3C, ARID1A, ARID1B, HIF1A, NPAS1, NPAS3, NPAS4, MLXIPL, ARNTL2, MXD1, AHRR, TFE3, HES2, MNT, TCF3, SREBF1, TFAP4, TCFL5, LYL1, USF2, TFEC, AHR, MLX, MYF6, MYF5, SIM1, TFEB, HAND1, HES1, ID2, MYCL1, ID3, TCF21, MXI1, SOHLH2, MYOG, TWIST 1, NEUROG3, BHLHE41, NEUROD4, MXD4, BHLHE23, TCF15, MAX, ID 1, MYOD 1, ARNTL, BHLHE40, MYCN, CLOCK, HEY2, MYC, ASCL1, TCF12, ARNT, HES6, FERD3L, MSGN1, USF1, TALI, NEUROD1, TCF23, HEYL, HAND2, NEUROD6, HEY1, SOHLH1, MESP1, PTF1A, ATOH8, NPAS2, NEUROD2, NHLH1, ID4, ATOH1, ARNT2, HES3, MLXIP, ASCL3, KIAA2018, OLIG3, NHLH2, NEUROG2, MSC, HES7, ATOH7, BHLHA15, BHLHE22, NEUROG1, FIGLA, ASCL2, OLIG1, TAL2, MITF, SCXB, HELT, ASCL4, MESP2, HES4, SCXA, TCF4, HES5, SREBF2, BHLHA9, OLIG2, MXD3, TWIST2, LOC388553, C13orf38-SOHLH2, CEBPE, XBP1, BATF3, CREB5, CEBPG, ATF3, ATF7, CEBPB, CEBPD, CEBPA, CBFB, CAMTA2, CAMTA1, EBF4, EBF3, EBF1, EBF2, NR2F6, NR2F1, NR2F2, GRHL2, TFCP2L1, GRHL1, TFCP2, UBP1, GRHL3, YBX2, CSDE1, CSDA, YBX1, LIN28A, CARHSP1, CSDC2, LIN28B, NFIX, NFIC, NFIB, NFIA, CUX2, ONECUT2, CUX1, ONECUT 1, SATB 1, ONECUT3, SATB2, DMRT3, DMRT1, DMRTC2, DMRTA2, DMRTB1, DMRT2, DMRTA1, E2F2, E2F1, E2F3, TFDP2, E2F8, E2F5, E2F7, E2F6, TFDP3, TFDP1, E2F4, NR1H3, NR1H2, ETV1, ETV7, SPI1, ELF4, ETV2, ERF, ELF2, ELK3, ETV3, ELF1, SPDEF, ELK1, ETS1, EHF, ELF5, ETV6, SPIB, FLI1, GABPA, ERG, ETS2, ELK4, ELF3, FEV, SPIC, ETV4, ETV5, FOXN3, FOXC1, FOXJ2, FOXF1, FOXN1, FOXM1, FOXP1, FOX03, FOXA2, FOXP2, FOXJ1, FOXP4, FOXF2, FOXN4, FOXK2, FOXO1, FOXH1, FOXQ1, FOXK1, FOXI1, FOXD4, FOXA3, FOXN2, FOXB1, FOXG1, FOXR1, FOXL1, FOXC2, FOXE1, FOXS1, FOXL2, FOX04, FOXD4L1, FOXD4L4, FOXD2, FOXI2, FOXE3, FOXD3, FOXD4L3, FOXR2, FOXJ3, FOX06, FOXB2, FOXD4L5, FOXD4L6, FOXD4L2, KIAA0415, FOXA1, FOXP3, GCM2, GCM1, NR3C1, GTF2IRD1, GTF2I, GTF2IRD2B, GTF2IRD2, SOX8, SOX30, PMS1, CIC, TCF7, TOX4, SOX10, HMGXB4, HBP1, TFAM, UBTF, WHSC1, SOX6, HMGXB3, BBX, TOX2, SOX4, SOX21, SOX9, SOX15, SOX5, SOX3, LEF1, HMG20A, SOX13, TCF7L2, SSRP1, TCF7L1, SOX17, SOX14, PINX1, SOX7, SOX11, SOX12, SOX2, SOX1, SRY, SOX18, UBTFL1, UBTFL2, TOX, HMGB1, HMGB2, PBRM1, TOX3, SMARCE1, HMG20B, HMGB3, HMGA2, HMGA1, ARX, HOXA11, MEOX1, DLX6, ISL1, HOXC8, BARX2, ALX4, GSC2, DLX3, PITX1, HOXA9, HOXA10, LHX5, LASS4, ZFHX4, SIX4, VSX1, ADNP, RHOXF1, MEIS3, PBX4, DLX5, HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA5, HOXA6, HOXA13, EVX1, NOBOX, MEOX2, LHX2, LHX6, LHX3, TLX1, PITX3, HOXB6, HNF1B, DLX4, SEBOX, VTN, PHOX2B, NKX3-2, DBX1, NANOG, IRX4, CDX1, TLX2, DLX2, VAX2, PRRX1, TGIF2, VSX2, NKX2-3, HOXB8, HOXB5, HOXB7, HOXB3, HOXB1, MSX2, LHX4, HOXA7, HOXC13, HOXC11, HOXC12, ESX1, BARHL1, NKX2-4, NKX2-2, SIX1, HOXD1, HOXD3, HOXD9, HOXD 10, HOXD11, HOXD13, MNX1, CDX4, BARX1, RHOXF2, LHX1, GSC, MEIS2, RAX, EMX1, NKX2-8, NKX2-1, HLX, LMX1B, SIX3, LBX1, PDX1, LASS5, ZFHX3, BARHL2, LHX9, LASS2, MEIS1, DLX1, HMBOX1, ZEB1, VAX1, NKX6-2, VENTX, HHEX, TGIF2LX, LASS3, ALX3, HOXB13, IRX6, ISL2, PKNOX1, LHX8, LMX1A, EN1, MSX1, NKX6-1, HESX1, PITX2, TLX3, EN2, UNCX, GBX1, NKX6-3, ZHX1, HDX, PHOX2A, PKNOX2, CDX2, DRGX, NKX3-1, PBX3, PRRX2, GBX2, SHOX2, GSX1, HOXD4, HOXD12, EMX2, IRX1, IRX2, SIX2, HOXB9, HOPX, OTP, LASS6, HOXC5, HOXB2, RAX2, EVX2, ZHX3, PROP1, ISX, HOXD8, TGIF2LY, IRX5, SIX5, TGIF1, IRX3, ZHX2, LBX2, NKX2-6, ALX1, GSX2, HOXC9, HOXC10, HOXB4, NKX2-5, SIX6, MIXL1, DBX2, PBX1, SHOX, ARGFX, HMX3, HMX2, BSX, HOXA4, DMBX1, HOXC6, HOXC4, RHOXF2B, PBX2, DUXA, DPRX, LEUTX,, NOTO, HOMEZ, HMX1, DUX4L5, DUX4L2, DUX4L3, DUX4L6, NKX1-1, NF1A, HSF4, HSFY2, HSFX1, HSFX2, HSFY1, HSF1, LCORL, LCOR, IRF6, IRF1, IRF3, IRF5, IRF4, IRF8, IRF2, IRF7, IRF9, MBD3, BAZ2B, MBD4, SETDB2, MBD1, MECP2, SETDB1, MBD2, BAZ2A, SMAD7, SMAD5, SMAD9, SMAD6, SMAD4, SMAD3, SMAD1, SMAD2, ZZZ3, RCOR1, CDC5L, MYBL2, DNAJC2, TADA2A, RCOR3, MYB, TERF2, DMTF1, DNAJC1, NCOR1, TERF1, MIER3, MYSM1, SNAPC4, RCOR2, TADA2B, MYBL1, TERF1P2, NCOR2, CCDC79, SMARCC1, SMARCC2, TTF1, 1 lorf9, NFYA, NFYC, NFYB, NRF1, NR4A3, NR4A1, NR4A2, ESR1, NROB2, NR0B1, PREB, EAF2, SPZ1, TP63, TP73, TP53, PAX6, PAX7, PAX2, PAX4, PAX8, PAX1, PAX3, PAX5, PAX9, SUB1, POU2F2, POU1F1, POU4F3, POU6F2, POU2F3, POU2F 1, POU4F2, POU4F1, POU6F1, POU3F2, POU3F1, POU3F4, POU3F3, POU5F1, POU5F1B, PPARD, PPARG, PPARA, PGR, PROX1, PROX2, NR2E1, NR5A2, NR2C1, NR5A1, NR6A1, ESRRA, NR2C2, RFX3, RFX2, RFX4, RFX1, RFX5, RFX7, RFX6, RFX8, NFATC3, NFKB2, NFATC4, NFATC2, NFAT5, RELB, NFKB1, NFATC1, REL, RELA, RORA, RORC, NR1D2, RORB, RUNX3, RUNX1, SP100, SP140, GMEB2, SP110, AIRE, GMEB1, DEAF1, SP140L, LOC729991-MEF2B, MEF2A, SRF, MEF2D, MEF2B, STAT1, STAT5A, STAT4, STAT6, STAT3, STAT2, STAT5B, TBX21, TBX5, TBX15, TBX18, TBX2, TBX4, TBX22, TBX3, TBR1, TBX19, TBX6, EOMES, T, TBX20, TBX10, MGA, TBX1, TEAD3, TEAD2, TEAD1, TEAD4, CREBL2, NFE2L3, CREB3L3, FOSL2, NFE2L1, CREM, DBP, CREB3, HLF, BACH2, ATF2, NFE2L2, ATF6, CREB1, ATF1, NFE2, FOSB, ATF4, NRL, JUND, JDP2, CREB3L4, BATF, BACH1, CREB3L1, NFIL3, TEF, BATF2, ATF5, FOS, JUNB, DDIT3, FOSL1, JUN, MAF, CREB3L2, MAFA, MAFF, MAFG, MAFK, MAFB, ATF6B, CRX, OTX1, OTX2, THAP3, THAP10, THAP1, PRKRIR, THAP8, THAP9, THAP11, THAP2, THAP6, THAP4, THAP5, THAP7, NR1H4, NR2E3, RARB, HNF4A, VDR, ESRRB, THRA, NR1D1, RARA, ESR2, NR1I3, NR1I2, THRB, NR3C2, HNF4G, RARG, RXRA, ESRRG, RXRB, TSC22D1, TSC22D3, TSC22D4, TSC22D2, TULP3, TULP2, TULP1, TULP4, TUB, ZBTB33, ZBTB32, ZBTB11, MYNN, ZBTB25, PATZ1, ZBTB16, ZBTB24, BCL6, ZBTB47, ZBTB17, ZBTB45, GZF1, ZBTB1, ZBTB46, ZBTB8A, ZBTB7B, BCL6B, ZBTB49, ZBTB43, HIC2, ZBTB26, ZNF131, ZNF295, ZBTB4, ZBTB34, ZBTB38, HIC1, ZBTB41, ZBTB7A, ZNF238, ZBTB42, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB40, ZBTB7C, ZBTB37, ZBTB3, ZBTB6, ZBTB44, ZFP161, ZBTB12, ZBTB48, ZBTB10, ZBED4, ZBED3, ZBED2, C11orf95, ZBED1, IKZF5, ZNF821, ZNF451, ZNF195, ZFX, ZNF263, ZNF200, HIVEP2, WIZ, ZNF582, SNAI2, ZFP64, IKZF2, ZIC2, ZNF800, PRDM1, PRDM6, ZFP112, ZNF275, ZNF76, ZFAT, KLF6, ZFY, ZXDC, GLI2, ZNF532, ZNF37A, ZNF510, ZNF506, ZNF324, ZNF671, ZNF416, ZNF586, ZNF446, ZNF8, ZNF264, REST, MECOM, ZNF213, ZNF343, ZNF302, ZNF268, ZNF10, HIVEP1, ZNF184, MZF1, SALL4, ZNF516, KLF8, KLF5, ZNF629, ZNF423, CTCF, ZNF500, ZNF174, SALL1, MAZ, ZNF419, OVOL3, ZNF175, ZNF14, ZNF574, ZNF85, SP4, ZKSCAN1, GLI3, GLIS3, KLF3, PRDM4, GLI1, PRDM13, ZNF142, PRDM2, ZNF684, ZNF541, KLF7, PLAGL1, ZNF430, KLF12, KLF9, ZNF410, BCL11A, EGR1, ZFP30, TSHZ3, ZNF549, ZSCAN18, ZNF211, ZNF639, ZSCAN20, GTF3A, ZNF205, ZNF644, EGR2, IKZF4, CTCFL, ZNF831, SNAI1, ZNF576, ZNF45, TRERF1, ZNF391, RREB1, ZNF133, OVOL2, ZNF436, PLAGL2, GLIS2, ZNF384, ZNF484, HIVEP3, BCL11B, KLF2, ZNF780B, FEZF1, KLF16, ZSCAN10, ZNF557, ZNF337, PRDM12, ZNF317, ZNF426, ZNF331, ZNF236, ZNF341, ZNF227, ZNF141, ZNF304, ZSCAN5A, ZNF132, ZNF20, EGR4, ZNF670, VEZF1, KLF4, ZFP37, ZNF189, ZNF193, ZNF280D, PRDM5, ZNF740, ZIC5, ZSCAN29, ZNF710, ZNF434, ZNF287, ZIM3, PRDM15, ZFP14, ZNF787, ZNF473, ZNF614, PRDM16, ZNF697, ZNF687, OSR1, ZNF514, ZNF660, ZNF300, RBAK, ZNF92, ZNF157, ZNF182, ZNF41, ZNF711, PRDM14, ZNF7, ZNF214, ZNF215, SALL3, ZNF827, ZNF547, ZNF773, ZNF776, ZNF256, ZSCAN1, ZNF837, PRDM8, ZNF117, ZIC1, FEZF2, ZNF599, ZNF18, KLF10, ZKSCAN2, ZNF689, ZIC3, ZNF19, ZSCAN12, ZNF276, ZNF283, ZNF221, ZNF225, ZNF230, ZNF222, ZNF234, ZNF233, ZNF235, ZNF362, ZNF208, ZNF714, ZNF394, ZNF333, ZNF382, IKZF3, ZNF577, ZNF653, ZNF75A, GFI1, ZNF281, ZNF496, ZNF2, ZNF513, ZNF148, KLF15, ZNF691, ZNF589, PRDM9, ZNF12, SP8, OSR2, ZNF367, ZNF22, GFI1B, ZNF219, SALL2, ZNF319, ZNF202, ZNF143, ZNF3, ZSCAN21, ZNF606, SP2, ZNF91, ZNF23, ZNF226, ZNF229, ZNF180, ZNF668, ZNF646, ZNF641, ZNF610, ZNF528, ZNF701, ZNF526, ZNF146, ZNF444, ZNF83, ZNF558, ZNF232, E4F1, ZNF597, INSM2, ZNF30, ZNF507, ZNF354A, ZEB2, ZNF32, KLF13, ZFPM2, ZNF764, ZNF768, ZNF35, ZNF778, ZNF212, ZNF282, PRDM10, SP7, SCRT1, ZNF16, ZNF296, ZNF160, ZNF415, ZNF672, ZNF692, ZNF439, ZNF440, ZNF581, ZNF524, ZNF562, ZNF561, ZNF584, ZNF274, ZIK1, ZNF540, ZNF570, KLF17, ZNF217, ZNF57, ZNF556, ZNF554, KLF11, HINFP, ZNF24, ZNF596, OVOL1, SP3, ZNF621, ZNF680, BNC2, ZNF483, ZNF449, INSM1, ZNF417, ZNF791, ZNF80, GLIS1, ZNF497, KLF14, ZNF266, ZIC4, ZNF408, ZNF519, ZNF25, ZNF77, ZNF169, ZNF613, ZNF683, ZNF135, ZSCAN2, ZNF575, ZNF491, ZNF620, ZNF619, ZNF354C, ZNF114, ZNF366, ZNF454, ZNF543, ZNF354B, ZNF223, ZNF713, ZNF852, ZNF552, ZFP42, ZNF664, EGR3, ZFPM1, ZNF784, ZNF648, FIZ1, ZNF771, TSHZ1, ZNF48, ZNF816, ZNF571, ZSCAN4, ZNF594, ZFP3, ZNF443, ZNF792, ZNF572, ZNF707, ZNF746, ZNF322A, ZNF467, ZNF678, ZFP41, HKR1, PLAG1, ZNF329, ZNF101, ZNF716, ZNF708, ZSCAN22, ZNF662, ZNF320, ZNF623, ZNF530, ZNF285, ZFP1, WT1, ZFP90, ZNF479, ZNF445, ZNF74, SP1, SNAI3, ZNF696, IKZF1, ZNF267, ZNF566, ZNF224, ZNF529, ZNF284, ZNF749, ZNF17, ZNF555, ZNF75D, ZNF501, ZNF197, ZNF396, ZFP91, ZNF732, ZNF397, ZSCAN30, ZNF546, ZNF286A, ZKSCAN4, ZNF70, ZNF643, ZNF642, ZSCAN23, ZNF490, ZNF626, ZNF793, ZNF383, ZNF669, ZNF559, ZNF177, ZNF548, MTF1, ZNF322B, ZNF563, ZNF292, ZNF567, SP6, ZNF573, ZNF527, ZNF33A, ZNF600, ZKSCAN3, ZNF676, ZNF699, ZNF250, ZNF79, ZNF681, ZNF766, ZNF107, ZNF471, ZNF836, ZNF493, ZNF167, ZNF565, ZNF34, ZNF781, ZNF140, ZNF774, ZNF658, ZNF765, ZNF124, ZNF569, ZNF777, ZNF775, ZNF799, ZNF782, ZNF846, ZNF136, ZKSCAN5, ZNF502, ZFP62, ZNF33B, ZNF512B, ZNF431, ZNF418, ZNF700, ZNF239, ZSCAN16, ZFP28, ZNF705A, ZNF585A, ZNF138, ZNF429, ZNF470, ZNF100, ZNF398, ZNF498, ZNF441, ZNF420, ZNF763, ZNF679, ZNF682, ZNF772, ZNF257, ZNF785, ZSCAN5B, ZNF165, ZNF655, ZNF98, ZNF786, ZNF517, ZNF675, ZNF860, ZNF628, ZNF665, ZNF624, ZNF841, ZNF615, ZNF350, ZNF432, ZNF433, ZNF460, ZNF81, ZNF780A, ZNF461, ZNF181, LOC100287841, ZNF44, ZNF790, ZNF677, ZNF823, ZNF311, ZNF347, ZNF71, ZNF121, ZNF335, ZNF560, ZNF273, ZNF84, ZNF667, ZNF649, ZNF248, ZNF544, ZNF770, ZNF737, ZNF251, ZNF607, ZNF334, ZXDA, ZNF485, ZIM2, PEG3, ZNF192, ZNF442, ZNF813, ZNF26, ZNF69, ZNF583, ZNF568, ZXDB, ZNF480, ZNF587, ZNF808, ZNF43, ZNF28, ZNF627, ZNF789, ZNF536, ZNF534, ZNF652, ZNF521, ZNF358, ZFP2, SP5, ZNF814, ZNF551, ZNF805, ZSCAN5C, ZNF468, ZNF616, ZFP57, ZNF155, ZNF783, ZNF425, ZNF580, ZNF611, ZNF254, ZNF625, ZNF134, ZNF845, ZNF99, ZNF253, ZNF90, ZNF93, ZNF486, REPIN1, LOC100131539, ZNF705D, LOC100132396, ZNF705G, SCRT2, ZNF407, SP9, ZNF579, ZNF880, ZNF630, ZNF844, ZNF469, ZNF717, ZNF865, ZNF492, ZNF688, YY2, ZNF878, ZNF879, ZNF736, ZNF323, ZNF709, ZNF512, ZNF585B, ZNF154, ZNF324B, ZNF564, ZFP82, GLI4, ZNF674, ZNF345, ZNF550, KLF1, YY1, MYST2, ST18, L3MBTL4, MYT1L, MYT1, L3MBTL1, MTA3, GATA1, TRPS1, GATA3, GATA5, GATA4, GATA6, GATAD2B, GATAD1, GATA2, MTA1, ZGLP1, MTA2, RERE, C16orf5, LITAF, PIAS1, PIAS2, PIAS4, ZMIZ1, ZMIZ2, PIAS3, RNF138, NFX1, NFXL1, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las células se manipulan (por ejemplo, se convierten o diferencian) de un tipo celular a otro. En algunas realizaciones, una célula pancreática se manipula en una célula de islote beta. En algunas realizaciones, se manipula un fibroblasto en una célula iPS. En algunas realizaciones, se manipula un preadipocito en una célula de grasa marrón. Otras células ejemplares incluyen, por ejemplo, células musculares, células neurales, leucocitos y linfocitos.

En algunas realizaciones, la célula es una célula enferma o portadora de mutantes. Tales células pueden manipularse para tratar la enfermedad, por ejemplo, para corregir una mutación, o para alterar el fenotipo de la célula, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula está asociada con una o más enfermedades o afecciones descritas en la presente.

En algunas realizaciones, la célula manipulada es una célula normal.

En algunas realizaciones, la célula manipulada es una célula madre o una célula progenitora (por ejemplo, células iPS, embrionarias no humanas, hematopoyéticas, adiposas, de línea germinal no humanas, pulmonares o neurales o progenitoras). En algunas realizaciones, la célula manipulada puede ser una célula de cualquiera de las tres capas germinales (es decir, mesodérmica, endodérmica o ectodérmica). En algunas realizaciones, la célula manipulada puede ser de un tejido extraembrionario, por ejemplo, de la placenta.

En algunas realizaciones, la célula que se está manipulando se selecciona de fibroblastos, precursores monocíticos, células B, células exocrinas, progenitores pancreáticos, progenitores endocrinos, hepatoblastos, mioblastos o preadipocitos. En algunas realizaciones, la célula se manipula (por ejemplo, se convierte o se diferencia) en células musculares, células eritroides-megacariocíticas, eosinófilos, células iPS, macrófagos, células T, células beta de los islotes, neuronas, cardiomiocitos, células sanguíneas, progenitores endocrinos, progenitores exocrinos, células ductales, células acinares, células alfa, células beta, células delta, células PP, hepatocitos, colangiocitos, angioblastos, mesoangioblastos o adipocitos marrones.

En algunas realizaciones, la célula es una célula muscular, célula eritroide-megacariocítica, eosinófilo, célula iPS, macrófago, célula T, célula beta de los islotes, neurona, cardiomiocito, célula sanguínea, progenitora endocrina, progenitora exocrina, célula ductal, célula acinar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatocito, colangiocitos o adipocito blanco o marrón.

En algunas realizaciones, la célula es una célula precursora, una célula pluripotente, una célula totipotente no humana, una célula madre adulta, una célula de masa celular interna no humana, una célula madre embrionaria o una célula iPS.

En algunas realizaciones, la célula manipulada es una célula cancerosa. En algunas realizaciones, la célula cancerosa puede ser una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de piel, una célula de cáncer de cerebro, una célula de cáncer de páncreas, una célula de cáncer hematopoyética, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de riñón, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de piel. En algunas realizaciones, la célula es una célula muscular, célula eritroidemegacariocítica, eosinófilo, célula iPS, macrófago, célula T, célula beta de los islotes, neurona, cardiomiocito, célula sanguínea, progenitora endocrina, progenitora exocrina, célula ductal, célula acinar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatocito, colangiocito o adipocito blanco o marrón.

Administración de inhibidores de ADNPK y sistema de edición de genes a una célula o células

La administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica. La administración puede ser in vitro, ex vivo o in vivo. La administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADNPK puede producirse simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, la administración da como resultado que los componentes del inhibidor de ADNPK y del sistema de edición del genoma entren en la membrana celular. En algunas realizaciones, la administración da como resultado que los componentes del inhibidor de ADNPK y del sistema de edición del genoma entren en el núcleo celular. En algunas realizaciones, la administración incluye la incubación de la célula en presencia del inhibidor de ADNPK y el sistema de edición del genoma.

El sistema de edición de genes puede administrarse a una célula o células mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede usarse cualquier método de administración de proteínas o ácidos nucleicos conocido en la técnica. El sistema de edición de genes se administra (por ejemplo, se suministra) a una célula por medio de un ácido nucleico que codifica los componentes del sistema de edición de genes. El sistema de edición de genes puede administrarse a una célula mediante vectores virales o vectores no virales. En algunas realizaciones, se usan vectores virales. Los vectores virales pueden ser retrovirales (por ejemplo, leucemia murina, VIH o lentivirales) o virus de ADN (por ejemplo, adenovirus, herpes simplex y adenoasociados). En algunas realizaciones, se usan métodos de transfección (por ejemplo, métodos de administración no viral) para introducir el sistema de edición del genoma en una célula. Los métodos de transfección incluyen poner en contacto la célula con DEAE-Dextrano, fosfato de calcio, liposomas o electroporación de un plásmido en una célula. Los métodos adicionales de administración no viral incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, ARN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por agentes. También puede usarse sonoporación usando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) para la administración de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos se administran como ARNm. En algunas realizaciones, los ARNm protegidos se usan para aumentar la eficiencia de traducción y/o la estabilidad del ARNm. En algunas realizaciones, se usan caperuzas ARCA (análogo de caperuza anti-inversa) o variantes de las mismas. Ver las Patentes de Estados Unidos US7074596yUS8153773.

En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) y el ARNg se transcriben a partir del ADN.

En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) se transcribe a partir de ADN y el ARNg se proporciona como ARN.

En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) y el ARNg se proporcionan como ARN.

En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) se proporciona como una proteína y el ARNg se proporciona como ADN.

En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) se proporciona como proteína y el ARNg se proporciona como ARN.

Los sistemas adicionales de administración de ácidos nucleicos incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Md.), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc, (ver, por ejemplo, la US6008336). La lipofección se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™ y Lipofectamine™ RNAiMAX). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección de polinucleótidos con reconocimiento de receptor eficaz incluyen los de Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024. La administración puede ser a las células (administración ex vivo) o a los tejidos objetivo (administración in vivo).

La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluyendo los liposomas dirigidos como los complejos de inmunolípidos, es bien conocida por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cáncer Gene Ther. 2:291-297 (1995), Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994), Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995).

Los métodos adicionales de administración incluyen el uso de empaquetar los ácidos nucleicos que se van a administrar en vehículos de administración EnGeneIC (EDV). Estos EDV se administran específicamente a los tejidos objetivo usando anticuerpos biespecíficos en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido objetivo y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula objetivo y luego el EDV se introduce en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, el contenido se libera (ver MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643) Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Patentes de Estados Unidos N24.186.183, 4.217.344, 4.235.871,4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).

En algunas realizaciones, la transfección puede ser transitoria en la que el plásmido que contiene el sistema de edición del genoma transfectado entra en el núcleo pero no se incorpora al genoma de la célula durante la replicación. La transfección puede ser estable en la que el plásmido transfectado se integrará en una región genómica de la célula.

En algunas realizaciones en las que se usa la expresión transitoria, pueden usarse sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido títulos altos y niveles de expresión altos. Este vector puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se usan vectores de virus adenoasociados ("AAV") para transducir células con ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (ver, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987), Patente de Estados Unidos N° 4.797.368, WO 93/24641, Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994), Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994). La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, que incluyen la Patente de Estados Unidos N° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol Cell. Biol.

4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81 :6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol 63:03822-3828 (1989).

En algunas realizaciones, la administración a una célula o células de un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, se realiza cultivando una célula o células aisladas en presencia del inhibidor de ADNPK y cualquier medio adecuado que permita que el inhibidor de ADNPK se introduzca en la membrana celular y/o o el núcleo celular.

En algunas realizaciones, los inhibidores de ADNPK, como se reivindica, se administran a una o más células in vitro, in vivo o ex vivo. En alguna realización, el inhibidor de ADNPK se pone en contacto con una célula o células durante aproximadamente 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas, 55 horas, 60 horas, 65 horas, 70 horas, 85 horas, 90 horas, 100 horas, 125 horas, 150 horas, 200 horas, o durante cualquier período de tiempo intermedio. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK se pone en contacto con una o más células durante aproximadamente 1,5 semanas, 2,0 semanas, 2,5 semanas, 3,0 semanas, 3,5 semanas, 4 semanas o cualquier período de tiempo intermedio. El inhibidor de ADNPK puede volver a administrarse con cambios en el medio de cultivo celular. El inhibidor de ADNPK puede ponerse en contacto con la célula antes, durante o después de la introducción de los componentes del sistema de edición del genoma.

En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK, como se reivindica, se administra a una célula o células a una concentración de aproximadamente 0,1 |j M, 0,25 |j M, 0,5 |j M, 0,75 |j M, 1,0 |j M, 1,25 |j M, 1,50 |j M, 1,75 |j M, 2,0 |jM, 2,5 jiM, 3,0 jiM, 3,5 jiM, 4,0 jiM, 4,5 jiM, 5,0 jiM, 5,5 jiM, 6,0 jiM, 6,5 jiM, 7,0 jiM, 7,5 jiM, 8,0 jiM, 8,5 j M, 9,0 jiM, 9,5 jiM, 10 jiM, 10,1 jiM, M10,1 ji0, 11,5 jiM, 12 jiM o cualquier concentración intermedia. La concentración del inhibidor de ADNPK puede modificarse durante el transcurso de la administración.

En algunas realizaciones, los componentes de edición de genes se administran en una célula o células mediante uno o más vectores o en forma de ARN, ARNm o, en el caso del componente de endonucleasas, como proteína purificada o ARNm (por ejemplo, proteína Cas9). El uno o más vectores pueden incluir vectores virales, plásmidos o ADNmc. Los vectores virales pueden incluir vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los componentes de edición de genes se administran mediante ARN o ARN sintético.

En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK, como se reivindica, a una célula junto con un sistema de edición de genes da como resultado cantidades aumentadas de resultados de edición de genes de reparación dirigida homóloga en comparación con una condición de referencia en la que no se administra un inhibidor de ADNPK a la célula. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la supresión de indeles (de NHEJ) en el objetivo o fuera del objetivo. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado una expresión aumentad o disminuida de un gen de interés. La administración de los inhibidores de ADNPK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes puede dar como resultado la expresión de un gen que no es endógeno a una célula. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación total o parcial, o una modificación de un gen de una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación completa o parcial, o una modificación de un intrón y/o un exón en una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación completa o parcial, o una modificación de una región no codificante en una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK a una célula junto con el sistema de edición de genes da como resultado una eliminación simultánea o secuencial, completa o parcial, o una modificación de una región genética codificante y/o no codificante en una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADNPK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación simultánea o secuencial, completa o parcial, o una modificación de una región genética codificante y/o no codificante en una célula o células, incluyendo ADN o ARN extracromosómico. El ADN extracromosómico puede ser ADN mitocondrial, ADN de cloroplasto, ADN circular extracromosómico o ADN viral extracromosómico.

En algunas realizaciones, la administración de inhibidores de ADNPK, como se reivindica, a una célula junto con el sistema de edición del genoma da como resultado una expresión aumentada o disminuida de un gen de interés. En algunas realizaciones, el aumento o disminución en la expresión de un gen de interés puede ser de aproximadamente o de entre el 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en comparación con una condición de referencia en la que a la célula no se le administra un inhibidor de ADNPK. En algunas realizaciones, el aumento o disminución de un gen de interés puede ser de aproximadamente o de entre 0,5 veces, 1,0 vez, 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en el que a la célula no se le administra un inhibidor de ADNPK.

En algunas realizaciones, la administración de inhibidores de ADNPK, como se reivindica, a una célula junto con un sistema de edición del genoma da como resultado un aumento en la edición del genoma. En algunas realizaciones, el aumento en la edición del genoma puede ser de aproximadamente o de entre el 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en comparación con un condición de referencia en la que a la célula no se le administra un inhibidor de ADNPK. En algunas realizaciones, el aumento en la edición del genoma puede ser de aproximadamente o de entre 0,5 veces, 1,0 vez, 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión de referencia en el que a la célula no se le administra un inhibidor de ADNPK.

En algunas realizaciones, la administración de un inhibidor de ADNPK, como se reivindica, y un sistema de edición de genes a una población celular da como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con una condición de referencia en la que a una población celular solo se le administra un sistema de edición de genes y no se le administra un inhibidor de ADNPK. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK que da como resultado una supervivencia celular aumentada es un compuesto de Fórmula Estructural I, Fórmula Estructural II o Fórmula Estructural II".

En algunas realizaciones, la célula se sincroniza en la fase del ciclo celular S o G2, ya sea antes, después o durante la administración del inhibidor de ADNPK. En algunas realizaciones, la célula se sincroniza en la fase del ciclo celular S o G2, ya sea antes, después o durante la introducción de los componentes de edición de genes. La sincronización de la célula en la fase del ciclo celular S o G2 puede lograrse mediante cualquier método conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, los agentes que pueden usarse para sincronizar una célula en la fase del ciclo celular S o G2 incluyen afidicolina, droxiurea, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina o cualquier combinación de los mismos. (Ver, Lin et al. Elife. 15 de diciembre de 2014; 32014). En algunas realizaciones, los agentes para la sincronización celular pueden administrarse en cualquier momento durante el proceso de edición de genes.

En algunas realizaciones, los inhibidores de ADNPK, como se reivindica, y el sistema de edición del genoma se incluyen en un kit con instrucciones de uso. El kit puede contener cualquier sistema de edición del genoma e inhibidor de ADNPK, como se reivindica, e instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK es cualquiera de los compuestos representados por la Fórmula Estructural I, I', II, II', II", II", III, III' o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efector del tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo. El sistema de edición del genoma puede proporcionarse en el kit en cualquier forma, por ejemplo, como un constructo de plásmido, vector, ADN o ARN.

En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK, como se reivindica, y/o un sistema de edición del genoma se administran in vivo. El inhibidor de ADNPK y el sistema de edición de genes se formulan para que sean compatibles con la vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

Para uso inyectable, los portadores adecuados incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa (IV), los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En tales administraciones inyectables e IV, la composición es estéril y fluida en la medida en que existe una capacidad de jeringuilla fácil. Son estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conservan frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En algunas realizaciones, se incluyen en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el agente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el agente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para propósitos de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un portador fluido para su uso como lavado bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se enjuaga y se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente disgregante como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administración por inhalación, los agentes se administran en forma de un espray en aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas como el dióxido de carbono o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse mediante el uso de espráis nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.

Los agentes también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

En algunas realizaciones, los agentes se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación sostenida/controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

Por ejemplo, los agentes activos pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente, tales matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (patente de Estados Unidos N° 3.773.919), copolímeros de ácido de L-glutamato y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros como etileno-acetato de vinilo y ácido lácticoácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.

En algunas realizaciones, la formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, por ejemplo, aquellas con actividades complementarias que no se ven afectadas negativamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que potencie su función como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

En algunas realizaciones, el uso de un compuesto como se reivindica comprende administrar el agente inhibidor de ADNPK y/o el sistema de edición del genoma en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, como las varias formas de cáncer y enfermedades inflamatorias El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se administran sustancialmente al mismo tiempo, ya sea simultánea o secuencialmente. Si se administran secuencialmente, al comienzo de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos todavía es preferiblemente detectable en concentraciones eficaces en el sitio de tratamiento.

Métodos de selección de edición del genoma

Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para seleccionar células en cuanto a la eficiencia de la edición del genoma, incluyendo la eficiencia de NHEJ y/o HDR. Por ejemplo, los métodos de selección pueden incluir la amplificación basada en PCR de las regiones objetivo seguido de secuenciación o secuenciación profunda de las regiones amplificadas para confirmar la edición del genoma. El genotipado por PCR permite la cuantificación y clasificación de compuestos en la estimulación de HDR. Otros métodos de selección pueden incluir la secuenciación de próxima generación. Ver, por ejemplo, Bell et al., "A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing," BMC Genomics, 15:1002 (2014).

Los cebadores de PCR pueden manipularse para amplificar selectivamente las regiones genéticas tanto modificadas como no modificadas, lo que da como resultado amplicones de diferentes longitudes dependiendo del estado de la modificación genética. Luego, los amplicones pueden resolverse en un gel y estimarse la eficiencia de HDR mediante densitometría usando un Bio-Imager. Alternativamente, puede usarse una nueva tecnología de PCR, la PCR digital rápida de gotitas (DDPCR) para medir simultáneamente eventos de HDR y NHEJ en muestras editadas con genoma. Ver, por ejemplo, Miyaoka et al., "Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effectrs of locus, nuclease, and cell type on genome-editin," Scientific Reports, 6, 2016. Otros métodos que pueden usarse para seleccionar células en busca de modificaciones genómicas incluyen la secuenciación de Sanger, la secuenciación profunda y la RT-PCR.

En algunas realizaciones, se usa un constructo informador de semáforo (TLR) para seleccionar las células. La selección de TLR incluye una célula informadora que está manipulada para expresar un marcador fluorescente en la edición del genoma objetivo. Después del direccionamiento apropiado, la célula expresa el marcador fluorescente. La cuantificación de las células dirigidas apropiadamente puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, análisis de citometría de flujo. Ver, por ejemplo, Certo et al. 2011, "Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints," Nature Methods, 8, páginas 671-676 (2011).

No se pretende que la cita de publicaciones y documentos de patente sea una admisión de que alguno sea un estado de la técnica pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o la fecha de los mismos. Habiéndose descrito ahora la presente divulgación a modo de descripción escrita, los expertos en la técnica reconocerán que pueden ponerse en práctica una variedad de realizaciones y que la descripción anterior y los ejemplos a continuación tienen propósitos ilustrativos y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos de la presente divulgación.

EJEMPLO 1: Materiales y Métodos

Ensayo de informador de semáforo (TLR): se adquirió la línea celular estable HEK293-EGIP (Proteína inhibida fluorescente verde mejorada) de System Biosciences (SBI). La línea celular HEK293-EGIP alberga una secuencia codificante de GPP interrumpida con un codón de terminación y un fragmento genómico de 53 pb del locus AAVS1. Las células se mantuvieron en DMEM (Life Technologies, N° de catálogo 10313-039) con alto contenido de glucosa (Life Technologies, N° de catálogo 10313-039) suplementado con FBS (suero bovino fetal, Expression Systems Inc.) inactivado por calor al 10%, Glutamax y Penicilina+Estreptomicina y se cultivaron a 37° C y 5% de CO2.

Transfección celular y tratamiento con inhibidor de NHEJ: se transfectaron células estables HEK293-EGIP con el vector de plásmido dual dos en uno ARNg/CRISPR-Cas9, donante de reparación de plásmido (ambos plásmidos de System Biosciences). La transfección se llevó a cabo usando el sistema nucleofector Amaxa (Lonza) siguiendo el protocolo del fabricante. Después de 16 horas, las células se trataron con el Compuesto 1 y Scr7 (Excess Bioscience; N° M60082-2s) a varias concentraciones, incluyendo 1 pM, 2,5 pM, 5 pM y 10 pM de compuesto. A continuación se muestra la estructura de Scr7:

El medio se cambió después de una incubación adicional de 24 horas. El análisis FACS se realizó 5 días después de la transfección; luego se recogieron las células para el aislamiento del ADN genómico y el genotipado por PCR.

Clasificación celular y citometría de flujo: Para el análisis de citometría de flujo, se tripsinizaron células HEK293 y se volvieron a suspender en tampón PBS/BSA FACS al 1% y se analizaron con un citómetro de flujo Fortessa (Becton Dickinson). Una parte de las células se centrifugó y se usó para el aislamiento de ADN genómico.

Ensayo de viabilidad celular tras el tratamiento con el compuesto: para evaluar la toxicidad potencial de Scr7, se evaluó la viabilidad celular después de la exposición a diferentes concentraciones de compuestos. La viabilidad celular de HEK293-EGIP se determinó mediante el kit CellTiter Glo (Promega). Las células transfectadas con el plásmido donante se cultivaron en presencia del compuesto (1 pM, 2,5 pM, 5 pM y 10 pM) durante 24, 48 o 72 h, y se sometieron al ensayo CellTiter Glo. Cada experimento se repitió tres veces independientes por triplicado. Para mantener células sanas capaces de entrar en S/G2, lo cual es necesario para la HDR, las células se trataron con compuesto a una concentración de 2,5 pM.

Aislamiento de ADN genómico, genotipado por PCR y cuantificación en gel: los pares de cebadores de PCR especialmente diseñados proporcionaron otro medio para evaluar la edición del genoma mediada por HDR para obtener células positivas para eGFP funcionales. El par de cebadores de PCR de genotipado se muestra a continuación, correspondiente a las SEQ ID NO: 6 y 7. Un producto de PCR de 219 pb corresponde a células no modificadas y un nucleótido de 163 pb corresponde a la modificación a través de HDR. La intensidad de estas bandas en un gel al >2,5% permite la estimación de HDR por densitometría usando un Bio-Imager. La técnica permite la clasificación relativa de mejora de HDR por inhibidores. Las intensidades medidas para cada fila se normalizaron calculando las relaciones de las bandas de PCR correspondientes a las "inserciones" divididas por el "total" (insertadas y sin modificar). Las veces de cambio se calcularon comparando la relación de inserciones con el compuesto sobre las de sin compuesto.

EJEMPLO 2: Ensayo para monitorizar la eficiencia de HDR

Se realizaron ensayos para determinar la eficiencia de HDR en células HEK293-EGIP. Con este fin, se utilizó un constructo bicistrónicoa que se dirige al locus AAVS1 humano (FIG. 1 A). El sistema de vector bicistrónico coexpresa Cas9 optimizado por codón humano impulsado por el promotor EF1, así como ARN guía (ARNg) personalizado que consiste en un transcrito quimérico ARNcrARNtracr impulsado por el promotor HI. hspCas9 contiene dos señales de localización nuclear (NLS) en el extremo N-terminal y el extremo C-terminal para asegurar una importación eficiente de la proteína de hspCas9 al núcleo. El marco de lectura abierto (ORF) de hspCas9 va seguido de un elemento regulador llamado WPRE (elemento regulador postranscripcional del virus de la marmota) para impulsar la expresión génica y estabilizar la transcripción del ARNm.

Su usó la línea de células humanas manipuladas EGIP HEK293 para monitorizar la eficiencia de HDR usando el constructo bicistrónico descrito anteriormente y en la FIG. 1A. La línea celular informadora EGIP HEK293 se adquirió de SBI. La línea celular HEK293-EGIP alberga una secuencia codificante de GFP interrumpida con un codón de terminación y un fragmento genómico de 53 pb del locus AAVS1. La línea estable se generó mediante infección lentiviral de células 293T con un promotor EF1alfa para impulsar la expresión de eGFP seguido de selección de puromicina. La secuencia de eGFP se modificó para insertar un inserto de 56 nucleótidos (en mayúsculas) del sitio de puerto inocuo de AAVS1 humano. Esta secuencia contiene un codón de terminación (TAA en rojo) después del aminoácido T109 en la secuencia traducida de eGFP. Las secuencias guía objetivo están en negrita. Tras la transfección con la guía y el donante, se cortó el sitio AAVS1 dentro de la eGFP rota y el constructo del donante proporcionó una secuencia homóloga para reparar la eGFP, eliminando el codón de terminación y el inserto de AAVS1. Las células editadas que se habían sometido a la reparación del donante de HDR generarán células positivas para GFP. Por consiguiente, la cotransfección de Cas9, AAVS1 de direccionamiento de ARNg y un donante de rescate AAVS1/EGFP restauró la secuencia mediante HDR para dar células GFP+.

La población de células positivas para GFP fue directamente proporcional a la eficiencia de la reparación dirigida por homología (FIG. 1B).

Para estos ensayos, se introdujeron vectores de plantilla de donante eGFP y Cas9-ARNsg dos en uno en las células HEK293 EGIP mediante electroporación usando el nucleofector Amaxa (Lonza) para impulsar la síntesis de Cas9-ARNsg y la plantilla de donante de eGFP. Los compuestos se añadieron 16 h después de la transfección seguido de un cambio de medio 48 horas más tarde. A continuación, se permitió que las células se propagaran durante 72 horas adicionales antes del análisis FACS.

La secuencia plantilla donante de HDR contenía un brazo de homología 5' de 266 nucleótidos (en negrita, en negro y subrayado) y un brazo de homología 3' de 378 nucleótidos (en cursiva y subrayado) (ver SEQ ID NO: 1 a continuación). Tras la transfección con el ARN guía y la plantilla del donante, se cortó el sitio AAVS1 dentro de la eGFP rota y el constructo del donante proporcionó una secuencia homóloga para reparar la eGFP, eliminando el codón de terminación y el inserto de AAVS1.

A continuación se muestra la secuencia de plantilla de HDR usada en el ensayo de informador de semáforo (SEQ ID NO: 1):

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGC TTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGG TGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGT GTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCT GCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGG GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAA CGACGGCCAGTGAAACTAGTGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAG GGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGC CCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCA CATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATC TTCTTCAAGGA.CGA.CGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGG TGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCT GGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAG GTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGC AGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTC CGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCC GCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGTCGACACCGGTGATATCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCA TAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCA TAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACT GCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGG AGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCG TTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGG GGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCC GCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAA GTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCT CGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGA AGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCA AGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCG TCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATT AGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA CTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGG

TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAG

ATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTC

AGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA

GATCCTTTTGATCCCCGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTT

GAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAAC

TCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCA

GTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAAT

TTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAA

ACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCC

AACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCA

TGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAA

CAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGA

TTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAA

TGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTT

CTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGT

ACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATC

TCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGG

GCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATA

CCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGA

ATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATG

ATATAT T T T TAT C T T GT GCAAT GTAACAT CAGAGAT T T T GAGACACAAT T CAT CGAT GAT GGT T

GAGATGTGTATAAGAGACAGATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC

ATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGC

CACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAG

GCCCTTTCGTC (SEQ ID NO: 1)

A continuación se muestran los sitios de cebadores usados para el ensayo descrito en la presente. Estos sitios de cebadores están localizados dentro de la secuencia donante. La reacción de PCR en la plantilla genómica generó un producto de 700 nucleótidos y se esperaba que NHEJ produjera fragmentos de alrededor de 300 nucleótidos y 400 nucleótidos de longitud. Después del evento de HDR, el producto de PCR esperado usando la plantilla de donante suministrada tiene 644 nucleótidos. Los sitios de cebadores usados para el ensayo incluyen las siguientes secuencias.

Guía GTCCCCTCCACCCCACAGTG (SEQ ID NO: 2)

RNA_

1 :

Guía GGGGCCACTAGGGACAGGAT (SEQ ID NO: 3)

RNA_

2 :

4) Cebador Inspector Directo: GCGACGTAAACGGCCACAAG (SEQ ID NO:

Cebador Inspector Inverso GTCCATGCCGAGAGTGATCC (SEQ ID NO:

5) Cebador_1 HDR: ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC (SEQ ID NO:

6) Cebador 2 HDR: ATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCG (SEQ ID NO: 7)

EJEMPLO 3: el inhibidor de ADNPK aumenta la eficiencia de HDR de la edición del genoma CRISPR

Se nucleofectaron células HEK293-EGIP con los siguientes constructos y se cultivaron como se describe: ARNg-Cas9 de expresión dual únicamente, ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de reparación de donante, ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de donante y cultivo de las células con 2,5 gM de compuesto 1, y ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de reparación de donante y cultivo de las células con 2,5 gM del supuesto inhibidor de ligasa IV Scr7. Las células se pusieron en contacto con el Compuesto 1 o cona Scr7 durante 24 horas.

Los datos de estos ensayos se muestran en las FIGS. 2A-2C y en la Tabla 1 a continuación. LA FIG. 2A indica que la adición de Scr7 al medio de cultivo aumentó la cantidad de células HEK-EGIP editadas con el genoma CRISPR en aproximadamente un 30% en comparación con ARNg-Cas9 y la condición de plantilla de donante solamente. La FIG. 2A muestra además que la adición del Compuesto 1 al medio de cultivo de células HEK293-EGIP nucleofectadas con ARNg-Cas9 y plantilla de donante dio como resultado un aumento de aproximadamente un 83% en la cantidad de células HEK-EGIP editadas con el genoma CRISPR en comparación con la condición de ARNg-Cas9 y de plantilla de donante únicamente.

La Tabla 1 muestra la cuantificación de HDR para tres réplicas técnicas de uno de los tres experimentos independientes con un aumento de veces similar en la mejora de HDR. Los datos presentados en la Tabla 1 y la FIG. 2C muestran que la adición del Compuesto 1 al medio de cultivo celular dio como resultado un aumento de aproximadamente 4,5 veces en la cantidad de células editadas con el genoma CRISPR, en comparación con el aumento aproximado de 2,3 veces en la cantidad de células editadas con el genoma CRISPR en el condición en la que las células HEK293-EGIP se pusieron en contacto con Scr7.

Tabla 1. Análisis FACS - Porcentaje de mejora de HDR (ARNg-Cas9 donante) sin compuesto, o con la

^

En conjunto, estos datos muestran que el contacto de las células con el Compuesto 1 aumentó la cantidad de edición del genoma basada en CRISPR en comparación con el contacto de las células con Scr7, o en comparación con las células que solo han sido nucleofectadas con ARNg, Cas9 y la plantilla del donante.

También se evaluó el rendimiento del Compuesto 3 usando el sistema TLR y se usó la línea celular HEK EGIP para monitorizar la eficiencia de HDR. Además, se comparó el rendimiento del Compuesto 3 frente a Scr7 y Nu7026, un supuesto inhibidor de ADN ligasa IV e inhibidor de ADNPK, respectivamente, en experimentos paralelos usando el ensayo robusto 'Informador de Semáforo' (TLR). En el sistema TLR, la línea celular HEK293-EGIP se manipuló para expresar de manera estable eGFP no funcional. La expresión de eGFP funcional puede restaurarse a través del proceso de reparación dirigida homóloga (HDR) transfectando Cas9, ARNg y una plantilla de reparación de ADN. Ver FIG. 1A -1C. El clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) cuantificó el aumento de veces en la mejora del proceso de reparación del ADN usando el sistema CRISPR-Cas9 en presencia de una plantilla de reparación del donante.

48 horas después de la transfección mediante electroporación, comenzaron a emerger células positivas para eGFP. El análisis de citometría de flujo 10 días después de la transfección proporcionó un 4% de células positivas para GFP en presencia de 10 gM del Compuesto 3. Por el contrario, las células sin compuesto proporcionaron aproximadamente un 0,2% de células positivas para eGFP y las tratadas con el inhibidor comercial de ADNPK SCR7 mostraron una mejora de aproximadamente un 0,5%. (FIG. 4). Los datos de los experimentos llevados a cabo por triplicado fueron consistentes con un aumento de aproximadamente 8 veces en la mejora de HDR en comparación con la transfección en presencia del compuesto comercial SCR7.

Sumario

Se evaluó el rendimiento del inhibidor de ADNPK, Compuesto 1, con respecto a su capacidad para estimular el proceso de reparación de HDR basado en CRISPR mediante la supresión de la vía de reparación de ADN NHEJ propensa a errores. Además, se comparó el rendimiento del Compuesto 1 con Scr7 (FIGS. 2A, 2B y 3), un supuesto inhibidor de la ADN ligasa IV en experimentos paralelos. Se usó el ensayo robusto "Informador de Semáforo" (TLR) (FIG. 1B) para cuantificar el aumento de veces en la mejora del proceso de reparación de ADN mediado por ^hD^ren el sistema CRISPR-Cas9. En el sistema TLR, la línea celular estable HEK293-EGIP que expresa la proteína fluorescente verde "rota" eGFP, se basa en la reparación mediada por HDR para generar eGFP funcional en presencia de la plantilla del donante de ADN (ver FIGS. 1B y 1C). Como se muestra en el flujo de trabajo experimental en la FIG. 1C aparecieron células GFP positivas funcionales a través de la vía de HDR, donde la inserción de 56 nt se reemplazó con la secuencia de ADN correcta. Cuarenta y ocho horas después de la transfección mediante electroporación, surgieron células positivas para GFP. El análisis de citometría de flujo mostró que el evento HDR, según lo indicado por las células positivas para GFP, se produjo en menos del 1% de las células (FIGS. 2A y 2B) en las condiciones experimentales. En base a dos experimentos separados realizados por triplicado, los datos mostraron que la adición del Compuesto 1 proporcionó un aumento de 4,5 veces en la mejora de HDR en comparación con la transfección en ausencia del compuesto, y una mejora de HDR 2 veces mejor en comparación con la transfección con Scr7 (FIGS. 2B y 2C).

Los ensayos que evaluaron el rendimiento del Compuesto 3 mostraron que el Compuesto 3 mejoró la eficiencia de edición de genes de HDR. Los datos de estos experimentos muestran que hay una mejora de aproximadamente 4 veces la eficiencia de HDR, como se indica por el análisis FACS, en presencia del Compuesto 3 en comparación con la condición de Cas9+ARNg solamente. Ver la FIG. 4.

EJEMPLO 4: Comparación de inhibidores de NHEJ de molécula pequeña para aumentar la edición del genoma por HDR

Se realizaron experimentos adicionales utilizando la línea celular HEK293-EGIP para determinar la eficiencia de HDR después del contacto con un inhibidor de DNPK o un inhibidor de NHEJ.

Otra serie de experimentos comparó el aumento de la eficiencia de HDR después del contacto con Scr7 o el Compuesto 1, un inhibidor de ADNPK. Para estos experimentos, las células HEK293-EGIP se nucleofectaron solamente con plantilla de donante o plantilla de donante y Cas9-ARNsg. Para probar la capacidad de Scr7 y el Compuesto 1 para mejorar la edición de HDR, se administró Scr7 o el Compuesto 1 a las células que habían sido nucleofectadas con la plantilla del donante solamente o con la plantilla del donante y Cas9-ARNsg. Los datos de estos experimentos se presentan en la FIG. 3 y la Tabla 2 a continuación.

El estado de recombinación de HDR se determinó mediante el genotipado y la cuantificación del cebador de PCR de "punto final" tradicional en base a las intensidades de las bandas de agarosa. Los cebadores produjeron distintos amplicones: una banda de nucleótidos de 219 pb correspondía a células no modificadas y un producto de nucleótidos de 163 pb para el evento HDR. La intensidad de estas bandas en un gelal >2,5% permite la estimación de HDR por densitometría utilizando un Bio-Imager. La técnica permite la clasificación relativa de las condiciones para la mejora de HDR por inhibidores de NHEJ. A continuación se muestran los pares de cebadores de PCR de genotipado para estos ensayos.

Cebador _1 de HDR ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC (SEQ ID NO: 6)

Cebador 2 de HDR ATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCG (SEQ ID NO: 7)

Los datos de estos ensayos indican una mayor eficiencia de edición de HDR en células nucleofectadas a las que se administró el Compuesto 1 en comparación con las células a las que se le administró Scr7 (FIG. 3 y Tabla 2).

Tabla 2. Eficiencia de edición de HDR después de la administración o de Scr7 o el Compuesto 1 a células

- -

La proteína Cas9 y los ARNsg pueden administrarse en forma de ARN sintéticos en lugar de los sistemas de vectores adquiridos de SBI. Además de potenciar la eficiencia de HDR, nuestros experimentos internos de edición del genoma indicaron una mayor viabilidad celular después de la transfección de proteína ribonucleoproteica (RNP) en comparación con la transfección de ADN. Además, la sincronización celular de la fase S/G2 también puede estimular HDR (Lin S et al. Elife. 2014 15 de diciembre; 3, 2014). Estas nuevas estrategias y la detección robusta de la edición del genoma, como la PCR de gotitas digitales y la secuenciación de próxima generación, agilizarían la edición del genoma tanto con propósitios terapéuticos como de investigación.

Ejemplo 5: Administración del inhibidor de ADNPK Compuesto 1 Edición de genes aumentada

Se realizaron ensayos para determinar la capacidad de un inhibidor de ADNPK para permitir la edición de un gen objetivo. Para estos ensayos, se evaluó la edición del gen Serpina A1 de la forma M a la Z. Con este fin, se nucleofectaron células de carcinoma hepatocelular Huh7 con ARNg y proteína Cas9, con o sin plantilla de reparación del donante en la que se introdujo un sitio KpnI. A continuación, las células nucleofectadas se cultivaron en presencia de DMSO o 2,5 pM de Compuesto 1 durante tres días, después de lo cual, se amplificó el ADN genómico y se evaluó la introducción del sitio Kpn.

El ensayo funciona de la siguiente manera: cuando se edita el gen SerpinaAI, la endonucleasa Kpn puede digerir el fragmento del gen, lo que da como resultado la aparición de una banda digerida en un gel solo cuando se edita el gen SerpinaAI. Por el contrario, cuando no se edita SerpinaAI, la endonucleasa Kpn no puede cortar el fragmento del gen y, por lo tanto, no aparecerá una nueva banda digerida en un gel.

Los datos de estos ensayos indicaron que la incubación de las células nucleofectadas en presencia del Compuesto 1 dio como resultado la edición del gen SerpinaAI para introducir un fragmento de ADN de interés, aquí el sitio KpnI (FIG. 5). Estos datos mostraron que los inhibidores de ADNPK, como el Compuesto 1, pueden usarse para permitir o aumentar la capacidad de edición de genes.

Aunque esta divulgación se ha mostrado y descrito en particular con referencias a realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la técnica entenderán que pueden realizarse varios cambios en la forma y los detalles de la misma sin apartarse del alcance de la divulgación como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5};

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^{1 -4}-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 - 2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H;

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^{1 -4}, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}; y

en donde la una o más regiones genómicas objetivo se editan, opcionalmente en donde la eficiencia de la edición de las regiones genómicas objetivo en la una o más células se aumenta en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; y

en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

2. Un método para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de reparación dirigida por homología (HDR), opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una rotura de cadena doble de ADN (DSB), que comprende

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5};

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^{i -4}-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^{i -4}-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 - 2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H;

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}.

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde la rotura del ADN se repara por lo menos en parte a través de una vía HDR, opcionalmente en donde se aumenta la eficiencia de la reparación de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía HDR en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; y

en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

3. Un método para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una DSB de ADN, que comprende:

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 - 2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H.

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}; y

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde se inhibe o suprime la rotura del ADN a través de una vía NHEJ, opcionalmente en donde se aumenta la eficiencia de la inhibición o supresión de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía NHEJ en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; y

en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

4. Un método para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprende

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 -2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H.

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}.

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo de uno o más genes objetivo, lo que da como resultado la edición de la una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de uno o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociadas con el uno o más genes objetivo, opcionalmente en donde la rotura del ADN incluye una rotura de cadena doble de ADN (DSB); y

en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

5. Un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de editar una o más regiones genómicas, el método comprendiendo:

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, en donde el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^{i -4}-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 -2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H;

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^{1 -4}o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^{1 -4}, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 -2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}; y

en donde se editan la una o más regiones genómicas objetivo, opcionalmente en donde se aumenta la eficiencia de la edición de las regiones genómicas objetivo en la una o más células en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; y

en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

6. Un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas a través de una vía HDR, opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una DSB de ADN, el método comprendiendo:

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, en donde el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5};

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 - 2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H;

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}; y

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde la rotura del ADN se repara por lo menos en parte a través de una vía HDR, opcionalmente en donde se aumenta la eficiencia de la reparación de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía HDR en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; y

en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

7. Un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía NHEJ, opcionalmente en donde una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo comprende una DSB de ADN, el método comprendiendo:

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, en donde el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5};

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^{1 -4}-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 -2}.

cada R^A4es, independientemente, H o ²H;

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^{1 -4}, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}; y

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde se inhibe o suprime la rotura del ADN a través de una vía NHEJ, opcionalmente en donde se aumenta la eficiencia de la inhibición o supresión de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía NHEJ en comparación con otra célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto.

en donde launa o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

8. Un compuesto para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección con necesidad de editar una o más regiones genómicas objetivo en una o más células del sujeto, en donde el tratamiento comprende un método de modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, el método comprendiendo:

administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, en donde el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5};

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 - 2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H;

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^{1 -4}, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4};

en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo de uno o más genes objetivo, lo que da como resultado la edición de la una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de uno o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociados con el gen o genes objetivo, opcionalmente en donde una rotura de ADN comprende una DSB de ADN; y

en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (II), la Fórmula Estructural (II'), la Fórmula Estructural (II") o la Fórmula Estructural (II"):

o u n a s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m is m o o c o c r i s t a l d e l m is m o ,

e n d o n d e c a d a u n o d e R 1 y R 2 e s h id r ó g e n o o d e u t e r io .

10 . E l m é t o d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 4 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 5 - 7 , e n d o n d e d i c h a e f i c i e n c i a s e a u m e n t a p o r lo m e n o s 2 v e c e s , 3 v e c e s , 4 v e c e s , 5 v e c e s , 10 v e c e s , 15 v e c e s , 20 v e c e s , 25 v e c e s , 30 v e c e s , 40 v e c e s , 50 v e c e s o 10 0 v e c e s e n c o m p a r a c i ó n c o n e l d e u n a c é l u l a o c é l u l a s p o r lo d e m á s i d é n t i c a s p e r o s in c o m p u e s t o .

1 1 . E l m é t o d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 3 y 1 0 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c i o n e s 5 - 7 y 1 0 , e n d o n d e d i c h a e f i c i e n c i a s e m id e p o r la f r e c u e n c i a d e l a in t e g r a c ió n d e l p o l in u c le ó t id o o b je t i v o o m u t a g é n e s i s d i r ig id a , o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e l a m u t a g é n e s i s d i r i g i d a c o m p r e n d e m u t a c i o n e s p u n t u a l e s , d e l e c i o n e s y / o i n s e r c i o n e s .

1 2 . E l m é t o d o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 4 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 8 , e n d o n d e s e a u m e n t a la e x p r e s i ó n d e u n o o m á s g e n e s y / o p r o t e í n a s e n s e n t id o d e s c e n d e n t e a s o c i a d o s c o n e l g e n o g e n e s o b je t i v o e n c o m p a r a c i ó n c o n e l n iv e l d e e x p r e s i ó n d e r e f e r e n c i a e n la u n a o m á s c é l u l a s a n t e s d e la a d m i n i s t r a c i ó n , o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e d i c h a e x p r e s i ó n s e a u m e n t a e n p o r lo m e n o s u n 10 % , 20 % , 30 % , 4 0 % , 50 % , 60 % , 70 % , 80 % , 9 0 % , 1 v e z , 1 , 5 v e c e s , 2 v e c e s , 2 , 5 - v e c e s , 3 v e c e s , 3 , 5 v e c e s , 4 v e c e s , 4 , 5 v e c e s , 5 v e c e s o 10 v e c e s e n c o m p a r a c i ó n c o n e l n iv e l d e e x p r e s i ó n d e r e f e r e n c i a e n l a u n a o m á s c é l u l a s a n t e s d e l a a d m i n i s t r a c i ó n .

1 3 . E l m é t o d o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 4 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e l a r e i v i n d i c a c i ó n 8 , e n d o n d e l a e x p r e s i ó n d e u n o o m á s g e n e s y / o p r o t e í n a s e n s e n t id o d e s c e n d e n t e a s o c i a d o s c o n e l g e n o g e n e s o b je t i v o s e r e d u c e e n c o m p a r a c i ó n c o n e l n iv e l d e e x p r e s i ó n d e r e f e r e n c i a e n l a u n a o m á s c é l u l a s a n t e s d e la a d m i n i s t r a c i ó n , o e n d o n d e s e e l i m i n a s u s t a n c i a l m e n t e la e x p r e s i ó n d e u n o o m á s g e n e s y / o p r o t e í n a s e n s e n t id o d e s c e n d e n t e a s o c i a d o s c o n e l g e n o g e n e s o b je t i v o e n la u n a o m á s c é l u l a s , o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e la e x p r e s i ó n g é n i c a s e r e d u c e e n p o r lo m e n o s u n 1 0 % , 2 0 % , 30 % , 40 % , 5 0 % , 60 % , 7 0 % , 8 0 % , 90 % , 95 % , 9 6 % , 97 % , 98 % , o 9 9 % e n c o m p a r a c i ó n c o n e l n iv e l d e e x p r e s i ó n d e r e f e r e n c i a e n la u n a o m á s c é l u l a s a n t e s d e la a d m i n i s t r a c i ó n .

1 4 . E l m é t o d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 4 y 9 - 13 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 5 - 13 ,e n d o n d e la c é l u l a e s t á s i n c r o n i z a d a e n la f a s e d e l c i c l o c e l u l a r S o G 2 .

1 5 . E l m é t o d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 4 y 9 - 14 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 5 - 14 , e n d o n d e l a u n a o m á s c é l u l a s q u e s e a d m in is t r a n o s e p o n e n e n c o n t a c t o c o n d ic h o c o m p u e s t o t ie n e n u n a s u p e r v i v e n c i a a u m e n t a d a e n c o m p a r a c i ó n c o n u n a o m á s c é l u l a s q u e n o s e h a n a d m in is t r a d o o p u e s t o e n c o n t a c t o c o n d ic h o c o m p u e s t o .

1 6 . E l m é t o d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 4 y 9 - 15 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 5 - 1 5 , e n d o n d e e l s i s t e m a d e e d i c i ó n d e l g e n o m a y e l c o m p u e s t o s e a d m in is t r a n a la u n a o m á s c é l u l a s s i m u l t á n e a m e n t e o s e c u e n c i a l m e n t e , o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e e l s i s t e m a d e e d i c i ó n d e l g e n o m a s e a d m i n i s t r a a la u n a o m á s c é l u l a s a n t e s d e l c o m p u e s t o o e n d o n d e e l c o m p u e s t o s e a d m i n i s t r a a l a u n a o m á s c é l u l a s a n t e s d e l s i s t e m a d e e d i c i ó n d e l g e n o m a .

1 7 . E l m é t o d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 4 y 9 - 16 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 5 - 1 6 , e n d o n d e e l o r g a n i s m o e s u n m a m í f e r o o u n h u m a n o .

1 8 . E l m é t o d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 4 y 9 - 17 , o e l c o m p u e s t o p a r a e l u s o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 5 - 17 ,e n d o n d e e l s i s t e m a d e e d i c i ó n d e l g e n o m a y e l c o m p u e s t o s e a d m in is t r a n p o r la m i s m a v í a o p o r u n a v í a d if e r e n t e .

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-18, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-18, en donde el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores del tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo, opcionalmente en donde el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-19, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-19, en donde el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía que incluye: (i) un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; (ii) y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN direccionador o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que incluye una proteína Cas o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas, opcionalmente en donde dichos ARN direccionador y ARN activador se fusionan como una sola molécula, u opcionalmente en donde la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II, opcionalmente en donde la proteína Cas9 es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-19, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-19, en donde el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf y en donde el sistema CRISPR-Cpf incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el ARN guía que incluye un ARN direccionador que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo; y (b) un elemento de proteína Cpf que comprende una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cpf.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-21, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-21, en donde el sistema de edición del genoma se administra mediante uno o más vectores, opcionalmente en donde el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc, opcionalmente en donde los vectores virales son del grupo que consiste en vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-22, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-22, en donde el sistema de edición del genoma se administra mediante ARN sintético o mediante una nanoformulación.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-23, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-23, en donde el compuesto es:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-24, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-24, en donde el compuesto es un cocristal que comprenden un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I) o la Fórmula (I') y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-24, o el compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-24, en donde el compuesto es un compuesto es un cocristal que comprende: (a) el Compuesto 1 o el Compuesto 2; y (b) ácido adípico, opcionalmente en donde la relación molar de ácido adípico al Compuesto 1 o al Compuesto 2 es de aproximadamente 2 a 1.

27. Un kit o composición para editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende:

un sistema de edición del genoma; y

un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I) o la Fórmula Estructural (I'):

o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde

X es N, CR^{A 5}.

R^A1es F, alquilo C^{1 -4}, cicloalquilo C^3-5, alquilo OC^{1 -4}, alquilo OC^1-4-cicloalquilo C^{3 -5}, NH², alquilo NHC^{1 -4}, alquilo NHC^1-4-cicloalquilo C^3-5o alquilo C^0-4-heterociclilo, en donde dicho sistema de anillo heterocíclico se selecciona de oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo, y cada uno de dichos alquilo, cicloalquilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales, o hasta dos alquilo OC^{1 - 2};

cada R^A4es, independientemente, H o ²H;

R^A5es hidrógeno, F, alquilo C^1-4o alquilo OC^{1 -4}, en donde cada uno de dichos alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F o hasta tres átomos de ²H;

R^B3es alquilo C(O)NHC^1-4, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con hasta tres átomos de F, hasta tres átomos de ²H, hasta dos grupos OH no geminales o hasta dos alquilo OC^{1 - 2}; y cada R^B4es, independientemente, hidrógeno, deuterio, F o alquilo C^{1 -4}.

28. El kit o composición de la reivindicación 27, en donde, el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (II), la Fórmula Estructural (II'), la Fórmula Estructural (II") o la Fórmula Estructural (II'"):

3 2 . E l k it o c o m p o s i c i ó n d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 2 7 - 3 1 , e n d o n d e e l s i s t e m a d e e d ic ió n d e l g e n o m a s e i n c l u y e o e m p a q u e t a e n u n o o m á s v e c t o r e s , o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e e l u n o o m á s v e c t o r e s s e s e l e c c i o n a n d e v e c t o r e s v i r a l e s , p l á s m i d o s o A D N m c , o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e lo s v e c t o r e s v i r a l e s s e s e l e c c i o n a n d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n v e c t o r e s v i r a l e s r e t r o v i r a le s , l e n t iv i r a l e s , a d e n o v i r a l e s , a d e n o a s o c i a d o s y d e h e r p e s s im p l e x .

33. El kit o composición de cualquiera de las reivindicaciones 27-32, en donde el compuesto es:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

34. El kit o composición de cualquiera de las reivindicaciones 27-33, en donde el compuesto es un cocristal que comprende un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I) o Fórmula (II) y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.

35. El kit o composición de cualquiera de las reivindicaciones 27-34, en donde el compuesto es un cocristal que comprende (a) el Compuesto 1 o el Compuesto 2; y (b) ácido adípico en donde la relación molar de ácido adípico al Compuesto 1 o al Compuesto 2 es de aproximadamente 2 a 1.