KR20200110687A - 유전체 편집 효율을 증가시키기 위한 퀴녹살리논 화합물, 조성물, 방법 및 키트 - Google Patents

유전체 편집 효율을 증가시키기 위한 퀴녹살리논 화합물, 조성물, 방법 및 키트 Download PDF

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수디프타 마하잔
마크 사울 와인버그
디에고 세바스티안 다스톨포
케빈 엠. 코트렐
마크 에이. 모리스
존 패트릭 맥스웰
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버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명의 화합물, 표적 유전체 영역(들)을 편집하는 방법, HDR 경로를 통해 DNA 절단을 복구하는 방법, NHEJ 경로를 통해 DNA 절단의 복구를 억제 또는 저해하는 방법, 및 유전자(들) 또는 단백질(들)의 발현을 변화시키는 방법은, 본원에 개시된 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 포함하는 세포에, 유전체 편집 시스템 및 DNA 단백질-키나제 (DNA-PK) 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 표적 유전자를 편집하기 위한 키트 및 조성물은 본원에 개시된 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 포함한다.

Description

유전체 편집 효율을 증가시키기 위한 퀴녹살리논 화합물, 조성물, 방법 및 키트
관련 출원의 인용
[0001] 본 출원은 2018년 1월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 62/618,385호에 대한 이익을 주장하며, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
[0002] 본 출원은 ASCII 형식의 전자문서로 제출된 서열 목록을 포함하는데, 해당 목록 전체가 본원에 참조로 포함된다.　 2019년 1월 16일에 생성한 상기 ASCII 복사본은 파일명이 14390-687 Sequence listing_ST25.txt로서, 크기는 4 KB이다.
본 발명의 기술 분야
[0003] 본 발명은 일반적으로 DNA 단백질-키나제 (DNA-PK) 억제제 및 유전체 편집 시스템을 세포(들)에 투여함으로써 유전체 편집 효율을 증가시키기 위한 화합물, 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.
[0004] 유전적 변이에 대한 체계적인 공학기술을 가능케 하기 위해서는 정확한 유전체 표적화 기법이 필요하다. 유전체 편집 시스템, 특히 CRISPR-엔도뉴클레아제 기반의 유전체 편집 기술의 사용은 지난 수년간 기하 급수적으로 증가하였다. II형 CRISPR-Cas9 박테리아 선천성 면역계가 인간 유전체의 표적화 변형을 위한 효과적인 유전체 편집 도구로 부상하였다 (Wiedenheft, B. 2012; Hsu, P.D. eta. 2014). 최근에는, CRISPR-Cpf 유전체 편집 시스템이 설명된 바 있다. CRISPR-엔도뉴클레아제 기반의 유전체 편집은, DNA 이중 가닥 손상을 복구하는 비상동성 말단 접합 (NHEJ) 및 상동성 지향 복구 (HDR) 경로에 일부 의존하고 있다. 세포 복구 기전은 HDR보다는 NHEJ를 선호한다.
[0005] NHEJ에서의 삽입 또는 결실 (indel)의 달성은 일부 보고서에서 최대 70% 효율을 나타내는 한편, HDR의 효율은 여전히 1% 미만의 비율로서 쉽지 않은 과제로 남아있다.
[0006] 따라서, 유전체 편집 효율, 특히 HDR 효율을 증가시키는 방법이 필요한 실정이다.
[0007] 본 발명은 DNA-PK 억제제를 사용하여 DNA-PK와 같은 NHEJ 효소들을 억제함으로써 HDR 효율을 향상시킬 수 있다.
[0008] 일부 실시양태에서, 본 발명은 구조식 (I)로 나타낸 화합물:
[0009]
Figure pct00001
(I) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 제공한다.
[0010] m과 n은 독립적으로 1 또는 2이다.
[0011] X는 O 또는 NR이고; 여기서 R은 H 또는 C1-C4-알킬이다.
[0012] Y는 결합, O 또는 NR이고; 여기서 R은 H 또는 C1-C4-알킬이다.
[0013] R1은 C1-C4-알킬이다.
[0014] R2는 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 고리이거나; 또는 COOR4이고, 여기서, 상기 아릴 및 헤테로아릴 고리는 CN, 할로, C1-C4-알킬, C3-C6 사이클로알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, C(=O)NHR1' (여기서, R1'는 C1-C4 알킬임), 및 5원 또는 6원 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴 고리 (여기서, 각 고리는 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유함)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환기 R3으로 치환될 수 있거나, 또는 상기 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 또는 6원 고리를 형성할 수 있으며; R4는 C1-C4 -알킬 또는 벤질이다.
[0015] C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시 및 C1-C4-할로알콕시는 각각 OR5 또는 NR6R7로 추가로 치환될 수 있다.
[0016] R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-C4 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이다.
[0017] R6과 R7, 및 이들이 부착되는 질소 원자는 N, O 및 S로부터 선택된 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있는 포화 5원 또는 6원 고리를 형성할 수 있고, 여기서 상기 고리는 C1-C4-알킬에 의해 추가로 치환될 수 있다.
[0018] 고리 A는
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
, 및
Figure pct00005
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0019] W는 N 또는 CR3이고; Z는 O 또는 S이며; 여기서 R3은 H 또는 C1-C4 알킬이다.
[0020] 일부 실시양태에서, 본 발명은 구조식 (I)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 제공하는데, 여기서, R2는 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 방향족 또는 헤테로방향족 고리이거나; 또는 COOR4 (여기서, R4는 C1-C4 -알킬 또는 벤질임)이고, 여기서 상기 방향족 또는 헤테로방향족 고리는 CN, 할로, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'(여기서, R1'는 C1-C4 알킬임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환기 R3으로 치환될 수 있거나; 또는 상기 방향족 또는 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[0021] 일부 실시양태에서, R2는:
Figure pct00006
,
Figure pct00007
,
Figure pct00008
또는
Figure pct00009
이다:
여기서, #은 R2가 화학식 (I)의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[0022] 일부 실시양태에서, 본 화합물은 구조식 (II), 구조식 (II'), 구조식 (II") 또는 구조식 (II"')로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이다:
Figure pct00010
(II),
Figure pct00011
(II'),
Figure pct00012
(II") 또는
Figure pct00013
(II"').
[0023] 일부 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00014
,
Figure pct00015
,
Figure pct00016
, 및
Figure pct00017
로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는:
Figure pct00018
또는
Figure pct00019
이다.
[0024] 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 구조식 (III), 구조식 (III'), 구조식 (III") 또는 구조식 (III"')로 나타낸다:
Figure pct00020
(III),
Figure pct00021
(III'),
Figure pct00022
(III") 또는
Figure pct00023
(III"').
[0025] 일부 실시양태에서, R2는:
Figure pct00024
또는
Figure pct00025
이다.
[0026] 일부 실시양태에서, 본 화합물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')의 구조를 갖는 화합물; 및 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산으로부터 선택된 공결정 형성제를 포함하는 공결정이다.
[0027] 또한, 본 발명은 하나 이상의 표적 유전체 영역을 편집하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하나 이상의 표적 유전체 영역을 함유하는 하나 이상의 세포에, 유전체 편집 시스템 및 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 투여하는 단계를 포함한다.
[0028] 일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 표적 유전체 영역을 편집하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하나 이상의 표적 유전체 영역을 함유하는 하나 이상의 세포에, 유전체 편집 시스템 및 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 투여하는 단계를 포함한다.
[0029] 일부 실시양태에서, 본 발명은 상동성 지향 복구 (HDR) 경로를 통해 하나 이상의 표적 유전체 영역에서 DNA 절단을 복구하는 방법도 제공하는데, 상기 방법은 하나 이상의 표적 유전체 영역을 함유하는 하나 이상의 세포에, 유전체 편집 시스템 및 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 투여하는 단계를 포함한다.
[0030] 상기 유전체 편집 시스템은 상기 표적 유전체 영역들의 핵산(들)과 상호작용하여 DNA 절단을 유도하고, 상기 DNA 절단은 HDR 경로를 통해 적어도 부분적으로 복구된다.
[0031] 또한, 본 발명은 NHEJ 경로를 통해 하나 이상의 표적 유전체 영역에서 DNA 절단의 복구를 억제 또는 저해하는 방법도 제공하는데, 상기 방법은 하나 이상의 표적 유전체 영역을 함유하는 하나 이상의 세포에, 유전체 편집 시스템 및 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 투여하는 단계를 포함한다.
[0032] 상기 유전체 편집 시스템은 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 핵산(들)과 상호작용하여 DNA 절단을 유도하고, 이 경우 NHEJ 경로를 통한 DNA 절단의 복구는 억제 또는 저해된다.
[0033] 또한, 본 발명은 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 변화시키는 방법도 제공하는데, 상기 방법은 하나 이상의 표적 유전체 영역을 포함하는 하나 이상의 세포에, 유전체 편집 시스템 및 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 투여하는 단계를 포함한다.
[0034] 상기 유전체 편집 시스템은 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 핵산(들)과 상호작용하여 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 편집을 유도하고, 여기서 상기 편집은 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현을 변화시킨다.
[0035] 일부 실시양태에서, 상기 DNA 절단은 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 포함한다.
[0036] 일부 실시양태에서, 본 화합물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')의 구조를 갖는 화합물; 및 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산으로부터 선택된 공결정 형성제를 포함하는 공결정이다.
[0037] 도 1은 유전자 편집 분석의 설계에 대해 도시한 것이다.
[0038] 도 2는 DNA-PK 억제제로 처리한 BEC에서의 유전자 편집 비율을 나타낸 그래프이다.
[0039] 도 3a 및 3b는 서로 다른 두 공여체의 CD34+ 세포에서 DNA-PK 억제제로 처리한 후의 유전자 편집 비율을 나타내고 있는 그래프이다.
[0040] 도 4는 DNA-PK 억제제로 처리한 iPSC에서의 유전자 편집 비율을 나타낸 그래프이다.
[0041] 도 5는 DNA-PK 억제제 ECmax에 있어서 BEC의 유전자 편집 동역학을 나타낸 그래프이다.
[0042] 도 6은 DNA-PK 억제제 EC50에 있어서 BEC의 유전자 편집 동역학을 나타낸 그래프이다.
[0043] 도 7은 BEC에서 지질 매개형 형질감염으로 전달되는 성분들의 유전자 편집에 있어서의 HDR 비율을 나타내는 그래프이다.
[0044] 달리 정의하지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 모든 과학 기술 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본원에 기술한 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법과 이들의 기법들은 당업계에 익히 알려져 있어 통상적으로 사용되는 것들이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양과 형질전환 (예컨대, 전기천공, 리포펙션)에 표준 기법들을 사용한다. 효소 반응과 정제 기법들은 제조업체의 사양에 따르거나, 당업계에서 통상적으로 행해지는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행한다. 전술한 기법과 절차들은 일반적으로 당업계에 익히 알려진 통상적인 방법에 따라서, 그리고 본 발명의 전반에 걸쳐 언급되고 논의된 다양한 일반적인 참조문헌 및 보다 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]을 참조한다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약과 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법과 이들의 실험실 절차 및 기법들은 당업계에 익히 알려져 있어 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제 제조, 제제화와 전달, 및 환자의 치료에 표준 기법들을 사용한다. 일반적으로, 화학 원소들은 원소 주기율표 (CAS 버전)와 화학 및 물리학 핸드북 (Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. 1994)에 의거하여 확인한다. 추가로, 유기 화학의 일반적 원리에 대해서는 문헌["Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999] 및 ["March's Advanced Organic Chemistry," 5th Ed., Smith, M.B. and March, J., eds. John Wiley & Sons, New York: 2001]에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명에 따라 사용된 바와 같이, 본 발명에 정의된 용어들은, 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 바와 같은 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다.
[0045] 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 세포에서 표적 유전체 영역들을 편집하는 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 증가된다.
[0046] 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 세포의 표적 유전체 영역들에서 HDR 경로를 통한 DNA 절단 복구의 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 증가된다.
[0047] 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 세포의 표적 유전체 영역들에서 NHEJ 경로를 통한 DNA 절단 복구를 억제 또는 저해하는 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 증가된다.
[0048] 일부 실시양태에서, 상기 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 증가된다.
[0049] 일부 실시양태에서, 상기 효율은 표적화된 폴리뉴클레오타이드 통합의 빈도수에 의해 측정한다. 일부 실시양태에서, 상기 효율은 표적화된 돌연변이 유발의 빈도수에 의해 측정한다. 일부 실시양태에서, 상기 표적화된 돌연변이 유발은 점 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 포함한다.
[0050] 일부 실시양태에서, 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현은, 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 증가된다. 예를 들어, 상기 발현은 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배 또는 10배 증가된다.
[0051] 일부 실시양태에서, 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현은, 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 감소된다. 예를 들어, 상기 유전자 발현은 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 감소된다.
[0052] 일부 실시양태에서, 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현은, 상기 하나 이상의 세포에서 실질적으로 제거된다.
[0053] 일부 실시양태에서, 상기 세포는 세포 주기의 S 또는 G2 기에서 동기화된다.
[0054] 일부 실시양태에서, 상기 화합물을 투여하거나 상기 화합물과 접촉시킨 상기 하나 이상의 세포들은, 상기 화합물을 투여하지 않거나 상기 화합물과 접촉시키지 않은 하나 이상의 세포들에 비해 생존율이 증가된다.
[0055] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 상기 하나 이상의 세포에 동시에 투여한다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 상기 하나 이상의 세포에 순차적으로 투여한다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템을 상기 화합물보다 먼저 상기 하나 이상의 세포에 투여한다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템을 상기 유전체 편집 시스템보다 먼저 상기 하나 이상의 세포에 투여한다.
[0056] 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 세포들은 배양된 세포들이다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 세포들은 유기체 내에 존재하는 생체 내 세포들이다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 세포들은 유기체로부터 유래한 생체 외 세포들이다.
[0057] 일부 실시양태에서, 상기 유기체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 상기 유기체는 인간이다.
[0058] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 동일한 경로를 통해 투여한다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 서로 다른 경로를 통해 투여한다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템을 정맥내 투여하고 상기 화합물을 경구 투여한다.
[0059] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 기반 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템으로부터 선택된다.
[0060] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 CRISPR 기반 시스템이다. 일부 실시양태에서, 상기 CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cas 시스템 또는 CRISPR-Cpf 시스템이다.
[0061] 일부 실시양태에서, 상기 CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cas 시스템이고, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 (a) (i) 표적화 RNA로서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 표적화 RNA; 및 (ii) 활성화 RNA로서, 상기 표적화 RNA와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 활성화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 활성화 RNA를 포함하는, 적어도 하나의 가이드 RNA 성분; 및 (b) Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는, Cas 단백질 성분을 포함한다.
[0062] 일부 실시양태에서, 상기 표적화 RNA 및 활성화 RNA는 단일 분자로서 융합된다.
[0063] 일부 실시양태에서, 상기 Cas 단백질은 II형 Cas9 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 Cas9 단백질은 SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 또는 D10A 니카제, 또는 이들의 임의의 조합이다.
[0064] 일부 실시양태에서, 상기 CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cpf 시스템이고, 상기 CRISPR-Cpf 시스템은 (a) 적어도 하나의 가이드 RNA 성분 또는 상기 가이드 RNA 성분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산으로서, 상기 가이드 RNA가 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 RNA를 포함하는 것인, 상기 가이드 RNA 성분 또는 핵산; 및 (b) Cpf 단백질 또는 상기 Cpf 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, Cpf 단백질 성분을 포함한다.
[0065] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 하나 이상의 벡터에 의해 전달된다.
[0066] 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 ssDNA로부터 선택된다.
[0067] 일부 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 단순 포진 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
[0068] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 합성 RNA에 의해 전달된다.
[0069] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 나노제제에 의해 전달된다.
[0070] 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 편집하기 위한 키트 또는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물은 유전체 편집 시스템; 및
[0071] 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III"), 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 화합물은 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III"), 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이며, 여기서, R1과 R2는 각각 수소 또는 중수소이다.
[0072] 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 유전체 편집 시스템은 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 기반 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템이다. 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 유전체 편집 시스템은 CRISPR 기반 시스템이다. 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cas 시스템 또는 CRISPR-Cpf 시스템이다.
[0073] 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cas 시스템이고, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 (a) (i) 표적화 RNA로서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 표적화 RNA; 및 (ii) 활성화 RNA로서, 상기 표적화 RNA와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 활성화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 활성화 RNA를 포함하는, 적어도 하나의 가이드 RNA 성분; 및 (b) Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는, Cas 단백질 성분을 포함한다.
[0074] 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 Cas 단백질은 II형 Cas9 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 Cas9 단백질은 SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 또는 D10A 니카제, 또는 이들의 임의의 조합이다.
[0075] 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cpf 시스템이고, 상기 CRISPR-Cpf 시스템은 (a) 표적화 RNA로서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 표적화 RNA; 및 (b) Cpf 단백질 또는 상기 Cpf 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, Cpf 단백질 성분을 포함한다.
[0076] 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 유전체 편집 시스템은 하나 이상의 벡터 중에 포함되거나 패키징된다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 ssDNA로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 단순 포진 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
[0077] 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 화합물은 표 1로부터 선택되는 화합물이다.
[0078] 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 화합물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')의 구조를 갖는 화합물; 및 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산으로부터 선택된 공결정 형성제를 포함하는 공결정이다.
[0079] 일부 실시양태에서, 상기 키트 또는 조성물의 화합물은 (a) 표 1에서 선택된 화합물 및 (b) 아디프산을 포함하는 공결정이다.
[0080] 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점들은 후술하는 상세한 설명에서 명백히 설명될 것이다. 그러나, 본 발명의 실시양태와 양상들을 제시하는 본 발명의 상세한 설명은 본 발명을 한정하려는 것이 아니라 예시로서만 제공된다는 점을 이해해야 한다. 상세한 설명을 바탕으로 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경과 변형을 가할 수 있음은 당업계의 통상의 기술자에게는 자명한 일일 것이다.
[0081] 일부 실시양태에서, 본 발명은 예컨대 돌연변이를 교정하여 표적 유전체를 편집하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 이러한 방법, 조성물 및 키트는 DNA-PK 억제제 사용으로 유전체 편집 효율을 증대시킬 수 있다.
[0082] 유전체 편집 시스템은 유전체 (또는 표적 유전체 영역) 중의 목적하는 유전자좌에서 DSB(들)와 같은 DNA 절단(들)을 자극하거나 유도할 수 있다. DNA 개열의 생성은 세포 효소들을 촉진하여 오차 경향이 있는 NHEJ 경로나 오차가 없는 HDR 경로를 통해 절단 부위를 복구하도록 한다. NHEJ에서, DNA 병변은, KU70/80 이종이합체와 DNA 의존성 단백질 키나제 (DNA-PK) 효소들을 수반하는 일련의 효소 과정에서 DNA 절단부의 두 말단을 융합시킴으로써 복구된다. 상기 복구 기작은 2개의 DNA 말단의 테터링과 정렬, 절제, 신장 및 결찰 단계를 수반하여 (Rouet et al.; Dexheimer T. DNA repair pathways and mechanisms. In: Mathews L, Cabarcas S, Hurt E, editors. DNA repair of cancer stem cells. Dordrecht: Springer; 2013. p.19-32.) 절단 부위에 작은 삽입 또는 결실 돌연변이 (indel)의 형성을 유도한다. 유전자의 암호화 서열에 도입된 indel은 조기 정지 코돈 또는 틀 이동(frame-shift) 돌연변이를 유발하여 절단된 비기능성 단백질의 생성을 초래할 수 있다. HDR 경로의 기작은 완전히 이해되고 있지 않으며, 염기 삽입 또는 유전자 대체를 위한 공여체 복구 주형에 의해 가닥 침습을 촉진하는 Rad51과 같은 다른 복구 단백질 세트를 수반한다. 따라서, HDR은 외인성 DNA 주형의 도입을 통해 유전체 내에서 목적하는 DNA 편집 결과를 얻을 수 있으며, 유전자 기능을 회복시킬 목적의 해독관련 질병 모델링 (translational disease modeling) 및 치료 유전체 편집을 위한 강력한 전략법일 수 있다.
[0083] 상기 두 DNA 복구 경로 중에서, NHEJ가 나타나는 빈도수가 훨씬 더 높고, 심지어 뉴런에서도 70% 이상의 효율을 달성할 수 있다는 보고들도 있다 (Swiech et al., "In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9," Nat Biotechnol. 2015 Jan; 33(1):102-62014). 그러나, HDR 유전자 교정은, DNA 복제가 완료되어 자매 염색분체들이 복구 주형으로 사용될 수 있을 때에 매우 낮은 빈도수로 S 및 G2 기에서 나타난다 (Heyer et al., Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics 44:113-139, 2010). NHEJ는 세포 주기 전반에 걸쳐 나타나고 S 및 G2 기 동안에는 HDR과 경쟁하여 그보다 선호되기 때문에, HDR 경로를 통한 표적화 삽입은 지속적인 연구의 당면 과제 및 중심으로 남아있다.
[0084] DNA 단백질-키나아제 (DNA-PK)는 다양한 DNA 복구 과정들에서 중요한 역할을 담당한다. DNA-PK는 비상동성 말단 접합 (NHEJ) 경로의 활성화를 통해 DNA 이중 가닥 절단 복구에 참여하게 된다. NHEJ는 3가지 단계들을 통해 진행되는 것으로 생각된다: DSB를 인식하는 단계, 말단부에서 결찰불가한 말단 또는 다른 형태의 손상을 제거하는 DNA 가공처리 단계, 및 마지막으로 DNA 말단의 결찰 단계. DSB의 인식은 고르지 못한 DNA 말단에 Ku 이종이합체를 결합시킨 후 DSB의 인접 측면에 2개의 DNA 의존성 단백질 키나제 촉매 서브유닛 (DNA-PKcs 또는 DNA-PK) 분자를 동원시킴으로써 수행되며; 이는 추가의 가공처리 효소들이 동원될 때까지 상기 손상된 말단을 보호하는 역할을 한다. 최근 자료에 따르면, 추가의 가공처리를 위한 DNA 말단을 준비하기 위해 DNA-PKcs가 가공처리 효소인 아르테미스(Artemis)뿐 아니라 그 자체도 인산화시킨다는 가설에 힘이 실리고 있다. 경우에 따라서는, DNA 폴리머라제가 결찰 단계 전에 새로운 말단들을 합성하는데 필요할 수도 있다. DNA-PKcs의 자가인산화가, 중심 DNA 결합 공간을 개방하여, DNA로부터 DNA-PKcs를 방출시키고, 궁극적으로는 DNA 말단의 재결찰을 촉진시키는 입체구조 변화를 유도하는 것으로 생각된다.
[0085] 일부 실시양태에서, 본 발명은 유전자 편집을 향상시키는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는데, 특히 세포에서 CRISPR 기반 HDR 복구를 비롯한 유전체 편집 시스템에서, HDR 경로를 통해 DNA 절단(들)의 복구 효율을 증대시키거나, 또는 NHEJ 경로를 통해 DNA 절단(들)의 복구를 억제 또는 저해하는 효율을 증대시키는 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 임의의 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 세포(들)에 투여된 유전체 편집 시스템은 표적 유전자의 핵산(들)과 상호작용하여 DNA 절단을 유도하거나 야기하는 것으로 생각되며; 이러한 DNA 절단은 여러 복구 경로들, 예컨대 HDR에 의해 복구되고, 세포에 투여된 DNA-PK 억제제는 NHEJ 복구 경로를 억제, 차단 또는 저해하여, HDR DNA 복구 경로의 빈도수 또는 효율은 증가 또는 증진된다.
[0086] 유전체 편집 시스템과 표적 유전자의 핵산(들) 간의 상호작용은, 유전체 편집 시스템의 적어도 일부와 표적 유전자의 핵산(들)과의 하이브리드화, 또는 유전체 편집 시스템에 의한 표적 유전자의 핵산(들)의 임의의 기타 인식일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 상호작용은 단백질-DNA 상호작용 또는 염기쌍들 간의 하이브리화이다.
[0087] 일부 실시양태에서, 본 발명은 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여함으로써 상기 세포(들)의 하나 이상의 표적 유전체 영역을 편집하는 방법을 제공한다. 상기 편집은 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 편집은 임의의 종류의 유전자 조작 또는 세포 유전체의 공학기법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역의 편집은 세포(들)의 유전체 영역의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 유전체 영역은 세포(들) 중의 유전 물질, 예컨대 DNA, RNA, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 세포(들) 중의 유전체 영역은 세포(들)에 함유되어 있는 미토콘드리아 또는 엽록체의 유전체를 포함한다.
[0088] 일부 실시양태에서, 삽입, 결실 또는 치환은 인트론 또는 엑손 영역의 암호화 또는 비암호화 유전체 영역, 또는 이들의 임의의 조합 (이들의 중첩 또는 비중첩 세그먼트를 포함)일 수 있다. 본원에 사용된 "비암호화 영역"이란 아미노산 서열을 암호화하지 않는 유전체 영역을 지칭한다. 예를 들어, 비암호화 영역에는 인트론이 포함된다. 암호화 영역은 아미노산 서열을 암호화하는 유전체 영역을 가리킨다. 예를 들어, 암호화 영역에는 엑손이 포함한다.
[0089] 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 편집은 세포(들)의 유전체 중 임의의 하나 이상의 표적 영역에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 편집은 예를 들어 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, 프로모터 영역, 인핸서 영역, 사일렌서 영역, 절연체 영역, 항저해제, 번역후 조절 요소, 폴리아데닐화 신호 (예컨대, 최소 폴리 A), 보존된 영역, 전사 인자 결합 부위 또는 이들의 임의의 조합에서 일어날 수 있다.
[0090] 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제와 유전체 편집 시스템을 세포(들)에 투여하면, 상기 DNA-PK 억제제와 유전체 편집 시스템을 세포(들)에 투여하지 않은 조건과 비교했을 때, 표적화된 유전체 편집 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 효율은, 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템이 투여되지 않은 조건에 비해, 또는 세포(들)에 유전체 편집 시스템만 투여되고 DNA-PK 억제제는 투여되지 않은 조건에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 증가된다. 상기 유전체 편집의 효율은, 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 표적화된 폴리뉴클레오타이드 통합의 빈도수를 확인하는 임의의 방법이나, 또는 표적화된 돌연변이 유발의 빈도수를 측정함으로써 측정될 수 있다. 또한, 표적화된 폴리뉴클레오타이드 통합도 유전체, 염색체 또는 세포 염색질에서 관심대상 영역의 서열의 변경 또는 치환을 유도할 수 있다. 표적화된 폴리뉴클레오타이드 통합은, 이에 제한되지는 않지만, 점 돌연변이 (즉, 단일 염기쌍의 다른 염기쌍으로의 전환), 치환 (즉, 복수의 염기쌍의 동일한 길이의 다른 서열로의 전환), 하나 이상의 염기쌍의 삽입, 하나 이상의 염기쌍의 결실 및 상기 언급한 서열 변경들의 임의의 조합을 포함하는 표적화된 돌연변이를 유도할 수 있다.
[0091] 일부 실시양태에서, 세포(들)의 하나 이상의 표적 유전체 영역을 편집하는 방법은 상기 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하는 단계를 수반한다. 일부 실시양태에서, 세포(들)은 S 또는 G2 기의 세포주기 에서 동기화된다. S 또는 G2 기의 세포 주기에서 세포(들)을 동기화시키는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예로서, S 또는 G2 기의 세포주기에서 세포(들)을 동기화시키는데 사용될 수 있는 제제로는 아피디콜린, 하이드록시우레아, 로바스타틴, 미모신, 노코다졸, 티미딘 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. (문헌 [Lin et al."Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery," Elife. 2014 Dec 15;3] 참조). 일부 실시양태에서, 세포 동기화를 위한 제제는 유전자 편집 과정을 수행하는 동안에는 언제든지 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전체 편집 시스템 및/또는 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후에 S 또는 G2 기의 세포주기에서 세포(들)을 동기화시킬 수 있다.
[0092] 일부 실시양태에서, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하여 상기 세포(들)에서 하나 이상의 표적 유전체 영역을 편집하는 방법은, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하지 않은 조건, 또는 DNA-PK 억제제는 놔두고 유전자 편집 시스템만을 세포(들)과 접촉시키거나 세포(들)에 투여한 조건과 비교하였을 때, 세포 생존율을 증가시킬 수 있다.
[0093] 일부 실시양태에서, HDR 경로를 통해 하나 이상의 표적 유전체 영역의 DNA 절단을 복구하는 방법이 본원에 제공된다. 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하면, 상기 유전체의 표적화된 영역의 DNA 절단을 유도하게 되고, 그 후 상기 DNA 절단은 HDR 경로에 의해 적어도 부분적으로 복구된다. 이러한 방법들은, 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템을 투여하지 않은 조건과 비교했을 때, 하나 이상의 표적 유전체 영역에서 HDR 매개형 복구(예컨대, HDR 경로)의 양을 증가시켜, HDR 매개형 복구의 효율을 크게 증가시키게 된다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA 절단에 대한의 HDR 경로 매개형 복구의 효율은, 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템이 투여되지 않은 조건에 비해, 또는 세포(들)에 유전체 편집 시스템만 투여되고 DNA-PK 억제제는 투여되지 않은 조건에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 증가된다. 상기 HDR 경로 매개형 복구의 효율은, 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 표적화된 폴리뉴클레오타이드 통합의 빈도수를 확인하거나, 또는 표적화된 돌연변이 유발의 빈도수를 측정함으로써 측정될 수 있다.
[0094] 일부 실시양태에서, 본원에서는 HDR 경로의 효율을 증가시킴으로써 DNA 절단을 복구하는 방법을 제공한다.
[0095] 상기 HDR 경로는 "표준법" 또는 "대안법"일 수 있다. "HDR" (상동성 지향 복구)은, 예를 들어 세포(들)에서 이중 가닥 절단이나 DNA 닉(nick)을 복구하는 동안에 나타나는 전문화된 형태의 DNA 복구를 지칭한다. 이중 가닥 절단의 HDR은 일반적으로 뉴클레오타이드 서열 상동성을 기반으로 하고, "표적" 분자 (예를 들어, 이중 가닥 절단이 된 분자)의 주형 복구에 대하여 "공여체" 분자를 사용하여, 상기 공여체의 유전자 정보를 상기 표적으로 이동시킬 수 있다. 이중 가닥 절단의 표준 HDR은 일반적으로 BRCA2 및 RAD51을 기반으로 하며, 통상 dsDNA 공여체 분자를 사용한다. 비표준 방식, 즉 "대안" HDR은 BRCA2, RAD51 및/또는 기능 관련 유전자에 의해 억제되는 HDR 기전이다. 대안적인 HDR은 ssDNA 또는 닉이 있는 dsDNA 공여체 분자를 사용할 수 있다. 예를 들어, WO 2014172458를 참조한다.
[0096] 일부 실시양태에서, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하여 HDR 경로를 통해 하나 이상의 표적 유전체 영역의 DNA 절단을 복구하는 방법은, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하지 않은 조건, 또는 DNA-PK 억제제는 놔두고 유전자 편집 시스템만을 세포(들)에 투여한 조건에 비해, 세포 생존율을 증가시킬 수 있다.
[0097] 일부 실시양태에서, 세포(들)에서 하나 이상의 표적 유전체 영역의 DNA 절단의 NHEJ 매개형 복구를 억제 또는 저해하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, DNA 절단의 NHEJ 매개형 복구의 억제 또는 저해는 NHEJ 경로를 억제 또는 저해함으로써 이루어진다. 상기 NHEJ 경로는 고전적 ("표준") 또는 대안적 NHEJ 경로 [alt-NHEJ, 또는 미세상동성(microhomology) 매개형 말단 접합 (MMEJ)]일 수 있다. 상기 NHEJ 경로 또는 alt-NHEJ 경로는 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여함으로써 세포(들) 중에서 저해된다.
[0098] 상기 고전적 NHEJ 복구 경로는 이중 가닥 절단의 말단이 광범위한 상동성 없이도 결찰되는 DNA 이중 가닥 절단 복구 경로이다. 고전적 NHEJ 복구는 KU70/80 이종이합체 (KU), XRCC4, 리가제 IV 및 DNA 단백질 키나제 촉매 서브유닛 (DNA-PKcs)을 비롯한 여러 가지 인자들을 사용한다. Alt-NHEJ는 이중 가닥 절단을 복구하는 또 다른 경로이다. Alt-NHEJ는 상기 절단 말단부들을 정렬하는데 5-25개의 염기쌍의 미세상동성 서열을 사용하여 상기 절단된 말단부를 접합시킨다. Alt-NHEJ는 KU70/80 이종이합체 (KU), XRCC4, 리가제 IV, DNA 단백질 키나제 촉매 서브유닛 (DNA-PKcs), RAD52 및 ERCC1과는 대체로 독립적이다. 문헌 [Bennardo et al., "Alternative-NHEJ is a Mechanistically Distinct Pathway of Mammalian Chromosome Break Repair," PLOS Genetics, June 27, 2008]을 참고한다.
[0099] 일부 실시양태에서, 세포(들)에 대한 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제 투여를 통해 NHEJ 경로를 억제 또는 저해함으로써 세포(들)의 하나 이상의 표적 유전체 영역에서 NHEJ 경로를 통한 DNA 절단의 NHEJ 매개형 복구를 억제 또는 저해하는 방법은, 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여받지 않은 세포(들)에 비해, 또는 세포(들)이 유전체 편집 시스템은 투여받았으나 DNA-PK 억제제를 투여받지 않은 조건에 비해, DNA 절단의 NHEJ 매개형 복구의 억제 또는 저해 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포(들)을 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템과 접촉시킴으로써 NHEJ 경로를 통한 DNA 절단의 복구를 억제 또는 저해하는 효율은, 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템이 투여되지 않은 조건에 비해, 또는 세포(들)에 유전체 편집 시스템만 투여되고 DNA-PK 억제제는 투여되지 않은 조건에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 증가된다. NHEJ 경로를 통한 DNA 절단의 복구를 억제 또는 저해하는 효율은, 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 표적화된 폴리뉴클레오타이드 통합의 빈도수를 확인하거나, 또는 표적화된 돌연변이 유발의 빈도수를 측정함으로써 측정될 수 있다.
[00100] 일부 실시양태에서, 세포(들)에 대한 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제 투여를 통해 NHEJ 경로를 억제 또는 저해함으로써 세포(들)의 하나 이상의 표적 유전체 영역에서 DNA 절단의 NHEJ 매개형 복구를 억제 또는 저해하는 방법은, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 접촉시키거나 투여하지 않은 조건에 비해, 또는 세포(들)에 유전체 편집 시스템만 투여하고 DNA-PK 억제제는 투여하지 않은 조건에 비해, 세포 생존율을 증가시킬 수 있다.
[00101] DNA 절단은 이중 가닥 절단 (DSB) 또는 2개의 단일 가닥 절단 (예컨대, 2개의 DNA 닉)일 수 있다. 상기 DSB는 블런트형 말단일 수 있거나, 5' 또는 3' 오버행을 함유할 수 있는데, 가닥들이 각각 너무 멀리 떨어져서 쪼개지게 되는 경우에는, 상기 오버행들은 서로 계속 어닐링하여 하나의 DSB가 아닌 2개의 닉으로 존재하게 될 것이다.
[00102] 일부 실시양태에서, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여함으로써 하나 이상의 유전자 (표적 유전자(들)) 및/또는 상응하거나 후속하는 단백질의 발현을 변형시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 예를 들어, 세포(들)의 표적 유전자(들)의 표적 유전체 영역(들)에서 삽입, 결실, 치환, 변형 또는 붕괴를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 삽입, 결실, 치환, 변형 또는 붕괴는 특정 단백질 또는 단백질군 또는 후속 단백질들의 표적화된 발현을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 비암호화 영역 또는 암호화 영역에서 삽입, 결실 또는 치환을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 프로모터 영역, 인핸서 영역 및/또는 임의의 기타 유전자 조절 요소, 예컨대 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, 사일렌서 영역, 절연체 영역, 항저해제, 번역후 조절 요소, 폴리아데닐화 신호 (예컨대, 최소 폴리 A), 보존된 영역, 전사 인자 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합에서 삽입, 결실, 치환, 변형 또는 붕괴를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전체 편집 시스템은 하나 이상의 표적 영역에서, 동시에 또는 순차적으로 삽입, 결실, 치환, 변형 또는 붕괴를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하면, 상기 세포(들)에서 표적화 변형된 유전자 발현을 이끌어낼 수 있다. 이러한 표적화 변형된 유전자 발현은 특정 단백질 및 이의 후속 단백질들의 발현으로 이어질 수 있다.
[00103] 일부 실시양태에서, 상기 후속 유전자 및/또는 단백질의 발현은, 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템이 투여되지 않은 조건에 비해, 또는 세포(들)에 유전체 편집 시스템만 투여되고 DNA-PK 억제제는 투여되지 않은 조건에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배 또는 10배 증가된다.
[00104] 일부 실시양태에서, 상기 후속 유전자 및/또는 단백질의 유전자 발현은, 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템이 투여되지 않은 조건에 비해, 또는 세포(들)에 유전체 편집 시스템만 투여되고 DNA-PK 억제제는 투여되지 않은 조건에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 감소된다.
[00105] 본원의 방법의 세포는 임의의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 척추동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 척추동물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 척추동물 세포는 인간 세포이다.
[00106] 상기 세포는 모든 발달 단계의 임의 종류의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 분화된 세포, 분화전능성 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 성체 줄기 세포, 전구 세포, 유도된 만능 줄기 세포 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 분화된 세포는 조직에서 특정 기능을 수행하는 전문화된 세포이다. 분화전능성 줄기 세포는 배아, 태아 또는 성체의 미분화된 세포로서, 장기간 동안 분열하여 유기체의 3가지 배엽층 중 임의의 세포 유형으로 분화하는 능력을 보유할 수 있다. 만능 줄기 세포는 배아, 태아 또는 성체의 미분화된 세포로서, 장기간 동안 분열하여 유기체의 임의의 세포 유형 (배아외 조직 또는 태반은 제외)으로 분화하는 능력을 보유할 수 있다. 배아 줄기 세포는 배아의 내부 세포 덩어리에서 발견되는 미분화된 줄기 세포로서, 3가지 배엽층 중 임의의 세포 유형으로 분화하는 능력을 보유한다. 배아 생식 세포는 정자 세포 또는 난자 세포와 같은 생식 세포를 만들 수 있는 배아 세포이다. 성체 줄기 세포는 분화된 조직에서 발견되며 자기 재생이 가능하고 이들이 귀속된 조직의 임의의 세포로 분화될 수 있는 미분화된 세포이다. 전구체 또는 전구 세포는 일반적으로 한 종류의 세포 (예컨대, 단분화능 세포)로만 분화할 수 있는 부분적으로 분화된 세포이다. 유도된 만능 줄기 세포는 분화되거나 부분적으로 분화된 성체 세포로부터 생성되는 일종의 만능 줄기 세포이다. 예를 들어, WO/2010/017562호를 참고한다.
[00107] 본원에서 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는, 문맥상 명백하게 달리 언급하지 않는 한, 복수에 대한 언급도 포함한다. 예를 들어, "세포"라는 용어는 이들의 혼합물을 비롯한 여러 개의 세포들도 포함한다. 예를 들어, "하나 이상의 세포" 및 "세포(들)"은 본원에서 서로 교환하여 사용된다. 마찬가지로, "하나 이상의 표적 유전체 영역" 및 "표적 유전체 영역(들)"은 본원에서 서로 교환하여 사용된다.
[00108] "대략" 및 "약"이라는 용어는 본원에서 서로 교환하여 사용된다. 하나 이상의 관심대상 값에 적용되는 "대략" 또는 "약"이라는 용어는 언급한 기준 값과 유사한 값을 가리킨다. 특정 실시양태에서, "대략" 또는 "약"이라는 용어는, 달리 언급하지 않거나 또는 문맥상 분명한 경우가 아닌 한, 언급한 기준 값에서 (초과 또는 미만이 되는) 한 방향으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하에 속하게 되는 값의 범위를 지칭한다 (이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
[00109] "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어들은 서로 교환하여 사용된다. 이들은 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드로서, 데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA) 또는 리보뉴클레오타이드 (RNA) 또는 이들의 유사체를 가리킨다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지 또는 미공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예들이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비암호화 영역, 결합 분석에서 정의되는 유전자좌, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 분리된 임의 서열의 DNA, 분리된 임의 서열의 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 있는 경우, 상기 변형은 해당 중합체의 조립 전이나 후에 추가할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드의 서열은 뉴클레오타이드가 아닌 성분들에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 표지 성분과의 접합에 의한 것과 같은 중합 후에 추가로 변형될 수도 있다. "ssDNA"라는 용어는 단일 가닥 DNA 분자를 의미한다. "ssODN"라는 용어는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드를 의미한다.
[00110] 본원에서 언급하는 "천연 뉴클레오타이드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에서 언급하는 "변형된 뉴클레오타이드"라는 용어는 변형되거나 치환된 당기(sugar group) 등을 함유하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에서 언급하는 "올리고뉴클레오타이드 결합"이라는 용어는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포르아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오타이드 결합을 포함한다. 필요하다면, 올리고뉴클레오타이드는 검출용 표지를 포함할 수도 있다.
[00111] "합성 RNA"라는 용어는 조작되거나 비천연 RNA를 지칭한다.
[00112] 본원에 사용된 "야생형"이라는 용어는, 당업자라면 누구나 이해할 수 있는 당업계의 용어로서, 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는 자연에서 발생하는 유기체, 균주, 유전자 또는 특성의 일반적인 형태를 의미한다.
[00113] "비천연" 또는 "조작된"이라는 용어들은 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 인간의 수작업이 관여되었음을 의미한다. 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 언급하는 경우, 상기 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 자연계에서 선천적으로 결부되어 있고 자연계에서 발견되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미한다.
[00114] "상보성"이라는 말은, 전통적인 왓슨-크릭 또는 기타 비전통적인 유형에 의해 핵산이 또 다른 핵산과 수소 결합(들)을 형성하는 능력을 지칭한다. 상보성 비율(percent complementarity)이란 제2핵산 서열과 수소 결합 (예컨대, 왓슨-크릭 염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자의 잔기의 비율을 나타낸다 (예컨대, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개인 경우 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%의 상보성). "완전한 상보성"이란 핵산 서열의 모든 인접 잔기들이 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기들과 수소 결합한다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 "실질적으로 상보성"이라는 말은, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 가리키거나, 또는 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 2개의 핵산을 지칭한다.
[00115] 본원에 사용된 "발현"이라는 말은, 폴리뉴클레오타이드가 DNA 주형에서 (예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 해독되는 과정을 지칭한다. 전사체와 암호화된 폴리펩타이드를 총괄하여 "유전자 산물"로 지칭할 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드가 유전체 DNA에서 유래하는 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA 스플라이싱을 포함할 수 있다.
[00116] "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어들은, 본원에서 서로 교환하여 사용되어, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 아미노산이 아닌 것에 의해 중단될 수도 있다. 또한, 상기 용어들은 변형된 아미노산 중합체를 포함하는데; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 기타 조작을 사용하여 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 본원에 사용된 "아미노산"이라는 용어는, 글리신 및 D 또는 L의 두 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
[00117] 본원에서 "제제"라는 용어는 화합물, 소분자, 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로 제조된 추출물을 의미하는데 사용한다.
[00118] "대상체", "개체" 및 "환자"라는 용어들은 서로 교환하여 사용되는 것으로, 포유동물 또는 인간과 같은 척추동물을 지칭한다. 포유동물로는, 이에 제한되지는 않지만, 쥐과류, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함한다.
[00119] 본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화시키는" 또는 "개선하는"이란 용어들은 서로 교환하여 사용된다. 이러한 용어들은 치료적 유용성 및/또는 예방적 유용성을 포함하나 이에 제한되지 않는 유익하거나 바람직한 결과를 수득하기 위한 접근법을 가리킨다. 치료적 유용성이라는 것은 치료 중인 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상에 대한 치료적으로 적절한 개선 또는 효과를 의미한다. 예방적 유용성을 위해, 본 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상을 발생시킬 위험에 처한 대상체, 또는 상기 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지는 않았지만 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 호소하는 대상체에게 투여할 수 있다. 또한, 이러한 용어들은 (a) 질병의 억제하는 것, 즉 해당 질병의 발생을 저지 또는 예방하는 것; (b) 질병을 완화시키는 것, 즉 해당 질병 상태의 퇴행을 유발하는 것; 또는 (c) 질병을 치유하는 것을 포함하는, 포유동물, 예컨대 인간에서의 질병의 치료를 의미하기도 한다.
[00120] "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는 유익하거나 바람직한 결과를 가져오기에 충분한 제제의 양을 가리킨다. 상기 치료적 유효량은 치료될 대상체 및 질병 상태, 대상체의 체중과 연령, 질병 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상의 요인에 따라 달라질 수 있는데, 이 치료적 유효량은 당업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술한 임의의 한 촬영 기법에 의해 검출용 영상을 제공해주는 광량에도 적용된다. 구체적인 투여량은 선택된 특정 제제, 수반되는 투여 처방계획, 다른 화합물들과 병용 투여되는지의 여부, 투여 시기, 영상화할 조직 및 해당 제제가 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라서 달라질 수 있다.
[00121] 본원에 사용된 "투여하다"라는 말은, 세포 또는 대상체에 유전체 편집 시스템 및/또는 DNA-PK 억제제를 접촉, 주사, 분배, 전달 또는 적용하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 유전체 편집 시스템 및/또는 DNA-PK 억제제를 세포(들)과 접촉시키는 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 유전체 편집 시스템 및/또는 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 전달하는 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 유전체 편집 시스템 및/또는 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 적용하는 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 유전체 편집 시스템 및/또는 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 주사하는 것이다. 투여는 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 일어날 수 있다. 세포(들)에 대한 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제의 투여는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
[00122] 본원에 사용된 질환 또는 질병과 관련하여 "후천성"이라는 용어는, 출생시 존재하는 선천성 장애와는 대조적으로, 태아 단계 이후에 발생하는 장애 또는 의학적 질환을 의미한다. 선천성 장애가 후천성 장애보다 앞설 수 있다.
[00123] "선천성" 또는 "유전" 질환 또는 질병이라는 용어는 출생시 대상체에 존재하는 대상체의 유전체에서 발견되는 유전적 장애이다. 본원에 사용된 "유전체"는 핵과 세포질의 모든 유전 물질을 포함하며, 미토콘드리아 유전체 및 리보솜 유전체도 추가로 포함한다. 상기 선천성 또는 유전성은 대상체의 일생 동안 어느 때라도, 예를 들어 출생시 또는 성인기에 발현될 수 있다.
[00124] "유전적 장애" 또는 "유전성 질환"이라는 용어는, 대상체의 유전체 중에서 질병을 유발하거나 유발할 수 있는 유전되거나 후천적으로 획득된 돌연변이를 포함한다.
[00125] "다형성" 또는 "유전적 변이"라는 용어들은 유전자좌에서 유전자의 서로 다른 형태들을 의미한다.
[00126] "바이러스 벡터"는 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 숙주 세포로 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합에 의해 생산된 바이러스 또는 바이러스 입자로 정의된다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 키메라 바이러스 벡터 등이 포함된다. 유전자 전달이 레트로바이러스 벡터에 의해 매개되는 일부 실시양태에서, 벡터 작제물이란 레트로바이러스 유전체 또는 이의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.
[00127] 본 발명의 일부 실시양태는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템, 또는 그와 같은 벡터 자체에 관한 것이다. 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 CRISPR 전사체 (예컨대, 핵산 전사체, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사체는 대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포 (바큘로바이러스 발현 벡터를 사용함), 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다.
[00128] 상기 세포는 1차 세포, 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 배아 줄기 세포 (hESC), 성체 줄기 세포, 전구 세포 또는 세포주일 수 있다. "1차 세포"는 생물 조직으로부터 직접 채취하여 증식을 위해 시험관 내에 정치시킨 세포이다. 1차 세포는 모집단 배가를 거의 하지 않아서, 시험관 내에서 모집단 배가 집단에 비해 한정된 수명을 갖는다. "줄기 세포", "배아 줄기 세포" 및 "유도된 만능 줄기 세포"는 자기 재생이 가능하고, 특화한 기능을 갖는 서로 다른 유형의 세포들로 분화될 잠재력이 있는 아직 특화 및 분화되지 않은 세포를 말한다. "세포주"는 무한정 증식할 수 있는 하나의 세포 유형 또는 동일한 유형의 세포군에서 유래한 세포 배양물을 포함한다. 포유동물 세포주의 비제한적인 예로는 CD34 세포, 293 세포, HEK 세포, CHO 세포, BHK 세포, CV-1 세포, 저캇(Jurkat) 세포, HeLa 세포, 또는 이들의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
[00129] 일부 실시양태에서, 벡터는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포 중에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 pCDM8 및 pMT2PC를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 일반적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 유인원 바이러스 40 및 기타 본원에서 개시되고 당업계에 공지된 것들로부터 유래한다. 다른 프로모터로는, 예를 들어 EF1 프로모터 또는 EF1 알파 프로모터를 포함할 수 있다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템에 대해서는, 예컨대, 문헌 [Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 16장과 17장을 참조한다.
[00130] 본원에 사용된 "표지" 또는 "표지된"이라는 용어는, 예컨대 방사성표지된 아미노산의 도입 또는 마킹된 아비딘 (예컨대, 광학적 방법 또는 비색법으로 측정가능한 형광 마커 또는 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출가능한 비오틴 모이어티의 폴리펩타이드로의 부착에 의한 검출가능한 마커의 도입을 가리킨다. 어떠한 경우에는, 상기 표지 또는 마커는 치료제일 수도 있다. 폴리펩타이드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있어 이를 사용할 수 있다. 폴리펩타이드용 표지의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종 (예컨대, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 표지 (예컨대, FITC, 로다민, 란탄 계열의 인광체), 효소 표지 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, p-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광체, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프 (예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지는 다양한 길이의 스페이서 아암으로 부착시켜 잠재적인 입체 장애를 감소시킨다. 본원에 사용된 "약학적 제제 또는 약물"이라는 용어는, 환자에게 적절하게 투여되는 경우에 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 가리킨다.
[00131] 본원에 사용된 "실질적으로 순수한"이라는 말은 대상 화학종이 우세하게 존재하는 화학종임을 의미한다 (즉, 몰 기준으로, 조성물 중의 임의의 다른 각각의 화학종들보다 더 풍부함). 일부 실시양태에서, 실질적으로 정제된 분획이란, 대상 화학종이 존재하는 모든 거대분자 화학종들 중에서 적어도 약 50% (몰 기준)를 차지하는 조성물이다.
[00132] 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 해당 조성물에 존재하는 모든 거대분자 화학종들 중에서 약 80% 이상을 차지할 것이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 순수한 조성물은 해당 조성물에 존재하는 모든 거대분자 화학종들 중 약 85%, 90%, 95% 및 99% 이상을 차지할 것이다. 일부 실시양태에서, 대상 화학종은 본질적으로 균질한 상태 (오염물 화학종들이 통상적인 검출법으로 조성물 중에서 검출되지 않음)가 될 때까지 정제하며, 이때 해당 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 화학종으로 이루어지게 된다.
유전체 편집 시스템
[00133] 다양한 유형의 유전체 공학 시스템을 사용할 수 있다. "유전체 편집 시스템", "유전자 편집 시스템" 등의 용어들은 본원에서 서로 교환하여 사용되는 것으로, 표적 유전자 또는 이의 기능 또는 발현을 편집하는 시스템 또는 기술을 지칭한다. 유전체 편집 시스템은, 표적 유전체 영역(들) (또는 표적 서열(들))의 개열을 가능하게 하는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제 성분; 및 상기 엔도뉴클레아제 성분을 표적 유전체 영역(들)으로 데려가거나 표적화하는 하나 이상의 유전체 표적화 성분을 포함한다. 유전체 표적화 성분의 예로는, DNA 결합 도메인 (예컨대, 징크 핑거 DNA 결합 단백질 또는 TALE DNA 결합 도메인), 가이드 RNA 성분 (예컨대, CRISPR 가이드 RNA) 및 가이드 DNA 성분 (예컨대, NgAgo 가이드 DNA)을 포함한다. 프로그램가능한 유전체 표적화 및 엔도뉴클레아제 성분들은 특정 유전체 유전자좌에서 이중 가닥 절단 (DSB)과 같은 DNA 손상을 도입함으로써 정확한 유전체 편집을 할 수 있도록 한다. 그 후, DSB는 비상동성 말단 접합 (NHEJ) 또는 상동성 지향 복구 (HDR)를 위한 내인성 복구 기구를 해당 DSB 부위로 동원하여 유전체 편집을 조율하게 된다. 상기 "엔도뉴클레아제 성분"은 엔도뉴클레아제 또는 이러한 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함한다.
[00134] "엔도뉴클레아제"라는 용어는 DNA 또는 RNA 분자 내의 핵산들 간의 결합의 가수분해 (개열)를 촉진할 수 있는 임의의 야생형, 돌연변이체, 변이체 또는 조작된 효소를 지칭한다. 엔도뉴클레아제는 그의 표적 유전체 영역에서 DNA 또는 RNA 분자를 인식하여 절단시킬 수 있다. 엔도뉴클레아제의 예로는 귀환(homing) 엔도뉴클레아제; FokI와 같은 제한 효소; 조작된 징크 핑거 도메인과 FokI와 같은 제한 효소의 촉매 도메인과의 융합으로 생성된 키메라 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN); Cas 효소 및 Cpf 효소를 포함한다. 화학적 또는 펩타이드성 개열제가 핵산의 중합체 또는 특정 표적 서열을 인식하는 또 다른 DNA에 접합됨으로써 절단 활성을 특정 서열에 표적화하는 화학적 엔도뉴클레아제도 "엔도뉴클레아제"라는 용어에 포함된다. 화학적 엔도뉴클레아제의 예로는, 오르쏘페난트롤린의 접합체와 같은 합성 뉴클레아제, DNA 절단 분자 및 삼중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오타이드 (TFO)를 포함한다.
[00135] "변이체"라는 말은, 모체 단백질의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 잔기를 다른 아미노산으로 치환하여 수득된 재조합 단백질을 의미하고자 한 것이다.
[00136] 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제, 예컨대 ZFN, TALEN 및/또는 메가뉴클레아제는 절단 도메인 및/또는 절단 반(half) 도메인을 포함한다. 상기 절단 도메인은 DNA 결합 도메인과 상동성이거나 이종성일 수 있다. 예를 들어, 한 뉴클레아제의 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 절단 도메인 또는 서로 다른 뉴클레아제의 메가뉴클레아제 DNA 결합 도메인과 절단 도메인이 사용될 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀환 엔도뉴클레아제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, WO2013/130824호를 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소들에 대해서도 공지되어 있다 (예컨대, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌 [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]도 참조한다). 하나 이상의 이러한 효소들 (또는 이의 기능적 단편들)을 절단 도메인 및 절단 반도메인의 공급원으로 사용할 수도 있다.
[00137] 절단 반도메인은, 절단 활성을 위해 이합체화가 필요한 상기 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질이 절단 반도메인을 포함하는 경우에는 절단을 위해 2개의 융합 단백질이 필요하다. 일부 실시양태에서, 2개의 절단 반도메인을 포함하는 하나의 단백질이 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 상기 2개의 절단 반도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 절단 반도메인은 서로 다른 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)로부터 유래할 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질의 각각의 표적 부위에 대한 결합이, 예컨대 이합체화에 의해 절단 반도메인으로 하여금 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있게끔 하는 서로에 대한 공간 배향으로 상기 절반 반도메인들이 놓이도록, 상기 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위들은 서로에 대해 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위의 가까운 가장자리들은 5-50개의 뉴클레오타이드, 5-8개의 뉴클레오타이드 또는 15-18개의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 있다. 임의의 정수개의 뉴클레오타이드들 또는 뉴클레오타이드 쌍이 2개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다 (예컨대, 2 내지 50개의 뉴클레오타이드 쌍 또는 그 이상). 일부 실시양태에서, 절단 부위는 표적 부위들 사이에 있다.
[00138] 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 여러 종들에 존재하며, (인식 부위에서) DNA에 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 부위 또는 그 근방에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예컨대, IIS형)는 DNA를 해당 부위에서 절단하여 인식 부위로부터 제거하고, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok I는 DNA의 이중 가닥 절단을 촉진한다. 예를 들어, 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라, 문헌 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279]; [Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768]; [Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887]; [Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]를 참조한다.
[00139] 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 성분은, 하나 이상의 IIS형 제한 효소의 절단 도메인 (또는 절단 반도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인 (이들은 조작되거나 조작되지 않을 수도 있음)을 포함하는 융합 단백질(들)을 포함한다. 절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는 예시적인 IIS형 제한 효소로는 Fok I을 들 수 있다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다. 문헌 [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575]. 이러한 융합 단백질에 사용된 Fok I 효소의 일부는 절단 반도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거 또는 TALE-Fok I 융합을 이용하여 세포 서열들의 표적화 이중 가닥 절단 및/또는 표적화 치환을 위해서, Fok I 절단 반도메인을 각각 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 다르게는, 징크 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 반도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자도 사용될 수 있다.
[00140] 예시적인 IIS형 제한 효소들에 대해서는 국제 공보 WO 07/014275호 (전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. 추가의 제한 효소들도 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하며, 이들도 본 발명에서 고려된다. 예를 들어, 문헌 [Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
[00141] 특정 실시양태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 미국 특허 공보 20050064474호 및 20060188987호 및 WO 2013/130824호에 기재된 바와 같이, 동종이합체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 반도메인 (이합체화 도메인 돌연변이체로도 지칭함)을 포함한다. 절대 이종이합체(obligate heterodimer)를 형성하는 Fok I의 조작된 절단 반도메인의 예로는, 제1 절단 반도메인이 Fok I의 490번과 538번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고, 제2 절단 반도메인이 486번과 499번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다. 예컨대, 미국 특허 공보 2008/0131962 및 2011/0201055호를 참조한다. 본원에 기술한 조작된 절단 반도메인은 임의 적절한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 공보 20050064474호 및 20080131962호에 기술된 야생형 절단 반도메인 (Fok I)의 부위 특이적 돌연변이 유발법에 의해 제조될 수 있다.
[00142] "편집하다", "편집하고", "편집하는" 등의 용어는 임의 유형의 조작, 변경, 변형 또는 조절을 지칭한다 (각각의 경우, 이에 제한되지는 않지만, 유전자 녹아웃, 유전자 태깅, 유전자 붕괴, 유전자 돌연변이, 유전자 삽입, 유전자 결실, 유전자 활성화, 유전자 사일런싱 또는 유전자 녹인을 포함함).
[00143] 본원에 사용된 "유전자 변형", "유전체 편집", "유전체 변형", "유전자 변형" 및 "유전자 편집"이란, 세포의 뉴클레오타이드에 대한 임의의 유전자 첨가, 결실, 녹아웃, 녹인, 태깅, 돌연변이화, 활성화, 사일런싱, 변형 및/또는 붕괴를 가리킨다. 상기 문맥상 세포는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외일 수 있다.
[00144] "표적 유전체 영역", "표적 유전자", "DNA 표적", "DNA 표적 서열", "표적 서열", "표적 뉴클레오타이드 서열", "표적 부위", "표적", "관심대상 부위", "인식 부위", "폴리 뉴클레오타이드 인식 부위", "인식 서열", "절단 부위"라는 것은, 유전체 편집 시스템에 의해 인식되어 절단되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미하고자 한 것이다. 이러한 용어들은, DNA 절단 (개열)이 유전체 편집 시스템에 의해 유도되는 특징적인 DNA 위치, 바람직하게는 유전체 위치를 가리킨다.
[00145] 조작, 변경, 변형 및 조절을 포함하는 상기 편집은 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 유전체 편집 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 계열 뉴클레아제 (TALEN) 기반 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템이다.
[00146] 메가뉴클레아제 기반, ZFN 기반 및 TALEN 기반 시스템은 각각, 하나 이상의 DNA 결합 도메인 또는 상기 DNA 결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하여, 단백질-DNA 상호작용을 통해 표적 유전체 영역(들)의 특이적 표적화 또는 인식을 달성한다. CRISPR 기반 시스템은 적어도 하나의 가이드 RNA 성분 또는 상기 가이드 RNA 성분을 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하여, 염기쌍을 통해 직접적으로 표적 유전체 영역(들)의 DNA 표적 유전체 영역(들)에 대한 특이적 표적화 또는 인식을 달성한다. NgAgo 기반 시스템은 적어도 하나의 가이드 DNA 성분 또는 상기 가이드 DNA 성분을 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하여, 염기쌍을 통해 직접적으로 표적 유전체 영역(들)의 DNA 표적 유전체 영역(들)에 대한 특이적 표적화 또는 인식을 달성한다.
[00147] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 메가뉴클레아제 기반 시스템이다. 메가뉴클레아제 기반 시스템은 큰 (>14 bp) 인식 부위를 갖는 엔도뉴클레아제인 메가뉴클레아제를 사용하며, 그의 DNA 결합 도메인 역시 표적 서열의 절단을 담당한다. 상기 메가뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 12 내지 45 bp의 이중 가닥 DNA 표적 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 메가뉴클레아제는 이량체 효소인데, 이 경우 각 메가뉴클레아제 도메인은 단량체 상에 존재하거나, 또는 단일 폴리펩타이드 상에 상기 두 도메인을 포함하는 단량체 효소이다. 무수히 많은 독특한 서열 조합들을 다루기 위해, 야생형 메가뉴클레아제 뿐만 아니라 다양한 메가뉴클레아제 변이체들을 단백질 공학 기법으로 제조하였다. 일부 실시양태에서, 인식 부위의 절반은 메가뉴클레아제 A 및 나머지 절반은 단백질 B로 이루어진 인식 부위를 갖는 키메라 메가뉴클레아제도 사용될 수 있다. 이러한 키메라 메가뉴클레아제의 구체적인 예로는 I-DmoI 및 I-CreI의 단백질 도메인을 포함하는 것들을 포함한다. 메가뉴클레아제의 예로는 LAGLIDADG 계열의 귀환 엔도뉴클레아제를 포함한다.
[00148] 상기 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-ChuI, I-CreI, I-CsmI, PI-SceI, PI-TliI, PI-MtuI, I-CeuI, I-SceII, I-SceIII, HO, PI-CivI, PI-CtrI, PI-AaeI, PI-BsuI, PI-DhaI, PI-DraI, PI-MavI, PI-MchI, PI-MfuI, PI-MflI, PI-MgaI, PI-MgoI, PI-MinI, PI-MkaI, PI-MleI, PI-MmaI, PI-MshI, PI-MsmI, PI-MthI, PI-MtuI, PI-MxeI, PI-NpuI, PI-PfuI, PI-RmaI, PI-SpbI, PI-SspI, PI-FacI, PI-MjaI, PI-PhoI, PI-TagI, PI-ThyI, PI-TkoI, PI-TspI 또는 I-MsoI일 수 있거나; 또는 동종이합체, 이종이합체 또는 단량체의 여부와 무관하게 기능성 돌연변이체 또는 이의 변이체일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 상기 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 I-CreI 유도체이다. 일부 실시양태에서, 상기 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 천연 I-CreI LAGLIDADG 메가뉴클레아제와 적어도 80%의 유사성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 상기 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 천연 I-CreI LAGLIDADG 메가뉴클레아제의 1-152번 잔기와 적어도 80%의 유사성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 상기 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는, 링커 펩타이드의 존재 또는 부재 하에 함께 결합된 천연 I-CreI LAGLIDADG 메가뉴클레아제의 1-152번 잔기와 적어도 80%의 유사성을 공유하는 2개의 단량체로 이루어질 수 있다.
[00150] 상기 "LAGLIDADG 메가뉴클레아제"는, 스토다드(Stoddard) 등 (Stoddard, 2005)이 정의한 바와 같은 LAGLIDADG 계열의 귀환 엔도뉴클레아제를 지칭하거나, 또는 상기 천연 귀환 엔도뉴클레아제와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상의 동일성 또는 유사성을 공유하는 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 변이체를 가리킨다. 이렇게 조작된 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 단량체 또는 이량체 메가뉴클레아제에서 유래할 수 있다. 이량체 메가뉴클레아제에서 유래하는 경우, 이러한 조작된 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 단쇄 또는 이량체성 엔도뉴클레아제일 수 있다.
[00151] "I-CreI"는 pdb 등록 코드 1g9y의 서열을 갖는 천연의 야생형 I-CreI 메가뉴클레아제를 의미한다. 메가뉴클레아제의 DNA 인식과 절단 기능은 일반적으로 단일 도메인 중에 혼재되어 있다. 메가뉴클레아제와는 달리, ZFN 기반 및 TALEN 기반 시스템의 DNA 결합 도메인은 절단 기능을 위한 엔도뉴클레아제와는 구별된다. ZFN 기반 시스템은, 그 DNA 결합 도메인으로서, 적어도 하나의 징크 핑거 단백질 또는 이의 변이체, 또는 상기 징크 핑거 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산; 및 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 Fok I 절단 도메인과 같은 엔도뉴클레아제 성분을 포함한다. 상기 징크 핑거 단백질 (ZFP)은 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비천연 발생적이다. 예를 들어, 문헌 [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141]; [Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; [Isalan ei al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; [Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637]; [Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct Biol. 10:411-416]; 미국 특허 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공보 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061호를 참조한다.
[00152] 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 천연 징크 핑거 단백질에 비해 새로운 결합 특이성을 보유할 수 있다. 조작 방법에는 합리적 설계 및 다양한 유형의 선별이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계에는, 예를 들어, 삼중항 (또는 사중항) 뉴클레오타이드 서열 (여기서, 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 서열은 각각 특정 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련됨) 및 각각의 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것이 포함된다. 예를 들어, 공유 지분이 있는 미국 특허 6,453,242호 및 6,534,261호를 참고한다.
[00153] 다양한 종류의 선별 방법들을 본원의 방법과 함께 사용할 수 있다. 파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 비롯한 예시적인 선별 방법에 대해서는, 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568호; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237호에도 개시되어 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상에 대해서는, 예를 들어 WO 02/077227호에 기재되어 있다.또한, 상기 문헌들 및 다른 참고문헌들에 개시되어 있는 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중 핑거형(multi-fingered) 징크 핑거 단백질들은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 비롯한 임의 적절한 링커 서열을 사용하여 함께 결합될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예시에 대해서는, 미국 특허 6,479,626호; 6,903,185호; 및 7,153,949호도 참조한다. 본원에 기재된 단백질들은 해당 단백질의 각 징크 핑거들 간에 적절한 링커의 임의의 조합도 포함할 수 있다. 표적 부위의 선별; 융합 단백질 (및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계와 구축을 위한 ZFP 및 방법들에 대해서는 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759호; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496호에 상세하게 기술되어 있다.
[00154] 또한, 상기 문헌들 및 다른 참고문헌들에 개시되어 있는 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중 핑거형 징크 핑거 단백질들은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 비롯한 임의 적절한 링커 서열을 사용하여 함께 결합될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예시에 대해서는, 미국 특허 6,479,626호; 6,903,185호; 및 7,153,949호도 참조한다. 본원에 기재된 단백질들은 해당 단백질의 각 징크 핑거들 간에 적절한 링커의 임의의 조합도 포함할 수 있다.
[00155] TALEN (전사 활성화제 유사 효과기 계열 뉴클레아제) 시스템은, 하나 이상의 TALE (전사 활성화제 유사 효과기)-DNA 결합 도메인, 및 Fok I 절단 도메인과 같은 엔도뉴클레아제 성분을 사용하는 유전체 편집 시스템을 가리킨다. 상기 TALE-DNA 결합 도메인은, 각각 길이가 30-38개 (예컨대, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개)인 아미노산을 갖는 하나 이상의 TALE 반복 단위를 포함한다. 상기 TALE-DNA 결합 도메인은 전장 TALE 단백질 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체를 사용할 수도 있다. 상기 TALE-DNA 결합 도메인은 링커에 의해 엔도뉴클레아제 도메인에 융합되거나 결합될 수도 있다.
[00156] "CRISPR 기반 시스템", "CRISPR 기반 유전자 편집 시스템", "CRISPR 유전체 편집", "CRISPR 유전자 편집", "CRISPR 엔도뉴클레아제 기반 유전체 편집" 등의 용어들은, 본원에서 서로 교환하여 사용되는 것으로, 하나 이상의 가이드 RNA 성분; 및 하나 이상의 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 성분을 포함하는 유전체 편집 시스템을 총괄하여 지칭한다. 상기 가이드 RNA 성분은 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 RNA, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함한다. 상기 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 성분은, 가이드 RNA 성분에 의해 표적 유전체 영역(들)으로 가이드되거나 유도된 엔도뉴클레아제; 또는 이러한 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 CRISPR 기반 유전자 편집 시스템의 예로는 CRISPR-Cas 시스템 또는 CRISPR-Cpf 시스템과 같은 CRISPR 기반 시스템을 포함한다.
[00157] 본원에 사용된 "가이드 RNA 성분", "가이드 RNA", "gRNA", "gRNA 분자" 및 "합성 가이드 RNA"라는 용어들은, 서로 교환하여 사용되는 것으로서, 표적 핵산 서열과 하이브리드화하는 표적화 RNA, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. gRNA의 표적화 RNA는 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함한다. "실질적으로 상보성"이라는 말은, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 가리키거나, 또는 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 2개의 핵산을 의미한다.
[00158] 가이드 RNA 성분은 표적화 RNA와 하이브리드화할 수 있는 활성화 RNA, 또는 상기 활성화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 상기 활성화 RNA 및 표적화 RNA는 분리되어 있거나, 링커 루프 서열을 통해 단일 핵산으로 융합되어 단일 gRNA 분자를 형성할 수 있다. gRNA 분자는 다수의 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 gRNA는, 예를 들어 5 '내지 3' 방향으로: (표적 핵산에 상보적인) 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; (제1 상보성 도메인에 상보적인) 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 임의로, 꼬리 도메인을 포함한다. WO2015048557호를 참조한다.
[00159] "제1 상보성 도메인"은 제2 상보성 도메인과 실질적인 상보성을 가지며, 적어도 일부 생리학적 조건 하에 이중 구조화된 영역을 형성할 수 있다.
[00160] "연결 도메인"은 제1 상보성 도메인을 단분자 gRNA의 제2 상보성 도메인과 연결시키는 기능을 한다. 상기 연결 도메인은 제1 및 제2 상보성 도메인을 공유 또는 비공유적으로 연결할 수 있다.
[00161] "근위 도메인"은 3-25개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 5-20개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 상기 근위 도메인은 천연 근위 도메인과 상동성을 공유하거나 그로부터 유래할 수도 있다.
[00162] "꼬리 도메인"은 존재하지 않거나, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 상기 꼬리 도메인은 서로에 대해 상보적이고, 적어도 일부 생리학적 조건 하에 이중 구조화된 영역을 형성하는 서열을 포함할 수 있다.
[00163] 상기 가이드 RNA 성분은 Cas 엔도뉴클레아제 ("gRNA/뉴클레아제 복합체")와 같은 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 성분의 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수도 있다. gRNA/뉴클레아제 복합체의 예로는 CRISR 기반 시스템과 관련하여 아래에 기술한 CRISPR 복합체를 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 CRISPR 복합체는 표적화 RNA와 복합체화된 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 시스템의 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 CRISPR 복합체는 표적화 RNA 및 활성화 RNA와 복합체화된 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 시스템의 엔도뉴클레아제를 포함한다.
[00164] 상기 표적화 RNA의 표적화 도메인은 표적 뉴클레오타이드 서열에 대한 gRNA/뉴클레아제 복합체의 특이적 표적화 또는 귀환을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 상기 표적화 도메인은 10-30개의 bp, 예컨대 15-25개의 bp, 18-22개의 bp 또는 20개의 bp일 수 있다.
[00165] 표적 도메인을 선별, 설계 및 검증하는 방법을 포함하는 gRNA를 설계하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO2015048577호, 문헌 [Mali et al., 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826]; [Hsu et al., 2013 NATBIOTECHNOL, 31(9): 827-32]; [Fu et al., 2014 NATBTOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574]; [Heigwer et al., 2014 NAT METHODS 11 (2): 122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216]; [Bae et al., 2014 BIOTNFORMATICS PubMed PMID: 24463181]; [Xiao A et al., 2014 BIOINFORMATICS Pub Med PMID: 24389662]을 참조한다.
[00166] 일부 실시양태에서, RNA 가이드된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas 효소 또는 단백질 (예컨대, II형 Cas9 단백질) 또는 Cpf 효소 또는 단백질 (예컨대, Cpf1 단백질)이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 Cas 또는 Cpf 효소 또는 단백질의 변형된 형태도 사용될 수 있다.
[00167] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cas 시스템이다. 상기 CRISPR-Cas 시스템은 하기를 포함한다: (a) 적어도 하나의 가이드 RNA 성분 또는 상기 가이드 RNA 성분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산으로서, 상기 가이드 RNA 성분이 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 RNA, 및 상기 표적화 RNA와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 활성화 RNA를 포함하는 것인, 상기 가이드 RNA 성분 또는 핵산; 및 (b) Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, Cas 단백질 성분. 상기 표적화 RNA 및 활성화 RNA는 분리되거나 단일 RNA로 함께 융합될 수 있다.
[00168] 일부 실시양태에서, 상기 CRISPR 기반 시스템은 클래스 1 CRISPR 및/또는 클래스 2 CRISPR 시스템을 포함한다. 클래스 1 시스템은 기능적 엔도뉴클레아제를 구축하기 위해 수개의 Cas 단백질과 함께 표적화 RNA로서 CRISPR RNA (crRNA)를 사용한다. 클래스 2 CRISPR 시스템은 단일 Cas 단백질과 표적화 RNA로서 crRNA를 사용한다. II형 Cas9 기반 시스템을 포함하는 클래스 2 CRISPR 시스템은, 클래스 1 시스템에서 사용되는 다중 서브유닛 복합체보다는 절단을 조율하기 위한 단일 Cas 단백질을 포함한다. 상기 CRISPR 기반 시스템은 Cpf1 단백질과 표적화 RNA로서 crRNA를 사용하는 클래스 II, V형 CRISPR 시스템도 포함한다.
[00169] 상기 Cas 단백질은 CRISPR 연관 (Cas) 이중 가닥 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 시스템은 Cas9 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Cas9 단백질은 SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 또는 D10A 니카제이다. Cas9 단백질과 같은 "Cas 단백질"이라는 용어는, 야생형 Cas 단백질 또는 이의 기능적 유도체 (예컨대, 뉴클레아제 활성을 갖는 야생형 Cas 단백질의 절단된 형태 또는 변이체)를 포함한다.
[00170] 일부 실시양태에서, S. 파이오진스(S. pyogenes) 및 S. 써모파일스(S. thermophiles) 이외의 종에서 유래한 Cas9 단백질을 사용할 수 있다. 입수하여 본원에서 사용할 수 있는 추가의 Cas9 단백질 종으로는 하기를 포함한다: 아시도보락스 아베네(Acidovorax avenae), 액티노바실러스 플뢰로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae), 액티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 액티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 액티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 사이클리필러스 데니트리피칸스(Cycliphilus denitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스미티(Bacillus smithii), 바실러스 트루린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피레룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실러스 라테로스포러스(Brevibacillus laterosporus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 돌리춤(Corynebacterium dolichum), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp.), 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아 종(Neisseria sp.), 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텔스(Phascolarctobacterium succinatutells), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스텔라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 또는 베르미네프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae).
[00171] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 시스템의 하나 이상의 성분들은 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템에서 유래한다.
[00172] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 시스템의 하나 이상의 성분들은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예컨대 스크렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 프레보텔라 종(Prevotella sp.), 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) 및 라크노스피라세애 종(Lachnospiraceae sp.)로부터 유래한다. 일반적으로, CRISPR 기반 시스템은 표적 유전체 영역 또는 표적 서열 부위 (내인성 CRISPR 시스템의 내용과 관련하여 프로토스페이서(protospacer)로도 지칭함)에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 성분들을 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성과 관련한 내용에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 실질적으로 상보성을 보유하도록 설계된 서열을 가리키는데, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유도하여 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재하는 한, 완전한 상보성이 반드시 요구되는 것은 아니다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 세포(들)의 핵 또는 세포질 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 진핵 세포(들)의 세포 소기관, 예를 들어 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 존재할 수 있다.
[00173] 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형을 "편집용 주형" 또는 "편집용 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집용 서열"로 지칭한다. 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드를 편집 주형 또는 공여체 주형으로 지칭할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 합성 또는 생물제제 기원의 단일 가닥 DNA 및 이중 가닥 DNA를 사용할 수 있다. 비제한적인 예로서, 적절한 편집용 주형으로는 ssODN, dsODN, PCR 생성물, 플라스미드; 및 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 등을 포함하는 바이러스를 포함한다. 추가의 편집용 주형들도 가능하다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합은 상동성 재조합이다.
[00174] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cas9 시스템이다. 상기 CRISPR-Cas9 시스템의 표적화 RNA는 CRISPR 표적화 RNA (crRNA)를 포함하고, 상기 CRISPR-Cas9 시스템의 활성화 RNA는 전사 활성화 CRISPR RNA (tracRNA)를 포함한다. 상기 CRISPR-Cas9 시스템의 Cas 단백질 성분은 Cas9 단백질을 사용한다. 상기 crRNA 및 tracrRNA는 분리되어 있거나, 링커 루프 서열을 통해 단일 RNA 작제물로 혼합될 수 있다. 상기 혼합된 RNA 작제물을 단일 가이드 RNA (sgRNA; 또는 가이드 RNA)라고 한다.
[00175] CRISPR-Cas 시스템, 이의 성분들 및 이러한 성분들의 전달에 관한 일반적인 정보들, 예컨대 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, AAV 및 함량과 제제화에 대한 것을 비롯한 이의 제조와 사용에 관해서는, 하기의 문헌들에서 찾아볼 수 있다: US 특허 8,999,641, 8,993,233, 8,945,839, 8,932,814, 8,906,616, 8,895,308, 8,889,418, 8,889,356, 8,871,445, 8,865,406, 8,795,965, 8,771,945 및 8,697,359; US 특허 공보 US 2014-0310830, US 2014-0287938 A1, US 2014-0273234 A1, US2014-0273232 A1, US 2014-0273231, US 2014-0256046 A1, US 2014-0248702 A1, US 2014-0242700 A1, US 2014-0242699 A1, US 2014-0242664 A1, US 2014-0234972 A1, US 2014-0227787 A1, US 2014-0189896 A1, US 2014-0186958, US 2014-0186919 A1, US 2014-0186843 A1, US 2014-0179770 A1 및 US 2014-0179006 A1, US 2014-0170753; 유럽 특허 EP 2 784 162 B1 및 EP 2 771 468 B1; 유럽 특허 출원 EP 2 771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6) 및 EP 2 784 162 (EP14170383.5); 및 PCT 특허 공보 PCT 특허 공보 WO 2014/093661, WO 2014/093694, WO 2014/093595, WO 2014/093718, WO 2014/093709, WO 2014/093622, WO 2014/093635, WO 2014/093655, WO 2014/093712, WO2014/093701, WO2014/018423, WO 2014/204723, WO 2014/204724, WO 2014/204725, WO 2014/204726, WO 2014/204727, WO 2014/204728, WO 2014/204729, 및 WO2016/028682호.
[00176] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 시스템은 CRISPR-Cpf 시스템이다. 상기 "CRISPR-Cpf 시스템"은 하기를 포함한다: (a) 적어도 하나의 가이드 RNA 성분 또는 상기 가이드 RNA 성분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산으로서, 상기 가이드 RNA가 표적 핵산의 유전자좌의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 RNA를 포함하는 것인, 상기 가이드 RNA 성분 또는 핵산; 및 (b) Cpf 단백질 또는 상기 Cpf 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
[00177] Cpf 단백질 성분의 예로는 Cpf1 뉴클레아제, 예컨대 프란시셀라 Cpf1 (FnCpf1) 및 이의 임의의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Zetsche et al., "Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system," Cell, 163(3): pages 759-71]; 및 [Fonfara et al., "The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA," Nature 532 (7600): pages, 517-21]를 참조한다. Cpf1의 바람직한 PAM은 5'-TTN인데, 이는 유전체 위치 및 GC 함량 모두에서 Cas9 (3'-NGG)와는 다르다. CRISPR-Cpf 시스템은 활성화 RNA (tracrRNA)를 사용하지 않는다. Cpf1 및 이의 가이드 RNA는 모두 일반적으로 이들의 SpCas9 대응물보다 작다. Cpf1 유전자좌는 혼성 알파/베타 도메인, RuvC-I에 이어서 나선형 영역, RuvC-II 및 징크 핑거 유사 도메인을 함유한다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC 유사 엔도뉴클레아제 도메인을 가진다. 또한, Cpf1은 HNH 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지 않으며, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파 나선형 인식 로브(lobe)를 가지지 않는다. Cpf1 유전자좌는 II형 시스템보다는 I형 및 III형과 더 유사한 Cas1, Cas2 및 Cas4 단백질을 암호화한다. Cpf1 계열의 단백질들은 다수의 박테리아 종들에서 발견될 수 있다.
[00178] 어떤 특정 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 상기 CRISPR-Cpf 시스템은, Cas9로 표적화되는 G-풍부 PAM과는 대조적으로, 프로토스페이서 인접 모티프인 5'-YTN-3' (여기서, "Y"는 피리미딘이고, "N"은 임의의 핵염기임) 또는 5'-TTN-3'의 식별에 의해 표적 DNA 또는 RNA를 절단하는 Cpf1-crRNA 복합체를 사용한다. PAM의 식별 후, Cpf1은 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드 오버행에 대한 점착성 말단형 DNA 이중 가닥 절단을 도입한다.
[00179] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 NgAgo 기반 시스템이다. 상기 NgAgo 기반 시스템은 적어도 하나의 가이드 DNA 성분 또는 상기 가이드 DNA 성분을 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 핵산; 및 DNA 가이드된 엔도뉴클레아제를 포함한다. 상기 NgAgo 기반 시스템은 가이드 성분으로 DNA를 사용한다. 그 작동 원리는 CRISPR-Cas9 기술의 원리와 유사하지만, CRISPR-Cas9 기술에서 가이드 성분은 gRNA라기 보다는 가이드 DNA (dDNA)의 분절이다. DNA 가이드된 엔도뉴클레아제의 예로는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi)의 아르고노트 엔도뉴클레아제(Argonaute endonuclease, NgAgo)를 들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Feng Gao et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute," Nature Biotechnology, (2016): doi:10.1038/nbt.3547]를 참고한다.
[00180] "링커", "펩타이드 링커", "펩타이드성 링커" 또는 "펩타이드 스페이서"라는 말은, 융합 단백질에서 서로 다른 단량체들의 연결과 상기 융합 단백질 활성을 위해 올바른 입체구조의 채택을 가능하게 하면서도 상기 단량체들의 활성을 변화시키지 않는 펩타이드 서열을 의미하고자 한 것이다. 펩타이드 링커는 비제한적인 범위로서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 내지 50개의 아미노산이나, 또는 상기 범위 내의 임의의 중간값의 크기일 수 있다.
DNA-PK 억제제
[00181] 일부 실시양태에서, 하기의 구조식 (I)으로 나타낸 화합물:
Figure pct00026
(I) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정이 사용된다.
[00182] m과 n은 독립적으로 1 또는 2이다.
[00183] X는 O 또는 NR이고; 여기서 R은 H 또는 C1-C4 알킬이다. R은 2H (D 또는 중수소)일 수도 있다. 본원에서, "중수소," "2H" 및 "D"라는 용어는 서로 교환하여 사용될 수 있다.
[00184] R1은 C1-C4-알킬이다.
[00185] R2는
[00186] N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고, 이 경우 상기 방향족 또는 헤테로방향족 고리는 CN, 할로, NO2, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시 및 C(=O)NHR1' (여기서, R1'는 C1-C4 알킬임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환기 R3으로 치환될 수 있거나; 또는 상기 방향족 또는 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00187] 다르게는, R2는 COOR4일 수도 있으며, 이 경우 R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.고리 A는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
[00188]
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
, 및
Figure pct00030
.
[00189] W는 N 또는 CR3이고; Z는 O 또는 S이며; 여기서 R3은 H (또는 2H) 또는 C1-C4 알킬이다.
[00190] 실시양태에서, A는
Figure pct00031
이다. 실시양태에서, R1은 메틸이다.
[00191] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
Figure pct00034
또는
Figure pct00035
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (I)의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00192] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이다.
[00193] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00036
이다.
[00194] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00037
이다.
[00195] .
[00196] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R1은 메틸이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00197] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00198] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00199] 실시양태에서, 구조식 (I) 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00200] 실시양태에서, 구조식 (I) 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00201] 실시양태에서, 구조식 (I)의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00202] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 구조식 (I)의 화합물의 비율은 약 2:1이다. 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 구조식 (I)의 화합물의 비율은 약 1:2이다. 실시양태에서, 공결정은 (구조식 (I)의 화합물)p:(CCF)q의 비율로 구조식 (I)의 화합물과 CCF를 포함한다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. (화학식 (I))p:(CCF)q. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00203] 실시양태에서, 구조식 (II)로 나타낸 화학식 (II)의 화합물,
[00204]
Figure pct00038
(II) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00205] 실시양태에서, R1은 메틸이다.
[00206] 실시양태에서, Y는 O 또는 NR이고; 여기서 R은 H 또는 C1-C4 알킬이다.
[00207] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00039
,
Figure pct00040
,
Figure pct00041
또는
Figure pct00042
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (II)의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00208] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이다.
[00209] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00043
이다.
[00210] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00044
이다.
[00211] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R1은 메틸이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00212] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00213] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00045
,
Figure pct00046
,
Figure pct00047
, 및
Figure pct00048
로 이루어지 군으로부터 선택된다.
[00214] 추가의 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00049
이다.
[00215] 일부 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00050
이다.
[00216] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00051
이다.
[00217] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00052
이다.
[00218] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00219] 실시양태에서, 구조식 (II) 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00220] 실시양태에서, 구조식 (II) 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00221] 실시양태에서, 구조식 (II)의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00222] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 구조식 (II)의 화합물의 비율은 약 2:1이다. 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 구조식 (II)의 화합물의 비율은 약 1:2이다. 실시양태에서, 공결정은 (구조식 (II)의 화합물)p:(CCF)q의 비율로 구조식 (II)의 화합물과 CCF를 포함한다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00223] 실시양태에서, 구조식 (II')로 나타낸 화학식 (II')의 화합물,
[00224]
Figure pct00053
(II') 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00225] 실시양태에서, R1은 메틸이다.
[00226] 실시양태에서, Y는 O 또는 NR이고; 여기서 R은 H 또는 C1-C4 알킬이다.
[00227] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00054
,
Figure pct00055
,
Figure pct00056
또는
Figure pct00057
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (II')의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00228] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이다.
[00229] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00058
이다.
[00230] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00059
이다.
[00231] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R1은 메틸이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00232] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00233] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00060
,
Figure pct00061
,
Figure pct00062
및
Figure pct00063
로 이루어지 군으로부터 선택된다.
[00234] 추가의 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00064
이다.
[00235] 일부 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00065
이다.
[00236] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00066
이다.
[00237] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00067
이다.
[00238] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00239] 실시양태에서, 구조식 (II') 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00240] 실시양태에서, 구조식 (II') 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00241] 실시양태에서, 구조식 (II')의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00242] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (II')의 비율은 약 2:1이다. 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (II')의 비율은 약 1:2이다. 실시양태에서, 공결정은 (화합물 (II'))p:(CCF)q의 비율로 화합물 (II')와 CCF를 포함한다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00243] 실시양태에서, 구조식 (II")로 나타낸 화학식 (II")의 화합물,
[00244]
Figure pct00068
(II") 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00245] 실시양태에서, R1은 메틸이다.
[00246] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00069
,
Figure pct00070
,
Figure pct00071
또는
Figure pct00072
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (II")의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00247] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이다.
[00248] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00073
이다.
[00249] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00074
이다.
[00250] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R1은 메틸이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00251] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00252] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00253] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00075
,
Figure pct00076
,
Figure pct00077
및
Figure pct00078
로 이루어지 군으로부터 선택된다.
[00254] 추가의 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00079
이다.
[00255] 일부 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00080
이다.
[00256] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00081
이다.
[00257] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00082
이다.
[00258] 실시양태에서, 구조식 (II") 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00259] 실시양태에서, 구조식 (II") 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00260] 실시양태에서, 구조식 (II")의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00261] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (II")의 비율은 약 2:1이다. 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (II")의 비율은 약 1:2이다. 실시양태에서, 공결정은 (구조식 (II")의 화합물)p:(CCF)q의 비율로 구조식 (II")의 화합물과 CCF를 포함한다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00262] 실시양태에서, 구조식 (II"')로 나타낸 화학식 (II"')의 화합물,
[00263]
Figure pct00083
(II"') 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00264] 실시양태에서, R1은 메틸이다.
[00265] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00084
,
Figure pct00085
,
Figure pct00086
또는
Figure pct00087
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (II"')의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00266] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이다.
[00267] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00088
이다.
[00268] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R2는:
Figure pct00089
이다.
[00269] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, R1은 메틸이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00270] 실시양태에서, m과 n은 각각 2이고, Y는 결합이며, R1은 메틸이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00271] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00272] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00273] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00090
,
Figure pct00091
,
Figure pct00092
및
Figure pct00093
로 이루어지 군으로부터 선택된다.
[00274] 추가의 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00094
이다.
[00275] 일부 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00095
이다.
[00276] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00096
이다.
[00277] 실시양태에서, 고리 A는
Figure pct00097
이다.
[00278] 실시양태에서, 구조식 (II"') 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00279] 실시양태에서, 구조식 (II"') 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00280] 실시양태에서, 구조식 (II"')의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00281] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (II"')의 비율은 약 2:1이다. 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (II"')의 비율은 약 1:2이다. 실시양태에서, 공결정은 (화합물 (II"'))p:(CCF)q의 비율로 화합물 (II"')와 CCF를 포함한다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00282] 실시양태에서, 구조식 (III)으로 나타낸 화학식 (III)의 화합물,
Figure pct00098
(III) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00283] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00099
,
Figure pct00100
,
Figure pct00101
또는
Figure pct00102
이다:
여기서, #은 R2가 화학식 (III)의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00284] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00103
이다.
[00285] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00104
이다.
[00286] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00105
이다.
[00287] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00106
이다.
[00288] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00289] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00290] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00291] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00292] 실시양태에서, 구조식 (III) 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00293] 실시양태에서, 구조식 (III) 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00294] 실시양태에서, 구조식 (III)의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00295] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (III)의 비율은 약 2:1이다. 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (III)의 비율은 약 1:2이다. 실시양태에서, 공결정은 (화합물 (III))p:(CCF)q의 비율로 화합물 (III)와 CCF를 포함한다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00296] 실시양태에서, 구조식 (III')로 나타낸 화학식 (III')의 화합물,
Figure pct00107
(III') 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00297] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00108
,
Figure pct00109
,
Figure pct00110
또는
Figure pct00111
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (III')의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00298] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00112
이다.
[00299] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00113
이다.
[00300] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00114
이다.
[00301] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00115
이다.
[00302] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00303] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00304] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00305] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00306] 실시양태에서, 구조식 (III') 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00307] 실시양태에서, 구조식 (III') 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00308] 실시양태에서, 구조식 (III')의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00309] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (III')의 비율은 약 2:1이다. 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF) : 화합물 (III')의 비율은 약 1:2이다. 실시양태에서, 공결정은 (화합물 (III'))p:(CCF)q의 비율로 화합물 (III')와 CCF를 포함한다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.4 내지 약 2.1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 0.9 내지 약 3.1이다. 실시양태에서, p는 약 2이고 q는 약 1이다. 실시양태에서, p는 약 1이고 q는 약 2이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00310] 실시양태에서, 구조식 (III")로 나타낸 화학식 (III")의 화합물,
Figure pct00116
(III") 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00311] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00117
,
Figure pct00118
,
Figure pct00119
또는
Figure pct00120
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (III")의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00312] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00121
이다.
[00313] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00122
이다.
[00314] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00123
이다.
[00315] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00124
이다.
[00316] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00317] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00318] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00319] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00320] 실시양태에서, 구조식 (III") 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00321] 실시양태에서, 구조식 (III") 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00322] 실시양태에서, 구조식 (III")의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00323] 실시양태에서, 구조식 (III"')로 나타낸 화학식 (III"')의 화합물,
Figure pct00125
(III"') 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정이 사용된다.
[00324] 실시양태에서, R2는:
Figure pct00126
,
Figure pct00127
,
Figure pct00128
또는
Figure pct00129
이고;
여기서, #은 R2가 화학식 (III"')의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며; o는 0, 1 또는 2이다.
[00325] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00130
이다.
[00326] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00131
이다.
[00327] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00132
이다.
[00328] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는:
Figure pct00133
이다.
[00329] 실시양태에서, Y는 결합이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00330] 실시양태에서, Y는 NH이고, X는 O이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질이다.
[00331] 실시양태에서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 R1'는 C1-C2 알킬이다.
[00332] 실시양태에서, 상기 헤테로방향족 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있다.
[00333] 실시양태에서, 구조식 (III"') 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00334] 실시양태에서, 구조식 (III"') 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00335] 실시양태에서, 구조식 (III"')의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00336] 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 표 1 (하기)의 1-37번 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 공결정으로부터 선택되어 사용된다.
[00337] 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다.
[00338] 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00339] 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다. 실시양태에서, CCF는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다. 실시양태에서, CCF는 아디프산이다.
[00340] 일부 실시양태에서, 본 화합물은 표 1에서 선택된 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정이다:
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
[00341] 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에 개시된 화합물은 하나 이상의 치환기들로 임의로 치환될 수 있는데, 상기 치환기는 위에서 일반적으로 설명된 바와 같거나 특정 부류, 하위부류 및 화학종들로 예시된 바와 같다. "임의(로) 치환된"이라는 말은 "치환되거나 치환되지 않은"이라는 말과 서로 교환하여 사용할 수 있다. 일반적으로, "치환된"이라는 용어는, "임의(로)"라는 용어가 선행하는지 선행하지 않는지의 여부에 관계없이, 주어진 구조에서 하나 이상의 수소 라디칼이 특정된 치환기의 라디칼로 대체됨을 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 임의로 치환된 기는 해당 기의 각 치환가능한 위치에 치환기를 가질 수 있다. 주어진 구조에서 하나 이상의 위치가 특정된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 상기 치환기는 각 위치에서 동일하거나 서로 다른 것일 수 있다.
[00342] 화학적으로 구현가능하거나 화학적으로 안정한 경우라면, 본원에 기술된 분자기들은 치환되지 않거나 치환된다 (즉, "임의로 치환된다"). 본원에 기재된 바와 같이, "임의(로) 치환된"이라는 용어가 열거된 목록에 선행하는 경우, 상기 용어는 해당 목록 중의 뒤따르는 모든 치환가능한 기들을 지칭한다. 예를 들면, X 기가 할로겐; 임의로 치환된 알킬 또는 페닐인 경우; X는 임의로 치환된 알킬 또는 임의로 치환된 페닐일 수 있다. 이와 마찬가지로, "임의(로) 치환된"이라는 용어가 열거된 목록에 뒤이어 나오는 경우, 상기 용어 역시, 달리 명시하지 않는 한, 해당 선행 목록의 치환가능한 기들 모두를 가리킨다. 예를 들면: X가 할로겐, C1-4 알킬 또는 페닐이고, 여기서 X가 JX로 임의로 치환되는 경우, 이때 C1-4 알킬 및 페닐은 모두 JX로 임의로 치환될 수 있다. 당업계의 숙련자들에게 분명한 바와 같이, H, 할로겐, NO2, CN, NH2, OH 또는 OCF3과 같은 기들은 치환가능한 기가 아니므로 포함되지 않을 것이다. 또한, 당업자에게 분명한 바와 같이, NH 기를 함유하는 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릭 고리는 수소 원자를 치환기로 대체하여 임의로 치환될 수 있다.
[00343] 실시양태에서, 기 (예컨대, C1-4알킬; C3-5사이클로알킬; 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐 또는 모르폴리닐과 같은 헤테로사이클릴; 페닐과 같은 아릴; 또는 헤테로아릴)는 치환되지 않는다.
[00344] 실시양태에서, 기 (예컨대, C1-4알킬; C3-5사이클로알킬; 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐 또는 모르폴리닐과 같은 헤테로사이클릴; 페닐과 같은 아릴; 또는 헤테로아릴)는 치환된다. 실시양태에서, 기는 원자가 및 화학적 안정성이 허용하는 한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환기를 포함한다.
[00345] 본 발명에서 상정되는 치환기들의 조합은 바람직하게는 안정하거나 화학적으로 구현가능한 화합물의 형성을 유도하는 조합이다. 본원에 사용된 "안정한"이라는 용어는 화합물의 제조, 검출, 및 바람직하게는, 회수, 정제 및 본원에 개시된 하나 이상의 목적을 위한 용도에 대한 조건에 해당 화합물을 적용하는 경우에 실질적으로 변형되지 않는 화합물을 지칭한다. 실시양태에서, 안정한 화합물 또는 화학적으로 구현가능한 화합물이란, 습기 또는 다른 화학적으로 반응성인 조건의 부재하에 40℃ 이하의 온도로 적어도 1주간 유지되는 경우에 실질적으로 변하지 않는 화합물이다.
[00346] 수치 x와 관련하여 "약"이라는 용어는, 예를 들어 x +/-10%를 의미한다.
[00347] 본원에 사용된 "알킬" 또는 "알킬기"라는 용어는 완전히 포화된, 직쇄형 (즉, 분지쇄형이 아닌 형태) 또는 분지쇄형의 치환되거나 치환되지 않은 탄화수소 사슬을 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 알킬기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 함유한다 (C1-8 알킬로 나타냄). 실시양태에서, 알킬기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유한다 (C1-4 알킬로 나타냄). 실시양태에서, "C0-4 알킬"로 기재된 분자 구조물은 공유 결합 (예컨대, "C0 알킬") 또는 본원에 기재된 바와 같은 C1-4 알킬 사슬을 포함한다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, 이소부틸, 2급-부틸 및 3급-부틸을 포함한다.
[00348] 본원에 사용된 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클로알킬" 또는 "헤테로사이클릭"이라는 용어는, 해당 시스템 중 적어도 하나의 고리가 동일하거나 상이한 하나 이상의 헤테로원자를 함유하고, 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하지만 방향족이 아니며, 해당 분자의 나머지 부분에 대한 단일 부착점을 갖는, 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 고리 시스템을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클로알킬" 또는 "헤테로사이클릭" 기는 하나 이상의 고리 구성원이 산소, 황, 질소 또는 인으로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자인 3 내지 14개의 고리 구성원을 가지며, 상기 시스템 중의 각 고리는 3 내지 8개의 고리 구성원을 함유한다. 헤테로사이클릭 고리의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 하기의 모노사이클: 2-테트라하이드로퓨라닐, 3-테트라하이드로퓨라닐, 2-테트라하이드로티오페닐, 3-테트라하이드로티오페닐, 2-모르폴리노, 3-모르폴리노, 4-모르폴리노, 2-티오모르폴리노, 3-티오모르폴리노, 4-티오모르폴리노, 1-피롤리디닐, 2-피롤리디닐, 3-피롤리디닐, 1-테트라하이드로피페라지닐, 2-테트라하이드로피페라지닐, 3-테트라하이드로피페라지닐, 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 1-피라졸리닐, 3-피라졸리닐, 4-피라졸리닐, 5-피라졸리닐, 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-피페리디닐, 2-티아졸리디닐, 3-티아졸리디닐, 4-티아졸리디닐, 1-이미다졸리디닐, 2-이미다졸리디닐, 4-이미다졸리디닐, 5-이미다졸리디닐; 및 하기 바이사이클: 3-1H-벤즈이미다졸-2-온, 3-(1-알킬)-벤즈이미다졸-2-온, 인돌리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 벤조티올란, 벤조디티안 및 1,3-디하이드로-이미다졸-2-온을 포함한다.
[00349] 본원에서 "헤테로원자"라는 용어는 임의의 산화된 형태의 질소, 황 또는 인을 비롯한, 산소, 황, 질소 또는 인; 4급화된 형태의 임의의 염기성 질소; 또는 헤테로사이클릭 고리의 치환가능한 질소, 예컨대 (3,4-디하이드로-2H-피롤릴에서의) N, (피롤리디닐에서의) NH 또는 (N-치환된 피롤리디닐에서의) NR+ 중 하나 이상을 의미한다.
[00350] 본원에 사용된 "불포화된"이라는 용어는 모이어티가 하나 이상의 불포화 단위를 가짐을 의미한다.
[00351] 본원에 사용된 "알콕시" 또는 "티오알킬"이라는 용어는 산소 ("알콕시") 또는 황 ("티오알킬") 원자를 통해 주요 탄소 사슬에 부착된, 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 가리킨다.
[00352] 본원에서 "할로알킬", "할로알케닐" 및 "할로알콕시"라는 용어들은, 경우에 따라서는, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되는 알킬, 알케닐 또는 알콕시를 의미한다. "할로겐"이라는 용어는 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
[00353] 본원에서, 단독으로 사용되거나 "아르알킬" "아르알콕시" 또는 "아릴옥시알킬"에서와 같이 큰 모이어티의 일부로서 사용되는 "아릴"이라는 용어는, 총 6 내지 14개의 고리 구성원을 갖는 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 카보사이클릭 고리 시스템을 가리키며, 여기서 상기 고리 시스템은 해당 분자의 나머지 부분에 대한 단일 부착점을 가지며, 상기 시스템 중 적어도 하나의 고리는 방향족이고, 상기 고리 시스템 중의 고리는 각각 4 내지 7개의 고리 구성원을 함유한다. "아릴"이라는 용어는 "아릴 고리"라는 용어와 서로 교환하여 사용할 수 있다. 아릴 고리의 예로는 페닐, 나프틸 및 안트라센을 포함한다.
[00354] 본원에서, 단독으로 사용되거나 "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아릴알콕시"에서와 같이 큰 모이어티의 일부로서 사용되는 "헤테로아릴"이라는 용어는, 총 5 내지 14개의 고리 구성원을 갖는 모노사이클릭, 바이사이클릭 및 트리사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 상기 고리 시스템은 해당 분자의 나머지 부분에 대한 단일 부착점을 가지며, 상기 시스템 중 적어도 하나의 고리는 방향족이고, 상기 시스템 중 적어도 하나의 고리는 질소, 산소, 황 또는 인으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하고, 상기 시스템 중의 고리는 각각 4 내지 7개의 고리 구성원을 함유한다. "헤테로아릴"이라는 용어는 "헤테로아릴 고리" 또는 "헤테로방향족"이라는 용어와 서로 교환하여 사용할 수 있다. 헤테로아릴 고리의 추가의 예로는 하기의 모노사이클: 2-퓨라닐, 3-퓨라닐, N-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 5-이미다졸릴, 3-이소옥사졸릴, 4-이소옥사졸릴, 5-이소옥사졸릴, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, N-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 피리다지닐(예컨대, 3-피리다지닐), 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 테트라졸릴(예컨대, 5-테트라졸릴), 트리아졸릴(예컨대, 2-트리아졸릴 및 5-트리아졸릴), 2-티에닐, 3-티에닐, 피라졸릴(예컨대, 2-피라졸릴), 이소티아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 피라지닐, 1,3,5-트리아지닐, 및 하기 바이사이클: 벤즈이미다졸릴, 벤조푸릴, 벤조티오페닐, 인돌릴(예컨대, 2-인돌릴), 푸리닐, 퀴놀리닐(예컨대, 2-퀴놀리닐, 3-퀴놀리닐, 4-퀴놀리닐) 및 이소퀴놀리닐(예컨대, 1-이소퀴놀리닐, 3-이소퀴놀리닐 또는 4-이소퀴놀리닐)을 포함한다.
[00355] 달리 도시하거나 언급하지 않는 한, 본원에 언급한 구조들은 해당 구조의 모든 이성질체 [예컨대, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 기하 이성질체 (또는 형태 이성질체)] 형태; 예를 들어, 각각의 비대칭 중심에 대한 R 및 S 배위, (Z) 및 (E) 이중 결합 이성질체, 및 (Z) 및 (E) 형태 이성질체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물의 단일 입체화학 이성질체 뿐만 아니라 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 기하 이성질체 (또는 형태 이성질체) 혼합물도 본 발명의 범위 내에 속한다. 일반적으로 해치형(hatched) 또는 볼드형(bolded) 결합의 사용을 통해 명확한 입체화학구조의 중심이 그려진 화합물들은 입체화학적으로 순수하지만, 절대 입체화학구조에서는 여전히 명확하지 않다. 이러한 화합물들은 R 또는 S 배위를 가질 수 있다. 절대 배위가 결정된 경우에는, 키랄 중심(들)은 도면에서 (R) 또는 (S)로 표시된다.
[00356] 달리 언급하지 않는 한, 본원에 개시된 화합물의 모든 호변이성질체 형태들도 본 발명의 범위 내에 속한다. 추가로, 달리 언급하지 않는 한, 본원에 도시된 구조들은 동위원소가 풍부한 하나 이상의 원자들의 존재 하에서만 상이한 화합물들을 포함하고자 한다. 예를 들면, 수소의 중수소 또는 삼중수소로의 대체 또는 탄소의 13C- 또는 14C-풍부한 탄소로의 대체를 제외하고는, 본 발명의 구조를 갖는 화합물들은 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 화합물들은, 예를 들면, 분석 도구로서, 생물학적 분석에서의 프로브로서, 또는 치료 프로파일이 향상된 DNA-PK 억제제로서 유용하다.
약제학적으로 허용가능한 염:
[00357] 본원에 개시된 일부 화합물들은 유리 형태로 존재하거나, 또는 적절한 경우에는 이의 약제학적으로 허용가능한 유도체로 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 유도체는, 이에 제한되지는 않지만, 이를 필요로 하는 환자에게 투여시, 본원에 기재된 다른 화합물 또는 이의 대사물 또는 잔류물을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는, 약제학적으로 허용가능한 프로드럭, 염, 에스테르, 이러한 에스테르의 염, 또는 임의의 다른 부가물 또는 유도체를 포함한다.
[00358] 본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 적절한 의학적 판단의 범위 내에서 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 염을 가리킨다.
[00359] 약학적으로 허용가능한 염에 대해서는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, S. M. 버지(Berge) 등은 약제학적으로 허용가능한 염과 관련하여 본원에 참고로 인용되는 문헌 [J. Pharmaceutical Sciences, 66:1-19, 1977]에서 약제학적으로 허용가능한 염에 대하여 상술하고 있다. 본원에 개시된 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염으로는 적절한 무기산, 유기산, 무기염기, 및 유기염기로부터 유도된 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 비독성 산 부가염의 예로는, 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산으로 형성되거나, 당업계에서 사용되는 기타 방법들, 예컨대 이온 교환을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 기타 약제학적으로 허용가능한 염에는 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캠퍼레이트, 캠퍼설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등이 포함된다. 추가의 예시적인 염으로는 아디페이트, 벤조에이트, 시트레이트, 푸마레이트, 말레에이트 또는 숙시네이트를 포함한다. 적절한 염기로부터 유도되는 염에는 알칼리 금속염, 알칼리토류 금속염, 암모늄염 및 N+(C1-4알킬)4 염이 포함된다.
[00360] 또한, 본원에 개시된 화합물들의 모든 염기성 질소 함유기의 4급화도 본 발명에 포함된다. 수용성 또는 수분산성 또는 유용성 또는 유분산성 생성물이 이러한 4급화로 수득될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토류 금속염으로는 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용가능한 염으로는, 적절한 경우, 할라이드, 하이드록사이드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, C1-8 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 반대이온을 사용하여 형성된 비독성 암모늄, 4급 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다.
공결정
[00361] 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 [예컨대, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물] 및 공결정 형성제 (CCF)를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00362] 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물, 및 CCF는 모두 고체 상태 (예컨대, 결정)로 존재한다. 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물, 및 CCF는 (예컨대, 수소 결합에 의해) 비공유 결합한다.
[00363] 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물과 CCF (예컨대, 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산)의 공결정은 실온에서 고체이다. 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물과 CCF (예컨대, 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산)는 비공유 결합에 의해 상호작용한다. 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물과 CCF (예컨대, 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산) 간의 비공유 결합 상호작용은 수소 결합 및/또는 반데르발스 상호작용을 포함한다.
[00364] 실시양태에서, 공결정 형성제 (CCF)는 아디프산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산 또는 벤조산이다.
[00365] 실시양태에서, 공결정은 국제 특허 공보 WO 2015/058067호 (전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있는 공결정이다.
[00366] 실시양태에서, 공결정은 (5)-N-메틸-8-(1-((2'-메틸-[4,5'-바이피리미딘]-6-일)아미노)프로판-2-일)퀴놀린-4-카복사미드를 포함한다. 실시양태에서, 본 화합물은 (+) 거울상이성질체이다. 실시양태에서, 본 화합물은 (-) 거울상이성질체이다.
[00367] 실시양태에서, 공결정은 (5)-N-메틸-8-(l-((2'-메틸-4 6'-디듀테로-[4,5'-바이피리미딘]-6-일)아미노)프로판-2-일)퀴놀린-4-카복사미드를 포함한다. 실시양태에서, 본 화합물은 (+) 거울상이성질체이다. 실시양태에서, 본 화합물은 (-) 거울상이성질체이다.
[00368] 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) 및 CCF로서 시트르산을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00369] 실시양태에서, 본 발명은 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) 및 CCF로서 푸마르산을 포함하는 공결정을 특징으로 한다.
[00370] 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) 및 CCF로서 말레산을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00371] 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) 및 CCF로서 숙신산을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00372] 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) 및 CCF로서 벤조산을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00373] 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) 및 CCF로서 아디프산을 포함하는 공결정이 사용된다.
[00374]
[00375] 일부 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물)과, 분리된 순수한 형태의 상기 기술한 CCF, 또는 다른 물질들과 혼합되는 경우, 예를 들어 유리 형태의 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물)과 혼합되는 경우에는 고체 조성물로서 혼합물 형태의 상기 기술한 CCF, 또는 유리 CCF를 포함하는 공결정이 사용된다.
[00376] 일부 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물), (예컨대, 상기 기술한 바와 같은) 제1 CCF, 및 상기 제1 CCF와 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 추가의 유리 CCF의 공결정을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물이 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물), 아디프산인 제1 CCF, 및 추가의 아디프산의 공결정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 중에서 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) : CCF [예컨대, 제1 CCF (예컨대, 상기 기술한 바와 같은 것들) 및 하나 이상의 추가의 유리 CCF를 모두 포함하는 전체 CCF]의 전체 몰비는 약 1:0.55 내지 약 1:100 범위이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 중에서 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) : CCF의 전체 몰비는 약 1:0.55 내지 약 1:50 범위이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 중에서 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) : CCF의 전체 몰비는 약 1:0.55 내지 약 1:10 범위이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물에서 화학식 (I)의 화합물 : CCF의 전체 중량비는 약 85 중량% : 15 중량% 내지 약 60 중량% : 40 중량% 범위이다. 일부 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) : CCF의 전체 중량비는 약 70 중량% : 30 중량% 내지 약 60 중량% : 40 중량% 범위이다. 일부 실시양태에서, 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 (예컨대, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물) : CCF의 전체 중량비는 약 65 중량% : 35 중량%이다.
유전체 편집 효율 증가를 위한 DNA-PK 억제제
[00377] 표적화된 유전체 편집 효율은, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물 (예컨대, DNA-PK 억제제) 및 유전체 편집 시스템을 세포(들)에 투여함으로써 증가시킬 수 있다. 사용하기에 적합한 유전체 편집 시스템으로는, 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 기반 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템을 포함한다. 본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 유전체 편집 효율을 증가시키기 위한 DNA-PK 억제제 및/또는 유전체 편집 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, HDR 유전체 편집 효율은 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여한 후에 증가된다.
[00378] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 CRISPR 기반 유전체 편집 시스템이다. 상기 CRISPR 기반 유전체 편집 시스템은 CRISPR-Cas 시스템 또는 이의 변형된 시스템일 수 있다. 상기 CRISPR-Cas 시스템은 Cas9 엔도뉴클레아제와 같은 임의의 Cas 엔도뉴클레아제 및 이의 변이체를 사용할 수 있다. Cas9 엔도뉴클레아제의 예로는 Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체, 예컨대 SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 또는 CasD10A 니카제를 포함한다. Cas 엔도뉴클레아제는 야생형이거나, 조작되거나, 또는 니카제 돌연변이체이거나, 또는 이들의 임의의 변이체일 수 있다.
[00379] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 유전체 편집 시스템은 CRISPR 서열, 전사 활성화 cr (tracr) 서열, 가이드 서열 및 Cas 엔도뉴클레아제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00380] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 유전체 편집 시스템은 CRISPR 서열을 포함하는 RNA (crRNA), 전사 활성화 cr (tracr) 서열을 포함하는 RNA (tracrRNA) 및 Cas 엔도뉴클레아제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00381] 일부 실시양태에서, CRISPR 기반 유전체 편집 시스템은 CRISPR 서열, 가이드 서열 및 Cas 엔도뉴클레아제 또는 Cpf 엔도뉴클레아제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00382] 일부 실시양태에서, 상기 CRISPR 기반 유전체 편집 시스템은 CRISPR-Cpf 시스템이다. 상기 Cpf 뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템 엔도뉴클레아제이다. Cpf는 단일 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제이다. 상기 Cpf 뉴클레아제는 야생형이거나, 조작되거나, 또는 니카제 돌연변이체이거나, 또는 이들의 임의의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zetsche et al., "CPF1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System," Cell, 163(3): 759-71]를 참고한다. 일부 실시양태에서, 상기 Cpf 뉴클레아제는 Cpf 1 엔도뉴클레아제이다.
[00383] 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 메가뉴클레아제 기반 시스템이다. 메가뉴클레아제 기반 유전체 편집은 큰 DNA 표적 부위 (예컨대, 통상 약 12 bp)를 인식하는 서열 특이적 엔도뉴클레아제를 사용한다. 예를 들어, U.S. 9,365,964호를 참조한다. 메가뉴클레아제는 전체 유전체의 완전성에 영향을 주지 않으면서 독특한 염색체 서열을 절단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 메가뉴클레아제는 귀환 엔도뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 메가뉴클레아제는 인트론 엔도뉴클레아제 또는 인테인(intein) 엔도뉴클레아제일 수 있다. 상기 귀환 엔도뉴클레아제는 LAGLIDADG 계열에 속할 수 있다. 상기 메가뉴클레아제는 야생형이거나, 조작되거나, 또는 니카제 돌연변이체일 수 있다.
[00384] 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템이다. ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인 간의 융합을 기반으로 하여 조작된 인공 제한 효소이다. 예를 들어, U.S. 9,145,565호를 참조한다.
[00385] 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 전사 활성화 유사 효과기 계열의 뉴클레아제 (TALEN)이다. TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인으로 융합시켜 제조된 조작된 제한 효소이다. 예를 들어, U.S. 9,181,535호를 참조한다.
[00386] 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템은 아르고노트 기반 시스템이다. 아르고노트 기반 유전자 편집 시스템에는 아르고노트 유래의 엔도뉴클레아제 및 5' 인산화된 ssDNA가 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 인산화된 ssDNA는 10-40개의 뉴클레오타이드, 15-30개의 뉴클레오타이드 또는 18-30개의 뉴클레오타이드 (예컨대, 약 24개의 뉴클레오타이드) 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 아르고노트 엔도뉴클레아제는 임의의 엔도뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 아르고노트 엔도뉴클레아제는 테르무스 써모파일스(Thermus thermophiles, TtAgo), 파이로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus, PfAgo) 또는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi, NgAgo)에서 유래한다. 일부 실시양태에서, 상기 나트로노박테리움 그레고리(NgAgo)는 균주 2 (즉, N. 그레고리 SP2)이다. 일부 실시양태에서, 상기 아르고노트 엔도뉴클레아제는 NgAgo이다. 예를 들어, 문헌 [Gao et al., "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute," Nature Biotechnology, May 2016]를 참조한다.
[00387] 상기 DNA-PK 억제제는 임의의 DNA-PK 억제제일 수 있다. 상기 DNA-PK 억제제는 DNA-PK의 억제를 유발하는 임의의 화합물 또는 물질일 수 있다. 상기 DNA-PK 억제제는 화합물, 소분자, 항체 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제는 구조식 (I) 또는 구조식 (II)로 나타낸 화합물이다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제는 구조식 (I') 또는 구조식 (II')로 나타낸 화합물이다. 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제는 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물이다. 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제는 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물, 및 아디프산을 포함하는 공결정이다.
[00388] 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제는 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물, 또는 이들의 조합이다.
[00389] 일부 실시양태에서, 임의의 NHEJ 억제제를 사용하여 HDR 유전체 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 NHEJ 억제제는 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물, 또는 이들의 조합이다.
[00390] 일부 실시양태에서, 상기 NHEJ 억제제는 NHEJ의 억제를 유발하는 임의의 화합물 또는 물질일 수 있다. NHEJ 억제제의 예로는 DNA-PK 억제제를 포함한다. 상기 NHEJ 억제제는 화합물, 소분자, 항체 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 NHEJ 억제제는 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')로 나타낸 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 공결정이다. 일부 실시양태에서, 상기 NHEJ 억제제는 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 효율은, 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템이 투여되지 않은 조건에 비해, 또는 세포(들)에 유전체 편집 시스템만 투여되고 DNA-PK 억제제는 투여되지 않은 조건에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 증가된다.
DNA-PK 억제제, 조성물 및 이의 키트의 용도
[00391] 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 DNA-PK 억제제, 예컨대 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')의 DNA-PK 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 공결정을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료제 또는 DNA 병변을 유도하는 질병 상태에 상기 세포를 감작시키는 방법이 본원에 제공된다.
[00392] 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유효량의 DNA-PK 억제제, 예컨대 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')의 DNA-PK 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 공결정을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 위한 치료 요법을 강화시키는 방법도 본원에 제공된다. 한 양태에서, 암 치료를 위한 치료 요법은 방사선 요법을 포함한다.
[00393] 본원에 개시된 DNA-PK 억제제는 방사선 요법이 이러한 치료의 치료적 유용성을 향상시키는 것으로 나타나는 경우에 유용하다. 또한, 방사선 요법은 암 치료에서 수술에 대한 보조 수단으로 제안되는 경우가 많다. 보조적인 방법으로의 방사선 요법의 목적은 원발성 종양이 억제되는 경우에 재발의 위험을 감소시켜 무병 생존율을 개선하는 것이다. 보조 방사선 요법은 후술하는 바와 같이 결장암, 직장암, 폐암, 위식도암 및 유방암을 비롯한 일부 질환들에서 제안된다.
[00394] 방사선 요법의 실시 또는 비실시 하에, 암 치료를 위한 치료 요법에서 본원에 개시된 DNA-PK 억제제와 함께 다른 항암 화학요법제들도 사용할 수 있다. 본원에 개시된 DNA-PK 억제제와 이러한 다른 제제들의 병용은 화학요법 프로토콜을 강화시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 DNA-PK 억제제는 DNA 가닥 절단을 유발하는 것으로 알려진 제제인 에토포사이드 또는 블레오마이신과 함께 투여될 수 있다.
[00395] 본원에서는 DNA-PK 억제제를 이용하는 방사선감작 종양 세포도 추가로 개시된다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포를 "방사선감작"시킬 수 있는 DNA-PK 억제제는, 전자기 방사선에 대한 세포의 감수성을 증가시키고/시키거나 전자기 방사선 (예컨대, X-선)으로 치료가능한 질병의 치료를 촉진시키도록 치료학적 유효량으로 동물에게 투여되는 분자, 바람직하게는 저분자량 분자로 정의된다. 전자기 방사선으로 치료가능한 질병으로는 신생물 질환, 양성 및 악성 종양 및 암성 세포를 포함한다.
[00396] 또한, 본원에 개시된 유효량의 DNA-PK 억제제, 예컨대 본 발명의 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에 있어서 암을 치료하는 방법도 본원에 추가로 제공된다. 본 발명은 추가로, 생물학적 시스템에서 세포 증식, 침입 및 전이의 과정을 포함하는 암 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 암 세포 증식의 억제제로서의 본 발명의 화합물의 용도를 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 살아있는 동물, 예컨대 포유동물에서 암 세포 증식, 침입, 전이 또는 종양 발생을 억제하거나 감소시키는데 사용된다. 본 발명의 화합물은, 암을 치료하거나 암 세포 증식을 억제하는데 있어서, 단독으로 사용되거나, IR 또는 하나 이상의 화학요법제와 함께 병용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은, 예컨대 암 세포 증식 및 이의 특성을 분석하는 것 뿐만 아니라, 암 세포 증식에 영향을 미치는 화합물을 확인하는 분석 시스템에서 사용하도록 쉽게 개작할 수도 있다.
[00397] 종양 또는 신생물은 세포의 증식이 억제되지 않거나 진행 중인 조직 세포의 성장을 포함한다. 일부 이러한 증식은 양성이지만, 다른 경우에는 "악성"으로 지칭하며 유기체의 사멸을 초래할 수 있다. 악성 신생물 또는 "암"은, 공격적인 세포 증식을 나타내는 것 외에도, 주변 조직들에 침입하여 전이할 수 있다는 점에서 양성 증식과 차이가 있다. 또한, 악성 신생물은, 이들이 분화에 있어서의 퇴행 ("탈분화")이 더 심해지고, 서로에 대하여 그리고 주변 조직에 대한 유기적 구조의 손실이 더 커진다는 것을 특징으로 한다. 이러한 특성을 "역형성"이라고도 한다.
[00398] 본 발명에 의해 치료가능한 신생물로는 고형 종양, 즉, 암종 및 육종도 포함한다. 암종은 주변 조직들에 침투(침입)하여 전이를 일으키는 상피 세포로부터 유래한 악성 신생물을 포함한다. 선암종은 선상 조직으로부터 유래하거나, 또는 인식가능한 선상 구조를 형성하는 조직으로부터 유래된 암종이다. 또 다른 광범위 부류의 암으로는, 세포가 배아 결합 조직과 같은 원섬유성 또는 동종 물질에 내장된 종양인 육종을 포함한다. 또한, 본 발명은 일반적으로 종양 덩어리로 존재하지는 않지만, 혈관계 또는 림프망내계에 분포되어 있는 백혈병, 림프종 및 기타 암들을 비롯한 골수계 또는 림프계의 암 치료할 수도 있다.
[00399] DNA-PK 활성은, 예를 들면, 성인 및 소아 종양학에서 다양한 형태의 암, 고형 종양/악성 종양의 증식, 점액 및 원형 세포 암종, 국소 진행 종양, 전이성 암, 유잉 육종을 포함하는 인간 연조직 육종, 림프관 전이를 포함하는 암 전이, 특히 두경부의 편평세포 암종, 식도 편평세포 암종, 구강 암종, 다발골수종을 포함하는 혈액 세포 악성종양, 급성 림프구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병 및 모발상 세포 백혈병을 포함하는 백혈병, 삼출 림프종(체강계 림프종), 소세포 폐암종을 포함하는 흉선 림프종 폐암, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 부신피질의 암, ACTH-생성 종양, 비소세포 암, 소세포 암종 및 도관암을 포함하는 유방암, 위암, 결장암, 결장직장암을 포함하는 위장 암, 결장직장 신생물과 관련된 폴립, 췌장암, 간암, 원발성 표재성 방광 종양, 방광의 침습성 이행 세포 암종 및 근육-침습성 방광암을 포함하는 방광암을 포함하는 비뇨기암, 전립선암, 난소 암종, 원발성 복막 상피 신생물, 자궁경부 암종, 자궁내막 암, 질암, 외음부 암, 자궁암 및 난포의 고형 종양을 포함하는 여성 생식기의 악성종양, 고환암 및 음경암을 포함하는 남성 생식기의 악성종양, 신장 세포 암종을 포함하는 신장암, 내인성 뇌종양을 포함하는 뇌암, 신경모세포종, 성상세포 뇌종양, 신경아교종, 중추신경계의 전이성 종양 세포 침입, 골종 및 골육종을 포함하는 골암, 악성 흑색종을 포함하는 피부암, 인간 피부 각질세포의 종양 진행, 편평세포 암, 갑상선암, 망막모세포종, 신경모세포종, 복막 삼출, 악성 흉막 삼출, 중피종, 윌름스 종양, 담낭암, 영양막 신생물, 혈관주위세포종, 및 카포시 육종과 관련될 수 있다. 상기 암들 및 다른 형태의 암의 치료를 향상시키는 방법도 본 발명에 포함된다.
[00400] 본 발명은, 생물학적 샘플을 본 발명의 화합물 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 DNA-PK 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "생물학적 샘플"이라는 용어는 생물 유기체 이외의 샘플을 의미하며, 여기에는 세포 배양물 또는 이의 추출물; 포유동물로부터 수득한 생검 물질 또는 이의 추출물; 및 혈액, 타액, 뇨, 변, 정액, 누액 또는 기타 체액 또는 이의 추출물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 생물학적 샘플에서 키나제 활성, 특히 DNA-PK 활성의 억제는 당업자에게 알려진 다양한 목적상 유용하다. 이러한 목적들의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 생물학적 검체 보관 및 생물학적 분석을 포함한다. 한 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 DNA-PK 활성을 억제하는 방법은 비치료적인 방법으로 한정된다.
유전자 편집을 위한 용도
[00401] 특정 유전체 영역이 정확하게 변경되는 유전체 편집은 치료 잠재력이 매우 크다.　
[00402] 일부 실시양태에서, 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여함으로써, 하나 이상의 표적 유전체 영역을 편집하고, HDR 경로를 통해 하나 이상의 표적 유전체 영역에서 DNA 절단을 복구하고, 하나 이상의 표적 유전체 영역에서 DNA 절단에 대한 NHEJ 매개성 복구를 억제 또는 저해하고, 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 변형시키기 위한 방법이 본원에 제공된다.
[00403] 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 유전체 영역을 포함하는 하나 이상의 세포에 본원에 기재된 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 변형시키는 방법이 본원에 제공되는데, 여기서 상기 유전체 편집 시스템은 표적 유전자(들)의 하나 이상의 표적 유전체 영역의 핵산(들)과 상호작용하여, 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 편집을 유도하고, 상기 편집은 상기 표적 유전자(들)과 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현을 변형시킨다.
[00404] 상기 유전체 편집 시스템은 세포(들) 내의 표적 유전체 영역을 편집할 수 있는 임의의 유전체 편집 시스템일 수 있다. 예시적인 유전체 편집 시스템들은 위에서 자세히 설명하였으며, 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 기반 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템을 포함할 수 있다.
[00405] 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 편집은 임의의 종류의 유전자 조작 또는 세포 유전체의 공학기법을 포함한다. 하나 이상의 표적 유전체 영역의 편집은 하나 이상의 엔도뉴클레아제에 의해 수행된 세포(들)에 있어서 유전체 영역들의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 유전체 영역은 세포(들) 중의 유전 물질, 예컨대 DNA, RNA, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 세포(들) 중의 유전체 영역은 세포(들)에 함유되어 있는 미토콘드리아 또는 엽록체의 유전체를 포함한다.
[00406] 상기 DNA-PK 억제제는 임의의 DNA-PK 억제제일 수 있다. 상기 DNA-PK 억제제는 DNA-PK의 억제를 유발하는 임의의 화합물 또는 물질일 수 있다. 상기 DNA-PK 억제제는 화합물, 소분자, 항체 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제는 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물들이다. 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제는 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물들이다. 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제는 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물이다. 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제는 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물, 및 아디프산을 포함하는 공결정이다. 일부 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물에 대한 아디프산의 비율은 약 5 내지 0.5, 또는 이 범위 중 임의의 비율이다. 일부 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물에 대한 아디프산의 비율은 약 4 내지 0.5, 또는 이 범위 중 임의의 비율이다. 일부 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물에 대한 아디프산의 비율은 약 3 내지 0.5, 또는 이 범위 중 임의의 비율이다. 일부 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물에 대한 아디프산의 비율은 약 2 내지 0.5, 또는 이 범위 중 임의의 비율이다. 일부 실시양태에서, 1-37번 화합물들 중 임의의 화합물에 대한 아디프산의 비율은 약 2 내지 1.0, 또는 이 범위 중 임의의 비율이다. 일부 실시양태에서, 상기 NHEJ 억제제는 구조식 (I), 화학식 (II), 화학식 (II'), 화학식 (II"), 화학식 (II"'), 화학식 (III), 화학식 (III'), 화학식 (III") 또는 화학식 (III"')으로 나타낸 화합물 또는 이들의 임의의 조합이다.
[00407] 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포들에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 세포(들) 중의 하나 이상의 표적 유전체 영역을 편집 할 필요가 있는 질병 또는 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
[00408] 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 한 경로에서 유전자, RNA 분자, 단백질, 단백질군 또는 후속 단백질들의 발현을 변형시키는데 사용된다. 이러한 변형은 후천적 또는 유전적이거나 또는 노화로 인한 질병, 기능장애, 비정상적인 유기체의 항상성을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 "변형시키다" 또는 "변형시키는"는 이라는 용어는 조절, 향상, 감소, 증가, 삽입, 결실, 녹아웃(knocking-out), 녹인(knocking-in) 등을 포함한다.
[00409] 당업자라면 누구나 후천적 또는 유전적이거나 또는 다른 방식으로 얻게된 질병이 유전자 또는 단백질 기능이 관련된 항상성 기전의 조절장애를 수반한다는 것을 이해하고 있을 것이다. 이를 위해, 당업자라면 누구나 본원에 제공된 방법을 사용하여 대상체에서 유전자 기능을 조절하거나, 변형시키거나, 향상시키거나, 감소시키거나 또는 다른 방식으로 유전자 기능을 제공할 수 있다.
[00410] 세포(들)에서의 유전자의 발현 및 그에 따른 단백질 발현의 변형은, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, 프로모터 영역, 인핸서 영역, 사일렌서 영역, 절연체 영역, 항저해제, 번역후 조절 요소, 폴리아데닐화 신호 (예컨대, 최소 폴리 A), 보존된 영역, 전사 인자 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 부위의 핵산 서열의 특정 부분을 편집 (예컨대, 치환, 삽입 또는 결실, 이들의 임의의 조합)에 의해 달성될 수 있다.
[00411] 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 키트 및 조성물은 암에 걸린 대상체를 치료하는데 사용된다. 암 또는 암 관련 질환에 걸린 대상체를 치료하는 방법은 상기 대상체의 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템의 투여는 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
[00412] 상기 암은 임의의 종류의 암일 수 있다. 이러한 암으로는 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암, 신장암, 위암, 결장암, 고환암, 두경부암, 췌장암, 뇌암, 흑색종과 같은 고형 종양과 기타 다른 장기 조직의 종양, 및 혈액 세포의 암, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, T 세포 림프구성 백혈병 및 B 세포 림프종을 포함하는 림프종 및 백혈병을 포함한다. 상기 암은 흑색종, 백혈병, 성상세포종, 교모세포종, 림프종, 신경교종, 호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 췌장, 유방, 갑상선, 난소, 자궁, 고환, 뇌하수체, 신장, 위, 식도 및 직장의 암을 포함할 수 있다.
[00413] 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 키트 및 조성물은 하기의 암들 중 임의의 하나 이상의 암에 걸린 대상체를 치료하는데 사용된다: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS 연관 암, AIDS 연관 림프종, 항문암, 맹장암, 소아기 소뇌 또는 뇌 성상세포종, 기저세포 암종, 간외 담도암 (담도암 참고), 방광암, 골육종/악성 섬유성 조직구종 골육종, 뇌간 신경교종, 뇌암, 소뇌 성상세포종 뇌종양, 뇌 성상세포종/악성 신경교종 뇌종양, 상의세포종 뇌종양, 수모세포종 뇌종양, 천막상 원시 신경외배엽 종양 뇌종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종 뇌종양, 유방암, 기관지 선종/유암종, 버킷 림프종, 소아기 유암종 종양, 위장관 유암종 종양, 원발병소 불명 암종, 원발성 중추 신경계 림프종, 소아기 소뇌 성상세포종, 소아기 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 자궁경부암, 소아암, 연골육종, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 자궁막암, 상의세포종, 상피상 혈관내피종 (EHE), 식도암, 유잉 계열의 종양 중 유잉 육종, 두개외 생식세포종, 성선외 생식세포종, 간외 담도암, 안구내 흑색종 안암, 망막아세포종 안암, 담낭암, 위암, 위장관 유암종 종양, 위장관 간질성 종양 (GIST), 생식세포종: 두개외, 성선외 또는 난소, 임신성 영양막 종양, 뇌간 신경교종, 소아기 뇌 성상세포종 신경교종, 소아기 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 위 유암종, 모발세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 소아기 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 안구내 흑색종, 섬세포 암종(내분비계 췌장), 카포시 육종, 신장암(신세포암), 후두암, 백혈병류, 백혈병, 급성 림프아구성(급성 림프구성 백혈병으로도 불림), 백혈병, 급성 골수성(급성 골수성 백혈병으로도 불림), 백혈병, 만성 림프구성(만성 림프구성 백혈병으로도 불림), 백혈병, 만성 골수성(만성 골수성 백혈병으로도 불림), 모발세포 백혈병, 구순암 및 구강암, 지방육종, 간암(원발성), 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 림프종류, 림프종, AIDS 연관 림프종, 버킷 림프종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨(호지킨을 제외한 모든 림프종에 대한 구분류) 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 발덴스트륌(Waldenstrom)의 고분자글로불린혈증, 남성 유방암, 골/골육종의 악성 섬유성 조직구종, 수모세포종, 소아기 흑색종, 안구내 흑색종, 메르켈 세포암, 중피종, 성인의 악성 중피종, 잠복 원발형 전이성 편평경부암, 구강암, 다발성 내분비 종양 증후군, 다발성 골수종/형질세포 신생물, 균상식육종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/척수증식성 질병, 만성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 소아기 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종(골수암), 만성 골수증식성 장애, 점액종, 비강암 및 부비동암, 비인두 암종, 신경아세포종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 희소돌기 아교세포종, 구강암, 구인두암, 골의 골육종/악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피암(표면 상피 간질성 종양), 난소 생식세포종, 난소의 저악성 잠재적 종양(Ovarian low malignant potential tumor), 섬세포 췌장암, 췌장암, 비강암 및 부비동암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 음경 성상세포종, 음경 배아세포종, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 선종, 혈장세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종 (신장암), 전이세포성 신우요관암, 망막아세포종, 횡문근육종, 침샘암, 유잉 계열의 종양 육종, 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁 육종, 세자리 증후군(Sezary syndrome), 피부암(비흑색종), 피부암(흑색종), 피부 암종, 메르켈 세포, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종 - 피부암(비흑색종) 참고, 잠복 원발성 전이형 편평 경부암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 피부 T 세포 림프종(균상식육종 및 세자리 증후군), 고환암, 인후암, 흉선종, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 갑상선암, 전이세포성 신우요관암, 임신성 영양막 종양, 성인의 원발병소 불명 암종, 소아의 원발병소 불명 암, 요관 및 신우의 전이세포성 암, 요도암, 자궁암, 자궁내막암, 자궁 육종, 질암, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트륌의 고분자글로불린 혈증 및 윌름즈 종양(신장암).
[00414] 일부 실시양태에서, 암과 관련된 예시적인 표적 유전자로는 ABL1, ABL2, ACSL3, AF15Q14, AF1Q, AF3p21, AF5q31, AKAP9, AT1, AKT2, ALDH2, AL, AL017, APC, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC3, BLM, BMPRIA, BRAF, BRCAl, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIPI, BTG1, BUB1B, C12orf9, C15orf21, C15orf55, C16orf75, C2orf44, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CBFA2T1, CBFA2T3, C.BFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD74, CD79A, CD79B, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CD N2A, CD N2a(pl4), CD N2C, CDX2, CEBPA, CEPl, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHNl, CIC, Cin A, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1 Al, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CTNNB1, CYLD, D10S170, DAXX, DDB2, DDIT3, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, D1CER1, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBFI, ECT2L, EGFR, E1F4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ETVl, ETV4, ETV5, ETV6, EVIl, EWSR1, EXTl, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM22A, FAM22B, FAM46C, 1ANCA, EANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FBXOl 1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFRIOP, FGFR2, FGFR3, FTI, FIIIT, FIP1L1, FLU, FLJ27352, FLT3, FNBP1, FOXL2, FOXOIA, FOX03A, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, IICMOGT-1, IIEAB, HERPUD1, IIEY1, IIIPl, HIST1IT3B, IIIST1II4I, IILF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNRNPA2BI, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, IIRPT2, HSPCA, HSPCB, IDHl, IDH2, IGH, IGK, IGL, IKZFl, IL2, TL21R, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KRAS, KTN1, LAF4, LASPl, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LMOl, LM02, LPP, LRIG3, LYL1, MADH4, MAF, MAFB, MALT1, MAML2, MAP2KL MAP2K2, ΜAΡ2Κ4, MAX, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECTl, MED12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLIIl, MLL, MLL2, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NACA, NBS1, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2-1, NONO, NOTCH I, NOTCH2, NPMl, NR4A3, NRAS, NSDl, NT5C2, NTRKl, NTRK3, NUMAl, NUP214, NUP98, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB 2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PIIF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG 1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1 A, PRO1073, PSIP2, PTCH, PTEN, PTPN11, RAB5EP, RACl, RAD51L1, RAFl, RALGDS, RANBP17, RAPIGDSI, RARA, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RUNDC2A, RUNX1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SEPT6, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRGAP3, SRSF2, SSI8, SS18L1, SSH3BP1, SSX1, SSX2, SSX4, STAT3, STK11, STL, SUFU, SIJZ12, SYK, TAF15, TALI, TAL2, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1A, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIF1, TLX1, TLX 3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF6, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, USP6, VHL, VTUA, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WTX, WWTR1, XPA, XPC, XPOl, YWHAE, ZNF145, ZNF198, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00415] 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 유전성 장애를 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다. 유전적 질병 또는 질환 또는 유전성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법은 대상체의 세포(들)에 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템의 투여는 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
[00416] 상기 유전성 장애는 염색체 영역에서의 돌연변이 또는 복제 (예컨대, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 틀이동, 염색체 복제 또는 결실)로 유발될 수 있다. 상기 유전성 장애는 임의의 유전성 장애일 수 있다.
[00417] 일부 실시양태에서, 상기 유전성 장애는 22q11.2 결손 증후군, 앵겔만(Angelman) 증후군, 카나반(Canavan)병, 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth)병, 색맹, 묘성 증후군(Cri du chat), 다운 증후군, 뒤시엔느(Duchenne) 근이영양증, 혈색소증, 혈우병, 클라인펠터 증후군, 신경섬유종증, 페닐케톤뇨증, 다낭성 신장 질환, 프레더-윌리(Prader-Willi) 증후군, 겸상적혈구병, 척추성 근위축증, 척추성 근위축증, 테이-삭스(Tay-Sachs)병, 터너 증후군, 혈색소병증, 또는 이들의 임의의 조합이다.
[00418] 일부 실시양태에서, 상기 유전성 장애는 1p36 결손 증후군, 18p 결손 증후군, 21-하이드록실라아제 결핍증, 47 XXX(삼중 X 증후군), 47 XXY(클라인펠터 증후군), 5-ALA 탈수효소 결핍 포르피린증, ALA 탈수효소 결핍증, 5-아미노레불린 탈수효소 결핍 포르피린증, 5p 결손 증후군, 묘성 증후군(AKA 5p-증후군), 모세혈관확장성 운동실조증후군(AKA-A-T), 알파-1 항트립신 결핍증(AAT), 선천성철분대사이상증(aceruloplasminemia), II형 연골무형성증(ACG2), 연골형성부전증(ACH), 산 베타-글루코시다제 결핍증, 고셔병(Gaucher disease)(임의 유형, 예컨대 1형, 2형, 3형), 첨두합지증(애퍼트), 애퍼트 증후군, 첨두합지증(임의 유형, 예컨대 1형, 2형, 3형, 5형), 파이퍼 증후군, 첨두증, 급성 뇌 고셔병, 급성 간헐성 포르피린증(AIP), ACY2 결핍증, 알츠하이머병(AD), 아델라이드형 두개골 유합증(Adelaide-type craniosynostosis), 뮌케 증후군(Muenke syndrome), 결장의 선종성 용종증, 가족성 선종성 용종증(ADP), 아데닐로숙시네이트 리아제 결핍증, 부신 장애, 부신성기 증후군, 부신백질이영양증, 안드로겐 무감성 증후군(AIS), 알캅톤뇨증(AKU), ALA 탈수효소 포르피린증, ALA-D 포르피린증, ALA 탈수효소 결핍증, 알라질 증후군, 백색증, 알캅톤뇨증, 알렉산더병, 알캅톤뇨증, 알캅톤뇨 조직흑갈증(Alkaptonuric ochronosis), 알캅톤뇨증, 알파-1 단백분해효소 억제제, 알파-1 관련 폐기종, 알파-갈락토시다제 A 결핍증, 파브리병(Fabry disease), 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 알렉산더병(ALX), 법랑질형성 부전증(Amelogenesis Imperfecta), 아미노레불린산 탈수효소 결핍증, 아미노아실라아제 2 결핍증, 카나반병, 앤더슨-파브리병(Anderson-Fabry disease), 안드로겐 무감성 증후군, 유전성 철적아구성 빈혈, X 염색체-연관 철적아구성 및/또는 가족성 빈혈, 확산성 구간혈관각화종(Angiokeratoma Corporis Diffusum), 확산성 혈관 각화종(Angiokeratoma diffuse), 망막 혈관종(Angiomatosis retinae), 폰 히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), APC 내성, 라이덴형(Leiden type)(인자 V 라이덴 혈전성향증, 애퍼트 증후군, AR 결핍증, 안드로겐 무감성 증후군, 샤르코-마리-투스병(임의 유형, 예컨대 CMT1, CMTX, CMT2, CMT4, 중증 조기 발병 CMT), 지주지증, 마르판 증후군, ARNSHL, 비증후군성 난청(상염색체 열성, 상염색체 우성, X 염색체-연관 또는 미토콘드리아), 유전성 진행형 관절눈병, 스티클러 증후군(예컨대, COL2A1, COL11A1, COL11A2, COL9A1), 선천성 다발성 관절 이완증, 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome)(운동과잉증형, 관절이완증형, 고전형, 혈관형, 척추후측만증형, 피부파열증형), Asp 결핍증, Aspa 결핍증, 아스파르토아실라아제 결핍증, 모세혈관확장성 운동실조증, 자폐증-치매-운동실조증-자신의 의도대로 손을 사용할 수 없음 증후군(Autism-Dementia-Ataxia-Loss of Purposeful Hand Use syndrome), 레트 증후군, 상염색체 우성 청소년기 ALS, 상염색체 우성 오피츠 G/BBB 증후군, 제3형 청소년기 ALS의 상염색체 열성형, 근위축성 측색 경화증 (임의 유형, 예컨대 ALS1, ALS2, ALS3, ALS4, ALS5, ALS5, ALS6, ALS7, ALS8, ALS9, ALS10, ALS11, ALS12, ALS13, ALS14, ALS15, ALS16, ALS17, ALS18, ALS19, ALS20, ALS21, ALS22, FTDALS1, FTDALS2, FTDALS3, FTDALS4, FTDALS4, IBMPFD2), 상염색체 열성 비증후군성 청각 상실, 상염색체 열성 감각신경 청각 장애 및 갑상선종, 펜드리드 증후군, 알렉산더병(AxD), 아이에르자 증후군(Ayerza syndrome), 가족성 폐동맥 고혈압, 헥소사미니다제 GM2 강글리오시드 축적증의 B 변이형, 샌드호프병(Sandhoff disease, BANF-관련 장애, 신경섬유종증(임의 유형, 예컨대 NF1, NF2, 신경초종증), 비아레-스티븐슨 뇌회상 두피 증후군(Beare-Stevenson cutis gyrata syndrome), 양성 발작성 복막염(Benign paroxysmal peritonitis), 벤자민 증후군, 베타 지중해빈혈(beta thalassemia), BH4 결핍증, 테트라하이드로비오프테린 결핍증, 양측성 청각 신경섬유종증, 바이오티니다제 결핍증, 방광암, 출혈성 장애, 인자 V 라이덴 혈전성향증, 블로크-슐쯔베르거 증후군(Bloch-Sulzberger syndrome), 색소 실조증, 블룸 증후군(Bloom syndrome), 골질환, 부르네빌병(Bourneville disease), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 뇌질환, 프리온병, 유방암, 버트-호그-두베 증후군(Birt-Hogg-Dube syndrome), 취약성 골절, 골형성 부전증, 넓은 엄지손가락-발가락 증후군(Broad Thumb-Hallux syndrome), 루빈스타인-타이비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome), 청동 당뇨병(Bronze Diabetes), 혈색소증, 청동 간경변(Bronzed cirrhosis), 연수척추성 근위축증, X 염색체 연관 척수 및 연수 근위축증, 버거-그러츠 증후군(Burger-Grutz syndrome), 가족성 지단백 리파제 결핍증, 가족성 CADASIL 증후군, CGD 만성 육아종성 장애, 캠프토멜릭 이형성증(Camptomelic dysplasia), 암 가계 증후군, 유전성 비용종증 대장암, 유방암, 방광암, 카복실라아제 결핍증, 다발성 말기 발병 바이오티니다제 결핍증, 묘성 증후군, 카일로 심안면 증후군(Caylor cardiofacial syndrome), 세라마이드 트리헥소시다제 결핍증, 소뇌망막 혈관종, 가족성 폰 히펠-린다우병, 대뇌 동맥병증, CADASIL 증후군, 대뇌 상염색체 우성 동맥병증, CADASIL 증후군, 대뇌 위축성 고암모니아혈증, 레트 증후군, 세레브로사이드 지질축적 증후군, 샤르코병, CHARGE 증후군, 연골형성이상증, 연골형성이상 증후군, 감각신경 난청 동반 연골형성이상증, 귀척추거대골단 이형성증, 연골형성 부전증, 무도무정위운동 자가-돌연변이 고요산혈증 증후군(Choreoathetosis self-mutilation hyperuricemia syndrome), 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome), 전형적 갈락토오스혈증, 갈락토오스혈증, 구순구개열, 스티클러 증후군, 치사성 난장이증 동반 클로버잎 모양 두개골(Cloverleaf skull with thanatophoric dwarfism), 치사성 이형성증(예컨대, 1형 또는 2형), 코핀-로우리 증후군(Coffin-Lowry syndrome)(CLS), 코케인 증후군, 코핀-로우리 증후군, II형 및 XI형 콜라겐병증, 가족성 비용종증, 유전성 비용종증 대장암, 가족성 결장암, 가족성 선종성 용종증, 대장암, 완전 HPRT 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 완전 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍증, 압박 신경장애, 압박 마비유전성 신경병증, 결합조직병, 뿔줄기 기형 안면 증후군(Conotruncal anomaly face syndrome), 쿨리 빈혈, 베타 지중해빈혈, 구리 축적병, 윌슨병, 구리 운송병, 멘케스병, 코프로포르피린증, 유전성 코프로포르피린증, 코프로포르피리노겐 옥시다제 결핍증, 카우덴 증후군, CPX 결핍증, 두개안면 관절기형(Craniofacial dysarthrosis), 크루존 증후군(Crouzon syndrome), 두개안면 골형성부전증, 크루존 증후군, 섬유협착성 크론병, 크루존 증후군, 흑색 가시세포증 동반 크루존 증후군, 크루존 피부골격 증후군, 크루존 피부골격 증후군, 코케인 증후군(CS), 카우덴 증후군, 쿠루슈만-배튼-스타이너트 증후군(Curschmann-Batten-Steinert syndrome), 비아레-스티븐슨의 뇌회상 두피 증후군, 비아레-스티븐슨 뇌회상 두피 증후군, D-글리서레이트 탈수소효소 결핍증, 원발성 고수산뇨증, 얼룩 골간단 증후군(Dappled metaphysis syndrome), 스트루드위크형 척추골단골간단 이형성증(spondyloepimetaphyseal dysplasia, Strudwick type), 알츠하이머형 치매(DAT), 유전성 고칼슘뇨증, 덴트병, 근이영양증(예컨대, 듀센느-베커형), 갑상선종 동반 난청, 펜드리드 증후군, 난청-망막 색소변성 증후군, 어셔 증후군, 페닐알라닌 하이드록실라아제 결핍성 질환, 퇴행성 신경병, 드 그루쉬 증후군 1(de Grouchy syndrome 1), 드 그루쉬 증후군, 데제린-소타스 증후군(Dejerine-Sottas syndrome), 델타-아미노레불리네이트 탈수소효소 결핍증 포르피린증, 치매, CADASIL 증후군, 탈수초성 백질이영양증, 알렉산더병, 피부파열형 엘러스-단로스 증후군, 피부 파열증, 유전성 발달 장애, 원위 유전성 운동 신경병증(dHMN), 원위 유전성 운동 신경병증(예컨대, DHMN-V), DHTR 결핍증, 안드로겐 무감성 증후군, 확산성 글로보이드체 경화증, 크라베병(Krabbe disease), 디조지 증후군(DiGeorge syndrome), 디하이드로테스토스테론 수용체 결핍증, 안드로겐 무감성 증후군, 원위 유전성 운동 신경병증, 근긴장성 이영양증(1형 또는 2형), 원위 척추성 근위축증(임의 유형, 예컨대, 1형, 2형, 3형, 4형, 5형, 6형), 듀센느/베커형 근이영양증, 난장이증, 난장이증-망막 감퇴-난청 증후군(Dwarfism-retinal atrophy-deafness syndrome), 코케인 증후군, 수초형성장애 유발성 백질이영양증, 알렉산더병, 근긴장성 이영양증, 색소성 망막 이영양증-골형성 부전증 증후군(dystrophia retinae pigmentosa-dysostosis syndrome), 어셔 증후군, 조기 발병형 가족성 알츠하이머병(EOFAD), 알츠하이머병(예컨대, 1형, 2형, 3형 또는 4형 포함), 에크만-롭슈타인병(Ekman-Lobstein disease), 골형성 부전증, 죄임 신경병증(Entrapment neuropathy), 압박 마비 유전성 신경병증, 적혈구조혈성 프로토포르피린증(EPP), 적아구성 빈혈,베타 지중해빈혈, 적혈구간성 프로토포르피린증, 에리스로이드 5-아미노레불리네이트 합성효소 결핍증, X 염색체-연관 철적아구성 빈혈, 안암, 망막모세포종 FA - 프리드리히 운동실조증, 프리드리히 운동실조증, 판코니 빈혈, 안면 부상 및 장애, 인자 V 라이덴 혈전성향증, FALS, 근위축성 측색 경화증, 가족성 청신경종, 가족 선종성 용종증, 가족성 알츠하이머병(FAD),가족성 근위축성 측색 경화증, 근위축성 측색 경화증, 가족성 자율신경장애, 가족성 지방유도성 고중성지질혈증, 가족성 지단백 리파제 결핍증, 가족성 혈색소증, 혈색소증, 가족성 LPL 결핍증, 가족성 지단백 리파제 결핍증, 가족성 비용종증 결장암, 유전성 비용종증 대장암, 가족성 발작성 다발장막염, 가족성 PCT, 만발성 피부 포르피린증, 가족성 압박 감수성 신경병증, 압박 마비 유전성 신경병증, 가족성 원발성 폐고혈압(FPPH), 가족성 혈관성 백질뇌증, CADASIL 증후군, FAP, 가족성 선종성 용종증, FD, 가족성 자율신경장애, 페로켈라타아제 결핍증(Ferrochelatase deficiency), 페로포르틴병(ferroportin disease), 혈색소증(임의 유형, 예컨대 1형, 2A형, 2B형, 3형, 4형, 신생아 혈색소증, 선천성철분대사이상증, 선천성 무트랜스페린증, GRACILE 증후군, 주기성 발열 증후군, 가족성 지중해열(FMF), FG 증후군, FGFR3 연관 두개골 조기유합증(FGFR3-associated coronal synostosis), 성상세포의 유섬유소변성, 알렉산더병, 췌장의 섬유낭포증, 폴링병, 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), fra(X) 증후군, 취약성 X 증후군, 골취약증, 골형성 부전증, FRAXA 증후군, 프리드리히 운동실조증(FRDA), G6PD 결핍증, 갈락토키나제 결핍성 질환, 갈락토오스혈증, 갈락토오스-1-인산염 우리딜트랜스퍼라제 결핍성 질환, 갈락토오스혈증, 갈락토실세라미다제 결핍성 질환, 크라베병, 갈락토실세라마이드 지방증, 크라베병, 갈락토실세레브로시다제 결핍증, 갈락토실스핑고신 지방증, GALC 결핍증, GALT 결핍증, 갈락토오스혈증, 고셔병 유사 질환, 유사 고셔병, GBA 결핍증, 유전성 뇌장애, 유전성 폐기종, 유전성 혈색소증, 혈색소증, 신생아 거대세포 간염, 신생아 혈색소증, GLA 결핍증, 망막 교모세포종, 망막모세포종, 망막 신경교종, 망막모세포종, 글로보이드 세포 백질이영양증(GCL, GLD), 크라베병, 글로보이드 세포 백질뇌증, 글루코세레브로시다제 결핍증, 글루코세레브로사이드 축적증, 글루코실 세레브로사이드 지방증, 글루코실세라미다제 결핍증, 글루코실세라마이드 베타-글루코시다제 결핍증, 글루코실세라마이드 지방증, 글리세린 산뇨증, 원발성 고수산뇨증, 글리신 뇌병증, 비케톤성 고글리신혈증, 글리콜 산뇨증, 원발성 고수산뇨증, GM2 강글리오시드축적증, 테이-삭스병, 갑상선종-난청 증후군, 펜드리드 증후군, 그레페-어셔 증후군(Graefe-Usher syndrome), 어셔 증후군, 그론블라드-스트랜드버그 증후군(Gronblad-Strandberg syndrome), 탄력섬유성 위황색종(pseudoxanthoma elasticum), 혈색소증, 혈색소증, 홀그렌 증후군, 어셔 증후군, 할리퀸 어린선(Harlequin Ichthyosis), Hb S 질환, 연골저형성증(HCH), 유전성 코프로포르피린증(HCP), 두부 및 뇌 기형, 청각 장애 및 난청, 소아의 청력 장애, HEF2A, HEF2B, 헤마토포르피린증, 포르피린증, 헴 합성효소 결핍증, 혈색소증, 헤모글로빈 M 질환, 메트헤모글로빈혈증 베타-글로빈형, 헤모글로빈 S 질환, 혈우병, 간적혈구조혈성 포르피린증(HEP), 간 AGT 결핍증, 원발성 고수산뇨증, 간렌즈핵변성 증후군(Hepatolenticular degeneration syndrome), 윌슨병, 유전성 관절눈병, 스티클러 증후군, 유전성 디스토피아 지방증(Hereditary dystopic lipidosis), 유전성 혈색소증(HHC), 혈색소증, 유전성 출혈형 모세혈관확장증(HHT), 유전성 봉입체 근육병, 골격근 신생, 유전성 철적재형 빈혈(Hereditary iron-loading anemia), X 염색체-연관 철적아구성 빈혈, 유전성 운동 및 감각 신경병증, V형 유전성 운동 신경병증, 원위 유전성 운동 신경병증, 유전성 다발성 외골증, 유전성 비용종증 대장암, 유전성 주기성 발열 증후군, 유전성 대장 용종증, 가족성 선종성 용종증, 유전성 폐기종, 활성화 단백질 C에 대한 유전성 내성, 인자 V 라이덴 혈전성향증, III형 유전성 감각 및 자율 신경병증, 가족성 자율신경장애, 유전성 경련성 하지대마비, 영아 발병 증가성 유전적 경련성 마비, 유전성 척수성 운동실조증, 프리드리히 운동실조증, 유전성 척추 경화증, 프리드리히 운동실조증, 헤릭 빈혈, 이형접합성 OSMED, 바이센바허-쯔바이뮐러 증후군(Weissenbacher-Zweymuller syndrome), 이형접합성 귀척추거대골단 이형성증, 바이센바허-쯔바이뮐러 증후군, HexA 결핍증, 테이-삭스병, 헥소사미니다제 A 결핍증, 테이-삭스병, 헥소사미니다제 알파-서브유닛 결핍증(임의의 변이형, 예컨대 A형 변이, B형 변이), 테이-삭스병, HFE-연관 혈색소증, 혈색소증, HGPS, 조로증, 히펠-린다우병, 폰 히펠-린다우병, 혈색소증(HLAH), 원위 유전성 운동 신경병증(HMN V), 유전성 비용종증 대장암(HNPCC), 압박 마비 유전성 신경병증(HNPP), 호모시스틴뇨증, 호모겐티신산 옥시다제 결핍증, 알캅톤뇨증, 호모겐티신산뇨증, 알캅톤뇨증, 동형접합성 만발성 피부 포르피린증, 간적혈구조혈성 포르피린증, 원발성 고수산뇨증(HP1), 원발성 고수산뇨증(HP2), 고페닐알라닌혈증(HPA), HPRT - 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍증, 레쉬-니한 증후군, III형 HSAN, 가족성 자율신경장애, 가족성 자율신경장애(HSAN3), 유전성 감각 신경병증(임의 유형, 예컨대 HSN-1, HSN-II, HSN-III), 가족성 자율신경장애, 인간 피부파열증, 헌팅톤병, 허치슨-길포드 조로증후군(Hutchinson-Gilford progeria syndrome, 조로증, 21-하이드록실라아제 결핍증으로 인한 비전형적 안드로겐과잉증, 가족성 고카일로마이크론혈증, 가족성 지단백 리파제 결핍증, 케토산증 및 백혈구감소증 동반 고글리신혈증,프로피온산혈증, I형 고지단백혈증, 지단백 리파아제 결핍증, 가족성 고수산뇨증, 원발성 고페닐알라닌혈증, 고페닐알라닌혈증, 연골이형성증, 연골저형성증, 연골형성저하증, 연골저발생증, 저색소성 빈혈, X 염색체-연관 철적아구성 빈혈, 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라아제(HPRT) 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 영아 발병 증가성 유전적 경련성 마비(IAHSP), ICF 증후군, 면역결핍증, 동원체 불안정 및 안면 기형 증후군, 특발성 혈색소증, 3형 혈색소증, 특발성 신생아 혈색소증, 신생아 혈색소증, 특발성 폐고혈압, 면역계 장애, X 염색체-연관 중증 복합 면역결핍증, 색소 실조증, 영아 뇌 고셔병, 영아 고셔병, 영아 발병 증가성 유전적 경련성 마비, 불임, 유전성 폐기종, 압박 마비에 대한 유전 성향, 압박 마비 유전성 신경병증, 인슬리-아슬리 증후군(Insley-Astley syndrome), 귀척추거대골단 이형성증, 간헐적 급성 포르피린 증후군, 급성 간헐성 포르피린증, 장 용종증-피부 색소침착 증후군, 푸에츠-제거스 증후군, 색소 실조증(IP), 철 축적 장애, 혈색소증, 이중심절 15번(Isodicentric 15), 이중심절 15번, 고립형 난청(Isolated deafness), 비증후군성 난청, 잭슨-바이스 증후군(Jackson-Weiss syndrome), 주버트 증후군(Joubert syndrome), 소아 원발성 측색 경화증(JPLS), 소아 근위축성 측색 경화증, 소아 통풍, 무도무정위운동, 정신지체 증후군, 레쉬-니한 증후군, 소아 고요산혈증 증후군, 레쉬-니한 증후군, 잭슨-바이스 증후군(JWS), 척수 및 연수 근위축증, 케네디병, 척수 및 연수 근위축증, 케네디 척수 및 연수 근위축증, 척수 및 연수 근위축증, 케라신 조직구증, 케라신 유지증, 케라신 축적증, 케톤형 글리신혈증, 프로피온산혈증, 케톤형 고글리신혈증, 프로피온산혈증, 신장병, 원발성 고수산뇨증, 니스트 이형성증(Kniest dysplasia), 크라베병, 쿠겔베르그-벨란더병(Kugelberg-Welander disease), 척수성 근위축증, 반상 치매, CADASIL 증후군, 랑거-살디노 연골무형성증, 랑거-살디노 이형성증, 후기 발병성 알츠하이머병, 후기 발병성 크라베병(LOKD), 크라베병, 학습 장애, 학습 부진, 구주위 흑자증, 푸에츠-제거스 증후군, 레쉬-니한 증후군, 백질이영양증, 로젠탈 섬유 동반 백질이영양증, 알렉산더병, 해면형 백질이영양증, 리-프라우메니 증후군(LFS), 리-프라우메니 증후군, 리파제 D 결핍증, 지단백 리파제 결핍증, 가족성 LIPD 결핍증, 지단백 리파아제 결핍증, 가족성 지방증, 세레브로사이드 지방증, 영아 강글리오시드 지방증, 테이-삭스병, 리포이드조직구증(케라신형), 지단백 리파아제 결핍증, 가족성 간질환, 갈락토오스혈증, 루게릭병, 루이-바 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증, 린치 증후군, 유전성 비용종증 대장암, 리실-하이드록실라아제 결핍증, 마카도-조셉병(Machado-Joseph disease), 척수소뇌 운동실조증(임의 유형, 예컨대 SCA1, SCA2, SCA3, SCA18, SCA20, SCA21, SCA23, SCA26, SCA28, SCA29), 남성 유방암, 유방암, 남성 생식기 장애, 유방 악성 신생물, 유방암, 유방 악성 종양, 유방암, 방광 악성 종양, 방광암, 유선암, 유방암, 마르판 증후군, 마커 X 증후군, 취약성 X 증후군, 마틴-벨 증후군, 취약성 X 증후군, 맥쿤-알브라이트 증후군(McCune-Albright syndrome), 맥러드 증후군(McLeod syndrome), MEDNIK 증후군, 지중해 빈혈, 베타 지중해빈혈, 거대골단 난장이증, 귀척추거대골단 이형성증, 멘케스 증후군, 멘케스 증후군, 멘케스 증후군, 골연골이상 동반 정신 지체, 코핀-로우리 증후군, 대사 장애, II형 영양위축성 난장이증, 니스트 이형성증, II형 영양위축성 이형성증, 니스트 이형성증, 메트헤모글로빈혈증(임의 유형, 예컨대, 선천성 베타글로빈형, 선천성 II형 메트헤모글로빈혈증), 메틸말론산혈증, 마르판 증후군(MFS), MHAM, 카우덴 증후군, 마이크로 증후군, 소두증, MMA, 메틸말론산 혈증, 멘케스병(AKA MK 또는 MNK), 1염색체성 1p36 증후군, 운동 신경병, 근위축성 측색 경화증, 근위축성 측색 경화증, 운동 장애, 모왓-윌슨 증후군, 점액다당류축적증(MPS I), 점액점착증, 다발경색치매, CADASIL 증후군, 후발성 다발 카복실라아제 결핍증, 바이오티니다제 결핍증, 다발성 과오종 증후군, 카우덴 증후군, 다발성 신경섬유종증, 근이영양증(임의 유형, 예컨대 듀센트 및 베커형), 위축성 근육긴장증, 근긴장성 이영양증, 이영양성 근긴장증, 낸스-인슬리 증후군, 귀척추거대골단 이형성증, 낸스-스위니 연골이형성증, 귀척추거대골단 이형성증, NB1A1, 판토테네이트 키나아제-연관 신경변성증, 네일-딩월 증후군(Neill-Dingwall syndrome), 코케인 증후군, 망막신경아세포종, 망막모세포종, 1형 뇌내 철축적 동반 신경변성증, 판토테네이트 키나아제-연관 신경변성증, 신경 질환, 신경근 장애, 원위 유전성 운동신경병증, 니만-픽(Niemann-Pick), 니만-픽병, 노악 증후군, 비케톤성 고글리신혈증, 글리신 뇌병증, 비신경계침윤성 고셔병, 비페닐케톤뇨 고페닐알라닌혈증, 테트라하이드로바이오프테린 결핍증, 비증후군성 난청, 누난 증후군, 노보트니 고셔병, 조직흑갈증, 알캅톤뇨증, 조직흑갈증성 관절염,알캅톤뇨증, 오그덴 증후군, 골형성 부전증(OI), 오슬러-웨버-랑뒤병(Osler-Weber-Rendu disease), 유전성 출혈형 모세혈관확장증, OSMED, 귀척추거대골단 이형성증, 골형성 부전증, 골취약증, 골형성 부전증, 선천성 골경화증, 귀척추거대골단 이형성증, 귀척추거대골단 이형성증, 귀척추거대골단 이형성증, 수산증, 원발성 고수산뇨증, 원발성 옥살산뇨, 원발성 고수산뇨증, 판토테네이트 키나아제-연관 신경변성증, 파타우 증후군(Patau Syndrome)(3염색체성 13), PBGD 결핍증, 급성 간헐성 포르피린증, PCC 결핍증, 프로피온산 혈증, 포르피린증 만발성 피부(PCT), PDM병, 펜드리드 증후군, 주기적 질환, 지중해열, 가족성 주기적 복막염, 구주위 흑자증 증후군,푸에츠-제거스 증후군, 말초 신경 장애, 가족성 자율신경장애, 말초 신경섬유종증, 비골근 위축증, 퍼옥시좀 알라닌:글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라아제 결핍증, 원발성 고수산뇨증, 푸에츠-제거스 증후군, 페닐알라닌 하이드록실라아제 결핍성 질환, 갈색세포종, 폰 히펠-린다우병, 태아 연골이형성증 동반 피에르 로빈 증후군, 바이센바허-쯔바이뮐러 증후군, 색소성 간경변, 혈색소증, 푸에츠-제거스 증후군(PJS), 판토테네이트 키나제-연관 신경변성증(PKAN), PKU, 페닐케톤뇨증, 플럼보 포르피린증, ALA 결핍증 포르피린증, PMA, 다낭성 신장 질환, 다골성 섬유성골 이형성증, 맥쿤-알브라이트 증후군, 가족성 선종성 용종증, 과오종성 장 용종증, 폴립 및 스팟 증후군(polyps-and-spots syndrome), 푸에츠-제거스 증후군, 포르포빌리노겐 합성효소 결핍증, ALA 결핍 포르피린증, 포르피린 장애, PPOX 결핍증, 반문상 포르피린증, 프레이더-랩하트-윌리 증후군(Prader-Labhart-Willi syndrome), 프레이더-윌리 증후군, 초로기 및 노인성 치매, 원발성 섬모운동 이상증 (PCD), 원발성 혈색소증, 혈색소증, 원발성 과뇨산혈증 증후군,레쉬-니한 증후군, 원발성 노인성 퇴행 치매, 돌연변이 프로콜라겐형 EDS VII, 조로증, 허친슨 길포드 조로증후군, 조로증 유사 증후군, 코케인 증후군, 조로성 왜소증, 코케인 증후군, 유전적 만성 진행성 무도병(헌팅톤), 헌팅톤병, 정상 공막 동반 진행성 변형 골형성 부전증(progressively deforming osteogenesis imperfecta with normal sclerae), 골형성 부전증(임의 유형, 예컨대 I형, II형, III형, IV형, V형, VI형, VII형, VIII형), 근위 근긴장성 이영양증(PROMM), 프로피온산혈증, 프로피오닐-CoA 카복실라아제 결핍증, 단백질 C 결핍증, 단백질 S 결핍증, 프로토포르피린증, 프로토포르피리노겐 옥시다제 결핍증, 반문상 포르피린증, 근위 근긴장성 이영양증, 2형 근긴장성 이영양증, 근위 근긴장성 근육병, 유사 고셔병, 탄력섬유성 위황색종, 사이코신 지방증, 크라베병, 폐동맥 고혈압, 폐고혈압, 탄력섬유성 위황색종(PXE), 탄력섬유성 위황색종, 망막모세포종(Rb), 레클링하우젠병(Recklinghausen disease), 재발성 다발장막염, 망막 장애, 망막 색소변성증-난청 증후군, 어셔 증후군, 망막모세포종, 레트 증후군, 3형 RFALS, 리커 증후군, 릴리-데이 증후군(Riley-Day syndrome), 가족성 자율신경장애, 로우시-레비 증후군(Roussy-Levy syndrome), 루빈스타인-테이비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome)(RSTS), 레트 증후군(RTS), 루빈스타인-테이비 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 색-바라바스 증후군(Sack-Barabas syndrome), SADDAN 병, 리 및 프라우메니의 육종 계열 증후군(sarcoma family syndrome of Li and Fraumeni), 리-프라우메니 증후군, SBLA 증후군(육종, 유방암, 백혈병 및 부신 증후군), 리-프라우메니 증후군, 척수 및 연수 근위축증(SBMA), 양측성 청각 슈반종, 2형 신경섬유종증, 슈발츠-얌펠 증후군(Schwartz-Jampel syndrome), X 염색체-연관 중증 복합 면역결핍증(SCIDX1), 선천성 SED, 선천성 척추골단 이형성증, 스트루드위크형 SED, 스트루드위크형 척추골단골간단 이형성증, 선천성 척추골단 이형성증(SEDc), 스트루드위크형 척추골단골간단 이형성증(SEMD), 스트루드위크형 SEMD, 노인성 치매, 발달 지연 및 흑색 가시세포증 동반 중증 연골발육부전증, SADDAN 병, 스프린젠 증후군, PHF8 유전자 돌연변이로 유발된 사이데리우스(Siderius) X 염색체-연관 정신 지체 증후군, 골격-피부-뇌 증후군, 피부 색소침착 장애, 척추 근위축증(SMA), 척추골단골간단 이형성증(SEMD)(임의 유형, 예컨대 스트루드위크형, 1형), 스미스 렘리 오피츠 증후군(Smith Lemli Opitz Syndrome), 스미스 마제니스 증후군(Smith Magenis Syndrome), 유전성 남아프리카 포르피린증, 영아 발병 증가성 경련성 마비,영아 발병 증가 유전적 경련성 마비, 언어 및 소통 장애, 테이-삭스 스핑고지방증, 테이-삭스병, 척수 및 연수 근위축증, 척추 근위축증, V형 원위 척추 근위축증, 원위 유전성 운동 신경병증, 주로 팔에 발병하는 원위 척추성 근위축증, 원위 유전성 운동 신경병증, 척수소뇌 운동실조증, 선천성 척추골단 이형성증, 척추골단 이형성증, 콜라겐병증(임의 유형, 예컨대 II형 및 XI형), 척추골단골간단 이형성증, 척추골간단 이형성증(SMD), 척추골단골간단 이형성증, 중추 신경계의 해면상 변성, 뇌의 해면상 변성, 영아의 백질 해면상 변성, 산발형 원발성 폐고혈압, SSB 증후군, 강철빛 모발 증후군(steely hair syndrome), 멘케스 증후군, 슈타이너트병, 근긴장성 이영양증, 슈타이너트 근긴장성 이영양증후군, 근긴장성 이영양증, 스티클러 증후군, 뇌졸중, CADASIL 증후군, 스트루드위크 증후군, 아급성 신경계침윤형 고셔병, 스웨덴 유전성 포르피린증, 급성 간헐형 포르피린증, 급성 간헐형 포르피린증, 스위스 치즈 연골 이형성증, 니스트 이형성증, 테이-삭스병, TD - 치사성 난장이증, 치사성 이형성증, 곧은 대퇴골 및 클로버잎 모양 두개골을 보이는 TD(TD with straight femurs and cloverleaf skull), 2형 치사성 이형성증, 소뇌-안구피부 모세혈관확장증, 모세혈관확장성 운동실조증, 고환 여성화 증후군, 안드로겐 무감성 증후군, 테트라하이드로비오프테린 결핍증, 고환 여성화 증후군(TFM), 안드로겐 무감성 증후군, 중간성 지중해빈혈(thalassemia intermedia), 베타-지중해빈혈, 종증성 지중해 빈혈,베타 지중해빈혈, 치사성 이형성증, 활성화 단백질 C에 대한 보조인자 결핍으로 인한 라이덴형 혈전성향증, 인자 V 라이덴형 혈전성향증, 갑상선 질환, 순대양 신경병증, 압박 마비 유전성 신경병증, 총 HPRT 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 총 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 트리처 콜린스 증후군, 트리아스 취약성 골, 3중 X 증후군, 3중 X 증후군, 3염색체 21 X, 트로이시에-하놋-쇼파르 증후군(Troisier-Hanot-Chauffard syndrome), 혈색소증(hemochromatosis), 테이-삭스병(TSD), 복합 결절성 경화증(TSC), 결절성 경화증, 터너 유사 증후군, 누난 증후군, UDP-갈락토오스-4-에피머라아제 결핍성 질환, 갈락토오스혈증, UDP 글루코오스 헥소오스-1-인산염 우리딜트랜스퍼라아제 결핍증, 갈락토오스혈증, 미분류 난청, 비증후군성 난청, UPS 결핍증, 급성 간헐성 포르피린증, 방광암, 방광암, UROD 결핍증, 유로포르피리노겐 디카복실라제 결핍증, 유로포르피리노겐 합성효소 결핍증, 급성 간헐성 포르피린증, 어셔 증후군, UTP 헥소오스-1-인산염 우리딜릴트랜스퍼라아제 결핍증, 갈락토오스혈증, 반 보가에르트-베르트란트 증후군(Van Bogaert-Bertrand syndrome), 판 더 회브 증후군(Van der Hoeve syndrome), 구개심장안면 증후군(Velocardiofacial syndrome), VHL 증후군, 폰 히펠-린다우병, 시력 손상 및 실명, 알스트롬 증후군, 폰 보가에르트-베르트란트병, 폰 히펠-린다우병, 폰 레클렌하우젠-애플바움병, 혈색소증, 폰 레클렌하우젠병, I형 신경섬유종증, 브롤릭병(Vrolik disease), 골형성 부전증, 바르덴부르크 증후군(Waardenburg syndrome), 바르부르크 쇼 플레델리우스 증후군(Warburg Sjo Fledelius syndrome), 마이크로 증후군, 윌슨병(WD), 바이센바허-쯔바이뮐러 증후군, 베르드니히-호프만 병, 척수성 근위축증, 윌리암스 증후군, 윌슨병, 윌슨병, 윌슨병, 볼프-허시혼 증후군(Wolf-Hirschhorn syndrome), 볼프 주기적 질환, 바이센바허-쯔바이뮐러 증후군(WZS), 색소성 건피증, X 염색체-연관 정신 지체 및 거대고환증, 취약성 X 증후군, X 염색체-연관 원발성 과뇨산혈증, 레쉬-니한 증후군, X 염색체-연관 중증 복합 면역결핍증, X 염색체-연관 철적아구성 빈혈, X 염색체-연관 척수-연수 근위축증, 척수 및 연수 근위축증, X 염색체-연관 요산뇨증 효소 결함, 레쉬-니한 증후군, X-SCID, X 염색체-연관 중증 복합 면역결핍증, X 염색체-연관 철적아구성 빈혈(XLSA), XSCID, X 염색체-연관 중증 복합 결핍증, X 염색체-연관 철적아구성 빈혈(XLSA), XSCID, X 염색체-연관 중증 복합 결핍증, XXX 증후군, 3중 X 증후군, XXXX 증후군, XXXXX 증후군, XXXXX, XXY 증후군, XXY 3염색체, 클라인펠터 증후군, XYY 증후군, 3염기 반복 질환, 또는 이들의 임의의 조합이다.
[00419] 실시양태에서, 특정 전사후 제어 조절자는 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템을 투여함으로써 그 활성의 조절, 변형, 강화 또는 감소를 위해 표적화된다. 예를 들어, 전사후 제어 조절자로는 PARN, PAN, CPSF, CstF, PAP, PABP, PAB2, CFI, CFII, RNA 트리포스파타제, RNA 구아닐트랜스퍼라제, RNA 메틸트랜스퍼라제, SAM 신타제, 유비퀴틴 접합 효소 E2R, SR 단백질 SFRS1 내지 SFR11, hnRNP 단백질 (예컨대, HNRNPA0, HNRNPA1, HNRNPA1L1, HNRNPA1L2, HNRNPA2, HNRNPA2B1, HNRNPAB, HNRNPB1, HNRNPC, HNRNPCL1, HNRNPD, HNRPDL, HNRNPF, HNRNHP1, HNRNPH2, HNRNPH3, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPLL, HNRNPM, HNRNPR, HNRNPU, HNRNPUL1, HNRNPUL2, HNRNPUL3), ADAR, Mex 67, Mtr2, Nab2, 데드-박스(Dead-box) 헬리카제, elF4A, elF4B, elF4E, elF4G, GEF, GCN2, PKR, HRI, PERK, eEF1, eEF2, GCN, eRF3, ARE-특이적 결합 단백질, EXRN1, DCP1, DCP2, RCK/p54, CPEB, eIF4E, 마이크로RNA 및 siRNA, DICER, Ago 단백질, 넌센스 매개형 mRNA 제거 (Nonsence-mediated mRNA decay) 단백질, UPF3A, UPF3BeIF4A3, MLN51, Y14/MAGOH, MG-1, SMG-5, SMG-6, SMG-7 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00420] 일부 실시양태에서, 세포 주기와 관련된 유전적 경로들은 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템을 투여하여 그 활성을 조절, 향상 또는 감소시킨다. 세포 주기와 관련된 예시적인 경로 및 유전자들로는 ATM, PMS2, FAS-L, MRE11, MLH1, FasR, NBS1, MSH6, Trail-L, RAD50, MSH2, Trail-R, 53BP1, RFC, TNF-Ct, P53, PCNA, TNF-R1, CHKE, MSH3, FADD, E2F1, MutS 동족체, TRADD, PML, MutL 동족체, R1P1, FANCD2, 엑소뉴클레아제, MyD88, SMC1, DNA, 폴리머라제 델타, IRAK, BLM1, (POLDl, POLD2, POLD3, NIL, BRCA1, 및 POLD4-유전자, IKK, H2AX 암호화 서브유닛), NFΚβ, ATR, 토포아이소머라제1, ΙκΒα, RPA, 토포아이소머라제2, IAP, ATRIP, RNAseHl, 카스파제 3, RAD9, 리가제1, 카스파제 6, RAD1, DNA, 폴리머라제1, 카스파제 7, HUS, DNA, 폴리머라제 3, 카스파제 8, RAD17, 프리마제, 카스파제10, RFC, 헬리카제, HDAC1, CHK1, 단일 가닥 결합 HDAC2, TLK1 단백질, 시토크롬 C, CDC25, Bxl-xL, STAT3, STAT5, DFF45, Vcl-2, ENDO-G, PI3K, Akt, 칼페인, Bad, Bax, 유비퀴틴 매개형 단백질가수분해, 저산소증, 세포 증식, HIF-loc, MAPK, El, HERC1, TRAF6, HIF-Ιβ, MAPKK, E2, UBE2Q, MEKK1, Refl, MAPKKK, E3, UBE2R, COP!, HSP90, c-Met, UBLE1A, UBE2S, PIFH2, VEGF, HGF, UBLE1B, UBE2U, cIAP, PAS, ER, S1/2, UBLEIC, UBE2W, PIAS, ARNT, ATK, UBE2A, UBE2Z, SYVN, VHL, PKCs, UBE2B, AFC, LLC, N, NHLRC1, HLF, 팍실린, UBE2C, UBE1, AIRE, EPF, FAK, UBE2A, E6AP, MGRN1, VDU2, 아듀신, UBE2E, UBE3B, BRCA1, SUMORESUME, PYK1, UBE2F, Smurf, FANCL, SENP1, RB, UBE2G1, 소양증, MIDI, 칼시뉴린, A, RBI, UBE2G2, HERC2, Cdc20, RACK1, Raf-1, UBE2I, HERC3, Cdhl, PTB, A-Raf, UBE2J1, HERC4, Apcl, Hur, B-raf, UBE2J2, UBE4A, Apc2, PHD2, MEK1/2, UBE2L3, UBE4B, Apc3, SSAT2, ERK1/2, UBE2L6, CHIP, Apc4, SSAT1, Ets, UBE2M, CYC4, Apc5, GSK3, Elkl, UBE2N, PPR19, Apc6, CBP, SAP1, UBE20, UIP5, Apc7, FOX04, cPLA2, WWPI, Mdm2, Apc8, FlH-1, WWP2, 파르킨, Apc9, TRIP, 12, Trim32, Ape, 10, NEED4, Trim37, Ape, 11, ARF-BP1, SIAH-1, Ape, 12, EDD1, PML, 세포 생존, 세포 주기 정지, SMADI, P21, SMAD5, BAX, SAMD8, MDR, LEF1, DRAIL, IGFBP3, TCF3, GADD45, TCF4, P300, HAT1, PI3, Akt, GF1 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00421] 일부 실시양태에서, 혈관형성과 관련된 유전자들은 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템을 세포(들)에 투여하여 그 활성을 조절, 향상 또는 감소시킨다. 혈관형성 및 혈관형성 관련 질환들과 관련된 예시적인 유전자 및 유전적 경로로는 VEGF, VEGFR2, SHC, E2F7, VEGFB, VEGFR3, PI3, VEGFC, Nrp l, PIP3, EGFDIP3, DAG, GRB2, SOS, Akt, PB, PKC, Ras, RAF1, DAG, eNOS, NO, ERK1, ER2, cPLA2, ME1, MEK2 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00422] 일부 실시양태에서, 미토콘드리아 기능과 관련된 유전적 경로 및/또는 유전자들은 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템을 세포(들)에 투여하여 그 활성을 조절, 향상 또는 감소시킨다. 미토콘드리아 기능과 관련된 유전자 및 유전적 경로로는 말레이트 디하이드로게나제 아미노트랜스퍼라제, 하이드라타제, 디아실라제, 디하이드로게나제, 카복실라제, 뮤타제, 지방산 산화 류신 산화 이소류신 장애 (효소 경로 산화 경로 결핍증) 아미노트랜스퍼라제 아미노트랜스퍼라제, OCTN2 분지쇄, FATP1-6 아미노트랜스퍼라제 2, 아미노트랜스퍼라제 2, CPT-1 미토콘드리아, CACT 이소부틸-CoA 2-메틸부틸릴-CoA, CPT-II 디하이드로게나제, SCAD (분지쇄 (분지쇄, MCAD 케토산 케토산, VLCAD 디하이드로게나제 디하이드로게나제, ETF-DH 복합체) 복합체), 알파-ETF 하이드라타제 하이드라타제, 베타-ETF HMG-CoA 리아제 2-메틸-3-OH- SCHAD 부티릴-CoA, LCHAD 디하이드로게나제, MTP 3-옥소티올라제, LKAT,DECR 1, HMGCS2, HMGCL 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00423] 일부 실시양태에서, DNA 손상 또는 유전체 불안정성과 관련된 유전적 경로 및/또는 유전자들은 그 활성이 조절, 향상 또는 감소된다. DNA 손상 및 유전체 불안정성에 대한 경로 및/또는 유전자와 관련된 예시적인 유전자 및 유전적 경로로는, 53BP1, BLM, MBD2, DNA, 리가제 4, MDC1, H2AX, XLF, SMC1, 53BP1, Rad50, P53, P53, 아르테미스, Rad27, TdT, APE1, PMS2, APE2, UvrA, RecA, MLH1, NEIL1, UvrB, SSB, MSH6, NEIL2, UvrC, Mrell, MSH2, NEIL3, XPC, Rad50, RFC, XRCC1, Rad23B, Nbsl, PCNA, PNKP, CEN2, CtIP, MSH3, Tdpl, DDB1, RPA, MutS, APTX, XPE, Rad51, MutL, DNA, 폴리머라제 β CSA, Rad52, DNA 폴리머라제 δ, CSB, Rad54, 토포아이소머라제 1, DNA, TFT1H, BRCA1, 토포아이소머라제 2, PCNA, XPB, BRCA2, RNAseHl, FEN1, XPD, Exol, 리가제 1, RFC, XPA, BLM, DNA, 폴리머라제 1, PAR1, RPA, Topllla, DNA, Ligl, XPG, GEN1, 프리마제, Lig3, ERCC1 Yenl 헬리카제, UNG, XPF, Slxl, SSBs, MUTY DNA 폴리머라제 δ, Slx4, SMUG DNA 폴리머라제 ε, Mus8, MBD4, Emel, Dssl, ASH1L, SETD4, DQT1L, SETD5, EHMT1, SETD6, EHMT2, SETD7, EZH1, SETD8, EZH2, SETD9, MLL, SETDB1, MLL2, SETDB2, MLL3, SETMAR, MLL4, SMYD1, MLL5, SMYD2, NSD1, SMYD3, PRDM2, SMYD4, SET, SMYD5, SETBP1, SUV39H1, SETD 1A, SUV39H2, SETD 1B, SUV420H1, SETD2, SUV420 H2, SETD3 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00424] 일부 실시양태에서, 포유동물 전사 인자를 암호화하는 유전자들은 조절, 향상, 감소되거나, 또는 세포에 제공된다. 예시적인 인간 전사 인자로는 AFF4, AFF3, AFF2, AFF1, AR, TFAP2B, TFAP2D, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, JARID2, KDM5D, ARID4A, ARID4B, KDM5A, ARID3A, KDM5B, KDM5C, ARID5B, ARID3B, ARID2, ARID5A, ARID3C, ARID1A, ARID1B, HIF1A, NPAS1, NPAS3, NPAS4, MLXIPL, ARNTL2, MXD1, AHRR, TFE3, HES2, MNT, TCF3, SREBF1, TFAP4, TCFL5, LYL1, USF2, TFEC, AHR, MLX, MYF6, MYF5, SIM1, TFEB, HAND1, HES1, ID2, MYCL1, ID3, TCF21, MXI1, SOHLH2, MYOG, TWIST1, NEUROG3, BHLHE41, NEUROD4, MXD4, BHLHE23, TCF15, MAX, ID1, MYOD1, ARNTL, BHLHE40, MYCN, CLOCK, HEY2, MYC, ASCL1, TCF12, ARNT, HES6, FERD3L, MSGN1, USF1, TAL1, NEUROD1, TCF23, HEYL, HAND2, NEUROD6, HEY1, SOHLH1, MESP1, PTF1A, ATOH8, NPAS2, NEUROD2, NHLH1, ID4, ATOH1, ARNT2, HES3, MLXIP, ASCL3, KIAA2018, OLIG3, NHLH2, NEUROG2, MSC, HES7, ATOH7, BHLHA15, BHLHE22, NEUROG1, FIGLA, ASCL2, OLIG1, TAL2, MITF, SCXB, HELT, ASCL4, MESP2, HES4, SCXA, TCF4, HES5, SREBF2, BHLHA9, OLIG2, MXD3, TWIST2, LOC388553, C13orf38-SOHLH2, CEBPE, XBP1, BATF3, CREB5, CEBPG, ATF3, ATF7, CEBPB, CEBPD, CEBPA, CBFB, CAMTA2, CAMTA1, EBF4, EBF3, EBF1, EBF2, NR2F6, NR2F1, NR2F2, GRHL2, TFCP2L1, GRHL1, TFCP2, UBP1, GRHL3, YBX2, CSDE1, CSDA, YBX1, LIN28A, CARHSP1, CSDC2, LIN28B, NFIX, NFIC, NFIB, NFIA, CUX2, ONECUT2, CUX1, ONECUT1, SATB1, ONECUT3, SATB2, DMRT3, DMRT1, DMRTC2, DMRTA2, DMRTB1, DMRT2, DMRTA1, E2F2, E2F1, E2F3, TFDP2, E2F8, E2F5, E2F7, E2F6, TFDP3, TFDP1, E2F4, NR1H3, NR1H2, ETV1, ETV7, SPI1, ELF4, ETV2, ERF, ELF2, ELK3, ETV3, ELF1, SPDEF, ELK1, ETS1, EHF, ELF5, ETV6, SPIB, FLI1, GABPA, ERG, ETS2, ELK4, ELF3, FEV, SPIC, ETV4, ETV5, FOXN3, FOXC1, FOXJ2, FOXF1, FOXN1, FOXM1, FOXP1, FOXO3, FOXA2, FOXP2, FOXJ1, FOXP4, FOXF2, FOXN4, FOXK2, FOXO1, FOXH1, FOXQ1, FOXK1, FOXI1, FOXD4, FOXA3, FOXN2, FOXB1, FOXG1, FOXR1, FOXL1, FOXC2, FOXE1, FOXS1, FOXL2, FOXO4, FOXD4L1, FOXD4L4, FOXD2, FOXI2, FOXE3, FOXD3, FOXD4L3, FOXR2, FOXJ3, FOXO6, FOXB2, FOXD4L5, FOXD4L6, FOXD4L2, KIAA0415, FOXA1, FOXP3, GCM2, GCM1, NR3C1, GTF2IRD1, GTF2I, GTF2IRD2B, GTF2IRD2, SOX8, SOX30, PMS1, CIC, TCF7, TOX4, SOX10, HMGXB4, HBP1, TFAM, UBTF, WHSC1, SOX6, HMGXB3, BBX, TOX2, SOX4, SOX21, SOX9, SOX15, SOX5, SOX3, LEF1, HMG20A, SOX13, TCF7L2, SSRP1, TCF7L1, SOX17, SOX14, PINX1, SOX7, SOX11, SOX12, SOX2, SOX1, SRY, SOX18, UBTFL1, UBTFL2, TOX, HMGB1, HMGB2, PBRM1, TOX3, SMARCE1, HMG20B, HMGB3, HMGA2, HMGA1, ARX, HOXA11, MEOX1, DLX6, ISL1, HOXC8, BARX2, ALX4, GSC2, DLX3, PITX1, HOXA9, HOXA10, LHX5, LASS4, ZFHX4, SIX4, VSX1, ADNP, RHOXF1, MEIS3, PBX4, DLX5, HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA5, HOXA6, HOXA13, EVX1, NOBOX, MEOX2, LHX2, LHX6, LHX3, TLX1, PITX3, HOXB6, HNF1B, DLX4, SEBOX, VTN, PHOX2B, NKX3-2, DBX1, NANOG, IRX4, CDX1, TLX2, DLX2, VAX2, PRRX1, TGIF2, VSX2, NKX2-3, HOXB8, HOXB5, HOXB7, HOXB3, HOXB1, MSX2, LHX4, HOXA7, HOXC13, HOXC11, HOXC12, ESX1, BARHL1, NKX2-4, NKX2-2, SIX1, HOXD1, HOXD3, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD13, MNX1, CDX4, BARX1, RHOXF2, LHX1, GSC, MEIS2, RAX, EMX1, NKX2-8, NKX2-1, HLX, LMX1B, SIX3, LBX1, PDX1, LASS5, ZFHX3, BARHL2, LHX9, LASS2, MEIS1, DLX1, HMBOX1, ZEB1, VAX1, NKX6-2, VENTX, HHEX, TGIF2LX, LASS3, ALX3, HOXB13, IRX6, ISL2, PKNOX1, LHX8, LMX1A, EN1, MSX1, NKX6-1, HESX1, PITX2, TLX3, EN2, UNCX, GBX1, NKX6-3, ZHX1, HDX, PHOX2A, PKNOX2, CDX2, DRGX, NKX3-1, PBX3, PRRX2, GBX2, SHOX2, GSX1, HOXD4, HOXD12, EMX2, IRX1, IRX2, SIX2, HOXB9, HOPX, OTP, LASS6, HOXC5, HOXB2, RAX2, EVX2, ZHX3, PROP1, ISX, HOXD8, TGIF2LY, IRX5, SIX5, TGIF1, IRX3, ZHX2, LBX2, NKX2-6, ALX1, GSX2, HOXC9, HOXC10, HOXB4, NKX2-5, SIX6, MIXL1, DBX2, PBX1, SHOX, ARGFX, HMX3, HMX2, BSX, HOXA4, DMBX1, HOXC6, HOXC4, RHOXF2B, PBX2, DUXA, DPRX, LEUTX,, NOTO, HOMEZ, HMX1, DUX4L5, DUX4L2, DUX4L3, DUX4L6, NKX1-1, HNF1A, HSF4, HSFY2, HSFX1, HSFX2, HSFY1, HSF1, LCORL, LCOR, IRF6, IRF1, IRF3, IRF5, IRF4, IRF8, IRF2, IRF7, IRF9, MBD3, BAZ2B, MBD4, SETDB2, MBD1, MECP2, SETDB1, MBD2, BAZ2A, SMAD7, SMAD5, SMAD9, SMAD6, SMAD4, SMAD3, SMAD1, SMAD2, ZZZ3, RCOR1, CDC5L, MYBL2, DNAJC2, TADA2A, RCOR3, MYB, TERF2, DMTF1, DNAJC1, NCOR1, TERF1, MIER3, MYSM1, SNAPC4, RCOR2, TADA2B, MYBL1, TERF1P2, NCOR2, CCDC79, SMARCC1, SMARCC2, TTF1, C11orf9, NFYA, NFYC, NFYB, NRF1, NR4A3, NR4A1, NR4A2, ESR1, NR0B2, NR0B1, PREB, EAF2, SPZ1, TP63, TP73, TP53, PAX6, PAX7, PAX2, PAX4, PAX8, PAX1, PAX3, PAX5, PAX9, SUB1, POU2F2, POU1F1, POU4F3, POU6F2, POU2F3, POU2F1, POU4F2, POU4F1, POU6F1, POU3F2, POU3F1, POU3F4, POU3F3, POU5F1, POU5F1B, PPARD, PPARG, PPARA, PGR, PROX1, PROX2, NR2E1, NR5A2, NR2C1, NR5A1, NR6A1, ESRRA, NR2C2, RFX3, RFX2, RFX4, RFX1, RFX5, RFX7, RFX6, RFX8, NFATC3, NFKB2, NFATC4, NFATC2, NFAT5, RELB, NFKB1, NFATC1, REL, RELA, RORA, RORC, NR1D2, RORB, RUNX3, RUNX1, SP100, SP140, GMEB2, SP110, AIRE, GMEB1, DEAF1, SP140L, LOC729991-MEF2B, MEF2A, SRF, MEF2D, MEF2B, STAT1, STAT5A, STAT4, STAT6, STAT3, STAT2, STAT5B, TBX21, TBX5, TBX15, TBX18, TBX2, TBX4, TBX22, TBX3, TBR1, TBX19, TBX6, EOMES, T, TBX20, TBX10, MGA, TBX1, TEAD3, TEAD2, TEAD1, TEAD4, CREBL2, NFE2L3, CREB3L3, FOSL2, NFE2L1, CREM, DBP, CREB3, HLF, BACH2, ATF2, NFE2L2, ATF6, CREB1, ATF1, NFE2, FOSB, ATF4, NRL, JUND, JDP2, CREB3L4, BATF, BACH1, CREB3L1, NFIL3, TEF, BATF2, ATF5, FOS, JUNB, DDIT3, FOSL1, JUN, MAF, CREB3L2, MAFA, MAFF, MAFG, MAFK, MAFB, ATF6B, CRX, OTX1, OTX2, THAP3, THAP10, THAP1, PRKRIR, THAP8, THAP9, THAP11, THAP2, THAP6, THAP4, THAP5, THAP7, NR1H4, NR2E3, RARB, HNF4A, VDR, ESRRB, THRA, NR1D1, RARA, ESR2, NR1I3, NR1I2, THRB, NR3C2, HNF4G, RARG, RXRA, ESRRG, RXRB, TSC22D1, TSC22D3, TSC22D4, TSC22D2, TULP3, TULP2, TULP1, TULP4, TUB, ZBTB33, ZBTB32, ZBTB11, MYNN, ZBTB25, PATZ1, ZBTB16, ZBTB24, BCL6, ZBTB47, ZBTB17, ZBTB45, GZF1, ZBTB1, ZBTB46, ZBTB8A, ZBTB7B, BCL6B, ZBTB49, ZBTB43, HIC2, ZBTB26, ZNF131, ZNF295, ZBTB4, ZBTB34, ZBTB38, HIC1, ZBTB41, ZBTB7A, ZNF238, ZBTB42, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB40, ZBTB7C, ZBTB37, ZBTB3, ZBTB6, ZBTB44, ZFP161, ZBTB12, ZBTB48, ZBTB10, ZBED4, ZBED3, ZBED2, C11orf95, ZBED1, IKZF5, ZNF821, ZNF451, ZNF195, ZFX, ZNF263, ZNF200, HIVEP2, WIZ, ZNF582, SNAI2, ZFP64, IKZF2, ZIC2, ZNF800, PRDM1, PRDM6, ZFP112, ZNF275, ZNF76, ZFAT, KLF6, ZFY, ZXDC, GLI2, ZNF532, ZNF37A, ZNF510, ZNF506, ZNF324, ZNF671, ZNF416, ZNF586, ZNF446, ZNF8, ZNF264, REST, MECOM, ZNF213, ZNF343, ZNF302, ZNF268, ZNF10, HIVEP1, ZNF184, MZF1, SALL4, ZNF516, KLF8, KLF5, ZNF629, ZNF423, CTCF, ZNF500, ZNF174, SALL1, MAZ, ZNF419, OVOL3, ZNF175, ZNF14, ZNF574, ZNF85, SP4, ZKSCAN1, GLI3, GLIS3, KLF3, PRDM4, GLI1, PRDM13, ZNF142, PRDM2, ZNF684, ZNF541, KLF7, PLAGL1, ZNF430, KLF12, KLF9, ZNF410, BCL11A, EGR1, ZFP30, TSHZ3, ZNF549, ZSCAN18, ZNF211, ZNF639, ZSCAN20, GTF3A, ZNF205, ZNF644, EGR2, IKZF4, CTCFL, ZNF831, SNAI1, ZNF576, ZNF45, TRERF1, ZNF391, RREB1, ZNF133, OVOL2, ZNF436, PLAGL2, GLIS2, ZNF384, ZNF484, HIVEP3, BCL11B, KLF2, ZNF780B, FEZF1, KLF16, ZSCAN10, ZNF557, ZNF337, PRDM12, ZNF317, ZNF426, ZNF331, ZNF236, ZNF341, ZNF227, ZNF141, ZNF304, ZSCAN5A, ZNF132, ZNF20, EGR4, ZNF670, VEZF1, KLF4, ZFP37, ZNF189, ZNF193, ZNF280D, PRDM5, ZNF740, ZIC5, ZSCAN29, ZNF710, ZNF434, ZNF287, ZIM3, PRDM15, ZFP14, ZNF787, ZNF473, ZNF614, PRDM16, ZNF697, ZNF687, OSR1, ZNF514, ZNF660, ZNF300, RBAK, ZNF92, ZNF157, ZNF182, ZNF41, ZNF711, PRDM14, ZNF7, ZNF214, ZNF215, SALL3, ZNF827, ZNF547, ZNF773, ZNF776, ZNF256, ZSCAN1, ZNF837, PRDM8, ZNF117, ZIC1, FEZF2, ZNF599, ZNF18, KLF10, ZKSCAN2, ZNF689, ZIC3, ZNF19, ZSCAN12, ZNF276, ZNF283, ZNF221, ZNF225, ZNF230, ZNF222, ZNF234, ZNF233, ZNF235, ZNF362, ZNF208, ZNF714, ZNF394, ZNF333, ZNF382, IKZF3, ZNF577, ZNF653, ZNF75A, GFI1, ZNF281, ZNF496, ZNF2, ZNF513, ZNF148, KLF15, ZNF691, ZNF589, PRDM9, ZNF12, SP8, OSR2, ZNF367, ZNF22, GFI1B, ZNF219, SALL2, ZNF319, ZNF202, ZNF143, ZNF3, ZSCAN21, ZNF606, SP2, ZNF91, ZNF23, ZNF226, ZNF229, ZNF180, ZNF668, ZNF646, ZNF641, ZNF610, ZNF528, ZNF701, ZNF526, ZNF146, ZNF444, ZNF83, ZNF558, ZNF232, E4F1, ZNF597, INSM2, ZNF30, ZNF507, ZNF354A, ZEB2, ZNF32, KLF13, ZFPM2, ZNF764, ZNF768, ZNF35, ZNF778, ZNF212, ZNF282, PRDM10, SP7, SCRT1, ZNF16, ZNF296, ZNF160, ZNF415, ZNF672, ZNF692, ZNF439, ZNF440, ZNF581, ZNF524, ZNF562, ZNF561, ZNF584, ZNF274, ZIK1, ZNF540, ZNF570, KLF17, ZNF217, ZNF57, ZNF556, ZNF554, KLF11, HINFP, ZNF24, ZNF596, OVOL1, SP3, ZNF621, ZNF680, BNC2, ZNF483, ZNF449, INSM1, ZNF417, ZNF791, ZNF80, GLIS1, ZNF497, KLF14, ZNF266, ZIC4, ZNF408, ZNF519, ZNF25, ZNF77, ZNF169, ZNF613, ZNF683, ZNF135, ZSCAN2, ZNF575, ZNF491, ZNF620, ZNF619, ZNF354C, ZNF114, ZNF366, ZNF454, ZNF543, ZNF354B, ZNF223, ZNF713, ZNF852, ZNF552, ZFP42, ZNF664, EGR3, ZFPM1, ZNF784, ZNF648, FIZ1, ZNF771, TSHZ1, ZNF48, ZNF816, ZNF571, ZSCAN4, ZNF594, ZFP3, ZNF443, ZNF792, ZNF572, ZNF707, ZNF746, ZNF322A, ZNF467, ZNF678, ZFP41, HKR1, PLAG1, ZNF329, ZNF101, ZNF716, ZNF708, ZSCAN22, ZNF662, ZNF320, ZNF623, ZNF530, ZNF285, ZFP1, WT1, ZFP90, ZNF479, ZNF445, ZNF74, SP1, SNAI3, ZNF696, IKZF1, ZNF267, ZNF566, ZNF224, ZNF529, ZNF284, ZNF749, ZNF17, ZNF555, ZNF75D, ZNF501, ZNF197, ZNF396, ZFP91, ZNF732, ZNF397, ZSCAN30, ZNF546, ZNF286A, ZKSCAN4, ZNF70, ZNF643, ZNF642, ZSCAN23, ZNF490, ZNF626, ZNF793, ZNF383, ZNF669, ZNF559, ZNF177, ZNF548, MTF1, ZNF322B, ZNF563, ZNF292, ZNF567, SP6, ZNF573, ZNF527, ZNF33A, ZNF600, ZKSCAN3, ZNF676, ZNF699, ZNF250, ZNF79, ZNF681, ZNF766, ZNF107, ZNF471, ZNF836, ZNF493, ZNF167, ZNF565, ZNF34, ZNF781, ZNF140, ZNF774, ZNF658, ZNF765, ZNF124, ZNF569, ZNF777, ZNF775, ZNF799, ZNF782, ZNF846, ZNF136, ZKSCAN5, ZNF502, ZFP62, ZNF33B, ZNF512B, ZNF431, ZNF418, ZNF700, ZNF239, ZSCAN16, ZFP28, ZNF705A, ZNF585A, ZNF138, ZNF429, ZNF470, ZNF100, ZNF398, ZNF498, ZNF441, ZNF420, ZNF763, ZNF679, ZNF682, ZNF772, ZNF257, ZNF785, ZSCAN5B, ZNF165, ZNF655, ZNF98, ZNF786, ZNF517, ZNF675, ZNF860, ZNF628, ZNF665, ZNF624, ZNF841, ZNF615, ZNF350, ZNF432, ZNF433, ZNF460, ZNF81, ZNF780A, ZNF461, ZNF181, LOC100287841, ZNF44, ZNF790, ZNF677, ZNF823, ZNF311, ZNF347, ZNF71, ZNF121, ZNF335, ZNF560, ZNF273, ZNF84, ZNF667, ZNF649, ZNF248, ZNF544, ZNF770, ZNF737, ZNF251, ZNF607, ZNF334, ZXDA, ZNF485, ZIM2, PEG3, ZNF192, ZNF442, ZNF813, ZNF26, ZNF69, ZNF583, ZNF568, ZXDB, ZNF480, ZNF587, ZNF808, ZNF43, ZNF28, ZNF627, ZNF789, ZNF536, ZNF534, ZNF652, ZNF521, ZNF358, ZFP2, SP5, ZNF814, ZNF551, ZNF805, ZSCAN5C, ZNF468, ZNF616, ZFP57, ZNF155, ZNF783, ZNF425, ZNF580, ZNF611, ZNF254, ZNF625, ZNF134, ZNF845, ZNF99, ZNF253, ZNF90, ZNF93, ZNF486, REPIN1, LOC100131539, ZNF705D, LOC100132396, ZNF705G, SCRT2, ZNF407, SP9, ZNF579, ZNF880, ZNF630, ZNF844, ZNF469, ZNF717, ZNF865, ZNF492, ZNF688, YY2, ZNF878, ZNF879, ZNF736, ZNF323, ZNF709, ZNF512, ZNF585B, ZNF154, ZNF324B, ZNF564, ZFP82, GLI4, ZNF674, ZNF345, ZNF550, KLF1, YY1, MYST2, ST18, L3MBTL4, MYT1L, MYT1, L3MBTL1, MTA3, GATA1, TRPS1, GATA3, GATA5, GATA4, GATA6, GATAD2B, GATAD1, GATA2, MTA1, ZGLP1, MTA2, RERE, C16orf5, LITAF, PIAS1, PIAS2, PIAS4, ZMIZ1, ZMIZ2, PIAS3, RNF138, NFX1, NFXL1 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[00425] 일부 실시양태에서, 세포들을 한 세포 유형에서 다른 세포 유형으로 조작한다 (예컨대, 전환시키거나 분화시킴). 일부 실시양태에서, 췌장 세포를 베타 섬세포로 조작한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포를 iPS 세포로 조작한다. 일부 실시양태에서, 지방전구세포를 갈색 지방 세포로 조작한다. 기타 예시적인 세포로는, 예컨대, 근육 세포, 신경 세포, 백혈구 및 림프구를 포함한다.
[00426] 일부 실시양태에서, 세포는 질환이 생기거나 돌연변이를 함유하고 있는 세포이다. 이러한 세포들은 질병을 치료하기 위해, 예를 들어 돌연변이를 교정하기 위해서, 또는 세포의 표현형을 변형시키기 위해, 예를 들어 암세포의 증식을 억제하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포는 본원에 기재된 하나 이상의 질병 또는 질환과 관련이 있다.
[00427] 일부 실시양태에서, 상기 조작된 세포는 정상 세포이다.
[00428] 일부 실시양태에서, 상기 조작된 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포 (예를 들어, iPS, 배아, 조혈, 지방, 생식, 폐 또는 신경 줄기 또는 전구 세포)이다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 세포는 3개의 배엽층 (즉, 중배엽, 내배엽 또는 외배엽) 중 어느 하나로부터 유래한 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 세포는 배아외 조직, 예를 들어 태반으로부터 유래될 수 있다.
[00429] 일부 실시양태에서, 상기 조작되는 세포는 섬유아세포, 단세포성 전구체, B 세포, 외분비 세포, 췌장 전구세포, 내분비 전구세포, 간모세포, 근원세포 또는 지방전구세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포를 근육 세포, 적혈구 거핵세포, 호산구, iPS 세포, 대식세포, T 세포, 섬 베타 세포, 뉴런, 심근세포, 혈액 세포, 내분비 전구세포, 외분비 전구세포, 췌관 세포, 선포 세포, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 간세포, 담관세포, 혈관모세포, 중간혈관모세포 또는 갈색 지방 세포로 조작한다 (예를 들어, 전환시키거나 분화시킴).
[00430] 일부 실시양태에서, 상기 세포는 근육 세포, 적혈구 거핵세포, 호산구, iPS 세포, 대식세포, T 세포, 섬 베타 세포, 뉴런, 심근세포, 혈액 세포, 내분비 전구세포, 외분비 전구세포, 췌관 세포, 선포 세포, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 간세포, 담관세포, 백색 또는 갈색 지방 세포이다.
[00431] 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 세포, 만능성 세포, 분화전능성 세포, 성체 줄기 세포, 내부 세포 덩어리 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포이다.
[00432] 일부 실시양태에서, 상기 조작된 세포는 암세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 암세포는 폐암 세포, 유방암 세포, 피부암 세포, 뇌암 세포, 췌장암 세포, 조혈암 세포, 간암 세포, 신장암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 피부암 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 육 세포, 적혈구 거핵세포, 호산구, iPS 세포, 대식세포, T 세포, 섬 베타 세포, 뉴런, 심근세포, 혈액 세포, 내분비 전구세포, 외분비 전구세포, 췌관 세포, 선포 세포, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 간세포, 담관세포 또는 백색 또는 갈색 지방 세포이다.
DNA-PK 억제제 및 유전자 편집 시스템의 세포 투여
[00433] 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 투여는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내일 수 있다. 세포(들)에 유전체 편집 시스템 및 DNA-PK 억제제를 투여하는 것은 동시에 또는 순차적으로 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템 성분들을 세포막으로 도입시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템 성분들을 세포핵 내로 도입시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 DNA-PK 억제제 및 유전체 편집 시스템의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
[00434] 상기 유전자 편집 시스템은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 세포(들)에 투여될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 핵산 또는 단백질 전달 방법들이 사용될 수 있다. 상기 유전자 편집 시스템은 해당 유전자 편집 시스템 성분들을 암호화하는 핵산을 이용하여 세포에 투여 (예컨대, 전달) 된다. 상기 유전자 편집 시스템은 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터에 의해 세포에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터를 사용한다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 (예컨대, 쥐과의 백혈병, HIV 또는 렌티바이러스) 또는 DNA 바이러스 (예컨대, 아데노바이러스, 단순 포진 및 아데노 연관 바이러스)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질감염 방법 (예를 들어, 비바이러스성 전달 방법)을 사용하여 유전체 편집 시스템을 세포 내로 도입한다. 형질감염 방법은 해당 세포를 DEAE-덱스트란, 인산칼슘, 리포좀과 접촉시키거나, 또는 플라스미드를 세포 내로 전기천공시키는 것을 포함한다. 추가의 비바이러스성 전달 방법으로는 전기천공, 리포펙션, 미량주입, 입자사출(biolistics), 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 네이키드 RNA, 인공 비리온 및 DNA 흡수 향상제를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템 (Rich-Mar)을 사용한 초음파천공법(sonoporation)도 핵산의 전달에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산들은 mRNA로 전달된다. 일부 실시양태에서, 캡핑된 mRNA를 사용하여 번역 효율 및/또는 mRNA 안정성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, ARCA (역방향 반응 방지용 캡 유사체) 캡 또는 이의 변형체가 사용된다. US 특허 US7074596 및 US8153773를 참조한다.
[00435] 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas, Cpf1 등) 및 gRNA는 DNA로부터 전사된다.
[00436] 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas, Cpf1 등)는 DNA로부터 전사되고 gRNA는 RNA로서 제공된다.
[00437] 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas, Cpf1 등) 및 gRNA는 RNA로서 제공된다.
[00438] 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas, Cpf1 등)는 단백질로서 제공되고 gRNA는 DNA로서 제공된다.
[00439] 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas, Cpf1 등)는 단백질로서 제공되고 gRNA는 RNA로서 제공된다.
[00440] 추가의 핵산 전달 시스템으로는, Amaxa Biosystems (독일 쾰른 소재), Maxcyte, Inc. (미국 메릴랜드주 록빌 소재), BTX Molecular Delivery Biosystems (미국 매사추세츠주 홀리스톤 소재) 및 Copernicus Therapeutics Inc (예를 들어, US6008336 참조)에 의해 제공되는 것들을 포함한다. 리포펙션은 (예컨대, 미국 특허 번호 5,049,386호, 4,946,787호; 및 4,897,355호)에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 시판된다 (예컨대, Transfectam™, Lipofectin™ 및 Lipofectamine™ RNAiMAX). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질로는 페이그너(Feigner)의 WO 17424호; WO 91/16024호에 기재된 것들을 포함한다. 전달은 세포 (생체외 투여) 또는 표적 조직 (생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
[00441] 면역지질 복합체와 같은 표적화 리포좀을 비롯한 지질:핵산 복합체의 제조에 대해서는 당업자에게 널리 알려져 있다 (예컨대, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; [Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)]; [Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)]; [Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)]; [Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)]을 참조한다).
[00442] 추가적인 전달 방법으로는, 전달할 핵산을 EnGeneIC 전달 비히클 (EDV)로 패키징하여 사용하는 것을 포함한다. 이러한 EDV들은 이중특이적 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달되며, 여기서 항체의 한쪽 아암(arm)은 표적 조직에 대한 특이성을 가지고, 다른 하나는 EDV에 특이성을 가진다. 상기 항체가 EDV를 표적 세포 표면으로 데려온 후, 상기 EDV는 세포내 이입에 의해 세포 내로 도입된다. 일단 세포 중에 존재하게 되면, 내용물이 방출된다 (문헌 [MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643], [Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028 및 4,946,787호 참조].
[00443] 일부 실시양태에서, 형질감염은, 플라스미드를 함유하는 형질감염된 유전체 편집 시스템이 핵으로 유입되기는 하지만 복제하는 동안 해당 세포의 유전체에는 포함되지 않는, 일시적인 것일 수 있다. 상기 형질감염은, 형질감염된 플라스미드가 해당 세포의 유전체 영역으로 통합되는, 안정한 것일 수도 있다.
[00444] 일시적 발현이 사용되는 일부 실시양태에서는, 아데노바이러스 기반의 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 여러 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 나타낼 수 있어, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 얻어졌다. 상기 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 아데노 연관 바이러스 ("AAV") 벡터 역시, 예를 들어 핵산 및 펩타이드의 시험관 내 제조, 및 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차들에 있어서 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는데 사용된다 (예컨대, 문헌 [West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 4,797,368; WO 93/24641; 문헌 [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)]; [Muzyczka, J.. Clin. Invest. 94: 1351 (1994)]을 참고한다). 재조합 AAV 벡터의 작제에 대해서는 미국 특허 5,173,414호; 문헌 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)]; [Tratschin, et al., Mol Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)]; [Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)]; 및 [Samulski et al., J. Virol 63:03822-3828 (1989)]를 비롯한 다수의 간행물들에 설명되어 있다.
[00445] 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제의 세포(들)에 대한 투여는, DNA-PK 억제제 및 상기 DNA-PK 억제제가 세포막 및/또는 세포핵에 도입될 수 있도록 해주는 임의 적절한 배지의 존재 하에 분리한 세포(들)를 배양함으로써 수행된다.
[00446] 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 세포(들)에 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제를 약 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 45시간, 50시간, 55시간, 60시간, 65시간, 70시간, 85시간, 90시간, 100시간, 125시간, 150시간, 200시간, 또는 상기 언급한 시간들 중 임의의 시간 동안 세포(들)과 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제를 약 1.5주, 2.0주, 2.5주, 3.0주, 3.5주, 4주 또는 상기 언급한 시간들 중 임의의 시간 동안 세포(들)과 접촉시킨다. 상기 DNA-PK 억제제는 세포 배양 배지의 변화에 따라 재투여될 수도 있다. DNA-PK 억제제는 유전체 편집 시스템 성분들을 도입하기 전, 도입하는 동안 또는 도입한 후에 세포와 접촉시킬 수 있다.
[00447] 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제는 약 0.1 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 0.75 μM, 1.0 μM, 1.25 μM, 1.50 μM, 1.75 μM, 2.0 μM, 2.5 μM, 3.0 μM, 3.5 μM, 4.0 μM, 4.5 μM, 5.0 μM, 5.5 μM, 6.0 μM, 6.5 μM, 7.0 μM, 7.5 μM, 8.0 μM, 8.5 μM, 9.0 μM, 9.5 μM, 10 μM, 10.5 μM, 11.0 μM, 11.5 μM, 12μM, 또는 상기 언급한 농도들 중 임의의 농도로 세포(들)에 투여된다. 상기 DNA-PK 억제제 농도는 투여를 수행하는 과정에 변화시킬 수도 있다.
[00448] 일부 실시양태에서, 상기 유전자 편집 성분들은 하나 이상의 벡터에 의해, 또는 RNA, mRNA의 형태로 세포(들)에 전달되거나, 또는 엔도뉴클레아제 성분의 경우 정제된 단백질 또는 mRNA (예컨대, Cas9 단백질)로 세포(들)에 전달된다. 상기 하나 이상의 벡터로는 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 ssDNA를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 단순 포진 바이러스 벡터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전자 편집 성분들은 RNA 또는 합성 RNA를 통해 전달된다.
[00449] 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포에 투여하면, 세포에 DNA-PK 억제제가 투여되지 않는 기준 조건과 비교했을 때 상동성 지향 복구 유전자 편집 결과물의 양이 증가된다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면 표적내 또는 표적외 (NHEJ를 통한) indel이 저해된다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면 관심대상 유전자의 발현이 증가 또는 감소된다. 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면 해당 세포에 대하여 내생성이 없는 유전자를 발현시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면, 해당 세포(들)의 유전자를 완전히 또는 부분적으로 제거하거나, 또는 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면, 해당 세포(들)의 인트론 및/또는 엑손을 완전히 또는 부분적으로 제거하거나, 또는 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면, 해당 세포(들)의 비암호화 영역을 완전히 또는 부분적으로 제거하거나, 또는 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면, 해당 세포(들)의 암호화 및/또는 비암호화 유전자 영역을 동시에 또는 순차적으로 완전히 또는 부분적으로 제거하거나, 또는 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포(들)에 투여하면, 염색체외 DNA 또는 RNA를 비롯한 해당 세포(들)의 암호화 및/또는 비암호화 유전자 영역을 동시에 또는 순차적으로 완전히 또는 부분적으로 제거하거나, 또는 변형시킬 수 있다. 상기 염색체외 DNA는 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, 염색체외 원형 DNA 또는 바이러스성 염색체외 DNA일 수 있다.
[00450] 일부 실시양태에서, 유전체 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포에 투여하면 관심대상 유전자의 발현이 증가 또는 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 관심대상 유전자 발현의 증가 또는 감소는, 해당 세포에 DNA-PK 억제제를 투여하지 않은 기준 조건과 비교했을 때 약 2.5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 사이 정도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 관심대상 유전자의 증가 또는 감소는, 해당 세포에 DNA-PK 억제제를 투여하지 않은 기준 발현 수준과 비교했을 때 약 0.5배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배 또는 10배일 수 있다.
[00451] 일부 실시양태에서, 유전체 편집 시스템과 함께 DNA-PK 억제제를 세포에 투여하면 유전체 편집을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집의 증가는, 해당 세포에 DNA-PK 억제제를 투여하지 않은 기준 조건과 비교했을 때 약 2.5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 사이 정도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집의 증가는, 해당 세포에 DNA-PK 억제제를 투여하지 않은 기준 발현 수준과 비교했을 때 약 0.5배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배 또는 10배 또는 그 사이 정도일 수 있다.
[00452] 일부 실시양태에서, 세포군에 DNA-PK 억제제와 유전자 편집 시스템을 투여하면, 해당 세포군에 유전자 편집 시스템만을 투여하고 DNA-PK 억제제를 투여하지 않은 기준 조건과 비교했을 때 세포 생존율을 더 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 큰 세포 생존율을 유도하는 DNA-PK 억제제는 구조식 (I), 구조식 (II) 또는 구조식 (II")의 화합물이다.
[00453] 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제를 투여하기 전, 투여한 후 또는 투여하는 동안에 세포를 S 또는 G2 기의 세포 주기에서 동기화시킨다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 성분들을 도입하기 전, 투여한 후 또는 투여하는 동안에 세포를 S 또는 G2 기의 세포 주기에서 동기화시킨다. S 또는 G2 기의 세포 주기에서 세포를 동기화시키는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예로서, S 또는 G2 기의 세포주기에서 세포를 동기화시키는데 사용될 수 있는 제제로는 아피디콜린, 하이드록시우레아, 로바스타틴, 미모신, 노코다졸, 티미딘 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. (문헌 [Lin et al. Elife. 2014 Dec 15;32014] 참조). 일부 실시양태에서, 세포 동기화를 위한 제제는 유전자 편집 과정을 수행하는 동안에는 언제든지 투여할 수 있다.
[00454] 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제 및/또는 유전체 편집 시스템은 사용 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함된 DNA-PK 억제제 및/또는 유전체 편집 시스템은 키트이다.
[00455] 일부 실시양태에서, DNA-PK 억제제 및/또는 유전체 편집 시스템은 사용 설명서와 함께 키트 내에 포함된다. 상기 키트는 임의의 유전체 편집 시스템 및/또는 DNA-PK 억제제 및 사용 설명서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제는 구조식 (I), (I'), (II), (II'), (II"), (II"'), (III), (III')로 나타낸 임의의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 기반 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템으로부터 선택된다. 유전체 편집 시스템은 임의의 형태, 예를 들어 플라스미드, 벡터, DNA 또는 RNA 작제물로 키트 내에 제공될 수 있다.
[00456] 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제 및/또는 유전체 편집 시스템은 생체 내 투여된다. 상기 DNA-PK 억제제 및 유전자 편집 시스템은 목적한 투여 경로에 상용하도록 제형화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대 정맥내, 피부내, 피하, 경구 (예컨대, 흡입), 경피 (즉, 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피부내 또는 피하 용도로 사용되는 용액 또는 현탁액은, 하기의 성분들: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 등장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대, 염산 또는 수산화나트륨으로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알 중에 봉입될 수 있다.
[00457] 주사용의 경우, 적절한 담체로는 (수용성인 경우) 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 (IV) 투여의 경우, 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™ (미국 뉴저지주 파스패니 소재의 BASF사 제조) 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 이러한 주사 및 IV 투여에서, 조성물은 멸균되어 있으며 주사기 주입성이 용이할 정도로 유동성이 있다. 이들은 제조 및 보관 조건 하에 안정하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존된다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의하여, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의하여, 그리고 계면활성제의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살 등에 의하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 등장화제, 예를 들어 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨이 조성물에 포함된다. 주사가능한 조성물의 흡수 지연은 해당 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 포함하여 유발될 수 있다.
[00458] 필요하다면, 활성 제제를 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 중에 필요량으로 포함시킨 뒤, 여과 살균하여 멸균 주사액을 제조할 수도 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 제제들을 염기성 분산매 및 상기 열거한 것들 중 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 포함시켜 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전에 멸균 여과시킨 해당 용액으로부터 활성 성분 및 추가의 원하는 임의 성분의 분말을 생성하는 진공건조 또는 동결건조 기법이다.
[00459] 경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐제 내로 봉입되거나, 정제로 압축될 수 있다. 치료적 경구 투여를 위해서는, 활성 성분이 부형제와 함께 혼입되어, 정제, 트로키 또는 캡슐제의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 경구 조성물은 구강 세척제로 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수도 있는데, 이 경우, 유체 담체 중의 화합물은 입으로 먹고, 입을 헹구어 뱉거나 삼키게 된다. 약학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조제 물질은 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키 등은 하기 성분들 또는 이와 유사한 성질을 가진 화합물들 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들면 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 전분 또는 락토스; 붕해제, 예를 들면, 알킨산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들면, 스테아르산마그네슘 또는 스테로트(Sterote); 활택제, 예를 들면 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예를 들면 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제.
[00460] 흡입에 의한 투여의 경우, 해당 제제는 적절한 분사제, 예컨대 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압형 용기 또는 디스펜서, 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
[00461] 또한, 전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의하여 이루어질 수도 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어서, 투과되는 장벽에 적절한 투과제가 제제화에 사용된다. 이러한 투과제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투과의 경우, 계면활성제, 담즙산염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해서 수행될 수 있다. 경피 투여에 있어서, 활성 성분은 일반적으로 당해 분야에 공지된 연고, 고약, 겔제 또는 크림제로 제제화된다.
[00462] 또한, 제제는 (예컨대, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 기재를 사용하는) 좌제의 형태나 직장 전달용 정체 관장의 형태로도 제조될 수 있다.
[00463] 일부 실시양태에서, 제제는 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 서방형 제제/제어 방출형 제제와 같이 해당 화합물이 체내로부터 신속하게 제거되는 것을 보호하는 담체와 함께 제조될 수도 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당해 분야의 숙련자에게는 명백할 것이다.
[00464] 예를 들어, 활성 제제는, 예컨대 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 중에 봉입하거나, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중에 봉입하거나, 또는 마크로에멀젼 중에 봉입할 수 있다.
[00465] 서방형 제제도 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적절한 예로는, 해당 제제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (해당 매트릭스는 성형품, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐 형태로 존재함)를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로는, 폴리에스테르, 하이드로겔 [예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락타이드 (미국 특허 3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사용 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있으나, 어떤 하이드로겔들은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다.
[00466] 일부 실시양태에서, 상기 제제는 치료할 구체적인 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 예를 들어 서로 나쁜 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것들도 함유할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 조성물은 그 기능을 향상시키는 제제, 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제 또는 증식 억제제도 포함할 수 있다. 이러한 분자들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절히 함유시킨다.
[00467] 일부 실시양태에서, 상기 DNA-PK 억제제 제제 및/또는 유전체 편집 시스템은 병용 요법으로, 즉 다른 제제들, 예컨대 다양한 형태의 암과 염증성 질환과 같은 병리적 상태 또는 장애의 치료에 유용한 치료제들과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 내용과 관련하여 "조합하여"라는 용어는 해당 제제들을 실질적으로 동시에, 또는 동시에 또는 순차적으로 제공하는 것을 의미한다. 순차적으로 제공하는 경우에, 제2 화합물의 투여 개시시, 두 화합물 중 제1 화합물은 치료 부위에서 유효 농도로 여전히 검출할 수 있는 것이 바람직하다.
유전체 편집 스크리닝 방법
[00468] 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 NHEJ 및/또는 HDR의 효율을 비롯한 유전체 편집 효율에 대하여 세포를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 방법으로는 표적 영역들의 PCR 기반 증폭 후 유전체 편집을 확인하기 위한 상기 증폭된 영역들의 시퀀싱 또는 딥 시퀀싱을 포함할 수 있다. PCR 유전자형 분석을 통해 HDR을 자극하는데 있어서 화합물들의 정량 및 순위 평가를 할 수 있다. 다른 스크리닝 방법으로는 차세대 시퀀싱을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Bell et al., “A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing," BMC Genomics, 15:1002 (2014)]을 참고한다.
[00469] PCR 프라이머는, 변형되지 않은 유전자 영역과 변형된 유전자 영역을 선택적으로 증폭하여 유전자 변형 상태에 따라 서로 다른 길이의 앰플리콘을 생성하도록 조작될 수 있다. 다음으로, 상기 앰플리콘을 겔 상에서 분해하고, Bio-Imager를 사용한 밀도계측에 의해 HDR 효율을 추산할 수 있다. 다르게는, 새로운 PCR 기법인 신속한 디지털 액적 PCR (DDPCR: Rapid Digital Droplet PCR)을 사용하여 유전체 편집된 샘플들 중에서 HDR 및 NHEJ를 통한 편집 사례들을 동시에 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Miyaoka et al., “Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effectrs of locus, nuclease, and cell type on genome-editin," Scientific Reports, 6, 2016]을 참고한다. 생어(Sanger) 시퀀싱, 딥 시퀀싱 및 RT-PCR을 비롯한 기타 방법들도 유전체 변형을 위한 세포 스크리닝에 사용될 수 있다.
[00470] 일부 실시양태에서, TMR (신호등 리포터) 작제물은 세포를 스크리닝하는데 사용된다. TLR 스크리닝은 표적화된 유전체 편집시 형광 마커를 발현하도록 조작된 리포터 세포를 포함한다. 적절한 표적화 후에, 상기 형광 마커는 해당 세포에 의해 발현된다. 적절히 표적화된 세포의 정량은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 유세포 분석에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Certo et al. 2011, “Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints," Nature Methods, 8, pages 671-676 (2011)]을 참고한다.
[00471] 본원에 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌들 중에서의 관련 부분들은 상기 각각의 간행물 또는 문헌들이 구체적으로 그리고 개별적으로 본원에 참고로 포함되었던 바과 같이 본원에 참고로 포함된다. 간행물 및 특허 문헌의 인용은, 이들이 선행 기술과 관련이 있음을 인정하는 것이 아니며, 해당 간행물 및 문헌의 내용이나 날짜에 대해서 인정하는 것도 아니다. 본 발명을 여기에 서면으로 기술하였으나, 당업자라면 누구나 다양한 실시양태들이 실시될 수 있다는 점과, 상술한 설명 및 하기의 실시예들이 예시의 목적일 뿐, 첨부된 청구범위를 한정하려는 것이 아니라는 점을 알 수 있을 것이다.
질환의 치료/예방에 있어서의 DNA-PK 억제제의 용도
[00472] 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 화학식들 중 어느 한 화학식의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 표 1의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 표 2의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 상기 조성물은 추가의 치료제를 더 포함한다.
[00473] 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 유도체 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 화합물의 양은 생물학적 샘플 또는 환자에서 DNA-PK를 측정가능한 정도로 억제하는데 효과적인 양이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 화합물의 양은 DNA-PK를 측정가능한 정도로 억제하는데 효과적인 양이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 이러한 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하기 위해 제형화된다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 환자에게 경구 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 화합물의 제조
섹션 I: 하이드록시 퀴녹살리논 중간체의 제조
섹션 I에서는 기능성 8-하이드록시-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 중간체의 제조를 위한 합성 절차에 대하여 기술한다. 이러한 중간체들을 섹션 II에 기술한 메실레이트 중간체의 적절한 선택과 함께 사용하여 표 A의 화합물들을 제조하였다.
Figure pct00143
8-하이드록시-1,3-디메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온의 합성:
단계 1: 5-브로모-1-플루오로-3-((4-메톡시벤질)옥시)-2-니트로벤젠
5-브로모-1,3-디플루오로-2-니트로-벤젠 (300 g, 1.261 mol)과 p-메톡시벤질 알코올 (190 g, 1.375 mol)을 N,N-디메틸포름아미드 (1.8 L)에 용해시켰다. 상기 생성된 용액에 탄산세슘 (611 g, 1.875 mol)을 첨가하고, 상기 혼합물을 70℃로 가온하여 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 냉수 (2 L)에 부어 황색 고체를 침전시켰다. 상기 침전물을 부흐너 깔때기 상에서 수집하여 물 (2 x 500 mL)로 헹구었다. 상기 침전물을 디클로로메탄 (5 L)에 용해하여, 물 (2 x 1 L)과 염수 (1 L)로 세척하고 건조 (Na2SO4)시킨 후, 실리카겔 플러그 (500 g)를 통해 여과하였다. 상기 실리카겔 층을 디클로로메탄 (500 mL)으로 세척한 후, 혼합된 여과액을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 헵탄 (2 L)으로 분쇄하고 진공 오븐 중에서 50℃로 14시간 동안 건조시켜 5-브로모-1-플루오로-3-((4-메톡시벤질)옥시)-2-니트로벤젠 (350 g, 72% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.35 - 7.27 (m, 2H), 7.08 - 6.99 (m, 2H), 6.97 - 6.87 (m, 2H), 5.11 (s, 2H), 3.82 (s, 3H). 19F NMR (282 MHz, CDCl3) δ -120.36.
단계 2: 메틸 (5-브로모-3-((4-메톡시벤질)옥시)-2-니트로페닐)글리시네이트
N,N-디메틸포름아미드 (2 L) 중의 5-브로모-1-플루오로-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-2-니트로-벤젠 (350 g, 0.914 mol) 및 메틸 2-아미노아세테이트 (염산염, 173 g, 1.364 mol)의 혼합물에 트리에틸아민 (350 mL, 2.511 mol)을 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 50℃로 가온한 후, 이 온도에서 54시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 상온으로 냉각시킨 후 냉수 (3 L)에 부어 담갈색의 끈적한 물질을 형성시켰다. 물을 따라 내고, 담갈색의 점착성 물질을 디클로로메탄 (5 L)에 용해시키고, 물 (1 L)과 염수 (1 L)로 세척한 후 건조 (Na2SO4)하였다. 상기 용액을 실리카겔 층을 통해 여과한 후, 상기 층을 디클로로메탄 (2 x 500 mL)으로 세척하였다. 상기 혼합된 여과액을 감압 하에 농축하였다. 상기 잔류물을 메틸 3급-부틸 에테르 (2 L)로 분쇄하고 진공 오븐에서 50℃로 12시간 동안 건조시켜 메틸 (5-브로모-3-((4-메톡시벤질)옥시)-2-니트로페닐)글리시네이트 (252 g, 62%)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.40 - 7.30 (m, 2H), 6.96 - 6.86 (m, 2H), 6.63 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.96 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.82 (s, 6H).
단계 3: 6-브로모-8-((4-메톡시벤질)옥시)-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1 H )-온
테트라하이드로퓨란 (700 mL) 및 메탄올 (400 mL) 중의 메틸 (5-브로모-3-((4-메톡시벤질)옥시)-2-니트로페닐)글리시네이트 (52 g, 112.5 mmol)의 용액에 백금 [목재 활성탄 상의 3% w/w 7g, 환원형, 70% 습식 페이스트 (ESCAT 2931), 1.076 mmol]을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 5분간 흡인 배출시킨 후, 수소 대기 (풍선) 하에 16시간 동안 정치시켰다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 상기 층을 메탄올 (2 × 200 mL)로 세척하었다. 상기 혼합된 여과액을 감압 하에 농축하였다. 이렇게 수득된 잔류물을 디클로로메탄 (400 mL)과 함께 공비등시키고 메틸 3급-부틸 에테르로 분쇄하여
6-브로모-8-((4-메톡시벤질)옥시)-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-온 (39 g, 93%)을 황갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.42 (s, 1H), 7.56 - 7.29 (m, 2H), 7.02 - 6.81 (m, 2H), 6.60 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.19 (s, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.70 (s, 2H).
단계 4: 6-브로모-8-((4-메톡시벤질)옥시)퀴녹살린-2(1 H )-온
6-브로모-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-3,4-디하이드로-1H-퀴녹살린-2-온 (178 g, 0.485 mmol)을 클로로포름 (6.0 L)에 용해시켰다. 생성된 상기 용액에 이산화망간(IV) (400 g, 4.601 mol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 55°C로 가온하여 4시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 상온으로 냉각시킨 후, 셀라이트 층을 통해 여과하였다. 상기 층을 디클로로메탄 (4 × 500 mL) 중의 40% 에틸 아세테이트로 세척하였다. 상기 혼합된 여과액을 감압 하에 농축하였다. 상기 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트/메틸 3급-부틸 에테르 (1:2 비율, 3 L)로 분쇄한 후, 진공 오븐에서 50℃로 14시간 동안 건조시켜 6-브로모-8-((4-메톡시벤질)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온 (125 g, 71%)을 황갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 12.06 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.67 - 7.33 (m, 4H), 7.03 - 6.85 (m, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.75 (s, 3H).
단계 5: 6-브로모-8-((4-메톡시벤질)옥시)-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온
N,N-디메틸포름아미드 (4.0 L) 중의 6-브로모-8-((4-메톡시벤질)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온 (125 g, 0.343 mmol)의 용액에 요오드화메틸 (110 mL, 1.767 mol)을 첨가하였다. 상기 생성된 혼합물을 얼음조를 이용하여 0℃로 냉각시킨 후, 수소화나트륨 (60% w/w 35 g, 0.875 mmol)을 20분간에 걸쳐 나누어 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 30분간 ≤3℃에서 교반하였는데, 이 시간 동안 HPLC 분석 결과, N-메틸화 및 O-메틸화 생성물의 비율이 약 85:15인 것으로 나타났다. 상기 반응 혼합물을 냉수 (4.0 L)에 부어 황색 침전물을 형성시켰다. 상기 고체를 부흐너 깔때기 상에서 수집하여, 물 (2 x 1.0 L)로 헹군 후, 대류식 오븐에서 50℃로 4시간 동안 건조시켰다. 상기 침전물 (85:15 비율)을 메틸 3급-부틸 에테르 (3.0 L) 중의 20% 에틸 아세테이트에 현탁시키고, 1시간 동안 환류시킨 후, 상온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물을 중간 정도의 다공도를 갖는 유리질 깔때기를 통해 여과한 후, 진공 오븐에서 50℃로 5시간 동안 건조시켜 목적한 N-메틸화 생성물 (120 g)을 96%의 순도로 수득하였다. 상기 생성물을 상술한 바와 같이 메틸 3급-부틸 에테르 (3.0 L) 중의 20% 에틸 아세테이트에 다시 재현탁시키고, 1시간 동안 환류하여 여과시킨 후, 진공 건조하여 6-브로모-8-((4-메톡시벤질)옥시)-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (90 g)을 황색 고체로서 99%의 순도로 수득하였다. 추가로, 여과액을 감압 하에 농축한 후, 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (330 g Isco 금 컬럼, 선형 구배, 0% → 60% 에틸 아세테이트/디클로로메탄)로 정제하여 목적한 생성물 3 (13 g, 99% 순도)을 추가로 조금 더 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.26 (s, 1H), 7.63 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.40 - 7.29 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.05 - 6.83 (m, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.84 (d, J = 1.7 Hz, 6H). ESI-MS m/z 계산치 374.03, 실측치 375.05 (M+1).
단계 6: 8-((4-메톡시벤질)옥시)-1-메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온
디옥산 (2.0 L) 중의 6-브로모-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (103 g, 270.9 mmol) 및 모르폴린 (36 mL, 412.8 mmol)의 혼합물을 해당 용액을 통해 질소 기체의 스트림을 10분간 버블링하여 탈산소화시켰다. 팔라듐(II) 아세테이트 (1.3 g, 5.790 mmol), RuPhos (5.5 g, 11.79 mmol) 및 탄산세슘 (200 g, 613.8 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 기체 스트림으로 10분간 더 탈산소화시켰다. 생성된 반응 혼합물을 80°C로 가온하여 14시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 상온으로 냉각시킨 후 감압 하에 농축하여 디옥산을 제거하였다. 냉수 (2.5 L)를 첨가하였더니, 황색 침전물이 형성되었다. 상기 침전물을 부흐너 깔때기 상에서 수집하고, 물 (500 mL)로 세척한 후, 대류식 오븐에서 건조시켰다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (4 x 330 g의 컬럼, 선형 구배, 0% → 10% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여 8-((4-메톡시벤질)옥시)-1-메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온 (68 g, 66%)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.25 (s, 1H), 7.41 - 7.28 (m, 2H), 7.03 - 6.89 (m, 3H), 6.82 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.93 - 3.87 (m, 4H), 3.86 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.46 - 2.82 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 381.17, 실측치 382.21 (M+1).
단계 7: 8-하이드록시-1-메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온
8-((4-메톡시벤질)옥시)-1-메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온 (13.90 g, 36.44 mmol)을 디클로로메탄 (250 mL)에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산 (31.0 mL, 402 mmol)을 첨가하고, 생성된 암갈색 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 남은 잔류물을 디클로로메탄에 용해시킨 후 실리카겔 플러그를 사용하여 여과하였다. 상기 플러그를 먼저 디클로로메탄으로 용리하여 높은 Rf 불순물들을 용리하여 폐기하였다. 상기 용리제를 아세톤으로 바꿔 황색-오렌지색의 용리 밴드를 얻었다. 상기 밴드를 수집한 후, 농축 건조하여 8-하이드록시-1-메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온 (8.89 g, 50% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz DMSO-d 6) δ 10.23 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 6.77 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.81 - 3.70 (m, 4H), 3.19 - 2.99 (m, 4H).
Figure pct00144
8-하이드록시-1,3-디메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온의 합성:
단계 1: 5-플루오로-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-2-니트로-아닐린
테트라하이드로퓨란 (52.4 mL) 중의 (4-메톡시페닐)메탄올 (4.17 g, 30.18 mmol)의 용액에 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% 분산액; 1.28 g, 32.00 mmol)을 첨가하였다. 생성된 상기 혼합물을 10분간 교반하고, 3,5-디플루오로-2-니트로-아닐린 (5 g, 28.72 mmol)으로 처리한 후, 1시간 동안 더 교반하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트와 물에 조심스럽게 분배하고, 적색이 황색/주황색으로 옅어질 때까지 1N의 염산을 적가하였다. 상기 유기물을 수집하여 건조시킨 후 (Na2SO4), 여과 및 농축시켰다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (330 g의 ISCO 컬럼, 0-25% 에틸 아세테이트/헵탄의 선형 구배)로 정제하여 5-플루오로-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-2-니트로-아닐린을 황색-오렌지색 고체로서 수득하였다.
단계 2: 3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-5-모르폴리노-2-니트로-아닐린
디메틸 설폭사이드 (13.6 mL) 중의 5-플루오로-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-2-니트로-아닐린 (4.64 g, 15.88 mmol) 및 모르폴린 (7.0 mL, 80.27 mmol)의 용액을 100℃로 2.5시간 동안 가열하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 분배하였다. 상기 상들을 분리한 후 수성층을 에틸 아세테이트로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물을 건조 (Na2SO4), 여과 및 농축시켜 3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-5-모르폴리노-2-니트로-아닐린 (5.70 g, 100% 수율)을 오렌지색 고체로서 수득하고, 이를 추가의 조작없이 사용하였다. ESI-MS m/z 계산치 359.15, 실측치 360.17 (M+1).
단계 3: 3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-5-모르폴리노-벤젠-1,2-디아민
3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-5-모르폴리노-2-니트로-아닐린 (5.66 g, 15.75 mmol), 염화암모늄 (1.53 g, 28.60 mmol), 아연 (5.59 g, 85.46 mmol) 및 물 (31 mL) 중의 2% TPGS-750-M의 혼합물을 밤새 교반하였다. 셀라이트를 첨가하여 물을 흡수한 다음, 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 상기 혼합물을 여과한 후, 상기 셀라이트 플러그를 더 많은 에틸 아세테이트로 헹구었다. 상기 혼합된 여과액을 농축하고, 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (330 g의 실리카겔 카트리지; 0-5% 메탄올/디클로로메탄의 선형 구배)로 정제하여 3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-5-모르폴리노-벤젠-1,2-디아민 (3.41 g, 66% 수율)을 적색 고체로서 수득하였다. ESI-MS m/z 계산치 329.17, 실측치 330.19 (M+1).
단계 4: 8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-3-메틸-6-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온
3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-5-모르폴리노-벤젠-1,2-디아민 (315 mg, 0.956 mmol), 에틸 피루베이트 (212 μL, 1.908 mmol) 및 메탄올 (3.0 mL)의 혼합물을 밀봉된 용기 중에서 65℃로 2시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물에서 고체가 침전되었다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 물을 첨가하여 상기 혼합물을 30분간 교반하였다. 상기 고체를 여과로 수집한 후, 물로 세척하고, 진공 하에 밤새 건조시켜 생성물들의 위치이성질체 혼합물을 수득하였다 (365 mg, 1.7:1 비율이 상기 반응식에 나타낸 목적 화합물에 유리함). 상기 생성된 혼합물을 SFC로 정제하여 목적한 이성질체인 8-((4-메톡시페닐)메톡시)-3-메틸-6-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온 (110 mg) 및 원치 않았던 이성질체인 5-((4-메톡시벤질)옥시)-3-메틸-7-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온 (64 mg)을 수득하였다.
8-((4-메톡시벤질)옥시)-3-메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온에 대한 데이터: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.56 (s, 1H), 7.55 - 7.46 (m, 2H), 6.98 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.95 - 6.89 (m, 2H), 6.72 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.74 (m, 7H), 3.10 (m, 4H), 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.23 - 1.14 (t, 3H). ESI-MS m/z 계산치 381.17, 실측치 382.17 (M+1).
5-((4-메톡시벤질)옥시)-3-메틸-7-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온에 대한 데이터: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (s, 1H), 7.49 - 7.38 (m, 2H), 7.00 - 6.90 (m, 2H), 6.60 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 3.75 (m, 7H), 3.18 (m, 4H), 2.69 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.17 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI-MS m/z 계산치 381.17, 실측치 382.17 (M+1).
단계 5: 8-((4-메톡시벤질)옥시)-1,3-디메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온
8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-3-메틸-6-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온 (110 mg, 0.274 mmol), 탄산칼륨 (183 mg, 1.324 mmol) 및 아세톤 (3.0 mL)의 혼합물을 요오드화메틸 (21 μL, 0.337 mmol)로 처리하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 밀봉하여 60℃에서 밤새 교반하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 분배하였다. 상기 상들을 분리한 후 수성층을 에틸 아세테이트로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물을 건조시킨 후 (Na2SO4), 여과 및 농축시켰다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (4 g의 실리카겔 카트리지; 0-10%의 메탄올/디클로로메탄의 선형 구배)로 정제하여 8-((4-메톡시벤질)옥시)-1,3-디메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온 (94 mg, 82%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.48 - 7.41 (m, 2H), 7.04 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.99 - 6.94 (m, 2H), 6.79 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H), 3.76 (m, 10H), 3.16 (m, 4H), 2.38 (s, 3H). ESI-MS m/z 계산치 395.18, 실측치 396.26 (M+1).
단계 6: 8-하이드록시-1,3-디메틸-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온
디클로로메탄 (5.0 mL) 중에서 교반된 8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-1,3-디메틸-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온 (88 mg, 0.177 mmol)의 용액을 트리플루오로아세트산으로 처리하였다. 상기 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축한 후, 상기 미정제 잔류물을 추가의 정제없이 사용하였다. ESI-MS m/z 계산치 275.13, 실측치 276.14 (M+1).
Figure pct00145
1-에틸-8-하이드록시-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온의 합성:
단계 1: 8-((4-메톡시벤질)옥시)-6-모르폴리노퀴녹살린-2(1H)-온
메탄올 (877 mL) 중의 3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-5-모르폴리노-벤젠-1,2-디아민 (7.51 g, 22.80 mmol)의 용액에 에틸 글리옥살레이트 (톨루엔 중 50% w/v 9.3 mL, 45.55 mmol)를 첨가하였다. 상기 생성된 용액을 밀봉하여 65℃로 2시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물에서 고체가 침전되었다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 물을 첨가하였다. 상기 고체를 여과로 수집하여 물로 세척하고, 이소프로판올로 분쇄한 후, 진공 하에 건조시켜 생성물의 위치이성질체 혼합물 (6.34 g)을 수득하였다. 상기 생성된 혼합물을 SFC [40% 에탄올 (5 mM의 암모니아)을 이용하는 IB 분취용 컬럼]로 정제하여 목적한 위치이성질체인 8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온 (3.48 g) 및 원치 않은 위치이성질체인 5-[(4-메톡시페닐)메톡시]-7-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온 (2.35 g)를 모두 수득하였다.
8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온에 대한 데이터:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.80 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.55 - 7.47 (m, 2H), 7.06 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.96 - 6.89 (m, 2H), 6.76 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 3.76 (m, 7H), 3.12 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 367.15, 실측치 368.09 (M+1).
5-[(4-메톡시페닐)메톡시]-7-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온에 대한 데이터:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.08 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.46 - 7.37 (m, 2H), 7.02 - 6.92 (m, 2H), 6.63 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.77 (m, 7H), 3.24 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 367.15, 실측치 368.09 (M+1).
단계 2: 1-에틸-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온
아세톤 (4.3 mL) 중의 8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6-모르폴리노-1H-퀴녹살린-2-온 (150 mg, 0.408 mmol)의 용액에 탄산칼륨 (273 mg, 1.975 mmol) 및 요오드화에탄 (40 μL, 0.500 mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 밀봉하여 바이알 중에서 60℃로 밤새 교반하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 분배하였다. 상기 상들을 분리한 후 수성층을 에틸 아세테이트로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물을 건조시킨 후 (Na2SO4), 여과 및 농축시켰다. 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (4 g의 실리카겔 카트리지; 0-10% 메탄올/디클로로메탄의 선형 구배)로 정제하여 1-에틸-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온 (55 mg, 32% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.46 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.99 - 6.93 (m, 2H), 6.86 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.43 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.78 (m, 4H), 3.76 (s, 3H), 3.23 (m, 4H), 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI-MS m/z 계산치 395.18, 실측치 396.23 (M+1).
단계 3: 1-에틸-8-하이드록시-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온
디클로로메탄 (약 1.0 mL) 중의 1-에틸-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온 (50 mg, 0.1264 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 생성된 적색 반응 용액을 농축하여 추가의 조작없이 그대로 사용하였다. ESI-MS m/z 계산치 275.13, 실측치 276.14 (M+1).
Figure pct00146
6-브로모-8-하이드록시-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온
아세트산 (56 mL) 중의 6-브로모-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (4 g, 10.66 mmol)의 용액을 100℃로 5시간 동안 가열하였다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시킨 후 밤새 방치하여 황색 침전물을 형성시켰다. 상기 고체를 진공 여과로 수집하여 디에틸 에테르로 세척한 후, 진공 하에 건조시켜 6-브로모-8-하이드록시-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (1.92 g, 69% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.21 (s, 1H), 7.44 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H). ESI-MS m/z 계산치 253.97, 실측치 254.97 (M+1).
Figure pct00147
8-하이드록시-1-메틸-6-(6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄-3-일)퀴녹살린-2-온
6-브로모-8-하이드록시-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (312 mg, 1.223 mmol), 6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄 (염산염; 201 mg, 1.482 mmol), RuPhos-G3-팔라다사이클 (52 mg, 0.062 mmol) 및 RuPhos (29 mg, 0.062 mmol)를 질소 하의 밀봉된 바이알 중에서 혼합하였다. 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 (테트라하이드로퓨란 중 1.0 M 용액 3 mL, 3.000 mmol)를 첨가한 뒤, 상기 바이알을 65℃로 밤새 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 에틸 아세테이트로 희석하여 여과하였다. 상기 여과액을 농축한 뒤, 미정제 잔류물을 아미노 작용화시킨 실리카겔 크로마토그래피 (12 g의 카트리지, 0-10% 메탄올/디클로로메탄의 선형 구배)로 정제하여 8-하이드록시-1-메틸-6-(6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄-3-일)퀴녹살린-2-온 (214 mg, 64% 수율)을 수득하였다. ESI-MS m/z 계산치 273.11, 실측치 274.24 (M+1).
Figure pct00148
6-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-8-하이드록시-1-메틸-퀴녹살린-2-온의 합성:
단계 1: 6-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-8-((4-메톡시벤질)옥시)-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온
6-브로모-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (4.0 g, 10.66 mmol), 2-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (2.72 g, 12.95 mmol), 탄산나트륨 (2.0 M 수용액 8 mL, 16.00 mmol) 및 디옥산 (40 mL)의 혼합물에 질소 기체를 버블링시켜 10분간 탈기시켰다. [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]-디클로로팔라듐(II) (디클로로메탄 복합체; 881 mg, 1.079 mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 5분간 더 탈기시킨 다음, 85℃로 4시간 동안 가열하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 물과 에틸 아세테이트로 분배하였다. 상기 층들을 분리한 후, 수성층을 에틸 아세테이트로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물을 염수로 세척한 후, 건조 (MgSO4), 여과 및 농축하였다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (330 g의 실리카겔 카트리지, 0-50% 에틸 아세테이트/헵탄의 선형 구배)로 정제하여 6-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (2.81 g, 69% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.21 (s, 1H), 7.52 - 7.42 (m, 4H), 7.02 - 6.94 (m, 2H), 6.48 - 6.42 (m, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.27 (q, J = 2.8 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.77 (s, 3H). ESI-MS m/z 계산치 378.16, 실측치 379.17 (M+1).
단계 2: 6-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-8-하이드록시-1-메틸-퀴녹살린-2-온
디클로로메탄 (20 mL) 중의 6-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-8-[(4-메톡시페닐)메톡시]-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (1.81 g, 4.783 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (5.0 mL, 64.90 mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 반응 용액을 2시간 동안 교반하여 농축시켰다. 상기 미정제 잔류물을 에틸 아세테이트와 포화 수성 중탄산나트륨으로 분배하였다. 상기 층들을 분리한 후, 수성층을 에틸 아세테이트로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기 추출물들을 염수로 세척한 후, MgSO4로 건조, 여과 및 농축시켰다. 디클로로메탄을 첨가하여, 갈색 침전물을 형성시킨 후, 이를 진공 여과로 수집하여 6-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-8-하이드록시-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (1.10 g, 82% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.40 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.32 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.26 (dp, J = 3.1, 1.5 Hz, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.24 (q, J = 2.8 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 2.48 - 2.40 (m, 2H). ESI-MS m/z 계산치 258.10, 실측치 259.16 (M+1).
섹션 II: 메실레이트 중간체의 제조
섹션 II에서는 메실레이트 중간체의 제조를 위한 합성 절차에 대하여 기술한다. 이러한 중간체들을 (섹션 I에서 기술한) 8-하이드록시-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 중간체의 적절한 선택과 함께 사용하여 섹션 III에 기술된 방법을 이용해 표 A의 화합물들을 제조한다.
Figure pct00149
(1,4- 트랜스 )-4-(피리미딘-2-일옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트
단계 1: (1,4-트랜스)-4-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)사이클로헥산-1-올
디클로로메탄 (1.5 L) 중의 (1,4-트랜스)-사이클로헥산-1,4-디올 (70 g, 602.6 mmol) 및 이미다졸 (130 g, 1.910 mol)의 용액에 3급-부틸-클로로-디메틸-실란 (100 g, 663.5 mmol)을 한번에 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온한 뒤 24시간 동안 교반하였는데, 이 시간대의 TLC 분석 결과, 이는 출발 물질, 목적 생성물 및 비스-부가 생성물의 혼합물임을 알 수 있었다. 상기 반응 혼합물을 물 (300 mL)에 부었다. 상기 유기층을 분리한 후, 수성층을 에틸 디클로로메탄 (100 mL)으로 추출하였다. 상기 혼합된 유기 추출물들을 물 (100 mL)과 염수 (100 mL)로 세척하여 Na2SO4로 건조시킨 후, 여과하여 감압 하에 농축시켰다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (800 g의 실리카겔 컬럼, 0-50% 헵탄 중 에틸 아세테이트의 선형 구배)로 정제하여 (1,4-트랜스)-4-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시사이클로헥산올 (58 g, 41%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 4.44 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 3.69 - 3.50 (m, 1H), 3.48 - 3.35 (m, 1H), 1.84 - 1.60 (m, 4H), 1.37 - 1.09 (m, 4H), 0.84 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
단계 2: 2-(((1,4-트랜스)-4-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)사이클로헥실)옥시)피리미딘
N,N-디메틸포름아미드 (100 mL) 중의 (1,4-트랜스)-4-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시사이클로헥산올 (13.7 g, 58.86 mmol) 및 2-클로로피리미딘 (9 g, 74.65 mmol)의 2℃ 용액에 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% w/w 현탁액 5 g, 125.0 mmol)을 한번에 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 30분간에 걸쳐 실온으로 가온한 후, 추가로 10시간 동안 교반을 지속하였다. 상기 반응 혼합물을 냉수 (400 L)에 부어 황갈색 고체를 침전시켰다. 상기 고체를 진공 여과로 수집한 후, 물 (3 x 100 mL)로 헹군 뒤, 진공 오븐 중에서 50℃로 16시간 동안 건조시켜 (1,4-트랜스)-3급-부틸-디메틸-(4-피리미딘-2-일옥시사이클로-헥속시)실란 (18.8 g, 95% 순도, 98% 수율)을 수득하였고, 이를 추가의 정제없이 사용하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.57 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.08 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.04 - 4.80 (m, 1H), 3.90 - 3.68 (m, 1H), 2.11 - 1.95 (m, 2H), 1.93 - 1.76 (m, 2H), 1.64 - 1.47 (m, 2H), 1.46 - 1.30 (m, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.05 (s, 6H).
단계 3: (1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일옥시)사이클로헥산-1-올
테트라하이드로퓨란 (150 mL) 및 메탄올 (6 mL)의 혼합물 중의 (1,4-트랜스)-3급-부틸-디메틸-(4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)실란 (26 g, 83.44 mmol)의 용액에 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 (40 g, 248.1 mmol)를 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 얼음조를 이용하여 0℃로 냉각하고, 수산화암모늄 수용액 (30% w/w 30 g, 256.8 mmol)을 첨가한 후, 물 (100 mL)과 에틸 아세테이트 (200 mL)를 첨가하였다. 상기 유기층을 분리한 후, 수성층을 에틸 아세테이트(100 mL)로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기 추출물들을 물 (100 mL)과 염수 (100 mL)로 세척하여 건조시킨 후(Na2SO4), 여과하여 감압 하에 농축시켜 (1,4-트랜스)-4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥산올 (16.2 g, 99%)을 담황색의 점성 오일로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.48 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 6.89 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.09 - 4.87 (m, 1H), 3.91 - 3.62 (m, 1H), 2.29 - 2.10 (m, 2H), 2.10 - 1.95 (m, 2H), 1.68 - 1.36 (m, 4H).
단계 4: (1,4- 트랜스 )-4-(피리미딘-2-일옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트
디클로로메탄 중의 (1,4-트랜스)-4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥산올 (16.2 g, 82.6 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (40 mL, 229.6 mmol)의 0℃ 용액에
디클로로메탄 (50 mL) 중의 염화메탄설포닐 (8 mL, 103.4 mmol)의 용액을 25분간에 걸쳐 적가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하였다.
상기 반응 혼합물을 포화 수성 중탄산나트륨 (100 mL)을 첨가하여 ??칭시켰다. 상기 유기층을 분리한 후, 수성층을 에틸 디클로로메탄 (100 mL)으로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물들을 포화 수성 중탄산나트륨으로 세척하여 건조시킨 후(Na2SO4), 여과하여 감압 하에 농축시켰다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (330 g의 Isco 금 컬럼, 0-50% 에틸 아세테이트/디클로로메탄의 선형 구배)로 정제하여 (1,4-트랜스)-(4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥실) 메탄설포네이트 (19.4 g, 85% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.49 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 6.91 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.25 - 5.02 (m, 1H), 4.98 - 4.77 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.33 - 2.04 (m, 4H), 1.95 - 1.72 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 272.32, 실측치 273.07 (M+1).
Figure pct00150
(1,4-트랜스)-4-((5-메톡시피리미딘-2-일)옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트
(1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트도 상술한 바와 동일한 4-단계 합성 순서로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (s, 2H), 5.13 - 4.95 (m, 1H), 4.94 - 4.73 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.02 (s, 3H), 2.37 - 1.99 (m, 4H), 1.94 - 1.68 (m, 4H).
Figure pct00151
(1,4-트랜스)-4-((2-메틸피리미딘-4-일)옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트
단계 1: 4-(((1,4-트랜스)-4-((3급-부틸디메틸실릴)옥시)사이클로헥실)옥시)-2-메틸피리미딘
N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 중의 (1,4-트랜스)-사이클로헥산-1,4-디올 (2 g, 17.05 mmol) 및 4-클로로-2-메틸-피리미딘 (1.5 g, 11.67 mmol)의 2℃ 용액에 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% w/w 현탁액 950 mg, 23.75 mmol)을 한번에 첨가하였다. 냉각조를 제거하고 상기 반응 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 가온하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 냉수 (60 L)에 부어 황갈색 침전물을 형성시켰다. 상기 고체를 진공 여과로 수집하여 물 (2 x 10 mL)로 헹군 뒤, 진공 오븐에서 60℃로 14시간 동안 건조시켜 원치 않는 비스-부가물인 2-메틸-4-[4-(2-메틸피리미딘-4-일)옥시사이클로헥속시]피리미딘 (1.1 g, 31%)을 수득하였다. 상기 진공 여과로부터 얻은 여과액을 2-메틸-테트라하이드로퓨란 (4 x 60 mL)으로 추출한 후, 혼합된 여과액을 건조 (Na2SO4), 여과하고 감압 하에 농축하여 황색 오일을 수득하고, 이를 실리카겔 크로마토그래피 (0-100% 에틸 아세테이트/헵탄의 선형 구배)로 정제하여 목적 생성물인 (1,4-트랜스)-4-(2-메틸피리미딘-4-일)옥시사이클로헥산올 (1.23 g, 95% 순도, 48% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.39 - 8.18 (m, 1H), 6.76 - 6.38 (m, 1H), 5.24 - 5.02 (m, 1H), 3.81 - 3.62 (m, 1H), 3.54 (s, 1H), 2.66 - 2.39 (m, 3H), 2.26 - 1.80 (m, 4H), 1.69 - 1.15 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 208.26, 실측치 209.13 (M+1).
단계 2:
이소프로필 알코올 (225 mL) 중의 3급-부틸-디메틸-[4-(2-메틸피리미딘-4-일)옥시사이클로헥속시]실란 (17.82 g, 54.70 mmol)의 용액을 농축 염산 (16 mL의 12 M 용액, 192.0 mmol)으로 처리하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에 농축시킨 후, 잔류물을 에틸 아세테이트 (2 x 200 mL)과 함께 공비등시켜 황갈색 고체를 수득하였다. 상기 미정제 잔류물을 메틸 3급-부틸 에테르 (100 mL)를 이용한 분쇄에 의해 추가로 정제한 후, 진공 오븐에서 50℃로 14시간 동안 건조하여 (1,4-트랜스)-4-(2-메틸피리미딘-4-일)옥시사이클로헥산올 (11.57 g, 98%)을 황갈색 고체로서 수득하고, 이를 추가의 정제없이 사용하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.62 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.30 - 4.95 (m, 1H), 3.64 - 3.42 (m, 1H), 2.66 (s, 3H), 2.17 - 1.95 (m, 2H), 1.95 - 1.75 (m, 2H), 1.65 - 1.43 (m, 2H), 1.43 - 1.22 (m, 2H).
단계 3: (1,4-트랜스)-4-((2-메틸피리미딘-4-일)옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트
메실레이트의 제조는 (1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트에 대하여 상술한 절차에 따라 수행하였다. (1,4-트랜스)-4-(2-메틸피리미딘-4-일)옥시사이클로헥산올을 출발 물질로 사용하여 (1,4-트랜스)-4-((2-메틸피리미딘-4-일)옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트 (85% 수율)를 황갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.31 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 5.35 - 5.13 (m, 1H), 5.00 - 4.75 (m, 1H), 3.04 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 2.28 - 2.03 (m, 4H), 1.96 - 1.64 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 286.35, 실측치 287.07 (M+1).
Figure pct00152
(1,4-트랜스)-4-((5-메틸피리미딘-2-일)옥시)사이클로헥실 메탄설포네이트
본 섹션에서는 상기 나타낸 합성 반응식을 통해 상술한 반응 조건들을 사용하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.31 (s, 2H), 5.17 - 4.99 (m, 1H), 4.97 - 4.74 (m, 1H), 3.02 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.20 - 2.01 (m, 4H), 1.94 - 1.71 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 286.35, 실측치 287.16 (M+1).
Figure pct00153
(1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실 메탄설포네이트
단계 1: (1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥산-1-올
2-클로로피리딘 (70.30 g, 613.8 mmol) 및 트랜스-1,4-아미노사이클로헥산올 (71.77 g, 604.5 mmol)을 이소프로판올 (400 mL)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (120 mL, 689 mmol)을 첨가하고 생성된 용액을 밤새 환류 가열하였다. 용매를 감압 하에 증발시킨 뒤, 남아있는 고체를 디클로로메탄에 현탁시키고 실리카겔 플러그를 통해 여과하였다. 상기 실리카 플러그를 먼저 디클로로메탄으로 용리하여 잔류 출발 물질을 용리시킨 다음, 에틸 아세테이트로 목적 생성물을 용리시켰다. 상기 에틸 아세테이트 용리로부터 얻은 여과액을 감압 하에 증발시켜 (1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥산-1-올을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.25 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 6.50 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.95 - 3.54 (m, 2H), 2.25 - 1.91 (m, 5H), 1.60 - 1.13 (m, 4H).
단계 2: (1,4- 트랜스 )-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실 메탄설포네이트
디클로로메탄 (727 mL) 중의 (1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥산-1-올 (52 g, 55.53 mmol)의 0℃ 현탁액에 디이소프로필에틸아민 (90 mL, 516.7 mmol)을 첨가하였다. 내부 온도가 20℃ 이하로 유지되는 속도로 염화메탄설포닐 (35 mL, 452.2 mmol)을 주사기를 통해 첨가하였다. 상기 반응물을 1시간 동안 더 교반하고, 디클로로메탄으로 희석한 후, 포화 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 상기 유기층을 건조시킨 후 (MgSO4), 짧은 실리카겔 플러그를 통해 여과시켰다. 상기 플러그를 20%의 에틸 아세테이트/디클로로메탄으로 용리시킨 후, 여과액을 감압 하에 농축하여 황갈색 고체를 수득하였다. 상기 고체를 최소량의 디클로로메탄에 용해시켰다. 생성물이 결정화되기 시작할 때까지 펜탄을 첨가하였다. 상기 혼합물을 드라이아이스/아세톤 조에서 냉각시키고, 고체를 진공 여과로 수집하여 펜탄으로 세척한 후, 진공에서 건조하여 (1,4-트랜스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실 메탄설포네이트 (59.72 g, 82% 수율)를 옅은 황갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.27 (d, J = 2H), 6.54 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.13 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.69 (tt, J = 10.5, 4.0 Hz, 1H), 3.98 - 3.73 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.21 (dd, J = 9.3, 4.2 Hz, 4H), 1.91 - 1.67 (m, 2H), 1.51 - 1.25 (m, 2H).
Figure pct00154
R이 치환 또는 비치환된 방향족 고리, 치환 또는 비치환된 헤테로방향족 고리, 또는 카바메이트인 상기 나타낸 유형의 추가적인 메실레이트를 이용하기 위한 합성 경로에 대해서는 이전에 보고된 바 있기 때문에 (US 20140275059 A1호), 본원에서는 설명하지 않을 것이다.
섹션 III: 메실레이트 치환을 최종 단계로 사용하여 제조된 화합물
섹션 III에 설명한 화합물들은 (섹션 I에 설명된) 8-하이드록시-퀴녹살리논 및 (섹션 II에 설명된) 메실레이트 중간체를 적절히 선택하여 하기의 방법들을 사용해 제조하였다. 섹션 III의 방법으로 제조된 화합물들에 대한 분석 데이터는 표 A에 나타내었다.
방법 A-A
Figure pct00155
1-메틸-6-모르폴리노-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온
N,N-디메틸포름아미드 (100 mL) 중의 8-하이드록시-1-메틸-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온 (7.65 g, 15.63 mmol)의 용액에 트랜스-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실 메탄설포네이트 (30.34 g, 111.8 mmol) 및 탄산세슘 (35.64 g, 109.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 60℃로 밤새 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후 셀라이트로 여과하였다. 상기 셀라이트 플러그를 N,N-디메틸포름아미드로 세척한 후, 여과액을 진공에서 증발시켜 어두운색의 오일을 수득하고, 이를 고진공 하에 고형화시켰다. 상기 고체를 디클로로메탄에 용해시키고, 실리카겔 플러그로 여과한 후, 5% 메탄올/에틸 아세테이트로 용리시켰다. 여과액을 증발시켜 갈색을 띤 오렌지색 고체를 수득하였다. 상기 고체를 디클로로메탄에 용해시킨 후, 실리카겔 크로마토그래피 (330 g의 실리카겔 카트리지; 등용매 구동 3% 메탄올/에틸 아세테이트)로 정제하여 담황색 고체를 수득하였다. 상기 고체를 드라이아이스/아세톤 조에서 미리 냉각시킨 소량의 에틸 아세테이트로 세척한 후, 헵탄으로 세척하였다. 마지막으로, 상기 물질을 60℃에서 고진공 하에 건조하여 1-메틸-6-모르폴리노-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온을 수득하였다.
방법 A-B
Figure pct00156
1-메틸-6-모르폴리노-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일옥시)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온
N,N-디메틸포름아미드 (690 μL) 중의 8-하이드록시-1-메틸-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온 (34.5 mg, 0.132 mmol)의 용액에 트랜스-(4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥실) 메탄설포네이트 (68.0 mg, 0.247 mmol) 및 탄산세슘 (215 mg, 0.660 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 90℃로 5시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 디클로로메탄과 물로 분배하였다. 상기 유기상을 수집하여 증발시켰다. 상기 미정제 잔류물을 최소 DMSO에 용해시킨 후 C18 분취용 HPLC (아세토니트릴/물 + 트리플루오로아세트산 개질제)로 정제하고, 관련 분획들을 혼합하여 농축 건조시켰다. 이렇게 수득된 물질을 디클로로메탄에 용해시키고 포화 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 상기 유기상을 수집하여 건조시킨 후 (Na2SO4), 여과 및 농축시켜 1-메틸-6-모르폴리노-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일옥시)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온 (16.1 mg, 25% 수율)을 수득하였다.
주: 본 방법으로 제조된 분자들은 실리카겔 크로마토그래피 (메탄올/디클로로메탄)로도 정제하였다.
방법 A-C
Figure pct00157
1,3-디메틸-6-모르폴리노-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온
N,N-디메틸포름아미드 (1.1 mL) 중의 8-하이드록시-1,3-디메틸-6-모르폴리노-퀴녹살린-2-온 (48.7 mg, 0.177 mmol) 및 탄산세슘 (572 mg, 1.756 mmol)의 혼합물에 (트랜스)-[4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실] 메탄설포네이트 (147 mg, 0.542 mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 혼합물을 100℃로 밤새 교반하였다. 상기 반응물을 실온으로 냉각한 후, 메틸 3급-부틸과 물로 분배하였다. 상기 상들을 분리한 후, 수성층을 메틸 3급-부틸 에테르로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물을 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4), 여과 및 농축시켰다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (0-10% 메탄올/디클로로메탄의 선형 구배를 사용하는 4 g의 실리카겔 카트리지; 이후 0-100% 에틸 아세테이트/헵탄의 선형 구배를 사용하는 제2 실리카겔 정제)로 정제하여 1,3-디메틸-6-모르폴리노-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실)옥시)-퀴녹살린-2(1H)-온 (17.3 mg, 21% 수율)을 수득하였다.
주: 본 방법으로 제조된 분자들은 역상 C18 분취용 HPLC (아세토니트릴/물 + 트리플루오로아세트산 또는 수산화암모늄 개질제) 또는 역상 C18-유도체화된 실리카겔 크로마토그래피 (아세토니트릴/물 + 트리플루오로아세트산 개질제)로도 정제하였다.
방법 A-D
Figure pct00158
6-브로모-1-메틸-8-[(1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥속시]퀴녹살린-2-온
디메틸 설폭사이드 (7.0 mL) 중의 6-브로모-8-하이드록시-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (954 mg, 3.740 mmol) 및 [4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실] 메탄설포네이트 (3.1 g, 11.42 mmol)의 용액에 탄산루비듐 (2.49 g, 10.78 mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 혼합물을 80℃로 밤새 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 디클로로메탄과 물로 분배하였다. 상기 상들을 분리한 후, 수성층을 디클로로메탄으로 더 추출하였다. 상기 유기물들을 농축하여 진공 하에 밤새 건조시켰다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (80 g의 실리카겔 카트리지; 0-5% 메탄올/디클로로메탄의 선형 구배)로 정제하여 6-브로모-1-메틸-8-[4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥속시]퀴녹살린-2-온 (700 mg, 42% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
섹션 IV: 브로모-퀴녹살리논 중간체의 제조
섹션 IV에는 본 특허에서 설명하지 않은 작용화된 6-브로모-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 중간체의 제조를 위한 합성 절차에 대해 기술한다. 이러한 중간체들을 아민 또는 붕소 에스테르 커플링 파트너를 적절히 선택해서 함께 사용하여 표 B의 화합물들을 제조하였다.
Figure pct00167
6-브로모-1-메틸-8-(4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)퀴녹살린-2-온
6-브로모-8-하이드록시-1-메틸-퀴녹살린-2-온 (299 mg, 1.172 mmol), (4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥실) 메탄설포네이트 (517 mg, 1.899 mmol), 탄산세슘 (501 mg, 1.538 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (6.0 mL)의 혼합물을 100°C로 4시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후 여과하였다. 상기 여과액을 역상 크로마토그래피 (100 g의 Isco RediSep Rf C18-유도체화된 실리카겔 카트리지; 25-60% 아세토니트릴/물 + 트리플루오로아세트산 개질제의 선형 구배)로 정제하였다. 생성물을 포함하고 있는 분획들을 에틸 아세테이트와 포화 수성 중탄산나트륨으로 분배하였다. 상기 상들을 분리한 후 수성층을 에틸 아세테이트로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물을 염수로 세척한 후, 건조 (MgSO4), 여과 및 농축시켜 6-브로모-1-메틸-8-(4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)퀴녹살린-2-온 (320.6 mg, 63% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.60 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 8.25 (s, 1H), 7.58 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.22 - 5.09 (m, 2H), 4.85 - 4.72 (m, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.03 - 1.85 (m, 8H). ESI-MS m/z 계산치 430.06, 실측치 431.16 (M+1).
Figure pct00168
6-브로모-8-(((1,4-시스)-4-((5-메톡시피리미딘-2-일)옥시)사이클로헥실)옥시)-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온
6-브로모-1-메틸-8-((1,4-시스)-4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)퀴녹살린-2-온에 대하여 상술한 것과 유사한 절차에 의해 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.30 (s, 1H), 8.22 (s, 2H), 7.63 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.20 - 5.10 (m, 1H), 4.58 - 4.47 (m, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 2.26 - 1.85 (m, 8H). ESI-MS m/z 계산치 460.07, 실측치 461.13 (M+1).
Figure pct00169
6-브로모-1-메틸-8-(((1,4-시스)-4-((5-메틸피리미딘-2-일)옥시)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온
6-브로모-1-메틸-8-((1,4-시스)-4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)퀴녹살린-2-온에 대하여 상술한 것과 유사한 절차에 의해 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 0.9 Hz, 2H), 8.14 (s, 1H), 7.48 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.13 - 4.99 (m, 1H), 4.43 - 4.30 (m, 1H), 3.86 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.09 - 1.93 (m, 4H), 1.93 - 1.71 (m, 4H). ESI-MS m/z 계산치 444.08, 실측치 445.11 (M+1).
Figure pct00170
6-브로모-1-메틸-8-(((1,4-시스)-4-((2-메틸피리미딘-4-일)옥시)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온
6-브로모-1-메틸-8-((1,4-시스)-4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)퀴녹살린-2-온에 대하여 상술한 것과 유사한 절차에 의해 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.36 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.65 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.29 (s, 8H), 6.57 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 - 5.35 (m, 1H), 4.61 - 4.51 (m, 1H), 4.03 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 2.18 - 1.86 (m, 8H). ESI-MS m/z 계산치 444.08, 실측치 445.11 (M+1).
섹션 V: 부흐발트 커플링 또는 스즈키 커플링을 최종 단계로 사용하여 제조된 화합물
본 섹션에 설명된 화합물들은, 작용화된 (섹션 IV에 설명된) 6-브로모-1-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 및 (부흐발트 커플링의 경우) 아민 또는 (스즈키 커플링의 경우) 붕소 에스테르를 적절히 선택하여 하기 설명된 방법을 사용해 제조하였다. 본 섹션의 화합물들에 대한 분석 데이터는 표 B에 나타내었다.
방법 B-A
Figure pct00171
6-(6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄-3-일)-1-메틸-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)-사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온
6-브로모-1-메틸-8-[4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실옥시]퀴녹살린-2-온 (74 mg, 0.167 mmol), 6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄 (염산염; 61 mg, 0.450 mmol), 탄산세슘 (263 mg, 0.807 mmol), RuPhos-G3-팔라다사이클 (30 mg, 0.036 mmol), RuPhos (17 mg, 0.036 mmol) 및 디옥산 (700 μL)의 혼합물을 100℃로 밤새 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 에틸 아세테이트와 물로 분배하였다. 상기 상들을 분리한 후, 수성층을 에틸 아세테이트로 더 추출하였다. 상기 혼합된 유기물을 건조시킨 후 (Na2SO4), 여과 및 농축시켰다. 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (12 g의 실리카겔 카트리지; 0-5% 메탄올/디클로로메탄의 선형 구배)로 정제하여
6-(6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄-3-일)-1-메틸-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온 (17.0 mg, 22% 수율)을 수득하였다.
주: 본 방법으로 제조된 분자들은 C18 분취용 HPLC (아세토니트릴/물 + 트리플루오로아세트산 또는 수산화암모늄 개질제)로도 정제하였다.
방법 B-B
Figure pct00172
6-(3,6-디하이드로-2 H -피란-4-일)-1-메틸-8-(((1,4- 시스 )-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로-헥실)-옥시)퀴녹살린-2(1 H )-온
6-브로모-1-메틸-8-[4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥속시]퀴녹살린-2-온 (62 mg, 0.140 mmol), 2-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (44 mg, 0.209 mmol), 탄산나트륨 (207 μL의 2M 수용액, 0.414 mmol) 및 디옥산 (1.1 mL)의 혼합물에 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]-디클로로팔라듐(II) (디클로로메탄 복합체; 10 mg, 0.014 mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 100℃로 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 여과한 후, 상기 여과액을 C18 분취용 HPLC (아세토니트릴/물 + 트리플루오로아세트산 개질제)로 직접 정제하고, 관련 분획들을 혼합하여 농축 건조시켰다. 이렇게 수득된 물질을 디클로로메탄에 용해시키고 포화 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 상기 유기상을 수집하여 건조(Na2SO4), 여과 및 농축한 후, 건조하여 6-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-1-메틸-8-(((1,4-시스)-4-(피리미딘-2-일아미노)사이클로헥실)옥시)퀴녹살린-2(1H)-온 (30 mg, 47% 수율)을 수득하였다.
주: 본 방법으로 제조된 분자들은 실리카겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/디클로로메탄)로도 정제하였다.
방법 B-C
Figure pct00173
1-메틸-6-(6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄-3-일)-8-((1,4-시스)-4-피리미딘-2-일옥시-사이클로헥속시)-퀴녹살린-2-온
디옥산 (1.0 mL) 중의 6-브로모-1-메틸-8-(4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)퀴녹살린-2-온 (80 mg, 0.186 mmol) 및 탄산세슘 (195 mg, 0.599 mmol)의 현탁액에 질소 기체를 5분간 버블링하여 탈기시켰다. RuPhos (9 mg, 0.019 mmol) 및 팔라듐(II) 아세테이트 (2 mg, 0.009 mmol)를 첨가한 후, 상기 반응물을 5분간 더 탈기시켰다. 마지막으로, 6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄 (31 mg, 0.313 mmol)을 첨가하고, 상기 바이알을 밀봉하여 3시간 동안 100℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후 여과 및 농축시켰다. 상기 미정제 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (등용매 에틸 아세테이트를 사용하는 12 g의 실리카겔 카트리지)로 정제하여 1-메틸-6-(6-옥사-3-아자비사이클로[3.1.1]헵탄-3-일)-8-((1,4-시스)-4-피리미딘-2-일옥시사이클로헥속시)퀴녹살린-2-온 (36.5 mg, 43% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00174
Figure pct00175
Figure pct00176
유전자 편집 실시예
[00474] 수행된 실험과 달성된 결과를 포함하는 하기의 실시예는 예시의 목적으로만 제공될 뿐, 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
[00475] 방법:
[00476] 세포 및 배양
[00477] 기관지 상피 세포 (BEC)는 CFTR dF508/dF508 유전자형을 갖는 낭포성 섬유증으로 진단된 인간 기증자로부터 유래하였다.
[00478] 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)는 야마나카(Yamanaka)의 재프로그래밍 인자인 Oct4, Sox2, KLF4 및 c-Myc를 사용한 바이러스 형질도입 후의 인간 진피 섬유아세포로부터 유래하였다. 유도된 iPSC는 3개의 배엽층으로 분화할 수 있으며, 23쌍의 염색체를 갖는 정상적인 핵형을 포함하였다.
[00479] 1차 인간 동원(mobilized) 말초 혈액 (mPB) CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 (HSPC)는 헤마케어(Hemacare) 또는 올셀스(AllCells)에서 구입하였다. 세포들을 해동하고, 세척하여 무혈청 배지인 CellGro SCGM (CellGenix)으로 이루어지고 사이토카인 혼합물 (300 ng/mL의 SCF, 300 ng/mL의 Flt3L, 100 ng/mL의 TPO, 60 ng/ml의 IL- 3)로 보충된 완전 배지 중에 1 mL당 1-3 x 105개의 세포 밀도로 재현탁시킨 후, 37℃/5% CO2의 항온배양기에서 48시간 동안 항온배양 후 전기천공하였다.
[00480] DNA-PK 억제제:
[00481] DNA-PK 억제제 화합물 1을 유전자 편집 실시예로 사용하였다. 10 mM 스톡 용액을 무수 DMSO를 사용해 제조하여 -80°C로 보관하였다.
[00482] 전기천공:
[00483] 사용된 합성 sgRNA는 신테고(Synthego)에서 구입하여 HPLC (고성능 액체크로마토그래피)로 정제하였으며, 5' 및 3' 말단 모두에서 3개의 말단 위치에 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 (2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트)를 포함하였다. 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 sgRNA의 서열은 아래와 같이 밑줄을 그어 놓았다:
[00484] AAVS1 sgRNA:
5'ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 3' (서열번호 3).
[00485] NAV1.7 sgRNA:
[00486]
5'GGCUGAGCGUCCAUCAACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 3' (서열번호 4)
[00487] Cas9 mRNA는 트리링크 바이오테크놀로지스(TriLink Biotechnologies) (L-7206)에서 구입하였다. Cas9 mRNA는 핵 위치선정 신호를 사용하여 스트렙토코커스 파이오진스 SF370 Cas9 단백질 (CRISPR 결합 단백질 9)의 형태를 발현한다. 또한, spCas9 mRNA는 CAP1 구조, 폴리아데닐화 신호 및 변형된 우리딘도 포함하여 포유동물 세포에서 최적의 발현 수준을 얻게 된다.
[00488] 공여체 ssODN은 IDT에서 구입하였다. ssODN은 40개의 뉴클레오타이드의 상동성 아암에 의해 측접되어 있는, TIDE 분석으로 HDR 사건들을 측정하기 위한 10개의 뉴클레오타이드 삽입 서열을 포함하고 있다. ssODN은 총 90개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 5' 및 3' 양 말단에 세 말단 위치에 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고 있다. 밑줄을 그려놓은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 공여체 ssODN의 서열을 다음과 같이 나타낸다.
[00489] AAVS1 PAM:
[00490]
5'GGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCAGAATTCTCAGCTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGG3' (서열번호 5)
[00491] AAVS1 비-PAM:
[00492]
5'CCTAAGGATGGGGCTTTTCTGTCACCAATCCTGTCCCTAGCTGAGAATTCTGGCCCCACTGTGGGGTGGAGGGGACAGATAAAAGTACCC3' (서열번호 6)
[00493]
[00494] NAV1.7 PAM:
[00495]
5'AGCTGTCCATTGGGGAGCATGAGGGCTGAGCGTCCATCAACTGAGAATTCCCAGGGAGACCACACCGTTGCAGTCCACAGCACTGTGCAT3' (서열번호 7)
[00496] NAV1.7 비-PAM:
[00497]
5'ATGCACAGTGCTGTGGACTGCAACGGTGTGGTCTCCCTGGGAATTCTCAGTTGATGGACGCTCAGCCCTCATGCTCCCCAATGGACAGCT3' (서열번호 8)
[00498] 모든 전기천공은 론자(Lonza) 4D-Nucleofector™ 시스템에서 수행하였다.
[00499] BEC의 경우, 전기천공에 하기의 조건들을 사용하였다: 프로그램 CM-138을 사용하는 20 μl의 P4 전기천공 버퍼 중에서 1.8xE5개의 세포, 250 ng의 CAS9 mRNA, 500 ng의 sgRNA 및 0.66 μM의 ssODN. 전기천공된 세포들을 DNA-PK 억제제가 보충된 100 μl의 BEC 배양 배지를 포함하는 96 웰 플레이트로 옮기거나, 또는 처리하지 않은 채로 두었다. 세포들을 5% CO2 항온배양기 중에서 37℃로 항온배양하였다.
[00500] iPSC의 경우, 하기의 조건들을 사용하였다: 프로그램 CM-137을 사용하는 20 μl의 P3 전기천공 버퍼 중에서 2.0xE5개의 세포, 250 ng의 CAS9 mRNA, 500 ng의 sgRNA 및 0.66 μM의 ssODN. 전기천공된 세포들을 DNA-PK 억제제의 존재 또는 부재 하에 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632 (Stem Cell Technologies)가 보충된 100 μl의 mTEsR1 배지 (Stem Cell Technologies)를 함유하는 96 웰 플레이트로 옮긴 후, 5% CO2 항온배양기 중에서 37℃로 항온배양하였다.
[00501] CD34+ 세포들은 해동 2일 후 전기천공하였다. 전기천공에 하기의 조건들을 사용하였다: 프로그램 CA-137을 사용하는 100 μl의 P3 전기천공 버퍼 중에서 2.0xE6개의 세포, 15 μg의 Cas9 단백질 (Feldan), 15 μg의 sgRNA, 1 μM의 ssODN. 전기천공된 세포들을 다양한 농도의 DNA-PK 억제제를 함유하고 있는 24 웰 플레이트 중의 8개의 각 웰에 똑같이 나누어 옮겼다. 세포들을 5% CO2 항온배양기 중에서 2일간 37℃로 항온배양한 후, 세포 생존력과 유전자 편집에 대하여 평가하였다.
[00502] 지질 매개형 세포 형질감염:
[00503] 형질감염 하루 전, BEC를 BEC 배양 배지 중에서 웰당 1xE4개의 세포의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하였다. 먼저, 0.15 μl의 MessengerMax (ThermoFisher, LMRNA 003)를 5 μl의 Opti-MEM에 희석시킨 후, 실온에서 10분간 항온배양하였다. 한편, 80 ng의 Cas9 mRNA (트리링크, L-7206), 20 ng의 sgRNA (신테고) 및 1 pM의 ssODN을 5 μl의 Opti-MEM에 첨가한 후, MessengerMAx 용액과 혼합하였다. 상기 혼합물을 세포에 첨가하기 전에 5분간 항온배양하였다. 전체 용액을 DNA-PK 억제제의 존재 또는 부재 하의 100 μl의 배양 배지를 함유한 96-웰 플레이트의 웰에 있는 세포들에 첨가하였다. 세포들을 5% CO2 항온배양기 중에서 37℃로 항온배양하였다.
[00504] 세포 생존율의 측정:
[00505] 세포들을 5 μg/ml의 Hoechst 33342 (Life technologies: H3570) 및 0.5 μg/ml의 프로피듐 요오드화물 (PI; Life technologies: P3566)과 함께 배양 배지 중에서 37℃로 1시간 동안 항온배양하였다. 고함량 이미징 시스템(High-Content Imaging System) (Molecular devices)을 사용하여 세포들을 촬영하여 Hoechst 양성 사건 (살아있는 세포와 사멸 세포) 및 PI 양성 사건 (사멸 세포)를 살펴보았다. 상대적인 세포 생존율은 다음과 같이 계산하였다: [샘플의 (Hoechst+ 사건 - PI+ 사건)]/[대조군의 (Hoechst+ 사건 - PI+ 사건)] * 100. 대조군은 모의(Mock) 형질감염시킨 세포였으며, 그 세포 생존율을 100%로서 임의 설정하였다.
[00506] CD34+ HSPC 세포 생존은 CTG (Cell Titer Glo) 시약 (Promega)을 사용하여 측정하였다. 100 μl의 세포 현탁액을 100 μl의 완전 CTG 시약과 혼합하였다. 화학발광 신호는 광도계를 사용하여 측정하였고, 생존 세포의 비율(%)은 대조군 세포 (DNA-PK 억제제로 처리하지 않은 세포)와 비교하여 계산하였다.
[00507] 유전자 편집율의 측정:
[00508] 96 웰 플레이트의 웰당 50 μl의 DNA Quickextract 용액 (Epicentre)으로 세포들을 37℃에서 30분간 항온배양하여 유전체 DNA를 분리하였다. 세포 추출물을 혼합하여 PCR 플레이트로 옮긴 후 65℃에서 6분간, 98℃에서 2분간 항온배양하였다. PCR 반응은 AccuPrime™ Pfx DNA 폴리머라제 (Thermofisher, 12344024)를 사용하여 1 μl의 유전체 DNA 함유 용액으로 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 4분 (1x)에 이어서, 94℃에서 15초, 60℃에서 15초 및 60℃에서 1분 (40x)이었다. PCR 생성물을 정제한 다음 GENEWIZ에 의해 생어 시퀀싱을 수행하였다. 표적 부위에 걸쳐 있는 하기의 프라이머 쌍들을 PCR (FW, 정방향; RV, 역방향)에 사용하였다. 생어 시퀀싱에 사용된 프라이머는 별표(*)로 표시하였다.
[00509] AAVS1_FW: 5' ggacaaccccaaagtacccc 3' (서열번호 9)
[00510] AAVS1_RV*: 5' aggatcagtgaaacgcacca 3' (서열번호 10).
[00511] NAV1.7_FW*: 5' gccagtgggttcagtggtat 3' (서열번호 11).
[00512] NAV1.7_RV: 5' tcagcattatccttgcattttctgt 3' (서열번호 12).
[00513] 각 서열의 크로마토그램은 TIDE (분해에 의한 Indel의 추적, Tracking of Indels by Decomposition) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. (http://tide.nki.nl) (또한, 문헌 [Brinkman et al., Nucleic Acids Research, Volume 42, Issue 22, 16 December 2014, Pages e168]도 참조한다). 모의 전기천공된 샘플들을 기준 서열로 사용하였고, 파라미터들을 30 nt의 indel 크기에 맞추고, 분해 범위는 고품질의 추적으로 가능한한 큰 범위를 망라할 수 있도록 설정하였다. 총 indel (삽입 및 결실) 비율은 TIDE 플롯에서 직접 취하였다. HDR 비율은 10개의 뉴클레오타이드가 삽입된 사건들의 비율이었다. NHEJ 비율은 총 Indel 비율 - HDR 비율로 계산하였다. GraphPad Prism 7 소프트웨어를 사용하여 그래프를 만들고 모든 통계 정보를 계산하였다.
[00514] 실시예 2: DNA-PK 억제제는 BEC에서 HDR 유전자 편집 비율을 개선시킨다
[00515] 도 1은 하기 실시예에 사용된 유전자 편집 분석의 설계에 대하여 도시한 것이다. HDR 유전자 편집 비율에 대한 DNA-PK 억제제의 영향을 조사하기 위해, BEC를 spCAS9 mRNA, NAV1.7 sgRNA 및 NAV1.7 비-PAM ssODN으로 전기천공한 후, 서로 다른 농도의 화합물 1와 함께 항온배양하거나, 또는 처리하지 않은 상태(대조군)로 두었다. 유전자 편집 비율은 전기천공 후 72시간 째에 TIDE 분석을 사용하여 측정하였다. 유전자 편집 비율은 백분율로 나타냈으며 HDR 및 NHEJ로 분류하였다. 세포 생존율도 백분율로 나타내었으며, 이때 대조군 세포들을 100%로 설정하였다.
[00516] 도 2에 나타낸 바와 같이, 화합물 1의 DNA-PK 억제제는 BEC에서 유전자 편집 비율을 개선시킨다. 화합물 1의 경우, NHEJ IC50은 0.4450 μM이었고, HDR EC50은 0.4448 μM이었으며, HDR TOP%는 69.37이었다.
[00517] 실시예 3: DNA-PK 억제제는 CD34 + 세포에서 HDR 유전자 편집 비율을 개선시킨다
[00518] HDR 유전자 편집 비율에 대한 DNA-PK 억제제의 영향을 조사하기 위해, mPB CD34+ 세포들을 RNP (spCAS9 단백질 + NAV1.7 sgRNA) 및 NAV1.7 비-PAM ssODN으로 전기천공하였다. 다음으로, 세포들을 다양한 농도의 화합물 1를 사용하여 항온배양하였다. 유전자 편집 비율은 전기천공 후 48시간 째에 TIDE 분석을 사용하여 측정하였다. 유전자 편집 비율은 백분율로 나타내었으며, 도 3a (공여체 B) 및 도 3b (공여체 C)에 나타낸 바와 같이 HDR 및 NHEJ로 분류하였다. 세포 생존율도 백분율로 나타내었으며, 이때 대조군 세포들을 100%로 설정하였다.
[00519] 도 3a와 3b에 나타낸 바와 같이, 화합물 1의 DNA-PK 억제제는 CD34+ 세포에서 유전자 편집 비율을 개선시킨다. 공여제 B에서 HDR 및 Indel 형성에 대한 EC50 값은 각각 0.29 μM 및 0.35 μM이었다.
[00520] 실시예 4: DNA-PK 억제제는 iPSC에서 HDR 유전자 편집 비율을 개선시킨다
[00521] HDR 유전자 편집 비율에 대한 DNA-PK 억제제의 영향을 조사하기 위해, iPSC를 spCAS9 mRNA, AAVS1 sgRNA 및 AAVS1 PAM ssODN으로 전기천공한 후, 서로 다른 농도의 화합물 1와 함께 항온배양하거나, 또는 처리하지 않은 상태(대조군)로 두었다. 유전자 편집 비율은 전기천공 후 72시간 째에 TIDE 분석을 사용하여 측정하였다. 유전자 편집 비율은 백분율로 나타냈으며 HDR 및 NHEJ로 분류하였다. 세포 생존율도 백분율로 나타내었으며, 이때 대조군 세포들을 100%로 설정하였다.
[00522] 도 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 1의 DNA-PK 억제제는 iPSC에서 유전자 편집 비율을 개선시킨다. 화합물 1의 경우, NHEJ IC50은 0.474 μM이었고, HDR EC50은 0.3253 μM이었으며, HDR TOP%는 24.41이었다.
[00523] 실시예 5: EC max 에서 유전자 편집 동역학의 측정
[00524] ECmax에서 유전자 편집 동역학을 조사하기 위해, BEC를 spCAS9 mRNA, AAVS1 sgRNA 및 AAVS1 PAM ssODN으로 전기천공한 후, 서로 다른 시간대에서 10 μM의 화합물 1와 함께 항온배양하거나, 또는 처리하지 않은 상태(대조군)로 두었다. 유전자 편집 비율은 TIDE 분석을 사용하여 측정하여 HDR 및 NHEJ의 백분율로 나타내었다. 10 μM은 화합물 1의 최대 향상 농도 (ECmax)이다.
[00525] 도 5는 HDR과 NHEJ 사건들 간에 긴밀한 역의 상관관계가 있음을 보여주고 있다.
[00526] 실시예 6: EC 50 에서 유전자 편집 동역학의 측정
[00527] BEC를 spCAS9 mRNA, AAVS1 sgRNA 및 AAVS1 PAM ssODN으로 전기천공한 후, 서로 다른 시간대에서 0.7 μM의 화합물 1와 함께 항온배양하거나, 또는 처리하지 않은 상태(대조군)로 두었다. 유전자 편집 비율은 TIDE 분석을 사용하여 측정하여 HDR 및 NHEJ의 백분율로 나타내었다. 0.7 μM은 화합물 1의 향상 농도 50 (EC50)이다. 도 6은 BEC에서 HDR 및 NHEJ에 대한 DNA-PK 억제의 시간 경과를 도시한 것이다.
[00528] 실시예 7: DNA-PK 억제제는 BEC에서 유전자 편집 성분들이 지질 매개형 형질감염으로 전달될 때 HDR 비율을 개선한다
[00529] 지질 매개형 형질감염의 영향을 조사하기 위해, BEC를 spCAS9 mRNA, AAVS1 sgRNA 및 AAVS1 PAM ssODN으로 형질감염시킨 후, 서로 다른 농도의 화합물 1와 함께 항온배양하거나, 또는 처리하지 않은 상태(대조군)로 두었다. 유전자 편집 비율은 형질감염 후 72시간 째에 TIDE 분석을 사용하여 측정하였다. 도 7은 지질 기반 형질감염에 의해 전달되는 화합물 1의 농도가 증가함에 따라 HDR 효율이 증가함을 보여주고 있다.
[00530] 요약:
[00531] DNA-PK 억제제를 다양한 세포 유형 및 유전자좌에 첨가한 결과, 해당 세포 유형과 유전자좌 전반에 걸쳐 HDR이 현저하게 향상되었음을 알 수 있었다. HDR 유전자 편집의 향상은 BEC, iPSC, CD34+ HPSC (3개의 개별 공여체)를 비롯한 다수의 세포 유형들에서 나타났다. HDR 유전자 편집의 향상은 AAVS1.1, NaV1.7를 비롯한 다수의 유전자좌에서 나타났다. 또한, 상기 실험 결과로 지질 기반 전달과 전기 천공 전달이 효과적이라는 것도 알 수 있었다. 전기천공의 예에는 BEC, iPSC, CD34+ HPSC, 및 BEC에서 지질 기반 전달 시스템을 이용한 유효 전달이 포함된다. HDR과 NHEJ 사건들 간의 긴밀한 역 상관관계는 유전자좌, 실험 조건 및 세포 유형 전반에 걸쳐 관찰되었다.
[00532] 요약표: DNA-PK 억제제는 HDR 구동형 유전자 편집을 개선한다
Figure pct00177
균등물
[00533] 본 발명을 바람직한 실시예들에 대해서 구체적으로 보여주면서 설명하였지만, 당업계의 통상의 기술자라면 누구나 첨부된 특허청구범위에 의해 규정되는 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 그 형태 및 세부사항에 대하여 다양한 변화를 가할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 당업계의 통상의 기술자라면 누구나 통상적인 실험만을 이용하여도 본원에 구체적으로 기술되는 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 여러가지 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물들도 특허청구항의 범위에 포함시키고자 한다.
<110> Vertex Pharmaceuticals Incorporated MAHAJAN, Sudipta WEINBERG, Marc Saul D'ASTOLFO, Diego Sebastian COTTRELL, Kevin M. MORRIS, Mark A. MAXWELL, John Patrick <120> DNA-PK INHIBITORS <130> 67573-303726 <140> PCT/US2019/013785 <141> 2019-01-16 <150> US 62/618,385 <151> 2018-01-17 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 target site <400> 1 accccacagt ggggccacta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAV1.7 target <400> 2 ggctgagcgt ccatcaacca 20 <210> 3 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 sgRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (97)..(99) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <400> 3 accccacagu ggggccacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 4 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAV1.7 sgRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (97)..(99) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <400> 4 ggcugagcgu ccaucaacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 PAM <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (87)..(89) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <400> 5 gggtactttt atctgtcccc tccaccccac agtggggcca gaattctcag ctagggacag 60 gattggtgac agaaaagccc catccttagg 90 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 Non-PAM <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (87)..(89) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <400> 6 cctaaggatg gggcttttct gtcaccaatc ctgtccctag ctgagaattc tggccccact 60 gtggggtgga ggggacagat aaaagtaccc 90 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAV1.7 PAM <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (87)..(89) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <400> 7 agctgtccat tggggagcat gagggctgag cgtccatcaa ctgagaattc ccagggagac 60 cacaccgttg cagtccacag cactgtgcat 90 <210> 8 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAV1.7 Non-PAM <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (87)..(89) <223> 2'-O-methyl 3'-phosphorothioate <400> 8 atgcacagtg ctgtggactg caacggtgtg gtctccctgg gaattctcag ttgatggacg 60 ctcagccctc atgctcccca atggacagct 90 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 FW <400> 9 ggacaacccc aaagtacccc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 RV <400> 10 aggatcagtg aaacgcacca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAV1.7 FW <400> 11 gccagtgggt tcagtggtat 20 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAV1.7 RV <400> 12 tcagcattat ccttgcattt tctgt 25

Claims (75)

  1. 화학식 (I)의 화합물:
    [화학식 I]
    Figure pct00178

    상기 식에서, m과 n은 독립적으로 1 또는 2이고;
    X는 O 또는 NR이고; 여기서 R은 H 또는 C1-C4 알킬이며;
    Y는 결합, O 또는 NR이고; 여기서 R은 H 또는 C1-C4-알킬이고;
    R1은 C1-C4 알킬이며;
    R2는
    a) N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 고리로서, 상기 아릴 및 헤테로아릴 고리가 CN, 할로, C1-C4-알킬, C3-C6 사이클로알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시, C(=O)NHR1' (여기서, R1'는 C1-C4 알킬임), 및 5원 또는 6원 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴 고리 (여기서, 각 고리는 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유함)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환기 R3으로 치환될 수 있거나; 또는 상기 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기가 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 또는 6원 고리를 형성할 수 있는, 상기 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 고리; 또는
    b) COOR4 (여기서, R4가 C1-C4-알킬 또는 벤질임)이고;
    여기서, C1-C4-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시 및 C1-C4-할로알콕시는 각각 OR5 또는 NR6R7로 추가로 치환될 수 있으며, 이 경우, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-C4 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이거나; 또는 R6과 R7, 및 이들이 부착되는 질소 원자는 N, O 및 S로부터 선택된 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있는 포화 5원 또는 6원 고리를 형성할 수 있고, 여기서 상기 고리는 C1-C4-알킬에 의해 추가로 치환될 수 있으며;
    고리 A는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    Figure pct00179
    ,
    Figure pct00180
    ,
    Figure pct00181
    , 및
    Figure pct00182
    ;
    여기서, W는 N 또는 CR3이고; Z는 O 또는 S이며; 여기서 R3은 H 또는 C1-C4 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서,
    R2는 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고, 상기 아릴 및 헤테로아릴 고리가 CN, 할로, C1-C4-알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'(여기서, R1'는 C1-C4 알킬임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1 또는 2개의 치환기 R3으로 치환될 수 있거나; 또는 상기 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기가 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있는 것인, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2이
    Figure pct00183
    ,
    Figure pct00184
    ,
    Figure pct00185
    또는
    Figure pct00186
    이고; 여기서, #은 R2가 상기 화학식 (I)의 화합물의 나머지 부분에 연결된 위치를 의미하며;
    o는 0, 1 또는 2인 것인, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물을 하기 구조식 (II), 구조식 (II'), 구조식 (II") 또는 구조식 (II"')로 나타내는 것인, 화합물:
    Figure pct00187
    (II),
    Figure pct00188
    (II'),
    Figure pct00189
    (II") 또는
    Figure pct00190
    (II"').
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, m과 n이 각각 2인 것인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 메틸인 것인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R2가
    Figure pct00191
    또는
    Figure pct00192
    인 것인, 화합물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, m과 n이 각각 2이고, Y는 결합이며, R1은 메틸이며, R2는 COOR4이고, R4는 C1-C4-알킬 또는 벤질인 것인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A가
    Figure pct00193
    인 것인, 화합물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A가
    Figure pct00194
    인 것인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A가
    Figure pct00195
    인 것인, 화합물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A가
    Figure pct00196
    인 것인, 화합물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물을 구조식 (III), 구조식 (III'), 구조식 (III") 또는 구조식 (III"')로 나타내는 것인, 화합물:
    Figure pct00197
    (III),
    Figure pct00198
    (III'),
    Figure pct00199
    (III") 또는
    Figure pct00200
    (III"').
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, o는 0, 1 또는 2이고, R3은 각각 CN, 할로, NO2, C1-C2-알킬, C1-C4-할로알킬, C1-C2-알콕시, C1-C2-할로알콕시 및 C(=O)NHR1'(여기서, R1'는 C1-C2 알킬임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 탄소 원자들에 연결된 2개의 R3 기가 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자를 함유할 수 있는 융합된 5원 고리를 형성할 수 있는 것인, 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 화합물들로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00201

    Figure pct00202

    Figure pct00203

    Figure pct00204

    Figure pct00205

    Figure pct00206

    Figure pct00207

    Figure pct00208

    Figure pct00209
  17. 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 편집하는 방법으로서, 상기 방법이
    유전체 편집 시스템 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을, 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 포함하는 하나 이상의 세포에 투여하는 단계를 포함하여,
    상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 편집하는 것인, 방법.
  18. 상동성 지향 복구 (HDR, homology directed repair) 경로를 통해 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 DNA 절단(break)을 복구하는 방법으로서,
    유전체 편집 시스템 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을, 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 포함하는 하나 이상의 세포에 투여하는 단계를 포함하여,
    상기 유전체 편집 시스템이 상기 표적 유전체 영역들의 핵산(들)과 상호작용하여 DNA 절단을 유도하고, 상기 DNA 절단은 HDR 경로를 통해 적어도 부분적으로 복구되는 것인, 방법.
  19. 비상동성 말단 접합 (NHEJ, non-homologous end joining) 경로를 통해 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 DNA 절단의 복구를 억제 또는 저해하는 방법으로서,
    유전체 편집 시스템 및 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을, 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 포함하는 하나 이상의 세포에 투여하는 단계를 포함하여,
    상기 유전체 편집 시스템이 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 핵산(들)과 상호작용하여 DNA 절단을 유도하고, NHEJ 경로를 통한 DNA 절단의 복구가 억제 또는 저해되는 것인, 방법.
  20. 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 변형시키는 방법으로서,
    유전체 편집 시스템 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을, 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 포함하는 하나 이상의 세포에 투여하는 단계를 포함하여,
    상기 유전체 편집 시스템이 상기 표적 유전자(들)의 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 핵산(들)과 상호작용하여 상기 하나 이상의 표적 유전체 영역들의 편집을 유도하고, 상기 편집이 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현을 변형시키는 것인, 방법.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 DNA 절단이 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 포함하는 것인, 벙법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포에서 표적 유전체 영역들의 편집 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 증가되는 것인, 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포의 표적 유전체 영역들에서 HDR 경로를 통한 DNA 절단 복구의 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 증가되는 것인, 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포의 표적 유전체 영역들에서 NHEJ 경로를 통한 DNA 절단 복구를 억제 또는 저해하는 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 증가되는 것인, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효율은, 상기 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고 다른 조건들이 동일한 세포(들)에서의 효율에 비해 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 증가되는 것인, 방법.
  26. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효율이 표적화된 폴리뉴클레오타이드 통합의 빈도수에 의해 측정되는 것인, 방법.
  27. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효율이 표적화된 돌연변이 유발의 빈도수에 의해 측정되는 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 표적화된 돌연변이 유발이 점 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 것인, 방법.
  29. 제20항에 있어서, 상기 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현이, 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 증가되는 것인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 발현이 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배 또는 10배 증가되는 것인, 방법.
  31. 제20항에 있어서, 상기 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현은, 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 감소되는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유전자 발현이 투여 전 상기 하나 이상의 세포에서의 기준 발현 수준에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 감소되는 것인, 방법.
  33. 제20항에 있어서, 상기 표적 유전자(들)에 연결된 후속 유전자(들) 및/또는 단백질(들)의 발현이, 상기 하나 이상의 세포에서 실질적으로 제거되는 것인, 방법.
  34. 제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 S 또는 G2 세포 주기 단계에서 동기화하는 것인, 방법.
  35. 제17항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물을 투여하거나 상기 화합물과 접촉시킨 상기 하나 이상의 세포들은, 상기 화합물을 투여하지 않거나 상기 화합물과 접촉시키지 않은 하나 이상의 세포들에 비해 생존율이 증가된 것인, 방법.
  36. 제17항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 상기 하나 이상의 세포에 동시에 투여하는 것인, 방법.
  37. 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 상기 하나 이상의 세포에 순차적으로 투여하는 것인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템을 상기 화합물보다 먼저 상기 하나 이상의 세포에 투여하는 것인, 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 화합물을 상기 유전체 편집 시스템보다 먼저 상기 하나 이상의 세포에 투여하는 것인, 방법.
  40. 제17항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 배양된 세포인 것인, 방법.
  41. 제17항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 유기체 내의 생체내 세포인 것인, 방법.
  42. 제17항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 유기체 유래의 생체외 세포인 것인, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 유기체가 포유동물인 것인, 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 유기체가 인간인 것인, 방법.
  45. 제17항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 동일한 경로를 통해 투여하는 것인, 방법.
  46. 제17항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템과 상기 화합물을 서로 다른 경로를 통해 투여하는 것인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템을 정맥내 투여하고 상기 화합물을 경구 투여하는 것인, 방법.
  48. 제17항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 기반 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템으로부터 선택되는 것인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 CRISPR 기반 시스템인 것인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 CRISPR 기반 시스템이 CRISPR-Cas 시스템 또는 CRISPR-Cpf 시스템인 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 CRISPR 기반 시스템이 CRISPR-Cas 시스템이고, 상기 CRISPR-Cas 시스템이 (a) (i) 표적화 RNA로서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 표적화 RNA; 및 (ii) 활성화 RNA로서, 상기 표적화 RNA와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 활성화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 활성화 RNA를 포함하는, 적어도 하나의 가이드 RNA 성분; 및 (b) Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는, Cas 단백질 성분을 포함하는 것인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 표적화 RNA 및 활성화 RNA가 단일 분자로서 융합되는 것인, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 II형 Cas9 단백질인 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 Cas9 단백질이 SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 또는 D10A 니카제, 또는 이들의 임의의 조합인 것인, 방법.
  55. 제50항에 있어서, 상기 CRISPR 기반 시스템이 CRISPR-Cpf 시스템이고, 상기 CRISPR-Cpf 시스템이 (a) 적어도 하나의 가이드 RNA 성분 또는 상기 가이드 RNA 성분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산으로서, 상기 가이드 RNA가 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 RNA를 포함하는 것인, 상기 가이드 RNA 성분 또는 핵산; 및 (b) Cpf 단백질 또는 상기 Cpf 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, Cpf 단백질 성분을 포함하는 것인, 방법.
  56. 제17항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 하나 이상의 벡터에 의해 전달되는 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터가 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 ssDNA로부터 선택되는 것인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 단순 포진 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  59. 제17항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 합성 DNA에 의해 전달되는 것인, 방법.
  60. 제17항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 나노제제에 의해 전달되는 것인, 방법.
  61. 하나 이상의 표적 유전체 영역들을 편집하기 위한 키트 또는 조성물로서,
    유전체 편집 시스템; 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 공결정을 포함하는 것인, 키트 또는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 메가뉴클레아제 기반 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기반 시스템, 전사 활성화제 유사 효과기 기반 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, CRISPR 기반 시스템 또는 NgAgo 기반 시스템인 것인, 키트 또는 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 CRISPR 기반 시스템인 것인, 키트 또는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 CRISPR 기반 시스템이 CRISPR-Cas 시스템 또는 CRISPR-Cpf 시스템인 것인, 키트 또는 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 CRISPR 기반 시스템이 CRISPR-Cas 시스템이고, 상기 CRISPR-Cas 시스템이 (a) (i) 표적화 RNA로서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 표적화 RNA; 및 (ii) 활성화 RNA로서, 상기 표적화 RNA와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 활성화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 활성화 RNA를 포함하는, 적어도 하나의 가이드 RNA 성분; 및 (b) Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는, Cas 단백질 성분을 포함하는 것인, 키트 또는 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 II형 Cas9 단백질인 것인, 키트 또는 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 Cas9 단백질이 SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 또는 D10A 니카제, 또는 이들의 임의의 조합인 것인, 키트 또는 조성물.
  68. 제64항에 있어서, 상기 CRISPR 기반 시스템이 CRISPR-Cpf 시스템이고, 상기 CRISPR-Cpf 시스템이 (a) 표적화 RNA로서, 하나 이상의 표적 유전체 영역의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 표적화 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함하는 것인, 상기 표적화 RNA; 및 (b) Cpf 단백질 또는 상기 Cpf 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, Cpf 단백질 성분을 포함하는 것인, 키트 또는 조성물.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 하나 이상의 벡터 중에 포함되거나 패키징되는 것인, 키트 또는 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터가 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 ssDNA로부터 선택되는 것인, 키트 또는 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 단순 포진 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 키트 또는 조성물.
  72. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  73. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료제 또는 DNA 병변을 유도하는 질병 상태에 상기 세포를 감작시키는 방법.
  74. 환자의 암 치료를 위한 치료 요법을 강화하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  75. 환자의 암을 치료하거나 암세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 단독으로 투여하거나, 또는 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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