TW202132565A - Ｇｉｎ重組酶變異體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種Gin重組酶催化域變異體及一種鋅指重組酶，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，且提供藉由使用該鋅指重組酶蛋白來修飾細胞之基因體或治療個體之病症的方法。

Description

GIN重組酶變異體
本發明屬於絲胺酸重組酶及基因編輯方法之領域。
靶向基因工程正驅動基礎研究、生物技術及基因療法之新領域的進展。包括鋅指重組酶(ZFN)、大範圍核酸酶、TAL效應子(TALEN)及CRISPR/Cas系統之位點特異性核酸內切酶大大增強研究人員可將靶向基因修飾引入至細胞及生物體中的速度及效率。
儘管位點特異性核酸酶是多功能的且促進廣泛範圍之基因改變，但其依賴於諸如非同源末端連接(NHEJ)及同源定向修復(HDR)之細胞DNA修復機制來誘導定製改變。然而，某些細胞類型內缺乏DNA修復路徑之可獲得性可能降低此技術之效用。詳言之，已顯示，核酸酶誘導DNA雙股斷裂(DSB)或鏈裂對HDR之不良誘導為實現高位點特異性整合率之主要限制因素。
位點特異性重組酶(SSR，例如Cre、Flp、phiC31及Bxb1)表示用於靶向基因工程之習知位點特異性核酸酶的通用替代物。SSR為促進DNA之區段之間的高保真DNA重排(例如整合、切除或倒位)的極特殊之酶。然而，許多SSR系統證實之精確目標特異性限制了其在需要具有高度靈活識別能力之工具的學科中之採用。
由來源於絲胺酸重組酶之解離酶/轉化酶家族(例如Gin、Hin、Tn3及γδ)的催化域構成的雜合重組酶代表了一種有前景的基因工程工具，該催化域與定製設計之鋅指或TAL效應子DNA結合域或CRISPR/Cas系統融合。詳言之，鋅指重組酶(ZFR)為一類能夠將靶向修飾引入至哺乳動物細胞中的嵌合蛋白。ZFR重組由兩個鋅指結合位點組成的雜合目標位點，該等鋅指結合位點側接藉由重組酶催化域識別之中心20-bp核心序列。不同於靶向核酸酶及習知SSR系統，ZFR特異性為模組化位點特異性DNA識別及序列依賴性催化之協同產物。
藉由使用各種選擇策略，已鑑別出允許最小識別序列之間的無限制重組的重組酶突變體。由於鋅指域可經組裝以識別多種獨特序列，所以此等催化域與定製鋅指蛋白之融合允許設計具有廣泛靶向能力之雜合重組酶。亦已鑑別出支援不依賴輔因子(Fis)之催化的「高度活化」突變。此等突變對於非天然系統(諸如真核生物體)中之重組酶的應用而言十分重要。不管其特異性識別DNA區段之能力如何，一些定製設計之ZFR以極低特異性靶向整合。此外，當前設計之ZFR之靶向整合效率通常極低(約0.5%)。
因此，仍持續需要研發能夠實現較高靶向整合，同時維持對目標序列之高特異性的新穎ZFR。
本發明提供顯示高靶向整合效率之高度活化Gin重組酶變異體。此等變異體適用於例如外源性序列之整合或基因體中之非所需序列之缺失或基因體中序列之倒位。
在第一態樣中，本發明提供一種Gin重組酶催化域變異體，其相對於Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代，該Gin重組酶催化域包含如以下序列中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代。在一些實施例中，該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含Ile94Val胺基酸取代。在一些實施例中，該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 61。
在第二態樣中，本發明提供一種編碼如本文所揭示之Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸。在一些實施例中，編碼該Gin重組酶催化域變異體之核酸序列包含SEQ ID NO: 7中所列之核苷酸序列。
在第三態樣中，本發明提供一種鋅指重組酶，其包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於包含如以下序列中之任一者中所列之胺基酸序列的Gin重組酶催化域，該Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，該鋅指重組酶包含Gin重組酶催化域變異體，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代。在一些實施例中，該鋅指重組酶包含Gin重組酶催化域變異體，該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，該鋅指重組酶包含Gin重組酶催化域變異體，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含Ile94Val胺基酸取代。在一些實施例中，該鋅指重組酶包含Gin重組酶催化域變異體，該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 61。
在一些實施例中，該鋅指重組酶蛋白為多聚體蛋白。在一些實施例中，該鋅指重組酶蛋白為同源多聚體蛋白。在一些實施例中，該鋅指重組酶蛋白為異源多聚體蛋白。在一些實施例中，該鋅指重組酶蛋白為二聚體蛋白。在一些實施例中，該鋅指重組酶蛋白為同源二聚體蛋白。在一些實施例中，該鋅指重組酶蛋白為異源二聚體蛋白。在一些實施例中，該鋅指重組酶為四聚體蛋白。在一些實施例中，該四聚體蛋白為同源四聚體蛋白。在一些實施例中，該四聚體蛋白為異源四聚體蛋白。
在一些實施例中，該鋅指核苷酸結合域包含如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所列之序列。
在一些實施例中，該鋅指重組酶結合包含如SEQ ID NO: 15中所列之序列的核苷酸序列。
在一些實施例中，該鋅指核苷酸結合域能夠結合內源性基因座。視情況，該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)基因、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。視情況，該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)基因及安全港基因座。
在第四態樣中，本發明提供一種編碼本發明之該鋅指重組酶之聚核苷酸。在一些實施例中，編碼該Gin重組酶催化域變異體之核酸序列包含SEQ ID NO: 7中所列之核苷酸序列。
在第五態樣中，本發明提供一種載體，其包含本發明之編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸或本發明之該鋅指重組酶。在一些實施例中，該載體包含本發明之編碼Gin重組酶催化域變異體之該聚核苷酸。在一些實施例中，該載體包含本發明之該鋅指重組酶。
在第六態樣中，本發明提供一種細胞，其包含本發明之該載體、Gin重組酶催化域變異體、編碼該Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸、鋅指重組酶或編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸。在一些實施例中，該細胞包含載體，該載體包含本發明之編碼該Gin重組酶催化域變異體之該聚核苷酸或本發明之該鋅指重組酶。在一些實施例中，該細胞包含本發明之該Gin重組酶催化域變異體。在一些實施例中，該細胞包含本發明之該鋅指重組酶。在一些實施例中，該細胞包含本發明之編碼該Gin重組酶催化域變異體之該聚核苷酸。在一些實施例中，該細胞包含本發明之編碼該鋅指重組酶之該聚核苷酸。
在一些實施例中，該細胞為真核細胞。在一些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，該細胞為幹細胞。在一些實施例中，該細胞為人類細胞。
在第七態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之該載體、Gin重組酶催化域變異體、編碼該Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸、鋅指重組酶或編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸。在一些實施例中，該醫藥組合物包含本發明之該Gin重組酶催化域變異體或本發明之該鋅指重組酶。在一些實施例中，該醫藥組合物包含本發明之該Gin重組酶催化域變異體。在一些實施例中，該醫藥組合物包含本發明之該鋅指重組酶。在一些實施例中，該醫藥組合物包含編碼本發明之該Gin重組酶催化域變異體或本發明之該鋅指重組酶之聚核苷酸。在一些實施例中，該醫藥組合物包含編碼本發明之該Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸。在一些實施例中，該醫藥組合物包含編碼本發明之該鋅指重組酶之聚核苷酸。
在第八態樣中，本發明提供一種修飾細胞之基因體的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或編碼本發明之該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，修飾細胞之基因體之該方法包含將本發明之該鋅指重組酶引入至該細胞中。在一些實施例中，修飾細胞之基因體之該方法包含將本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
在第九態樣中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。在一些實施例中，將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的該方法包含將本發明之鋅指重組酶引入至細胞中。在一些實施例中，將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的該方法包含將本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。在一些實施例中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶引入至該細胞中。在一些實施例中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
在第十態樣中，本發明提供一種破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的該方法包含將本發明之鋅指重組酶引入至該細胞中。在一些實施例中，破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的該方法包含將本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，本發明提供一種破壞細胞之基因中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，破壞細胞之基因中之目標核苷酸序列的該方法包含將本發明之鋅指重組酶引入至該細胞中。在一些實施例中，破壞細胞之基因中之目標核苷酸序列的該方法包含將本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
在第十一態樣中，本發明提供一種切除細胞之基因體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的該方法包含將本發明之鋅指重組酶引入至該細胞中。在一些實施例中，自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的該方法包含將本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。在一些實施例中，自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的該方法包含將鋅指重組酶引入至該細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的該方法包含將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的該方法包含將非同源末端連接(NHEJ)抑制劑引入至該細胞中。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在第十二態樣中，本發明提供一種切除細胞之染色體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
在第十三態樣中，本發明提供一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中來修飾該細胞之基因體中之目標序列。在一些實施例中，治療個體之病症的方法包含藉由將本發明之鋅指重組酶引入至細胞中來修飾該細胞之基因體中之目標序列。在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含藉由將本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中來修飾該細胞之基因體中之目標序列。在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含藉由將本發明之鋅指重組酶引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列。在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含自細胞之基因體切除目標序列，聚核苷酸編碼本發明之鋅指重組酶。在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，治療病症之該方法進一步包含投與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在第十四態樣中，本發明提供一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含修飾該細胞之該基因體中之目標序列，包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的該方法包含修飾該細胞之該基因體中之目標序列，包含將本發明之鋅指重組酶引入至該細胞中。在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的方法包含修飾該細胞之該基因體中之目標序列，包含將本發明之編碼該鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的該方法包含藉由將本發明之鋅指重組酶引入至該細胞中而自該細胞之該基因體切除目標序列。在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的該方法包含將本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中而自該細胞之該基因體切除目標序列。在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至該細胞中而自該細胞之該基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中來切除該細胞之該基因體中之目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的該方法進一步包含非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在一些實施例中，用於本文所揭示之該等方法中之該細胞為真核細胞。在一些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，該細胞為幹細胞。在一些實施例中，該細胞為人類細胞。
在一些實施例中，本文所揭示之該等方法不依賴於Fis。
在一些實施例中，使用質體、病毒載體、微環或線形DNA形式將用於本文所揭示之該等方法中的編碼該鋅指重組酶之該聚核苷酸引入至該細胞中。
在一些實施例中，用於本文所揭示之該等方法中之該目標核苷酸序列為內源性基因座。視情況，該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。視情況，該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)及安全港基因座。
在第十五態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於修飾細胞之基因體。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於修飾細胞之基因體。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於修飾細胞之基因體。
在第十六態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中。
在第十七態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列。
在第十八態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種鋅指重組酶，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，本發明提供一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的本發明之該鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸係與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑組合使用。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在第十九態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症。
在第二十態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症。
在一些實施例中，本發明提供一種鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，本發明提供一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的本發明之該鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸係與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑組合使用。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在第二十一態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。
在第二十二態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。
在一些實施例中，本發明提供一種鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，本發明提供一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的本發明之該鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸係與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑組合使用。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在第二十三態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備修飾細胞之基因體的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶之用途，其用於製備修飾細胞之基因體的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備修飾細胞之基因體的藥物。
在第二十四態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶的用途，其用於製備將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的藥物。
在第二十五態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶的用途，其用於製備破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的藥物。
在第二十六態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物。
在一些實施例中，本發明提供一種鋅指重組酶之用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，本發明提供一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物的本發明之該鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途進一步包含使用非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在第二十七態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症的藥物。
在第二十八態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物。
在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，本發明提供一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物的本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途係與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑組合使用。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
在第二十九態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。
在第三十態樣中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備校正細胞之基因體中之致病突變的藥物。
在一些實施例中，本發明提供一種鋅指重組酶之用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，本發明提供一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物的本發明之該鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途係與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑組合。在一些實施例中，該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。在一些實施例中，該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年11月1日申請之美國臨時申請案第62/929,563號之優先權及權益，其內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全文以引用的方式併入本文中。2020年10月27日創建之該ASCII複本命名為000222-0006-WO1_SL.txt且大小為95,323個位元組。
本發明提供具有改良靶向整合效率之絲胺酸重組酶變異體、包含該重組酶變異體之組合物及藉由整合外源性序列、切除內源性序列或藉由破壞非所需序列編輯基因體的方法。
藉由使用各種選擇策略，已鑑別出超活化之ZFR突變體。經定製設計之ZFR以高精確度及接近20%之靶向整合效率靶向外源性序列之整合。
本發明描述能夠以高精確度及靶向整合效率整合外源性核苷酸序列或切除內源性目標核苷酸序列的鋅指重組酶變異體蛋白；包含該重組酶之細胞及醫藥組合物；修飾細胞之基因體的方法；整合外源性核苷酸序列的方法；及使用該重組酶變異體使目標序列缺失的方法。通用
除非另有指示，否則本文所揭示之方法的實踐以及組合物的製備及使用採用分子生物學、生物化學、染色體結構及分析、計算化學、細胞培養、重組DNA及在此項技術之技藝內之相關領域中的習知技術。此等技術在文獻中已予以充分說明。參見例如Sambrook等人 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989及第三版, 2001；Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987及定期更新；系列METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 第三版, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, 第304卷, 「Chromatin」 (P.M. Wassarman及A. P. Wolffe編), Academic Press, San Diego, 1999；及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第119卷, 「Chromatin Protocols」 (P.B. Becker編) Humana Press, Totowa, 1999。定義
術語「本文中」意謂整個申請案。
除非本文另有定義，否則本申請案中所用之科學及技術術語應具有本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常理解之含義。一般而言，與本文所描述之化合物、組合物及方法結合使用之命名法為此項技術中熟知且常用之彼等命名法。
應理解，除非明確否認或不當，否則本文所描述之任一實施例，包括在本發明之不同態樣及本說明書之不同部分中所描述之實施例(包括僅在實例中描述之實施例)可與本發明之一或多個其他實施例組合。實施例之組合不限於由多個附屬請求項所主張之彼等特定組合。
本申請案中所提及之所有公開案、專利及公開之專利申請案特定言之係以引用之方式併入本文中。在有衝突之情況下，以本說明書(包括其特定定義)為主。
在本說明書通篇中，字語「包含(comprise)」或諸如「含有(comprises)」或「含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所陳述之整體(或組分)或整體(或組分)之群組，但不排除任何其他整體(或組分)或整體(或組分)之群組。
在本說明書通篇中，當將組合物描述為具有、包括或包含(或其變化形式)特定組分時，預期組合物亦可基本上由所述組分組成或由其組成。類似地，當將方法或製程描述為具有、包括或包含特定製程步驟時，製程亦可基本上由所述處理步驟組成或由其組成。另外，應理解，步驟之次序或執行某些動作之次序不重要，只要本文所描述之組合物及方法保持可操作即可。此外，可同時進行兩個或更多個步驟或動作。
如本文所用之術語「包括」意謂「包括但不限於」。「包括」及「包括但不限於」可互換使用。因此，此等術語應理解為暗示包括所陳述之整數(或組分)或整體(或組分)之群組，但不排除任何其他整體(或組分)或整體(或組分)之群組。
如本文所用，「約」或「大約」意謂在如由一般熟習此項技術者所測定的特定值之可接受誤差範圍內，該誤差範圍將部分取決於如何量測或測定該值，亦即量測系統之侷限性。
除非本文另有指示或明顯與上下文相矛盾，否則在描述要素之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)使用術語「一」及「該」及類似指示物應理解為涵蓋單數及複數。
除非上下文另有明確指示，否則如本文所用之術語「或」應理解為意謂「及/或」。
除非本文另有指示，否則本文中值範圍之列舉僅意欲充當個別提及屬於該範圍內之各獨立值的簡寫方法，且各獨立值併入至本說明書中，如同在本文中個別列舉一般。除非本文另有指示或另外明顯與上下文相矛盾，否則本文所描述之所有方法可以任何適合之次序執行。除非另有說明，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)的使用僅意欲更好地說明實施例，而不對申請專利範圍之範疇構成限制。本說明書中之語言均不應解釋為表示任何未主張之要素為必不可少的。
術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」可互換使用，且係指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，其呈線形或環形構形，且呈單股或雙股形式。出於本發明之目的，此等術語不應理解為對聚合物之長度具有限制性。該等術語可涵蓋天然核苷酸之已知類似物，以及在鹼基、糖及/或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯主鏈)中經修飾之核苷酸。一般而言，特定核苷酸之類似物具有相同鹼基配對特異性；亦即A之類似物將與T鹼基配對。
如本文所用之術語「結合」係指大分子之間(例如蛋白質與核酸之間)的序列特異性、非共價相互作用。並非結合相互作用之全部組分均需要為序列特異性的(例如與DNA主鏈中之磷酸酯殘基接觸)，只要整體相互作用為序列特異性的即可。此類相互作用一般以10- 6 M- 1 或更低之解離常數(Kd )為特徵。「親和力」係指結合強度：增加之結合親和力與較低Kd 相關。「非特異性結合」係指在任何所關注分子(例如經工程改造核酸酶)與不為依賴性目標序列之大分子(例如DNA)之間發生的非共價相互作用。
如本文所用之術語「染色體(chromosome)」係指包含細胞之整個或部分基因體的染色質複合體。細胞之基因體通常以其核型為特徵，核型為包含細胞之基因體之所有染色體的集合。細胞之基因體可包含一或多個染色體。
如本文所用之術語「裂解」係指DNA分子之共價主鏈的斷裂。裂解可藉由多種方法，包括但不限於磷酸二酯鍵之酶或化學水解引發。單股裂解及雙股裂解均為可能的，且雙股裂解可由於兩個獨特單股裂解事件而發生。DNA裂解可致使產生鈍端或交錯末端。在某些實施例中，融合多肽用於靶向雙股DNA裂解。
如本文所用之「DNA結合分子」係指可結合於DNA之分子。此類DNA結合分子可為多肽、蛋白質域、較大蛋白質內之域或聚核苷酸。在一些實施例中，聚核苷酸為DNA，而在其他實施例中，聚核苷酸為RNA。在一些實施例中，DNA結合分子為核酸酶之蛋白質域(例如鋅指域)。
如本文所用之「DNA結合蛋白」或「結合域」係指蛋白質或較大蛋白質內之域，其以序列特異性方式，例如經由一或多個鋅指或經由分別與鋅指蛋白或TALE中之一或多個重複可變二殘基(RVD)相互作用而結合DNA。
如本文所用之「鋅指DNA結合蛋白」或「鋅指核苷酸結合域」係指經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之蛋白質或較大蛋白質內之域，該等鋅指為經由一或多個鋅離子之配位而使其結構穩定的結合域內之胺基酸序列之區域。術語鋅指DNA結合蛋白通常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。
「外源性」序列為通常不存在於特定細胞之基因體中，但可藉由一或多種遞送方法引入至細胞中的序列。外源性核酸可包含治療性基因、引入至細胞中之質體或游離基因體或通常不存在於細胞中之染色體。將外源性分子引入至細胞中之方法為熟習此項技術者所知，且包括但不限於脂質介導之轉移(亦即脂質體，包括中性及陽離子型脂質)、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沈澱、DEAE-聚葡萄糖介導之轉移及病毒載體介導之轉移。外源性核酸亦可與內源性分子為相同分子類型，但來源於與細胞所源於之物種不同的物種。舉例而言，人類核酸序列可引入至最初來源於小鼠或倉鼠之細胞株中。
如本文所用，術語「外源性核酸之產物」包括聚核苷酸及多肽產物，例如轉錄產物(聚核苷酸，諸如RNA)及轉譯產物(多肽)。
「內源性」分子或序列為通常存在於在特定環境條件下處於特定發育階段之特定細胞中的分子。舉例而言，內源性核酸可包含染色體；粒線體、葉綠體或其他細胞器之基因體；或天然存在之游離型核酸。額外內源性分子可包括蛋白質，例如轉錄因子及酶。
「真核」細胞包括但不限於真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞(例如T細胞)，包括幹細胞(多能及多潛能)。
術語「切除」、「靶向切除」、「缺失」及「靶向缺失」在本文中可互換使用且係指移除用於其內源性基因座的所關注之DNA或核苷酸序列。所關注之核苷酸序列可為基因體中之重複核苷酸序列(亦稱作重複事件)。待切除之靶向核苷酸序列可在小於100個鹼基至兆鹼基之範圍內。
「融合」分子或其任何變化形式為兩個或更多個次單元分子較佳共價連接的分子。次單元分子可為相同化學類型之分子，或可為不同化學類型之分子。融合分子之實例包括但不限於融合蛋白(例如，鋅指DNA結合域與重組酶之間的融合)及融合核酸(例如編碼融合蛋白之核酸)。
如本文所用之「基因」包括編碼基因產物之DNA區(參見下文)以及調控基因產物之產生之所有DNA區，無論此類調控序列是否鄰近於編碼序列及/或轉錄序列。因此，基因包括但不一定限於啟動子序列、終止子、轉譯調控序列(諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點)、強化子、靜默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附接位點及基因座控制區。
如本文所用之「基因表現」係指基因中所含之資訊轉化成基因產物。基因產物可為基因之直接轉錄產物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核糖核酸酶、結構RNA或任何其他類型之RNA)，或由mRNA轉譯產生之蛋白質。基因產物亦包括藉由諸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化及編輯之過程修飾之RNA，及藉由例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、豆蔻醯化及糖基化修飾之蛋白質。
如本文所用之「側接」係指直接位於所關注之目標核苷酸序列或核苷酸序列之5'端(亦即，上游)或3'端(亦即，下游)的核苷酸序列。舉例而言，兩個ZFR結合位點可側接待切除之目標核苷酸序列之5'及3'端。在胺基酸序列之情形下，「側接」係指位於所關注之目標胺基序列或胺基酸序列之N端(上游)或C端(下游)的胺基酸序列。
「重組酶」為催化DNA序列內之位點特異性重組事件的酶家族(參見例如Esposito, D.及Scocca, J. J., Nucleic Acids Research 25, 3605-3614 (1997)；Nunes-Duby, S. E.等人, Nucleic Acids Research 26, 391-406 (1998)；Stark, W. M.等人, Trends in Genetics 8, 432-439 (1992))。
如本文所用之「Gin重組酶」或「Gin重組酶蛋白」係指埃希氏菌屬(Escherichia ) 噬菌體μ中發現之酶(絲胺酸重組酶)。該酶能夠進行編碼兩個尾絲蛋白替代對之病毒區段(G區段)之倒位，從而調節病毒之宿主特異性。在細菌中，該酶以二聚體形式結合病毒gix位點，該等位點為側接可逆G區段且在宿主因子Fis存在下催化位點特異性重組的34-bp回文序列。結合至各gix位點之Gin二聚體及結合至強化子之宿主因子Fis一起形成突觸複合體，且各Gin單體引入鏈裂且變得共價連接至DNA之5'-磷酸根，從而導致兩個重組位點處之雙股交錯斷裂。圍繞四聚體界面之180度旋轉繼之以DNA之再連接使得G區段倒位(G+或G-定向)。Plasterk R.H.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:2689-2692 (1984)。
如本文所用之術語「Gin重組酶催化域」係指Gin重組酶之催化域。Gin催化域識別由兩個鋅指蛋白結合位點側接之20-bp核心序列。Smith MC等人, Mol Microbiol; 44:299-307 (2002)。Gin重組酶催化域藉由催化同一DNA分子上兩個特定重組位點之間的倒位來介導所需核苷酸序列之切除及整合。術語「高度活化」或「超活化」突變重組酶用於指示能夠具有不依賴輔因子(Fis)之重組酶活性的突變體。產生超活化變異體之突變殘基通常位於活性位點絲胺酸附近，且可藉由最佳地定位DNA以進行裂解及股裂解來增強催化。Gin重組酶催化域之高度活化取代或突變之實例包括但不限於D12G、N14S、K50E、M70V、I94V及H106Y或其組合。已研發歸因於寬鬆或變化核心序列需求而具有增大靶向範圍的若干Gin重組酶變異體，包括α、β、γ、δ、ε及ζ。本文所用之Gin重組酶催化域可指代α、β、γ、δ、ε或ζ變異體中之任一者之催化域。在一些實施例中，Gin重組酶催化域為γ Gin重組酶催化域。術語「Gin重組酶催化域變異體」及「Gin重組酶變異體」在本文中可互換使用。
術語「異源」意謂來源於與所比較之其他實體相比基因型獨特之實體。舉例而言，藉由基因工程技術引入至來源於不同物種之質體或載體中的聚核苷酸為異源聚核苷酸。
如本文所用之術語「插入缺失%」係指基因體之目標序列中若干核苷酸的插入或缺失之百分比。
基因表現之「調節」(或其變化形式)係指基因活性之變化。表現之調節可包括但不限於基因活化及基因抑制。基因體編輯(例如裂解、改變、不活化、隨機突變)可用於調節表現。基因不活化係指相較於不包括如本文所描述之ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統之細胞，基因表現之任何降低。因此，基因不活化可為部分或完全的。
如本文所用之術語「可操作連接」及「以可操作方式連接」(或「可操作地連接」)或其變化形式在提及兩種或更多種組分(諸如序列元件)之併接之情況下可互換使用，其中組分經配置以使得兩種組分均正常起作用，且使得組分中之至少一者可介導施加於其他組分中之至少一者之功能成為可能。舉例說明，Gin重組酶催化域以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域。Gin重組酶催化域以可操作方式與鋅指核苷酸結合域順式連接，但不必與其直接相鄰。舉例而言，連接子序列可位於兩個序列之間。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物。該術語亦適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸為對應天然存在之胺基酸的化學類似物或經修飾衍生物。
如本文所用之術語「安全港(safe-harbor)基因座或位點」為基因或其他基因元件可安全地插入及表現之基因體基因座，因為已知其對基因修飾具有耐受性而無任何非所需作用。
術語「序列」係指任何長度之核苷酸序列，其可為DNA或RNA；可為線形、環形或分支的，且可為單股或雙股的。術語「序列」亦指代任何長度之胺基酸序列。術語「轉殖基因」係指插入至基因體中之核苷酸序列。轉殖基因可具有任何長度，例如長度為2至100,000,000個核苷酸(或其間或其以上之任何整數值)，長度為約100至100,000個核苷酸(或其間之任何整數)，長度為約2000至20,000個核苷酸(或其間之任何值)，或約5至15 kb (或其間之任何值)。
如本文所用之術語「特異性」(或其變化形式)係指核酸酶能夠精確地在特定位置結合目標序列。術語「特異性」及「精確度」可互換使用。
術語「個體」及「患者」可互換使用，且係指哺乳動物，包括但不限於人類患者及非人類靈長類動物，以及實驗動物，諸如兔、狗、貓、大鼠、小鼠及其他動物。因此，如本文所用之術語「個體」或「患者」意謂可投與本發明之表現卡匣的任何哺乳動物患者或個體。本發明之個體包括患有病症之彼等個體。
如本文所用之術語「目標核苷酸序列」係指位於細胞之基因體中之核苷酸序列，其由本發明之鋅指核酸酶蛋白之鋅指核苷酸結合域特異性識別。
如本文所用之術語「治療(treating/treatment)」係指降低症狀之嚴重度及/或頻率、消除症狀及/或根本病因、預防症狀及/或其根本病因之出現及改善或修復損傷。癌症、單基因病及移植物抗宿主疾病為可使用本文所描述之組合物及方法治療之病況的非限制性實例。
聚核苷酸「載體」或「構築體」能夠將基因序列轉移至目標細胞。通常，「載體構築體」、「表現載體」、「表現構築體」、「表現卡匣」及「基因轉移載體」意謂能夠導引所關注基因之表現且可將基因序列轉移至目標細胞的任何核酸構築體。因此，該術語包括選殖及表現媒劑以及整合載體。
如本文所用，術語「變異體」係指具有與參考聚核苷酸或多肽基本上類似的序列之聚核苷酸或多肽。在聚核苷酸之情況下，相較於參考聚核苷酸，變異體可在5'端、3'端及/或一或多個內部位點處具有一或多個核苷酸之缺失、取代、添加。變異體與參考聚核苷酸之間的序列類似性及/或差異可使用此項技術中已知之習知技術(例如聚合酶鏈反應(PCR)及雜合技術)偵測。變異體聚核苷酸亦包括合成衍生之聚核苷酸，諸如例如藉由使用定點突變誘發產生之聚核苷酸。一般而言，如藉由熟習此項技術者已知之序列比對程式所測定，包括但不限於DNA之聚核苷酸之變異體可與參考聚核苷酸具有至少約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大的序列一致性。在多肽之情況下，相較於參考多肽，變異體可具有一或多個胺基酸之缺失、取代、添加。變異體與參考多肽之間的序列類似性及/或差異可使用此項技術中已知之習知技術(例如西方墨點法(Western blot))偵測。一般而言，如藉由熟習此項技術者已知之序列比對程式所測定，多肽之變異體可與參考多肽具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大的序列一致性。
如本文所用之術語「鋅指核酸酶蛋白」或「鋅指核酸酶」係指包含直接或間接地連接至DNA裂解域(例如Fok I DNA裂解域)之鋅指DNA結合域(ZFP)的蛋白質。術語鋅指核酸酶蛋白縮寫為鋅指核酸酶或ZFN。裂解域可直接連接至ZFP。或者，裂解域係藉助於介入序列(例如連接子)連接至ZFP。連接子區為包含約1至150個胺基酸之序列。或者，連接子區為包含約6至50個核苷酸之序列。該術語包括一個ZFN以及二聚合以裂解目標基因之一對ZFN (該對之成員被稱作「左及右」或「第一及第二」或「對」)。一對ZFN可被稱作「左及右」、「第一及第二」或「對」且可二聚合以裂解目標基因。
如本文所用之「鋅指重組酶蛋白」或「鋅指重組酶」為包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之重組酶蛋白(例如絲胺酸重組酶，包括例如Gin重組酶)之催化域的雜合重組酶蛋白。術語鋅指重組酶蛋白通常縮寫為鋅指重組酶或ZFR。鋅指重組酶蛋白可為多聚體(例如同源多聚體或異源多聚體)。在一些實施例中，鋅指重組酶蛋白為二聚體。在一些實施例中，鋅指重組酶蛋白為同源二聚體。在一些實施例中，同源二聚體包含兩個γ Gin重組酶。在一些實施例中，鋅指重組酶蛋白為異源二聚體。在一些實施例中，異源二聚體包含含有γ Gin重組酶之單體及含有選自以下之群之Gin重組酶變異體的另一單體：α、β、δ、ε及ζ。在一些實施例中，鋅指重組酶蛋白為四聚體。ZFR目標位點通常包括側接藉由絲胺酸重組酶催化域識別之20-bp核心序列的兩個鋅指蛋白結合位點。 Gin重組酶
在一個態樣中，本文所揭示之主題係關於一種Gin重組酶催化域變異體，其相對於包含如以下序列中之任一者中所列之胺基酸序列的Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。
在一些實施例中，相對於包含以下序列中之任一者中所列之胺基酸序列的Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體僅包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，相對於包含以下序列中之任一者中所列之胺基酸序列的Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體僅包含Phe104Asn胺基酸取代且無其他高度活化突變(例如D12G、N14S、K50E、M70V、I94V及H106Y)：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體進一步包含修飾(例如取代、插入、缺失)。視情況，相對於包含如以下中所列之胺基酸序列的Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。視情況，相對於包含如以下中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代及His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。視情況，相對於包含如以下中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含Ile94Val胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。視情況，相對於包含如以下中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代及Ile94Val胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 31)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRIGGRPPKSG。
在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 32)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 33)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERVMAGLAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 34)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERLSILERPMAGHAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 35)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTSAGRAAAINKGRIMGRPRKSG。
在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 1)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVST NDQNTDLQRN ALVCAGCEQI FEDKLSGTRT DRPGLKRALK RLQKGDTLVV WKLDRLGRSM KHLISLVGEL RERGINFRSL TDSIDTSSPM GRFFFHVMGA LAEMERELIL ERVMAGIAAA RNKGRRWGRP P。
在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含SEQ ID NO: 3中所列之序列，其相對於Gin重組酶催化域(SEQ ID NO: 1)包含Phe104Asn取代。在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含與參考SEQ ID NO: 3具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性的胺基酸序列，如藉由熟習此項技術者已知之序列比對方案所測定。在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列，其相對於Gin重組酶催化域(SEQ ID NO: 1)包含Phe104Asn取代。在一些實施例中，Gin重組酶催化域變異體包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列，但不包含其他高度活化突變，諸如D12G或H106Y。
在一些實施例中，編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸序列包含下文SEQ ID NO: 6中所列之序列：
atg ctg atc ggc tat gtg cgg gtg tcc acc aac gac cag aac acc gac ctg cag aga aac gcc ctt gtg tgt gcc gga tgc gag cag atc ttc gag gat aag ctg agc ggc acc aga acc gac aga ccc gga ctg aag aga gcc ctg aag aga ctg cag aaa ggc gac acc ctg gtc gtg tgg aag ctg gat aga ctg ggc cgc agc atg aag cac ctg atc agc ctt gtg ggc gag ctg aga gag cgg ggc atc aac ttt aga agc ctg acc gac agc atc gac aca agc agc cct atg ggc aga ttc ttc ttc tac gtg atg ggc gcc ctg gcc gag atg gaa aga gag ctg atc ctg gag aga gtc atg gcc gga atc gcc gct gcc aga aac aag gga aga aga tgg ggc cgg cca cct aag tct ggc aca ggc gag agg ccc ttc cag tgt cga atc tgc atg。
在一些實施例中，編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸序列包含下文SEQ ID NO:7中所列之序列，其編碼相對於Gin重組酶催化域(SEQ ID NO: 6)包含Phe104Asn取代的Gin重組酶催化域：
atg ctg atc ggc tat gtg cgg gtg tcc acc aac gac cag aac acc gac ctg cag aga aac gcc ctt gtg tgt gcc gga tgc gag cag atc ttc gag gat aag ctg agc ggc acc aga acc gac aga ccc gga ctg aag aga gcc ctg aag aga ctg cag aaa ggc gac acc ctg gtc gtg tgg aag ctg gat aga ctg ggc cgc agc atg aag cac ctg atc agc ctt gtg ggc gag ctg aga gag cgg ggc atc aac ttt aga agc ctg acc gac agc atc gac aca agc agc cct atg ggc aga ttc aac ttc cat gtg atg ggc gcc ctg gcc gag atg aga tgg ggc cgg cca cct。
在一些實施例中，本發明之Gin重組酶核苷酸序列包含與參考SEQ ID NO: 7至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大之序列一致性，如藉由熟習此項技術者已知之序列比對方案所測定。
本文亦提供載體，其包含編碼如本文所描述之Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸序列。適合之載體包括但不限於質體、病毒載體、微環及線形DNA形式。亦提供含有該等聚核苷酸序列或載體之宿主細胞。前述Gin重組酶催化域變異體、編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸、載體或細胞中之任一者可用於本文所揭示之方法中。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含：如本文所揭示之Gin重組酶催化域變異體；及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含：如本文所揭示之編碼Gin重組酶變異體之聚核苷酸；及醫藥學上可接受之載劑。 鋅指重組酶
在一個態樣中，本文所揭示之主題係關於維持對目標序列之高特異性及目標序列中之高目標整合率的鋅指重組酶(ZFR)變異體之鑑別。因此，本文描述鋅指重組酶蛋白，其包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
本發明之鋅指重組酶變異體以二聚體形式結合目標核苷酸序列，從而經由催化域與目標序列相互作用，其中兩個單體中之每一者之DNA結合域與目標核苷酸序列相互作用，而第二鋅指重組酶變異體二聚體與供體核苷酸序列相互作用。二聚體可為同源二聚體或異源二聚體(例如包含兩個γ-γ Gin重組酶變異體，或一個γ Gin重組酶變異體及一個δ或α或β或ε或ζ Gin重組酶變異體)。
在一些實施例中，鋅指重組酶變異體包含Gin絲胺酸重組酶催化域變異體及異源性DNA結合域(鋅指核苷酸結合域)。在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含如SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體進一步包含修飾(例如取代、插入、缺失)。視情況，相對於包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代。視情況，相對於包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn及His106Tyr胺基酸取代。視情況，相對於包含如SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域胺基酸包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及His106Tyr胺基酸取代的Gin重組酶催化域。
在一些實施例中，鋅指重組酶變異體包含Gin絲胺酸重組酶催化域變異體及異源性DNA結合域(鋅指核苷酸結合域)。在一些實施例中，相對於包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含苯丙胺酸104經天冬醯胺之取代。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含如SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體進一步包含修飾(例如取代、插入、缺失)。視情況，相對於包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含Ile94Val胺基酸取代。視情況，相對於包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn及Ile94Val胺基酸取代。視情況，相對於包含如SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含Ile94Val胺基酸取代。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域包含Ile94Val胺基酸取代之Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及Ile94Val胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域包含Ile94Val胺基酸取代之Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及Ile94Val胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域胺基酸包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域包含Ile94Val胺基酸取代之Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及Ile94Val胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域包含Ile94Val胺基酸取代之Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及Ile94Val胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸序列之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸的Gin重組酶催化域包含Ile94Val胺基酸取代之Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於包含如SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸之Gin重組酶催化域包含Phe104Asn及Ile94Val胺基酸取代的Gin重組酶催化域。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於序列SEQ ID NO: 1、31、32、33、34或35中之任一者包含Phe104Asn胺基酸取代，但不存在其他「高度活化」取代(例如D12G、N14S、K50E、M70V、I94V及H106Y)的Gin重組酶催化域。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體為相對於序列SEQ ID NO: 1、31、32、33、34或35中之任一者包含Phe104Asn胺基酸取代的Gin重組酶催化域，其中不存在D12G或H106Y取代。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 31)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRIGGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 32)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 33)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERVMAGLAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 34)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERLSILERPMAGHAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 35)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTSAGRAAAINKGRIMGRPRKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 1)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVST NDQNTDLQRN ALVCAGCEQI FEDKLSGTRT DRPGLKRALK RLQKGDTLVV WKLDRLGRSM KHLISLVGEL RERGINFRSL TDSIDTSSPM GRFFFHVMGA LAEMERELIL ERVMAGIAAA RNKGRRWGRP P。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 2)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVST NDQNTDLQRN ALVCAGCEQI FEDKLSGTRT DRPGLKRALK RLQKGDTLVV WKLDRLGRSM KHLISLVGEL RERGINFRSL TDSIDTSSPM GRFFFYVMGA LAEMERELIL ERVMAGIAAA RNKGRRWGRP P。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 43)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELILERVMAGIAAARNKGRRWGRPP。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 36)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVST NDQNTDLQRN ALVCAGCEQI FEDKLSGTRT DRPGLKRALK RLQKGDTLVV WKLDRLGRSM KHLISLVGEL RERGINFRSL TDSIDTSSPM GRFNFYVMGA LAEMERELIL ERVMAGIAAA RNKGRRWGRP P。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 42)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELILERVMAGIAAARNKGRRWGRPP。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 37)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFYVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRIGGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 44)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRIGGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 45)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRIGGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 46)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRIGGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 47)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRIGGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 38)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFYVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 48)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 49)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 50)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 51)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 39)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFYVMGALAEMERELIIERVMAGLAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 52)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERVMAGLAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 53)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERVMAGLAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 54)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERVMAGLAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 55)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERVMAGLAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 40)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERLSILERPMAGHAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 56)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFYVMGALAEMERLSILERPMAGHAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 57)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERLSILERPMAGHAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 58)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERLSILERPMAGHAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 59)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERLSILERPMAGHAAARNKGRRFGRPPKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 41)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTSAGRAAAINKGRIMGRPRKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 60)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFYVMGALAEMERELIIERTSAGRAAAINKGRIMGRPRKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 61)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERTSAGRAAAINKGRIMGRPRKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 62)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELIIERTSAGRAAAINKGRIMGRPRKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 63)所列之胺基酸序列： MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSVDTSSPMGRFFFHVMGALAEMERELIIERTSAGRAAAINKGRIMGRPRKSG。
在一些實施例中，包括於ZFR中的包含Phe104Asn突變之Gin重組酶催化域變異體包含下文(SEQ ID NO: 3)所列之序列： MLIGYVRVST NDQNTDLQRN ALVCAGCEQI FEDKLSGTRT DRPGLKRALK RLQKGDTLVV WKLDRLGRSM KHLISLVGEL RERGINFRSL TDSIDTSSPM GRFN FHVMGA LAEMERELIL ERVMAGIAAA RNKGRRWGRP P。
在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列(相對於SEQ ID NO: 1之Gin重組酶催化域，其包含Phe104Asn取代)。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含與參考SEQ ID NO: 3具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性的胺基酸序列，如藉由熟習此項技術者已知之序列比對方案所測定。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列，其相對於Gin重組酶催化域(SEQ ID NO: 1)包含Phe104Asn取代。在一些實施例中，包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列且不包含其他高度活化突變，諸如D12G或H106Y。
在一些實施例中，鋅指重組酶中所用之鋅指蛋白包含左臂。在一些實施例中，鋅指重組酶中所用之鋅指蛋白包含右臂。在一些實施例中，鋅指重組酶中所用之鋅指蛋白包含左臂及右臂。
在一些實施例中，編碼包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸序列包含下文SEQ ID NO: 6中所列之序列：
atg ctg atc ggc tat gtg cgg gtg tcc acc aac gac cag aac acc gac ctg cag aga aac gcc ctt gtg tgt gcc gga tgc gag cag atc ttc gag gat aag ctg agc ggc acc aga acc gac aga ccc gga ctg aag aga gcc ctg aag aga ctg cag aaa ggc gac acc ctg gtc gtg tgg aag ctg gat aga ctg ggc cgc agc atg aag cac ctg atc agc ctt gtg ggc gag ctg aga gag cgg ggc atc aac ttt aga agc ctg acc gac agc atc gac aca agc agc cct atg ggc aga ttc ttc ttc tac gtg atg ggc gcc ctg gcc gag atg gaa aga gag ctg atc ctg gag aga gtc atg gcc gga atc gcc gct gcc aga aac aag gga aga aga tgg ggc cgg cca cct aag tct ggc aca ggc gag agg ccc ttc cag tgt cga atc tgc atg。
在一些實施例中，編碼包括於ZFR中之Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸序列包含下文SEQ ID NO:7中所列之序列，其編碼相對於Gin重組酶催化域(SEQ ID NO: 6)包含Phe104Asn取代的Gin重組酶催化域：
atg ctg atc ggc tat gtg cgg gtg tcc acc aac gac cag aac acc gac ctg cag aga aac gcc ctt gtg tgt gcc gga tgc gag cag atc ttc gag gat aag ctg agc ggc acc aga acc gac aga ccc gga ctg aag aga gcc ctg aag aga ctg cag aaa ggc gac acc ctg gtc gtg tgg aag ctg gat aga ctg ggc cgc agc atg aag cac ctg atc agc ctt gtg ggc gag ctg aga gag cgg ggc atc aac ttt aga agc ctg acc gac agc atc gac aca agc agc cct atg ggc aga ttc aac ttc cat gtg atg ggc gcc ctg gcc gag atg aga aga tgg ggc cgg cca cct。
在一些實施例中，包括於編碼本發明之ZFR之核苷酸序列中的Gin重組酶核苷酸序列包含與參考SEQ ID NO: 7至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大之序列一致性，如藉由熟習此項技術者已知之序列比對方案所測定。
在一些實施例中，Gin重組酶蛋白之催化域可操作地連接於鋅指核苷酸結合域。視情況，Gin重組酶蛋白之催化域藉助於連接子連接至鋅指核苷酸結合域，其中該重組酶能夠藉助於該鋅指核苷酸結合域結合目標核酸序列。在一些實施例中，連接子區為具有結構可撓性之序列。在一些實施例中，連接子區之長度包含至少3個、至少6個、至少10個、至少20個、至少30個或至少40個胺基酸。較佳地，核酸之長度為3、4、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42或45個胺基酸。在一些實施例中，連接子之序列為SEQ ID NO: 8中所列之序列(KSGTG)。在一些實施例中，在γ Gin重組酶蛋白序列之上游包括3x FLAG (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK；SEQ ID NO: 18)及SV40 NLS (PKKKRKV；SEQ ID NO: 19)序列。
在一些實施例中，編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸包含編碼Gin重組酶蛋白之催化域之聚核苷酸，該催化域可操作地連接於鋅指核苷酸結合域。視情況，編碼Gin重組酶蛋白之催化域的聚核苷酸藉助於連接子連接至鋅指核苷酸結合域。在一些實施例中，連接子之長度包含至少6個、至少10個、至少20個、至少30個或至少40個鹼基對。較佳地，核酸之長度為6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42或45個鹼基對。
「鋅指蛋白」或「ZFP」係指具有藉由鋅穩定化之鋅指核苷酸結合域的蛋白質。ZFP以序列特異性方式結合於DNA。個別DNA結合域被稱作「指」。ZFP具有至少一個指，各指結合兩個至四個DNA鹼基對，通常結合三個或四個DNA鹼基對。各鋅指通常包含大約30個胺基酸且與鋅形成螯合物。相較於天然存在之鋅指蛋白，ZFP可經工程改造成具有新穎結合特異性。工程改造方法包括但不限於合理設計及各種類型之選擇。合理設計包括例如使用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列及個別鋅指胺基酸序列的資料庫，其中各三聯體或四聯體核苷酸序列與鋅指的結合特定三聯體或四聯體序列的一或多個胺基酸序列相關聯。參見例如以下中詳細描述之ZFP設計方法：美國專利第5,789,538號、第5,925,523號、第6,007,988號、第6,013,453號、第6,140,081號、第6,200,759號、第6,453,242號、第6,534,261號、第6,979,539號及第8,586,526號；以及國際專利公開案WO 95/19431、WO 96/06166、WO 98/53057、WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 98/54311、WO 00/27878、WO 01/60970、WO 01/88197、WO 02/016536、WO 02/099084及WO 03/016496。
鋅指核苷酸結合域(ZFP)包括至少一個鋅指，但可包括複數個鋅指(例如2、3、4、5、6或更多個指)。通常，ZFP包括至少三個指。某些ZFP包括四個、五個或六個指，而一些ZFP包括8、9、10、11或12個或更多個指。包括三個指之ZFP通常識別包括9或10個核苷酸之目標位點；包括四個指之ZFP通常識別包括12至14個核苷酸之目標位點；而具有六個指之ZFP可識別包括18至21個核苷酸之目標位點。ZFP亦可為包括一或多個功能(調控)域之融合蛋白，該等域可為轉錄活化或抑制域或諸如DNMT域之其他域。DNA結合域與至少一個調控(功能)域融合，且可被視為『ZFP-TF』架構。目標位點之選擇、設計及構築鋅指重組酶蛋白(及編碼其之聚核苷酸)之ZFP及方法為熟習此項技術者所知且詳細描述於以下中：美國專利第6,140,081號、第5,789,538號、第6,453,242號、第6,534,261號、第5,925,523號、第6,007,988號、第6,013,453號、第6,200,759號；及國際專利公開案第WO 95/19431號、第WO 96/06166號、第WO 98/53057號、第WO 98/54311號、第WO 00/27878號、第WO 01/60970號、第WO 01/88197號、第WO 02/099084號、第WO 98/53058號、第WO 98/53059號、第WO 98/53060號、第WO 02/016536號及第WO 03/016496號。
方法及組合物亦可用以例如藉由ZFP主鏈之突變提高ZFP相對於其他非預期裂解位點(稱為脫靶位點)針對其預期目標的特異性，如美國專利公開案第20180087072號中所描述。因此，本文所描述之鋅指核苷酸結合域可包含其DNA結合域主鏈區中之一或多者中的突變。此等ZFP可包括ZFP DNA結合域(『ZFP主鏈』)內之胺基酸的突變，但其不包含DNA識別螺旋之改變，該胺基酸可非特異性地與DNA主鏈上之磷酸根相互作用。因此，本發明包括ZFP主鏈中不為核苷酸目標特異性所需之陽離子胺基酸殘基的突變。在一些實施例中，ZFP主鏈中之此等突變包含使陽離子胺基酸殘基突變成中性或陰離子胺基酸殘基。在一些實施例中，ZFP主鏈中之此等突變包含使極性胺基酸殘基突變成中性或非極性胺基酸殘基。在一些實施例中，在相對於DNA結合螺旋的位置(-5)、(-9)及/或位置(-14)處發生突變。在一些實施例中，鋅指可包含(-5)、(-9)及/或(-14)處之一或多個突變。在其他實施例中，多指形鋅指蛋白中之一或多個鋅指可包含(-5)、(-9)及/或(-14)處之突變。在一些實施例中，(-5)、(-9)及/或(-14)處之胺基酸(例如精胺酸(R)或離胺酸(K))突變成丙胺酸(A)、白胺酸(L)、Ser(S)、Asp(N)、Glu(E)、Tyr(Y)及/或麩醯胺酸(Q)。
在一些實施例中，鋅指核苷酸結合域之左臂包含下文SEQ ID NO: 9中所列之胺基酸序列： ERPFQCRICMRNFSRPYTLRLHIRTHTGEKPFACDICGRKFADNSNRIKHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSQSSDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRQDCLSLHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNDNRKTHTKIHLRQKD。
在一些實施例中，鋅指核苷酸結合域之右臂包含下文SEQ ID NO: 10中所列之胺基酸序列： ERPFQCRICMRNFSLRHHLTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSYARTLHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSWRSSLKTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADRSNRKTHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHLRQKD。
在一些實施例中，本發明之鋅指重組酶蛋白之左臂之胺基酸序列包含下文(SEQ ID NO: 64)所列之序列，其中以粗體描繪Gin重組酶F104N變異體催化域胺基酸序列，以斜體描繪鋅指蛋白胺基酸序列，且連接子加底線。MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELILERVMAGIAAARNKGRRWGRPP KSGTG ERPFQCRICMRNFSRPYTLRLHIRTHTGEKPFACDICGRKFADNSNRIKHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSQSSDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRQDCLSLHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNDNRKTHTKIHLRQKD
在一些實施例中，本發明之鋅指重組酶蛋白之右臂之胺基酸序列為下文(SEQ ID NO: 65)所列之序列，其中以粗體描繪Gin重組酶F104N變異體催化域胺基酸序列，以斜體描繪鋅指蛋白胺基酸序列，且連接子加底線。MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELILERVMAGIAAARNKGRRWGRPP KSGTG ERPFQCRICMRNFSLRHHLTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSYARTLHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSWRSSLKTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADRSNRKTHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHLRQKD
在一些實施例中，本發明之鋅指重組酶蛋白之左臂之胺基酸序列包含下文(SEQ ID NO: 4)所列之序列，其中以粗體描繪Gin重組酶F104N變異體催化域胺基酸序列，以斜體描繪鋅指蛋白胺基酸序列，且連接子加底線。在一些實施例中，在γ Gin重組酶蛋白序列之上游包括3x FLAG (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK；SEQ ID NO: 18)及SV40 NLS (PKKKRKV；SEQ ID NO: 19)序列。 MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAPKKKRKVDMLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELILERVMAGIAAARNKGRRWGRPP KSGTG ERPFQCRICMRNFSRPYTLRLHIRTHTGEKPFACDICGRKFADNSNRIKHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSQSSDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRQDCLSLHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNDNRKTHTKIHLRQKD
在一些實施例中，本發明之鋅指重組酶蛋白之右臂之胺基酸序列為下文(SEQ ID NO: 5)所列之序列，其中以粗體描繪Gin重組酶F104N變異體催化域胺基酸序列，以斜體描繪鋅指蛋白胺基酸序列，且連接子加底線。在一些實施例中，在γ Gin重組酶蛋白序列之上游包括3x FLAG (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK；SEQ ID NO: 18)及SV40 NLS (PKKKRKV；SEQ ID NO: 19)序列。 MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAPKKKRKVDMLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFNFHVMGALAEMERELILERVMAGIAAARNKGRRWGRPP KSGTG ERPFQCRICMRNFSLRHHLTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSYARTLHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSWRSSLKTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADRSNRKTHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHLRQKD
在一些實施例中，鋅指核苷酸結合域結合內源性基因座。在一些實施例中，內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)及安全港基因座。在一些實施例中，內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。在一些實施例中，安全港基因座在染色體1中。
在一些實施例中，鋅指核苷酸結合域結合HPRT基因。在一些實施例中，HPRT鋅指重組酶蛋白供體質體包含SEQ ID NO: 11中所列之核苷酸序列： AGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCATGAAAAGGTGGAAGCTTTACTTGGTTATAACTTTACTTTTAATACCTAGAACAGTGAGTCTTCAAACTGCTTTATTGATGCCCAATTTATAAAAAGTTTCCTGAGCATTTACCCCTAATATATGCTCTGCTAATGGAGCTATGCAATCTACTGAATGTCATAATCAACTTCAAGGATATACTGAAGCTATGTGGGCTTCTCATGAAAGAGAATTTTTTGCTTGTAAGGAAAGATGTATGCTTGAAATAAGCCACCATAGAGACCCATGTCCTAACAGCTCCCTGGAGACGGCTAATGATACTTGGAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTC。
鋅指重組酶蛋白促進由兩個鋅指結合位點組成之DNA目標之間的位點特異性重組，該等鋅指結合位點側接藉由重組酶催化域識別之中心20-bp核心序列。在一些實施例中，藉由本發明之Gin重組酶催化域識別的20-bp核心序列包含SEQ ID NO: 12中所列之核苷酸序列：GTTATAACTTTACTTTTAAT。在一些實施例中，兩個鋅指結合位點分別包含SEQ ID NO: 13 (AAGGTGGAAGCTTTACTTG)及SEQ ID NO: 14 (ACCTAGAACAGTGAGTCTTC)中所列之核苷酸序列。在一些實施例中，鋅指重組酶蛋白之完整目標位點包含SEQ ID NO: 15中所列之核苷酸序列：AAGGTGGAAGCTTTACTTGGTTATAACTTTACTTTTAATACCTAGAACAGTGAGTCTTC。
在一些實施例中，本發明提供一種pVAX質體，其包含編碼鋅指重組酶蛋白之左臂的聚核苷酸。在一些實施例中，編碼鋅指重組酶蛋白之左臂的質體之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 16中所列之序列： CTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTGACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCAAGCTGACTAGCGTTTAAACTTAAGCTGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGACTACAAAGACCACGACGGTGATTATAAAGATCACGACATCGATTACAAGGACGACGACGACAAGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTCGACATGCTGATCGGCTATGTGCGGGTGTCCACCAACGACCAGAACACCGACCTGCAGAGAAACGCCCTTGTGTGTGCCGGATGCGAGCAGATCTTCGAGGATAAGCTGAGCGGCACCAGAACCGACAGACCCGGACTGAAGAGAGCCCTGAAGAGACTGCAGAAAGGCGACACCCTGGTCGTGTGGAAGCTGGATAGACTGGGCCGCAGCATGAAGCACCTGATCAGCCTTGTGGGCGAGCTGAGAGAGCGGGGCATCAACTTTAGAAGCCTGACCGACAGCATCGACACAAGCAGCCCTATGGGCAGATTCAACTTCCATGTGATGGGCGCCCTGGCCGAGATGGAAAGAGAGCTGATCCTGGAGAGAGTCATGGCCGGAATCGCCGCTGCCAGAAACAAGGGAAGAAGATGGGGCCGGCCACCTAAGTCTGGCACAGGCGAGAGGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCGCCCGTACACCCTGCGCCTGCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCGACAACTCCAACCGCATCAAGCATACCAAGATACACACGCATCCCAGGGCACCTATTCCCAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCAGTCCTCCGACCTGTCCCGCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCAGTCCGGCAACCTGGCCCGCCATACCAAGATACACACGGGATCTCAGAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCGCCAGGACTGTCTGTCCCTGCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCGCAACGACAACCGCAAGACCCATACCAAGATACACCTGCGGCAGAAGGACTGATAAC。
在一些實施例中，本發明提供一種pVAX質體，其包含編碼鋅指重組酶蛋白之右臂的聚核苷酸。在一些實施例中，編碼鋅指重組酶蛋白之右臂的質體之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 17中所列之序列： GGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTGACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCAAGCTGACTAGCGTTTAAACTTAAGCTGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGACTACAAAGACCACGACGGTGATTATAAAGATCACGACATCGATTACAAGGACGACGACGACAAGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTCGACATGCTGATCGGCTATGTGCGGGTGTCCACCAACGACCAGAACACCGACCTGCAGAGAAACGCCCTTGTGTGTGCCGGATGCGAGCAGATCTTCGAGGATAAGCTGAGCGGCACCAGAACCGACAGACCCGGACTGAAGAGAGCCCTGAAGAGACTGCAGAAAGGCGACACCCTGGTCGTGTGGAAGCTGGATAGACTGGGCCGCAGCATGAAGCACCTGATCAGCCTTGTGGGCGAGCTGAGAGAGCGGGGCATCAACTTTAGAAGCCTGACCGACAGCATCGACACAAGCAGCCCTATGGGCAGATTCAACTTCCATGTGATGGGCGCCCTGGCCGAGATGGAAAGAGAGCTGATCCTGGAGAGAGTCATGGCCGGAATCGCCGCTGCCAGAAACAAGGGAAGAAGATGGGGCCGGCCACCTAAGTCTGGCACAGGCGAGAGGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCTGCGCCACCACCTGACCCGCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCAGTCCTACGCCCGCACCCTGCATACCAAGATACACACGCATCCCAGGGCACCTATTCCCAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTTGGCGCTCCTCCCTGAAGACCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCGACCGCTCCAACCGCAAGACCCATACCAAGATACACACGCACCCGCGCGCCCCGATCCCGAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTGACCGCTCCAACCTGTCCCGCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCAGTCCGGCAACCTGGCCCGCCATACCAAGATACACCTGCGGCAGAAGGACTGATAAC。
本文亦提供載體，其包含編碼如本文所描述之鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸序列。適合之載體包括但不限於質體、病毒載體、微環及線形DNA形式。亦提供含有該等聚核苷酸序列或載體之宿主細胞。前述鋅指重組酶蛋白、編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸、載體或細胞中之任一者可用於本文所揭示之方法中。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含本發明之鋅指重組酶蛋白及醫藥學上可接受之載劑，該鋅指重組酶蛋白包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含編碼本發明之鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑，該鋅指重組酶蛋白包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
醫藥學上可接受之載劑在某種程度上由所投與之特定組合物以及投與組合物所用之特定方法決定。因此，存在多種可用的醫藥組合物之適合調配物，如下文所描述(參見例如Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 第17版, 1989)。 修飾細胞之基因體的方法
在一個態樣中，本發明提供一種修飾細胞之基因體的方法，該方法包含將本發明之Gin重組酶催化域變異體、本發明之鋅指重組酶蛋白或本發明之編碼Gin重組酶催化域變異體或鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸引入至細胞中。本發明之鋅指重組酶蛋白(ZFR)為能夠將靶向修飾引入至細胞中的嵌合蛋白。ZFR促進由兩個鋅指結合位點組成之DNA位點之間的位點特異性重組，該等鋅指結合位點側接藉由重組酶催化域識別之中心20-bp核心序列。鋅指核苷酸結合域之定製允許設計能夠識別廣泛範圍之限定DNA目標且直接位點特異性整合至內源性基因體基因座中的ZFR。
在另一態樣中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白引入至細胞中。
在另一態樣中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白引入至細胞中。
在另一態樣中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將編碼本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸引入至細胞中。
在另一態樣中，本發明提供一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將編碼本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸引入至細胞中。
在另一態樣中，本發明提供一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
在另一態樣中，本發明提供一種切除細胞之染色體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將本發明之鋅指重組酶或本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
在一些實施例中，自細胞之基因體切除目標序列的該方法包含將鋅指重組酶引入至細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，自細胞之基因體切除目標序列的該方法包含將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含阻斷NHEJ之基因表現或抑制NHEJ。阻斷NHEJ之基因表現或抑制其之例示性方法包括但不限於小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)或肽抑制劑。在一些實施例中，藉由小分子阻斷NHEJ之基因表現。在一些實施例中，藉由包括以下之小分子抑制劑阻斷NHEJ之基因表現：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。參見例如WO2018/013840。在一些實施例中，藉由小分子抑制劑KU0060648阻斷NHEJ之基因表現。在一些實施例中，藉由ZFP-TF阻斷NHEJ之基因表現。參見例如US20130253040、US20150335708、US20160296605、US9943565、US7939327及WO2012068380。在一些實施例中，藉由肽抑制劑阻斷NHEJ之基因表現。在一些實施例中，藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)、TALEN或CRISPR/Cas系統靶向基因來剔除NHEJ，該等基因包括KU70、KU80、DNA-PK、XRCC4或DNA連接酶IV。
本發明之鋅指重組酶蛋白以二聚體形式結合目標核苷酸序列，從而經由重組酶之催化域相互作用，其中兩個鋅指單體之DNA結合域可與不同目標核苷酸序列相互作用。本發明之第二鋅指重組酶蛋白以二聚體形式結合供體核苷酸序列。兩個鋅指重組酶二聚體(目標二聚體及供體二聚體)之間形成四聚體，其為能夠將供體序列整合至目標核苷酸序列中之重組酶的活性形式。在一些實施例中，兩個二聚體包含Gin重組酶催化域。
為使鋅指重組酶蛋白催化重組，鋅指核苷酸結合域需要識別且結合於適當DNA片段。通常，DNA序列可包含藉由鋅指重組酶蛋白之鋅指核苷酸結合域識別的兩個鋅指蛋白結合位點，其側接與Gin催化域相互作用之中心序列。
鋅指核苷酸結合域經最佳化以識別其目標。此舉可使用熟習此項技術者熟知之以下方法完全與重組系統分開地進行：突變誘發繼之以『噬菌體呈現』選擇、置換DNA結合域之已知變異體之部分等(Pabo等人，Annu Rev Biochem. 2001; 70:313-40)。
本文所揭示之方法及組合物可用於任何類型的細胞，包括真核或原核細胞及/或細胞株。細胞之實例包括但不限於原核細胞、真菌細胞、古菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。在一些實施例中，該細胞為真核細胞。在一些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，該哺乳動物細胞為幹細胞。在一些實施例中，該真核細胞為人類細胞。在一些實施例中，該真核細胞為植物細胞。真核細胞或由此類細胞產生之細胞株之非限制性實例包括T細胞、COS、K562、CHO (例如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293 (例如HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、初代人類肝細胞(PHH)及perC6細胞，以及昆蟲細胞，諸如草地貪夜蛾(Spodoptera fugiperda ，Sf)，或真菌細胞，諸如酵母屬(Saccharomyces )、畢赤酵母屬(Pichia )及裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces )。幹細胞之實例包括但不限於胚胎幹細胞、誘導性多能幹細胞(iPS細胞)、造血幹細胞、神經元幹細胞及間葉幹細胞。
在一些實施例中，本文所描述之修飾細胞之基因體的方法、整合外源性核苷酸序列的方法或使目標核苷酸序列缺失(切除目標核苷酸序列)的方法中之任一者不依賴於Fis強化子系統。
在一些實施例中，為了將鋅指重組酶蛋白引入至細胞中，將編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸併入質體、病毒載體、微環或線形DNA形式中。
在本文所揭示之方法之一些實施例中，鋅指核苷酸結合域包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所列之胺基酸序列。
在將外源性序列整合至目標序列中或使目標核苷酸序列缺失的方法之一些實施例中，目標核苷酸序列包含SEQ ID NO: 15中所列之序列。
在一些實施例中，目標核苷酸序列為內源性基因座。在一些實施例中，內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)及安全港基因座。在一些實施例中，內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
在一些實施例中，本發明提供外源性核酸序列至細胞之基因體中之安全港基因座中的整合。安全港基因座通常為轉殖基因可整合且以可預測方式起作用而不擾亂內源基因活性的基因體基因座。人類基因體中之例示性安全港基因座包括但不限於Rosa26基因座、AAVS1基因座及Sadelain等人Nat Rev Cancer. 2012;12(1):51-8中列舉之安全港基因座。在一些實施例中，安全港基因座位於染色體1中。
將外源性核苷酸序列靶向整合至目標核苷酸序列中之機制如下： (a)  第一鋅指重組酶藉由識別目標核苷酸序列形成二聚體； (b)  第二鋅指重組酶藉由識別供體核苷酸序列(外源性核苷酸序列)形成二聚體； (c)  第一與第二鋅指重組酶二聚體(目標二聚體及供體二聚體)之間形成四聚體； (d)  兩個重組酶二聚體圍繞四聚體界面旋轉，從而允許在各重組酶二聚體保持共價連接至DNA時的股交換；及 (e)  使核苷酸片段再連接，從而促成股交換及將外源性核苷酸序列(供體核苷酸序列)引入至目標序列中。
內源性核苷酸序列之靶向切除之機制如下： (a)   第一鋅指重組酶藉由識別側接待切除之核苷酸序列之第一端的第一目標核苷酸序列而形成二聚體； (b)   第二鋅指重組酶藉由識別側接待切除之核苷酸序列之第二端的第二目標核苷酸序列而形成二聚體(第一及第二目標核苷酸序列可一致或可不一致)； (c)   第一與第二鋅指重組酶二聚體之間形成四聚體； (d)   兩個重組酶二聚體圍繞四聚體界面旋轉，從而允許在各重組酶二聚體保持共價連接至DNA時的DNA股交換； (e)   切除位於第一與第二目標核苷酸序列之間的內源性核苷酸序列；及 (f)    使側接所切除目標核苷酸序列之內源性核苷酸序列連接，且修復染色體DNA序列。
在一些實施例中，各鋅指重組酶二聚體獨立地為同源二聚體。在一些實施例中，各鋅指重組酶二聚體獨立地為異源二聚體。在一些實施例中，四聚體鋅指重組酶為同源四聚體。在其他實施例中，四聚體鋅指重組酶為異源四聚體。
在一些實施例中，兩個重組酶二聚體中之每一者包含γ Gin重組酶催化域。在一些實施例中，兩個重組酶二聚體中之一者包含γ Gin重組酶催化域。
鋅指重組酶蛋白或編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸可遞送至經分離細胞(其又可向活個體投與以進行離體細胞療法)或遞送至活個體。將基因編輯分子遞送至細胞及個體為此項技術中所已知。如本文所描述之遞送鋅指重組酶蛋白之方法描述於例如美國專利第6,453,242號、第6,503,717號、第6,534,261號、第6,599,692號、第6,607,882號、第6,689,558號、第6,824,978號、第6,933,113號、第6,979,539號、第7,013,219號及第7,163,824號中，所有該等專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
適合之細胞包括但不限於真核及原核細胞及/或細胞株。真核細胞或由此類細胞產生之細胞株之非限制性實例包括T細胞、COS、K562、CHO (例如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293 (例如HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)及perC6細胞，以及昆蟲細胞，諸如草地貪夜蛾(Sf)，或真菌細胞，諸如酵母屬、畢赤酵母屬及裂殖酵母屬。在一些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞為幹細胞，諸如胚胎幹細胞、誘導性多能幹細胞(iPS細胞)、造血幹細胞、神經元幹細胞及間葉幹細胞。
如本文所描述之編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸亦可使用載體遞送，該等載體含有編碼鋅指重組酶蛋白之一或多個組分之序列。在一些實施例中，亦可經由此等載體遞送額外核酸(例如供體序列)。此外，將顯而易見的是，此等載體中之任一者可包含一或多個編碼DNA結合蛋白之序列及/或按需要包含額外核酸。因此，當將如本文所描述之一或多種鋅指重組酶蛋白引入至細胞中及按需要將額外DNA引入至細胞中時，可在同一載體或在不同載體上進行。當使用多個載體時，各載體可包含編碼一或多種鋅指重組酶蛋白及視需要編碼額外核酸的序列。習知的基於病毒及非病毒之基因轉移方法可用於在細胞(例如哺乳動物細胞)及目標組織中引入編碼經工程改造DNA結合蛋白之核酸且視需要共引入額外核苷酸序列。此類方法亦可用於將核酸活體外投與至細胞。在某些實施例中，投與核酸以用於活體內或離體基因療法用途。
包含本發明之編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸的基因療法載體可藉由向個別患者(個體)投與，通常藉由全身投與(例如靜脈內、腹膜內、肌肉內、真皮下或顱內輸注)或體表施用而活體內遞送，如下文所描述。或者，載體可離體遞送至細胞，諸如自個別患者外植之細胞(例如淋巴球、骨髓抽出物、組織切片)或通用供體造血幹細胞，之後通常在針對已併入載體之細胞進行選擇之後將細胞再植入患者中。
用於診斷、研究、移植或用於基因療法(例如經由將經轉染細胞再輸注至宿主生物體中)之離體細胞轉染為熟習此項技術者所熟知。在一些實施例中，細胞係自個體生物體分離，經編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸轉染，且再輸注回至個體生物體(例如患者)中。適合於離體轉染之各種細胞類型已為熟習此項技術者所熟知(參見例如Freshney等人, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (第3版 1994))及其中所引用的關於如何自患者分離及培養細胞之論述的參考文獻)。
在一個實施例中，幹細胞在離體程序中用於細胞轉染及基因療法。使用幹細胞之優勢在於其可活體外分化成其他細胞類型，或可引入至其將移植於骨髓中之哺乳動物(諸如細胞供體)中。使用諸如GM-CSF、IFN-γ及TNF-α之細胞介素將CD34+細胞活體外分化成臨床上重要的免疫細胞類型之方法為吾人所知(參見Inaba等人 (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702)。 治療個體之病症之方法或校正致病突變之方法
在一個態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病病症的方法，該方法包含藉由將本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白引入至細胞中來修飾細胞之基因體中之目標序列。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病或病症的方法，該方法包含藉由將編碼本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸引入至細胞中來修飾細胞之基因體中之目標序列。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將本發明之鋅指重組酶引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之病症的方法，該方法包含自細胞之基因體切除目標序列，聚核苷酸編碼本發明之鋅指重組酶。
在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在另一態樣中，本發明提供一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白引入至細胞中來修飾細胞之基因體中之目標序列。
在另一態樣中，本發明提供一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將編碼本發明之Gin重組酶催化域變異體或本發明之鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸引入至細胞中來修飾細胞之基因體中之目標序列。
在另一態樣中，本發明提供一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將本發明之鋅指重組酶引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列。
在另一態樣中，本發明提供一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將本發明之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中來切除細胞之基因體中之目標序列。
在一些實施例中，校正細胞之基因體中之致病突變的該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，治療個體之病症的該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
在一些實施例中，本文所揭示之治療個體之病症的方法或校正細胞之基因體中之致病突變的方法進一步包含阻斷NHEJ之基因表現或抑制NHEJ。阻斷NHEJ之基因表現或抑制其之例示性方法包括但不限於小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)或肽抑制劑。在一些實施例中，藉由小分子阻斷NHEJ之基因表現。在一些實施例中，藉由包括以下之小分子抑制劑阻斷NHEJ之基因表現：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。在一些實施例中，藉由小分子抑制劑KU0060648阻斷NHEJ之基因表現。在一些實施例中，藉由ZFP-TF阻斷NHEJ之基因表現。在一些實施例中，藉由肽抑制劑阻斷NHEJ之基因表現。在一些實施例中，藉由使用鋅指核酸酶(ZFN)、TALEN或CRISPR/Cas系統靶向基因來剔除NHEJ，該等基因包括KU70、KU80、DNA-PK、XRCC4或DNA連接酶IV。
在治療疾病或病症或校正致病突變的方法之一個實施例中，至少一個細胞、細胞類型或組織包含藉由鋅指核苷酸結合域識別之重組位點。此細胞經供體核酸構築體(「供體構築體」)轉型，該供體核酸構築體包含第二重組序列及一或多種所關注之聚核苷酸(通常為治療性基因)。將本發明之鋅指重組酶蛋白或本發明之編碼鋅指重組酶蛋白之聚核苷酸引入至同一細胞中。鋅指重組酶蛋白特異性地識別重組序列，從而在使得所關注核酸序列經由第一與第二重組位點之間的重組事件插入至基因體中的條件下形成四聚體。可使用本發明之方法治療之個體包括人類及非人類動物兩者。
可採用本發明之方法治療各種疾病或病症。非限制性實例包括單基因病症、感染性疾病、後天性病症、癌症及其類似者。例示性單基因病症包括ADA缺乏症、囊性纖維化(cystic fibrosis)、家族性高膽固醇血症(familial-hypercholesterolemia)、血友病、慢性肉芽腫病、杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)、范康尼氏貧血(Fanconi anemia)、鐮狀細胞貧血、高歇氏病(Gaucher's disease)、亨特氏症候群、X性聯SCID及其類似疾病。
亦可使用本文所揭示之方法治療或預防遺傳疾病或病症。可藉由本文所描述之鋅指重組酶蛋白及方法治療及/或預防之例示性遺傳疾病包括但不限於軟骨發育不全、色盲、酸性麥芽糖酶缺乏症、腺苷脫胺酶缺乏症(OMIM編號102700)、腎上腺腦白質失養症(腎上腺腦白質營養不良)、艾卡迪氏症候群(aicardi syndrome)、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、α-地中海型貧血、雄性激素失敏症候群(androgen insensitivity syndrome)、阿帕特氏症候群(apert syndrome)、致心律失常性右室(arrhythmogenic right ventricular)、發育不良(dysplasia)、毛細血管擴張性失調(ataxia telangiectasia)、巴氏症候群(barth syndrome)、β-地中海型貧血、藍色橡皮球痣症候群(blue rubber bleb nevus syndrome)、卡納萬氏病(canavan disease)、慢性肉芽腫病(chronic granulomatous disease；CGD)、貓叫症候群(cri du chat syndrome)、囊性纖維化、德爾肯氏病(dercum's disease)、外胚層發育不良(ectodermal dysplasia)、范康尼氏貧血(fanconi anemia)、進行性骨化性纖維發育不良(fibrodysplasia ossificans progressive)、X染色體脆折症(fragile X syndrome)、半乳糖血症(galactosemis)、高歇氏病(Gaucher's disease)、全身性神經節醣苷病(generalized gangliosidose)(例如GM1)、血色素沉著症(hemochromatosis)、β-血球蛋白第6密碼子血紅素C突變(hemoglobin C mutation in the 6th codon of beta-globin；HbC)、血友病、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、赫勒氏症候群(Hurler Syndrome)、低磷酸酶症(hypophosphatasia)、克氏症候群(Klinefelter syndrome)、克拉培氏病(Krabbes Disease)、朗-格二氏症候群(Langer-Giedion Syndrome)、白血球黏附分子缺乏症(leukocyte adhesion deficiency；LAD，OMIM編號116920)、腦白質失養症、長QT症候群(long QT syndrome)、馬凡氏症候群(Marfan syndrome)、牟比士症候群(Moebius syndrome)、黏多糖病(mucopolysaccharidosis；MPS)、甲髕症候群(nail patella syndrome)、腎原性尿崩症(nephrogenic diabetes insipdius)、神經纖維瘤、尼曼匹克氏症(Neimann-Pick disease)、成骨不全、苯酮尿症(PKU)、 紫質症(porphyria)、普-威二氏症候群(Prader-Willi syndrome)、早衰症、普洛提斯症候群(Proteus syndrome)、視網膜母細胞瘤、雷特氏症候群(Rett syndrome)、魯賓斯坦-泰氏症候群(Rubinstein-Taybi syndrome)、聖菲利波氏症候群(Sanfilippo syndrome)、嚴重合併性免疫缺失(SCID)、舒瓦克曼氏症候群(Shwachman syndrome)、鐮狀細胞疾病(鐮狀細胞貧血)、史-馬二氏症候群(Smith-Magenis syndrome)、斯蒂克勒氏症候群(Stickler syndrome)、戴-薩二氏病(Tay-Sachs disease)、血小板減少橈骨缺失(Thrombocytopenia Absent Radius；TAR)症候群、特雷徹柯林斯氏症候群(Treacher Collins syndrome)、三染色體症(trisomy)、結節性硬化症、特納氏症候群(Turner's syndrome)、脲循環障礙、希-林二氏病(von Hippel-Landau disease)、瓦登伯革氏症候群(Waardenburg syndrome)、威廉斯氏症候群(Williams syndrome)、威爾森氏病(Wilson's disease)、韋-奧二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、X性聯淋巴增生症候群(X-linked lymphoproliferative syndrome；XLP，OMIM編號308240)、夏-馬-圖三氏(Charcot Marie Tooth；CMT)病、常染色體顯性多囊性腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease；ADPKD)及類似疾病。
本文所揭示之方法亦允許治療宿主之感染(病毒或細菌)(例如藉由阻斷病毒或細菌受體之表現，從而預防宿主生物體之感染及/或其中之擴散)。可靶向的病毒或病毒受體之非限制性實例包括單純疱疹病毒(HSV)，諸如HSV-1及HSV-2；水痘帶狀疱疹病毒(VZV)；埃-巴二氏病毒(EBV)；及巨細胞病毒(CMV)；HHV6及HHV7。肝炎病毒家族包括A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、E型肝炎病毒(HEV)及G型肝炎病毒(HGV)。可靶向之其他病毒或其受體包括但不限於小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰白質炎病毒等)；杯狀病毒科；披膜病毒科(例如風疹病毒、登革病毒等)；黃病毒科；冠狀病毒科；呼腸孤病毒科；雙核糖核酸病毒科；彈狀病毒科(例如狂犬病病毒等)；絲狀病毒科；副黏液病毒科(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合細胞病毒等)；正黏液病毒科(例如A型、B型及C型流感病毒等)；布尼亞病毒科；沙粒病毒科；逆轉錄病毒科；慢病毒(例如HTLV-I、HTLV-II；HIV-1 (亦稱為HTLV-III、LAV、ARV、hTLR等)、HIV-II)；猴類免疫缺陷病毒(SIV)；人類乳突病毒(HPV)；流感病毒；及蜱傳腦炎病毒。關於此等及其他病毒之描述，參見例如Virology, 第3版 (W. K. Joklik編 1988)；Fundamental Virology, 第2版 (B. N. Fields及D. M. Knipe編 1991)。亦包括經諸如結核分支桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)及其類似者之其他病原生物體或諸如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)及其類似者之寄生蟲感染。
用於治療或校正致病突變之方法可活體內或離體進行。「活體內」意謂在動物活體中。「離體」意謂細胞或器官在體外經修飾，通常會將此類細胞或器官返回至活體內。
用於治療性投與包括本發明之鋅指重組酶蛋白之載體或構築體的方法為此項技術中所熟知。核酸構築體可藉由陽離子脂質(Goddard等人Gene Therapy, 4:1231-1236, 1997；Gorman等人Gene Therapy 4:983-992, 1997；Chadwick等人Gene Therapy 4:937-942, 1997；Gokhale等人Gene Therapy 4:1289-1299, 1997；Gao及Huang, Gene Therapy 2:710-722, 1995，其皆以引用之方式併入本文中)、使用病毒載體(Monahan等人Gene Therapy 4:40-49, 1997；Onodera等人Blood 91:30-36, 1998，其皆以引用之方式併入本文中)、藉由攝取「裸DNA」及其類似方式遞送。此項技術中熟知的用於轉染細胞之技術(參見上文論述)可用於離體投與核酸構築體。確切配方、投與途徑及劑量可由個別醫師考慮患者病況來選擇。(Fingl等人，1975, 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」,第1章，第1頁)。
如本文所描述，本文所描述之鋅指重組酶蛋白及方法可用於基因體修飾、基因體校正及基因體破壞。
本文所描述之鋅指重組酶蛋白及方法亦可應用於基於幹細胞之療法，包括但不限於促成以下之編輯：體細胞突變之校正；顯性失活等位基因之破壞；病原體進入細胞或產毒性感染細胞所需之基因體的破壞；例如藉由編輯基因體活性以促進功能性組織之分化或形成，及/或破壞基因體活性以促進功能性組織之分化或形成，從而增強組織工程；阻斷分化或例如藉由編輯阻斷分化之基因以促進幹細胞分化出特定譜系路徑來誘導分化。用於此程序之細胞類型包括但不限於T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。另外，可使用誘導性多能幹細胞(iPSC)，其亦將由患者自身之體細胞產生。因此，此等幹細胞或其衍生物(分化之細胞類型或組織)無論其來源或組織相容性，皆可潛在地移植至任何個人中。
如上文所指出，本文所描述之鋅指重組酶蛋白及方法可用於基因修飾、基因校正及基因破壞。
本文所描述之鋅指重組酶蛋白及方法亦可應用於基於幹細胞之療法，包括但不限於促成以下之編輯：體細胞突變之校正；顯性失活等位基因之破壞；病原體進入細胞或產毒性感染細胞所需之基因的破壞；例如藉由編輯基因活性以促進功能性組織之分化或形成，及/或破壞基因活性以促進功能性組織之分化或形成，從而增強組織工程；阻斷分化或例如藉由編輯阻斷分化之基因以促進幹細胞分化出特定譜系路徑來誘導分化。用於此程序之細胞類型包括但不限於T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。另外，可使用誘導性多能幹細胞(iPSC)，其亦將由患者自身之體細胞產生。因此，此等幹細胞或其衍生物(分化之細胞類型或組織)無論其來源或組織相容性，皆可潛在地移植至任何個人中。
除治療性應用以外，本文所描述之鋅指重組酶蛋白及方法亦可用於細胞株工程及建構疾病模型。實例 實例 1 ： 鋅指重組酶蛋白設計
使用連接子KSGTG (SEQ ID NO: 8)使Gin重組酶催化域(包括(i) H106Y突變(SEQ ID NO: 2)、(ii) F104N突變(SEQ ID NO: 3)及(iii)無修飾(SEQ ID NO: 1))各獨立地與鋅指DNA結合域之N端融合。使用Gin核心序列評分演算法鑑別HPRT基因中之Gin核心序列以及染色體1上之安全港位點。
將鋅指核苷酸結合域之左(SEQ ID NO: 9)臂及右(SEQ ID NO: 10)臂設計成靶向來自HPRT基因之序列。
將鋅指核苷酸結合域或ZFP設計成靶向側接Gin核心序列之序列。選擇Gin重組酶催化域來靶向Gin核心序列。對於HPRT目標位點，Gin核心序列為SEQ ID NO: 12。對於染色體1目標位點上之安全港位點，Gin核心序列為SEQ ID NO: 27 (CTAATTACCTTCATTATAGT)及SEQ ID NO: 28 (ACAAATAGTATAATTTGAGT)。
針對人類將γ Gin重組酶催化域密碼子最佳化，合成為gBlock且選殖至哺乳動物表現載體pVax中。根據製造商說明書使用NEB® 定點突變誘發套組及使用起始經密碼子最佳化之γ Gin重組酶催化域作為模板而產生位置H106Y (蛋白質序列-SEQ ID NO: 2)或F104N (蛋白質序列-SEQ ID NO: 3)處之Gin變異體突變。經由桑格定序(Sanger sequencing)來確認Gin變異體序列。
將能夠結合HPRT基因之鋅指DNA結合域組裝及選殖至Gin表現載體中。藉由桑格定序來確認純系序列。
   鋅指DNA結合域胺基酸序列
左臂 SEQ ID NO: 9
右臂 SEQ ID NO: 10
包含F104N突變之鋅指重組酶蛋白之左臂的完整pVAX 質體DNA序列為SEQ ID NO: 16，且包含F104N突變之鋅指重組酶蛋白之右臂的完整質體DNA序列為SEQ ID NO: 17。實例 2 ：供體構築體設計
藉由將鋅指重組酶位點(ZFP結合位點:Gin核心序列:ZFP結合位點)插入至pUC19載體主鏈中來選殖位點特異性供體分子。使用HiFi組裝套組(NEB® )產生供體構築體。藉由IDT® 合成供體片段，且將其提供為基因片段(gBlock)，包括HiFi組裝突出物。供體構築體包含兩個鋅指核苷酸結合域的側接Gin核心序列之結合位點(ZFP結合位點-Gin核心序列-ZFP結合位點)。
對pUC19載體主鏈進行PCR擴增。gBlock及引子序列展示於下文。
gBlock核苷酸序列。SEQ ID NO: 20 taaaacgacggccagtgaattcATGAAAAGGTGGAAGCTTTACTTGGTTATAACTTTACTTTTAATACCTAGAACAGTGAGTCTTCAAACTGCTTTATTGATGCCCAATTTATAAAAAGTTTCCTGAGCATTTACCCCTAATATATGCtctgctaatggagctatgcaat
用於將gBlock片段選殖至pUC19中的pUC19正向引子。SEQ ID NO: 21 tgctaatggagctatgcaatCTACTGAATGTCATAATCAACTTC
用於將gBlock片段選殖至pUC19中的pUC19反向引子。SEQ ID NO: 22 attcactggccgtcgttttaCAACGTCGTGACTGGGAAAAC
添加額外序列資訊(包括基因體引子結合位點中之一者)以支援基於下一代定序(NGS)之標準目標整合(TI)分析。添加獨特標籤序列以區分野生型鋅指重組酶蛋白(SEQ ID NO: 23-TGTATTTGC)及目標整合(TI) PCR擴增子(SEQ ID NO: 24-GCTTTATTG)。重組酶介導之TI事件產生具有TI標籤之讀段。實例 3 ： 人類 K562 細胞中之靶向整合
自ATCC獲得K562 (ATCC® CCL243TM )細胞，且在37℃及5% CO2 氛圍下維持於含有10% FBS及1×PSG之RPMI1640培養基中。
遵循製造商說明書使用SF細胞株96孔NucleofectorTM 套組(Lonza® ，V4SC-2960)將各種劑量的編碼具有或不具有供體分子之鋅指重組酶蛋白(H106Y變異體或F104N變異體)之質體DNA (亦以pDNA形式供應)電穿孔至K562細胞中。
簡言之，用1×PBS (不含二價陽離子)將細胞洗滌一次，且以每13 µl補充之SF細胞株96孔NucleofectorTM 溶液2×105 個細胞再懸浮。對於每次轉染，將13 µl細胞懸浮液與7 µl之pDNA混合並轉移至Lonza® NucleocuvetteTM 培養盤，且在Amaxa NucleofectorTM 96孔Shuttle系統(Lonza® )上使用用於K562細胞之方案(NucleofectorTM 程式96-FF-120)進行電穿孔。在室溫下培育經電穿孔細胞10 min，隨後轉移至96孔組織培養盤中之180 µl經預熱完全培養基中。培育細胞72 h，隨後收集以用於靶向整合定量。遵循製造商說明書使用QuickExtractTM 提取基因體DNA。在將細胞轉移至37℃下之前，在30℃下對細胞進行視情況選用之冷震過夜。實例 4 ： 基於 NGS 之標準靶向整合分析
使用Primer3設計工具在以下最佳條件下設計所關注之基因座之PCR引子：擴增子之大小為200 nt；解鏈溫度為60℃；引子長度為20 nt；且GC含量為50%。添加轉接子以進行第二PCR反應，從而添加Illumina庫序列(正向引子：ACACGACGCTCTTCCGATCT (SEQ ID NO: 25)；反向引子：GACGTGTGCTCTTCCGAT (SEQ ID NO: 26))。所用HPRT基因座特異性引子序列為：SEQ ID NO: 29 (taaaacgacggccagtgaattc)及SEQ ID NO: 30 (tctgctaatggagctatgcaat)。
使用來自含AccuPrime HiFi聚合酶之QuickExtractTM gDNA溶液(Invitrogen® )的2.5 µl 基因體DNA以25 µl擴增所關注區。在0.1 µM之最終濃度及以下熱循環條件下使用引子：在95℃下初始解鏈5 min；95℃下30s、55℃下30s及68℃下40s，進行30個循環；及在68℃下最終擴展10 min。
使用一微升此PCR產物進行20 µl PCR反應，從而使用含有HF緩衝液之PhusionTM High-Fidelity PCR MasterMix (NEB® )添加Illumina庫序列。在0.5 µM之最終濃度及以下熱循環條件下使用引子：在98℃下初始解鏈30 s；98℃下10 s、60℃下30 s及72℃下40 s，進行12個循環；及在72℃下最終擴展10 min。
使用QIAquickTM PCR純化套組(Qiagen)純化PCR庫。使用QubitTM dsDNA HS分析套組(Invitrogen® )對樣本進行定量，且將其稀釋至2 nM。
隨後根據製造商說明書在使用標準300循環套組之Illumina® MiSeqTM 或使用中等輸出300循環套組之Illumina® NextSeq 500上運行庫。藉由對野生型讀段之總數目及TI讀段(包括獨特TI序列標籤)之總數目進行定量來測定TI效率。參見圖1，其展示比較H106Y鋅指重組酶變異體及F104N鋅指重組酶變異體之目標整合效率的圖表。F104N鋅指重組酶變異體之目標整合效率為約20%，而H106Y鋅指重組酶變異體之目標整合效率為約1.5%。實例 5 ：流動式細胞測量術分析
將GFP表現卡匣選殖至上文所描述之供體載體主鏈中。如所描述進行轉染，且將細胞維持3週。3週之後，洗去未併入之供體分子，且僅穩定整合之供體分子引起GFP表現。
將1×106 個K562細胞在PBS中洗滌，再懸浮於200 µl FACS緩衝液(不含Ca2+/Mg2+之PBS，1% BSA)中，且經由流動式細胞測量術分析進行GFP定量，其中測定轉染效率。
遵循製造商說明書在Invitrogen® Attune Nxt流式細胞儀上進行流動式細胞測量術。在顯示背景信號之未經轉染細胞(圖2，A圖)、顯示隨機GFP整合的僅經供體分子轉染之細胞(圖2，B圖)與經F104N鋅指重組酶變異體以及供體構築體一起轉染之細胞(圖2，C圖)之間比較GFP表現細胞之百分比。如圖2中所示，經F104N鋅指重組酶變異體及HPRT供體構築體轉染之細胞中所偵測的GFP螢光比僅經供體轉染之細胞中所偵測之螢光高得多(17.7%比2.91%)。實例 6 ：鋅指核酸酶設計
如別處所描述設計靶向HPRT之鋅指蛋白，且將其併入質體中。表A展示兩個例示性HPRT ZFN之DNA結合域內的識別螺旋(N＞C指序列)。表B展示此等ZFN之目標位點(以大寫字母指示DNA目標位點；以小寫字母指示非接觸核苷酸)。表 A
   HPRT特異性鋅指核酸酶螺旋設計
   F1 F2 F3 F4 F5 F6
SB85969 LRHHLTR (SEQ ID NO: 66) DRSTLRQ (SEQ ID NO: 67) QSANRTK (SEQ ID NO: 68) DNSYLPR (SEQ ID NO: 69) RSDNLSV (SEQ ID NO: 70) QKATRIN (SEQ ID NO: 71)
SB85973 RSDNLAR (SEQ ID NO: 72) LRQHLRA (SEQ ID NO: 73) QSGNLAR (SEQ ID NO: 74) QSTPRTT (SEQ ID NO: 75) DRSNRIK (SEQ ID NO: 76)   
表 B
   HPRT特異性鋅指核酸酶之目標位點
SB85969 5'-3': GTAAAGTTATAACCAAGT  (SEQ ID NO: 77)
SB85973 5'-3': TACCTAGAAcAGTGAG  (SEQ ID NO: 78)
實例 7 ： ZFR 介導之目標整合 ( TI ) 對比 ZFN 介導之 TI
HPRT ZFN對照組(參見實例6)或HPRT ZFR構築體(F104N:I94V)經供體質體共轉染至如實例3中所描述之K562細胞中。將濃度為0 µM、0.032 µM、0.179 µM或1.00 µM之NHEJ抑制劑KU0060648添加至恢復培養基中。3天後收集細胞以供後續如實例4中所描述進行基於PCR之NGS分析。如圖4之B圖中所示，在KU0060648存在下的ZFN誘導之NHEJ介導之靶向整合受到不利影響。%插入缺失%、完美TI%(無插入缺失之TI)及總TI%全部隨NHEJ抑制劑之劑量增加而降低。相比之下，ZFR (F104N:I94V)顯示完美TI%及總TI%兩者之增加，該兩者在插入缺失%隨著KU0060648劑量增加而降低時增加(圖4，B圖)。此情況證實ZFR介導之靶向整合機制與ZFN誘導之NHEJ介導之靶向整合不同。實例 8 ： 製備穩定切除報導子細胞株
產生具有兩個HPRT ZFR結合位點之K562報導子細胞株。首先，將切除報導子構築體選殖至質體中。質體之序列列出於SEQ ID NO: 81中。報導子構築體具有用於HPRT ZFR之兩個結合位點，間隔開2888 nt。HPRT ZFR結合位點如下：AAGGTGGAAGCTTTACTTGGTTATAACTTTACTTTTAATACCTAGAACAGTGAGTCTTC (SEQ ID NO: 15)。
選殖之切除構築體經ZFN:30035及30054 (其切割基因體及質體)共轉染至K562細胞中以藉由如先前描述之ZFN誘導的NHEJ介導之靶向整合整合至AAVS1安全基因座位點中(參見例如Miller等人, Enhancing gene editing specificity by attenuating DNA cleavage kinetics, Nature Biotechnology (第37卷, 2019))。報導子構築體包含有助於促進報導子構築體整合至AAVS1中的聚核苷酸序列(參見表C)。 如實例4中所描述使用基於PCR之分析偵測HPRT供體構築體至AAVS1基因座中之整合。經靶向以偵測至AAVS1中之適當整合的引子結合位點列於表C中。在適當偵測HPRT供體至AAVS1基因座中之整合之後，選擇純系K562報導子細胞株。表 C
SEQ ID NO: 79 圖例：粗體 ：報導子構築體成功整合至AAVS1基因座中的序列標籤加底線 ：30035結合位點短劃線： 30054結合位點斜體： 目標整合標籤加雙底線： PCR分析：引子結合位點 GCC CCACTGTGGGGTGGAGGG GA TCGACACAAAACGACAATACAAGAATCTCG CAAACCGGCCCTGGGAATATAAG GCTCAGACCATCCTTCCAGACTCAGGAGATCATGTGTTGCCGACCGTCCTTCCGTCAAGCGGGTTTTAGAGATTCAAGGTCGAGAAGCAAAAGCAGCAGGAGATGCTTCTCTGCATCCGTCTTAAACTGCTTTGAGACATGAAAAGGTGGAAGCTTTACTTGGTTATAACTTTACTTTTAATACCTAGAACAGTGAGTCTTCAAACTGCTTTATTGATGCCCAATTTATAAAAAGTTTCCTGAGGCGGACTGGACGTAAAACATTCTGCTAATGGAGCTATGCAATCTACTGAATGTCATAATCAACTTCAAGGATATACTGAAGCTATGTGGGCTTCTCATGAAAGAGAATTTTTTGCTTGTAAGGAAAGATGTATGCTTGAAATAAGCCACCATAGAGACCCATGTCCTAACAGCTCCCTGGAGACGGCTAATGATACTTGGAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCATGAAAAGGTGGAAGCTTTACTTGGTTATAACTTTACTTTTAATACCTAGAACAGTGAGTCTTCAAACTTGTATTTGCATGCCCAATTTATAAAAAGTTTCCTGAGGCGGACTGGACGTAAAACATGAGCAACGACCACAACACACCCACAGGGACAAACACCGCCCAAGTCAAAGATCACTCATGTCGTCGAGGAAGTGGAGGTTGCTTACATGGCTCCTTCTCTGGACA GTGTGTCACCAGATAAGGAAT CTGCCTAACAGGAGGTGGGACCGTTCGAG AATATCAGGAGACTAGGAAGGAGGAGGCCTAAGGATGGGGCTTTTCTGTCACCAATCCTGTCCCTA GTG
實例 9 ： 藉由 NHEJ 抑制增強 ZFR ( H106Y ) 介導之靶向切除
在純系K562細胞株經H106Y ZFR、F104N ZFR或ZFN構築體轉染之後，誘導靶向切除。轉染後，用0 µM或3.14 µM NHEJ抑制劑KU0060648處理細胞。如實例4中所描述進行基於PCR之NGS分析。使用以下引子偵測切除事件：正向引子：ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNATGCTTCTCTGCATCCGTCT (SEQ ID NO: 80)及反向引子：GACGTGTGCTCTTCCGATCTATGTTTTACGTCCAGTCCGC (SEQ ID NO: 81)。
添加額外序列資訊(包括基因體引子結合位點中之一者)以支援基於下一代定序(NGS)之標準目標切除分析。添加獨特標籤序列以區分ZFR切除活性之缺乏(SEQ ID NO: 24-GCTTTATTG)及由經轉染ZFR構築體誘導之可偵測靶向切除(SEQ ID NO: 23-TGTATTTGC)。
如圖5之B圖中所示，在無NHEJ抑制劑(KU0060648)存在下，靶向ZFR結合位點之ZFN及ZFR變異體(H106Y及F104N)有效地切除藉由兩個ZFR位點側接之DNA分子，如藉由完美切除%(切除之後的無插入缺失目標基因座)、總切除%(非完美事件)及非切除目標位點內之插入缺失%所量測。在3.14 µM KU0060648存在下，ZFN及F104N ZFR變異體具有減少之切除事件，而H106Y ZFR變異體顯示增加之完美切除%及總切除%以及減少之插入缺失%。儘管如圖1中所示，高度活化H106Y ZFR變異體在靶向整合實驗中表現不佳，但結果在靶向切除之無供體應用中有所改變。因此，NHEJ之抑制可有益於ZFR介導之靶向整合及ZFR介導之靶向切除兩者。編號實施例
本發明之特定實施例闡述於以下編號段落中：
1. 一種Gin重組酶催化域變異體，其相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
2. 如段落1之Gin重組酶催化域變異體，其進一步包含His106Tyr胺基酸取代。
3. 如段落2之Gin重組酶催化域變異體，其包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 60。
4. 如段落1之Gin重組酶催化域變異體，其進一步包含Ile94Val胺基酸取代。
5. 如段落4之Gin重組酶催化域變異體，其包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO: 61。
6. 一種編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸，其中編碼該Gin重組酶催化域變異體之核酸序列包含SEQ ID NO: 7中所列之核苷酸序列。
7. 一種編碼如段落1至5中任一者之Gin重組酶催化域變異體的聚核苷酸。
8. 一種鋅指重組酶，其包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
9. 如段落8之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代。
10. 如段落9之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 60。
11. 如段落8之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體進一步包含Ile94Val胺基酸取代。
12. 如段落11之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 61。
13. 如段落8至12中任一者之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為多聚體蛋白。
14. 如段落13之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為同源多聚體蛋白。
15. 如段落13之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為異源多聚體蛋白。
16. 如段落13之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為二聚體蛋白。
17. 如段落16之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為同源二聚體蛋白。
18. 如段落16之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為異二聚體蛋白。
19. 如段落14之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為四聚體蛋白。
20. 如段落19之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為同源四聚體蛋白。
21. 如段落19之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為異源四聚體蛋白。
22. 如段落8至21中任一者之鋅指重組酶，其中該鋅指核苷酸結合域包含如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所列之序列。
23. 如段落8至22中任一者之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白結合包含如SEQ ID NO: 15中所列之序列的核苷酸序列。
24. 如段落8至23中任一者之鋅指重組酶，其中該鋅指核苷酸結合域能夠結合內源性基因座。
25. 如段落24之鋅指重組酶，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)基因、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
26. 一種聚核苷酸，其編碼如段落8至25中任一者之鋅指重組酶。
27. 如段落26之聚核苷酸，其中編碼該Gin重組酶催化域變異體之核酸序列包含SEQ ID NO: 7中所列之核苷酸序列。
28. 一種載體，其包含如段落6至7之編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸。
29. 一種載體，其包含如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸。
30. 一種細胞，其包含如段落28或29之載體。
31. 一種細胞，其包含如段落1至5中任一者之Gin重組酶催化域變異體。
32. 一種細胞，其包含如段落6至7之編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸。
33. 一種細胞，其包含如段落8至25中任一者之鋅指重組酶蛋白。
34. 一種細胞，其包含如段落26至27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸。
35. 如段落30至34中任一者之細胞，其中該細胞為真核細胞。
36. 如段落35之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
37. 如段落36之細胞，其中該細胞為幹細胞。
38. 如段落35之細胞，其中該細胞為人類細胞。
39. 一種醫藥組合物，其包含如段落1至5中任一者之Gin重組酶催化域變異體；及醫藥學上可接受之載劑。
40. 一種醫藥組合物，其包含如段落6至7之編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸；及醫藥學上可接受之載劑。
41. 一種醫藥組合物，其包含如段落8至25中任一者之鋅指重組酶；及醫藥學上可接受之載劑。
42. 一種醫藥組合物，其包含如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸；及醫藥學上可接受之載劑。
43. 一種修飾細胞之基因體的方法，該方法包含將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中。
44. 一種修飾細胞之基因體的方法，該方法包含將如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
45. 一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中。
46. 一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
47. 一種破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中。
48. 一種破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
49. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中。
50. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
51. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將鋅指重組酶引入至該細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
52. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
53. 如段落49至52中任一者之方法，其進一步包含將非同源末端連接(NHEJ)抑制劑引入至細胞中。
54. 如段落53之方法，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
55. 如段落54之方法，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
56. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中來修飾細胞之基因體中之目標序列。
57. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中來修飾細胞之基因體中之目標序列。
58. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列。
59. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含自細胞之基因體切除目標序列，聚核苷酸編碼如段落26或27之鋅指重組酶。
60. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
61. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
62. 如段落58至61中任一者之方法，其進一步包含投與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。
63. 如段落62之方法，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白質、轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
64. 如段落63之方法，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
65. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含修飾細胞之基因體中之目標序列，包含將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中。
66. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含修飾細胞之基因體中之目標序列，包含將如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
67. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將如段落8至25中任一者之鋅指重組酶引入至細胞中而自細胞之基因體切除目標序列。
68. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中來切除細胞之基因體中之目標序列。
69. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至該細胞中而自該細胞之該基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
70. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中來切除該細胞之該基因體中之目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
71. 如段落67至70中任一者之方法，其中該方法進一步包含非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。
72. 如段落71之方法，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
73. 如段落72之方法，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
74. 如段落43至73中任一者之方法，其中該細胞為真核細胞。
75. 如段落74之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
76. 如段落75之方法，其中該細胞為幹細胞。
77. 如段落74之方法，其中該細胞為人類細胞。
78. 如段落43至73中任一者之方法，其中該方法不依賴於Fis。
79. 如段落43至78中任一者之方法，其中使用質體、病毒載體、微環或線形DNA形式將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中。
80. 如段落45至78中任一者之方法，其中該目標核苷酸序列為內源性基因座。
81. 如段落80之方法，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
82. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於修飾細胞之基因體。
83. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於修飾細胞之基因體。
84. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中。
85. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中。
86. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列。
87. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列。
88. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列。
89. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列。
90. 一種鋅指重組酶，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
91. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
92. 如段落88或90所使用的鋅指重組酶或如段落89或91之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其進一步包含非同源末端連接(NHEJ)抑制劑之使用。
93. 如段落92所使用之鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
94. 如段落93所使用之鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
95. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症。
96. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症。
97. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症。
98. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症。
99. 一種鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
100. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
101. 如段落97至100中任一者所使用之鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
102. 如段落101所使用之鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
103. 如段落102所使用之鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
104. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。
105. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列校正該細胞之該基因體中之致病突變。
106. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。
107. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於校正細胞之基因體中之致病突變。
108. 一種鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
109. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
110. 如段落106至109中任一者所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
111. 如段落110所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
112. 如段落111所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
113. 如段落82至112中任一者所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為真核細胞。
114. 如段落113所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為哺乳動物細胞。
115. 如段落114所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為幹細胞。
116. 如段落113所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為人類細胞。
117. 如段落82至116中任一者所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該使用不依賴於Fis。
118. 如段落82至117中任一者所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中使用質體、病毒載體、微環或線形DNA形式將編碼該鋅指重組酶之該聚核苷酸引入至該細胞中。
119. 如段落84至118中任一者所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該目標核苷酸序列為內源性基因座。
120. 如段落119所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
121. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備修飾細胞之基因體的藥物。
122. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備修飾細胞之基因體的藥物。
123. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的藥物。
124. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的藥物。
125. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的藥物。
126. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的藥物。
127. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物。
128. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物。
129. 一種鋅指重組酶之用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
130. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
131. 如段落127至130中任一者之用途，其進一步包含使用非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。
132. 如段落131之用途，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
133.  如段落132之用途，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
134. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症的藥物。
135. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症的藥物。
136. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物。
137. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物。
138. 一種鋅指重組酶之用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
139. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
140. 如段落136至139中任一者之用途，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
141. 如段落140之用途，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
142. 如段落141之用途，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
143. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。
144. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。
145. 一種如段落8至25中任一者之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。
146. 一種如段落26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備校正細胞之基因體中之致病突變的藥物。
147. 一種鋅指重組酶之用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
148. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
149. 如段落145至148中任一者之用途，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
150. 如段落149之用途，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
151. 如段落150之用途，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
152. 如段落121至151中任一者之用途，其中該細胞為真核細胞。
153. 如段落152之用途，其中該細胞為哺乳動物細胞。
154. 如段落153之用途，其中該細胞為幹細胞。
155. 如段落152之用途，其中該細胞為人類細胞。
156. 如段落121至155中任一者之用途，其中該用途不依賴於Fis。
157. 如段落121至156中任一者之用途，其中使用質體、病毒載體、微環或線形DNA形式將編碼該鋅指重組酶之該聚核苷酸引入至該細胞中。
158. 如段落123至157中任一者之用途，其中該目標核苷酸序列為內源性基因座。
159. 如段落158之用途，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
儘管已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例相當詳細地提供了揭示內容，但對於熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本發明之精神或範疇的情況下實踐各種改變及修改。因此，前述描述及實例不應被解釋為具有限制性。
本發明含有至少一個彩製圖式。
圖 1 為展示K562細胞中之HPRT基因中的基於下一代定序(NGS)之標準目標整合分析之結果的圖表，其中在左側描繪目標整合率(%TI)，且在右側描繪插入缺失%(插入缺失突變)。該圖表比較與H106Y重組酶變異體及無重組酶(GFP)相比的藉由鋅指重組酶F104N變異體催化的整合。
圖 2 展示BL1-A (藍色雷射螢光通道1)流動式細胞測量術分析之結果，其中K562細胞經包含GFP表現卡匣及靶向HPRT基因之F104N ZFR變異體的供體載體轉染(C 圖 )，且與僅經包含GFP表現卡匣之供體載體轉染的細胞(B 圖 )及未經轉染之細胞(A 圖 )相比較。
圖 3 展示本發明之絲胺酸重組酶及Gin重組酶之DNA股交換機制的示意圖，第一步驟為目標位點及供體位點處之二聚體形成(A 圖 )；二聚體中之每一者特異性結合目標位點及供體位點，且四聚體形成於目標二聚體與供體二聚體之間，從而催化裂解(B 圖 )；圍繞四聚體界面之亞單元旋轉允許在各重組酶亞單元保持共價連接至DNA時的股交換(C 圖 )；且再連接完成供體序列至目標序列中之穩定整合(靶向整合)(D 圖 )。
圖4展示與ZFN/NHEJ介導之TI不同的ZFR TI機制。A 圖 為在NHEJ抑制劑存在下核酸酶介導之TI及重組酶介導之TI的示意圖；在存在或不存在NHEJ抑制劑(KU00060648)之情況下用HPRT ZFN對照組或HPRT ZFR構築體(F104N:I94V)及供體質體共轉染K562細胞之後量測插入缺失%、完美TI%及總TI% (B 圖 )。
圖 5 展示使用C-NHEJ抑制劑的無插入缺失的ZFR介導之切除。A 圖 展示ZFR介導之切除之示意圖。B 圖 展示具有兩個HPRT ZFR結合位點的在存在或不存在NHEJ抑制劑(KU0060648)之情況下經H106Y ZFR、F104N ZFR或ZFN構築體轉染的K562報導子細胞株中之插入缺失%、總切除%及完美切除%的結果。
圖 6 為鋅指重組酶(ZFR)結合於目標核苷酸序列及形成ZFR二聚體的示意圖。各ZFR之ZFP及Gin催化域結合於其在ZFR目標核苷酸序列中之各別ZFP結合域(或ZFP結合位點)及Gin結合位點。
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Claims (159)

  1. 一種Gin重組酶催化域變異體，其相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  2. 如請求項1之Gin重組酶催化域變異體，其進一步包含His106Tyr胺基酸取代。
  3. 如請求項2之Gin重組酶催化域變異體，其包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 60。
  4. 如請求項1之Gin重組酶催化域變異體，其進一步包含Ile94Val胺基酸取代。
  5. 如請求項4之Gin重組酶催化域變異體，其包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 61。
  6. 一種編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸，其中編碼該Gin重組酶催化域變異體之核酸序列包含SEQ ID NO: 7中所列之核苷酸序列。
  7. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至5中任一項之Gin重組酶催化域變異體。
  8. 一種鋅指重組酶，其包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含Phe104Asn胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  9. 如請求項8之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代。
  10. 如請求項9之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 60。
  11. 如請求項8之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體進一步包含Ile94Val胺基酸取代。
  12. 如請求項11之鋅指重組酶，其中該Gin重組酶催化域變異體包含以下中之任一者中所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 61。
  13. 如請求項8至12中任一項之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為多聚體蛋白。
  14. 如請求項13之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為同源多聚體蛋白。
  15. 如請求項13之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為異源多聚體蛋白。
  16. 如請求項13之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為二聚體蛋白。
  17. 如請求項16之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為同源二聚體蛋白。
  18. 如請求項16之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為異源二聚體蛋白。
  19. 如請求項14之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為四聚體蛋白。
  20. 如請求項19之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為同源四聚體蛋白。
  21. 如請求項19之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白為異源四聚體蛋白。
  22. 如請求項8至21中任一項之鋅指重組酶，其中該鋅指核苷酸結合域包含如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所列之序列。
  23. 如請求項8至22中任一項之鋅指重組酶，其中該鋅指重組酶蛋白結合包含如SEQ ID NO: 15中所列之序列的核苷酸序列。
  24. 如請求項8至23中任一項之鋅指重組酶，其中該鋅指核苷酸結合域能夠結合內源性基因座。
  25. 如請求項24之鋅指重組酶，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)基因、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
  26. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶。
  27. 如請求項26之聚核苷酸，其中編碼該Gin重組酶催化域變異體之核酸序列包含SEQ ID NO: 7中所列之核苷酸序列。
  28. 一種載體，其包含如請求項6至7之編碼Gin重組酶催化域變異體的聚核苷酸。
  29. 一種載體，其包含如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸。
  30. 一種細胞，其包含如請求項28或29之載體。
  31. 一種細胞，其包含如請求項1至5中任一項之Gin重組酶催化域變異體。
  32. 一種細胞，其包含如請求項6至7之編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸。
  33. 一種細胞，其包含如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶蛋白。
  34. 一種細胞，其包含如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸。
  35. 如請求項30至34中任一項之細胞，其中該細胞為真核細胞。
  36. 如請求項35之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  37. 如請求項36之細胞，其中該細胞為幹細胞。
  38. 如請求項35之細胞，其中該細胞為人類細胞。
  39. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之Gin重組酶催化域變異體；及醫藥學上可接受之載劑。
  40. 一種醫藥組合物，其包含如請求項6至7之編碼Gin重組酶催化域變異體之聚核苷酸；及醫藥學上可接受之載劑。
  41. 一種醫藥組合物，其包含如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶；及醫藥學上可接受之載劑。
  42. 一種醫藥組合物，其包含如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸；及醫藥學上可接受之載劑。
  43. 一種修飾細胞之基因體的方法，該方法包含將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至細胞中。
  44. 一種修飾細胞之基因體的方法，該方法包含將如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
  45. 一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至細胞中。
  46. 一種將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的方法，該方法包含將如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
  47. 一種破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至該細胞中。
  48. 一種破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
  49. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至該細胞中。
  50. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
  51. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將鋅指重組酶引入至該細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  52. 一種自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的方法，該方法包含將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  53. 如請求項49至52中任一項之方法，其進一步包含將非同源末端連接(NHEJ)抑制劑引入至該細胞中。
  54. 如請求項53之方法，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  55. 如請求項54之方法，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  56. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至細胞中來修飾該細胞之基因體中之目標序列。
  57. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中來修飾該細胞之基因體中之目標序列。
  58. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列。
  59. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含自細胞之基因體切除目標序列，該聚核苷酸編碼如請求項26或27之鋅指重組酶。
  60. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  61. 一種治療個體之病症的方法，該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至細胞中而自該細胞之基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  62. 如請求項58至61中任一項之方法，其進一步包含投與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。
  63. 如請求項62之方法，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  64. 如請求項63之方法，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  65. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含修飾該細胞之該基因體中之目標序列，包含將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至該細胞中。
  66. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含修飾該細胞之該基因體中之目標序列，包含將如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中。
  67. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶引入至該細胞中而自該細胞之該基因體切除目標序列。
  68. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中而自該細胞之該基因體切除目標序列。
  69. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將鋅指重組酶引入至該細胞中而自該細胞之該基因體切除目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  70. 一種校正細胞之基因體中之致病突變的方法，該方法包含藉由將編碼鋅指重組酶之聚核苷酸引入至該細胞中來切除該細胞之該基因體中之目標序列，該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  71. 如請求項67至70中任一項之方法，其中該方法進一步包含非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。
  72. 如請求項71之方法，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  73. 如請求項72之方法，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  74. 如請求項43至73中任一項之方法，其中該細胞為真核細胞。
  75. 如請求項74之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  76. 如請求項75之方法，其中該細胞為幹細胞。
  77. 如請求項74之方法，其中該細胞為人類細胞。
  78. 如請求項43至73中任一項之方法，其中該方法不依賴於Fis。
  79. 如請求項43至78中任一項之方法，其中使用質體、病毒載體、微環或線形DNA形式將編碼該鋅指重組酶之該聚核苷酸引入至該細胞中。
  80. 如請求項45至78中任一項之方法，其中該目標核苷酸序列為內源性基因座。
  81. 如請求項80之方法，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
  82. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於修飾細胞之基因體。
  83. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於修飾細胞之基因體。
  84. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中。
  85. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中。
  86. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列。
  87. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列。
  88. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列。
  89. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列。
  90. 一種鋅指重組酶，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  91. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於自細胞之基因體切除目標核苷酸序列，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  92. 如請求項88或90所使用之鋅指重組酶或如請求項89或91之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其進一步包含使用非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。
  93. 如請求項92所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  94. 如請求項93所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  95. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症。
  96. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症。
  97. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症。
  98. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症。
  99. 一種鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  100. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  101. 如請求項97至100中任一項所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
  102. 如請求項101所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  103. 如請求項102所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  104. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。
  105. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。
  106. 如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變。
  107. 如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於校正細胞之基因體中之致病突變。
  108. 一種鋅指重組酶，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  109. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其用於藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  110. 如請求項106至109中任一項所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
  111. 如請求項110所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  112. 如請求項111所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  113. 如請求項82至112中任一項所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為真核細胞。
  114. 如請求項113所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  115. 如請求項114所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為幹細胞。
  116. 如請求項113所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該細胞為人類細胞。
  117. 如請求項82至116中任一項所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該使用不依賴於Fis。
  118. 如請求項82至117中任一項所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中使用質體、病毒載體、微環或線形DNA形式將編碼該鋅指重組酶之該聚核苷酸引入至該細胞中。
  119. 如請求項84至118中任一項所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該目標核苷酸序列為內源性基因座。
  120. 如請求項119所使用的鋅指重組酶或編碼鋅指重組酶之聚核苷酸，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
  121. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備修飾細胞之基因體的藥物。
  122. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備修飾細胞之基因體的藥物。
  123. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的藥物。
  124. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備將外源性核苷酸序列整合至細胞之基因體中之目標核苷酸序列中的藥物。
  125. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的藥物。
  126. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備破壞細胞之基因體中之目標核苷酸序列的藥物。
  127. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物。
  128. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物。
  129. 一種鋅指重組酶之用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  130. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備自細胞之基因體切除目標核苷酸序列的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下序列中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  131. 如請求項127至130中任一項之用途，其進一步包含使用非同源末端連接(NHEJ)抑制劑。
  132. 如請求項131之用途，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  133. 如請求項132之用途，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  134. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症的藥物。
  135. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來治療個體之病症的藥物。
  136. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物。
  137. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物。
  138. 一種鋅指重組酶之用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  139. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來治療個體之病症的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  140. 如請求項136至139中任一項之用途，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
  141. 如請求項140之用途，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  142. 如請求項141之用途，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  143. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。
  144. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由修飾細胞之基因體中之目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。
  145. 一種如請求項8至25中任一項之鋅指重組酶的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物。
  146. 一種如請求項26或27之編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備校正細胞之基因體中之致病突變的藥物。
  147. 一種鋅指重組酶之用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  148. 一種編碼鋅指重組酶之聚核苷酸的用途，其用於製備藉由自細胞之基因體切除目標序列來校正該細胞之該基因體中之致病突變的藥物，其中該鋅指重組酶包含以可操作方式連接於鋅指核苷酸結合域之Gin重組酶催化域變異體，其中相對於如以下中之任一者中所列之Gin重組酶催化域胺基酸序列，該Gin重組酶催化域變異體進一步包含His106Tyr胺基酸取代：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。
  149. 如請求項145至148中任一項之用途，其與非同源末端連接(NHEJ)抑制劑一起使用。
  150. 如請求項149之用途，其中該NHEJ抑制劑係選自由以下組成之群：小分子抑制劑、鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)及肽抑制劑。
  151. 如請求項150之用途，其中該小分子抑制劑係選自由以下組成之群：KU0060648、VX-984、W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、Mirin、SCR7、AG14361、M9831及VXc-296。
  152. 如請求項121至151中任一項之用途，其中該細胞為真核細胞。
  153. 如請求項152之用途，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  154. 如請求項153之用途，其中該細胞為幹細胞。
  155. 如請求項152之用途，其中該細胞為人類細胞。
  156. 如請求項121至155中任一項之用途，其中該用途不依賴於Fis。
  157. 如請求項121至156中任一項之用途，其中使用質體、病毒載體、微環或線形DNA形式將編碼該鋅指重組酶之該聚核苷酸引入至該細胞中。
  158. 如請求項121至157中任一項之用途，其中該目標核苷酸序列為內源性基因座。
  159. 如請求項158之用途，其中該內源性基因座係選自由以下組成之群：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、T細胞受體α恆定(TRAC)、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)及安全港基因座。
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