JP2021511312A - ゲノム編集効率を増加するためのキノキサリノン化合物、組成物、方法、およびキット - Google Patents

ゲノム編集効率を増加するためのキノキサリノン化合物、組成物、方法、およびキット Download PDF

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Abstract

標的ゲノム領域（複数可）を編集する化合物、標的ゲノム領域（複数可）を編集する方法、ＨＤＲ経路を介してＤＮＡ切断を修復する方法、ＮＨＥＪ経路を介したＤＮＡ切断の修復を阻害もしくは抑制する方法、および遺伝子（複数可）またはタンパク質（複数可）の発現を改変する方法は、１つまたは複数の標的ゲノム領域を含む１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび本明細書に開示されるＤＮＡタンパク質−キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）阻害剤を投与することを含む。標的遺伝子を編集するためのキットおよび組成物は、ゲノム編集システムおよび本明細書に開示されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１７日出願の米国仮特許出願第６２／６１８，３８５号の利益を主張するものであり、その内容全体は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１９年１月１６日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、１４３９０−６８７配列表＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズが４ＫＢである。
本発明は、一般に、ＤＮＡタンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）阻害剤およびゲノム編集システムを細胞（複数可）に投与することによってゲノム編集効率を増加するための、化合物、組成物、方法、およびキットに関する。
遺伝的変異の体系的操作を可能にするために正確なゲノム標的化技術が必要とされる。ゲノム編集システム、具体的にはＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼベースのゲノム編集技術の使用は、過去数年で指数関数的に成長した。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９細菌性先天免疫系は、ヒトゲノムの標的化された改変のための有効なゲノム編集ツールとして出現した（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ， Ｂ． ２０１２、Ｈｓｕ， Ｐ．Ｄ． ｅｔａ． ２０１４）。近年になって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆゲノム編集システムが記載されている。ＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼベースのゲノム編集は、ＤＮＡ二本鎖切断を修復するのに、部分的に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、および相同組換え修復（ＨＤＲ）経路に依存する。細胞の修復機序は、ＨＤＲよりもＮＨＥＪを好む。
ＮＨＥＪからの挿入または欠失（インデル）の達成は一部の報告では７０％まで有効であるが、ＨＤＲの効率は、１％未満の割合で困難なままである。
したがって、ゲノム編集効率、特にＨＤＲ効率を増加させる必要がある。
本発明は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を使用してＤＮＡ−ＰＫなどのＮＨＥＪ酵素を抑制することによりＨＤＲ効率を改善することができる。
一部の実施形態では、本開示は、構造式（Ｉ）によって表される化合物
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を提供する。
ｍおよびｎは、独立して、１または２である。
Ｘは、ＯまたはＮＲであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４−アルキルである。
Ｙは、結合、Ｏ、またはＮＲであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４−アルキルである。
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。
Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１個もしくは２個のヘテロ原子を含有する５員もしくは６員のアリールもしくはヘテロアリール環（ここで、アリールおよびヘテロアリール環は、ＣＮ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルコキシ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’、および５員もしくは６員のヘテロシクロアルキルもしくはヘテロアリール環からなる群から独立して選択される０、１、２もしくは３個の置換基Ｒ３によって置換されていてよく、各環は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含有し、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、またはアリールもしくはヘテロアリール環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員もしくは６員の縮合環を形成することができる）、またはＣＯＯＲ４（ここで、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである）である。
各Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ４−ハロアルコキシは、ＯＲ５またはＮＲ６Ｒ７でさらに置換されていてよい。
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、またはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルである。
Ｒ６およびＲ７、ならびにそれらが結合する窒素原子は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される０個または１個のさらなるヘテロ原子を含有し得る５員または６員の飽和環を形成することができ、環は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルによってさらに置換されていてよい。
環Ａは、
Figure 2021511312
 からなる群から選択される。
Ｗは、ＮまたはＣＲ３であり、Ｚは、ＯまたはＳであり、Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
一部の実施形態では、本開示は、Ｒ２が、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１個もしくは２個のヘテロ原子を含有する５員もしくは６員の芳香族もしくは芳香族複素環（ここで、芳香族もしくは芳香族複素環は、ＣＮ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択される０、１もしくは２個の置換基Ｒ３によって置換されていてよく、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、または芳香族もしくは芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる）、またはＣＯＯＲ４（ここで、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである）である、構造式（Ｉ）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を提供する。
一部の実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（Ｉ）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
一部の実施形態では、化合物は、構造式（ＩＩ）、構造式（ＩＩ’）、構造式（ＩＩ’’）もしくは構造式（ＩＩ’’’）によって表されるか、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶である。
一部の実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 からなる群から選択され、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、構造式（ＩＩＩ）、構造式（ＩＩＩ’）、構造式（ＩＩＩ’’）、または構造式（ＩＩＩ’’’）によって表される。
Figure 2021511312
一部の実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）または式（ＩＩＩ’’’）の構造を有する化合物、およびアジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸または安息香酸から選択される共結晶形成剤を含む、共結晶である。
本開示はまた、１つまたは複数の標的ゲノム領域を編集する方法であって、１つまたは複数の標的ゲノム領域を有する１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の標的ゲノム領域を編集する方法であって、１つまたは複数の標的ゲノム領域を有する１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示はまた、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を介して１つまたは複数の標的ゲノム領域のＤＮＡ切断を修復する方法であって、１つまたは複数の標的ゲノム領域を有する１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含む、方法を提供する。
ゲノム編集システムは、標的ゲノム領域の核酸（複数可）と相互作用して、ＤＮＡ切断をもたらし、ＤＮＡ切断は、ＨＤＲ経路を介して少なくとも部分的に修復される。
本開示はまた、ＮＨＥＪ経路を介した１つまたは複数の標的ゲノム領域におけるＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する方法であって、１つまたは複数の標的ゲノム領域を有する１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含む、方法を提供する。
ゲノム編集システムは、１つまたは複数の標的ゲノム領域の核酸（複数可）と相互作用して、ＤＮＡ切断をもたらし、ＮＨＥＪ経路を介したＤＮＡ切断の修復は、阻害または抑制される。
本開示はまた、１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質の発現を改変する方法であって、１つまたは複数の標的ゲノム領域を含む１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含む、方法を提供する。
ゲノム編集システムは、標的遺伝子（複数可）の１つまたは複数の標的ゲノム領域の核酸（複数可）と相互作用して、１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集をもたらし、編集は、標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現を改変する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を含む。
一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）または式（ＩＩＩ’’’）の構造を有する化合物、およびアジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸または安息香酸から選択される共結晶形成剤を含む、共結晶である。
図１は、遺伝子編集アッセイの設計を表している。
図２は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤で処置したＢＥＣにおける遺伝子編集率を示すグラフである。
図３Ａおよび３Ｂは、２人の異なるドナーからのＣＤ３４＋細胞におけるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤での処置後の遺伝子編集率を示すグラフである。
図４は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤で処置したｉＰＳＣにおける遺伝子編集率を示すグラフである。
図５は、ＢＥＣにおける、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤のＥＣｍａｘでの遺伝子編集速度を示すグラフである。
図６は、ＢＥＣにおける、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤のＥＣ５０での遺伝子編集速度を示すグラフである。
図７は、ＢＥＣにおいて脂質媒介トランスフェクションにより送達された遺伝子編集構成成分に対するＨＤＲ比率を示す棒グラフである。
別段定義されない限り、本開示と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。一般的に、本明細書に記載されている細胞および組織培養物、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリッド形成に関連して利用される命名法、およびこれらの技術は周知であり、当技術分野で共通して使用されている。標準的技術が組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および変換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に対して使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従いもしくは当技術分野で共通して達成されているようにまたは本明細書に記載されているように実施される。前述の技術および手順は一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従い、ならびに本開示全体にわたり引用および論じられている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医化学および薬品化学と関連して利用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。標準技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、および送達、および患者の処置のために使用される。一般に、化学元素は、元素周期表、ＣＡＳバージョン、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ７５ｔｈ Ｅｄ． １９９４に従い特定される。さらに、有機化学の一般的原理は、その全内容がこれにより参照により本明細書に組み込まれる”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ， Ｓａｕｓａｌｉｔｏ： １９９９および”Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｍａｒｃｈ， Ｊ．， ｅｄｓ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ２００１に記載されている。本開示に従って利用される通り、本開示で定義される用語は、別段示されない限り、本明細書で定義される意味を有すると理解されるべきである。
一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞において標的ゲノム領域を編集する効率は、化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して増加する。
一部の実施形態では、ＨＤＲ経路を介した１つまたは複数の細胞の標的ゲノム領域におけるＤＮＡ切断の修復の効率は、化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して増加する。
一部の実施形態では、ＮＨＥＪ経路を介した１つまたは複数の細胞の標的ゲノム領域におけるＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する効率は、化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して増加する。
一部の実施形態では、効率は、化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍増加する。
一部の実施形態では、効率は、標的化されたポリヌクレオチド組込みの頻度により測定される。一部の実施形態では、効率は標的化された突然変異導入の頻度により測定される。一部の実施形態では、標的化された突然変異導入は、点突然変異、欠失、および／または挿入を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現は、投与前の１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して増加する。例えば、前記発現は、投与前の１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、または１０倍増加する。
一部の実施形態では、標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現は、投与前の１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して低減する。例えば、遺伝子発現は、投与前の１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低減する。
一部の実施形態では、標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現は、１つまたは複数の細胞において実質的に消失する。
一部の実施形態では、細胞は、ＳまたはＧ２細胞周期フェーズにおいて同期化される。
一部の実施形態では、前記化合物を投与されたまたは接触させられた１つまたは複数の細胞は、前記化合物を投与されても、接触させられてもいない１つまたは複数の細胞と比較して生存期間の増加を有する。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムおよび化合物は、１つまたは複数の細胞に同時に投与される。一部の実施形態では、ゲノム編集システムおよび化合物は、１つまたは複数の細胞に逐次的に投与される。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、化合物の前に１つまたは複数の細胞に投与される。一部の実施形態では、化合物は、ゲノム編集システムの前に１つまたは複数の細胞に投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は培養細胞である。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は生物内のｉｎ ｖｉｖｏ細胞である。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は生物由来のｅｘ ｖｉｖｏ細胞である。
一部の実施形態では、生物は哺乳動物である。一部の実施形態では、生物はヒトである。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムおよび化合物は、同じ経路を介して投与される。一部の実施形態では、ゲノム編集システムおよび化合物は、異なる経路を介して投与される。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、静脈内投与され、化合物は、経口投与される。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、メガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム、またはＮｇＡｇｏベースのシステムから選択される。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムである。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、（ａ）以下を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメント：（ｉ）１つもしくは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、またはターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、（ｉｉ）およびターゲッターＲＮＡとのハイブリッド形成が可能なヌクレオチド配列を含むアクチベーターＲＮＡ、またはアクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、ならびに（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質エレメントまたはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、ターゲッターＲＮＡおよびアクチベーターＲＮＡは、単一分子として融合される。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ｎ、Ｃａｓ９−ＨＦ、Ｃａｓ９−Ｈ８４０Ａ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、またはＤ１０Ａニッカーゼ、またはこれらの任意の組合せである。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムであり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムは、（ａ）少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメントまたはガイドＲＮＡエレメントをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸であって、ガイドＲＮＡが１つまたは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡエレメントまたは核酸、および（ｂ）Ｃｐｆタンパク質を含むＣｐｆタンパク質エレメントまたはＣｐｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、１つまたは複数のベクターにより送達される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、またはｓｓＤＮＡから選択される。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスのベクターから選択される。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、合成ＲＮＡにより送達される。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、ナノ製剤により送達される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ゲノム領域を編集するためのキットまたは組成物が提供される。一部の実施形態では、キットまたは組成物は、ゲノム編集システム、および
構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を含む。一部の実施形態では、キットまたは組成物の化合物は、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、式（ＩＩＩ’’’）によって表されるか、または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶であり、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、水素または重水素である。
一部の実施形態では、キットまたは組成物のゲノム編集システムは、メガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム、またはＮｇＡｇｏベースのシステムである。一部の実施形態では、キットまたは組成物のゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムである。一部の実施形態では、キットまたは組成物のＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムである。
一部の実施形態では、キットまたは組成物のＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、（ａ）以下を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメント：（ｉ）１つもしくは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、またはターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、（ｉｉ）およびターゲッターＲＮＡとのハイブリッド形成が可能なヌクレオチド配列を含むアクチベーターＲＮＡ、またはアクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、ならびに（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質エレメントまたはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、キットまたは組成物のＣａｓタンパク質はＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、キットまたは組成物のＣａｓ９タンパク質は、ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ｎ、Ｃａｓ９−ＨＦ、Ｃａｓ９−Ｈ８４０Ａ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、もしくはＤ１０Ａニッカーゼ、またはこれらの任意の組合せである。
一部の実施形態では、キットまたは組成物のＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムであり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムは、（ａ）１つもしくは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、またはターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、および（ｂ）Ｃｐｆタンパク質を含むＣｐｆタンパク質エレメントまたはＣｐｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、キットまたは組成物のゲノム編集システムは、１つまたは複数のベクターに含まれるまたはパッケージされる。一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、またはｓｓＤＮＡから選択される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスのウイルスベクターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、キットまたは組成物の化合物は、表１から選択される化合物を含む。
一部の実施形態では、キットまたは組成物の化合物は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）または式（ＩＩＩ’’’）の構造を有する化合物、およびアジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸または安息香酸から選択される共結晶形成剤を含む、共結晶である。
一部の実施形態では、キットまたは組成物の化合物は、（ａ）表１から選択される化合物および（ｂ）アジピン酸を含む、共結晶である。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下に続く詳細な説明で明らかとなる。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すものではあるが、制限としてではなく、単に例示により付与されることを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変化および改変が詳細な説明から当業者に明らかとなる。
一部の実施形態では、本開示は、例えば突然変異を補正することによって、標的ゲノムを編集するための方法、組成物およびキットを提供する。このような方法、組成物およびキットは、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を使用することによって、ゲノム編集効率を増加することができる。
ゲノム編集システムは、例えば、ゲノム内の所望の遺伝子座（または標的ゲノム領域）のＤＳＢ（複数可）においてＤＮＡ切断（複数可）を刺激または誘発することができる。ＤＮＡ切断の生成は、細胞酵素が、エラーが生じやすいＮＨＥＪ経路またはエラーのないＨＤＲ経路のいずれかを介して、切断部位を修復することを促す。ＮＨＥＪでは、ＤＮＡ傷害は、Ｋｕ７０／８０ヘテロ二量体およびＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）酵素が関与する一連の酵素的プロセスにおいてＤＮＡ切断の２つの末端を融合することにより修復される。修復機序は、２つのＤＮＡ末端のテザリングおよびアライメント、切除、伸長およびライゲーションを含み（Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ； Ｄｅｘｈｅｉｍｅｒ Ｔ． ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｉｎ： Ｍａｔｈｅｗｓ Ｌ， Ｃａｂａｒｃａｓ Ｓ， Ｈｕｒｔ Ｅ， ｅｄｉｔｏｒｓ． ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ； ２０１３． ｐ．１９−３２．）、これは、切断部位に小さな挿入または欠失突然変異（インデル）を形成する。遺伝子のコード配列に導入されたインデルは、未成熟停止コドンまたはフレーム−シフト突然変異のいずれかを引き起こす可能性があり、これが非機能性の、末端切断型タンパク質の産生をもたらす。ＨＤＲ経路の機序はあまり理解されておらず、これには、塩基挿入または遺伝子置換えのためのドナー修復鋳型による鎖侵入を刺激するＲａｄ５１などの異なるセットの修復タンパク質が関与している。したがって、ＨＤＲは、外来性ＤＮＡ鋳型を導入し、ゲノム内で所望のＤＮＡ編集結果を得ることを可能にし、翻訳疾患モデリングおよび遺伝子機能を回復するための治療的ゲノム編集のための強力な戦略であり得る。
２つのＤＮＡ修復経路のうち、ＮＨＥＪははるかに高い頻度で生じ、ニューロンにおいてさえ、７０％より高い効率を達成することができることが報告されている（Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９”， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５ Ｊａｎ； ３３（１）：１０２−６２０１４）。しかし、ＨＤＲによる遺伝子補正は、ＤＮＡ複製が完了し、姉妹染色分体が修復鋳型として機能するために利用可能である場合、非常に低い頻度で、ＳおよびＧ２フェーズの間に生じる（Ｈｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４４：１１３−１３９， ２０１０）。ＮＨＥＪは細胞周期を通して起き、ＳおよびＧ２フェーズの間にはＨＤＲと競合しＨＤＲよりも好かれるため、ＨＤＲ経路を介した標的化された挿入には難題が依然として残されており、継続した研究の焦点となっている。
ＤＮＡタンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）は、様々なＤＮＡ修復プロセスにおいてある役割を演じる。ＤＮＡ−ＰＫは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の活性化を介してＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する。ＮＨＥＪは、３つのステップ；ＤＳＢの認識、ライゲーション不可能な末端または末端における他の形態の損傷を除去するためのＤＮＡプロセシング、最後にＤＮＡ末端のライゲーションを介して進行すると考えられる。ＤＳＢの認識は、ちぎれた（ｒａｇｇｅｄ）ＤＮＡ末端へのＫｕヘテロ二量体の結合、これに続く、ＤＳＢに隣接する側面へのＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃまたはＤＮＡ−ＰＫ）の２個の分子の動員により行われる。これは、追加のプロセシング酵素が動員されるまで切断された末端を保護する働きをする。最近のデータは、ＤＮＡ−ＰＫｃがプロセシング酵素、Ａｒｔｅｍｉｓ、ならびにそれ自体をリン酸化して、追加のプロセシングのためのＤＮＡ末端を準備するという仮説を支持している。場合によっては、ライゲーションステップ前に新規末端を合成するためのＤＮＡポリメラーゼが必要とされ得る。ＤＮＡ−ＰＫｃの自己リン酸化は、中央のＤＮＡ結合空洞を開き、ＤＮＡからＤＮＡ−ＰＫｃを放出し、ＤＮＡ末端の最終的な再ライゲーションを促進する立体配座変化を誘発すると考えられている。
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のＣＲＩＳＰＲベースのＨＤＲによる修復を含む、ゲノム編集システムにおける、遺伝子編集を増強するための、特にＨＤＲ経路を介したＤＮＡ切断（複数可）の修復効率、またはＮＨＥＪ経路を介したＤＮＡ切断（複数可）の修復の阻害もしくは抑制の効率を増加させるための方法、組成物、およびキットを提供する。特定の理論に拘束されるわけではないが、細胞（複数可）に投与されるゲノム編集システムは、標的遺伝子の核酸（複数可）と相互作用し、ＤＮＡ切断をもたらすまたは引き起こす；このようなＤＮＡ切断は、いくつかの修復経路、例えば、ＨＤＲにより修復され、細胞（複数可）に投与されたＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はＮＨＥＪ修復経路を阻害、遮断、または抑制し、ＨＤＲによるＤＮＡ修復経路の頻度または効率を増加または促進することができると考えられている。
ゲノム編集システムと標的遺伝子の核酸（複数可）との間の相互作用は、ゲノム編集システムの少なくとも一部の、標的遺伝子の核酸（複数可）とのハイブリッド形成、またはゲノム編集システムによる標的遺伝子の核酸（複数可）の他の任意の認識であり得る。一部の実施形態では、このような相互作用は、タンパク質−ＤＮＡ相互作用または塩基対間のハイブリッド形成である。
一部の実施形態では、本開示は、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することによる、細胞（複数可）内に１つまたは複数の標的ゲノム領域を編集する方法を提供する。編集は同時にまたは逐次的に行うことができる。１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集は、任意の種類の遺伝子操作または細胞ゲノムの操作を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集は、細胞（複数可）内でのゲノム領域の挿入、欠失、または置換えを含むことができる。ゲノム領域は、細胞（複数可）内の遺伝物質、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを含む。細胞（複数可）内のゲノム領域はまた、細胞（複数可）内に含有されるミトコンドリアまたは葉緑体のゲノムも含む。
一部の実施形態では、挿入、欠失または置換えは、コーディングまたは非コーディングゲノム領域内、イントロンもしくはエクソン領域内、またはこれらの重複もしくは非重複セグメントを含むこれらの任意の組合せのいずれかに存在し得る。本明細書で使用される場合、「非コーディング領域」とは、アミノ酸配列をコードしないゲノム領域を指す。例えば、非コーディング領域はイントロンを含む。コーディング領域とはアミノ酸配列をコードするゲノム領域を指す。例えば、コーディング領域はエクソンを含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集は、細胞（複数可）のゲノム内の任意の１つまたは複数の標的領域の中で生じ得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集は、例えば、エクソン、イントロン、転写開始部位、プロモーター領域、エンハンサー領域、サイレンサー領域、インスレーター領域、抗リプレッサー、翻訳後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル（例えば最小のポリＡ）、保存領域、転写因子結合部位、またはこれらの任意の組合せにおいて生じ得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムを細胞（複数可）に投与すると、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、標的化されたゲノム編集効率の増加が結果として生じる。一部の実施形態では、編集効率の増加は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、または細胞（複数可）にゲノム編集システムのみが投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されない条件と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍である。ゲノム編集効率は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、標的化されたポリヌクレオチド組込みの頻度を確定する任意の方法により、または標的化された突然変異導入の頻度を測定することにより測定することができる。標的化されたポリヌクレオチド組込みはまた、ゲノム、染色体または細胞クロマチン中の目的の領域内で配列の変更または置換えをもたらすこともできる。標的化されたポリヌクレオチド組込みは、これらに限定されないが、点突然変異（すなわち、単一の塩基対の異なる塩基対への変換）、置換（すなわち、複数の塩基対の、同一の長さの異なる配列への変換）、１つもしくは複数の塩基対の挿入、１つもしくは複数の塩基対の欠失および上述の配列変更の任意の組合せを含む標的化された突然変異をもたらすことができる。
一部の実施形態では、細胞（複数可）内の１つもしくは複数の標的ゲノム領域を編集する方法は、細胞（複数可）に、ゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態では、細胞（複数可）は、ＳまたはＧ２細胞周期フェーズに同期化される。ＳまたはＧ２細胞周期フェーズにおける細胞（複数可）の同期化は、当技術分野で公知の任意の方法により達成することができる。非限定的例として、ＳまたはＧ２細胞周期フェーズに細胞（複数可）を同期化させるために使用することができる薬剤として、アフィジコリン、ヒドロキシ尿素（ｄｙｒｏｘｙｕｒｅａ）、ロバスタチン、ミモシン、ノコダゾール、チミジン、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． ”Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｉｍｉｎｇ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，” Ｅｌｉｆｅ． ２０１４ Ｄｅｃ １５；３を参照されたい）。一部の実施形態では、細胞の同期化のための薬剤は、遺伝子編集プロセス中の任意の時点で投与することができる。一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよび／またはＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与する前に、投与している間、または投与した後に、細胞（複数可）を細胞周期のＳまたはＧ２フェーズに同期化させることができる。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することによって、細胞（複数可）の１つまたは複数の標的ゲノム領域を編集する方法は、ゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞（複数可）に投与されなかった条件と比較して、または細胞（複数可）に遺伝子編集システムのみが接触もしくは投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が接触もしくは投与されない条件と比較して、細胞生存期間の増加をもたらす。
一部の実施形態では、ＨＤＲ経路を介して１つまたは複数の標的ゲノム領域内のＤＮＡ切断を修復する方法が本明細書に提供されている。細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与すると、ゲノムの標的化された領域のＤＮＡ切断が結果として生じ、続いてＤＮＡ切断が少なくとも部分的に、ＨＤＲ経路により修復される。これらの方法は、１つまたは複数の標的ゲノム領域内で、ＨＤＲ媒介性修復（例えばＨＤＲ経路）の量の増加をもたらし、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、より高い効率でのＨＤＲ媒介性修復が結果として生じる。一部の実施形態では、ＤＮＡ切断のＨＤＲ経路媒介性修復の効率は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、または細胞（複数可）にゲノム編集システムのみが投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されない条件と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍である。ＨＤＲ経路媒介性修復の効率は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、標的化されたポリヌクレオチド組込みの頻度を確定することにより、または標的化された突然変異導入の頻度を測定することにより、測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書の方法は、ＨＤＲ経路の効率を増加させることによるＤＮＡ切断の修復を提供する。
ＨＤＲ経路は、「標準的」または「代替」であり得る。「ＨＤＲ」（相同組換え修復）とは、例えば、細胞（複数可）内の二本鎖切断またはＤＮＡニックの修復中に起きるＤＮＡ修復の特化した形態を指す。二本鎖切断のＨＤＲは一般的にはヌクレオチド配列相同性に基づき、「標的」分子（例えば、二本鎖切断を受けたもの）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の転移をもたらし得る。二本鎖切断の標準的ＨＤＲは、ＢＲＣＡ２およびＲＡＤ５１に一般的に基づき、通常ｄｓＤＮＡドナー分子を利用する。非標準的、または「代替」のＨＤＲは、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、および／または機能的関連遺伝子により抑制されるＨＤＲ機序である。代替のＨＤＲは、ｓｓＤＮＡまたはニックの入ったｄｓＤＮＡドナー分子を使用することもできる。例えば、ＷＯ２０１４１７２４５８を参照されたい。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することによって、ＨＤＲ経路を介した１つまたは複数の標的ゲノム領域のＤＮＡ切断を修復する方法は、ゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、または細胞（複数可）に遺伝子編集システムのみが投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されない条件と比較して、細胞生存期間の増加をもたらす。
一部の実施形態では、細胞（複数可）内の１つまたは複数の標的ゲノム領域内のＤＮＡ切断のＮＨＥＪ媒介性修復を阻害または抑制する方法が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、ＤＮＡ切断のＮＨＥＪ媒介性修復の阻害または抑制は、ＮＨＥＪ経路を阻害または抑制することにより実施される。ＮＨＥＪ経路は、古典的（「標準的」）または代替のＮＨＥＪ経路（ａｌｔ−ＮＨＥＪ、またはミクロ相同媒介末端結合（ＭＭＥＪ））のいずれかであり得る。ＮＨＥＪ経路またはａｌｔ−ＮＨＥＪ経路は、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することにより、細胞（複数可）内で抑制される。
古典的なＮＨＥＪ修復経路は、二本鎖切断の末端が大規模な相同性なしにライゲーションされているＤＮＡ二本鎖切断の修復経路である。古典的ＮＨＥＪ修復は、ＫＵ７０／８０ヘテロ二量体（ＫＵ）、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶ、およびＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）を含むいくつかの因子を使用する。ａｌｔ−ＮＨＥＪは、二本鎖切断を修復するための別の経路である。ａｌｔ−ＮＨＥＪは、切断末端を結合する前の切断末端のアライメント中に５〜２５塩基対のミクロ相同配列を使用する。Ａｌｔ−ＮＨＥＪは、ＫＵ７０／８０ヘテロ二量体（ＫＵ）、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶ、ＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、ＲＡＤ５２、およびＥＲＣＣ１とは主として無関係である。Ｂｅｎｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ−ＮＨＥＪ ｉｓ ａ Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃａｌｌｙ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｂｒｅａｋ Ｒｅｐａｉｒ”， ＰＬＯＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｕｎｅ ２７， ２００８を参照されたい。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することによりＮＨＥＪ経路を阻害または抑制することによって、細胞（複数可）の１つまたは複数の標的ゲノム領域のＮＨＥＪ経路を介したＤＮＡ切断のＮＨＥＪ媒介性修復を阻害または抑制する方法は、ゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を受けなかった細胞（複数可）と比較して、または細胞（複数可）が遺伝子編集システムを受け、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は受けない条件と比較して、ＤＮＡ切断のＮＨＥＪ媒介性修復を阻害または抑制する効率を増加する。一部の実施形態では、細胞（複数可）をＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムと接触させることによってＮＨＥＪ経路を介したＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する効率の増加は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、または細胞（複数可）に遺伝子編集システムのみが投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されない条件と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍である。ＮＨＥＪ経路を介したＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する効率は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば標的化されたポリヌクレオチド組込みの頻度を確定することによって、または標的化された突然変異導入の頻度を測定することによって、測定することができる。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することによりＮＨＥＪ経路を阻害または抑制することによって、細胞（複数可）の１つまたは複数の標的ゲノム領域のＤＮＡ切断のＮＨＥＪ媒介性修復を阻害または抑制する方法は、ゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞（複数可）に接触もしくは投与されなかった条件と比較して、または遺伝子編集システムのみが細胞（複数可）に接触もしくは投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が接触もしくは投与されない条件と比較して、細胞生存期間の増加をもたらす。
ＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）または２つの一本鎖切断（例えば、２つのＤＮＡニック）であり得る。ＤＳＢは、平滑末端であってもよいし、または５’もしくは３’のいずれかがオーバーハングしていてもよく、鎖がそれぞれ大きく間をあけて切断された場合、このオーバーハングは継続して互いにアニーリングし、１つのＤＳＢではなく２つのニックとして存在する。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することにより、１つまたは複数の遺伝子（標的遺伝子（複数可））、および／または対応するもしくは下流タンパク質の発現を改変する方法が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、細胞（複数可）の標的遺伝子（複数可）の標的ゲノム領域（複数可）において、例えば、挿入、欠失、置換え、改変または破壊を作り出し、結果として、標的遺伝子（複数可）の改変された発現が生じ得る。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換え、改変または破壊は、特定のタンパク質、またはタンパク質の群、または下流タンパク質の標的化された発現をもたらし得る。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、非コーディング領域またはコーディング領域内で挿入、欠失または置換えを作り出すことができる。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、プロモーター領域、エンハンサー領域、および／または、エクソン、イントロン、転写開始部位、サイレンサー領域、インスレーター領域、抗リプレッサー、翻訳後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル（例えば最小ポリＡ）、保存領域、転写因子結合部位、またはこれらの任意の組合せを含む任意の他の遺伝子調節エレメントにおいて、挿入、欠失、置換え、改変または破壊を作り出すことができる。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、１つより多くの標的領域内で、挿入、欠失、置換え、改変または破壊を同時にまたは逐次的に作り出すことができる。一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することにより、細胞（複数可）において標的化された遺伝子発現の改変が可能になり得る。このような標的化された遺伝子発現の改変は、特定のタンパク質およびその下流タンパク質の発現をもたらすことができる。
一部の実施形態では、下流遺伝子および／またはタンパク質の発現は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、またはゲノム編集システムのみが細胞（複数可）に投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されない条件と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、または１０倍増加する。
一部の実施形態では、下流遺伝子および／またはタンパク質の遺伝子発現は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、またはゲノム編集システムのみが細胞（複数可）に投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されない条件と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低減する。
本明細書の方法の細胞は、任意の細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は脊椎動物細胞である。一部の実施形態では、脊椎動物細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、脊椎動物細胞はヒト細胞である。
細胞は、任意の発育段階における任意の種類の細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は、分化細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、胚性胚細胞、成体幹細胞、前駆細胞、人工多能性幹細胞、またはこれらの任意の組合せであり得る。分化細胞は、組織内で特定の機能を実施する特化した細胞である。全能性幹細胞は胚、胎児または成体由来の未分化細胞であり、これらの細胞は長期間にわたり分裂することができ、生物の三胚葉のいずれかの任意の細胞型へと分化する能力を有する。多能性幹細胞は、胚、胎児または成体由来の未分化細胞であり、これらの細胞は、長期間にわたり分裂することができ、胚外組織または胎盤を除く生物の任意の細胞型に分化する能力を有する。胚性幹細胞は、胚の内部細胞集団において発見される未分化幹細胞であり、三胚葉のいずれかの任意の細胞型へと分化する能力を有する。胚性胚細胞は、精子細胞または卵細胞などの生殖細胞を生じることができる胚性細胞である。成体幹細胞は分化した組織に見出される未分化細胞であり、自己再生可能であり、それが宿る組織の細胞のいずれかへと分化することができる。前駆体または前駆細胞は、通常１種類の細胞（例えば単能性細胞）へと分化することしかできない部分的に分化した細胞である。人工多能性幹細胞は、成体の分化細胞または部分的に分化した細胞から生成される多能性幹細胞の一種である。例えば、ＷＯ／２０１０／０１７５６２を参照されたい。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと指示していない限り、複数への言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、これらの混合物を含めた、複数の細胞を含む。例えば「１つまたは複数の細胞」および「細胞（複数可）」は本明細書で交換可能なように使用されている。同様に、「１つまたは複数の標的ゲノム領域」および「標的ゲノム領域（複数可）」は本明細書で交換可能なように使用されている。
「およそ」および「約」という用語は、本明細書で交換可能なように使用される。「およそ」または「約」という用語は、目的の１つまたは複数の値に適用される場合、述べられた基準値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に述べられていない限りまたは特に文脈から明らかではない限り（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、述べられた基準値のいずれかの方向において（それより大きいまたはそれ未満）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る値の範囲を指す。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能なように使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）もしくはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のいずれか、またはこれらのアナログの任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知のまたは未知の任意の機能を実施することができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子または遺伝子断片のコーディングまたは非コーディング領域、連結分析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマー組立の前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分により分断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに改変することもできる。「ｓｓＤＮＡ」という用語は、一本鎖ＤＮＡ分子を意味する。「ｓｓＯＤＮ」という用語は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを意味する。
本明細書で言及されている「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及された「改変ヌクレオチド」という用語は、改変または置換された糖類などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及された「オリゴヌクレオチド連結」という用語は、オリゴヌクレオチド連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデートなどを含む。所望する場合、オリゴヌクレオチドは検出用標識を含むことができる。
「合成ＲＮＡ」という用語は、操作された、または天然に存在しないＲＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者に理解されている技術用語であり、突然変異体またはバリアント形態とは区別される、自然に生じる生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
「天然に存在しない」または「操作された」という用語は、交換可能なように使用され、人の手の関与を示す。核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、この用語は、その核酸分子またはポリペプチドが本来、自然界において付随し、自然界に見出される少なくとも１種の他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「相補性」とは、従来のワトソンクリック型または他の非従来型のいずれかにより、核酸が別の核酸と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性のパーセントは、第２の核酸配列と、水素結合（例えば、ワトソンクリック型塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個中５、６、７、８、９、１０個は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性がある）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての隣接する残基が第２の核酸配列中の同数の隣接する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれよりも多くのヌクレオチド領域にわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性の程度を指すか、または厳格な条件下でハイブリッド形成する２つの核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ＤＮＡ鋳型からポリヌクレオチドが（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などに）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、総合的に「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導された場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能なように使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖または分枝であってよく、ポリマーは修飾アミノ酸を含んでもよく、ポリマーは非アミノ酸で分断されていてもよい。この用語はまた、改変されたアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作を包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含む、天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸を含む。
「薬剤」という用語は、化学化合物、小分子、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的物質から生成された抽出物を表すように本明細書で使用されている。
「対象」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書では、脊椎動物、例えば哺乳動物、またはヒトを指すために交換可能なように使用される。哺乳動物には、それに限定されるものではないが、マウス、サル、ヒト、家畜動物、競技用動物、およびペットが含まれる。
本明細書で使用される場合、「処置」もしくは「処置する」または「和らげる」もしくは「回復させる」は交換可能なように使用される。これらの用語は、これらに限定されないが、治療利益および／または予防的利益を含む、有益なまたは所望の結果を得るための手法を指す。治療利益とは、処置中の１種または複数種の疾患、状態、または症状に対する任意の治療的関連のある改善または作用を意味する。予防的利益のため、組成物は、疾患、状態、または症状が未だ現れていなくとも特定の疾患、状態、もしくは症状を発症するリスクがある対象、または疾患の生理学的症状のうちの１種もしくは複数種を報告している対象に投与され得る。これらの用語はまた、哺乳動物における、例えば、ヒトにおける疾患の処置を意味し、処置は以下を含む：（ａ）疾患を阻害する、すなわち、その発症を止めるもしくは予防する；（ｂ）疾患を軽減する、すなわち、疾患状態の退縮を引き起こす；または（ｃ）疾患を治癒する。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果を生じるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、処置を受けている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与方式などのうちの１つまたは複数に応じて変動し得るが、当業者により容易に決定することができる。この用語はまた、本明細書に記載されているイメージング法のいずれか１つによる、検出用画像が得られるような用量にも適用される。具体的な用量は、選択された特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与のタイミング、イメージングする組織、およびこれを運ぶ物理的送達システムのうちの１つまたは複数に応じて変動し得る。
本明細書で使用される場合、「投与する」とは、ゲノム編集システムおよび／またはＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を細胞または対象に接触させる、注射する、分配する、送達する、または適用することを指す。一部の実施形態では、投与は、ゲノム編集システムおよび／またはＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を細胞（複数可）に接触させる。一部の実施形態では、投与は、ゲノム編集システムおよび／またはＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を細胞（複数可）に送達する。一部の実施形態では、投与は、ゲノム編集システムおよび／またはＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を細胞（複数可）に適用する。一部の実施形態では、投与は、ゲノム編集システムおよび／またはＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を細胞（複数可）に注射する。投与することは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで生じ得る。ゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を細胞（複数可）に投与することは同時にまたは逐次的に行うことができる。
本明細書で使用される状態または疾患に関連して、「後天性」という用語は、出生時に存在する先天性障害とは対照的に、胎児期後に発症する障害または医学的状態を意味する。先天性障害は後天性障害に先行し得る。
「先天性」または「遺伝性」の状態または疾患という用語は、出生時に対象に存在する対象のゲノムに発見された遺伝的障害である。「ゲノム」とは、本明細書で使用される場合、核および細胞形質内のすべての遺伝物質を含み、ミトコンドリアゲノムおよびリボソームゲノムをさらに含む。先天性または遺伝性は対象の生涯のいつでも、例えば、出生時または成人期に発現し得る。
「遺伝的障害」または「遺伝的疾患」という用語は、疾患を引き起こす、または引き起こし得る、対象のゲノムにおける遺伝性または後天性の突然変異を含む。
「多型」または「遺伝的変異」という用語は、遺伝子座における遺伝子の異なる形態を意味する。
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えで生成されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例として、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびキメラウイルスベクターなどが挙げられる。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される一部の実施形態では、ベクター構築物とは、レトロウイルスゲノムまたはその一部分を含むポリヌクレオチドを指す。
本開示の一部の実施形態は、１つもしくは複数のベクターを含むベクター系、またはベクターそれ自体に関する。ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発現させることができる。
細胞は、初代細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、成体幹細胞、前駆細胞または細胞系であってよい。「初代細胞」は生体組織から直接採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏに配置して成長させる細胞である。初代細胞は、ほとんど集団で倍化せず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの集団倍化に対する寿命は有限である。「幹細胞」、「胚性幹細胞」および「人工多能性幹細胞」は、自己再生可能であり、特化した機能を有する異なる型の細胞へと分化する可能性を有する非特化、未分化の細胞である。「細胞系」は、無制限に増殖できる１つの細胞型または同じ型の一連の細胞から誘導される細胞培養物を含む。哺乳動物細胞系の非限定的例として、ＣＤ３４細胞、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはこれらの任意のバリアントを挙げることができる。
一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞内の１つまたは複数の配列の発現を推進することが可能である。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は通常、１つまたは複数の調節エレメントにより提供される。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、および本明細書で開示されているおよび当技術分野で公知のその他のものから誘導される。他のプロモーターとして、例えば、ＥＦ１プロモーター、またはＥＦ１アルファプロモーターを挙げることができる。原核細胞と真核細胞の両方に対する他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９の第１６章および第１７章を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、ラジオ標識されたアミノ酸の組込み、またはマーク付きアビジンにより検出可能なビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能なマーカーの組込みを指す（例えば、蛍光マーカーを含有するストレプトアビジンまたは光学的もしくは熱量測定法により検出できる酵素活性）。ある特定の状況では、標識またはマーカーは治療用であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。一部の実施形態では、標識を様々な長さのスペーサーアームにより結合させ、潜在的立体障害を減少させる。「薬剤または薬物」という用語は、本明細書で使用される場合、患者に適切に投与された場合、所望の治療効果を誘発することが可能な化学化合物または組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、対象種が存在する主要な種である（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味する。一部の実施形態では、実質的な精製画分は、対象種が存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モルベースで）を構成する組成物である。
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種のうちの約８０パーセントより多くを含む。一部の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種のうちの約８５％、９０％、９５％、および９９％より多くを含む。一部の実施形態では、対象種は、本質的に均一となるように精製し（汚染種は従来の検出方法により組成物中に検出されない）、組成物は本質的に単一の巨大分子種からなる。
ゲノム編集システム
様々な種類のゲノム操作システムを使用することができる。「ゲノム編集システム」、「遺伝子編集システム」などの用語は、本明細書で交換可能なように使用され、標的遺伝子またはその機能もしくは発現を編集するシステムまたは技術を指す。ゲノム編集システムは以下を含む：標的ゲノム領域（複数可）（または標的配列（複数可））の切断を可能にする少なくとも１つのエンドヌクレアーゼコンポーネント；およびエンドヌクレアーゼコンポーネントを標的ゲノム領域（複数可）に届ける、または標的ゲノム領域（複数可）をエンドヌクレアーゼコンポーネントの標的にする少なくとも１つのゲノム標的化エレメント。ゲノム標的化エレメントの例として、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン）、ガイドＲＮＡエレメント（例えば、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）、およびガイドＤＮＡエレメント（例えば、ＮｇＡｇｏガイドＤＮＡ）が挙げられる。プログラミング可能なゲノム標的化およびエンドヌクレアーゼエレメントは、特定のゲノムの遺伝子座に、二本鎖切断（ＤＳＢ）などのＤＮＡ切断を導入することにより正確なゲノム編集を可能にする。ＤＳＢは、続いて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）のいずれかのための内因性修復機構をＤＳＢ部位に動員し、ゲノム編集を媒介する。「エンドヌクレアーゼコンポーネント」は、このようなエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含むエンドヌクレアーゼまたは核酸を含む。
「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することが可能な任意の野生型、突然変異型、バリアント、または操作した酵素を指す。エンドヌクレアーゼは、その標的ゲノム領域においてＤＮＡまたはＲＮＡ分子を認識し、切断することができる。エンドヌクレアーゼの例として、ホーミングエンドヌクレアーゼ；制限酵素、例えば、ＦｏｋＩなど；操作されたジンクフィンガードメインの、ＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合から生成されるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；Ｃａｓ酵素、およびＣｐｆ酵素が挙げられる。化学的またはペプチド切断物質が、特異的標的配列を認識する核酸のポリマー、または別のＤＮＡのいずれかにコンジュゲートされ、これにより切断活性を特異的配列に標的化する化学的エンドヌクレアーゼは、「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。化学的エンドヌクレアーゼの例として、オルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼが挙げられる。
「バリアント」とは、親タンパク質のアミノ酸配列の中の少なくとも１個の残基を、異なるアミノ酸で置き換えることにより得られる組換えタンパク質を意図する。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ、例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼは、切断ドメインおよび／または切断ハーフドメインを含む。切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して同種であっても、異種であってもよい。例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインを使用することができる。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが誘導され得る例示的エンドヌクレアーゼとして、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、ＷＯ２０１３／１３０８２４を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素は公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；ヤエナリヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９３も参照されたい）。これらの酵素のうちの１つまたは複数（またはその機能的断片）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上に記載されたような任意のヌクレアーゼまたはその部分から誘導することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。一部の実施形態では、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。一部の実施形態では、２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から誘導することができる。一部の実施形態では、各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から誘導することができる。加えて、２つの融合タンパク質に対する標的部位は互いに対して好ましく配置され、この結果、２つの融合タンパク質のこれらのそれぞれの標的部位への結合が、例えば二量体化により切断ハーフドメインの機能的切断ドメインの形成を可能にする互いの空間的方向性で切断ハーフドメインを配置させる。よって、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、５〜５０ヌクレオチド、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介入できる（例えば、２から５０のヌクレオチド対またはそれより多く）ことが指摘されている。一部の実施形態では、切断部位は標的部位の間に位置する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡへ配列特異結合（認識部位において）すること、および結合部位において、またはその付近でＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除外された部位でＤＮＡを切断し、分離可能結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８３−８８７； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３１， ９７８−３１， ９８２を参照されたい。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼコンポーネントは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメイン（操作されていても、操作されていなくてもよい）を含む融合タンパク質（複数可）を含む。その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な例示的ＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は二量体として活性がある。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。このような融合タンパク質に使用されているＦｏｋＩ酵素の部分は切断ハーフドメインと考えられる。よって、ジンクフィンガー融合またはＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ融合を使用した、細胞配列の標的化された二本鎖切断および／または標的化された置換えのため、それぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性のある切断ドメインを再構成することができる。代わりに、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。
例示的ＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれている国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。追加の制限酵素もまた分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは本開示で想定されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：４１８−４２０を参照されたい。
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号およびＷＯ２０１３／１３０８２４に記載されているようなホモ二量体化を最小化するまたは阻止する１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。必須ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８の位置でアミノ酸残基の突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９において突然変異を含む、対を含む。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号および第２０１１／０２０１０５５号を参照されたい。本明細書に記載されている操作された切断ハーフドメインは、任意の適切な方法を使用して、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および第２００８０１３１９６２号に記載されているような野生型切断ハーフドメインの部位特異的突然変異導入（ＦｏｋＩ）により調製することができる。
「編集する（ｅｄｉｔ）」、「編集する（ｅｄｉｔｓ）」、「編集している（ｅｄｉｔｉｎｇ）」などの用語は、任意の種類の操作、変更、改変またはモジュレートを指す（いずれの場合も、これらに限定されないが、遺伝子ノックアウト、遺伝子タグ化、遺伝子破壊、遺伝子突然変異、遺伝子挿入、遺伝子欠失、遺伝子活性化、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子ノックインの手段によるものを含む）。
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」、「ゲノム編集」、「ゲノム改変」、「遺伝子の改変」および「遺伝子編集」は、細胞のヌクレオチドに対する、任意の遺伝子の付加、欠失、ノックアウト、ノックイン、タグ化、突然変異、活性化、サイレンシング、改変、および／または破壊を指す。この文脈において、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏであり得る。
「標的ゲノム領域」、「標的遺伝子」、「ＤＮＡ標的」、「ＤＮＡ標的配列」、「標的配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的部位」、「標的」、「目的の部位」、「認識部位」、「ポリヌクレオチド認識部位」、「認識配列」、「切断部位」とは、ゲノム編集システムにより認識および切断されるポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、明確なＤＮＡの位置、好ましくは、ＤＮＡ切断（ｂｒｅａｋ）（切断（ｃｌｅａｖａｇｅ））がゲノム編集システムにより誘発されることになるゲノムの位置を指す。
操作、変更、改変およびモジュレートを含む前述の編集は、同時にまたは逐次的に生じ得る。当技術分野で公知の任意のゲノム編集システムを使用することができる。一部の実施形態では、ゲノム編集システムはメガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ベースのシステム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム、またはＮｇＡｇｏベースのシステムである。
メガヌクレアーゼベース、ＺＦＮベースおよびＴＡＬＥＮベースはそれぞれ、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインまたはこのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列（複数可）を含む核酸を含み、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して標的ゲノム領域（複数可）の特異的標的化または認識を達成する。ＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメントまたはこのガイドＲＮＡエレメントをコードする核酸配列（複数可）を含む核酸を含み、標的ゲノム領域（複数可）のＤＮＡとの直接的な塩基対を介して、標的ゲノム領域（複数可）の特異的な標的化または認識を達成する。ＮｇＡｇｏベースのシステムは少なくとも１つのガイドＤＮＡエレメントまたはこのガイドＤＮＡエレメントをコードする核酸配列（複数可）を含む核酸を含み、標的ゲノム領域（複数可）のＤＮＡとの直接的な塩基対を介して、標的ゲノム領域（複数可）の特異的な標的化または認識を達成する。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、メガヌクレアーゼベースのシステムである。メガヌクレアーゼベースのシステムは、大きな（＞１４ｂｐ）認識部位を有するエンドヌクレアーゼであるメガヌクレアーゼを利用し、そのＤＮＡ結合ドメインもまた標的配列の切断に関与している。メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは１２〜４５ｂｐの二本鎖ＤＮＡ標的配列を有し得る。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼドメインが単量体上にある二量体酵素であるか、または単一のポリペプチド上の２つのドメインを含む単量体酵素のいずれかである。野生型メガヌクレアーゼだけではなく、様々なメガヌクレアーゼバリアントも、無数の独特な配列の組合せを網羅するようタンパク質操作により生成されてきた。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼＡの半分の部位およびプロテインＢの半分の部位で構成される認識部位を有するキメラメガヌクレアーゼもまた使用することができる。このようなキメラメガヌクレアーゼの具体例はＩ−ＤｍｏＩおよびＩ−ＣｒｅＩのタンパク質ドメインを含む。メガヌクレアーゼの例として、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来のホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−ＣｉｖＩ、ＰＩ−ＣｔｒＩ、ＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＢｓｕＩ、ＰＩ−ＤｈａＩ、ＰＩ−ＤｒａＩ、ＰＩ−ＭａｖＩ、ＰＩ−ＭｃｈＩ、ＰＩ−ＭｆｕＩ、ＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｉｎＩ、ＰＩ−ＭｋａＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｍａＩ、ＰＩ−ＭｓｈＩ、ＰＩ−ＭｓｍＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｘｅＩ、ＰＩ−ＮｐｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｐｂＩ、ＰＩ−ＳｓｐＩ、ＰＩ−ＦａｃＩ、ＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＰｈｏＩ、ＰＩ−ＴａｇＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｋｏＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ、もしくはＩ−ＭｓｏＩであってよく、またはホモ二量体、ヘテロ二量体もしくは単量体であるかどうかに関わらずそれらの機能的な突然変異体もしくはバリアントであってもよい。一部の実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼはＩ−ＣｒｅＩ誘導体である。一部の実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、天然のＩ−ＣｒｅＩ ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼと少なくとも８０％の類似性を共有する。一部の実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、天然のＩ−ＣｒｅＩ ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの残基１〜１５２と少なくとも８０％の類似性を共有する。一部の実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、天然のＩ−ＣｒｅＩ ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの残基１〜１５２と少なくとも８０％類似性を共有し、リンカーペプチドと共に、またはリンカーペプチドなしで、一緒に連結している２つの単量体からなってもよい。
「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、Ｓｔｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ （Ｓｔｏｄｄａｒｄ， ２００５）において定義されているような、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来のホーミングエンドヌクレアーゼ、または前記天然ホーミングエンドヌクレアーゼと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれよりも多くの同一性または類似性を共有するポリペプチドを含む操作されたバリアントを指す。このような操作されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、単量体または二量体メガヌクレアーゼから誘導することができる。二量体メガヌクレアーゼから誘導される場合、このような操作されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、一本鎖または二量体エンドヌクレアーゼであり得る。
「Ｉ−ＣｒｅＩ」とは、ｐｄｂ受託コード１ｇ９ｙの配列を有する天然の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを意図する。
メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識および切断機能は一般的に単一ドメイン内で縒り合わされている。メガヌクレアーゼとは異なり、ＺＦＮベースおよびＴＡＬＥＮベースのシステムのＤＮＡ結合ドメインは、切断機能に対してエンドヌクレアーゼとははっきりと異なる。ＺＦＮベースのシステムは以下を含む：少なくとも１つのジンクフィンガータンパク質もしくはそのバリアント、またはジンクフィンガータンパク質もしくはそのバリアントをそのＤＮＡ結合ドメインとしてコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸；およびエンドヌクレアーゼエレメント、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＦｏｋ１切断ドメインなど。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、これが選択した標的部位と結合するよう操作されているという点で天然に存在しない。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１３５−１４１； Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：３１３−３４０； Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：６５６−６６０； Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：６３２−６３７； Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． １０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０３０，２１５号；第６，７９４，１３６号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，０７０，９３４号；第７，３６１，６３５号；第７，２５３，２７３号；および米国特許公開第２００５／００６４４７４号；第２００７／０２１８５２８号；第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に生じるジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有することができる。操作方法として、これらに限定されないが、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられる。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれるが、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連する。例えば、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる、共有米国特許第６，４５３，２４２号および同６，５３４，２６１号を参照。
様々な種類の選択方法を本明細書の方法と共に使用することができる。ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７で開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。加えて、これらおよび他の参考文献において開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質を、例えば、長さ５またはそれよりも長いアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結してもよい。また、長さ６またはそれよりも長いアミノ酸の例示的なリンカー配列については米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。標的部位の選択、ＺＦＰ、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は、当業者には公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号；第７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、長さ５またはそれよりも長いアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結してもよい。また、長さ６またはそれよりも長いアミノ酸の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムとは、１つまたは複数の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）−ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼエレメント、例えば、Ｆｏｋ１切断ドメインを利用するゲノム編集システムを指す。ＴＡＬＥ−ＤＮＡ結合ドメインは、それぞれ長さ３０〜３８（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、または３６）のアミノ酸を有する１つまたは複数のＴＡＬＥ繰り返し単位を含む。ＴＡＬＥ−ＤＮＡ結合ドメインは、全長ＴＡＬＥタンパク質もしくはその断片、またはそのバリアントを利用し得る。ＴＡＬＥ−ＤＮＡ結合ドメインは、リンカーによりエンドヌクレアーゼドメインに融合または連結することができる。
「ＣＲＩＳＰＲベースのシステム」、「ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集システム」、「ＣＲＩＳＰＲゲノム編集」、「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集」、「ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼベースのゲノム編集」などの用語は本明細書で交換可能なように使用され、１つまたは複数のガイドＲＮＡエレメントおよび１つまたは複数のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼエレメントを含むゲノム編集システムを総合的に指す。ガイドＲＮＡエレメントは、１つまたは複数の標的ゲノム領域でのヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、またはターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む。ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼエレメントは、ガイドＲＮＡエレメントにより標的ゲノム領域（複数可）へガイドされるもしくはもたらされるエンドヌクレアーゼ；またはこのようなエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲベースのシステムを含む、このようなＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集システムの例は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムである。
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡエレメント」、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ分子」、および「合成ガイドＲＮＡ」という用語は、交換可能なように使用され、標的核酸配列とハイブリッド形成するターゲッターＲＮＡまたはこのターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含むポリヌクレオチド配列を指す。ｇＲＮＡのターゲッターＲＮＡは、標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む。「実質的に相補的」という句は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の程度を意味するか、または厳格な条件下でハイブリッド形成する２つの核酸を指す。
ガイドＲＮＡエレメントは、ターゲッターＲＮＡとハイブリッド形成することが可能なアクチベーターＲＮＡ、またはこのアクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸をさらに含むことができる。アクチベーターＲＮＡおよびターゲッターＲＮＡは、別個であるか、またはリンカーループ配列を介して単一の核酸として融合して、単一のｇＲＮＡ分子を形成することができる。ｇＲＮＡ分子はいくつかのドメインを含んでもよい。例えば、このようなｇＲＮＡは、例えば、５’から３’に以下を含む：標的化ドメイン（標的核酸に相補的）；第１の相補性ドメイン；連結ドメイン；第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインに相補的）；近位ドメイン；および必要に応じて、テールドメイン。ＷＯ２０１５０４８５５７を参照されたい。
「第１の相補性ドメイン」は、第２の相補性ドメインとの実質的な相補性を有し、少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成することができる。
「連結ドメイン」は、第１の相補性ドメインを、単分子ｇＲＮＡの第２の相補性ドメインに連結する働きをする。連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを共有結合または非共有結合により連結することができる。
「近位ドメイン」は、３〜２５ヌクレオチドの長さ、または５〜２０ヌクレオチドの長さであってよい。近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を共有でき、または天然に存在する近位ドメインから誘導することができる。
「テールドメイン」は、存在しなくてもよいし、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの長さであってもよい。テールドメインは、互いに相補的であり、少なくともいくつかの生理学的な条件下で二重鎖領域を形成する配列を含み得る。
ガイドＲＮＡエレメントは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼエレメントのエンドヌクレアーゼとの複合体、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（「ｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体」）などを形成し得る。ｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体の例は、ＣＲＩＳＲベースのシステムに関して以下に記載されているようなＣＲＩＳＰＲ複合体である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ターゲッターＲＮＡと複合体を形成するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼシステムのエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ターゲッターＲＮＡおよびアクチベーターＲＮＡと複合体を形成するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼシステムのエンドヌクレアーゼを含む。
ターゲッターＲＮＡの標的化ドメインは、標的ヌクレオチド配列へのｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体の特異的標的化またはホーミングを促進する。一部の実施形態では、標的化ドメインは、１０〜３０ｂｐ、例えば、１５〜２５ｂｐ、１８〜２２ｂｐ、または２０ｂｐであり得る。
標的ドメインを選択、設計、および検証するための方法を含む、ｇＲＮＡを設計する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＷＯ２０１５０４８５７７、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３ ＳＣＩＥＮＣＥ， ３３９（６１２１）： ８２３−８２６； Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３ ＮＡＴＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ， ３１（９）：８２７−３２； Ｆｕ ｅｔ ａｌ，， ２０１４ ＮＡＴＢＴＯＴＥＣＨＮＯＬ， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４４６３５７４； Ｈｅｉｇｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＮＡＴ ＭＥＴＨＯＤＳ １１（２）：１２２−３． ｄｏｉ： ｌ ０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４４８１２１６； Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４ ＢＩＯＴＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４４６３１８１； Ｘｉａｏ Ａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ Ｐｕｂ Ｍｅｄ ＰＭＩＤ： ２４３８９６６２を参照されたい。
一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ酵素もしくはタンパク質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質）またはＣｐｆ酵素もしくはタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質）を使用することができる。一部の実施形態では、このようなＣａｓまたはＣｐｆ酵素またはタンパク質の改変バージョンもまた使用することができる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、（ａ）少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメントまたはこのガイドＲＮＡエレメントをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸であって、このガイドＲＮＡエレメントが１つまたは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、およびターゲッターＲＮＡとのハイブリッド形成が可能なヌクレオチド配列を含むアクチベーターＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡエレメントまたは核酸；ならびに（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質エレメントまたはこのＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。ターゲッターＲＮＡおよびアクチベーターＲＮＡは、別個であってもよいし、または単一のＲＮＡ内に一緒に融合されていてもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、クラス１ＣＲＩＳＰＲおよび／またはクラス２ＣＲＩＳＰＲシステムを含む。クラス１システムは、ターゲッターＲＮＡとしてＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と一緒にいくつかのＣａｓタンパク質を利用して、機能的エンドヌクレアーゼを構築する。クラス２ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＣａｓタンパク質、およびターゲッターＲＮＡとしてｃｒＲＮＡを利用する。ＩＩ型Ｃａｓ９ベースのシステムを含むクラス２ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス１システムにより利用されるマルチ−サブユニット複合体ではなく、切断を媒介するための単一のＣａｓタンパク質を含む。ＣＲＩＳＰＲベースのシステムはまた、Ｃｐｆ１タンパク質およびターゲッターＲＮＡとしてｃｒＲＮＡを利用するクラスＩＩ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムを含む。
Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）二本鎖のヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＣａｓ９タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ｎ、Ｃａｓ９−ＨＦ、Ｃａｓ９−Ｈ８４０Ａ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、またはＤ１０Ａニッカーゼである。「Ｃａｓタンパク質」という用語、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質またはその機能的誘導体（例えば、ヌクレアーゼ活性を有する野生型Ｃａｓタンパク質の末端切断型バージョンまたはバリアント）を含む。
一部の実施形態では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ以外の種由来のＣａｓ９タンパク質を使用することができる。以下を含む追加のＣａｓ９タンパク質種を入手し、本明細書で使用することができる：Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｌｚｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、ｌｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｌｌｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．、またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムの１つまたは複数のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムから誘導される。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムの１つまたは複数のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、およびＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．から誘導される。一般的に、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムは、標的ゲノム領域または標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連でプロトスペーサーとも呼ばれる）により特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成との関連で、「標的配列」とは、実質的な相補性を有するようにガイド配列が設計された配列を指し、この場合、標的配列とガイド配列との間のハイブリッド形成がＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要とされないが、ただし、ハイブリッド形成を引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性は存在するものとする。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞（複数可）の核または細胞形質に位置する。一部の実施形態では、標的配列は、真核細胞（複数可）の細胞器官、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体内にあってもよい。
標的配列を含む標的化された遺伝子座への組換えのために使用することができる配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。外来性鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型またはドナー鋳型と呼ぶことができる。一部の実施形態では、合成または生物的起源の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを使用することができる。非限定的例として、適切な編集鋳型として、ｓｓＯＤＮ、ｄｓＯＤＮ、ＰＣＲ生成物、プラスミド、およびＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどを含むウイルスが挙げられる。追加の編集鋳型もまた可能である。一部の実施形態では、組換えは相同組換えである。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのターゲッターＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのアクチベーターＲＮＡは、ｔｒａｎｓ−活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃＲＮＡ）を含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのＣａｓタンパク質エレメントはＣａｓ９タンパク質を利用する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、別個にすることも、またはリンカーループ配列を介して単一のＲＮＡ構築物に合わせることもできる。この合わせたＲＮＡ構築物は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；またはガイドＲＮＡ）と呼ばれる。
方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ、ならびに量および製剤化に関するものを含めたこれを作製および使用することを含めた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、その構成成分、およびこのような構成成分の送達に関する一般的な情報については、以下に見出される：米国特許第８，９９９，６４１号、第８，９９３，２３３号、第８，９４５，８３９号、第８，９３２，８１４号、第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号および第８，６９７，３５９号；米国特許公開ＵＳ２０１４−０３１０８３０、ＵＳ２０１４−０２８７９３８Ａ１、ＵＳ２０１４−０２７３２３４Ａ１、ＵＳ２０１４−０２７３２３２Ａ１、ＵＳ２０１４−０２７３２３１、ＵＳ２０１４−０２５６０４６Ａ１、ＵＳ２０１４−０２４８７０２Ａ１、ＵＳ２０１４−０２４２７００Ａ１、ＵＳ２０１４−０２４２６９９Ａ１、ＵＳ２０１４−０２４２６６４Ａ１、ＵＳ２０１４−０２３４９７２Ａ１、ＵＳ２０１４−０２２７７８７Ａ１、ＵＳ２０１４−０１８９８９６Ａ１、ＵＳ２０１４−０１８６９５８、ＵＳ２０１４−０１８６９１９Ａ１、ＵＳ２０１４−０１８６８４３Ａ１、ＵＳ２０１４−０１７９７７０Ａ１およびＵＳ２０１４−０１７９００６Ａ１、ＵＳ２０１４−０１７０７５３；欧州特許ＥＰ２７８４１６２Ｂ１およびＥＰ２７７１４６８Ｂ１；欧州特許出願ＥＰ２７７１４６８（ＥＰ１３８１８５７０．７）、ＥＰ２７６４１０３（ＥＰ１３８２４２３２．６）、およびＥＰ２７８４１６２（ＥＰ１４１７０３８３．５）；ならびにＰＣＴ特許出願公開ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１４／０９３６６１、ＷＯ２０１４／０９３６９４、ＷＯ２０１４／０９３５９５、ＷＯ２０１４／０９３７１８、ＷＯ２０１４／０９３７０９、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９３６３５、ＷＯ２０１４／０９３６５５、ＷＯ２０１４／０９３７１２、ＷＯ２０１４／０９３７０１、ＷＯ２０１４／０１８４２３、ＷＯ２０１４／２０４７２３、ＷＯ２０１４／２０４７２４、ＷＯ２０１４／２０４７２５、ＷＯ２０１４／２０４７２６、ＷＯ２０１４／２０４７２７、ＷＯ２０１４／２０４７２８、ＷＯ２０１４／２０４７２９、およびＷＯ２０１６／０２８６８２。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムである。「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステム」は、（ａ）少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメントまたはこのガイドＲＮＡエレメントをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸であって、このガイドＲＮＡが、標的核酸の遺伝子座においてヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するターゲッターＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡエレメントまたは核酸；ならびに（ｂ）Ｃｐｆタンパク質エレメントまたはこのＣｐｆタンパク質エレメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
Ｃｐｆタンパク質エレメントの例として、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）およびその任意のバリアントが挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ”， Ｃｅｌｌ， １６３（３）： ｐａｇｅｓ ７５９−７１；およびＦｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＮＡ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｃｐｆ１ ａｌｓｏ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ” Ｎａｔｕｒｅ， ５３２（７６００）： ｐａｇｅ， ５１７−２１を参照されたい。Ｃｐｆ１の好ましいＰＡＭは５’−ＴＴＮであり、ゲノムの位置とＧＣ含量の両方において、Ｃａｓ９（３’−ＮＧＧ）とは異なる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムは、アクチベーターＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を利用しなくてもよい。Ｃｐｆ１もガイドＲＮＡも一般的にこれらのＳｐＣａｓ９同等物より小さい。Ｃｐｆ１遺伝子座は、混合アルファ／ベータドメイン、ＲｕｖＣ−Ｉ、これに続くヘリックス領域、ＲｕｖＣ−ＩＩおよびジンクフィンガー様ドメインを含有する。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様であるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Ｃｐｆ１はＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端はＣａｓ９のアルファヘリックスの認識ローブを有さない。Ｃｐｆ１遺伝子座は、ＩＩ型システムよりも、ＩおよびＩＩＩ型により類似したＣａｓ１、Ｃａｓ２およびＣａｓ４タンパク質をコードする。Ｃｐｆ１−ファミリータンパク質は多くの細菌種に見出すことができる。
特定の理論に拘束されることなく、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムは、Ｃａｓ９で標的化されたＧ豊富なＰＡＭとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ５’−ＹＴＮ−３’（式中、「Ｙ」はピリミジンであり、「Ｎ」は任意の核酸塩基である）または５’−ＴＴＮ−３を識別することにより、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断するＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体を利用する。ＰＡＭの識別後、Ｃｐｆ１は４または５ヌクレオチドオーバーハングの粘着性末端様ＤＮＡ二本鎖切断を導入する。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、ＮｇＡｇｏベースのシステムである。ＮｇＡｇｏベースのシステムは、少なくとも１つのガイドＤＮＡエレメントまたはガイドＤＮＡエレメントをコードする核酸配列（複数可）を含む核酸、およびＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む。ＮｇＡｇｏベースのシステムは、ガイドエレメントとしてＤＮＡを利用する。その作動原理はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術のものとは類似しているが、そのガイドエレメントはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術のｇＲＮＡではなく、ガイドＤＮＡ（ｄＤＮＡ）のセグメントである。ＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼの例は、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ由来のアルゴノートエンドヌクレアーゼ（ＮｇＡｇｏ）である。例えば、Ｆｅｎｇ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ． ”ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， （２０１６）： ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５４７を参照されたい。
「リンカー」、「ペプチドリンカー」、「ペプチド性リンカー」または「ペプチドスペーサー」とは、融合タンパク質中の異なる単量体の接続、および前記融合タンパク質活性のための正しい立体配座の採用を可能にし、単量体のいずれの活性も変化させないペプチド配列を意味することを意図する。ペプチドリンカーは、非限定的な指標範囲として、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０〜５０アミノ酸またはこの範囲内の任意の中間値の様々なサイズであってもよい。
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤
一部の実施形態では、構造式（Ｉ）によって表される化合物
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶が用いられる。
ｍおよびｎは、独立して、１または２である。
Ｘは、ＯまたはＮＲであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである。Ｒは、２Ｈ（Ｄまたは重水素）であってもよい。本明細書で使用される場合、「重水素」、「２Ｈ」および「Ｄ」という用語は、交換可能なように使用される。
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。
Ｒ２は、
Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１個または２個のヘテロ原子を含有する５員または６員の芳香族または芳香族複素環であり、芳香族もしくは芳香族複素環は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択される０、１もしくは２個の置換基Ｒ３によって置換されていてよく、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、または芳香族もしくは芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
あるいはＲ２は、ＣＯＯＲ４であってよく、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。環Ａは、
Figure 2021511312
 からなる群から選択される。
Ｗは、ＮまたはＣＲ３であり、Ｚは、ＯまたはＳであり、Ｒ３は、Ｈ（または２Ｈ）またはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ａは、
Figure 2021511312
 である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、メチルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（Ｉ）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２である。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の構造式（Ｉ）の化合物に対する比は、約２：１である。いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の構造式（Ｉ）の化合物に対する比は、約１：２である。いくつかの実施形態では、共結晶は、構造式（Ｉ）の化合物およびＣＣＦを、（構造式（Ｉ）の化合物）ｐ：（ＣＣＦ）ｑの比で含む。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。式（Ｉ））ｐ：（ＣＣＦ）ｑ。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ）によって表される化合物（Ｉ）、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、メチルである。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＯまたはＮＲであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩ）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
一部の実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の構造式（ＩＩ）の化合物に対する比は、約２：１である。いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の構造式（ＩＩ）の化合物に対する比は、約１：２である。いくつかの実施形態では、共結晶は、構造式（ＩＩ）の化合物およびＣＣＦを、（構造式（ＩＩ）の化合物）ｐ：（ＣＣＦ）ｑの比で含む。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’）によって表される化合物（Ｉ）、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、メチルである。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＯまたはＮＲであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩ’）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
一部の実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩ’に対する比は、約２：１である。いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩ’に対する比は、約１：２である。いくつかの実施形態では、共結晶は、化合物ＩＩ’およびＣＣＦを、（化合物ＩＩ’）ｐ：（ＣＣＦ）ｑの比で含む。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’）によって表される化合物（Ｉ）、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、メチルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩ’’）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
一部の実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩ’’に対する比は、約２：１である。いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩ’’に対する比は、約１：２である。いくつかの実施形態では、共結晶は、化合物ＩＩ’’およびＣＣＦを、（構造式ＩＩ’’の化合物）ｐ：（ＣＣＦ）ｑの比で含む。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’’）によって表される化合物（Ｉ）、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、メチルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩ’’’）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、２であり、Ｙは、結合であり、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
一部の実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’’）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’’）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ’’’）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩ’’’に対する比は、約２：１である。いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩ’’’に対する比は、約１：２である。いくつかの実施形態では、共結晶は、化合物ＩＩ’’’およびＣＣＦを、（化合物ＩＩ’’’）ｐ：（ＣＣＦ）ｑの比で含む。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ）によって表される式（Ｉ）の化合物、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩＩ）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩＩに対する比は、約２：１である。いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩＩに対する比は、約１：２である。いくつかの実施形態では、共結晶は、化合物ＩＩＩおよびＣＣＦを、（化合物ＩＩＩ）ｐ：（ＣＣＦ）ｑの比で含む。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’）によって表される式（Ｉ）の化合物、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩＩ’）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩＩ’に対する比は、約２：１である。いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）の化合物ＩＩＩ’に対する比は、約１：２である。いくつかの実施形態では、共結晶は、化合物ＩＩＩ’およびＣＣＦを、（化合物ＩＩＩ’）ｐ：（ＣＣＦ）ｑの比で含む。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．４〜約２．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約０．９〜約３．１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２であり、ｑは、約１である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１であり、ｑは、約２である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’）によって表される式（Ｉ）の化合物、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩＩ’’）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’’）によって表される式（Ｉ）の化合物、
Figure 2021511312
 または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 ［式中、＃は、Ｒ２が式（ＩＩＩ’’’）の化合物の残部に結合している箇所を示し、ｏは、０、１、または２である］である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、
Figure 2021511312
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、結合であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＮＨであり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ２は、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである。
いくつかの実施形態では、ｏは、０、１、または２であり、各Ｒ３は、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、芳香族複素環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’’）の化合物の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’’）の化合物を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩＩ’’’）の化合物および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、表１の化合物番号１〜３７から選択される式（Ｉ）の化合物（上記）、または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、任意の化合物番号１〜３７の薬学的に許容される塩が用いられる。
いくつかの実施形態では、化合物番号１〜３７のいずれかを含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、化合物番号１〜３７のいずれかおよび共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦは、アジピン酸である。
一部の実施形態では、化合物は、表１から選択される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶である。
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
本明細書に記載されているように、本明細書に開示される化合物は、上記に一般的に例示されているような、または特定のクラス、サブクラスおよび種で例示されているような１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換されていてもよい。「必要に応じて置換されている」という句は、「置換または非置換」という句と交換可能なように使用されることを認識されたい。一般的に、「置換されている」という用語は、「必要に応じて」という用語が先行してもしなくても、所与の構造内の１個または複数の水素基を特定された置換基の基で置き換えることを指す。他に指摘されていない限り、必要に応じて置換されている基は、基の各置換可能な位置に置換基を有することができる。所与の構造内の１つより多くの位置が、特定された基から選択される１つより多くの置換基で置換され得る場合、置換基は、各位置において同じでも、異なっていてもよい。
本明細書に記載される分子基は、化学的に可能なまたは化学的に安定な場合、非置換または置換である（すなわち、「必要に応じて置換されている」）。本明細書に記載されているように、「必要に応じて置換されている」という用語がリストの前に先行する場合、前記用語は、そのリスト内のそれに続く置換可能な基のすべてを指す。例えば、基Ｘが、「ハロゲン；必要に応じて置換されているアルキルまたはフェニル；」である場合、Ｘは、必要に応じて置換されているアルキルまたは必要に応じて置換されているフェニルのいずれかであってよい。同様に、「必要に応じて置換されている」という用語がリストの後に続く場合、前記用語はまた、他に指摘されていない限り、前のリスト内の置換可能な基のすべてを指す。例えば、Ｘがハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、またはフェニルであり、ＸがＪｘで必要に応じて置換されている場合、Ｃ１〜４アルキルとフェニルは両方ともＪｘで必要に応じて置換されていてもよい。当業者に明らかであるように、Ｈ、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＨ２、ＯＨ、またはＯＣＦ３などの基は、置換可能な基ではないため、含まれない。同様に当業者に明らかなように、ＮＨ基を含有するヘテロアリールまたは複素環式環は、水素原子を置換基で置き換えることにより必要に応じて置換されていてもよい。
いくつかの実施形態では、基（例えば、Ｃ１〜４アルキル；Ｃ３〜５シクロアルキル；ヘテロシクリル、例えばオキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、またはモルホリニル；アリール、例えばフェニル；またはヘテロアリール）は、非置換である。
いくつかの実施形態では、基（例えば、Ｃ１〜４アルキル；Ｃ３〜５シクロアルキル；ヘテロシクリル、例えばオキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、またはモルホリニル；アリール、例えばフェニル；またはヘテロアリール）は、置換されている。いくつかの実施形態では、基は、原子価および化学的安定性が許す限り、１、２、３、４、５、または６個の置換基を含む。
本開示で想定される置換基の組合せは、安定したまたは化学的に可能な化合物の形成をもたらすものが好ましい。「安定した」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に開示されている目的のうちの１つまたは複数のためのこれらの生成、検出、ならびに好ましくは、これらの回収、精製、および使用を可能にする条件下におかれた場合、実質的に変化しない化合物を指す。いくつかの実施形態では、安定した化合物なまたは化学的に可能な化合物は、水分または他の化学反応性条件の非存在下で、４０℃またはそれ未満の温度で少なくとも１週間保持された場合、実質的に変化しないものである。
数値ｘに関する「約」という用語は、例えば、ｘ＋／−１０％を意味する。
「アルキル」または「アルキル基」という用語は、本明細書で使用される場合、完全飽和の直鎖（すなわち、非分枝）または分枝、置換または非置換の炭化水素鎖を意味する。特に明記しない限り、アルキル基は、１〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜８アルキル」と表される）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜４アルキル」と表される）。いくつかの実施形態では、「Ｃ０〜４アルキル」と記載される分子実体には、本明細書に記載される通り、共有結合（例えば、「Ｃ０アルキル」）またはＣ１〜４アルキル鎖が含まれる。アルキル基の例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクロアルキル」、または「複素環式」という用語は、本明細書で使用される場合、系内の少なくとも１つの環が、同じまたは異なる１個または複数のヘテロ原子を含有する単環式、二環式、または三環式環系を指し、これは、完全に飽和しているか、または１つもしくは複数の不飽和の単位を含有するが、芳香族ではなく、分子の残りへの単一結合点を有する。一部の実施形態では、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクロアルキル」、または「複素環式」基は、３〜１４個の環員を有し、この中の１つまたは複数の環員は、酸素、硫黄、窒素、またはリンから独立して選択されるヘテロ原子であり、系内の各環は、３〜８個の環員を含有する。複素環式環の例として、これらに限定されないが、以下の単環が挙げられる：２−テトラヒドロフラニル、３−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロチオフェニル、３−テトラヒドロチオフェニル、２−モルホリノ、３−モルホリノ、４−モルホリノ、２−チオモルホリノ、３−チオモルホリノ、４−チオモルホリノ、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、１−テトラヒドロピペラジニル、２−テトラヒドロピペラジニル、３−テトラヒドロピペラジニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、５−ピラゾリニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、２−チアゾリジニル、３−チアゾリジニル、４−チアゾリジニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、５−イミダゾリジニル、ならびに以下の二環：３−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、３−（１−アルキル）−ベンズイミダゾール−２−オン、インドリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、ベンゾチオラン、ベンゾジチアンおよび１，３−ジヒドロ−イミダゾール−２−オン。
「ヘテロ原子」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の酸化形態の窒素、硫黄もしくはリンを含む、酸素、硫黄、窒素またはリンのうちの１つまたは複数；任意の塩基性窒素の四級化形態；または複素環式環の置換可能な窒素、例えばＮ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルの場合）、ＮＨ（ピロリジニルの場合）またはＮＲ＋（Ｎ置換ピロリジニルの場合）を意味する。
「不飽和」という用語は、本明細書で使用される場合、部分が１つまたは複数の不飽和の単位を有することを意味する。
「アルコキシ」、または「チオアルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、酸素（「アルコキシ」）または硫黄（「チオアルキル」）原子を介して主要な炭素鎖に結合している、以前に定義されたようなアルキル基を指す。
「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」および「ハロアルコキシ」という用語は、本明細書で使用される場合、場合によって１つまたは複数のハロゲン原子で置換されている、アルキル、アルケニル、またはアルコキシを意味する。「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。
単独でまたは「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」のようなより大きい部分の一部として使用される「アリール」という用語は、本明細書で使用される場合、合計６〜１４の環員を有する単環式、二環式、または三環式炭素環式環系を指し、前記環系は、分子の残りへの単一結合点を有し、系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、系内の各環は４〜７個の環員を含有する。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と交換可能なように使用することができる。アリール環の例として、フェニル、ナフチル、およびアントラセンが挙げられる。
本明細書で使用される場合、単独でまたは「ヘテロアラルキル」もしくは「ヘテロアリールアルコキシ」のようなより大きい部分の一部として使用される「ヘテロアリール」という用語は、合計５〜１４の環員を有する単環式、二環式、または三環式環系を指し、ここで前記環系は分子の残りへの単一結合点を有し、系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、系内の少なくとも１つの環は窒素、酸素、硫黄またはリンから独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有し、系内の各環は４〜７環員を含有する。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」という用語または「ヘテロ芳香族」という用語と交換可能なように使用することができる。ヘテロアリール環のさらなる例として以下の単環が挙げられる：２−フラニル、３−フラニル、Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、Ｎ−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、ピリダジニル（例えば、３−ピリダジニル）、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、テトラゾリル（例えば、５−テトラゾリル）、トリアゾリル（例えば、２−トリアゾリルおよび５−トリアゾリル）、２−チエニル、３−チエニル、ピラゾリル（例えば、２−ピラゾリル）、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、ならびに以下の二環：ベンズイミダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル（例えば、２−インドリル）、プリニル、キノリニル（例えば、２−キノリニル、３−キノリニル、４−キノリニル）およびイソキノリニル（例えば、１−イソキノリニル、３−イソキノリニル、または４−イソキノリニル）。
他に示されても、述べられてもいない限り、本明細書で列挙された構造は、すべての異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマーおよび幾何学的（または立体配座））形態の構造；例えば、各不斉中心に対するＲおよびＳ立体配置、（Ｚ）および（Ｅ）二重結合異性体、ならびに（Ｚ）および（Ｅ）立体配座異性体を含み得る。したがって、単一の立体化学異性体ならびに本発明の化合物のエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的（または立体配座）混合物は本開示の範囲内である。普通、ハッチング線またはボールド体の結合を使用して定義された立体化学的中心と共に描かれた化合物は、立体化学的に純粋であるが、絶対立体化学は依然として定義されていない。このような化合物はＲまたはＳ立体配置のいずれかを有することができる。絶対立体配置が決定されている場合、キラル中心（複数可）は、図の中で（Ｒ）または（Ｓ）と標識されている。
特に述べられていない限り、本明細書に開示される化合物のすべての互変異性形態は、このような開示の範囲内にある。さらに、特に述べられていない限り、本明細書で示されている構造はまた、１個または複数の同位体を豊富に含む原子が存在することのみが異なる化合物を含むことも意味する。例えば、水素が重水素もしくはトリチウムで置き換えられている、または炭素が１３Ｃもしくは１４Ｃを豊富に含む炭素で置き換えられていることを除いて本発明の構造を有する化合物は、本開示の範囲内にある。このような化合物は、例えば、分析用ツールとして、生物学的アッセイのプローブとして、または改善された治療プロファイルを有するＤＮＡ−ＰＫ阻害剤として有用である。
薬学的に許容される塩
本明細書に開示される化合物のいくつかは、遊離形態で、または適切な場合には、薬学的に許容されるその誘導体で存在することができることもまた認識されたい。薬学的に許容される誘導体として、これらに限定されないが、薬学的に許容されるプロドラッグ、塩、エステル、このようなエステルの塩、あるいは任意の他の付加物または誘導体が挙げられ、これらは、必要とする患者への投与の際、直接的または間接的に、本明細書で別段記載されているような化合物、またはその代謝物もしくはその残基を提供することが可能である。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などが生じることなく、ヒトおよび下等動物の組織に接触させて使用するのに適切な塩を指す。
薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓ． Ｍ． Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６６： １−１９， １９７７において薬学的に許容される塩を詳細に記載しており、その文献は、薬学的に許容される塩に関して参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される化合物の薬学的に許容される塩は、適切な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基から誘導されるものを含む。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸を用いて、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸を用いて、または当技術分野で使用される他の方法、例えばイオン交換を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩として、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。またさらに例示的な塩には、アジピン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、またはコハク酸塩が含まれる。適切な塩基から誘導される塩として、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムおよびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩が挙げられる。
本開示には、本明細書に開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も含まれる。このような四級化により、水溶性もしくは油溶性または分散性の生成物を得ることができる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。薬学的に許容されるさらなる塩として、適当な場合、対イオン、例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、Ｃ１〜８スルホン酸イオンおよびアリールスルホン酸イオンなどが、非毒性アンモニウムカチオン、第四級アンモニウムカチオン、およびアミンカチオンと形成する塩が挙げられる。
共結晶
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される通りの化合物（例えば、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物）、および共結晶形成剤（ＣＣＦ）を含む共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、およびＣＣＦは、共に固体状態（例えば、結晶性）である。いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、およびＣＣＦは、非共有結合（例えば、水素結合）によって結合する。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、およびＣＣＦ（例えば、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸）の共結晶は、室温で固体である。いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、およびＣＣＦ（例えば、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸）の共結晶は、非共有結合によって相互作用する。いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物と、ＣＣＦ（例えば、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸）の間の非共有結合の相互作用には、水素結合および／またはファンデルワールス相互作用が含まれる。
いくつかの実施形態では、共結晶形成剤（ＣＣＦ）は、アジピン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、または安息香酸である。
いくつかの実施形態では、共結晶は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１５／０５８０６７号に記載される共結晶である。
いくつかの実施形態では、共結晶は、（５）−Ｎ−メチル−８−（１−（（２’−メチル−［４，５’−ビピリミジン］−６−イル）アミノ）プロパン−２−イル）キノリン−４−カルボキサミドを含む。いくつかの実施形態では、化合物は、（＋）エナンチオマーである。いくつかの実施形態では、化合物は、（−）エナンチオマーである。
いくつかの実施形態では、共結晶は、（５）−Ｎ−メチル−８−（１−（（２’−メチル−４，６’−ジジュウテロ−［４，５’−ビピリミジン］−６−イル）アミノ）プロパン−２−イル）キノリン−４−カルボキサミドを含む。いくつかの実施形態では、化合物は、（＋）エナンチオマーである。いくつかの実施形態では、化合物は、（−）エナンチオマーである。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）およびＣＣＦとしてのクエン酸を含む、共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、本発明は、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）およびＣＣＦとしてのフマル酸を含む、共結晶を特徴とする。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）およびＣＣＦとしてのマレイン酸を含む、共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）およびＣＣＦとしてのコハク酸を含む、共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）およびＣＣＦとしての安息香酸を含む、共結晶が用いられる。
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）およびＣＣＦとしてのアジピン酸を含む、共結晶が用いられる。
一部の実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）および上記のＣＣＦを、単離された純粋形態で、あるいは他の材料、例えば遊離形態の構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）または遊離ＣＣＦと混和される場合には、固体組成物としての混合物で含むような共結晶が用いられる。
一部の実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）、第１のＣＣＦ（例えば、本明細書に記載される通り）、および第１のＣＣＦと同じであっても異なっていてもよい１つまたは複数の追加の遊離ＣＣＦの共結晶を含む、薬学的に許容される組成物が用いられる。一部の実施形態では、組成物は、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）、アジピン酸である第１のＣＣＦ、および追加のアジピン酸の共結晶を含む。一部の実施形態では、このような組成物における、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）のＣＣＦ（例えば、第１のＣＣＦ（例えば、本明細書に記載される通り）および１つまたは複数の追加の遊離ＣＣＦの両方を含む全ＣＣＦ）に対する全モル比は、約１：０．５５〜約１：１００の範囲である。一部の実施形態では、このような組成物における、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）のＣＣＦに対する全モル比は、約１：０．５５〜約１：５０の範囲である。一部の実施形態では、このような組成物における、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）のＣＣＦに対する全モル比は、約１：０．５５〜約１：１０の範囲である。一部の実施形態では、このような組成物における式Ｉの化合物のＣＣＦに対する全重量比は、約８５ｗｔ％：１５ｗｔ％〜約６０ｗｔ％：４０ｗｔ％の範囲である。一部の実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）のＣＣＦに対する全重量比は、約７０ｗｔ％：３０ｗｔ％〜約６０ｗｔ％：４０ｗｔ％の範囲である。一部の実施形態では、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物（例えば、化合物番号１〜３７のいずれか）のＣＣＦに対する全重量比は、約６５ｗｔ％：３５ｗｔ％である。
ゲノム編集効率を増加するためのＤＮＡ−ＰＫ阻害剤
標的化されたゲノム編集効率は、細胞（複数可）に、本明細書に記載されている１つまたは複数の化合物（例えば、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤）およびゲノム編集システムを投与することにより増加することができる。使用に適したゲノム編集システムとして、例えば、メガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムまたはＮｇＡｇｏベースのシステムが挙げられる。本開示の方法、組成物、およびキットは、ゲノム編集効率を増加するためのＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および／またはゲノム編集システムを提供する。一部の実施形態では、ＨＤＲゲノム編集効率は、細胞（複数可）にＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与した後に増加する。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムである。ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムまたはそのバリアントであり得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、任意のＣａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびそのバリアントを使用することができる。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの例として、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアント、例えば、ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ｎ、Ｃａｓ９−ＨＦ、Ｃａｓ９−Ｈ８４０Ａ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、またはＣａｓＤ１０Ａニッカーゼが挙げられる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、野生型、操作された、またはニッカーゼ突然変異体、またはその任意の変化形であり得る。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ配列、ｔｒａｎｓ−活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列、ガイド配列およびＣａｓエンドヌクレアーゼまたはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ配列を含むＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｎｓ−活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列を含むＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣａｓエンドヌクレアーゼまたはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ配列、ガイド配列、およびＣａｓエンドヌクレアーゼまたはＣｐｆエンドヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムである。Ｃｐｆヌクレアーゼはクラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムエンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆは単一ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆヌクレアーゼは、野生型、操作された、またはニッカーゼ突然変異体、またはその任意の変化形であり得る。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ，， ”ＣＰＦ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ”， Ｃｅｌｌ， １６３（３）：７５９−７１を参照されたい。一部の実施形態では、ＣｐｆヌクレアーゼはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、ゲノム編集システムはメガヌクレアーゼベースのシステムである。メガヌクレアーゼベースのゲノム編集は、大きなＤＮＡ標的部位を認識する（例えば通常約＞１２ｂｐ）配列特異的なエンドヌクレアーゼを使用する。例えば、Ｕ．Ｓ．９，３６５，９６４を参照されたい。メガヌクレアーゼは、全体的なゲノムの完全性に影響を与えることなく、独特な染色体配列を切断することができる。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、イントロンエンドヌクレアーゼまたはインテインエンドヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼはＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに属することができる。メガヌクレアーゼは、野生型、操作された、またはニッカーゼ突然変異体であり得る。
一部の実施形態では、遺伝子編集システムはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステムである。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとの間の融合に基づき操作された人工制限酵素である。例えば、Ｕ．Ｓ．９，１４５，５６５を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ切断ドメインへの融合により生成された、操作された制限酵素である。例えば、Ｕ．Ｓ．９，１８１，５３５を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子編集システムはアルゴノートベースのシステムである。アルゴノートベースの遺伝子編集システムは、アルゴノートから誘導されるエンドヌクレアーゼおよび５’リン酸化ｓｓＤＮＡを含む。一部の実施形態では、リン酸化ｓｓＤＮＡは、１０〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチドまたは１８〜３０ヌクレオチド（例えば、約２４ヌクレオチド）の長さであり得る。一部の実施形態では、アルゴノートエンドヌクレアーゼは任意のエンドヌクレアーゼであり得る。一部の実施形態では、アルゴノートエンドヌクレアーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ（ＴｔＡｇｏ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＰｆＡｇｏ）、またはＮａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ（ＮｇＡｇｏ）から誘導される。一部の実施形態では、Ｎａｔｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ（ＮｇＡｇｏ）は株２（すなわちＮ．ｇｒｅｇｏｒｙｉ ＳＰ２）である。一部の実施形態では、アルゴノートエンドヌクレアーゼはＮｇＡｇｏである。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ”ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ ２０１６を参照されたい。
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、任意のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤であってよい。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、ＤＮＡ−ＰＫの阻害を引き起こす任意の化合物または物質であってよい。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、化合物、小分子、抗体、またはヌクレオチド配列であってよい。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、構造式Ｉまたは構造式ＩＩによって表される化合物である。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、構造式Ｉ’または構造式ＩＩ’によって表される化合物である。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、化合物番号１〜３７のいずれかである。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、化合物番号１〜３７のいずれか、およびアジピン酸を含む共結晶である。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、化合物番号１〜３７のいずれか、またはこれらの組合せである。
一部の実施形態では、任意のＮＨＥＪ阻害剤を使用して、ＨＤＲゲノム編集効率を増加することができる。一部の実施形態では、ＮＨＥＪ阻害剤は、化合物番号１〜３７のいずれか、またはこれらの組合せである。
一部の実施形態では、ＮＨＥＪ阻害剤は、ＮＨＥＪの阻害を引き起こす任意の化合物または物質であってよい。ＮＨＥＪ阻害剤の例として、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が挙げられる。ＮＨＥＪ阻害剤は、化合物、小分子、抗体、またはヌクレオチド配列であってよい。一部の実施形態では、ＮＨＥＪ阻害剤は、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶である。一部の実施形態では、ＮＨＥＪ阻害剤は、化合物番号１〜３７のいずれか、またはこれらの組合せである。
一部の実施形態では、ゲノム編集効率の増加は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムが細胞（複数可）に投与されない条件と比較して、または細胞（複数可）に遺伝子編集システムのみが投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されない条件と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍である。
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、組成物、およびそのキットの使用
一部の実施形態では、本明細書において、細胞を、ＤＮＡ傷害を誘発する治療剤または疾患状態に対して感受性化させるための方法であって、細胞を、１つまたは複数の本明細書に開示されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、例えば構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）の阻害剤、または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶と接触させるステップを含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、本明細書において、がんを処置するための治療レジメンを増強するための方法であって、それを必要とする個体に、有効量の本明細書に開示されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、例えば構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）もしくは式（ＩＩＩ’’’）の阻害剤、または薬学的に許容されるその塩もしくはその共結晶を投与するステップを含む、方法が提供される。一態様では、がんを処置するための治療レジメンは、放射線療法を含む。
本明細書で開示されているＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、放射線療法がこのような処置の治療利益を増強するために適応される場合において有用である。加えて、放射線療法は頻繁にがんの処置において、手術に対するアジュバントとして適応されている。アジュバント設定において、放射線療法のゴールは、原発性腫瘍が制御される場合、再発の危険性を減少させ、無病生存を増強することである。アジュバント放射線療法は、以下に記載されている結腸、直腸、肺、胃食道、および乳房がんを含むいくつかの疾患に適応されている。
がんの処置のための治療レジメンでは、本明細書に開示されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤と共に、別の抗がん化学療法剤を、放射線療法を伴ってまたは伴わずに使用することができる。本明細書に開示されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤とこのような他の薬剤との組合せは、化学療法のプロトコールを増強することができる。例えば、本明細書で開示されているＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、ＤＮＡ鎖の破損を引き起こすことが公知の薬剤であるエトポシドまたはブレオマイシンと共に投与することができる。
本明細書ではさらに、本明細書のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を利用する、腫瘍細胞の放射線感受性化が開示される。細胞を「放射線感受性化する」ことができるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、本明細書で使用される場合、治療有効量で動物に投与されて、電磁放射線に対する細胞の感受性を増加させる、および／または電磁放射線（例えば、Ｘ線）で処置可能な疾患の処置を促進する分子、好ましくは低分子量分子と定義される。電磁放射線で処置可能な疾患として、新生物疾患、良性および悪性腫瘍、ならびにがん性細胞が挙げられる。
動物に有効量の本明細書で開示されているＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、例えば本発明の化合物などを投与することを含む、動物において、がんを処置する方法がさらに本明細書に提供されている。本発明はさらに、生物システムにおいて細胞の増殖、侵襲、および転移のプロセスを含む、がん細胞成長を阻害する方法を対象とする。その方法は、本発明の化合物のがん細胞成長の阻害剤としての使用を含む。好ましくは、その方法を利用して、哺乳動物などの生きている動物において、がんの細胞成長、侵襲、転移、または腫瘍発症率を阻害するまたは減少させる。本発明の化合物は、がんの処置またはがん細胞成長の阻害において、単独であるいはＩＲまたは１種もしくは複数種の化学療法剤の使用と併用して使用することができる。本発明の方法はまた、アッセイシステム、例えば、がん細胞成長およびその特性をアッセイすること、ならびにがん細胞成長に影響を与える化合物を同定することにおける使用に容易に適応可能である。
腫瘍または新生物は組織細胞の成長を含み、細胞の増殖は無制御であり、進行性である。一部のこのような成長は良性であるが、他は「悪性」と呼ばれ、生物の死亡をもたらし得る。悪性新生物または「がん」は、侵攻性細胞の増殖を示すことに加えて、これらは周辺組織に侵入し、転移することができるという点で良性の成長から区別される。さらに、悪性新生物は、相互に対しておよびこれらの周辺組織と比べて、これらがより多くの分化およびこれらの組織の損失（より多くの「脱分化」）を示すことにより特徴付けられる。この特性はまた「退生」とも呼ばれる。
本発明で処置可能な新生物はまた、固形腫瘍、すなわち、癌腫および肉腫を含む。癌腫は、周辺組織に浸潤し（侵入する）、転移を生じる上皮細胞から誘導される悪性新生物を含む。腺癌は、腺組織から、または認識可能な腺状構造を形成する組織から誘導される癌腫である。別の広範なカテゴリーのがんとして肉腫が挙げられる、肉腫は、その細胞が原線維または胚性結合組織などの均一な物質内に埋め込まれる腫瘍である。本発明はまた、白血病、リンパ腫、および通常腫瘤として存在しないが、血管系またはリンパ網内系組織系内で分配される他のがんを含めた、骨髄系またはリンパ系のがんの処置も可能にすることができる。
ＤＮＡ−ＰＫ活性は、例えば、成人および小児オンコロジー、固形腫瘍／悪性腫瘍の成長、粘液性および円形細胞癌、局所的に進行した腫瘍、転移性がん、ユーイング肉腫を含むヒト軟部組織肉腫、リンパ性転移を含むがん転移、扁平上皮癌、特に頭頸部のもの、食道扁平上皮癌、口腔癌、多発性骨髄腫を含む血液細胞の悪性腫瘍、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および有毛細胞白血病を含む白血病、滲出性リンパ腫（体腔ベースのリンパ腫）、小細胞肺癌を含む胸腺リンパ腫肺がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質のがん、ＡＣＴＨ産生腫瘍、非小細胞がん、小細胞癌および腺管癌を含む乳がん、胃がん、結腸がん、結腸直腸がんを含む、消化管がん、結腸直腸新生物に関連するポリープ、膵臓がん、肝臓がん、原発性表在性膀胱腫瘍、侵襲性膀胱移行上皮癌、および筋層侵襲性膀胱がん、前立腺がんを含む膀胱がんを含む泌尿器がん、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸癌、子宮内膜がん、膣がん、外陰部のがん、子宮がんおよび卵胞内の固形腫瘍を含む女性生殖器官の悪性腫瘍、精巣がんおよび陰茎がんを含む男性生殖器官の悪性腫瘍、腎臓細胞癌を含む腎臓がん、内因性脳腫瘍、神経芽細胞腫、星状膠細胞の脳腫瘍を含む脳がん、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞の侵入、骨腫および骨肉腫を含む骨がん、悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行を含む皮膚がん、扁平上皮細胞がん、甲状腺がん、網膜芽腫、神経芽細胞腫、腹水、悪性胸膜滲出、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆嚢がん、絨毛性腫瘍、血管外皮細胞腫、およびカポジ肉腫における様々な形態のがんに関連し得る。これらおよび他の形態のがんの処置を増強する方法もまた本明細書で開示されている。これらおよび他の形態のがんの処置を増強する方法は、本発明によって包含される。
本発明は、生体試料を本発明の化合物または組成物と接触させることを含む、生体試料においてＤＮＡ−ＰＫ活性を阻害するための方法を提供する。「生体試料」という用語は、本明細書で使用される場合、生命体の外の試料を意味し、制限なしで、細胞培養物またはその抽出物；哺乳動物から得た、生検が行われる物質またはその抽出物；および血液、唾液、尿、糞、精液、涙、または他の体液またはその抽出物を含む。生体試料におけるキナーゼ活性、特にＤＮＡ−ＰＫ活性の阻害は、当業者に公知の様々な目的に対して有用である。このような目的の例として、これらに限定されないが、生物学的検体の貯蔵および生物学的アッセイが挙げられる。一実施形態では、生体試料においてＤＮＡ−ＰＫ活性を阻害する方法は、非治療的方法に限定される。
ゲノム編集のための使用
特定のゲノム領域が正確に変化するゲノム編集は、多大な治療的可能性を保持する。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することを介して、ＨＤＲ経路を介して１つまたは複数の標的ゲノム領域内のＤＮＡ切断を修復するため、１つまたは複数の標的ゲノムのＤＮＡ切断のＮＨＥＪ媒介性修復を阻害または抑制するため、および１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質の発現を改変するために、１つまたは複数の標的ゲノム領域を編集するための方法が本明細書に提供されている。
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質の発現を改変する方法であって、１つまたは複数の標的ゲノム領域を含む１つまたは複数の細胞に、本明細書に記載されているゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することを含み、ゲノム編集システムが、標的遺伝子（複数可）の１つまたは複数の標的ゲノム領域の核酸（複数可）と相互作用して、１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集をもたらし、この編集が、標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現を改変する方法が本明細書に提供されている。
ゲノム編集システムは、細胞（複数可）内の標的ゲノム領域を編集することができる任意のゲノム編集システムであり得る。例示的ゲノム編集システムは上記に詳細に記載されており、例えば、メガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム、またはＮｇＡｇｏベースのシステムを含むことができる。
１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集は、任意の種類の遺伝子操作または細胞のゲノムの操作を含む。１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集は、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼにより実施される細胞（複数可）内のゲノム領域の挿入、欠失、または置換えを含むことができる。ゲノム領域は、細胞（複数可）内の遺伝物質、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを含む。細胞（複数可）内のゲノム領域はまた、細胞（複数可）内に含有されるミトコンドリアまたは葉緑体のゲノムも含む。
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、任意のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤であってよい。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、ＤＮＡ−ＰＫの阻害を引き起こす任意の化合物または物質であってよい。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、化合物、小分子、抗体、またはヌクレオチド配列であってよい。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物である。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物である。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、化合物番号１〜３７のいずれかである。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、化合物番号１〜３７のいずれか、およびアジピン酸を含む共結晶である。一部の実施形態では、アジピン酸の化合物番号１〜３７のいずれかに対する比は、約５〜０．５、またはその間の任意の比である。一部の実施形態では、アジピン酸の化合物番号１〜３７のいずれかに対する比は、約４〜０．５、またはそれらの間の任意の比である。一部の実施形態では、アジピン酸の化合物番号１〜３７のいずれかに対する比は、約３〜０．５、またはそれらの間の任意の比である。一部の実施形態では、アジピン酸の化合物番号１〜３７のいずれかに対する比は、約２〜０．５、またはそれらの間の任意の比である。一部の実施形態では、アジピン酸の化合物番号１〜３７のいずれかに対する比は、約２〜１．０、またはそれらの間の任意の比である。一部の実施形態では、ＮＨＥＪ阻害剤は、構造式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩ’）、式（ＩＩ’’）、式（ＩＩ’’’）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩ’）、式（ＩＩＩ’’）、または式（ＩＩＩ’’’）によって表される化合物、またはこれらの任意の組合せである。
一部の実施形態では、対象の細胞（複数可）内の１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集を必要とする疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、１つまたは複数の細胞にゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を投与することを含む方法が本明細書に提供されている。
一部の実施形態では、本明細書に提供されている方法は、経路における、遺伝子、ＲＮＡ分子、タンパク質、タンパク質の群、または下流タンパク質の発現を改変するために使用される。このような改変は、疾患、機能障害、異常な生命体ホメオスタシスを処置するために使用することができ、これらは、後天性もしくは遺伝性のいずれか、または高齢化過程によるものである。本明細書で使用される場合、「改変する」または「改変している」という用語は、モジュレートする、促進する、低減する、増加する、挿入する、欠失する、ノックアウトする、ノックインすることなどを含む。
当業者は、その疾患は、後天性であっても遺伝性であっても、または別の方法で得たものであっても、遺伝子またはタンパク質機能の関与を含むホメオスタシス機序の異常調節が関与していることを理解する。この目的を達成するために、当業者であれば、本明細書に提供されている方法を使用して、対象において、遺伝子機能をモジュレートする、改変する、増強する、低減する、または別の方法を提供することができる。
遺伝子の発現の改変および結果として起こる細胞（複数可）内のタンパク質発現は、本明細書に提供されている方法、例えば、エクソン、イントロン、転写開始部位、プロモーター領域、エンハンサー領域、サイレンサー領域、インスレーター領域、抗リプレッサー、翻訳後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル（例えば最小ポリＡ）、保存領域、転写因子結合部位のうちのいずれか、またはこれらの任意の組合せにおける核酸配列を特異的に編集すること（例えば、置換え、挿入または欠失、これらの任意の組合せ）により達成することができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されている方法、キットおよび組成物は、がんを有する対象を処置するために使用される。がんまたはがんに関連した状態を有する対象を処置する方法は、対象の細胞（複数可）に、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムを投与することを含む。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムの投与は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏであり得る。
がんは任意の種類のがんであり得る。がんは、固形腫瘍、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、および他の組織臓器の腫瘍ならびに血液細胞のがん、例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、およびＢ細胞リンパ腫を含めたリンパ腫および白血病を含む。がんは、黒色腫、白血病、星状細胞腫（ａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）、神経膠芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病ならびに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸のがんを含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されている方法、キットおよび組成物は、以下のがんのうちのいずれか１種または複数種を有する対象を処置するために使用される：急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、小児小脳または脳の星状細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管がん（胆管癌を参照）、膀胱がん、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳がん、脳腫瘍（小脳星状細胞腫）、脳腫瘍（脳星状細胞腫／悪性神経膠種）、脳腫瘍（上衣細胞腫）、脳腫瘍（髄芽腫）、脳腫瘍（テント上原始神経外胚葉性腫瘍）、脳腫瘍（視覚経路および視床下部神経膠腫）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、小児カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、原発不明癌腫、原発性中枢神経系リンパ腫、小児の小脳星状細胞腫、小児の脳星状細胞腫／悪性神経膠種、子宮頚部がん、小児がん、軟骨肉腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣細胞腫、類上皮血管内皮腫（Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｄ Ｈｅｍａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｍａ）（ＥＨＥ）、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍のユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん（眼球内黒色腫）、眼がん（網膜芽腫）、胆嚢がん、胃のがん（胃がん）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外、性腺外、または卵巣の胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹の神経膠腫、神経膠腫（小児の脳星状細胞腫）、小児視覚経路および視床下部の神経膠腫、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、小児の視床下部および視覚経路神経膠腫、眼球内黒色腫、島細胞癌（膵臓内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓がん（腎臓細胞がん）、喉頭部がん、白血病類、急性リンパ性白血病（急性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄性白血病（Ｌｅｕｋａｅｍｉａ， ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ）（急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）とも呼ばれる）、慢性リンパ球性白血病（Ｌｅｕｋａｅｍｉａ， ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）（慢性リンパ球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）とも呼ばれる）、慢性骨髄性白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）（慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）とも呼ばれる）、有毛細胞白血病、唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん（原発性）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン（ホジキンを除くすべてのリンパ腫の古い分類）リンパ腫、原発性中枢神経系ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、男性の乳がん、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、小児の黒色腫、眼球内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、成人期悪性中皮腫、原発不明の、小児の転移性扁平頸部がん、がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、成人の急性骨髄性白血病、小児の急性骨髄腫、多発性（骨髄がん）、骨髄増殖性障害、慢性粘液腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、乏突起膠腫、口のがん、口腔咽頭がん、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん（表面上皮間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、島細胞膵臓がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎臓細胞癌（腎臓がん）、腎孟尿管がん（ｃａｎｅｒ）、移行性細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイングファミリーの腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん（非黒色腫）、皮膚がん（黒色腫）、皮膚癌（メルケル細胞）、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌−皮膚がん（非黒色腫）を参照、原発不明、転移性の頸部扁平上皮がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫およびセザリー症候群）、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、甲状腺がん、腎孟尿管の移行性細胞がん、妊娠性絨毛腫瘍、成人期の原発部位不明癌、小児の原発部位不明のがん、尿管および腎盂移行性細胞がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、視覚経路および視床下部神経膠腫、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍（腎臓がん）。
一部の実施形態では、がんに関連する例示的標的遺伝子として、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＳＬ３、ＡＦ１５Ｑ１４、ＡＦ１Ｑ、ＡＦ３ｐ２１、ＡＦ５ｑ３１、ＡＫＡＰ９、ＡＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＤＨ２、ＡＬ、ＡＬ０１７、ＡＰＣ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＨＨ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＮＴ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＡＳＸＬ１、ＡＴＦ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＡＸＩＮ１、ＢＡＰ１、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ５、ＢＣＬ６、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＯＲ、ＢＣＲ、ＢＨＤ、ＢＩＲＣ３、ＢＬＭ、ＢＭＰＲＩＡ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡｌ、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰＩ、ＢＴＧ１、ＢＵＢ１Ｂ、Ｃ１２ｏｒｆ９、Ｃ１５ｏｒｆ２１、Ｃ１５ｏｒｆ５５、Ｃ１６ｏｒｆ７５、Ｃ２ｏｒｆ４４、ＣＡＭＴＡ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＢＦＡ２Ｔ３、Ｃ．ＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＤＣ６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＮ２Ａ、ＣＤＮ２ａ（ｐｌ４）、ＣＤＮ２Ｃ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＰｌ、ＣＨＣＨＤ７、ＣＨＥＫ２、ＣＨＩＣ２、ＣＨＮｌ、ＣＩＣ、Ｃｉｎ Ａ、ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＮＯＴ３、ＣＯＬ１Ａｌ、ＣＯＰＥＢ、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＴＣ３、ＣＴＮＮＢ１、ＣＹＬＤ、Ｄ１０Ｓ１７０、ＤＡＸＸ、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ１０、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、Ｄ１ＣＥＲ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＵＸ４、ＥＢＦＩ、ＥＣＴ２Ｌ、ＥＧＦＲ、Ｅ１Ｆ４Ａ２、ＥＬＦ４、ＥＬＫ４、ＥＬＫＳ、ＥＬＬ、ＥＬＮ、ＥＭＬ４、ＥＰ３００、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＥＲＧ、ＥＴＶｌ、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＶＩｌ、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴｌ、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＥＺＲ、ＦＡＣＬ６、ＦＡＭ２２Ａ、ＦＡＭ２２Ｂ、ＦＡＭ４６Ｃ、１ＡＮＣＡ、ＥＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＢＸＯｌ１、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲＩＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＴＩ、ＦＩＩＩＴ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＬＵ、ＦＬＪ２７３５２、ＦＬＴ３、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯＩＡ、ＦＯＸ０３Ａ、ＦＯＸＰ１、ＦＳＴＬ３、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＦＶＴ１、ＧＡＳ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＭＰＳ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＧＰＣ３、ＧＰＨＮ、ＧＲＡＦ、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＩＩＣＭＯＧＴ−１、ＩＩＥＡＢ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＩＩＥＹ１、ＩＩＩＰｌ、ＨＩＳＴ１ＩＴ３Ｂ、ＩＩＩＳＴ１ＩＩ４Ｉ、ＩＩＬＦ、ＨＬＸＢ９、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＲＮＰＡ２ＢＩ、ＨＯＯＫ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＨＲＡＳ、ＩＩＲＰＴ２、ＨＳＰＣＡ、ＨＳＰＣＢ、ＩＤＨｌ、ＩＤＨ２、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＫＺＦｌ、ＩＬ２、ＴＬ２１Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＴＡ１、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＡＺＦ１、ＪＵＮ、ＫＣＮＪ５、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＬＫ２、ＫＲＡＳ、ＫＴＮ１、ＬＡＦ４、ＬＡＳＰｌ、ＬＣＫ、ＬＣＰ１、ＬＣＸ、ＬＨＦＰ、ＬＩＦＲ、ＬＭＯｌ、ＬＭ０２、ＬＰＰ、ＬＲＩＧ３、ＬＹＬ１、ＭＡＤＨ４、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＬＴ１、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２ＫＬ ＭＡＰ２Ｋ２、ΜλΡ２Κ４、ＭＡＸ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＤＳ１、ＭＤＳ２、ＭＥＣＴｌ、ＭＥＤ１２、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＫＬ１、ＭＬＦ１、ＭＬＩＩｌ、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬＴ１、ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬＴ２、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ４、ＭＬＬＴ６、ＭＬＬＴ７、ＭＮ１、ＭＰＬ、ＭＳＦ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＣＰ１、ＭＵＣ１、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＨ１１、ＭＹＨ９、ＭＹＳＴ４、ＮＡＣＡ、ＮＢＳ１、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＤＲＧ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＩＮ、ＮＫＸ２−１、ＮＯＮＯ、ＮＯＴＣＨＩ、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭｌ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＳＤｌ、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴＲＫｌ、ＮＴＲＫ３、ＮＵＭＡｌ、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＯＬＩＧ２、ＯＭＤ、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＢＸ１、ＰＣＭ１、ＰＣＳＫ７、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＲＩ、ＰＩＩＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＭＬ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＸ１、ＰＮＵＴＬ１、ＰＯＴ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＲＣＣ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＯ１０７３、ＰＳＩＰ２、ＰＴＣＨ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＢ５ＥＰ、ＲＡＣｌ、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＲＡＦｌ、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＡＮＢＰ１７、ＲＡＰＩＧＤＳＩ、ＲＡＲＡ、ＲＢＩ、ＲＢＭ１５、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＮＦ４３、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ５、ＲＰＮ１、ＲＵＮＤＣ２Ａ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸＢＰ２、ＳＢＤＳ、ＳＤＣ４、ＳＤＨ５、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＥＰＴ６、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＳ３、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ３ＧＬ１、ＳＩＬ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＯ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＲＧＡＰ３、ＳＲＳＦ２、ＳＳＩ８、ＳＳ１８Ｌ１、ＳＳＨ３ＢＰ１、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＳＴＡＴ３、ＳＴＫ１１、ＳＴＬ、ＳＵＦＵ、ＳＩＪＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１５、ＴＡＬＩ、ＴＡＬ２、ＴＣＥＡ１、ＴＣＦ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ６、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ２、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＧ、ＴＦＰＴ、ＴＦＲＣ、ＴＨＲＡＰ３、ＴＩＦ１、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＯＰＩ、ＴＰ５３、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＴＰＲ、ＴＲＡ、ＴＲＡＦ７、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＰ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＴＴＬ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＳＰ６、ＶＨＬ、ＶＴＵＡ、ＷＡＳ、ＷＨＳＣ１、ＷＨＳＣ１Ｌ１、ＷＩＦ１、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＴＸ、ＷＷＴＲ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯｌ、ＹＷＨＡＥ、ＺＮＦ１４５、ＺＮＦ１９８、ＺＮＦ２７８、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ５２１、ＺＮＦ９、ＺＲＳＲ２またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されている方法は、遺伝性障害を有する対象を処置するために使用される。遺伝的疾患もしくは遺伝的状態または遺伝性障害を有する対象を処置する方法は、対象の細胞（複数可）にＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムを投与することを含む。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムの投与は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏであり得る。
遺伝性障害は、染色体領域内での突然変異または重複から（例えば、点突然変異、欠失、挿入、フレームシフト、染色体の重複または欠失から）生じ得る。遺伝性障害は任意の遺伝性障害であり得る。
一部の実施形態では、遺伝性障害は、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコーマリートゥース疾患、色盲、ネコ鳴き症候群、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヘモクロマトーシス、血友病、クラインフェルター症候群、神経線維腫症、フェニルケトン尿症、多嚢胞腎臓疾患、プラダー・ウィリ症候群、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、テイ−サックス病、ターナー症候群、異常ヘモグロビン症、またはこれらの任意の組合せである。
一部の実施形態では、遺伝性障害は、１ｐ３６欠失症候群、１８ｐ欠失症候群、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症、４７ＸＸＸ（トリプルＸ症候群）、４７ＸＸＹ（クラインフェルター症候群）、５−ＡＬＡ脱水酵素欠損性ポルフィリン症（ＡＬＡ脱水酵素欠損症）、５−アミノレブリン酸脱水酵素欠損症ポルフィリン症、５ｐ欠失症候群（ネコ鳴き症候群）（別名５ｐ−症候群）、細血管拡張運動失調（別名Ａ−Ｔ）、アルファ１−アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴ）、セルロプラスミン欠損症、軟骨無発生症ＩＩ型（ＡＣＧ２）、軟骨無形成症（ＡＣＨ）、酸性ベータ−グルコシダーゼ欠損症、ゴーシェ病（任意の型、例えば１型、２型、３型）、短頭合指症（アペール）（アペール症候群）、短頭合指症（任意の型、例えば、１型、２型、３型、５型）、ファイファー症候群、尖頭症、急性脳ゴーシェ病、急性間欠性ポルフィリン症、（ＡＩＰ）ＡＣＹ２欠損症、アルツハイマー病（ＡＤ）、アデレイド型頭蓋骨癒合症、ミュエンク症候群、大腸腺腫症、家族性大腸腺腫症、結腸の腺腫様ポリープ、家族性大腸腺腫症（ＡＤＰ）、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎障害、副腎性器症候群、副腎脳白質ジストロフィー、アンドロゲン不感性症候群（ＡＩＳ）、アルカプトン尿症（ＡＫＵ）、ＡＬＡ脱水酵素欠損性ポルフィリン症、ＡＬＡ−Ｄポルフィリン症、ＡＬＡ脱水酵素欠損症、アラジール症候群、白子症、アルカプトン尿症、アルカプトン尿症、アレキサンダー病、アルカプトン尿症、アルカプトン尿性組織黒変症、アルカプトン尿症（アルファ−１プロテアーゼインヒビター疾患）、アルファ−１関連肺気腫、アルファ−ガラクトシダーゼＡ欠損症、ファブリー病、アルストレム症候群、アレキサンダー病（ＡＬＸ）、遺伝性エナメル質形成不全症、アミノレブリン酸脱水酵素欠損症、アミノアシラーゼ２欠損症、カナバン病、アンダーソン−ファブリー病、アンドロゲン不感性症候群、遺伝性鉄芽球性貧血、Ｘ連鎖の鉄芽球性脾性貧血および／または家族性貧血、広汎性体幹角化血管腫、びまん性体部被角血管腫、網膜血管腫症、フォンヒッペル−リンドウ疾患、ＡＰＣ抵抗性、ライデン型、第Ｖ因子ライデン栓友病、アペール症候群、ＡＲ欠損症、アンドロゲン不感性症候群、シャルコーマリートゥース病（任意の型、例えば、ＣＭＴ１、ＣＭＴＸ、ＣＭＴ２、ＣＭＴ４、重度早期開始ＣＭＴ）、クモ指症、マルファン症候群、ＡＲＮＳＨＬ、非症候性難聴（常染色体劣性、常染色体優性、ｘ連鎖、またはミトコンドリア）、遺伝性進行性関節眼疾患、スティックラー症候群（例えばＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＯＬ９Ａ１）、先天性多発性関節弛緩症、エーラース−ダンロス症候群（例えば過剰運動型、多発性関節弛緩型、古典型、血管型、後側弯型、皮膚脆弱型）Ａｓｐ欠損症、Ａｓｐａ欠損症、アスパルトアシラーゼ欠損症、細血管拡張運動失調、自閉症−認知症−運動失調−目的のない手の動き症候群、レット症候群、常染色体優性若年型ＡＬＳ、常染色体優性ｏｐｉｔｚ Ｇ／ＢＢＢ症候群、常染色体劣性形態の若年型ＡＬＳ３型、筋萎縮性側索硬化症（任意の型；例えば、ＡＬＳ１、ＡＬＳ２、ＡＬＳ３、ＡＬＳ４、ＡＬＳ５、ＡＬＳ５、ＡＬＳ６、ＡＬＳ７、ＡＬＳ８、ＡＬＳ９、ＡＬＳ１０、ＡＬＳ１１、ＡＬＳ１２、ＡＬＳ１３、ＡＬＳ１４、ＡＬＳ１５、ＡＬＳ１６、ＡＬＳ１７、ＡＬＳ１８、ＡＬＳ１９、ＡＬＳ２０、ＡＬＳ２１、ＡＬＳ２２、ＦＴＤＡＬＳ１、ＦＴＤＡＬＳ２、ＦＴＤＡＬＳ３、ＦＴＤＡＬＳ４、ＦＴＤＡＬＳ４、ＩＢＭＰＦＤ２）、常染色体劣性非症候性難聴、常染色体劣性感覚神経的な聴力機能障害および甲状腺腫、ペンドレッド症候群、アレキサンダー疾患（ＡｘＤ）、アイエルザ症候群、家族性（ｆａｍｉｌｉｌａｌ）肺動脈性肺高血圧症、ヘキソサミニダーゼＧＭ２ガングリオシドーシスのＢバリアント、サンドホフ病、ＢＡＮＦ関連障害、神経線維腫症（任意の型、例えば、ＮＦ１、ＮＦ２、神経鞘腫症）、ベーレ−スティーブンソン脳回状頭皮症候群、良性発作性腹膜炎、ベンジャミン症候群、ベータ−サラセミア、ＢＨ４欠損症、テトラヒドロビオプテリン欠損症、両側性聴神経線維腫症、ビオチニダーゼ欠損症、膀胱がん、出血性障害、第Ｖ因子ライデン栓友病、ブロッホズルツベルガー症候群、色素失調症、ブルーム症候群、骨疾患、ブルタヴィーユ病、結節性硬化症、脳疾患、プリオン病、乳がん、バート−ホッグ−デュベ症候群、骨粗鬆症、骨形成不全症、広幅指−母趾症候群、ルビンシュタイン−テイビ症候群、青銅糖尿病、血色症、青銅硬変、球脊髄性筋萎縮症、Ｘ連鎖脊髄性延髄性筋萎縮症、ビュルガー−グリュッツ症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ＣＧＤ慢性肉芽腫性障害、屈曲肢異形成症、家族性がん症候群、遺伝性非ポリポーシス直腸結腸がん、乳がん、膀胱がん、カルボキシラーゼ欠損症、多発性遅発性ビオチニダーゼ欠損症、ネコ鳴き症候群、ケーラー心顔症候群、セラミドトリヘキソシダーゼ欠損症、小脳網膜血管腫症、家族性フォンヒッペル−リンドウ病、脳動脈症、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、脳常染色体優性動脈症（ａｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、大脳萎縮性高アンモニア血症、レット症候群、セレブロシドリピドーシス症候群、シャルコー病、ＣＨＡＲＧＥ症候群、軟骨形成異常症、軟骨形成異常症症候群、感音性難聴を伴う軟骨形成異常症、耳脊椎巨大骨端異形成、軟骨形成不全症、舞踏病アテトーゼ（自傷行為）、高尿酸血症症候群（レッシュナイハン症候群）、古典的ガラクトース血症、ガラクトース血症、口唇裂および口蓋裂、スティックラー症候群、致死性小人症を伴うクローバ形頭蓋、致死性骨異形成症（例えば１型または２型）、コフィン−ローリー症候群（ＣＬＳ）、コケイン症候群、コフィン−ローリー症候群、コラーゲン異常症ＩＩ型およびＸＩ型、家族性の非ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス直腸結腸がん、家族性の結腸がん、家族性大腸腺腫症、直腸結腸がん、完全ＨＰＲＴ欠損症（レッシュナイハン症候群）、完全ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、圧迫性ニューロパシー、遺伝性圧脆弱性ニューロパシー、結合組織疾患、円錐動脈幹異常顔貌症候群、クーリー貧血、ベータ−サラセミア、銅蓄積症、ウィルソン病、銅輸送病、メンケス病、コプロポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、コプロポルフィリノーゲン酸化酵素欠損症、カウデン症候群、ＣＰＸ欠損症、頭蓋顔面関節異常、クルーゾン症候群、頭蓋顔面異骨症、クルーゾン症候群、クローン病、線維性狭窄、クルーゾン症候群、黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群、コケイン症候群（ＣＳ）、カウデン症候群、クルシュマン−バッテン−シュタイナート症候群、ベーレ−スティーブンソンの脳回状頭皮症候群、ベーレ−スティーブンソン脳回状頭皮症候群、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素欠損症、高シュウ酸塩尿、原発性まだらの骨幹端症候群、ストラドウィック型脊椎骨端骨幹端異形成、アルツハイマー型認知症（ＤＡＴ）、遺伝性高カルシウム尿症、デント病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型およびベッカー型）、甲状腺腫を伴う難聴、ペンドレッド症候群、難聴網膜色素変性症症候群、アッシャー症候群、フェニルアラニン水酸化酵素欠損症疾患、神経変性疾患、ｄｅ Ｇｒｏｕｃｈｙ症候群１、Ｄｅ Ｇｒｏｕｃｈｙ症候群、デジェリン−ソッタス症候群、デルタ−アミノレブリン酸脱水酵素欠損性ポルフィリン症、認知症（ＣＡＤＡＳＩＬ症候群）、脱髄型大脳白質萎縮症、アレキサンダー病、皮膚脆弱型エーラース−ダンロス症候群（皮膚脆弱）、遺伝性発達障害、遠位遺伝性運動ニューロパシー（ｄＨＭＮ）、遠位遺伝性運動ニューロパシー（例えば、ＤＨＭＮ−Ｖ）、ＤＨＴＲ欠損症、アンドロゲン不感性症候群、びまん性のグロボイド体硬化症、クラッベ病、ディジョージ症候群、ジヒドロテストステロン受容体欠損症、アンドロゲン不感性症候群、遠位遺伝性運動ニューロパシー、筋直性ジストロフィー（１型または２型）、遠位型脊髄性筋萎縮症（任意の型、例えば、１型、２型、３型、４型、５型、６型を含む）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、小人症（任意の種類、例えば、軟骨形成不全型、軟骨無形成症、致死性骨異形成型）、小人症−網膜萎縮−難聴症候群、コケイン症候群、脱髄性白質ジストロフィー（アレキサンダー病）、筋強直性ジストロフィー、異栄養網膜色素性骨形成不全症候群（アッシャー症候群）、早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）、アルツハイマー病（例えば１型、２型、３型、または４型を含む）、エクマンロブシュタイン病、骨形成不全症、絞扼性ニューロパシー、遺伝性圧脆弱性ニューロパシー、赤芽球型プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、赤芽球性貧血、ベータ−サラセミア、赤芽肝性プロトポルフィリン症、赤血球５−アミノレブリン酸合成酵素欠損症、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血、眼のがん、網膜芽腫ＦＡ−フリードライヒ運動失調症、フリードライヒ運動失調症、ＦＡ、ファンコニ貧血、顔面傷害および障害、第Ｖ因子ライデン栓友病、ＦＡＬＳ、筋萎縮性側索硬化症、家族性聴神経腫瘍、家族性腺腫性ポリポーシス、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）、家族性筋萎縮性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、家族性自律神経異常症、家族性脂肪誘発性高トリグリセリド血症（家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症）、家族性血色症、血色症、家族性ＬＰＬ欠損症（家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症）、家族性非ポリポーシス結腸がん、遺伝性非ポリポーシス直腸結腸がん、家族性発作性多発性漿膜炎、家族性ＰＣＴ、晩発性皮膚ポルフィリン症、家族性圧力感受性のニューロパシー、遺伝性圧脆弱性ニューロパシー、家族性原発性肺高血圧（ＦＰＰＨ）、家族性血管系白質脳症、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ＦＡＰ（家族性腺腫性ポリポーシス）、ＦＤ（家族性自律神経異常症）、フェロケラターゼ欠損症、フェロポーチン疾患、ヘモクロマトーシス（任意の型、例えば、１型、２Ａ型、２Ｂ型、３型、４型、新生児ヘモクロマトーシス、セルロプラスミン欠損症（ａｃａｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎａｅｍｉａ）、先天性無トランスフェリン血症、ｇｒａｃｉｌｅ症候群）周期熱症候群（ｓｙｎｄｏｍｅ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、ＦＧ症候群、ＦＧＦＲ３−関連冠状縫合骨癒合症、星状細胞のフィブリノイド変性（アレキサンダー病）、膵臓の線維嚢胞性疾患、フォリング病、ｆｒａ（Ｘ）症候群、脆弱Ｘ症候群、骨脆弱症、骨形成不全症、ＦＲＡＸＡ症候群、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、Ｇ６ＰＤ欠損症、ガラクトキナーゼ欠損症疾患（ガラクトース血症）、ガラクトース−１−リン酸ウリジル−トランスフェラーゼ欠損症疾患（ガラクトース血症）、ガラクトシルセラミダーゼ欠損症疾患（クラッベ病）、ガラクトシルセラミドリピドーシス（クラッベ病）、ガラクトシルセレブロシダーゼ欠損症、ガラクトシルスフィンゴシンリピドーシス、ＧＡＬＣ欠損症、ＧＡＬＴ欠損症（ガラクトース血症）、ゴーシェ病様疾患、擬似ゴーシェ病疾患、ＧＢＡ欠損症、遺伝性脳障害、遺伝性肺気腫、遺伝性血色症、血色症、巨細胞性肝炎（新生児）、新生児血色症、ＧＬＡ欠損症、網膜神経膠芽細胞腫（網膜芽腫）、網膜神経膠腫（網膜芽腫）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（ＧＣＬ、ＧＬＤ）、（クラッベ病）、グロボイド細胞白質脳症、グルコセレブロシダーゼ欠損症、グルコセレブロシドーシス、グルコシルセレブロシドリピドーシス、グルコシルセラミダーゼ欠損症、グルコシルセラミドベータ−グルコシダーゼ欠損症、グルコシルセラミドリピドーシス、グリセリン酸尿症、原発性高シュウ酸塩尿症、グリシン脳症、非ケトン性高グリシン血症、グリコール酸尿症、原発性高シュウ酸塩尿症、ＧＭ２ガングリオシドーシス、テイ−サックス病、甲状腺腫−難聴症候群（ペンドレッド症候群）、グレーフ−アッシャー症候群（アッシャー症候群）、グレンブラッド−ストランドベリー症候群、弾性線維性仮性黄色腫、ヘモクロマトーシス（血色症）、ハルグレン症候群、アッシャー症候群、ハーレクイン型魚鱗癬、Ｈｂ Ｓ病、軟骨低形成
症（ＨＣＨ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、頭部および脳の奇形、聴覚障害および難聴、小児における聴覚問題、ＨＥＦ２Ａ、ＨＥＦ２Ｂ、ヘマトポルフィリン症（ポルフィリン症）、ヘム合成酵素欠損症、ヘモクロマトーシス、ヘモグロビンＭ病、ベータ−グロビン型メトヘモグロビン血症、ヘモグロビンＳ病、血友病、骨髄肝性ポルフィリン症（ＨＥＰ）、肝性ＡＧＴ欠損症、原発性高シュウ酸塩尿症、肝レンズ核変性症候群、ウィルソン病、遺伝性関節眼疾患、スティックラー症候群、遺伝性異所性リピドーシス、遺伝性血色症（ＨＨＣ）（血色症）、遺伝性出血性末梢血管拡張症（ＨＨＴ）、遺伝性封入体筋炎、骨格筋再生、遺伝性鉄付加性貧血、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血、遺伝性運動性および感覚性ニューロパシー、遺伝性運動ニューロノパシー、Ｖ型、遠位性遺伝性運動ニューロパシー、遺伝性多発性外骨腫、遺伝性非ポリポーシス直腸結腸がん、遺伝性周期熱症候群、遺伝性大腸ポリポーシス、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性肺気腫、活性化プロテインＣに対する遺伝性抵抗性、第Ｖ因子ライデン栓友病、遺伝性感覚性および自律神経ニューロパシーＩＩＩ型、家族性自律神経異常症、遺伝性痙性対麻痺、乳児期開始上行性遺伝性痙性運動麻痺、遺伝性脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調症、遺伝性脊髄硬化症（フリードライヒ運動失調症）、ヘリック貧血症、ヘテロ接合性ＯＳＭＥＤ（ヴァイセンバッヒャー−ツヴァイミュラー症候群）、ヘテロ接合性耳脊椎巨大骨端異形成（ヴァイセンバッヒャー−ツヴァイミュラー症候群）、ＨｅｘＡ欠損症（テイ−サックス病）、ヘキソサミニダーゼＡ欠損症（テイ−サックス病）、ヘキソサミニダーゼアルファ−サブユニット欠損症（任意のバリアント、例えばバリアントＡ、バリアントＢ）（テイ−サックス病）、ＨＦＥ−関連血色症（血色症）、ＨＧＰＳ（早老症）、ヒッペル−リンドウ病（フォンヒッペル−リンドウ病）、血色症（ＨＬＡＨ）、遠位遺伝性運動ニューロパシー（ＨＭＮ Ｖ）、遺伝性非ポリポーシス直腸結腸がん（ＨＮＰＣＣ）、遺伝性圧脆弱性ニューロパシー（ＨＮＰＰ）、ホモシスチン尿症、ホモゲンチジン酸酸化酵素欠損症、（アルカプトン尿症）、ホモゲンチジン酸尿症（アルカプトン尿症）、ホモ接合性晩発性皮膚ポルフィリン症（骨髄肝性ポルフィリン症）、原発性高シュウ酸塩尿症（ＨＰ１）、高シュウ酸塩尿症（ＨＰ２）、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）、ＨＰＲＴ−ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症（レッシュ−ナイハン症候群）、ＨＳＡＮ ＩＩＩ型、家族性自律神経異常症、家族性自律神経異常症（ＨＳＡＮ３）、遺伝性感覚性ニューロパシー（任意の型、例えば、ＨＳＮ−１、ＨＳＮ−ＩＩ、ＨＳＮ−ＩＩＩ）、家族性自律神経異常症、ヒト皮膚脆弱、ハンチントン病、ハッチンソン−ギルフォード早老症候群（早老）、２１水酸化酵素欠損症による非古典型アンドロゲン過剰症、高カイロミクロン血症、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性、ケトアシドーシスおよび白血球減少症を伴う高グリシン血症（プロピオン酸血症）、高リポタンパク質血症Ｉ型、リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性高シュウ酸塩尿症、原発性高フェニルアラニン血症（ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｅｍｉａ）（高フェニルアラニン血症）、高フェニルアラニン血症、軟骨異形性軟骨低形成症、軟骨低発生症、軟骨低形成症、低色素性貧血、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）欠損症、レッシュ−ナイハン症候群、乳児期開始上行性遺伝性痙性運動麻痺（ＩＡＨＳＰ）、ＩＣＦ症候群、免疫不全、動原体不安定性および顔面奇形症候群、特発性血色症、血色症３型、特発性の新生児の血色症（血色症）、新生児特発性肺高血圧、免疫系障害、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、色素失調症、乳児脳性ゴーシェ病、乳児ゴーシェ病、乳児期開始上行性遺伝性痙性運動麻痺、不妊症、遺伝性肺気腫、圧迫性麻痺への遺伝性傾向、遺伝性圧脆弱性ニューロパシー、Ｉｎｓｌｅｙ−Ａｓｔｌｅｙ症候群（耳脊椎巨大骨端異形成）、間欠性急性ポルフィリン症症候群（急性間欠性ポルフィリン症）、腸ポリポーシス−皮膚色素沈着症候群（ポイツ−ジェガース症候群）、色素失調症（ＩＰ）、鉄蓄積障害（血色症）、イソジセントリック１５、イソジセントリック１５、非症候性難聴（Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｄｅａｆｎｅｓｓ）、非症候性難聴（ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｄｅａｆｎｅｓｓ）、ジャクソン−ワイス症候群、ジュベール症候群、若年性原発性側索硬化症（ＪＰＬＳ）、若年性筋萎縮性側索硬化症、若年性痛風、舞踏病アテトーゼ、精神遅滞症候群、レッシュ−ナイハン症候群、若年性高尿酸血症症候群、レッシュ−ナイハン症候群、ジャクソン−ワイス症候群（ＪＷＳ）、球脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、球脊髄性筋萎縮症、ケネディ球脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、ケラシン組織球症、ケラシンリポイドーシス、ケラシン蓄積症、ケトーシス型グリシン血症（プロピオン酸血症）、ケトーシス型高グリシン血症（プロピオン酸血症）、腎臓病、原発性高シュウ酸塩尿症、Ｋｎｉｅｓｔ異形成、クラッベ病、クーゲルベルク−ヴェランダー病、脊髄性筋萎縮症、ラクナ認知症、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｌｄｉｎｏ型軟骨無発生症、Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｌｄｉｎｏ型異形成、遅発性アルツハイマー病、遅発性クラッベ病（ＬＯＫＤ）（クラッベ病）、学習障害、学習能力障害、口周囲黒子症、ポイツ−ジェガース症候群、レッシュ−ナイハン症候群、白質ジストロフィー、ローゼンタール線維を伴う白質ジストロフィー（アレキサンダー病）、海綿状白質ジストロフィー、リー−フラウメニ症候群（ＬＦＳ）、リー−フラウメニ症候群リパーゼＤ欠損症、リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性ＬＩＰＤ欠損症、リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性セレブロシドリピドーシス、乳児期ガングリオシドリピドーシス、テイ−サックス病、リポイド組織球症（ケラシン型）、リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性肝疾患（ガラクトース血症）、ルーゲーリック病、ルイバー症候群、細血管拡張運動失調、リンチ症候群（遺伝性非ポリポーシス直腸結腸がん）、リシル水酸化酵素欠損症、マシャドジョセフ病、脊髄小脳変性症（任意の型、例えばＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ１８、ＳＣＡ２０、ＳＣＡ２１、ＳＣＡ２３、ＳＣＡ２６、ＳＣＡ２８、ＳＣＡ２９）、男性乳がん（乳がん）、男性生殖器障害、乳房の悪性新生物（乳がん）、乳房の悪性腫瘍（乳がん）、膀胱の悪性腫瘍（膀胱がん）、乳房のがん（乳がん）、マルファン症候群、マーカーＸ症候群、脆弱Ｘ症候群、マーティン−ベル症候群、脆弱Ｘ症候群、マキューン−オルブライト症候群、マクラウド症候群、ＭＥＤＮＩＫ症候群、地中海性貧血、ベータ−サラセミア、巨大骨端性小人症、耳脊椎巨大骨端異形成、メンケア病（メンケス病）、メンケス病、骨軟骨異常を伴う精神遅滞、コフィン−ローリー症候群、代謝障害、変容性小人症ＩＩ型、Ｋｎｉｅｓｔ異形成、変容性異形成ＩＩ型、Ｋｎｉｅｓｔ異形成、メトヘモグロビン血症（任意の型、例えば先天性、ベータ−グロビン型、先天性メトヘモグロビン血症ＩＩ型）、メチルマロン酸血症、マルファン症候群（ＭＦＳ）、ＭＨＡＭ、カウデン症候群、ミクロ症候群、小頭症、ＭＭＡ、メチルマロン酸血症、メンケス病（別名ＭＫまたはＭＮＫ）、モノソミー１ｐ３６症候群、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、運動障害、モワット−ウィルソン症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）、膵臓線維症、多発硬化性認知症、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、多発性カルボキシラーゼ欠損症、遅発性ビオチニダーゼ欠損症、多発性過誤腫症候群（カウデン症候群）、多発性神経線維腫症、筋ジストロフィー（任意の型、例えば、デュシェンヌ型およびベッカー型を含む）、萎縮性ミオトニー、筋直性ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、Ｎａｎｃｅ−Ｉｎｓｌｅｙ症候群（耳脊椎巨大骨端異形成）、Ｎａｎｃｅ−Ｓｗｅｅｎｅｙ軟骨異形成（耳脊椎巨大骨端異形成）、ＮＢＩＡ１、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、ニール−ディングウォール症候群、コケイン症候群、網膜神経芽細胞腫、網膜芽腫、脳内鉄蓄積１型を伴う神経変性、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、神経疾患、神経筋障害、遠位性遺伝性運動ニューロノパシー、ニーマンピック（ニーマンピック病）、ノアク症候群、非ケトン性高グリシン血症、グリシン脳症、非神経障害性ゴーシェ病、非フェニルケトン尿症型高フェニルアラニン血症、テトラヒドロビオプテリン欠損症、非症候性難聴、ヌーナン症候群、ノルボットン型ゴーシェ病、組織黒変症、アルカプトン尿症、アルカプトン尿性関節炎、オグデン症候群、骨形成不全症（ＯＩ）、オスラー−ウェーバー−ランデュ病、遺伝性出血性末梢血管拡張症、ＯＳＭＥＤ（耳脊椎巨大骨端異形成）、骨形成不全症、骨脆弱症（骨形成不全症）、先天性骨硬化症（耳脊椎巨大骨端異形成）、耳脊椎巨大骨端異形成（耳脊椎巨大骨端異形成）、シュウ酸症、原発性高シュウ酸塩尿症、原発性シュウ酸塩尿症、原発性高シュウ酸塩尿症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パトー症候群（トリソミー１３）、ＰＢＧＤ欠損症（急性間欠性ポルフィリン症）、ＰＣＣ欠損症、プロピオン酸血症、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、ＰＤＭ病、ペンドレッド症候群、周期性疾患（地中海性発熱、家族性周期性腹膜炎）、口周囲多発性黒子症症候群（ポイツ−ジェガース症候群）、末梢神経障害（家族性自律神経異常症）、末梢性神経線維腫症、腓骨筋萎縮、ペルオキシソームアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損症、高シュウ酸塩尿症、原発性ポイツ−ジェガース症候群、フェニルアラニン水酸化酵素欠損症疾患、褐色細胞腫、フォンヒッペル−リンドウ疾患、胎児性軟骨異形成を伴うピエール−ロビン症候群、ヴァイセンバッヒャー−ツヴァイミュラー症候群、色素性肝硬変症（血色症）、ポイツ−ジェガース症候群（ＰＪＳ）、パントテン酸キナーゼ関連神経変性（ＰＫＡＮ）、ＰＫＵ、フェニルケトン尿症、プルモボポルフィリン症、ＡＬＡ欠損症ポルフィリン症、ＰＭＡ、多発性嚢胞腎、多骨性線維性異形成（マキューン−オルブライト症候群）、家族性腺腫性ポリポーシス、過誤腫性大腸ポリポーシス、ポリープおよび色素斑症候群（ポイツ−ジェガース症候群）、ポルフォビリノーゲン合成酵素欠損症、ＡＬＡ欠損症ポルフィリン症、ポルフィリン障害、ＰＰＯＸ欠損症、異型ポルフィリン症、プラダー−ラープハルト−ウィリー症候群、プラダー・ウィリ症候群、初老および老人性認知症、原発性線毛機能不全（ＰＣＤ）、原発性血色症（血色症）、原発性高尿酸血症症候群、レッシュ−ナイハン症候群、原発性老年性変性認知症、プロコラーゲン型ＥＤＳ ＶＩＩ、突然変異型早老型ハッチンソンギルフォード早老症候群、早老様症候群（コケイン症候群）、早老症性小体症（コケイン症候群）、進行性舞踏病、慢性遺伝性（ハンチントン）、ハンチントン病、正常な強膜を伴う進行性変形性骨形成不全症、骨形成不全症（任意の型、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＶＩＩＩ型）、近位筋直性ジストロフィー（ＰＲＯＭＭ）、プロピオン酸血症、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症、プロテインＣ欠損症、プロテインＳ欠損症、プロトポルフィリン症、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素欠損症、異型ポルフィリン症、近位筋直性ジストロフィー、筋直性ジストロフィー２型、近位筋強直性ミオパシー、擬似ゴーシェ病、弾性線維性仮性黄色腫、サイコシンリピドーシス（クラッベ病）、肺動脈性肺高血圧症、肺高血圧、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、弾性線維性仮性黄色腫、網膜芽腫（Ｒｂ）、レックリングハウゼン病、再発性多発性漿膜炎、網膜障害、網膜色素変性症−難聴症候群、アッシャー症候群、網膜芽腫、レット症候群、３型ＲＦＡＬＳ、リッカー症候群、ライリー−デイ症候群、家族性自律神経異常症、ルシー−レヴィ症候群、ルビンシュタイン−テイビ症候群（ＲＳＴＳ）、レット症候群（ＲＴＳ）、ルビンシュタイン−テイビ症候群、ルビンシュタイ
ン−テイビ症候群、サック−バラバス症候群、ＳＡＤＤＡＮ疾患、リーおよびフラウメニの家族性肉腫症候群（リー−フラウメニ症候群）、ＳＢＬＡ症候群（肉腫、乳房、白血病、および副腎症候群）（リー−フラウメニ症候群）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、シュワン細胞腫、両側性、聴覚神経線維腫症ＩＩ型、シュワルツヤンペル症候群、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤＸ１）、先天性ＳＥＤ、先天性脊椎骨端異形成、ストラドウィック型ＳＥＤ、ストラドウィック型脊椎骨端骨幹端異形成、先天性脊椎骨端異形成（ＳＥＤｃ）、脊椎骨端骨幹端異形成（ＳＥＭＤ）、ストラドウィック型ＳＥＭＤ、老人性認知症、発育遅延および黒色表皮腫を伴う重度の軟骨無形成症、ＳＡＤＤＡＮ疾患、シュプリンツェン症候群、ＰＨＦ８遺伝子の突然変異によって引き起こされるＳｉｄｅｒｉｕｓ Ｘ連鎖精神遅滞症候群、軟骨無形成症、皮膚色素沈着障害、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、脊椎骨幹端骨端異形成症（ＳＭＥＤ）（任意の型、例えばＳｔｕｄｗｉｃｋ型、１型）、スミス−レムリ−オピッツ症候群、スミス−マゲニス症候群、南アフリカ遺伝性ポルフィリン症、乳児期開始上行性痙性運動麻痺、乳児期開始上行性遺伝性痙性運動麻痺、発話能力およびコミュニケーション障害、スフィンゴリピドーシス、テイ−サックス（テイ−サックス病）、球脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症（遠位性Ｖ型）、遠位性遺伝性運動ニューロパシー、上肢優位を伴う遠位性脊髄性筋萎縮症、遠位性遺伝性運動ニューロパシー、脊髄小脳変性症、先天性脊椎骨端異形成、脊椎骨端異形成、コラーゲン異常症（任意の型、例えばＩＩ型およびＸＩ型）、脊椎骨端骨幹端異形成、脊椎骨幹端異形成（ＳＭＤ）（脊椎骨端骨幹端異形成）、中枢神経系の海綿状変性、脳の海綿状変性、乳児期の白質の海綿状変性、散発性原発性肺高血圧、ＳＳＢ症候群、剛毛症候群（メンケス病）、スタイナート病（筋直性ジストロフィー）、スタイナート筋直性ジストロフィー症候群（筋直性ジストロフィー）、スティックラー症候群、脳卒中、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ストラドウィック症候群、亜急性神経障害性ゴーシェ病、スウェーデン遺伝性ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症、スイスチーズ軟骨異形成、Ｋｎｉｅｓｔ異形成、テイ−サックス病、ＴＤ−致死性小人症、致死性骨異形成症、まっすぐな大腿およびクローバ形頭蓋を伴うＴＤ、致死性骨異形成症２型、末梢血管拡張症、小脳眼皮膚細血管拡張運動失調、精巣性女性化症候群（アンドロゲン不感性症候群）、テトラヒドロビオプテリン欠損症、精巣性女性化症候群（ＴＦＭ）（アンドロゲン不感性症候群）、中間型サラセミア（ベータ−サラセミア）、重症型サラセミア（ベータ−サラセミア）、致死性骨異形成症、活性化プロテインＣコファクター欠損による、ライデン型栓友病（第Ｖ因子ライデン栓友病）、甲状腺疾患、ソーセージ様ニューロパシー、遺伝性圧脆弱性ニューロパシー、全ＨＰＲＴ欠損症、レッシュ−ナイハン症候群、全ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、レッシュ−ナイハン症候群、トレハーコリンズ症候群、三徴候骨脆弱症、トリプルＸ症候群、ＴｒｉｐｌｏＸ症候群、トリソミー２１、トリソミーＸ、トロアジュ−ハノット−シャウファード症候群（血色症）、テイ−サックス病（ＴＳＤ）、結節性硬化症症候群（ＴＳＣ）、結節性硬化症、ターナー様症候群、ヌーナン症候群、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ欠損症疾患、ガラクトース血症、ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ欠損症疾患、ガラクトース血症、ＵＤＰグルコースヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ欠損症、ガラクトース血症、未分化難聴、非症候性難聴、ＵＰＳ欠損症、急性間欠性ポルフィリン症、膀胱のがん、膀胱がん、ＵＲＯＤ欠損症、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ欠損症、ウロポルフィリノーゲン合成酵素欠損症、急性間欠性ポルフィリン症、アッシャー症候群、ＵＴＰヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ欠損症（ガラクトース血症）、Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ−Ｂｅｒｔｒａｎｄ症候群、ファンデルヘーヴェ症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＶＨＬ症候群、フォンヒッペル−リンドウ疾患、視覚機能障害および失明、アルストレム症候群、Ｖｏｎ Ｂｏｇａｅｒｔ−Ｂｅｒｔｒａｎｄ疾患、フォンヒッペル−リンドウ疾患、Ｖｏｎ Ｒｅｃｋｌｅｎｈａｕｓｅｎ−Ａｐｐｌｅｂａｕｍ疾患（血色症）、フォンレックリングハウゼン病、神経線維腫症Ｉ型、フロリク病、骨形成不全症、ワールデンブルグ症候群、Ｗａｒｂｕｒｇ Ｓｊｏ Ｆｌｅｄｅｌｉｕｓ症候群、マイクロ症候群、ウィルソン病（ＷＤ）、ヴァイセンバッハー−ツヴェイミューラー症候群、ウェルドニッヒ−ホフマン病、脊髄性筋萎縮症、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィルソン病、ウィルソン病、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウォルフ周期病、ヴァイセンバッヒャー−ツヴァイミュラー症候群（ＷＺＳ）、色素性乾皮症、Ｘ連鎖精神遅滞および巨精巣症、脆弱Ｘ症候群、Ｘ連鎖原発性高尿酸血症（レッシュ−ナイハン症候群）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血、Ｘ連鎖脊髄性−延髄性筋萎縮、球脊髄性筋萎縮症、Ｘ連鎖尿酸尿酵素欠損症、（レッシュ−ナイハン症候群）、Ｘ−ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、Ｘ−ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、ＸＳＣＩＤ、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、ＸＸＸ症候群、トリプルＸ症候群、ＸＸＸＸ症候群、ＸＸＸＸＸ症候群、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＹ症候群、ＸＸＹトリソミー、クラインフェルター症候群、ＸＹＹ症候群、トリプレットリピート障害、またはこれらの任意の組合せである。
ある実施形態では、特定の転写後制御モジュレーターは、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムを投与することにより、活性のモジュレーション、改変、増強または低減に対して標的化される。例えば、転写後制御モジュレーターとして、ＰＡＲＮ、ＰＡＮ、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＰＡＰ、ＰＡＢＰ、ＰＡＢ２、ＣＦＩ、ＣＦＩＩ、ＲＮＡトリホスファターゼ、ＲＮＡグルタミルトランスフェラーゼ（ｇｌｕａｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＳＡＭシンターゼ、ユビキチン複合体化酵素Ｅ２Ｒ、ＳＲタンパク質ＳＦＲＳ１〜ＳＦＲ１１、ｈｎＲＮＰタンパク質（例えば、ＨＮＲＮＰＡ０、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ１Ｌ１、ＨＮＲＮＰＡ１Ｌ２、ＨＮＲＮＰＡ２、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＨＮＲＮＰＢ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＣＬ１、ＨＮＲＮＰＤ、ＨＮＲＰＤＬ、ＨＮＲＮＰＦ、ＨＮＲＮＨＰ１、ＨＮＲＮＰＨ２、ＨＮＲＮＰＨ３、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＬＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＲ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＨＮＲＮＰＵＬ２、ＨＮＲＮＰＵＬ３、ＡＤＡＲ、Ｍｅｘ６７、Ｍｔｒ２、Ｎａｂ２、Ｄｅａｄ−ｂｏｘｈｅｌｉｃａｓｅ、ｅｌＦ４Ａ、ｅｌＦ４Ｂ、ｅｌＦ４Ｅ、ｅｌＦ４Ｇ、ＧＥＦ、ＧＣＮ２、ＰＫＲ、ＨＲＩ、ＰＥＲＫ、ｅＥＦ１、ｅＥＦ２、ＧＣＮ、ｅＲＦ３、ＡＲＥ特異結合タンパク質、ＥＸＲＮ１、ＤＣＰ１、ＤＣＰ２、ＲＣＫ／ｐ５４、ＣＰＥＢ、ｅＩＦ４Ｅ、ミクロＲＮＡＳおよびｓｉＲＮＡ、ＤＩＣＥＲ、Ａｇｏタンパク質、ナンセンス−媒介ｍＲＮＡ分解タンパク質、ＵＰＦ３Ａ、ＵＰＦ３ＢｅＩＦ４Ａ３、ＭＬＮ５１、Ｙ１４／ＭＡＧＯＨ、ＭＧ−１、ＳＭＧ−５、ＳＭＧ−６、ＳＭＧ−７、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムを投与することによって細胞周期に関連する遺伝子経路の活性を、モジュレート、増強または低減する。細胞周期に関連する例示的経路および遺伝子として、ＡＴＭ、ＰＭＳ２、ＦＡＳ−Ｌ、ＭＲＥ１１、ＭＬＨ１、ＦａｓＲ、ＮＢＳ１、ＭＳＨ６、Ｔｒａｉｌ−Ｌ、ＲＡＤ５０、ＭＳＨ２、Ｔｒａｉｌ−Ｒ、５３ＢＰ１、ＲＦＣ、ＴＮＦ−Ｃｔ、Ｐ５３、ＰＣＮＡ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＨＫＥ、ＭＳＨ３、ＦＡＤＤ、Ｅ２Ｆ１、ＭｕｔＳホモログ、ＴＲＡＤＤ、ＰＭＬ、ＭｕｔＬホモログ、Ｒ１Ｐ１、ＦＡＮＣＤ２、エキソヌクレアーゼ、ＭｙＤ８８、ＳＭＣ１、ＤＮＡ、ポリメラーゼデルタ、ＩＲＡＫ、ＢＬＭ１、（ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＤ３、ＮＩＬ、ＢＲＣＡ１、および、ＰＯＬＤ４、−遺伝子、ＩＫＫ、Ｈ２ＡＸ、コード、サブユニット）、ＮＦΚβ、ＡＴＲ、トポイソメラーゼ１、ΙκΒα、ＲＰＡ、トポイソメラーゼ２、ＩＡＰ、ＡＴＲＩＰ、ＲＮＡｓｅＨｌ、カスパーゼ３、ＲＡＤ９、リガーゼ、１、カスパーゼ、６、ＲＡＤ１、ＤＮＡ、ポリメラーゼ１、カスパーゼ７、ＨＵＳ、ＤＮＡ、ポリメラーゼ３、カスパーゼ８、ＲＡＤ１７、プライマーゼ、カスパーゼ１０、ＲＦＣ、ヘリカーゼ、ＨＤＡＣ１、ＣＨＫ１、一本鎖、結合、ＨＤＡＣ２、ＴＬＫ１タンパク質、シトクロムＣ、ＣＤＣ２５、Ｂｘｌ−ｘＬ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＤＦＦ４５、Ｖｃｌ−２、ＥＮＤＯ−Ｇ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、カルパイン、Ｂａｄ、Ｂａｘ、ユビキチン媒介タンパク質分解、低酸素、細胞増殖、ＨＩＦ−ｌｏｃ、ＭＡＰＫ、Ｅｌ、ＨＥＲＣ１、ＴＲＡＦ６、ＨＩＦ−Ιβ、ＭＡＰＫＫ、Ｅ２、ＵＢＥ２Ｑ、ＭＥＫＫ１、Ｒｅｆｌ、ＭＡＰＫＫＫ、Ｅ３、ＵＢＥ２Ｒ、ＣＯＰ！、ＨＳＰ９０、ｃ−Ｍｅｔ、ＵＢＬＥ１Ａ、ＵＢＥ２Ｓ、ＰＩＦＨ２、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＵＢＬＥ１Ｂ、ＵＢＥ２Ｕ、ｃＩＡＰ、ＰＡＳ、ＥＲ、Ｓ１／２、ＵＢＬＥＩＣ、ＵＢＥ２Ｗ、ＰＩＡＳ、ＡＲＮＴ、ＡＴＫ、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｚ、ＳＹＶＮ、ＶＨＬ、ＰＫＣ、ＵＢＥ２Ｂ、ＡＦＣ、ＬＬＣ、Ｎ、ＮＨＬＲＣ１、ＨＬＦ、パキシリン、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ１、ＡＩＲＥ、ＥＰＦ、ＦＡＫ、ＵＢＥ２Ａ、Ｅ６ＡＰ、ＭＧＲＮ１、ＶＤＵ２、アデュシン、ＵＢＥ２Ｅ、ＵＢＥ３Ｂ、ＢＲＣＡ１、ＳＵＭＯＲＥＳＵＭＥ、ＰＹＫ１、ＵＢＥ２Ｆ、Ｓｍｕｒｆ、ＦＡＮＣＬ、ＳＥＮＰ１、ＲＢ、ＵＢＥ２Ｇ１、Ｉｔｃｈ、ＭＩＤＩ、カルシニューリンＡ、ＲＢＩ、ＵＢＥ２Ｇ２、ＨＥＲＣ２、Ｃｄｃ２０、ＲＡＣＫ１、Ｒａｆ−１、ＵＢＥ２Ｉ、ＨＥＲＣ３、Ｃｄｈｌ、ＰＴＢ、Ａ−Ｒａｆ、ＵＢＥ２Ｊ１、ＨＥＲＣ４、Ａｐｃｌ、Ｈｕｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＵＢＥ２Ｊ２、ＵＢＥ４Ａ、Ａｐｃ２、ＰＨＤ２、ＭＥＫ１／２、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥ４Ｂ、Ａｐｃ３、ＳＳＡＴ２、ＥＲＫ１／２、ＵＢＥ２Ｌ６、ＣＨＩＰ、Ａｐｃ４、ＳＳＡＴ１、Ｅｔｓ、ＵＢＥ２Ｍ、ＣＹＣ４、Ａｐｃ５、ＧＳＫ３、Ｅｌｋｌ、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＰＲ１９、Ａｐｃ６、ＣＢＰ、ＳＡＰ１、ＵＢＥ２０、ＵＩＰ５、Ａｐｃ７、ＦＯＸ０４、ｃＰＬＡ２、ＷＷＰＩ、Ｍｄｍ２、Ａｐｃ８、ＦｌＨ−１、ＷＷＰ２、Ｐａｒｋｉｎ、Ａｐｃ９、ＴＲＩＰ、１２、Ｔｒｉｍ３２、Ａｐｅ１０、ＮＥＥＤ４、Ｔｒｉｍ３７、Ａｐｅ１１、ＡＲＦ−ＢＰ１、ＳＩＡＨ−１、Ａｐｅ１２、ＥＤＤ１、ＰＭＬ、細胞生存期間、細胞周期停止、ＳＭＡＤＩ、Ｐ２１、ＳＭＡＤ５、ＢＡＸ、ＳＡＭＤ８、ＭＤＲ、ＬＥＦ１、ＤＲＡＩＬ、ＩＧＦＢＰ３、ＴＣＦ３、ＧＡＤＤ４５、ＴＣＦ４、Ｐ３００、ＨＡＴ１、ＰＩ３、Ａｋｔ、ＧＦ１、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムを投与することによって、血管新生に関連する遺伝子の活性を、モジュレート、増強または低減する。血管新生、および血管新生に関連する状態に関連する例示的な遺伝子および遺伝子経路として、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＳＨＣ、Ｅ２Ｆ７、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＲ３、ＰＩ３、ＶＥＧＦＣ、Ｎｒｐ１、ＰＩＰ３、ＥＧＦＤＩＰ３、ＤＡＧ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ、Ａｋｔ、ＰＢ、ＰＫＣ、Ｒａｓ、ＲＡＦ１、ＤＡＧ、ｅＮＯＳ、ＮＯ、ＥＲＫ１、ＥＲ２、ｃＰＬＡ２、ＭＥ１、ＭＥＫ２、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、細胞（複数可）にＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムを投与することによって、ミトコンドリア機能に関連する遺伝子経路および／または遺伝子の活性を、モジュレート、増強または低減する。ミトコンドリア機能に関連する例示的な遺伝子および遺伝子経路として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼアミノトランスフェラーゼ、ヒドラターゼ、デアシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、カルボキシラーゼ、ムターゼ、脂肪酸酸化ロイシン酸化イソロイシン障害（酵素経路酸化経路不全）アミノトランスフェラーゼアミノトランスフェラーゼ、ＯＣＴＮ２分枝鎖分枝鎖、ＦＡＴＰ１−６アミノトランスフェラーゼ２、アミノトランスフェラーゼ２、ＣＰＴ−１ミトコンドリアミトコンドリア、ＣＡＣＴイソブチル（Ｉｓｏｂｕｔｙｔｙｌ）−ＣｏＡ２−メチルブチル（ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｔｙｌ）−ＣｏＡ、ＣＰＴ−ＩＩデヒドロゲナーゼデヒドロゲナーゼ、ＳＣＡＤ（分枝鎖（分枝鎖、ＭＣＡＤケト酸ケト酸、ＶＬＣＡＤデヒドロゲナーゼ（Ｄｅｈｙｄｒｏｇａｓｅ）デヒドロゲナーゼ、ＥＴＦ−ＤＨ複合体）複合体）、アルファ−ＥＴＦヒドラターゼヒドラターゼ、ベータ−ＥＴＦ ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼ２−メチル−３−ＯＨ−ＳＣＨＡＤブチリル−ＣｏＡ、ＬＣＨＡＤデヒドロゲナーゼ、ＭＴＰ３−オキソチオラーゼ、ＬＫＡＴ、ＤＥＣＲ１、ＨＭＧＣＳ２、ＨＭＧＣＬ、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷またはゲノム不安定性に関連する遺伝子経路および／または遺伝子の活性を、モジュレート、増強または低減する。ＤＮＡ損傷およびゲノム不安定性に関する経路および／または遺伝子に関連する例示的遺伝子および遺伝子経路として、５３ＢＰ１、ＢＬＭ、ＭＢＤ２、ＤＮＡ、リガーゼ４、ＭＤＣ１、Ｈ２ＡＸ、ＸＬＦ、ＳＭＣ１、５３ＢＰ１、Ｒａｄ５０、Ｐ５３、Ｐ５３、Ａｒｔｅｍｉｓ、Ｒａｄ２７、ＴｄＴ、ＡＰＥ１、ＰＭＳ２、ＡＰＥ２、ＵｖｒＡ、ＲｅｃＡ、ＭＬＨ１、ＮＥＩＬ１、ＵｖｒＢ、ＳＳＢ、ＭＳＨ６、ＮＥＩＬ２、ＵｖｒＣ、Ｍｒｅｌｌ、ＭＳＨ２、ＮＥＩＬ３、ＸＰＣ、Ｒａｄ５０、ＲＦＣ、ＸＲＣＣ１、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｎｂｓｌ、ＰＣＮＡ、ＰＮＫＰ、ＣＥＮ２、ＣｔＩＰ、ＭＳＨ３、Ｔｄｐｌ、ＤＤＢ１、ＲＰＡ、ＭｕｔＳ、ＡＰＴＸ、ＸＰＥ、Ｒａｄ５１、ＭｕｔＬ、ＤＮＡポリメラーゼβＣＳＡ、Ｒａｄ５２、ＤＮＡポリメラーゼδ、ＣＳＢ、Ｒａｄ５４、トポイソメラーゼ１、ＤＮＡ、ＴＦＴ１Ｈ、ＢＲＣＡ１、トポイソメラーゼ２、ＰＣＮＡ、ＸＰＢ、ＢＲＣＡ２、ＲＮＡｓｅＨｌ、ＦＥＮ１、ＸＰＤ、Ｅｘｏｌ、リガーゼ１、ＲＦＣ、ＸＰＡ、ＢＬＭ、ＤＮＡ、ポリメラーゼ１、ＰＡＲ、１、ＲＰＡ、Ｔｏｐｌｌｌａ、ＤＮＡ、Ｌｉｇｌ、ＸＰＧ、ＧＥＮ１、プライマーゼ、Ｌｉｇ３、ＥＲＣＣ１Ｙｅｎｌヘリカーゼ、ＵＮＧ、ＸＰＦ、Ｓｌｘｌ、ＳＳＢ、ＭＵＴＹ ＤＮＡポリメラーゼδ、Ｓｌｘ４、ＳＭＵＧ ＤＮＡポリメラーゼε、Ｍｕｓ８、ＭＢＤ４、Ｅｍｅｌ、Ｄｓｓｌ、ＡＳＨ１Ｌ、ＳＥＴＤ４、ＤＱＴ１Ｌ、ＳＥＴＤ５、ＥＨＭＴ１、ＳＥＴＤ６、ＥＨＭＴ２、ＳＥＴＤ７、ＥＺＨ１、ＳＥＴＤ８、ＥＺＨ２、ＳＥＴＤ９、ＭＬＬ、ＳＥＴＤＢ１、ＭＬＬ２、ＳＥＴＤＢ２、ＭＬＬ３、ＳＥＴＭＡＲ、ＭＬＬ４、ＳＭＹＤ、１、ＭＬＬ５、ＳＭＹＤ２、ＮＳＤ、１、ＳＭＹＤ３、ＰＲＤＭ２、ＳＭＹＤ４、ＳＥＴ、ＳＭＹＤ５、ＳＥＴＢＰ１、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＥＴＤ１Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＥＴＤ２、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＳＥＴＤ３、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、哺乳動物転写因子をコードする遺伝子がモジュレート、増強、低減されるか、または細胞に提供される。例示的ヒト転写因子として、ＡＦＦ４、ＡＦＦ３、ＡＦＦ２、ＡＦＦ１、ＡＲ、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＦＡＰ２Ｄ、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＴＦＡＰ２Ａ、ＪＡＲＩＤ２、ＫＤＭ５Ｄ、ＡＲＩＤ４Ａ、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＡＲＩＤ３Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＡＲＩＤ３Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＩＤ５Ａ、ＡＲＩＤ３Ｃ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＰＡＳ１、ＮＰＡＳ３、ＮＰＡＳ４、ＭＬＸＩＰＬ、ＡＲＮＴＬ２、ＭＸＤ１、ＡＨＲＲ、ＴＦＥ３、ＨＥＳ２、ＭＮＴ、ＴＣＦ３、ＳＲＥＢＦ１、ＴＦＡＰ４、ＴＣＦＬ５、ＬＹＬ１、ＵＳＦ２、ＴＦＥＣ、ＡＨＲ、ＭＬＸ、ＭＹＦ６、ＭＹＦ５、ＳＩＭ１、ＴＦＥＢ、ＨＡＮＤ１、ＨＥＳ１、ＩＤ２、ＭＹＣＬ１、ＩＤ３、ＴＣＦ２１、ＭＸＩ１、ＳＯＨＬＨ２、ＭＹＯＧ、ＴＷＩＳＴ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＢＨＬＨＥ４１、ＮＥＵＲＯＤ４、ＭＸＤ４、ＢＨＬＨＥ２３、ＴＣＦ１５、ＭＡＸ、ＩＤ１、ＭＹＯＤ１、ＡＲＮＴＬ、ＢＨＬＨＥ４０、ＭＹＣＮ、ＣＬＯＣＫ、ＨＥＹ２、ＭＹＣ、ＡＳＣＬ１、ＴＣＦ１２、ＡＲＮＴ、ＨＥＳ６、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＭＳＧＮ１、ＵＳＦ１、ＴＡＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＴＣＦ２３、ＨＥＹＬ、ＨＡＮＤ２、ＮＥＵＲＯＤ６、ＨＥＹ１、ＳＯＨＬＨ１、ＭＥＳＰ１、ＰＴＦ１Ａ、ＡＴＯＨ８、ＮＰＡＳ２、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＨＬＨ１、ＩＤ４、ＡＴＯＨ１、ＡＲＮＴ２、ＨＥＳ３、ＭＬＸＩＰ、ＡＳＣＬ３、ＫＩＡＡ２０１８、ＯＬＩＧ３、ＮＨＬＨ２、ＮＥＵＲＯＧ２、ＭＳＣ、ＨＥＳ７、ＡＴＯＨ７、ＢＨＬＨＡ１５、ＢＨＬＨＥ２２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＦＩＧＬＡ、ＡＳＣＬ２、ＯＬＩＧ１、ＴＡＬ２、ＭＩＴＦ、ＳＣＸＢ、ＨＥＬＴ、ＡＳＣＬ４、ＭＥＳＰ２、ＨＥＳ４、ＳＣＸＡ、ＴＣＦ４、ＨＥＳ５、ＳＲＥＢＦ２、ＢＨＬＨＡ９、ＯＬＩＧ２、ＭＸＤ３、ＴＷＩＳＴ２、ＬＯＣ３８８５５３、Ｃ１３ｏｒｆ３８−ＳＯＨＬＨ２、ＣＥＢＰＥ、ＸＢＰ１、ＢＡＴＦ３、ＣＲＥＢ５、ＣＥＢＰＧ、ＡＴＦ３、ＡＴＦ７、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＢＰＤ、ＣＥＢＰＡ、ＣＢＦＢ、ＣＡＭＴＡ２、ＣＡＭＴＡ１、ＥＢＦ４、ＥＢＦ３、ＥＢＦ１、ＥＢＦ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＧＲＨＬ２、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＧＲＨＬ１、ＴＦＣＰ２、ＵＢＰ１、ＧＲＨＬ３、ＹＢＸ２、ＣＳＤＥ１、ＣＳＤＡ、ＹＢＸ１、ＬＩＮ２８Ａ、ＣＡＲＨＳＰ１、ＣＳＤＣ２、ＬＩＮ２８Ｂ、ＮＦＩＸ、ＮＦＩＣ、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＡ、ＣＵＸ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＣＵＸ１、ＯＮＥＣＵＴ１、ＳＡＴＢ１、ＯＮＥＣＵＴ３、ＳＡＴＢ２、ＤＭＲＴ３、ＤＭＲＴ１、ＤＭＲＴＣ２、ＤＭＲＴＡ２、ＤＭＲＴＢ１、ＤＭＲＴ２、ＤＭＲＴＡ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、ＴＦＤＰ２、Ｅ２Ｆ８、Ｅ２Ｆ５、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ６、ＴＦＤＰ３、ＴＦＤＰ１、Ｅ２Ｆ４、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ２、ＥＴＶ１、ＥＴＶ７、ＳＰＩ１、ＥＬＦ４、ＥＴＶ２、ＥＲＦ、ＥＬＦ２、ＥＬＫ３、ＥＴＶ３、ＥＬＦ１、ＳＰＤＥＦ、ＥＬＫ１、ＥＴＳ１、ＥＨＦ、ＥＬＦ５、ＥＴＶ６、ＳＰＩＢ、ＦＬＩ１、ＧＡＢＰＡ、ＥＲＧ、ＥＴＳ２、ＥＬＫ４、ＥＬＦ３、ＦＥＶ、ＳＰＩＣ、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＦＯＸＮ３、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＮ１、ＦＯＸＭ１、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＪ１、ＦＯＸＰ４、ＦＯＸＦ２、ＦＯＸＮ４、ＦＯＸＫ２、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＨ１、ＦＯＸＱ１、ＦＯＸＫ１、ＦＯＸＩ１、ＦＯＸＤ４、ＦＯＸＡ３、ＦＯＸＮ２、ＦＯＸＢ１、ＦＯＸＧ１、ＦＯＸＲ１、ＦＯＸＬ１、ＦＯＸＣ２、ＦＯＸＥ１、ＦＯＸＳ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＤ４Ｌ１、ＦＯＸＤ４Ｌ４、ＦＯＸＤ２、ＦＯＸＩ２、ＦＯＸＥ３、ＦＯＸＤ３、ＦＯＸＤ４Ｌ３、ＦＯＸＲ２、ＦＯＸＪ３、ＦＯＸＯ６、ＦＯＸＢ２、ＦＯＸＤ４Ｌ５、ＦＯＸＤ４Ｌ６、ＦＯＸＤ４Ｌ２、ＫＩＡＡ０４１５、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＰ３、ＧＣＭ２、ＧＣＭ１、ＮＲ３Ｃ１、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＧＴＦ２Ｉ、ＧＴＦ２ＩＲＤ２Ｂ、ＧＴＦ２ＩＲＤ２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ３０、ＰＭＳ１、ＣＩＣ、ＴＣＦ７、ＴＯＸ４、ＳＯＸ１０、ＨＭＧＸＢ４、ＨＢＰ１、ＴＦＡＭ、ＵＢＴＦ、ＷＨＳＣ１、ＳＯＸ６、ＨＭＧＸＢ３、ＢＢＸ、ＴＯＸ２、ＳＯＸ４、ＳＯＸ２１、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ５、ＳＯＸ３、ＬＥＦ１、ＨＭＧ２０Ａ、ＳＯＸ１３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＳＳＲＰ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ１４、ＰＩＮＸ１、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１１、ＳＯＸ１２、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１、ＳＲＹ、ＳＯＸ１８、ＵＢＴＦＬ１、ＵＢＴＦＬ２、ＴＯＸ、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＰＢＲＭ１、ＴＯＸ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＨＭＧ２０Ｂ、ＨＭＧＢ３、ＨＭＧＡ２、ＨＭＧＡ１、ＡＲＸ、ＨＯＸＡ１１、ＭＥＯＸ１、ＤＬＸ６、ＩＳＬ１、ＨＯＸＣ８、ＢＡＲＸ２、ＡＬＸ４、ＧＳＣ２、ＤＬＸ３、ＰＩＴＸ１、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＬＨＸ５、ＬＡＳＳ４、ＺＦＨＸ４、ＳＩＸ４、ＶＳＸ１、ＡＤＮＰ、ＲＨＯＸＦ１、ＭＥＩＳ３、ＰＢＸ４、ＤＬＸ５、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ１３、ＥＶＸ１、ＮＯＢＯＸ、ＭＥＯＸ２、ＬＨＸ２、ＬＨＸ６、ＬＨＸ３、ＴＬＸ１、ＰＩＴＸ３、ＨＯＸＢ６、ＨＮＦ１Ｂ、ＤＬＸ４、ＳＥＢＯＸ、ＶＴＮ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＫＸ３−２、ＤＢＸ１、ＮＡＮＯＧ、ＩＲＸ４、ＣＤＸ１、ＴＬＸ２、ＤＬＸ２、ＶＡＸ２、ＰＲＲＸ１、ＴＧＩＦ２、ＶＳＸ２、ＮＫＸ２−３、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ１、ＭＳＸ２、ＬＨＸ４、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＥＳＸ１、ＢＡＲＨＬ１、ＮＫＸ２−４、ＮＫＸ２−２、ＳＩＸ１、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＭＮＸ１、ＣＤＸ４、ＢＡＲＸ１、ＲＨＯＸＦ２、ＬＨＸ１、ＧＳＣ、ＭＥＩＳ２、ＲＡＸ、ＥＭＸ１、ＮＫＸ２−８、ＮＫＸ２−１、ＨＬＸ、ＬＭＸ１Ｂ、ＳＩＸ３、ＬＢＸ１、ＰＤＸ１、ＬＡＳＳ５、ＺＦＨＸ３、ＢＡＲＨＬ２、ＬＨＸ９、ＬＡＳＳ２、ＭＥＩＳ１、ＤＬＸ１、ＨＭＢＯＸ１、ＺＥＢ１、ＶＡＸ１、ＮＫＸ６−２、ＶＥＮＴＸ、ＨＨＥＸ、ＴＧＩＦ２ＬＸ、ＬＡＳＳ３、ＡＬＸ３、ＨＯＸＢ１３、ＩＲＸ６、ＩＳＬ２、ＰＫＮＯＸ１、ＬＨＸ８、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ１、ＭＳＸ１、ＮＫＸ６−１、ＨＥＳＸ１、ＰＩＴＸ２、ＴＬＸ３、ＥＮ２、ＵＮＣＸ、ＧＢＸ１、ＮＫＸ６−３、ＺＨＸ１、ＨＤＸ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＫＮＯＸ２、ＣＤＸ２、ＤＲＧＸ、ＮＫＸ３−１、ＰＢＸ３、ＰＲＲＸ２、ＧＢＸ２、ＳＨＯＸ２、ＧＳＸ１、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ１２、ＥＭＸ２、ＩＲＸ１、ＩＲＸ２、ＳＩＸ２、ＨＯＸＢ９、ＨＯＰＸ、ＯＴＰ、ＬＡＳＳ６、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＢ２、ＲＡＸ２、ＥＶＸ２、ＺＨＸ３、ＰＲＯＰ１、ＩＳＸ、ＨＯＸＤ８、ＴＧＩＦ２ＬＹ、ＩＲＸ５、ＳＩＸ５、ＴＧＩＦ１、ＩＲＸ３、ＺＨＸ２、ＬＢＸ２、ＮＫＸ２−６、ＡＬＸ１、ＧＳＸ２、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＢ４、ＮＫＸ２−５、ＳＩＸ６、ＭＩＸＬ１、ＤＢＸ２、ＰＢＸ１、ＳＨＯＸ、ＡＲＧＦＸ、ＨＭＸ３、ＨＭＸ２、ＢＳＸ、ＨＯＸＡ４、ＤＭＢＸ１、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ４、ＲＨＯＸＦ２Ｂ、ＰＢＸ２、ＤＵＸＡ、ＤＰＲＸ、ＬＥＵＴＸ、ＮＯＴＯ、ＨＯＭＥＺ、ＨＭＸ１、ＤＵＸ４Ｌ５、ＤＵＸ４Ｌ２、ＤＵＸ４Ｌ３、ＤＵＸ４Ｌ６、ＮＫＸ１−１、ＨＮＦ１Ａ、ＨＳＦ４、ＨＳＦＹ２、ＨＳＦＸ１、ＨＳＦＸ２、ＨＳＦＹ１、ＨＳＦ１、ＬＣＯＲＬ、ＬＣＯＲ、ＩＲＦ６、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＲＦ２、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＭＢＤ３、ＢＡＺ２Ｂ、ＭＢＤ４、ＳＥＴＤＢ２、ＭＢＤ１、ＭＥＣＰ２、ＳＥＴＤＢ１、ＭＢＤ２、ＢＡＺ２Ａ、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ９、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＺＺＺ３、ＲＣＯＲ１、ＣＤＣ５Ｌ、ＭＹＢＬ２、ＤＮＡＪＣ２、ＴＡＤＡ２Ａ、ＲＣＯＲ３、ＭＹＢ、ＴＥＲＦ２、ＤＭＴＦ１、ＤＮＡＪＣ１、ＮＣＯＲ１、ＴＥＲＦ１、ＭＩＥＲ３、ＭＹＳＭ１、ＳＮＡＰＣ４、ＲＣＯＲ２、ＴＡＤＡ２Ｂ、ＭＹＢＬ１、ＴＥＲＦ１Ｐ２、ＮＣＯＲ２、ＣＣＤＣ７９、ＳＭＡＲＣＣ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＴＴＦ１、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＮＦＹＡ、ＮＦＹＣ、ＮＦＹＢ、ＮＲＦ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＥＳＲ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ０Ｂ１、ＰＲＥＢ、ＥＡＦ２、ＳＰＺ１、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＴＰ５３、ＰＡＸ６、ＰＡＸ７、ＰＡＸ２、ＰＡＸ４、ＰＡＸ８、ＰＡＸ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ９、ＳＵＢ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＯＵ６Ｆ２、ＰＯＵ２Ｆ３、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ６Ｆ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＰＯＵ３Ｆ１、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ３Ｆ３、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＯＵ５Ｆ１Ｂ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＡＲＡ、ＰＧＲ、ＰＲＯＸ１、ＰＲＯＸ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ６Ａ１、ＥＳＲＲＡ、ＮＲ２Ｃ２、ＲＦＸ３、ＲＦＸ２、ＲＦＸ４、ＲＦＸ１、ＲＦＸ５、ＲＦＸ７、ＲＦＸ６、ＲＦＸ８、ＮＦＡＴＣ３、ＮＦＫＢ２、ＮＦＡＴＣ４、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＡＴ５、ＲＥＬＢ、ＮＦＫＢ１、ＮＦＡＴＣ１、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＯＲＡ、ＲＯＲＣ、ＮＲ１Ｄ２、ＲＯＲＢ、ＲＵＮＸ３、ＲＵＮＸ１、ＳＰ１００、ＳＰ１４０、ＧＭＥＢ２、ＳＰ１１０、ＡＩＲＥ、ＧＭＥＢ１、ＤＥＡＦ１、ＳＰ１４０Ｌ、ＬＯＣ７２９９９１−ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＲＦ、ＭＥＦ２Ｄ、ＭＥＦ２Ｂ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＢＸ２１、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１５、ＴＢＸ１８、ＴＢＸ２、ＴＢＸ４、ＴＢＸ２２、ＴＢＸ３、ＴＢＲ１、ＴＢＸ１９、ＴＢＸ６、ＥＯＭＥＳ、Ｔ、ＴＢＸ２０、ＴＢＸ１０、ＭＧＡ、ＴＢＸ１、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ４、ＣＲＥＢＬ２、ＮＦＥ２Ｌ３、ＣＲＥＢ３Ｌ３、ＦＯＳＬ２、ＮＦＥ２Ｌ１、ＣＲＥＭ、ＤＢＰ、ＣＲＥＢ３、ＨＬＦ、ＢＡＣＨ２、ＡＴＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢ１、ＡＴＦ１、ＮＦＥ２、ＦＯＳＢ、ＡＴＦ４、ＮＲＬ、ＪＵＮＤ、ＪＤＰ２、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＢＡＴＦ、ＢＡＣＨ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＮＦＩＬ３、ＴＥＦ、ＢＡＴＦ２、ＡＴＦ５、ＦＯＳ、ＪＵＮＢ、ＤＤＩＴ３、ＦＯＳＬ１、ＪＵＮ、ＭＡＦ、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＭＡＦＡ、ＭＡＦＦ、ＭＡＦＧ、ＭＡＦＫ、ＭＡＦＢ、ＡＴＦ６Ｂ、ＣＲＸ、ＯＴＸ１、ＯＴＸ２、ＴＨＡＰ３、ＴＨＡＰ１０、ＴＨＡＰ１、ＰＲＫＲＩＲ、ＴＨＡＰ８、ＴＨＡＰ９、ＴＨＡＰ１１、ＴＨＡＰ２、ＴＨＡＰ６、ＴＨＡＰ４、ＴＨＡＰ５、ＴＨＡＰ７、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ２Ｅ３、ＲＡＲＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＶＤＲ、ＥＳＲＲＢ、ＴＨＲＡ、ＮＲ１Ｄ１、ＲＡＲＡ、ＥＳＲ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ１Ｉ２、ＴＨＲＢ、ＮＲ３Ｃ２、ＨＮＦ４Ｇ、ＲＡＲＧ、ＲＸＲＡ、ＥＳＲＲＧ、ＲＸＲＢ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＴＳＣ２２Ｄ２、ＴＵＬＰ３、ＴＵＬＰ２、ＴＵＬＰ１、ＴＵＬＰ４、ＴＵＢ、ＺＢＴＢ３３、ＺＢＴＢ３２、ＺＢＴＢ１１、ＭＹＮＮ、ＺＢＴＢ２５、ＰＡＴＺ１、ＺＢＴＢ１６、ＺＢＴＢ２４、ＢＣＬ６、ＺＢＴＢ４７、ＺＢＴＢ１７、ＺＢＴＢ４５、ＧＺＦ１、ＺＢＴＢ１、ＺＢＴＢ４６、ＺＢＴＢ８Ａ、ＺＢＴＢ７Ｂ、ＢＣＬ６Ｂ、ＺＢＴＢ４９、ＺＢＴＢ４３、ＨＩＣ２、ＺＢＴＢ２６、ＺＮＦ１３１、ＺＮＦ２９５、ＺＢＴＢ４、ＺＢＴＢ３４、ＺＢＴＢ３８、ＨＩＣ１、ＺＢＴＢ４１、ＺＢＴＢ７Ａ、ＺＮＦ２３８、ＺＢＴＢ４２、ＺＢＴＢ２、ＺＢＴＢ２０、ＺＢＴＢ４０、ＺＢＴＢ７Ｃ、ＺＢＴＢ３７、ＺＢＴＢ３、ＺＢＴＢ６、ＺＢＴＢ４４、ＺＦＰ１６１、ＺＢＴＢ１２、ＺＢＴＢ４８、ＺＢＴＢ１０、ＺＢＥＤ４、ＺＢＥＤ３、ＺＢＥＤ２、Ｃ１１ｏｒｆ９５、ＺＢＥＤ１、ＩＫＺＦ５、ＺＮＦ８２１、ＺＮＦ４５１、ＺＮＦ１９５、ＺＦＸ、ＺＮＦ２６３、ＺＮＦ２００、ＨＩＶＥＰ２、ＷＩＺ、ＺＮＦ５８２、ＳＮＡＩ２、ＺＦＰ６４、ＩＫＺＦ２、ＺＩＣ２、ＺＮＦ８００、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ６、ＺＦＰ１１２、ＺＮＦ２７５、ＺＮＦ７６、
ＺＦＡＴ、ＫＬＦ６、ＺＦＹ、ＺＸＤＣ、ＧＬＩ２、ＺＮＦ５３２、ＺＮＦ３７Ａ、ＺＮＦ５１０、ＺＮＦ５０６、ＺＮＦ３２４、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ４１６、ＺＮＦ５８６、ＺＮＦ４４６、ＺＮＦ８、ＺＮＦ２６４、ＲＥＳＴ、ＭＥＣＯＭ、ＺＮＦ２１３、ＺＮＦ３４３、ＺＮＦ３０２、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ１０、ＨＩＶＥＰ１、ＺＮＦ１８４、ＭＺＦ１、ＳＡＬＬ４、ＺＮＦ５１６、ＫＬＦ８、ＫＬＦ５、ＺＮＦ６２９、ＺＮＦ４２３、ＣＴＣＦ、ＺＮＦ５００、ＺＮＦ１７４、ＳＡＬＬ１、ＭＡＺ、ＺＮＦ４１９、ＯＶＯＬ３、ＺＮＦ１７５、ＺＮＦ１４、ＺＮＦ５７４、ＺＮＦ８５、ＳＰ４、ＺＫＳＣＡＮ１、ＧＬＩ３、ＧＬＩＳ３、ＫＬＦ３、ＰＲＤＭ４、ＧＬＩ１、ＰＲＤＭ１３、ＺＮＦ１４２、ＰＲＤＭ２、ＺＮＦ６８４、ＺＮＦ５４１、ＫＬＦ７、ＰＬＡＧＬ１、ＺＮＦ４３０、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ９、ＺＮＦ４１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＥＧＲ１、ＺＦＰ３０、ＴＳＨＺ３、ＺＮＦ５４９、ＺＳＣＡＮ１８、ＺＮＦ２１１、ＺＮＦ６３９、ＺＳＣＡＮ２０、ＧＴＦ３Ａ、ＺＮＦ２０５、ＺＮＦ６４４、ＥＧＲ２、ＩＫＺＦ４、ＣＴＣＦＬ、ＺＮＦ８３１、ＳＮＡＩ１、ＺＮＦ５７６、ＺＮＦ４５、ＴＲＥＲＦ１、ＺＮＦ３９１、ＲＲＥＢ１、ＺＮＦ１３３、ＯＶＯＬ２、ＺＮＦ４３６、ＰＬＡＧＬ２、ＧＬＩＳ２、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ４８４、ＨＩＶＥＰ３、ＢＣＬ１１Ｂ、ＫＬＦ２、ＺＮＦ７８０Ｂ、ＦＥＺＦ１、ＫＬＦ１６、ＺＳＣＡＮ１０、ＺＮＦ５５７、ＺＮＦ３３７、ＰＲＤＭ１２、ＺＮＦ３１７、ＺＮＦ４２６、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ２３６、ＺＮＦ３４１、ＺＮＦ２２７、ＺＮＦ１４１、ＺＮＦ３０４、ＺＳＣＡＮ５Ａ、ＺＮＦ１３２、ＺＮＦ２０、ＥＧＲ４、ＺＮＦ６７０、ＶＥＺＦ１、ＫＬＦ４、ＺＦＰ３７、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ１９３、ＺＮＦ２８０Ｄ、ＰＲＤＭ５、ＺＮＦ７４０、ＺＩＣ５、ＺＳＣＡＮ２９、ＺＮＦ７１０、ＺＮＦ４３４、ＺＮＦ２８７、ＺＩＭ３、ＰＲＤＭ１５、ＺＦＰ１４、ＺＮＦ７８７、ＺＮＦ４７３、ＺＮＦ６１４、ＰＲＤＭ１６、ＺＮＦ６９７、ＺＮＦ６８７、ＯＳＲ１、ＺＮＦ５１４、ＺＮＦ６６０、ＺＮＦ３００、ＲＢＡＫ、ＺＮＦ９２、ＺＮＦ１５７、ＺＮＦ１８２、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ７１１、ＰＲＤＭ１４、ＺＮＦ７、ＺＮＦ２１４、ＺＮＦ２１５、ＳＡＬＬ３、ＺＮＦ８２７、ＺＮＦ５４７、ＺＮＦ７７３、ＺＮＦ７７６、ＺＮＦ２５６、ＺＳＣＡＮ１、ＺＮＦ８３７、ＰＲＤＭ８、ＺＮＦ１１７、ＺＩＣ１、ＦＥＺＦ２、ＺＮＦ５９９、ＺＮＦ１８、ＫＬＦ１０、ＺＫＳＣＡＮ２、ＺＮＦ６８９、ＺＩＣ３、ＺＮＦ１９、ＺＳＣＡＮ１２、ＺＮＦ２７６、ＺＮＦ２８３、ＺＮＦ２２１、ＺＮＦ２２５、ＺＮＦ２３０、ＺＮＦ２２２、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ２３３、ＺＮＦ２３５、ＺＮＦ３６２、ＺＮＦ２０８、ＺＮＦ７１４、ＺＮＦ３９４、ＺＮＦ３３３、ＺＮＦ３８２、ＩＫＺＦ３、ＺＮＦ５７７、ＺＮＦ６５３、ＺＮＦ７５Ａ、ＧＦＩ１、ＺＮＦ２８１、ＺＮＦ４９６、ＺＮＦ２、ＺＮＦ５１３、ＺＮＦ１４８、ＫＬＦ１５、ＺＮＦ６９１、ＺＮＦ５８９、ＰＲＤＭ９、ＺＮＦ１２、ＳＰ８、ＯＳＲ２、ＺＮＦ３６７、ＺＮＦ２２、ＧＦＩ１Ｂ、ＺＮＦ２１９、ＳＡＬＬ２、ＺＮＦ３１９、ＺＮＦ２０２、ＺＮＦ１４３、ＺＮＦ３、ＺＳＣＡＮ２１、ＺＮＦ６０６、ＳＰ２、ＺＮＦ９１、ＺＮＦ２３、ＺＮＦ２２６、ＺＮＦ２２９、ＺＮＦ１８０、ＺＮＦ６６８、ＺＮＦ６４６、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ５２８、ＺＮＦ７０１、ＺＮＦ５２６、ＺＮＦ１４６、ＺＮＦ４４４、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ５５８、ＺＮＦ２３２、Ｅ４Ｆ１、ＺＮＦ５９７、ＩＮＳＭ２、ＺＮＦ３０、ＺＮＦ５０７、ＺＮＦ３５４Ａ、ＺＥＢ２、ＺＮＦ３２、ＫＬＦ１３、ＺＦＰＭ２、ＺＮＦ７６４、ＺＮＦ７６８、ＺＮＦ３５、ＺＮＦ７７８、ＺＮＦ２１２、ＺＮＦ２８２、ＰＲＤＭ１０、ＳＰ７、ＳＣＲＴ１、ＺＮＦ１６、ＺＮＦ２９６、ＺＮＦ１６０、ＺＮＦ４１５、ＺＮＦ６７２、ＺＮＦ６９２、ＺＮＦ４３９、ＺＮＦ４４０、ＺＮＦ５８１、ＺＮＦ５２４、ＺＮＦ５６２、ＺＮＦ５６１、ＺＮＦ５８４、ＺＮＦ２７４、ＺＩＫ１、ＺＮＦ５４０、ＺＮＦ５７０、ＫＬＦ１７、ＺＮＦ２１７、ＺＮＦ５７、ＺＮＦ５５６、ＺＮＦ５５４、ＫＬＦ１１、ＨＩＮＦＰ、ＺＮＦ２４、ＺＮＦ５９６、ＯＶＯＬ１、ＳＰ３、ＺＮＦ６２１、ＺＮＦ６８０、ＢＮＣ２、ＺＮＦ４８３、ＺＮＦ４４９、ＩＮＳＭ１、ＺＮＦ４１７、ＺＮＦ７９１、ＺＮＦ８０、ＧＬＩＳ１、ＺＮＦ４９７、ＫＬＦ１４、ＺＮＦ２６６、ＺＩＣ４、ＺＮＦ４０８、ＺＮＦ５１９、ＺＮＦ２５、ＺＮＦ７７、ＺＮＦ１６９、ＺＮＦ６１３、ＺＮＦ６８３、ＺＮＦ１３５、ＺＳＣＡＮ２、ＺＮＦ５７５、ＺＮＦ４９１、ＺＮＦ６２０、ＺＮＦ６１９、ＺＮＦ３５４Ｃ、ＺＮＦ１１４、ＺＮＦ３６６、ＺＮＦ４５４、ＺＮＦ５４３、ＺＮＦ３５４Ｂ、ＺＮＦ２２３、ＺＮＦ７１３、ＺＮＦ８５２、ＺＮＦ５５２、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ６６４、ＥＧＲ３、ＺＦＰＭ１、ＺＮＦ７８４、ＺＮＦ６４８、ＦＩＺ１、ＺＮＦ７７１、ＴＳＨＺ１、ＺＮＦ４８、ＺＮＦ８１６、ＺＮＦ５７１、ＺＳＣＡＮ４、ＺＮＦ５９４、ＺＦＰ３、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ７９２、ＺＮＦ５７２、ＺＮＦ７０７、ＺＮＦ７４６、ＺＮＦ３２２Ａ、ＺＮＦ４６７、ＺＮＦ６７８、ＺＦＰ４１、ＨＫＲ１、ＰＬＡＧ１、ＺＮＦ３２９、ＺＮＦ１０１、ＺＮＦ７１６、ＺＮＦ７０８、ＺＳＣＡＮ２２、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ３２０、ＺＮＦ６２３、ＺＮＦ５３０、ＺＮＦ２８５、ＺＦＰ１、ＷＴ１、ＺＦＰ９０、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ４４５、ＺＮＦ７４、ＳＰ１、ＳＮＡＩ３、ＺＮＦ６９６、ＩＫＺＦ１、ＺＮＦ２６７、ＺＮＦ５６６、ＺＮＦ２２４、ＺＮＦ５２９、ＺＮＦ２８４、ＺＮＦ７４９、ＺＮＦ１７、ＺＮＦ５５５、ＺＮＦ７５Ｄ、ＺＮＦ５０１、ＺＮＦ１９７、ＺＮＦ３９６、ＺＦＰ９１、ＺＮＦ７３２、ＺＮＦ３９７、ＺＳＣＡＮ３０、ＺＮＦ５４６、ＺＮＦ２８６Ａ、ＺＫＳＣＡＮ４、ＺＮＦ７０、ＺＮＦ６４３、ＺＮＦ６４２、ＺＳＣＡＮ２３、ＺＮＦ４９０、ＺＮＦ６２６、ＺＮＦ７９３、ＺＮＦ３８３、ＺＮＦ６６９、ＺＮＦ５５９、ＺＮＦ１７７、ＺＮＦ５４８、ＭＴＦ１、ＺＮＦ３２２Ｂ、ＺＮＦ５６３、ＺＮＦ２９２、ＺＮＦ５６７、ＳＰ６、ＺＮＦ５７３、ＺＮＦ５２７、ＺＮＦ３３Ａ、ＺＮＦ６００、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＮＦ６７６、ＺＮＦ６９９、ＺＮＦ２５０、ＺＮＦ７９、ＺＮＦ６８１、ＺＮＦ７６６、ＺＮＦ１０７、ＺＮＦ４７１、ＺＮＦ８３６、ＺＮＦ４９３、ＺＮＦ１６７、ＺＮＦ５６５、ＺＮＦ３４、ＺＮＦ７８１、ＺＮＦ１４０、ＺＮＦ７７４、ＺＮＦ６５８、ＺＮＦ７６５、ＺＮＦ１２４、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ７７７、ＺＮＦ７７５、ＺＮＦ７９９、ＺＮＦ７８２、ＺＮＦ８４６、ＺＮＦ１３６、ＺＫＳＣＡＮ５、ＺＮＦ５０２、ＺＦＰ６２、ＺＮＦ３３Ｂ、ＺＮＦ５１２Ｂ、ＺＮＦ４３１、ＺＮＦ４１８、ＺＮＦ７００、ＺＮＦ２３９、ＺＳＣＡＮ１６、ＺＦＰ２８、ＺＮＦ７０５Ａ、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ１３８、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ４７０、ＺＮＦ１００、ＺＮＦ３９８、ＺＮＦ４９８、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ４２０、ＺＮＦ７６３、ＺＮＦ６７９、ＺＮＦ６８２、ＺＮＦ７７２、ＺＮＦ２５７、ＺＮＦ７８５、ＺＳＣＡＮ５Ｂ、ＺＮＦ１６５、ＺＮＦ６５５、ＺＮＦ９８、ＺＮＦ７８６、ＺＮＦ５１７、ＺＮＦ６７５、ＺＮＦ８６０、ＺＮＦ６２８、ＺＮＦ６６５、ＺＮＦ６２４、ＺＮＦ８４１、ＺＮＦ６１５、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ４３２、ＺＮＦ４３３、ＺＮＦ４６０、ＺＮＦ８１、ＺＮＦ７８０Ａ、ＺＮＦ４６１、ＺＮＦ１８１、ＬＯＣ１００２８７８４１、ＺＮＦ４４、ＺＮＦ７９０、ＺＮＦ６７７、ＺＮＦ８２３、ＺＮＦ３１１、ＺＮＦ３４７、ＺＮＦ７１、ＺＮＦ１２１、ＺＮＦ３３５、ＺＮＦ５６０、ＺＮＦ２７３、ＺＮＦ８４、ＺＮＦ６６７、ＺＮＦ６４９、ＺＮＦ２４８、ＺＮＦ５４４、ＺＮＦ７７０、ＺＮＦ７３７、ＺＮＦ２５１、ＺＮＦ６０７、ＺＮＦ３３４、ＺＸＤＡ、ＺＮＦ４８５、ＺＩＭ２、ＰＥＧ３、ＺＮＦ１９２、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ８１３、ＺＮＦ２６、ＺＮＦ６９、ＺＮＦ５８３、ＺＮＦ５６８、ＺＸＤＢ、ＺＮＦ４８０、ＺＮＦ５８７、ＺＮＦ８０８、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ２８、ＺＮＦ６２７、ＺＮＦ７８９、ＺＮＦ５３６、ＺＮＦ５３４、ＺＮＦ６５２、ＺＮＦ５２１、ＺＮＦ３５８、ＺＦＰ２、ＳＰ５、ＺＮＦ８１４、ＺＮＦ５５１、ＺＮＦ８０５、ＺＳＣＡＮ５Ｃ、ＺＮＦ４６８、ＺＮＦ６１６、ＺＦＰ５７、ＺＮＦ１５５、ＺＮＦ７８３、ＺＮＦ４２５、ＺＮＦ５８０、ＺＮＦ６１１、ＺＮＦ２５４、ＺＮＦ６２５、ＺＮＦ１３４、ＺＮＦ８４５、ＺＮＦ９９、ＺＮＦ２５３、ＺＮＦ９０、ＺＮＦ９３、ＺＮＦ４８６、ＲＥＰＩＮ１、ＬＯＣ１００１３１５３９、ＺＮＦ７０５Ｄ、ＬＯＣ１００１３２３９６、ＺＮＦ７０５Ｇ、ＳＣＲＴ２、ＺＮＦ４０７、ＳＰ９、ＺＮＦ５７９、ＺＮＦ８８０、ＺＮＦ６３０、ＺＮＦ８４４、ＺＮＦ４６９、ＺＮＦ７１７、ＺＮＦ８６５、ＺＮＦ４９２、ＺＮＦ６８８、ＹＹ２、ＺＮＦ８７８、ＺＮＦ８７９、ＺＮＦ７３６、ＺＮＦ３２３、ＺＮＦ７０９、ＺＮＦ５１２、ＺＮＦ５８５Ｂ、ＺＮＦ１５４、ＺＮＦ３２４Ｂ、ＺＮＦ５６４、ＺＦＰ８２、ＧＬＩ４、ＺＮＦ６７４、ＺＮＦ３４５、ＺＮＦ５５０、ＫＬＦ１、ＹＹ１、ＭＹＳＴ２、ＳＴ１８、Ｌ３ＭＢＴＬ４、ＭＹＴ１Ｌ、ＭＹＴ１、Ｌ３ＭＢＴＬ１、ＭＴＡ３、ＧＡＴＡ１、ＴＲＰＳ１、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＧＡＴＡＤ１、ＧＡＴＡ２、ＭＴＡ１、ＺＧＬＰ１、ＭＴＡ２、ＲＥＲＥ、Ｃ１６ｏｒｆ５、ＬＩＴＡＦ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ４、ＺＭＩＺ１、ＺＭＩＺ２、ＰＩＡＳ３、ＲＮＦ１３８、ＮＦＸ１、ＮＦＸＬ１、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、細胞は１つの細胞型から別の細胞型へと操作される（例えば、変換または分化される）。一部の実施形態では、膵臓細胞を操作してベータ膵島細胞にする。一部の実施形態では、線維芽細胞を操作してｉＰＳ細胞にする。一部の実施形態では、前脂肪細胞を操作して褐色脂肪細胞にする。他の例示的細胞として、例えば、筋肉細胞、神経細胞、白血球、およびリンパ球が挙げられる。
一部の実施形態では、細胞は、疾患細胞または突然変異体保有細胞である。このような細胞は、疾患を処置する、例えば、突然変異を補正する、または細胞の表現型を変化させて、例えば、がん細胞の成長を阻害するよう操作することができる。例えば、細胞は、本明細書に記載されている１種または複数種の疾患または状態に関連する。
一部の実施形態では、操作される細胞は正常細胞である。
一部の実施形態では、操作される細胞は幹細胞または前駆細胞（例えば、ｉＰＳ、胚、造血、脂肪、生殖系、肺、または神経の幹細胞または前駆細胞）である。一部の実施形態では、操作される細胞は、三胚葉のうちのいずれか由来の細胞（すなわち中胚葉、内胚葉または外胚葉）であり得る。一部の実施形態では、操作される細胞は、例えば、胎盤由来の胚体外組織由来であり得る。
一部の実施形態では、操作される細胞は、線維芽細胞、単球前駆体、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆体、内分泌前駆体、肝芽細胞、筋原細胞、または前脂肪細胞から選択される。一部の実施形態では、細胞を操作して（例えば、変換または分化する）、筋肉細胞、赤血球系−巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ−細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆体、外分泌前駆体、乳管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞または褐色脂肪細胞にする。
一部の実施形態では、細胞は筋肉細胞、赤血球系−巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ−細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆体、外分泌前駆体、乳管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または白色もしくは褐色脂肪細胞である。
一部の実施形態では、細胞は、前駆細胞、多能性細胞、全能性細胞、成体幹細胞、内部細胞塊細胞、胚性幹細胞、またはｉＰＳ細胞である。
一部の実施形態では、操作される細胞はがん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、肺がん細胞、乳がん細胞、皮膚がん細胞、脳がん細胞、膵臓がん細胞、造血系がん細胞、肝臓がん細胞、腎臓がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞であり得る。
一部の実施形態では、細胞は、筋肉細胞、赤血球系−巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ−細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆体、外分泌前駆体、乳管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または白色もしくは褐色脂肪細胞である。
細胞（複数可）へのＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および遺伝子−編集システムの投与
細胞（複数可）への、ゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の投与は、当技術分野で公知の任意の方法により実施することができる。投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。細胞（複数可）へのゲノム編集システムおよびＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の投与は同時または逐次的に行うことができる。一部の実施形態では、投与は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システム構成成分の細胞膜への進入を結果として生じる。一部の実施形態では、投与は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システム構成成分の細胞核への進入を結果として生じる。一部の実施形態では、投与は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤およびゲノム編集システムの存在下で細胞をインキュベートすることを含む。
遺伝子編集システムは、当技術分野で公知の任意の方法により細胞（複数可）に投与することができる。例えば、当技術分野で公知の任意の核酸またはタンパク質送達方法を使用することができる。遺伝子編集システムは、遺伝子編集システムの構成成分をコードする核酸として細胞に投与される（例えば、送達される）。遺伝子編集システムは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのいずれによっても細胞に投与することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターが使用される。ウイルスベクターは、レトロウイルス（例えば、マウス白血病、ＨＩＶ、またはレンチウイルス）またはＤＮＡウイルス（例えばアデノウイルス、単純ヘルペス、およびアデノ随伴）であり得る。一部の実施形態では、トランスフェクション方法（例えば非ウイルス送達方法）を使用して、ゲノム編集システムを細胞に導入する。トランスフェクション方法は、細胞をＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム、リポソームと接触させること、またはプラスミドを細胞に電気穿孔することを含む。非ウイルス送達の追加の方法は、電気穿孔、リポフェクション、顕微注射、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポゾーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によるＤＮＡ取込みの増強を含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーション法もまた核酸の送達に使用することができる。一部の実施形態では、１種または複数種の核酸がｍＲＮＡとして送達される。一部の実施形態では、キャップしたｍＲＮＡを使用して、翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させる。一部の実施形態では、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ））キャップまたはそのバリアントが使用される。米国特許ＵＳ７０７４５９６およびＵＳ８１５３７７３を参照されたい。
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ、Ｃｐｆ１など）およびｇＲＮＡはＤＮＡから転写される。
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ、Ｃｐｆ１など）はＤＮＡから転写され、ｇＲＮＡはＲＮＡとして提供される。
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ、Ｃｐｆ１など）およびｇＲＮＡはＲＮＡとして提供される。
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ、Ｃｐｆ１など）はタンパク質として提供されｇＲＮＡはＤＮＡとして提供される。
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ、Ｃｐｆ１など）はタンパク質として提供され、ｇＲＮＡはＲＮＡとして提供される。
追加の核酸送達システムとして、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照されたい）から提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；第４，９４６，７８７号；および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質として、Ｆｅｉｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）に対して行うことができる。
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）； Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２：７１０−７２２（１９９５）を参照されたい）。
追加の送達方法として、送達される核酸の、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらＥＤＶは、二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは標的組織に対する特異性を有し、他方はＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に届け、次いでＥＤＶをエンドサイトーシスにより細胞に届ける。細胞内に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ（２００９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３； Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
一部の実施形態では、トランスフェクションは一過性であり得、この場合、プラスミドを含有する、トランスフェクトしたゲノム編集システムは核に進入するが、複製中に細胞のゲノムに組み込まれることはない。トランスフェクションは安定させることができ、この場合、トランスフェクトしたプラスミドは細胞のゲノム領域に組み込まれる。
一過性発現が使用される一部の実施形態では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られてきた。このベクターは、比較的単純なシステムで大量生産することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成において標的核酸で細胞を形質導入するため、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法手順のために使用されている（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；および Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含むいくつかの刊行物に記載されている。
一部の実施形態では、細胞（複数可）へのＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の投与は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤ならびにＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の細胞膜および／または細胞核への侵入を可能にする任意の適切な媒体の存在下で単離細胞（複数可）を培養することによって実施する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、細胞（複数可）にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで投与される。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、細胞（複数可）に約５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、５５時間、６０時間、６５時間、７０時間、８５時間、９０時間、１００時間、１２５時間、１５０時間、２００時間、またはその間の任意の期間にわたり接触させる。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、細胞（複数可）に、約１．５週間、２．０週間、２．５週間、３．０週間、３．５週間、４週間、またはその間の任意の期間にわたり接触させる。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は細胞培養培地の交換と共に再投与してもよい。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、ゲノム編集システム構成成分の導入前、導入中または導入後のいずれかに細胞と接触させることができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、約０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、０．７５μＭ、１．０μＭ、１．２５μＭ、１．５０μＭ、１．７５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、４．５μＭ、５．０μＭ、５．５μＭ、６．０μＭ、６．５μＭ、７．０μＭ、７．５μＭ、８．０μＭ、８．５μＭ、９．０μＭ、９．５μＭ、１０μＭ、１０．５μＭ、１１．０μＭ、１１．５μＭ、１２μＭの濃度、またはその間の任意の濃度で細胞（複数可）に投与される。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、濃度は、投与の過程において改変することができる。
一部の実施形態では、遺伝子編集構成成分は、１種または複数種のベクターにより、またはＲＮＡ、ｍＲＮＡの形態で、またはエンドヌクレアーゼコンポーネントの場合、精製タンパク質またはｍＲＮＡ（例えばＣａｓ９タンパク質）として細胞（複数可）に送達される。１種または複数種のベクターは、ウイルスベクター、プラスミドまたはｓｓＤＮＡを含むことができる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、および単純ヘルペスウイルスベクター、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子編集構成成分はＲＮＡまたは合成ＲＮＡを介して送達される。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を、遺伝子編集システムと共に細胞に投与することによって、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞に投与されないベースライン条件と比較して、相同組換え修復による遺伝子編集結果の量が増加する。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞（複数可）に投与することは、オンターゲットでもオフターゲットでもインデル（ＮＨＥＪ由来）の抑制をもたらす。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞（複数可）に投与することは、目的の遺伝子の発現の増加または低減をもたらす。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞（複数可）に投与することは、細胞にとって内因性ではない遺伝子の発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞（複数可）に投与することは、細胞（複数可）からの遺伝子の完全もしくは部分的な除去、または改変をもたらす。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞（複数可）に投与することは、細胞（複数可）内のイントロンおよび／またはエクソンの完全もしくは部分的な除去、または改変をもたらす。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞（複数可）に投与することは、細胞（複数可）内の非コーディング領域の完全もしくは部分的な除去、または改変をもたらす。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞に投与することは、細胞（複数可）内のコーディングおよび／または非コーディング遺伝子領域の同時もしくは逐次的な、完全もしくは部分的な除去、または改変をもたらす。一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を遺伝子編集システムと共に細胞（複数可）に投与することは、染色体外ＤＮＡまたはＲＮＡを含めた、細胞（複数可）内のコーディングおよび／または非コーディング遺伝子領域の同時もしくは逐次的な、完全もしくは部分的な除去、または改変をもたらす。染色体外ＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、染色体外環状ＤＮＡ、またはウイルス染色体外ＤＮＡであってもよい。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤をゲノム編集システムと共に細胞に投与することは、目的の遺伝子の発現増加または発現低減をもたらす。一部の実施形態では、目的の遺伝子の発現の増加または低減は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞に投与されないベースライン条件と比較して、約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％であるか、またはこれらの間であり得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子の増加または低減は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞に投与されないベースライン発現レベルと比較して、約０．５倍、１．０倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍または１０倍であるか、またはこれらの間であり得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤をゲノム編集システムと共に細胞に投与することは、ゲノム編集の増加をもたらす。一部の実施形態では、ゲノム編集の増加は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞に投与されないベースライン条件と比較して、約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％であるか、またはこれらの間であり得る。一部の実施形態では、ゲノム編集の増加は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が細胞に投与されないベースライン発現レベルと比較して、約０．５倍、１．０倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍または１０倍であるか、またはこれらの間であり得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および遺伝子編集システムの細胞集団への投与は、細胞集団に遺伝子編集システムのみが投与され、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤が投与されないベースライン条件と比較して、より大きな細胞生存期間をもたらす。一部の実施形態では、より大きな細胞生存期間をもたらすＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、構造式Ｉ、構造式ＩＩ、または構造式ＩＩ’’の化合物である。
一部の実施形態では、細胞は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の投与前、投与後または投与中のいずれかにおいて、ＳまたはＧ２細胞周期フェーズに同期化させる。一部の実施形態では、細胞は、遺伝子編集構成成分の導入前、導入後または導入中のいずれかにおいて、ＳまたはＧ２細胞周期フェーズに同期化させる。ＳまたはＧ２細胞周期フェーズでの細胞の同期化は、当技術分野で公知の任意の方法により達成することができる。非限定的例として、細胞をＳまたはＧ２細胞周期フェーズに同期化するために使用することができる薬剤として、アフィジコリン、ヒドロキシ尿素、ロバスタチン、ミモシン、ノコダゾール、チミジン、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｌｉｆｅ． ２０１４ Ｄｅｃ １５；３２０１４を参照されたい）。一部の実施形態では、細胞同期化のための薬剤は、遺伝子編集プロセスの間の任意の時点で投与することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および／またはゲノム編集システムは、使用説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。一部の実施形態では、使用説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサーに含まれるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤薬剤および／またはゲノム編集システムはキットである。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および／またはゲノム編集システムは使用説明書と共にキットに含まれる。キットは任意のゲノム編集システム、ならびに／またはＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および使用説明書を含有することができる。一部の実施形態ではＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、構造式（Ｉ、Ｉ’、ＩＩ、ＩＩ’、ＩＩ’’、ＩＩ’’’、ＩＩＩ，ＩＩＩ’）で表される化合物またはそれらの任意の組み合わせのいずれかである。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、メガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム、またはＮｇＡｇｏベースのシステムから選択される。ゲノム編集システムは、キット内に、任意の形態で、例えば、プラスミド、ベクター、ＤＮＡ、またはＲＮＡ構築物として提供することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および／またはゲノム編集システムは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤および遺伝子編集システムは、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例として、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所的）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含むことができる。滅菌希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および浸透圧調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはブドウ糖。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。
注射への使用では、適切な担体には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液を即時調製するための滅菌散剤が含まれる。静脈内（ＩＶ）投与では、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。このような注射可能なＩＶ投与では、組成物は、滅菌であり、容易に注射可能な程度に流体である。それらの組成物は、製造および保存条件下で安定であり、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンを使用することによって、分散液の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。一部の実施形態では、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウムが、組成物に含まれる。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
注射可能な滅菌溶液は、必要量の活性剤を、必要に応じて先に列挙した成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性剤を、塩基性分散媒および先に列挙したものから必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌散剤の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過したその溶液から得る。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口組成物は、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物は、含漱剤として使用するために流体担体を使用して調製することもでき、ここで、流体担体中の化合物は経口適用され、口の中で回し吐き出されるか、または嚥下される。薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含有することができる。結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン、賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはトウモロコシデンプン、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ、流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素、甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン、または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味剤。
吸入による投与では、薬剤は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーから、エアゾールスプレーの形態で送達される。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によって行うこともできる。経粘膜または経皮投与では、浸透させるための障壁に適した浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は、当技術分野で一般に公知であり、このような浸透剤には、例えば経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤を使用することによって達成することができる。経皮投与では、活性化合物は、当技術分野で一般に公知である通り、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
薬剤は、直腸送達のために、坐剤（例えば、従来の坐剤基剤、例えばカカオバターおよび他のグリセリドを用いる）または停留浣腸の形態に調製することもできる。
一部の実施形態では、薬剤は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含めた持続／制御放出製剤などの、身体からの急速な排除に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかとなろう。
例えば、活性剤は、例えばコアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）のマイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに封入することができる。
持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適切な例として、薬剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透明マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成された注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間を超えて分子を放出することができ、一方、ある特定のヒドロゲルは、より短期間でタンパク質を放出する。
一部の実施形態では、製剤はまた、処置を受けている特定の適応症に対する必要に応じて、１つより多くの活性化合物、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有することもできる。代わりに、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤を含むことができる。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤薬剤および／またはゲノム編集システムは、併用療法、すなわち、病理学的状態または障害、例えば、様々な形態のがんおよび炎症性疾患を処置するのに有用な他の薬剤、例えば、治療剤と併用して投与される。「併用して」という用語は、この文脈において、薬剤を、実質的に同時期に、同時にまたは逐次的に付与することを意味する。逐次的に付与される場合、第２の化合物の投与の開始時に、２つの化合物のうちの第１の化合物は、処置部位において依然として有効濃度で検出可能なことが好ましい。
ゲノム編集スクリーニング法
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲの効率を含むゲノム編集効率について細胞をスクリーニングすることができる。例えば、スクリーニング法として、ゲノム編集を確認するための標的化領域のＰＣＲベースの増幅、これに続く、増幅領域のシークエンシングまたはディープシークエンシングを挙げることができる。ＰＣＲの遺伝子型判定により、ＨＤＲ刺激における化合物の定量化およびランキングが可能となる。他方のスクリーニング法として、次世代シークエンシングを挙げることができる。例えばＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ”Ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １５：１００２（２０１４）を参照されたい。
ＰＣＲプライマーは、未改変遺伝子領域と改変遺伝子領域の両方を選択的に増幅し、遺伝子改変状態に応じて異なる長さのアンプリコンをもたらすように操作することができる。次いで、アンプリコンをゲル上で分割し、Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｅｒを使用してデンシトメトリーによりＨＤＲ効率を予測することができる。あるいは、新規ＰＣＲ技術である、高速デジタルドロップレットＰＣＲ（ＤＤＰＣＲ）を使用して、ゲノム編集試料においてＨＤＲおよびＮＨＥＪ事象を同時に測定することができる。例えば、Ｍｉｙａｏｋａ ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＤＲ ａｎｄ ＮＨＥＪ ｒｅｖｅａｌｓ ｅｆｆｅｃｔｒｓ ｏｆ ｌｏｃｕｓ， ｎｕｃｌｅａｓｅ， ａｎｄ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｏｎ ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎ，” Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ６， ２０１６を参照されたい。ゲノム改変のための細胞スクリーニングには、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング、ディープシークエンシング、およびＲＴ−ＰＣＲを含む他の方法を使用することができる。
一部の実施形態では、細胞をスクリーニングするために、トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）構築物が使用される。ＴＬＲスクリーニングは、標的化ゲノム編集時に蛍光性マーカーを発現するように操作されているレポーター細胞を含む。適切な標的化の後、細胞によって蛍光性マーカーが発現される。適切に標的化された細胞の定量化は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、フローサイトメトリー分析によって実施することができる。例えば、Ｃｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１１， ”Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＤＮＡ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ８， ｐａｇｅｓ ６７１−６７６ （２０１１）を参照。
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許文書の関連部分は、あたかもそのような各刊行物または文書が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的に個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、それらがいずれも、関連する従来技術であるという承認を意図するものではなく、その内容または日付に関して任意の承認を構成するものでもない。本開示を、書面による説明によってここに記載してきたが、当業者は、様々な実施形態を実施することができ、先の説明および以下の実施例が例示目的であり、以下に続く特許請求の範囲を制限するものではないことを認識されよう。
状態の処置／防止におけるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の使用
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される式のいずれかの化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、表１の化合物を含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、表２の化合物を含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、組成物は、追加の治療剤をさらに含む。
別の実施形態に従い、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される誘導体と、薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルとを含む組成物を提供する。一実施形態では、本発明の組成物中の化合物の量は、生体試料または患者においてＤＮＡ−ＰＫを適度に阻害するのに有効であるような量である。別の実施形態では、本発明の組成物中の化合物の量は、ＤＮＡ−ＰＫを適度に阻害するのに有効であるような量である。一実施形態では、本発明の組成物は、このような組成物を必要とする患者への投与用に製剤化される。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、患者への経口投与用に製剤化される。
本発明の化合物の調製
セクションＩ：ヒドロキシキノキサリノン中間体の調製
セクションＩには、官能化８−ヒドロキシ−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン中間体の調製のための合成手順を記載する。これらの中間体を、セクションＩＩに記載されるメシレート中間体の適切な選択と共に使用して、表Ａの化合物を調製した。
Figure 2021511312
 ８−ヒドロキシ−１，３−ジメチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オンの合成：
ステップ１：５−ブロモ−１−フルオロ−３−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−２−ニトロベンゼン
５−ブロモ−１，３−ジフルオロ−２−ニトロ−ベンゼン（３００ｇ、１．２６１ｍｏｌ）およびｐ−メトキシベンジルアルコール（１９０ｇ、１．３７５ｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．８Ｌ）に溶解させた。得られた溶液に、炭酸セシウム（６１１ｇ、１．８７５ｍｏｌ）を添加し、混合物を７０℃に加温し、１６時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、冷水（２Ｌ）に注ぎ、その結果、黄色の固体が沈殿した。沈殿物をブフナー漏斗上に収集し、水（２×５００ｍＬ）ですすいだ。沈殿物をジクロロメタン（５Ｌ）に溶解させ、水（２×１Ｌ）およびブライン（１Ｌ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、シリカゲルプラグ（５００ｇ）を介して濾過した。シリカゲル床をジクロロメタン（５００ｍＬ）で洗浄し、合わせた濾液を減圧下で濃縮した。残渣をヘプタン（２Ｌ）と共に研和し、真空オーブン中で５０℃において１４時間乾燥させて、５−ブロモ−１−フルオロ−３−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−２−ニトロベンゼン（３５０ｇ、収率７２％）を黄色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ステップ２：メチル（５−ブロモ−３−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−２−ニトロフェニル）グリシネート
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２Ｌ）中５−ブロモ−１−フルオロ−３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−２−ニトロ−ベンゼン（３５０ｇ、０．９１４ｍｏｌ）およびメチル２−アミノアセテート（塩酸塩、１７３ｇ、１．３６４ｍｏｌ）の混合物に、トリエチルアミン（３５０ｍＬ、２．５１１ｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を５０℃に加温し、この温度で５４時間撹拌した。反応混合物を周辺温度に冷却し、冷水（３Ｌ）に注ぎ、その結果、淡褐色の粘着物様の材料が形成された。水をデカントし、淡褐色の粘着物をジクロロメタン（５Ｌ）に溶解させ、水（１Ｌ）およびブライン（１Ｌ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶液を、シリカゲル床を介して濾過し、床をジクロロメタン（２×５００ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮した。残渣をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）と共に研和し、真空オーブン中で５０℃において１２時間乾燥させて、メチル（５−ブロモ−３−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−２−ニトロフェニル）グリシネート（２５２ｇ、６２％）を黄色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ステップ３：６−ブロモ−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３，４−ジヒドロキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
メチル（５−ブロモ−３−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−２−ニトロフェニル）グリシネート（５２ｇ、１１２．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７００ｍＬ）およびメタノール（４００ｍＬ）溶液に、白金［３％ｗ／ｗ担持活性木炭７ｇ、還元、７０％水で湿潤したペースト（ＥＳＣＡＴ２９３１）、１．０７６ｍｍｏｌ］を添加した。反応混合物を５分間脱気し、次に水素雰囲気（バルーン）下に１６時間置いた。反応混合物を、セライトを介して濾過し、床をメタノール（２×２００ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮した。こうして得られた残渣を、ジクロロメタン（４００ｍＬ）と共沸させ、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルと共に研和して、６−ブロモ−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３，４−ジヒドロキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（３９ｇ、９３％）を黄褐色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ステップ４：６−ブロモ−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２−オン（１７８ｇ、０．４８５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（６．０Ｌ）に溶解させた。得られた溶液に、二酸化マンガン（ＩＶ）（４００ｇ、４．６０１ｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を５５℃に加温し、４時間撹拌した。反応混合物を周辺温度に冷却し、シリカゲル床を介して濾過した。床をジクロロメタン（４×５００ｍＬ）中４０％酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を、酢酸エチル／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１：２比、３Ｌ）と共に研和し、真空オーブン中で５０℃において１４時間乾燥させて、６−ブロモ−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン（１２５ｇ、７１％）を黄褐色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ステップ５：６−ブロモ−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン（１２５ｇ、０．３４３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４．０Ｌ）溶液に、ヨウ化メチル（１１０ｍＬ、１．７６７ｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、氷浴で０℃に冷却し、水素化ナトリウム（６０％ｗ／ｗで３５ｇ、０．８７５ｍｍｏｌ）を２０分間にわたって少しずつ添加した。得られた反応混合物を≦３℃で３０分間撹拌し、その時点で、ＨＰＬＣ分析によっておよそ８５：１５比のＮ−メチル化およびＯ−メチル化生成物が明らかになった。反応混合物を冷水（４．０Ｌ）に注ぎ、その結果、黄色の沈殿物が形成された。固体をブフナー漏斗上に収集し、水（２×１．０Ｌ）ですすぎ、対流式オーブン中で５０℃において４時間乾燥させた。沈殿物（８５：１５比）を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３．０Ｌ）中２０％酢酸エチルに懸濁させ、１時間還流させ、周辺温度に冷却した。混合物を、中程度の多孔性のフリット漏斗を介して濾過し、真空オーブン中で５０℃において５時間乾燥させて、所望のＮ−メチル化生成物（１２０ｇ）を９６％純度で得た。生成物を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３．０Ｌ）中２０％酢酸エチルに再び再懸濁させ、１時間還流させ、濾過し、上記の通り真空乾燥させて、６−ブロモ−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（９０ｇ）を９９％純度で黄色の固体として得た。さらに、濾液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（３３０ｇのＩｓｃｏゴールドカラム、０％→６０％酢酸エチル／ジクロロメタンの直線勾配）、所望の生成物３（１３ｇ、９９％純度）のさらなる収穫物を得た。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値３７４．０３、実測値３７５．０５（Ｍ＋１）。
ステップ６：８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１−メチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
ジオキサン（２．０Ｌ）中６−ブロモ−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−１−メチル−キノキサリン−２−オン（１０３ｇ、２７０．９ｍｍｏｌ）およびモルホリン（３６ｍＬ、４１２．８ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素ガスストリームを溶液に１０分間バブリングすることによって脱酸素化した。酢酸パラジウム（ＩＩ）（１．３ｇ、５．７９０ｍｍｏｌ）、ＲｕＰｈｏｓ（５．５ｇ、１１．７９ｍｍｏｌ）、および炭酸セシウム（２００ｇ、６１３．８ｍｍｏｌ）を逐次的に添加した。反応混合物を、窒素ガスストリームを用いてさらに１０分間脱酸素化した。得られた反応混合物を８０℃に加温し、１４時間撹拌した。反応混合物を周辺温度に冷却し、減圧下で濃縮して、ジオキサンを除去した。冷水（２．５Ｌ）を添加すると、黄色の沈殿物が形成された。沈殿物をブフナー漏斗上に収集し、水（５００ｍＬ）で洗浄し、対流式オーブン中で乾燥させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（４×３３０ｇのカラム、０％→１０％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配）、８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１−メチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（６８ｇ、６６％）を黄色の固体として提供した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３８１．１７， ｆｏｕｎｄ ３８２．２１ （Ｍ＋ １）．
ステップ７：８−ヒドロキシ−１−メチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１−メチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（１３．９０ｇ、３６．４４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２５０ｍＬ）に溶解させた。トリフルオロ酢酸（３１．０ｍＬ、４０２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた暗褐色の溶液を室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残りの残渣を、ジクロロメタンに溶解させ、シリカゲルプラグで濾過した。プラグを、最初にジクロロメタンで溶出して、高Ｒｆ不純物を溶出し、それを廃棄した。溶出液をアセトンに変更し、その結果、黄色からオレンジ色のバンドが溶出した。このバンドを収集し、濃縮乾固させて、８−ヒドロキシ−１−メチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（８．８９ｇ、収率５０％）を提供した。
Figure 2021511312
Figure 2021511312
 ８−ヒドロキシ−１，３−ジメチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オンの合成：
ステップ１：５−フルオロ−３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−２−ニトロ−アニリン
（４−メトキシフェニル）メタノール（４．１７ｇ、３０．１８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５２．４ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散液、１．２８ｇ、３２．００ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１０分間撹拌し、３，５−ジフルオロ−２−ニトロ−アニリン（５ｇ、２８．７２ｍｍｏｌ）で処理し、さらに１時間撹拌した。混合物を、酢酸エチルと水に注意深く分配し、赤色が消失して黄色／オレンジ色になるまで、１Ｎの塩酸を滴下添加した。有機物を収集し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（３３０ｇのＩＳＣＯカラム、０〜２５％酢酸エチル／ヘプタンの直線勾配）、５−フルオロ−３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−２−ニトロ−アニリンを、黄色からオレンジ色の固体として提供した。
ステップ２：３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−５−モルホリノ−２−ニトロ−アニリン
５−フルオロ−３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−２−ニトロ−アニリン（４．６４ｇ、１５．８８ｍｍｏｌ）およびモルホリン（７．０ｍＬ、８０．２７ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（１３．６ｍＬ）溶液を、１００℃に２．５時間加熱した。混合物を酢酸エチルと水に分配した。相を分離し、水相を酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮して、３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−５−モルホリノ−２−ニトロ−アニリン（５．７０ｇ、収率１００％）をオレンジ色の固体として得、それをさらに操作することなく使用した。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値３５９．１５、実測値３６０．１７（Ｍ＋１）。
ステップ３：３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−５−モルホリノ−ベンゼン−１，２−ジアミン
水（３１ｍＬ）中３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−５−モルホリノ−２−ニトロ−アニリン（５．６６ｇ、１５．７５ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（１．５３ｇ、２８．６０ｍｍｏｌ）、亜鉛（５．５９ｇ、８５．４６ｍｍｏｌ）および２％ＴＰＧＳ−７５０−Ｍの混合物を、終夜撹拌した。セライトを添加して水を吸収させた後、酢酸エチルを添加した。混合物を濾過し、セライトプラグを、さらなる酢酸エチルですすいだ。合わせた濾液を濃縮し、粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（３３０ｇのシリカゲルカートリッジ、０〜５％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配）、３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−５−モルホリノ−ベンゼン−１，２−ジアミン（３．４１ｇ、収率６６％）を赤色の固体として提供した。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値３２９．１７、実測値３３０．１９（Ｍ＋１）。
ステップ４：８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−３−メチル−６−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オン
３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−５−モルホリノ−ベンゼン−１，２−ジアミン（３１５ｍｇ、０．９５６ｍｍｏｌ）、エチルピルベート（２１２μＬ、１．９０８ｍｍｏｌ）、およびメタノール（３．０ｍＬ）の混合物を、密閉バイアル中で６５℃において２時間加熱した。固体が反応混合物から沈殿した。反応物を室温に冷却し、水を添加し、混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、真空下で終夜乾燥させて、生成物の位置異性体混合物（３６５ｍｇ、１．７：１比で先のスキームに示される所望の化合物が優先的に）を提供した。得られた混合物をＳＦＣによって精製して、所望の異性体８−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）−３−メチル−６−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オン（１１０ｍｇ）および望ましくない異性体５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−メチル−７−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（６４ｍｇ）を提供した。
８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−メチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オンのデータ：

Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３８１．１７， ｆｏｕｎｄ ３８２．１７ （Ｍ＋１）．
５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−メチル−７−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オンのデータ：
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３８１．１７， ｆｏｕｎｄ ３８２．１７ （Ｍ＋１）．
ステップ５：８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１，３−ジメチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−３−メチル−６−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オン（１１０ｍｇ、０．２７４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１８３ｍｇ、１．３２４ｍｍｏｌ）、およびアセトン（３．０ｍＬ）の混合物を、ヨウ化メチル（２１μＬ、０．３３７ｍｍｏｌ）で処理した。得られた反応混合物を密閉し、６０℃で終夜撹拌した。混合物を酢酸エチルと水に分配した。相を分離し、水相を酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（４ｇのシリカゲルカートリッジ、０〜１０％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配）、８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１，３−ジメチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（９４ｍｇ、８２％）を提供した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３９５．１８， ｆｏｕｎｄ ３９６．２６ （Ｍ＋１）．
ステップ６：８−ヒドロキシ−１，３−ジメチル−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
撹拌した８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−１，３−ジメチル−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン（８８ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５．０ｍＬ）溶液を、トリフルオロ酢酸で処理した。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗残渣を、さらに精製することなく使用した。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値２７５．１３、実測値２７６．１４（Ｍ＋１）。
Figure 2021511312
 １−エチル−８−ヒドロキシ−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オンの合成：
ステップ１：８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−６−モルホリノキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−５−モルホリノ−ベンゼン−１，２−ジアミン（７．５１ｇ、２２．８０ｍｍｏｌ）のメタノール（８７７ｍＬ）溶液に、エチルグリオキサレート（トルエン中５０％ｗ／ｖで９．３ｍＬ、４５．５５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を密閉し、６５℃で２時間加熱した。固体が反応混合物から沈殿した。反応物を室温に冷却し、水を添加した。固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、イソプロパノールと共に研和し、真空下で乾燥させて、生成物の位置異性体混合物（６．３４ｇ）を提供した。得られた混合物を、ＳＦＣによって精製して［４０％エタノール（５ｍＭアンモニア）を使用するＩＢ分取カラム］、所望の位置異性体である８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オン（３．４８ｇ）、ならびに望ましくない位置異性体である５−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−７−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オン（２．３５ｇ）の両方を得た。
８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オンのデータ：
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３６７．１５， ｆｏｕｎｄ ３６８．０９ （Ｍ＋１）．
５−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−７−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オンのデータ：
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３６７．１５， ｆｏｕｎｄ ３６８．０９ （Ｍ＋１）．
ステップ２：１−エチル−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン
８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６−モルホリノ−１Ｈ−キノキサリン−２−オン（１５０ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）のアセトン（４．３ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（２７３ｍｇ、１．９７５ｍｍｏｌ）およびヨードエタン（４０μＬ、０．５００ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を密閉し、バイアル中６０℃で終夜撹拌した。混合物を酢酸エチルと水に分配した。相を分離し、水相を酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（４ｇのシリカゲルカートリッジ、０〜１０％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配）、１−エチル−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン（５５ｍｇ、収率３２％）を提供した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３９５．１８， ｆｏｕｎｄ ３９６．２３ （Ｍ＋１）．
ステップ３：１−エチル−８−ヒドロキシ−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン
１−エチル−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン（５０ｍｇ、０．１２６４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（およそ１．０ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸を添加した。得られた赤色の反応溶液を濃縮し、さらに操作することなくそのまま使用した。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値２７５．１３、実測値２７６．１４（Ｍ＋１）。
Figure 2021511312
 ６−ブロモ−８−ヒドロキシ−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−１−メチル−キノキサリン−２−オン（４ｇ、１０．６６ｍｍｏｌ）の酢酸（５６ｍＬ）溶液を、１００℃に５時間加熱した。反応物を室温に冷却し、終夜静置し、その結果、黄色の沈殿物が形成された。固体を真空濾過によって収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、６−ブロモ−８−ヒドロキシ−１−メチル−キノキサリン−２−オン（１．９２ｇ、収率６９％）を提供した。
Figure 2021511312
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ２５３．９７， ｆｏｕｎｄ ２５４．９７ （Ｍ＋１）．
Figure 2021511312
 ８−ヒドロキシ−１−メチル−６−（６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン−３−イル）キノキサリン−２−オン
６−ブロモ−８−ヒドロキシ−１−メチル−キノキサリン−２−オン（３１２ｍｇ、１．２２３ｍｍｏｌ）、６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン（塩酸塩、２０１ｍｇ、１．４８２ｍｍｏｌ）、ＲｕＰｈｏｓ−Ｇ３−パラダサイクル（５２ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、およびＲｕＰｈｏｓ（２９ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）を、密閉バイアル中、窒素中で合わせた。リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（１．０Ｍテトラヒドロフラン溶液３ｍＬ、３．０００ｍｍｏｌ）を添加し、バイアルを６５℃に終夜加熱した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチルで希釈し、濾過した。濾液を濃縮し、粗残渣を、アミノ官能化シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（１２ｇのカートリッジ、０〜１０％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配）、８−ヒドロキシ−１−メチル−６−（６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン−３−イル）キノキサリン−２−オン（２１４ｍｇ、収率６４％）を提供した。ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値２７３．１１、実測値２７４．２４（Ｍ＋１）。
Figure 2021511312
 ６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−ヒドロキシ−１−メチル−キノキサリン−２−オンの合成：
ステップ１：６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−１−メチル−キノキサリン−２−オン（４．０ｇ、１０．６６ｍｍｏｌ）、２−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（２．７２ｇ、１２．９５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２．０Ｍ水溶液８ｍＬ、１６．００ｍｍｏｌ）、およびジオキサン（４０ｍＬ）の混合物を、窒素ガスを混合物に１０分間バブリングすることによって脱気した。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］−ジクロロパラジウム（ＩＩ）（ジクロロメタン複合体、８８１ｍｇ、１．０７９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物をさらに５分間脱気し、次に８５℃に４時間加熱した。混合物を室温に冷却し、水と酢酸エチルに分配した。層を分離し、水層を酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（３３０ｇのシリカゲルカートリッジ、０〜５０％酢酸エチル／ヘプタンの直線勾配）、６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−１−メチル−キノキサリン−２−オン（２．８１ｇ、収率６９％）を黄色の固体として提供した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ３７８．１６， ｆｏｕｎｄ ３７９．１７ （Ｍ＋１）．
ステップ２：６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−ヒドロキシ−１−メチル−キノキサリン−２−オン
６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−１−メチル−キノキサリン−２−オン（１．８１ｇ、４．７８３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸（５．０ｍＬ、６４．９０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応溶液を２時間撹拌し、濃縮した。粗残渣を、酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウム水溶液に分配した。層を分離し、水層を酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。ジクロロメタンを添加し、その結果、褐色の沈殿物が形成され、それを真空濾過によって収集して、６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−ヒドロキシ−１−メチル−キノキサリン−２−オン（１．１０ｇ、収率８２％）を提供した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ２５８．１０， ｆｏｕｎｄ ２５９．１６ （Ｍ＋１）．
セクションＩＩ：メシレート中間体の調製
セクションＩＩには、メシレート中間体の調製のための合成手順を記載する。これらの中間体を、８−ヒドロキシ−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン中間体（セクションＩに記載される）を適切に選択すると共に使用して、表Ａの化合物を、セクションＩＩＩに記載される方法を使用して調製する。
Figure 2021511312
 （１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルオキシ）シクロヘキシルメタンスルホネート
ステップ１：（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロヘキサン−１−オール
（１，４−ｔｒａｎｓ）−シクロヘキサン−１，４−ジオール（７０ｇ、６０２．６ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１３０ｇ、１．９１０ｍｏｌ）のジクロロメタン（１．５Ｌ）溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル−クロロ−ジメチル−シラン（１００ｇ、６６３．５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた反応混合物を室温に加温し、２４時間撹拌し、その時点で、ＴＬＣ分析によって、出発材料、所望の生成物、およびビス付加生成物の混合物が明らかになった。反応混合物を水（３００ｍＬ）に注いだ。有機層を分離し、水層を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（８００ｇのシリカゲルカラム、ヘプタン中０〜５０％酢酸エチルの直線勾配）、（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシシクロヘキサノール（５８ｇ、４１％）を白色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ステップ２：２−（（（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロヘキシル）オキシ）ピリミジン
２℃の（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシシクロヘキサノール（１３．７ｇ、５８．８６ｍｍｏｌ）および２−クロロピリミジン（９ｇ、７４．６５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中６０％ｗ／ｗ懸濁液５ｇ、１２５．０ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた反応混合物を３０分間にわたって室温に加温し、撹拌をさらに１０時間継続した。反応混合物を氷冷水（４００ｍＬ）に注ぎ、その結果、黄褐色の固体が沈殿した。固体を真空濾過によって収集し、水（３×１００ｍＬ）ですすぎ、真空オーブン中で５０℃において１６時間乾燥させて、（１，４−ｔｒａｎｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロ−ヘキサオキシ）シラン（１８．８ｇ、９５％純度、収率９８％）を得、それをさらに精製することなく使用した。
Figure 2021511312
 ステップ３：（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルオキシ）シクロヘキサン−１−オール
テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）およびメタノール（６ｍＬ）の混合物中、（１，４−ｔｒａｎｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）シラン（２６ｇ、８３．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（４０ｇ、２４８．１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を、室温で２４時間撹拌した。反応混合物を氷浴で０℃に冷却し、水酸化アンモニウム（３０％ｗ／ｗで３０ｇ、２５６．８ｍｍｏｌ）水溶液を添加した後、水（１００ｍＬ）および酢酸エチル（２００ｍＬ）を添加した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（１００ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機抽出物を、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮して、（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサノール（１６．２ｇ、９９％）を薄黄色の粘性油状物質として得た。
Figure 2021511312
 ステップ４：（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルオキシ）シクロヘキシルメタンスルホネート
０℃の（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサノール（１６．２ｇ、８２．６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４０ｍＬ、２２９．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、塩化メタンスルホニル（８ｍＬ、１０３．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を２５分間にわたって滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を添加することによってクエンチした。有機層を分離し、水層をジクロロメタン（１００ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（３３０ｇのＩｓｃｏゴールドカラム、０〜５０％酢酸エチル／ジクロロメタンの直線勾配）、（１，４−ｔｒａｎｓ）−（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキシル）メタンスルホネート（１９．４ｇ、収率８５％）を白色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ２７２．３２， ｆｏｕｎｄ ２７３．０７ （Ｍ＋１）．
Figure 2021511312
 （１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（５−メトキシピリミジン−２−イル）オキシ）シクロヘキシルメタンスルホネート
（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルオキシ）シクロヘキシルメタンスルホネートについて上記のものと同じ４ステップ合成手順によって調製した。
Figure 2021511312
Figure 2021511312
 （１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシ）シクロヘキシルメタンスルホネート
ステップ１：４−（（（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）シクロヘキシル）オキシ）−２−メチルピリミジン
２℃の（１，４−ｔｒａｎｓ）−シクロヘキサン−１，４−ジオール（２ｇ、１７．０５ｍｍｏｌ）および４−クロロ−２−メチル−ピリミジン（１．５ｇ、１１．６７ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中６０％ｗ／ｗ懸濁液で９５０ｍｇ、２３．７５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。冷却浴を除去し、反応混合物を６０℃に２時間加温した。反応混合物を室温に冷却し、氷冷水（６０ｍＬ）に注ぎ、その結果、黄褐色の沈殿物が形成された。固体を真空濾過によって収集し、水（２×１０ｍＬ）ですすぎ、真空オーブン中で６０℃において１４時間乾燥させて、望ましくないビス付加物である２−メチル−４−［４−（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシシクロヘキサオキシ］ピリミジン（１．１ｇ、３１％）を得た。真空濾過から得た濾液を、２−メチル−テトラヒドロフラン（４×６０ｍＬ）で抽出し、合わせた濾液を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮して黄色の油状物質を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（０〜１００％酢酸エチル／ヘプタンの直線勾配）、所望の生成物である（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシシクロヘキサノール（１．２３ｇ、９５％純度、収率４８％）を白色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ２０８．２６， ｆｏｕｎｄ ２０９．１３ （Ｍ＋１）．
ステップ２：
ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−［４−（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシシクロヘキサオキシ］シラン（１７．８２ｇ、５４．７０ｍｍｏｌ）のイソプロピルアルコール（２２５ｍＬ）溶液を、濃塩酸（１２Ｍ溶液で１６ｍＬ、１９２．０ｍｍｏｌ）で処理した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）と共沸させて、黄褐色の固体を得た。粗残渣を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１００ｍＬ）と共に研和することによってさらに精製し、真空オーブン中で５０℃において１４時間乾燥させて、（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシシクロヘキサノール（１１．５７ｇ、９８％）を黄褐色の固体として得、それを、さらに精製することなく使用した。
Figure 2021511312
 ステップ３：（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシ）シクロヘキシルメタンスルホネート
メシレート形成を、（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルオキシ）シクロヘキシルメタンスルホネートの調製について上記の手順に従って行った。（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシシクロヘキサノールを出発材料として使用して、（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシ）シクロヘキシルメタンスルホネート（収率８５％）を黄褐色の固体として提供した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ２８６．３５， ｆｏｕｎｄ ２８７．０７ （Ｍ＋１）．
Figure 2021511312
 （１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（（５−メチルピリミジン−２−イル）オキシ）シクロヘキシルメタンスルホネート
先に示される合成スキームを介して、このセクションで既に記載されている反応条件を使用して調製した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃ． ２８６．３５， ｆｏｕｎｄ ２８７．１６ （Ｍ＋１）．
Figure 2021511312
 （１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシルメタンスルホネート
ステップ１：（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキサン−１−オール
２−クロロピリミジン（ｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｍｄｉｎｅ）（７０．３０ｇ、６１３．８ｍｍｏｌ）、およびｔｒａｎｓ−１，４−アミノシクロヘキサノール（７１．７７ｇ、６０４．５ｍｍｏｌ）を、イソプロパノール（４００ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加し（１２０ｍＬ、６８９ｍｍｏｌ）、得られた溶液を終夜加熱還流させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残った固体をジクロロメタンに懸濁させ、シリカゲルプラグを介して濾過した。シリカプラグを、最初にジクロロメタンで溶出して、残留出発材料を溶出し、次に酢酸エチルで所望の生成物を溶出した。酢酸エチル溶出から得た濾液を、減圧下で蒸発させて、（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキサン−１−オールを白色の固体として得た。
Figure 2021511312
 ステップ２：（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシルメタンスルホネート
０℃のジクロロメタン（７２７ｍＬ）中（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキサン−１−オール（５２ｇ、５５．５３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン（９０ｍＬ、５１６．７ｍｍｏｌ）を添加した。塩化メタンスルホニル（３５ｍＬ、４５２．２ｍｍｏｌ）を、内部温度を２０℃またはそれ未満に維持できる速度で、シリンジを介して添加した。反応物をさらに１時間撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、シリカゲルのショートプラグを介して濾過した。プラグを、２０％酢酸エチル／ジクロロメタンで溶出し、濾液を減圧下で濃縮して、黄褐色の固体を得た。固体を、最少量のジクロロメタンに溶解させた。生成物が結晶化し始めるまで、ペンタンを添加した。混合物を、ドライアイス／アセトン浴中で冷却し、固体を真空濾過によって収集し、ペンタンで洗浄し、減圧下で乾燥させて、（１，４−ｔｒａｎｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシルメタンスルホネート（５９．７２ｇ、収率８２％）を淡黄褐色の固体として得た。
Figure 2021511312
Figure 2021511312
 先に示されるタイプのさらなるメシレート［式中、Ｒは、置換もしくは非置換芳香環、置換もしくは非置換芳香族複素環、またはカルバメートに等しい］を得るための合成経路は、既に報告されており（米国特許出願公開第２０１４０２７５０５９Ａ１号）、したがってここでは記載しない。
セクションＩＩＩ：メシレートの置換えを最終ステップとして使用して調製した化合物
セクションＩＩＩに記載される化合物を、８−ヒドロキシ−キノキサリノン（セクションＩに記載される）およびメシレート中間体（セクションＩＩに記載される）を適切に選択することにより、以下の方法を使用して調製した。セクションＩＩＩの方法によって調製した化合物の分析データを、表Ａに提供する。
方法Ａ−Ａ
Figure 2021511312
 １−メチル−６−モルホリノ−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
８−ヒドロキシ−１−メチル−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン（７．６５ｇ、１５．６３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）溶液に、ｔｒａｎｓ−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシルメタンスルホネート（３０．３４ｇ、１１１．８ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（３５．６４ｇ、１０９．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を６０℃に終夜加熱した。反応混合物を室温に冷却し、セライトで濾過した。セライトプラグをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄し、濾液を減圧下で蒸発させて、暗色の油状物質を得、それを高真空下で固化させた。固体をジクロロメタンに溶解させ、シリカゲルプラグで濾過し、５％メタノール／酢酸エチルで溶出した。濾液を蒸発させて、褐色がかった黄色の固体を得た。固体をジクロロメタンに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（３３０ｇのシリカゲルカートリッジ、均一濃度の３％メタノール／酢酸エチル）、鮮黄色の固体を得た。固体を、ドライアイス／アセトン浴で予冷した少量の酢酸エチルで洗浄した後、ヘプタンで洗浄した。最後に、材料を高真空下で６０℃において乾燥させて、１−メチル−６−モルホリノ−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オンを提供した。
方法Ａ−Ｂ
Figure 2021511312
 １−メチル−６−モルホリノ−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルオキシ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
８−ヒドロキシ−１−メチル−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン（３４．５ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６９０μＬ）溶液に、ｔｒａｎｓ−（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキシル）メタンスルホネート（６８．０ｍｇ、０．２４７ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（２１５ｍｇ、０．６６０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を９０℃に５時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、ジクロロメタンと水に分配した。有機相を収集し、蒸発させた。粗残渣を、最少量のＤＭＳＯに溶解させ、Ｃ１８分取ＨＰＬＣによって精製し（アセトニトリル／水とトリフルオロ酢酸改変剤）、関連する画分を合わせ、濃縮乾固させた。こうして得られた材料をジクロロメタンに溶解させ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を収集し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮して、１−メチル−６−モルホリノ−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルオキシ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン（１６．１ｍｇ、収率２５％）を提供した。
注記：この方法によって調製した分子を、シリカゲルクロマトグラフィーによっても精製した（メタノール／ジクロロメタン）。
方法Ａ−Ｃ
Figure 2021511312
 １，３−ジメチル−６−モルホリノ−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．１ｍＬ）中８−ヒドロキシ−１，３−ジメチル−６−モルホリノ−キノキサリン−２−オン（４８．７ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（５７２ｍｇ、１．７５６ｍｍｏｌ）の混合物に、（ｔｒａｎｓ）−［４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル］メタンスルホネート（１４７ｍｇ、０．５４２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１００℃で終夜撹拌した。反応物を室温に冷却し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルと水に分配した。相を分離し、水相をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルでさらに抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（４ｇのシリカゲルカートリッジにより、０〜１０％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配を使用した後、０〜１００％酢酸エチル／ヘプタンの直線勾配を使用して第２のシリカゲル精製を行った）、１，３−ジメチル−６−モルホリノ−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル）オキシ）−キノキサリン−２（１Ｈ）−オン（１７．３ｍｇ、収率２１％）を提供した。
注記：この方法によって調製した分子を、逆相Ｃ１８分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水とトリフルオロ酢酸または水酸化アンモニウム改変剤のいずれか）または逆相Ｃ１８−誘導体化シリカゲルクロマトグラフィー（アセトニトリル／水とトリフルオロ酢酸改変剤）によっても精製した。
方法Ａ−Ｄ
Figure 2021511312
 ６−ブロモ−１−メチル−８−［（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキサオキシ］キノキサリン−２−オン
６−ブロモ−８−ヒドロキシ−１−メチル−キノキサリン−２−オン（９５４ｍｇ、３．７４０ｍｍｏｌ）および［４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル］メタンスルホネート（３．１ｇ、１１．４２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（７．０ｍＬ）溶液に、炭酸ルビジウム（２．４９ｇ、１０．７８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を８０℃で終夜撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、ジクロロメタンと水に分配した。相を分離し、水相をジクロロメタンでさらに抽出した。有機物を濃縮し、真空下で終夜乾燥させた。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（８０ｇのシリカゲルカートリッジ、０〜５％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配）、６−ブロモ−１−メチル−８−［４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキサオキシ］キノキサリン−２−オン（７００ｍｇ、収率４２％）を提供した。
表Ａ． メシレートの置換えを最終ステップとして使用して調製した化合物。
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
セクションＩＶ：ブロモ−キノキサリノン中間体の調製
セクションＩＶは、本明細書の他所に記載されていない官能化６−ブロモ−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン中間体を調製するための合成手順を含有する。これらの中間体を、アミンまたはボロン酸エステルカップリングパートナーを適切に選択すると共に使用して、表Ｂの化合物を調製した。
Figure 2021511312
 ６−ブロモ−１−メチル−８−（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）キノキサリン−２−オン
６−ブロモ−８−ヒドロキシ−１−メチル−キノキサリン−２−オン（２９９ｍｇ、１．１７２ｍｍｏｌ）、（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキシル）メタンスルホネート（５１７ｍｇ、１．８９９ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（５０１ｍｇ、１．５３８ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６．０ｍＬ）の混合物を、１００℃に４時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を、逆相クロマトグラフィーによって精製した（１００ｇのＩｓｃｏ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｃ１８誘導体化シリカゲルカートリッジ、２５〜６０％アセトニトリル／水の直線勾配とトリフルオロ酢酸改変剤）。生成物を含有する画分を、酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウムに分配した。相を分離し、水相を酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、６−ブロモ−１−メチル−８−（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）キノキサリン−２−オン（３２０．６ｍｇ、収率６３％）を提供した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値４３０．０６、実測値４３１．１６（Ｍ＋１）。
Figure 2021511312
 ６−ブロモ−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（（５−メトキシピリミジン−２−イル）オキシ）シクロヘキシル）オキシ）−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−１−メチル−８−（（１，４−ｃｉｓ）−４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）キノキサリン−２−オンについて先に記載される手順に類似の手順によって調製した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値４６０．０７、実測値４６１．１３（Ｍ＋１）。
Figure 2021511312
 ６−ブロモ−１−メチル−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（（５−メチルピリミジン−２−イル）オキシ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−１−メチル−８−（（１，４−ｃｉｓ）−４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）キノキサリン−２−オンについて先に記載される手順に類似の手順を介して調製した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値４４４．０８、実測値４４５．１１（Ｍ＋１）。
Figure 2021511312
 ６−ブロモ−１−メチル−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（（２−メチルピリミジン−４−イル）オキシ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−１−メチル−８−（（１，４−ｃｉｓ）−４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）キノキサリン−２−オンについて先に記載される手順に類似の手順によって調製した。
Figure 2021511312
 ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚの計算値４４４．０８、実測値４４５．１１（Ｍ＋１）。
セクションＶ：ＢＵＣＨＷＡＬＤカップリングまたは鈴木カップリングを最終ステップとして使用して調製した化合物
このセクションに記載される化合物を、官能化６−ブロモ−１−メチルキノキサリン−２（１Ｈ）−オン（セクションＩＶに記載される）およびアミン（Ｂｕｃｈｗａｌｄカップリングの場合）またはボロン酸エステル（鈴木カップリングの場合）を適切に選択することにより、下記の方法を使用して調製した。このセクションの化合物の分析データを、表Ｂに提供する。
方法Ｂ−Ａ
Figure 2021511312
 ６−（６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン−３−イル）−１−メチル−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）−シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−１−メチル−８−［４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシルオキシ］キノキサリン−２−オン（７４ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）、６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン（塩酸塩、６１ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（２６３ｍｇ、０．８０７ｍｍｏｌ）、ＲｕＰｈｏｓ−Ｇ３−パラダサイクル（３０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）、ＲｕＰｈｏｓ（１７ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）、およびジオキサン（７００μＬ）の混合物を、１００℃で終夜撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチルと水に分配した。相を分離し、水層を酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（１２ｇのシリカゲルカートリッジ、０〜５％メタノール／ジクロロメタンの直線勾配）、６−（６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン−３−イル）−１−メチル−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン（１７．０ｍｇ、収率２２％）を提供した。
注記：この方法によって調製した分子を、Ｃ１８分取ＨＰＬＣによっても精製した（アセトニトリル／水とトリフルオロ酢酸または水酸化アンモニウム改変剤のいずれか）。
方法Ｂ−Ｂ
Figure 2021511312
 ６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１−メチル−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロ−ヘキシル）−オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン
６−ブロモ−１−メチル−８−［４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキサオキシ］キノキサリン−２−オン（６２ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ）、２−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（４４ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２Ｍ水溶液を２０７μＬ、０．４１４ｍｍｏｌ）、およびジオキサン（１．１ｍＬ）の混合物に、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］−ジクロロパラジウム（ＩＩ）（ジクロロメタン複合体、１０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を１００℃で２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を、Ｃ１８分取ＨＰＬＣによって直接的に精製し（アセトニトリル／水とトリフルオロ酢酸改変剤）、関連する画分を合わせ、濃縮乾固させた。こうして得られた材料をジクロロメタンに溶解させ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を収集し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、蒸発させて、６−（３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１−メチル−８−（（（１，４−ｃｉｓ）−４−（ピリミジン−２−イルアミノ）シクロヘキシル）オキシ）キノキサリン−２（１Ｈ）−オン（３０ｍｇ、収率４７％）を提供した。
注記：この方法によって調製した分子を、シリカゲルクロマトグラフィーによっても精製した（酢酸エチル／ジクロロメタン）。
方法Ｂ−Ｃ
Figure 2021511312
 １−メチル−６−（６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン−３−イル）−８−（（１，４−ｃｉｓ）−４−ピリミジン−２−イルオキシ−シクロヘキサオキシ）−キノキサリン−２−オン
ジオキサン（１．０ｍＬ）中６−ブロモ−１−メチル−８−（４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）キノキサリン−２−オン（８０ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（１９５ｍｇ、０．５９９ｍｍｏｌ）の懸濁液を、窒素ガスを混合物に５分間バブリングすることによって脱気した。ＲｕＰｈｏｓ（９ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）および酢酸パラジウム（ＩＩ）（２ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに５分間脱気した。最後に、６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン（３１ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）を添加し、バイアルを密閉し、１００℃に３時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して（１２ｇのシリカゲルカートリッジにより均一濃度の酢酸エチルを使用した）、１−メチル−６−（６−オキサ−３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタン−３−イル）−８−（（１，４−ｃｉｓ）−４−ピリミジン−２−イルオキシシクロヘキサオキシ）キノキサリン−２−オン（３６．５ｍｇ、収率４３％）を提供した。
表Ｂ． Ｂｕｃｈｗａｌｄカップリングを最終ステップとして使用して調製した化合物。
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
Figure 2021511312
遺伝子編集の実施例
実施した実験および達成された結果を含めた以下の実施例は、単に例示目的で提供され、本開示を制限すると解釈されるべきではない。
（実施例１）
材料および方法
方法：
細胞および培養物
気管支上皮細胞（ＢＥＣ）は、ＣＦＴＲｄＦ５０８／ｄＦ５０８遺伝子型を有する嚢胞性線維症と診断されたヒトドナーから誘導した。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は山中リプログラミング因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃを用いたウイルス形質導入後のヒト皮膚の線維芽細胞から誘導した。誘導されたｉＰＳＣは３つの胚葉に分化することができ、２３対の染色体を有する正常な核型を含有した。
原発性ヒト動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）はＨｅｍａｃａｒｅまたはＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した。細胞を解凍し、洗浄し、血清フリー培地ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で構成され、サイトカインミックス（３００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３）を１ｍＬ当たり１〜３×１０５個の細胞密度で補充した完全培地に再懸濁させ、電気穿孔前、４８時間にわたり３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤：
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤化合物１を遺伝子編集例に使用した。無水ＤＭＳＯを使用することにより１０ｍＭストック溶液を作製し、−８０℃で保存した。
電気穿孔：
使用した合成ｓｇＲＮＡは、Ｓｙｎｔｈｅｇｏから購入したＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）精製したものであり、５’および３’の両末端の３つの末端位置において化学的改変ヌクレオチド（２’−Ｏ−メチル３’−ホスホロチオエート）を含有した。改変ヌクレオチドに下線が付されたｓｇＲＮＡの配列は、以下の通りである：
ＡＡＶＳ１ ｓｇＲＮＡ：
Figure 2021511312
ＮＡＶ１．７ ｓｇＲＮＡ：
Figure 2021511312
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡはＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した（Ｌ−７２０６）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、核局在化シグナルを有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＳＦ３７０ Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ９）のバージョンを発現する。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡはまたＣＡＰ１構造、ポリアデニル化シグナルおよび改変ウリジンを含有することで、哺乳動物細胞における最適な発現レベルが得られる。
ドナーｓｓＯＤＮはＩＤＴから購入した。ｓｓＯＤＮは、相同性アームの４０ヌクレオチドが両側に配置された、１０ヌクレオチド挿入配列を含有することで、ＴＩＤＥアッセイによりＨＤＲ事象を測定する。ｓｓＯＤＮは、全部で９０ヌクレオチドおよびホスホロチオエート改変ヌクレオチドを５’および３’末端の両方の３つの末端位置で含有する。ホスホロチオエート改変ヌクレオチドに下線が付されたドナーｓｓＯＤＮの配列は以下の通り示される：
ＡＡＶＳ１ ＰＡＭ：
Figure 2021511312
ＡＡＶＳ１ 非ＰＡＭ：
Figure 2021511312
ＮＡＶ１．７ ＰＡＭ：
Figure 2021511312
ＮＡＶ１．７ 非ＰＡＭ：
Figure 2021511312
すべての電気穿孔は、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システムで実施した。
ＢＥＣに対して、電気穿孔の以下の条件を使用した：２０ｕｌのＰ４電気穿孔緩衝剤中、１．８×Ｅ５細胞、２５０ｎｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡ、５００ｎｇのｓｇＲＮＡおよび０．６６ｕＭのｓｓＯＤＮ、プログラムＣＭ−１３８を使用。電気穿孔した細胞は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を補充した１００ｕｌのＢＥＣ培地を含有する９６ウェルプレートに移すか、または未処理のまま置いた。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃でインキュベートした。
ｉＰＳＣに対して、以下の条件を使用した：２０ｕｌのＰ３電気穿孔緩衝剤中、２．０×Ｅ５細胞、２５０ｎｇのＣＡＳ９ ｍＲＮＡ、５００ｎｇのｓｇＲＮＡおよび０．６６ｕＭのｓｓＯＤＮ、プログラムＣＡ−１３７を使用。電気穿孔した細胞は、１０ｕＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した、１００ｕｌのｍＴＥｓＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有し、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を含むまたは含まない、９６ウェルプレートに移し、次いで５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃でインキュベートした。
ＣＤ３４＋細胞を解凍の２日後に電気穿孔した。以下の条件を電気穿孔に対して使用した：１００μｌのＰ３電気穿孔緩衝剤中、２．０×Ｅ６細胞、１５μｇＣａｓ９タンパク質（Ｆｅｌｄａｎ）、１５μｇのｓｇＲＮＡ、１μＭのｓｓＯＤＮ、プログラムＣＡ−１３７を使用。電気穿孔した細胞は、各ウェルが様々な濃度のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を含有する、２４−ウェルプレートの８つのウェルに同等に分割して移した。５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２日間細胞をインキュベートし、細胞生存率および遺伝子編集について評価した。
脂質媒介細胞トランスフェクション：
トランスフェクションの１日前、９６−ウェルプレートに１ウェル当たり１×Ｅ４細胞の細胞密度で、ＢＥＣ培地内にＢＥＣを播種した。第１に、０．１５ｕｌのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ ００３）を５ｕｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭへと希釈し、室温で１０分間インキュベートした。一方、８０ｎｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｌ−７２０６）、２０ｎｇのｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）および１ピコモルのｓｓＯＤＮを５ｕｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに加え、次いでＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡｘ溶液と混合した。混合物を５分間インキュベートしてから、細胞に加えた。１００ｕｌの培地を有し、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤を含む、または含まない９６−ウェルプレートのウェル内で、全溶液を細胞に加えた。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃でインキュベートした。
細胞生存率の測定：
５ｕｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｈ３５７０）および０．５ｕｇ／ｍｌのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｐ３５６６）と共に、培地内で、３７度で１時間細胞をインキュベートした。細胞をイメージングし、Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用することにより、Ｈｏｅｓｃｈｔ陽性事象（生細胞および死亡細胞）およびＰＩ陽性事象（死亡細胞）について測定した。相対的な細胞生存率を以下の通り計算した：［試料の（Ｈｏｅｓｃｈｔ＋事象−ＰＩ＋事象）］／対照の（Ｈｏｅｓｃｈｔ＋事象−ＰＩ＋事象）］＊１００。対照は模擬トランスフェクト細胞であり、細胞生存率は任意に１００％に設定した。
Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（ＣＴＧ）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＣＤ３４＋ＨＳＰＣの細胞生存期間を測定した。１００μｌの細胞懸濁液を１００μｌの完全ＣＴＧ試薬と混合した。照度計を使用して化学発光性シグナルを測定し、対照細胞（ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤で処理していない細胞）と比較して生存細胞の％を計算した。
遺伝子編集率の測定：
９６ウェルプレートの１ウェル当たり５０ｕｌのＤＮＡＱｕｉｃｋｅｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）と共に、３７℃で３０分間細胞をインキュベートすることにより、ゲノムＤＮＡを単離した。細胞抽出物を混合し、ＰＣＲプレートに移し、次いで６５℃で６分間および９８℃で２分間インキュベートした。ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１２３４４０２４）を使用することにより、１ｕｌのゲノムＤＮＡ含有溶液でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は９４℃（１×）で４分間、これに続いて、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、６０℃で１分（４０×）であった。ＰＣＲ生成物を精製し、次いでＧＥＮＥＷＩＺでＳａｎｇｅｒ配列を決めた。標的部位に及ぶ以下のプライマー対をＰＣＲに使用した（ＦＷ、フォワード；ＲＶ、リバース）。Ｓａｎｇｅｒシークエンシングにより使用されるプライマーはアスタリスク（＊）で示されている：
ＡＡＶＳ１＿ＦＷ： ５’ＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣ３’（配列番号９）
ＡＡＶＳ１＿ＲＶ＊： ５’ａｇｇａｔｃａｇｔｇａａａｃｇｃａｃｃａ３’（配列番号１０）。
ＮＡＶ１．７＿ＦＷ＊： ５’ｇｃｃａｇｔｇｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｔａｔ３’（配列番号１１）。
ＮＡＶ１．７＿ＲＶ： ５’ｔｃａｇｃａｔｔａｔｃｃｔｔｇｃａｔｔｔｔｃｔｇｔ３’（配列番号１２）。
ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）ソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌ）を使用して各配列クロマトグラムを分析した（またＢｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４２， Ｉｓｓｕｅ ２２， １６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１４， Ｐａｇｅｓ ｅ１６８を参照されたい）。模擬電気穿孔した試料を参照配列として使用し、パラメーターをインデルサイズ３０ｎｔに設定し、高い質のトレースで可能な最大ウィンドウを網羅する、分解ウィンドウを設定した。全インデル（挿入および欠失）率を直接ＴＩＤＥプロットから得た。ＨＤＲ率は１０ヌクレオチドの挿入を有する事象のパーセンテージであった。ＮＨＥＪ率を全インデル率−ＨＤＲ率として計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウエアを使用して、グラフを生成し、すべての統計的情報を計算した。
（実施例２）
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はＢＥＣにおいてＨＤＲ遺伝子編集率を改善する
図１は、以下の実施例に使用されている遺伝子編集アッセイの設計を例示している。ＨＤＲ遺伝子編集率に対するＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の作用を調べるために、ＢＥＣをｓｐＣＡＳ９ ｍＲＮＡ、ＮＡＶ１．７ｓｇＲＮＡおよびＮＡＶ１．７非ＰＡＭ ｓｓＯＤＮを用いて電気穿孔し、次いで異なる濃度の化合物１と共にインキュベートするか、または未処理のまま置いた（対照）。電気穿孔から７２時間後、ＴＩＤＥアッセイを使用することにより、遺伝子編集率を決定した。遺伝子編集率はパーセンテージで表現し、ＨＤＲとＮＨＥＪに分類した。細胞生存率は、パーセンテージで示され、この場合、対照細胞を１００％と設定した。
図２に示されている通り、化合物１のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はＢＥＣにおいて遺伝子編集率を改善する。化合物１に対して、ＮＨＥＪ ＩＣ５０は０．４４５０μＭであり、ＨＤＲ ＥＣ５０は０．４４４８μＭであり、ＨＤＲ ＴＯＰ％は６９．３７であった。
（実施例３）
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はＣＤ３４＋細胞においてＨＤＲ遺伝子編集率を改善する
ＨＤＲ遺伝子編集率に対するＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の作用を調べるため、ｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞をＲＮＰ（ｓｐＣＡＳ９タンパク質＋ＮＡＶ１．７ ｓｇＲＮＡ）およびＮＡＶ１．７ 非ＰＡＭ ｓｓＯＤＮを用いて電気穿孔した。次いで、細胞を様々な濃度の化合物１と共にインキュベートした。電気穿孔から４８時間後、ＴＩＤＥアッセイを使用して、遺伝子編集率を決定した。遺伝子編集率をパーセンテージで表現し、図３Ａ（ドナーＢ）および図３Ｂ（ドナーＣ）に示されている通りＨＤＲとＮＨＥＪに分類した。細胞生存率はパーセンテージで示され、この場合、対照細胞を１００％と設定した。
図３Ａおよび３Ｂに示されている通り、化合物１のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集率を改善する。ドナーＢに対するＨＤＲおよびインデル形成のＥＣ５０値はそれぞれ０．２９μＭおよび０．３５μＭであった。
（実施例４）
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はｉＰＳＣにおいてＨＤＲ遺伝子編集率を改善する
ＨＤＲ遺伝子編集率に対するＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の作用を調べるため、ｉＰＳＣをｓｐＣＡＳ９ ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１ ｓｇＲＮＡおよびＡＡＶＳ１ ＰＡＭ ｓｓＯＤＮを用いて電気穿孔し、次いで異なる濃度の化合物１と共にインキュベートするか、または未処理のまま置いた（対照）。電気穿孔から７２時間後、ＴＩＤＥアッセイを使用することで遺伝子編集率を決定した。遺伝子編集率をパーセンテージで表現し、ＨＤＲとＮＨＥＪに分類した。細胞生存率はパーセンテージで示され、この場合、対照細胞を１００％と設定した。
図４に示されている通り、化合物１のＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はｉＰＳＣにおける遺伝子編集率を改善する。化合物１に対して、ＮＨＥＪ ＩＣ５０は０．４７４μＭであり、ＨＤＲ ＥＣ５０は０．３２５３μＭであり、ＨＤＲ ＴＯＰ％は２４．４１であった。
（実施例５）
ＥＣｍａｘにおける遺伝子編集速度の決定
ＥＣ ｍａｘにおける遺伝子編集速度を調べるため、ＢＥＣをｓｐＣＡＳ９ ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１ ｓｇＲＮＡおよびＡＡＶＳ１ ＰＡＭ ｓｓＯＤＮを用いて電気穿孔し、次いで異なる時間で１０μＭの化合物１と共にインキュベートするか、または未処理のまま置いた（対照）。ＴＩＤＥアッセイを使用することにより遺伝子編集率を決定し、ＨＤＲおよびＮＨＥＪのパーセンテージで表現した。１０μＭは化合物１の最大増強濃度（ＥＣｍａｘ）である。
図５は、ＨＤＲとＮＨＥＪ事象の間に厳格な逆相関関係が存在することを示している。
（実施例６）
ＥＣ５０における遺伝子編集速度の決定
ＢＥＣを、ｓｐＣＡＳ９ ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１ ｓｇＲＮＡおよびＡＡＶＳ１ ＰＡＭ ｓｓＯＤＮを用いて電気穿孔し、次いで異なる時間で０．７μＭの化合物１と共にインキュベートするか、または未処理のまま置いた（対照）。ＴＩＤＥアッセイを使用することにより遺伝子編集率を決定し、ＨＤＲおよびＮＨＥＪのパーセンテージで表現した。０．７μＭは化合物１の増強濃度５０（ＥＣ５０）である。図６は、ＢＥＣにおけるＨＤＲおよびＮＨＥＪに対するＤＮＡ−ＰＫ阻害の時間経過を例示している。
（実施例７）
ＢＥＣにおいて遺伝子編集構成成分が脂質媒介トランスフェクションにより送達された場合、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はＨＤＲ率を改善する
脂質媒介トランスフェクションの作用を調べるため、ＢＥＣに、ｓｐＣＡＳ９ ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１ ｓｇＲＮＡおよびＡＡＶＳ１ ＰＡＭ ｓｓＯＤＮをトランスフェクトし、次いで異なる濃度の化合物１と共にインキュベートするか、または未処理のまま置いた（対照）。トランスフェクションから７２時間後、ＴＩＤＥアッセイを使用することにより遺伝子編集率を決定した。図７は、脂質ベースのトランスフェクションにより送達される化合物１の濃度が増加するにつれて、ＨＤＲ効率が増加する。
総括：
異なる細胞型および遺伝子座へのＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の添加の結果は、細胞型および遺伝子座の全域でのＨＤＲの有意な増強を示している。ＨＤＲ遺伝子編集の増強が、ＢＥＣ、ｉＰＳＣ、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣ（３人の別個のドナー）を含む複数の細胞型において示されている。ＨＤＲ遺伝子編集の増強が、ＡＡＶＳ１．１、ＮａＶ１．７を含む複数の遺伝子座において示されている。実験の結果はまた、脂質ベースのおよび電気穿孔送達が有効であることを示している。電気穿孔の例はＢＥＣ、ｉＰＳＣ、ＣＤ３４＋ ＨＰＳＣ、および脂質ベースの送達システムを使用したＢＥＣにおける作用送達を含む。ＨＤＲとＮＨＥＪ事象の間の厳格な逆相関関係は、遺伝子座、実験条件および細胞型の全域で観察されている。
総括表： ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤はＨＤＲで駆動された遺伝子編集を改善する
Figure 2021511312
Figure 2021511312
 均等論
本開示を、その好ましい実施形態を参照しながら具体的に示し、記載してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される通り、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書の形態および詳細に様々な変更を行うことができることを、当業者は理解されよう。当業者は、ごく日常的な実験方法を使用して、本明細書に具体的に記載される本開示の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができよう。このような均等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (75)

  1. 式（Ｉ）の化合物
    Figure 2021511312
     ［式中、ｍおよびｎは、独立して、１または２であり、
    Ｘは、ＯまたはＮＲであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｙは、結合、Ｏ、またはＮＲであり、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ２は、
    ａ）Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１個もしくは２個のヘテロ原子を含有する５員もしくは６員のアリールもしくはヘテロアリール環（ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリール環は、ＣＮ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルコキシ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’、および５員もしくは６員のヘテロシクロアルキルもしくはヘテロアリール環からなる群から独立して選択される０、１、２もしくは３個の置換基Ｒ３によって置換されていてよく、各環は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含有し、Ｒ１’は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、または前記アリールもしくはヘテロアリール環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員もしくは６員の縮合環を形成することができる）、または
    ｂ）ＣＯＯＲ４（ここで、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである）
    であり、
    各Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ４−ハロアルコキシは、ＯＲ５またはＮＲ６Ｒ７でさらに置換されていてよく、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルもしくはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルであり、またはＲ６およびＲ７、ならびにそれらが結合する窒素原子は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される０個もしくは１個のさらなるヘテロ原子を含有し得る５員もしくは６員の飽和環を形成し、環は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルによってさらに置換されていてよく、
    環Ａは、
    Figure 2021511312
     （式中、Ｗは、ＮまたはＣＲ３であり、Ｚは、ＯまたはＳであり、Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである）からなる群から選択される］。
  2. Ｒ２が、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１個または２個のヘテロ原子を含有する５員または６員のアリールまたはヘテロアリール環であり、前記アリールおよび前記ヘテロアリール環が、ＣＮ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルもしくはＣ３〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択される０、１もしくは２個の置換基Ｒ３によって置換されていてよく、Ｒ１’が、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルであり、または前記アリールもしくはヘテロアリール環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基が、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ２が、
    Figure 2021511312
     ［式中、＃は、Ｒ２が式（Ｉ）の前記化合物の残部に結合している箇所を示し、
    ｏは、０、１、または２である］である、
    請求項１または２に記載の化合物。
  4. 式（Ｉ）の前記化合物が、構造式（ＩＩ）、構造式（ＩＩ’）、構造式（ＩＩ’’）、または構造式（ＩＩ’’’）によって表される、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
    Figure 2021511312
  5. ｍおよびｎのそれぞれが、２である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
  6. Ｒ１が、メチルである、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
  7. Ｒ２が、
    Figure 2021511312
     である、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
  8. ｍおよびｎのそれぞれが、２であり、Ｙが、結合であり、Ｒ１が、メチルであり、Ｒ２が、ＣＯＯＲ４であり、Ｒ４が、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
  9. Ａが、
    Figure 2021511312
     である、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
  10. Ａが、
    Figure 2021511312
     である、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
  11. Ａが、
    Figure 2021511312
     である、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
  12. Ａが、
    Figure 2021511312
     である、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
  13. 式（Ｉ）の前記化合物が、構造式（ＩＩＩ）、構造式（ＩＩＩ’）、構造式（ＩＩＩ’’）、または構造式（ＩＩＩ’’’）によって表される、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
    Figure 2021511312
  14. ｏが、０、１、または２であり、各Ｒ３が、ＣＮ、ハロ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ２−アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２−ハロアルコキシ、およびＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１’からなる群から独立して選択され、Ｒ１’が、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
  15. 前記アリールまたはヘテロアリール環の隣接する炭素原子に結合している２個のＲ３基が、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有し得る５員の縮合環を形成することができる、請求項１〜１４のいずれかに記載の化合物。
  16. 以下の化合物から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
    Figure 2021511312
  17. １つまたは複数の標的ゲノム領域を編集する方法であって、
    １つまたは複数の標的ゲノム領域を含む１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含み、
    前記１つまたは複数の標的ゲノム領域が編集される、方法。
  18. 相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を介して１つまたは複数の標的ゲノム領域のＤＮＡ切断を修復する方法であって、
    １つまたは複数の標的ゲノム領域を含む１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含み、
    前記ゲノム編集システムが、前記標的ゲノム領域の核酸（複数可）と相互作用して、ＤＮＡ切断をもたらし、前記ＤＮＡ切断が、ＨＤＲ経路を介して少なくとも部分的に修復される、
    方法。
  19. 非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した１つまたは複数の標的ゲノム領域のＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する方法であって、
    １つまたは複数の標的ゲノム領域を含む１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含み、
    前記ゲノム編集システムが、前記１つまたは複数の標的ゲノム領域の核酸（複数可）と相互作用して、ＤＮＡ切断をもたらし、ＮＨＥＪ経路を介した前記ＤＮＡ切断の修復が、阻害または抑制される、
    方法。
  20. １つまたは複数の遺伝子またはタンパク質の発現を改変する方法であって、
    １つまたは複数の標的ゲノム領域を含む１つまたは複数の細胞に、ゲノム編集システムおよび請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶を投与することを含み、
    前記ゲノム編集システムが、標的遺伝子（複数可）の前記１つまたは複数の標的ゲノム領域の核酸（複数可）と相互作用して、前記１つまたは複数の標的ゲノム領域の編集をもたらし、前記編集が、前記標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現を改変する、
    方法。
  21. 前記ＤＮＡ切断が、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
  22. 前記１つまたは複数の細胞において前記標的ゲノム領域を編集する効率が、前記化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して増加する、請求項１７に記載の方法。
  23. ＨＤＲ経路を介した前記１つまたは複数の細胞の前記標的ゲノム領域における前記ＤＮＡ切断の修復の効率が、前記化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して増加する、請求項１８に記載の方法。
  24. ＮＨＥＪ経路を介した前記１つまたは複数の細胞の前記標的ゲノム領域における前記ＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する効率が、前記化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して増加する、請求項１９に記載の方法。
  25. 前記効率が、前記化合物が存在しないこと以外の点では同一である１つまたは複数の細胞と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍増加する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記効率が、標的化されたポリヌクレオチド組込みの頻度により測定される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記効率が、標的化された突然変異導入の頻度により測定される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記標的化された突然変異導入が、点突然変異、欠失、および／または挿入を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現が、前記投与前の前記１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して増加する、請求項２０に記載の方法。
  30. 前記発現が、前記投与前の前記１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、または１０倍増加する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現が、前記投与前の前記１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して低減する、請求項２０に記載の方法。
  32. 前記遺伝子発現が、前記投与前の前記１つまたは複数の細胞におけるベースライン発現レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低減する、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記標的遺伝子（複数可）に関連する下流遺伝子（複数可）および／またはタンパク質（複数可）の発現が、前記１つまたは複数の細胞において実質的に消失する、請求項２０に記載の方法。
  34. 前記細胞が、ＳまたはＧ２細胞周期フェーズにおいて同期化される、請求項１７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記化合物を投与されたまたは接触させられた前記１つまたは複数の細胞が、前記化合物を投与されても、接触させられてもいない１つまたは複数の細胞と比較して生存期間の増加を有する、請求項１７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ゲノム編集システムおよび前記化合物が、前記１つまたは複数の細胞に同時に投与される、請求項１７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ゲノム編集システムおよび前記化合物が、前記１つまたは複数の細胞に逐次的に投与される、請求項１７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ゲノム編集システムが、前記化合物の前に、前記１つまたは複数の細胞に投与される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記化合物が、前記ゲノム編集システムの前に、前記１つまたは複数の細胞に投与される、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記１つまたは複数の細胞が、培養細胞である、請求項１７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記１つまたは複数の細胞が、生物内のｉｎ ｖｉｖｏ細胞である、請求項１７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記１つまたは複数の細胞が、生物由来のｅｘ ｖｉｖｏ細胞である、請求項１７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記生物が哺乳動物である、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記生物がヒトである、請求項４１または４２に記載の方法。
  45. 前記ゲノム編集システムおよび前記化合物が、同じ経路を介して投与される、請求項１７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ゲノム編集システムおよび前記化合物が、異なる経路を介して投与される、請求項１７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ゲノム編集システムが、静脈内投与され、前記化合物が、経口投与される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ゲノム編集システムが、メガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム、またはＮｇＡｇｏベースのシステムから選択される、請求項１７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. ゲノム編集システムが、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ＣＲＩＳＰＲベースのシステムが、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ＣＲＩＳＰＲベースのシステムが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、（ａ）以下を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメント：（ｉ）前記１つもしくは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、または前記ターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、（ｉｉ）および前記ターゲッターＲＮＡとのハイブリッド形成が可能なヌクレオチド配列を含むアクチベーターＲＮＡ、または前記アクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、ならびに（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質エレメントまたは前記Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ターゲッターＲＮＡおよびアクチベーターＲＮＡが、単一分子として融合される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記Ｃａｓタンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ｎ、Ｃａｓ９−ＨＦ、Ｃａｓ９−Ｈ８４０Ａ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、またはＤ１０Ａニッカーゼ、またはこれらの任意の組合せである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ＣＲＩＳＰＲベースのシステムが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムが、（ａ）少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメントまたは前記ガイドＲＮＡエレメントをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸であって、前記ガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡエレメントまたは核酸、および（ｂ）Ｃｐｆタンパク質を含むＣｐｆタンパク質エレメントまたは前記Ｃｐｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項５０に記載の方法。
  56. 前記ゲノム編集システムが、１つまたは複数のベクターにより送達される、請求項１７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記１つまたは複数のベクターが、ウイルスベクター、プラスミド、またはｓｓＤＮＡから選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスのベクターからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ゲノム編集システムが、合成ＲＮＡにより送達される、請求項１７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記ゲノム編集システムが、ナノ製剤により送達される、請求項１７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. １つまたは複数の標的ゲノム領域を編集するためのキットまたは組成物であって、
    ゲノム編集システム、および請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは共結晶
    を含む、キットまたは組成物。
  62. 前記ゲノム編集システムが、メガヌクレアーゼベースのシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースのシステム、転写活性因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム、またはＮｇＡｇｏベースのシステムである、請求項６１に記載のキットまたは組成物。
  63. ゲノム編集システムが、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムである、請求項６２に記載のキットまたは組成物。
  64. 前記ＣＲＩＳＰＲベースのシステムが、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムである、請求項６３に記載のキットまたは組成物。
  65. 前記ＣＲＩＳＰＲベースのシステムが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、（ａ）以下を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡエレメント：（ｉ）前記１つもしくは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、または前記ターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、（ｉｉ）および前記ターゲッターＲＮＡとのハイブリッド形成が可能なヌクレオチド配列を含むアクチベーターＲＮＡ、または前記アクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、ならびに（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質エレメントまたは前記Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む、請求項６４に記載のキットまたは組成物。
  66. 前記Ｃａｓタンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６５に記載のキットまたは組成物。
  67. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ｎ、Ｃａｓ９−ＨＦ、Ｃａｓ９−Ｈ８４０Ａ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、またはＤ１０Ａニッカーゼ、またはこれらの任意の組合せである、請求項６６に記載のキットまたは組成物。
  68. 前記ＣＲＩＳＰＲベースのシステムが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆシステムが、（ａ）前記１つもしくは複数の標的ゲノム領域におけるヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲッターＲＮＡ、または前記ターゲッターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸、および（ｂ）Ｃｐｆタンパク質を含むＣｐｆタンパク質エレメントまたは前記Ｃｐｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸を含む、請求項６４に記載のキットまたは組成物。
  69. 前記ゲノム編集システムが、１つまたは複数のベクターに含まれるまたはパッケージされる、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
  70. 前記１つまたは複数のベクターが、ウイルスベクター、プラスミド、またはｓｓＤＮＡから選択される、請求項６９に記載のキットまたは組成物。
  71. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスのベクターからなる群から選択される、請求項７０に記載のキットまたは組成物。
  72. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  73. 細胞を、ＤＮＡ傷害を誘発する治療剤または疾患状態に対して感受性化させる方法であって、前記細胞を、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、または前記化合物を含む医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
  74. 患者のがんを処置するための治療レジメンを増強する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、または前記化合物を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  75. 患者におけるがんを処置する、またはがん細胞の成長を阻害する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、または前記化合物を含む医薬組成物を単独で、または１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
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