TW202246510A - 以crispr/slucas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涵蓋用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的組合物及方法。

Description

以CRISPR/SLUCAS9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
第1型肌強直性營養不良(DM1)為一種體染色體顯性肌肉病症，其起因於人類 DMPK基因之3'非轉譯區(UTR)中存在CTG重複序列擴增，導致對於肌肉功能具有重要作用的基因產生RNA病灶及誤剪接。該病症影響骨骼肌及平滑肌以及眼、心臟、內分泌系統及中樞神經系統，且導致肌無力、消瘦、身體失能及壽命縮短。
使用Cas9及嚮導RNA進行基於CRISPR的基因體編輯，可使得基因體DNA達成序列特異性裂解。舉例而言，可將編碼Cas9酶的核酸及根據適當嚮導RNA編碼的核酸設置於不同載體上或一起設置於單個載體上且活體內或活體外投與以剔除或校正基因突變。位於嚮導RNA 5'端的約20個核苷酸充當嚮導或間隔子序列，其可為與基因體目標位置的一個股互補的任何序列，該股具有相鄰的原間隔子相鄰模體(PAM)。PAM序列為Cas9分子進行適當結合所需要的短序列，該短序列鄰接於Cas9核酸酶切割位點。嚮導RNA之嚮導或間隔子序列的3'核苷酸充當與Cas9相互作用的支架序列。當表現嚮導RNA及Cas9時，嚮導RNA將結合至Cas9且將其導引至與嚮導序列互補的序列，接著，其將在該序列中起始雙股斷裂(DSB)。為了修復此等斷裂，細胞典型地利用容易出錯的非同源末端接合機制(NHEJ)，該機制可經由密碼子插入或缺失、閱讀框架移位而引起目標基因功能中斷，或促使過早終止密碼子觸發無義股介導的衰減。參見例如Kumar等人(2018) Front. Mol. Neurosci.第11卷, 論文413。
由於早期不斷地成功完成AAV載體設計、製造及基因療法的臨床階段投與，因此在活體內或活體外經由腺相關病毒(AAV)投與CRISPR-Cas組分具有吸引力。參見例如Wang等人(2019) Nature Reviews Drug Discovery 18:358-378; Ran等人(2015a) Nature 520: 186-101。然而，常用的釀膿鏈球菌(spCas9)非常大，且當在基於AAV之CRISPR/Cas系統中使用時，需要兩個AAV載體：一個載體攜載編碼spCas9的核酸，且另一個攜載編碼嚮導RNA的核酸。克服此技術障礙的一種可能方式為利用來源於不同原核生物物種之Cas9的較小直系同源物。較小的Cas9's能夠隨同編碼嚮導RNA的核酸一起在單一AAV載體上製成，藉此降低製造成本且減小投藥途徑及方案之複雜度。
本文提供使用來自路鄧葡萄球菌( Staphylococcus lugdunensis)( SluCas9)的較小Cas9治療DM1的組合物及方法。提供的組合物包含：i)包含編碼SluCas9之核酸分子及一或多個嚮導RNA的單一AAV載體；及ii)視情況存在的DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，單一AAV載體包含編碼SluCas9及單嚮導RNA(例如包含SEQ ID No: 8、63、64及81中之任一者之序列的嚮導RNA)之一或多個複本的核酸分子。在一些實施例中，單一AAV載體包含編碼SluCas9及第一嚮導RNA之一或多個複本及第二嚮導RNA之一或多個複本的核酸分子。亦提供使用所揭示之組合物治療DM1的方法。本文所揭示之組合物及方法可以用於切除CTG重複區域的一部分以治療DM1、減少RNA病灶且/或校正DM1患者細胞中的誤剪接。舉例而言，本文揭示特別適合與SluCas9一起使用的嚮導RNA及嚮導RNA組合，其用於在DNA-PK抑制劑存在或不存在下切除DMPK之3' UTR中之CTG重複序列的方法中。
本文亦提供包含超過一個載體的系統，其中一或多個嚮導RNA隨同較小SluCas9一起併入單個載體中且另一載體包含編碼嚮導RNA之多個複本的核酸。此類系統允許在需要超過一個嚮導RNA達成最佳效能的情形下實現極大的設計靈活性。舉例而言，一個載體可用於表現SluCas9及視情況存在之靶向一或多個基因體目標的一或多個嚮導RNA，且第二載體可用於表現靶向相同或不同基因體目標之相同或不同嚮導RNA的多個複本。本文提供利用此等雙載體組態之組合物及方法且該等組合物及方法的益處為降低製造成本、減少投藥途徑及方案的複雜度，及就利用相同或不同嚮導RNA的多個複本靶向相同或不同基因體目標序列而言實現最大靈活性。在一些情形下，提供相同嚮導RNA的多個複本改良了嚮導RNA的效率，從而改良已成功的系統。
相應地，提供以下非限制性實施例： [實施例01]一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA的單一核酸分子及Cas9，其中該單一核酸分子包含： a. 編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 ( SluCas9)的第二核酸； b. 編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸； c. 編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致； d. 編碼選自SEQ ID NO: 63與100及SEQ ID NO: 64與100中之任一者之2個間隔子序列的第一核酸，以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸；或 e. 編碼一或多個選自SEQ ID NO: 8、63、64及81中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸。 [實施例02]   如實施例1之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑。 [實施例03]   如實施例1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。 [實施例04]   如實施例1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。 [實施例05]   如實施例1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。 [實施例06]   如實施例1至5中任一例之組合物，其中該嚮導RNA為sgRNA。 [實施例07]   如實施例1至6中任一例之組合物，其中該嚮導RNA經修飾。 [實施例08]   如實施例7之組合物，其中該修飾改變一或多個2'位置及/或磷酸二酯鍵聯。 [實施例09]   如實施例7至9中任一例之組合物，其中該修飾改變嚮導RNA之前三個核苷酸中的一或多者或全部。 [實施例10]   如實施例7至9中任一例之組合物，其中該修飾改變嚮導RNA之最後三個核苷酸中的一或多者或全部。 [實施例11]   如實施例7至10中任一例之組合物，其中該修飾包括以下中之一或多者：硫代磷酸酯修飾、2'-OMe修飾、2'-O-MOE修飾、2'-F修飾、2'-O-次甲基-4'橋修飾、3'-硫代膦醯基乙酸酯修飾或2'-去氧修飾。 [實施例12]   如前述實施例中之任一例的組合物，其中該單一核酸分子與脂質奈米粒子(LNP)締合。 [實施例13]   如實施例1至12中任一例之組合物，其中該單一核酸分子為病毒載體。 [實施例14]   如實施例13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒載體、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體，或單純疱疹病毒載體。 [實施例15]   如實施例13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。 [實施例16]   如實施例15之組合物，其中該AAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10、AAVrh74或AAV9載體，其中AAV後之數字指示AAV血清型。 [實施例17]   如實施例16之組合物，其中該AAV載體為AAV血清型9載體。 [實施例18]   如實施例16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh10載體。 [實施例19]   如實施例16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh74載體。 [實施例20]   如實施例13至19中任一例之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含組織特異性啟動子。 [實施例21]   如實施例13至19中任一例之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含肌肉特異性啟動子，視情況其中該肌肉特異性啟動子為肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子、SPc5-12啟動子或CK8e啟動子。 [實施例22]   如實施例13至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含U6、H1或7SK啟動子。 [實施例23]   如實施例1至22中任一例之組合物，其包含編碼SluCas9的核酸，其中該SluCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 712。 [實施例24]   如實施例1至22中任一例之組合物，其包含編碼SluCas9的核酸，其中該SluCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 712之變異體。 [實施例25]   如實施例1至22中任一例之組合物，其包含編碼SluCas9的核酸，其中該SluCas9包含選自SEQ ID NO: 718-720中之任一者的胺基酸序列。 [實施例26]   如實施例1至25中任一例之組合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。 [實施例27]   一種包含嚮導RNA的組合物，該嚮導RNA由包含SEQ ID NO: 1-65、67-167與201-531中之任一者的序列或其互補序列編碼。 [實施例28]   如實施例1至27中任一例之組合物，其用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)。 [實施例29]   如實施例1至27中任一例之組合物，其用於在DMPK基因中製造雙股斷裂。 [實施例30]   如實施例1至27中任一例之組合物，其用於切除DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。 [實施例31]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如實施例1至27中任一例之組合物及視情況存在之DNA-PK抑制劑遞送至細胞。 [實施例32]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； 編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例33]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a. 選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列，及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列； b. 包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c. 與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； d. 第一及第二間隔子，或編碼嚮導RNA對的一或多個載體，其中第一及第二間隔子序列包含以下對中之任一者：SEQ ID NO: 6與72；6與81；6與84；6與98；6與100；6與114；6與122；6與134；6與139；6與149；6與166；8與72；8與72；8與81；8與84；8與98；8與100；8與114；8與122；8與134；8與139；8與149；8與166；10與72；10與81；10與84；10與98；10與100；10與114；10與122；10與134；10與139；10與149；10與166；21與72；21與81；21與84；21與98；21與100；21與114；21與122；21與134；21與139；21與149；21與166；58與72；58與81；58與84；58與98；58與100；58與114；58與122；58與134；58與139；58與149；58與166；62與72；62與81；62與84；62與98；62與100；62與114；62與122；62與134；62與139；62與149；62與166；63與72；63與81；63與84；63與98；63與100；63與114；63與122；63與134；63與139；63與149；63與166；64與72；64與81；64與84；64與98；64與100；64與114；64與122；64與134；64與139；64與149；及64與166； e. 第一及第二間隔子，或編碼嚮導RNA對的一或多個載體，其中第一及第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 63與100或SEQ ID NO: 64與100； 編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例34]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如實施例1至27中任一例之組合物遞送至細胞。 [實施例35]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個選自SEQ ID NO: 8、63、64及81中之任一者的間隔子序列； c. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 d. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； e. 選自SEQ ID NO: 63與100及64與100中之任一者的兩個(2)間隔子序列，以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸；或 編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例36]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a. 選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列，及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列； b. 包含i)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；及 c. 與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； 編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例37]   如實施例32至36中任一例之方法，其中該單一核酸分子於單一載體上遞送至細胞。 [實施例38]   如實施例32至37中任一例之方法，包含投與DNA-PK抑制劑。 [實施例39]    如實施例38之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。 [實施例40]    如實施例38之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。 [實施例41]    如實施例38之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。 [實施例42]   如實施例32至39中任一例之方法，其中SluCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 712。 [實施例43]   如實施例32至40中任一例之方法，其中SluCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 712之變異體。 [實施例44]   如實施例32至41中任一例之方法，其中SluCas9包含選自SEQ ID NO: 718-720中之任一者的胺基酸序列。 [實施例45]   如實施例1至26或28至44中任一例之組合物或方法，其中編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含選自SEQ ID NO: 600-601或900-917中之任一者的序列。 [實施例46]   如實施例1至26或28至44中任一例之組合物或方法，其中編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含選自SEQ ID NO: 901-917中之任一者的序列。 [實施例47]   如前述實施例中任一例之組合物，其中該核酸分子至少編碼第一嚮導RNA及第二嚮導RNA。 [實施例48]   如實施例47之組合物，其中該核酸分子編碼第一嚮導RNA的間隔子序列、第一嚮導RNA的支架序列、第二嚮導RNA的間隔子序列，及第二嚮導RNA的支架序列。 [實施例49]   如實施例48之組合物，其中第一嚮導RNA的間隔子序列與第二嚮導RNA的間隔子序列相同。 [實施例50]   如實施例48之組合物，其中第一嚮導RNA的間隔子序列與第二嚮導RNA的間隔子序列不同。 [實施例51]   如實施例49或50之組合物，其中第一嚮導RNA的支架序列與第二嚮導RNA的支架序列相同。 [實施例52]   如實施例49或50之組合物，其中第一嚮導RNA的支架序列與第二嚮導RNA的支架序列不同。 [實施例53]   如實施例52之組合物，其中第一嚮導RNA的支架序列包含選自由SEQ ID NO: 901-916組成之群的序列，並且其中第二嚮導RNA的支架序列包含選自由SEQ ID NO: 901-916組成之群的不同序列。 [實施例54]   一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個核酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； 編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例55]   一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a. 選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列，及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列； b. 包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c. 與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； d. 第一及第二間隔子，或編碼嚮導RNA對的一或多個載體，其中第一及第二間隔子序列包含以下對中之任一者：SEQ ID NO: 6與72；6與81；6與84；6與98；6與100；6與114；6與122；6與134；6與139；6與149；6與166；8與72；8與72；8與81；8與84；8與98；8與100；8與114；8與122；8與134；8與139；8與149；8與166；10與72；10與81；10與84；10與98；10與100；10與114；10與122；10與134；10與139；10與149；10與166；21與72；21與81；21與84；21與98；21與100；21與114；21與122；21與134；21與139；21與149；21與166；58與72；58與81；58與84；58與98；58與100；58與114；58與122；58與134；58與139；58與149；58與166；62與72；62與81；62與84；62與98；62與100；62與114；62與122；62與134；62與139；62與149；62與166；63與72；63與81；63與84；63與98；63與100；63與114；63與122；63與134；63與139；63與149；63與166；64與72；64與81；64與84；64與98；64與100；64與114；64與122；64與134；64與139；64與149；及64與166； e. 第一及第二間隔子，或編碼嚮導RNA對的一或多個載體，其中第一及第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 63與100或SEQ ID NO: 64與100； 編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例56]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其包含嚮導RNA對，其中該嚮導RNA對具有切除功能且亦充當單一嚮導切割器。 [實施例57]   如實施例54或55之方法，其中第一核酸與第二核酸處於同一核酸分子中。 [實施例58]   如實施例54或55之方法，其中第一核酸與第二核酸處於不同的核酸分子中。 [實施例59]   如實施例58之方法，其中各別核酸分子各自處於不同載體中。 [實施例60]   如實施例54至59中任一例之方法，其中編碼SluCas9的核酸不編碼嚮導RNA。 [實施例61]   如實施例54至60中任一例之方法，其中編碼SluCas9的核酸編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列。 [實施例62]   一種包含第一核酸分子及第二核酸分子的組合物，其中核酸分子編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)且第二核酸分子編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列。 [實施例63]   如實施例62之組合物，其中該第一核酸分子不編碼嚮導RNA。 [實施例64]   如實施例62之組合物，其中該第一核酸分子編碼： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列。 [實施例65]   如實施例62至64中任一例之組合物，其中第一核酸分子處於第一載體中，且第二核酸分子處於不同的第二載體中。 [實施例66]   如實施例65之組合物，其中第一及第二載體為AAV載體。 [實施例67]   如實施例66之組合物，其中AAV載體為AAV9載體。 [實施例68]   一種包含AAV載體的組合物，其中該AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，以及聚腺苷酸化序列。 [實施例69]   一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸以及聚腺苷酸化序列。 [實施例70]   一種包含AAV載體的組合物，其中該AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。 [實施例71]   一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列以及第二sgRNA支架序列。 [實施例72]   一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA支架序列之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之7SK2或hU6c啟動子的反向互補序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列以及第二sgRNA支架序列。 [實施例73]    如實施例68至72中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 63，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。 [實施例74]    如實施例68至72中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 64，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。 [實施例75]   一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 63，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。 [實施例76]   一種包含核酸分子的組合物，其包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 64，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。 [實施例77]   一種組合物，其包含編碼一或多個選自SEQ ID NO: 8、63、64及81中之任一者之間隔子序列的第一核酸；及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸。 [實施例78]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如實施例68至77中任一例之組合物及視情況存在之DNA-PK抑制劑遞送至細胞。 [實施例79]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如實施例68至77中任一例之組合物遞送至細胞。 [實施例80]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 63，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100；或 b. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 64，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例81]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 63，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100；或 b. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 64，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例82]   如實施例75或76中任一例之組合物，其中該組合物進一步包含路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)或編碼SluCas9的核酸。 [實施例83]   如實施例75、76或82中任一例之組合物，其中該組合物與脂質奈米粒子締合。 [實施例84]   如實施例1至74或77至83中任一例之組合物或方法，其中SV40核定域信號(NLS)與Cas9的N端融合且核質蛋白NLS與Cas9蛋白的C端融合。 [實施例85]   如實施例1至74或77至83中任一例之組合物或方法，其中c-myc核定域信號(NLS)與Cas9的N端融合且SV40 NLS及/或核質蛋白NLS與Cas9的C端融合。 [實施例86]   如實施例1至74或77至83中任一例之組合物或方法，其中c-myc NLS與Cas9的N端融合(例如藉助於連接子，諸如GSVD (SEQ ID NO: 940))，SV40 NLS與Cas9的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))，且核質蛋白NLS與SV-40 NLS的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))。 [實施例87]如實施例1至86中任一例之組合物或方法，其中嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 901。
本申請案主張以下臨時申請案的優先權：2021年2月26日申請的美國臨時申請案第63/154,444號；2021年4月26日申請的美國臨時專利申請案第63/179,859號；2021年11月5日申請的美國臨時申請案第63/276,002號；及2022年2月4日申請的美國臨時專利申請案第63/306,902號，此等所有臨時申請案皆以全文引用之方式併入。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例在附圖中加以說明。儘管本發明結合所說明之實施例加以描述，但應瞭解不希望將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋所有替代例、潤飾及等效物，其可包括於如隨附申請專利範圍及所包括之實施例所定義的本發明內。
在詳細描述本發明教示內容之前，應瞭解，本發明不限於特定組合物或方法步驟，因此可加以改變。應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一嚮導」包括複數個嚮導，及提及「一細胞」包括複數個細胞及其類似者。
數值範圍包括限定該範圍之數字。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，實測值及可量測值應理解為近似值。此外，「包含(comprise/comprises/comprising)」、「含有(contain/contains/containing)」及「包括(include/includes/including)」之使用不希望具有限制性。應瞭解，前文一般描述與詳細說明僅具有例示性及解釋性且不限制教示內容。
除非說明書中具體指出，否則本說明書中敍述「包含」各種組分之實施例亦考慮為「由所述組分組成」或「基本上由所述組分組成」；本說明書中敍述「由各種組分組成」之實施例亦考慮為「包含」所述組分或「基本上由所述組分組成」；且本說明書中敍述「基本上由各種組分組成」之實施例亦考慮為「由所述組分組成」或「包含」所述組分(此互換性不適用於此等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另外明確指示，否則術語「或(or)」以包括性意義使用，亦即等效於「及/或(and/or)」。
本文所用之章節標題僅出於組織目的，且不應解釋為以任何方式限制所需標的物。在以引用之方式併入之任何材料與本說明書中所定義之任何術語或本說明書之任何其他表述內容相矛盾之情況下，以本說明書為準。雖然本發明教示內容結合多個實施例描述，但不希望本發明教示內容限於此類實施例。相反，如熟習此項技術者將瞭解，本發明教示內容涵蓋各種替代例、潤飾及等效物。 I. 定義
除非另外說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
「聚核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物的多聚體化合物，該等核苷或核苷類似物具有沿著主鏈連接在一起的含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習知RNA、DNA、混合型RNA-DNA，及作為其類似物的聚合物。核酸「主鏈」可由多個鍵聯構成，其包括糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖，或具有取代(例如2'甲氧基或2'鹵基取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他)、肌苷、嘌呤或嘧啶之衍生物(例如N 4-甲基去氧鳥苷、去氮嘌呤或氮雜嘌呤、去氮嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位處具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位處具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O 6-甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶，及O 4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般論述，參見 The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams等人編, 第11版, 1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈在聚合物位置不包括含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習知組分與取代(例如具有2'甲氧基鍵聯之習知鹼基，或含有習知鹼基與一或多個鹼基類似物的聚合物)。核酸包括「鎖定核酸」(LNA)，含有一或多個LNA核苷酸單體之類似物，其中雙環呋喃醣單元被鎖定於模擬糖構形之RNA中，由此增強針對互補RNA及DNA序列之雜交親和力(Vester及Wengel, 2004, Biochemistry43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且不同之處可為RNA中存在尿嘧啶或其類似物及DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物。
「嚮導RNA (Guide RNA)」、「嚮導RNA (guide RNA)」及簡稱「嚮導(guide)」在本文中互換使用且指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)，或crRNA與trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。crRNA與trRNA可締合為單一RNA分子(單嚮導RNA，sgRNA)或兩種不同RNA分子(雙嚮導RNA，dgRNA)。「嚮導RNA (Guide RNA)」或「嚮導RNA (guide RNA)」係指各種類型。trRNA可為天然存在之序列或與天然存在之序列相比具有修飾或變異之trRNA序列。
如本文所用，「間隔子序列」在本文中及文獻中有時亦稱為「間隔子」、「原間隔子」、「嚮導序列」或「目標序列」，係指嚮導RNA內之與目標序列互補且用於將嚮導RNA導引至目標序列以被Cas9裂解的序列。嚮導序列的長度可為24、23、22、21、20個或更少個鹼基對，例如在路鄧葡萄球菌(亦即，SluCas9)及相關Cas9同源物/直系同源物的情況下。亦可使用更短或更長的序列作為嚮導，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸的長度。在較佳實施例中，在SluCas9情況下的嚮導/間隔子序列具有至少20個鹼基對的長度，或更具體言之，長度在20-25個鹼基對內(參見例如Schmidt等人, 2021, Nature Communications,「Improved CRISPR genome editing using small highly active and specific engineered RNA-guided nucleases」)。舉例而言，在一些實施例中，嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之序列的至少17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531的序列。在一些實施例中，目標序列位於例如基因中或染色體上，且與嚮導序列互補。在一些實施例中，嚮導序列與其相應目標序列之間的互補性或一致性程度可為約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。舉例而言，在一些實施例中，嚮導序列包含與選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之序列的至少17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。在一些實施例中，嚮導序列包含與選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之序列具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。在一些實施例中，嚮導序列與目標區域可100%互補或一致。在其他實施例中，嚮導序列與目標區域可含有至少一個錯配。舉例而言，嚮導序列及目標序列可含有1、2、3或4個錯配，其中目標序列之總長度為至少17、18、19、20或更多個鹼基對。在一些實施例中，嚮導序列及目標區域可含有1至4個錯配，其中嚮導序列包含至少17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及目標區域可含有1、2、3或4個錯配，其中嚮導序列包含20個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及目標區域不含有任何錯配。
在一些實施例中，嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之序列，其中若5'端核苷酸不為鳥嘌呤，則將一或多個鳥嘌呤(g)添加至該序列的5'端。在一些情況下轉錄可能需要5' g或gg，例如RNA聚合酶III依賴性U6啟動子或T7啟動子的表現需要。在一些實施例中，5'鳥嘌呤添加至本文所揭示之任一嚮導序列或嚮導序列對中。
Cas9s之目標序列包括基因體DNA之正股及負股(亦即，指定的序列及該序列之反向互補序列)，因為Cas9之核酸受質為雙股核酸。因此，在稱嚮導序列「與目標序列互補」之情況下，應瞭解，嚮導序列可導引嚮導RNA結合至目標序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，在嚮導序列結合目標序列之反向互補序列的情況下，嚮導序列與目標序列(例如不包括PAM之目標序列)之某些核苷酸一致，但嚮導序列中的T被U取代。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指嚮導RNA以及Cas9。在一些實施例中，嚮導RNA將Cas9(諸如Cas9)導引至目標序列，且嚮導RNA與該目標序列雜交且該藥劑結合至目標序列，隨後其可發生裂解或切割(在經修飾之「切口酶」Cas9的情形下)。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配，則第一序列視為「包含與第二序列具有至少X%一致性的序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，原因為由於第二序列之全部三個位置均存在匹配，因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(一般而言，尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)的存在不會造成聚核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同互補序列(例如對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全體而言，為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為互補序列)。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為經修飾之任何尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)視為與AUG具有100%一致性，因為兩者均與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對算法為此項技術中熟知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)及尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法。熟習此項技術者將瞭解，算法選擇及參數設置適於待比對之指定序列對；對於長度大體相似且預期一致性＞50% (胺基酸)或＞75% (核苷酸)的序列而言，EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的具有尼德曼-翁施算法介面預設值設置的尼德曼-翁施算法通常為適當的。
「mRNA」在本文中用於指一種聚核苷酸，其不為DNA且包含可轉譯成多肽(亦即，可充當供核糖體及胺基醯基化tRNA轉譯的受質)之開放閱讀框架。mRNA可包含包括磷酸酯-糖主鏈，其包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈中之糖類基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。
適用於本文所述之嚮導RNA組合物及方法的嚮導序列顯示於 表 1A及 表 1B及整個說明書中。
如本文所用，「目標序列」係指目標基因中之與嚮導RNA之嚮導序列的至少一部分具有互補性的核酸序列。目標序列與嚮導序列的相互作用導引Cas9結合，且潛在地在目標序列內進行切割或裂解(視藥劑活性而定)。
如本文所用，「治療(treatment)」係指在個體中針對疾病或病症之治療劑的任何投與或施用，且包括抑制疾病或疾病發展(其可發生在正式診斷出疾病之前或之後，例如在個體之基因型可能或有可能引起疾病發展的情況下)、遏制其發展、減輕疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀復發。舉例而言，DM1治療可包含緩解DM1症狀。
如本文所用，「緩解(ameliorating)」係指對於表型或症狀產生任何有益作用，諸如降低其嚴重程度、減慢或延遲其發展、遏制其發展或部分或完全逆轉或消除其。在定量表型(諸如表現量)之情況下，緩解涵蓋改變表現量，使得其更接近於健康或未感染細胞或個體中所見之表現量。
「醫藥學上可接受之賦形劑」係指醫藥調配物中所包括之不為活性成分的藥劑。醫藥學上可接受之賦形劑可例如有助於藥物遞送或支持或增強穩定性或生物可用性。
術語「約」或「大致」意謂如一般熟習此項技術者所確定的可接受之特定值誤差，其部分取決於如何量測或測定該值。
如本文所用，「路鄧葡萄球菌Cas9」亦可稱為SluCas9，且包括野生型SluCas9 (例如SEQ ID NO: 712)及其變異體。SluCas9變異體包含相較於SEQ ID NO: 712的一或多個胺基酸變化，包括一或多個胺基酸的插入、缺失或取代，或對一或多個胺基酸的化學修飾。 II. 組合物
本文提供適用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的組合物，該等組合物例如使用單一核酸分子，該單一核酸分子編碼：1)包含表 1A及表 1B之一或多個嚮導序列的一或多個嚮導RNA；及2) SluCas9。此類組合物可投與患有或疑似患有DM1之個體。本文揭示的任一個嚮導序列可存在於本文揭示的任一對組合中，且可存在於包含本文所揭示之任一種Cas9蛋白或編碼本文所揭示之任一種Cas9蛋白之核酸的組合物中。此類組合物可存在於本文所揭示之任一種載體(例如本文所揭示之任一種AAV載體)或與脂質奈米粒子締合。
在一些實施例中，本發明提供編碼一或多個嚮導RNA組分(例如本文所揭示之間隔子及支架序列中的任一者)之特定核酸序列。本發明涵蓋本文所提供之任一種DNA序列的RNA等效物(亦即，其中「T」置換成「U」)，或本文所提供之任一種RNA序列的DNA等效物(例如其中「U」置換成「T」)，以及本文所揭示之任一種序列的互補序列(包括反向互補序列)。
在一些實施例中，一或多個嚮導RNA將Cas9導引至DM1蛋白激酶(DMPK)基因之3' UTR中的CTG重複序列中或附近。舉例而言，可將Cas9導引至目標序列之10、20、30、40或50個核苷酸內進行切割。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA及Cas9的單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含： a. 編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸； b. 編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸； c. 編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致。
在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
在一些實施例中，提供編碼選自SEQ ID NO: 63與100及64與100中之任一者之2個間隔子序列的第一核酸以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸。在一些實施例中，提供編碼一或多個選自SEQ ID NO: 8、63、64及81中之任一者之間隔子序列的第一核酸以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA及Cas9的單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含： a. 編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與67；1與68；1與69；1與70；1與71；1與72；1與73；1與74；1與75；1與76；1與77；1與78；1與79；1與80；1與81；1與82；1與83；1與84；1與85；1與86；1與87；1與88；1與89；1與90；1與91；1與92；1與93；1與94；1與95；1與96；1與97；1與98；1與99；1與100；1與101；1與102；1與103；1與104；1與105；1與106；1與107；1與108；1與109；1與110；1與111；1與112；1與113；1與114；1與115；1與116；1與117；1與118；1與119；1與120；1與121；1與122；1與123；1與124；1與125；1與126；1與127；1與128；1與129；1與130；1與131；1與132；1與133；1與134；1與135；1與136；1與137；1與138；1與139；1與140；1與141；1與142；1與143；1與144；1與145；1與146；1與147；1與148；1與149；1與150；1與151；1與152；1與153；1與154；1與155；1與156；1與157；1與158；1與159；1與160；1與161；1與162；1與163；1與164；1與165；1與166；1與167；2與67；2與68；2與69；2與70；2與71；2與72；2與73；2與74；2與75；2與76；2與77；2與78；2與79；2與80；2與81；2與82；2與83；2與84；2與85；2與86；2與87；2與88；2與89；2與90；2與91；2與92；2與93；2與94；2與95；2與96；2與97；2與98；2與99；2與100；2與101；2與102；2與103；2與104；2與105；2與106；2與107；2與108；2與109；2與110；2與111；2與112；2與113；2與114；2與115；2與116；2與117；2與118；2與119；2與120；2與121；2與122；2與123；2與124；2與125；2與126；2與127；2與128；2與129；2與130；2與131；2與132；2與133；2與134；2與135；2與136；2與137；2與138；2與139；2與140；2與141；2與142；2與143；2與144；2與145；2與146；2與147；2與148；2與149；2與150；2與151；2與152；2與153；2與154；2與155；2與156；2與157；2與158；2與159；2與160；2與161；2與162；2與163；2與164；2與165；2與166；2與167；3與67；3與68；3與69；3與70；3與71；3與72；3與73；3與74；3與75；3與76；3與77；3與78；3與79；3與80；3與81；3與82；3與83；3與84；3與85；3與86；3與87；3與88；3與89；3與90；3與91；3與92；3與93；3與94；3與95；3與96；3與97；3與98；3與99；3與100；3與101；3與102；3與103；3與104；3與105；3與106；3與107；3與108；3與109；3與110；3與111；3與112；3與113；3與114；3與115；3與116；3與117；3與118；3與119；3與120；3與121；3與122；3與123；3與124；3與125；3與126；3與127；3與128；3與129；3與130；3與131；3與132；3與133；3與134；3與135；3與136；3與137；3與138；3與139；3與140；3與141；3與142；3與143；3與144；3與145；3與146；3與147；3與148；3與149；3與150；3與151；3與152；3與153；3與154；3與155；3與156；3與157；3與158；3與159；3與160；3與161；3與162；3與163；3與164；3與165；3與166；3與167；4與67；4與68；4與69；4與70；4與71；4與72；4與73；4與74；4與75；4與76；4與77；4與78；4與79；4與80；4與81；4與82；4與83；4與84；4與85；4與86；4與87；4與88；4與89；4與90；4與91；4與92；4與93；4與94；4與95；4與96；4與97；4與98；4與99；4與100；4與101；4與102；4與103；4與104；4與105；4與106；4與107；4與108；4與109；4與110；4與111；4與112；4與113；4與114；4與115；4與116；4與117；4與118；4與119；4與120；4與121；4與122；4與123；4與124；4與125；4與126；4與127；4與128；4與129；4與130；4與131；4與132；4與133；4與134；4與135；4與136；4與137；4與138；4與139；4與140；4與141；4與142；4與143；4與144；4與145；4與146；4與147；4與148；4與149；4與150；4與151；4與152；4與153；4與154；4與155；4與156；4與157；4與158；4與159；4與160；4與161；4與162；4與163；4與164；4與165；4與166；4與167；5與67；5與68；5與69；5與70；5與71；5與72；5與73；5與74；5與75；5與76；5與77；5與78；5與79；5與80；5與81；5與82；5與83；5與84；5與85；5與86；5與87；5與88；5與89；5與90；5與91；5與92；5與93；5與94；5與95；5與96；5與97；5與98；5與99；5與100；5與101；5與102；5與103；5與104；5與105；5與106；5與107；5與108；5與109；5與110；5與111；5與112；5與113；5與114；5與115；5與116；5與117；5與118；5與119；5與120；5與121；5與122；5與123；5與124；5與125；5與126；5與127；5與128；5與129；5與130；5與131；5與132；5與133；5與134；5與135；5與136；5與137；5與138；5與139；5與140；5與141；5與142；5與143；5與144；5與145；5與146；5與147；5與148；5與149；5與150；5與151；5與152；5與153；5與154；5與155；5與156；5與157；5與158；5與159；5與160；5與161；5與162；5與163；5與164；5與165；5與166；5與167；6與67；6與68；6與69；6與70；6與71；6與72；6與73；6與74；6與75；6與76；6與77；6與78；6與79；6與80；6與81；6與82；6與83；6與84；6與85；6與86；6與87；6與88；6與89；6與90；6與91；6與92；6與93；6與94；6與95；6與96；6與97；6與98；6與99；6與100；6與101；6與102；6與103；6與104；6與105；6與106；6與107；6與108；6與109；6與110；6與111；6與112；6與113；6與114；6與115；6與116；6與117；6與118；6與119；6與120；6與121；6與122；6與123；6與124；6與125；6與126；6與127；6與128；6與129；6與130；6與131；6與132；6與133；6與134；6與135；6與136；6與137；6與138；6與139；6與140；6與141；6與142；6與143；6與144；6與145；6與146；6與147；6與148；6與149；6與150；6與151；6與152；6與153；6與154；6與155；6與156；6與157；6與158；6與159；6與160；6與161；6與162；6與163；6與164；6與165；6與166；6與167；7與67；7與68；7與69；7與70；7與71；7與72；7與73；7與74；7與75；7與76；7與77；7與78；7與79；7與80；7與81；7與82；7與83；7與84；7與85；7與86；7與87；7與88；7與89；7與90；7與91；7與92；7與93；7與94；7與95；7與96；7與97；7與98；7與99；7與100；7與101；7與102；7與103；7與104；7與105；7與106；7與107；7與108；7與109；7與110；7與111；7與112；7與113；7與114；7與115；7與116；7與117；7與118；7與119；7與120；7與121；7與122；7與123；7與124；7與125；7與126；7與127；7與128；7與129；7與130；7與131；7與132；7與133；7與134；7與135；7與136；7與137；7與138；7與139；7與140；7與141；7與142；7與143；7與144；7與145；7與146；7與147；7與148；7與149；7與150；7與151；7與152；7與153；7與154；7與155；7與156；7與157；7與158；7與159；7與160；7與161；7與162；7與163；7與164；7與165；7與166；7與167；8與67；8與68；8與69；8與70；8與71；8與72；8與73；8與74；8與75；8與76；8與77；8與78；8與79；8與80；8與81；8與82；8與83；8與84；8與85；8與86；8與87；8與88；8與89；8與90；8與91；8與92；8與93；8與94；8與95；8與96；8與97；8與98；8與99；8與100；8與101；8與102；8與103；8與104；8與105；8與106；8與107；8與108；8與109；8與110；8與111；8與112；8與113；8與114；8與115；8與116；8與117；8與118；8與119；8與120；8與121；8與122；8與123；8與124；8與125；8與126；8與127；8與128；8與129；8與130；8與131；8與132；8與133；8與134；8與135；8與136；8與137；8與138；8與139；8與140；8與141；8與142；8與143；8與144；8與145；8與146；8與147；8與148；8與149；8與150；8與151；8與152；8與153；8與154；8與155；8與156；8與157；8與158；8與159；8與160；8與161；8與162；8與163；8與164；8與165；8與166；8與167；9與67；9與68；9與69；9與70；9與71；9與72；9與73；9與74；9與75；9與76；9與77；9與78；9與79；9與80；9與81；9與82；9與83；9與84；9與85；9與86；9與87；9與88；9與89；9與90；9與91；9與92；9與93；9與94；9與95；9與96；9與97；9與98；9與99；9與100；9與101；9與102；9與103；9與104；9與105；9與106；9與107；9與108；9與109；9與110；9與111；9與112；9與113；9與114；9與115；9與116；9與117；9與118；9與119；9與120；9與121；9與122；9與123；9與124；9與125；9與126；9與127；9與128；9與129；9與130；9與131；9與132；9與133；9與134；9與135；9與136；9與137；9與138；9與139；9與140；9與141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8；61與139；61與140；61與141；61與142；61與143；61與144；61與145；61與146；61與147；61與148；61與149；61與150；61與151；61與152；61與153；61與154；61與155；61與156；61與157；61與158；61與159；61與160；61與161；61與162；61與163；61與164；61與165；61與166；61與167；62與67；62與68；62與69；62與70；62與71；62與72；62與73；62與74；62與75；62與76；62與77；62與78；62與79；62與80；62與81；62與82；62與83；62與84；62與85；62與86；62與87；62與88；62與89；62與90；62與91；62與92；62與93；62與94；62與95；62與96；62與97；62與98；62與99；62與100；62與101；62與102；62與103；62與104；62與105；62與106；62與107；62與108；62與109；62與110；62與111；62與112；62與113；62與114；62與115；62與116；62與117；62與118；62與119；62與120；62與121；62與122；62與123；62與124；62與125；62與126；62與127；62與128；62與129；62與130；62與131；62與132；62與133；62與134；62與135；62與136；62與137；62與138；62與139；62與140；62與141；62與142；62與143；62與144；62與145；62與146；62與147；62與148；62與149；62與150；62與151；62與152；62與153；62與154；62與155；62與156；62與157；62與158；62與159；62與160；62與161；62與162；62與163；62與164；62與165；62與166；62與167；63與67；63與68；63與69；63與70；63與71；63與72；63與73；63與74；63與75；63與76；63與77；63與78；63與79；63與80；63與81；63與82；63與83；63與84；63與85；63與86；63與87；63與88；63與89；63與90；63與91；63與92；63與93；63與94；63與95；63與96；63與97；63與98；63與99；63與100；63與101；63與102；63與103；63與104；63與105；63與106；63與107；63與108；63與109；63與110；63與111；63與112；63與113；63與114；63與115；63與116；63與117；63與118；63與119；63與120；63與121；63與122；63與123；63與124；63與125；63與126；63與127；63與128；63與129；63與130；63與131；63與132；63與133；63與134；63與135；63與136；63與137；63與138；63與139；63與140；63與141；63與142；63與143；63與144；63與145；63與146；63與147；63與148；63與149；63與150；63與151；63與152；63與153；63與154；63與155；63與156；63與157；63與158；63與159；63與160；63與161；63與162；63與163；63與164；63與165；63與166；63與167；64與67；64與68；64與69；64與70；64與71；64與72；64與73；64與74；64與75；64與76；64與77；64與78；64與79；64與80；64與81；64與82；64與83；64與84；64與85；64與86；64與87；64與88；64與89；64與90；64與91；64與92；64與93；64與94；64與95；64與96；64與97；64與98；64與99；64與100；64與101；64與102；64與103；64與104；64與105；64與106；64與107；64與108；64與109；64與110；64與111；64與112；64與113；64與114；64與115；64與116；64與117；64與118；64與119；64與120；64與121；64與122；64與123；64與124；64與125；64與126；64與127；64與128；64與129；64與130；64與131；64與132；64與133；64與134；64與135；64與136；64與137；64與138；64與139；64與140；64與141；64與142；64與143；64與144；64與145；64與146；64與147；64與148；64與149；64與150；64與151；64與152；64與153；64與154；64與155；64與156；64與157；64與158；64與159；64與160；64與161；64與162；64與163；64與164；64與165；64與166；64與167；65與67；65與68；65與69；65與70；65與71；65與72；65與73；65與74；65與75；65與76；65與77；65與78；65與79；65與80；65與81；65與82；65與83；65與84；65與85；65與86；65與87；65與88；65與89；65與90；65與91；65與92；65與93；65與94；65與95；65與96；65與97；65與98；65與99；65與100；65與101；65與102；65與103；65與104；65與105；65與106；65與107；65與108；65與109；65與110；65與111；65與112；65與113；65與114；65與115；65與116；65與117；65與118；65與119；65與120；65與121；65與122；65與123；65與124；65與125；65與126；65與127；65與128；65與129；65與130；65與131；65與132；65與133；65與134；65與135；65與136；65與137；65與138；65與139；65與140；65與141；65與142；65與143；65與144；65與145；65與146；65與147；65與148；65與149；65與150；65與151；65與152；65與153；65與154；65與155；65與156；65與157；65與158；65與159；65與160；65與161；65與162；65與163；65與164；65與165；65與166；及65與167；以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸； b. 編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自a.中之任一者之第一及第二間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸； c. 編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對與選自a.下中之任一者的第一及第二間隔子序列至少90%一致；以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸。 在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
在一些實施例中，編碼嚮導RNA的核酸與編碼Cas9的核酸設置於單一核酸分子上。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼一或多個嚮導RNA的核酸及編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，編碼Cas9 (例如SluCas9)及單嚮導RNA(例如包含SEQ ID No: 8、63、64或81中之任一者之序列的嚮導RNA)之一或多個複本的核苷酸序列設置於單一核酸分子上。在一些實施例中，編碼兩個嚮導RNA及一個Cas9的核苷酸序列設置於單一核酸分子上。在一些實施例中，編碼三個嚮導RNA的核酸與一個編碼SluCas9的核酸設置於單一核酸分子上。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼一個Cas9的核酸及編碼兩個嚮導RNA的核酸，其中核酸分子編碼不超過兩個嚮導RNA。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸及編碼SluCas9的核酸，其中第一嚮導RNA與第二嚮導RNA可相同或不同。在一些實施例中，第一嚮導RNA包含選自SEQ ID No: 6、8、10、21、58、62、63或64中之任一者的序列，且第二嚮導RNA包含選自SEQ ID No: 72、81、84、98、100、114、122、134、139、149或166中之任一者的序列。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸、編碼第三嚮導RNA的核酸及編碼SluCas9的核酸，其中第一、第二及第三嚮導RNA可相同或不同。在一些實施例中，第一與第二嚮導RNA的間隔子序列一致。在一些實施例中，第一與第二嚮導RNA的間隔子序列不一致(例如嚮導RNA對)。在一些實施例中，所提供的系統包含兩種載體，其中相較於第二載體中的其他嚮導RNA或相較於第一載體中的其他嚮導RNA，第一載體包含一或多個(例如1、2、3、4、5或6種)可相同或不同的嚮導RNA，且第二載體包含一或多個(例如1、2或3種)可相同或不同的嚮導RNA；以及編碼SluCas9的核酸。
在一些實施例中，本發明提供包含兩個核酸分子的組合物，其中第一核酸分子包含編碼SluCas9蛋白的序列，且其中第二核酸分子編碼第一嚮導RNA。在一些實施例中，第一核酸分子亦編碼第一嚮導RNA。在其他實施例中，第一核酸分子不編碼任何嚮導RNA。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第二嚮導RNA。在一些實施例中，第一核酸分子亦編碼第二嚮導RNA。在特定實施例中第一嚮導RNA與第二嚮導RNA不一致。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第二嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的三個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第二嚮導RNA的三個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的兩個複本及第二嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的兩個複本及第二嚮導RNA的一個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的一個複本及第二嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的三個複本及第二嚮導RNA的三個複本。在特定實施例中第一嚮導RNA與第二嚮導RNA不一致。在一些實施例中，第一核酸存在於第一病毒載體中且第二核酸存在於不同的第二病毒載體中。在一些實施例中，第一嚮導RNA包含選自SEQ ID No: 6、8、10、21、58、62、63或64中之任一者的序列，且第二嚮導RNA包含選自SEQ ID No: 72、81、84、98、100、114、122、134、139、149或166中之任一者的序列。在一些實施例中，第二核酸編碼第一嚮導RNA (例如包含SEQ ID No: 6、8、10、21、58、62、63、64、72、81、84、98、100、114、122、134、139、149或166中之任一者之序列的嚮導RNA)的一或多個複本，且不編碼任何其他不同嚮導RNA。在一些實施例中，第二核酸編碼包含核苷酸序列SEQ ID NO: 8、63、64或81之第一嚮導RNA的一或多個複本，且不編碼任何其他不同嚮導RNA。在一些實施例中，第一核酸分子編碼Cas9分子且亦編碼第一嚮導RNA的一或多個複本及第二嚮導RNA的一或多個複本。在一些實施例中，第一核酸分子編碼Cas9分子，但不編碼任何嚮導RNA。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的一或多個複本及第二嚮導RNA的一或多個複本，其中第二核酸分子不編碼Cas9分子。
在一些實施例中，單一核酸分子為單一載體。在一些實施例中，單一載體表現一或兩個或三個嚮導RNA及Cas9。在一些實施例中，一或多個嚮導RNA及一個Cas9係由設置於單一載體上的核酸編碼。在一些實施例中，單一載體包含編碼嚮導RNA的核酸及編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，兩個嚮導RNA及一個Cas9係由設置於單一載體上的核酸編碼。在一些實施例中，三個嚮導RNA及一個Cas9設置於單一載體上。在一些實施例中，單一載體包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸及編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，單一載體包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸、編碼第三嚮導RNA的核酸，及編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，第一、第二及第三嚮導RNA的間隔子序列若存在，則為一致的。在一些實施例中，第一、第二及第三嚮導RNA的間隔子序列若存在，則為不一致的(例如嚮導RNA對)。
表 1A 及表 1B中所示之嚮導序列各自可進一步包含其他核苷酸以形成或編碼crRNA，例如使用適於正使用之Cas9的任何已知序列來形成或編碼crRNA。在一些實施例中，crRNA包含(5'至3')至少一個間隔子序列及第一互補域。第一互補域與第二互補域充分互補，第二互補域可為相同分子之一部分(在sgRNA之情況下)或存在於tracrRNA中(在雙重或模組化gRNA之情況下)以形成雙股體。關於包括第一及第二互補域之crRNA及gRNA域的詳細論述，參見例如US 2017/0007679。
單分子嚮導RNA (sgRNA)可以5'至3'方向包含視情況存在之間隔子延長序列、間隔子序列、最小CRISPR重複序列、單分子嚮導連接子、最小tracrRNA序列、3' tracrRNA序列及/或視情況存在之tracrRNA延長序列。視情況存在之tracrRNA延長序列可以包含向嚮導RNA貢獻其他功能(例如穩定性)的元件。單分子嚮導連接子可使最小CRISPR重複序列與最小tracrRNA序列連接而形成髮夾結構。視情況存在之tracrRNA延長序列可以包含一或多個髮夾。
在5'至3'取向上，位於嚮導序列之3'端之後、適於聯合SluCas9使用的兩個例示性支架序列為GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGA (SEQ ID NO: 600)及GTTTAAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGA (SEQ ID NO: 601)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SluCas9使用的例示性序列為與SEQ ID NO: 600或SEQ ID NO: 601至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 600或SEQ ID NO: 601差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
下文亦顯示位於嚮導序列之3'端之後、適於聯合SluCas9使用的例示性支架序列(5'至3'取向)：
支架 ID SEQ ID NO 支架序列 (5 ' 至 3 ' ) 與 Slu v5 的 同源性 與 Slu v5 同源的劃線 ( 核苷酸數目 )
Wildtype 900 GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGAT N/A N/A
Slu-VCGT-4.5 601 GTTTAAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGA N/A N/A
Slu_v5 901 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 100.00% 77
Slu_v5-1 902 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 87.50% 47
Slu_v5-2 903 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGgCAAaATGcCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 96.10% 37
Slu_v5-3 904 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGcgcccaTCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 94.81% 48
Slu_v5-4 905 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATgggTTgAATTTATTcGacccAT 91.55% 55
Slu_v5-5 906 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGgCAAaATGcCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 83.75% 31
Slu_v5-6 907 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGACAATATGTCGcgcccaTCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 82.50% 23
Slu_v5-7 908 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATgggTTgAATTTATTcGacccAT 78.38% 25
Slu_v5-8 909 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGgCAAaATGcCGcgcccaTCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 90.91% 37
Slu_v5-9 910 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGgCAAaATGcCGTGTTTATgggTTgAATTTATTcGacccAT 87.32% 37
Slu_v5-10 911 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGcgcccaTgggTTgAATTTATTcGacccAT 82.89% 48
Slu_v5-11 912 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGgCAAaATGcCGcgcccaTCCCATCAATTTATTGGTGGGAT 78.75% 23
Slu_v5-12 913 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGgCAAaATGcCGTGTTTATgggTTgAATTTATTcGacccAT 74.32% 9
Slu_v5-13 914 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGACAATATGTCGcgcccaTgggTTgAATTTATTcGacccAT 70.89% 18
Slu_v5-14 915 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGgCAAaATGcCGcgcccaTgggTTgAATTTATTcGacccAT 78.95% 37
Slu_v5-15 916 GTTTggTaACcTaGGAAACTagATCTTaccAAACAAGgCAAaATGcCGcgcccaTgggTTgAATTTATTcGacccAT 67.09% 8
Slu v4 917 GTTTCAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAATCTACTGAAACAAGACAATATGTCGTGTTTATCCCATCAATTTATTGGTGGGAT N/A N/A
在一些實施例中，在5'至3取向上，位於嚮導序列之3'端之後、適於聯合SluCas9使用的支架序列係選自SEQ ID NO: 600-601或900-917中之任一者(參見下文)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SluCas9使用的例示性序列為與SEQ ID NO: 600-601或900-917中之任一者至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 600-601或900-917中之任一者差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，在5'至3取向上，位於嚮導序列之3'端之後、適於聯合SluCas9使用的支架序列係選自SEQ ID NO: 901-917中之任一者(參見下文)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SluCas9使用的例示性序列為與SEQ ID NO: 901-917中之任一者至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 901-917中之任一者差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 600的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 601的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 900的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 901的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 902的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 903的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 904的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 905的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 906的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 907的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 908的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 909的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 910的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 911的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 912的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 913的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 914的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 915的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 916的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 917的序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，gRNA之一包含選自SEQ ID NO: 600-601或900-917中之任一者的序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，兩個gRNA均包含選自SEQ ID NO: 600-601或900-917中之任一者的序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，該對中的第一gRNA包含選自SEQ ID No: 600-601或900-917中之任一者的序列，且該對中的第二gRNA包含選自SEQ ID No: 600-601或900-917中之任一者的不同序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，gRNA之嚮導序列3'的核苷酸為相同序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，gRNA之嚮導序列3'的核苷酸為不同序列。
在一些實施例中，支架序列的莖環1相較於野生型SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 900的支架)或參考SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 901的支架)的莖環1包含一或多個變化。在一些實施例中，支架序列的莖環2相較於野生型SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 900的支架)或參考SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 901的支架)的莖環2包含一或多個變化。在一些實施例中，支架序列的四環相較於野生型SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 900的支架)或參考SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 901的支架)的四環包含一或多個變化。在一些實施例中，支架序列的重複區域相較於野生型SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 900的支架)或參考SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 901的支架)的重複區域包含一或多個變化。在一些實施例中，支架序列的抗重複區域相較於野生型SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 900的支架)或參考SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 901的支架)的抗重複區域包含一或多個變化。在一些實施例中，支架序列的連接子區域相較於野生型SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 900的支架)或參考SluCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 901的支架)的連接子區域包含一或多個變化。關於支架區域的描述，參見例如Nishimasu等人, 2015, Cell, 162:1113-1126。
在使用tracrRNA的情況下，在一些實施例中，其包含(5'至3')第二互補域及近端域。在sgRNA的情況下，嚮導序列連同其他核苷酸(例如SEQ ID NO: 600-601，或900-917)一起形成或編碼sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含(5'至3')至少一個間隔子序列、第一互補域、連接域、第二互補域及近端域。sgRNA或tracrRNA可進一步包含尾域。連接域可為髮夾形成域。關於crRNA及gRNA域(包括第二互補域、連接域、近端域及尾域)的詳細論述及實例，參見例如US 2017/0007679。
一般而言，在DNA核酸構築體編碼嚮導RNA的情況下，本文所述之任一RNA序列中的U殘基可經T殘基置換，且在DNA編碼嚮導RNA構築體的情況下，T殘基可經U殘基置換。
本文提供組合物，其包含一或多個嚮導RNA或編碼一或多個嚮導RNA的一或多個核酸，該一或多個嚮導RNA包含本文在表1A及表1B中及通篇說明書中所揭示的嚮導序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含本文在表1A及表1B及通篇說明書中所揭示之任一個嚮導序列的17、18、19、20或21個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含與表1A及表1B及通篇說明書中所示之嚮導序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含與表1A及表1B及通篇說明書中所示之嚮導序列約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 22。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 24。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 29。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 36。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 37。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 38。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 39。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 40。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 41。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 42。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 43。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 44。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 46。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 47。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 49。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 50。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 51。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 51。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 52。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 53。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 54。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 57。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 59。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 62。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 63。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 64。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 67。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 69。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 71。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 72。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 73。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 74。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 75。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 76。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 77。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 79。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 80。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 81。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 82。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 83。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 84。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 85。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 86。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 87。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 88。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 89。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 90。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 91。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 92。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 93。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 94。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 95。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 96。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 97。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 98。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 99。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 100。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 102。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 103。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 105。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 106。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 108。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 109。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 110。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 111。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 112。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 113。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 114。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 115。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 116。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 118。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 119。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 120。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 121。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 122。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 123。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 124。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 126。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 127。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 128。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 129。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 130。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 131。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 132。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 133。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 134。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 135。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 136。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 137。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 138。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 139。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 140。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 141。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 144。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 145。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 146。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 147。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 148。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 149。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 150。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 151。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 152。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 153。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 154。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 155。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 156。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 157。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 158。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 159。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 160。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 161。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 161。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 162。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 163。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 164。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 165。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 166。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 167。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-531中之任一者的間隔子序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA進一步包含trRNA。在本文所述之各組合物及方法實施例中，crRNA (包含間隔子序列)及trRNA可結合為單一RNA (sgRNA)或可處於不同RNA (dgRNA)上。在sgRNA之情形下，crRNA與trRNA組分可共價連接，例如經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵共價連接。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)一或多個嚮導RNA，其包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的嚮導序列；及2) SluCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)一或多個嚮導RNA，其包含與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的嚮導序列；以及2) SluCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在另一態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)一或多個包含嚮導序列的嚮導RNA，該嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；以及2) SluCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼：1)一或多個嚮導RNA，其包含選自SEQ ID NO: 1-172及201-531中之任一者的嚮導序列；以及2) SluCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼：1)一或多個嚮導RNA，其包含與SEQ ID NO: 1-172及201-531中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的嚮導序列；以及2) SluCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在另一態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼：1)一或多個嚮導RNA，其包含含有選自SEQ ID NO: 1-172及201-531中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的嚮導序列；以及2) SluCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼：1)嚮導RNA對，其包含選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列；或嚮導RNA對，其包含與1)中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的第一及第二間隔子序列；或嚮導RNA對，其包含含有選自1)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；以及2) SluCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在包含編碼嚮導RNA及/或Cas9之核酸分子的任何實施例中，核酸分子可為載體。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含編碼嚮導RNA及Cas9之單一核酸分子，其中核酸分子為載體。
可使用任何類型之載體，諸如本文所述之彼等載體中的任一者。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為非整合型病毒載體(亦即，不將來自載體之序列插入宿主染色體中)。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒載體(AAV)、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體或單純疱疹病毒載體。在一些實施例中，載體包含肌肉特異性啟動子。例示性肌肉特異性啟動子包括肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子或SPc5-12啟動子。參見US 2004/0175727 A1; Wang等人, Expert Opin Drug Deliv. (2014) 11, 345-364; Wang等人, Gene Therapy(2008) 15, 1489-1499。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8e啟動子。在任一前述實施例中，載體可為腺相關病毒載體(AAV)。在一些實施例中，載體為AAV9載體。
在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。CK8啟動子具有以下序列(SEQ ID NO. 700)：
Figure 02_image001
在一些實施例中，肌肉細胞的細胞特異性啟動子為CK8啟動子變異體，稱為CK8e。CK8e啟動子具有以下序列(SEQ ID NO. 701)：
Figure 02_image003
在一些實施例中，載體包含U6、H1或7SK啟動子中的一或多者。在一些實施例中，U6啟動子為人類U6啟動子(例如U6L啟動子或U6S啟動子)。在一些實施例中，啟動子為鼠類U6啟動子。在一些實施例中，7SK啟動子為人類7SK啟動子。在一些實施例中，7SK啟動子為7SK1啟動子。在一些實施例中，7SK啟動子為7SK2啟動子。在一些實施例中，H1啟動子為人類H1啟動子(例如H1L啟動子或H1S啟動子)。在一些實施例中，載體包含多個嚮導序列，其中各嚮導序列處於不同啟動子的控制下。在一些實施例中，多個嚮導序列中之每一者包含不同序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含相同序列(例如多個嚮導序列中的每一者包含相同的間隔子序列)。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含相同間隔子序列及相同支架序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含不同間隔子序列及不同支架序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含相同間隔子序列，但包含不同支架序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含不同間隔子序列及不同支架序列。在一些實施例中，不同啟動子各自包含相同核苷酸序列(例如U6啟動子序列)。在一些實施例中，不同啟動子各自包含不同核苷酸序列(例如U6、H1及/或7SK啟動子序列)。
在一些實施例中，U6啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 702至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image005
在一些實施例中，H1啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 703至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image007
在一些實施例中，7SK啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 704至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image009
Figure 02_image011
在一些實施例中，U6啟動子為hU6c啟動子且包含與如下序列SEQ ID NO: 705至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image013
在一些實施例中，7SK啟動子為7SK2啟動子且包含與如下序列SEQ ID NO: 706至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image015
在一些實施例中，H1啟動子為H1m或mH1啟動子且包含與如下序列SEQ ID NO: 707至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image017
在一些實施例中，Ck8e啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 701至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image019
在一些實施例中，載體包含多個反向末端重複序列(ITR)。此等ITR可為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型。在一些實施例中，ITR為AAV2血清型。在一些實施例中，5' ITR包含序列SEQ ID NO: 709：
Figure 02_image021
在一些實施例中，3' ITR包含序列SEQ ID NO: 710：
Figure 02_image023
在一些實施例中，提供包含單一核酸分子的載體，該單一核酸分子編碼1)一或多個嚮導RNA，其包含SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之間隔子序列中的任一者或多者；以及2) SluCas9。在一些實施例中，載體為AAV載體。在一些實施例中，載體為AAV9載體。在一些實施例中，將AAV載體投與個體以治療DM1。在一些實施例中，由於使用適用於SluCas9之背景下的特定嚮導序列，因此僅需一種載體。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，提供包含超過一種載體的組合物或系統，其中第一載體包含單一核酸分子，該單一核酸分子編碼：1)包含間隔子序列SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者或多者的一或多個嚮導RNA，以及2) SluCas9；且第二載體包含編碼嚮導RNA (例如間隔子序列SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者或多者)之多個複本的核酸。在一些實施例中，提供包含第一載體及第二載體的組合物或系統，其中第一載體包含編碼SluCas9而不編碼任何嚮導RNA的單一核酸分子，且第二載體包含編碼嚮導RNA (例如間隔子序列SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者或多者)之多個複本的核酸。在編碼多個嚮導RNA的此類組合物或系統中，嚮導RNA可相同或不同。
在一些實施例中，提供包含單一核酸分子的載體，該單一核酸分子編碼1)嚮導RNA對，其包含選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列；以及 2) SluCas9。在一些實施例中，載體為AAV載體。在一些實施例中，將AAV載體投與個體以治療DM1。在一些實施例中，由於使用適用於SluCas9之背景下的特定嚮導序列，因此僅需一種載體。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，載體包含編碼Cas9蛋白(例如SluCas9蛋白)的核酸且進一步包含編碼一或多個單嚮導RNA的核酸。在一些實施例中，編碼Cas9蛋白的核酸處於CK8e啟動子的控制下。在一些實施例中，編碼嚮導RNA序列的核酸處於hU6c啟動子的控制下。在一些實施例中，載體為AAV9。在較佳實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於5 kb。在特定實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.9 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.85 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.8 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.75 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.7 kb。在一些實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於3.9-5 kb、4-5 kb、4.2-5 kb、4.4-5 kb、4.6-5 kb、4.7-5 kb、3.9-4.9 kb、4.2-4.9 kb、4.4-4.9 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.85 kb、4.2-4.85 kb、4.4-4.85 kb、4.6-4.85 kb、4.7-4.85 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.8 kb、4.2-4.8 kb、4.4-4.8 kb或4.6-4.8 kb之間。在一些實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於4.4-4.85 kb之間。
在一些實施例中，載體包含編碼超過一個嚮導RNA之多個核酸。在一些實施例中，載體包含編碼兩個嚮導RNA序列的兩個核酸。
在一些實施例中，載體包含編碼Cas9蛋白(例如SluCas9蛋白)的核酸、編碼第一嚮導RNA的核酸，及編碼第二嚮導RNA的核酸。在一些實施例中，載體不包含編碼超過兩個嚮導RNA之核酸。在一些實施例中，編碼第一嚮導RNA之核酸與編碼第二嚮導RNA之核酸相同。在一些實施例中，編碼第一嚮導RNA之核酸不同於編碼第二嚮導RNA之核酸。在一些實施例中，載體包含單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含編碼Cas9蛋白的核酸、編碼第一嚮導RNA的核酸，及作為第二嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸。在一些實施例中，載體包含單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含編碼Cas9蛋白的核酸、作為第一嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸，及作為第二嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸。在一些實施例中，編碼Cas9蛋白(例如SluCas9蛋白)的核酸處於CK8e啟動子的控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於7SK2啟動子的控制下，且第二嚮導處於H1m啟動子的控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於H1m啟動子之控制下，且第二嚮導處於7SK2啟動子之控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於hU6c啟動子之控制下，且第二嚮導處於H1m啟動子之控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於H1m啟動子之控制下，且第二嚮導處於hU6c啟動子之控制下。在一些實施例中，編碼Cas9蛋白的核酸：a)介於編碼嚮導RNA的核酸之間；b)介於作為嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸之間；c)介於編碼第一嚮導RNA的核酸與作為第二嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸之間；d)介於編碼第二嚮導RNA之核酸與作為第一嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸之間；e)位於編碼嚮導RNA之核酸的5'；f)位於作為嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的5'；g)位於編碼嚮導RNA之一之核酸的5'及作為其他嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的5'；h)位於編碼嚮導RNA之核酸的3'；i)位於作為嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的3'；或j)位於編碼嚮導RNA之一之核酸的3'及作為其他嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的3'。在一些實施例中，利用自ITR至ITR (包括兩個ITR)的核苷酸長度量測AAV載體尺寸。在一些實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於5 kb。在特定實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.9 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.85 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.8 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.75 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.7 kb。在一些實施例中，載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於3.9-5 kb、4-5 kb、4.2-5 kb、4.4-5 kb、4.6-5 kb、4.7-5 kb、3.9-4.9 kb、4.2-4.9 kb、4.4-4.9 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.85 kb、4.2-4.85 kb、4.4-4.85 kb、4.6-4.85 kb、4.7-4.85 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.8 kb、4.2-4.8 kb、4.4-4.8 kb或4.6-4.8 kb之間。在一些實施例中，載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於4.4-4.85 kb之間。在一些實施例中，載體為AAV9。
在一些實施例中，本發明提供一種核酸，其就正股而言自5'至3'包含：第一嚮導RNA支架序列(支架包含核苷酸序列SEQ ID NO: 901)的反向互補序列、編碼第一嚮導RNA序列之核苷酸序列的反向互補序列、編碼第一嚮導RNA序列之核苷酸序列表現用之啟動子(例如hU6c)的反向互補序列、應與內切核酸酶之啟動子相同的方向表現第二嚮導RNA用的啟動子(例如7SK2)、第二嚮導RNA序列及第二嚮導RNA支架序列(支架包含核苷酸序列SEQ ID NO: 901)、編碼內切核酸酶之核苷酸序列表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼內切核酸酶的核苷酸序列(例如本文所揭示的任一種SluCas9)、聚腺苷酸化序列。
本發明提供新穎的AAV載體組態。本文提供此等新穎AAV載體組態的一些實例，且此等例示性載體中的元件次序根據正股、以5'至3'方式提及。對於此等組態而言，應瞭解，所述元件可以不直接鄰接，並且所述元件之間可存在一或多個核苷酸或一或多個其他元件。然而，在一些實施例中，所述元件之間可不存在核苷酸或其他元件。此外，除非另有說明，否則「用於表現元件X的啟動子」意謂啟動子以促進所述元件X表現的方式定向。在一些實施例中，本發明提供編碼SluCas9的核酸。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現SluCas9用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。參見下文 圖 12的「設計1」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 900。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之啟動子的反向互補序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。參見 圖 12的「設計2」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 900。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之hU6c啟動子的反向互補序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、第二sgRNA表現用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之7SK2啟動子的反向互補序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之hU6c啟動子的反向互補序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、第二sgRNA表現用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之hU6c啟動子的反向互補序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之7SK2啟動子的反向互補序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、SluCas9的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。參見圖12的「設計3」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 900。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 901的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 901的第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 901的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 901的第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、SV40核定域序列(NLS)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 901的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 901的第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、SV40核定域序列(NLS)，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 901的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 901的第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。參見 圖 12的「設計4」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 900。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，AAV載體包含表6中所概述的任一種組態。
啟動子配置 嚮導啟動子組合
Cas9位於中間 (直列) (圖12的「設計1」幾何結構) hU6c-嚮導1-Cas9-hU6c-嚮導2
hU6c-嚮導1-Cas9-7SK2-嚮導2
hU6c-嚮導1-Cas9-H1m-嚮導2
Cas9位於中間 (發散) (圖12的「設計2」幾何結構) hU6c-嚮導1-Cas9-hU6c-嚮導2
hU6c-嚮導1-Cas9-7SK2-嚮導2
hU6c-嚮導1-Cas9-H1m-嚮導2
7SK2-嚮導1-Cas9-hU6c-嚮導2
Cas9位於右側 (直列) (圖12的「設計3」幾何結構) hU6c-嚮導1-hU6c-嚮導2-Cas9
hU6c-嚮導1-7SK2-嚮導2-Cas9
hU6c-嚮導1-H1m-嚮導2-Cas9
hU6c-嚮導1(v5)-7SK2-嚮導2(v5)-Cas9
hU6c-嚮導1(v2)-7SK2-嚮導2(v2)-Cas9
Cas9位於左側 (直列) (圖12的「設計4」幾何結構) Cas9-hU6c-嚮導1-hU6c-嚮導2
Cas9-hU6c-嚮導1-7SK2-嚮導2
Cas9-hU6c-嚮導1-H1m-嚮導2
Cas9-hU6m-嚮導1-hU6c-嚮導2
Cas9-hU6m-嚮導1-7SK2-嚮導2
Cas9-hU6m-嚮導1-H1m-嚮導2
Cas9-7SK2-嚮導1-hU6c-嚮導2
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，本文中所揭示之任一種載體包含至少編碼第一嚮導RNA及第二嚮導RNA的核酸。在一些實施例中，核酸包含第一嚮導RNA的間隔子編碼序列、第一嚮導RNA的支架編碼序列、第二嚮導RNA的間隔子編碼序列，及第二嚮導RNA的支架編碼序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的間隔子編碼序列(例如編碼本文中所揭示的任一個間隔子序列)與第二嚮導RNA的間隔子編碼序列一致。在一些實施例中，第一嚮導RNA的間隔子編碼序列(例如編碼本文中所揭示的任一個間隔子序列)不同於第二嚮導RNA的間隔子編碼序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列與編碼第二嚮導RNA之核酸的支架編碼序列一致。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列不同於第二嚮導RNA的支架編碼序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含選自由SEQ ID No: 901-916組成之群的序列，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含選自由SEQ ID No: 901-916組成之群的不同序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 905。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 910。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 911。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 912。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 913。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 914。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 915。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: SEQ ID NO: 901，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 916。在一些實施例中，第一嚮導RNA的間隔子編碼序列與第二嚮導RNA的間隔子編碼序列相同，且第一嚮導RNA的支架編碼序列不同於編碼第二嚮導RNA之核酸的支架編碼序列。
在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸編碼包含與如下序列SEQ ID NO: 712至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的SluCas9：
Figure 02_image025
Figure 02_image027
在一些實施例中，SluCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 712之變異體。SluCas9變異體包含相較於SEQ ID NO: 712的一或多個胺基酸變化，包括一或多個胺基酸的插入、缺失或取代，或對一或多個胺基酸的化學修飾。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置781的位置處包含除Q之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置1013的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置781的位置處包含K。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置966的位置處包含K。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置1013的位置處包含H。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置781的位置處包含除Q之外的胺基酸；且在對應於SEQ ID NO: 712之位置1013的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置781的位置處包含K；在對應於SEQ ID NO: 712之位置966的位置處包含K；且在對應於SEQ ID NO: 712之位置1013的位置處包含H。
在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置246的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置414的位置處包含除N之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置420的位置處包含除T之外的胺基酸。 在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置655的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置246的位置處包含除R之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 712之位置414的位置處包含除N之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 712之位置420的位置處包含除T之外的胺基酸；且在對應於SEQ ID NO: 712之位置655的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置246的位置處包含A。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置414的位置處包含A。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置420的位置處包含A。 在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置655的位置處包含A。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置246的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 712之位置414的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 712之位置420的位置處包含A；且在對應於SEQ ID NO: 712之位置655的位置處包含A。
在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置246的位置處包含除R之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 712之位置414的位置處包含除N之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 712之位置420的位置處包含除T之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 712之位置655的位置處包含除R之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 712之位置781的位置處包含除Q之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 712之位置966的位置處包含K；且在對應於SEQ ID NO: 712之位置1013的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SluCas9在對應於SEQ ID NO: 712之位置246的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 712之位置414的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 712之位置420的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 712之位置655的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 712之位置781的位置處包含K；在對應於SEQ ID NO: 712之位置966的位置處包含K；且在對應於SEQ ID NO: 712之位置1013的位置處包含H。
在一些實施例中，SluCas9包含與如下序列SEQ ID NO: 718 (在本文中稱為SluCas9-KH或SLUCAS9KH)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image029
在一些實施例中，SluCas9包含與如下序列SEQ ID NO: 719 (在本文中稱為SluCas9-HF)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image031
在一些實施例中，SluCas9包含與如下序列SEQ ID NO: 720 (在本文中稱為SluCas9-HF-KH)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image033
Figure 02_image035
在一些實施例中，Cas蛋白為以下文獻中所揭示之任一種工程化Cas蛋白：Schmidt等人, 2021, Nature Communications,「Improved CRISPR genome editing using small highly active and specific engineered RNA-guided nucleases」。
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 716 (在本文中稱為sRGN1)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image037
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 717 (在本文中稱為sRGN2)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image039
Figure 02_image041
在一些實施例中，Cas9包含與序列SEQ ID NO: 723 (在本文中稱為sRGN3)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image043
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 724 (在本文中稱為sRGN3.1)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image045
Figure 02_image047
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 725 (在本文中稱為sRGN3.2)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image049
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 721 (在本文中稱為sRGN3.3)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image051
Figure 02_image053
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 722 (在本文中稱為sRGN4)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image055
經修飾之嚮導 RNA
在一些實施例中，嚮導RNA經化學修飾。包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸的嚮導RNA稱為「經修飾」之嚮導RNA或「經化學修飾」之嚮導RNA，以描述替代典型A、G、C及U殘基使用或除其之外使用的非天然及/或天然存在之一或多種組分或組態的存在。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA係由非典型核苷或核苷酸合成，在此稱為「經修飾」。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)磷酸二酯主鏈鍵聯中之一或兩個非鍵聯磷酸酯氧及/或一或多個鍵聯磷酸酯氧的變化，例如置換(例示性主鏈修飾)；(ii)核糖成分(例如核糖上之2'羥基)的變化，例如置換(例示性糖修飾)；(iii)用「去磷酸化」連接子成批置換磷酸酯部分(例示性主鏈修飾)；(iv)天然存在之核鹼基的修飾或置換，包括用非典型核鹼基修飾或置換(例示性鹼基修飾)；(v)核糖-磷酸酯主鏈之置換或修飾(例示性主鏈修飾)；(vi)寡核苷酸之3'端或5'端之修飾，例如末端磷酸酯基團之移除、修飾或置換，或部分、帽或連接子之結合(此類3'或5'帽修飾可包含糖及/或主鏈修飾)；及(vii)糖之修飾或置換(例示性糖修飾)。
化學修飾(諸如上文所列的化學修飾)可加以組合，以提供經修飾之嚮導RNA，其包含可具有兩個、三個、四個或更多個修飾的核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)。舉例而言，經修飾之殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基，或經修飾之糖及經修飾之磷酸二酯。在一些實施例中，嚮導RNA中的每個鹼基經修飾，例如所有鹼基具有經修飾之磷酸酯基團，諸如硫代磷酸酯基團。在某些實施例中，嚮導RNA分子中的所有或基本上所有磷酸酯基團經硫代磷酸酯基團置換。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA在RNA之5'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA在RNA之3'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。
在一些實施例中，嚮導RNA包含一個、兩個、三個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA中的至少5% (例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)位置為經修飾之核苷或核苷酸。
未經修飾之核酸可容易藉由例如細胞內核酸酶或血清中所發現之彼等核酸酶降解。舉例而言，核酸酶可使核酸磷酸二酯鍵水解。因此，在一個態樣中，本文所述之嚮導RNA可含有一或多個經修飾之核苷或核苷酸，例如以向細胞內核酸酶或基於血清之核酸酶引入穩定性。在一些實施例中，本文所述之經修飾的嚮導RNA分子當引入細胞群中時，在活體內與離體均可展現降低之先天免疫反應。術語「先天免疫反應」包括針對包括單股核酸之外源核酸的細胞反應，包括誘導細胞介素(特定言之，干擾素)表現及釋放以及細胞死亡。
在主鏈修飾的一些實施例中，經修飾之殘基中的磷酸酯基團可藉由用不同取代基置換一或多個氧而經修飾。另外，經修飾之殘基，例如存在於經修飾之核酸中的經修飾之殘基，可包括用如本文所述之經修飾之磷酸酯基團成批置換未修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾可包括產生不帶電連接子或電荷分佈不對稱之帶電連接子的變化。
經修飾之磷酸酯基團實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、膦酸烷酯或膦酸芳酯，及磷酸三酯。未修飾之磷酸酯基團中的磷原子呈非對掌性。然而，用上述原子或原子基團之一置換非橋連氧之一可使得磷原子呈對掌性。立體對稱磷原子可具有「R」組態(本文中為Rp)或「S」組態(本文中為Sp)。主鏈亦可藉由用氮(橋連胺基磷酸酯)、硫(橋連硫代磷酸酯)及碳(橋連亞甲基膦酸酯)置換橋連氧(亦即，連接磷酸酯與核苷之氧)而加以修飾。置換可發生在任一連接氧或兩個連接氧處。
磷酸酯基團可在某些主鏈修飾中經不含磷之連接基團置換。在一些實施例中，帶電磷酸酯基團可經中性部分置換。可置換磷酸酯基之部分之實例可包括但不限於例如膦酸甲酯、羥胺基、矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基肼、亞甲基二甲基肼及亞甲氧基甲基亞胺基。
亦可構築可模擬核酸之支架，其中磷酸酯連接子及核糖經核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置換。此類修飾可包含主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可藉由替代主鏈系拴。實例可包括(但不限於) N-嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。
經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括一或多個針對糖基之修飾，亦即糖修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如經多個不同「氧基」或「去氧」取代基置換。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，原因為羥基不可再發生去質子化而形成2'-烷醇鹽離子。
2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)；O(CH 2CH 2O) nCH 2CH 2OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20之整數(例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，其為氟置換2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖定」核酸(LNA)，其中2'羥基可藉由例如C 1-6伸烷基或C 1-6伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中例示性橋可包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋；O-胺基(其中胺基可為例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)及胺基烷氧基、O(CH 2) n-胺基(其中胺基可為例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「未鎖定」核酸(unlocked nucleic acid；UNA)，其中核糖環缺乏C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(methoxyethyl group；MOE)(OCH 2CH 2OCH 3，例如PEG衍生物)。
「去氧」2'修飾可包括氫(亦即，去氧核糖，例如位於部分dsRNA之突出部分)；鹵基(例如溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH 2CH 2NH) nCH2CH 2-胺基(其中胺基可例如如本文所述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；及可視情況經例如如本文所述之胺基取代的烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基。
糖修飾可包含亦可含有一或多個碳之糖基，該一或多個碳具有與核糖中之相應碳相反的立體化學組態。因此，經修飾之核酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。經修飾之核酸亦可包括無鹼基糖。此等無鹼基糖亦可進一步在一或多個組成性糖原子處經修飾。經修飾之核酸亦可包括一或多種呈L形式之糖，例如L-核苷。
可併入經修飾之核酸中的本文所述之經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括經修飾之鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括(但不限於)腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。此等核鹼基可經修飾或全部被置換以提供可併入經修飾之核酸中的經修飾之殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如天然存在之鹼基衍生物及合成的鹼基衍生物。
在使用雙重嚮導RNA的實施例中，crRNA及tracr RNA中的每一者可含有修飾。此類修飾可位於crRNA及/或tracr RNA之一端或兩端。在包含sgRNA之實施例中，sgRNA之一端或兩端的一或多個殘基可經化學修飾，且/或內部核苷可經修飾，且/或整個sgRNA可經化學修飾。某些實施例包含5'端修飾。某些實施例包含3'端修飾。
涵蓋2'-O-甲基之修飾。
已顯示可影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2'-氟(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。涵蓋2'-氟(2'-F)之修飾。
硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指一鍵，其中磷酸二酯鍵聯(例如核苷酸鹼基之間的鍵)中的一個非橋接磷酸酯氧被硫取代。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可被稱作S-寡核苷酸。
無鹼基核苷酸係指缺乏含氮鹼基之彼等核苷酸。
反向鹼基係指鍵聯相對於正常5'至3'鍵聯(亦即，5'至5'鍵或3'至3'鍵聯)呈反向之彼等鹼基。
無鹼基核苷酸可經由反向鍵聯連接。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵聯連接至末端5'核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵聯連接至末端3'核苷酸。末端5'或3'核苷酸處之反向無鹼基核苷酸亦可稱為反向無鹼基端帽。
在一些實施例中，對5'末端之前三、四或五個核苷酸中的一或多者及3'末端之最後三、四或五個核苷酸中的一或多者進行修飾。在一些實施例中，修飾為2'-O-Me、2'-F、反向無鹼基核苷酸、PS鍵，或此項技術中熟知可增強穩定性及/或效能的其他核苷酸修飾。
在一些實施例中，5'末端之前四個核苷酸，及3'末端之最後四個核苷酸經由硫代磷酸酯(PS)鍵連接。
在一些實施例中，5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端之前三個核苷酸及3'末端之最後三個核苷酸包含經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。 核糖核蛋白複合物
在一些實施例中，涵蓋組合物，該組合物包含：a)一或多個嚮導RNA，包括 表 1A及 表 1B的一或多個嚮導序列；以及b) SluCas9，或本文所揭示之任一種變異型Cas9蛋白。在一些實施例中，嚮導RNA連同Cas9一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。
在一些實施例中，本發明提供一種RNP複合物，其中嚮導RNA(例如本文所揭示之任一個嚮導RNA)結合至或能夠結合至DMPK基因中的目標序列，或 表 1A及 表 1B中所揭示之任一種序列所結合的目標序列，其中DMPK基因包含目標序列上游位置的PAM識別序列，且其中RNP在DMPK基因中之PAM上游3個核苷酸的位置(-3)處進行切割。在一些實施例中，RNP亦在DMPK基因中之PAM上游2個核苷酸(-2)、上游4個核苷酸(-4)、上游5個核苷酸(-5)或上游6個核苷酸(-6)的位置處切割。在一些實施例中，RNP在DMPK基因中之PAM上游3個核苷酸(-3)及上游4個核苷酸(-4)的位置處切割。
在一些實施例中，使用嵌合Cas9 (SluCas9)核酸酶，其中蛋白質之一個域或區域經不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas9核酸酶域可經來自不同核酸酶(諸如Fok1)之域置換。在一些實施例中，Cas9核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在一些實施例中，Cas9經修飾以僅含一個核酸酶功能域。舉例而言，藥劑蛋白質可經修飾以使得一個核酸酶域發生突變或完全或部分缺失以減少其核酸裂解活性。
在一些實施例中，Cas9蛋白核酸酶域內的保守胺基酸經取代以減少或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas9核酸酶可在RuvC或RuvC樣核酸酶域中包含胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見例如Zetsche等人, (2015) CellOct 22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas9核酸酶可在HNH或HNH樣核酸酶域中包含胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見例如Zetsche等人(2015)。其他例示性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西斯氏菌( Francisella novicida) U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。其他例示性胺基酸取代包括D10A及N580A (基於路鄧葡萄球菌Cas9蛋白)。參見例如Friedland等人, 2015, Genome Biol., 16:257。
在一些實施例中，Cas9缺乏裂解酶活性。在一些實施例中，Cas9包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽為dCas9多肽。在一些實施例中，缺乏裂解酶活性之Cas9或dCas DNA結合多肽為Cas核酸酶的一種形式(例如上文論述的Cas9核酸酶)，其中其內切核酸酶活性位點不活化，例如藉由其催化域之一或多種變化(例如點突變)而不活化。參見例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些實施例中，Cas9包含一或多個異源功能域(例如為融合多肽或包含融合多肽)。
在一些實施例中，異源功能域可促進Cas9轉運至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定域信號(NLS)。在一些實施例中，Cas9可與1至10個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與1至5個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與一個NLS融合。在使用一個NLS的情況下，NLS可在Cas9序列之N端或C端處連接，且可直接連接。在一些實施例中，在使用超過一個NLS的情況下，一或多個NLS可在N端連接且/或一或多個NLS可在C端連接。在一些實施例中，一或多個NLS直接連接至Cas9。在一些實施例中，一或多個NLS藉由連接子連接至Cas9。在實施例中，連接子的長度在3至25個胺基酸之間。在實施例中，連接子的長度在3至6個胺基酸之間。在一些實施例中，連接子包含甘胺酸及絲胺酸。在一些實施例中，連接子包含序列GSVD (SEQ ID NO: 940)或GSGS (SEQ ID NO: 941)。其亦可插入Cas9序列內。在其他實施例中，Cas9可與超過一個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與兩個NLS融合。在某些環境中，兩個NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，Cas9蛋白與SV40 NLS融合。在一些實施例中，SV40 NLS包含胺基酸序列SEQ ID NO: 713 (PKKKRKV)。在一些實施例中，Cas9蛋白(例如SluCas9蛋白)與核質蛋白NLS融合。在一些實施例中，核質蛋白NLS包含胺基酸序列SEQ ID NO: 714 (KRPAATKKAGQAKKKK)。在一些實施例中，Cas9蛋白與c-Myc NLS融合。在一些實施例中，c-Myc NLS為SEQ ID NO: 942 (PAAKKKKLD)且/或由核酸序列SEQ ID NO: 943 (CCGGCAGCTAAGAAAAAGAAACTGGAT)編碼。在一些實施例中，Cas9與在羧基端連接的兩個SV40 NLS序列融合。在一些實施例中，Cas9可與兩個NLS融合，一個在N端連接且一個在C端連接。在一些實施例中，Cas9可與3個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可不與NLS融合。在一些實施例中，Cas9蛋白與SV40 NLS融合且與核質蛋白NLS融合。在一些實施例中，SV40 NLS與Cas9的C端融合，而核質蛋白NLS與Cas9蛋白的N端融合。在一些實施例中，SV40 NLS與Cas9的N端融合，而核質蛋白NLS與Cas9蛋白的C端融合。在一些實施例中，c-myc NLS與Cas9的N端融合且SV40 NLS及/或核質蛋白NLS與Cas9的C端融合。在一些實施例中，c-myc NLS與Cas9的N端(例如藉由連接子，諸如GSVD (SEQ ID NO: 940))融合，SV40 NLS與Cas9的C端(例如藉由連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))融合，且核質蛋白NLS與SV-40 NLS的C端(例如藉由連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))融合。在一些實施例中，SV40 NLS藉由連接子與Cas9蛋白融合。在一些實施例中，核質蛋白NLS藉由連接子與Cas9蛋白融合。
在一些實施例中，異源功能域能夠調節Cas9的細胞內半衰期。在一些實施例中，可延長Cas9半衰期。在一些實施例中，可縮短Cas9半衰期。在一些實施例中，異源功能域能夠增強Cas9穩定性。在一些實施例中，異源功能域能夠減小Cas9穩定性。在一些實施例中，異源功能域可充當蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶介導，諸如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶(calpain proteases)。在一些實施例中，異源功能域可包含PEST序列。在一些實施例中，可藉由添加泛素或聚泛素鏈來修飾Cas9。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包括小泛素樣調節因子(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關調節因子-1 (URM1)、神經元前驅體細胞表現之發育下調蛋白-8(NEDD8，在釀酒酵母( S. cerevisiae)中亦稱作Rub1)、人類白血球F相關抗原(FAT10)、自體吞噬-8 (ATG8)及自體吞噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素摺疊調節因子-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能域可為標記域。標記域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、抗原決定基標籤及報導基因序列。在一些實施例中，標記域可為螢光蛋白。適合螢光蛋白之非限制實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami綠(Azami Green)、單體Azami綠、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、氰基螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed單體、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)，及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira橙、單體Kusabira橙、mTangerine、tdTomato)或任何其他適合螢光蛋白。在其他實施例中，標記域可為純化標籤及/或抗原決定基標籤。非限制性例示性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)、殼質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(tandem affinity purification，TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚His及調鈣蛋白。非限制性之例示性報導基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在其他實施例中，異源功能域可使Cas9靶向特定細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能域可使Cas9靶向肌肉。
在其他實施例中，異源功能域可為效應域。當Cas9針對其目標序列時，例如當Cas9藉由嚮導RNA針對目標序列時，效應域可修飾或影響目標序列。在一些實施例中，效應域可選自核酸結合域或核酸酶域(例如非Cas核酸酶域)。在一些實施例中，異源功能域為核酸酶，諸如FokI核酸酶。參見例如美國專利第9,023,649號。 測定嚮導 RNA 的功效
在一些實施例中，當嚮導RNA連同形成RNP之其他組分一起遞送或表現時，測定該嚮導RNA的功效。在一些實施例中，嚮導RNA連同SluCas9一起表現。在一些實施例中，嚮導RNA遞送至或表現於已穩定表現SluCas9的細胞株中。在一些實施例中，嚮導RNA作為RNP之一部分遞送至細胞。在一些實施例中，嚮導RNA連同編碼SluCas9的核酸(例如mRNA)一起遞送至細胞。
在一些實施例中，基於活體外模型來測定特定嚮導RNA的功效。在一些實施例中，活體外模型為細胞株。
在一些實施例中，根據嚮導RNA選擇過程，跨越多種活體外細胞模型測定特定嚮導RNA的功效。在一些實施例中，對細胞株使用所選嚮導RNA的資料進行比較。在一些實施例中，對多種細胞模型進行交叉篩選。
在一些實施例中，基於活體內模型來測定特定嚮導RNA的功效。在一些實施例中，活體內模型為嚙齒動物模型。在一些實施例中，嚙齒動物模型為表現包含擴增之三核苷酸重複序列或自身互補區域之基因的小鼠。基因可為表1中所列之任一種基因的人類形式或嚙齒動物(例如鼠類)同源物。在一些實施例中，基因為人類 DMPK。在一些實施例中，基因為 DMPK之嚙齒動物(例如鼠類)同源物。在一些實施例中，活體內模型為非人類靈長類動物，例如食蟹獼猴。參見例如Huguet等人, 2012, PLoS Genet, 8(11):e1003043中所述的小鼠模型。在一些實施例中，活體內模型為非人類靈長類動物，例如食蟹獼猴。 III. 基因編輯、 CTG 重複序列切除及治療 DM1 的方法
本發明提供治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法及用途。在一些實施例中，本文所述的任一種組合物或系統可投與有需要之個體用於在DMPK基因中產生雙股斷裂。在一些實施例中，本文所述之組合物或系統中的任一者可投與有需要之個體用於切除DMPK基因之3'非轉譯區(UTR)中的CTG重複序列。在一些實施例中，本文所述之組合物或系統中的任一者可投與有需要之個體用於治療DM1。在一些實施例中，將核酸分子投與個體以治療DM1，該核酸分子包含編碼 表 1A 及表 1B中之一或多個嚮導RNA的第一核酸及編碼SluCas9的第二核酸。在一些實施例中，將單一核酸分子(其可為載體，包括AAV載體)投與個體以治療DM1，該單一核酸分子包含編碼 表 1A 及表 1B中之一或多個嚮導RNA的第一核酸及編碼SluCas9的第二核酸。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以治療第1型肌強直性營養不良(DM1)。
為了治療個體(例如人類)，本文所揭示之任一種組合物可以與劑型相容的方式且以治療上有效的量投與。組合物可容易以多種劑型(諸如可注射溶液)投與。舉例而言，以水溶液非經腸投與時，溶液通常宜緩衝，且首先用例如足夠的生理鹽水或葡萄糖來賦予液體稀釋劑等張性。此類水溶液可用於例如靜脈內、肌肉內、皮下及/或腹膜內投與。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以誘導DMPK基因中發生雙股斷裂。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以切除DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以治療DM1，例如投與DMPK基因之3' UTR中具有CTG重複序列的個體。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，所述方法包含將本文所述之任一種組合物遞送至細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
特定而言，在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含向細胞遞送：1)核酸分子，其包含：編碼選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之間隔子序列的核酸；編碼包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸之間隔子序列的核酸；或編碼與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致之間隔子序列的核酸；以及2)路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)或編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 22。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 24。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 29。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 36。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 37。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 38。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 39。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 40。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 41。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 42。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 43。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 44。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 46。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 47。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 49。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 50。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 51。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 51。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 52。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 53。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 54。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 57。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 59。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 62。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 63。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 64。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 67。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 69。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 71。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 72。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 73。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 74。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 75。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 76。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 77。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 79。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 80。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 81。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 82。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 83。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 84。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 85。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 86。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 87。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 88。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 89。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 90。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 91。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 92。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 93。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 94。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 95。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 96。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 97。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 98。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 99。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 100。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 102。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 103。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 105。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 106。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 108。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 109。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 110。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 111。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 112。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 113。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 114。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 115。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 116。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 118。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 119。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 120。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 121。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 122。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 123。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 124。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 126。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 127。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 128。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 129。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 130。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 131。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 132。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 133。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 134。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 135。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 136。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 137。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 138。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 139。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 140。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 141。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 144。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 145。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 146。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 147。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 148。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 149。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 150。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 151。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 152。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 153。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 154。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 155。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 156。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 157。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 158。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 159。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 160。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 161。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 161。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 162。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 163。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 164。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 165。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 166。在一些實施例中，間隔子選自SEQ ID NO: 8、63、64及81。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 167。在一些實施例中，細胞包含位於DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
特定而言，在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含向細胞遞送：1)核酸分子，其包含：編碼選自SEQ ID NO: 1-172及201-531之間隔子序列的核酸；編碼包含選自SEQ ID NO: 1-172及201-531之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸之間隔子序列的核酸；或編碼與SEQ ID NO: 1-172及201-531中之任一者至少90%一致之間隔子序列的核酸；以及2)路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)或編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸亦編碼選自SEQ ID NO: 1-172及201-531的間隔子序列；核酸編碼包含選自SEQ ID NO: 1-172及201-531之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的間隔子序列；或核酸編碼與SEQ ID NO: 1-172及201-531中之任一者至少90%一致的間隔子序列。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸不編碼任何嚮導RNA。
在某些較佳實施例中，間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-172及201-531之間隔子序列的至少20個鄰接核苷酸；或核酸編碼與SEQ ID NO: 1-172及201-531中之任一者至少90%一致的間隔子序列。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸亦編碼嚮導RNA對，該嚮導RNA對包含：a)選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列；b)包含a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與a)或b之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸不編碼任何嚮導RNA。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)核酸分子，包含：編碼選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之間隔子序列的核酸；編碼包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸之間隔子序列的核酸；或編碼與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致之間隔子序列的核酸；以及2)路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)或編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸亦編碼選自SEQ ID NO: 1-172及201-531的間隔子序列；核酸編碼包含選自SEQ ID NO: 1-172及201-531之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的間隔子序列；或核酸編碼與SEQ ID NO: 1-172及201-531中之任一者至少90%一致的間隔子序列。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸不編碼任何嚮導RNA。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，僅投與一個嚮導RNA且切除3' UTR中的CTG重複序列。在一些實施例中，投與嚮導RNA對且切除3' UTR中的CTG重複序列。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸分子，該嚮導RNA對包含：a)包含以下之嚮導RNA對：選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列；b)包含選自1) a)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與1) a)或1) b)中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及2)路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)或編碼SluCas9的核酸。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸亦編碼嚮導RNA對，該嚮導RNA對包含：a)選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列；b)包含a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與a)或b之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。在一些實施例中，編碼SluCas9的核酸不編碼任何嚮導RNA。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，本文所提供的方法包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與67；1與68；1與69；1與70；1與71；1與72；1與73；1與74；1與75；1與76；1與77；1與78；1與79；1與80；1與81；1與82；1與83；1與84；1與85；1與86；1與87；1與88；1與89；1與90；1與91；1與92；1與93；1與94；1與95；1與96；1與97；1與98；1與99；1與100；1與101；1與102；1與103；1與104；1與105；1與106；1與107；1與108；1與109；1與110；1與111；1與112；1與113；1與114；1與115；1與116；1與117；1與118；1與119；1與120；1與121；1與122；1與123；1與124；1與125；1與126；1與127；1與128；1與129；1與130；1與131；1與132；1與133；1與134；1與135；1與136；1與137；1與138；1與139；1與140；1與141；1與142；1與143；1與144；1與145；1與146；1與147；1與148；1與149；1與150；1與151；1與152；1與153；1與154；1與155；1與156；1與157；1與158；1與159；1與160；1與161；1與162；1與163；1與164；1與165；1與166；1與167；2與67；2與68；2與69；2與70；2與71；2與72；2與73；2與74；2與75；2與76；2與77；2與78；2與79；2與80；2與81；2與82；2與83；2與84；2與85；2與86；2與87；2與88；2與89；2與90；2與91；2與92；2與93；2與94；2與95；2與96；2與97；2與98；2與99；2與100；2與101；2與102；2與103；2與104；2與105；2與106；2與107；2與108；2與109；2與110；2與111；2與112；2與113；2與114；2與115；2與116；2與117；2與118；2與119；2與120；2與121；2與122；2與123；2與124；2與125；2與126；2與127；2與128；2與129；2與130；2與131；2與132；2與133；2與134；2與135；2與136；2與137；2與138；2與139；2與140；2與141；2與142；2與143；2與144；2與145；2與146；2與147；2與148；2與149；2與150；2與151；2與152；2與153；2與154；2與155；2與156；2與157；2與158；2與159；2與160；2與161；2與162；2與163；2與164；2與165；2與166；2與167；3與67；3與68；3與69；3與70；3與71；3與72；3與73；3與74；3與75；3與76；3與77；3與78；3與79；3與80；3與81；3與82；3與83；3與84；3與85；3與86；3與87；3與88；3與89；3與90；3與91；3與92；3與93；3與94；3與95；3與96；3與97；3與98；3與99；3與100；3與101；3與102；3與103；3與104；3與105；3與106；3與107；3與108；3與109；3與110；3與111；3與112；3與113；3與114；3與115；3與116；3與117；3與118；3與119；3與120；3與121；3與122；3與123；3與124；3與125；3與126；3與127；3與128；3與129；3與130；3與131；3與132；3與133；3與134；3與135；3與136；3與137；3與138；3與139；3與140；3與141；3與142；3與143；3與144；3與145；3與146；3與147；3與148；3與149；3與150；3與151；3與152；3與153；3與154；3與155；3與156；3與157；3與158；3與159；3與160；3與161；3與162；3與163；3與164；3與165；3與166；3與167；4與67；4與68；4與69；4與70；4與71；4與72；4與73；4與74；4與75；4與76；4與77；4與78；4與79；4與80；4與81；4與82；4與83；4與84；4與85；4與86；4與87；4與88；4與89；4與90；4與91；4與92；4與93；4與94；4與95；4與96；4與97；4與98；4與99；4與100；4與101；4與102；4與103；4與104；4與105；4與106；4與107；4與108；4與109；4與110；4與111；4與112；4與113；4與114；4與115；4與116；4與117；4與118；4與119；4與120；4與121；4與122；4與123；4與124；4與125；4與126；4與127；4與128；4與129；4與130；4與131；4與132；4與133；4與134；4與135；4與136；4與137；4與138；4與139；4與140；4與141；4與142；4與143；4與144；4與145；4與146；4與147；4與148；4與149；4與150；4與151；4與152；4與153；4與154；4與155；4與156；4與157；4與158；4與159；4與160；4與161；4與162；4與163；4與164；4與165；4與166；4與167；5與67；5與68；5與69；5與70；5與71；5與72；5與73；5與74；5與75；5與76；5與77；5與78；5與79；5與80；5與81；5與82；5與83；5與84；5與85；5與86；5與87；5與88；5與89；5與90；5與91；5與92；5與93；5與94；5與95；5與96；5與97；5與98；5與99；5與100；5與101；5與102；5與103；5與104；5與105；5與106；5與107；5與108；5與109；5與110；5與111；5與112；5與113；5與114；5與115；5與116；5與117；5與118；5與119；5與120；5與121；5與122；5與123；5與124；5與125；5與126；5與127；5與128；5與129；5與130；5與131；5與132；5與133；5與134；5與135；5與136；5與137；5與138；5與139；5與140；5與141；5與142；5與143；5與144；5與145；5與146；5與147；5與148；5與149；5與150；5與151；5與152；5與153；5與154；5與155；5與156；5與157；5與158；5與159；5與160；5與161；5與162；5與163；5與164；5與165；5與166；5與167；6與67；6與68；6與69；6與70；6與71；6與72；6與73；6與74；6與75；6與76；6與77；6與78；6與79；6與80；6與81；6與82；6與83；6與84；6與85；6與86；6與87；6與88；6與89；6與90；6與91；6與92；6與93；6與94；6與95；6與96；6與97；6與98；6與99；6與100；6與101；6與102；6與103；6與104；6與105；6與106；6與107；6與108；6與109；6與110；6與111；6與112；6與113；6與114；6與115；6與116；6與117；6與118；6與119；6與120；6與121；6與122；6與123；6與124；6與125；6與126；6與127；6與128；6與129；6與130；6與131；6與132；6與133；6與134；6與135；6與136；6與137；6與138；6與139；6與140；6與141；6與142；6與143；6與144；6與145；6與146；6與147；6與148；6與149；6與150；6與151；6與152；6與153；6與154；6與155；6與156；6與157；6與158；6與159；6與160；6與161；6與162；6與163；6與164；6與165；6與166；6與167；7與67；7與68；7與69；7與70；7與71；7與72；7與73；7與74；7與75；7與76；7與77；7與78；7與79；7與80；7與81；7與82；7與83；7與84；7與85；7與86；7與87；7與88；7與89；7與90；7與91；7與92；7與93；7與94；7與95；7與96；7與97；7與98；7與99；7與100；7與101；7與102；7與103；7與104；7與105；7與106；7與107；7與108；7與109；7與110；7與111；7與112；7與113；7與114；7與115；7與116；7與117；7與118；7與119；7與120；7與121；7與122；7與123；7與124；7與125；7與126；7與127；7與128；7與129；7與130；7與131；7與132；7與133；7與134；7與135；7與136；7與137；7與138；7與139；7與140；7與141；7與142；7與143；7與144；7與145；7與146；7與147；7與148；7與149；7與150；7與151；7與152；7與153；7與154；7與155；7與156；7與157；7與158；7與159；7與160；7與161；7與162；7與163；7與164；7與165；7與166；7與167；8與67；8與68；8與69；8與70；8與71；8與72；8與73；8與74；8與75；8與76；8與77；8與78；8與79；8與80；8與81；8與82；8與83；8與84；8與85；8與86；8與87；8與88；8與89；8與90；8與91；8與92；8與93；8與94；8與95；8與96；8與97；8與98；8與99；8與100；8與101；8與102；8與103；8與104；8與105；8與106；8與107；8與108；8與109；8與110；8與111；8與112；8與113；8與114；8與115；8與116；8與117；8與118；8與119；8與120；8與121；8與122；8與123；8與124；8與125；8與126；8與127；8與128；8與129；8與130；8與131；8與132；8與133；8與134；8與135；8與136；8與137；8與138；8與139；8與140；8與141；8與142；8與143；8與144；8與145；8與146；8與147；8與148；8與149；8與150；8與151；8與152；8與153；8與154；8與155；8與156；8與157；8與158；8與159；8與160；8與161；8與162；8與163；8與164；8與165；8與166；8與167；9與67；9與68；9與69；9與70；9與71；9與72；9與73；9與74；9與75；9與76；9與77；9與78；9與79；9與80；9與81；9與82；9與83；9與84；9與85；9與86；9與87；9與88；9與89；9與90；9與91；9與92；9與93；9與94；9與95；9與96；9與97；9與98；9與99；9與100；9與101；9與102；9與103；9與104；9與105；9與106；9與107；9與108；9與109；9與110；9與111；9與112；9與113；9與114；9與115；9與116；9與117；9與118；9與119；9與120；9與121；9與122；9與123；9與124；9與125；9與126；9與127；9與128；9與129；9與130；9與131；9與132；9與133；9與134；9與135；9與136；9與137；9與138；9與139；9與140；9與141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在一些實施例中，提供組合物、方法/用途及系統，其包含含有第一及第二間隔子的嚮導RNA對或編碼嚮導RNA對的一或多個載體，其中第一及第二間隔子序列包含以下對中之任一者：SEQ ID NO: 6與72；6與81；6與84；6與98；6與100；6與114；6與122；6與134；6與139；6與149；6與166；8與72；8與72；8與81；8與84；8與98；8與100；8與114；8與122；8與134；8與139；8與149；8與166；10與72；10與81；10與84；10與98；10與100；10與114；10與122；10與134；10與139；10與149；10與166；21與72；21與81；21與84；21與98；21與100；21與114；21與122；21與134；21與139；21與149；21與166；58與72；58與81；58與84；58與98；58與100；58與114；58與122；58與134；58與139；58與149；58與166；62與72；62與81；62與84；62與98；62與100；62與114；62與122；62與134；62與139；62與149；62與166；63與72；63與81；63與84；63與98；63與100；63與114；63與122；63與134；63與139；63與149；63與166；64與72；64與81；64與84；64與98；64與100；64與114；64與122；64與134；64與139；64與149；及64與166。
在一些實施例中，方法包含將編碼SluCas9的核酸分子遞送至細胞，其中該SluCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 712。在一些實施例中，方法包含將編碼SluCas9的核酸分子遞送至細胞，其中該SluCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 712的變異體。在一些實施例中，方法包含將編碼SluCas9的核酸分子遞送至細胞，其中該SluCas9包含選自SEQ ID NO: 718-720中之任一者的胺基酸序列。
在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。 IV. DNA-PK 抑制劑
在本文所揭示之組合物或方法中使用DNA-PK抑制劑的情況下，其可為此項技術中已知之任何DNA-PK抑制劑。DNA-PK抑制劑詳細論述於例如WO2014/159690；WO2013/163190；WO2018/013840；WO2019/143675；WO 2019/143677；WO 2019/143678；US2014275059；US2013281431；US2020361877；US2020353101及Robert等人, Genome Medicine(2015) 7:93，其各自以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為NU7441、KU-0060648，或化合物1、2、3、4、5或6 (結構在下文顯示)中之任一者，其各自亦描述於至少一個前述引文中。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物3。例示性DNA-PK抑制劑結構如下。除非另外指示，否則以名稱或結構提及DNA-PK抑制劑涵蓋其醫藥學上可接受之鹽。
DNA-PK抑制劑 結構
NU7441
Figure 02_image057
KU-0060648
Figure 02_image059
化合物1
Figure 02_image061
化合物2
Figure 02_image063
化合物3
Figure 02_image065
化合物4
Figure 02_image067
化合物5
Figure 02_image069
化合物6
Figure 02_image071
在使用DNA-PK抑制劑的任一前述實施例中，其可與僅一種gRNA或編碼僅一種gRNA的載體組合使用以促進切除，亦即，該方法並非始終包括提供兩種或更多種促進在CTG重複序列附近裂解的嚮導。
在使用DNA-PK抑制劑的一些實施例中，其可與gRNA對或編碼嚮導RNA對的載體組合使用以促進切除。在一些實施例中，gRNA對包含不相同的gRNA。在特定實施例中，gRNA對共同靶向與細胞基因體中之CTG重複序列區域側接的序列。 V. 組合療法
在一些實施例中，本發明包含組合療法，其包含本文所述之任一種方法或用途以及適於緩解DM1的另一種療法。 VI. 嚮導 RNA 組合物的遞送
本文所揭示的方法及用途可使用用於遞送本文所述之嚮導RNA及組合物的任何適合方法。例示性遞送方法包括載體，諸如病毒載體；脂質奈米粒子；轉染；及電穿孔。在一些實施例中，與本文所揭示之單一載體嚮導RNA/Cas9結合的載體或LNP用於製備供治療DM1用的藥劑。
在使用載體的情況下，其可為病毒載體，諸如非整合性病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒載體、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體或單純疱疹病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，AAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10 (參見例如US 9,790,472之SEQ ID NO: 81，該文獻以全文引用之方式併入本文中)、AAVrh74 (參見例如US 2015/0111955之SEQ ID NO: 1，該文獻以全文引用之方式併入本文中)或AAV9載體，其中AAV後之數字指示AAV血清型。通用術語AAV載體、AAV1載體等涵蓋AAV載體或其血清型之任何變異體，諸如自互補AAV (scAAV)載體。關於各種AAV載體的詳細論述，參見例如McCarty等人, Gene Ther. 2001;8:1248-54, Naso等人, BioDrugs2017; 31:317-334，及其中所引述的參考文獻。
在一些實施例中，載體(例如病毒載體，諸如腺相關病毒載體)包含組織特異性(例如肌肉特異性)啟動子，例如其可操作地連接至編碼嚮導RNA的序列。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子或SPc5-12啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8e啟動子。肌肉特異性啟動子詳細描述於例如US2004/0175727 A1; Wang等人, Expert Opin Drug Deliv. (2014) 11, 345-364; Wang等人, Gene Therapy(2008) 15, 1489-1499。在一些實施例中，組織特異性啟動子為神經元特異性啟動子，諸如烯醇酶啟動子。關於組織特異性啟動子(包括神經元特異性啟動子)的詳細論述，參見例如Naso等人, BioDrugs2017; 31:317-334; Dashkoff等人, Mol Ther Methods Clin Dev. 2016;3:16081及其中所引述之參考文獻。
在一些實施例中，除嚮導RNA及Cas9序列之外，載體進一步包含不編碼嚮導RNA之核酸。不編碼嚮導RNA及Cas9的核酸包括(但不限於)啟動子、增強子及調控序列。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。
脂質奈米粒子(LNP)為用於遞送核苷酸及蛋白質負荷之已知方式，且可用於遞送本文所揭示之嚮導RNA、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP遞送核酸、蛋白質，或核酸以及蛋白質。
電穿孔為遞送負荷之熟知方式，且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之單一載體。
在一些實施例中，本發明包含一種將本文所揭示之任一種單一載體遞送至離體細胞的方法，其中嚮導RNA係由與LNP結合或處於水溶液中的載體編碼。在一些實施例中，嚮導RNA/LNP或嚮導RNA亦與Cas9或編碼Cas9的序列結合(例如處於同一載體、LNP或溶液中)。 實例
以下實例係為了說明所揭示的某些實施例而提供且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。 實例 1 ： DM1 sgRNA 的評價 A. 材料及方法 1.  sgRNA 選擇
針對有義股或反義股上的SluCas9 PAM序列NNGG，掃描人類 DMPK基因的3' UTR，且鑑別出172種與PAM鄰接的sgRNA原間隔子序列(長度為22個核苷酸)( 表 1A)。選擇166種sgRNA，以便基於電腦模擬的脫靶評估來針對DM1患者原代肌母細胞作出評價。其他例示性嚮導序列顯示於 表 1B中。 表 1A ：人類 DMPK 基因之 3' UTR 區域中具有 SluCas9 PAM 序列的 SluCas9 sgRN A
SluCas9 sgRNA 名稱 SEQ ID NO 股 原間隔子序列 (22 bp) 原間隔子 起點 原間隔子 終點 PAM 序列 PAM 起點 PAM 終點 原間隔子 GC 含量 預測的脫靶位點數目
SluU01 1 - AACCCTAGAACTGTCTTCGACT 45770467 45770488 CCGG 45770463 45770466 45.45 1
SluU02 2 - ACCCTAGAACTGTCTTCGACTC 45770466 45770487 CGGG 45770462 45770465 50 10
SluU03 3 - CCCTAGAACTGTCTTCGACTCC 45770465 45770486 GGGG 45770461 45770464 54.55 1
SluU04 4 + CCCCGGAGTCGAAGACAGTTCT 45770461 45770482 AGGG 45770483 45770486 59.09 2
SluU05 5 + GCCCCGGAGTCGAAGACAGTTC 45770460 45770481 TAGG 45770482 45770485 63.64 5
SluU06 6 - TGTCTTCGACTCCGGGGCCCCG 45770456 45770477 TTGG 45770452 45770455 72.73 2
SluU07 7 + CACTCAGTCTTCCAACGGGGCC 45770441 45770462 CCGG 45770463 45770466 63.64 0
SluU08 8 - GCCCCGTTGGAAGACTGAGTGC 45770440 45770461 CCGG 45770436 45770439 63.64 2
SluU09 9 - CCCCGTTGGAAGACTGAGTGCC 45770439 45770460 CGGG 45770435 45770438 63.64 4
SluU10 10 - CCCGTTGGAAGACTGAGTGCCC 45770438 45770459 GGGG 45770434 45770437 63.64 3
SluU11 11 + CCCGGGCACTCAGTCTTCCAAC 45770435 45770456 GGGG 45770457 45770460 63.64 7
SluU12 12 + CCCCGGGCACTCAGTCTTCCAA 45770434 45770455 CGGG 45770456 45770459 63.64 4
SluU13 13 + GCCCCGGGCACTCAGTCTTCCA 45770433 45770454 ACGG 45770455 45770458 68.18 8
SluU14 14 - TGGAAGACTGAGTGCCCGGGGC 45770433 45770454 ACGG 45770429 45770432 68.18 12
SluU15 15 + GCGCGGCTTCTGTGCCGTGCCC 45770415 45770436 CGGG 45770437 45770440 77.27 5
SluU16 16 + GGCGCGGCTTCTGTGCCGTGCC 45770414 45770435 CCGG 45770436 45770439 77.27 1
SluU17 17 + TGTGAACTGGCAGGCGGTGGGC 45770395 45770416 GCGG 45770417 45770420 68.18 22
SluU18 18 + GCGGTTGTGAACTGGCAGGCGG 45770390 45770411 TGGG 45770412 45770415 68.18 3
SluU19 19 + AGCGGTTGTGAACTGGCAGGCG 45770389 45770410 GTGG 45770411 45770414 63.64 2
SluU20 20 + CGGAGCGGTTGTGAACTGGCAG 45770386 45770407 GCGG 45770408 45770411 63.64 4
SluU21 21 + GCTCGGAGCGGTTGTGAACTGG 45770383 45770404 CAGG 45770405 45770408 63.64 0
SluU22 22 - CCAGTTCACAACCGCTCCGAGC 45770383 45770404 GTGG 45770379 45770382 63.64 1
SluU23 23 - CAGTTCACAACCGCTCCGAGCG 45770382 45770403 TGGG 45770378 45770381 63.64 1
SluU24 24 + CCACGCTCGGAGCGGTTGTGAA 45770379 45770400 CTGG 45770401 45770404 63.64 0
SluU25 25 + TGGGCGGAGACCCACGCTCGGA 45770368 45770389 GCGG 45770390 45770393 72.73 1
SluU26 26 + GGAGCTGGGCGGAGACCCACGC 45770363 45770384 TCGG 45770385 45770388 77.27 4
SluU27 27 - CGCCCAGCTCCAGTCCTGTGAT 45770352 45770373 CCGG 45770348 45770351 63.64 6
SluU28 28 - GCCCAGCTCCAGTCCTGTGATC 45770351 45770372 CGGG 45770347 45770350 63.64 8
SluU29 29 + CGGATCACAGGACTGGAGCTGG 45770349 45770370 GCGG 45770371 45770374 63.64 13
SluU30 30 + GCCCGGATCACAGGACTGGAGC 45770346 45770367 TGGG 45770368 45770371 68.18 5
SluU31 31 + GGCCCGGATCACAGGACTGGAG 45770345 45770366 CTGG 45770367 45770370 68.18 6
SluU32 32 + GGGGCGGGCCCGGATCACAGGA 45770339 45770360 CTGG 45770361 45770364 77.27 3
SluU33 33 - TGTGATCCGGGCCCGCCCCCTA 45770336 45770357 GCgg 45770332 45770335 72.73 2
SluU34 34 + GCTAGGGGGCGGGCCCGGATCA 45770334 45770355 CAGG 45770356 45770359 77.27 1
SluU35 35 - ATCCGGGCCCGCCCCCTAGCgg 45770332 45770353 ccgg 45770328 45770331 81.82 3
SluU36 36 - TCCGGGCCCGCCCCCTAGCggc 45770331 45770352 cggg 45770327 45770330 86.36 7
SluU37 37 - CCGGGCCCGCCCCCTAGCggcc 45770330 45770351 gggg 45770326 45770329 90.91 10
SluU38 38 - GGCCCGCCCCCTAGCggccggg 45770327 45770348 gagg 45770323 45770326 90.91 10
SluU39 39 + ccccggccGCTAGGGGGCGGGC 45770326 45770347 CCGG 45770348 45770351 90.91 10
SluU40 40 - GCCCGCCCCCTAGCggccgggg 45770326 45770347 aggg 45770322 45770325 90.91 12
SluU41 41 - CGCCCCCTAGCggccggggagg 45770323 45770344 gagg 45770319 45770322 86.36 7
SluU42 42 - GCCCCCTAGCggccggggaggg 45770322 45770343 aggg 45770318 45770321 86.36 9
SluU43 43 + tccctccccggccGCTAGGGGG 45770321 45770342 CGGG 45770343 45770346 81.82 5
SluU44 44 - CCCCCTAGCggccggggaggga 45770321 45770342 gggg 45770317 45770320 81.82 8
SluU45 45 + ctccctccccggccGCTAGGGG 45770320 45770341 GCGG 45770342 45770345 81.82 6
SluU46 46 + cccctccctccccggccGCTAG 45770317 45770338 GGGG 45770339 45770342 81.82 11
SluU47 47 - CTAGCggccggggagggagggg 45770317 45770338 ccgg 45770313 45770316 81.82 33
SluU48 48 + gcccctccctccccggccGCTA 45770316 45770337 GGGG 45770338 45770341 81.82 11
SluU49 49 - TAGCggccggggagggaggggc 45770316 45770337 cggg 45770312 45770315 81.82 22
SluU50 50 + ggcccctccctccccggccGCT 45770315 45770336 AGGG 45770337 45770340 86.36 29
SluU51 51 + cggcccctccctccccggccGC 45770314 45770335 TAGG 45770336 45770339 90.91 28
SluU52 52 - cggggagggaggggccgggtcc 45770309 45770330 gcgg 45770305 45770308 86.36 66
SluU53 53 + cgcggacccggcccctccctcc 45770306 45770327 ccgg 45770328 45770331 86.36 21
SluU54 54 - gagggaggggccgggtccgcgg 45770305 45770326 ccgg 45770301 45770304 86.36 41
SluU55 55 - gggccgggtccgcggccggcga 45770298 45770319 acgg 45770294 45770297 90.91 41
SluU56 56 - ggccgggtccgcggccggcgaa 45770297 45770318 cggg 45770293 45770296 86.36 10
SluU57 57 - gccgggtccgcggccggcgaac 45770296 45770317 gggg 45770292 45770295 86.36 5
SluU58 58 + gccccgttcgccggccgcggac 45770291 45770312 ccgg 45770313 45770316 86.36 1
SluU59 59 - cgcggccggcgaacggggcTCG 45770288 45770309 AAGG 45770284 45770287 86.36 5
SluU60 60 - gcggccggcgaacggggcTCGA 45770287 45770308 AGGG 45770283 45770286 81.82 2
SluU61 61 + CTTCGAgccccgttcgccggcc 45770285 45770306 gcgg 45770307 45770310 77.27 1
SluU62 62 + AGGACCCTTCGAgccccgttcg 45770279 45770300 ccgg 45770301 45770304 68.18 0
SluU63 63 - ggggcTCGAAGGGTCCTTGTAG 45770274 45770295 CCGG 45770270 45770273 63.64 4
SluU64 64 - gggcTCGAAGGGTCCTTGTAGC 45770273 45770294 CGGG 45770269 45770272 63.64 1
SluU65 65 + cagcagcagcaTTCCCGGCTAC 45770256 45770277 AAGG 45770278 45770281 63.64 7
SluU66* 66 + agcagcagcagcagcagcaTTC 45770248 45770269 CCGG 45770270 45770273 59.09 647
SluD01 67 - GATCACAGACCATTTCTTTCTT 45770179 45770200 TCGG 45770175 45770178 36.36 14
SluD02 68 - CAGACCATTTCTTTCTTTCGGC 45770174 45770195 CAGG 45770170 45770173 45.45 5
SluD03 69 - ATTTCTTTCTTTCGGCCAGGCT 45770168 45770189 GAGG 45770164 45770167 45.45 14
SluD04 70 + TCAGCCTGGCCGAAAGAAAGAA 45770166 45770187 ATGG 45770188 45770191 50 6
SluD05 71 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTGAC 45770157 45770178 GTGG 45770153 45770156 72.73 8
SluD06 72 - CCAGGCTGAGGCCCTGACGTGG 45770153 45770174 ATGG 45770149 45770152 72.73 12
SluD07 73 - CAGGCTGAGGCCCTGACGTGGA 45770152 45770173 TGGG 45770148 45770151 68.18 6
SluD08 74 + CCATCCACGTCAGGGCCTCAGC 45770149 45770170 CTGG 45770171 45770174 68.18 5
SluD09 75 - CCTGACGTGGATGGGCAAACTG 45770141 45770162 CAGG 45770137 45770140 59.09 2
SluD10 76 + CTGCAGTTTGCCCATCCACGTC 45770138 45770159 AGGG 45770160 45770163 59.09 3
SluD11 77 + CCTGCAGTTTGCCCATCCACGT 45770137 45770158 CAGG 45770159 45770162 59.09 3
SluD12 78 - CGTGGATGGGCAAACTGCAGGC 45770136 45770157 CTGG 45770132 45770135 63.64 7
SluD13 79 - GTGGATGGGCAAACTGCAGGCC 45770135 45770156 TGGG 45770131 45770134 63.64 31
SluD16 80 - CAGGCCTGGGAAGGCAGCAAGC 45770119 45770140 CGGG 45770115 45770118 68.18 40
SluD14 81 - ATGGGCAAACTGCAGGCCTGGG 45770131 45770152 AAGG 45770127 45770130 63.64 77
SluD15 82 - GCAGGCCTGGGAAGGCAGCAAG 45770120 45770141 CCGG 45770116 45770119 68.18 46
SluD17 83 + ACGGCCCGGCTTGCTGCCTTCC 45770111 45770132 CAGG 45770133 45770136 72.73 4
SluD18 84 + TGGAGGATGGAACACGGACGGC 45770094 45770115 CCGG 45770116 45770119 63.64 3
SluD19 85 + GTGCGTGGAGGATGGAACACGG 45770089 45770110 ACGG 45770111 45770114 63.64 0
SluD20 86 + GGGGGTGCGTGGAGGATGGAAC 45770085 45770106 ACGG 45770107 45770110 68.18 26
SluD21 87 + GATAGGTGGGGGTGCGTGGAGG 45770078 45770099 ATGG 45770100 45770103 68.18 29
SluD22 88 - CTCCACGCACCCCCACCTATCG 45770077 45770098 TTGG 45770073 45770076 68.18 1
SluD23 89 + CAACGATAGGTGGGGGTGCGTG 45770074 45770095 GAGG 45770096 45770099 63.64 0
SluD24 90 + AACCAACGATAGGTGGGGGTGC 45770071 45770092 GTGG 45770093 45770096 59.09 1
SluD25 91 + CTTTGCGAACCAACGATAGGTG 45770064 45770085 GGGG 45770086 45770089 50 1
SluD26 92 + ACTTTGCGAACCAACGATAGGT 45770063 45770084 GGGG 45770085 45770088 45.45 3
SluD27 93 + CACTTTGCGAACCAACGATAGG 45770062 45770083 TGGG 45770084 45770087 50 3
SluD28 94 + GCACTTTGCGAACCAACGATAG 45770061 45770082 GTGG 45770083 45770086 50 3
SluD29 95 + TTTGCACTTTGCGAACCAACGA 45770058 45770079 TAGG 45770080 45770083 45.45 2
SluD30 96 - TTCTTGTGCATGACGCCCTGCT 45770033 45770054 CTGG 45770029 45770032 54.55 5
SluD31 97 - TCTTGTGCATGACGCCCTGCTC 45770032 45770053 TGGG 45770028 45770031 59.09 3
SluD32 98 - CTTGTGCATGACGCCCTGCTCT 45770031 45770052 GGGG 45770027 45770030 59.09 6
SluD33 99 - GACGCCCTGCTCTGGGGAGCGT 45770022 45770043 CTGG 45770018 45770021 72.73 4
SluD34 100 + CGCGCCAGACGCTCCCCAGAGC 45770014 45770035 AGGG 45770036 45770039 77.27 7
SluD35 101 + TCGCGCCAGACGCTCCCCAGAG 45770013 45770034 CAGG 45770035 45770038 72.73 1
SluD36 102 - GGCGCGATCTCTGCCTGCTTAC 45769998 45770019 TCGG 45769994 45769997 63.64 1
SluD37 103 - GCGCGATCTCTGCCTGCTTACT 45769997 45770018 CGGG 45769993 45769996 59.09 1
SluD38 104 + AAAAGCAAATTTCCCGAGTAAG 45769981 45770002 CAGG 45770003 45770006 36.36 5
SluD39 105 - TGCTTTTGCCAAACCCGCTTTT 45769966 45769987 TCGG 45769962 45769965 45.45 2
SluD40 106 - GCTTTTGCCAAACCCGCTTTTT 45769965 45769986 CGGG 45769961 45769964 45.45 3
SluD41 107 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTTTC 45769964 45769985 GGGG 45769960 45769963 45.45 2
SluD42 108 + CGGGATCCCCGAAAAAGCGGGT 45769954 45769975 TTGG 45769976 45769979 63.64 2
SluD43 109 + GGGCGCGGGATCCCCGAAAAAG 45769949 45769970 CGGG 45769971 45769974 68.18 1
SluD44 110 + GGGGCGCGGGATCCCCGAAAAA 45769948 45769969 GCGG 45769970 45769973 68.18 1
SluD45 111 + AGCGCAAGTGAGGAGGGGGGCG 45769932 45769953 CGGG 45769954 45769957 72.73 14
SluD46 112 + CAGCGCAAGTGAGGAGGGGGGC 45769931 45769952 GCGG 45769953 45769956 72.73 13
SluD47 113 - CCCCTCCTCACTTGCGCTGCTC 45769928 45769949 TCGG 45769924 45769927 68.18 8
SluD48 114 + GAGAGCAGCGCAAGTGAGGAGG 45769926 45769947 GGGG 45769948 45769951 63.64 37
SluD49 115 + CGAGAGCAGCGCAAGTGAGGAG 45769925 45769946 GGGG 45769947 45769950 63.64 5
SluD50 116 + CCGAGAGCAGCGCAAGTGAGGA 45769924 45769945 GGGG 45769946 45769949 63.64 5
SluD51 117 + TCCGAGAGCAGCGCAAGTGAGG 45769923 45769944 AGGG 45769945 45769948 63.64 4
SluD52 118 + CTCCGAGAGCAGCGCAAGTGAG 45769922 45769943 GAGG 45769944 45769947 63.64 3
SluD53 119 + GGGCTCCGAGAGCAGCGCAAGT 45769919 45769940 GAGG 45769941 45769944 68.18 6
SluD54 120 - TGCGCTGCTCTCGGAGCCCCAG 45769916 45769937 CCGG 45769912 45769915 72.73 7
SluD55 121 - GCCCCAGCCGGCTCCGCCCGCT 45769901 45769922 TCGG 45769897 45769900 86.36 7
SluD56 122 - CCAGCCGGCTCCGCCCGCTTCG 45769898 45769919 GCGG 45769894 45769897 81.82 4
SluD57 123 + GCCGAAGCGGGCGGAGCCGGCT 45769896 45769917 GGGG 45769918 45769921 81.82 12
SluD58 124 + CGCCGAAGCGGGCGGAGCCGGC 45769895 45769916 TGGG 45769917 45769920 86.36 9
SluD59 125 + CCGCCGAAGCGGGCGGAGCCGG 45769894 45769915 CTGG 45769916 45769919 86.36 6
SluD60 126 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCGGT 45769893 45769914 TTGG 45769889 45769892 81.82 3
SluD61 127 + CAAACCGCCGAAGCGGGCGGAG 45769890 45769911 CCGG 45769912 45769915 72.73 0
SluD62 128 + AATATCCAAACCGCCGAAGCGG 45769884 45769905 GCGG 45769906 45769909 54.55 0
SluD63 129 + ATAAATATCCAAACCGCCGAAG 45769881 45769902 CGGG 45769903 45769906 40.91 2
SluD64 130 + AATAAATATCCAAACCGCCGAA 45769880 45769901 GCGG 45769902 45769905 36.36 1
SluD65 131 - ACCTCGTCCTCCGACTCGCTGA 45769857 45769878 CAGG 45769853 45769856 63.64 0
SluD66 132 + GCCTGTCAGCGAGTCGGAGGAC 45769852 45769873 GAGG 45769874 45769877 68.18 45
SluD67 133 - CCTCCGACTCGCTGACAGGCTA 45769850 45769871 CAGG 45769846 45769849 63.64 4
SluD68 134 + CCTGTAGCCTGTCAGCGAGTCG 45769846 45769867 GAGG 45769868 45769871 63.64 2
SluD69 135 + GGTCCTGTAGCCTGTCAGCGAG 45769843 45769864 TCGG 45769865 45769868 63.64 1
SluD70 136 - CCCAACAACCCCAATCCACGTT 45769821 45769842 TTGG 45769817 45769820 54.55 1
SluD71 137 + AAAACGTGGATTGGGGTTGTTG 45769819 45769840 GGGG 45769841 45769844 45.45 5
SluD72 138 + CAAAACGTGGATTGGGGTTGTT 45769818 45769839 GGGG 45769840 45769843 45.45 5
SluD73 139 + CCAAAACGTGGATTGGGGTTGT 45769817 45769838 TGGG 45769839 45769842 50 6
SluD74 140 + TCCAAAACGTGGATTGGGGTTG 45769816 45769837 TTGG 45769838 45769841 50 7
SluD75 141 + CAGTGCATCCAAAACGTGGATT 45769809 45769830 GGGG 45769831 45769834 45.45 6
SluD76 142 + TCAGTGCATCCAAAACGTGGAT 45769808 45769829 TGGG 45769830 45769833 45.45 4
SluD77 143 + CTCAGTGCATCCAAAACGTGGA 45769807 45769828 TTGG 45769829 45769832 50 3
SluD78 144 + GGGGTCTCAGTGCATCCAAAAC 45769802 45769823 GTGG 45769824 45769827 54.55 3
SluD79 145 - TGCACTGAGACCCCGACATTCC 45769794 45769815 TCGG 45769790 45769793 59.09 4
SluD80 146 + ACAATAAATACCGAGGAATGTC 45769780 45769801 GGGG 45769802 45769805 36.36 2
SluD81 147 + GACAATAAATACCGAGGAATGT 45769779 45769800 CGGG 45769801 45769804 36.36 4
SluD82 148 + AGACAATAAATACCGAGGAATG 45769778 45769799 TCGG 45769800 45769803 36.36 12
SluD83 149 + GTGGGGACAGACAATAAATACC 45769770 45769791 GAGG 45769792 45769795 45.45 13
SluD84 150 - GTATTTATTGTCTGTCCCCACC 45769769 45769790 TAGG 45769765 45769768 45.45 6
SluD85 151 + GTCGGGGGTGGGGGTCCTAGGT 45769750 45769771 GGGG 45769772 45769775 72.73 89
SluD86 152 + GGTCGGGGGTGGGGGTCCTAGG 45769749 45769770 TGGG 45769771 45769774 77.27 37
SluD87 153 + GGGTCGGGGGTGGGGGTCCTAG 45769748 45769769 GTGG 45769770 45769773 77.27 44
SluD88 154 + CGAGGGTCGGGGGTGGGGGTCC 45769745 45769766 TAGG 45769767 45769770 81.82 56
SluD89 155 + TTATTCGCGAGGGTCGGGGGTG 45769738 45769759 GGGG 45769760 45769763 63.64 4
SluD90 156 - CACCCCCGACCCTCGCGAATAA 45769738 45769759 AAGG 45769734 45769737 63.64 0
SluD91 157 + TTTATTCGCGAGGGTCGGGGGT 45769737 45769758 GGGG 45769759 45769762 59.09 3
SluD92 158 + TTTTATTCGCGAGGGTCGGGGG 45769736 45769757 TGGG 45769758 45769761 59.09 5
SluD93 159 + CTTTTATTCGCGAGGGTCGGGG 45769735 45769756 GTGG 45769757 45769760 59.09 2
SluD94 160 + GGCCTTTTATTCGCGAGGGTCG 45769732 45769753 GGGG 45769754 45769757 59.09 1
SluD95 161 + GGGCCTTTTATTCGCGAGGGTC 45769731 45769752 GGGG 45769753 45769756 59.09 4
SluD96 162 + AGGGCCTTTTATTCGCGAGGGT 45769730 45769751 CGGG 45769752 45769755 54.55 2
SluD97 163 + GAGGGCCTTTTATTCGCGAGGG 45769729 45769750 TCGG 45769751 45769754 59.09 1
SluD98 164 + GATGGAGGGCCTTTTATTCGCG 45769725 45769746 AGGG 45769747 45769750 54.55 1
SluD99 165 + AGATGGAGGGCCTTTTATTCGC 45769724 45769745 GAGG 45769746 45769749 50 2
SluD100 166 + GTCCAGAGCTTTGGGCAGATGG 45769708 45769729 AGGG 45769730 45769733 59.09 1
SluD101 167 AGTCCAGAGCTTTGGGCAGATG 45769707 45769728 GAGG 45769729 45769722 54.55 10
SluR1* 168 - gctgctgctgctgctgctgctg 45770208 45770229 ctgG 45770204 45770207 68.18 1932
SluR2* 169 - ctgctgctgctgctgctgctgc 45770207 45770228 tgGG 45770203 45770206 68.18 1644
SluR3* 170 - tgctgctgctgctgctgctgct 45770206 45770227 gGGG 45770202 45770205 63.64 1521
SluR4* 171 - gctgctgctgctgctgctgctg 45770205 45770226 GGGG 45770201 45770204 68.18 1932
SluR5* 172 - ctgctgctgctgctgctgctgG 45770204 45770225 GGGG 45770200 45770203 68.18 1352
* 由於預測的脫靶位點數目大而不選用於針對DM1患者原代肌母細胞的評價
表 1B ：人類 DMPK 基因之 3' UTR 區域中具有 PAM 序列的例示性 SluCas9 sgRNA
SEQ ID NO 股 嚮導序列
1 - AACCCTAGAACTGTCTTCGACT
201 - AACCCTAGAACTGTCTTCGAC
202 - AACCCTAGAACTGTCTTCGA
2 - ACCCTAGAACTGTCTTCGACTC
203 - ACCCTAGAACTGTCTTCGACT
204 - ACCCTAGAACTGTCTTCGAC
3 - CCCTAGAACTGTCTTCGACTCC
205 - CCCTAGAACTGTCTTCGACTC
206 - CCCTAGAACTGTCTTCGACT
4 + CCCCGGAGTCGAAGACAGTTCT
207 + CCCGGAGTCGAAGACAGTTCT
208 + CCGGAGTCGAAGACAGTTCT
5 + GCCCCGGAGTCGAAGACAGTTC
209 + CCCCGGAGTCGAAGACAGTTC
210 + CCCGGAGTCGAAGACAGTTC
6 - TGTCTTCGACTCCGGGGCCCCG
211 - TGTCTTCGACTCCGGGGCCCC
212 - TGTCTTCGACTCCGGGGCCC
7 + CACTCAGTCTTCCAACGGGGCC
213 + ACTCAGTCTTCCAACGGGGCC
214 + CTCAGTCTTCCAACGGGGCC
8 - GCCCCGTTGGAAGACTGAGTGC
215 - GCCCCGTTGGAAGACTGAGTG
216 - GCCCCGTTGGAAGACTGAGT
9 - CCCCGTTGGAAGACTGAGTGCC
217 - CCCCGTTGGAAGACTGAGTGC
218 - CCCCGTTGGAAGACTGAGTG
10 - CCCGTTGGAAGACTGAGTGCCC
219 - CCCGTTGGAAGACTGAGTGCC
220 - CCCGTTGGAAGACTGAGTGC
11 + CCCGGGCACTCAGTCTTCCAAC
221 + CCGGGCACTCAGTCTTCCAAC
222 + CGGGCACTCAGTCTTCCAAC
12 + CCCCGGGCACTCAGTCTTCCAA
223 + CCCGGGCACTCAGTCTTCCAA
224 + CCGGGCACTCAGTCTTCCAA
13 + GCCCCGGGCACTCAGTCTTCCA
225 + CCCCGGGCACTCAGTCTTCCA
226 + CCCGGGCACTCAGTCTTCCA
14 - TGGAAGACTGAGTGCCCGGGGC
227 - TGGAAGACTGAGTGCCCGGGG
228 - TGGAAGACTGAGTGCCCGGG
15 + GCGCGGCTTCTGTGCCGTGCCC
229 + CGCGGCTTCTGTGCCGTGCCC
230 + GCGGCTTCTGTGCCGTGCCC
16 + GGCGCGGCTTCTGTGCCGTGCC
231 + GCGCGGCTTCTGTGCCGTGCC
232 + CGCGGCTTCTGTGCCGTGCC
17 + TGTGAACTGGCAGGCGGTGGGC
233 + GTGAACTGGCAGGCGGTGGGC
234 + TGAACTGGCAGGCGGTGGGC
18 + GCGGTTGTGAACTGGCAGGCGG
235 + CGGTTGTGAACTGGCAGGCGG
236 + GGTTGTGAACTGGCAGGCGG
19 + AGCGGTTGTGAACTGGCAGGCG
237 + GCGGTTGTGAACTGGCAGGCG
238 + CGGTTGTGAACTGGCAGGCG
20 + CGGAGCGGTTGTGAACTGGCAG
239 + GGAGCGGTTGTGAACTGGCAG
240 + GAGCGGTTGTGAACTGGCAG
21 + GCTCGGAGCGGTTGTGAACTGG
241 + CTCGGAGCGGTTGTGAACTGG
242 + TCGGAGCGGTTGTGAACTGG
22 - CCAGTTCACAACCGCTCCGAGC
243 - CCAGTTCACAACCGCTCCGAG
244 - CCAGTTCACAACCGCTCCGA
23 - CAGTTCACAACCGCTCCGAGCG
245 - CAGTTCACAACCGCTCCGAGC
246 - CAGTTCACAACCGCTCCGAG
24 + CCACGCTCGGAGCGGTTGTGAA
247 + CACGCTCGGAGCGGTTGTGAA
248 + ACGCTCGGAGCGGTTGTGAA
25 + TGGGCGGAGACCCACGCTCGGA
249 + GGGCGGAGACCCACGCTCGGA
250 + GGCGGAGACCCACGCTCGGA
26 + GGAGCTGGGCGGAGACCCACGC
251 + GAGCTGGGCGGAGACCCACGC
252 + AGCTGGGCGGAGACCCACGC
27 - CGCCCAGCTCCAGTCCTGTGAT
253 - CGCCCAGCTCCAGTCCTGTGA
254 - CGCCCAGCTCCAGTCCTGTG
28 - GCCCAGCTCCAGTCCTGTGATC
255 - GCCCAGCTCCAGTCCTGTGAT
256 - GCCCAGCTCCAGTCCTGTGA
29 + CGGATCACAGGACTGGAGCTGG
257 + GGATCACAGGACTGGAGCTGG
258 + GATCACAGGACTGGAGCTGG
30 + GCCCGGATCACAGGACTGGAGC
259 + CCCGGATCACAGGACTGGAGC
260 + CCGGATCACAGGACTGGAGC
31 + GGCCCGGATCACAGGACTGGAG
261 + GCCCGGATCACAGGACTGGAG
262 + CCCGGATCACAGGACTGGAG
32 + GGGGCGGGCCCGGATCACAGGA
263 + GGGCGGGCCCGGATCACAGGA
264 + GGCGGGCCCGGATCACAGGA
33 - TGTGATCCGGGCCCGCCCCCTA
265 - TGTGATCCGGGCCCGCCCCCT
266 - TGTGATCCGGGCCCGCCCCC
34 + GCTAGGGGGCGGGCCCGGATCA
267 + CTAGGGGGCGGGCCCGGATCA
268 + TAGGGGGCGGGCCCGGATCA
35 - ATCCGGGCCCGCCCCCTAGCgg
269 - ATCCGGGCCCGCCCCCTAGCg
270 - ATCCGGGCCCGCCCCCTAGC
36 - TCCGGGCCCGCCCCCTAGCggc
271 - TCCGGGCCCGCCCCCTAGCgg
272 - TCCGGGCCCGCCCCCTAGCg
37 - CCGGGCCCGCCCCCTAGCggcc
273 - CCGGGCCCGCCCCCTAGCggc
274 - CCGGGCCCGCCCCCTAGCgg
38 - GGCCCGCCCCCTAGCggccggg
275 - GGCCCGCCCCCTAGCggccgg
276 - GGCCCGCCCCCTAGCggccg
39 + ccccggccGCTAGGGGGCGGGC
277 + cccggccGCTAGGGGGCGGGC
278 + ccggccGCTAGGGGGCGGGC
40 - GCCCGCCCCCTAGCggccgggg
279 - GCCCGCCCCCTAGCggccggg
280 - GCCCGCCCCCTAGCggccgg
41 - CGCCCCCTAGCggccggggagg
281 - CGCCCCCTAGCggccggggag
282 - CGCCCCCTAGCggccgggga
42 - GCCCCCTAGCggccggggaggg
283 - GCCCCCTAGCggccggggagg
284 - GCCCCCTAGCggccggggag
43 + tccctccccggccGCTAGGGGG
285 + ccctccccggccGCTAGGGGG
286 + cctccccggccGCTAGGGGG
44 - CCCCCTAGCggccggggaggga
287 - CCCCCTAGCggccggggaggg
288 - CCCCCTAGCggccggggagg
45 + ctccctccccggccGCTAGGGG
289 + tccctccccggccGCTAGGGG
290 + ccctccccggccGCTAGGGG
46 + cccctccctccccggccGCTAG
291 + ccctccctccccggccGCTAG
292 + cctccctccccggccGCTAG
47 - CTAGCggccggggagggagggg
293 - CTAGCggccggggagggaggg
294 - CTAGCggccggggagggagg
48 + gcccctccctccccggccGCTA
295 + cccctccctccccggccGCTA
296 + ccctccctccccggccGCTA
49 - TAGCggccggggagggaggggc
297 - TAGCggccggggagggagggg
298 - TAGCggccggggagggaggg
50 + ggcccctccctccccggccGCT
299 + gcccctccctccccggccGCT
300 + cccctccctccccggccGCT
51 + cggcccctccctccccggccGC
301 + ggcccctccctccccggccGC
302 + gcccctccctccccggccGC
52 - cggggagggaggggccgggtcc
303 - cggggagggaggggccgggtc
304 - cggggagggaggggccgggt
53 + cgcggacccggcccctccctcc
305 + gcggacccggcccctccctcc
306 + cggacccggcccctccctcc
54 - gagggaggggccgggtccgcgg
307 - gagggaggggccgggtccgcg
308 - gagggaggggccgggtccgc
55 - gggccgggtccgcggccggcga
309 - gggccgggtccgcggccggcg
310 - gggccgggtccgcggccggc
56 - ggccgggtccgcggccggcgaa
311 - ggccgggtccgcggccggcga
312 - ggccgggtccgcggccggcg
57 - gccgggtccgcggccggcgaac
313 - gccgggtccgcggccggcgaa
314 - gccgggtccgcggccggcga
58 + gccccgttcgccggccgcggac
315 + ccccgttcgccggccgcggac
316 + cccgttcgccggccgcggac
59 - cgcggccggcgaacggggcTCG
317 - cgcggccggcgaacggggcTC
318 - cgcggccggcgaacggggcT
60 - gcggccggcgaacggggcTCGA
319 - gcggccggcgaacggggcTCG
320 - gcggccggcgaacggggcTC
61 + CTTCGAgccccgttcgccggcc
321 + TTCGAgccccgttcgccggcc
322 + TCGAgccccgttcgccggcc
62 + AGGACCCTTCGAgccccgttcg
323 + GGACCCTTCGAgccccgttcg
324 + GACCCTTCGAgccccgttcg
63 - ggggcTCGAAGGGTCCTTGTAG
325 - ggggcTCGAAGGGTCCTTGTA
326 - ggggcTCGAAGGGTCCTTGT
64 - gggcTCGAAGGGTCCTTGTAGC
327 - gggcTCGAAGGGTCCTTGTAG
328 - gggcTCGAAGGGTCCTTGTA
65 + cagcagcagcaTTCCCGGCTAC
329 + agcagcagcaTTCCCGGCTAC
330 + gcagcagcaTTCCCGGCTAC
66 + agcagcagcagcagcagcaTTC
331 + gcagcagcagcagcagcaTTC
332 + cagcagcagcagcagcaTTC
67 - GATCACAGACCATTTCTTTCTT
333 - GATCACAGACCATTTCTTTCT
334 - GATCACAGACCATTTCTTTC
68 - CAGACCATTTCTTTCTTTCGGC
335 - CAGACCATTTCTTTCTTTCGG
336 - CAGACCATTTCTTTCTTTCG
69 - ATTTCTTTCTTTCGGCCAGGCT
337 - ATTTCTTTCTTTCGGCCAGGC
338 - ATTTCTTTCTTTCGGCCAGG
70 + TCAGCCTGGCCGAAAGAAAGAA
339 + CAGCCTGGCCGAAAGAAAGAA
340 + AGCCTGGCCGAAAGAAAGAA
71 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTGAC
341 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTGA
342 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTG
72 - CCAGGCTGAGGCCCTGACGTGG
343 - CCAGGCTGAGGCCCTGACGTG
344 - CCAGGCTGAGGCCCTGACGT
73 - CAGGCTGAGGCCCTGACGTGGA
345 - CAGGCTGAGGCCCTGACGTGG
346 - CAGGCTGAGGCCCTGACGTG
74 + CCATCCACGTCAGGGCCTCAGC
347 + CATCCACGTCAGGGCCTCAGC
348 + ATCCACGTCAGGGCCTCAGC
75 - CCTGACGTGGATGGGCAAACTG
349 - CCTGACGTGGATGGGCAAACT
350 - CCTGACGTGGATGGGCAAAC
76 + CTGCAGTTTGCCCATCCACGTC
351 + TGCAGTTTGCCCATCCACGTC
173 + GCAGTTTGCCCATCCACGTC
77 + CCTGCAGTTTGCCCATCCACGT
352 + CTGCAGTTTGCCCATCCACGT
353 + TGCAGTTTGCCCATCCACGT
78 - CGTGGATGGGCAAACTGCAGGC
354 - CGTGGATGGGCAAACTGCAGG
355 - CGTGGATGGGCAAACTGCAG
79 - GTGGATGGGCAAACTGCAGGCC
356 - GTGGATGGGCAAACTGCAGGC
357 - GTGGATGGGCAAACTGCAGG
80 - CAGGCCTGGGAAGGCAGCAAGC
358 - CAGGCCTGGGAAGGCAGCAAG
359 - CAGGCCTGGGAAGGCAGCAA
81 - ATGGGCAAACTGCAGGCCTGGG
360 - ATGGGCAAACTGCAGGCCTGG
361 - ATGGGCAAACTGCAGGCCTG
82 - GCAGGCCTGGGAAGGCAGCAAG
362 - GCAGGCCTGGGAAGGCAGCAA
363 - GCAGGCCTGGGAAGGCAGCA
83 + ACGGCCCGGCTTGCTGCCTTCC
364 + CGGCCCGGCTTGCTGCCTTCC
365 + GGCCCGGCTTGCTGCCTTCC
84 + TGGAGGATGGAACACGGACGGC
366 + GGAGGATGGAACACGGACGGC
367 + GAGGATGGAACACGGACGGC
85 + GTGCGTGGAGGATGGAACACGG
368 + TGCGTGGAGGATGGAACACGG
369 + GCGTGGAGGATGGAACACGG
86 + GGGGGTGCGTGGAGGATGGAAC
370 + GGGGTGCGTGGAGGATGGAAC
371 + GGGTGCGTGGAGGATGGAAC
87 + GATAGGTGGGGGTGCGTGGAGG
372 + ATAGGTGGGGGTGCGTGGAGG
373 + TAGGTGGGGGTGCGTGGAGG
88 - CTCCACGCACCCCCACCTATCG
374 - CTCCACGCACCCCCACCTATC
375 - CTCCACGCACCCCCACCTAT
89 + CAACGATAGGTGGGGGTGCGTG
376 + AACGATAGGTGGGGGTGCGTG
377 + ACGATAGGTGGGGGTGCGTG
90 + AACCAACGATAGGTGGGGGTGC
378 + ACCAACGATAGGTGGGGGTGC
379 + CCAACGATAGGTGGGGGTGC
91 + CTTTGCGAACCAACGATAGGTG
380 + TTTGCGAACCAACGATAGGTG
381 + TTGCGAACCAACGATAGGTG
92 + ACTTTGCGAACCAACGATAGGT
382 + CTTTGCGAACCAACGATAGGT
383 + TTTGCGAACCAACGATAGGT
93 + CACTTTGCGAACCAACGATAGG
384 + ACTTTGCGAACCAACGATAGG
385 + CTTTGCGAACCAACGATAGG
94 + GCACTTTGCGAACCAACGATAG
386 + CACTTTGCGAACCAACGATAG
387 + ACTTTGCGAACCAACGATAG
95 + TTTGCACTTTGCGAACCAACGA
388 + TTGCACTTTGCGAACCAACGA
389 + TGCACTTTGCGAACCAACGA
96 - TTCTTGTGCATGACGCCCTGCT
390 - TTCTTGTGCATGACGCCCTGC
391 - TTCTTGTGCATGACGCCCTG
97 - TCTTGTGCATGACGCCCTGCTC
392 - TCTTGTGCATGACGCCCTGCT
393 - TCTTGTGCATGACGCCCTGC
98 - CTTGTGCATGACGCCCTGCTCT
394 - CTTGTGCATGACGCCCTGCTC
395 - CTTGTGCATGACGCCCTGCT
99 - GACGCCCTGCTCTGGGGAGCGT
396 - GACGCCCTGCTCTGGGGAGCG
397 - GACGCCCTGCTCTGGGGAGC
100 + CGCGCCAGACGCTCCCCAGAGC
398 + GCGCCAGACGCTCCCCAGAGC
399 + CGCCAGACGCTCCCCAGAGC
101 + TCGCGCCAGACGCTCCCCAGAG
400 + CGCGCCAGACGCTCCCCAGAG
401 + GCGCCAGACGCTCCCCAGAG
102 - GGCGCGATCTCTGCCTGCTTAC
402 - GGCGCGATCTCTGCCTGCTTA
403 - GGCGCGATCTCTGCCTGCTT
103 - GCGCGATCTCTGCCTGCTTACT
404 - GCGCGATCTCTGCCTGCTTAC
405 - GCGCGATCTCTGCCTGCTTA
104 + AAAAGCAAATTTCCCGAGTAAG
406 + AAAGCAAATTTCCCGAGTAAG
407 + AAGCAAATTTCCCGAGTAAG
105 - TGCTTTTGCCAAACCCGCTTTT
408 - TGCTTTTGCCAAACCCGCTTT
409 - TGCTTTTGCCAAACCCGCTT
106 - GCTTTTGCCAAACCCGCTTTTT
410 - GCTTTTGCCAAACCCGCTTTT
411 - GCTTTTGCCAAACCCGCTTT
107 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTTTC
412 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTTT
413 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTT
108 + CGGGATCCCCGAAAAAGCGGGT
414 + GGGATCCCCGAAAAAGCGGGT
415 + GGATCCCCGAAAAAGCGGGT
109 + GGGCGCGGGATCCCCGAAAAAG
416 + GGCGCGGGATCCCCGAAAAAG
417 + GCGCGGGATCCCCGAAAAAG
110 + GGGGCGCGGGATCCCCGAAAAA
418 + GGGCGCGGGATCCCCGAAAAA
419 + GGCGCGGGATCCCCGAAAAA
111 + AGCGCAAGTGAGGAGGGGGGCG
420 + GCGCAAGTGAGGAGGGGGGCG
421 + CGCAAGTGAGGAGGGGGGCG
112 + CAGCGCAAGTGAGGAGGGGGGC
422 + AGCGCAAGTGAGGAGGGGGGC
423 + GCGCAAGTGAGGAGGGGGGC
113 - CCCCTCCTCACTTGCGCTGCTC
424 - CCCCTCCTCACTTGCGCTGCT
425 - CCCCTCCTCACTTGCGCTGC
114 + GAGAGCAGCGCAAGTGAGGAGG
426 + AGAGCAGCGCAAGTGAGGAGG
427 + GAGCAGCGCAAGTGAGGAGG
115 + CGAGAGCAGCGCAAGTGAGGAG
428 + GAGAGCAGCGCAAGTGAGGAG
429 + AGAGCAGCGCAAGTGAGGAG
116 + CCGAGAGCAGCGCAAGTGAGGA
430 + CGAGAGCAGCGCAAGTGAGGA
431 + GAGAGCAGCGCAAGTGAGGA
117 + TCCGAGAGCAGCGCAAGTGAGG
432 + CCGAGAGCAGCGCAAGTGAGG
433 + CGAGAGCAGCGCAAGTGAGG
118 + CTCCGAGAGCAGCGCAAGTGAG
434 + TCCGAGAGCAGCGCAAGTGAG
435 + CCGAGAGCAGCGCAAGTGAG
119 + GGGCTCCGAGAGCAGCGCAAGT
436 + GGCTCCGAGAGCAGCGCAAGT
437 + GCTCCGAGAGCAGCGCAAGT
120 - TGCGCTGCTCTCGGAGCCCCAG
438 - TGCGCTGCTCTCGGAGCCCCA
439 - TGCGCTGCTCTCGGAGCCCC
121 - GCCCCAGCCGGCTCCGCCCGCT
440 - GCCCCAGCCGGCTCCGCCCGC
441 - GCCCCAGCCGGCTCCGCCCG
122 - CCAGCCGGCTCCGCCCGCTTCG
442 - CCAGCCGGCTCCGCCCGCTTC
443 - CCAGCCGGCTCCGCCCGCTT
123 + GCCGAAGCGGGCGGAGCCGGCT
444 + CCGAAGCGGGCGGAGCCGGCT
445 + CGAAGCGGGCGGAGCCGGCT
124 + CGCCGAAGCGGGCGGAGCCGGC
446 + GCCGAAGCGGGCGGAGCCGGC
447 + CCGAAGCGGGCGGAGCCGGC
125 + CCGCCGAAGCGGGCGGAGCCGG
448 + CGCCGAAGCGGGCGGAGCCGG
449 + GCCGAAGCGGGCGGAGCCGG
126 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCGGT
450 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCGG
451 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCG
127 + CAAACCGCCGAAGCGGGCGGAG
452 + AAACCGCCGAAGCGGGCGGAG
453 + AACCGCCGAAGCGGGCGGAG
128 + AATATCCAAACCGCCGAAGCGG
454 + ATATCCAAACCGCCGAAGCGG
455 + TATCCAAACCGCCGAAGCGG
129 + ATAAATATCCAAACCGCCGAAG
456 + TAAATATCCAAACCGCCGAAG
457 + AAATATCCAAACCGCCGAAG
130 + AATAAATATCCAAACCGCCGAA
458 + ATAAATATCCAAACCGCCGAA
459 + TAAATATCCAAACCGCCGAA
131 - ACCTCGTCCTCCGACTCGCTGA
460 - ACCTCGTCCTCCGACTCGCTG
461 - ACCTCGTCCTCCGACTCGCT
132 + GCCTGTCAGCGAGTCGGAGGAC
462 + CCTGTCAGCGAGTCGGAGGAC
463 + CTGTCAGCGAGTCGGAGGAC
133 - CCTCCGACTCGCTGACAGGCTA
464 - CCTCCGACTCGCTGACAGGCT
465 - CCTCCGACTCGCTGACAGGC
134 + CCTGTAGCCTGTCAGCGAGTCG
466 + CTGTAGCCTGTCAGCGAGTCG
467 + TGTAGCCTGTCAGCGAGTCG
135 + GGTCCTGTAGCCTGTCAGCGAG
468 + GTCCTGTAGCCTGTCAGCGAG
469 + TCCTGTAGCCTGTCAGCGAG
136 - CCCAACAACCCCAATCCACGTT
470 - CCCAACAACCCCAATCCACGT
471 - CCCAACAACCCCAATCCACG
137 + AAAACGTGGATTGGGGTTGTTG
472 + AAACGTGGATTGGGGTTGTTG
473 + AACGTGGATTGGGGTTGTTG
138 + CAAAACGTGGATTGGGGTTGTT
474 + AAAACGTGGATTGGGGTTGTT
475 + AAACGTGGATTGGGGTTGTT
139 + CCAAAACGTGGATTGGGGTTGT
476 + CAAAACGTGGATTGGGGTTGT
477 + AAAACGTGGATTGGGGTTGT
140 + TCCAAAACGTGGATTGGGGTTG
478 + CCAAAACGTGGATTGGGGTTG
479 + CAAAACGTGGATTGGGGTTG
141 + CAGTGCATCCAAAACGTGGATT
480 + AGTGCATCCAAAACGTGGATT
481 + GTGCATCCAAAACGTGGATT
142 + TCAGTGCATCCAAAACGTGGAT
482 + CAGTGCATCCAAAACGTGGAT
483 + AGTGCATCCAAAACGTGGAT
143 + CTCAGTGCATCCAAAACGTGGA
484 + TCAGTGCATCCAAAACGTGGA
485 + CAGTGCATCCAAAACGTGGA
144 + GGGGTCTCAGTGCATCCAAAAC
486 + GGGTCTCAGTGCATCCAAAAC
487 + GGTCTCAGTGCATCCAAAAC
145 - TGCACTGAGACCCCGACATTCC
488 - TGCACTGAGACCCCGACATTC
489 - TGCACTGAGACCCCGACATT
146 + ACAATAAATACCGAGGAATGTC
490 + CAATAAATACCGAGGAATGTC
491 + AATAAATACCGAGGAATGTC
147 + GACAATAAATACCGAGGAATGT
492 + ACAATAAATACCGAGGAATGT
493 + CAATAAATACCGAGGAATGT
148 + AGACAATAAATACCGAGGAATG
494 + GACAATAAATACCGAGGAATG
495 + ACAATAAATACCGAGGAATG
149 + GTGGGGACAGACAATAAATACC
496 + TGGGGACAGACAATAAATACC
497 + GGGGACAGACAATAAATACC
150 - GTATTTATTGTCTGTCCCCACC
498 - GTATTTATTGTCTGTCCCCAC
499 - GTATTTATTGTCTGTCCCCA
151 + GTCGGGGGTGGGGGTCCTAGGT
500 + TCGGGGGTGGGGGTCCTAGGT
501 + CGGGGGTGGGGGTCCTAGGT
152 + GGTCGGGGGTGGGGGTCCTAGG
502 + GTCGGGGGTGGGGGTCCTAGG
503 + TCGGGGGTGGGGGTCCTAGG
153 + GGGTCGGGGGTGGGGGTCCTAG
504 + GGTCGGGGGTGGGGGTCCTAG
505 + GTCGGGGGTGGGGGTCCTAG
154 + CGAGGGTCGGGGGTGGGGGTCC
506 + GAGGGTCGGGGGTGGGGGTCC
507 + AGGGTCGGGGGTGGGGGTCC
155 + TTATTCGCGAGGGTCGGGGGTG
508 + TATTCGCGAGGGTCGGGGGTG
509 + ATTCGCGAGGGTCGGGGGTG
156 - CACCCCCGACCCTCGCGAATAA
510 - CACCCCCGACCCTCGCGAATA
511 - CACCCCCGACCCTCGCGAAT
157 + TTTATTCGCGAGGGTCGGGGGT
512 + TTATTCGCGAGGGTCGGGGGT
513 + TATTCGCGAGGGTCGGGGGT
158 + TTTTATTCGCGAGGGTCGGGGG
514 + TTTATTCGCGAGGGTCGGGGG
515 + TTATTCGCGAGGGTCGGGGG
159 + CTTTTATTCGCGAGGGTCGGGG
516 + TTTTATTCGCGAGGGTCGGGG
517 + TTTATTCGCGAGGGTCGGGG
160 + GGCCTTTTATTCGCGAGGGTCG
518 + GCCTTTTATTCGCGAGGGTCG
519 + CCTTTTATTCGCGAGGGTCG
161 + GGGCCTTTTATTCGCGAGGGTC
520 + GGCCTTTTATTCGCGAGGGTC
521 + GCCTTTTATTCGCGAGGGTC
162 + AGGGCCTTTTATTCGCGAGGGT
522 + GGGCCTTTTATTCGCGAGGGT
523 + GGCCTTTTATTCGCGAGGGT
163 + GAGGGCCTTTTATTCGCGAGGG
524 + AGGGCCTTTTATTCGCGAGGG
525 + GGGCCTTTTATTCGCGAGGG
164 + GATGGAGGGCCTTTTATTCGCG
526 + ATGGAGGGCCTTTTATTCGCG
527 + TGGAGGGCCTTTTATTCGCG
165 + AGATGGAGGGCCTTTTATTCGC
528 + GATGGAGGGCCTTTTATTCGC
529 + ATGGAGGGCCTTTTATTCGC
166 + GTCCAGAGCTTTGGGCAGATGG
530 + TCCAGAGCTTTGGGCAGATGG
531 + CCAGAGCTTTGGGCAGATGG
2. 電腦模擬脫靶評估
基於與hg38人類參考基因體的序列相似性，用電腦預測各sgRNA的脫靶位點( 表 1A)，具體而言，鑑別出具有PAM序列且相對於原間隔子序列具有至多3個錯配或至多2個錯配及1個DNA/RNA隆突的任何位點。 3. 基因體 DNA 提取、 PCR 擴增及 TapeStation
使用Kingfisher Flex純化系統(Thermal Fisher)，依循製造商說明書，在96孔格式中分離出DM1肌母細胞的基因體DNA。使用GoTaq綠色預混液(Promega)及側接3' UTR區域的PCR引子來擴增DMPK 3' UTR區域。在一些實施例中，可使用的正向引子序列為CGCTAGGAAGCAGCCAATGA (SEQ ID NO: 532)，且可使用的反向引子序列為TAGCTCCTCCCAGACCTTCG (SEQ ID NO: 533)。利用以下循環參數執行擴增：1個循環：95℃下歷時2分鐘；40個循環：95℃下歷時30秒、63℃下歷時30秒及72℃下歷時90秒；1個循環：72℃下歷時5分鐘。僅野生型對偶基因藉由PCR反應擴增。在具有高靈敏度D5000 ScreenTape的TapeStation系統(Agilent Technologies)上分析PCR產物。 4. 桑格定序 (Sanger sequencing) 及 ICE 分析
純化PCR產物且藉由桑格定序法定序。在一些實施例中，定序引子UTRsF3 (AATGACGAGTTCGGACGG；(SEQ ID NO: 534))可以用於上游sgRNA的定序，且反向PCR引子(TAGCTCCTCCCAGACCTTCG；(SEQ ID NO: 533))可以用於下游sgRNA的定序。利用ICE分析算法(Synthego)以及獲自桑格定序的層析圖檔案來估算插入缺失值。 5. 原代肌母細胞培養
自Cook MyoSite獲得原代健康肌母細胞(P01431-18F)及DM1患者肌母細胞(03001-32F)。肌母細胞於肌母細胞生長培養基中培養，該生長培養基由肌強直性基礎培養基(Cook MyoSite, MB-2222)及肌強直性生長增補劑(Cook MyoSite, MS-3333)組成。核轉染之前的三天，使用EasySep人類CD56正向選擇套組II (StemCell Tech, 17855)，依循製造商說明書進一步純化人類原代肌母細胞，且接著在肌母細胞生長培養基中維持直至核轉染。 6.  RNP 製備
使用重組SluCas9蛋白與經化學修飾之sgRNA，以1:3比率(蛋白質:sgRNA)組裝RNP。對於單切篩選而言，在P5原代細胞核轉染溶液(Lonza)中，用30 pmol SluCas9及90 pmol sgRNA組裝RNP複合物。在室溫下培育20分鐘之後，將10 µL RNP複合物與再懸浮於10 µL P5核轉染溶液中的二十萬個原代肌母細胞混合。對於雙切篩選而言，在5 µL P5核轉染溶液中，用20 pmol SluCas9蛋白及60 pmol sgRNA首先組裝個別sgRNA的RNP複合物。在室溫下培育20分鐘之後，將兩種RNP複合物(一種含有上游sgRNA且一種含有下游sgRNA)以1:1比率混合且接著進一步與再懸浮於10 µL P5核轉染溶液中的二十萬個原代肌母細胞混合。 7.  RNP 核轉染至原代 DM1 肌母細胞中
使用核轉染儀96孔穿梭系統(Lonza)，利用核轉染程式CM138將SluCa9/sgRNA RNP遞送至DM1患者原代肌母細胞中。核轉染之後，將來自核轉染穿梭系統各孔的肌母細胞分離至經基質膠塗佈之96孔細胞培養盤(Greiner, 655090)的六個孔中。前三個孔用DMSO處理48小時，隨後更換成新鮮的肌母細胞生長培養基，且其他三個孔用3 µM DNA-PKi化合物6處理48小時，隨後更換成新鮮的肌母細胞生長培養基。核轉染後的第72小時，使用Kingfisher Flex純化系統(Thermal Fisher)收集兩個孔的經DMSO處理之肌母細胞及兩個孔的經DNA-PKi處理之各肌母細胞(各經核轉染)用於基因體DNA提取，而一個孔的經DMSO處理之肌母細胞及一個孔的經DNA-PKi處理之肌母細胞藉由FISH染色進行RNA病灶染色。 8.  ddPCR
使用線上引子設計軟體Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)設計ddPCR的引子及探針。在一些實施例中，使用兩組目標引子/探針偵測CTG重複序列切除，且使用參考引子/探針組擴增位於人類 DMPK基因之外顯子1中的區域且其充當目標組的參考對照。可能ddPCR引子及探針序列的實例列於 表 2中。24 µL ddPCR反應物由以下組成：12 µL探針超混合液(無dUTP)(Bio-Rad Laboratories)、1 µL參考引子混合液(21.6 µM)、1 µL參考探針(6 µM)、1 µL目標引子混合液(21.6 µM)、1 µL目標探針(6 µM)及8 µL樣品基因體DNA。使用探針油，用QX200微滴產生器(Bio-Rad Laboratories)產生微滴。將微滴轉移至96孔PCR盤中，密封且在C1000深孔熱循環儀(Bio-Rad Laboratories)中依據以下循環方案循環：1個循環：95℃下歷時10分鐘；40個循環：94℃下歷時30秒及58℃下歷時1分鐘；1個循環：98℃下歷時10分鐘(用於酶不活化)。接著轉移循環的培養盤且使用Bio-Rad QX200微滴讀取器(Bio-Rad Laboratories)在FAM及HEX通道中讀取。藉由Bio-Rad QuantaSoft Pro軟體執行ddPCR分析。 表 2 ：信號丟失 ddPCR 分析用的引子及探針序列
ddPCR 組 寡核苷酸類型 名稱 序列 (5 ' 至 3 ' )
目標_下游 正向引子 UTRF1 GGGGATCACAGACCATTTCT (SEQ ID NO: 535)
反向引子 UTRR14 TGGAGGATGGAACACGGAC (SEQ ID NO: 536)
探針 UTRP2-FAM TTCTTTCGGCCAGGCTGAGGCCCT (SEQ ID NO: 537)
目標_上游 正向引子 UpExcisionF CTAGCGGCCGGGGAG (SEQ ID NO: 538)
反向引子 UpExcisionR AGCAGCATTCCCGGCTA (SEQ ID NO: 539)
探針 UpExcisionP-FAM CGAACGGGGCTCGAAGGGTCCTTG (SEQ ID NO: 540)
參考 正向引子 DMPKF8 GGATATGTGACCATGCTACC (SEQ ID NO: 541)
反向引子 DMPKR7 GGGTTGTATCCAGTACCTCT (SEQ ID NO: 542)
探針 DMPKP6-HEX TGTCCTGTTCCTTCCCCCAGCCCCA (SEQ ID NO: 543)
9.  RNA 病灶的 FISH 染色
原代肌母細胞用4%多聚甲醛(PFA)固定15分鐘且在室溫下用1x PBS洗滌五次，每次10分鐘。染色之前，細胞在室溫下用含有0.5% triton X-100的1x PBS滲透5分鐘，且接著在室溫下用30%甲醯胺及2x生理鹽水-檸檬酸鈉(SSC)混合物洗滌10分鐘。細胞接著在80℃下用1 ng/µL於30%甲醯胺中稀釋的Cy3-PNA(CAG) 5探針(PNA Bio, F5001)、2x SSC、2 µg/mL BSA、66 µg/mL酵母tRNA及2 mM釩醯基複合物染色15分鐘。探針染色之後，細胞接著在42℃下用30%甲醯胺及2x SSC混合物洗滌30分鐘，接著在37℃下用30%甲醯胺及2x SSC混合物洗滌30分鐘，且接著在室溫下用1x SSC溶液洗滌10分鐘，且最後在室溫下用1x PBS洗滌10分鐘。細胞接著在4℃用1%牛血清白蛋白(BSA)中稀釋的抗MBNL1抗體(Santa Cruz, 3A4)染色隔夜，且在室溫下用1x PBS洗滌兩次，每次10分鐘。細胞接著與1% BSA中稀釋的二級抗體山羊抗兔Alexa 647 (Thermo Fisher, A32728)一起在室溫下培育1小時，且在室溫下用1x PBS洗滌兩次，每次10分鐘。接著，細胞用0.1 mg/ml Hoechst溶液(Thermo Fisher, H3569)染色5分鐘，且用1x PBS洗滌一次歷時5分鐘。抽出PBS且向各孔中添加新鮮的100 µl新鮮PBS。使用ImageXpress微共焦高內涵成像系統(Molecular Devices)完成影像的高通量擷取。使用定製的MetaXpress程式分析模組(Molecular Devices)完成RNA病灶定量。 B. 單切篩選
鑑別出靶向人類 DMPK基因之3' UTR的一百七十二(172)種SluCas9 sgRNA，該等sgRNA具有典型的NNGG原間隔子相鄰模體(PAM)模體，其中在終止密碼子與 DMPK基因之最後一個外顯子的末端之間產生雙股斷裂(DSB)點，使得CRISPR誘導的基因編輯不會干擾 DMPK編碼序列及mRNA成熟( 表 1A)。六(6)種sgRNA (SluU66、SluR1、SluR2、SluR3、SluR4及SluR5)由於預測的脫靶位點數目大( 表 1A)而自進一步評價中排除。在剩餘166種sgRNA中，65種sgRNA (SluU01-SluU65)定位於CTG重複序列擴增的上游(介於終止密碼子與CTG重複序列擴增之間)，且101種sgRNA (SluD01-SluD101)定位於CTG重複序列擴增的下游(介於CTG重複序列擴增與 DMPK基因之最後一個外顯子的末端之間)( 圖 1)。
為了評估個別SluCas9 sgRNA誘導插入缺失編輯及CTG重複序列切除的效率，進行單切篩選，其中將個別SluCas9 sgRNA與重組SluCas9蛋白組裝成核糖核蛋白(RNP)且遞送至DM1患者原代肌母細胞中。核轉染的肌母細胞用DMSO (媒劑)或3 µM DNA依賴型蛋白激酶抑制劑(DNA-PKi)化合物6處理48小時。核轉染後七十二(72)小時，藉由螢光原位雜交(FISH)對肌母細胞進行基因體DNA分離或RNA病灶染色。
藉由PCR自所提取之基因體DNA擴增涵蓋野生型對偶基因中之CTG重複序列擴增及sgRNA目標區域的1174 bp序列。接著執行桑格定序及ICE分析來定量個別sgRNA所誘導之插入缺失的頻率。應注意，僅使用經媒劑處理之樣品用於ICE分析。
在所評價的166種sgRNA中，8種sgRNA誘導大於80%的插入缺失效率，21種sgRNA誘導大於60%的插入缺失效率，且44種sgRNA誘導大於40%的插入缺失效率( 圖 2及 表 3)。藉由桑格定序及ICE分析來評估編輯效率。sgRNA在 圖 2中依最高效率至最低效率排序。*表示ICE分析中R2 ＜0.9的sgRNA (可靠ICE分析用的內部QC標準)。
十一(11)種sgRNA由於ICE算法無法對其桑格定序層析圖與對照定序層析圖進行比對而在ICE分析中不合格(在圖2中以「#」表示)。
利用TapeStation分析來評估個別SluCas9 sgRNA所誘導的大型插入缺失(＞30bp)概況(上游sgRNA為 圖 3A- B且下游sgRNA為 圖 4A- B)。在約尺寸10,000處出現的頂部譜帶為較高標準，且在約尺寸15處出現的底部譜帶為較低標準。虛線指示自未編輯之野生型對偶基因或具有小型插入缺失(＜30 bp)之野生型對偶基因擴增的1174 bp PCR產物。若干SluCas9 sgRNA誘導不同尺寸的大型缺失，其由位於1174 bp PCR譜帶下方的PCR譜帶(＞30 bp)表示。與媒劑組(A)相比，DNA-PKi組(B)顯示更豐裕的大型缺失。DM1模擬物為經SluCas9蛋白核轉染、但未經sgRNA核轉染的DM1患者肌母細胞。
RNA病灶的FISH染色顯示，個別sgRNA ( 圖 5A(上游嚮導)及 圖 5B(下游嚮導)及 表 3)使DM1患者肌母細胞中的CUG病灶(由 DMPKmRNA中的CUG重複序列擴增而形成)減少。所示為經媒劑處理之肌母細胞(白色條柱)或經DNA-PKi處理之肌母細胞(黑色條柱)中之不含CUG病灶之細胞核的百分比。sgRNA依媒劑組中的最高效率至最低效率排序。健康肌母細胞(健康)充當陽性對照，且經SluCas9蛋白核轉染、但未經sgRNA核轉染的DM1患者肌母細胞(DM1)充當陰性對照。在所評價的166種sgRNA中，4種sgRNA (SluU08、SluU63、SluU64及SluD14)在媒劑處理下使超過40%肌母細胞核中的CUG RNA病灶完全消除。作為最有效的sgRNA，SluD14在媒劑處理下使53%肌母細胞核中的CUG RNA病灶消除，且在DNA-PKi處理下使81.82%肌母細胞核中的CUG RNA病灶消除。RNA病灶分佈分析表明，SluU63及SluD14不僅排除大部分肌母細胞核中的CUG病灶，而且使含有超過三個CUG病灶之肌母細胞核的頻率降低( 圖 6A- B)。SluU63及SluD14不僅使不含CUG病灶之肌母細胞核(每個核的病灶數目=0)的頻率增大，而且使含有超過三個CUG病灶之肌母細胞核的頻率降低。與媒劑處理相比，DNA-PKi處理使更多肌母細胞核中的CUG病灶消除且使含有超過三個CUG病灶之肌母細胞核的頻率降低。 圖 6A- B及 表 3。
除C U G病灶染色之外，亦執行C A G病灶染色，其由來源於下游SIX5基因的反義轉錄物形成或藉由將個別SluCas9 sgRNA誘導的CTG重複序列逆轉來形成。絕大部分的SluCas9 sgRNA誘導低水準的CAG病灶( 表 3)。
表 3 ：單切資料概述
SluCas9 sgRNA 名稱 SEQ ID NO. 插入缺失效率 不含 CUG 病灶之細胞核 % ( 媒劑 ) 不含 CUG 病灶之細胞核 % (DNA-PKi) CAG 病灶陽性細胞核 % ( 媒劑 ) CAG 病灶陽性細胞核 % (DNA-PKi)
SluD01 67 0 18.45 17.29 0.79 1.34
SluD02 68 0 8.76 22.29 1.13 1.08
SluD03 69 2 14.38 49.43 1.19 2.14
SluD04 70 1 13.29 19.38 1.17 1.94
SluD05 71 22 26.95 26.99 1.42 1.1
SluD06 72 55 24.51 23.09 3.12 1.35
SluD07 73 28 12.52 29.79 2.37 0.82
SluD08 74 45 27.09 48.28 5 1.22
SluD09 75 5 12.5 33.83 1.16 1.48
SluD10 76 18 13.43 27.41 2.84 1.26
SluD11 77 16 14.54 52.55 1.7 2.22
SluD12 78 44 17.76 23.77 4.65 1.21
SluD13 79 55 15.93 42.02 4.07 2.77
SluD14 81 NA 53.12 81.82 6.7 3.96
SluD15 82 49 11.01 27.46 2.44 0.64
SluD16 80 31 15.2 38.89 2.11 1.74
SluD17 83 33 12.25 21.7 2.07 1.47
SluD18 84 75 15.38 31.47 2.71 1.55
SluD19 85 24 12.59 27.72 2.32 1.68
SluD20 86 24 13.32 24.59 1.81 1.1
SluD21 87 36 9.96 32.15 1.95 1.77
SluD22 88 21 7.86 20.98 0.76 1.54
SluD23 89 48 19.61 64.98 3.33 4.37
SluD24 90 27 17.65 22.99 2.75 1.68
SluD25 91 41 26.87 32.03 2.62 1.35
SluD26 92 NA 19.92 32.32 3.44 2.09
SluD27 93 8 7.6 20.28 0.93 1.4
SluD28 94 48 11.31 31.88 1.23 1.29
SluD29 95 35 7.97 28.37 1.72 2.38
SluD30 96 NA 15.1 30.01 2.66 2.1
SluD31 97 63 14.17 23.95 3.06 3.21
SluD32 98 94 19.22 26.23 1.43 1.31
SluD33 99 74 12.72 33.92 4.78 1.76
SluD34 100 71 15 31.92 3.9 2.01
SluD35 101 0 6.61 12.47 1.04 1.13
SluD36 102 52 13.52 29.02 3.24 2.32
SluD37 103 25 6.89 31.69 1.76 2.15
SluD38 104 1 6.59 15.53 0.93 1.96
SluD39 105 39 9.15 31.63 1.95 1.68
SluD40 106 5 8.9 23.44 1.68 1.46
SluD41 107 6 8.97 37.15 1.33 1.44
SluD42 108 NA 13.3 38.26 4.25 2.85
SluD43 109 1 6.41 20.27 1.31 0.82
SluD44 110 24 8.05 36.44 1.49 2.29
SluD45 111 8 7.51 32.39 1.17 1.16
SluD46 112 46 8.24 34.71 1.69 1.16
SluD47 113 18 8.95 28.63 1 1.11
SluD48 114 60 13.31 25.41 2.3 2.91
SluD49 115 41 12.39 37.77 2.83 2.3
SluD50 116 4 7.64 30.13 1.81 2.2
SluD51 117 33 14.34 28.86 2.15 2.13
SluD52 118 6 7.59 26.8 1.26 1.57
SluD53 119 NA 12.28 41.45 1.94 1.6
SluD54 120 26 10.7 33.12 2.11 2.85
SluD55 121 41 15.71 34.69 3.01 2.92
SluD56 122 70 13.88 31.7 1.04 2.91
SluD57 123 NA 15.61 37.23 2.09 1.02
SluD58 124 33 18.03 31.45 1.37 1.96
SluD59 125 NA 9.79 27.36 1.18 1.29
SluD60 126 0 6.71 16.87 1.02 1.16
SluD61 127 2 17.04 26.76 1.27 1.94
SluD62 128 14 11.48 34.48 1.59 2.45
SluD63 129 6 9.09 19.22 0.85 2.95
SluD64 130 23 11.02 32.65 2.64 2.38
SluD65 131 36 18.5 32.37 1.33 0.92
SluD66 132 28 13.03 30.48 1.41 1.94
SluD67 133 39 10.06 25.54 0.69 1.8
SluD68 134 72 12.88 25.13 2.3 1.94
SluD69 135 14 10.88 27.98 1.3 2.13
SluD70 136 14 22.75 30.47 2.33 2.45
SluD71 137 23 9.75 23.51 1.38 2.27
SluD72 138 5 16.2 28.82 2.62 2.33
SluD73 139 65 12.95 32.52 2.52 2.33
SluD74 140 56 10.6 31.37 2.27 1.55
SluD75 141 17 11.9 22.6 1.56 1.9
SluD76 142 20 15.78 29.87 1.73 2.16
SluD77 143 17 14.94 28.94 1.8 3.13
SluD78 144 4 12.61 27 2.31 1.36
SluD79 145 2 11.48 25.61 0.82 1.79
SluD80 146 1 11.92 17.34 1.98 1.49
SluD81 147 10 9.64 28.66 1.54 1.75
SluD82 148 22 14.98 29.51 1.39 2.02
SluD83 149 70 19.15 34 1.64 1.51
SluD84 150 10 9.15 30.25 1.28 3.03
SluD85 151 28 17.4 29.51 2.51 2.82
SluD86 152 30 11.98 31.62 1.98 3.95
SluD87 153 30 15.16 39.12 1.3 2.19
SluD88 154 7 11.11 31.95 1.4 2.42
SluD89 155 0 10.23 11.37 0.61 2.54
SluD90 156 2 7.35 23.81 0.86 1.27
SluD91 157 33 22.42 21.28 1 4.23
SluD92 158 30 24.08 24.03 1.4 3.02
SluD93 159 18 11.34 26.14 1.63 3.58
SluD94 160 30 18.18 27.23 1 1.32
SluD95 161 28 21.81 27.23 1.3 2.19
SluD96 162 31 21 31.02 2.21 2.73
SluD97 163 11 16.07 39.95 1.19 2.01
SluD98 164 0 11.21 11.71 0.84 1.47
SluD99 165 1 22.87 22.16 0.73 2.23
SluD100 166 81 22.06 37.39 2.15 3.35
SluD101 167 38 21.35 33.61 2.09 2.93
SluU01 1 38 22.92 51.01 1.71 1.15
SluU02 2 16 9.09 54.94 1.38 1.26
SluU03 3 9 11.12 49.49 1.05 2.04
SluU04 4 NA 17.21 65.78 0.72 1.21
SluU05 5 65 26.37 61.16 1.53 1.64
SluU06 6 81 25.49 67.15 1.01 1.1
SluU07 7 57 26.22 51.08 2.36 1.27
SluU08 8 87 31.42 61.56 2.21 1.61
SluU09 9 65 26.05 74.97 1.48 1.22
SluU10 10 81 27.04 72.18 2 0.66
SluU11 11 21 19.12 52.22 1.44 1.27
SluU12 12 20 16.44 50.23 1.29 1.38
SluU13 13 27 17.02 43.12 1.11 1.07
SluU14 14 52 29.12 58.84 1.02 1.63
SluU15 15 4 7.97 31.71 0.75 1.28
SluU16 16 7 10.73 27.5 1.28 1.73
SluU17 17 32 21.96 67.55 1.5 1.28
SluU18 18 14 9.74 48.57 1.1 1.24
SluU19 19 48 19.3 69.93 1.54 0.83
SluU20 20 30 18.45 49.95 1.15 1.43
SluU21 21 80 23.65 54.83 0.68 0.66
SluU22 22 41 27.56 50.21 0.96 1.28
SluU23 23 5 11.23 29.8 1 1.53
SluU24 24 28 20.62 50.23 1 1.56
SluU25 25 38 23.15 47.96 0.92 1.29
SluU26 26 NA 28.68 66.19 1.56 2.39
SluU27 27 1 7.71 38.24 1.64 1.94
SluU28 28 17 10.14 36.78 1.15 1.64
SluU29 29 67 27.28 48.49 1.18 1.82
SluU30 30 48 26.92 46.16 0.67 2.14
SluU31 31 29 14.2 40.74 0.94 1.62
SluU32 32 43 24.5 59.19 2.19 6.56
SluU33 33 26 24.67 57.35 1.14 1.3
SluU34 34 53 19.95 63.08 0.78 1.03
SluU35 35 25 14.23 55.71 0.69 1.42
SluU36 36 24 11.72 40.62 1.05 1.96
SluU37 37 15 8.09 30.58 0.72 2.28
SluU38 38 2 7.24 32.86 0.68 1.56
SluU39 39 11 10.53 36.78 0.71 2.5
SluU40 40 3 15.29 25.77 1 2.01
SluU41 41 13 13.34 47.52 0.74 1.08
SluU42 42 15 7.05 42.7 0.86 1.62
SluU43 43 5 7.64 28.61 1.02 1.76
SluU44 44 16 12.6 47 0.7 1.77
SluU45 45 14 12.63 43.15 1.11 2.36
SluU46 46 41 14.46 62.89 0.74 1.5
SluU47 47 0 5.91 12.71 1 2.4
SluU48 48 11 20.76 24.81 1.1 1.56
SluU49 49 0 7.53 38.7 1.03 1.44
SluU50 50 22 11.21 48.15 0.75 1.59
SluU51 51 28 8.62 46.88 0.72 1.6
SluU52 52 34 23.34 65.25 0.74 2.65
SluU53 53 31 22.52 61.52 1.44 2.9
SluU54 54 10 13.12 53.64 1.14 1.28
SluU55 55 67 27.94 57.91 0.99 1.34
SluU56 56 27 16.76 42.84 0.94 1.83
SluU57 57 17 18.03 52.65 1.54 1.77
SluU58 58 36 16.57 49.37 1.35 1.51
SluU59 59 92 23.05 72.56 1.35 1.4
SluU60 60 40 22.98 49.06 1.23 2.17
SluU61 61 14 17.78 49.57 0.9 1.46
SluU62 62 87 17.18 59.07 1 1.67
SluU63 63 NA 44.78 70.99 3.29 5.49
SluU64 64 59 37.58 67.39 1.23 2.58
SluU65 65 NA 22.41 66 1.29 2.09
DM對照 1000 N/A 7.97 10.2 0.75 1.26
健康對照 1001 N/A 97.16 96.18 0.42 0.22
C. 雙切篩選
執行雙切篩選以評估成對sgRNA誘導之CTG重複序列切除及RNA病灶減少的效率。
如上文在實例B中所述(參見例如 圖 2及 表 3)，基於166種sluCas9 sgRNA在DM1患者原代肌母細胞中的單切篩選結果，指定八十八(88)種SluCas9 sgRNA對用於在人類DMPK基因的3' UTR中進行雙切篩選。
為了評估SluCas9 sgRNA對誘導CTG重複序列切除的效率，進行雙切篩選，其中將個別SluCas9 sgRNA與重組SluCas9蛋白組裝成核糖核蛋白(RNP)且遞送至DM1患者原代肌母細胞中。核轉染的肌母細胞用DMSO (媒劑)或3 µM DNA依賴型蛋白激酶抑制劑(DNA-PKi)化合物6處理48小時。核轉染後72小時，藉由螢光原位雜交(FISH)對肌母細胞進行基因體DNA分離或RNA病灶染色。
根據得自ICE分析之編輯效率與得自TapeStation分析之大型插入缺失概況的組合，定位於CTG重複序列擴增上游(介於終止密碼子與CTG重複序列擴增之間)的八(8)種sgRNA (SluU06、SluU08、SluU10、SluU21、SluU59、SluU62、SluU63及SluU64)(分別為SEQ ID NO: 6、8、10、21、59、62、63及64)以及定位於CTG重複序列擴增下游(介於CTG重複序列擴增與DMPK基因之最後一個外顯子的末端之間)的11種sgRNA (D06、D14、D18、D32、D34、D48、D56、D68、D73、D83及D100) (分別為SEQ ID NO: 72、81、84、98、100、114、122、134、139、149及166)由於其在166種sluCas9 sgRNA之單切篩選中的插入缺失編輯效率高而納入以便在雙切篩選中進一步評價( 表 4及 圖 7)。八種上游sgRNA各自與11種下游sgRNA配對而得到88個測試對。
表 4 ：雙切用的 sgRNA
SluCas9 sgRNA 名稱 SEQ ID NO 原間隔子序列 (22 bp) 原間隔子 _ 起點 原間隔子 _ 終點 PAM 序列 PAM_ 起點 PAM_ 終點 預測的脫靶位點數目 (22 聚體 )
U06 6 TGTCTTCGACTCCGGGGCCCCG 45770455 45770477 TTGG 45770451 45770455 2
U08 8 GCCCCGTTGGAAGACTGAGTGC 45770439 45770461 CCGG 45770435 45770439 2
U10 10 CCCGTTGGAAGACTGAGTGCCC 45770437 45770459 GGGG 45770433 45770437 3
U21 21 GCTCGGAGCGGTTGTGAACTGG 45770382 45770404 CAGG 45770404 45770408 0
U58 58 gccccgttcgccggccgcggac 45770290 45770312 ccgg 45770312 45770316 1
U62 62 AGGACCCTTCGAgccccgttcg 45770278 45770300 ccgg 45770300 45770304 0
U63 63 ggggcTCGAAGGGTCCTTGTAG 45770273 45770295 CCGG 45770269 45770273 4
U64 64 gggcTCGAAGGGTCCTTGTAGC 45770272 45770294 CGGG 45770268 45770272 1
D06 72 CCAGGCTGAGGCCCTGACGTGG 45770152 45770174 ATGG 45770148 45770152 12
D14 81 ATGGGCAAACTGCAGGCCTGGG 45770130 45770152 AAGG 45770126 45770130 77
D18 84 TGGAGGATGGAACACGGACGGC 45770093 45770115 CCGG 45770115 45770119 3
D32 98 CTTGTGCATGACGCCCTGCTCT 45770030 45770052 GGGG 45770026 45770030 6
D34 100 CGCGCCAGACGCTCCCCAGAGC 45770013 45770035 AGGG 45770035 45770039 7
D48 114 GAGAGCAGCGCAAGTGAGGAGG 45769925 45769947 GGGG 45769947 45769951 37
D56 122 CCAGCCGGCTCCGCCCGCTTCG 45769897 45769919 GCGG 45769893 45769897 4
D68 134 CCTGTAGCCTGTCAGCGAGTCG 45769845 45769867 GAGG 45769867 45769871 2
D73 139 CCAAAACGTGGATTGGGGTTGT 45769816 45769838 TGGG 45769838 45769842 6
D83 149 GTGGGGACAGACAATAAATACC 45769769 45769791 GAGG 45769791 45769795 13
D100 166 GTCCAGAGCTTTGGGCAGATGG 45769708 45769729 AGGG 45769730 45769733 1
評估88對中之每一者的CRISPR重複序列切除效率 ( 圖 8A-B 及表 5)。針對媒劑(DMSO；白色條柱)及DNA-PKi (黑色條柱)顯示CTG重複序列切除效率百分比( 圖 8B 及表 5)。
表 5 ：雙切資料概述
SluCas9 sgRNA 對名稱 SluCas9 sgRNA 對 (SEQ ID NOs.) 根據 ddPCR 的 切除效率 ( 媒劑 ) 切除效率 ( 根據 ddPCR) 不含 CUG 病灶之細胞核 % ( 媒劑 ) 不含 CUG 病灶之細胞核 %(DNA-PKi)
SluU64+SluD34 64+100 76.3522013 79.9065421 83.684029 91.4510166
SluU10+SluD34 10+100 52.1204065 68.5949082 80.8986227 88.6290558
SluU06+SluD34 6+100 51.3656895 67.5717048 78.5632184 90.6636304
SluU08+SluD34 8+100 58.1102534 69.4661848 77.9269202 91.1452514
SluU63+SluD34 63+100 63.2704403 93.5046729 77.8499278 87.2456726
SluU64+SluD32 64+98 60.754717 85.5607477 77.5994651 89.9914821
SluU10+SluD32 10+98 48.6201616 72.5162286 77.2907438 90.0761124
SluU64+SluD83 64+149 55.2201258 78.9719626 76.5463918 90.6284454
SluU59+SluD34 59+100 55.2201258 71.9626168 76.4747191 89.0050876
SluU64+SluD48 64+114 47.672956 80.8411215 75.4465736 88.4432945
SluU63+SluD32 63+98 60.754717 94.8130841 75.2569926 89.0378314
SluU64+SluD68 64+134 46.163522 72.8971963 74.9421488 89.558883
SluU10+SluD83 10+149 47.6269329 68.8032319 74.1650763 89.4985809
SluU63+SluD83 63+149 58.7421384 93.271028 74.1052632 89.7999436
SluU08+SluD32 8+98 50.8668983 73.0215 74.104352 90.9117909
SluU63+SluD48 63+114 63.7735849 94.2523364 73.7275449 90.0299401
SluU63+SluD100 63+166 58.2389937 91.4953271 73.1483715 89.9731423
SluU64+SluD18 64+84 N/A N/A 72.5132626 89.744663
SluU63+SluD68 63+134 57.2327044 93.6448598 71.7386285 90.625
SluU10+SluD18 10+84 51.5451174 60.591133 71.691974 89.0786894
SluU64+SluD73 64+139 50.6918239 74.7663551 70.1931649 91.0221531
SluU63+SluD73 63+139 63.2704403 95.5140187 70.0337512 90.5766944
SluU10+SluD73 10+139 46.126206 64.7679665 69.9696191 88.4638022
SluU64+SluD100 64+166 45.1572327 68.2242991 69.881202 85.8852662
SluU06+SluD18 6+84 45.6118665 64.5320197 69.247197 87.7938808
SluU59+SluD32 59+98 57.2327044 83.317757 69.2344612 91.1886458
SluU10+SluD48 10+114 44.135395 62.2922518 69.1129401 88.0196937
SluU63+SluD18 63+84 N/A N/A 68.6201261 88.1469115
SluU10+SluD68 10+134 42.3743888 61.2943695 68.1479579 89.5024272
SluU08+SluD83 8+149 45.636122 70.464067 68.1400438 90.3820465
SluU10+SluD100 10+166 44.6472468 64.2500345 67.8052158 88.2369615
SluU06+SluD32 6+98 50.6327402 73.5141108 67.7698574 89.8445596
SluU63+SluD14 63+81 N/A N/A 67.3458725 85.9981372
SluU64+SluD06 64+72 N/A N/A 67.2061329 86.5919064
SluU08+SluD18 8+84 50.5562423 63.546798 67.0639468 90.4390526
SluU64+SluD14 64+81 N/A N/A 67.0583627 86.0696517
SluU06+SluD48 6+114 45.8920478 63.3281157 66.882309 89.4649934
SluU63+SluD06 63+72 N/A N/A 66.8191057 88.4507042
SluU06+SluD14 6+81 48.0840544 65.0246305 66.7242869 83.3656331
SluU08+SluD100 8+166 41.6545001 66.3781594 66.3115278 88.5915112
SluU06+SluD83 6+149 46.1305596 66.1824962 66.0344397 89.4458172
SluU59+SluD18 59+84 N/A N/A 65.7246213 88.2099828
SluU08+SluD73 8+139 50.1208885 67.6096865 65.4225352 89.9372784
SluU06+SluD73 6+139 43.4024458 63.290134 65.152325 88.3744171
SluU08+SluD68 8+134 42.6303147 62.5638783 65.1006711 88.2368082
SluU06+SluD100 6+166 40.8910761 65.6772248 64.9460709 87.3691099
SluU08+SluD48 8+114 42.1445842 55.9205378 64.9313772 87.6255088
SluU62+SluD34 62+100 48.1761006 64.953271 64.7101981 88.2910425
SluU59+SluD83 59+149 49.1823899 64.953271 64.6134347 90.4929577
SluU06+SluD68 6+134 47.3840676 62.9931864 64.0101523 89.3964655
SluU10+SluD14 10+81 43.1396786 61.5763547 62.9525032 84.0366972
SluU59+SluD68 59+134 58.2389937 65.4205607 62.8125 89.368216
SluU06+SluD06 6+72 42.645241 57.635468 62.8060523 87.0221328
SluU59+SluD100 59+166 37.6100629 68.6915888 62.4540938 90.0859753
SluU59+SluD48 59+114 47.1698113 65.8878505 62.1517771 87.2830725
SluU10+SluD06 10+72 48.578492 63.0541872 61.3699907 86.3519313
SluU21+SluD14 21+81 54.0173053 63.0541872 61.2514758 89.6
SluU63+SluD56 63+122 50.6918239 90.046729 60.9140859 88.1204685
SluU64+SluD56 64+122 42.1383648 67.7570093 60.3561047 87.6001687
SluU62+SluD14 62+81 N/A N/A 59.5964691 85.6952317
SluU59+SluD14 59+81 N/A N/A 59.2913386 84.8609355
SluU59+SluD73 59+139 42.1383648 64.953271 59.2228571 87.854129
SluU08+SluD06 8+72 46.6007417 59.1133005 59.2214112 86.6882163
SluU62+SluD18 62+84 N/A N/A 57.1738188 89.3198263
SluU62+SluD83 62+149 43.1446541 68.6915888 56.6520468 88.9364129
SluU08+SluD14 8+81 45.1174289 63.0541872 56.3689997 82.0916503
SluU21+SluD34 21+100 42.1619983 61.7489987 56.0138249 88.4267119
SluU62+SluD32 62+98 50.1886792 79.9065421 55.6309362 88.7545685
SluU21+SluD18 21+84 45.6118665 65.5172414 54.2579625 89.213198
SluU62+SluD48 62+114 35.5974843 66.3551402 54.2204996 88.0831778
SluU62+SluD100 62+166 37.1069182 64.0186916 53.4463018 88.3484474
SluU62+SluD73 62+139 38.1132075 65.8878505 52.8724895 88.1341108
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SluU10+SluD56 10+122 33.8862327 54.9226555 49.8346477 83.6832633
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SluU62+SluD56 62+122 32.0754717 61.2149533 36.419214 84.2970677
SluU21+SluD56 21+122 25.9404032 59.9684637 31.9021039 85.3877315
  
  
DM對照 N/A N/A 1.955 1.813814075
健康對照 N/A N/A 96.9184349 96.76620245
利用TapeStation分析來評估SluCas9 + sgRNA對所誘導的大型插入缺失(＞30 bp)概況( 圖 9A(媒劑DMSO)及 圖 9B(使用DNA-PKi)。在約尺寸10,000處出現的頂部譜帶為較高標準，且在約尺寸15處出現的底部譜帶為較低標準。虛線指示自未編輯之野生型對偶基因或具有小型插入缺失(＜30 bp)之野生型對偶基因擴增的1174 bp PCR產物。若干SluCas9 sgRNA對誘導不同尺寸的大型缺失，其由位於1174 bp PCR譜帶下方的PCR譜帶(＞30 bp)表示。與媒劑組(A)相比，DNA-PKi組(B)顯示更豐裕的大型缺失。DM1模擬物為經SluCas9蛋白核轉染、但未經sgRNA核轉染的DM1患者肌母細胞。
RNA病灶的FISH染色顯示經88個SluCas9 sgRNA對核轉染之DM1患者肌母細胞中的CUG病灶(由 DMPKmRNA中的CUG重複序列擴增而形成)減少( 圖 10)。所示為經媒劑處理之肌母細胞(白色條柱)或經DNA-PKi處理之肌母細胞(黑色條柱)中之不含CUG病灶之細胞核的百分比。sgRNA對依媒劑組中的最高效率至最低效率排序。健康肌母細胞(健康)充當陽性對照，且經SluCas9蛋白核轉染、但未經sgRNA核轉染的DM1患者肌母細胞(DM1)充當陰性對照。另外，兩對SluCas9嚮導(U63 + D34)(分別為SEQ ID NO: 63 + 100)及U64 + D34 (分別為SEQ ID NO: 64 + 100)在DNA-PKi存在及不存在下成功地使RNA病灶減少( 圖 11A- B)。四(4)種sgRNA顯示格外高的RNA病灶減少效率(SluU08 (SEQ ID NO: 8)、SluU63 (SEQ ID NO: 63)、SluU64 (SEQ ID NO: 64)及SluD14 (SEQ ID NO: 81))，此表明其可藉由與其sgRNA搭配物一起作用或僅藉由自身作用來切除CTG重複序列擴增。
本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外說明，否則表示數量、百分比或比例的所有數字，及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值均應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾(就其尚未如此修飾而言)。因此，除非有相反說明，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所述之數值參數為可根據設法獲得之所需特性而變的近似值。至少，且不試圖將均等論(doctrine of equivalents)之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用一般捨入技術來解釋。
應注意，除非明確地且肯定地限於一個提及物，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」與「該」及任何詞之任何單數使用形式包括複數個提及物。如本文所用，術語「包括」及其文法變化形式意欲具有非限制性，因此清單中之各項的敍述不排除可以取代或添加至所列項中的其他類似項。
圖1顯示166種所選SluCas9 sgRNA的位置。
圖2顯示166種SluCas9 sgRNA在DM1患者原代肌母細胞中的編輯效率。
圖3A-3B顯示經SluCas9蛋白及65種SluCas9上游sgRNA核轉染之DM1肌母細胞所擴增之PCR產物的TapeStation分析。圖3A無DNA-PKi且圖3B具有DNA-PKi。
圖4A-4B顯示經SluCas9蛋白及101種SluCas9下游sgRNA核轉染之DM1肌母細胞所擴增之PCR產物的TapeStation分析。圖4A無DNA-PKi且圖4B具有DNA-PKi。
圖5A-5B顯示個別SluCas9 sgRNA使RNA病灶減少。圖5A顯示上游嚮導且圖5B顯示下游嚮導。
圖6A-6B顯示SluU63及SluD14使RNA病灶減少。圖6A顯示免疫螢光影像，其顯示肌母細胞核(影像中之較深陰影)中的CUG病灶染色(細胞中的小點)。圖6B顯示具有不同數目個CUG病灶之肌母細胞核的頻率分佈。
圖7顯示19種所選SluCas9 sgRNA在雙切篩選時的位置。
圖8A-B顯示信號丟失ddPCR分析(圖8A)及在DM1患者原代肌母細胞中所測試之88個SluCas9 sgRNA對的編輯效率(CTG重複序列切除效率%)的示意圖(圖8B)。
圖9A-B顯示經SluCas9蛋白及88個SluCas9 sgRNA對核轉染之DM1肌母細胞所擴增之PCR產物的TapeStation分析。圖9A顯示不存在DNA-PKi的媒劑(DMSO)，且圖9B顯示存在DNA-PKi時的情形。
圖10顯示個別SluCas9 sgRNA對使RNA病灶減少。
圖11A-B顯示SluCas9 sgRNA-U63 + D34及sgRNA-U64 + D34使RNA病灶減少。圖11A顯示免疫螢光影像，其顯示肌母細胞核(影像中的較深陰影)中的CUG病灶染色(細胞中的小點)。圖11B顯示具有不同數目個CUG病灶之肌母細胞核的頻率分佈。
圖12為顯示代表性載體組態的示意圖，其稱為設計1、設計2、設計3及設計4。
 

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          cagttcacaa ccgctccgag cg                                                22
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          ccacgctcgg agcggttgtg aa                                                22
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          cgcccagctc cagtcctgtg at                                                22
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          tgtgatccgg gcccgccccc ta                                                22
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          atccgggccc gccccctagc gg                                                22
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          <![CDATA[<211>  22]]>
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          cggcccctcc ctccccggcc gc                                                22
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
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          cggggaggga ggggccgggt cc                                                22
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          cgcggacccg gcccctccct cc                                                22
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          gagggagggg ccgggtccgc gg                                                22
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          gggccgggtc cgcggccggc ga                                                22
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          <![CDATA[<211>  22]]>
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          ggccgggtcc gcggccggcg aa                                                22
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          gccgggtccg cggccggcga ac                                                22
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          gccccgttcg ccggccgcgg ac                                                22
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          cttcgagccc cgttcgccgg cc                                                22
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          aggacccttc gagccccgtt cg                                                22
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          cagcagcagc attcccggct ac                                                22
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          gatcacagac catttctttc tt                                                22
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  68]]>
          cagaccattt ctttctttcg gc                                                22
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          <![CDATA[<211>  22]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  69]]>
          atttctttct ttcggccagg ct                                                22
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          <![CDATA[<220>]]>
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          tcggccaggc tgaggccctg ac                                                22
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          caggctgagg ccctgacgtg ga                                                22
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          atgggcaaac tgcaggcctg gg                                                22
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          gcaggcctgg gaaggcagca ag                                                22
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          acggcccggc ttgctgcctt cc                                                22
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
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          gtgcgtggag gatggaacac gg                                                22
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          gggggtgcgt ggaggatgga ac                                                22
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          gataggtggg ggtgcgtgga gg                                                22
          <![CDATA[<210>  88]]>
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          ctccacgcac ccccacctat cg                                                22
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          caacgatagg tgggggtgcg tg                                                22
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          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
          aaccaacgat aggtgggggt gc                                                22
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          <![CDATA[<400>  91]]>
          ctttgcgaac caacgatagg tg                                                22
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          actttgcgaa ccaacgatag gt                                                22
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          cactttgcga accaacgata gg                                                22
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          gcactttgcg aaccaacgat ag                                                22
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          tttgcacttt gcgaaccaac ga                                                22
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          ttcttgtgca tgacgccctg ct                                                22
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          tcgcgccaga cgctccccag ag                                                22
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ggcgcgatct ctgcctgctt ac                                                22
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          gcgcgatctc tgcctgctta ct                                                22
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          aaaagcaaat ttcccgagta ag                                                22
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          tgcttttgcc aaacccgctt tt                                                22
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          gcttttgcca aacccgcttt tt                                                22
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          cagcgcaagt gaggaggggg gc                                                22
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          ccagccggct ccgcccgctt cg                                                22
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          aatatccaaa ccgccgaagc gg                                                22
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          ataaatatcc aaaccgccga ag                                                22
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          aataaatatc caaaccgccg aa                                                22
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          acctcgtcct ccgactcgct ga                                                22
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          gcctgtcagc gagtcggagg ac                                                22
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          cccaacaacc ccaatccacg tt                                                22
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          cagtgcatcc aaaacgtgga tt                                                22
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          ctcagtgcat ccaaaacgtg ga                                                22
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          acaataaata ccgaggaatg tc                                                22
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          <![CDATA[<400>  147]]>
          gacaataaat accgaggaat gt                                                22
          <![CDATA[<210>  148]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          agacaataaa taccgaggaa tg                                                22
          <![CDATA[<210>  149]]>
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          <![CDATA[<400>  149]]>
          gtggggacag acaataaata cc                                                22
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  150]]>
          gtatttattg tctgtcccca cc                                                22
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          <![CDATA[<400>  151]]>
          gtcgggggtg ggggtcctag gt                                                22
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          ggtcgggggt gggggtccta gg                                                22
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          <![CDATA[<400>  153]]>
          gggtcggggg tgggggtcct ag                                                22
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          cgagggtcgg gggtgggggt cc                                                22
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  155]]>
          ttattcgcga gggtcggggg tg                                                22
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          cacccccgac cctcgcgaat aa                                                22
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          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  157]]>
          tttattcgcg agggtcgggg gt                                                22
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          <![CDATA[<400>  158]]>
          ttttattcgc gagggtcggg gg                                                22
          <![CDATA[<210>  159]]>
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          <![CDATA[<400>  159]]>
          cttttattcg cgagggtcgg gg                                                22
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          ggccttttat tcgcgagggt cg                                                22
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          gggcctttta ttcgcgaggg tc                                                22
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  162]]>
          agggcctttt attcgcgagg gt                                                22
          <![CDATA[<210>  163]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  163]]>
          gagggccttt tattcgcgag gg                                                22
          <![CDATA[<210>  164]]>
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          gatggagggc cttttattcg cg                                                22
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          agatggaggg ccttttattc gc                                                22
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          <![CDATA[<211>  22]]>
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          <![CDATA[<210>  169]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  170]]>
          tgctgctgct gctgctgctg ct                                                22
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          <![CDATA[<211>  22]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
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          aaccctagaa ctgtcttcga c                                                 21
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  202]]>
          aaccctagaa ctgtcttcga                                                   20
          <![CDATA[<210>  203]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  203]]>
          accctagaac tgtcttcgac t                                                 21
          <![CDATA[<210>  204]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  204]]>
          accctagaac tgtcttcgac                                                   20
          <![CDATA[<210>  205]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
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          <![CDATA[<400>  205]]>
          ccctagaact gtcttcgact c                                                 21
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  206]]>
          ccctagaact gtcttcgact                                                   20
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          cccggagtcg aagacagttc t                                                 21
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          ccggagtcga agacagttct                                                   20
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          ctcggagcgg ttgtgaactg g                                                 21
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          atccgggccc gccccctagc g                                                 21
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          gcccgccccc tagcggccgg g                                                 21
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          cggggaggga ggggccgggt c                                                 21
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          gagggagggg ccgggtccgc g                                                 21
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          ctccacgcac ccccacctat                                                   20
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          aacgataggt gggggtgcgt g                                                 21
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          accaacgata ggtgggggtg c                                                 21
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          ccaacgatag gtgggggtgc                                                   20
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          ttgcgaacca acgataggtg                                                   20
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          ctttgcgaac caacgatagg t                                                 21
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          tttgcgaacc aacgataggt                                                   20
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          actttgcgaa ccaacgatag g                                                 21
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          ttgcactttg cgaaccaacg a                                                 21
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          ttcttgtgca tgacgccctg                                                   20
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          tcttgtgcat gacgccctgc t                                                 21
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          cttgtgcatg acgccctgct c                                                 21
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          aaagcaaatt tcccgagtaa g                                                 21
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          aagcaaattt cccgagtaag                                                   20
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          tgcttttgcc aaacccgctt t                                                 21
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          aaacgtggat tggggttgtt                                                   20
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          caaaacgtgg attggggttg t                                                 21
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          aaaacgtgga ttggggttgt                                                   20
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          ccaaaacgtg gattggggtt g                                                 21
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          caataaatac cgaggaatgt c                                                 21
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          aataaatacc gaggaatgtc                                                   20
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          acaataaata ccgaggaatg t                                                 21
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          caataaatac cgaggaatgt                                                   20
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          gacaataaat accgaggaat g                                                 21
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          ggggacagac aataaatacc                                                   20
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          tcgggggtgg gggtcctagg t                                                 21
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          cgggggtggg ggtcctaggt                                                   20
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          tcgggggtgg gggtcctagg                                                   20
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          gagggtcggg ggtgggggtc c                                                 21
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          agggtcgggg gtgggggtcc                                                   20
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          tattcgcgag ggtcgggggt g                                                 21
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          <![CDATA[<400>  700]]>
          ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt       60
          tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat      120
          aaccctgcat gccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct agactcagca      180
          cttagtttag gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa ggccatgggg      240
          ctgggcaagc tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac gagctgaaag      300
          ctcatctgct ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt cacaccctgt      360
          aggctcctct atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac cacctccaca      420
          gcacagacag acactcagga gccagccagc                                       450
          <![CDATA[<210>  701]]>
          <![CDATA[<211>  436]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  701]]>
          tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac acccgagatg cctggttata attaacccag       60
          acatgtggct gccccccccc ccccaacacc tgctgcctct aaaaataacc ctgcatgcca      120
          tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac      180
          cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca      240
          cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca      300
          ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat      360
          aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac      420
          tcaggagcca gccagc                                                      436
          <![CDATA[<210>  702]]>
          <![CDATA[<211>  472]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  702]]>
          cgagtccaac acccgtggga atcccatggg caccatggcc cctcgctcca aaaatgcttt       60
          cgcgtcgcgc agacactgct cggtagtttc ggggatcagc gtttgagtaa gagcccgcgt      120
          ctgaaccctc cgcgccgccc cggccccagt ggaaagacgc gcaggcaaaa cgcaccacgt      180
          gacggagcgt gaccgcgcgc cgagcgcgcg ccaaggtcgg gcaggaagag ggcctatttc      240
          ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata attagaatta      300
          atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc      360
          ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa      420
          cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aa              472
          <![CDATA[<210>  703]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  703]]>
          gctcggcgcg cccatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa       60
          atgtctttgg atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccacggta                   108
          <![CDATA[<210>  704]]>
          <![CDATA[<211>  251]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  704]]>
          tgacggcgcg ccctgcagta tttagcatgc cccacccatc tgcaaggcat tctggatagt       60
          gtcaaaacag ccggaaatca agtccgttta tctcaaactt tagcattttg ggaataaatg      120
          atatttgcta tgctggttaa attagatttt agttaaattt cctgctgaag ctctagtacg      180
          ataagtaact tgacctaagt gtaaagttga gatttccttc aggtttatat agcttgtgcg      240
          ccgcctgggt a                                                           251
          <![CDATA[<210>  705]]>
          <![CDATA[<211>  249]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  705]]>
          gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag       60
          ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga      120
          aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat      180
          atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga      240
          cgaaacacc                                                              249
          <![CDATA[<210>  706]]>
          <![CDATA[<211>  243]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  706]]>
          ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc       60
          ggaaatcaag tccgtttatc tcaaacttta gcattttggg aataaatgat atttgctatg      120
          ctggttaaat tagattttag ttaaatttcc tgctgaagct ctagtacgat aagcaacttg      180
          acctaagtgt aaagttgaga cttccttcag gtttatatag cttgtgcgcc gcttgggtac      240
          ctc                                                                    243
          <![CDATA[<210>  707]]>
          <![CDATA[<211>  100]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  707]]>
          aatatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat       60
          ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actctttccc                            100
          <![CDATA[<210>  708]]>
          <![CDATA[<400>  708]]>
          000
          <![CDATA[<210>  709]]>
          <![CDATA[<211>  143]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  709]]>
          ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg       60
          acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc      120
          caactccatc actaggggtt cct                                              143
          <![CDATA[<210>  710]]>
          <![CDATA[<211>  137]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  710]]>
          aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg       60
          ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc      120
          gagcgcgcag agaggga                                                     137
          <![CDATA[<210>  711]]>
          <![CDATA[<400>  711]]>
          000
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          <![CDATA[<211>  1053]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  712]]>
          Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Gln Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Pro Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Ala Ile Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Glu Ala Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Ile His Lys Ile Asp Val Ile Asp Ser Asn Asp Asp 
                  115                 120                 125             
          Val Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Leu Asn Lys Asn Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Lys Asp Lys Phe Val Cys Gln Ile Gln Leu Glu Arg Met Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Gln Val Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Ala Asp Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Lys Glu Ile Ile Gln Leu Leu Asn Val Gln Lys Asn Phe His Gln 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Glu Asn Phe Ile Asn Lys Tyr Ile Glu Leu Val Glu Met Arg 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro Tyr Gly Trp Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Asp Pro Lys Ala Trp Tyr Glu Thr Leu Met Gly His Cys Thr Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Asp Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp Leu 
                          245                 250                 255     
          Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Gln Arg Asp Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Ser Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Asn Glu Ile 
              290                 295                 300                 
          Asn Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Pro Gln Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp Leu Lys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Asp Gln Ser Ile Leu Glu Asn Glu Asp Val Leu Asp Gln Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Lys Ser Lys 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Glu Leu Asp Ile Leu Leu Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ile 
              370                 375                 380                 
          Ala Gln Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Arg Leu Ser Leu Lys Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Arg Leu Val Leu Glu Glu Gln Trp Tyr Ser Ser Arg Asn Gln Met 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Thr His Leu Asn Ile Lys Pro Lys Lys Ile Asn Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Ala Ala Asn Lys Ile Pro Lys Ala Met Ile Asp Glu Phe Ile Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Gly Gln Ala Ile Asn Leu Ile Asn Lys 
              450                 455                 460                 
          Ile Ile Glu Lys Tyr Gly Val Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Glu Asn Asn Ser Lys Asp Lys Gln Lys Phe Ile Asn Glu Met Gln 
                          485                 490                 495     
          Lys Lys Asn Glu Asn Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly Lys 
                      500                 505                 510         
          Tyr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Leu Val Glu Lys Ile Arg Leu His 
                  515                 520                 525             
          Asp Glu Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Pro Leu 
              530                 535                 540                 
          Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val Asp His Ile Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn Lys Val Leu Val 
                          565                 570                 575     
          Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr Pro Tyr Gln Tyr 
                      580                 585                 590         
          Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln His 
                  595                 600                 605             
          Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asn Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr Leu Arg Lys Val 
                  675                 680                 685             
          Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala Glu 
              690                 695                 700                 
          Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu Thr 
                          725                 730                 735     
          Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu Met 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn Phe 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Gln Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Val 
          785                 790                 795                 800 
          Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys Lys 
                          805                 810                 815     
          Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp Pro 
                      820                 825                 830         
          Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu Thr 
              850                 855                 860                 
          Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys Tyr 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe Lys 
                          885                 890                 895     
          Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg Phe 
                      900                 905                 910         
          Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser Tyr 
                  915                 920                 925             
          Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln Lys 
              930                 935                 940                 
          Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys Phe 
          945                 950                 955                 960 
          Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu Ile 
                          965                 970                 975     
          Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu Leu 
                      980                 985                 990         
          Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr Lys  Glu Tyr Cys Glu Leu  Asn Asn Ile 
                  995                 1000                 1005             
          Lys Gly  Glu Pro Arg Ile Lys  Lys Thr Ile Gly Lys  Lys Val Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Glu Lys Leu Thr Thr  Asp Val Leu Gly Asn  Val Phe Thr 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Thr  Gln Tyr Thr Lys Pro  Gln Leu Leu Phe Lys  Arg Gly Asn 
              1040                 1045                 1050             
          <![CDATA[<210>  713]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  713]]>
          Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  714]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  714]]>
          Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  715]]>
          <![CDATA[<400>  715]]>
          000
          <![CDATA[<210>  716]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  716]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Val Lys His Leu Leu Ala Glu Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ile Pro Lys Ser Thr Asn Pro Tyr Gln Thr Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Glu Lys Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Glu Gly Asn Ile Lys Lys Trp Phe Glu Gln Met Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ser Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Glu Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile 
                      260                 265                 270         
          Thr Arg Asp Glu Asp Ala Lys Leu Asn Tyr Gly Glu Lys Phe Gln Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Thr Pro Asn Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Ile Glu Ile Gly Val His Glu Thr Glu Ile Lys Gly Tyr Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Ser Ile Val Phe Asp Lys Ser Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile 
                      340                 345                 350         
          Leu Asp Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Glu Gln Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Lys Glu Glu Leu Asn Lys Leu Pro Glu Ile Leu Asn Glu Gln Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Ala Glu Ile Ala Lys Leu Ile Gly Tyr Asn Gly Thr His Arg Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Ile His Leu Ile Asn Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ser 
                          405                 410                 415     
          Arg Asn Gln Met Glu Ile Phe Asn Tyr Leu Asn Ile Lys Pro Asn Lys 
                      420                 425                 430         
          Val Asp Leu Ser Glu Gln Asn Lys Ile Pro Lys Asp Met Val Asn Asp 
                  435                 440                 445             
          Phe Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Lys 
              530                 535                 540                 
          Asp Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asn Tyr Asp Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asp Ser Met His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Arg Arg Glu Gln Asn Ala Lys Lys Asn Asn Gln Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Leu Thr Ser Gly Tyr Ala Asp Ile Lys Tyr Ser Val 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Val Leu Asn Leu Ala Glu Asn Lys Asp Arg Met Thr 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Thr Tyr Ile Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Lys Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln His Asp Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ala Asn Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Leu Lys Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          His Gln Phe Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Pro Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ser Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Glu Gln Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys 
          945                 950                 955                 960 
          Asn Ala Lys Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asp Gly Glu Ile Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Met Ile Glu Leu Asp Leu Pro Asp  Ile Arg Tyr Lys Glu  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Leu Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Val Asn Ser Ile Glu  Lys Leu Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Val  Phe Thr Asn Thr Gln  Tyr Thr Lys Pro Gln  Leu Leu Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Asn 
              1055         
          <![CDATA[<210>  717]]>
          <![CDATA[<211>  1053]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  717]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Ser Leu Leu Ser Glu Tyr Lys Ile Ile Ser Gly Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Pro Thr Asn Asn Gln Pro Tyr Asn Ile Arg Val Lys Gly Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Glu Gln Leu Thr Lys Asp Glu Leu Ala Val Ala Leu Leu His Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Ile His Lys Ile Asp Val Ile Asp Ser Asn Asp Asp 
                  115                 120                 125             
          Val Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Leu Asn Lys Asn Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Lys Asp Lys Phe Val Cys Gln Ile Gln Leu Glu Arg Met Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Gln Val Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Ala Asp Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Lys Glu Ile Ile Gln Leu Leu Asn Val Gln Lys Asn Phe His Gln 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Glu Asn Phe Ile Asn Lys Tyr Ile Glu Leu Val Glu Met Arg 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro Phe Gly Trp Asn 
              210                 215                 220                 
          Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp Leu 
                          245                 250                 255     
          Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile Gln Arg Asp Asn 
                      260                 265                 270         
          Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile 
              290                 295                 300                 
          Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Pro Glu Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp Leu Lys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Asp Gln Ser Ile Leu Glu Asn Glu Asp Val Leu Asp Gln Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Lys Ser Lys 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Glu Leu Asp Ile Leu Leu Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ile 
              370                 375                 380                 
          Ala Gln Leu Thr Gly Tyr Asn Gly Thr His Arg Leu Ser Leu Lys Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Arg Leu Val Leu Glu Glu Gln Trp Tyr Ser Ser Arg Asn Gln Met 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Thr His Leu Asn Ile Lys Pro Lys Lys Ile Asn Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Ala Ala Asn Lys Ile Pro Lys Ala Met Ile Asp Glu Phe Ile Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn Val Ile Asn Lys 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile Asn Asn Leu Gln 
                          485                 490                 495     
          Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly Gln 
                      500                 505                 510         
          Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys Ile Arg Leu His 
                  515                 520                 525             
          Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Ala Leu 
              530                 535                 540                 
          Met Asp Leu Leu Asn Asn Pro Gln Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Arg Ser Val Ala Phe Asp Asn Ser Ile His Asn Lys Val Leu Val 
                          565                 570                 575     
          Lys Gln Ile Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Tyr Gln Tyr 
                      580                 585                 590         
          Leu Asn Ser Ser Asp Ala Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln His 
                  595                 600                 605             
          Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Lys Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Asp Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Thr Ser Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asp Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asn His Leu Arg Lys Val 
                  675                 680                 685             
          Trp Arg Phe Asp Lys Tyr Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala Glu 
              690                 695                 700                 
          Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu Thr 
                          725                 730                 735     
          Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu Met 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn Phe 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Gln Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Val 
          785                 790                 795                 800 
          Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys Lys 
                          805                 810                 815     
          Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp Pro 
                      820                 825                 830         
          Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu Thr 
              850                 855                 860                 
          Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys Tyr 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe Lys 
                          885                 890                 895     
          Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg Phe 
                      900                 905                 910         
          Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser Tyr 
                  915                 920                 925             
          Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln Lys 
              930                 935                 940                 
          Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys Phe 
          945                 950                 955                 960 
          Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu Ile 
                          965                 970                 975     
          Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu Leu 
                      980                 985                 990         
          Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr Lys  Glu Tyr Cys Glu Leu  Asn Asn Ile 
                  995                 1000                 1005             
          Lys Gly  Glu Pro Arg Ile Lys  Lys Thr Ile Gly Lys  Lys Val Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Glu Lys Leu Thr Thr  Asp Val Leu Gly Asn  Val Phe Thr 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Thr  Gln Tyr Thr Lys Pro  Gln Leu Leu Phe Lys  Arg Gly Asn 
              1040                 1045                 1050             
          <![CDATA[<210>  718]]>
          <![CDATA[<211>  1053]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  718]]>
          Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Gln Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Pro Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Ala Ile Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Glu Ala Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Ile His Lys Ile Asp Val Ile Asp Ser Asn Asp Asp 
                  115                 120                 125             
          Val Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Leu Asn Lys Asn Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Lys Asp Lys Phe Val Cys Gln Ile Gln Leu Glu Arg Met Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Gln Val Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Ala Asp Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Lys Glu Ile Ile Gln Leu Leu Asn Val Gln Lys Asn Phe His Gln 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Glu Asn Phe Ile Asn Lys Tyr Ile Glu Leu Val Glu Met Arg 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro Tyr Gly Trp Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Asp Pro Lys Ala Trp Tyr Glu Thr Leu Met Gly His Cys Thr Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Asp Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp Leu 
                          245                 250                 255     
          Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Gln Arg Asp Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Ser Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Asn Glu Ile 
              290                 295                 300                 
          Asn Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Pro Gln Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp Leu Lys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Asp Gln Ser Ile Leu Glu Asn Glu Asp Val Leu Asp Gln Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Lys Ser Lys 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Glu Leu Asp Ile Leu Leu Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ile 
              370                 375                 380                 
          Ala Gln Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Arg Leu Ser Leu Lys Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Arg Leu Val Leu Glu Glu Gln Trp Tyr Ser Ser Arg Asn Gln Met 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Thr His Leu Asn Ile Lys Pro Lys Lys Ile Asn Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Ala Ala Asn Lys Ile Pro Lys Ala Met Ile Asp Glu Phe Ile Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Gly Gln Ala Ile Asn Leu Ile Asn Lys 
              450                 455                 460                 
          Ile Ile Glu Lys Tyr Gly Val Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Glu Asn Asn Ser Lys Asp Lys Gln Lys Phe Ile Asn Glu Met Gln 
                          485                 490                 495     
          Lys Lys Asn Glu Asn Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly Lys 
                      500                 505                 510         
          Tyr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Leu Val Glu Lys Ile Arg Leu His 
                  515                 520                 525             
          Asp Glu Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Pro Leu 
              530                 535                 540                 
          Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val Asp His Ile Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn Lys Val Leu Val 
                          565                 570                 575     
          Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr Pro Tyr Gln Tyr 
                      580                 585                 590         
          Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln His 
                  595                 600                 605             
          Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asn Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr Leu Arg Lys Val 
                  675                 680                 685             
          Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala Glu 
              690                 695                 700                 
          Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu Thr 
                          725                 730                 735     
          Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu Met 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn Phe 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Val 
          785                 790                 795                 800 
          Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys Lys 
                          805                 810                 815     
          Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp Pro 
                      820                 825                 830         
          Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu Thr 
              850                 855                 860                 
          Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys Tyr 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe Lys 
                          885                 890                 895     
          Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg Phe 
                      900                 905                 910         
          Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser Tyr 
                  915                 920                 925             
          Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln Lys 
              930                 935                 940                 
          Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys Phe 
          945                 950                 955                 960 
          Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu Ile 
                          965                 970                 975     
          Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu Leu 
                      980                 985                 990         
          Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr Lys  Glu Tyr Cys Glu Leu  Asn Asn Ile 
                  995                 1000                 1005             
          Lys Gly  Glu Pro His Ile Lys  Lys Thr Ile Gly Lys  Lys Val Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Glu Lys Leu Thr Thr  Asp Val Leu Gly Asn  Val Phe Thr 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Thr  Gln Tyr Thr Lys Pro  Gln Leu Leu Phe Lys  Arg Gly Asn 
              1040                 1045                 1050             
          <![CDATA[<210>  719]]>
          <![CDATA[<211>  1053]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  719]]>
          Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Gln Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Pro Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Ala Ile Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Glu Ala Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Ile His Lys Ile Asp Val Ile Asp Ser Asn Asp Asp 
                  115                 120                 125             
          Val Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Leu Asn Lys Asn Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Lys Asp Lys Phe Val Cys Gln Ile Gln Leu Glu Arg Met Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Gln Val Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Ala Asp Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Lys Glu Ile Ile Gln Leu Leu Asn Val Gln Lys Asn Phe His Gln 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Glu Asn Phe Ile Asn Lys Tyr Ile Glu Leu Val Glu Met Arg 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro Tyr Gly Trp Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Asp Pro Lys Ala Trp Tyr Glu Thr Leu Met Gly His Cys Thr Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Asp Glu Leu Ala Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp Leu 
                          245                 250                 255     
          Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Gln Arg Asp Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Ser Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Asn Glu Ile 
              290                 295                 300                 
          Asn Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Pro Gln Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp Leu Lys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Asp Gln Ser Ile Leu Glu Asn Glu Asp Val Leu Asp Gln Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Lys Ser Lys 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Glu Leu Asp Ile Leu Leu Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ile 
              370                 375                 380                 
          Ala Gln Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Arg Leu Ser Leu Lys Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Arg Leu Val Leu Glu Glu Gln Trp Tyr Ser Ser Arg Ala Gln Met 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Ala His Leu Asn Ile Lys Pro Lys Lys Ile Asn Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Ala Ala Asn Lys Ile Pro Lys Ala Met Ile Asp Glu Phe Ile Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Gly Gln Ala Ile Asn Leu Ile Asn Lys 
              450                 455                 460                 
          Ile Ile Glu Lys Tyr Gly Val Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Glu Asn Asn Ser Lys Asp Lys Gln Lys Phe Ile Asn Glu Met Gln 
                          485                 490                 495     
          Lys Lys Asn Glu Asn Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly Lys 
                      500                 505                 510         
          Tyr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Leu Val Glu Lys Ile Arg Leu His 
                  515                 520                 525             
          Asp Glu Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Pro Leu 
              530                 535                 540                 
          Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val Asp His Ile Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn Lys Val Leu Val 
                          565                 570                 575     
          Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr Pro Tyr Gln Tyr 
                      580                 585                 590         
          Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln His 
                  595                 600                 605             
          Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Ala Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asn Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr Leu Arg Lys Val 
                  675                 680                 685             
          Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala Glu 
              690                 695                 700                 
          Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu Thr 
                          725                 730                 735     
          Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu Met 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn Phe 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Gln Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Val 
          785                 790                 795                 800 
          Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys Lys 
                          805                 810                 815     
          Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp Pro 
                      820                 825                 830         
          Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu Thr 
              850                 855                 860                 
          Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys Tyr 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe Lys 
                          885                 890                 895     
          Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg Phe 
                      900                 905                 910         
          Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser Tyr 
                  915                 920                 925             
          Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln Lys 
              930                 935                 940                 
          Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys Phe 
          945                 950                 955                 960 
          Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu Ile 
                          965                 970                 975     
          Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu Leu 
                      980                 985                 990         
          Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr Lys  Glu Tyr Cys Glu Leu  Asn Asn Ile 
                  995                 1000                 1005             
          Lys Gly  Glu Pro Arg Ile Lys  Lys Thr Ile Gly Lys  Lys Val Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Glu Lys Leu Thr Thr  Asp Val Leu Gly Asn  Val Phe Thr 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Thr  Gln Tyr Thr Lys Pro  Gln Leu Leu Phe Lys  Arg Gly Asn 
              1040                 1045                 1050             
          <![CDATA[<210>  720]]>
          <![CDATA[<211>  1053]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  720]]>
          Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Gln Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Pro Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Ala Ile Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Glu Ala Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Ile His Lys Ile Asp Val Ile Asp Ser Asn Asp Asp 
                  115                 120                 125             
          Val Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Leu Asn Lys Asn Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Lys Asp Lys Phe Val Cys Gln Ile Gln Leu Glu Arg Met Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Gln Val Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Ala Asp Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Lys Glu Ile Ile Gln Leu Leu Asn Val Gln Lys Asn Phe His Gln 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Glu Asn Phe Ile Asn Lys Tyr Ile Glu Leu Val Glu Met Arg 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro Tyr Gly Trp Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Asp Pro Lys Ala Trp Tyr Glu Thr Leu Met Gly His Cys Thr Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Asp Glu Leu Ala Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp Leu 
                          245                 250                 255     
          Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Gln Arg Asp Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Ser Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Asn Glu Ile 
              290                 295                 300                 
          Asn Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Pro Gln Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp Leu Lys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Asp Gln Ser Ile Leu Glu Asn Glu Asp Val Leu Asp Gln Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Lys Ser Lys 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Glu Leu Asp Ile Leu Leu Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ile 
              370                 375                 380                 
          Ala Gln Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Arg Leu Ser Leu Lys Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Arg Leu Val Leu Glu Glu Gln Trp Tyr Ser Ser Arg Ala Gln Met 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Ala His Leu Asn Ile Lys Pro Lys Lys Ile Asn Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Ala Ala Asn Lys Ile Pro Lys Ala Met Ile Asp Glu Phe Ile Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Gly Gln Ala Ile Asn Leu Ile Asn Lys 
              450                 455                 460                 
          Ile Ile Glu Lys Tyr Gly Val Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Glu Asn Asn Ser Lys Asp Lys Gln Lys Phe Ile Asn Glu Met Gln 
                          485                 490                 495     
          Lys Lys Asn Glu Asn Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly Lys 
                      500                 505                 510         
          Tyr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Leu Val Glu Lys Ile Arg Leu His 
                  515                 520                 525             
          Asp Glu Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Pro Leu 
              530                 535                 540                 
          Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val Asp His Ile Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn Lys Val Leu Val 
                          565                 570                 575     
          Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr Pro Tyr Gln Tyr 
                      580                 585                 590         
          Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln His 
                  595                 600                 605             
          Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Ala Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asn Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr Leu Arg Lys Val 
                  675                 680                 685             
          Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala Glu 
              690                 695                 700                 
          Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu Thr 
                          725                 730                 735     
          Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu Met 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn Phe 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Val 
          785                 790                 795                 800 
          Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys Lys 
                          805                 810                 815     
          Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp Pro 
                      820                 825                 830         
          Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu Thr 
              850                 855                 860                 
          Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys Tyr 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe Lys 
                          885                 890                 895     
          Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg Phe 
                      900                 905                 910         
          Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser Tyr 
                  915                 920                 925             
          Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln Lys 
              930                 935                 940                 
          Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys Phe 
          945                 950                 955                 960 
          Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu Ile 
                          965                 970                 975     
          Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu Leu 
                      980                 985                 990         
          Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr Lys  Glu Tyr Cys Glu Leu  Asn Asn Ile 
                  995                 1000                 1005             
          Lys Gly  Glu Pro His Ile Lys  Lys Thr Ile Gly Lys  Lys Val Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Glu Lys Leu Thr Thr  Asp Val Leu Gly Asn  Val Phe Thr 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Thr  Gln Tyr Thr Lys Pro  Gln Leu Leu Phe Lys  Arg Gly Asn 
              1040                 1045                 1050             
          <![CDATA[<210>  721]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  721]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Ser Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asp Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asn His 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Arg Phe Asp Lys Tyr Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Gln Asn Thr Asn Lys Ile Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Thr Ile Glu Asn Asn Thr Lys Lys Val Thr Val Glu Lys Glu Glu Asp 
                      740                 745                 750         
          Tyr Asn Asn Val Phe Glu Thr Pro Lys Leu Val Glu Asp Ile Lys Gln 
                  755                 760                 765             
          Tyr Arg Asp Tyr Lys Phe Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Met Lys Asp Glu His 
          785                 790                 795                 800 
          Asp Tyr Ile Val Gln Thr Ile Thr Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Asn Leu Lys Lys Gln Phe Asn Lys Asn Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln Asn Asp Pro Lys Thr Phe Glu Lys Leu Ser Ile Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ser Asp Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Lys Ile Lys Leu Leu Gly Asn Lys Val Gly Asn His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          Asn Lys Tyr Glu Asn Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Asn Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Glu Lys Gly Tyr Lys Phe Val 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ala Tyr Leu Asn Val Phe Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Lys Asp Lys Tyr Gln Glu Leu Lys Glu Lys Lys Lys Ile Lys Asp 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Asp Gln Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asn Gly Asp Leu Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Asp Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Ile Ile Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp  Ile Lys Tyr Lys Asp  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Thr Glu Ser Ile Glu  Lys Phe Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Leu  Tyr Leu His Ser Thr  Glu Lys Ala Pro Gln  Leu Ile Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Leu 
              1055         
          <![CDATA[<210>  722]]>
          <![CDATA[<211>  1054]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  722]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Ala Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ala Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Ile Asn Val Ser Ser Glu Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Ala Ser Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Asn Arg Asn Asn 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Leu Lys Asp Lys Tyr Val Cys Glu Val Gln Leu Gln Arg Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Gly Gln Ile Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Thr Asp 
                          165                 170                 175     
          Ile Leu Lys Glu Ile Asp Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Asp Tyr His 
                      180                 185                 190         
          Asn Leu Asp Ile Asp Phe Ile Asn Gln Tyr Lys Glu Ile Val Glu Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro Tyr Gly Trp 
              210                 215                 220                 
          Glu Gly Asp Pro Lys Ala Trp Tyr Glu Thr Leu Met Gly His Cys Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Phe Pro Asp Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp 
                          245                 250                 255     
          Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Gln Arg Asp 
                      260                 265                 270         
          Gly Leu Ser Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn 
                  275                 280                 285             
          Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Asn Glu 
              290                 295                 300                 
          Ile Asn Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp Leu Lys Lys 
                          325                 330                 335     
          Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu Leu Asn Gln 
                      340                 345                 350         
          Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Val Ala 
                  355                 360                 365             
          Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ser 
              370                 375                 380                 
          Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu Ser Leu Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser Met Asn Gln 
                          405                 410                 415     
          Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys Tyr Glu Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp Ala Ile Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn Val Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile Asn Asn Leu 
                          485                 490                 495     
          Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly 
                      500                 505                 510         
          Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys Ile Arg Leu 
                  515                 520                 525             
          His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Pro 
              530                 535                 540                 
          Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val Asp His Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn Lys Val Leu 
                          565                 570                 575     
          Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr Pro Tyr Gln 
                      580                 585                 590         
          Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln 
                  595                 600                 605             
          His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg 
                          645                 650                 655     
          Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asn 
                      660                 665                 670         
          Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr Leu Arg Lys 
                  675                 680                 685             
          Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala 
              690                 695                 700                 
          Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu 
                          725                 730                 735     
          Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu 
                      740                 745                 750         
          Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn 
                  755                 760                 765             
          Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Gln Leu Ile 
              770                 775                 780                 
          Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile 
          785                 790                 795                 800 
          Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys 
                          805                 810                 815     
          Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp 
                      820                 825                 830         
          Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn 
                  835                 840                 845             
          Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu 
              850                 855                 860                 
          Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe 
                          885                 890                 895     
          Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg 
                      900                 905                 910         
          Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser 
                  915                 920                 925             
          Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln 
              930                 935                 940                 
          Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys 
          945                 950                 955                 960 
          Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu 
                          965                 970                 975     
          Ile Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu 
                      980                 985                 990         
          Leu Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr  Lys Glu Tyr Cys Glu  Leu Asn Asn 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Lys  Gly Glu Pro Arg Ile  Lys Lys Thr Ile Gly  Lys Lys Val 
              1010                 1015                 1020             
          Asn Ser  Ile Glu Lys Leu Thr  Thr Asp Val Leu Gly  Asn Val Phe 
              1025                 1030                 1035             
          Thr Asn  Thr Gln Tyr Thr Lys  Pro Gln Leu Leu Phe  Lys Arg Gly 
              1040                 1045                 1050             
          Asn 
          <![CDATA[<210>  723]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  723]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Thr Tyr Ile Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Lys Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln His Asp Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ala Asn Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Leu Lys Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          His Gln Phe Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Pro Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ser Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Glu Gln Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys 
          945                 950                 955                 960 
          Asn Ala Lys Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asp Gly Glu Ile Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Met Ile Glu Leu Asp Leu Pro Asp  Ile Arg Tyr Lys Glu  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Leu Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Val Asn Ser Ile Glu  Lys Leu Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Val  Phe Thr Asn Thr Gln  Tyr Thr Lys Pro Gln  Leu Leu Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Asn 
              1055         
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          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Thr Tyr Ile Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Lys Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln His Asp Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ala Asn Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Leu Lys Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          His Gln Phe Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Asn Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Glu Lys Gly Tyr Lys Phe Val 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ala Tyr Leu Asn Val Phe Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Lys Asp Lys Tyr Gln Glu Leu Lys Glu Lys Lys Lys Ile Lys Asp 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Asp Gln Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asn Gly Asp Leu Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Asp Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Ile Ile Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp  Ile Lys Tyr Lys Asp  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Thr Glu Ser Ile Glu  Lys Phe Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Leu  Tyr Leu His Ser Thr  Glu Lys Ala Pro Gln  Leu Ile Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Leu 
              1055         
          <![CDATA[<210>  725]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  725]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Phe Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Met Lys Asp Glu His 
          785                 790                 795                 800 
          Asp Tyr Ile Val Gln Thr Ile Thr Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Asn Leu Lys Lys Gln Phe Asn Lys Asn Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln Asn Asp Pro Lys Thr Phe Glu Lys Leu Ser Ile Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ser Asp Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Lys Ile Lys Leu Leu Gly Asn Lys Val Gly Asn His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          Asn Lys Tyr Glu Asn Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Asn Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Glu Lys Gly Tyr Lys Phe Val 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ala Tyr Leu Asn Val Phe Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Lys Asp Lys Tyr Gln Glu Leu Lys Glu Lys Lys Lys Ile Lys Asp 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Asp Gln Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asn Gly Asp Leu Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Asp Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Ile Ile Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp  Ile Lys Tyr Lys Asp  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Thr Glu Ser Ile Glu  Lys Phe Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Leu  Tyr Leu His Ser Thr  Glu Lys Ala Pro Gln  Leu Ile Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Leu 
              1055         
          <![CDATA[<210>  726]]>
          <![CDATA[<400>  726]]>
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          <![CDATA[<210>  727]]>
          <![CDATA[<400>  727]]>
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          <![CDATA[<210>  728]]>
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          Pro Ala Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp 
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          ccggcagcta agaaaaagaa actggat                                           27
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Claims (87)

  1. 一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA及Cas9的單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含： a. 編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的第一核酸，以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 ( Staphylococcus lugdunensisCas9，SluCas9)的第二核酸； b. 編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸； c. 編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致； d. 編碼選自SEQ ID NO: 63與100及64與100中之任一者之2個間隔子序列的第一核酸，以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸；或 e. 編碼一或多個選自SEQ ID NO: 8、63、64及81中之任一者之間隔子序列的第一核酸，以及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸。
  2. 如請求項1之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑。
  3. 如請求項1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。
  4. 如請求項1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。
  5. 如請求項1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該嚮導RNA為sgRNA。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該嚮導RNA經修飾。
  8. 如請求項7之組合物，其中該修飾改變一或多個2'位置及/或磷酸二酯鍵聯。
  9. 如請求項7至8中任一項之組合物，其中該修飾改變該嚮導RNA之前三個核苷酸中的一或多者或全部。
  10. 如請求項7至9中任一項之組合物，其中該修飾改變該嚮導RNA之最後三個核苷酸中的一或多者或全部。
  11. 如請求項7至10中任一項之組合物，其中該修飾包括以下中之一或多者：硫代磷酸酯修飾、2'-OMe修飾、2'-O-MOE修飾、2'-F修飾、2'-O-次甲基-4'橋修飾、3'-硫代膦醯基乙酸酯修飾或2'-去氧修飾。
  12. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該單一核酸分子與脂質奈米粒子(LNP)締合。
  13. 如請求項1至12中任一項之組合物，其中該單一核酸分子為病毒載體。
  14. 如請求項13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒載體、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體，或單純疱疹病毒載體。
  15. 如請求項13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。
  16. 如請求項15之組合物，其中該AAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10、AAVrh74或AAV9載體，其中AAV後之數字指示AAV血清型。
  17. 如請求項16之組合物，其中該AAV載體為AAV血清型9載體。
  18. 如請求項16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh10載體。
  19. 如請求項16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh74載體。
  20. 如請求項13至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含組織特異性啟動子。
  21. 如請求項13至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含肌肉特異性啟動子，視情況其中該肌肉特異性啟動子為肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子、SPc5-12啟動子或CK8e啟動子。
  22. 如請求項13至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含U6、H1或7SK啟動子。
  23. 如請求項1至22中任一項之組合物，其包含編碼SluCas9的核酸，其中該SluCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 712。
  24. 如請求項1至22中任一項之組合物，其包含編碼SluCas9的核酸，其中該SluCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 712之變異體。
  25. 如請求項1至22中任一項之組合物，其包含編碼SluCas9之核酸，其中該SluCas9包含選自SEQ ID NO: 718至720中之任一者的胺基酸序列。
  26. 如請求項1至25中任一項之組合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。
  27. 一種包含嚮導RNA的組合物，該嚮導RNA由包含SEQ ID NO: 1-65、67-167與201-531中之任一者的序列或其互補序列編碼。
  28. 如請求項1至27中任一項之組合物，其用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)。
  29. 如請求項1至27中任一項之組合物，其用於在DMPK基因中產生雙股斷裂。
  30. 如請求項1至27中任一項之組合物，其用於切除DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。
  31. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如請求項1至27中任一項之組合物及視情況存在之DNA-PK抑制劑遞送至細胞。
  32. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.  一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b.  一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.  與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  33. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列，及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列； b.  包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.  與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； d.  第一及第二間隔子，或編碼該嚮導RNA對的一或多個載體，其中該第一及第二間隔子序列包含以下對中之任一者：SEQ ID NO: 6與72；6與81；6與84；6與98；6與100；6與114；6與122；6與134；6與139；6與149；6與166；8與72；8與72；8與81；8與84；8與98；8與100；8與114；8與122；8與134；8與139；8與149；8與166；10與72；10與81；10與84；10與98；10與100；10與114；10與122；10與134；10與139；10與149；10與166；21與72；21與81；21與84；21與98；21與100；21與114；21與122；21與134；21與139；21與149；21與166；58與72；58與81；58與84；58與98；58與100；58與114；58與122；58與134；58與139；58與149；58與166；62與72；62與81；62與84；62與98；62與100；62與114；62與122；62與134；62與139；62與149；62與166；63與72；63與81；63與84；63與98；63與100；63與114；63與122；63與134；63與139；63與149；63與166；64與72；64與81；64與84；64與98；64與100；64與114；64與122；64與134；64與139；64與149；及64與166； e.  第一及第二間隔子，或編碼該嚮導RNA對的一或多個載體，其中該第一及第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 63與100或SEQ ID NO: 64與100； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  34. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如請求項1至27中任一項之組合物遞送至細胞。
  35. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.  一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b.  一或多個選自SEQ ID NO: 8、63、64及81中之任一者的間隔子序列； c.  一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 d.  與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  36. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列，及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列； b.  包含i)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；及 c.  與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；或 d.  選自SEQ ID NO: 63與100及SEQ ID NO: 64與100中之任一者的第一及第二間隔子序列； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  37. 如請求項32至36中任一項之方法，其中該單一核酸分子在單一載體上遞送至該細胞。
  38. 如請求項32至37中任一項之方法，包含投與DNA-PK抑制劑。
  39. 如請求項38之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。
  40. 如請求項38之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。
  41. 如請求項38之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。
  42. 如請求項32至41中任一項之方法，其中該SluCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 712。
  43. 如請求項32至42中任一項之方法，其中該SluCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 712之變異體。
  44. 如請求項32至41中任一項之方法，其中該SluCas9包含選自SEQ ID NO: 718至720中之任一者的胺基酸序列。
  45. 如請求項1至26或28至44中任一項之組合物或方法，其中編碼該gRNA的核酸或編碼該gRNA對的核酸包含選自SEQ ID NO: 600-601或900-917中之任一者的序列。
  46. 如請求項1至26或28至44中任一項之組合物或方法，其中編碼該gRNA的核酸或編碼該gRNA對的核酸包含選自SEQ ID NO: 901-917中之任一者的序列。
  47. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該核酸分子至少編碼第一嚮導RNA及第二嚮導RNA。
  48. 如請求項47之組合物，其中該核酸分子編碼該第一嚮導RNA的間隔子序列、該第一嚮導RNA的支架序列、該第二嚮導RNA的間隔子序列，及該第二嚮導RNA的支架序列。
  49. 如請求項48之組合物，其中該第一嚮導RNA的該間隔子序列與該第二嚮導RNA的該間隔子序列相同。
  50. 如請求項48之組合物，其中該第一嚮導RNA的該間隔子序列與該第二嚮導RNA的該間隔子序列不同。
  51. 如請求項49或50之組合物，其中該第一嚮導RNA的該支架序列與該第二嚮導RNA的該支架序列相同。
  52. 如請求項49或50之組合物，其中該第一嚮導RNA的該支架序列與該第二嚮導RNA的該支架序列不同。
  53. 如請求項52之組合物，其中該第一嚮導RNA的該支架序列包含選自由SEQ ID NO: 901-916組成之群的序列，且其中該第二嚮導RNA的該支架序列包含選自由SEQ ID NO: 901-916組成之群的不同序列。
  54. 一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個核酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.  一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b.  一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.  與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  55. 一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個核酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  選自SEQ ID NO: 1-65中之任一者的第一間隔子序列，及選自SEQ ID NO: 67-167中之任一者的第二間隔子序列； b.  包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.  與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； d.  第一及第二間隔子，或編碼該嚮導RNA對的一或多個載體，其中該第一及第二間隔子序列包含以下對中之任一者：SEQ ID NO: 6與72；6與81；6與84；6與98；6與100；6與114；6與122；6與134；6與139；6與149；6與166；8與72；8與72；8與81；8與84；8與98；8與100；8與114；8與122；8與134；8與139；8與149；8與166；10與72；10與81；10與84；10與98；10與100；10與114；10與122；10與134；10與139；10與149；10與166；21與72；21與81；21與84；21與98；21與100；21與114；21與122；21與134；21與139；21與149；21與166；58與72；58與81；58與84；58與98；58與100；58與114；58與122；58與134；58與139；58與149；58與166；62與72；62與81；62與84；62與98；62與100；62與114；62與122；62與134；62與139；62與149；62與166；63與72；63與81；63與84；63與98；63與100；63與114；63與122；63與134；63與139；63與149；63與166；64與72；64與81；64與84；64與98；64與100；64與114；64與122；64與134；64與139；64與149；及64與166； e.  選自SEQ ID NO: 63與100及SEQ ID NO: 64與100中之任一者的第一及第二間隔子序列； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  56. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其包含嚮導RNA對，其中該嚮導RNA對具有切除功能且亦充當單一嚮導切割器。
  57. 如請求項54或55之方法，其中該第一核酸與該第二核酸存在於同一核酸分子中。
  58. 如請求項54或55之方法，其中該第一核酸與該第二核酸存在於不同的核酸分子中。
  59. 如請求項58之方法，其中該等各別核酸分子各自存在於不同載體中。
  60. 如請求項55至59中任一項之方法，其中編碼該SluCas9的該核酸不編碼嚮導RNA。
  61. 如請求項55至60中任一項之方法，其中編碼該SluCas9的該核酸編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列。
  62. 一種包含第一核酸分子及第二核酸分子的組合物，其中該第一核酸分子編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)且該第二核酸分子編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列。
  63. 如請求項62之組合物，其中該第一核酸分子不編碼嚮導RNA。
  64. 如請求項62之組合物，其中該第一核酸分子編碼： a. 一或多個選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c. 與SEQ ID NO: 1-65、67-167及201-531中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列。
  65. 如請求項62至64中任一項之組合物，其中該第一核酸分子存在於第一載體中，且該第二核酸分子存在於不同的第二載體中。
  66. 如請求項65之組合物，其中該第一及第二載體為AAV載體。
  67. 如請求項66之組合物，其中該AAV載體為AAV9載體。
  68. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
  69. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
  70. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  71. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  72. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA支架序列之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之7SK2或hU6c啟動子的反向互補序列、編碼SluCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SluCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  73. 如請求項68至72中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 63，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。
  74. 如請求項68至72中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 64，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。
  75. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 63，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。
  76. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 64，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 100。
  77. 一種組合物，其包含編碼一或多個選自SEQ ID NO: 8、63、64及81中之任一者之間隔子序列的第一核酸；及編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的第二核酸。
  78. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如請求項68至77中任一項之組合物及視情況存在的DNA-PK抑制劑遞送至細胞。
  79. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如請求項68至77中任一項之組合物遞送至細胞。
  80. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 63，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100；或 b.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 64，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  81. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i) 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 63，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100；或 b.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 64，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 100； ii)     編碼路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)的核酸；及 iii)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  82. 如請求項75或76之組合物，其中該組合物進一步包含路鄧葡萄球菌Cas9 (SluCas9)或編碼SluCas9的核酸。
  83. 如請求項75、76或82中任一項之組合物，其中該組合物與脂質奈米粒子締合。
  84. 如請求項1至74或77至83中任一項之組合物或方法，其中SV40核定域信號(NLS)與該Cas9的N端融合且核質蛋白NLS與該Cas9蛋白的C端融合。
  85. 如請求項1至74或77至83中任一項之組合物或方法，其中c-myc核定域信號(NLS)與該Cas9的N端融合且SV40 NLS及/或核質蛋白NLS與該Cas9的C端融合。
  86. 如請求項1至74或77至83中任一項之組合物或方法，其中c-myc NLS與該Cas9的N端融合(例如藉助於連接子，諸如GSVD (SEQ ID NO: 940))，SV40 NLS與該Cas9的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))，且核質蛋白NLS與該SV-40 NLS的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))。
  87. 如請求項1至86中任一項之組合物或方法，其中該(等)嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 901。
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