ES2940786T3 - Compuestos de quinoxalinona, composiciones, métodos y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma - Google Patents

Compuestos de quinoxalinona, composiciones, métodos y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma Download PDF

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Abstract

Compuestos, métodos para editar regiones genómicas diana, métodos para reparar una rotura de ADN a través de una vía HDR, métodos para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN a través de una vía NHEJ y métodos para modificar la expresión de un gen o genes) o proteína(s) comprenden la administración a una o más células que incluyen una o más regiones genómicas diana, un sistema de edición del genoma y un inhibidor de proteína quinasa de ADN (ADN-PK) descrito en el presente documento. Los kits y las composiciones para editar un gen diana comprenden un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK descrito en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de quinoxalinona, composiciones, métodos y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 62/618,385, presentada el 17 de enero de 2018.
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado electrónicamente en formato ASCII. La copia ASCII, creada el 16 de enero de 2019, se llama 14390-687 Sequence listing_ST25.txt y tiene un tamaño de 4 KB.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere de manera general a compuestos, composiciones, métodos y kits para aumentar la eficiencia de la edición del genoma mediante la administración de un inhibidor de proteína quinasa de ADN (ADN-PK) y un sistema de edición del genoma a una célula o células.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se necesitan tecnologías precisas de direccionamiento del genoma para permitir la manipulación sistemática de variaciones genéticas. El uso de sistemas de edición del genoma, específicamente la tecnología de edición del genoma basada en endonucleasas CRISPR, ha crecido exponencialmente en los últimos años. El sistema inmunitario innato bacteriano CRISPR-Cas9 de tipo II se ha convertido en una herramienta eficaz de edición del genoma para la modificación específica del genoma humano (Wiedenheft, B. 2012; Hsu, P.D. et al. 2014). Recientemente, se han descrito sistemas de edición del genoma CRISPR-Cpf. La edición del genoma basada en endonucleasa CRISPR depende, en parte, de las vías de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (h Dr ) para reparar roturas de doble cadena de ADN. El mecanismo de reparación celular favorece NHEJ sobre HDR.
Aunque el logro de inserciones o deleciones (indeles) de NHEJ tiene hasta un 70% de efectividad en algunos informes, la eficiencia de la HDR sigue siendo un desafío, con tasas de menos del 1%.
Por consiguiente, hay una necesidad de aumentar la eficiencia de la edición del genoma, en particular, la eficiencia de HDR.
La WO 2014/159690 divulga "compuestos que son útiles como inhibidores de ADN-PK. La divulgación también proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden dichos compuestos y método de uso de las composiciones en el tratamiento de varias enfermedades, afecciones o trastornos".
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención puede mejorar la eficiencia de HDR mediante la supresión de enzimas de NHEJ tales como ADN-PK usando inhibidores de a DN-PK. Las referencias en la presente a los métodos de edición de una o más regiones genómicas objetivo, los métodos de reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo, los métodos para inhibir o suprimir una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo o los métodos para modificar la expresión del uno o más genes o proteínas se refieren a métodos que usan una o más células cultivadas o células ex vivo de un organismo. La invención también se refiere a compuestos, sales farmacéuticamente aceptables y cocristales de los mismos, composiciones farmacéuticas y medicamentos para su uso en métodos de editar una o más regiones genómicas objetivo, métodos para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo, métodos para inhibir o suprimir una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo o métodos para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, en donde las células usadas en los métodos son células in vivo dentro de un organismo.
La invención reivindicada no está relacionada con usos de embriones humanos para propósitos industriales o comerciales.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I):
Figure imgf000003_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.
m yn son independientemente 1 o 2.
X es O o NR; en donde R es H o alquilo C1-C4.
Y es un enlace, O o NR; en donde R es H o alquilo C1-C4.
R1 es alquilo C1-C4.
un anillo arilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros que contiene uno o dos heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S, en donde el anillo arilo y heteroarilo puede estar sustituido con 0, 1, 2 o 3 sustituyentes R3 independientemente seleccionados del grupo que consiste en CN, halo, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4, C(=O)NHRr y un anillo heterocicloalquilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros, en donde cada anillo contiene 1,2 o 3 heteroátomos seleccionados de N, O y S; en donde R1' es alquilo C1-C4; o en donde dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar un anillo fusionado de 5 o 6 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S; o COOR4 en donde R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
Cada alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4 y haloalcoxi C1-C4 puede estar además sustituido con OR5 o NR6 R7.
Cada uno de R5, R6y R7 es independientemente H, alquilo C1-C4o cicloalquilo C3-C6.
R6 y R7 y el átomo de nitrógeno al que están unidos pueden formar un anillo saturado de 5 o 6 miembros que puede contener 0 o 1 heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S y en donde el anillo puede estar además sustituido por alquilo C1-C4.
El anillo A se selecciona del grupo que consiste en
y
Figure imgf000003_0002
W es N o CR3; y Z es O o S; en donde R3 es H o alquilo C1-C4.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, en donde R2 es un anillo aromático o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o dos heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S, en donde el anillo aromático o heteroaromático puede estar sustituido con 0, 1 o 2 sustituyentes R3 independientemente seleccionados del grupo que consiste en CN, halo, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4 y C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C4; o en donde dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo aromático o heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S; o COOR4 en donde R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En algunas realizaciones, R2 es:
Figure imgf000004_0002
en donde # indica que R2 está conectado al resto del compuesto de fórmula (I); y o es 0, 1 o 2.
En algunas realizaciones, el compuesto está representado por la Fórmula Estructural (II), la Fórmula Estructural (II'), la Fórmula Estructural (II") o la Fórmula Estructural (II'''):
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o cocristales del mismo.
En algunas realizaciones, el anillo A se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000005_0002
En otras realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (III), la Fórmula Estructural (III'), la Fórmula Estructural (III") o la Fórmula Estructural (Mi'"):
Figure imgf000005_0003
o
Figure imgf000006_0001
En algunas realizaciones, R2 es:
Figure imgf000006_0002
En algunas realizaciones, el compuesto es un cocristal que incluye un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II"), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'''), y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.
La divulgación también proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'''), o un sal aceptable o un cocristal de la misma.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'''), o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.
En algunas realizaciones, la divulgación también proporciona un método para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de reparación dirigida por homología (HDR), el método incluye la administración a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''), o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristales de la misma.
El sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en donde la rotura del ADN se repara por lo menos en parte a través de una vía de HDR.
La divulgación también proporciona un método para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de NHEJ, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III''), o Fórmula (III'''), o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.
El sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una ruptura del ADN, y en donde se inhibe o suprime la reparación de la ruptura del ADN a través de una vía de NHEJ.
La divulgación también proporciona un método para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, el método incluye administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II"), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (MI"'), o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.
El sistema de edición del genoma interactúa con un o unos ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo de un gen o genes objetivo, lo que da como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociados con el gen o genes objetivo.
En algunas realizaciones, la rotura de ADN incluye una rotura de doble cadena (DSB) de ADN.
En algunas realizaciones, el compuesto es un cocristal que incluye un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'''), y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 representa el diseño de los ensayos de edición de genes.
La FIG. 2 es un gráfico que muestra las tasas de edición de genes en BEC tratados con un inhibidor de ADN-PK. Las FIGS. 3A y 3B son gráficos que muestran las tasas de edición de genes después del tratamiento con inhibidores de ADN-PK en células CD34+ de dos donantes diferentes.
La FIG. 4 es un gráfico que muestra las tasas de edición de genes en iPSC tratadas con un inhibidor de ADN-PK. La FIG. 5 es un gráfico que muestra la cinética de edición de genes en BEC en la ECmax del inhibidor de ADN-PK.
La FIG. 6 es un gráfico que muestra la cinética de edición de genes en BEC en la EC50 del inhibidor de ADN-PK. La FIG. 7 es un gráfico de barras que muestra las tasas de HDR para los componentes de edición de genes administrados portransfección mediada por lípidos en BEC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos usados en relación con esta divulgación tendrán los significados entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligonucleótidos o polinucleótidos descritas en la presente son bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Se usan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de esta divulgación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y médica descritas en la presente son bien conocidas y se usan comúnmente en la técnica. Las técnicas estándar se usan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica, y tratamiento de pacientes. En general, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, y el Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed. 1994. Además, los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry," Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y "March's Advanced Organic Chemistry," 5a Ed., Smith, M.B. and March, J., eds. John Wiley & Sons, New York: 2001. Como se utilizan de acuerdo con esta divulgación, se entenderá que los términos definidos en esta divulgación, a menos que se indique lo contrario, tienen los significados definidos en la presente.
En algunas realizaciones, la eficacia de editar las regiones genómicas objetivo en una o más células aumenta en comparación con la de una célula o células idénticas pero sin el compuesto.
En algunas realizaciones, la eficacia de la reparación de la ruptura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía de HDR aumenta en comparación con la de una célula o células idénticas pero sin el compuesto.
En algunas realizaciones, la eficacia de inhibir o suprimir la reparación de la ruptura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía de NHEJ aumenta en comparación con la de células idénticas pero sin el compuesto.
En algunas realizaciones, la eficiencia aumenta por lo menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces en comparación con el de una célula o células por lo demás idénticas pero sin compuesto.
En algunas realizaciones, la eficiencia se mide por la frecuencia de la integración de polinucleótidos dirigida. En algunas realizaciones, la eficacia se mide por la frecuencia de la mutagénesis dirigida. En algunas realizaciones, la mutagénesis dirigida comprende mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones.
En algunas realizaciones, la expresión de uno o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociados con el o los genes objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en la una o más células antes de la administración. Por ejemplo, dicha expresión se aumenta en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5-veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración.
En algunas realizaciones, la expresión de uno más genes y/o proteínas en sentido descendente asociadas con el gen o genes objetivo disminuye en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración. Por ejemplo, la expresión génica se reduce en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración.
En algunas realizaciones, la expresión de uno o más genes y/o proteínas en sentido descendente asociados con el o los genes objetivo se elimina sustancialmente en una o más células.
En algunas realizaciones, la célula está sincronizada en la fase del ciclo celular S o G2.
En algunas realizaciones, la una o más células que se administran o se ponen en contacto con dicho compuesto tienen una supervivencia aumentada en comparación con una o más células que no se han administrado o puesto en contacto con dicho compuesto.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en la una o más células simultáneamente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en la una o más células secuencialmente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra en la una o más células antes del compuesto. En algunas realizaciones, el compuesto se administra en la una o más células antes del sistema de edición del genoma.
En algunas realizaciones, la una o más células son células cultivadas. En algunas realizaciones, la una o más células son células in vivo dentro de un organismo. En algunas realizaciones, la una o más células son células ex vivo de un organismo.
En algunas realizaciones, el organismo es un mamífero. En algunas realizaciones, el organismo es un humano.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran por la misma vía. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran a través de una vía diferente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra por vía intravenosa y el compuesto se administra por vía oral.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores del tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en CRISPR. En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía que incluye: (i) un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; (ii) y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN direccionador o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que incluye una proteína Cas o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas.
En algunas realizaciones, el ARN direccionador y el ARN activador se fusionan como una única molécula.
En algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf y el sistema CRISPR-Cpf incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el ARN guía que incluye un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo; y (b) un elemento de proteína Cpf que incluye una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cpf.
En algunas realizaciones, el sistema
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edición del genoma se administra mediante uno o más vectores. En algunas realizaciones, el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc.
En algunas realizaciones, los vectores virales se seleccionan de vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se administra mediante ARN sintético. En algunas realizaciones, el sistema
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edición del genoma se administra mediante una nanoformulación. En algunas realizaciones, se proporciona un kit o una composición para editar una o más regiones genómicas objetivo. En algunas realizaciones, el kit o composición incluye un sistema de edición del genoma; y
un compuesto representado por Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II"), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III"), Fórmula (III'"), o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición está representado por Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III"), Fórmula (III'"), o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde cada uno de R1 y R2 es hidrógeno o deuterio.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma del kit o composición es un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores del tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR, o un sistema basado en NgAgo. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma del kit o composición es un sistema basado en CRISPR. En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas incluye: (a) por lo menos un elemento de ARN guía que incluye: (i) un ARN direccionador que incluye un secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; (ii) y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN direccionador, o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que incluye una proteína Cas o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas.
En algunas realizaciones, la proteína Cas del kit o composición es una proteína Cas9 de tipo II. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 del kit o composición es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cpf, y en donde el sistema CRISPR-Cpf incluye: (a) un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo, o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; y (b) un elemento de proteína Cpf que incluye una proteína Cpf o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cpf.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma del kit o composición se incluye o empaqueta en uno o más vectores. En algunas realizaciones, el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc. En algunas realizaciones, los vectores virales se seleccionan del grupo que consiste en vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex.
En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición comprende un compuesto seleccionado de la
Tabla 1.
En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición es un cocristal que incluye un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II"), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (lll'), Fórmula (III") o Fórmula (IIP), y un formador de cocristales seleccionado de ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, o ácido benzoico.
En algunas realizaciones, el compuesto del kit o composición es un cocristal que incluye (a) un compuesto seleccionado de la Tabla 1 y (b) ácido adípico.
Otras características, objetos y ventajas de la invención son evidentes en la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica realizaciones y aspectos de la invención, se proporciona únicamente a modo de ilustración, no de limitación. A partir de la descripción detallada para los expertos en la técnica serán evidentes varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención.
En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona métodos, composiciones y kits para editar un genoma objetivo, por ejemplo, mediante la corrección de una mutación. Tales métodos, composiciones y kits pueden aumentar la eficiencia de edición del genoma mediante el uso de un inhibidor de ADN-PK.
Un sistema de edición genómica puede estimular o inducir la rotura o roturas de ADN, como DSB en el locus deseado en el genoma (o región genómica objetivo). La creación de la escisión del ADN provoca que las enzimas celulares reparen el sitio de rotura a través de la vía NHEJ propensa a errores o a través de la vía HDR libre de errores. En NHEJ, la lesión del ADN se repara fusionando los dos extremos de la rotura del ADN en una serie de procesos enzimáticos que implican enzimas del heterodímero Ku70/80 y proteína quinasa dependiente del ADN (ADN-PK). El mecanismo de reparación implica el anclaje y la alineación de dos extremos del ADN, la resección, la elongación y el ligamiento (Rouet et al.; Dexheimer T. DNA repair pathways and mechanisms. In: Mathews L, Cabarcas S, Hurt E, editores. DNA repair of cancer stem células Dordrecht: Springer, 2013, págs. 19-32) lo que da como resultado la formación de pequeñas mutaciones de inserciones o deleciones (indeles) en el sitio de rotura. Los indeles introducidos en la secuencia codificante de un gen pueden provocar mutaciones prematuras en el codón de terminación o de cambios en el marco que llevan a la producción de proteínas truncadas no funcionales. El mecanismo de la vía HDR se comprende menos e implica un conjunto diferente de proteínas de reparación, como Rad51, que estimulan la invasión de cadenas por una plantilla de reparación de donante para la inserción de bases o el reemplazo de genes. Por lo tanto, HDR permite la introducción de una plantilla de a Dn exógena para obtener el resultado deseado de la edición de ADN dentro de un genoma y puede ser una estrategia potente para el modelado de enfermedades traslacionales y la edición genómica terapéutica para restaurar la función génica.
De las dos vías de reparación del ADN, la NHEJ se produce con una frecuencia mucho más alta y pueden lograrse informes de más del 70% de eficiencia incluso en neuronas (Swiech et al., "In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9," Nat Biotechnol. enero 2015; 33(1):102-62014). Sin embargo, la corrección del gen de HDR se produce a muy baja frecuencia y durante las fases S y G2 cuando se ha completado la replicación del ADN y las cromátidas hermanas están disponibles para servir como plantillas de reparación (Heyer et al., Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics 44:113-139, 2010). Como NHEJ se produce a lo largo del ciclo celular, en competencia y se ve favorecido sobre HDR durante la fase S y G2, la inserción dirigida a través de la vía HDR sigue siendo un desafío y un foco de estudios continuos.
La proteína quinasa de ADN (ADN-PK) desempeña un papel en varios procesos de reparación del ADN. ADN-PK participa en la reparación de roturas de cadena doble del ADN a través de la activación de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Se cree que NHEJ se desarrolla a través de tres pasos: el reconocimiento de las DSB, el procesamiento del ADN para eliminar los extremos no ligables u otras formas de daño en los extremos terminales y, finalmente, el ligamiento de los extremos del ADN. El reconocimiento de las DSB se lleva a cabo uniendo del heterodímero Ku a los extremos del ADN irregulares, seguido del reclutamiento de dos moléculas de la subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs o ADN-PK) a los lados adyacentes de la DSB; esto sirve para proteger los extremos terminales rotos hasta que se recluten enzimas de procesamiento adicionales. Datos recientes respaldan la hipótesis de que ADNPK-cs fosforila la enzima de procesamiento, Artemis, así como a sí mismo para preparar los extremos del ADN para un procesamiento adicional. En algunos casos, puede requerirse ADN polimerasa para sintetizar nuevos extremos antes del paso de ligamiento. Se cree que la autofosforilación de ADN-PKcs induce un cambio conformacional que abre la cavidad de unión central del ADN, libera ADN-PKcs del ADN y facilita el religamiento final de los extremos del ADN.
En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona métodos, composiciones y kits para mejorar la edición génica, en particular aumentar la eficiencia de la reparación de una rotura o roturas de ADN a través de la vía HDR, o la eficiencia de la inhibición o supresión de la reparación de una rotura o roturas de ADN a través de una vía NHEJ, en sistemas de edición de genomas, incluyendo la reparación HDR basada en CRISPR en células. aunque no se desea estar limitado a ninguna teoría en particular, se cree que un sistema de edición del genoma administrado a una o más células interactúa con uno o más ácidos nucleicos del gen objetivo, lo que da como resultado o provoca una ruptura del ADN; dicha rotura de ADN se repara mediante varias vías de reparación, por ejemplo, HDR, y un inhibidor de ADN-PK administrado a una o más células inhibe, bloquea o suprime una vía de reparación de NHEJ, y puede aumentarse o promoverse la frecuencia o eficiencia de la vía de reparación de ADN HDR.
La interacción entre un sistema de edición del genoma con uno o más ácidos nucleicos del gen objetivo puede ser la hibridación de por lo menos una parte del sistema de edición del genoma con el o los ácidos nucleicos del gen objetivo, o cualquier otro reconocimiento del ácido nucleico o los ácidos nucleicos del gen objetivo por el sistema de edición del genoma. En algunas realizaciones, dicha interacción es una interacción proteína-ADN o hibridación entre pares de bases.
En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células administrando a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK. La edición puede producirse simultáneamente o secuencialmente. La edición de una o más regiones genómicas objetivo incluye cualquier tipo de manipulación o ingeniería genética del genoma de una célula. En algunas realizaciones, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede incluir inserciones, deleciones o reemplazos de regiones genómicas en una célula o células. Las regiones genómicas comprenden el material genético en una célula o células, como ADN, ARN, polinucleótidos y oligonucleótidos. Las regiones genómicas en una célula o células también comprenden los genomas de las mitocondrias o cloroplastos contenidos en una célula o células.
En algunas realizaciones, las inserciones, deleciones o reemplazos pueden estar o en una región genómica codificante o no codificante, en regiones intrónicas o exónicas, o cualquier combinación de las mismas, incluyendo segmentos superpuestos o no superpuestos de las mismas. Como se usa en la presente, una "región no codificante" se refiere a regiones genómicas que no codifican una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las regiones no codificantes incluyen intrones. Las regiones codificantes se refieren a regiones genómicas que codifican una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las regiones codificantes incluyen exones.
En algunas realizaciones, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede producirse en una cualquiera o más regiones objetivo en un genoma de una célula o células. En algunas realizaciones, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede producirse, por ejemplo, en un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, en una región promotora, una región potenciadora, una región silenciadora, una región aislante, un antirrepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (por ejemplo, poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión del factor de transcripción o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la administración a una célula o células con un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica da como resultado una eficiencia de edición del genoma dirigida aumentada en comparación con las condiciones en las que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica a una célula o células. En algunas realizaciones, la eficiencia de edición aumentada es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK a una célula o células. La eficiencia de la edición genómica puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante cualquier método que determine la frecuencia de integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de mutagénesis dirigida. Las integraciones de polinucleótidos dirigidas también pueden dar como resultado la alteración o el reemplazo de una secuencia en un genoma, cromosoma o una región de interés en la cromatina celular. Las integraciones de polinucleótidos dirigidas pueden dar lugar a mutaciones dirigidas que incluyen, pero no se limitan a, mutaciones puntuales (es decir, conversión de un solo par de bases en un par de bases diferente), sustituciones (es decir, conversión de una pluralidad de pares de bases en una secuencia diferente de idéntica longitud), inserciones de uno o más pares de bases, deleciones de uno o más pares de bases y cualquier combinación de las alteraciones de secuencia mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, los métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células implican administrar a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK. En algunas realizaciones, la célula o células se sincronizan en la fase del ciclo celular S o G2. La sincronización de la célula o células en la fase del ciclo celular S o G2 puede lograrse mediante cualquier método conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, los agentes que pueden usarse para sincronizar una célula o células en la fase del ciclo celular S o G2 incluyen afidicolina, droxiurea, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina o cualquier combinación de los mismos. (Ver, Lin et al. al."Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery" Elife. 15 de diciembre de 2014;3). En algunas realizaciones, los agentes para la sincronización celular pueden administrarse en cualquier momento durante el proceso de edición de genes. En algunas realizaciones, una célula o células pueden sincronizarse en la fase S o G2 del ciclo celular antes, durante o después de administrar a una célula o células un sistema de edición del genoma y/o un inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, los métodos de edición de una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células administrando a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con las condiciones en las que el sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK no se administraron a una célula o células, o en comparación con condiciones en las que solo un sistema de edición de genes se pone en contacto o se administra a una célula o células y no un inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de HDR. La administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK da como resultado una rotura del ADN de una región específica del genoma, y posteriormente se repara la rotura del ADN, por lo menos en parte, mediante una vía HDR. Estos métodos dan como resultado cantidades aumentadas de reparación mediada por HDR (por ejemplo, vía HDR) en la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una mayor eficiencia de la reparación mediada por HDR en comparación con las condiciones en las que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica a una célula o células. En algunas realizaciones, la eficiencia de la reparación mediada por la vía HDR de la rotura del ADN es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula o células un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK. La eficiencia de la reparación mediada por la vía HDR puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, determinando la frecuencia de integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de mutagénesis dirigida.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente proporciona la reparación de la rotura del ADN aumentando la eficiencia de la vía HDR.
La vía HDR puede ser "canónica" o "alternativa". "HDR" (reparación dirigida por homología) se refiere a una forma especializada de reparación del ADN que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de cadena doble o una muesca de ADN en una célula o células. La HDR de roturas de cadena doble generalmente se basa en la homología de secuencias de nucleótidos, usa una molécula "donante" para la reparación de plantilla de una molécula "objetivo" (por ejemplo, la que experimentó la rotura de la cadena doble) y puede llevar a la transferencia de información genética del donante al objetivo. La HDR canónica de roturas de cadena doble generalmente se basa en BRCA2 y RAD51 y típicamente emplea una molécula donante de ADNdc. La HDR no canónica o "alternativa" es un mecanismo de HDR que es suprimido por BRCA2, RAD51 y/o genes relacionados funcionalmente. La HDR alternativa puede usar una molécula donante de ADNmc o ADNdc recortada. Ver, por ejemplo, la WO 2014172458.
En algunas realizaciones, los métodos para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR administrando a la célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con las condiciones en las que no se administran un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK a una célula o células, o en comparación con condiciones en las que solo se administra un sistema de edición de genes a una célula o células y no un inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células. En algunas realizaciones, la inhibición o supresión de la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN se realiza inhibiendo o suprimiendo la vía NHEJ. La vía NHEJ puede ser clásica ("canónica") o una vía NHEJ alternativa (alt-NHEJ, o unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)). La vía NHEJ o la vía alt-NHEJ se suprime en una célula o células administrando a una célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK.
La vía de reparación de NHEJ clásica es una vía de reparación de roturas de cadena doble de ADN en la que los extremos de la rotura de cadena doble se ligan sin una homología amplia. La reparación de NHEJ clásica usa varios factores, incluyendo el heterodímero KU70/80 (KU), XRCC4, ligasa IV y la subunidad catalítica de proteínas quinasas de ADN (ADN-PKcs). Alt-NHEJ es otra vía para la reparación de roturas de cadena doble. Alt-NHEJ usa una secuencia microhomóloga de 5-25 pares de bases durante la alineación de los extremos rotos antes de unir los extremos rotos. Alt-NHEJ es en gran medida independiente del heterodímero KU70/80 (KU), XRCC4, Ligasa IV, subunidad catalítica de proteínas quinasas de ADN (ADN-PKcs), RAD52 y ERCC1. Ver, Bennardo et al., "Alternative-NHEJ is a Mechanistically Distinct Pathway of Mammalian Chromosome Break Repair", PLOS Genetics, 27 de junio de 2008.
En algunas realizaciones, los métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN a través de la vía NHEJ en una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células inhibiendo o suprimiendo la vía NHEJ mediante la administración a una célula o células de un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una eficiencia aumentada de la inhibición o supresión de la reparación mediada por NHEJ de la rotura del ADN en comparación con una célula o células que no han recibido un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADN-PK, o en comparación con una condición en la que una célula o células reciben un sistema de edición genómica y no un inhibidor de ADN-PK. En algunas realizaciones, la eficiencia aumentada de inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN a través de la vía NHEJ al poner en contacto una célula o células con un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administran un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula o células un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK. La eficiencia de la inhibición o supresión de la reparación de una rotura de ADN a través de la vía NHEJ puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, determinando la frecuencia de integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de mutagénesis dirigida.
En algunas realizaciones, los métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células inhibiendo o suprimiendo la vía NHEJ mediante la administración a una célula o células de una edición genómica y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con las condiciones en las que no se puso en contacto o administró un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK a una célula o células, o en comparación con las condiciones en las que solo se puso en contacto o administró un sistema de edición de genes a una célula o células y no un inhibidor de ADN-PK.
La rotura del ADN puede ser una rotura de cadena doble (DSB) o dos roturas de cadena sencilla (por ejemplo, dos recortes de ADN). La DSB puede tener un extremo romo o tener un saliente de 5 'o 3', si las cadenas se escinden demasiado cada una, los salientes continuarán apareándose entre sí y existirán como dos recortes, no como una DSB.
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para modificar la expresión de uno o más genes (un gen o genes objetivo) y/o proteínas correspondientes o en sentido descendente, administrando a una célula o células un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear, por ejemplo, inserciones, deleciones, reemplazos, modificaciones o interrupciones en una región o regiones genómicas objetivo de un gen o genes objetivo de la célula o células, lo que da como resultado la expresión modificada del gen o genes objetivo. En algunas realizaciones, la inserción, deleción, reemplazo, modificación o interrupción pueden dar como resultado la expresión dirigida de una proteína específica, o grupo de proteínas, o de proteínas en sentido descendente. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear inserciones, deleciones o reemplazos en regiones no codificantes o en regiones no codificantes. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear inserciones, deleciones, reemplazos, modificaciones o interrupciones en una región promotora, una región potenciadora y/o cualquier otro elemento regulador de genes, incluyendo un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, una región silenciadora, una región aislante, un antirrepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (por ejemplo, poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión del factor de transcripción o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma puede crear las inserciones, deleciones, reemplazos, modificaciones o interrupciones en más de una región objetivo, simultáneamente o secuencialmente. En algunas realizaciones, la administración a una célula o células con un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK puede permitir la expresión génica modificada dirigida en la célula o células. Tal expresión génica modificada dirigida puede llevar a la expresión de proteínas específicas y proteínas en sentido descendente de las mismas.
En algunas realizaciones, la expresión de un gen y/o proteína en sentido descendente aumenta en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1,1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula o células un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, la expresión génica de un gen y/o proteína en sentido descendente se reduce en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK a una célula o células.
La célula de los métodos de la presente puede ser cualquier célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula de vertebrado. En algunas realizaciones, la célula de vertebrado es una célula de mamífero. En alguna realización, la célula de vertebrado es una célula humana. La invención reivindicada no se refiere a usos de embriones humanos con propósitos industriales o comerciales.
La célula puede ser cualquier tipo de célula en cualquier etapa de desarrollo, aunque la invención reivindicada no se refiere a uso de embriones humanos con propósitos industriales o comerciales. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula diferenciada, una célula madre totipotente, una célula madre pluripotente, una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria, una célula madre adulta, una célula precursora, una célula madre pluripotente inducida o cualquier combinación de las mismas. Una célula diferenciada es una célula especializada que realiza una función específica en un tejido. Una célula madre totipotente es una célula indiferenciada de un embrión, feto o adulto que puede dividirse durante períodos prolongados y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de cualquiera de las tres capas germinales de un organismo. Una célula madre pluripotente es una célula indiferenciada de un embrión, feto o adulto que puede dividirse durante períodos prolongados y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de un organismo, excepto el tejido extraembrionario o la placenta. Una célula madre embrionaria es una célula madre indiferenciada que se encuentra en la masa celular interna de un embrión y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de cualquiera de las tres capas germinales. Una célula germinal embrionaria es una célula embrionaria que puede dar lugar a células reproductoras, como espermatozoides u óvulos. Una célula madre adulta es una célula indiferenciada que se encuentra en un tejido diferenciado, es capaz de autorrenovarse y puede diferenciarse en cualquiera de las células del tejido en el que reside. Una célula precursora o progenitora es una célula parcialmente diferenciada que típicamente sólo puede diferenciarse en un tipo de célula (por ejemplo, una célula unipotente). Una célula madre pluripotente inducida es un tipo de célula madre pluripotente que se genera a partir de una célula adulta diferenciada o parcialmente diferenciada. Ver, por ejemplo, la Wo /2010/017562.
Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas. Por ejemplo, "una o más células" y "una células o células" se usan indistintamente en la presente. De manera similar, "una o más regiones genómicas objetivo" y "una región o regiones genómicas objetivo" se usan indistintamente en la presente.
Los términos, "aproximadamente" y "alrededor de" se usan indistintamente en la presente. El término "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente del contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).
Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos (ADN) o ribonucleótidos (ARN), o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir del análisis de enlace, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, Ar N ribosómico, ARN interferente corto (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), micro-ARN (ARNmi), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones a la estructura de nucleótidos pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, como mediante conjugación con un componente de marcado. El término "ADNmc" significa una molécula de ADN de cadena sencilla. El término "ODNmc" significa oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla.
El término "nucleótidos de origen natural" al que se hace referencia en la presente incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en la presente incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" al que se hace referencia en la presente incluye enlaces de oligonucleótidos como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleroato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonamidato y similares. Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si se desea.
El término "ARN sintético" se refiere al ARN que está manipulado o que no es de origen natural.
Como se usa en la presente, el término "tipo salvaje" es un término de la técnica entendido por los expertos y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica tal como se presenta en la naturaleza, a diferencia de las formas mutantes o variantes.
Los términos "de origen no natural" o "manipulado" se usan indistintamente e indican la participación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos, significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido está por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente con el que está asociado de manera natural en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.
"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar enlaces de hidrógeno con otro ácido nucleico mediante Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, apareamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 siendo el 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementarios). "Perfectamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos serán enlaces de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácidos nucleicos. "Sustancialmente complementario" como se usa en la presente se refiere a un grado de complementariedad que es por lo menos del 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 100% sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas.
Como se usa en la presente, "expresión" se refiere al proceso mediante el cual se transcribe un polinucleótido a partir de una plantilla de ADN (como en ARNm u otra transcripción de ARN) y/o el proceso mediante el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas A las transcripciones y los polipéptidos codificados puede hacerse referencia colectivamente como "producto génico". Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de marcado. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y los isómeros ópticos tanto D como L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.
El término "agente" se usa en la presente para indicar un compuesto químico, una molécula pequeña, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos.
Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente en la presente para referirse a un vertebrado, como un mamífero o un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, murinos, simios, humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas.
Como se usa en la presente, "tratamiento" o "tratar", o "paliar" o "mejorar" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen, pero no se limitan a, un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende cualquier mejora o efecto terapéuticamente relevante en una o más enfermedades, afecciones o síntomas bajo tratamiento. Para el beneficio profiláctico, las composiciones pueden administrarse a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad, afección o síntoma particular, o a un sujeto que informa de uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, aunque la enfermedad, afección o síntoma puede que no se haya manifestado todavía. Estos términos también significan el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un humano, incluyendo (a) la inhibir la enfermedad, es decir, detener o impedir su desarrollo; (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado de enfermedad; o (c) curar la enfermedad.
El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de uno o más de: el sujeto y el estado patológico que se esté tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad del estado patológico, la forma de administración y similares, que pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la técnica. El término también se aplica a una dosis que proporcionará una imagen para la detección mediante cualquiera de los métodos de imagenología descritos en la presente. La dosis específica puede variar dependiendo de uno o más de: el agente particular elegido, el régimen de dosificación a seguir, si se administra en combinación con otros compuestos, la cadencia de la administración, el tejido del que se van a obtener imágenes, y el sistema de administración físico en el que se transporta.
Como se usa en la presente, "administrar" se refiere a poner en contacto, inyectar, dispensar, suministrar o aplicar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una célula o un sujeto. En algunas realizaciones, la administración es poner en contacto un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK con una célula o células. En algunas realizaciones, la administración es suministrar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una célula o células. En algunas realizaciones, la administración es aplicar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una célula o células. En algunas realizaciones, la administración es inyectar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una célula o células. La administración puede producirse in vivo, ex vivo o in vitro. La administración de un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADN-PK a una célula o células puede realizarse simultánea o secuencialmente.
El término "adquirido" en referencia a una afección o enfermedad como se usa en la presente significa un trastorno o condición médica que se desarrolla después del feto; al contrario que un trastorno congénito, que está presente al nacer. Un trastorno congénito puede ser un antecedente de un trastorno adquirido.
Los términos afección o enfermedad "congénita" o "heredada" es un trastorno genético que se encuentra en el genoma de un sujeto que está presente en un sujeto al nacer. El "genoma", como se usa en la presente, incluye todo el material genético en el núcleo y el citoplasma, e incluye además el genoma mitocondrial y el genoma ribosómico. La congénita o hereditaria puede manifestarse en cualquier momento durante la vida del sujeto, por ejemplo al nacer o en la edad adulta.
El término "trastorno genético" o "enfermedad genética" incluye mutaciones heredadas o adquiridas en el genoma de un sujeto que provoca o puede provocar una enfermedad.
Los términos "polimorfismos" o "variaciones genéticas" significan diferentes formas de un gen en un locus genético.
Un "vector viral" se define como un virus o partícula viral producido recombinantemente que comprende un polinucleótido que se va a administrar a una célula huésped, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores virales del herpes simple y vectores virales quiméricos y similares. En algunas realizaciones en las que la transferencia de genes está mediada por un vector retroviral, un constructo de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma retroviral o parte del mismo.
Algunas realizaciones de la divulgación se refieren a sistemas de vectores que comprenden uno o más vectores, o vectores como tales. Los vectores pueden diseñarse para la expresión de transcritos de CRISPR (por ejemplo, transcritos de ácidos nucleicos, proteínas o enzimas) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los transcritos de CRISPR pueden expresarse en células bacterianas como Escherichia coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero.
Las células pueden ser células primarias, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre embrionarias (hESC), células madre adultas, células progenitoras o líneas celulares. Las "células primarias" son células tomadas directamente de tejido vivo y colocadas in vitro para su crecimiento. Las células primarias tienen pocas duplicaciones de población y tienen una esperanza de vida finita para duplicaciones de población in vitro. Las "células madre" y las "células madre pluripotentes inducidas" son células no especializadas e indiferenciadas capaces de autorrenovarse y que tienen el potencial de diferenciarse en células de diferentes tipos con funciones especializadas. Las "líneas celulares" incluyen cultivos celulares que se derivan de un tipo de célula o un conjunto de células del mismo tipo que pueden proliferar indefinidamente. Los ejemplos no limitativos de líneas celulares de mamíferos pueden incluir células CD34, células 293, células HEK, células CHO, células BHK, células CV-1, células Jurkat, células HeLa, o cualquier variante de las mismas.
En algunas realizaciones, un vector es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 y pMT2PC. Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus de simio 40 y otros divulgados en la presente y conocidos en la técnica. Otros promotores pueden incluir, por ejemplo, el promotor EF1 o el promotor alfa EF1. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticas ver, por ejemplo, los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Como se usa en la presente, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de fracciones de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen y pueden usarse varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan as, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc,111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Como se usa en la presente, "sustancialmente puro" significa que una especie en cuestión es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie en cuestión comprende por lo menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En algunas realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En algunas realizaciones, la especie en cuestión se purifica hasta la homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se detectan en la composición mediante métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
Sistema de edición del genoma
Pueden usarse varios tipos de sistemas de manipulación del genoma. Los términos "sistema de edición del genoma", "sistema de edición de genes" y similares, se usan indistintamente en la presente y se refieren a un sistema o tecnología que edita un gen objetivo o la función o la expresión del mismo. Un sistema de edición del genoma comprende: por lo menos un componente de endonucleasa que permite la escisión de una región o regiones genómicas objetivo (o secuencia o secuencias objetivo); y por lo menos un elemento de direccionamiento del genoma que lleva o dirige el componente de endonucleasa a una región o regiones genómicas objetivo. Los ejemplos de elementos de direccionamiento del genoma incluyen un dominio de unión a ADN (por ejemplo, proteína de unión a ADN con dedos de zinc o un dominio de unión a ADN TALE), elementos de ARN de guía (por ejemplo, ARN de guía de CRISPR) y elementos de ADN de guía (por ejemplo, ADN de guía NgAgo). Los elementos programables de endonucleasas y direccionamiento del genoma permiten la edición precisa del genoma introduciendo roturas de ADN, como roturas de cadena doble (DSB) en loci genómicos específicos. Posteriormente, las DSB reclutan maquinaria de reparación endógena para la unión final no homóloga (NHEj ) o la reparación dirigida por homología (HDR) en el sitio de DSB para mediar en la edición del genoma. El "componente de endonucleasa" comprende una endonucleasa o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dicha endonucleasa.
El término "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima de tipo salvaje, mutante, variante o manipulada capaz de catalizar la hidrólisis (escisión) de un enlace entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o a Rn . Las endonucleasas pueden reconocer y escindir una molécula de ADN o ARN en sus regiones genómicas objetivo. Los ejemplos de endonucleasas incluyen una endonucleasa dirigida; enzima de restricción como FokI; una nucleasa de dedos de zinc quimérica (ZFN) resultante de la fusión de dominios de dedos de zinc manipulados con el dominio catalítico de una enzima de restricción como FokI; enzimas Cas y enzimas Cpf. Las endonucleasas químicas en las que un escisor químico o peptídico se conjuga o con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia objetivo específica, dirigiendo de este modo la actividad de escisión a una secuencia específica, están comprendidas en el término "endonucleasa". Los ejemplos de endonucleasas químicas incluyen nucleasas sintéticas como conjugados de ortopenantrolina, una molécula de escisión de ADN, y oligonucleótidos que forman tripletes (TFO).
Por "variante" se entiende una proteína recombinante obtenida mediante el reemplazo de por lo menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la proteína original con un aminoácido diferente.
En algunas realizaciones, las endonucleasas como ZFN, TALEN y/o meganucleasas comprenden un dominio de escisión y/o un semidominio de escisión. El dominio de escisión puede ser homólogo o heterólogo al dominio de unión al ADN. Por ejemplo, pueden usarse un dominio de unión a ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa o un dominio de unión a ADN de meganucleasa y un dominio de escisión de una nucleasa diferente. Los dominios de escisión heterólogos pueden obtenerse a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas ejemplares de las que puede derivarse un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y endonucleasas dirigidas. Ver, por ejemplo, la WO2013/130824. Se conocen enzimas adicionales que escinden el ADN (por ejemplo, nucleasa S1; nucleasa de judía mungo; DNasa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura; ver también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Pueden usarse una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.
Un semidominio de escisión puede derivarse de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se ha expuesto anteriormente, que requiere dimerización para la actividad de escisión. En algunas realizaciones, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. En algunas realizaciones, puede usarse una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. En algunas realizaciones, los dos semidominios de escisión pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma). En algunas realizaciones, cada semidominio de escisión puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios objetivo para las dos proteínas de fusión están preferiblemente dispuestos, uno con respecto al otro, de tal manera que la unión de las dos proteínas de fusión con sus respectivos sitios objetivo coloque los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permita que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, por ejemplo, mediante dimerización. Por tanto, en ciertas realizaciones, los bordes cercanos de los sitios objetivo están separados por 5-50 nucleótidos, 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Se observa que cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios objetivo (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En algunas realizaciones, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios objetivo.
Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse al ADN de manera específica de la secuencia (en un sitio de reconocimiento,) y escindir el ADN cerca o en el sitio de unión. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, tipo IIS) escinden el ADN en sitios eliminados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima tipo IIS Fok I cataliza la escisión de cadena doble del ADN. Ver, por ejemplo, las Patente de Estados Unidos N° 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982.
En algunas realizaciones, el componente de endonucleasa comprende una proteína o proteínas de fusión que incluyen un dominio de escisión (o semidominio de escisión) de por lo menos una enzima de restricción de Tipo llS y uno o más dominios de unión a dedos de zinc, que pueden estar manipulados o no. Una enzima de restricción de Tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. La porción de la enzima Fok I usada en tales proteínas de fusión se considera un semidominio de escisión. Por tanto, para la escisión dirigida de cadena doble y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones de dedos de zinc o TALE-Fok I, pueden usarse dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un semidominio de escisión FokI, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también puede usarse una única molécula polipeptídica que contiene un dominio de unión de dedos de zinc y dos semidominios de escisión Fok
Las enzimas de restricción de tipo IIS ejemplares se describen en la Publicación Internacional WO 07/014275. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos se contemplan en la divulgación. Ver, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
En ciertas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión manipulados (también denominados mutantes de dominio de dimerización) que minimizan o evitan la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 20050064474 y 20060188987 y en la w O 2013/130824. Los semidominios de escisión manipulados ejemplares de Fok I que forman heterodímeros obligados incluyen un par en el que un primer semidominio de escisión incluye mutaciones en los residuos de aminoácidos en las posiciones 490 y 538 de Fok I y un segundo semidominio de escisión incluye mutaciones en el aminoácido residuos 486 y 499. Ver, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2008/0131962 y 2011/0201055. Los semidominios de escisión manipulados descritos en la presente pueden prepararse usando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio de semidominios de escisión de tipo salvaje (Fok I) como se describe en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 20050064474 y 20080131962.
El término "editar", "edita", "que edita" y similares se refieren a cualquier tipo de manipulación, alteración, modificación o modulación (en cada caso incluye, pero no se limita a, por medio de la desactivación de genes, el etiquetado de genes, la interrupción de genes, la mutación de genes, la inserción de genes, la deleción de genes, la activación de genes, el silenciamiento de genes o la activación de genes).
Como se usa en la presente, "modificación genética", "edición del genoma", "modificación del genoma", "modificación de genes" y "edición de genes" se refieren a cualquier adición, deleción, deactivación, activación, etiquetado, mutación, activación, silenciamiento, modificación y/o alteración de los nucleótidos de una célula. La célula en este contexto puede ser in vitro, in vivo o ex vivo.
Por "región genómica objetivo", "gen objetivo", "objetivo de ADN", "secuencia objetivo de ADN", "secuencia objetivo", "secuencia de nucleótidos objetivo", "sitio objetivo", "objetivo", "sitio de interés", "sitio de reconocimiento", "sitio de reconocimiento de polinucleótidos", "secuencia de reconocimiento", "sitio de escisión" se entiende una secuencia de polinucleótidos que es reconocida y escindida por un sistema de edición del genoma. Estos términos se refieren a una localización distinta del ADN, preferiblemente una localización genómica, en la que el sistema de edición del genoma va a inducir una rotura (escisión) del ADN.
La edición mencionada anteriormente, incluyendo la manipulación, la alteración, la modificación y la modulación, puede producirse simultánea o secuencialmente. Puede usarse cualquier sistema de edición del genoma conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema basado en nucleasas basado en efectores del tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo.
Los basados en meganucleasas, basados en ZFN y basados en TALEN comprenden cada uno por lo menos un dominio de unión al ADN o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifica el dominio de unión al ADN, y logran el direccionamiento o el reconocimiento específicos de una región o regiones genómicas objetivo a través de interacciones proteína-ADN. Un sistema basado en CRISPR comprende por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican el elemento de ARN guía, y logra el direccionamiento o el reconocimiento específicos de una región o regiones genómicas objetivo a través de pares de bases directamente con el ADN de la región o regiones genómicas objetivo. Un sistema basado en NgAgo comprende por lo menos un elemento de ADN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican el elemento de ADN guía, y logra el direccionamiento o reconocimiento específicos de una región o regiones genómicas objetivo a través de pares de bases directamente con el ADN de la región o regiones genómicas objetivo.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasas. Un sistema basado en meganucleasas emplea meganucleasas, que son endonucleasas con sitios de reconocimiento grandes (>14 pb), y sus dominios de unión al ADN también son responsables de la escisión de las secuencias objetivo. El dominio de unión al ADN de las meganucleasas puede tener una secuencia objetivo de ADN de cadena doble de 12 a 45 pb. En algunas realizaciones, la meganucleasa es o una enzima dimérica, en donde cada dominio de meganucleasa está en un monómero, o una enzima monomérica que comprende los dos dominios en un solo polipéptido. No solo se han generado meganucleasas de tipo salvaje sino también varias variantes de meganucleasas mediante manipulación de proteínas para cubrir una infinidad de combinaciones de secuencias únicas. En algunas realizaciones, También pueden usarse meganucleasas quiméricas con un sitio de reconocimiento compuesto por un medio-sitio de meganucleasa A y un medio-sitio de proteína B. Ejemplos específicos de tales meganucleasas quiméricas comprenden los dominios proteicos de I-Dmol e I-Crel. Los ejemplos de meganucleasas incluyen endonucleasas dirigidas de la familia LAGLIDADG.
La meganucleasa LAGLIDADG puede ser I-SceI, I-ChuI, I-CreI, I-CsmI, PI-SceI, PI-TliI, PI-MtuI, I-CeuI, I-SceII, I-SceIII, HO, PI-CivI, PI-CtrI, PI-AaeI, PI-BsuI, PI-DhaI, PI-DraI, PI-MavI, PI-MchI, PI-MfuI, PI-MflI, PI-MgaI, PI-MgoI, PIMinI, PI-MkaI, PI-MleI, PI-MmaI, PI-MshI, PI-MsmI, PI-MthI, PI-MtuI, PI-MxeI, PI-NpuI, PI-PfuI, PI-RmaI, PI-SpbI, PISspI, PI-FacI, PI-MjaI, PI-PhoI, PI-TagI, PI-ThyI, PI-TkoI, PI-TspI, o I-MsoI; o puede ser un mutante funcional o una variante de la misma, ya sea homodimérica, heterodimérica o monomérica. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG es un derivado de I-CreI. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG comparte por lo menos un 80% de similitud con la meganucleasa LAGLIDADG I-CreI natural. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG comparte por lo menos un 80% de similitud con los residuos 1-152 de la meganucleasa LAGLIDADG I-CreI natural. En algunas realizaciones, la meganucleasa LAGLIDADG puede consistir en dos monómeros que comparten por lo menos un 80% de similitud con los residuos 1-152 de la meganucleasa LAGLIDADG I-CreI natural enlazados entre sí, con o sin un péptido conector.
La "meganucleasa LAGLIDADG" se refiere a una endonucleasa dirigida de la familia LAGLIDADG, como se define en Stoddard et al (Stoddard, 2005), o una variante manipulada que comprende un polipéptido que comparte por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más de identidad o similitud con dicha endonucleasa dirigida natural. Tales meganucleasas LAGLIDADG manipuladas pueden derivarse de meganucleasas monoméricas o diméricas. Cuando se derivan de meganucleasas diméricas, tales meganucleasas LAGLIDADG manipuladas pueden ser endonucleasas de cadena sencilla o diméricas.
Por "I-CreI" se entiende la meganucleasa I-CreI de tipo salvaje natural que tiene la secuencia del código de registro de pdb 1g9y.
Las funciones de reconocimiento y escisión del ADN de las meganucleasas generalmente están entrelazadas en un único dominio. A diferencia de las meganucleasas, los dominios de unión al ADN de los sistemas basados en ZFN y los basados en TALEN son distintos de la endonucleasa para la función de escisión. El sistema basado en ZFN comprende: por lo menos una proteína con dedos de zinc o una variante de la misma, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína con dedos de zinc o una variante de la misma como su dominio de unión al ADN; y un elemento de endonucleasa, como nucleasa con dedos de zinc (ZFN) o dominio de escisión Fok1. La proteína con dedos de zinc (ZFP) no se produce de manera natural, ya que está manipulada para unirse a un sitio objetivo de elección. Ver, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.
20: 135-141 ; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct Biol. 10:411-416; Patentes de Estados Unidos N° 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
Un dominio de unión con dedos de zinc manipulado puede tener una especificidad de unión novedosa, en comparación con una proteína con dedos de zinc de origen natural. Los métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos con dedos de zinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos de triplete o cuadruplete está asociada con una o más secuencias de aminoácidos con dedos de zinc que se unen a la secuencia de triplete o cuadruplete particular. Ver, por ejemplo, las Patente de Estados Unidos de titularidad compartida N° 6.453.242 y 6.534.261.
Con los métodos de la presente pueden usarse varios tipos de métodos de selección. Los métodos de selección ejemplares, que incluyen la presentación en fagos y los sistemas de dos híbridos, se divulgan en las Patentes de Estados Unidos N° 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en las WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, se ha descrito la potenciación de la especificidad de unión para los dominios de unión a dedos de zinc, por ejemplo, en la WO 02/077227. Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios con dedos de zinc y/o las proteínas con dedos de zinc de múltiples dedos pueden enlazarse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver, también, las Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuada entre los dedos de zinc individuales de la proteína. La selección de sitios objetivo; las ZFP y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y los polinucleótidos que codifican las mismas) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen con detalle en las Patentes de Estados Unidos N° 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311 ; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.
Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios con dedos de zinc y/o las proteínas con dedos de zinc de múltiples dedos pueden enlazarse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver, también, las Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.
Un sistema de nucleasas basado en efectores de tipo activador de transcripción (TALEN) se refiere a un sistema de edición del genoma que emplea uno o más dominios de unión de ADN de efectores de tipo activador de transcripción (TALE) y un elemento de endonucleasas, como el dominio de escisión Fok1. El dominio de unión ADN-TALE comprende una o más unidades de repetición TALE, cada una de las cuales tiene 30-38 (como 31, 32, 33, 34, 35 o 36) aminoácidos de longitud. El dominio de unión a ADN-TALE puede emplear una proteína TALE de longitud completa o un fragmento de la misma, o una variante de la misma. El dominio de unión a ADN-TALE puede fusionarse o enlazarse al dominio de la endonucleasa mediante un conector.
Los términos "sistema basado en CRISPR", "sistema de edición de genes basado en CRISPR", "edición de genoma CRISPR", "edición de genes CRISPR", "edición de genoma basado en endonucleasa CRISPR" y similares se usan indistintamente en la presente, y se refieren colectivamente a un sistema de edición del genoma que comprende uno o más elementos de ARN guía; y uno o más elementos de endonucleasas guiadas por ARN. El elemento de ARN guía comprende un ARN direccionador que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador. El elemento de endonucleasa guiada por ARN comprende una endonucleasa que es guiada o llevada a una región o regiones genómicas objetivo por un elemento de ARN guía; o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dicha endonucleasa. Los ejemplos de tales sistemas de edición de genes basados en CRISPR incluyen el sistema basado en CRISPR que es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.
Como se usa en la presente, los términos "elemento de ARN guía", "ARN guía", "ARNg", "molécula de ARNg" y "ARN guía sintético" se usan indistintamente y se refieren a la secuencia de polinucleótidos que comprende un ARN direccionador que hibrida con una secuencia nucleica objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador. Un ARN direccionador de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos en una región genómica objetivo. La frase "sustancialmente complementario" significa un grado de complementariedad que es por lo menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 99% o 100% en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas.
Un elemento de ARN guía puede comprender además un ARN activador que es capaz de hibridar con el ARN direccionador, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador. El ARN activador y el ARN direccionador pueden estar separados o fusionados como un único ácido nucleico a través de una secuencia de giro de conector para formar una única molécula de ARNg. Una molécula de ARNg puede comprender una serie de dominios. Por ejemplo, dicho ARNg comprende, por ejemplo, de 5' a 3': un dominio de direccionamiento (que es complementario a un ácido nucleico objetivo); un primer dominio de complementariedad; un dominio de enlace; un segundo dominio de complementariedad (que es complementario al primer dominio de complementariedad); un dominio proximal; y opcionalmente, un dominio de cola. Ver la WO2015048557.
Un "primer dominio de complementariedad" tiene una complementariedad sustancial con el segundo dominio de complementariedad y puede formar una región duplicada en por lo menos algunas condiciones fisiológicas.
Un "dominio de enlace" sirve para enlazar el primer dominio de complementariedad con el segundo dominio de complementariedad de un ARNg unimolecular. El dominio de enlace puede enlazar el primer y el segundo dominios de complementariedad covalentemente o no covalentemente.
Un "dominio proximal" puede tener 3-25 nucleótidos de longitud o 5-20 nucleótidos de longitud. El dominio proximal puede compartir homología o derivarse de un dominio proximal de origen natural.
Un "dominio de cola" puede estar ausente o tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud. El dominio de cola puede incluir secuencias que son complementarias entre sí y que, en por lo menos en algunas condiciones fisiológicas, forman una región duplicada.
El elemento de ARN guía puede formar un complejo con una endonucleasa del elemento de endonucleasas guiadas por ARN, como la endonucleasa Cas ("complejo de ARNg/nucleasa"). Un ejemplo de complejo ARNg/nucleasa es un complejo CRISPR como se describe a continuación con respecto a un sistema basado en CRISPR. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una endonucleasa de un sistema de endonucleasas guiadas por ARN que forma un complejo con el ARN direccionador. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una endonucleasa de un sistema de endonucleasas guiadas por ARN que forma un complejo con el ARN direccionador y el ARN activador.
El dominio de direccionamiento del ARN direccionador promueve el direccionamiento u orientación específicos de un complejo de ARNg/nucleasa a una secuencia de nucleótidos objetivo. En algunas realizaciones, el dominio de direccionamiento puede tener 10-30 pb, como 15-25 pb, 18-22 pb o 20 pb.
Los métodos para diseñar ARNg son conocidos en la técnica, incluyendo los métodos para seleccionar, diseñar y validar el dominio objetivo. Ver, por ejemplo, WO2015048577, Mali et al., 2013 SCIENCE 339(6121): 823­ 826; Hsu et al., 2013 NATBIOTECHNOL, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 NATBTOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 NAT METHODS 11 (2): 122-3. doi: l 0.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 BIOTNFORMATICS PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 BIOINFORMATICS Pub Med PMID: 24389662.
En algunas realizaciones, pueden usarse endonucleasas guiadas por ARN, como una enzima o proteína Cas (por ejemplo, proteína Cas9 Tipo II) o una enzima o proteína Cpf (por ejemplo, proteína Cpfl). En algunas realizaciones, también puede usarse una versión modificada de tal enzima o proteína Cas o Cpf.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas. El sistema CRISPR-Cas comprende: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el elemento de ARN guía comprendiendo un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo, y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN objetivo; y (b) un elemento de proteína Cas que comprende una proteína Cas o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas. El ARN direccionador y los ARN activadores pueden separarse o fusionarse en un único ARN.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR incluye sistemas CRISPR de Clase 1 y/o CRISPR de Clase 2. Los sistemas de Clase 1 emplean varias proteínas Cas junto con un ARN CRISPR (ARNcr) como ARN direccionador para construir una endonucleasa funcional. Los sistemas CRISPR de Clase 2 emplean una única proteína Cas y un ARNcr como ARN direccionador. Los sistemas CRISPR de Clase 2, incluyendo el sistema basado en Cas9 tipo II, comprenden una única proteína Cas para mediar en la escisión en lugar del complejo de múltiples subunidades empleado por los sistemas de Clase 1. El sistema basado en CRISPR también incluye un sistema CRISPR de Clase II, Tipo V que emplea una proteína Cpfl y un ARNcr como ARN direccionador.
La proteína Cas es una nucleasa de cadena doble asociada a CRISPR (Cas). En algunas realizaciones, el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 es nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A. El término "proteína Cas", como proteína Cas9, incluye proteína Cas de tipo salvaje o derivados funcionales de la misma (como versiones truncadas o variantes de la proteína Cas de tipo salvaje con una actividad de nucleasas).
En algunas realizaciones, pueden usarse proteínas Cas9 de especies distintas de S. pyogenes y S. thermophiles. Las especies de proteína Cas9 adicionales que pueden obtenerse y usarse en la presente incluyen: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp.,cydiphilus denitrificans, Aminomonaspaucivorans, Bacillus cereus; Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus Puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfingens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium dolichum, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, gamma proteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemoplzilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicohacter cinaedi, Helicobacter mustelae, llyobacter polytropus, Kingella kingae, lactobacillus crispatus, listeria ivanovii, listeria monocytogenes, listeriaceae bacterium, Methylocystis sp.,Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutells, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., o Verminephrobacter eiseniae.
En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema basado en CRISPR se derivan de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III.
En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema basado en CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, como Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Prevotella sp., Acidaminococcussp., y Lachnospiraceae sp. En general, un sistema basado en CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en las regiones genómicas objetivo o en el sitio de una secuencia objetivo (también denominado protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la cual se diseña una secuencia guía para que tenga una complementariedad sustancial, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente la complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia objetivo se localiza en el núcleo o citoplasma de una célula o células. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo puede estar dentro de un orgánulo de una o más células eucariotas, por ejemplo, una mitocondria o un cloroplasto.
A una secuencia o plantilla que puede usarse para la recombinación en el locus objetivo que comprende las secuencias objetivo se hace referencia como "plantilla de edición" o "polinucleótido de edición" o "secuencia de edición". A un polinucleótido plantilla exógeno puede hacerse referencia como plantilla de edición o plantilla donante. En algunas realizaciones, puede usarse ADN de cadena sencilla y ADN de cadena doble de origen sintético o biológico. A modo de ejemplo no limitativo, las plantillas de edición adecuadas incluyen ODNmc, ODNdc, productos de PCR, plásmidos y virus que incluyen AAV, adenovirus, retrovirus, lentivirus, etc. También son posibles plantillas de edición adicionales. En algunas realizaciones, la recombinación es una recombinación homóloga.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas9. El ARN direccionador del sistema CRISPR-Cas9 comprende un ARN de direccionamiento de CRISPR (ARNcr) y el ARN activador del sistema CRISPR-Cas 9 comprende un ARN de CRISPR transactivador (ARNtrac). El elemento de proteína Cas del sistema CRISPR-Cas9 emplea una proteína Cas9. El ARNcr y el ARNtracr pueden separarse o combinarse en un único constructo de ARN a través de una secuencia de giro conector. Este constructo de ARN combinado se denomina ARN de guía única (ARNsg; o ARN guía).
Con respecto a la información general sobre los sistemas CRISPR-Cas, los componentes de los mismos y la administración de tales componentes, incluyendo los métodos, materiales, vehículos de administración, vectores, partículas, AAV, y la elaboración y el uso de los mismos, incluyendo las cantidades y formulaciones, puede encontrarse en: las Patentes de Estados Unidos N° 8,999,641, 8,993,233, 8,945,839, 8,932,814, 8,906,616, 8,895,308, 8,889,418, 8,889,356, 8,871,445, 8,865,406, 8,795,965, 8,771,945 y 8,697,359; las Publicaciones de Patente de Estados Unidos US 2014-0310830, US 2014-0287938 A1, US 2014-0273234 A1, US2014-0273232 A1, US 2014-0273231, US 2014-0256046 A1, US 2014-0248702 A1, US 2014-0242700 A1, US 2014-0242699 A1, US 2014-0242664 A1, US 2014-0234972 A1, US 2014-0227787 A1, US 2014-0189896 A1, US 2014-0186958, US 2014­ 0186919 A1, US 2014-0186843 A1, US 2014-0179770 A1 y US 2014-0179006 A1, US 2014-0170753; las Patentes Europeas EP 2784 162 B1 y EP 2771468 B1; las Solicitudes de Patente Europea EP 2771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6), y EP 2 784 162 (EP14170383.5); y las Publicaciones de Patente de PCT WO 2014/093661, WO 2014/093694, WO 2014/093595, WO 2014/093718, WO 2014/093709, WO 2014/093622, WO 2014/093635, WO 2014/093655, WO 2014/093712, WO2014/093701, WO2014/018423, WO 2014/204723, WO 2014/204724, WO 2014/204725, WO 2014/204726, WO 2014/204727, WO 2014/204728, WO 2014/204729, y WO2016/028682.
En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf. El "sistema CRISPR-Cpf" comprende: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el ARN guía comprendiendo un ARN direccionador que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a un secuencia de nucleótidos en un locus del ácido nucleico objetivo; y (b) un elemento de proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de proteína Cpf.
Un ejemplo de un elemento de proteína Cpf incluye nucleasas Cpfl, como Francisella Cpfl (FnCpfl) y cualquier variante de la misma. Ver, por ejemplo, Zetsche et al., "Cpfl es una endonucleasa guiada por ARN individual de un sistema CRISPR-Cas de clase 2", Cell, 163(3): páginas 759-71; y Fonfara et al., "La enzima de escisión de ADN asociada a CRISPR Cpfl también procesa el Ar N de CRISPR precursor", Nature 532 (7600): páginas, 517-21. El PAM preferido de Cpf1 es 5'-TTN, que difiere del de Cas9 (3'-NGG) tanto en la localización genómica como en el contenido de GC. El sistema CRISPR-Cpf puede que no emplee un ARN activador (ARNtracr). Tanto Cpfl como sus ARN guía son, en general, más pequeños que sus homólogos de SpCas9. El locus de Cpfl contiene un dominio mixto alfa/beta, un RuvC-I seguido de una región helicoidal, un RuvC-II y un dominio tipo dedos de zinc. La proteína de Cpfl tiene un dominio de endonucleasas similar a RuvC que es similar al dominio RuvC de Cas9. Además, Cpfl no tiene un dominio de endonucleasa de HNH, y el extremo N-terminal de Cpfl no tiene el lóbulo de reconocimiento alfa-helicoidal de Cas9. Los loci de Cpfl codifican proteínas Cas1, Cas2 y Cas4 más similares a los tipos I y III que a los sistemas de tipo II. Las proteínas de la familia de Cpfl pueden encontrarse en muchas especies bacterianas.
Sin querer estar limitados por ninguna teoría particular, el sistema CRISPR-Cpf emplea un complejo Cpfl-ARNcr que escinde el ADN o el ARN objetivo mediante la identificación de un motivo adyacente protoespaciador 5'-YTN-3 (donde "Y" es una pirimidina y "N" es cualquier nucleobase) o 5'-TTN-3 en contraste con el PAM rico en G dirigido por Cas9. Después de la identificación de PAM, Cpfl introduce una rotura de cadena doble de ADN similar a un extremo pegajoso de 4 o 5 nucleótidos salientes.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en NgAgo. El sistema basado en NgAgo comprende por lo menos un elemento de ADN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican el elemento de ADN guía; y una endonucleasa guiada por ADN. El sistema basado en NgAgo emplea el ADN como elemento guía. Su principio de funcionamiento es similar al de la tecnología CRISPR-Cas9, pero su elemento guía es un segmento de ADN guía (ADNd) en lugar de ARNg en la tecnología CRISPR-Cas9. Un ejemplo de endonucleasa guiada por ADN es una endonucleasa Argonauta (NgAgo) de Natronobacterium gregoryi. Ver, por ejemplo, Feng Gao et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute", Nature Biotechnology, (2016): doi: 10.1038/nbt.3547.
Por "conector", "conector de péptidos", "conector peptídico" o "espaciador peptídico" se entiende una secuencia peptídica que permite la conexión de diferentes monómeros en una proteína de fusión y la adopción de la conformación correcta para dicha actividad de proteína de fusión y que no altera la actividad de ninguno de los monómeros. Los conectores peptídicos pueden tener varios tamaños de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 a 50 aminoácidos como un intervalo indicativo no limitativo o cualquier valor intermedio dentro de este intervalo.
-En algunas realizaciones, se emplea un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I):
Figure imgf000024_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal de la misma.
m yn son independientemente 1 o 2.
X es O o NR; donde R es H o alquilo C1-C4. R también puede ser 2H (D o deuterio). Como se usa en la presente, el término "deuterio", "2H" y "D" se usan indistintamente
R1 es alquilo C1-C4.
R2 es
un anillo aromático o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o dos heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S, en donde el anillo aromático o heteroaromático puede estar sustituido con 0, 1 o 2 sustituyentes R3 independientemente seleccionados del grupo formado por CN, halo, NO2, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4 y C(=O)NHRr en donde R 1 es alquilo C1-C4; o en donde dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo aromático o heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
Alternativamente, R2 puede ser COOR4 en donde R4 es alquilo C1-C4 o bencilo. El anillo A se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000024_0002
En realizaciones, R1 es metilo.
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000025_0003
en donde # indica que R2 está conectado al resto del compuesto de fórmula (I); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2.
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000025_0001
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000025_0002
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, R1 es metilo, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en
CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en d C1-C2.
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la Fórmula Estructural (I).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de la Fórmula Estructural (I).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de la Fórmula Estructural (I) y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (I) es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (I) es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye un compuesto de Fórmula Estructural (I) y un CCF en una proporción que es (un compuesto de Fórmula Estructural (I))p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. Fórmula (I))p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, el compuesto de fórmula (II) está representado por la Fórmula Estructural (II),
Figure imgf000026_0001
o se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.
En realizaciones, R1 es metilo.
En realizaciones, Y es O o NR; en donde R es H o alquilo C1-C4
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000026_0002
o
Figure imgf000027_0001
en donde # indica que R2 está conectado al resto del compuesto de fórmula (II); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, y R2 es:
Figure imgf000027_0002
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, y R2 es:
Figure imgf000027_0003
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, R1 es metilo, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo. En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C2.
En realizaciones, el anillo A se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000027_0004
En realizaciones adicionales, el Anillo A es
Figure imgf000027_0005
En algunas realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000028_0001
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000028_0002
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000028_0003
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (II).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II) y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (II) es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y un compuesto de Fórmula Estructural (II) es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II) y un CCF en una proporción que es (un compuesto de Fórmula Estructural (II))p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.. En realizaciones, un CCF es ácido adípico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (II'),
Figure imgf000028_0004
, o se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.
En realizaciones, R1 es metilo.
En realizaciones, Y es O o NR; en donde R es H o alquilo C1-C4
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000029_0002
en donde # indica que R2 está conectado al resto del compuesto de fórmula (II'); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, y R2 es:
Figure imgf000029_0001
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, R1 es metilo, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en
CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en dond C1-C2.
En realizaciones, el anillo A se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000030_0001
En realizaciones adicionales, el Anillo A es
Figure imgf000030_0002
En algunas realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000030_0003
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000030_0004
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000030_0005
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II').
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II') y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y un Compuesto II' es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y un Compuesto II' es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye el Compuesto II' y un CCF en una proporción que es (Compuesto II')p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. En las realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (II''),
Figure imgf000031_0001
En realizaciones, R1 es metilo.
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000031_0003
en donde # indica donde está conectado R2 al resto del compuesto de fórmula (II”); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, y R2 es:
Figure imgf000031_0002
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, y R2 es:
Figure imgf000032_0001
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, R1 es metilo, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C2.
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, el anillo A se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000032_0002
En realizaciones adicionales, el Anillo A es
Figure imgf000032_0003
En algunas realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000032_0004
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000032_0005
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000032_0006
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II”).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II”) y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto II" es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto II" es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye el Compuesto II” y un CCF en una proporción que es (un compuesto de Fórmula Estructural II”)p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (II'"),
Figure imgf000033_0001
o se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.
En realizaciones, R1 es metilo.
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000033_0002
en donde # indica donde está conectado R2 al resto del compuesto de fórmula (II”); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2.
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, y R2 es:
Figure imgf000034_0001
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, y R2 es:
Figure imgf000034_0002
En realizaciones, cada uno de m y n es 2, R1 es metilo, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en
CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en donde C1-C2.
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, el anillo A se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000034_0003
En algunas realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000034_0004
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000035_0001
En realizaciones, el Anillo A es
Figure imgf000035_0002
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (Nm).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II'").
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (II'") y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto II''' es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto II''' es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye el Compuesto II''' y un CCF en una proporción que es (Compuesto II'')p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (III),
Figure imgf000035_0003
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000035_0004
o
Figure imgf000036_0001
en donde # indica donde está conectado R2 al resto del compuesto de fórmula (III); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, Y es un enlace, X es O y R2 es:
Figure imgf000036_0002
En realizaciones, Y es un enlace, X es O, y R2 es:
Figure imgf000036_0003
En realizaciones, Y es NH, X es O, y R2 es:
Figure imgf000036_0004
En realizaciones, Y es NH, X es O, y R2 es:
Figure imgf000036_0005
En realizaciones, Y es un enlace, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, Y es NH, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C2.
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (III).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (III).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (III) y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto III es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto III es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye el Compuesto III y un CCF en una proporción que es (Compuesto III)p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (III'),
Figure imgf000037_0001
o se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.
En realizaciones, R2 es:
Figure imgf000037_0002
o
Figure imgf000038_0001
en donde # indica donde está conectado R2 al resto del compuesto de fórmula (II'); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, Y es un enlace, X es O y R2 es:
Figure imgf000038_0002
En realizaciones, Y es un enlace, X es O, y R2 es:
Figure imgf000038_0003
En realizaciones, Y es NH, X es O, y R2 es:
Figure imgf000038_0004
En realizaciones, Y es NH, X es O, y R2 es:
Figure imgf000038_0005
En realizaciones, Y es un enlace, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, Y es NH, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C2.
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (III').
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (III').
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (III') y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto III' es de aproximadamente 2:1. En realizaciones, la proporción entre un formador de cocristales (CCF) y el Compuesto III' es de aproximadamente 1:2. En realizaciones, un cocristal incluye el Compuesto III' y un CCF en una proporción que es (Compuesto III')p:(CCF)q. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 2,1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,1. En realizaciones, p es aproximadamente 2 y q es aproximadamente 1. En realizaciones, p es aproximadamente 1 y q es aproximadamente 2. En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (III''),
Figure imgf000039_0001
o se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.
En realizaciones, R2 es:
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o
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en donde # indica donde está conectado R2 al resto del compuesto de fórmula (II'); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, Y es un enlace, X es O y R2 es:
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En realizaciones, Y es un enlace, X es O, y R2 es:
Figure imgf000040_0003
En realizaciones, Y es NH, X es O, y R2 es:
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En realizaciones, Y es NH, X es O, y R2 es:
Figure imgf000040_0005
En realizaciones, Y es un enlace, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, Y es NH, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C2.
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (NI").
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (III").
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (III") y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (III"),
Figure imgf000041_0001
en donde # indica donde está conectado R2 al resto del compuesto de fórmula (II'); y o es 0, 1 o 2.
En realizaciones, Y es un enlace, X es O y R2 es:
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En realizaciones, Y es un enlace, X es O, y R2 es:
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En realizaciones, Y es un enlace, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, Y es NH, X es O, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4 o bencilo.
En realizaciones, o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C2.
En realizaciones, dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo heteroaromático pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula Estructural (NI'").
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (NI'").
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto de Fórmula Estructural (IM'") y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, el compuesto de fórmula (I) se selecciona de los compuestos N°. 1-37 en la Tabla 1 (supra), o se emplea una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo.
En realizaciones, se emplea una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los compuestos N° 1­ 37.
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye cualquiera de los compuestos N° 1-37.
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye cualquiera de los compuestos N° 1-37 y un formador de cocristales (CCF). En realizaciones, un CCF es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico. En realizaciones, un CCF es ácido adípico.
En algunas realizaciones, el compuesto es un compuesto seleccionado de
Tabla 1, o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo
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(continuación)
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continuación
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(continuación)
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Como se describe en la presente, los compuestos divulgados en la presente pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, como los que se han ilustrado de manera general con anterioridad, o como se ejemplifica por clases, subclases y especies particulares. Se apreciará que la frase "opcionalmente sustituido" se usa indistintamente con la frase "sustituido o no sustituido". En general, el término "sustituido", ya sea precedido por el término "opcionalmente" o no, se refiere al reemplazo de uno o más radicales de hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente especificado. A menos que se indique lo contrario, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo. Cuando más de una posición en una estructura dada puede sustituirse con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser o el mismo o diferente en cada posición.
Cuando sea químicamente posible o químicamente estable, un grupo molecular descrito en la presente está no sustituido o sustituido (es decir, "opcionalmente sustituido"). Como se describe en la presente, cuando el término "opcionalmente sustituido" precede a una lista, dicho término se refiere a todos los grupos sustituibles posteriores en esa lista. Por ejemplo, si el grupo X es "halógeno; alquilo o fenilo opcionalmente sustituido;" entonces X puede ser o alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido. De igual manera, si el término "opcionalmente sustituido" sigue a una lista, dicho término también se refiere a todos los grupos sustituibles de la lista anterior a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo: si X es halógeno, alquilo C1-4 o fenilo, en donde X está opcionalmente sustituido por JX, entonces tanto el alquilo C-m como el fenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por JX. Como es evidente para los expertos en la técnica, los grupos como H, halógeno, NO2, CN, NH2, OH u OCF3 no se incluirían porque no son grupos sustituibles. Como también es evidente para los expertos en la técnica, un anillo heteroarilo o heterocíclico que contiene un grupo NH puede sustituirse opcionalmente reemplazando el átomo de hidrógeno con el sustituyente.
En realizaciones, un grupo (por ejemplo, un alquilo C1-4; cicloalquilo C3-5; un heterociclilo como oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo; un arilo como fenilo o un heteroarilo) no está sustituido.
En realizaciones, un grupo (por ejemplo, un alquilo C1-4; cicloalquilo C3-5; un heterociclilo como oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o morfolinilo; un arilo como fenilo o un heteroarilo) está sustituido. En realizaciones, un grupo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituyentes según lo permitan la valencia y la estabilidad química.
Las combinaciones de sustituyentes previstas en esta divulgación son preferiblemente aquellas que dan como resultado la formación de compuestos estables o químicamente viables. El término "estable", como se usa en la presente, se refiere a compuestos que no se alteran sustancialmente cuando se someten a condiciones que permiten su producción, detección y, preferiblemente, su recuperación, purificación y uso para uno o más de los propósitos divulgados en la presente. En realizaciones, un compuesto estable o un compuesto químicamente viable es uno que no se altera sustancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 40° C o menos, en ausencia de humedad u otras condiciones químicamente reactivas, durante por lo menos una semana.
El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x+/-10%.
El término "alquilo" o "grupo alquilo", como se usa en la presente, significa una cadena hidrocarbonada de cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, sustituida o no sustituida que está completamente saturada. A menos que se especifique lo contrario, los grupos alquilo tienen de 1 a 8 átomos de carbono (representados como "alquilo C1-8"). En realizaciones, los grupos alquilo tienen de 1 a 4 átomos de carbono (representados como "alquilo C-m "). En realizaciones, una entidad molecular descrita como "alquilo C0-4" incluye un enlace covalente (por ejemplo, un "alquilo C0") o una cadena de alquilo C1-4 como se describe en la presente. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo.
El término "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalquilo" o "heterocíclico", como se usa en la presente, se refiere a un sistema de anillos monocíclico, bicíclico o tricíclico en el que por lo menos un anillo del sistema contiene uno o más heteroátomos, que es el igual o diferente, y que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de instauración, pero que no es aromático, y que tiene un único punto de unión con el resto de la molécula. En algunas realizaciones, el grupo "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalquilo" o "heterocíclico" tiene de tres a catorce miembros del anillo en los que uno o más miembros del anillo es un heteroátomo seleccionado independientemente de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo, y cada anillo en el sistema contiene de 3 a 8 miembros de anillo. Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes monociclos: 2-tetrahidrofuranilo, 3-tetrahidrofuranilo, 2-tetrahidrotiofenilo, 3-tetrahidrotiofenilo, 2-morfolino, 3-morfolino, 4-morfolino, 2-tiomorfolino, 3-tiomorfolino, 4-tiomorfolino, 1 -pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo, 3-pirrolidinilo, 1 -tetrahidropiperazinilo, 2-tetrahidropiperazinilo, 3-tetrahidropiperazinilo, 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 1 -pirazolinilo, 3-pirazolinilo, 4-pirazolinilo, 5-pirazolinilo, 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-piperidinilo, 2-tiazolidinilo, 3-tiazolidinilo, 4-tiazolidinilo, 1 -imidazolidinilo, 2-imidazolidinilo, 4-imidazolidinilo, 5-imidazolidinilo; y los siguientes biciclos: 3-IH-bencimidazol-2-ona, 3-(I-alquil)-bencimidazol-2-ona, indolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, benzotiolano, benzoditiano y 1,3-dihidro-imidazol-2-ona.
El término "heteroátomo", como se usa en la presente, significa uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo, incluyendo cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre o fósforo; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico; o un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido).
El término "insaturado", como se usa en la presente, significa que una fracción tiene una o más unidades de instauración.
El término "alcoxi" o "tioalquilo", como se usa en la presente, se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, unido a la cadena de carbono principal a través de un átomo de oxígeno ("alcoxi") o azufre ("tioalquilo").
Los términos "haloalquilo", "haloalquenilo" y "haloalcoxi", como se usan en la presente, significan alquilo, alquenilo o alcoxi, según sea el caso, sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "halógeno" significa F, Cl, Bro I.
El término "arilo", como se usa en la presente, solo o como parte de una fracción más grande como en "aralquilo", "aralcoxi" o "ariloxialquilo", se refiere a un sistema de anillo carbocíclico monocíclico, bicíclico o tricíclico que tiene un total de seis a catorce miembros de anillo, en donde dicho sistema de anillo tiene un único punto de unión con el resto de la molécula, por lo menos un anillo en el sistema es aromático y en donde cada anillo en el sistema contiene de 4 a 7 miembros de anillo. El término "arilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo de arilo". Los ejemplos de anillos de arilo incluyen fenilo, naftilo y antraceno.
Como se usa en la presente, el término "heteroarilo", usado solo o como parte de una fracción más grande como en "heteroaralquilo" o "heteroarilalcoxi", se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico y tricíclico que tiene un total de cinco a catorce miembros en el anillo, en donde dicho sistema de anillo tiene un único punto de unión con el resto de la molécula, por lo menos un anillo en el sistema es aromático, por lo menos un anillo en el sistema contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo, y en donde cada anillo del sistema contiene de 4 a 7 miembros de anillo. El término "heteroarilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo de heteroarilo" o el término "heteroaromático". Ejemplos adicionales de anillos de heteroarilo incluyen los siguientes monociclos: 2 furanilo, 3-furanilo, N-imidazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, 5-imidazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo, N-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, piridazinilo (por ejemplo, 3-piridazinilo), 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, tetrazolilo (por ejemplo, 5-tetrazolilo), triazolilo (por ejemplo, 2-triazolilo y 5-triazolilo), 2-tienilo, 3-tienilo, pirazolilo (por ejemplo, 2-pirazolilo), isotiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,3-triazolilo , 1,2,3-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, pirazinilo, 1,3,5-triazinilo y los siguientes biciclos: bencimidazolilo, benzofurilo, benzotiofenilo, indolilo (por ejemplo, 2-indolilo), purinilo, quinolinilo (por ejemplo, 2-quinolinilo, 3-quinolinilo, 4-quinolinilo) e isoquinolinilo (por ejemplo, 1 -isoquinolinilo, 3-isoquinolinilo o 4-isoquinolinilo).
A menos que se represente o indique lo contrario, las estructuras enumeradas en la presente pueden incluir todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas, diastereoisómeras y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, los isómeros de doble enlace (Z) y (E) y los isómeros conformacionales (Z) y (E). Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos individuales así como las mezclas enantioméricas, diastereoisómeras y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del alcance de esta divulgación. Los compuestos que se han dibujado con centros estereoquímicos definidos, habitualmente mediante el uso de un enlace rayado o en negrita, son estereoquímicamente puros, pero con la estereoquímica absoluta aún sin definir. Tales compuestos pueden tener la configuración R o S. En aquellos casos en que se ha determinado la configuración absoluta, el centro o centros quirales están marcados con (R) o (S) en el dibujo.
A menos que se indique lo contrario, todas las formas tautoméricas de los compuestos divulgados en la presente están dentro del alcance de dicha divulgación. Además, a menos que se indique lo contrario, también se pretende que las estructuras representadas en la presente incluyan compuestos que difieren solo en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto por el reemplazo de hidrógeno por deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por un carbono enriquecido con 13C o 14C están dentro del alcance de esta divulgación. Tales compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, sondas en ensayos biológicos o como inhibidores de ADN-PK con un perfil terapéutico mejorado.
Sales farmacéuticamente aceptables
También se apreciará que ciertos compuestos divulgados en la presente pueden existir en forma libre o, cuando sea apropiado, como un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. Un derivado farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, profármacos, sales, ésteres, sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables o cualquier otro aducto o derivado que, tras su administración a un paciente con necesidad del mismo, sea capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto como se describe de otro modo en la presente, o un metabolito o residuo del mismo.
Como se usa en la presente, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas.
Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Berge et al. describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, 1977. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos divulgados en la presente incluyen las derivadas de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácidos no tóxicas farmacéuticamente aceptables son las sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Otras sales ejemplares más incluyen adipato, benzoato, citrato, fumarato, maleato o succinato. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo C-m ^.
En esta divulgación también se incluye la cuaternización de cualquier grupo básico que contenga nitrógeno de los compuestos divulgados en la presente. Mediante tal cuaternización pueden obtenerse productos solubles o dispersables en agua o en aceite. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato C1-8 y sulfonato de arilo.
Cocristales
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto como se describe en la presente (por ejemplo, un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II"), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III") o Fórmula (III'")) y un formador de cocristales (CCF).
En realizaciones, un compuesto representado por Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III''), o Fórmula (III''), y un CCF están ambos en estado sólido (por ejemplo, cristalino). En realizaciones, un compuesto representado por Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III''), o Fórmula (III'''), y un CCF están unidos de manera no covalente (por ejemplo, mediante enlaces de hidrógeno).
En realizaciones, un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II"), Fórmula (II"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'') y un CCF (por ejemplo, ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico) es un sólido a temperatura ambiente. En realizaciones, un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'") y un CCF (por ejemplo, ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico) interactúan mediante enlaces no covalentes. En realizaciones, una interacción de enlace no covalente entre un compuesto representado por Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'') y un CCF (por ejemplo, ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico) incluye enlaces de hidrógeno y/o interacciones de van der Waals.
En realizaciones, un formador de cocristales (CCF) es ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.
En realizaciones, un cocristal es un cocristal que se describe en la Publicación Internacional N° WO 2015/058067.
En realizaciones, un cocristal incluye (5)-N-metil-8-(1-((2'-metil-[4,5'-bipirimidin]-6-il)amino)propan-2-il)quinolina-4-carboxamida. En realizaciones, el compuesto es el enantiómero (+). En realizaciones, el compuesto es el enantiómero (-).
En realizaciones, un cocristal incluye (5)-N-metil-8-(1-((2'-metil-4 6'-dideutero-[4,5'-bipirimidin]-6-il)amino)propan-2-il)quinolina-4-carboxamida. En realizaciones, el compuesto es el enantiómero (+). En realizaciones, el compuesto es el enantiómero (-).
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) y ácido cítrico como CCF.
En realizaciones, la invención presenta un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) y ácido fumárico como CCF.
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) y ácido maleico como CCF.
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) y ácido succínico como CCF.
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) y ácido benzoico como CCF.
En realizaciones, se emplea un cocristal que incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) y ácido adípico como CCF.
En algunas realizaciones, se emplea un cocristal en donde dicho cocristal incluye un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) y un CCF descrito anteriormente en forma aislada, pura o en una mezcla como una composición sólida cuando se mezcla con otros materiales, por ejemplo, la forma libre de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) o CCF libre.
En algunas realizaciones, se emplean composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37), un primer CCF (por ejemplo, como se describe en la presente), y uno o más CCF libres adicionales, que pueden ser iguales o diferentes del primer CCF. En algunas realizaciones, una composición incluye un cocristal de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37), un primer CCF que es ácido adípico y ácido adípico adicional. En algunas realizaciones, la relación molar general de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (IIP) (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) con el CCF (por ejemplo, CCF total que incluye tanto un primer CCF (por ejemplo, como se describe en la presente y uno o más CCF libres adicionales) en tales composiciones varía de aproximadamente 1:0,55 a aproximadamente 1:100. En algunas realizaciones, la relación molar general de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) con el CCF en tales composiciones varía de aproximadamente 1:0,55 a aproximadamente 1:50. En algunas realizaciones, la relación molar general de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III''') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) con el CCF en tales composiciones varía de aproximadamente 1:0,55 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relación en peso general del compuesto de Fórmula I con CCF en dichas composiciones varía de aproximadamente el 85% en peso:15% en peso a aproximadamente el 60% en peso:40% en peso. En algunas realizaciones, la relación en peso general del compuesto de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) a CCF varía de aproximadamente el 70% en peso: 30% en peso a aproximadamente el 60% en peso: 40% en peso. En algunas realizaciones, la relación en peso general del compuesto de un compuesto representado por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'') (por ejemplo, cualquiera de los compuestos N° 1-37) a CCF es de aproximadamente el 65% en peso:35% en peso.
Inhibidores de ADN-PK para aumentar la eficiencia de la edición genómica
La eficiencia de la edición del genoma dirigida puede aumentarse administrando a una célula o células uno o más compuestos (por ejemplo, inhibidores de ADNPK) descritos en la presente y un sistema de edición del genoma. Los sistemas de edición del genoma adecuados para el uso incluyen, por ejemplo, un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores del tipo activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo. Los métodos, composiciones y kits de la divulgación proporcionan inhibidores de ADN-PK y/o un sistema de edición del genoma para aumentar la eficiencia de la edición del genoma. En algunas realizaciones, se aumenta la eficiencia de edición del genoma de HDR después de la administración a una célula o células de un inhibidor de ADNPK.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema de edición del genoma basado en CRISPR. El sistema de edición del genoma basado en CRISPR puede ser un sistema CRISPR-Cas o variantes del mismo. El sistema CRISPR-Cas puede usar cualquier endonucleasa Cas, como las endonucleasas Cas 9 y variantes de las mismas. Los ejemplos de endonucleasas Cas 9 incluyen endonucleasas Cas9 o variantes de las mismas, como nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o CasDIOA. La endonucleasa Cas puede ser de tipo salvaje, manipulada o un mutante de nickasa, o cualquier variación de las mismas.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye una secuencia CRISPR, una secuencia cr de activación de trans (tracr), una secuencia guía y una endonucleasa Cas o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye un ARN que comprende una secuencia CRISPR (ARNcr), un ARN que comprende una secuencia cr de activación de trans (tracr) (ARNtracr) y una endonucleasa Cas o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye una secuencia CRISPR, una secuencia guía y una endonucleasa Cas o una endonucleasa Cpf, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf. La nucleasa Cpf es una endonucleasa del sistema CRISPR-Cas de clase 2. Cpf es una endonucleasa guiada por ARN individual. La nucleasa Cpf puede ser de tipo salvaje, manipulada o mutante de nickasa, o cualquier variación de la misma. Ver, por ejemplo, Zetsche et al., "CPF1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163(3): 759-71. En algunas realizaciones, la nucleasa Cpf es una endonucleasa Cpf 1.
En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasas. La edición del genoma basada en meganucleasas usa endonucleasas específicas de secuencia que reconocen sitios objetivo de ADN grandes (por ejemplo, típicamente de aproximadamente >12 pb). Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 9.365.964. Las meganucleasas pueden escindir secuencias cromosómicas únicas sin afectar a la integridad general del genoma. En algunas realizaciones, la meganucleasa puede ser una endonucleasa dirigida. En algunas realizaciones, la meganucleasa puede ser una endonucleasa de intrones o una endonucleasa de inteínes. Las endonucleasas dirigidas pueden pertenecer a la familia LAGLIDADG. Las meganucleasas pueden ser de tipo salvaje, manipuladas o un mutante de nickasa.
En algunas realizaciones, el sistema de edición de genes es un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN). La ZFN es una enzima de restricción artificial diseñada en base a la fusión entre un dominio de unión a ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión de ADN. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 9.145.565.
En algunas realizaciones, el sistema de edición de genes es una nucleasa basada en efectores del tipo activador de transcripción (TALEN). Las TALEN son enzimas de restricción manipuladas que se elaboran mediante la fusión de un dominio de unión al ADN del efector TAL con un dominio de escisión del ADN. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 9.181.535.
En algunas realizaciones, el sistema de edición de genes es un sistema basado en Argonauta. Los sistemas de edición de genes basados en Argonauta incluyen una endonucleasa derivada de Argonauta y un ADNmc 5' fosforilado. En algunas realizaciones, el ADNmc fosforilado puede tener una longitud de 10-40 nucleótidos, de 15-30 nucleótidos o de 18-30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 24 nucleótidos). En algunas realizaciones, la endonucleasa Argonauta puede ser cualquier endonucleasa. En algunas realizaciones, la endonucleasa Argonauta se deriva de Thermus thermophiles (TtAgo), Pyrococcus furiosus (PfAgo) o Natronobacterium gregoryi (NgAgo). En algunas realizaciones, la Natrobacterium gregoryi (NgAgo) es la cepa 2 (es decir, N. gregoryi SP2). En algunas realizaciones, la endonucleasa de Argonauta es NgAgo. Ver, por ejemplo, "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute," Nature Biotechnology, mayo de 2016.
Los inhibidores de ADN-PK pueden ser cualquier inhibidor de ADN-PK. El inhibidor de ADN-PK puede ser cualquier compuesto o sustancia que provoque la inhibición de ADN-PK. El inhibidor de ADN-PK puede ser un compuesto, una molécula pequeña, un anticuerpo o una secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, los inhibidores de ADN-PK son compuestos representados por la Fórmula Estructural I o la Fórmula Estructural II. En algunas realizaciones, los inhibidores de a DN-PK son compuestos representados por la Fórmula Estructural I' o la Fórmula Estructural II'. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK es cualquiera de los compuestos N° 1-37. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK es un cocristal que incluye cualquiera de los compuestos N° 1-37 y ácido adípico.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK es cualquiera de los compuestos N° 1-37, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, puede usarse cualquier inhibidor de NHEJ para aumentar la eficiencia de edición del genoma HDR. En algunas realizaciones, el inhibidor de NHEJ es cualquiera de los compuestos N° 1-37, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el inhibidor de NHEJ puede ser cualquier compuesto o sustancia que provoque la inhibición de un NHEJ. Los ejemplos de inhibidor de NHEJ incluyen inhibidores de ADN-PK. El inhibidor de NHEJ puede ser un compuesto, una molécula pequeña, un anticuerpo o una secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, los inhibidores de NHEJ son compuestos representados por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III"), o Fórmula (III'"), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o cocristales de los mismos. En algunas realizaciones, el inhibidor de NHEJ es cualquiera de los compuestos N° 1-37, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la eficiencia de edición del genoma aumentada es de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una célula o células, o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula o células un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK.
Uso de inhibidores de ADN-PK, composiciones y kits de los mismos
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para sensibilizar una célula para un agente terapéutico o un estado de enfermedad que induce una lesión en el ADN que comprende el paso de poner en contacto la célula con uno o más inhibidores de ADN-PK divulgados en la presente, como los de las Fórmulas Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II"'), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'''), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o cocristales de los mismos.
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan inhibidores de ADN-PK divulgados en la presente para su uso en métodos para potenciar un régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer que comprenden el paso de administrar a un individuo con necesidad de ello una cantidad eficaz de un inhibidor de ADN-PK, como los de la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'''), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III'') o Fórmula (III'''), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un cocristal del mismo. En un aspecto, el régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer incluye radioterapia.
Los inhibidores de ADN-PK divulgados en la presente son útiles en los casos en los que está indicada la radioterapia para mejorar el beneficio terapéutico de dicho tratamiento. Además, la radioterapia está frecuentemente indicada como adyuvante de la cirugía en el tratamiento del cáncer. El objetivo de la radioterapia en el entorno adyuvante es reducir el riesgo de recurrencia y mejorar la supervivencia libre de enfermedad cuando se ha controlado el tumor primario. La radioterapia adyuvante está indicada en varias enfermedades, incluyendo los cánceres de colon, recto, pulmón, gastroesofágico y de mama, como se describe a continuación.
Puede usarse otro agente quimioterapéutico contra el cáncer con un inhibidor de ADN-PK divulgado en la presente en un régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer, con o sin radioterapia. La combinación de un inhibidor de ADN-PK divulgado en la presente con otros agentes puede potenciar el protocolo quimioterapéutico. Por ejemplo, un inhibidor de ADN-PK divulgado en la presente puede administrarse con etopósido o bleomicina, agentes que se sabe que provocan la rotura de la cadena de ADN.
Además, en la presente se divulgan células tumorales radiosensibilizadoras que utilizan los inhibidores de ADN-PK de la presente. Un inhibidor de ADN-PK que puede “radiosensibilizar” una célula, como se usa en la presente, se define como una molécula, preferiblemente una molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en una cantidad terapéuticamente eficaz para aumentar la sensibilidad de las células a la radiación electromagnética y/o para promover el tratamiento de enfermedades que son tratables con radiación electromagnética (por ejemplo, rayos X). Las enfermedades que son tratables con radiación electromagnética incluyen enfermedades neoplásicas, tumores benignos y malignos y células cancerosas.
Además, en la presente se proporcionan inhibidores de ADN-PK divulgados en la presente para su uso en métodos para tratar el cáncer en un animal que incluyen administrar al animal una cantidad eficaz de un inhibidor de ADN-PK como, por ejemplo, un compuesto de la invención. La invención está dirigida además a métodos para inhibir el crecimiento de células cancerosas, incluyendo procesos de proliferación celular, invasividad y metástasis en sistemas biológicos. Los métodos incluyen el uso de un compuesto de la invención como inhibidor del crecimiento de células cancerosas. Preferiblemente, los métodos se emplean para inhibir o reducir el crecimiento de células cancerosas, la invasividad, la metástasis o la incidencia de tumores en animales vivos, como mamíferos. Los compuestos de la invención pueden usarse, ya sea solos o en combinación con el uso de IR o uno o más agentes quimioterapéuticos, para tratar el cáncer o inhibir el crecimiento de células cancerosas. Los métodos de la invención también son fácilmente adaptables para su uso en sistemas de ensayo, por ejemplo, en el ensayo del crecimiento de células cancerosas y propiedades de las mismas, así como para identificar compuestos que afectan al crecimiento de células cancerosas.
Los tumores o neoplasias incluyen crecimientos de células tisulares en los que la multiplicación de las células es descontrolada y progresiva. Algunos de estos crecimientos son benignos, pero otros se denominan "malignos" y pueden provocar la muerte del organismo. Las neoplasias malignas o “cánceres” se distinguen de los crecimientos benignos en que, además de mostrar una proliferación celular agresiva, pueden invadir los tejidos circundantes y hacer metástasis. Además, las neoplasias malignas se caracterizan por mostrar una mayor pérdida de diferenciación (mayor "desdiferenciación") y de su organización unas con respecto a otras y con los tejidos circundantes. Esta propiedad también se llama “anaplasia”.
Los neoplasias tratables por la presente invención también incluyen tumores sólidos, es decir, carcinomas y sarcomas. Los carcinomas incluyen aquellas neoplasias malignas derivadas de células epiteliales que infiltran (invaden) los tejidos circundantes y dan lugar a metástasis. Los adenocarcinomas son carcinomas derivados del tejido glandular o de tejidos que forman estructuras glandulares reconocibles. Otra amplia categoría de cánceres incluye los sarcomas, que son tumores cuyas células están incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea como el tejido conectivo embrionario. La invención también permite el tratamiento de cánceres de los sistemas mieloide o linfoide incluyendo leucemias, linfomas y otros cánceres que típicamente no se presentan como una masa tumoral, sino que se distribuyen en los sistemas vasculares o linforreticulares.
La actividad de ADN-PK puede asociarse con varias formas de cáncer en, por ejemplo, oncología pediátrica y de adultos, crecimiento de tumores sólidos/enfermedades malignas, carcinoma mixoide y de células redondas, tumores localmente avanzados, cáncer metastásico, sarcomas de tejidos blandos humanos, incluyendo el sarcoma de Ewing, metástasis de cáncer, incluyendo metástasis linfáticas, carcinoma de células escamosas, particularmente de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas de esófago, carcinoma oral, enfermedades malignas de células sanguíneas, incluyen mieloma múltiple, leucemias, incluyendo leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica y leucemia de células pilosas, linfomas de efusión (linfomas con base en la cavidad corporal), linfoma tímico, cáncer de pulmón, incluyendo el carcinoma de pulmón de células pequeñas, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de la corteza suprarrenal, tumores productores de ACTH, cánceres de células no pequeñas, cáncer de mama, incluyendo carcinoma de células pequeñas y carcinoma ductal, cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal cáncer, pólipos asociados a neoplasia colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cánceres urológicos, incluyendo cáncer de vejiga, incluyendo tumores primarios de vejiga superficiales, carcinoma invasivo de células de transición de la vejiga y cáncer de vejiga con invasión muscular, cáncer de próstata, enfermedades malignas del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma de ovario, neoplasias epiteliales peritoneales primarias, carcinoma cervical, cánceres de endometrio uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de útero y tumores sólidos en el folículo ovárico, enfermedades malignas del aparato genital masculino, incluyendo cáncer testicular y cáncer de pene, cáncer de riñón, incluyendo carcinoma de células renales, cáncer de cerebro, incluyendo tumores cerebrales intrínsecos, neuroblastoma, tumores cerebrales astrocíticos, gliomas, invasión de células tumorales metastásicas en el sistema nervioso central, cánceres de huesos, incluyendo osteomas y osteosarcomas, cánceres de piel, incluyendo melanomas malignos, progresión tumoral de queratinocitos de la piel humana, cáncer de células escamosas, cáncer de tiroides, retinoblastoma, neuroblastoma, derrame peritoneal, derrame pleural maligno, mesotelioma, tumores de Wilms, cáncer de vesícula biliar, neoplasias trofoblásticas, hemangiopericitoma y sarcoma de Kaposi. La invención abarca compuestos, sales farmacéuticamente aceptables y cocristales de los mismos, composiciones farmacéuticas y los medicamente para su uso en métodos para potenciar el tratamiento de estas y otras formas de cáncer.
La invención proporciona un método para inhibir la actividad de ADN-PK en una muestra biológica que incluye poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o composición de la invención. El término "muestra biológica", como se usa en la presente, significa una muestra fuera de un organismo vivo e incluye, sin limitación, cultivos celulares o extractos de los mismos; material de biopsia obtenido de un mamífero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos. La inhibición de la actividad de la quinasa, particularmente la actividad de la ADN-PK, en una muestra biológica es útil para una variedad de propósitos conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de tales propósitos incluyen, pero no se limitan a, almacenamiento de especímenes biológicos y ensayos biológicos. En una realización, el método para inhibir la actividad de ADN-PK en una muestra biológica se limita a métodos no terapéuticos.
Uso para la edición del genoma
La edición del genoma, en la que se alteran con precisión regiones genómicas particulares, tiene un gran potencial terapéutico.
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo, para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR, para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más genómicas objetivo, y para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas mediante la administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan métodos para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprenden administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK descrito en la presente, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo de un gen o genes objetivo, lo que da como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un gen o genes en sentido descendente y/o proteína o proteínas asociadas con el gen o genes objetivo.
El sistema de edición del genoma puede ser cualquier sistema de edición del genoma que pueda editar una región genómica objetivo en una célula o células. Los sistemas ejemplares de edición del genoma se han descrito con detalle con anterioridad y pueden incluir, por ejemplo, un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores tipo activador de la transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR, o sistema basado en NgAgo
La edición de una o más regiones genómicas objetivo incluye cualquier tipo de manipulación o ingeniería genética del genoma de una célula. La edición de una o más regiones genómicas objetivo puede incluir inserciones, deleciones o reemplazos de regiones genómicas en una célula o células realizadas por una o más endonucleasas. Las regiones genómicas comprenden el material genético en una célula o células, como ADN, ARN, polinucleótidos y oligonucleótidos. Las regiones genómicas en una célula o células también comprenden los genomas de las mitocondrias o cloroplastos contenidos en una célula o células.
El inhibidor de ADN-PK puede ser cualquier inhibidor de ADN-PK. El inhibidor de ADN-PK puede ser cualquier compuesto o sustancia que provoque la inhibición de ADN-PK. El inhibidor de ADN-PK puede ser un compuesto, una molécula pequeña, un anticuerpo o una secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, los inhibidores de ADN-PK son compuestos representados por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II"), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), fórmula (III") o Fórmula (IIP). En algunas realizaciones, los inhibidores de ADN-PK son compuestos representados por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (II''), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III") o Fórmula (III'"). En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK es cualquiera de los compuestos N° 1-37. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK es un cocristal que incluye cualquiera de los compuestos N° 1-37, y ácido adípico. En algunas realizaciones, la proporción de ácido adípico a cualquiera de los compuestos N° 1-37 es de aproximadamente 5 a 0,5, o cualquier proporción intermedia. En algunas realizaciones, la proporción de ácido adípico con cualquiera de los compuestos N° 1-37 es de aproximadamente 4 a 0,5, o cualquier proporción intermedia. En algunas realizaciones, la proporción de ácido adípico con cualquiera de los compuestos N° 1-37 es de aproximadamente 3 a 0,5, o cualquier proporción intermedia. En algunas realizaciones, la proporción de ácido adípico con cualquiera de los compuestos N° 1-37 es de aproximadamente 2 a 0,5, o cualquier proporción intermedia. En algunas realizaciones, la proporción de ácido adípico con cualquiera de los compuestos N° 1-37 es de aproximadamente 2 a 1,0, o cualquier proporción intermedia. En algunas realizaciones, los inhibidores de NHEJ son compuestos representados por la Fórmula Estructural (I), Fórmula (II), Fórmula (II'), Fórmula (N"), Fórmula (II'"), Fórmula (III), Fórmula (III'), Fórmula (III''), o Fórmula (III'"), o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan compuestos para su uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección que necesita editar una o más regiones genómicas objetivo en una célula o células del sujeto, que comprende administrar a una o más células un sistema de edición genómica y un Inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en la presente se usan para modificar la expresión de un gen, una molécula de ARN, una proteína, un grupo de proteínas o proteínas en sentido descendente en una vía. Dicha modificación puede usarse para tratar una enfermedad, una disfunción, una homeostasis orgánica anormal, ya sea adquirida o heredada o debida al proceso de envejecimiento. Como se usa en la presente, el término "modificar" o "que modifica" incluye modular, mejorar, disminuir, aumentar, insertar, eliminar, desactivar, activar y similares.
Un experto en la técnica entiende que las enfermedades, ya sean adquiridas o heredadas, u obtenidas de otro modo, implican una desregulación de los mecanismos homeostáticos, incluyendo la implicación de la función génica o proteica. Con este fin, un experto en la técnica puede usar los métodos proporcionados en la presente para modular, modificar, mejorar, disminuir o proporcionar una función génica en otras circunstancia en un sujeto.
La modificación de la expresión del gen y la consiguiente expresión de la proteína en una célula o células puede lograrse mediante los métodos proporcionados en la presente, por ejemplo, mediante la edición específica (por ejemplo, reemplazando, insertando o eliminando, cualquier combinación de los mismos) una secuencia de ácidos nucleicos en cualquiera de un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, una región promotora, una región potenciadora, una región silenciadora, una región aislante, un antirrepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (por ejemplo, poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión del factor de transcripción, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, los compuestos, kits y composiciones proporcionados en la presente son para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer. El método para tratar a un sujeto que tiene un cáncer o una afección relacionada con el cáncer comprende administrar a una célula o células del sujeto un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma. La administración del inhibidor de ADN-PK y del sistema de edición del genoma puede ser in vivo o ex vivo.
El cáncer puede ser de cualquier tipo de cáncer. El cáncer incluye tumores sólidos como los de mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testículo, cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma y otros tumores de órganos tisulares y cánceres de las células sanguíneas, como linfomas y leucemias, incluyendo la leucemia mielógena aguda, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia linfocítica de células T y los linfomas de células B. Los cánceres pueden incluir melanoma, leucemia, astocitoma, glioblastoma, linfoma, glioma, linfoma de Hodgkins, leucemia linfocitaria crónica y cáncer de páncreas, mama, tiroides, ovario, útero, testículo, pituitaria, riñón, estómago, esófago y recto.
En algunas realizaciones, los kits y composiciones proporcionados en la presente son para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene uno o más de los cánceres siguientes: leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer de ano, cáncer del apéndice, astrocitoma, cerebeloso o cerebral infantil, carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, extrahepático (ver colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno, tumor cerebral, ependimoma, tumor cerebral, meduloblastoma, tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor cerebral, glioma de vía visual e hipotalámico, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, infantil, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, primario, astrocitoma cerebeloso, infantil, astrocitoma cerebral/glioma maligno, infantil, cáncer de cuello uterino, cánceres infantiles, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, hemangioendotelioma epitelioide (EHE), cáncer de esófago, sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de las vías biliares extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular, cáncer ocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales: extracraneal, extragonadal u ovárico, tumor trofoblástico gestacional, glioma del tronco encefálico, glioma, astrocitoma cerebral infantil, glioma, vía visual infantil e hipotalámico, carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, glioma hipotalámico y de la vía visual, infantil, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias, leucemia linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), leucemia mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfomas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfomas de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (una clasificación antigua de todos los linfomas excepto el de Hodgkin), macroglobulinemia del sistema nervioso central primario, Waldenstrom, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma infantil, melanoma, intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma maligno en adultos, cáncer de cuello escamoso metastásico infantil con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda del adulto, mieloma agudo infantil, múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, mixoma crónico, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor del estroma epitelial superficial), tumor de células germinales de ovario, tumor de bajo potencial maligno de ovario, cáncer de páncreas, cáncer pancreático de células de los islotes, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), cáncer de pelvis y uréter renal, cáncer de células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel, células de Merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas - ver cáncer de piel (no melanoma), cáncer de cuello escamoso con primario oculto, metastásico, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma de células T, cutáneo (micosis fungoide y síndrome de Sezary), cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, tumor trofoblástico gestacional, carcinoma de sitio primario desconocido en adultos, cáncer de sitio primario desconocido, infantil, uréter y pelvis renal, cáncer de células de transición, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma hipotalámico y de la vía visual, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom o tumor de Wilms (cáncer de riñón).
En algunas realizaciones, los genes objetivo ejemplares asociados con el cáncer incluyen ABL1, ABL2, ACSL3, AF15Q14, AF1Q, AF3p21, AF5q31, AKAP9, A T1, AKT2, ALDH2, AL, AL017, APC, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC3, BLM, BMPRIA, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIPI, BTG1, BUB1B, C12orf9, C15orf21, C15orf55, C16orf75, C2orf44, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CBFA2T1, CBFA2T3, C.BFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD74, CD79A, CD79B, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CD N2A, CD N2a(pl4), CD N2C, CDX2, CEBPA, CEP1, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHNl, CIC, Cin A, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1 Al, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CTNNB1, CYLD, D10S170, DAXX, DDB2, DDIT3, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, D1CER1, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBFI, ECT2L, EGFR, E1F4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ETVl, ETV4, ETV5, ETV6, EVIl, EWSR1, EXTl, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM22A, FAM22B, FAM46C, 1ANCA, EANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FBXOl 1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFRIOP, FGFR2, FGFR3, FTI, FIIIT, FIP1L1, FLU, FLJ27352, FLT3, FNBP1, FOXL2, FOXOIA, FOX03A, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, IICMOGT-1, IIEAB, HERPUD1, IIEY1, IIIPl, HIST1IT3B, IMST1M4I, IILF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNRNPA2BI, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, IIRPT2, HSPCA, HSPCB, IDHl, IDH2, IGH, IGK, IGL, IKZFl, IL2, TL21R, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KRAS, KTN1, LAF4, LASPl, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LMOl, LM02, LPP, LRIG3, LYL1, MADH4, MAF, MAFB, MALT1, MAML2, MAP2KL MAP2K2, MAP2K4, MAX, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECTl, MED12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLIIl, MLL, MLL2, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NACA, NBS1, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2-1, NONO, NOTCH I, NOTCH2, NPMl, NR4A3, NRAS, NSDI, NT5C2, NTRKI, NTRK3, NUMAl, NUP214, NUP98, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB 2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PNF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG 1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1 A, PRO1073, PSIP2, PTCH, PTEN, PTPN11, RAB5EP, RACl, RAD51L1, RAFl, RALGDS, RANBP17, RAPIGDSI, RARA, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RUNDC2A, RUNX1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SEPT6, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRGAP3, SRSF2, SSI8, SS18L1, SSH3BP1, SSX1, SSX2, SSX4, STAT3, STK11, STL, SUFU, SIJZ12, SYK, TAF15, TALI, TAL2, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1A, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIF1, TLX1, TLX 3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF6, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, USP6, VHL, VTUA, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WTX, WWTR1, XPA, XPC, XPOl, YWHAE, ZNF145, ZNF198, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2 o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, los compuestos proporcionados en la presente son para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno hereditario. El método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección genética o un trastorno hereditario comprende administrar a una células o células del sujeto un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma. La administración del inhibidor de ADN-PK y el sistema de edición del genoma puede ser in vivo o ex vivo.
El trastorno hereditario puede resultar de mutaciones o duplicaciones en regiones cromosómicas (por ejemplo, de mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, cambios de marco, duplicaciones o deleciones cromosómicas). El trastorno hereditario puede ser cualquier trastorno hereditario.
En algunas realizaciones, el trastorno hereditario es síndrome de deleción 2211.2, síndrome de Angelman, enfermedad de Canavan, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, daltonismo, Cri du chat, síndrome de Down, distrofia muscular de Duchenne, hemocromatosis, hemofilia, síndrome de Klinefelter, neurofibromatosis, fenilcetonuria, enfermedad renal poliquística, síndrome de Prader-Willi, enfermedad de células falciformes, atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinal, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Turner, hemoglobinopatía o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el trastorno heredado es síndrome de deleción de Ip36, síndrome de deleción de 18p, deficiencia de 21-hidroxilasa, 47 XXX (síndrome de triple X), 47 XXY (síndrome de Klinefelter), porfiria por deficiencia de 5-ALA deshidratasa, deficiencia de ALA deshidratasa, porfiria por deficiencia de 5-aminolevulínico deshidratasa, síndrome de deleción de 5p, Cri du chat (también conocido como síndrome 5p-), ataxia telangiectasia (también conocida como A-T), deficiencia de alfa 1 -antitripsina (AAT), aceruloplasminemia, acondrogénesis tipo II (ACG2), acondroplasia (ACH), deficiencia de beta-glucosidasa ácida, enfermedad de Gaucher (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3), acrocefalosindactilia (Apert), síndrome de Apert, acrocefalosindactilia (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 5), síndrome de Pfeiffer, acrocefalia, enfermedad de Gaucher cerebral aguda, porfiria aguda intermitente, (AIP) deficiencia de ACY2, enfermedad de Alzheimer (EA), craneosinostosis tipo Adelaida, síndrome de Muenke, poliposis coli adenomatosa, poliposis adenomatosa familiar, poliposis adenomatosa del colon, poliposis adenomatosa familiar (ADP), deficiencia de adenilosuccinato liasa, trastornos de las glándulas suprarrenales, síndrome adrenogenital, adrenoleucodistrofia, síndrome de insensibilidad a los andrógenos (AIS), alcaptonuria (AKU), porfiria ALA deshidratasa, porfiria ALA-D, deficiencia de ALA deshidratasa, síndrome de Alagille, albinismo, alcaptonuria, alcaptonuria, enfermedad de Alexander, alcaptonuria, ocronosis alcaptonúrica, alcaptonuria, enfermedad por inhibidores de la proteinasa alfa-1, enfisema relacionado con alfa-1, deficiencia de alfagalactosidasa A, enfermedad de Fabry, síndrome de Alstrom, enfermedad de Alexander (ALX), amelogénesis imperfecta, deficiencia de deshidratasa de ácido aminolevulínico, deficiencia de aminoacilasa 2, enfermedad de Canavan, enfermedad de Anderson-Fabry, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, anemia, sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica y/o familiar ligada a X, angioqueratoma corporis diffusum, angioqueratoma difuso, angiomatosis retinae, enfermedad de von Hippel-Lindau, resistencia a APC, tipo Leiden, trombofilia del factor V Leiden, síndrome de Apert, deficiencia de AR, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (cualquier tipo, por ejemplo, CMT1, CMTX, CMT2, CMT4, CMT grave de aparición temprana), aracnodactilia, síndrome de Marfan, SRNAH, sordera no sindrómica (autosómica recesiva, autosómica dominante, ligada a x o mitocondrias), artrooftalmopatía, progresiva hereditaria, síndrome de Stickler (por ejemplo, COL2A1, COL11A1, COL11A2, COL9A1), artrocalasia múltiple congénita, síndrome de Ehlers-Danlos (por ejemplo, tipo hiperlaxitud, tipo artrocalasia, tipo clásico, tipo vascular, tipo cifoescoliosis, tipo dermatosparaxis), deficiencia de Asp, deficiencia de Aspa, deficiencia de aspartoacilasa, ataxia telangiectasia, síndrome de autismo-demencia-ataxiapérdida del uso intencional de la mano, síndrome de Rett, ELA juvenil autosómica dominante, Síndrome opitz G/BBB autosómico dominante, forma autosómica recesiva de ELA juvenil tipo 3, esclerosis lateral amiotrófica (cualquier tipo; por ejemplo, ALS1, ALS2, ALS3, ALS4, ALS5, ALS5, ALS6, ALS7, ALS8, ALS9, ALS10, ALS11, ALS12, ALS13, ALS14, ALS15, ALS16, ALS17, ALS18, ALS19, ALS20, ALS21, ALS22, FTDALS1, FTDALS2, FTDALS3, FTDALS4, FTDALS4, IBMPFD2), pérdida auditiva no sindrómica autosómica recesiva, deterioro auditivo neurosensorial autosómico recesivo y Goiter, síndrome de Pendred, enfermedad de Alexander (AxD), síndrome de Ayerza, hipertensión arterial pulmonar familiar, variante B de la hexosaminidasa GM2 gangliosidosis, enfermedad de Sandhoff, trastorno relacionado con BANF, neurofibromatosis (cualquier tipo, por ejemplo, NF1, NF2, schwannomatosis), síndrome de Beare-Stevenson cutis gyrata, peritonitis paroxística benigna, síndrome de Benjamin, beta-talasemia, deficiencia de BH4, deficiencia de tetrahidrobiopterina, neurofibromatosis acústica bilateral, deficiencia de biotinidasa, cáncer de vejiga, trastornos hemorrágicos, trombofilia del factor V de Leiden, síndrome de Bloch-Sulzberger, incontinentia pigmenti, síndrome de Bloom, enfermedades óseas, enfermedad de Bourneville, esclerosis tuberosa, enfermedades cerebrales, enfermedad priónica, cáncer de mama, síndrome de Birt-Hogg-Dubé, enfermedad de los huesos frágiles, osteogénesis imperfecta, pulgar ancho-síndrome de Hallux, síndrome de Rubinstein-Taybi, diabetes bronceada, hemocromatosis, cirrosis bronceada, atrofia muscular bulboespinal, atrofia muscular espinal y bulbar ligada al cromosoma X, síndrome de Burger-Grutz, deficiencia de lipoproteína lipasa, síndrome familiar de CADASIL, trastorno granulomatoso crónico CGD, displasia campomélica, síndrome de la familia del cáncer, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, cáncer de mama, cáncer de vejiga, deficiencia de carboxilasa, deficiencia múltiple de biotinidasa de aparición tardía, síndrome del llanto de gato, síndrome cardiofacial de Caylor, deficiencia de ceramida trihexosidasa, angiomatosis cerebelorretiniana, enfermedad de von Hippel-Lindau familiar, arteriopatía cerebral, síndrome de CADASIL, arteriopatía cerebral autosómica dominante, síndrome de CADASIL, hiperamonemia cerebroatrófica, síndrome de Rett, síndrome de lipidosis por cerebrósidos, enfermedad de Charcot, síndrome de CHARGE, condrodistrofia, síndrome de condrodistrofia, condrodistrofia con sordera neurosensorial, displasia otospondilomegaepifisaria, condrogénesis imperfecta, síndrome de hiperuricemia con automutilación de coreoatetosis, síndrome de Lesch-Nyhan, galactosemia clásica, galactosemia, labio leporino y paladar hendido, síndrome de Stickler, cráneo en hoja de trébol con enanismo tanatofórico, displasia tanatofórica (por ejemplo, tipo 1 o tipo 2), síndrome de Coffin-Lowry (CLS), síndrome de Cockayne, síndrome de Coffin-Lowry, colagenopatía tipos II y XI, sin poliposis familiar, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, cáncer de colon familiar, poliposis adenomatosa familiar, cáncer colorrectal, deficiencia completa de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia completa de hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, neuropatía por compresión, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, enfermedad del tejido conectivo, síndrome facial por anomalía conotruncal, anemia de Cooley, beta-talasemia, enfermedad de almacenamiento de cobre, enfermedad de Wilson, enfermedad de transporte de cobre, enfermedad de Menkes, coproporfiria, coproporfiria hereditaria, deficiencia de coproporfirinógeno oxidasa, síndrome de Cowden, deficiencia de CPX, disartrosis craneofacial, síndrome de Crouzon, disostosis craneofacial, síndrome de Crouzon, enfermedad de Crohn, fibroestenosante, síndrome de Crouzon, síndrome de Crouzon con acantosis nigricans, síndrome crouzonodermoesquelético, síndrome crouzonodermoesquelético, síndrome de Cockayne (CS), síndrome de Cowden, síndrome de Curschmann-Batten-Steinert, síndrome cutis gyrata de Beare-Stevenson, síndrome de cutis gyrata Beare-Stevenson, deficiencia de D-glicerato deshidrogenasa, hiperoxaluria, primaria, síndrome de metáfisis moteada, displasia espondiloepimetafisaria, tipo Strudwick, demencia tipo Alzheimer (DAT), hipercalciuria genética, enfermedad de Dent, distrofia muscular (por ejemplo, tipos Duchenne y Becker), sordera con bocio, síndrome de Pendred, síndrome de sordera-retinitis pigmentosa, síndrome de Usher, enfermedad por deficiencia, fenilalanina hidroxilasa, enfermedades nerviosas degenerativas, síndrome de De Grouchy 1, síndrome de De Jerine-Sottas, porfiria por deficiencia de deltaaminolevulinato deshidratasa, demencia, síndrome de CADASIL, leucodistrofia desmielinógena, enfermedad de Alexander, síndrome de Ehlers-Danlos de tipo dermatoparáctico, dermatoparaxis, discapacidades del desarrollo hereditarias, neuropatía motora hereditaria distal (dHMN), neuropatía motora hereditaria distal (por ejemplo, DHMN-V), deficiencia de DHTR, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, esclerosis difusa del cuerpo globoide, enfermedad de Krabbe, síndrome de Di George, deficiencia del receptor de dihidrotestosterona, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, neuropatía motora hereditaria distal, distrofia miotónica (tipo 1 o tipo 2), atrofia muscular espinal distal (cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 4, tipo 5, tipo 6), distrofia muscular de Duchenne/Becker, enanismo (cualquier tipo, por ejemplo, acondroplásico, acondroplasia, displasia tanatofórica), síndrome de enanismo-atrofia retiniana-sordera, síndrome de Cockayne, leucodistrofia dismielinógena, enfermedad de Alexander, distrofia miotónica, distrofia retinae pigmentosa-síndrome de disostosis, síndrome de Usher, enfermedad de Alzheimer familiar de aparición temprana (EOFAD), enfermedad de Alzheimer (incluyendo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 o tipo 4) enfermedad de Ekman-Lobstein, osteogénesis imperfecta, neuropatía por atrapamiento, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, protoporfiria eritropoyética (EPP), anemia eritroblástica, beta-talasemia, protoporfiria eritrohepática, deficiencia de 5-aminolevulinato sintetasa eritroide, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, cáncer de ojo, retinoblastoma FA -ataxia de Friedreich, ataxia de Friedreich, FA, anemia de fanconi, lesiones y trastornos faciales, trombofilia del factor V de Leiden, FALS, esclerosis lateral amiotrófica, neuroma acústico familiar, poliposis adenomatosa familiar, enfermedad de Alzheimer familiar (FAD), esclerosis lateral amiotrófica familiar, esclerosis lateral amiotrófica, disautonomía familiar, hipertrigliceridemia familiar inducida por grasa, deficiencia de lipoproteína lipasa, familiar, hemocromatosis familiar, hemocromatosis, deficiencia de LPL familiar, deficiencia de lipoproteína lipasa, familiar, cáncer de colon familiar sin poliposis, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, poliserositis paroxística familiar, PCT familiar, porfiria cutánea tardía, neuropatía sensible a la presión familiar, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, hipertensión pulmonar primaria familiar (FPPH), leucoencefalopatía vascular familiar, síndrome de CADAs iL, FAP, poliposis adenomatosa familiar, FD, disautonomía familiar, deficiencia de ferroquelatasa, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2A, tipo 2B, tipo 3, tipo 4, hemocromatosis neonatal, acaeruloplasminemia, atransferrinemia congénita, síndrome de fiebre periódica (síndrome grácil), fiebre mediterránea familiar (FMF), síndrome de FG, sinostosis coronal asociada a FGFR3, degeneración fibrinoide de astrocitos, enfermedad de Alexander, enfermedad fibroquística del páncreas, enfermedad de Folling, síndrome de fra(X), síndrome de X frágil, Fragilitas ossium, osteogénesis imperfecta, síndrome de FRAXA, ataxia de Friedreich (FRDA), deficiencia de G6PD, enfermedad por deficiencia de galactoquinasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de galactosa-1-fosfato uridil-transferasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de galactosilceramidasa, enfermedad de Krabbe, lipidosis de galactosilceramida, enfermedad de Krabbe, deficiencia de galactosilcerebrosidasa, lipidosis de galactosilesfingosina, deficiencia de GALC, deficiencia de GALT, galactosemia, enfermedad similar a Gaucher, enfermedad de pseudo-Gaucher, deficiencia de GBA, trastornos cerebrales genéticos, enfisema genético, hemocromatosis genética, hemocromatosis, hepatitis de células gigantes, neonatal, hemocromatosis neonatal, deficiencia de GLA, glioblastoma, retiniano, retinoblastoma, glioma, retiniano, retinoblastoma, leucodistrofia de células globoides (GCL, GLD), enfermedad de Krabbe, leucoencefalopatía de células globoides, deficiencia de glucocerebrosidasa, glucocerebrosidosis, lipidosis de glucosil cerebrósidos, deficiencia de glucosilceramidasa, deficiencia de glucosilceramida beta-glucosidasa, lipidosis de glucosilceramida, aciduria glicérica, hiperoxaluria primaria, encefalopatía por glicina, hiperglicinemia no cetósica, aciduria glicólica, hiperoxaluria primaria, gangliosidosis GM2, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de bocio-sordera, síndrome de Pendred, síndrome de Graefe-Usher, síndrome de Usher, síndrome de Gronblad-Strandberg, pseudoxantoma elástico, hemocromatosis, hemocromatosis, síndrome de Hallgren, síndrome de Usher, ictiosis tipo arlequín, enfermedad de Hb S, hipocondroplasia (HCH), coproporfiria hereditaria (HCP), malformaciones de la cabeza y el cerebro, trastornos auditivos y sordera, problemas de audición en niños, HEF2A, HEF2B, hematoporfiria, porfiria, deficiencia de hemo sintetasa, hemocromatosis, enfermedad de la hemoglobina M, metahemoglobinemia tipo betaglobina, enfermedad de la hemoglobina S, hemofilia, porfiria hepatoeritropoyética (HEP), deficiencia hepática de AGT, hiperoxaluria primaria, síndrome de degeneración hepatolenticular, enfermedad de Wilson, artro-oftalmopatía hereditaria, síndrome de Stickler, lipidosis distópica hereditaria, hemocromatosis hereditaria (HHC), hemocromatosis, telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT), miopatía hereditaria con cuerpos de inclusión, regeneración del músculo esquelético, anemia por carga de hierro hereditaria, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, neuropatía motora y sensorial hereditaria, neuronopatía motora hereditaria, tipo V, neuropatía motora hereditaria distal, exostosis múltiple hereditaria, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, síndrome de fiebre periódica hereditario, poliposis coli hereditaria, poliposis adenomatosa familiar, enfisema pulmonar hereditario, resistencia hereditaria a la proteína C activada, trombofilia del factor V de Leiden, neuropatía sensorial y autonómica hereditaria tipo III, disautonomía familiar, paraplejía espástica hereditaria, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil, ataxia espinal hereditaria, ataxia de Friedreich, esclerosis espinal hereditaria, ataxia de Friedreich, anemia de Herrick, OSMED heterocigoto, síndrome de Weissenbacher-Zweymuller, displasia otospondilomegaepifisaria heterocigota, síndrome de Weissenbacher-Zweymiller, deficiencia de HexA, enfermedad de Tay-Sachs, deficiencia de hexosaminidasa A, enfermedad de Tay-Sachs, deficiencia de la subunidad alfa de hexosaminidasa (cualquier variante, por ejemplo, variante A, variante B), enfermedad de Tay-Sachs, hemocromatosis asociada a HFE, hemocromatosis, HGPS, progeria, enfermedad de Hippel-Lindau, enfermedad de von Hippel-Lindau, hemocromatosis (HLAH), neuropatía motora hereditaria distal (HMN V), cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión (HNPP), homocistinuria, deficiencia de oxidasa de ácido homogentísico, acidura homogentísica, alcaptonuria, porfiria cutánea homocigótica tardía, porfiria hepatoeritropoyética, hiperoxaluria primaria (HP1), hiperoxaluria (HP2), hiperfenilalaninemia (HPA), HPRT -deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, síndrome de Lesch-Nyhan, HSAN tipo III, disautonomía familiar, disautonomía familiar (HSAN3), neuropatía sensorial hereditaria (cualquier tipo, por ejemplo, HSN-1, HSN-II, HSN-III), disautonomía familiar, dermatosparaxis humana, enfermedad de Huntington, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford, progeria, hiperandrogenismo, tipo no clásico debido a deficiencia de 21-hidroxilasa, hiperquilomicronemia, deficiencia de lipoproteína lipasa familiar, familiar, hiperglicinemia con cetoacidosis y leucopenia, acidemia propiónica, hiperlipoproteinemia tipo I, deficiencia de lipoproteína lipasa, hiperoxaluria familiar, hiperfenilalaninemia primaria, hiperfenilalaninemia, hiperfenilalaninemia, hipocondrodisplasia, hipocondroplasia, hipocondrogénesis, hipocondroplasia, anemia hipocrómica, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, deficiencia de hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), síndrome de Lesch-Nyhan, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil (IAHSP), síndrome ICF, inmunodeficiencia, inestabilidad del centrómero y síndrome de anomalías faciales, hemocromatosis idiopática, hemocromatosis, tipo 3, hemocromatosis neonatal idiopática, hemocromatosis, neonatal, hipertensión pulmonar idiopática, trastornos del sistema inmunitario, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, incontinencia pigmenti, enfermedad de Gaucher cerebral infantil, enfermedad de Gaucher infantil, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio en la infancia, infertilidad, enfisema hereditario, tendencia heredada a las parálisis por presión, neuropatía hereditaria con predisposición a las parálisis por presión, síndrome de Insley-Astley, displasia otospondilomegaepifisaria síndrome de porfiria aguda intermitente, porfiria intermitente aguda, síndrome de poliposis intestinal-pigmentación cutánea, síndrome de Peutz-Jeghers, incontinentia pigmenti (IP), trastorno de almacenamiento de hierro, hemocromatosis, isodicéntrico 15, isodicéntrico 15, sordera aislada, sordera no sindrómica, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Joubert, esclerosis lateral primaria juvenil (JPLS), esclerosis lateral amiotrófica juvenil, gota juvenil, coreoatetosis, síndrome de retraso mental, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de hiperuricemia juvenil, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Jackson-Weiss (JWS), atrofia muscular espinal y bulbar, enfermedad de Kennedy, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia muscular espinal y bulbar de Kennedy, atrofia muscular espinal y bulbar, histiocitosis de querasina, lipoidosis de querasina, tesaurismosis de querasina, glicinemia cetósica, acidemia propiónica, hiperglicinemia cetósica, acidemia propiónica, enfermedades renales, hiperoxaluria, primaria, displasia de Kniest, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Kugelberg-Welander, atrofia muscular espinal, demencia lacunar, síndrome de CADASIL, acondrogénesis de Langer-Saldino, displasia de Langer-Saldino, enfermedad de Alzheimer de inicio tardío, enfermedad de Krabbe de inicio tardío (LOKD), Enfermedad de Krabbe, trastornos del aprendizaje, discapacidad de aprendizaje, lentiginosis perioral, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofias, leucodistrofia con fibras de Rosenthal, enfermedad de Alexander, leucodistrofia espongiforme, síndrome de Li-Fraumeni (LFS), síndrome de Li-Fraumeni, deficiencia de lipasa D, deficiencia de lipoproteína lipasa, deficiencia familiar de LIPD, deficiencia de lipoproteína lipasa, lipidosis familiar, cerebrósido, lipidosis, gangliósido, infantil, enfermedad de Tay-Sachs, histiocitosis lipoide (tipo querasina), deficiencia de lipoproteína lipasa, enfermedades hepáticas familiares, galactosemia, enfermedad de Lou Gehrig, síndrome de Louis-Bar, ataxia telangiectasia, síndrome de Lynch, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, deficiencia de lisilhidroxilasa, enfermedad de Machado-Joseph, ataxia espinocerebelosa (cualquier tipo, por ejemplo, SCA1, SCA2, SCA3, SCA18, SCA20, SCA21, SCA23, SCA26, SCA28, SCA29), cáncer de mama masculino, cáncer de mama, trastornos genitales masculinos, neoplasia maligna de mama, cáncer de mama, tumor maligno de mama, cáncer de mama, tumor maligno de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, cáncer mamario, cáncer de mama, síndrome de Marfan, síndrome de Marker X, síndrome de X frágil, síndrome de Martin-Bell, síndrome de X frágil, síndrome de McCune-Albright, síndrome de McLeod, síndrome de MEDNIK, anemia mediterránea, beta-talasemia, enanismo megaepifisario, displasia otospondilomegaepifisaria, síndrome de Menkea, enfermedad de Menkes, enfermedad de Menkes, retraso mental con anomalías osteocartilaginosas, síndrome de Coffin-Lowry, trastornos metabólicos, enanismo metatrópico tipo II, displasia de Kniest, displasia metatrópica de tipo II, displasia de Kniest, metahemoglobinemia (cualquier tipo, por ejemplo, congénita, tipo betaglobina, metahemoglobinemia congénita tipo II), acidemia metilmalónica, síndrome de Marfan (MFS), MHAM, síndrome de Cowden, microsíndrome, microcefalia, MMA, acidemia metilmalónica, enfermedad de Menkes (también conocida como MK o MNK), síndrome de monosomía 1p36, enfermedad de neuronas motoras, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos del movimiento, síndrome de Mowat-Wilson, mucopolisacaridosis (MPS I), mucoviscidosis, demencia multiinfarto, síndrome de CADASIL, deficiencia de carboxilasa múltiple, inicio tardío, deficiencia de biotinidasa, síndrome de hamartoma múltiple, síndrome de Cowden, neurofibromatosis múltiple, distrofia muscular (cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, tipo Duchenne y Becker), miotonía atrófica, distrofia miotónica, miotonía distrófica, síndrome de Nance-Insley, displasia otospondilomegaepifisaria, condrodisplasia de Nance-Sweeney, displasia otospondilomegaepifisaria, NBIA1, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, síndrome de Neill-Dingwall, síndrome de Cockayne, neuroblastoma, retiniano, retinoblastoma, neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro tipo 1, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, enfermedades neurológicas, trastornos neuromusculares, neuronopatía motora hereditaria distal, Niemann-Pick, enfermedad de Niemann-Pick, síndrome de Noack, hiperglicinemia no cetósica, encefalopatía por glicina, enfermedad de Gaucher no neuropática, hiperfenilalaninemia no fenilcetonúrica, deficiencia de tetrahidrobiopterina, sordera no sindrómica, síndrome de Noonan, enfermedad norbottniana de Gaucher, ocronosis, alcaptonuria, artritis ocronótica, alcaptonuria, síndrome de Ogden, osteogénesis imperfecta (OI), enfermedad de Osler-Weber-Rendu, telangiectasia hemorrágica hereditaria, OSMED, displasia otospondilomegaepifisaria, osteogénesis imperfecta, osteopsiatirosis, osteogénesis imperfecta, osteoesclerosis congénita, displasia oto-espondilo-megaepifisaria, displasia otospondilomegaepifisaria, displasia otospondilomegaepifisaria, oxalosis, hiperoxaluria primaria, oxaluria primaria, hiperoxaluria primaria, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, síndrome de Patau (trisomía 13), deficiencia de PBGD, porfiria intermitente aguda, deficiencia de PCC, acidemia propiónica, porfiria cutánea tardía (PCT), enfermedad PDM, síndrome de Pendred, enfermedad periódica, fiebre mediterránea, peritonitis periódica familiar, síndrome de lentiginosis periorificial, síndrome de Peutz-Jeghers, trastornos nerviosos periféricos, disautonomía familiar, neurofibromatosis periférica, atrofia muscular peronea, deficiencia de alanina:glioxilato aminotransferasa peroxisomal, hiperoxaluria, síndrome de Peutz-Jeghers primario, enfermedad por deficiencia de fenilalanina hidroxilasa, feocromocitoma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Pierre Robin con condrodisplasia fetal, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, cirrosis pigmentaria, hemocromatosis, síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa (PKAN), PKU, fenilcetonuria, plumboporfiria, porfiria por deficiencia de ALA, PMA, enfermedad renal poliquística, displasia fibrosa poliostótica, síndrome de McCune-Albright, poliposis adenomatosa familiar, poliposis intestinal hamartomatosa, síndrome de pólipos y manchas, síndrome de Peutz-Jeghers, deficiencia de porfobilinógeno sintasa, porfiria por deficiencia de ALA, trastorno de porfirina, deficiencia de PPDX, porfiria variegata, síndrome de Prader-Labhart-Willi, síndrome de Prader-Willi, demencia presenil y senil, discinesia ciliar primaria (PCD), hemocromatosis primaria, hemocromatosis, síndrome de hiperuricemia primaria, síndrome de Lesch-Nyhan, demencia degenerativa senil primaria, procolágeno tipo EDS VII, mutante, progeria, síndrome de progeria de Hutchinson Gilford, síndrome tipo progeria, síndrome de Cockayne, nanismo progeroide, síndrome de Cockayne, corea progresiva, hereditaria crónica (Huntington), enfermedad de Huntington, osteogénesis imperfecta progresivamente deformante con esclerótica normal, osteogénesis imperfecta (cualquier tipo, por ejemplo, tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V, tipo VI, tipo VII, tipo VIII), distrofia miotónica proximal (PROMM), acidemia propiónica, deficiencia de propionil-CoA carboxilasa, deficiencia de proteína C, deficiencia de proteína S, protoporfiria, deficiencia de protoporfirinógeno oxidasa, porfiria variegata, distrofia miotónica proximal, distrofia miotónica tipo 2, miopatía miotónica proximal, enfermedad de pseudo-Gaucher, pseudoxantoma elástico, psicosina lipidosis, enfermedad de Krabbe, hipertensión pulmonar arterial, hipertensión pulmonar, pseudoxantoma elástico (PXE), pseudoxantoma elástico, retinoblastoma (Rb), enfermedad de Recklinghausen, poliserositis recurrente, trastornos retinianos, síndrome de retinitis pigmentosa-sordera, síndrome de Usher, retinoblastoma, síndrome de Rett, RFALS tipo 3, síndrome de Ricker, síndrome de Riley-Day, disautonomía familiar, síndrome de Roussy-Levy, síndrome de Rubinstein-Taybi (RSTS), síndrome de Rett (RTS), síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sack-Barabas, enfermedad, de SADDAN, síndrome de la familia del sarcoma de Li y Fraumeni, síndrome de Li-Fraumeni, síndrome de SBLA (sarcoma, mama, leucemia y síndrome de la glándula suprarrenal), síndrome de Li-Fraumeni, atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), schwannoma, acústico, bilateral, tipo neurofibromatosis II, síndrome de Schwartz-Jampel, inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (SCIDX1), SED congénita, displasia espondiloepimetafisaria congénita, SED Strudwick, displasia espondiloepimetafisaria, tipo Strudwick, displasia espondiloepimetafisaria congénita (SEDc), displasia espondiloepimetafisaria (SEMD), SEMD tipo Strudwick, demencia senil, acondroplasia grave con retraso del desarrollo y acantosis nigricans, enfermedad de SADDAN, síndrome de Shprintzen, síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X de Siderius provocado por mutaciones en el gen PHF8, síndrome esqueleto-piel-cerebro, trastornos de la pigmentación de la piel, atrofia muscular espinal (SMA), displasia espondilo-meta-epifisaria (SMED) (cualquier tipo, por ejemplo, tipo Studwick, tipo 1), síndrome de Smith-Lemli-Opitz, síndrome de Smith Magenis, porfiria genética sudafricana, parálisis espástica ascendente de inicio infantil, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil, trastornos del habla y la comunicación, esfingolipidosis, Tay-Sachs, enfermedad de Tay-Sachs, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinal, tipo V distal, neuropatía motora hereditaria distal, atrofia muscular espinal distal con predominio de las extremidades superiores, neuropatía motora hereditaria distal, ataxia espinocerebelosa, displasia espondiloepifisaria congénita, displasia espondiloepifisaria, colagenopatía (cualquier tipo, por ejemplo, tipos II y XI), displasia espondiloepimetafisaria, displasia espondiloepimetafisaria (SMD), displasia espondiloepimetafisaria, degeneración esponjosa del sistema nervioso central, degeneración esponjosa del cerebro, degeneración esponjosa de la materia blanca en la infancia, hipertensión pulmonar primaria esporádica, síndrome de SSB, síndrome del cabello acerado, enfermedad de Menkes, enfermedad de Steinert, distrofia miotónica, síndrome de distrofia miotónica de Steinert, distrofia miotónica, síndrome de Stickler, ataque cerebral, síndrome de CADASIL, síndrome de Strudwick, enfermedad de Gaucher neuronopática subaguda, porfiria genética sueca, porfiria intermitente aguda, porfiria intermitente aguda, displasia del cartílago de queso suizo, displasia de Kniest, enfermedad de Tay-Sachs, TD - enanismo tanatofórico, displasia tanatofórica, TD con fémur recto y cráneo en trébol, displasia tanatofórica tipo 2, telangiectasia, cerebelooculocutánea, ataxia telangiectasia, síndrome de feminización testicular, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, deficiencia de tetrahidrobiopterina, síndrome de feminización testicular (TFM), síndrome de insensibilidad a los andrógenos, talasemia intermedia, beta-talasemia, talasemia mayor, beta-talasemia, displasia tanatofórica, trombofilia debida a deficiencia del cofactor de la proteína C activada, tipo Leiden, trombofilia por factor V de Leiden, enfermedad de tiroides, neuropatía tomaculosa, neuropatía hereditaria con propensión a parálisis por presión, deficiencia total de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia total de hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Treacher Collins, trias fragilitis ossium, síndrome de triple X, síndrome de Triplo X, trisomía 21, trisomía X, síndrome de Troisier-Hanot-Chauffard, hemocromatosis, enfermedad de Tay-Sachs (TSD), complejo de esclerosis tuberosa (TSC), esclerosis tuberosa, síndrome similar a Tumer, síndrome de Noonan, enfermedad por deficiencia de UDP-galactosa-4-epimerasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de UDP glucosa 4-epimerasa, galactosemia, deficiencia de UDP glucosa hexosa-1-fosfato uridililtransferasa, galactosemia, sordera indiferenciada, sordera no sindrómica, deficiencia de UPS, porfiria aguda intermitente, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, deficiencia de UROD, deficiencia de uroporfirinógeno descarboxilasa, deficiencia de uroporfirinógeno sintasa, porfiria aguda intermitente, síndrome de Usher, deficiencia de UTP hexosa-1-fosfato uridililtransferasa, galactosemia, síndrome de Van Bogaert-Bertrand, síndrome de Van der Hoeve, síndrome velocardiofacial, síndrome de VHL, enfermedad de von Hippel-Lindau, deficiencia visual y ceguera, síndrome de Alstrom, enfermedad de Von Bogaert-Bertrand, enfermedad de von Hippel-Lindau, enfermedad de Von Recklenhausen-Applebaum, hemocromatosis, enfermedad de von Recklinghausen, neurofibromatosis tipo I, enfermedad de Vrolik, osteogénesis imperfecta, síndrome de Waardenburg, síndrome de Warburg Sjo Fledelius, Micro síndrome, enfermedad de Wilson (WD), síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, atrofia muscular espinal, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wilson, síndrome de Wolf-Hirschhom, enfermedad periódica de Wolff, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller (WZS), xeroderma pigmentoso, retraso mental y macroorquidismo ligados al cromosoma X, síndrome de X frágil, hiperuricemia primaria ligada al cromosoma X, síndrome de Lesch-Nyhan, Inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, atrofia muscular espinal-bulbar ligada al cromosoma X, atrofia muscular espinal y bulbar, defecto de la enzima aciduria úrica ligada al cromosoma X, síndrome de Lesch-Nyhan, X-SCId , inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica ligada a X (XLSA), X-SCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X (XLSA), XSCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, síndrome XXX, síndrome triple X, síndrome XXXX, síndrome XXXXX, XXXXX, síndrome XXY, trisomía XXY, síndrome de Klinefelter, síndrome XYY, trastornos de repetición de tripletes o cualquier combinación de los mismos.
En realizaciones, el objetivo para la modulación, modificación, mejora o disminución de la actividad mediante la administración de un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición genómica es un modulador de control postranscripcional específico,. Por ejemplo, los moduladores del control postranscripcional pueden incluir PARN, PAN, CPSF, CstF, PAP, PABP, Pa B2, Cf I, CFII, ARN trifosfatasa, ARN gluaniltransferasa, ARN metiltransferasa, SAM sintasa, enzima conjugadora de ubiquitina E2R, proteínas SR SFRS1 a través de SFR11, proteínas hnRNP (por ejemplo, HNRNPA0, HNRNPA1, HNRNPA1L1, HNRNPA1L2, HNRNPA2, HNRNPA2B1, HNRNPAB, HNRNPB 1, HNRNPC, HNRNPCL1, HNRNPD, HNRPDL, HNRNPF, HNRNHP1, HNRNPH2, HNRNPH3, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPLL, HNRNPM, HNRNPR, HNRNPU, HNRNPUL1, HNRNPUL2, HNRNPUL3, ADAR, Mex 67, Mtr2, Nab2, helicasa de Dead-box, elF4A, elF4B, elF4E, elF4G, GEF, GCN2, PKR, HRI, PERK, eEF1, eEF2, GCN, eRF3, proteínas de unión específica a ARE, EXRN1, DCP1, DCP2, RCK/p54, CPEB, eIF4E, microARNAs y ARNip, DICER, proteínas Ago, proteínas de descomposición del ARNm mediadas por antisentido, UPF3A, UPF3BeIF4A3, MLN51, Y14/MAGOH, MG-1, SMG-5, SMG-6, SMG-7, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, se modulan, potencian o disminuyen en actividad las vías genéticas asociadas con el ciclo celular mediante la administración de un inhibidor de ADNPK y un sistema de edición genómica. Las vías y genes ejemplares asociados con el ciclo celular incluyen ATM, PMS2, FAS-L, MRE11, MLH1, FasR, NBS1, MSH6, Trail-L, RAD50, MSH2, Trail-R, 53BP1, RFC, TNF-Ct, P53, PCNA, TNF-R1, CHKE, MSH3, FADD, E2F1, MutS, homólogo, TRADD, PML, MutL, homólogo, R1P1, FANCD2, exonucleasa, MyD88, SMC1, ADN, polimerasa, delta, IRAK, BLM1, (POLD1, POLD2, POLD3, NIL, BRCA1 y POLD4, -genes, IKK, H2AX, codificantes, subunidades), NFKp, ATR, topoisomerasa, 1, IKpa, RPA, topoisomerasa, 2, IAP, ATRIP, ARNsaHl, Caspasa, 3, RAD9, Ligasa, 1, Caspasa, 6, RAD1, ADA, polimerasa, 1, Caspasa, 7, HUS, ADN, polimerasa, 3, Caspasa, 8, RAD17, Primasa, Caspasa, 10, RFC, Helicasa, HDAC1, CHK1, cadena sencilla, de unión, HDAC2, TLK1, proteínas, Citocromo, C, CDC25, Bxl-xL, STAT3, STAT5, DFF45, Vcl-2, ENDO-G, PI3K, Akt, Calpaina, Bad, Bax, proteolísis mediada por ubiquitina, Hipoxia, proliferación celular, HIF-loc, MAPK, E1, HERC1, TRAF6, HIFIp, MAPKK, E2, UBE2Q, MEKK1, Refl, MAPKKK, E3, UBE2R, COP!, HSP90, c-Met, UBLE1A, UBE2S, PIFH2, VEGF, HGF, UBLE1B, UBE2U, clAP, PAS, ER, Sl/2, UBLEIC, UBE2W, PIAS, ARNT, ATK, UBE2A, UBE2Z, SYVN, VHL, PKCs, UBE2B, AFC, LLC, N, NHLRC1, HLF, Paxilin, UBE2C, UBE1, AIRE, EPF, FAK, UBE2A, E6AP, MGRN1, VDU2, Adducina, UBE2E, UBE3B, BRCA1, SUMORESUME, PYK1, UBE2F, Smurf, FANCL, SENP1, RB, UBE2G1, Itch, MIDI, Calcineurina, A, RBI, UBE2G2, HERC2, Cdc20, RACK1, Raf-1, UBE2I, HERC3, Cdhl, PTB, A-Raf, UBE2J1, HERC4, Apcl, Hur, Braf, UBE2J2, UBE4A, Apc2, PHD2, MEK1/2, UBE2L3, UBE4B, Apc3, SSAT2, ERK1/2, UBE2L6, CHIP, Apc4, SSAT1, Ets, UBE2M, CYC4, Apc5, GSK3, Elkl, UBE2N, PPR19, Apc6, CBP, SAP1, UBE20, UIP5, Apc7, FOX04, cPLA2, WWPI, Mdm2, Apc8, F1H-1, WWP2, Parkin, Apc9, TRIP, 12, Trim32, Mono, 10, NEED4, Trim37, Mono, 11, ARF-BP1, SIAH-1, Mono, 12, EDD1, PML, Célula, supervivencia, célula, ciclo, detención, SMADI, P21, SMAD5, BAX, SAMD8, MDR, LEF1, DRAIL, IGFBP3, TCF3, GADD45, TCF4, P300, HAT1, PI3, Akt, GF1, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, se modulan, potencian o disminuyen en actividad los genes asociados con la angiogénesis mediante la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica a una célula o células. Los genes y rutas genéticas ejemplares asociados con la angiogénesis y las condiciones relacionadas con la angiogénesis incluyen VEGF, VEGFR2, SHC, E2F7, VEGFB, VEGFR3, PI3, VEGFC, Nrp 1, PIP3, EGFDIP3, DAG, GRB2, SOS, Akt, PB, PKC, Ras, RAF1, DAG, eNOS, NO, ERK1, ER2, cPLA2, ME1, MEK2, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, se modulan, potencian o disminuyen en actividad las rutas genéticas y/o los genes asociados con la función mitocondrial mediante la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica a una célula o células. Los genes y las rutas genéticas ejemplares asociados con la función mitocondrial incluyen malato deshidrogenasa aminotransferasa, hidratasa, desacilasa, deshidrogenasa, carboxilasa, mutasa, oxidación de ácidos grasos Oxidación de leucina Trastornos de isoleucina (deficiencias de la vía de oxidación de la ruta enzimática) Aminotransferasa Aminotransferasa, OCTN2 Cadena ramificada Cadena ramificada, FATP1-6 aminotransferasa 2, aminotransferasa 2, CPT-1 mitocondrial mitocondrial, CACT Isobutitil-CoA 2-metilbutitil-CoA, CPT-II deshidrogenasa Deshidrogenasa, SCAD (cadena ramificada (cadena ramificada, MCAD cetoácido cetoácido, VLCAD deshidrogasa deshidrogenasa, complejo ETF-DH) Complejo), Alfa-ETF Hidratasa, Beta-ETF HMG-CoA liasa 2-metil-3-OH-SCHAD butiril-CoA, LCHAD deshidrogenasa, MTP 3-oxotiolasa, LKAT, DECR 1, HMGCS2, HMGCL o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, se modulan, potencian o disminuyen en actividad las rutas genéticas y/o los genes asociados con el daño del ADN o la inestabilidad genómica. Los genes y las rutas genéticas ejemplares asociados con rutas y/o genes relacionados con el daño del ADN y la inestabilidad genómica incluyen 53BP1, BLM, MBD2, DNA, ligase, 4, MDC1, H2AX, XLF, SMC1, 53BP1, Rad50, P53, P53, Artemis, Rad27, TdT, APE1, PMS2, APE2, UvrA, RecA, MLH1, NEIL1, UvrB, SSB, MSH6, NEIL2, UvrC, Mrell, MSH2, NEIL3, XPC, Rad50, RFC, XRCC1, Rad23B, Nbsl, PCNA, PNKP, CEN2, CtIP, MSH3, Tdpl, DDB1, RPA, MutS, APTX, XPE, Rad51, MutL, ADN, polimerasa p CSA, Rad52, ADN polimerasa 6, CSB, Rad54, topoisomerasa, 1, ADN, TFT1H, BRCA1, topoisomerasa, 2, PCNA, XPB, BRCA2, RNAsaH1, FEN1, XPD, Exol, Ligasa 1, RFC, XPA, BLM, ADN, polimerasa, 1, PAR, 1, RPA, Topllla, ANA, Ligl, XPG, GEN1, Primasa, Lig3, ERCC1 Yenl Helicasa, UNG, XPF, Slxl, SSBs, MUTYDNA polimerasa 6, Slx4, SMUG DNA polimerasa £, Mus8, MBD4, Emel, Dssl, ASH1L, SETD4, DQT1L, SETD5, EHMT1, SETD6, EHMT2, SETD7, EZH1, SETD8, EZH2, SETD9, MLL, SETDB1, MLL2, SETDB2, MLL3, SETMAR, MLL4, SMYD, 1, MLL5, SMYD2, NSD, 1, SMYD3, PRDM2, SMYD4, SET, SMYD5, SETBP1, SUV39H1, SETD 1A, SUV39H2, SETD 1B, SUV420H1, SETD2, SUV420 H2, SETD3, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, se modulan, potencian, disminuyen o proporcionan a una célula los genes que codifican factores de transcripción de mamíferos. Los factores de transcripción humanos ejemplares incluyen AFF4, AFF3, AFF2, AFF1, AR, TFAP2B, TFAP2D, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, JARID2, KDM5D, ARID4A, ARID4B, KDM5A, ARID3A, KDM5B, KDM5C, ARID5B, ARID3B, ARID2, ARID5A, ARID3C, ARID1A, ARID1B, HIF1A, NPAS1 NPAS3, NPAS4, MLXIPL, ARNTL2, MXD1, AHRR, TFE3, HES2, MNT, TCF3, SREBF1, TFAP4, TCFL5, LYL1 USF2, TFEC, AHR, MLX, MYF6, MYF5, SIM1, TFEB, HAND1, HES1, ID2, MYCL1, ID3, TCF21, MXI1, SOHLH2 MYOG, TWIST1, NEUROG3, BHLHE41, NEUROD4, MXD4, BHLHE23, TCF15, MAX, ID1, MYOD1, ARNTL BHLHE40, MYCN, CLOCK, HEY2, MYC, ASCL1, TCF12, ARNT, HES6, FERD3L, MSGN1, USF1, TAL1, NEUROD1 TCF23, HEYL, HAND2, NEUROD6, HEY1, SOHLH1, MESP1, PTF1A, ATOH8, NPAS2, NEUROD2, NHLH1, ID4 ATOH1, ARNT2, HES3, MLXIP, ASCL3, KIAA2018, OLIG3, NHLH2, NEUROG2, MSC, HES7, ATOH7, BHLHA15 BHLHE22, NEUROG1, FIGLA, ASCL2, OLIG1, TAL2, MITF, SCXB, HELT, ASCL4, MESP2, HES4, SCXA, TCF4 HES5, SREBF2, BHLHA9, OLIG2, MXD3, TWIST2, LOC388553, C13orf38-SOHLH2, CEBPE, XBP1, BATF3 CREB5, CEBPG, ATF3, ATF7, CEBPB, CEBPD, CEBPA, CBFB, CAMTA2, CAMTA1, EBF4, EBF3, EBF1, EBF2 NR2F6, NR2F1, NR2F2, GRHL2, TFCP2L1, GRHL1, TFCP2, UBP1, GRHL3, YBX2, CSDE1, CSDA, YBX1, LIN28A CARHSP1, CSDC2, LIN28B, NFIX, NFIC, NFIB, NFIA, CUX2, ONECUT2, CUX1, ONECUT1, SATB1, ONECUT3 SATB2, DMRT3, DMRT1, DMRTC2, DMRTA2, DMRTB1, DMRT2, DMRTA1, E2F2, E2F1, E2F3, TFDP2, E2F8 E2F5, E2F7, E2F6, TFDP3, TFDP1, E2F4, NR1H3, NR1H2, ETV1, ETV7, SPI1, ELF4, ETV2, ERF, ELF2, ELK3 ETV3, ELF1, SPDEF, ELK1, ETS1, EHF, ELF5, ETV6, SPIB, FLI1, GABPA, ERG, ETS2, ELK4, ELF3, FEV, SPIC ETV4, ETV5, FOXN3, FOXC1, FOXJ2, FOXF1, FOXN1, FOXM1, FOXP1, FOXO3, FOXA2, FOXP2, FOXJ1, FOXP4 FOXF2, FOXN4, FOXK2, FOXO1, FOXH1, FOXQ1, FOXK1, FOXI1, FOXD4, FOXA3, FOXN2, FOXB1, FOXG1 FOXR1, FOXL1, FOXC2, FOXE1, FOXS1, FOXL2, FOXO4, FOXD4L1, FOXD4L4, FOXD2, FOXI2, FOXE3, FOXD3 FOXD4L3, FOXR2, FOXJ3, FOXO6, FOXB2, FOXD4L5, FOXD4L6, FOXD4L2, KIAA0415, FOXA1, FOXP3, GCM2 GCM1, NR3C1, GTF2IRD1, GTF2I, GTF2IRD2B, GTF2IRD2, SOX8, SOX30, PMS1, CIC, TCF7, TOX4, SOX10 HMGXB4, HBP1, TFAM, UBTF, WHSC1, SOX6, HMGXB3, BBX, TOX2, SOX4, SOX21, SOX9, SOX15, SOX5 SOX3, LEF1, HMG20A, SOX13, TCF7L2, SSRP1, TCF7L1, SOX17, SOX14, PINX1, SOX7, SOX11, SOX12, SOX2 SOX1, SRY, SOX18, UBTFL1, UBTFL2, TOX, HMGB1, HMGB2, PBRM1, TOX3, SMARCE1, HMG20B, HMGB3 HMGA2, HMGA1, ARX, HOXA11, MEOX1, DLX6, ISL1, HOXC8, BARX2, ALX4, GSC2, DLX3, PITX1, HOXA9 HOXA10, LHX5, LASS4, ZFHX4, SIX4, VSX1, ADNP, RHOXF1, MEIS3, PBX4, DLX5, HOXA1, HOXA2, HOXA3 HOXA5, HOXA6, HOXA13, EVX1, NOBOX, MEOX2, LHX2, LHX6, LHX3, TLX1, PITX3, HOXB6, HNF1B, DLX4 SEBOX, VTN, PHOX2B, NKX3-2, DBX1, NANOG, IRX4, CDX1, TLX2, DLX2, VAX2, PRRX1, TGIF2, VSX2, NKX2-3 HOXB8, HOXB5, HOXB7, HOXB3, HOXB1, MSX2, LHX4, HOXA7, HOXC13, HOXC11, HOXC12, ESX1, BARHL1 NKX2-4, NKX2-2, SIX1, HOXD1, HOXD3, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD13, MNX1, CDX4, BARX1, RHOXF2 LHX1, GSC, MEIS2, RAX, EMX1, NKX2-8, NKX2-1, HLX, LMX1B, SIX3, LBX1, PDX1, LASS5, ZFHX3, BARHL2 LHX9, LASS2, MEIS1, DLX1, HMBOX1, ZEB1, VAX1, NKX6-2, VENTX, HHEX, TGIF2LX, LASS3, ALX3, HOXB13 IRX6, ISL2, PKNOX1, LHX8, LMX1A, EN1, MSX1, NKX6-1, HESX1, PITX2, TLX3, EN2, UNCX, GBX1, NKX6-3 ZHX1, HDX, PHOX2A, PKNOX2, CDX2, DRGX, NKX3-1, PBX3, PRRX2, GBX2, SHOX2, GSX1, HOXD4, HOXD12 EMX2, IRX1, IRX2, SIX2, HOXB9, HOPX, OTP, LASS6, HOXC5, HOXB2, RAX2, EVX2, ZHX3, PROP1, ISX HOXD8, TGIF2LY, IRX5, SIX5, TGIF1, IRX3, ZHX2, LBX2, NKX2-6, ALX1, GSX2, HOXC9, HOXC10, HOXB4 NKX2-5, SIX6, MIXL1, DBX2, PBX1, SHOX, ARGFX, HMX3, HMX2, BSX, HOXA4, DMBX1, HOXC6, HOXC4 RHOXF2B, PBX2, DUXA, DPRX, LEUTX,, NOTO, HOMEZ, HMX1, DUX4L5, DUX4L2, DUX4L3, DUX4L6, NKX1-1 HNF1A, HSF4, HSFY2, HSFX1, HSFX2, HSFY1, HSF1, LCORL, LCOR, IRF6, IRF1, IRF3, IRF5, IRF4, IRF8, IRF2 IRF7, IRF9, MBD3, BAZ2B, MBD4, SETDB2, MBD1, MECP2, SETDB1, MBD2, BAZ2A, SMAD7, SMAD5, SMAD9 SMAD6, SMAD4, SMAD3, SMAD1, SMAD2, ZZZ3, RCOR1, CDC5L, MYBL2, DNAJC2, TADA2A, RCOR3, MYB TERF2, DMTF1, DNAJC1, NCOR1, TERF1, MIER3, MYSM1, SNAPC4, RCOR2, TADA2B, MYBL1, TERF1P2 NCOR2, CCDC79, SMARCC1, SMARCC2, TTF1, C11orf9, NFYA, NFYC, NFYB, NRF1, NR4A3, NR4A1, NR4A2 ESR1, NR0B2, NR0B1, PREB, EAF2, SPZ1, TP63, TP73, TP53, PAX6, PAX7, PAX2, PAX4, PAX8, PAX1, PAX3 PAX5, PAX9, SUB1, POU2F2, POU1F1, POU4F3, POU6F2, POU2F3, POU2F1, POU4F2, POU4F1, POU6F1 POU3F2, POU3F1, POU3F4, POU3F3, POU5F1, POU5F1B, PPARD, PPARG, PPARA, PGR, PROX1, PROX2 NR2E1, NR5A2, NR2C1, NR5A1, NR6A1, ESRRA, NR2C2, RFX3, RFX2, RFX4, RFX1, RFX5, RFX7, RFX6, RFX8 NFATC3, NFKB2, NFATC4, NFATC2, NFAT5, RELB, NFKB1, NFATC1, REL, RELA, RORA, RORC, NR1D2, RORB RUNX3, RUNX1, SP100, SP140, GMEB2, SP110, AIRE, GMEB1, DEAF1, SP140L, LOC729991-MEF2B, MEF2A SRF, MEF2D, MEF2B, STAT1, STAT5A, STAT4, STAT6, STAT3, STAT2, STAT5B, TBX21, TBX5, TBX15, TBX18 TBX2, TBX4, TBX22, TBX3, TBR1, TBX19, TBX6, EOMES, T, TBX20, TBX10, MGA, TBX1, TEAD3, TEAD2 TEAD1, TEAD4, CREBL2, NFE2L3, CREB3L3, FOSL2, NFE2L1, CREM, DBP, CREB3, HLF, BACH2, ATF2 NFE2L2, ATF6, CREB1, ATF1, NFE2, FOSB, ATF4, NRL, JUND, JDP2, CREB3L4, BATF, BACH1, CREB3L1 NFIL3, TEF, BATF2, ATF5, FOS, JUNB, DDIT3, FOSL1, JUN, MAF, CREB3L2, MAFA, MAFF, MAFG, MAFK, MAFB ATF6B, CRX, OTX1, OTX2, THAP3, THAP10, THAP1, PRKRIR, THAP8, THAP9, THAP11, THAP2, THAP6, THAP4 THAP5, THAP7, NR1H4, NR2E3, RARB, HNF4A, VDR, ESRRB, THRA, NR1D1, RARA, ESR2, NR1I3, NR1I2 THRB, NR3C2, HNF4G, RARG, RXRA, ESRRG, RXRB, TSC22D1, TSC22D3, TSC22D4, TSC22D2, TULP3 TULP2, TULP1, TULP4, TUB, ZBTB33, ZBTB32, ZBTB11, MYNN, ZBTB25, PATZ1, ZBTB16, ZBTB24, BCL6 ZBTB47, ZBTB17, ZBTB45, GZF1, ZBTB1, ZBTB46, ZBTB8A, ZBTB7B, BCL6B, ZBTB49, ZBTB43, HIC2, ZBTB26 ZNF131, ZNF295, ZBTB4, ZBTB34, ZBTB38, HIC1, ZBTB41, ZBTB7A, ZNF238, ZBTB42, ZBTB2, ZBTB20 ZBTB40, ZBTB7C, ZBTB37, ZBTB3, ZBTB6, ZBTB44, ZFP161, ZBTB12, ZBTB48, ZBTB10, ZBED4, ZBED3 ZBED2, C11orf95, ZBED1, IKZF5, ZNF821, ZNF451, ZNF195, ZFX, ZNF263, ZNF200, HIVEP2, WIZ, ZNF582 SNAI2, ZFP64, IKZF2, ZIC2, ZNF800, PRDM1, PRDM6, ZFP112, ZNF275, ZNF76, ZFAT, KLF6, ZFY, ZXDC, GLI2 ZNF532, ZNF37A, ZNF510, ZNF506, ZNF324, ZNF671, ZNF416, ZNF586, ZNF446, ZNF8, ZNF264, REST MECOM, ZNF213, ZNF343, ZNF302, ZNF268, ZNF10, HIVEP1, ZNF184, MZF1, SALL4, ZNF516, KLF8, KLF5 ZNF629, ZNF423, CTCF, ZNF500, ZNF174, SALL1, MAZ, ZNF419, OVOL3, ZNF175, ZNF14, ZNF574, ZNF85, SP4 ZKSCAN1, GLI3, GLIS3, KLF3, PRDM4, GLI1, PRDM13, ZNF142, PRDM2, ZNF684, ZNF541, KLF7, PLAGL1 ZNF430, KLF12, KLF9, ZNF410, BCL11A, EGR1, ZFP30, TSHZ3, ZNF549, ZSCAN18, ZNF211, ZNF639, ZSCAN20 GTF3A, ZNF205, ZNF644, EGR2, IKZF4, CTCFL, ZNF831, SNAI1, ZNF576, ZNF45, TRERF1, ZNF391, RREB1 ZNF133, OVOL2, ZNF436, PLAGL2, GLIS2, ZNF384, ZNF484, HIVEP3, BCL11B, KLF2, ZNF780B, FEZF1, KLF16 ZSCAN10, ZNF557, ZNF337, PRDM12, ZNF317, ZNF426, ZNF331, ZNF236, ZNF341, ZNF227, ZNF141, ZNF304 ZSCAN5A, ZNF132, ZNF20, EGR4, ZNF670, VEZF1, KLF4, ZFP37, ZNF189, ZNF193, ZNF280D, PRDM5, ZNF740 ZIC5, ZSCAN29, ZNF710, ZNF434, ZNF287, ZIM3, PRDM15, ZFP14, ZNF787, ZNF473, ZNF614, PRDM16 ZNF697, ZNF687, OSR1, ZNF514, ZNF660, ZNF300, RBAK, ZNF92, ZNF157, ZNF182, ZNF41, ZNF711, PRDM14 ZNF7, ZNF214, ZNF215, SALL3, ZNF827, ZNF547, ZNF773, ZNF776, ZNF256, ZSCAN1, ZNF837, PRDM8 ZNF117, ZIC1, FEZF2, ZNF599, ZNF18, KLF10, ZKSCAN2, ZNF689, ZIC3, ZNF19, ZSCAN12, ZNF276, ZNF283 ZNF221, ZNF225, ZNF230, ZNF222, ZNF234, ZNF233, ZNF235, ZNF362, ZNF208, ZNF714, ZNF394, ZNF333 ZNF382, IKZF3, ZNF577, ZNF653, ZNF75A, GFI1, ZNF281, ZNF496, ZNF2, ZNF513, ZNF148, KLF15, ZNF691 ZNF589, PRDM9, ZNF12, SP8, OSR2, ZNF367, ZNF22, GFI1B, ZNF219, SALL2, ZNF319, ZNF202, ZNF143, ZNF3 ZSCAN21, ZNF606, SP2, ZNF91, ZNF23, ZNF226, ZNF229, ZNF180, ZNF668, ZNF646, ZNF641, ZNF610, ZNF528 ZNF701, ZNF526, ZNF146, ZNF444, ZNF83, ZNF558, ZNF232, E4F1, ZNF597, INSM2, ZNF30, ZNF507, ZNF354A ZEB2, ZNF32, KLF13, ZFPM2, ZNF764, ZNF768, ZNF35, ZNF778, ZNF212, ZNF282, PRDM10, SP7, SCRT1 ZNF16, ZNF296, ZNF160, ZNF415, ZNF672, ZNF692, ZNF439, ZNF440, ZNF581, ZNF524, ZNF562, ZNF561 ZNF584, ZNF274, ZIK1, ZNF540, ZNF570, KLF17, ZNF217, ZNF57, ZNF556, ZNF554, KLF11, HINFP, ZNF24 ZNF596, OVOL1, SP3, ZNF621, ZNF680, BNC2, ZNF483, ZNF449, INSM1, ZNF417, ZNF791, ZNF80, GLIS1 ZNF497, KLF14, ZNF266, ZIC4, ZNF408, ZNF519, ZNF25, ZNF77, ZNF169, ZNF613, ZNF683, ZNF135, ZSCAN2 ZNF575, ZNF491, ZNF620, ZNF619, ZNF354C, ZNF114, ZNF366, ZNF454, ZNF543, ZNF354B, ZNF223, ZNF713 ZNF852, ZNF552, ZFP42, ZNF664, EGR3, ZFPM1, ZNF784, ZNF648, FIZ1, ZNF771, TSHZ1, ZNF48, ZNF816 ZNF571, ZSCAN4, ZNF594, ZFP3, ZNF443, ZNF792, ZNF572, ZNF707, ZNF746, ZNF322A, ZNF467, ZNF678 ZFP41, HKR1, PLAG1, ZNF329, ZNF101, ZNF716, ZNF708, ZSCAN22, ZNF662, ZNF320, ZNF623, ZNF530 ZNF285, ZFP1, WT1, ZFP90, ZNF479, ZNF445, ZNF74, SP1, SNAI3, ZNF696, IKZF1, ZNF267, ZNF566, ZNF224 ZNF529, ZNF284, ZNF749, ZNF17, ZNF555, ZNF75D, ZNF501, ZNF197, ZNF396, ZFP91, ZNF732, ZNF397 ZSCAN30, ZNF546, ZNF286A, ZKSCAN4, ZNF70, ZNF643, ZNF642, ZSCAN23, ZNF490, ZNF626, ZNF793 ZNF383, ZNF669, ZNF559, ZNF177, ZNF548, MTF1, ZNF322B, ZNF563, ZNF292, ZNF567, SP6, ZNF573, ZNF527 ZNF33A, ZNF600, ZKSCAN3, ZNF676, ZNF699, ZNF250, ZNF79, ZNF681, ZNF766, ZNF107, ZNF471, ZNF836 ZNF493, ZNF167, ZNF565, ZNF34, ZNF781, ZNF140, ZNF774, ZNF658, ZNF765, ZNF124, ZNF569, ZNF777 ZNF775, ZNF799, ZNF782, ZNF846, ZNF136, ZKSCAN5, ZNF502, ZFP62, ZNF33B, ZNF512B, ZNF431, ZNF418 ZNF700, ZNF239, ZSCAN16, ZFP28, ZNF705A, ZNF585A, ZNF138, ZNF429, ZNF470, ZNF100, ZNF398, ZNF498 ZNF441, ZNF420, ZNF763, ZNF679, ZNF682, ZNF772, ZNF257, ZNF785, ZSCAN5B, ZNF165, ZNF655, ZNF98 ZNF786, ZNF517, ZNF675, ZNF860, ZNF628, ZNF665, ZNF624, ZNF841, ZNF615, ZNF350, ZNF432, ZNF433 ZNF460, ZNF81, ZNF780A, ZNF461, ZNF181, LOC100287841, ZNF44, ZNF790, ZNF677, ZNF823, ZNF311 ZNF347, ZNF71, ZNF121, ZNF335, ZNF560, ZNF273, ZNF84, ZNF667, ZNF649, ZNF248, ZNF544, ZNF770 ZNF737, ZNF251, ZNF607, ZNF334, ZXDA, ZNF485, ZIM2, PEG3, ZNF192, ZNF442, ZNF813, ZNF26, ZNF69 ZNF583, ZNF568, ZXDB, ZNF480, ZNF587, ZNF808, ZNF43, ZNF28, ZNF627, ZNF789, ZNF536, ZNF534, ZNF652 ZNF521, ZNF358, ZFP2, SP5, ZNF814, ZNF551, ZNF805, ZSCAN5C, ZNF468, ZNF616, ZFP57, ZNF155, ZNF783 ZNF425, ZNF580, ZNF611, ZNF254, ZNF625, ZNF134, ZNF845, ZNF99, ZNF253, ZNF90, ZNF93, ZNF486 REPIN1, LOC100131539, ZNF705D, LOC100132396, ZNF705G, SCRT2, ZNF407, SP9, ZNF579, ZNF880, ZNF630 ZNF844, ZNF469, ZNF717, ZNF865, ZNF492, ZNF688, YY2, ZNF878, ZNF879, ZNF736, ZNF323, ZNF709 ZNF512, ZNF585B, ZNF154, ZNF324B, ZNF564, ZFP82, GLI4, ZNF674, ZNF345, ZNF550, KLF1, YY1, MYST2 ST18, L3MBTL4, MYT1L, MYT1, L3MBTL1, MTA3, GATA1, TRPS1, GATA3, GATA5, GATA4, GATA6, GATAD2B GATAD1, GATA2, MTA1, ZGLP1, MTA2, RERE, C16orf5, LITAF, PIAS1, PIAS2, PIAS4, ZMIZ1, ZMIZ2, PIAS3 RNF138, NFX1, NFXL1, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, las células se manipulan (por ejemplo, se convierten o diferencian) de un tipo celular a otro. En algunas realizaciones, se manipula una célula pancreática en una célula de islote beta. En algunas realizaciones, se manipula un fibroblasto en una célula iPS. En algunas realizaciones, se manipula un preadipocito en una célula de grasa marrón. Otras células ejemplares incluyen, por ejemplo, células musculares, células neurales, leucocitos y linfocitos.
En algunas realizaciones, la célula es una célula enferma o portadora de mutantes. Tales células pueden manipularse para tratar la enfermedad, por ejemplo, para corregir una mutación, o para alterar el fenotipo de la célula, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula está asociada con una o más enfermedades o afecciones descritas en la presente.
En algunas realizaciones, la célula manipulada es una célula normal.
En algunas realizaciones, la célula manipulada es una célula madre o una célula progenitora (por ejemplo, células iPS, hematopoyéticas, adiposas, de línea germina, pulmonares o madre neurales o progenitoras). En algunas realizaciones, la célula manipulada puede ser una célula de cualquiera de las tres capas germinales (es decir, mesodermo, endodermo o ectodermo). En algunas realizaciones, la célula manipulada puede ser de un tejido extraembrionario, por ejemplo, de la placenta.
En algunas realizaciones, la célula que se está manipulando se selecciona de fibroblastos, precursores monocíticos, células B, células exocrinas, progenitoras pancreáticas, progenitoras endocrinas, hepatoblastos, mioblastos o preadipocitos. En algunas realizaciones, la célula se manipula (por ejemplo, se convierte o se diferencia) en células musculares, células eritroides-megacariocíticas, eosinófilos, células iPS, macrófagos, células T, células beta de los islotes, neuronas, cardiomiocitos, células sanguíneas, progenitoras endocrinas, progenitoras exocrinas, células ductales, células acinares, células alfa, células beta, células delta, células PP, hepatocitos, colangiocitos, angioblastos, mesoangioblastos o adipocitos marrones.
En algunas realizaciones, la célula es una célula muscular, célula eritroide-megacariocítica, eosinófilo, célula iPS, macrófago, célula T, célula beta de los islotes, neurona, cardiomiocito, célula sanguínea, progenitora endocrina, progenitora exocrina, célula ductal, célula acinar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatocito, colangiocitos o adipocito blanco o marrón.
En algunas realizaciones, la célula es una célula precursora, una célula pluripotente, una célula totipotente no humana, una célula madre adulta, una célula de masa celular interna, una célula iPS.
En algunas realizaciones, la célula manipulada es una célula cancerosa. En algunas realizaciones, la célula cancerosa puede ser una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de piel, una célula de cáncer de cerebro, una célula de cáncer de páncreas, una célula de cáncer hematopoyética, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de riñón, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de piel. En algunas realizaciones, la célula es una célula muscular, célula eritroidemegacariocítica, eosinófilo, célula iPS, macrófago, célula T, célula beta de los islotes, neurona, cardiomiocito, célula sanguínea, progenitora endocrina, progenitora exocrina, célula ductal, célula acinar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatocito, colangiocito o adipocito blanco o marrón.
Administración de inhibidores de ADN-PK y sistema de edición de genes a una célula o células
La administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica. La administración puede ser in vitro, ex vivo o in vivo. La administración a una célula o células de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK puede producirse simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, la administración da como resultado que los componentes del inhibidor de ADN-PK y del sistema de edición del genoma se introduzcan en la membrana celular. En algunas realizaciones, la administración da como resultado que los componentes del inhibidor de ADN-PK y del sistema de edición del genoma se introduzcan en el núcleo celular. En algunas realizaciones, la administración incluye incubar la célula en presencia del inhibidor de ADN-PK y el sistema de edición del genoma.
El sistema de edición de genes puede administrarse a una célula o células mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede usarse cualquier método de administración de proteínas o ácidos nucleicos conocido en la técnica. El sistema de edición de genes se administra (por ejemplo, se suministra) a una célula por medio de un ácido nucleico que codifica los componentes del sistema de edición de genes. El sistema de edición de genes puede administrarse a una célula mediante vectores virales o vectores no virales. En algunas realizaciones, se usan vectores virales. Los vectores virales pueden ser retrovirales (por ejemplo, leucemia murina, VIH o lentivirales) o virus de ADN (por ejemplo, adenovirus, herpes simplex y adenoasociados). En algunas realizaciones, para introducir el sistema de edición del genoma en una célula se usan métodos de transfección (por ejemplo, métodos de administración no viral). Los métodos de transfección incluyen poner en contacto la célula con DEAE-Dextrano, fosfato de calcio, liposomas o electroporación de un plásmido en una célula. Los métodos adicionales de administración no viral incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, ARN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por agentes. Para la administración de ácidos nucleicos también puede usarse sonoporación usando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar). En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos se administran como ARNm. En algunas realizaciones, se usan ARNm protegidos para aumentar la eficiencia de traducción y/o la estabilidad del ARNm. En algunas realizaciones, se usan caperuzas ARCA (análogo de caperuza anti-inversa) o variantes de las mismas. Ver las Patentes de Estados Unidos US7074596 y US8153773.
En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) y el ARNg se transcriben a partir del ADN.
En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) se transcribe a partir de ADN y el ARNg se proporciona como ARN.
En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) y el ARNg se proporcionan como ARN.
En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) se proporciona como una proteína y el ARNg se proporciona como ADN.
En realizaciones, la endonucleasa (por ejemplo, Cas, Cpfl y similares) se proporciona como proteína y el ARNg se proporciona como ARN.
Los sistemas adicionales de administración de ácidos nucleicos incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc, (ver, por ejemplo, la US6008336). La lipofección se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™ y Lipofectamine™ RNAiMAX). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección de polinucleótidos con reconocimiento de receptor eficaz incluyen los de Feigner, WO 91/17424, Wo 91/16024. La administración puede ser a las células (administración ex vivo) o a los tejidos objetivo (administración in vivo).
La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluyendo los liposomas dirigidos como los complejos de inmunolípidos, es bien conocida por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995), Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994), Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995).
Los métodos adicionales de administración incluyen el uso de empaquetar los ácidos nucleicos que se van a administrar en vehículos de administración EnGenelC (EDV). Estos e Dv se administran específicamente a los tejidos objetivo usando anticuerpos biespecíficos en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido objetivo y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula objetivo y luego el EDV se introduce en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, se libera el contenido (ver MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643) Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Patentes de Estados Unidos N° 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).
En algunas realizaciones, la transfección puede ser transitoria en la que el plásmido que contiene el sistema de edición del genoma transfectado se introduce en el núcleo pero no se incorpora al genoma de la célula durante la replicación. La transfección puede ser estable en la que el plásmido transfectado se integrará en una región genómica de la célula.
En algunas realizaciones en las que se usa expresión transitoria, pueden usarse sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido títulos altos y niveles altos de expresión. Este vector puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se usan vectores de virus adenoasociados ("AAV") para transducir células con ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (ver, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987), Patente de Estados Unidos N° 4.797.368, WO 93/24641, Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994), Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994). La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, incluyendo la Patente de Estados Unidos N° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81 :6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol 63:03822-3828 (1989).
En algunas realizaciones, la administración a una célula o células de un inhibidor de ADN-PK se realiza cultivando una célula o células aisladas en presencia del inhibidor de ADN-PK y cualquier medio adecuado que permita que el inhibidor de ADN-PK se introduzca en la membrana celular y/o o el núcleo celular.
En algunas realizaciones, los inhibidores de ADN-PK se administran a una célula o células in vitro, in vivo o ex vivo. En alguna realización, el inhibidor de ADN-PK se pone en contacto con una célula o células durante aproximadamente 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas, 55 horas, 60 horas, 65 horas, 70 horas, 85 horas, 90 horas, 100 horas, 125 horas, 150 horas, 200 horas, o durante cualquier período de tiempo intermedio. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADNPK se pone en contacto con una o más células durante aproximadamente 1,5 semanas, 2,0 semanas, 2,5 semanas, 3,0 semanas, 3,5 semanas, 4 semanas o cualquier período de tiempo intermedio. El inhibidor de ADN-PK puede volver a administrarse con cambios en el medio de cultivo celular. El inhibidor de ADN-PK puede ponerse en contacto con la célula antes, durante o después de la introducción de los componentes del sistema de edición del genoma.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK, como se reivindica, se administra a una célula o células a una concentración de aproximadamente 0,1 pM, 0,25 pM, 0,5 pM, 0,75 pM, 1,0 pM, 1,25 pM, 1,50 pM, 1,75 pM, 2.0 pM, 2,5 pM, 3,0 pM, 3,5 pM, 4,0 pM, 4,5 pM, 5,0 pM, 5,5 pM, 6,0 pM, 6,5 pM, 7,0 pM, 7,5 pM, 8,0 pM, 8,5 pM, 9.0 pM, 9,5 pM, 10 pM, 10,1 pM, M10,1 p0, 11,5 pM, 12 pM o cualquier concentración intermedia. La concentración del inhibidor de ADN-PK puede modificarse durante el transcurso de la administración.
En algunas realizaciones, los componentes de edición de genes se administran a una célula o células mediante uno o más vectores o en forma de ARN, ARNm o, en el caso del componente de endonucleasas, como proteína purificada o ARNm (por ejemplo, proteína Cas9). El uno o más vectores pueden incluir vectores virales, plásmidos o ADNmc. Los vectores virales pueden incluir vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los componentes de edición de genes se administran mediante ARN o ARN sintético.
En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición de genes da como resultado cantidades aumentadas de resultados de edición de genes de reparación dirigida homóloga en comparación con una condición de referencia en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK a la célula. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la supresión de indeles (de NHEJ) en el objetivo o fuera del objetivo. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado una expresión aumentada o disminuida de un gen de interés. La administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes puede dar como resultado la expresión de un gen que no es endógeno a una célula. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación total o parcial, o una modificación de un gen de una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación completa o parcial, o una modificación de un intrón y/o un exón en una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación completa o parcial, o una modificación de una región no codificante en una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula junto con el sistema de edición de genes da como resultado una eliminación simultánea o secuencial, completa o parcial, o una modificación de una región genética codificante y/o no codificante en una célula o células. En algunas realizaciones, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula o células junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación simultánea o secuencial, completa o parcial, o una modificación de una región genética codificante y/o no codificante en una célula o células, incluyendo ADN o ARN extracromosómico. El ADN extracromosómico puede ser ADN mitocondrial, ADN de cloroplasto, ADN circular extracromosómico o ADN viral extracromosómico.
En algunas realizaciones, la administración de inhibidores de ADN-PK a una célula junto con el sistema de edición del genoma da como resultado una expresión aumentada o disminuida de un gen de interés. En algunas realizaciones, el aumento o disminución en la expresión de un gen de interés puede ser de aproximadamente o de entre el 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en comparación con una condición de referencia en la que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK. En algunas realizaciones, el aumento o disminución de un gen de interés puede ser de aproximadamente o de entre 0,5 veces, 1,0 vez, 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en el que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, la administración de inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición del genoma da como resultado un aumento en la edición del genoma. En algunas realizaciones, el aumento en la edición del genoma puede ser de aproximadamente o de entre el 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en comparación con un condición de referencia en la que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK. En algunas realizaciones, el aumento en la edición del genoma puede ser de aproximadamente o de entre 0,5 veces, 1,0 vez, 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión de referencia en el que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK.
En algunas realizaciones, la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición de genes a una población celular da como resultado una supervivencia celular aumentada en comparación con una condición de referencia en la que a una población celular solo se le administra un sistema de edición de genes y no se le administra un inhibidor de ADN-PK. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK que da como resultado una supervivencia celular aumentada es un compuesto de Fórmula Estructural I, Fórmula Estructural II o Fórmula Estructural II".
En algunas realizaciones, la célula se sincroniza en la fase del ciclo celular S o G2, ya sea antes, después o durante la administración del inhibidor de ADN-PK. En algunas realizaciones, la célula se sincroniza en la fase del ciclo celular S o G2, ya sea antes, después o durante la introducción de los componentes de edición de genes. La sincronización de la célula en la fase del ciclo celular S o G2 puede lograrse mediante cualquier método conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, los agentes que pueden usarse para sincronizar una célula en la fase del ciclo celular S o G2 incluyen afidicolina, droxiurea, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina o cualquier combinación de los mismos. (Ver, Lin et al. Elife. 15 de diciembre de 2014; 32014). En algunas realizaciones, los agentes para la sincronización celular pueden administrarse en cualquier momento durante el proceso de edición de genes.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK y/o el sistema de edición del genoma pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el agente inhibidor de ADN-PK y/o el sistema de edición del genoma incluido en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones de uso es un kit.
En algunas realizaciones, los inhibidores de ADN-PK y el sistema de edición del genoma se incluyen en un kit con instrucciones de uso. El kit puede contener cualquier sistema de edición del genoma, y/o inhibidor de ADN-PK e instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK es cualquiera de los compuestos representados por la Fórmula Estructural I, I', II, II', II", II", III, III' o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores de tipo activador de la transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo. El sistema de edición del genoma puede proporcionarse en el kit en cualquier forma, por ejemplo, como un constructo de plásmido, vector, ADN o ARN.
En algunas realizaciones, el inhibidor de ADN-PK y/o un sistema de edición del genoma se administran in vivo. El inhibidor de ADN-PK y el sistema de edición de genes se formulan para que sean compatibles con la vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.
Para uso inyectable, los portadores adecuados incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa (IV), los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En tales administraciones inyectables e IV, la composición es estéril y fluida en la medida en que existe una capacidad de jeringuilla fácil. Son estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conservan frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En algunas realizaciones, se incluyen en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el agente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el agente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para propósitos de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un portador fluido para su uso como lavado bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se enjuaga y se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente disgregante como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los agentes se administran en forma de un espray en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse mediante el uso de espráis nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los agentes también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En algunas realizaciones, los agentes se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación sostenida/controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.
Por ejemplo, los agentes activos pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente, tales matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (patente de Estados Unidos N° 3.773.919), copolímeros de ácido de L-glutámico y y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
En algunas realizaciones, la formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, por ejemplo, aquellas con actividades complementarias que no se ven afectadas negativamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que potencie su función como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
En algunas realizaciones, el agente inhibidor de ADN-PK y/o el sistema de edición del genoma se administran en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, como las varias formas de cáncer y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se administran sustancialmente al mismo tiempo, ya sea simultánea o secuencialmente. Si se administran secuencialmente, al comienzo de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos todavía es preferiblemente detectable en concentraciones eficaces en el sitio de tratamiento.
Métodos de selección de edición del genoma
Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para seleccionar células en cuanto a la eficiencia de edición del genoma, incluyendo la eficiencia de NHEJ y/o HDR. Por ejemplo, los métodos de selección pueden incluir amplificación basada en PCR de las regiones objetivo seguido de secuenciación o secuenciación profunda de las regiones amplificadas para confirmar la edición del genoma. El genotipado por PCR permite la cuantificación y clasificación de compuestos en la estimulación de HDR. Otros métodos de selección pueden incluir la secuenciación de próxima generación. Ver, por ejemplo, Bell et al., "A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing," BMC Genomics, 15:1002 (2014).
Los cebadores de PCR pueden manipularse para amplificar selectivamente las regiones genéticas tanto modificadas como no modificadas, lo que da como resultado amplicones de diferentes longitudes dependiendo del estado de la modificación genética. Luego, los amplicones pueden resolverse en un gel y estimarse la eficiencia de HDR mediante densitometría usando un Bio-Imager. Alternativamente, puede usarse una nueva tecnología de PCR, la PCR digital rápida de gotitas (DDPCR) para medir simultáneamente eventos de HDR y NHEJ en muestras editadas con genoma. Ver, por ejemplo, Miyaoka et al., "Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effectrs of locus, nuclease, and cell type on genome-editin," Scientific Reports, 6, 2016. Otros métodos que pueden usarse para seleccionar células en busca de modificaciones genómicas incluyen la secuenciación de Sanger, la secuenciación profunda y la RT-PCR.
En algunas realizaciones, para seleccionar las células se usa un constructo informador de semáforo (TLR). La selección de TLR incluye una célula informadora que está manipulada para expresar un marcador fluorescente sobre la edición del genoma objetivo. Después del direccionamiento apropiado, la célula expresa el marcador fluorescente. La cuantificación de las células dirigidas apropiadamente puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, análisis de citometría de flujo. Ver, por ejemplo, Certo et al. 2011, "Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints," Nature Methods, 8, páginas 671-676 (2011).
No se pretende que la cita de publicaciones y documentos de patente sea una admisión de que alguno sea un estado de la técnica pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o la fecha de los mismos. Habiéndose descrito ahora la presente divulgación a modo de descripción escrita, los expertos en la técnica reconocerán que pueden ponerse en práctica una variedad de realizaciones y que la descripción anterior y los ejemplos siguientes tienen propósitos ilustrativos y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.
Uso de inhibidores de ADN-PK en el tratamiento/prevención de afecciones
En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Tabla 1. En una realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Tabla 2. En una realización adicional, las composiciones comprenden adicionalmente un agente terapéutico adicional.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de esta invención o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la cantidad de compuesto en una composición de esta invención es tal que es eficaz para inhibir perceptiblemente una ADN-PK en una muestra biológica o en un paciente. En otra realización, la cantidad de compuesto en las composiciones de esta invención es tal que es eficaz para inhibir perceptiblemente la ADN-PK. En una realización, la composición de esta invención se formula para su administración a un paciente con necesidad de dicha composición. En una realización adicional, la composición de esta invención se formula para administración oral a un paciente.
Preparación de Compuestos de la Invención
SECCIÓN I: PREPARACIÓN DE PRODUCTOS INTERMEDIOS DE HIDROXI QUINOXALINONA
En la Sección I se describen procedimientos sintéticos para la preparación de productos intermedios de 8-hidroxi-1-metilquinoxalin-2(1H)-ona funcionalizados. Estos productos intermedios se usaron, junto con la selección apropiada del producto intermedio de mesilato descrito en la Sección II, para preparar los compuestos de la Tabla A.
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Síntesis de 8-hidroxi-1,3-dimetil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona
Paso 1: 5-bromo-1-fluoro-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-nitrobenceno Se disolvieron 5-bromo-1,3-difluoro-2-nitro-benceno (300 g, 1,261 mol) y alcohol p-metoxibencílico (190 g, 1,375 mol) en N,N-dimetilformamida (1,8 l). A la solución resultante se le añadió carbonato de cesio (611 g, 1,875 mol) y la mezcla se calentó a 70° C y se agitó durante 16 h. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en agua fría (2 l), dando como resultado la precipitación de un sólido amarillo. El precipitado se recogió en un embudo Buchner y se enjuagó con agua (2 x 500 ml). El precipitado se disolvió en diclorometano (5 l), se lavó con agua (2 x 1 l) y salmuera (1 l), se secó (Na2SO4), y se filtró a través de un tapón de gel de sílice (500 g). El lecho de gel de sílice se lavó con diclorometano (500 ml) y los filtrados combinados se concentraron a presión reducida. El residuo se trituró con heptano (2 l) y se secó en un horno de vacío a 50° C durante 14 h para proporcionar 5-bromo-1-fluoro-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-nitrobenceno (350 g, 72% de rendimiento) como un sólido amarillo. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 87.35-7.27 (m, 2H), 7.08-6.99 (m, 2H), 6.97-6.87 (m, 2H), 5.11 (s, 2H), 3.82 (s, 3H). 19F NMR (282 MHz, CDCh) 8 -120.36.
Paso 2: (5-bromo-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-nitrofenil)glicinato de metilo
A una mezcla de 5-bromo-1-fluoro-3-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-nitrobenceno (350 g, 0,914 mol) y 2-aminoacetato de metilo (sal sw clorhidrato, 173 g, 1,364 mol) en N,N-dimetilformamida (2 l) se le añadió trietilamina (350 ml, 2,511 mol). La mezcla de la reacción resultante se calentó a 50° C y se agitó a esta temperatura durante 54 h. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en agua fría (3 l), dando como resultado la formación de un material similar a un pegamento de color marrón claro. El agua se decantó y el pegamento de color marrón claro se disolvió en diclorometano (5 l), se lavó con agua (1 l) y salmuera (1 l), se secó (Na2SO4). La solución se filtró a través de un lecho de gel de sílice y el lecho se lavó con diclorometano (2 x 500 ml). El filtrado combinado se concentró a presión reducida. El residuo se trituró con metil terc-butil éter (2 l) y se secó en un horno de vacío a 50° C durante 12 h para proporcionar (5-bromo-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-nitrofenil)glicinato de metilo (252 g, 62%) como un sólido amarillo. 1H NMR (300 MHz, CDCla) 87.40-7.30 (m, 2H), 6.96-6.86 (m, 2H), 6.63 (t, J=4.9 Hz, 1H), 6.58 (d, J=1.8 Hz, 1H), 6.40 (d, J=1.8 Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.96 (d, J=5.2 Hz, 2H), 3.82 (s, 6H).
Paso 3: 6-bromo-8-((4-metoxibencil)oxi)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona
A una solución de (5-bromo-3-((4-metoxibencil)oxi)-2-nitrofenil)glicinato de metilo (52 g, 112,5 mmol) en tetrahidrofurano (700 ml) y metanol (400 ml) se le añadió platino [7 g de 3% p/p sobre carbón activado de madera, reducido, 70% de pasta mojada con agua (ESCAT 2931), 1,076 mmol]. La mezcla de reacción se evacuó durante 5 minutos y luego se colocó bajo una atmósfera de hidrógeno (globo) durante 16 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de Celite y el lecho se lavó con metanol (2 x 200 ml). Los filtrados combinados se concentraron a presión reducida. El residuo obtenido de este modose destiló azeotrópicamente con diclorometano (400 ml) y se trituró con metil terc-butil éter para proporcionar
6-bromo-8-((4-metoxibencil)oxi)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona (39 g, 93%) como un sólido color tostado. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 89.42 (s, 1H), 7.56-7.29 (m, 2H), 7.02-6.81 (m, 2H), 6.60 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.49 (d, J=1.7 Hz, 1H), 6.19 (s, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.70 (s, 2H).
Paso 4: 6-bromo-8-((4-metoxibencil)oxi)quinoxalin-2(1H)-ona
Se disolvió 6-bromo-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-3,4-dihidro-1H-quinoxalin-2-ona (178 g, 0,485 mmol) en cloroformo (6,0 l). A la solución resultante se le añadió dióxido de manganeso (IV) (400 g, 4,601 mol). La mezcla de la reacción resultante se calentó a 55° C y se agitó durante 4 h. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El lecho se lavó con acetato de etilo al 40% en diclorometano (4 x 500 ml). Los filtrados combinados se concentraron a presión reducida. El residuo resultante se trituró con acetato de etilo/metil terc-butil éter (proporción 1:2, 3 l) y se secó en un horno de vacío a 50° C durante 14 h para proporcionar 6-bromo-8-((4-metoxibencilo)oxi)quinoxalin-2(1H)-ona (125 g, 71%) como un sólido color tostado. 1H NMR (300 MHz, DIVISOR) 812.06 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.67-7.33 (m, 4H), 7.03-6.85 (m, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.75 (s, 3H).
Paso 5: 6-bromo-8-((4-metoxibencil)oxi)-1-metilquinoxalin-2(1H)-ona
A una solución de 6-bromo-8-((4-metoxibencil)oxi)quinoxalin-2(1H)-ona (125 g, 0,343 mmol) en N,N-dimetilformamida (4,0 l) se le añadió yoduro de metilo (110 ml, 1,767 mol). La mezcla resultante se enfrió a 0° C con un baño de hielo y se añadió hidruro de sodio (35 g al 60% p/p, 0,875 mmol) en porciones durante 20 minutos. La mezcla de la reacción resultante se agitó a <3° C durante 30 minutos, momento en el que el análisis por HPLC reveló una proporción aproximada de 85:15 de productos de N-metilación y O-metilación. La mezcla de la reacción se vertió en agua fría (4,0 l), dando como resultado la formación de un precipitado amarillo. El sólido se recogió en un embudo Buchner, se enjuagó con agua (2 x 1,0 l) y se secó en un horno de convección a 50° C durante 4 h. El precipitado (proporción 85:15) se suspendió en acetato de etilo al 20% en metil terc-butil éter (3,0 l), se sometió a reflujo durante 1 h, y se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de un embudo fritado de porosidad media y se secó en un horno de vacío a 50° C durante 5 h para proporcionar el producto N-metilado deseado (120 g) con un 96% de pureza. El producto se volvió a suspender de nuevo en acetato de etilo al 20% en metil terc-butil éter (3,0 l), se calentó a reflujo durante 1 h, se filtró y se secó al vacío como se ha descrito anteriormente para proporcionar 6-bromo-8-((4-metoxibencil)oxi)-1-metilquinoxalin-2(1H)-ona (90 g) con una pureza del 99% como un sólido amarillo. Además, el filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 330 g, gradiente lineal, 0%^-60% de acetato de etilo/diclorometano) para proporcionar una cosecha adicional del producto deseado 3 (13 g, 99% de pureza). 1H NMR (300 MHz, CDCh) 88.26 (s, 1H), 7.63 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.40-7.29 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.05-6.83 (m, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.84 (d, J=1.7 Hz, 6H). ESI-MS m/z calc. 374.03, encontrado 375.05 (M+1).
Paso 6: 8-((4-metoxibencil)oxi)-1-metil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona
Se desoxigenó una mezcla de 6-bromo-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-1-metil-quinoxalin-2-ona (103 g, 270,9 mmol) y morfolina (36 ml, 412,8 mmol) en dioxano (2,0 l) burbujeando una corriente de gas nitrógeno a través de la solución durante 10 minutos. Se añadieron secuencialmente acetato de paladio (II) (1,3 g, 5,790 mmol), RuPhos (5,5 g, 11,79 mmol) y carbonato de cesio (200 g, 613,8 mmol). La mezcla de la reacción se desoxigenó con una corriente de gas nitrógeno durante 10 minutos adicionales. La mezcla de la reacción resultante se calentó a 80° C y se agitó durante 14 h. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida para eliminar el dioxano. Se añadió agua fría (2,5 l) y se formó un precipitado amarillo. El precipitado se recogió en un embudo Buchner, se lavó con agua (500 ml) y se secó en un horno de convección. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (columna de 4 x 330 g, gradiente lineal, 0%-10% de metanol/diclorometano) para proporcionar 8-((4-metoxibencil)oxi)-1-metil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona (68 g, 66%) como un sólido amarillo. 1H NMR (300 MHz, CDCla) 88.25 (s, 1H), 7.41-7.28 (m, 2H), 7.03-6.89 (m, 3H), 6.82 (d, J=2.7 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.93-3.87 (m, 4H), 3.86 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.46-2.82 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 381.17, encontrado 382.21 (M+1).
Paso 7: 8-hidroxi-1-metil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona
Se disolvió 8-((4-metoxibencil)oxi)-1-metil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona (13,90 g, 36,44 mmol) en diclorometano (250 ml). Se añadió ácido trifluoroacético (31,0 ml, 402 mmol) y la solución color marrón oscuro resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. El solvente se evaporó al vacío y el residuo restante se disolvió en diclorometano y se filtró sobre un tapón de gel de sílice. El tapón se eluyó primero con diclorometano para eluir las impurezas de alto Rf, que se desecharon. El eluyente se cambió a acetona, dando como resultado una elución de una banda amarillo-naranja. Esta banda se recogió y se concentró hasta la sequedad para proporcionar 8-hidroxi-1-metil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona (8,89 g, 50% de rendimiento). 1H NMR (300 Mhz DMSO-d6) 8 10.23 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 6.77 (d, J=3.1 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.81-3.70 (m, 4H), 3.19-2.99 (m, 4H).
Figure imgf000077_0001
Síntesis de 8-hidroxi-1,3-dimetil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona
Paso 1: 5-fluoro-3-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-nitro-anilina
A una solución de (4-metoxifenil)metanol (4,17 g, 30,18 mmol) en tetrahidrofurano (52,4 ml) se le añadió hidruro de sodio (dispersión al 60% en aceite mineral; 1,28 g, 32,00 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 10 minutos, se trató con 3,5-difluoro-2-nitro-anilina (5 g, 28,72 mmol) y se agitó 1 h adicional. La mezcla se repartió cuidadosamente entre acetato de etilo y agua, y se añadió gota a gota ácido clorhídrico IN hasta que el color rojo se disipó a amarillo/naranja. Los extractos orgánicos se recogieron, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna ISCO de 330 g, gradiente lineal con 0-25% de acetato de etilo/heptano) para proporcionar 5-fluoro-3-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-nitro-anilina como un sólido amarillo-naranja.
Paso 2: 3-[(4-metoxifenil)metoxi]-5-morfolino-2-nitro-anilina
Se calentó una solución de 5-fluoro-3-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-nitro-anilina (4,64 g, 15,88 mmol) y morfolina (7,0 ml, 80,27 mmol) en sulfóxido de dimetilo (13,6 ml) a 100° C durante 2,5 h. La mezcla se repartió entre acetato de etilo y agua. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para proporcionar 3-[(4-metoxifenil)metoxi]-5-morfolino-2-nitro-anilina (5,70 g, 100% de rendimiento) como un sólido naranja que se usó sin manipulación adicional. ESI-MS m/z calc. 359,15, encontrado 360,17 (M+1).
Paso 3: 3-[(4-metoxifenil)metoxi]-5-morfolino-benceno-1,2-diamina
Se agitó durante la noche una mezcla de 3-[(4-metoxifenil)metoxi]-5-morfolino-2-nitro-anilina (5,66 g, 15,75 mmol), cloruro de amonio (1,53 g, 28,60 mmol), zinc (5,59 g, 85,46 mmol) y TPGS-750-M al 2% en agua (31 ml). Se añadió Celite para absorber agua, seguido de acetato de etilo. La mezcla se filtró y el tapón de celite se enjuagó con más acetato de etilo. El filtrado combinado se concentró y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 330 g; gradiente lineal del 0-5% de metanol/diclorometano) para proporcionar 3-[(4-metoxifenil)metoxi]-5-morfolino-benceno-1,2-diamina (3,41 g, 66% de rendimiento) como un sólido rojo. ESI-MS m/z calc. 329,17, encontrado 330,19 (M+1).
Paso 4: 8-[(4-metoxifenil)metoxi]-3-metil-6-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona
Se calentó una mezcla de 3-[(4-metoxifenil)metoxi]-5-morfolino-benceno-1,2-diamina (315 mg, 0,956 mmol), piruvato de etilo (212 pl, 1,908 mmol) y metanol (3,0 ml) en un vial sellado a 65° C durante 2 horas. De la mezcla de la reacción precipitó un sólido. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se añadió agua y la mezcla se agitó durante 30 minutos. El sólido se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó al vacío durante la noche para proporcionar una mezcla regioisomérica de productos (365 mg, proporción 1,7:1 favoreciendo el compuesto deseado mostrado en el esquema anterior). La mezcla resultante se purificó mediante SFC para proporcionar el isómero deseado 8-((4-metoxifenil)metoxi)-3-metil-6-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona (110 mg) y el isómero no deseado 5-((4-metoxibencil)oxi)-3-metil-7-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona (64 mg).
Datos para 8-((4-metoxibencil)oxi)-3-metil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 11.56 (s, 1H), 7.55-7.46 (m, 2H), 6.98 (d, J=2.3 Hz, 1H), 6.95-6.89 (m, 2H), 6.72 (d, J=2.3 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.74 (m, 7H), 3.10 (m, 4H), 2.78 (q, J=7.4 Hz, 2H), 1.23-1.14 (t, 3H). ESI-MS m/z calc. 381.17, encontrado 382.17 (M+1).
Datos para 5-((4-metoxibencil)oxi)-3-metil-7-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 11.96 (s, 1H), 7.49-7.38 (m, 2H), 7.00-6.90 (m, 2H), 6.60 (d, J=2.4 Hz, 1H), 6.21 (d, J=2.4 Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 3.75 (m, 7H), 3.18 (m, 4H), 2.69 (q, J=7.4 Hz, 2H), 1.17 (t, J=7.4 Hz, 3H). ESI-MS m/z calc. 381.17, encontrado 382.17 (M+1).
Paso 5: 8-((4-metoxibencil)oxi)-1,3-dimetil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona
Se trató una mezcla de 8-[(4-metoxifenil)metoxi]-3-metil-6-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona (110 mg, 0,274 mmol), carbonato de potasio (183 mg, 1,324 mmol) y acetona (3,0 ml) con yoduro de metilo (21 pl, 0,337 mmol). La mezcla de la reacción resultante se selló y se agitó a 60° C durante la noche. La mezcla se repartió entre acetato de etilo y agua. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 4 g; gradiente lineal del 0-10% de metanol/diclorometano) para proporcionar 8-((4-metoxibencil)oxi)-1,3-dimetil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona (94 mg, 82%) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 87.48-7.41 (m, 2H), 7.04 (d, J=2.7 Hz, 1H), 6.99-6.94 (m, 2H), 6.79 (d, J=2.6 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H), 3.76 (m, 10H), 3.16 (m, 4H), 2.38 (s, 3H). ESI-MS m/z calc. 395.18, encontrado 396.26 (M+1).
Paso 6: 8-hidroxi-1,3-dimetil-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona
Se trató una solución de 8-[(4-metoxifenil)metoxi]-1,3-dimetil-6-morfolino-quinoxalin-2-ona (88 mg, 0,177 mmol) agitada en diclorometano (5,0 ml) con ácido trifluoroacético. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de la reacción se concentró y el residuo bruto se usó sin purificación adicional. ESI-MS m/z calc. 275,13, encontrado 276,14 (M+1).
Figure imgf000078_0001
Síntesis de 1-etil-8-hidroxi-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona:
Paso 1: 8-((4-metoxibencil)oxi)-6-morfolinoquinoxalin-2(1H)-ona
A una solución de 3-[(4-metoxifenil)metoxi]-5-morfolino-benceno-1,2-diamina (7,51 g, 22,80 mmol) en metanol (877 ml) se le añadió glioxalato de etilo (9,3 ml de solución al 50% p/v en tolueno, 45,55 mmol). La solución resultante se selló y se calentó a 65° C durante 2 horas. De la mezcla de la reacción precipitó un sólido. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadió agua. El sólido se recogió por filtración, se lavó con agua, se trituró con isopropanol y se secó al vacío para proporcionar una mezcla regioisomérica de productos (6,34 g). La mezcla resultante se purificó mediante SFC [columna preparatoria IB usando etanol al 40% (amoníaco 5 mM)] para obtener el regioisómero deseado, 8-[(4-metoxifenil)metoxi]-6-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona (3,48 g), así como la no deseada, 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona (2,35 g).
Datos para 8-[(4-metoxifenil)metoxi]-6-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 11.80 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.55-7.47 (m, 2H), 7.06 (d, J=2.4 Hz, 1H), 6.96-6.89 (m, 2H), 6.76 (d, J=2.3 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 3.76 (m, 7H), 3.12 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 367.15, encontrado 368.09 (M+1).
Datos para 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 12.08 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.46-7.37 (m, 2H), 7.02-6.92 (m, 2H), 6.63 (d, J=2.3 Hz, 1H), 6.19 (d, J=2.3 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.77 (m, 7H), 3.24 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 367.15, encontrado 368.09 (M+1).
Paso 2: 1-etil-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-6-morfolino-quinoxalin-2-ona
A una solución de 8-[(4-metoxifenil)metoxi]-6-morfolino-1H-quinoxalin-2-ona (150 mg, 0,408 mmol) en acetona (4,3 ml) se le añadió carbonato de potasio (273 mg, 1,975 mmol) y yodoetano (40 pl, 0,500 mmol). La mezcla de la reacción resultante se selló y se agitó a 60° C en un vial durante la noche. La mezcla se repartió entre acetato de etilo y agua. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 4 g; gradiente lineal del 0-10% de metanol/diclorometano) para proporcionar 1-etil-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-6-morfolino-quinoxalin-2-ona (55 mg, 32% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DIVISOR) 87.46 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.16 (d, J=2.5 Hz, 1H), 6.99-6.93 (m, 2H), 6.86 (d, J=2.5 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.43 (q, J=7.0 Hz, 2H), 3.78 (m, 4H), 3.76 (s, 3H), 3.23 (m, 4H), 1.40 (t, J=7.1 Hz, 3H). ESI-MS m/z calc. 395.18, encontrado 396.23 (M+1).
Paso 3: 1-etil-8-hidroxi-6-morfolino-quinoxalin-2-ona
A una solución de 1-etil-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-6-morfolino-quinoxalin-2-ona (50 mg, 0,1264 mmol) en diclorometano (aproximadamente 1,0 ml) se le añadió ácido trifluoroacético. La solución de la reacción roja resultante se concentró y se usó tal cual sin manipulación adicional. ESI-MS m/z calc. 275,13, encontrado 276,14 (M+1).
Figure imgf000079_0001
6-bromo-8-hidroxi-1-metilquinoxalin-2(1H)-ona
Se calentó una solución de 6-bromo-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-1-metil-quinoxalin-2-ona (4 g, 10,66 mmol) en ácido acético (56 ml) a 100° C durante 5 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se dejó reposar durante la noche, dando como resultado la formación de un precipitado amarillo. El sólido se recogió mediante filtración al vacío, se lavó con éter dietílico y se secó al vacío para proporcionar 6-bromo-8-hidroxi-1 -metil-quinoxalin-2-ona (1,92 g, 69% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 88.21 (s, 1H), 7.44 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.19 (d, J=2.3 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H). ESI-MS m/z calc. 253.97, encontrado 254.97 (M+1).
Figure imgf000079_0002
8-hidroxi-1-metil-6-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)quinoxalin-2-ona
Se combinaron 6-bromo-8-hidroxi-1-metil-quinoxalin-2-ona (312 mg, 1,223 mmol), 6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptano (sal de clorhidrato; 201 mg, 1,482 mmol), RuPhos-G3-paladaciclo (52 mg, 0,062 mmol) y RuPhos (29 mg, 0,062 mmol) en un vial sellado bajo nitrógeno. Se añadió bis(trimetilsilil)amida de litio (3 ml de solución 1,0 M en tetrahidrofurano, 3,000 mmol) y el vial se calentó a 65° C durante la noche. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo y se filtró. El filtrado se concentró y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice funcionalizada con amino (cartucho de 12 g, gradiente lineal del 0-10% de metanol/diclorometano) para proporcionar 8-hidroxi-1-metil-6-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)quinoxalin-2-ona (214 mg, 64% de rendimiento). ESI-MS m/z calc. 273,11, encontrado 274,24 (M+1).
Figure imgf000079_0003
Síntesis de 6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-8-hidroxi-1-metil-quinoxalin-2-ona:
Paso 1: 6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-8-((4-metoxibencil)oxi)-1-metilquinoxalin-2(1H)-ona
Se desgasificó una mezcla de 6-bromo-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-1-metil-quinoxalin-2-ona (4,0 g, 10,66 mmol), 2-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (2,72 g, 12,95 mmol), carbonato de sodio (8 ml de una solución acuosa 2,0 M, 16,00 mmol) y dioxano (40 ml) burbujeando gas nitrógeno a través de la mezcla durante 10 min. Se añadió [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]-dicloropaladio(II) (complejo de diclorometano; 881 mg, 1,079 mmol). La mezcla de la reacción resultante se desgasificó durante 5 minutos adicionales, luego se calentó a 85° C durante 4 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre agua y acetato de etilo. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 330 g, gradiente lineal del 0-50% de acetato de etilo/heptano) para proporcionar 6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-1-metil-quinoxalin-2-ona (2,81 g, 69% de rendimiento) como un sólido amarillo. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 88.21 (s, 1H), 7.52-7.42 (m, 4H), 7.02-6.94 (m, 2H), 6.48-6.42 (m, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.27 (q, J=2.8 Hz, 2H), 3.85 (t, J=5.5 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.77 (s, 3H). ESI-MS m/z calc. 378.16, encontrado 379.17 (M+1).
Paso 2: 6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-8-hidroxi-1-metil-quinoxalin-2-ona
A una solución de 6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-8-[(4-metoxifenil)metoxi]-1-metil-quinoxalin-2-ona (1,81 g, 4,783 mmol) en diclorometano (20 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (5,0 ml, 64,90 mmol). La solución de la reacción resultante se agitó durante 2 horas y se concentró. El residuo bruto se repartió entre acetato de etilo y bicarbonato de sodio acuoso saturado. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. Se añadió diclorometano, lo que dio como resultado la formación de un precipitado marrón, que se recogió mediante filtración al vacío para proporcionar 6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-8-hidroxi-1-metil-quinoxalin-2-ona (1,10 g, 82% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 810.40 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.32 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.20 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.26 (dp, J=3.1, 1.5 Hz, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.24 (q, J=2.8 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (t, J=5.5 Hz, 2H), 2.48-2.40 (m, 2H). ESI-MS m/z calc. 258.10, encontrado 259.16 (M+1).
SECCIÓN II: PREPARACIÓN DE PRODUCTOS INTERMEDIOS DE MESILATO
En la Sección II se describen procedimientos sintéticos para la preparación de productos intermedios de mesilato. Estos productos intermedios se usan, junto con la selección adecuada del producto intermedio 8-hidroxi-1-metilquinoxalin-2(1H)-ona (descrito en la Sección I), para preparar los compuestos de la Tabla A utilizando los métodos descritos en la Sección III.
Figure imgf000080_0001
Metanosulfonato de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-iloxi)ciclohexilo
Paso 1: (1,4-trans)-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)ciclohexan-1-ol
A una solución de (1,4-trans)-ciclohexano-1,4-diol (70 g, 602,6 mmol) e imidazol (130 g, 1,910 mol) en diclorometano (1,5 l) se le añadió terc-butil-cloro-dimetilsilano (100 g, 663,5 mmol) en una porción. La mezcla de la reacción resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 24 h, momento en el que el análisis por TLC reveló laa mezcla de material de partida, producto deseado y producto de bis-adición. La mezcla de la reacción se vertió en agua (300 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y salmuera (100 ml), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (columna de gel de sílice de 800 g, gradiente lineal del 0-50% de acetato de etilo en heptano) para proporcionar (1,4-trans)-4-[terc-butil(dimetil)silil]oxiciclohexanol (58 g, 41%) como un sólido blanco. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 4.44 (d, J=4.1 Hz, 1H), 3.69-3.50 (m, 1H), 3.48-3.35 (m, 1H), 1.84-1.60 (m, 4H), 1.37-1.09 (m, 4H), 0.84 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Paso 2: 2-(((1,4-trans)-4-((terc-butMdimetNsNN)oxi)ddohexM)oxi)pirimidma
A una solución a 2° C de (1,4-trans)-4-[terc-butil(dimetil)silil]oxicidohexanol (13,7 g, 58,86 mmol) y 2-doropirimidina (9 g, 74,65 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) se le añadió hidruro de sodio (5 g de suspensión al 60% p/p en aceite mineral, 125,0 mmol) en una porción. La mezcla de la reacción resultante se dejó calentar a temperatura ambiente durante 30 minutos y se continuó agitando durante 10 horas adicionales. La mezcla de la reacción se vertió en agua helada (400 ml), dando como resultado la precipitación de un sólido color tostado. El sólido se recogió mediante filtración al vacío, se enjuagó con agua (3 x 100 ml) y se secó en un horno de vacío a 50° C durante 16 h para proporcionar (1,4-trans)-terc-butil-dimetil-(4-pirimidin-2-iloxiciclo-hexoxi)silano (18,8 g, 95% de pureza, 98% de rendimiento), que se usó sin purificación adicional. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 88.57 (d, J=4.8 Hz, 2H), 7.08 (t, J=4.8 Hz, 1H), 5.04-4.80 (m, 1H), 3.90-3.68 (m, 1H), 2.11-1.95 (m, 2H), 1.93-1.76 (m, 2H), 1.64-1.47 (m, 2H), 1.46-1.30 (m, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.05 (s, 6H).
Paso 3: (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-iloxi)cidohexan-1-ol
A una solución de (1,4-trans)-terc-butil-dimetil-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)silano (26 g, 83,44 mmol) en una mezcla de tetrahidrofurano (150 ml) y metanol (6 ml) se le añadió trihidrofluoruro de trietilamina (40 g, 248,1 mmol). La mezcla de la reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de la reacción se enfrió a 0° C con un baño de hielo y se añadió una solución acuosa de hidróxido de amonio (30 g del 30% p/p, 256,8 mmol), seguido de agua (100 ml) y acetato de etilo (200 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo (100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 ml) y salmuera (100 ml), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar (1,4-trans)-4-pirimidin-2-iloxiciclohexanol (16,2 g, 99%) como un aceite viscoso de color amarillo pálido.
1H NMR (300 MHz, CDCla) 88.48 (d, J=4.8 Hz, 2H), 6.89 (t, J=4.8 Hz, 1H), 5.09-4.87 (m, 1H), 3.91-3.62 (m, 1H), 2.29-2.10 (m, 2H), 2.10-1.95 (m, 2H), 1.68-1.36 (m, 4H).
Paso 4: Metanosulfonato de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-iloxi)ciclohexilo
A una solución a 0° C de (1,4-trans)-4-pirimidin-2-iloxiciclohexanol (16,2 g, 82,6 mmol) y diisopropiletilamina (40 ml, 229,6 mmol) en diclorometano se le añadió una solución de cloruro de metanosulfonilo (8 ml, 103,4 mmol) en diclorometano (50 ml) gota a gota durante 25 minutos. La mezcla de la reacción resultante se agitó durante 30 minutos a 0° C. La mezcla de la reacción se inactivó mediante la adición de bicarbonato de sodio acuoso saturado (100 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo adicionalmente con diclorometano (100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con bicarbonato de sodio acuoso saturado, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 330 g, gradiente lineal del 0-50% de acetato de etilo/diclorometano) para proporcionar metanosulfonato de (1,4-trans)-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexilo) (19,4 g, 85% de rendimiento) como un sólido blanco.
1H NMR (400 MHz, CDCla) 88.49 (d, J=4.8 Hz, 2H), 6.91 (t, J=4.8 Hz, 1H), 5.25-5.02 (m, 1H), 4.98-4.77 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.33-2.04 (m, 4H), 1.95-1.72 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 272,32, encontrado 273,07 (M+1).
Figure imgf000081_0001
Metanosulfonato de (1,4-trans)-4-((5-metoxipirimidin-2-il)oxi)ciclohexilo
Preparado mediante la misma secuencia sintética de 4 pasos descrita anteriormente para el metanosulfonato de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-iloxi)ciclohexilo. 1H NMR (400 MHz, CDCh) 88.17 (s, 2H), 5.13-4.95 (m, 1H), 4.94-4.73 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.02 (s, 3H), 2.37-1.99 (m, 4H), 1.94-1.68 (m, 4H).
Figure imgf000082_0001
Metanosulfonato de (1,4-trans)-4-((2-metNpirimidm-4-N)oxi)ddohexNo
Paso 1: 4-(((1,4-trans)-4-((terc-butMdimetNsNM)oxi)ddohexM)oxi)-2-metNpmmidma
A una solución a 2° C de (1,4-trans)-ciclohexano-1,4-diol (2 g, 17,05 mmol) y 4-doro-2-metil-pirimidina (1,5 g, 11,67 mmol) en N,N-dimetilformamida (10 ml) se le añadió hidruro de sodio (950 mg de una suspensión al 60% p/p en aceite mineral, 23,75 mmol) en una porción. Se retiró el baño de enfriamiento y la mezcla de la reacción se calentó a 60° C durante 2 horas. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en agua enfriada con hielo (60 ml), dando como resultado la formación de un precipitado de color tostado. El sólido se recogió mediante filtración al vacío, se enjuagó con agua (2 x 10 ml) y se secó en un horno de vacío a 60° C durante 14 h para proporcionar el bis-aducto no deseado, 2-metil-4-[4-(2-metilpirimidin-4-il)oxiciclohexoxi]pirimidina (1,1 g, 31%). El filtrado de la filtración al vacío se extrajo con 2-metil-tetrahidrofurano (4 x 60 ml) y los filtrados combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar un aceite amarillo que se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente lineal del 0-100% de acetato de etilo/heptano) para dar el producto deseado, (1,4-trans)-4-(2-metilpirimidin-4-il)oxiciclohexanol (1,23 g, 95% de pureza, 48% de rendimiento), como un sólido blanco. 1H NMR (300 MHz, CD30D) 88.39-8.18 (m, 1H), 6.76-6.38 (m, 1H), 5.24-5.02 (m, 1H), 3.81-3.62 (m, 1H), 3.54 (s, 1H), 2.66-2.39 (m, 3H), 2.26-1.80 (m, 4H), 1.69-1.15 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 208.26, encontrado 209.13 (M+1).
Paso 2
Se trató una solución de terc-butil-dimetil-[4-(2-metilpirimidin-4-il)oxiciclohexoxi]silano (17,82 g, 54,70 mmol) en alcohol isopropílico (225 ml) con ácido clorhídrico concentrado (16 ml de solución 12 M solución, 192,0 milimoles). La mezcla de la reacción resultante se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida y el residuo se destiló azeotrópicamente con acetato de etilo (2 x 200 ml) para proporcionar un sólido de color tostado. El residuo bruto se purificó adicionalmente por trituración con metil tercbutil éter (100 ml) y se secó en horno de vacío a 50° C durante 14 h para proporcionar (1,4-trans)-4-(2-metilpirimidin-4-il)oxiciclohexanol (11,57 g, 98%) como un sólido tostado, que se usó sin purificación adicional. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 88.62 (d, J=6.6 Hz, 1H), 7.07 (d, J=6.6 Hz, 1H), 5.30-4.95 (m, 1H), 3.64-3.42 (m, 1H), 2.66 (s, 3H), 2.17­ 1.95 (m, 2H), 1.95-1.75 (m, 2H), 1.65-1.43 (m, 2H), 1.43-1.22 (m, 2H).
Paso 3: Metanosulfonato de (1,4-trans)-4-((2-metilpirimidin-4-il)oxi)cidohexilo
La formación de mesilato se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente para la preparación de metanosulfonato de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-iloxi)ciclohexilo. Se usó (1,4-trans)-4-(2-metilpirimidin-4-il)oxiciclohexanol como material de partida para proporcionar metanosulfonato de (1,4-trans)-4-((2-metilpirimidin-4-il)oxi)ciclohexilo (85% de rendimiento) como un sólido de color tostado. 1H NMR (300 MHz, CDCh) 88.31 (d, J=5.8 Hz, 1H), 6.47 (d, J=5.8 Hz, 1H), 5.35-5.13 (m, 1H), 5.00-4.75 (m, 1H), 3.04 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 2.28-2.03 (m, 4H), 1.96-1.64 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 286.35, encontrado 287.07 (M+1).
Figure imgf000082_0002
Metanosulfonato de (1,4-trans)-4-((5-metMpirimidm-2-M)oxi)cidohexMo
Preparado a través del esquema sintético que se ha mostrado anteriormente usando las condiciones de reacción descritas anteriormente en esta sección. 1H NMR (300 MHz, CDCI3) 88.31 (s, 2H), 5.17-4.99 (m, 1H), 4.97­ 4.74 (m, 1H), 3.02 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.20-2.01 (m, 4H), 1.94-1.71 (m, 4H). ESI-MS m/z calc. 286.35, encontrado 287.16 (M+1).
Figure imgf000083_0001
Metanosulfonato de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexilo
Paso 1: (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexan-1-ol
Se disolvieron 2-cloropirimdina (70,30 g, 613,8 mmol) y trans-1,4-aminociclohexanol (71,77 g, 604,5 mmol) en isopropanol (400 ml). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (120 ml, 689 mmol) y la solución resultante se calentó a reflujo durante la noche. El solvente se evaporó a presión reducida y el sólido que quedó se suspendió en diclorometano y se filtró a través de un tapón de gel de sílice. El tapón de sílice se eluyó primero con diclorometano para eluir el material de partida residual, luego con acetato de etilo para eluir el producto deseado. El filtrado de la elución con acetato de etilo se evaporó a presión reducida para proporcionar (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexan-1-ol como un sólido blanco. 1H NMR (300 MHz, CDCh) 88.25 (d, J=4.8 Hz, 2H), 6.50 (t, J=4.8 Hz, 1H), 5.16 (d, J=7.4 Hz, 1H), 3.95-3.54 (m, 2H), 2.25-1.91 (m, 5H), 1.60-1.13 (m, 4H).
Paso 2: metanosulfonato de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexilo
A una suspensión a 0° C de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexan-1-ol (52 g, 55,53 mmol) en diclorometano (727 ml) se le añadió diisopropiletilamina (90 ml, 516,7 mmol). Se añadió cloruro de metanosulfonilo (35 ml, 452,2 mmol) mediante una jeringuilla a una velocidad que permitió que la temperatura interna permaneciera a o por debajo de 20° C. La reacción se agitó durante 1 hora adicional, se diluyó con diclorometano y se lavó con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se secó (MgSO4) y se filtró a través de un tapón corto de gel de sílice. El tapón se eluyó con 20% de acetato de etilo/diclorometano y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar un sólido color tostado. El sólido se disolvió en una cantidad mínima de diclorometano. Se añadió pentano hasta que el producto empezó a cristalizar. La mezcla se enfrió en un baño de hielo seco/acetona y el sólido se recogió mediante filtración al vacío, se lavó con pentano y se secó al vacío para proporcionar metanosulfonato de (1,4-trans)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexilo. (59,72 g, 82% de rendimiento) como un sólido color tostado claro. 1H NMR (300 MHz, CDCla) 88.27 (d, J=2H), 6.54 (t, J=4.8 Hz, 1H), 5.13 (d, J=7.6 Hz, 1H), 4.69 (tt, J=10.5, 4.0 Hz, 1H), 3.98-3.73 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.21 (dd, J=9.3, 4.2 Hz, 4H), 1.91-1.67 (m, 2H), 1.51-1.25 (m, 2H).
Figure imgf000083_0002
Las rutas sintéticas para acceder a más mesilatos del tipo que se ha mostrado anteriormente donde R es igual a un anillo aromático sustituido o no sustituido, un anillo heteroaromático sustituido o no sustituido o un carbamato se han informado con anterioridad (US 20140275059 A1) y, en consecuencia, no se describirán aquí. SECCIÓN III: COMPUESTOS PREPARADOS USANDO DESPLAZAMIENTO DE MESILATO COMO PASO FINAL Los compuestos descritos en la Sección III se prepararon a partir de la selección apropiada de 8-hidroxiquinoxalinona (descrito en la Sección I) y el producto intermedio de mesilato (descrito en la Sección II) usando los métodos siguientes. Los datos analíticos de los compuestos preparados por los métodos de la Sección III se proporcionan en la Tabla A.
Figure imgf000084_0001
1-metM-6-morfolmo-8-(((1,4-cis)-4-(pinmidm-2-Mammo)cidohexM)oxi)qumoxaMn-2(1H)-ona
A una solución de 8-hidroxi-1-metil-6-morfolino-quinoxalin-2-ona (7,65 g, 15,63 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) se le añadió metanosulfonato de trans-4-(pirimidin-2-ilamino)cidohexilo (30,34 g, 111,8 mmol) y carbonato de cesio (35,64 g, 109,4 mmol). La mezcla se calentó a 60° C durante la noche. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se filtró sobre Celite. El tapón de Celite se lavó con N,N-dimetilformamida y el filtrado se evaporó al vacío para dar un aceite de color oscuro que solidificó a vacío alto. El sólido se disolvió en diclorometano, se filtró sobre un tapón de gel de sílice y se eluyó con 5% de metanol/acetato de etilo. El filtrado se evaporó para dar un sólido de color amarillo pardusco. El sólido se disolvió en diclorometano y se purificó por cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 330 g; isocrático 3% de metanol/acetato de etilo) para proporcionar un sólido amarillo brillante. El sólido se lavó con una pequeña cantidad de acetato de etilo que se había enfriado previamente en un baño de hielo seco/acetona, seguido de heptano. Finalmente, el material se secó a alto vacío a 60° C para proporcionar 1-metil-6-morfolino-8-(((1,4-cis)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexil)oxi)quinoxalina-2(1H)-ona.
Método A-B
Figure imgf000084_0002
1-metM-6-morfolmo-8-(((1,4-ds)-4-(pinmidm-2-Moxi)ddohexM)oxi)qumoxaMn-2(1H)-ona
A una solución de 8-hidroxi-1-metil-6-morfolino-quinoxalin-2-ona (34,5 mg, 0,132 mmol) en N,N-dimetilformamida (690 jl) se le añadió metanosulfonato de trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexilo) (68,0 mg, 0,247 mmol) y carbonato de cesio (215 mg, 0,660 mmol). La mezcla se calentó a 90° C durante 5 horas. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre diclorometano y agua. La fase orgánica se recogió y se evaporó. El residuo bruto se disolvió en DMSO mínimo y se purificó mediante HPLC preparativa C18 (acetonitrilo/agua con modificador de ácido trifluoroacético), y las fracciones relevantes se combinaron y concentraron hasta la sequedad. El material obtenido de este modo se disolvió en diclorometano y se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado. La fase orgánica se recogió, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró para proporcionar 1-metil-6-morfolino-8-(((1,4-cis)-4-(pirimidin-2-iloxi)ciclohexil)oxi)quinoxalin-2(1H)-ona (16,1 mg, 25% de rendimiento).
Nota: Las moléculas preparadas por este método también han sido purificadas por cromatografía en gel de sílice (metanol/diclorometano).
Método A-C
Figure imgf000084_0003
1,3-dimetM-6-morfoMno-8-(((1,4-cis)-4-(pinmidm-2-Mammo)cidohexM)oxi)qumoxalm-2(1H)-ona
A una mezcla de 8-hidroxi-1,3-dimetil-6-morfolino-quinoxalin-2-ona (48,7 mg, 0,177 mmol) y carbonato de cesio (572 mg, 1,756 mmol) en N,N-dimetilformamida (1,1 ml) se le añadió metanosulfonato de (transH4-(pirimidin-2-ilamino)cidohexilo] (147 mg, 0,542 mmol). La mezcla resultante se agitó a 100° C durante la noche. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre metil terc-butil éter y agua. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con metil terc-butil éter. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 4 g usando un gradiente lineal del 0-10% de metanol/diclorometano; seguido de una segunda purificación en gel de sílice usando un gradiente lineal del 0-100% de acetato de etilo/heptano) para proporcionar 1,3-dimetil-6-morfolino-8-(((1,4-cis)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexil)oxi)-quinoxalin-2(1H)-ona (17,3 mg, 21% de rendimiento).
Nota: Las moléculas preparadas por este método también se han purificado mediante HPLC preparativa C18 de fase inversa (acetonitrilo/agua con ácido trifluoroacético o modificador de hidróxido de amonio) o cromatografía en gel de sílice derivatizada C18 de fase inversa (acetonitrilo/agua con modificador de ácido trifluoroacético).
Método A-D
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6-bromo-1 -metil-8-[(1,4-cis)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexoxi]quinoxalin-2-ona
A una solución de 6-bromo-8-hidroxi-1-metil-quinoxalin-2-ona (954 mg, 3,740 mmol) y metanosulfonato de [4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexilo] (3,1 g, 11,42 mmol) en dimetil sulfóxido (7,0 ml) se le añadió carbonato de rubidio (2,49 g, 10,78 mmol). La mezcla resultante se agitó a 80° C durante la noche. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre diclorometano y agua. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con diclorometano. Los extractos orgánicos se concentraron y se secaron durante la noche al vacío. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 80 g, gradiente lineal del 0-5% de metanol/diclorometano) para proporcionar 6-bromo-1-metil-8-[4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexoxi]quinoxalin-2-ona (700 mg, 42% de rendimiento).
Tabla A. Com uestos rearados usando deslazamiento de mesilato como aso final.
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(continuación)
Figure imgf000087_0001
(continuación)
Figure imgf000088_0001
(continuación)
Figure imgf000089_0001
(continuación)
Figure imgf000090_0001
continuación
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SECCION IV: PREPARACION DE PRODUCTOS INTERMEDIOS DE BROMO-QUINOXALINONA
La Sección IV contiene procedimientos sintéticos para la preparación de productos intermedios de 6-bromo-1-metilquinoxalin-2(I)-ona funcionalizados que no se describen en otra parte de esta patente. Estos productos intermedios se usaron, junto con la selección apropiada de amina o compañero de acoplamiento de éster borónico, para preparar los compuestos de la Tabla B.
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Se calentó Una mezcla de 6-bromo-8-hidroxi-1-metil-quinoxalin-2-ona (299 mg, 1,172 mmol), metanosulfonato de (4-pirimidin-2-iloxiciclohexilo) (517 mg, 1,899 mmol), carbonato de cesio (501 mg, 1,538 mmol) y N,N-dimetilformamida (6,0 ml) a 100° C durante 4 horas. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se purificó mediante cromatografía de fase inversa (cartucho de gel de sílice derivatizado Isco RediSep Rf C18 de 100 g; gradiente lineal del 25-60% de acetonitrilo/agua con modificador de ácido trifluoroacético). Las fracciones que contenían el producto se repartieron entre acetato de etilo y bicarbonato sódico saturado. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para proporcionar 6-bromo-1-metil-8-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinoxalin-2-ona (320,6 mg, 63% de rendimiento). 1 H Nm R (300 MHz, DMSO-d6) 88.60 (d, J=4.8 Hz, 2H), 8.25 (s, 1H), 7.58 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.51 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.12 (t, J=4.8 Hz, 1H), 5.22-5.09 (m, 2H), 4.85-4.72 (m, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.03-1.85 (m, 8H). ESI-MS m/z calc. 430.06, encontrado 431.16 (M+1).
Figure imgf000092_0002
6-bromo-1-metil-8-(((1,4-cis)-4-((2-metilpirimidin-4-il)oxi)ciclohexil)oxi)quinoxalin-2(1H)-ona
Preparado por un procedimiento análogo al descrito anteriormente para la 6-bromo-1-metil-8-((1,4-cis)-4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinoxalin-2-ona. 1H NMR (400 MHz, CDCh) 88.36 (d, J=5.8 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.65 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.29 (s, 8H), 6.57 (d, J=5.8 Hz, 1H), 5.43-5.35 (m, 1H), 4.61-4.51 (m, 1H), 4.03 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 2.18-1.86 (m, 8H). ESI-MS m/z calc. 444.08, encontrado 445.11 (M+1).
SECCION V: COMPUESTOS PREPARADOS USANDO EL ACOPLAMIENTO DE BUCHWALD O EL ACOPLAMIENTO DE SUZUKI COMO PASO FINAL
Los compuestos descritos en esta sección se prepararon a partir de la elección adecuada de 6-bromo-1-metilquinoxalin-2(1H)-ona funcionalizada (descrita en la Sección IV) y amina (en el caso de los acoplamientos de Buchwald) o éster borónico (en el caso de acoplamientos Suzuki) usando los métodos que se describen a continuación. Los datos analíticos de los compuestos de esta sección se proporcionan en la Tabla B.
Método B-A
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6-(6-oxa-3-azabiddo[3.1.1]heptan-3-M)-1-metM-8-(((1,4-ds)-4-(pirimidm-2-Mammo)-ddohexM)oxi)qumoxaMn-2(1H)-ona
Se agitó a 100° C durante la noche una mezcla de 6-bromo-1-metil-8-[4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexiloxi]quinoxalin-2-ona (74 mg, 0,167 mmol), 6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptano (sal de clorhidrato; 61 mg, 0,450 mmol), carbonato de cesio (263 mg, 0,807 mmol), RuPhos-G3-Palladaciclo (30 mg, 0,036 mmol), RuPhos (17 mg, 0,036 mmol) y dioxano (700 jl). La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre acetato de etilo y agua. Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 12 g, gradiente lineal del 0-5% de metanol/diclorometano) para proporcionar 6-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)-1-metil-8-(((1,4-cis)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexil)oxi)quinoxalin-2(1H)-ona (17,0 mg, 22% de rendimiento).
Nota: Las moléculas preparadas mediante este método también se han purificado mediante HPLC preparatoria C18 (acetonitrilo/agua con ácido trifluoroacético o modificador de hidróxido de amonio).
Método B-B
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6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-M)-1-metM-8-(((1,4-ds)-4-(pirimidm-2-Mammo)ddohexM)-oxi)qumoxalma-2(1H)-ona A una mezcla de 6-bromo-1-metil-8-[4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexoxi]quinoxalin-2-ona (62 mg, 0,140 mmol), 2-(3,6-dihidro-2H- piran-4-il)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (44 mg, 0,209 mmol), carbonato de sodio (207 j l de solución acuosa 2M, 0,414 mmol) y dioxano (1,1 ml) se le añadió [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]-dicloropaladio(II) (complejo de diclorometano; 10 mg, 0,014 mmol). La mezcla de la reacción resultante se agitó a 100° C durante 2 horas. La mezcla de la reacción se filtró y el filtrado se purificó directamente mediante HPLC preparativa C18 (acetonitrilo/agua con modificador de ácido trifluoroacético) y las fracciones relevantes se combinaron y concentraron hasta la sequedad. El material obtenido de este modo se disolvió en diclorometano y se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado. La fase orgánica se recogió, se secó (Na2SO4), se filtró, se concentró y se evaporó para proporcionar 6-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-1-metil-8-(((1,4-cis)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexil)oxi)quinoxalin-2(1H)-ona (30 mg, 47% de rendimiento).
Nota: Las moléculas preparadas por este método también han sido purificadas por cromatografía en gel de sílice (acetato de etilo/diclorometano).
Método B-C
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1-metM-6-(6-oxa-3-azabiddo[3.1.1]heptan-3-M)-8-((1,4-ds)-4-pirimidm-2-Moxi-ddohexoxi)-qumoxalma-2-ona Se desgasificó una suspensión de 6-bromo-1-metil-8-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinoxalin-2-ona (80 mg, 0,186 mmol) y carbonato de cesio (195 mg, 0,599 mmol) en dioxano (1,0 ml) burbujeando gas nitrógeno a través de la mezcla durante 5 minutos. Se añadieron RuPhos (9 mg, 0,019 mmol) y acetato de paladio (II) (2 mg, 0,009 mmol) y la reacción se desgasificó durante 5 minutos adicionales. Finalmente, se añadió 6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptano (31 mg, 0,313 mmol), y el vial se selló y calentó a 100° C durante 3 horas. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de gel de sílice de 12 g usando acetato de etilo isocrático) para proporcionar 1-metil-6-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)-8-((1,4-cis)-4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinoxalin-2-ona (36,5 mg, 43% de rendimiento).
Tabla B. Compuestos preparados usando acoplamiento de Buchwald como paso final.
Figure imgf000094_0002
continuación
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(continuación)
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EJEMPLOS DE EDICIÓN DE GENES
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos y no debe interpretarse que limitan la presente divulgación. Ejemplo 1: Materiales y Métodos
Métodos:
Células y Cultivo
Las células epiteliales bronquiales (BEC) se derivaron de donantes humanos diagnosticados con fibrosis quística con un genotipo CFTR dF508/dF508.
Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se derivaron de fibroblastos dérmicos humanos después de la transducción viral con los factores de reprogramación de Yamanaka, Oct4, Sox2, KLF4 y c-Myc. Las iPSC derivadas pudieron diferenciarse en 3 capas germinales y contenían un cariotipo normal con 23 pares de cromosomas.
Las células progenitoras y madre hematopoyéticas (HSPC) CD34+ de sangre periférica humana movilizada primaria (mPB) se adquirieron de Hemacare o AllCells. Las células se descongelaron, lavaron y volvieron a suspender en medio completo compuesto por medio libre de suero CellGro SCGM (CellGenix) y suplementado con una mezcla de citoquinas (300 ng/ml SCF, 300 ng/ml Flt3L, 100 ng/ml TPO, 60 ng/ml de IL- 3) a una densidad de 1-3 x 105 células por ml y se incubaron a 37° C/incubadora con 5% de CO2 durante 48 horas antes de la electroporación.
Para los ejemplos de edición de genes se usó el inhibidor de ADN-PK, Compuesto 1. Se prepararon soluciones madre 10 mM usando DMSO anhidro y se almacenaron a -80° C.
Electroporación:
Los ARNsg sintéticos usados era HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) adquiridos purificados de Synthego y contenían nucleótidos modificados químicamente (2-O-metil 3'-fosforotioato) en las tres posiciones terminales ambos extremos 5' y 3'. Las secuencias de los ARNsg con los nucleótidos modificados se subrayan de la siguiente manera:
AAVS1 ARNsg:
5’ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAA
AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG
CUUUU 3’ (SEQ ID NO: 3)
NAV1.7 ARNsg:
[00486] 5 ’ GGCUGAGCGUCC AUC AACC AGUUUUAGAGCUAGAAAUAG
CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCG
AGUCGGUGCUUUU 3’ (SEQ ID NO: 4)
El ARNm de Cas9 se adquirió de TriLink Biotechnologies (L-7206). El ARNm de Cas9 expresa una versión de la proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes SF370 (Proteína asociada 9 de CRISPR) con señales de localización nuclear. El ARNm de spCas9 también contiene una estructura CAP1, una señal poliadenilada y uridinas modificadas para obtener niveles de expresión óptimos en células de mamífero.
Los ODNmc de donantes se adquirieron de IDT. Los ODNmc contienen una secuencia de inserción de 10 nucleótidos, para medir eventos de HDR mediante el ensayo TIDE, flanqueada por 40 nucleótidos de brazos de homología. Los ODNmc contienen 90 nucleótidos en total y nucleótidos modificados con fosforotioato en las tres posiciones terminales en los extremos 5' y 3'. Las secuencias de los ODNmc donantes con los nucleótidos modificados con fosforotioato subrayados se indican de la siguiente manera:
AAVS1 PAM:
[00490] 5’GGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCAG
A ATTC T C AGC T AGGGAC AGGATT GGT GAC AG A A A AGC C C C AT C C TT AGG3 ’
(SEQ ID NO: 5)
AAVS1 No PAM:
[00492] 5’CCTAAGGATGGGGCTTTTCTGTCACCAATCCTGTCCCTAGC
T GAGA ATT C T GGC C C C AC T GT GGGGT GGAGGGG AC AG AT A A A AGT ACC C 3
’ (SEQ ID NO: 6)
NAV1.7 PAM:
[00495] 5’AGCTGTCCATTGGGGAGCATGAGGGCTGAGCGTCCATCAA
CTGAGAATTCCCAGGGAGACCACACCGTTGCAGTCCACAGCACTGTGCAT
3’ (SEQ ID NO: 7)
NAV1.7 No PAM:
[00497] 5’ATGCACAGTGCTGTGGACTGCAACGGTGTGGTCTCCCTGG
GAATTCTCAGTTGATGGACGCTCAGCCCTCATGCTCCCCAATGGACAGC T3
5 (SEQ ID NO: 8)
Todas las electroporaciones se realizaron en el sistema Lonza 4D-Nucleofector™.
Para BEC, se usaron las siguientes condiciones para la electroporación: 1,8 x células E5, 250 ng de ARNm de CAS9, 500 ng de ARNsg y 0,66 jM de ODNmc en 20 j l de tampón de electroporación P4 usando el programa CM-138. Las células sometidas a electroporación se transfirieron a una placa de 96 pocillos que contenía 100 j l de medio de cultivo BEC suplementado con inhibidores de ADN-PK o se dejaron sin tratar. Las células se incubaron a 37° C en una incubadora con CO2 al 5%.
Para las iPSC se usaron las siguientes condiciones: 2,0 x células E5, 250 ng de ARNm de CAS9, 500 ng de ARNsg y 0,66 jM de ODNmc en 20 j l de tampón de electroporación P3 usando el programa CA-137. Las células sometidas a electroporación se transfirieron a una placa de 96 pocillos que contenía 100 j l de medio mTEsRI (Stem Cell Technologies) suplementado con inhibidor de ROCK Y-27632 10 jM (Stem Cell Technologies) con o sin inhibidores de ADN-PK y luego se incubaron a 37° C en una incubadora con CO2 al 5%.
Las células CD34+ se sometieron a electroporación dos días después de la descongelación. Se usaron las siguientes condiciones para la electroporación: 2,0 x células E6, 15 pg de proteína Cas9 (Feldan), 15 jg de ARNsg, 1 jM de ODNmc en 100 j l de tampón de electroporación P3 usando el programa CA-137. Las células sometidas a electroporación se transfirieron dividiéndolas por igual en ocho pocillos de una placa de 24 pocillos, cada uno de los cuales contenía varias concentraciones de inhibidores de a DN-PK. Las células se incubaron a 37° C en una incubadora con CO2 al 5% durante dos días y se evaluó la viabilidad celular y la edición de genes.
Transfección celular mediada por lípidos:
Un día antes de la transfección, se sembraron BEC en una placa de 96 pocillos a una densidad celular de 1xE4 células por pocillo en medio de cultivo de BEC. Primero, se diluyeron 0,15 j l de MessengerMax (ThermoFisher, LMRNA 003) en 5 j l de Opti-MEM y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente. Mientras tanto, se añadieron 80 ng de ARNm de Cas9 (Trilink, L-7206), 20 ng de ARNsg (Synthego) y 1 picomol de ODNmc a 5 j l de Opti-MEM y luego se mezclaron con la solución MessengerMAx. La mezcla se incubó durante 5 min antes de añadirla a las células. Toda la solución se añadió a las células en un pocillo de una placa de 96 pocillos con 100 j l de medio de cultivo con o sin inhibidores de ADN-PK. Las células se incubaron a 37° C durante en una incubador a con CO2 al 5%.
Medición de las tasas de supervivencia celular:
Las células se incubaron con 5 jg/ml de Hoechst 33342 (Life technologies: H3570) y 0,5 jg/ml de yoduro de propidio (PI; Life technologies: P3566) en medios de cultivo durante 1 hora a 37 grados. Se tomaron imágenes de las células para medir eventos positivos de Hoescht (células vivas y muertas) y eventos positivos de PI (células muertas) usando un sistema de imagenología de alto contenido (Molecular devices). La tasa de supervivencia celular relativa se calculó de la siguiente manera: [(eventos Hoescht+ - eventos PI+) de la muestra]/(eventos Hoescht+ -eventos PI+) del control]*100. El control eran células transfectadas simuladas y su tasa de supervivencia celular se fijó arbitrariamente en el 100%.
La supervivencia de las células HSPC CD34+ se midió usando el reactivo Cell Titer Glo (CTG) (Promega). Se mezclaron 100 j l de suspensión celular con 100 j l de reactivo CTG completo. La señal quimioluminiscente se midió usando un luminómetro y se calculó el % de células viables en comparación con las células de control (células no tratadas con los inhibidores de ADN-PK).
Medición de las tasas de edición de genes:
El ADN genómico se aisló incubando las células con 50 j l de solución DNA Quickextract (Epicentre) por pocillo de una placa de 96 pocillos durante 30 min a 37° C. El extracto celular se mezcló y transfirió a una placa de PCR y luego se incubó durante 6 min a 65° C y 2 min a 98° C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con 1 j l de solución que contenía ADN genómico usando AccuPrime™ Pfx ADN polimerasa (Thermofisher, 12344024). Las condiciones de PCR fueron 4 min a 94° C (1x), seguido de 15 s a 94° C, 15 s a 60° C y 1 min a 60° C (40x). Se purificaron los productos de PCR y luego se secuenciaron por Sanger por GENEWIZ. Para PCR se usaron los siguientes pares de cebadores que abarcan el sitio objetivo (FW, directo; RV, inverso). Los cebadores usados por Secuenciación Sanger se indican con un asterisco (*):
AAVS1_FW: 5' GGACAACCCCAAAGTACCCC 3' (SEQ ID NO: 9)
AAVS1_RV*: 5' AGGATCAGTGAAACGCACCA 3' (SEQ ID NO: 10).
NAV1.7_FW*: 5' GCCAGTGGGTTCAGTGGTAT 3' (SEQ ID NO: 11).
NAV1.7 RV: 5' TCAGCATTATCCTTGCATTTTCTGT 3' (SEQ ID NO: 12).
Cada cromatograma de secuencia se analizó usando el software TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) (http://tide.nki.nl) (Ver también Brinkman et al., Nucleic Acids Research, volumen 42, número 22, 16 de diciembre de 2014, páginas e168). Se usaron muestras electroporadas simuladas como secuencia de referencia, y los parámetros se establecieron en un tamaño de indel de 30 nt, y la ventana de descomposición se estableció para cubrir la ventana más grande posible con trazas de alta calidad. Las tasas totales de indeles (inserciones y deleciones) se obtuvieron directamente de los gráficos TIDE. Las tasas de HDR fueron el porcentaje de eventos con una inserción de 10 nucleótidos. Las tasas de NHEJ se calcularon como tasa de indeles total - tasa HDR. Se usó el software GraphPad Prism 7 para hacer gráficos y calcular toda la información estadística.
Ejemplo 2: Los inhibidores de ADN-PK mejoran las tasas de edición de genes HDR en BEC
La FIG. 1 ilustra el diseño de los ensayos de edición de genes usados en los ejemplos siguientes. Para investigar el efecto de los inhibidores de ADN-PK sobre las tasas de edición de genes h Dr , se sometieron a electroporación BEC con ARNm de spCAS9, ARNsg de NAV1.7 y ODNmc de NAV1.7 No PAM y luego se incubaron con diferentes concentraciones de Compuesto 1 o se dejaron sin tratar (Control). Las tasas de edición de genes se determinaron usando el ensayo TIDE 72 h después de la electroporación. Las tasas de edición de genes se expresaron en porcentajes y se clasificaron como HDR y NHEJ. Las tasas de supervivencia celular se muestran en porcentajes donde las células de control se establecieron como 100%.
Como se muestra en la FIG. 2, el inhibidor de ADN-PK del Compuesto 1 mejora las tasas de edición de genes en BEC. Para el Compuesto 1, la IC50 de NHEJ fue 0,4450 pM, la EC50 de HDR fue 0,4448 pM y el % SUPERIOR de HDR fue 69,37.
Ejemplo 3: Los inhibidores de ADN-PK mejoran las tasas de edición de genes HDR en células CD34+ Para investigar el efecto de los inhibidores de ADN-PK sobre las tasas de edición de genes HDR, se sometieron a electroporación células mPB CD34+ con RNP (proteína spCAS9 ARNsg de NAV1.7) y ODNmc de NAV1.7 No PAM. Luego, las células se incubaron con varias concentraciones del Compuesto 1. Las tasas de edición de genes se determinaron usando el ensayo TIDE 48 h después de la electroporación. Las tasas de edición de genes se expresaron en porcentajes y se clasificaron como h Dr y NHEJ como se muestra en la FIG. 3A (Donante B) y la FIG. 3B (Donante C. Las tasas de supervivencia celular se muestran en porcentajes donde las células de control se establecieron en el 100%).
Como se muestra en las FIGS. 3A y 3B, el inhibidor de ADN-PK del Compuesto 1 mejora las tasas de edición de genes en células CD34+. Los valores de EC50 de la formación de HDR e Indeles para el donante B fueron 0,29 pM y 0,35 pM, respectivamente.
Ejemplo 4: Los inhibidores de ADN-PK mejoran las tasas de edición de genes HDR en iPSC
Para investigar el efecto de los inhibidores de ADN-PK sobre las tasas de edición de genes HDR, las iPSC se sometieron a electroporación con ARNm de spCAS9, ARNsg de AAVS1 y ODNmc de AAVS1 PAM y luego se incubaron con diferentes concentraciones de Compuesto 1 o se dejaron sin tratar (Control). Las tasas de edición de genes se determinaron usando el ensayo TIDE 72 h después de la electroporación. Las tasas de edición de genes se expresaron en porcentajes y se clasificaron como HDR y NHEJ. Las tasas de supervivencia celular se muestran en porcentajes donde las células de control se establecieron como el 100%.
Como se muestra en la FIG. 4, el inhibidor de ADN-PK del Compuesto 1 mejora las tasas de edición de genes en iPSC. Para el Compuesto 1, la IC 50 de NHEJ fue 0,474 pM, la EC50 de HDR fue 0,3253 pM y el % SUPERIOR DE HDR fue 24,41.
Ejemplo 5: Determinación de la cinética de edición de genes en ECmax
Para investigar la cinética de edición de genes en EC max, se sometieron a electroporación BEC con ARNm de spCAS9, ARNsg de AAVS1 y ODNmc de AAVS1 PAM y luego se incubaron en diferentes momentos con Compuesto 1 10 pM o se dejaron sin tratar (Control). Las tasas de edición de genes se determinaron usando el ensayo TIDE y se expresaron en porcentajes de HDR y NHEJ. 10 pM es la concentración máxima mejorada (ECmax) del compuesto 1.
La FIG. 5 muestra que existe una estrecha correlación inversa entre los eventos de HDR y de NHEJ.
Ejemplo 6: Determinación de la cinética de edición de genes en EC50
Los BEC se sometieron a electroporación con ARNm de spCAS9, ARNsg de AAVS1 y ODNmc de AAVS1 PAM y luego se incubaron en diferentes momentos con Compuesto 10,7 pM o se dejaron sin tratar (Control). Las tasas de edición de genes se determinaron mediante el ensayo TIDE y se expresaron en porcentajes de HDR y NHEJ. 0,7 pM es la concentración mejorada 50 (EC50) del compuesto 1. La FIG. 6 ilustra el curso temporal de la inhibición de ADN-PK en HDR y NHEJ en BEC.
Ejemplo 7: los inhibidores de ADN-PK mejoran las tasas de HDR cuando los componentes de edición de genes se administraron mediante transfección mediada por lípidos en BEC
Para investigar los efectos de la transfección mediada por lípidos, se transfectaron BEC con ARNm de spCAS9, ARNsg de AAVS1 y ODNmc de AAVS1 PAM y luego se incubaron con diferentes concentraciones de Compuesto 1 o se dejaron sin tratar (Control). Las tasas de edición de genes se determinaron usando el ensayo TIDE 72 h después de la transfección. La FIG. 7 aumentar las tasas de eficiencia de HDR con concentraciones crecientes del Compuesto 1 administrado por transfección basada en lípidos.
Resumen:
Los resultados de la adición de inhibidores de ADN-PK a diferentes tipos de células y loci muestran una mejora significativa de HDR en todos los tipos de células y loci. Se ha demostrado la mejora de la edición de genes HDR en múltiples tipos de células, incluyendo BEC, iPSC, CD34+ HPSC (3 donantes separados). Se ha demostrado la mejora de la edición de genes HDR en múltiples loci, incluyendo AAVS1.1, NaV1.7. Los resultados experimentales también han demostrado que la administración basada en lípidos y por electroporación es eficaz. Los ejemplos de electroporación incluyen b Ec , iPSC, CD34+ HPSC y efectuar la administración usando un sistema de administración basado en lípidos en BEC. Se ha observado una estrecha correlación inversa entre los eventos HDR y NHEJ en loci, condiciones experimentales y tipos de células.
Tabla Resumen: Los inhibidores de ADN-PK mejoran la Edición de genes impulsada por HDR
Figure imgf000100_0001
Equivalentes
Aunque está divulgación se ha mostrado y descrito en particular con referencias a realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la técnica entenderán que pueden realizarse varios cambios en la forma y los detalles de la misma sin apartarse del alcance de la divulgación como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000101_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo.
en donde m y n son independientemente 1 o 2 ;
X es O o NR; en donde R es H o alquilo C1-C4;
Y es un enlace, O o NR, en donde R es H o alquilo C1-C4;
R1 es alquilo C1-C4;
R2 es
a) un anillo arilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros que contiene uno o dos heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S, en donde el anillo arilo y heteroarilo puede estar sustituido con 0, 1, 2 o 3 sustituyentes R3 independientemente seleccionados del grupo que consiste en CN, halo, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4, C(=O)NHRr y un anillo heterocicloalquilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros, en donde cada anillo contiene 1,2 o 3 heteroátomos seleccionados de N, O y S; en donde R1' es alquilo C1-C4; o en donde dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar un anillo fusionado de 5 o 6 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S; o
b) COOR4 en donde R4 es alquilo C1-C4 o bencilo;
en donde cada alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4 y haloalcoxi C1-C4 puede estar además sustituido con OR5 o NR6 R7 en donde cada uno de R5, R6 y R7 es independientemente H, alquilo C1-C4 o cicloalquilo C3-C6; o en donde R6 y R7 y el átomo de nitrógeno al que están unidos pueden formar un anillo saturado de 5 o 6 miembros que puede contener 0 o 1 heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S y en donde el anillo puede estar además sustituido por alquilo C1-C4.
el Anillo A se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000101_0002
en donde W es N o CR3; y Z es O o S; en donde R3 es H o alquilo C1-C4.
2. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de la reivindicación 1, en donde
R2 es un anillo arilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros que contiene uno o dos heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S, en donde el anillo arilo y heteroarilo puede estar sustituido con 0, 1, 2 o 3 sustituyentes R3 independientemente seleccionados del grupo que consiste en CN, halo, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4, C(=O)NHRr en donde R1' es alquilo C1-C4; o en donde dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que pueden contener un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y/o
Figure imgf000102_0001
en donde # indica que R2 está conectado al resto del compuesto de fórmula (I); y o es 0, 1 o 2.
3. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde el compuesto de fórmula (i) está representado por la Fórmula Estructural (II), la Fórmula Estructural (II'), la Fórmula Estructural (II") o la Fórmula Estructural (II'''): 4
Figure imgf000102_0002
4. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:
(i) cada uno de m y n es 2 ; y/o
(ii) R1 es metilo; y/o
(iii) R2 es:
Figure imgf000103_0001
5. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde cada uno de m y n es 2, Y es un enlace, R1 es metilo, R2 es COOR4 y R4 es alquilo C1-C4o bencilo.
6. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde A es
Figure imgf000103_0002
7. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde A es
Figure imgf000103_0003
8. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el compuesto de fórmula (I) está representado por la Fórmula Estructural (III), la Fórmula Estructural (III'), la Fórmula Estructural (III'') o la Fórmula Estructural (III'''):
Figure imgf000103_0004
Figure imgf000104_0001
9. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde o es cero, 1 o 2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CN, halo, NO2, alquilo C1-C2, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C2, haloalcoxi C1-C2, y C(=O)NHR1' en donde R1' es alquilo C1-C2.
10. El compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde:
(i) dos grupos R3 conectados a átomos de carbono adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar un anillo fusionado de 5 miembros que puede contener un heteroátomo seleccionado de O, N y S; y/o,
(ii) el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos:
Figure imgf000104_0002
continuación
Figure imgf000105_0001
continuación
Figure imgf000106_0001
(continuación)
Figure imgf000107_0001
(continuación)
Figure imgf000108_0001
(continuación)
Figure imgf000109_0001
(continuación)
Figure imgf000110_0001
continuación
Figure imgf000111_0001
(continuación)
Figure imgf000112_0001
11. Un método para editar una o más regiones genómicas objetivo que comprende: administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 , o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde se editan la una o más regiones genómicas objetivo;
opcionalmente en donde la eficiencia de la edición de las regiones genómicas objetivo en la una o más células se aumenta en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto;
en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.
12. Un método para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de la vía de reparación dirigida por homología (HDR), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10 , o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico o ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura de ADN, y en donde la rotura de ADN se repara por lo menos en parte a través de la vía HDR, opcionalmente en donde:
(a) la eficiencia de la reparación de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía HDR aumenta en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; o
(b) en donde la rotura de ADN comprende una rotura de cadena doble (DSB) de ADN;
en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.
13. Un método para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 , o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico o ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura de ADN, y en donde se inhibe o suprime la reparación de la rotura de ADN a través de la vía NHEJ; opcionalmente en donde:
(a) la eficiencia de la inhibición o supresión de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía NHEk aumenta en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; o
(b) en donde la rotura de ADN comprende una rotura de cadena doble (DSB) de ADN;
en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.
14. Un método para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 , o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico o ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo de un gen o genes objetivo, lo que da como resultado la edición de la una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociada con el gen o genes objetivo; opcionalmente en donde
(a) la expresión de un gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociados con el o los genes objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en la una o más células antes de la administración., opcionalmente además en donde dicha expresión se aumenta en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5-veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en la una o más células antes de la administración; o
(b) la expresión de un gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociadas con el gen o genes objetivo disminuye en comparación con el nivel de expresión inicial en la una o más células antes de la administración, opcionalmente en donde la expresión génica se reduce en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; o
(c) la expresión de uno gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociados con el o los genes objetivo se elimina sustancialmente en una o más células;
en donde la una o más células son células cultivadas o células ex vivo de un organismo.
15. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, para su uso en un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende: administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde se editan la una o más regiones genómicas objetivo;
opcionalmente en donde la eficiencia de la edición de las regiones genómicas objetivo en la una o más células se aumenta en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto;
en donde las células son células in vivo dentro de un organismo.
16. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, para su uso en un método para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de la vía de reparación dirigida por homología (HDR), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico o ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura de ADN, y en donde la rotura de ADN se repara por lo menos en parte a través de la vía HDR, opcionalmente en donde: (a) la eficiencia de la reparación de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía HDR aumenta en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; o
(b) en donde la rotura de ADN comprende una rotura de cadena doble (DSB) de ADN;
en donde la una o más células son células in vivo dentro de un organismo.
17. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, para su uso en un método para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico o ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura de ADN, y en donde se inhibe o suprime la reparación de la rotura de ADN a través de la vía NHEJ; opcionalmente en donde:
(a) la eficiencia de la inhibición o supresión de la rotura de ADN en las regiones genómicas objetivo en la una o más células a través de una vía NHEk aumenta en comparación con una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; o
(b) en donde la rotura de ADN comprende una rotura de cadena doble (DSB) de ADN;
en donde la una o más células son células in vivo dentro de un organismo.
18. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, para su uso en un método para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico o ácidos nucleicos de la una o más regiones genómicas objetivo de un gen o genes objetivo, lo que da como resultado la edición de la una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociada con el gen o genes objetivo; opcionalmente en donde
(a) la expresión de un gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociados con el o los genes objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en la una o más células antes de la administración, opcionalmente además en donde dicha expresión se aumenta en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5-veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en la una o más células antes de la administración; o
(b) la expresión de un gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociadas con el gen o genes objetivo disminuye en comparación con el nivel de expresión inicial en la una o más células antes de la administración, opcionalmente en donde la expresión génica se reduce en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; o
(c) la expresión de uno gen o genes y/o una proteína o proteínas en sentido descendente asociados con el o los genes objetivo se elimina sustancialmente en una o más células;
en donde la una o más células son células in vivo dentro de un organismo.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-13 o el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 15-17, en donde
(i) dicha eficiencia aumenta por lo menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces en comparación con el de una célula o células por lo demás idénticas pero sin el compuesto; o
(ii) dicha eficiencia se mide por la frecuencia de la integración de polinucleótidos dirigida, o por la frecuencia de la mutagénesis dirigida, opcionalmente en donde la mutagénesis dirigida comprende mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-14 o 19 o el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 15-19, en donde
(i) la célula se sincroniza en la fase del ciclo celular S o G2; y/o
(ii) la una o más células que se administran o se ponen en contacto con dicho compuesto tienen una supervivencia aumentada en comparación con una o más células que no se han administrado o puesto en contacto con dicho compuesto; y/o
(iii) el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en la una o más células simultáneamente (iv) el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en la una o más células secuencialmente, opcionalmente en donde:
(a) el sistema de edición del genoma se administra en la una o más células antes del compuesto; o
(b) el compuesto se administra en la una o más células antes del sistema de edición del genoma; y/o (v) el organismo es un mamífero o un humano; y/o
(vi) en donde el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran por
(a) la misma vía; o
(b) una vía diferente; y/o
(vii) el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores del tipo activador de la transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo.
21. El método, o el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf, opcionalmente en donde:
(i) el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas comprende: (a) por lo menos un elemento de ARN guía que comprende: (i) un ARN direccionador que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; (ii) y un ARN activador que comprende una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN direccionador o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que comprende una proteína Cas o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas, opcionalmente además en donde:
(a) dicho ARN direccionador y ARN activador se fusionan como una única molécula; o
(b) la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II, opcionalmente en donde la proteína Cas9 es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas; o
(ii) el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf y en donde el sistema CRISPR-Cpf comprende: (a) por lo menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el ARN guía comprendiendo un ARN direccionador que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo; y (b) un elemento de proteína Cpf que comprende una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cpf.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 o 19-21 o el compuesto, sal farmacéuticamente aceptable o cocristal del mismo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 17-21, en donde:
(i) el sistema de edición del genoma se administra mediante uno o más vectores, opcionalmente en donde el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc, opcionalmente además en donde los vectores virales se seleccionan de vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex; y/o
(ii) el sistema de edición del genoma se administra mediante
(a) ARN sintético; o
(b) una nanoformulación.
23. Un kit o composición para editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende:
un sistema de edición del genoma; y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una sal farmacéuticamente aceptable o un cocristal del mismo, opcionalmente en donde el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasas basado en efectores del tipo activador de la transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo, opcionalmente además en donde el sistema de edición del genoma es un sistema basado en CRISPR.
24. El kit o composición de la reivindicación 23, en donde el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf, opcionalmente en donde:
(i) el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas comprende: (a) por lo menos un elemento de ARN guía que comprende: (i) un ARN direccionador que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; (ii) y un ARN activador que comprende una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con el ARN direccionador o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que comprende una proteína Cas o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas, opcionalmente en donde la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II, opcionalmente además en donde la proteína Cas9 es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas; o
(ii) el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf y el sistema CRISPR-Cpf comprende: (a) un ARN direccionador que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN direccionador; y (b) un elemento de proteína Cpf que comprende una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cpf.
25. El kit o composición de la reivindicación 23 o 24, en donde el sistema de edición del genoma está incluido o empaquetado en uno o más vectores, opcionalmente en donde el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc, opcionalmente además en donde los vectores virales se seleccionan del grupo que consiste en vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simplex.
26. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
27. Un método para sensibilizar una célula a un agente terapéutico o un estado patológico que induce una lesión del ADN que comprende el paso de poner en contacto la célula con el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto,
en donde la célula es una célula cultivada o una célula e x v ivo de un organismo.
28. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para su uso en un método de sensibilizar una célula a un agente terapéutico o un estado patológico que induce una lesión del ADN que comprende el paso de poner en contacto la célula con el compuesto o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto,
en donde la célula es un célula in v ivo dentro de un organismo.
29. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para su uso en un método de
(i) potenciar un régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer en un paciente que comprende el paso de administrar a dicho paciente una cantidad eficaz del compuesto o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto; o
(ii) tratar el cáncer o inhibir el crecimiento de células cancerosas en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz del compuesto o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
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