ES2316148T3 - Acidos nucleicos compactados y su suministro a celulas. - Google Patents
Acidos nucleicos compactados y su suministro a celulas. Download PDFInfo
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Abstract
SE COMPACTAN ACIDOS NUCLEICOS, SUSTANCIALMENTE SIN AGREGACION, PARA FACILITAR SU ABSORCIONA POR LAS CELULAS DIANA DE UN ORGANISMO AL CUAL EL MATERIAL COMPACTADO ES ADMINISTRADO. EL ACIDO NUCLEICO PUEDE PROPORCIONAR UN EFECTO CLINICO COMO RESULTADO DE LA EXPRESION DE GEN, HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS ENDOGENOS CUYA EXPRESION ES INDESEABLE, O INTEGRACION EN SITIO ESPECIFICO DE MODO QUE EL GEN DIANA ES REEMPLAZADO, MODIFICADO O ELIMINADO. LA DIANIZACION PUEDE SER AUMENTADA POR MEDIO DE UNA ESTRUCTURA UNIDORA DE CELULAS DIANA. EL ACIDO NUCLEICO PREFERIBLEMENTE ES COMPACTADO A UN ESTADO CONDENSADO.
Description
Ácidos nucleicos compactados y su suministro a
células.
La presente invención se refiere a la
compactación de ácidos nucleicos y al suministro de ácidos nucleicos
exógenos compactados a células de organismos multicelulares, in
vivo.
Pueden introducirse genes exógenos funcionales
en células de mamíferos in vitro mediante una variedad de
métodos físicos, incluyendo transfección, microinyección directa,
electroporación y coprecipitación con fosfato de calcio. Sin
embargo, la mayoría de estas técnicas no son prácticas para
suministrar genes a células dentro de animales
intactos.
intactos.
Suministro de ADN no compactado mediado por
receptor in vivo . Se ha demostrado que la transferencia
génica mediada por receptor es satisfactoria en la introducción de
transgenes en células receptoras adecuadas, tanto in vitro
como in vivo. Este procedimiento implica unir el ADN a una
proteína policatiónica (habitualmente
poli-L-lisina) que contiene un
ligando unido covalentemente, que se selecciona para seleccionar
como diana un receptor específico en la superficie del tejido de
interés. El gen se capta por el tejido, se transporta al núcleo de
la célula y se expresa durante tiempos variables. El nivel global de
expresión del transgén en el tejido diana depende de varios
factores: la estabilidad del complejo de
ADN-portador, la presencia y el número de
receptores específicos en la superficie de la célula seleccionada
como diana, la interacción
receptor-portador-ligando, la
endocitosis y el transporte del complejo al núcleo, y la eficacia de
la transcripción génica en los núcleos de las células diana.
Wu, et al., documento USP 5.166.320, da a
conocer el suministro de ADN específico de tejido usando un
conjugado de un agente de unión a ácido polinucleico (tal como
polilisina, poliarginina, poliornitina, histona, avidina o
protamina) y un ligando de proteína específico de receptor de
tejido. Para seleccionar como diana células hepáticas, Wu sugiere
"ligandos de asialoglicoproteína
(galactosa-terminal)". Estos pueden formarse,
dice Wu, o bien mediante desialización de glicoproteínas apropiadas
o bien acoplando lactosa a proteínas que no llevan galactosa. La
razón molar de ácido polinucleico con respecto a conjugado está en
el intervalo de 1:10 a 10:1, más normalmente de 1:5 a 5:1, más
preferiblemente de 1:2 a 3:1. Aunque no se estableció por Wu et
al., en manos de los inventores, el método de Wu dio como
resultado estructuras con un diámetro de al menos 80 nm.
Low, et al., documento USP 5.108.921 dan
a conocer la unión de biotina a ADN para transformar una célula
usando endocitosis mediada por receptor.
Stomp, et al., patente estadounidense
5.122.466 y McCabe, et al., patente estadounidense 5.120.657
dan a conocer la unión de ADN a un gránulo metálico uniendo
covalentemente polilisina al material y permitiendo luego que el
ADN se acompleje con él. El producto resultante se usa entonces para
la transformación balística de una célula. Véase Stomp, et
al, columna 7, líneas 29-37 y McCabe, et
al., columna 7, líneas 49-65.
Wagner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
88:4255-4259 (1991) dan a conocer la acomplejación
de un conjugado de transferrina-polilisina con ADN
para suministrar ADN a células mediante endocitosis mediada por
receptor. Wagner, et al., enseñan que es importante que haya
suficiente policatión en la mezcla para garantizar la compactación
del ADN de plásmido en estructuras toroidales de
80-100 nm de diámetro, que, especulan, facilitan el
acontecimiento endocítico. Wagner et al. no reconocen el
valor de conseguir estructuras de diámetro más pequeño ni enseñan
como obtener un mayor grado de compactación. Se cree que las
estructuras de Wagner et al. son complejos multimoleculares,
que tienen la desventaja de que son más vulnerables a la fagocitosis
por macrófagos y menos susceptibles de captarse por tejidos
diana.
Inyección directa de ADN desnudo, no
compactado. La posibilidad de detectar expresión génica
inyectando directamente ADN desnudo en tejidos animales se demostró
por primera vez por Dubenski et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 81:7529-33 (1984), que mostraron que el ADN de
plásmido o viral inyectado en el hígado o el bazo de ratones se
expresaba a niveles detectables. El ADN se precipitó usando fosfato
de calcio y se inyectó junto con hialuronidasa y colagenasa. Se
demostró que el gen transfectado se replicaba en el hígado del
animal huésped. Benvenisty y Reshef, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
83:9551-55 (1986) inyectaron ADN precipitado con
fosfato de calcio por vía intraperitoneal en ratas recién nacidas y
observaron expresión génica en los hígados de los animales 48 h
tras la transfección. En 1990, Wolff et al, Science,
247:1456-68 (1990), notificaron que la inyección
directa de vectores de expresión de ADN o ARN en el músculo de
ratones daba como resultado la expresión detectable de los genes
durante periodos de hasta 2 meses. Esta técnica se ha extendido por
Acsadi et al, New Biologist, 3:71-81 (1991)
para que incluya la inyección directa de ADN desnudo en corazones
de rata; los genes inyectados se expresaron en el corazón de los
animales durante hasta 25 días. Otros genes, incluyendo el gen para
la distrofina, se han inyectado en el músculo de ratones usando esta
técnica. Este procedimiento forma la base de un amplio enfoque para
la generación de respuesta inmunitaria en un animal mediante la
administración de un gen mediante inyección directa en el tejido
diana. El gen se expresa de manera transitoria, produciendo un
antígeno específico (véase Donnelly et al, The Immunologist,
21, págs. 20-26 (1994) para una revisión reciente).
Sin embargo, el ADN usado en estos experimentos no se ha modificado
o compactado para mejorar su supervivencia en la célula, su
captación en el núcleo o su velocidad de transcripción en el núcleo
de las células diana.
Comportamiento del ADN en disolución. El
ADN es una molécula similar a una varilla en disolución, debido a
la naturaleza sumamente cargada de manera negativa de su estructura
principal de fosfato, y su estructura básica puede perturbarse
mediante la modificación de la capa de hidratación asociada a la
hélice. Esta perturbación puede provocarse de dos formas; en primer
lugar, un cambio en el grado de neutralización de cargas de las
moléculas de ADN que da como resultado una compactación extensa y
finalmente la separación de la fase de ADN (precipitación) en forma
de estructuras compactas, y en segundo lugar, un cambio en la
constante dieléctrica de la hélice de ADN que conduce a la
formación de estructuras compactas. Estas perturbaciones dan como
resultado un cambio en la conformación de la molécula de ADN que
permite que el polímero flexible se pliegue y se compacte,
alterando marcadamente las propiedades hidrodinámicas de la molécula
de ADN. Se cree que las estructuras resultantes son de naturaleza
similar a la que adopta el ADN en los cromosomas de eucariotas
superiores y dentro de las cápsides
virales.
virales.
El ADN en el núcleo de un eucariota superior
está íntimamente asociado con proteínas nucleares básicas (es
decir, las histonas y las protaminas) con un alto contenido en
lisina y arginina (histonas) o arginina (protaminas). El complejo
de ADN con estas proteínas básicas es responsable del control de la
compactación del ADN que se produce tras la formación de los
cromosomas y se cree que desempeña un papel en la regulación de la
expresión génica. La compactación del ADN, que se produce
fisiológicamente en virus, bacterias y núcleos eucariotas, ha sido
extremadamente difícil de reproducir en el laboratorio.
Teóricamente, debido a la naturaleza sumamente cargada de manera
negativa de la estructura principal del ADN, un cambio en el grado
de neutralización de cargas del ADN da como resultado una
compactación extensa y finalmente la separación de la fase de ADN
(precipitación) en forma de estructuras compactas. Sin embargo, el
comportamiento de los complejos de ADN-policatión en
disolución depende del método para acomplejar el ADN con la
proteína policatiónica.
Estudios realizados por Olins, Olins y von
Hipple (J. Mol. Bio. 24, 157-176, 1967) usando
homopolipéptidos catiónicos como modelos para la formación de
complejos de nucleoproteína presentaron pruebas de la formación de
complejos específicos de ADN con polipéptidos catiónicos
(poli-L-lisina,
poli-L-arginina y
poli-L-ornitina) tras el
"apareamiento" de ambos componentes en disolución. Este
procedimiento implicaba la diálisis descendente desde
concentraciones de NaCl de 2 M hasta 0,010 M.
Pueden hacerse varios comentarios sobre este
estudio. En primer lugar, la desnaturalización térmica de complejos
formados mediante la adición de policatión a ADN estableció que se
producía unión del policatión al ADN en cada caso estudiado, y dio
como resultado la estabilización de la estructura bicatenaria del
ADN. Es importante indicar que este sistema difiere de aquél en el
que un cambio en la constante dieléctrica (es decir, deshidratación
con alcohol) da como resultado que el ADN se colapse sin cambios en
las características de desnaturalización térmica del ADN. En
segundo lugar, estudios espectrofotométricos indicaron que la
absorbancia máxima a 260 nm se desplazaba ligeramente hacia el rojo
con un aumento progresivo en la turbidez a longitudes de onda
superiores a 300 nm (una región en la que ni el policatión ni el
ADN muestran ninguna absorbancia). Se creyó que estas
características indicaban que estaba detectándose un pequeño cambio
conformacional, que se producía posiblemente a través de la
interacción entre el ADN y el polipéptido, mediante unos espectros
de absorción anómalos. En tercer lugar, los complejos formados
mediante la adición de polipéptidos básicos a ADN dieron como
resultado la agregación molecular y la formación de
precipitados.
Se aplicaron la dispersión rotatoria óptica y el
dicroismo circular al estudio de la interacción entre
homopolipéptidos básicos y ADN en disolución. Shapiro, Leng y
Felsenfeld (Biochemistry, 8:3219-3232, 1969)
dilucidaron los cambios en la estructura secundaria asociados con
la formación de complejos de ADN examinando su rotación óptica,
usando un protocolo para acomplejar polilisina con ADN esencialmente
diferente al de aparear ambos componentes en una diálisis salina
descendente. Mezclaron directamente polilisina y ADN en un
disolvente con alto contenido en sal (NaCl 1 M), lo que dio como
resultado la formación de complejo "soluble". Se asocia un
alto grado de turbidez al complejo en disolución, lo que indica la
agregación de los componentes. Se produjo agregación en las
muestras usadas para determinar las propiedades rotatorias ópticas
del complejo ya que los espectros de dicroismo circular se
aproximaban al nivel inicial de manera asintótica a longitudes de
onda en el intervalo de 320 a 360 nm. El espectro anómalo se asoció
siempre a la turbidez. Se ha deducido que los cambios en la
actividad óptica surgen de la formación de complejos moleculares de
orden superior tras la agregación.
Los complejos de ADN obtenidos en las
condiciones de experimentación descritas anteriormente tienen un
coeficiente de sedimentación medio que varía entre aproximadamente
5000 y 10000 unidades. La partícula promedio tenía un diámetro de
340 nm, (calculado usando información proporcionada mediante
dispersión de luz) y las partículas tenían una masa seca promedio
correspondiente a aproximadamente 70 unidades moleculares de ácido
nucleico/polipéptido. La información proporcionada por estos
estudios, aunque no es absolutamente cuantitativa, traza los cambios
estructurales que experimenta el ADN tras su unión a un polipéptido
básico.
Se han investigado varios aspectos de la
estructura de los complejos de ADN-polibase en
disolución (Haynes, Garrett y Gratzer, Biochemistry,
9:4410-4416, 1970). La microscopía electrónica
confirmó la estructura ordenada de los complejos descrita por
Shapiro et al; estructuras de ADN formadas como toroides con
forma de rosquilla, con un diámetro externo de 300 nm. Las
características de microscopía electrónica y D.C. de los complejos
de ADN-poli-base corresponden a
factores estructurales que residen en la hélice de ADN de
Watson-Crick, ya que los complejos de
polibase-polinucleótidos monocatenarios, es decir,
ARNr, poli(A), poli(U), etc. no muestran actividad
óptica anómala. Además, pueden detectarse estructuras ordenadas en
el microscopio electrónico. Con el fin de clarificar si podría
observarse en los complejos un cambio en la inclinación de las bases
y/o el paso de hélice, se determinó el patrón de difracción de
rayos X de los complejos. La doble hélice está en la forma B normal
obtenida para ADN libre en disoluciones acuosas; no se encontraron
transiciones obvias a las formas C o A de ADN, lo que sugiere la
existencia de una forma estructural diferente cuando se acompleja
el ADN con polipéptidos básicos en disolución. Hay también una
asociación de complejos de ADN-polibase que implica
el apareamiento directo de cargas, tal como se muestra mediante el
desplazamiento progresivo de contraiones en complejos de
ADN-polilisina a medida que disminuye la
concentración salina. Por tanto, cualquier interacción fuerte del
grupo amino cargado con una base es muy improbable. Así, la fuerza
rotatoria anómala del ADN en disolución surge del empaquetamiento
quiral, la clase de fenómeno asociado con la aparición de una gran
periodicidad en el empaquetamiento asimétrico de moléculas en el
mismo plano.
Lerman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
68:1986-90 (1971) notifican que cuando una
disolución diluida de ADN de fago se mezcla con una concentración
suficientemente alta de un polímero neutro sencillo (poli(óxido de
etileno)) en presencia de alta concentración de NaCl (un entorno
intracelular simulado), las moléculas de ADN de fago se colapsan en
partículas que se aproximan a la compactibilidad del contenido de
cápsides de fago. La estructura de los complejos de ADN se resolvió
por Gosule y Schellman (Nature 259: 333-335, 1976).
Su publicación junto con un informe más detallado (Gosule, L.,
Chattoraj. D.K., y Schellman. J., Advances in Poliamine Research 1:
201-215, 1978), mostraron que la compactación del
ADN (en una disolución muy diluida) mediante polipéptidos básicos
(espermina y espermidina), en las condiciones descritas por primera
vez por Li, Biopolymers, 12: 287 (1973), dio como resultado
estructuras de toroide. Los complejos generados por Gosule y
Schellman tenían una estructura unimolecular que consistía en una
única unidad de ADN de ADN de fago compactado hasta un radio máximo
de aproximadamente 50 nm. Los autores indican que se sabe que
existen poliaminas en células bacterianas. La compactación del ADN
también se trata por Laemmli, PNAS 72: 4288-92
(1975) y Post y Zimm, Biopolymers,
21:2123-32
(1982).
(1982).
Bunnell, B.A., et al. (Som. Cell Mol.
Genet., 18:559-569 (1992)) tratan una técnica para
suministrar oligonucleótidos antisentido en células usando
complejos moleculares. Se describen complejos específicos de
nucleótidos antisentido con cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y
proteína
poli(L-lisina)-asialoorosumucoide
como estructuras similares a rosquillas que oscilan desde 50 hasta
150 nm de diámetro. Se muestra posteriormente que estos complejos
inhiben la expresión de CAT en un 54% en células NIH 3H3.
La presente invención se refiere a una
composición que comprende complejos de ácido nucleico no agregados,
consistiendo esencialmente cada complejo en una única molécula de
ácido nucleico y una o más moléculas portadoras, comprendiendo
dicha única molécula de ácido nucleico un gen sintético expresable o
un ADNc, y teniendo dicha molécula portadora un resto de unión a
ácido nucleico a través del cual el ácido nucleico se acompleja con
el ácido nucleico, en la que dicho complejo se compacta hasta un
diámetro que es inferior a 30 nm.
El ácido nucleico compactado puede suministrarse
eficazmente a través de la membrana de una célula viva,
especialmente en un organismo multicelular. El ADN condensado en
pequeñas partículas puede ser más adecuado para translocación
nuclear a través de los poros nucleares y puede protegerse frente a
nucleasas. Cuando el ácido nucleico incluye un gen expresable, ese
gen puede expresarse en la célula.
En algunas realizaciones, se prepara una
molécula portadora específica de tejido, que es una molécula
bifuncional que tiene un resto de unión a ácido nucleico y un resto
de unión a tejido diana. Entonces se compacta el ácido nucleico a
altas concentraciones con la molécula portadora a una concentración
salina crítica. Luego se administra la molécula portadora cargada
con el ácido nucleico al organismo. Cada molécula portadora lleva
una única molécula de ácido nucleico.
En otras realizaciones, no se usa una molécula
portadora de unión a tejido diana. Sin embargo, el ácido nucleico
se compacta todavía complejándose con una molécula portadora que
comprende un resto de unión a ácido nucleico que reduce las
interacciones entre el ácido nucleico y el disolvente. Los complejos
compactados se administran al organismo.
Figura 1 - Caracterización física de los
complejos de
galactosa-poli-L-lisina/ADN.
La figura 1A muestra los espectros de DC
asociados con ADN normal en disolución y con ciertos complejos de
poli-L-lisina/ADN. Se agitaron con
vórtex sesenta microgramos de plásmido de
\beta-galactosidasa de CMV libre de ARN (disuelto
en tampón TE, pH 8), 150 \mul de NaCl 700 mM a velocidad media en
un aparato VIBRAX (IKA-VIBRAX-VXR).
Se añadieron gota a gota diecinueve microgramos de biconjugado de
fenilisotiocianato de
\alpha-galactopiranosilo/poli-L-lisina
en 150 \mul de NaCl 700 mM a la disolución agitada con vórtex de
ADN. La adición lenta del policatión da como resultado la formación
de una disolución turbia que se disuelve mediante la adición lenta,
progresiva de alícuotas de 3 \mul de NaCl 5 M. Se monitorizó la
desaparición de la turbidez visualmente y se investigaron mediante
DC las disoluciones de complejos de
ADN/poli-L-lisina. En este punto
(NaCl 0,97 M), el espectro de DC era el característico del ADN
agregado. La adición adicional de alícuotas de 2 \mul de NaCl 5 M
(dando como resultado una concentración de NaCl 1,031 M) produjo el
espectro de DC esperado para un complejo de ADN condensado (o
relajado). También se tomó el espectro de DC de ADN bicatenario no
acomplejado a NaCl 1 M. Los espectros se obtuvieron usando un
espectropolarímetro JASCO-600 con una cubeta de 0,1
cm. Se restó en cada caso el espectro del tampón.
Las figuras 1B-1G son
micrografías electrónicas (ME). 1B-1D, 1F y 1G se
toman a 300.000x. La barra en 1D representa 33,3 nm. La figura 1E
se tomó a 600.000x y la barra es de 16,6 nm de longitud. Se realizó
la tinción con acetato de uranilo tal como se describió
anteriormente. (Ennever, et al., Biochem. Biophys. Acta, 826:
67 (1985)). En resumen, se sometió la rejilla a descarga
luminiscente antes de la tinción. Se añadió una gota de disolución
de ADN a la rejilla, se sometió a transferencia y se tiñó usando
acetato de uranilo al 0,04%.
Para los estudios de ME mostrados en las figuras
1B-1F, se agitaron con vórtex 60 \mug de ADN de
plásmido PEPCK-hFIX (disuelto en tampón TE, pH 8),
en 150 \mul de NaCl 700 mM a velocidad media en un aparato VIBRAX
(IKA-VIBRAX-VXR). Se añadieron gota
a gota diecinueve microgramos de biconjugado de fenilisotiocianato
de
\alpha-galactopiranosilo/poli-L-lisina
en 150 \mul de NaCl 700 mM a la disolución agitada con vórtex de
ADN. La adición lenta del policatión da como resultado la formación
de una disolución turbia que se disuelve mediante la adición lenta,
progresiva de alícuotas de 3 \mul de NaCl 5 M. Se monitorizó la
desaparición de la turbidez visualmente y se investigó mediante ME
la disolución de complejos de
ADN/poli-L-lisina (figura 1C). La
adición adicional de alícuotas de 2 \mul de NaCl 5 M dio como
resultado cambios estructurales tal como se muestra en las figuras
1D y 1E.
La figura 1B es una ME de ADN no acomplejado (1
\mug/ml a NaCl 1 M). La figura 1C representa un complejo de ADN a
la concentración subóptima de NaCl (760 mM). El ADN está en el
estado agregado; son visibles agrupaciones de toroides
unimoleculares. En la figura 1D, el complejo de ADN está a una
concentración óptima de NaCl para el complejo en cuestión (968 mM).
El ADN está apropiadamente condensado; sólo pueden observarse
toroides individuales. Para la figura 1E, se seleccionaron cuatro
complejos de ADN de la figura 1D y se imprimieron a más aumentos.
En la figura 1F, se observa un complejo de ADN, a una concentración
de NaCl 1,068 M, que es superior a la óptima para la condensación
de este complejo. El ADN está en el estado relajado. Obsérvense los
toroides unimoleculares ramificados en los que es visible un núcleo
de condensación y las fibras de ADN similares a varillas.
Las diferencias en la concentración de NaCl
requerida para los estados agregado, condensado y relajado en los
experimentos anteriores representan diferencias específicas de ADN o
policatión.
En un tercer experimento, se formaron complejos
de \beta-galactosidasa de CMV y
poli-L-lisina galactosilada
esencialmente como en Wu et al. Brevemente, se combinaron ADN
de plásmido y poli-L-lisina
galactosilada en NaCl 3 M. Se incubaron las muestras durante 1 hora
a temperatura ambiente, luego se dializaron frente a NaCl 0,15 M
durante 16 h a través de membranas con un límite de masa molecular
de 3.500 dalton. En la inspección visual, no estaban presentes
precipitados en el dializado.
La figura 1G es una micrografía electrónica del
complejo de ADN resultante, que está en el estado agregado
multimolecular. Obsérvese que los toroides en este caso son más
grandes que en 1C o 1D (la escala es la misma). La figura 1H
muestra el espectro de DC desde 240 hasta 300 nm para ADN no
acomplejado y para complejos de ADN multimulecular
agregado/poli-L-Lys, de modo que se
destaca la inversión del máximo del espectro del ADN normal a 269
nm. Esta inversión es característica de la agregación
multimolecular.
En otro experimento, se agitaron con vórtex
sesenta microgramos de ADN de plásmido de PEPCK-hFIX
(disuelto en tampón TE, pH 8), en 150 \mul de NaCl 200 mM a
velocidad media en un aparato VIBRAX
(IKA-VIBRAX-VXR). Se añadieron gota
a gota diecinueve microgramos de biconjugado de fenilisotiocianato
de
\alpha-galactopiranosilo/poli-L-lisina
en 150 \mul de NaCl 200 mM a la disolución agitada con vórtex de
ADN. La adición del policatión dio como resultado la formación de
precipitados en la inspección visual.
La figura 1I es un espectro de DC, proporcionado
por un complejo de ADN precipitado. Es esencialmente plano desde
240 hasta 300 nm. La figura 1J es una micrografía electrónica del
ADN precipitado.
Figura 2 - Relevancia funcional y
especificidad del sistema de transferencia de genes. (A) Se
evaluó la concentración relativa de factor IX humano en la sangre
de animales tratados con el complejo de ADN midiendo la actividad
procoagulante de factor IX humano. Se usó una modificación del
tiempo de tromboplastina parcial, activado por caolín, de una fase.
Se obtuvieron muestras de sangre de animales de experimentación
mediante punción venosa. Se añadió una quincuagésima parte del
volumen de citrato de sodio 500 nM, pH 5,0, para evitar la
coagulación y se almacenó el plasma a -20ºC. Se sometieron a ensayo
las muestras por duplicado, y se comparó su actividad con la
actividad funcional del plasma reunido de 24 hombres adultos
normales. En todos los cálculos, una unidad de actividad del factor
IX en un ml de plasma humano normal es equivalente al 100% de
actividad funcional o aproximadamente 3 \mug de factor IX por ml.
Se restó la actividad inicial del factor IX humano en el plasma de
la rata antes de la representación gráfica. (B) Se alimentaron los
animales transfectados con una dieta libre de hidratos de
carbono/con alto contenido en proteínas durante una semana. Se
tomaron muestras de sangre al inicio del tratamiento y tras una
semana con la dieta y se analizaron mediante hibridación por
inmunotransferencia de tipo Western. Se compararon los animales a
los 8 y 12 días con ratas transfectadas alimentadas con una dieta
comercial convencional. Se obtuvieron los datos mediante análisis
desitométrico de películas fotográficas de inmunotransferencias de
tipo Western e indican el aumento en veces de proteína de factor IX
humano tras el tratamiento dietético.
Figura 3.- Especificidad tisular de complejo
de ADN manosilado en el transporte dirigido de ADN a los macrófagos
in vivo . Se conjugó
poli-L-lisina manosilada con ADN de
SV40/luciferasa. Se introdujeron 300 \mug de complejo de ADN en
la vena cava caudal de ratas. Cuatro días tras la inyección, se
prepararon extractos de tejido y se sometieron a ensayo para
determinar la actividad luciferasa. Se representa gráficamente la
actividad luciferasa como unidades de luz integradas por miligramo
de extracto de proteína de bazo, hígado y pulmón. En otros tejidos
no se encontró actividad. Los datos se expresan como medias \pm
error estándar de la media (EEM). Las barras claras son los
controles no transfectados (n=4), y las barras oscuras, los animales
transfectados con complejos de
poli-L-lisina manosilada/ADN
(n=5).
Figura 4.- Especificidad del complejo de ADN
manosilado en el transporte dirigido de ADN a cultivo primario de
macrófagos in vitro . Se transfectaron cultivos primarios
de macrófagos peritoneales o bien con
poli-L-lisina galactosilada (barras
claras) o bien con poli-L-lisina
manosilada (barras oscuras) conjugada con un ADN de
SV40/luciferasa. A los tiempos indicados (2, 4, 8 y 24 horas), se
lavaron las células. Veinticuatro horas tras la transfección, se
recogieron las células y se sometieron a ensayo para determinar la
actividad luciferasa. Se representa gráficamente la actividad
luciferasa como actividad luciferasa relativa tras normalizarse
mediante la actividad encontrada en controles no transfectados. Los
datos se expresan como medias \pm error estándar de la media
(EEM).
Figura 5.- Competición entre el complejo de
ADN manosilado y albúmina sérica bovina manosilada por la unión al
receptor de manosa de macrófagos. Se transfectaron cultivos
primarios de macrófagos peritoneales con
poli-L-lisina manosilada conjugada
con ADN de SV40/luciferasa (T). Antes de la adición del complejo de
ADN, se añadió un exceso de 100 veces de albúmina sérica bovina
manosilada a un conjunto de placas (Tc). También se sometieron a
ensayo controles no transfectados (NT) para determinar la actividad
luciferasa 24 horas tras la transfección. Se representa
gráficamente la actividad luciferasa como actividad luciferasa
relativa tras normalizarse en relación con la actividad encontrada
en controles no transfectados. Los datos se expresan como medias
\pm error estándar de la media (EEM).
Figura 6.- Transferencia génica in
vivo usando el complejo de ADN conjugado con
Fab-poli-L-lisina
anti-plg-R de rata. Se conjugó
Fab-poli-L-lisina
con ADN de SV40/luciferasa y se introdujo en la vena cava caudal de
ratas (transfectadas) (n=3). Se procesaron como controles, controles
no transfectados (control) (n=3), animales a los que se les inyectó
un complejo de
Fab-poli-L-lisina-ADN
que contenía un fragmento Fab obtenido de una IgF irrelevante
(FabI) (n=3) y animales a los que se les inyectó un complejo de ADN
que no contiene un gen de SV40/luciferasa (ADNI) (n=3). Dos días
tras la inyección, se prepararon extractos de tejido y se sometieron
a ensayo para determinar la actividad luciferasa. Se representa
gráficamente la actividad luciferasa como unidades de luz
integradas por miligramo de extracto de proteína. Los datos se
expresan como medias \pm error estándar de la media (EEM).
Figura 7.- Transcurso de tiempo de la
expresión en pulmón e hígado de animales inyectados usando el
complejo de ADN conjugado con
Fab-poli-L-lisina
anti-plg-R de rata. Se conjugó
Fab-poli-L-lisina
con ADN de SV40/luciferasa y se introdujo en la vena cava caudal de
ratas (n=9). Se sacrificaron las ratas 2 (n=3), 4 (n=3) y 6 (n=3)
días tras la inyección. Se prepararon extractos de pulmón e hígado y
se sometieron a ensayo para determinar la actividad luciferasa. Se
representa gráficamente la actividad luciferasa como unidades de luz
integradas por miligramo de extracto de proteína usando una escala
logarítmica. Los datos se expresan como medias \pm error estándar
de la media
(EEM).
(EEM).
Figura 8.- Competición entre el complejo de
ADN galactosilado y asialoorosomucoide por la unión al receptor de
ASGP de células HepG2. Se transfectaron células de hepatoma
HepG2 con poli-L-lisina
galactosilada conjugada con ADN de PEPCK-hFIX.
Antes de la adición del complejo de ADN, se añadió un exceso de 100
veces de asialoorosomucoide a un conjunto de placas (+ Comp.). Se
monitorizó la internalización de ADN mediante hibridación por
ranuras del medio de cultivo que contenía el complejo de ADN. Los
datos se expresan como el porcentaje de ADN internalizado por el
receptor a diferentes tiempos tras la transfección.
Figura 9 Inyección directa al músculo e
hígado de ADN desnudo frente a ADN condensado. Se inyectaron
cien microgramos de ADN desnudo que codifica luciferasa de SV40 en
el hígado y músculo abdominal de dos ratas. Se inyectó la misma
cantidad del plásmido pSV40-luciferasa acomplejado
con poli-L-lisina y condensado tal
como se describió en el ejemplo 1, tanto en el hígado como el
músculo abdominal de otros dos animales. Las ratas se sacrificaron
48 horas tras la inyección. Se homogeneizó un trozo de hígado y
músculo abdominal en tampón de lisis y se analizaron los lisados
celulares para determinar la actividad luciferasa. Se realizaron
todas las mediciones de luciferasa por triplicado, se expresaron
como un promedio de los valores y se normalizaron para la proteína
total. La figura 9 muestra las unidades de luciferasa integradas por
mg de proteína en dos conjuntos diferentes de
animales.
animales.
Figura 10 Inyección directa en el tectum del
cerebro de ADN desnudo frente a ADN condensado. Inyecciones
intratecales de ADN de plásmido condensado con
poli-L-lisina y desnudo pueden
lograr altos niveles de expresión en el cuerpo celular de la
neurona a lo largo de 20 días. Actividad
\beta-galactosidasa en retinas de ratas a cuyos
cerebros se inyectó en las zonas tectales y se les administró o bien
pCMV-lacZ desnudo o pCMV-lacZ
condensado (pCMV-lacZ + lys) a las concentraciones
mostradas. Cuando el ADN no está condensado con
poli-L-lisina el nivel de expresión
retorna al inicial tras 10 días tras la inyección.
Figura 11 Cambios en la absorbancia de los
complejos de ADN durante el proceso de condensación. Se condensó
un plásmido que contenía el gen del receptor de hLDL de CMV
quimérico con poli-L-lisina, usando
el procedimiento descrito en detalle en el ejemplo 1. Tras la
adición de poli-L-lisina, se
determinó la absorbancia de la disolución a 260 nm. Entonces se
añadió NaCl concentrado progresivamente y se determinó la
absorbancia. Se indica la absorbancia esperada para el ADN
contenido en el complejo mediante la línea de puntos. La
concentración de NaCl inicial usada en la reacción de condensación
fue de 500 mM.
Figura 12 Relación entre la estructura del
complejo de ADN y su función en ratas adultas. Se prepararon
complejos de ADN-poli-lisina
galactosilada que corresponden a diversos estados de
condensación/agregación mostrados en la figura
1B-1G. El ADN consistía en el promotor de SV40 unido
al gen estructural para el gen de luciferasa de P. pyralis.
Se inyectaron a las ratas 300 \mug de los diversos complejos de
ADN en la vena cava caudal y se determinó la actividad luciferasa
en extractos del hígado y el bazo 48 h tras la inyección. Cada
barra representa la media \pm EEM para tres ratas; no se inyectó a
las ratas control el complejo de ADN.
Figura 13 Introducción de 3 mg de
PEPCK-hLDLr en su forma relajada (no acomplejadada)
frente a la condensada. Con el fin de introducir el complejo de
ADN en el animal, se realizó una inyección única de
3-10 ml de la disolución de complejo de ADN (NaCl
\sim400-900 mM) en la vena marginal de la oreja
del conejo. Se extrajeron aproximadamente 1,5 ml de sangre a los
tiempos indicados de la arteria de la oreja a las 4 p.m. Se realizó
la determinación de la concentración de colesterol sérico en el
Laboratorio Clínico de Hospitales Universitarios de Cleveland a
partir de 300 \mul de suero. La administración de una disolución
de complejo de ADN que contenía 3 mg del plásmido
pPEPCK-hLDLR en un estado relajado al conejo nº 676
no dio como resultado una disminución significativa (primera
flecha) en los niveles de colesterol sérico total. Una segunda
inyección de complejos de ADN apropiadamente condensados que
contenía 3 mg del mismo ADN (segunda flecha) produjo una reducción
del 20% de los niveles de colesterol en la sangre. Cuatro semanas
tras esta segunda administración, el colesterol retornó a
aproximadamente los niveles anteriores al tratamiento, alcanzando un
pico a aproximadamente 35 días.
Figura 14 Inyección del complejo de
poli-L-lisina/ADN que contiene 9 mg
del gen de PEPCK-hLDLr quimérico. En el segundo
experimento, se administraron 9 mg del gen de
PEPCK-hLDLr apropiadamente condensado con
poli-L-lisina galactosilada al
conejo nº 737. Tal como se muestra en la figura 14, el tratamiento
dio como resultado una reducción del 38% de los niveles de
colesterol sérico total que duraron aproximadamente 5 semanas. Por
tanto, un aumento de 3 veces en la dosis de complejo de ADN dio
como resultado una reducción de 2 veces en los niveles de
colesterol sérico total.
Figura 15 Inyección del complejo de
poli-L-lisina/ADN que contiene 3 mg
del gen de hLDLr de CMV quimérico. La administración de una
disolución de complejo de ADN que contenía 3 mg del gen del receptor
de hLDL de CMV quimérico al conejo nº 16 dio como resultado una
reducción máxima del 30% en los niveles de colesterol sérico total
(figura 15). Once semanas tras la inyección, los niveles de
colesterol son todavía el 20% inferiores a los observados antes del
tratamiento.
Figura 16 Inyección de dosis múltiples del
complejo de poli-L-lisina/ADN que
contiene 3 mg del gen de hLDLr de CMV quimérico. Se inyectó a
los conejos nº 775 (figura 16A) y nº 774 (figura 16B) 3 mg del
complejo pCMV-hLDLR. En el conejo nº 775, esto
provocó una reducción máxima del 24% en la concentración de
colesterol en la sangre, 3 semanas tras el tratamiento. Dos
inyecciones adicionales no dieron como resultado una reducción
significativa adicional en el colesterol sérico. En el conejo nº
774, se observó una disminución del 36% en los niveles de
colesterol en la sangre (figura 16B) tras la inyección inicial. Se
realizaron cuatro nuevas inyecciones una vez cada 2 semanas con la
misma cantidad de complejo de ADN. Dos de ellas dieron como
resultado un efecto mínimo mientras que las otras dos dieron como
resultado una reducción nula de los niveles de colesterol sérico
total. Sin embargo, tras cinco administraciones de la disolución de
complejo de ADN que contenía 3 mg de pCMV-hLDLr, la
concentración de colesterol había bajado aproximadamente un 48% con
respecto a niveles anteriores al
tratamiento.
tratamiento.
El conejo nº 774 se trató entonces con 10 mg de
lovastatina (barra rayada) por día durante 10 semanas. Se ha
observado una reducción del 20% adicional en los niveles de
colesterol. Por tanto, la inhibición de la ruta endógena para la
síntesis de colesterol ha llevado la concentración de colesterol del
conejo nº 774 hasta el 40% de la anterior para la primera
transferencia génica (figura 16B).
Figura 17 Inyección simulada del complejo de
poli-L-lisina/ADN que contiene 3 mg
del gen de luciferasa de SV40 quimérico (ADN irrelevante). Con
el fin de controlar una posible reducción no específica en los
niveles de colesterol sérico total inyectando a los conejos los
complejos de poli-L-lisina
galactosilada/ADN en una disolución con alta concentración de NaCl
(\sim900 mM), se ha administrado una disolución de complejo de ADN
que contiene un ADN irrelevante tal como el gen de luciferasa en el
conejo nº 775. La figura 17 muestra que la inyección da como
resultado una reducción no significativa (\leq12%) y transitoria
(\leq5 días) en la concentración de colesterol sérico. Por tanto,
se ha confirmado que la reducción en los niveles de colesterol
sérico total tras la inyección de partículas de ADN apropiadamente
condensadas que codifican para el gen del receptor de LDL humano no
son un resultado de o bien la alta concentración de NaCl de la
disolución o bien de la presencia de partículas de
poli-L-lisina galactosilada/ADN.
Figura 18 Relación de la turbidez con la
concentración de NaCl. La figura muestra el efecto de la
concentración de NaCl inicial y actual sobre la turbidez de una
disolución de ADN/poli-lisina. Cada línea representa
una concentración inicial diferente.
Figura 19 Efecto de la longitud de la
poli-L-lisina sobre la concentración
de NaCl.
Figura 20 Espectros de DC para diferentes
complejos. Se tomaron espectros de DC en una cubeta con una
longitud de trayectoria de 0,1 cm. Se complejó el ADN con
poli-L-lisina a razones molares
idénticas de grupos amino con respecto a grupos fosfato y se
compararon diversos espectros de DC: (A) control convencional para
ADN en NaCl 1 M; (B) \Psi-ADN tal como se observa
a una concentración de NaCl a la que se produce agregación
multimolecular; (C) el ADN agregado muestra turbidez y disminución
de la elipticidad; (D) complejos de ADN condensado, unimolecular;
(E) espectro del complejo de ADN relajado. Los espectros se tomaron
a iguales concentraciones de polímero y se restó la señal para el
tampón en cada caso. Se presentan detalles del ensayo en los
Métodos.
Cualquier organismo multicelular en el que puede
ser deseable introducir ácido nucleico exógeno es un posible objeto
de la presente invención. El organismo multicelular puede ser una
planta o un animal, preferiblemente este último. El animal es
preferiblemente un animal vertebrado, y más preferiblemente un
vertebrado superior, es decir, un mamífero o un ave, prefiriéndose
especialmente el primero. Entre los mamíferos, los sujetos
preferidos son los seres humanos y otros primates, animales de
laboratorio tales como ratones, ratas, conejos y hámsteres,
animales de compañía tales como perros y gatos, y animales de granja
tales como caballos, vacas, cabras, cerdos y ovejas. Se observará
que estos
\hbox{animales provienen de cuatro órdenes de la clase Mammalia : Primata, Rodenta, Carnivora y Artiodactyla .}
Las células diana pueden pertenecer a tejidos
(incluyendo órganos) del organismo, incluyendo células que
pertenecen a (en el caso de un animal) su sistema nervioso (por
ejemplo, el cerebro, la médula espinal y células nerviosas
periféricas), el sistema circulatorio (por ejemplo, el corazón,
tejido vascular y glóbulos rojos y blancos), el sistema digestivo
(por ejemplo, el estómago y los intestinos), el sistema respiratorio
(por ejemplo, la nariz y los pulmones), el sistema reproductor, el
sistema endocrino (el hígado, bazo, tiroides, paratiroides), la
piel, los músculos o el tejido conjuntivo.
Alternativamente, las células pueden ser células
de cáncer derivadas de cualquier órgano o tejido del organismo
diana, o células de un parásito o patógeno que infecta al organismo,
o células del organismo infectadas víricamente.
Un procedimiento útil para la terapia génica
hepática requiere un enfoque eficaz y relativamente no invasivo
para la introducción de genes de interés en el hígado. Se han usado
con algo de éxito varias técnicas que emplean transferencia génica
mediada por receptor. Sin embargo, hay una necesidad de un
procedimiento fácilmente reproducible que dé cómo resultado la
expresión prolongada del transgén en el hígado, incluso en ausencia
de hepatectomía parcial, y que por tanto podría usarse para terapia
génica en seres humanos. Se ha introducido ADN exógeno en
hepatocitos de animales adultos seleccionando como diana el receptor
de asialoglicoproteína (ASGP) por medio de un biconjugado de
ligando-poli-L-lisina.
Para que la técnica de transporte dirigido del ligando sea eficaz,
el ADN debe estar en una forma que permita que permanezca intacto en
la sangre y debe ser lo suficientemente pequeño para que se
reconozca por el receptor de ASGP en la superficie de los
hepatocitos. Wagner, et al. (1991) han dirigido genes al
receptor de transferrina en células de hepatoma condensando el ADN
con un conjugado de
poli-L-lisina/transferrina, en un
complejo con un diámetro de 80-100 nm. Este tamaño
de conjugado de ADN es apropiado para su reconocimiento por el
receptor de transferrina en células de hepatoma, pero el receptor
de ASGP de hepatocitos discrimina a ligandos mayores de
10-20 nm de diámetro.
Se ha desarrollado un procedimiento para la
introducción de genes en el hígado de animales adultos mediante
captación mediada por receptor que dio como resultado la expresión
del gen durante 140 días (la duración del experimento). Este
procedimiento tiene potencial para su aplicación a terapia génica en
seres humanos. Las ventajas principales de este método son (i) la
facilidad de preparación del complejo de ADN; (ii) la capacidad de
dirigir genes a tejidos específicos; (iii) la expresión prolongada
del gen en el hígado; (iv) la seguridad relativa del complejo, dado
que carece de ADN viral infeccioso; y (v) el mantenimiento episómico
del gen introducido.
El "transporte dirigido" es la
administración del ácido nucleico compactado de tal manera que entra
en las células diana en cantidades eficaces para lograr el
propósito clínico. A este respecto, debe indicarse que el ADN y el
ARN pueden replicarse en el núcleo de la célula diana, y en
consecuencia el nivel final del ácido nucleico en la célula puede
aumentar tras la captación. Además, si el efecto clínico está
mediado por una proteína expresada por el ácido nucleico, debe
indicarse que el ácido nucleico actúa como molde, y por tanto
pueden lograrse altos niveles de expresión de proteína incluso si el
número de copias del ácido nucleico en la célula es bajo. No
obstante, es deseable compactar altas concentraciones de ADN para
aumentar el número de células diana que captan el ADN y el número
de moléculas de ADN captadas por cada célula.
La vía y el sitio de administración pueden
elegirse para potenciar el transporte dirigido. Por ejemplo, para
seleccionar como diana células musculares, la inyección
intramuscular en los músculos de interés sería una elección lógica.
Podrían seleccionarse como diana células pulmonares administrando el
ADN compactado en forma de aerosol. Podrían seleccionarse como
diana células endoteliales vasculares recubriendo un catéter de
balón con el ADN compactando e introduciendo mecánicamente el
ADN.
En algunos casos, el resto de unión a ácido
nucleico, que mantiene el ácido nucleico en estado compactado,
también puede servir como agente de transporte dirigido. Se sabe que
polímeros de aminoácidos cargados positivamente actúan como señales
de localización nuclear (NLS) en muchas proteínas nucleares. Se
inyectó in situ un ADN de luciferasa de pSV40 condensado con
poli-L-lisina, en el músculo
abdominal de ratas. A pesar de la ausencia de un resto de unión a
célula diana explícito, se observó una actividad luciferasa 20 veces
superior en ratas a las que se inyectó el ADN acomplejado que en
ratas a las que se inyectó ADN desnudo. No obstante, en algunas
realizaciones, puede mejorarse el transporte dirigido si se emplea
un resto de unión a célula diana.
Si se usa un TBM, debe unirse específicamente a
una estructura accesible (el "receptor") de las células diana
previstas. No es necesario que sea absolutamente específico para
esas células, sin embargo, debe ser suficientemente específico para
que el conjugado sea terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, su
reactividad cruzada con otras células es inferior al 10%, más
preferiblemente inferior al 5%.
No hay una afinidad mínima absoluta que el TBM
deba tener por una estructura accesible de la célula diana, sin
embargo, cuanto mayor sea la afinidad, mejor. Preferiblemente, la
afinidad es al menos de 10^{3} litros/mol, más preferiblemente,
al menos 10^{6} litros/mol.
El TBM puede ser un anticuerpo (o un fragmento
de unión específico de un anticuerpo, tal como un Fab, Fab,
V_{M}, V_{L} o CDR) que se une específicamente a un epítopo en
la superficie de la célula diana. Se conocen en la técnica métodos
para producir anticuerpos frente a células, membranas celulares o
antígenos de la superficie celular
aislados:
aislados:
a. Producción de células inmunitarias del
bazo: inmunización con antígenos solubles Hurrell, J. G.
R. (1982) Monoclonal Antibodies: Techniques and
Applications. CRC Press, Boca Raton, Florida.
b. Inmunización con antígenos complejos:
membranas, células completas y microorganismos. Hurrell,
J. G. R. (1982) Monoclonal Antibodies: Techniques and
Applications. CRC Press, Boca Raton, Florida.
c. Producción de sobrenadantes monoclonales y
líquidos ascíticos. Andrew, S. M. y Titus, J. A.
(1991). Purification of Immunoglobulin G. in Current
Protocols in Immunology (J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H.J.
Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, ed.) págs.
A.3.9-A.3.12. Greene Publishing
Wiley-Interscience, Nueva York.
d. Producción de antisuero policlonal en
conejos. Garvey J.S., Cremer, N.E. y Sussdorf, D.H (eds)
(1977) Methods in Immunology: A Laboratory Text for
Instruction and Research, tercera edición. W. A. Benjamin,
North Hampton, Mass.
e. Producción de anticuerpos
anti-péptido mediante acoplamiento químico de
péptidos sintéticos con proteínas portadoras Jemmerson,
R., Morrow, P. I., Klinman, N. I y Patterson,
Y. (1985). Analysis of an evolutionary conserved site on
mammalian cytochrome C using synthetic peptides. Proc. Natl Acad.
Sci, U.S.A. 82, 1508-1512.
El TBM puede ser una lectina, para la que hay
una estructura de hidrato de carbono análoga en la superficie
celular.
El resto de unión a la diana puede ser un
ligando que se une específicamente por un receptor portado por las
células diana.
Una clase de ligandos de interés son los
hidratos de carbono, especialmente los mono y oligosacáridos. Los
ligandos adecuados incluyen galactosa, lactosa y manosa.
Otra clase de ligandos de interés son péptidos
(que en este caso incluyen proteínas), tales como insulina,
factor/factores de crecimiento epidérmico(s), factor de
necrosis tumoral, prolactina, gonadotropina coriónica, FSH, LH,
glucagón, lactoferrina, transferrina, apolipoproteína E, gp120 y
albúmina.
\newpage
La siguiente tabla enumera restos de unión a la
diana preferidos para diversas clases de células diana:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El resto de unión a la diana no es estrictamente
necesario en el caso de inyección directa del complejo condensado
de NABM/NA. La célula diana en este caso es accesible de manera
pasiva al complejo condensado de NABM/NA mediante la inyección del
complejo en la proximidad de la célula diana.
La posibilidad de detectar la expresión génica
encapsulando ADN en un liposoma (cuerpo contenido por una bicapa
lipídica) usando diversas condiciones de lípidos y disolvente, e
inyectando el liposoma en tejidos animales, se ha demostrado
ampliamente (1-7). Sin embargo, a pesar del
potencial de esta técnica para una variedad de sistemas biológicos,
el ADN usado en estos experimentos no se ha modificado o compactado
para mejorar su supervivencia en la célula, su captación en el
núcleo o su tasa de transcripción en el núcleo de las células diana.
Por tanto, estos procedimientos han dado como resultado
habitualmente sólo la expresión transitoria del gen portado por el
liposoma (4, 5).
Se han usado satisfactoriamente lípidos
catiónicos para transferir ADN. El componente catiónico de tales
lípidos puede compactar ADN en disolución (1-3, 7).
Se ha demostrado que este método da como resultado complejos de ADN
agregado de manera pesada (1, 2) que, cuando se usan para
transfectar el ADN in vitro, dan como resultado un aumento
de la eficacia de la expresión y la transferencia génicas (en
relación con el ADN desnudo). Aunque la formación de estos
complejos puede estimular la transferencia génica in vitro,
la inyección de tales complejos in vivo no da como resultado
una transferencia génica eficaz y de larga duración. Por tanto, el
procedimiento de condensación podría proporcionar características
estructurales al complejo de ADN/lípido catiónico que lo harán más
susceptible a una expresión in vivo prolongada. Se cree que
la combinación de tales métodos podría conseguirse mediante
cualquiera de dos procedimientos:
- 1.
- Formación de complejo de ADN condensado que se encapsula más tarde usando lípidos neutros en cuerpos de liposoma, o
- 2.
- Usando el procedimiento descrito en esta patente, podría conseguirse la formación de complejos unimoleculares de ADN sumamente condensado tras la condensación con lípidos catiónicos. Estos complejos deben proporcionar una eficacia superior de la transferencia génica en tejidos de animales in vivo.
El procedimiento para la condensación de ADN, si
se acopla a la encapsulación del ADN compactado resultante en un
cuerpo de liposoma, podría proporcionar una variedad de ventajas
para la transfección en animales:
- 1.
- El liposoma estimula la fusión pasiva con la bicapa lipídica de la membrana citoplasmática de células de mamíferos en tejidos.
- 2.
- El ADN condensado podría transferir entonces la información genética con una alta eficacia a través de los compartimentos de la célula hasta el núcleo para su expresión.
- 3.
- El ADN condensado podría protegerse contra la degradación en el interior de la célula, aumentando así la duración de la expresión del gen recién introducido.
- 4.
- Podría evitarse la posible respuesta inmunológica frente al ADN condensado con policatión mediante la encapsulación con la bicapa lipídica inmunológicamente inerte.
\vskip1.000000\baselineskip
1 Ghirlando, R., Wachtel, E. J,
Arad, T. y Minsky, A. (1992) ADN packaging
induced by micellar aggregates: A novel in vitro ADN
condensation system. Biochemistry, 31,
7110-7119.
2 Braulin, W. H., Strick, T. J., y
Record, M. T., Jr. (1982) Biopolymers 21,
1301-1309.
3 Zhu, N., Liggitt, D.,
Liu, Y., Debs, R. (1993) Systemic gene
expression after intravenous ADN delivery into adult mice.
Science, 261, 209-211.
4 Alino, S. F., Bobadilla, M.,
Garcia-Sanz, M., Lejarreta, M.,
Unda, F. e Hilario, E. (1993) In vivo
delivery of human \alpha1-antitrypsin gene to
mouse hepatocytes by liposomes. Biochem. Biophys. Research
Communications 192, 174-181.
5 Takeshits, S., Losordo, D. W.,
Kearney, M., Rossow, S. T. e Isner, J. M.
(1994) Time course of recombinant protein secretion after
liposome-mediated gene transfer in a rabbit arterial
organ culture model. Lab. Invest. 71,
387-391.
6 Jarnagin, W. R., Debs, R. J.,
Wang, S. S. y Bissell, D. M. (1992) Nucleic
Acids Res. 20, 4205-4211.
7 Philip, R., Liggitt, D.,
Phillip, M., Dazin, P., Debs, R. (1993)
In vivo gene delivery. Efficient transfection of T
lymphocytes in adult mice. J. Biol. Chem. 268,
16087-16090.
\vskip1.000000\baselineskip
Cualquier sustancia que se una
reversiblemente a un ácido nucleico puede servir como resto
de unión a ácido nucleico (NABM), siempre que (1) se una de manera
suficientemente fuerte y específica al ácido nucleico para
retenerlo hasta que el conjugado alcanza y entra en la célula diana,
y, a través de su unión, no daña o altera sustancialmente el ácido
nucleico y (2) reduzca las interacciones entre el ácido nucleico y
el disolvente, y de ese modo permita que se produzca la
condensación. El último criterio es uno de eficacia terapéutica del
conjugado.
Preferiblemente, el NABM es un policatión. Sus
grupos cargados positivamente se unen iónicamente al ADN cargado
negativamente, y la neutralización de la carga resultante reduce las
interacciones ADN-disolvente. Un policatión
preferido es la polilisina. Otros restos de unión a ácido nucleico
potenciales incluyen polímeros mixtos de Arg-Lys,
poliarginina, poliornitina, histonas, avidina y protaminas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se dan a conocer procedimientos básicos para
construir moléculas de ADN y ARN recombinantes según la presente
invención por Sambrook, J. et al., en: Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, NY (1989), referencia que se incorpora al presente
documento como referencia.
El ácido nucleico puede ser un ADN, ARN o un
derivado de ADN o ARN tal como un derivado resistente a la
degradación in vivo, tal como se trata a continuación.
Dentro de esta memoria descriptiva, las referencias a ADN se
aplican, cambiando lo que se deba cambiar, a otros ácidos nucleicos
también, a menos que se prohíba claramente por el contexto. El
ácido nucleico puede ser mono o bicatenario. Tiene preferiblemente
de 100 a 1.000.000 bases (o pares de bases), más preferiblemente de
100 a 100.000, y las bases pueden ser iguales o diferentes. Las
bases pueden ser las bases "normales" adenina (A), guanina (G),
timidina (T), citosina (C) y uracilo (U), o bases anómalas tales
como las enumeradas en 37 CFR \NAK 1,822 (p) (1). El ácido
nucleico puede prepararse mediante cualquier procedimiento deseado.
El ácido nucleico debe comprender un gen sintético expresable o un
ADNc.
En una realización preferida, el ácido nucleico
comprende un gen expresable que es funcional en la célula diana.
Por ejemplo, el gen puede codificar para factores de coagulación,
(tales como el factor IX), enzimas implicadas en defectos
metabólicos específicos, (tales como enzimas del ciclo de la urea,
especialmente ornitina transcarbamilasa, argininosuccinato sintasa
y carbamil fosfato sintasa); receptores, (por ejemplo, receptor de
LDL); toxinas; timidina cinasa para destruir células o tejidos
específicos; canales iónicos (por ejemplo, canal de cloruro de la
fibrosis quística); transportadores de membrana (por ejemplo,
transportador de glucosa); proteínas citoesqueléticas, (por
ejemplo, distrofina). El gen puede ser de origen sintético, de ADNc
o genómico, o una combinación de los mismos. El gen puede ser uno
que se produce en la naturaleza, un gen que se produce de manera no
natural que no obstante codifica un polipéptido que se produce de
manera natural, o un gen que codifica un mutante reconocible de tal
polipéptido. También puede codificar para un ARNm que será
"antisentido" con respecto al ADN encontrado o un ARNm que se
transcribe normalmente en la célula huésped, pero ARN antisentido
que no puede traducirse por sí mismo en una proteína funcional.
Para que el gen sea expresable, la secuencia
codificante debe unirse operativamente a una secuencia promotora
funcional en la célula diana. Se dice que dos secuencias de ADN
(tales como una secuencia de región promotora y una secuencia
codificante) están operativamente unidas si la naturaleza del
ligamiento entre las dos secuencias de ADN (1) no da como resultado
la introducción de una mutación de desplazamiento del marco de
lectura en la secuencia de la región para dirigir la transcripción
de la secuencia génica deseada, o (3) interfiere con la capacidad
para transcribirse de la secuencia génica por la secuencia de región
promotora. Una región promotora estaría operativamente unida a una
secuencia de ADN si el promotor pudiese afectar a la transcripción
de esa secuencia de ADN. Con el fin de estar "operativamente
unido" no es necesario que dos secuencias estén inmediatamente
adyacentes entre sí. Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal
como ADN, "puede expresar" un ARNm si contiene secuencias de
nucleótidos que contienen información reguladora de la transcripción
y tales secuencias están "operativamente unidas" a secuencias
de nucleótidos que codifican para el ARN. La naturaleza precisa de
las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede
variar de un organismo a otro, pero en general incluyen un promotor
que dirige la iniciación de la transcripción del ARN. Tales regiones
pueden incluir aquellas secuencias no codificantes en 5' implicadas
en la iniciación de la transcripción tales como la caja TATA.
Si se desea, puede obtenerse la región no
codificante en 3' para la secuencia génica que codifica el producto
de ARN deseado. Esta región puede conservarse por sus secuencias
reguladoras de la terminación de la transcripción, tales como
aquéllas que proporcionan terminación y poliadenilación. Por tanto,
conservando la región 3' contigua de manera natural a la secuencia
codificante, pueden proporcionarse señales de terminación de la
transcripción. Cuando las señales de terminación de la
transcripción no son satisfactoriamente funcionales en la célula
huésped de expresión, entonces puede sustituirse una región 3'
funcional en la célula huésped.
El promotor puede ser un promotor "ubicuo"
activo esencialmente en todas las células del organismo huésped,
por ejemplo, para mamíferos, el promotor de
beta-actina, o puede ser un promotor cuya expresión
es más o menos específica para las células dianas. En términos
generales, se prefiere el último caso. Puede usarse para este fin
un promotor nativo para un gen que se expresa de manera natural en
la célula diana, por ejemplo el promotor de PEPCK (fosfoenol
piruvato carboxicinasa) para su expresión en células hepáticas de
mamíferos. Otros promotores adecuados incluyen albúmina,
metalotienina, tensioactivo, apoE, piruvato cinasa, receptor de LDL,
HMG CoA reductasa o cualquier promotor que se ha aislado, clonado o
se ha demostrado que tiene un patrón apropiado de regulación y
expresión específica de tejido mediante factores (hormonas, dieta,
metales pesados, etc.) requerido para controlar la transcripción
del gen en el tejido diana. Además, puede usarse una amplia variedad
de promotores virales; estos incluyen MMTV, SV-40 y
CMV. Un "vector de expresión" es un vector que (debido a la
presencia de secuencial de control de la transcripción y/o
traducción apropiadas) puede expresar una molécula de ADN o (ADNc)
que se ha clonado en el vector y de ese modo producir un producto de
proteína o ARN. La expresión de las secuencias clonadas se produce
cuando el vector de expresión se introduce en una célula huésped
apropiada. Si se emplea un vector de expresión procariota, entonces
la célula huésped apropiada sería cualquier célula procariota que
pueda expresar las secuencias clonadas. De manera similar, cuando se
emplea un vector de expresión eucariota, entonces la célula huésped
apropiada sería cualquier célula eucariota que pueda expresar las
secuencias clonadas.
Además o en vez de un gen expresable, el ácido
nucleico puede comprender secuencias homólogas al material genético
de la célula diana, mediante lo cual puede insertarse por sí mismo
("integrarse") en el genoma mediante recombinación homóloga,
desplazando de ese modo una secuencia codificante o de control de un
gen, o delecionando un gen totalmente.
En otra realización, la molécula de ácido
nucleico es "antisentido" con respecto a una secuencia de ADN
genómico u otro del organismo diana (incluyendo virus y otros
patógenos) o con respecto a un ARN mensajero transcrito en células
de los organismos, que se hibrida suficientemente a la misma para
inhibir la transcripción del ADN genómico diana o la traducción del
ARN mensajero diana. La eficacia de tal hibridación es una función
de la longitud y la estructura de las secuencias que se hibridan.
Cuando más larga sea la secuencia y más cercana la complementaria a
la perfección, más fuerte será la interacción. A medida que aumenta
el número de apareamientos erróneos de pares de bases, la eficacia
de la hibridación caerá. Además, el contenido en GC de la secuencia
de ADN de empaquetamiento o el ARN antisentido también afectará a la
eficacia de la hibridación debido al puente de hidrógeno adicional
presente en un par de bases GC en comparación con un par de bases
AT (o AU). Por tanto, es preferible una secuencia diana más rica en
contenido en GC como diana.
Es deseable evitar secuencias antisentido que
formarían una estructura secundaria debido a hibridación
intramolecular, dado que esto haría al ácido nucleico antisentido
fuese menos activo o inactivo para su fin previsto. Un experto
habitual en la técnica apreciará fácilmente si una secuencia tiene
una tendencia a formar una estructura secundaria. Las estructuras
secundarias pueden evitarse seleccionando una secuencia diana
diferente.
Puede sintetizarse un oligonucleótido, de entre
aproximadamente 15 y aproximadamente 100 bases de longitud y
complementario a la secuencia diana a partir de mononucleósidos
naturales o, alternativamente, a partir de mononucleósidos que
tienen sustituciones en los oxígenos unidos a fósforo que no forman
puentes. Un análogo preferido es un análogo de metilfosfonato de
los mononucleósidos que se producen de manera natural. Más
generalmente, el análogo de mononucleósido es cualquier análogo
cuyo uso dé cómo resultado oligonucleótidos que tienen las ventajas
de (a) una capacidad mejorada para difundir a través de membranas
celulares y/o (b) resistencia a digestión con nucleasa dentro del
cuerpo de un sujeto (Miller, P.S. et al., Biochemistry
20:1874-1880 (1981)). Tales análogos de nucleósido
se conocen bien en la técnica. La molécula de ácido nucleico puede
ser un análogo de ADN o ARN. La presente invención no se limita al
uso de cualquier análogo de ARN o ADN particular, siempre que pueda
cumplir su fin terapéutico, tenga resistencia adecuada a nucleasas y
biodisponibilidad y captación celular adecuadas. El ADN o ARN
pueden hacerse más resistentes a degradación in vivo por
enzimas, por ejemplo, nucleasas, modificando enlaces
internucleosídicos (por ejemplo, metilfosfonatos o fosforotioatos)
o incorporando nucleósidos modificados (por ejemplo,
2'-O-metilrribosa o
1'-alfa-anómeros).
El enlace que se produce de manera natural
es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los enlaces alternativos incluyen los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(en los que los R son hidrógeno y/o
alquilo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(en el que R es hidrógeno o
alquilo)
También es posible sustituir el
3'O-P-O5' por otros enlaces tales
como 3'O-CH_{2}C(O)-O5',
3'O-C(O)-NH5' y
3'C-CH_{2}CH_{2}S-C5'.
La molécula de ácido nucleico entera puede estar
formada de tales enlaces modificados, o sólo ciertas partes, tales
como los extremos 5' y 3', pueden estar así afectadas,
proporcionando de ese modo resistencia a exonucleasas.
Por tanto, las moléculas de ácido nucleico
adecuadas para su uso en la presente invención incluyen pero no se
limitan a didesoxirribonucleósidos metilfosfonato, véase Mill, et
al., Biochemistry, 18:5134-43 (1979),
oligodesoxinucleótidos fosforotioato, véase Matsukura, et
al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84:7706-10 (1987),
oligodesoxinucleótidos unidos covalentemente a un agente de
intercalación, véase Zerial, et al., Nucleic Acids Res.,
15:9909-19 (1987), oligodesoxinucleótido conjugado
con poli(L-lisina), véase Leonetti, et
al., Gene, 72:32-33 (1988) y oligómeros unidos
a carbamato ensamblados a partir de subunidades derivadas de ribosa,
véase Summerton, J., Antisense Nucleic Acids Conference, 37:44
(Nueva York 1989).
Es deseable que el complejo del ácido nucleico y
el resto de unión a ácido nucleico se compacten hasta un tamaño de
partícula que es suficientemente pequeño para lograr la captación
mediante endocitosis mediada por receptor, internalización pasiva,
permeabilización de membrana mediada por receptor u otros mecanismos
aplicables. De manera deseable, el complejo del ácido nucleico
compactado, el resto de unión a la diana y el resto de unión a
ácido nucleico es pequeño, por ejemplo, inferior a 100 nm, porque
los sistemas capilares sinusoidales del pulmón y el bazo atraparán
agregados de ese tamaño, y más preferiblemente inferior a 80 ó 90
nm, ya que éste es el diámetro interno típico de vesículas
endocíticas de depresiones recubiertas.
Dado que complejos mayores de 30 nm pueden ser
propensos a captación no específica por macrófagos en el bazo y el
hígado, el conjugado también es preferiblemente más pequeño de 30
nm.
En el caso del receptor de ASGP del hígado, los
complejos mayores de 15-23 nm se excluyen de la
captación. Esta limitación de tamaño in vivo para el
receptor está directamente relacionada con la existencia de otro
receptor para proteínas galactosiladas en las células de Kupffer del
hígado. El receptor de las células de Kupffer es muy eficaz en la
captación y degradación de moléculas galactosiladas de mayor tamaño
in vivo y por tanto, competiría por la captación del
complejo de ADN galactosilado con el receptor de ASGP en la
superficie de los hepatocitos. Lo más preferiblemente, para el
suministro al hígado, el complejo es menor de 23 nm, más
preferiblemente menor de 15 nm, todavía más preferiblemente no mayor
de 12 nm de diámetro.
La presente invención requiere que el complejo
del ácido nucleico y el portador de unión a ácido nucleico se
compacten sin producir agregación o precipitación, y preferiblemente
hasta un estado condensado (véase la figura 12). Para el fin de la
presente invención, es útil caracterizar el ADN como que tiene uno
de los siguientes estados: normal (no condensado); condensado;
relajado, uniagregado (agrupaciones de toroides unimoleculares);
multiagregado (agrupaciones de toroides multimoleculares); y
precipitado. Estos estados se definen en cuanto a su aspecto bajo
microscopía electrónica (véase la tabla 103).
El ADN condensado está en un estado en el que la
interacción con el disolvente es mínima y por tanto el ADN está en
forma de esferas o toroides aislados. No es fibroso en un grado
apreciable. El ADN relajado, formado normalmente por la disociación
del policatión del ADN, forma fibras. El ADN agregado forma toroides
multimoleculares o aglutinados.
El tamaño teórico de un complejo de ADN
unimolecular puede calcularse mediante las fórmulas expuestas en las
leyendas "b" y "c" de la tabla 106. Preferiblemente, los
complejos de esta invención tienen un diámetro que es inferior al
doble del tamaño calculado mediante una o ambas de estas fórmulas.
Complejos más grandes corresponden probablemente a ADN agregado de
manera multimolecular.
El ADN puede compactarse hasta un estado
condensado neutralizando su carga, por ejemplo, mediante la adición
de un policatión, o de otra manera reduciendo sus interacciones con
el disolvente. Sin embargo, el policatión puede producir agregación
o precipitación del ADN si no se emplea un agente caotrópico para
evitarlas. Por tanto, la compactación puede conseguirse mediante el
uso acertado tanto del policatión (para condensar el ADN) como
(según se necesite) de un agente caotrópico (para evitar la
agregación o la precipitación).
Sin embargo, el uso excesivo del agente
caotrópico puede dar como resultado la relajación del ADN.
Preferiblemente, el complejo tiene una estructura de toroide
unimolecular, no agregada condensada hasta menos de 23 nm de
diámetro; el grado de compactación puede determinarse mediante
microscopía electrónica. Por ejemplo, se ha compactado un complejo
del gen de PBPCK-hFIX con polilisina galactosilada
hasta un toroide unimolecular con un diámetro medio de
aproximadamente 12 nm, tal como se muestra en la tabla 106.
La expresión "toroide unimolecular" indica
que el toroide contiene sólo una molécula de ácido nucleico; el
toroide puede contener muchas moléculas portadoras (por ejemplo,
poli-Lys galactosilada). Una razón típica es una
molécula de ADN con respecto a aproximadamente 100 moléculas
portadoras, por toroide "unimolecular". Alternativamente, y
quizá de manera más precisa, esta estructura puede denominarse
toroide de ácido mononucleico. Los toroides unimoleculares y
multimoleculares (cada uno de estos últimos contiene más de una
molécula de ADN) pueden distinguirse por el diferente tamaño de
cada uno de los complejos cuando se observan mediante el
microscopio electrónico, indicando la composición multi o
unimolecular (contando sólo las moléculas de ADN) de los
toroides.
También se han usado otras técnicas para
identificar cambios estructurales en el ADN tras la unión a
poli-L-lisina. La primera de éstas
es la determinación espectrofotométrica de la turbidez en la
disolución usando la absorbancia a 400 nm. La turbidez es
principalmente un indicador de la agregación. La agregación se
confirma mediante un valor de dicroismo circular (DC) mayor de 0 a
longitudes de onda de desde 300 hasta 340 nm.
La figura 18 ilustra el efecto sobre la turbidez
de la adición de la poli-L-lisina a
la disolución de ADN a diferentes concentraciones de partida de
NaCl. La turbidez aumenta a medida que aumenta la concentración
inicial de sal (esto podría confirmarse fácilmente a simple vista),
indicando que la condensación del complejo de ADN a fuerza iónica
inferior da como resultado una suspensión de partículas compuesta
por complejos de
ADN-poli-L-lisina
unimoleculares que interaccionan entre sí. Se observó que las
disoluciones de ADN condensado a concentración salina inferior eran
transparentes, con presencia de materia particulada en suspensión.
Se analizaron disoluciones que contenían el complejo de ADN con
diferentes grados de turbidez mediante ME para visualizar las
estructuras de ADN formadas en cada situación. Apropiadamente
condensados, se encontraron complejos de ADN unimoleculares tanto
en disoluciones transparentes como ligeramente turbias. Esto no era
cierto para la condensación de complejos de ADN a fuerza iónica
inicial baja, a la que se observó una absorbancia mínima a 400 nm
(figura 18) porque las disoluciones que contienen partículas en
suspensión no absorbían a 400 nm. Sin embargo, cuando se analizaron
estas disoluciones usando ME, se observaron las estructuras de
transición esperadas mostradas en la figura 1. Cuando las
partículas en suspensión se dispersaron totalmente, las estructuras
identificadas mediante ME eran esencialmente idénticas a complejos
unimoleculares de ADN condensado. Por tanto, la turbidez de la
disolución que contiene los complejos de ADN depende de la
concentración inicial de sal usada para la condensación del
complejo. Aunque los mecanismos responsables de las diferencias
observadas en la condensación de ADN a fuerza iónica inicial alta y
baja no están claros, se adaptó este protocolo para condensar
apropiadamente ADN, evitando la formación de disoluciones
turbias.
turbias.
Una técnica más fiable para diagnosticar la
transición estructural de complejos de
ADN-poli-L-lisina en
disolución es la absorbancia del complejo en condensación a 260 nm
a medida que aumenta la concentración de NaCl. El complejo de ADN
uniagregado en suspensión tiene sólo un 10-30% de la
absorbancia esperada porque la materia particulada no absorbe a 260
nm. La adición de NaCl dispersa el complejo de ADN uniagregado en
suspensión que da como resultado el aumento brusco observado en la
absorbancia observado en la figura 11. En este punto, la disolución
es transparente y no hay estructuras particuladas visibles en
suspensión. Esta característica de la condensación de
ADN-poli-L-lisina se
correlaciona claramente con las estructuras mostradas en la figura
1. A una concentración de NaCl que produce un aumento brusco en la
absorbancia a 260 nm, se observaron complejos condensados, no
agregados mediante ME; antes de que se lograse esta concentración
crítica de NaCl, el complejo de ADN parecía agregarse y a
concentraciones de NaCl superiores, el complejo de ADN se relajaba.
Una segunda transición en absorbancia a 260 nm, como resultado de
la relajación del complejo de ADN condensado que estaba en
suspensión, indica la solubilización completa del complejo de
ADN.
Puede usarse el dicroismo circular (DC) para
monitorizar la condensación del ADN. Cuando el espectro es idéntico
al del ADN solo, entonces se supone que el complejo de ADN está
correctamente compactado, es decir, en complejos unimoleculares. En
otras palabras, el espectro positivo a 220 nm es cuantitativamente
similar al espectro a 220 nm del ADN solo, y el cruce (la longitud
de onda a la que el espectro del complejo cruza el punto 0) es
esencialmente idéntico al del ADN solo. Cuando el ADN se agrega en
complejos multimoleculares, el espectro positivo a 270 nm se
invierte en un espectro negativo a esa longitud de onda (esto se
denomina estructura de psi-ADN o
\Psi-ADN).
La tabla 103 muestra las características de cada
estado tal como se determina mediante observación a simple vista,
espectroscopía de dicroísmo circular, microscopía electrónica y
absorbancia a 260 nm. Debe observarse que puede usarse cualquier
otra técnica que pueda identificar complejos de ADN condensados en
lugar de o en combinación con los tratados anteriormente.
Para compactar el ácido nucleico, se añade el
portador a la disolución de ácido nucleico, por lo que el portador
rompe el ácido nucleico: interacciones con el disolvente que
permiten que el ácido nucleico se condense. Preferiblemente, al
menos se monitoriza la turbidez de la disolución cuando se añade el
portador, de modo que se detecta inmediatamente un cambio en el
estado. Una vez que aparece la turbidez, puede analizarse
adicionalmente el estado del ADN mediante espectroscopía de DC para
determinar si el ADN está en el estado condensado o en el agregado.
(La precipitación también debe ser detectable a simple vista).
Preferiblemente, el portador se añade de manera suficientemente
lenta a la disolución de ácido nucleico de modo que se minimizan la
precipitación y la agregación. Si se produce precipitación o
agregación, debe añadirse lentamente una sal caotrópica y el
resultado debe examinarse de nuevo mediante espectroscopía de DC.
La sal preferida es NaCl. Pueden usarse otras sales caotrópicas
siempre que se toleren por el animal (o las células) al que se
administrarán. Los agentes adecuados incluyen sulfato de sodio
(Na_{2}SO_{4}), sulfato de litio (Li_{2}SO_{4}), sulfato de
amonio ((NH_{4})_{2}SO_{4}, sulfato de potasio
(K_{2}SO_{4}), sulfato de magnesio (MgSO_{4}), fosfato de
potasio (KH_{2}PO_{4}), fosfato de sodio (NaH_{2}PO_{4}),
fosfato de amonio (NH_{4}H_{2}PO_{4}), fosfato de magnesio
(MgHPO_{4}), cloruro de magnesio (MgCl_{2}), cloruro de litio
(LiCl) cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro
de cesio (CaCl), acetato de amonio, acetato de potasio, acetato de
sodio, fluoruro de sodio (NaF), fluoruro de potasio (KF), cloruro
de tetrametilamonio (TMA-Cl), cloruro de
tetrabutilamonio (TBA-Cl), cloruro de trietilamonio
(TEA-Cl) y cloruro de metiltrietilamonio
(MTEA-Cl)
Se han investigado las variables que afectan a
la condensación del ADN in vitro y la relevancia funcional
de estos parámetros para el suministro eficaz de los complejos de
ADN a animales mediante endocitosis mediada por receptor. Se ha
observado una fuerte correlación entre la fuerza iónica a la que el
complejo de ADN
condensado-poli-L-lisina
permanece estable en disolución y la concentración de ADN. Estos
experimentos se realizaron utilizando un plásmido de 4,5 kb que
contenía el promotor del gen para PEPCK unido al gen estructural
para hFIX, usando una razón de ADN con respecto a
poli-L-lisina que dio como resultado
una razón de 1 a 1 de cargas negativas con respecto a positivas en
la disolución. La variación en la concentración final de NaCl
necesaria para solubilizar las partículas es una función
logarítmica de la concentración de ADN, en la que se produce la
condensación de complejos de
ADN-poli-L-lisina
altamente concentrados con sólo un ligero aumento en la fuerza
iónica. Esta característica física de la condensación del ADN tiene
claras ventajas para el suministro de partículas de ADN a tejidos
de animales adultos in vivo, puesto que tiene poco efecto
sobre la carga iónica en la sangre del animal.
El ajuste lineal de los datos usando el método
de mínimos cuadrados se describe mediante la siguiente función:
log_{10}(NaCl,\ mM) = b0 * (ADN,\
\mu M\ de\ fosfato) + b1\ r2 =
0.97
en la que b0 = 2,52 x 10E - 3, b1 =
0,577
Se han observado variaciones en la función
descrita por la ecuación anterior cuando se usaron plásmidos de ADN
diferentes y preparaciones de ADN diferentes durante el proceso de
condensación. Estas diferencias probablemente están relacionadas
con la variación en la afinidad de
poli-L-lisina por el ADN de
diferentes fuentes y composiciones. Para una afinidad de unión
máxima, generalmente se usa ADN precipitado dos veces con acetato de
sodio y 2,5 volúmenes de etanol a -40ºC (véase Métodos). No se ha
encontrado ninguna diferencia evidente en la afinidad de unión de
poli-L-lisina por ADN de diferentes
formas (es decir, superenrollado, mellado y lineal) y por ADN
extraído usando cromatografía de intercambio aniónico o
centrifugación en gradiente de cloruro de cesio. Esto puede indicar
la presencia de un contaminante en las preparaciones de ADN de
diferentes fuentes que tiene actividad de unión a
poli-L-lisina, que se elimina
mediante la precipitación secuencial del ADN.
También se ha investigado el efecto de la
longitud de la poli-L-lisina sobre
la concentración de NaCl necesaria para la condensación eficaz del
ADN (figura 19). La correlación entre estas variables se evaluó
utilizando una concentración fija de ADN de diferentes fuentes. Se
ha usado un amplio intervalo de longitudes de
poli-L-lisina; esencialmente los
tamaños de poli-L-lisina
comercialmente disponibles. Sin embargo, la longitud de la
poli-L-lisina es un promedio de
diversos tamaños de la proteína tal como se determina mediante
análisis de dispersión de la luz de ángulo reducido de lotes
individuales de poli-L-lisina
sintetizada químicamente. La distribución real de tamaños dentro de
cada muestra varía desde el 60% hasta el 80% del material que se
está distribuyendo, que es +/- el 20% del tamaño promedio. Esta
amplia distribución dentro de un único tamaño constituye una fuente
de error en las determinaciones. No obstante, puede observarse una
clara correlación en la figura 19 entre la longitud de la
poli-L-lisina y la concentración
necesaria de NaCl que se necesita para la condensación del complejo
de ADN en la disolución. Esta correlación es una función lineal de
la longitud de la poli-L-lisina
hasta un tamaño de 150 residuos de lisina, tras lo que la función
alcanza la saturación y no hay aumento en la concentración de NaCl
necesaria para la condensación del ADN con
poli-L-lisina más larga. Estos datos
concuerdan con una unión cooperativa entre la
poli-L-lisina y la estructura
principal de fosfato del ADN. Así, mediante la reducción de la
longitud de las moléculas de
poli-L-lisina utilizadas para
condensar el ADN, la disolución de complejo de ADN inyectada en los
animales será menos hipertónica. También es importante considerar la
disolución del complejo de ADN en la sangre del animal para evaluar
la importancia funcional de estos cambios en la fuerza iónica sobre
la eficacia de este método para la terapia génica. Se han inyectado
a ratas complejos de ADN que contienen un intervalo mayor de
longitudes de poli-L-lisina que las
mostradas en la figura 19 y a conejos con el intervalo menor de
tamaños de poli-L-lisina, y se ha
observado la expresión positiva y persistente de los genes
transfectados en ambos casos.
La concentración de sal inicial mínima preferida
depende de la actividad de compactación del portador y de la
actividad caotrópica de la sal. Si el NABM era (Lys)_{8}, o
(Lys)_{27}, la concentración inicial de NaCl podría ser
cero. Sin embargo, con cadenas de poliLys más largas, en ausencia de
NaCl, la precipitación sería inmediata. Con (Lys)_{50}, la
concentración inicial de NaCl es preferiblemente de al menos
aproximadamente 300 mM. No obstante, si el TBM es una proteína que
afecta a la condensación, la concentración inicial de sal podría
ser de tan sólo cero.
El portador puede añadirse continuamente, o en
pequeñas etapas diferenciadas. Se puede comenzar con una velocidad
de flujo más alta, o con alícuotas mayores, y reducir la velocidad
de flujo o el tamaño de las alícuotas cuando el punto final deseado
de la reacción está cerca. Normalmente se añade del 0,1 al 10% de la
disolución de portador de una vez a la disolución de ADN. Cada
adición se realiza preferiblemente cada de 2 segundos a 2 minutos,
con agitación con vórtex constante. Sin embargo, pueden permitirse
tiempos de asentamiento más largos.
En una realización, se mezcla un ácido nucleico,
contenido en una disolución salina, que es preferiblemente de NaCl
de al menos 0,5 M, pero inferior a 1,5 M, con
poli-L-lisina (109 lisinas) que
contiene el resto de unión a célula diana unido covalentemente (por
ejemplo, galactosa), que está contenido en una disolución de NaCl
en la misma concentración (por ejemplo, NaCl de 0,5 a 1,5 M).
Preferiblemente, la razón molar del grupo fosfato del ácido
nucleico con respecto al grupo cargado positivamente del resto de
unión a ADN está en el intervalo de 4:1 a 1:4, y más
preferiblemente es de aproximadamente 1,5:1,73
Algunos resultados experimentales de los
solicitantes se muestran en la tabla 104. Se han tomado 16 ejemplos
(marcados con asterisco en la primera columna de la tabla 104) que
se han sometido a prueba y con los que se ha trabajado in
vivo, y se ha experimentado un retroceso en la concentración
final de NaCl (la variable independiente) frente a la concentración
de ADN y la longitud de poli-L-Lys
(las variables dependientes), con los resultados facilitados en la
tabla 105.
\vskip1.000000\baselineskip
En las realizaciones que se basan en la molécula
portadora de unión a diana, el resto de unión a ácido nucleico se
conjugará, covalente o no covalentemente, directa o indirectamente,
al resto de unión a célula diana. La conjugación puede realizarse
tras, o más habitualmente antes, de la carga del resto de unión a
ácido nucleico con el ácido nucleico de interés. De cualquiera de
las formas, la conjugación no debe interferir sustancialmente con
la unión del ácido nucleico al resto de unión a ácido nucleico o, en
realidad, con la capacidad del resto de unión a célula diana para
unirse a la célula diana.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido nucleico compactado, conjugado
opcionalmente con un TBM, puede mezclarse con un portador
farmacéuticamente aceptable para la administración a un ser humano
o a otro sujeto animal. Se apreciará que es posible que una
disolución de ADN contenga tanto ADN condensado como ADN relajado.
Las composiciones de esta invención preferiblemente son
suficientemente ricas en complejos condensados de modo que la
absorbancia a 260 nm es inferior al 50% que la del ADN desnudo de
igual concentración. Tal como estableció en la tabla 103, el ADN
condensado normalmente tiene una absorbancia del
20-30%, y el ADN relajado, del
80-100%, que la del ADN
desnudo.
desnudo.
La administración puede ser mediante cualquier
vía de administración adecuada. La forma farmacéutica debe ser
apropiada para esa vía. Las vías de administración y las formas
farmacéuticas adecuadas incluyen la vía intravascular (disolución
inyectable), subcutánea (disolución inyectable, implante de
liberación lenta), tópica (pomada, bálsamo, crema) y oral
(disolución, comprimido, cápsula). Con algunas vías de
administración, la forma farmacéutica debe formularse para proteger
el conjugado de la degradación, por ejemplo, mediante la inclusión
de un recubrimiento protector o de un inhibidor de la nucleasa.
La dosificación puede determinarse mediante
pruebas sistemáticas de dosis alternativas, como es convencional en
la técnica.
Las ratas (200-300 g) toleran
hasta dosis de 600 \mug del complejo de ADN del ejemplo 1 sin
ningún efecto perjudicial evidente sobre el crecimiento o la salud.
Se ha inyectado a ratones (25 g) 150 \mug de ese complejo de ADN
sin ningún problema evidente.
En los seres humanos, una dosis de ensayo típica
sería de 60-120 mg de ADN; si esta dosis es
demasiado baja para ser eficaz o si es demasiado alta para ser
tóxica, puede aumentarse o disminuirse, respectivamente, de una
manera sistemática, hasta que se identifique una dosis adecuada.
Para las células de vida corta, por ejemplo, los
macrófagos, un programa de dosificación típico podría ser una dosis
cada dos semanas. Para las células de vida larga, por ejemplo, los
hepatocitos, podría ser preferible una dosis cada dos meses.
Pueden usarse adyuvantes para disminuir el
tamaño del complejo de ADN (por ejemplo, MgCl 2-10
mM), para aumentar su estabilidad (por ejemplo, sacarosa, dextrosa,
glicerol), o para mejorar la eficacia del suministro (por ejemplo,
agentes lisosomotrópicos tales como cloroquina y monensina). Los
complejos pueden estar encerrados en un liposoma para protegerlos y
para facilitar su entrada en la célula diana (mediante la fusión del
liposoma con la membrana celular).
La invención se ilustra, pero no se limita,
mediante los ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La enfermedad de Christmas o hemofilia B, es un
trastorno hemorrágico recesivo asociado al sexo debido a una
deficiencia del factor IX de coagulación funcional en la
circulación. El factor IX humano (hFIX) es una glicoproteína
plasmática sintetizada normalmente en el hígado, que desempeña un
papel integral en la ruta de coagulación intrínseca. Una vez que se
ha convertido a su forma serina proteasa (IXa) mediante el precursor
de la tromboplastina plasmática activada (factor XIa), la proteína
activada interacciona con el factor VIIIa de coagulación, con iones
calcio y con fosfolípidos para producir un complejo que convierte el
factor X en Xa. El factor IX experimenta varias modificaciones
post-traduccionales en el hígado que son esenciales
para su función antes de la secreción en la sangre. Estas incluyen
\gamma-carboxilación dependiente de vitamina K de
residuos de ácido glutámico amino-terminales y
\beta-hidroxilación de ácido aspártico.
La enfermedad de Christmas representa
aproximadamente del 10 al 20 por ciento de todos los trastornos de
coagulación heredados. Los individuos afectados muestran un amplio
intervalo de gravedad clínica que generalmente se correlaciona con
el nivel de factor IX circulante. Los pacientes con deficiencias
graves de factor IX funcional pueden sangrar espontáneamente en los
tejidos blandos y las articulaciones o tras un traumatismo menor.
Las transfusiones de plasma o concentrados ricos en factor IX se
utilizan para abortar los episodios hemorrágicos corrigiendo
temporalmente la deficiencia. Desgraciadamente, el tratamiento
clínico se ha frustrado por la contaminación viral del plasma
recogido. Las infecciones portadas por la sangre, tales como la
hepatitis y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, se han
convertido en problemas significativos en el tratamiento de los
trastornos de coagulación hereditarios. Estas complicaciones
acentúan la importancia de desarrollar tratamientos
alternativos.
Se ha identificado y secuenciado el gen para el
factor IX de coagulación humano; de 1.248 pares de base de
longitud, el ADN complementario predice una proteína de 416
aminoácidos, y, tras las modificaciones
post-traduccionales, la proteína madura tiene un
peso molecular de aproximadamente 54.000 Da. Puede usarse un gen que
codifica el factor IX de coagulación humano para la corrección
genética de la hemofilia B.
Se condensó un gen
P-enolpiruvato carboxicinasa - factor IX humano
(PEPCK-hFIX) quimérico (50% superenrollado/50%
circular abierto) con poli-L-lisina
galactosilada (longitud promedio de 50 ó 109 aminoácidos) mediante
la titulación con NaCl. Este proceso se monitorizó utilizando
espectroscopía de DC y microscopía electrónica y dio como resultado
la formación de un complejo de ADN-portador de
10-12 nm de diámetro en una concentración de NaCl
crítica. Se ha introducido el gen de PEPCK-hFIX,
conjugado utilizando este procedimiento, en los hígados intactos de
ratas adultas y se ha demostrado que el complejo de
ADN-portador dirige específicamente el gen a este
órgano y que el ADN de hFIX, el ARNm y la proteína hFIX pueden
demostrarse hasta 140 días (la duración del experimento) tras la
administración del complejo de ADN-portador. El gen
está presente como un episoma tal como se determina mediante el
análisis de tipo Southern del ADN aislado del hígado de un animal 32
días tras la inyección del conjugado de ADN. Se controló la
transcripción del gen PEPCK-hFIX mediante la dieta
durante todo el transcurso de tiempo del experimento; la
alimentación de los animales con una dieta libre de hidratos de
carbono durante una semana dio como resultado la inducción
pronosticada de hFIX en la sangre, tal como se detectó mediante
hibridación por inmunotransferencia tipo Western.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a galactosilación polímeros de
L-lisina-HBr o
L-lisina-Cl con una longitud de
cadena promedio de 109 (Sigma) esencialmente tal como se describe
por Monsigny, et al. (1984) Biol. Cell., 51, 187. Brevemente,
se hicieron reaccionar 2 mg de
poli-L-lisina con 89 g de
fenil-isotiocianato de
\alpha-D-galactopiranosilo (Sigma
G-3266) disuelto en
N,N-dimetilformamida (5 mg/ml). Se ajustó la
disolución hasta pH 9,0 mediante la adición de un volumen 1/10 de
carbonato de sodio 1 M, pH 9,0. Dado que la reacción es eficaz en un
10%, el 0,8% de los grupos \varepsilon-NH_{3}
presentes en la disolución están glicosilados. El tubo se protegió
de la luz mediante lámina de aluminio y se mezcló durante 6 horas a
temperatura ambiente. Entonces se dializó la disolución, utilizando
tubos de diálisis Spectra-Por (Fisher de punto de
corte 3500 de PM) frente a 500 ml de tampón de NaCl 5 mM durante 2
días con cambios frecuentes de tampón (2 cambios/día).
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución dializada se analizó entonces
espectrofotométricamente a 205 \ring{A} y 250 \ring{A} para
determinar la concentración de la
poli-L-lisina y la concentración de
residuos de fenil-galactosa, respectivamente. Esta
etapa garantiza que no se han producido pérdidas significativas
durante la diálisis y que la reacción de galactosilación fue
completa, dado que en la disolución sólo la galactosa modificada
absorberá a 250 \ring{A}.
Se preparó ADN de plásmido utilizando técnicas
convencionales. El ADN se resuspendió en Tris-HCl 10
mM, pH 8,0, que contenía EDTA 1 mM y se determinó
espectrofotométricamente la concentración del ADN. Se digirió la
preparación de ADN dos veces con ARNasas A+T1. Esta etapa garantiza
que el ARN no está presente en la disolución (el ARN inhibe la
condensación del ADN mediante la
poli-L-lisina). Se utilizó una
disolución que contenía una alta concentración de ADN
(1,5-2 mg/ml) en etapas adicionales. Un ejemplo de
un protocolo típico para la condensación del ADN se describe de la
siguiente forma:
a) Se agitaron con vórtex 300 \mug de ADN en
200 \mul de NaCl 0,75 M (añadidos de una disolución de NaCl 5 M)
a velocidad media, utilizando una máquina VIBRAX
(IKA-VIBRAX-VXR). Este procedimiento
es deseable para aumentar la longitud eficaz del polímero de ADN en
altas disoluciones salinas, logrando así la unión eficaz del resto
de poli-L-lisina a la estructura
principal del ADN.
b) Se añaden gota a gota 84 \mug de
poli-L-lisina-galactosa
en 200 \mul de NaCl 0,75 M (añadidos de una disolución de NaCl 5
M) durante un periodo de 30 minutos a 1 hora en alícuotas de 20
\mul. Esta cantidad se traduce en una razón molar de 1 grupo
PO_{4}^{-} del ADN con respecto a 0,7 grupos NH_{3}^{+} del
portador.
c) La disolución se vuelve turbia en final del
proceso. Se añaden gota a gota alícuotas de 3 \mul de NaCl 5 M a
la disolución agitada con vórtex hasta que desaparece la turbidez
tal como se monitoriza visualmente. Este proceso es lento,
permitiendo 30 segundos entre la adición de cada nueva alícuota de
NaCl 5 M. Entonces se somete la disolución a monitorización
espectroscópica de DC mientras se añaden gradualmente alícuotas de
2 \mul de NaCl 5 M. El proceso de condensación se completa cuando
se observa el espectro de diagnóstico del complejo de ADN. Para las
preparaciones posteriores de complejo de ADN que consiste en el
mismo ADN de plásmido a la misma concentración del nucleótido,
puede seguirse el protocolo sin monitorizar mediante DC y los
resultados serán completamente reproducibles. Cuando se utiliza una
concentración diferente de ADN o un plásmido diferente, debe
repetirse la monitorización mediante
DC.
DC.
Se ha encontrado que una técnica alternativa
para monitorizar la formación del complejo de ADN da resultados
similares. Esta técnica consiste en las siguientes etapas:
a) y b) Ídem.
c) La disolución se vuelve turbia al final del
proceso. Se añaden gota a gota alícuotas de 3 \mul de NaCl 5 M a
la disolución agitada con vórtex hasta que desaparece la turbidez
tal como se monitoriza visualmente. Este proceso es lento,
permitiendo 30 segundos entre la adición de cada nueva alícuota de
NaCl 5 M. Entonces se centrifuga la disolución a velocidad completa
(12000x g) durante 30 segundos utilizando una microcentrífuga y se
monitoriza el aspecto del precipitado. Si se observa un precipitado,
se añaden alícuotas de 2 \mul de NaCl 5 M. La disolución se agita
con vórtex adicionalmente durante 0,5 minutos y se repite la etapa
de centrifugación. El aspecto de un precipitado se debe a la
agregación del complejo de ADN en la disolución e indica que el ADN
no se ha colapsado
completamente.
completamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Al desarrollar el procedimiento descrito en el
presente documento, se ha monitorizado la estructura física del
conjugado de
ADN/ligando-poli-L-lisina
utilizando dicroísmo circular (DC) y microscopía electrónica y se
han estudiado las condiciones en las que se genera un complejo
funcional. Entonces se ha determinado la relevancia funcional de la
estructura física del conjugado de
ADN/ligando-poli-L-lisina
usando animales intactos. Se condensó el ADN mediante la adición
del
ligando-poli-L-lisina
en presencia de diversas concentraciones de NaCl. Se agitaron con
vórtex o bien 60 \mug de \beta-galactosidasa del
CMV libre de ARN (A) o bien phFIX (B, C, D y E), diluidos hasta un
volumen final de 150 \mul en NaCl 700 mM a velocidad media en un
aparato VIBRAX (IKA-VIBRAX-VXR). Se
diluyeron 19 \mug del biconjugado de
fenil-isocianato de
\alpha-galactopiranosilo/poli-L-lisina
(Sigma) de la misma forma y se añadieron gota a gota a la
disolución agitada con vórtex de ADN. Para los estudios in
vivo, se condensaron 300 \mug de ADN (disueltos en tampón TE,
pH 8) en 150 \mul de NaCl 700 mM con 95 \mug de biconjugado de
fenil-isotiocianato de
\alpha-galactopiranosilo/poli-L-lisina
en 150 \mul de NaCl 700 mM. La lenta adición del policatión da
como resultado la formación de una disolución turbia que se
disuelve mediante la adición progresiva de alícuotas de 3 \mul de
NaCl 5 M. Se monitorizó visualmente la desaparición de la turbidez
y en el punto de no turbidez se investigaron las disoluciones de
complejos de ADN/poli-L-lisina
tanto mediante microscopía electrónica (M.E.) como mediante
espectroscopía de DC. La adición continua de alícuotas de 2 \mul
de NaCl 5 M dio como resultado cambios estructurales tal como se
muestra en las figuras 1A-1F. En la figura 1 se
presentan espectros representativos que demuestran diferentes
conformaciones estructurales del complejo de ADN a diversas
concentraciones de NaCl y en presencia y ausencia de
poli-L-lisina añadida. La unión del
policatión al ADN da como resultado un espectro específico
caracterizado por un desplazamiento del cruce hasta mayores
longitudes de onda; este desplazamiento puede estar correlacionado
con el empaquetamiento quiral de los conjugados de
ADN/poli-L-lisina en orden alto,
estructuras asimétricas similares a la forma Y del ADN. Tal como se
muestra en la figura 1A, el ADN bicatenario (en NaCl 1 M) tiene un
espectro característico que se modificó marcadamente mediante la
adición de poli-L-lisina a diversas
fuerzas iónicas (figura 1a). Cuando se aumentó la fuerza iónica del
conjugado
ADN/ligando-poli-L-lisina,
el complejo continuó a través de una transición de un estado
agregado (figura 1C) a uno condensado (figura 1D y figura 1E). Esto
corresponde a un desplazamiento en el espectro del complejo tal como
se muestra en la figura 1A. El cambio en los espectros de DC a 220
nm y el desplazamiento en el cruce (línea 0 en la figura 1A) que se
produce con el aumento de la fuerza iónica de la disolución es de
particular importancia en la monitorización de la formación del
complejo de ADN condensado por medio de espectroscopía de DC. Si la
fuerza iónica aumenta por encima del intervalo crítico requerido
para la condensación del complejo de ADN, el complejo adopta una
conformación relajada, no condensada (figura 1F). Esta transición en
la conformación del complejo de ADN no puede monitorizarse mediante
espectroscopía de DC de modo que una titulación rigurosa de NaCl
resulta crítica para el éxito de este procedimiento. Es importante
observar que el diámetro del complejo de ADN observado en la figura
1D (aproximadamente 10 nm) se ajusta al intervalo de discriminación
deseable para la internalización de los ligandos moleculares
mediante el receptor hepático para
asialoglicoproteínas.
asialoglicoproteínas.
Por tanto, se verificó la relevancia funcional
de las estructuras de ADN observadas como vehículos para transferir
el ADN a hepatocitos in vivo mediante endocitosis mediada por
receptor. Con el fin de establecer la naturaleza del proceso de
captación, se siguió con la eliminación del complejo de ADN de los
medios mediante las células HepG2, que contienen el receptor de
asialoglicoproteína. La captación del complejo de ADN se inhibió
completamente cuando se utilizó un exceso molar de 100 veces de
asialofetuína como un competidor, lo que indica que el complejo se
estaba captando mediante endocitosis mediada por receptor a través
de la ASGP.
Se utilizó un plásmido (pPFIX) que contenía un
gen quimérico compuesto por el promotor del gen para la forma
citosólica de P-enolpiruvato carboxicinasa (PEPCK)
de la rata, unido al ADNc para el factor IX de coagulación humano
(hFIX) (Perkol, et al., FASEB J., 7:1081 (1993)) para seguir
el suministro y la expresión del ADN en el hígado. Se determinó el
transcurso de tiempo de la expresión del gen hFIX en los animales
transfectados mediante hibridación por inmunotransferencia de tipo
Western, utilizando un anticuerpo monoclonal frente al péptido hFIX
maduro.
Se anestesiaron con éter ratas
Sprague-Dawley macho adultas, de aproximadamente 250
g de peso. Se infundieron 300-400 \mul de una
disolución que contenía 300 \mug de pPFIX acomplejado tal como se
describió anteriormente con
galactosa-poli-L-lisina,
en la vena cava caudal. Se sacrificaron las ratas a los 0, 4, 8, 12,
32, 72 y 136 días tras la transfección y se tomaron muestras de
tejidos y sangre.
Se sometieron a electroforesis muestras de
plasma (1 \mul) de animales transfectados y una dilución 1:4 de
un control de plasma humano en geles de SDS/poliacrilamida al 10% y
se transfirieron en filtros de membrana de nitrocelulosa utilizando
técnicas convencionales. Las transferencias se bloquearon con 1x
PBS, pH 7,4, monolaurato de polioxietilensorbitano al 0,03% (Tween
20), y leche desnatada en polvo al 10% (p/v) durante dos horas a
temperatura ambiente, seguido por incubación con una dilución 1/1000
de un anticuerpo monoclonal murino anti-factor IX
humano (3 \mug/ml) durante dos horas a temperatura ambiente. El
Dr. Kenneth Smith (United Blood Services, Albuquerque, Nuevo
Méjico) facilitó amablemente el anticuerpo monoclonal. Se lavó tres
veces la membrana en 1x PBS, pH 7,4 y Tween 20 al 0,03%, luego se
incubó con una dilución 1/500 de conjugado de Igg de cabra
anti-murina (H+L) - peroxidasa de rábano. Entonces
se lavó vigorosamente la membrana cuatro veces con 1x PBS, pH 7,4 y
Tween 20 al 0,03% y se aplicaron 10 ml de disolución de detección
por quimioluminiscencia potenciada mediante inmunotransferencia de
tipo Western durante un minuto. Se detectó la luminiscencia emitida
por el filtro mediante una exposición de 20 segundos a película
fotográfica. Se detectó una banda que hibridaba específicamente con
el anticuerpo monoclonal anti-hFIX durante hasta 140
días. No se detectó ninguna banda de hibridación en los controles
no
transfectados.
transfectados.
Se extrajo el hígado de un animal 32 días tras
la transfección y se aisló el ADN genómico utilizando técnicas
convencionales. Se digirieron 5 \mug del ADN total del animal
transfectado y de un control no transfectado o bien con EcoRI o
bien con BglII durante la noche. Se realizó electroforesis con
transferencia tipo Southern mediante métodos establecidos. El ADN
del animal transfectado sólo hibridó con sondas de BglII de 4,5 kb y
EcoRI de 2,6 kb.
Se obtuvieron tejidos de bazo, pulmón, corazón e
hígado de una rata transfectada con 300 \mug del complejo de ADN.
Se llevó a cabo un análisis de PCR en el ADN genómico total aislado
de estos tejidos. Sólo el hígado de la rata transfectada, y no su
bazo, pulmón o corazón, o el hígado de un animal control, fue
positivo para la sonda de
720 pb.
720 pb.
Se determinó la presencia de transcritos de ARNm
para el factor IX humano en hígados de ratas transfectadas con pFIX
tras el tratamiento de ARN hepático celular total con transcriptasa
inversa del virus de la leucemia murina de Moloney y la
amplificación del ADNc resultante mediante la reacción en cadena de
la polimerasa. Brevemente, se trató 1 \mug de ARN de hígado de
rata total con 10 U de ADNasa I (libre de ARNasa) y se añadió a una
disolución que contenía 500 nM de cebador de oligonucleótido
(dT)_{16} y 500 nM de cada dNTP, y se calentó hasta 42ºC,
y 1 \mul del conjunto de ADNc se amplificó mediante la reacción en
cadena de la polimerasa, usando cebadores que extienden la región
UTR en 5' del promotor de PEPCK y el ADNc para hFIX. Como control,
también se usaron las mismas muestras de ARN no convertidas en ADNc
mediante la transcriptasa inversa como moldes de la reacción en
cadena de la polimerasa para garantizar que el ADN de plásmido
contaminante no se hubiera amplificado. Se separaron los productos
mediante electroforesis en gel de agarosa e hibridación por
transferencia de tipo Southern usando una sonda de ADNc de factor IX
humano radiomarcada. Se observó una banda que hibridaba
específicamente con la sonda de hFIX sólo en los animales
transfectados. No se detectaron bandas ni en los controles no
transfectados ni en las muestras transfectadas no convertidas a ADNc
mediante la transcriptasa inversa.
Se analizó la actividad funcional de hFIX en el
plasma de los animales transfectados midiendo la actividad
procoagulante del factor IX humano. Se utilizó una modificación del
tiempo de tromboplastina parcial, activado por caolín, de una fase,
con plasma humano deficiente en factor IX. Se obtuvieron muestras de
sangre de animales de experimentación mediante venopunción. Se
añadió una quincuagésima parte del volumen de citrato de sodio 500
mM, pH 5,0, para evitar la coagulación y se almacenó el plasma a
20ºC. Se sometieron a ensayo las muestras por duplicado y se
comparó su actividad con la actividad funcional del plasma reunido
de 24 machos adultos normales. En un ser humano normal, el plasma
tiene una actividad funcional equivalente en un 100% o
aproximadamente a 3 \mug de factor IX humano por ml. Se restó la
actividad inicial del factor IX en el plasma de rata
(aproximadamente 0,15 unidades/ml de actividad de factor IX en
suero de rata) de cada valor de factor IX humano determinado en
animales individuales. Los valores iniciales constituyen la
actividad cruzada no específica del factor IX de rata determinados
en el ensayo del factor IX humano utilizado en este análisis. Se
obtuvieron muestras de sangre de animales de experimentación
mediante venopunción. Se añadió una quincuagésima parte del volumen
de citrato de sodio 500 mM, pH 5,0, para evitar la coagulación y se
almacenó el plasma a 20ºC. La concentración normal de hFIX en el
plasma humano es de 3 \mug/ml. Se produjeron aproximadamente de 15
ng/ml (72 días tras la transfección) a 1050 ng/ml (48 días tras la
transfección) de factor IX humano activo en los animales
individuales a los que se inyectó el complejo de ADN (tabla 102).
No está claro si las pequeñas variaciones en la concentración del
hFIX recombinante encontradas en los animales representan una
diferencia en la eficacia de suministro o en la expresión del gen
recién introducido. El gen de hFIX se expresó en los animales
durante hasta 140 días (la duración del experimento), observándose
el mayor nivel inicial a los 48 días (tabla 102).
Utilizando animales transgénicos se ha
establecido (McGrane, et al., 1988, 1990; Short, et
al. 1992) que puede inducirse la transcripción del promotor de
PEPCK mediante la administración de una dieta con alto contenido en
proteínas - con bajo contenido en hidratos de carbono. Con el fin de
demostrar la expresión regulada del transgén, se analizó la sangre
de los animales transfectados para determinar la presencia de hFIX
mediante hibridación de tipo Western antes y después de una
alimentación con alto contenido en proteínas - con bajo contenido
en hidratos de carbono o una dieta comercial normal durante 1
semana. Se observó una inducción de hasta 3 veces de la expresión
del gen de PFIX en los animales que contenían el gen de PFIX durante
hasta 140 días tras la inyección del complejo de ADN. El mismo gen
de PEPCK-hFIX, introducido en los hígados de ratas
usando un método alternativo de transferencia génica mediada por
receptor que selecciona como diana la ASGE, fue activo durante sólo
dos días (Ferkol, et al., 1993); esto sugiere que el uso de
un complejo de ADN altamente compactado puede ser responsable de la
expresión prolongada del transgén observada en el presente
estudio.
La detección de niveles mantenidos de la
proteína hFIX en puntos de tiempo de hasta 140 días es una prueba
de la expresión a lo largo de todo el transcurso de tiempo
experimental. Se detectó un transcrito específico de 800 pb de FIX
humano mediante amplificación por FCR de ADNc generado a partir de
ARN celular total mediante transcriptasa inversa, en los hígados de
animales que expresan la proteína hFIX funcional (figura 3A). La
presencia de ARNm a lo largo del transcurso de tiempo experimental
indicaría que existe un conjunto mantenido de ADN
transcripcionalmente activo en estos animales, persistencia que
explicará la expresión y detección prolongada de hFIX y ARNm
específico.
específico.
También se ha establecido la presencia del ADN
transfectado en el hígado de animales 32 días tras la transfección,
y se ha investigado su estado físico. Se sometió el ADN extraído a
análisis mediante enzimas de restricción con Bgl II que lineariza
el plásmido (4,5 Kb) y con EcoR I que libera el gen quimérico de 2,6
Kb del plásmido. La hibridación por transferencia de tipo Southern
utilizando una sonda específica para hFIX demostró que el ADN
transfectado permanece en estado episómico en los hígados
transfectados, puesto que Bgl II producía una única banda coherente
con el tamaño del plásmido lineal en contraste con la hibridación
por extensión esperada cuando se produce la integración aleatoria
(figura 3B). No puede descartarse la posibilidad de que una pequeña
proporción del ADN transfectado pueda haber experimentado la
integración aleatoria en el genoma de los animales transfectados.
Sin embargo, se cree que este caso es improbable puesto que el
hígado no se ha sometido a estimulación de mitosis (es decir,
hepatectomía
parcial).
parcial).
El receptor de asialoglicoproteína sólo está
presente en células de parénquima del hígado. No obstante, se ha
demostrado que las asialoglicoproteínas y otros ligandos con
galactosa-terminal pueden captarse por macrófagos
mediante un mecanismo dependiente del tamaño del ligando molecular.
Véase Schlepper-Schäfer, J. et al., Exp.
Cell. Res. 165:494 (1986); Bijsterbosch, M.K., et al., Mol.
Pharmacol 36:484 (1989); y Bijsterbosch, M.K., et al., Mol.
Pharmacol 41:404 (1992). El tamaño del complejo de
ADN/ligando-poli-L-lisina
en los experimentos sería compatible con el intervalo de
discriminación del receptor de asialoglicoproteína. Con el fin de
investigar la especificidad del complejo de ADN, se ha obtenido ADN
de diferentes tejidos en un animal transfectado y se ha amplificado
el ADN transfectado mediante PCR. Los resultados muestran la
ausencia de ADN amplificable en tejidos distintos al hígado, lo que
indicaría la captación específica por los hepatocitos. Resulta
especialmente interesante que no hay captación detectable en tejidos
que contienen macrófagos como el pulmón y el bazo. En
contraposición, se ha detectado ADN transfectado en el pulmón y el
bazo en animales transfectados usando el método descrito por Wu,
et al. para endocitosis mediada por receptor por medio del
receptor de asialoglicoproteína. Se cree que el pequeño tamaño del
ligando molecular logrado en los experimentos es responsable de la
especificidad de la captación notificada en el presente
documento.
documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En este ejemplo se administra una construcción
génica-promotor diferente (SV40/luciferasa) a un
tipo de células diferente (macrófagos) por medio de un resto de
unión a célula diana diferente.
El reconocimiento y la captación de
glicoproteínas circulantes por células específicas se determinan por
la naturaleza de los residuos de azúcar expuestos presentes sobre
la superficie de la molécula. Los sistemas de aclaramiento de las
glicoproteínas específicas son relativamente exclusivos y están
mediados por tipos de células específicos. El receptor de manosa
reconoce glicoproteínas con residuos de manosa, glucosa, fucosa, y
N-acetilglucosamina en partes no reductoras
expuestas. Diversos conjugados de glicoproteína y proteínas que
portan estos residuos de hidratos de carbono se unen a macrófagos
alveolares aislados, y las células de Kupffer in vivo
eliminan glicoproteínas con manosa-terminal
infundidas en la circulación de ratas. A la inversa, estas células
no reconocen las glicoproteínas con
galactosa-terminal, que se eliminan por el receptor
de asialoglicoproteína en hepatocitos. Este receptor de la
superficie celular se expresa por una variedad de subtipos de
macrófagos, pero no por los monocitos circulantes, y media el
suministro y la internalización de glicoproteínas con
manosa-terminal. El receptor de manosa se recircula
constitutivamente de un compartimento prelisosómico a la superficie
celular, y la expresión del receptor está regulada por los
macrófagos.
Los macrófagos están presentes en diversos
órganos (es decir, hígado, bazo, pulmón y médula ósea) que se unen
a las glicoproteínas con manosa-terminal y por tanto
pueden ser una célula diana para la transferencia génica mediada
por receptor. Se sometió a prueba esta hipótesis examinando la
capacidad para suministrar genes exógenos funcionales que expresan
el receptor de manosa. En este informe, se sintetizó y se empleó un
portador de neoglicoproteína con manosa-terminal
como ligando para la transferencia génica mediada por receptor a
macrófagos murinos primarios aislados de exudados peritoneales, que
expresan abundantemente el receptor sobre su superficie. Además, se
transfirieron con éxito los genes indicadores a los macrófagos
presentes en el hígado y el bazo de ratas intactas usando el
portador de neoglicoproteína con
manosa-terminal.
Materiales: Se adquirieron enzimas que
modifican ADN, nucleótidos y
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido
de Boehringer Mannheim (Indianápolis, Indiana, EE.UU.). Todos los
compuestos químicos, incluyendo
poli(L-lisina), fenilisocianato de
a-D-manopiranosilo, albúmina y
fenilisocianato de
a-D-galactopiranosilo, se obtuvieron
de Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri, EE.UU.). El sistema
de ensayo de luciferasa se obtuvo de Promega (Madison, Wisconsin,
EE.UU.). El anticuerpo de conejo
anti-\beta-galactosidasa y la IgG
de cabra anti-conejo conjugada con isotiocianato de
fluoresceína se obtuvieron de 5 Prime to 3 Prime, Inc. Todos los
medios, sueros y antibióticos se obtuvieron de Gibco Laboratories
(Grand Island, Nueva York, EE.UU.).
Preparación de portador de glicoproteína con
manosa-terminal: Se construyeron portadores de
glicoproteína sintéticos en los que la
poli(L-lisina), de longitud de cadena
promedio 100 (PM 20.000 Da), se glicosiló utilizando un
fenilisotiocianato de
a-D-manopiranosilo disuelto en
N,N-dimetilformamida. Se ajustó la disolución a pH
9,5 mediante la adición de carbonato de sodio 1 M, pH 9,5. Protegida
de la luz e incubada durante 16 horas a 22ºC, la disolución se
dializó frente a cloruro de sodio 5 mM durante dos días. Se
glicosilaron aproximadamente del 0,8 al 1,0% de las cadenas
laterales de amina en la polilisina, tal como se determinó mediante
espectroscopía de absorbancia a 250 nm. Como control, se sintetizó
un portador de glicoproteína alternativo sustituyendo el
fenilisocianato de
a-D-manopiranosilo con
fenilisotiocianato de
a-D-galactopiranosilo.
Preparación de genes indicadores y
plásmido: El plásmido de expresión pGEMluc contenía el promotor
y elementos potenciadores virales de SV40 ligados al gen de la
luciferasa de P. pyralis. También se usaron como genes
indicadores los plásmidos pCMVZ y pCMVIL2r, que consistían en el
promotor de citomegalovirus (CMV) unido a los genes de lacZ de
E. coli y el receptor de interleucina 2, respectivamente. Los
plásmidos se hicieron crecer en E. coli DH5a, se extrajeron
y se purificaron mediante técnicas convencionales (14). Las
digestiones de los plásmidos con endonucleasas de restricción
dieron fragmentos del tamaño apropiado y la pureza se estableció
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,0%. Los tamaños de
los plásmidos son los siguientes: pGEMluc, 6,0; pCMVlacZ, 10,9; y
pCMVIL2r, 5,4 kB. No hubo ADN genómico bacteriano presente en las
preparaciones de plásmido.
Preparación de complejos de portador de
glicoproteína con manosa-terminal - ADN. Los
complejos se formaron de manera análoga al ejemplo 1, sin embargo,
el ADN era superenrollado en aproximadamente el 80% y circular
abierto en el 20%.
Células y cultivo celular. Se aislaron
macrófagos primarios de la cavidad peritoneal de ratones cuatro
días después de la inyección intraperitoneal de un mililitro de
medio de tioglicolato de Brewer. Se recogieron los macrófagos del
exudado peritoneal tal como se describió anteriormente y se
mantuvieron en medio RPMI 1640. Este método dio aproximadamente 5 x
10^{6} células por ratón, de las que el 40-75%
eran fagocitos mononucleares basándose en las características
morfológicas de las células y en la identificación citoquímica. Se
realizaron transfecciones uno o dos días tras la recogida. Las
células aisladas eran confluentes en aproximadamente el
30-60% en el momento de la transfección. Se
determinó la viabilidad de las células mediante recuentos de células
en serie y exclusión mediante azul trípano.
Suministro de ADN a macrófagos en
cultivo: Un día tras el aislamiento, se lavaron las células
aisladas de los exudados peritoneales de ratones una vez con PBS
(pH 7,4) y los medios se cambiaron inmediatamente antes de la
transfección. Se aplicó el complejo de
conjugado-ADN, que contenía 5 \mug (0,4 - 0,7
pmol) de plásmido, al medio de cultivo y se permitió que
permaneciera en las células durante 24 horas a menos que el
experimento dictara otra cosa. Entonces o bien se recogieron las
células para la extracción de proteínas o bien se fijaron para
realizar ensayos de \beta-galactosidasa in
situ en varios puntos de tiempo tras la transfección.
Animales: Se anestesiaron con éter ratas
Sprague-Dawley macho, adultas, que pesaban
aproximadamente 250 g. Utilizando una técnica aséptica, se
inyectaron de 0,3 a 0,6 ml de una disolución que contenía 300 \mug
(20,8 - 42,0 pmol) de un plásmido de expresión acomplejado con el
portador en la vena cava caudal. Se sacrificaron las ratas a
diferentes intervalos tras la infusión de los complejos y se
extrajeron los hígados, pulmones y bazos de los animales
transfectados para su análisis. Además, se aislaron los macrófagos
de los alvéolos, la médula ósea y el bazo. Se obtuvieron células de
médula ósea de fémur de rata. El fémur se extirpó quirúrgicamente
una vez sacrificado el animal de experimentación y se infundió un
mililitro de los medios en y se aspiró de la cavidad medular. Se
preparó una suspensión de una única célula de la médula aspirando
suavemente las células con una pipeta Pasteur. Las células
extraídas de la médula ósea se mantuvieron en medio RPMI 1640
durante 8 - 12 horas y se permitió que se unieran a portaobjetos de
vidrio, momento en el que se fijaron las células adherentes para la
tinción inmunocitoquímica. Se utilizaron como controles animales no
transfectados y transfectados de manera simulada en todos los
análisis. El Institutional Animal Care Committee de la Case Western
Reserve University revisó y aprobó el protocolo de investigación
con
animales.
animales.
Ensayo citoquímico para determinar la
actividad de \beta-galactosidasa: Se
identificaron células individuales que expresaban
\beta-galactosidasa tras la incubación con
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactopiranósido
(X-gal) tal como se describió anteriormente.
Brevemente, se fijaron las células con una disolución de
glutaraldehído al 1% en PBS durante 15 minutos y después se
incubaron con una disolución que contenía X-gal al
0,5% durante 12 horas a 37ºC. Las células también se tiñeron para
determinar la actividad esterasa no específica, que produce un
colorante de color gris-negro insoluble. Se contó un
mínimo de 100 células en el cultivo tisular para determinar el
porcentaje de células que expresan
\beta-galactosidasa.
Se identificaron células individuales que
expresaban \beta-galactosidasa en tejidos tras la
incubación con X-gal tal como se describió
anteriormente. Brevemente, las células se fijaron con una disolución
de glutaraldehído al 0,5% en PBS durante 10 minutos, se lavaron dos
veces con PBS, pH 7,5 y luego se incubaron con una disolución que
contenía X-gal al 0,5%, ferricianato de potasio 5
mM, ferrocianato de potasio 5 mM y cloruro de magnesio 1 mM en
solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) durante 6 horas a
37ºC. Los tejidos teñidos se fijaron en paraformaldehído al
2%/glutaraldehído al 0,5% en PBS durante la noche a 4ºC, se
embebieron en parafina mediante el procedimiento convencional y se
cortaron para dar cortes de 5 \mum. Los cortes se contratiñeron
con rojo rápido nuclear al 0,1%. Los cortes tisulares adyacentes
también se tiñeron para determinar la actividad esterasa no
específica, que aparece de color marrón-negro. Las
células coloreadas de azul se identificaron mediante
microscopía
óptica.
óptica.
Identificación citoquímica de macrófagos.
Se tiñeron cortes de tejido y células para determinar la actividad
esterasa no específica, que es relativamente específica para los
fagocitos mononucleares. Se fijaron los frotis celulares tal como
se describió anteriormente, y se incubaron con una disolución
filtrada que contenía acetato de a-naftilo y sal de
azul rápido BB durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se tiñeron
los cortes de tejido con esta disolución durante
1-3 horas, y se contratiñeron con rojo rápido
nuclear al 0,1%.
Tinción inmunocitoquímica para la
determinación de beta-galactosidasa: Se
determinó la expresión del transgén en células aisladas de tejidos
(bazo y médula ósea) transfectadas in vivo con el plásmido
pCMVZ mediante inmunofluorescencia indirecta. Se fijaron los frotis
celulares con metanol/acetona durante 2 minutos a temperatura
ambiente, y se incubaron las células con un anticuerpo de conejo
policlonal anti-b-galactosidasa
durante una hora a 37ºC. Se diluyó el anticuerpo primario 1:100 en
PBS para la inmunodetección en los frotis de células fijadas. Se
utilizó inmunoglobulina G anti-conejo conjugada con
isotiocianato de fluoresceína diluida 1:100 en PBS como el
anticuerpo secundario. Las células también se contratiñeron con
yoduro de propidio, que produce fluorescencia roja en el núcleo
celular. Entre cada incubación, se lavaron las células tres veces
durante cinco minutos con PBS. Se examinaron las células teñidas
mediante microscopía fluorescente.
Ensayos para determinar la actividad
luciferasa: Se recogieron, lisaron y analizaron las células en
cultivo para determinar la actividad luciferasa tal como se
describió anteriormente. Los tejidos se recogieron de ratas
transfectadas y control una vez sacrificados los animales y
perfundidos in situ con 50 mililitros de PBS frío, pH 7,5.
Se homogeneizaron los tejidos en tampón de lisis y se permitió que
se incubaran a 22ºC durante 10 minutos. Posteriormente se
centrifugaron los lisados celulares durante 5 minutos a 4ºC, y se
analizaron los extractos de proteínas para determinar la actividad
luciferasa. Los lisados se sometieron a ensayo para determinar el
contenido en proteínas y se normalizaron las unidades de luz
integradas medidas para determinar el contenido en proteínas total.
Todas las mediciones se realizaron por triplicado y se expresaron
como un promedio de los valores.
Análisis estadístico: Los datos se
expresan como medias \pm error estándar de la media (SEM), y se
evalúan mediante un análisis de varianza utilizando la prueba de
Student-Newman-Keuls (SNK).
Utilizando un plásmido de expresión (pCMVZ) que
codifica el gen lacZ de E. coli como gen indicador, se
aplicaron complejos del plásmido y el portador de glicoproteína con
manosa-terminal a células de exudados peritoneales
celulares aislados de ratón. Veinticuatro horas tras la
transfección, se examinaron las células para determinar la
actividad \beta-galactosidasa. El número de
células transfectadas varió desde el 5 hasta el 26 por ciento de
todas las células examinadas. Además, la proporción de células con
actividad esterasa no específica, un marcador citoquímico
característico de monocitos y macrófagos, que expresaban el transgén
osciló desde el 40% hasta el 75%. Las transfecciones utilizando
complejos que consistían en un plásmido irrelevante (pGEMluc) unido
al portador o el plásmido de expresión (pCMVZ) unido a un portador
de glicoproteína con galactosa-terminal no
mostraron actividad \beta-galactosidasa
significativa en las células de exudado. Se observó tinción débil
de color azul en estas células control, que se debía lo más
probablemente a actividad \beta-galactosidasa
endógena. No obstante, el porcentaje y la intensidad de las células
teñidas de azul en los controles fue marcadamente inferior que en
las placas transfectadas. El complejo de portador de glicoproteína
con manosa-terminal - ADN pareció no ser tóxico
para las células, dado que el porcentaje de células viables, basado
en los recuentos de células y en la tinción con azul trípano tras
el tratamiento no fue significativamente diferente de los
controles.
Se aplicaron los complejos del portador de
glicoproteína con manosa-terminal y el plásmido de
expresión pGEMluc a células aisladas de los exudados peritoneales
durante periodos de tiempo crecientes, y se midió la actividad
luciferasa en los extractos de proteínas de las células
transfectadas 24 horas tras la transfección. Tal como se observó en
los experimentos anteriores, varió el nivel de expresión del gen
transferido. Estaba presente un aumento de ocho veces en la
actividad luciferasa relativa en las células transfectadas (p <
0,01), mientras que los extractos de proteínas obtenidos de las
células tratadas con un complejo formado utilizando un portador de
glicoproteína con galactosa-terminal no expresaron
actividad significativamente diferente de la del control no
transfectado. Además, la adición de un exceso molar de cien veces de
albúmina sérica bovina manosilada con respecto al complejo a los
medios de cultivo inmediatamente antes de la transfección, que debe
competir con el portador por el receptor de manosa, inhibió
completamente la captación y la expresión del gen indicador (p <
0,01). También se examinó la duración de la expresión del transgén
en estas células. Se aplicaron los complejos del portador de
glicoproteína con manosa-terminal y el plásmido de
expresión pGEMluc a las células durante 24 horas, y se sometieron a
ensayo extractos de proteínas para determinar la actividad
luciferasa en varios puntos de tiempo tras la transfección. Se
detectó la expresión del transgén óptima un día tras el tratamiento
y la actividad luciferasa disminuyó hasta niveles control ocho días
tras la transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó el portador de glicoproteína con
manosa-terminal para transferir genes indicadores en
el bazo y los hígados de animales intactos. Se anestesiaron las
ratas y se acomplejaron 300 \mug de plásmido (pGEMluc) con el
portador de glicoproteína con manosa-terminal y se
infundieron lentamente en la vena cava caudal durante varios
minutos. También se realizaron en paralelo transfecciones control y
simuladas de animales utilizando complejos que consistían en un
plásmido irrelevante (pCMVlacZ) unido al portador. Todos los
animales a los que se inyectó el complejo sobrevivieron. Se
realizaron ensayos de luciferasa cuatro días tras la infusión de
los complejos en homogeneizados de tejidos extraídos del hígado, los
pulmones y el bazo. Se observaron niveles significativos de
expresión del transgén en los extractos de proteínas del bazo
obtenido de animales transfectados. Se encontraron niveles
inferiores de actividad luciferasa en el hígado y el pulmón. Las
ratas no transfectadas y los animales tratados con los complejos
que consistían en un plásmido irrelevante (pCMVlacZ) unido al
portador de glicoproteína con manosa-terminal no
tuvieron actividad luciferasa significativa en extractos de
proteínas de ningún tejido. Doce días tras la transfección, la
actividad luciferasa se aproximaba a los niveles iniciales en todos
los tejidos examinados.
Se examinó la distribución celular de la
expresión del transgén en cortes de bazo e hígado tres días tras la
inyección de los complejos que contenían pCMVlacZ. Se analizaron los
tejidos para determinar la actividad
b-galactosidasa mediante una tinción citoquímica. Un
animal tratado con complejos obtenidos utilizando un plásmido
irrelevante (pCMVIL2r) sirvió como control. Se detectó la expresión
de beta-galactosidasa en varias células pequeñas en
el bazo situadas en la región subcapsular, que se ajustaba a la
distribución de las células que expresaban actividad esterasa no
específica basándose en tinción citoquímica. No se encontró
actividad beta-galactosidasa en las células
correspondientes del bazo control. En los cortes hepáticos del
animal transfectado estaban presentes células teñidas de azul poco
frecuentes, y las células endoteliales hepáticas, que también
tienen receptores de manosa de superficie, expresaron el transgén.
También se aislaron células nucleadas del bazo y se tiñeron in
vitro. Además, las células extraídas de la médula ósea y del
líquido de lavado broncoalveolar de los animales transfectados y
control también se trataron con una disolución que contenía
X-gal y se examinaron para determinar actividad
beta-galactosidasa. Aproximadamente el
10-20 por ciento de las células nucleadas obtenidas
del bazo se tiñeron de azul. Las células poco frecuentes de los
animales transfectados simulados también se tiñeron débilmente de
azul, lo más probablemente debido a una
\beta-galactosidasa endógena. No obstante, el
porcentaje y la intensidad de las células teñidas de azul en los
controles fueron significativamente inferiores que los encontrados
en el animal
control.
control.
Se utilizó un anticuerpo policlonal dirigido
contra la beta-galactosidasa bacteriana para la
localización inmunocitoquímica del producto transgénico para
establecer que las células teñidas de azul en el bazo no se deben a
la beta-galactosidasa endógena ni a la hidrólisis no
específica de X-gal. Las células nucleadas aisladas
del bazo y la médula ósea de los animales descritos anteriormente se
tiñeron con el anticuerpo dirigido contra la
beta-galactosidasa y con el anticuerpo
anti-conejo conjugado con isotiocianato de
fluoresceína y se examinaron para determinar la
inmunofluorescencia. Varias de las células aisladas, que eran
morfológicamente similares a las células teñidas de azul
demostradas en el ensayo citoquímico, presentaban tinción
inmunofluorescente. Además, estas células tenían actividad esterasa
no específica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha desarrollado un complejo de glicoproteína
sintético que puede mediar la transferencia de genes funcionales en
macrófagos en cultivo y en los hígados de animales completos. Pueden
introducirse plásmidos de expresión unidos no covalentemente a un
portador de glicoproteína con manosa-terminal de
manera eficaz en células que expresan el receptor de manosa. El
suministro de ADN mediante un sistema de transferencia génica
mediada por receptor depende de la presencia de receptores sobre la
superficie de las células seleccionadas como diana. Las células que
no expresan el receptor de asialoglicoproteína no se transfectaron
mediante este sistema. Además de los macrófagos, no se
transfectaron otros tipos celulares presentes en el exudado
peritoneal que no expresan el receptor de manosa, es decir,
granulocitos, linfocitos y fibroblastos. La expresión del gene
indicador se localizó en células que tenían o bien actividad
peroxidasa o bien esterasa no específica, marcadores citoquímicos
fidedignos utilizados para la identificación de macrófagos.
La especificidad y la afinidad del ligando para
el receptor específico son de importancia considerable para el
suministro de genes exógenos. Los macrófagos se unen a
glicoproteínas con manosa-terminal con alta afinidad
y especificidad. El portador de glicoproteína con
manosa-terminal introdujo satisfactoriamente genes
indicadores en macrófagos en cultivo y en animales intactos,
mientras que no se detectó la expresión del transgén en células
transfectadas utilizando un portador de glicoproteína con
galactosa-terminal. La captación no parece deberse
a un aumento no específico en pinocitosis o fagocitosis derivada de
la presencia de glicoproteína en el medio de cultivo. El suministro
y la expresión del plásmido se inhiben mediante la adición de
albúmina sérica bovina manosilada al medio de cultivo, que
presumiblemente compite por el/los sitio(s) de unión sobre el
receptor de manosa. Finalmente, la sustitución de un monosacárido
alternativo para la manosa podría aumentar la afinidad del complejo
de ADN-portador, dado que el receptor de manosa
también reconoce glicoproteínas con residuos de glucosa, fucosa y
N-acetilglucosamina en posiciones expuestas. Además,
podría mejorarse potencialmente la eficacia de transferencia génica
mediante la alteración del residuo de hidrato de carbono en un
oligosacárido, es decir, oligomanosa, puesto que los monosacáridos
son peores ligandos para el receptor que las glicoproteínas
polivalentes.
Un factor principal en la determinación del
nivel de expresión de los genes transferidos en las células dianas
implica la supervivencia y el suministro de ADN exógeno al núcleo.
La expresión de los genes introducidos mediante mecanismos mediados
por receptor puede limitarse mediante el atrapamiento y la
degradación del complejo en compartimentos endosómicos. Se
introducen glicoproteínas con manosa-terminal en
macrófagos mediante endocitosis mediada por receptor, suministrados
a un compartimento ácido pre-lisosómico y
posteriormente se transportan a los lisosomas secundarios.
Aparentemente, una parte del conjugado introducido evita la
destrucción dado que el ADN transferido debe escapar de la
degradación una vez que el complejo ha entrado en la célula con el
fin de que se exprese el transgén. El estado físico del ADN
transferido en las células mediante estos sistemas de suministro
también puede contribuir a su supervivencia y expresión posterior y
la forma altamente compacta del ADN puede ser más resistente a la
digestión por nucleasas. Además, el pequeño tamaño del complejo de
portador-ADN también puede permitir la introducción
del plásmido en las células del sistema reticuloendotelial
específicamente mediante el receptor de manosa y no mediante
fagocitosis.
Este estudio ilustra el potencial de dirigir
específicamente la transferencia génica en macrófagos seleccionando
como objetivo el receptor de manosa, y podría proporcionar
teóricamente un enfoque para el tratamiento de diversos errores
innatos del metabolismo, como la enfermedad de Gaucher. Se ha
demostrado que las terapias farmacológicas que también seleccionan
como objetivo el receptor de manosa son eficaces en pacientes con
enfermedad de Gaucher. Los tratamientos repetidos de individuos
afectados con glucocerebrosidasa humana modificada, en la que los
restos de hidratos de carbono externos se escinden para exponer los
residuos de manosa terminales, han tenido una mejora clínica
sustancial en su enfermedad, tal como se demuestra mediante la
reducción en hepatoesplenomegalia y la resolución de anemia.
Desgraciadamente, el coste de esta terapia ha resultado prohibitivo
para muchos pacientes. Se ha demostrado que el trasplante de médula
ósea es curativo en la forma no neuropática de la enfermedad,
aunque las complicaciones potenciales del trasplante descarta este
procedimiento en muchos pacientes, particularmente en aquellos
individuos con enfermedad leve. Sin embargo, dado que la enfermedad
de Gaucher puede corregirse mediante transplante de médula ósea, un
posible enfoque que se ha propuesto para la terapia génica de la
enfermedad de Gaucher implica la transferencia ex vivo del
gen de glucocerebrosidasa normal en células madre hematopoyéticas
autólogas y su introducción posterior en el paciente.
Alternativamente, podrían recogerse linfoblastos del individuo
afectado, infectado con retrovirus recombinantes incompetentes para
la replicación que contenían el gen de tipo natural, y devolverse al
paciente. La enzima secretada entraría en los macrófagos mediante
el receptor de manosa, convirtiéndose así en los objetivos
secundarios de la terapia. En el sistema que se describe en este
original, el macrófago sería la diana principal para la corrección
genética. Es necesario tratar cuestiones prácticas con respecto a
la eficacia del suministro de genes, la duración y el nivel de
expresión logrados utilizando esta técnica, y las propiedades
inmunológicas de los complejos de ADN-portador. No
obstante, la terapia génica mediada por receptor tiene el potencial
de proporcionar un enfoque no invasivo al tratamiento de tales
enfermedades.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
También se ha utilizado un fragmento Fab de
anticuerpo monoclonal dirigido frente al receptor de inmunoglobulina
polimérica de rata que se expresa en los epitelios de las vías
respiratorias. El péptido de Fab se acopló covalentemente a
poli-L-lisina y se complejó con un
vector de expresión de SV40-luciferasa utilizando el
procedimiento descrito más adelante. Las ratas a las que se inyectó
el complejo de ADN tuvieron actividad luciferasa durante hasta 8
días (la duración del experimento) sólo en tejidos que expresaban el
receptor. Estos hallazgos subrayan la flexibilidad de este sistema
para suministrar ADN a tejidos específicos de un animal adulto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han desarrollado varios métodos de
transferencia génica en el tracto respiratorio que permiten la
introducción de genes funcionales en células in vivo. Sin
embargo, muchos de estos enfoques han carecido de especificidad y
son citotóxicos. Se han utilizando adenovirus recombinantes,
deficientes en la replicación, para suministrar los genes
indicadores a células epiteliales respiratorias en una variedad de
modelos animales. Sin embargo, los efectos fisiológicos del
tratamiento con adenovirus no se entienden bien y la evidencia
reciente sugiere que los vectores adenovirales de primera
generación administrados a altos títulos virales a animales producen
una respuesta inflamatoria sustancial en el pulmón. También se han
usado liposomas para transferir genes funcionales al epitelio de
las vías respiratorias, pero este enfoque generalmente ha sido
tóxico para las células y carece de especificidad.
La transferencia génica mediada por receptor
puede proporcionar un método para suministrar ADN a dianas celulares
específicas utilizando un vector no tóxico no infeccioso. Esta
forma de transferencia génica permite la selección como diana de
tejido específico con plásmidos de ADN de tamaño considerable, que
permiten el suministro no sólo del transgén, sino también de
elementos de promotor y potenciador. En el caso de los sistemas
mediados por receptor, el suministro de ADN exógeno es dependiente
de la estabilidad del complejo de ADN-portador, de
la presencia y el número de receptores específicos sobre la
superficie de la célula seleccionada como diana, de la afinidad y
la interacción del receptor-ligando y de la
internalización eficaz del complejo. Además, la expresión de los
genes transferidos se basa en su escape de las vesículas endosómicas
y del transporte al núcleo de la célula diana. La duración de la
expresión del transgén en animales completos a los que se ha
administrado mediante el aprovechamiento de la endocitosis mediada
por receptor ha sido generalmente transitoria, volviendo a niveles
iniciales en el plazo de setenta y dos horas tras el tratamiento.
Esto ha sido el caso para genes indicadores introducidos en células
epiteliales de las vías respiratorias mediante la vía intratraqueal
utilizando vectores de adenovirus-polilisina y
transferrina-adenovirus-
polilisina.
polilisina.
Se ha demostrado que en cultivos primarios de
células epiteliales de tráquea humana, la selección como diana del
receptor de inmunoglobulina polimérica (pIgR) permite el suministro
eficaz del transgén específicamente a células que portan el
receptor. El receptor de inmunoglobulina polimérica se expresa sólo
en células epiteliales de la mucosa, incluyendo las células de la
glándula submucosa y las células epiteliales de las vías
respiratorias y está adaptado específicamente para la
internalización y la transferencia no degradativa de moléculas
grandes. En este informe, se demuestra que la selección como diana
del receptor de inmunoglobulina polimérica in vivo da como
resultado la expresión del transgén en tejidos que contienen células
que portan el receptor que era máxima seis días tras la
transfección.
transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales. Las enzimas que modifican
ADN, los nucleótidos y el
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido
se adquirieron de Boehringer Mannheim (Indianápolis, Indiana,
EE.UU.). El sistema de ensayo de luciferasa se obtuvo de Promega
(Madison, Wisconsin, EE.UU.). Las columnas de proteína A - MAPS -
agarosa se adquirieron de BioRad (Richmond, California, EE.UU.). La
papaína y la poli(L-lisina) se obtuvieron de
Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri, EE.UU.), y el
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato
era de Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois, EE.UU.). El
anticuerpo monoclonal de ratón anti-receptor de la
interleucina 2 humano se obtuvo de Dako Corporation (Carpenteria,
California, EE.UU.), y el anticuerpo de cabra
anti-ratón secundario marcado con isotiocianato de
fluoresceína era de Sigma Immunochemicals (St. Louis, Missouri,
EE.UU.). El método Vectastain ABC, utilizado en el procedimiento de
tinción con inmunoperoxidasa, se adquirió de Vector Laboratories
(Burlingame, California, EE.UU.). Todos los medios, sueros y
antibióticos se obtuvieron de Gibco Laboratories (Grand Island,
Nueva York, EE.UU.).
Preparación de fragmentos Fab.
Anteriormente se ha descrito el aislamiento y la digestión con
papaína de anticuerpos derivados de conejos inmunizados con
componente de secreción de rata. Brevemente, se aisló el anticuerpo
policlonal del suero de conejo utilizando una columna de proteína A
- MAPS - agarosa tal como describe el fabricante. Se trató la
inmunoglobulina G (2 mg) aislada con 20 \mug de papaína durante 12
horas a 37ºC en presencia de acetato de sodio 100 mM (pH 5,5),
cisteína 50 mM y EDTA 1 mM. El fragmento Fab se separó del
anticuerpo intacto y los fragmentos Fc mediante cromatografía de
proteína A. Se generó un Fab irrelevante (FabI) mediante digestión
con papaína de IgG de suero de conejo preinmunizado.
Preparación de conjugados de
Fab-polilisina. El fragmento Fab de la
inmunoglobulina G anti-pIgR se unió covalentemente
a poli(L-lisina) (PM 10.000 Da) utilizando el
reactivo de reticulación heterobifuncional
3-(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo (SPDP). Se incubó el fragmento Fab
con un exceso molar de setenta y cinco veces de SPDP en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M, pH 7,5, a 22ºC durante 60
minutos. Tras la introducción de estructuras de disulfuro de
2-piridilo en el fragmento Fab, se eliminaron
mediante diálisis el SPDP sin reaccionar y productos de reacción de
bajo peso molecular. Los puentes disulfuro del fragmento Fab
modificado se escindieron con ditiotreitol 25 mM. Tanto la
poli(L-lisina) como el SPDP se añadieron en
un exceso molar de quince veces al fragmento Fab modificado, y la
reacción se llevó a cabo a 22ºC durante 24 horas. Se dializó el
conjugado para eliminar los productos de reacción de bajo peso
molecular y se analizó mediante la separación de las proteínas
resultantes en una electroforesis en gel de SDS al 0,1% -
poliacrilamida al 7,5%. Tal como se describió anteriormente, el
análisis del conjugado demostró una proteína que migraba lentamente,
correspondiente a una proteína superior a 200 kDa en tamaño.
Genes indicadores y preparación de
plásmido. El plásmido de expresión pGEMluc contenía el promotor
viral de SV40 ligado al gen de luciferasa de P. pyralis.
También se usaron los plásmidos pCMVZ y pCMVIL2r, que consisten en
el promotor de citomegalovirus (CMV) unido a los genes de lacZ de
E. coli y el receptor de interleucina 2, respectivamente,
como genes indicadores. Para los estudios de la actividad
luciferasa, se emplearon estos plásmidos como controles de ADN
irrelevante (ADNI). Los plásmidos se hicieron crecer en E.
coli DH5a, se extrajeron y se purificaron mediante técnicas
convencionales. Las digestiones de los plásmidos con endonucleasas
de restricción dieron los fragmentos del tamaño apropiado y la
pureza se estableció mediante electroforesis en gel de agarosa al
1,0%. Los tamaños de los plásmidos son los siguientes: pGEMluc, 6,0;
pCMVlacZ, 10,9; y pCMVIL2r, 5,4 kB. No se observó contaminación con
ADN o ARN genómico bacteriano presente en la preparación de
plásmidos.
plásmidos.
Preparación de complejos de
Fab-polilisina-ADN. Se formaron
los complejos de portador-ADN utilizando un método
descrito anteriormente.
Animales: Se utilizó el portador de
polilisina - anticuerpo Fab anti-componente de
secreción de rata para transferir genes indicadores a las vías
respiratorias y los hígados de animales intactos. Se anestesiaron
ratas Sprague-Dawley macho, adultas, que pesaban
aproximadamente 250 g. Utilizando una técnica aséptica, se
inyectaron en la vena cava caudal de 0,3 a 0,6 ml de una disolución
que contenía 300 \mug de un plásmido de expresión acomplejado con
el portador. Se sacrificaron las ratas en varios tiempos diferentes
tras la infusión de los complejos y se extrajeron diversos órganos
para su análisis. También se realizaron en paralelo transfecciones
simuladas de animales utilizando complejos que consistían en un
plásmido irrelevante unido al portador o el plásmido de expresión
unido a un portador obtenido con un fragmento Fab irrelevante. El
Institutional Animal Care Committee de la Case Western Reserve
University revisó y aprobó el protocolo de investigación con
animales.
Ensayo citoquímico para la actividad
\beta-galactosidasa: Se identificaron células
individuales que expresaban \beta-galactosidasa
en tejidos tras la incubación con
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactopiranósido
(X-gal) tal como se describió anteriormente.
Brevemente, las células se fijaron con una disolución de
glutaraldehído al 0,5% en PBS durante 10 minutos, se lavaron dos
veces con PBS, pH 7,5, y luego se incubaron con una disolución que
contenía X-gal al 0,5%, ferricianato de potasio 5
mM, ferrocianato de potasio 5 mM y cloruro de magnesio 1 mM en
solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) durante 4 horas a
37ºC. Los tejidos teñidos se fijaron en paraformaldehído al
2%/glutaraldehído al 0,5% en PBS durante la noche a 4ºC, se
embebieron en parafina mediante el procedimiento convencional y se
cortaron para dar cortes de 5 \mum. Los cortes se contratiñeron
con rojo rápido nuclear. Se identificaron las células coloreadas de
azul mediante microscopía óptica. Se contó un mínimo de 100 células
para determinar el porcentaje de células por corte que expresan
\beta-galactosidasa. Además, se tiñeron cortes
adyacentes con azul alcián/ácido peryódico-Schiff o
hematoxilina/eosina utilizando protocolos convencionales.
Ensayos para determinar la actividad
luciferasa: Se recogieron, se lisaron y se analizaron las
células en cultivo para determinar la actividad luciferasa tal como
se describió anteriormente. Se recogieron los tejidos de ratas
transfectadas y control una vez sacrificados los animales y
perfundidos in situ con PBS frío, pH 7,5, durante cinco
minutos. Se homogeneizaron los tejidos en tampón de lisis y se
permitió incubarlos a 22ºC durante 10 minutos. Posteriormente se
centrifugaron los lisados de células durante 5 minutos a 4ºC, y se
analizaron los extractos de proteínas para determinar la actividad
luciferasa. Se sometieron a ensayo los lisados para determinar el
contenido en proteínas y se normalizaron las unidades de luz
integradas medidas (intervalo de 10 segundos) para determinar el
contenido en proteínas total. Todas las mediciones se realizaron
por triplicado y se expresaron como un promedio de los
valores.
valores.
Tinción inmunohistoquímica para el receptor
de interleucina 2. Se determinó la expresión del transgén en
tejidos transfectados con el plásmido pCMVZ mediante
inmunofluorescencia indirecta. Se fijaron cortes congelados de
diversos tejidos con acetona durante 10 minutos a -20ºC, y se
trataron con durante diez minutos a 22ºC para reducir la
autofluorescencia. Entonces se incubaron los cortes con suero de
cabra al 10% en PBS, pH 7,5, durante una hora a temperatura
ambiente. Entonces se incubaron las células secuencialmente con un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-receptor de la
interleucina 2 e IgG de cabra anti-ratón conjugada
con isotiocianato de fluoresceína. Ambos anticuerpos se diluyeron
1:100 en PBS, y entre cada incubación, se lavaron las células tres
veces durante cinco minutos con PBS, pH 7,5. Se examinaron las
células teñidas mediante microscopía fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los animales a los que se inyectó el
complejo de ADN - portador de polilisina - anticuerpo Fab
anti-componente de secreción de rata sobrevivieron.
Se realizaron los ensayos de luciferasa 48 horas tras la infusión
de los complejos en homogeneizados de tejidos extraídos del hígado,
los pulmones y el corazón. Se observaron niveles significativos de
expresión del transgén en los extractos de proteínas del hígado y
los pulmones obtenidos de animales transfectados. No se encontró
actividad luciferasa detectable en el bazo y el corazón, tejidos
que no expresan el pIgR. Además, los animales tratados con los
complejos que consisten en un plásmido irrelevante (pCMVlacZ) unido
al portador o el plásmido de expresión (pGEMluc) unido a un portador
basado en un fragmento Fab irrelevante dieron como resultado
actividad luciferasa no significativa en cualquiera de los tejidos
examinados. Así, sólo se transfectan los tejidos que contienen
células que portan pIgR y la transfección no puede atribuirse a la
captación no específica de un complejo basado en anticuerpo Fab
irrelevante.
Se desarrolló un transcurso de tiempo de la
expresión del gen transferido, en el que se midió la actividad
luciferasa en extractos de proteínas derivados de los cuatro tejidos
en diferentes puntos de tiempo tras la inyección del complejo. La
actividad luciferasa persistió en el hígado y el pulmón, tejidos que
tienen pIgR, logrando valores máximos de 13795 \pm 4431 y 461402
\pm 230078 unidades de luz integradas (ILU) por miligramo de
extracto de proteína, respectivamente, en de cuatro a seis días tras
la inyección. Los tejidos que no han expresado el receptor no
tuvieron expresión significativa del transgén.
Se examinó la distribución celular de la
expresión del transgén en cortes de diversos tejidos. Tres días tras
la inyección de complejos que contenían pCMVlacZ, se sometieron
cortes de tejido de tráquea, pulmón e hígado a tinción citoquímica
para determinar la actividad b-galactosidasa. Un
animal tratado con complejos obtenidos utilizando un plásmido
irrelevante (pCMVIL2r) sirvió como control. La expresión en la
tráquea se limitó a las células que revisten la superficie
epitelial. No se detectó actividad
beta-galactosidasa en los cortes de tráquea del
animal transfectado simulado. La expresión del transgén fue
variable, y en algunas zonas del epitelio respiratorio más del 50%
de las células se tiñeron de azul. En general, la expresión oscilo
desde el 10 hasta el 20% de las células epiteliales de tráquea.
Tanto las células epiteliales respiratorias secretoras
(caliciformes) como las ciliadas expresaron actividad
beta-galactosidasa, basándose en tinción con azul
alcián/ácido peryódico - Schiff de los cortes adyacentes de las
vías respiratorias. No se detectó expresión del transgén en las
vías respiratorias terminales ni en los alvéolos en los animales
transfectados ni en los control (datos no mostrados). Esto es
conforme a la distribución de las células epiteliales que expresan
pIgR basándose en la tinción inmunohistoquímica in situ.
Glándulas submucosas poco frecuentes fueron evidentes en los cortes
de tráquea y sólo se observó una débil tinción de azul. No se
encontró respuesta inflamatoria en ninguno de los cortes de tráquea
de animales no transfectados, simulados y transfectados. Además, se
utilizó un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido frente al
receptor de la interleucina 2 humano, una proteína de superficie que
se ha usado como un indicador en la transducción de células
epiteliales respiratorias in vitro pero que no se expresa
naturalmente en estas células, para la localización
inmunofluorescente del producto transgénico en la tráquea del
animal transfectado con el plásmido pCMVIL2r. Se examinaron cortes
en serie de la tráquea para determinar la presencia de
fluorescencia y la membrana apical de numerosas células epiteliales
respiratorias del animal transfectado se tiñeron apropiadamente. No
se detectó tinción fluorescente específica en los epitelios de las
vías respiratorias de un animal transfectado simulado con pCMVlacZ.
También se encontraron hepatocitos teñidos de azul poco frecuentes
en cortes hepáticos del animal transfectado. No se identificó la
expresión del transgén en los hígados ni de las ratas no
transfectadas ni de las transfectadas simuladas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se notifica la transferencia satisfactoria de
genes indicadores en el epitelio de las vías respiratorias in
vivo tras la inyección de un complejo de selección como diana
que consiste en la parte Fab de la inmunoglobulina G dirigida
contra el receptor de rata de la inmunoglobulina polimérica
conjugado con poli(L-lisina), y unido no
covalentemente a ADN de plásmido. Esta técnica suministró
específicamente el transgén al hígado y al pulmón, tejidos en los
que se expresa este receptor. No se transfectaron otros tejidos que
no expresan el receptor, como el bazo y el corazón. Además, tras la
inyección de un conjugado preparado con los fragmentos Fab
irrelevantes no se detectó expresión, y un complejo preparado con
un plásmido que contenía un gen indicador irrelevante tampoco
produjo actividad luciferasa detectable. Así, este complejo,
selecciona como diana específicamente tejidos que portan el
receptor y el transporte normal de los ligandos naturales del
receptor no interfiere con la captación del transgén in
vivo.
La mayoría de las estrategias para la
transferencia génica en el tracto respiratorio actualmente
disponibles dependen de vectores virales que no se dirigen
específicamente a células epiteliales respiratorias y que se basan
en la vía intratraqueal de suministro para permitir la selección
como diana de las vías respiratorias. También se ha utilizado la
instilación intratraqueal para dirigir específicamente la
transferencia génica mediante otros medios, como liposomas y
conjugados de
adenovirus-transferrina-polilisina,
al epitelio de las vías respiratorias. El suministro sistémico de
ADN unido a liposomas catiónicos no ha sido selectivo y transfiere
genes funcionales a varios tipos celulares en tejidos diferentes. La
especificidad de la transferencia génica mediada por receptor para
las células que portan el pIgR puede ser útil en la selección como
diana de células defectuosas en las vías respiratorias de pacientes
con fibrosis quística.
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Ejemplo
4
La hipercolesterolemia familiar (HF) en una
enfermedad genética humana caracterizada por aterosclerosis
fulminante y enfermedad cardiovascular. Una mutación en el gen para
el receptor que media la captación de la lipoproteína de baja
densidad (LDL) es responsable de esta enfermedad. Una de cada 500
personas es heterocigota para una mutación en el gen del receptor
de LDL que es responsable de la HF. Como resultado, se elimina LDL
de su plasma a sólo dos tercios de la tasa normal. En la cuarta a
quinta década de vida, los niveles elevados de LDL en plasma
producen aterosclerosis sintomática en estos pacientes. Los
homocigotos para HF (uno en un millón de personas) tienen poco o
ningún receptor de LDL funcional, dependiendo del dominio de la
proteína que está afectada por la mutación. Esto da como resultado
aterosclerosis coronaria sintomática antes de los 20 años de edad.
El tratamiento con resinas de unión a ácidos biliares e inhibidores
de la síntesis de colesterol ha sido considerablemente
satisfactorio en pacientes con HF heterocigotos mediante la
estimulación de la producción del receptor de LDL a partir del
único gen normal. En los homocigotos para HF no existe respuesta al
tratamiento con fármacos. Debido a la ausencia de un gen normal que
puede estimularse, la sustitución del gen mutado es el único
enfoque posible para el tratamiento de pacientes con HF homocigotos.
Puesto que el hígado es el órgano principal responsable del
catabolismo de LDL, los dos enfoques tomados para el tratamiento de
la enfermedad se dirigen a este órgano: trasplante de hígado y
terapia génica. El trasplante de un hígado normal en un paciente
con HF puede corregir la hiperlipidemia, lo que sugiere que la
reconstitución del receptor de LDL hepático debe ser suficiente
para la mejora fenotípica. Basándose en este resultado, todos los
enfoques realizados usando la terapia génica para el tratamiento de
HF se han dirigido a los hepatocitos.
Con el fin de entender el mecanismo de la
enfermedad, es necesario ser consciente del metabolismo/destino del
colesterol en el organismo. Cada célula necesita colesterol para la
síntesis de la membrana plasmática. Las glándulas suprarrenales y
el cuerpo lúteo del ovario, además, requieren colesterol para la
síntesis de hormonas esteroideas. El hígado es el órgano con la
mayor demanda debido a la producción de ácidos biliares. El
colesterol se obtiene en tejidos periféricos o bien a partir de
captación mediada por receptor de lipoproteínas de baja densidad
(LDL), que son los portadores principales del colesterol endógeno en
la sangre, o bien mediante biosíntesis. La HMG CoA reductasa es la
enzima determinante de la velocidad en la ruta. El colesterol de la
dieta se porta en el torrente sanguíneo mediante partículas
quilomicrónicas, que se captan mediante receptores específicos en
el hígado. Con el fin de proporcionar colesterol a los diferentes
tejidos, el hígado secreta partículas de lipoproteína de muy baja
densidad (VLDL) compuestas por triglicéridos, ésteres de colesterilo
y apoproteínas C, E y B-100. La captación de
triglicéridos de VLDL por el tejido adiposo y el músculo convierte
estas partículas en lipoproteínas de densidad intermedia (IDL). El
receptor de LDL, presente a la concentración más alta en el hígado
y las glándulas suprarrenales pero también en el resto de tejidos,
reconoce los componentes de apo E y apo B-100 de
IDL. Por tanto, en condiciones normales, las IDL se eliminan en su
mayor parte del torrente sanguíneo mediante captación mediada por
el receptor de LDL. Las IDL restantes se convierten en LDL, que se
captan también mediante el receptor de LDL que reconoce el
componente de apo B-100. El aclaramiento del
colesterol del organismo se lleva a cabo mediante el hígado, en el
que se convierte en ácidos biliares y se secretan en el tubo
digestivo. Aunque la mayor parte del colesterol se reabsorbe en el
íleo terminal para la reutilización hepática, esta ruta proporciona
la vía de salida.
Por tanto, la presencia de receptores de LDL no
funcionales que no pueden eliminar IDL ni LDL de la sangre da como
resultado niveles de LDL sérico elevados, y por tanto colesterol
sérico total. Esto es responsable de la deposición de colesterol en
las paredes arteriales y por tanto, de la aterosclerosis.
El conejo Watanabe con hiperlipidemia
hereditaria (WHHL) se ha usado previamente para estudiar la eficacia
de las técnicas de terapia génica para corregir la
hipercolesterolemia. Una deleción en marco de 12 nucleótidos en el
dominio de unión a ligando del receptor de LDL, similar a una clase
de mutación encontrada en pacientes con HF, da como resultado
síntomas, evolución e histopatología paralelos a los de la HF.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADN de plásmidos usados en este trabajo son
pLDLR-17, PCK-hLDLR,
PCK-rLDLR y SV40-luciferasa.
pLDLR-17 se proporcionó por el Dr. David Russell
(Universidad de Texas, Medical Center, Dallas) y consiste en el
potenciador/promotor del citomegalovirus (CMV) unido al ADNc del
receptor de LDL humano. Contiene un fragmento de ADN que corresponde
a la región no traducida en 5' (UTR) del ARN del virus del mosaico
de la alfalfa 4 (VMA4) unido al ADNc del receptor de LDL humano.
Esta secuencia actúa como potenciador de la traducción disminuyendo
los requisitos de factores de iniciación en la síntesis de
proteínas. El plásmido PCK-hLDLR se ha construido
subclonando el ADNc del receptor de LDL del
pLDLR-17 en un vector pTZ18R (Pharmacia) que
contiene el promotor de la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK)
(-460 a +73) y un intrón y una señal de poliadenilación del antígeno
T pequeño del virus del simio 40 (SV40). En un procedimiento de dos
etapas, se escindió el ADNc del receptor de hLDL con SacI y SmaI
del pLDLR-17 y se formaron extremos romos usando ADN
polimerasa de T4. El fragmento con extremos romos se subclonó en el
sitio de HincII de un vector pTZ18R. Entonces se escindió el ADNc
con XbaI y SalI y se introdujo en los sitios homólogos del plásmido
pTZ18R-poliA de SV40-promotor de
PEPCK. Para la construcción de pPCR-rLDLR, se
subclonó el fragmento EcoRI-EcoRI de
prLDLR-9 (proporcionado por el Dr. James Wilson,
Universidad de Pensilvania) que contenía el ADNc del receptor de
LDL de conejo en el sitio de EcoRI de un pBluescript (Stratagene).
Se digirió esta construcción con SacI y se formaron extremos romos
y entonces se digirió con XbaI, y se subclonó direccionalmente en
los sitios de HindIII con extremos romos - XbaI de un vector pTZ18R
que contenía el promotor de PEPCK (-460 a +73) y un intrón y una
señal de poliadenilación del antígeno T pequeño del SV40. El
plásmido SV40-luciferasa (Promega) contiene el
potenciador y el promotor viral del SV40 ligado al gen de la
luciferasa de P. pyralis insertado en el vector pUC19
(Pharmacia).
\vskip1.000000\baselineskip
Producción de la
poli-L-Lisina galactosilada. Se
trató con galactosa la poli-L-lisina
tal como se describió (PNAS). Se hicieron reaccionar dos mg de
poli-L-lisina-HBr
(Sigma P-7890, longitud de cadena promedio, 100)
con 85 mg de fenil-isotiocianato de
a-D-galactopiranosilo (Sigma
G-3266). Se ajustó la disolución hasta pH 9
mediante la adición de un volumen 1/10 de carbonato de sodio 1 M, pH
9. Se protegió el tubo de la luz mediante una lámina de aluminio y
se mezcló durante 16 horas a temperatura ambiente, entonces se
dializó usando tubos de diálisis Spectra-Por (punto
de corte de 3500 de PM) frente a 500 ml de NaCl 5 mM durante 2 días
con cambios frecuentes de tampón (4 cambios/día). La reacción es
estequiométrica y dio como resultado la galactosilación del 0,8 al
1% de los grupos NH_{3} presentes en la disolución.
Protocolo básico para la condensación de
ADN. Se preparó el ADN de plásmido usando técnicas
convencionales. Se resuspendió el ADN en Tris-HCl
10 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 1 mM y se determinó la
concentración del ADN espectrofotométricamente. Se trató la
preparación de ADN dos veces con ARNasa A+T1. Esta etapa garantiza
que no está presente ARN en la disolución (el ARN inhibe la
condensación de ADN mediante la
poli-L-lisina). Se usó en etapas
adicionales una disolución que contenía una alta concentración de
ADN (1,5-2 mg/ml). Un ejemplo de un protocolo
típico para la condensación de ADN se describe tal como sigue:
- a)
- Se agitan con vórtex 300 mg de ADN en 200 ml de NaCl 0,75 M (añadidos a partir de una disolución de NaCl 5 M) a velocidad media, usando un aparato VIBRAX (IKA-VIBRAX-VXR). Esta etapa es necesaria para aumentar la longitud eficaz del polímero de ADN en disoluciones con alto contenido en sal, logrando de ese modo la unión eficaz del resto de poli-L-lisina a la estructura principal del ADN.
- b)
- Se añaden gota a gota 120 mg de poli-L-lisina o poli-L-lisina galactosilada (longitud de cadena promedio de 100) en 200 ml de NaCl 0,75 M (añadidos a partir de una disolución de NaCl 5 M) a lo largo de un periodo de 30 minutos a 1 hora en alícuotas de 5 \mul. Esta cantidad se traduce en una razón molar de 1 grupo PO_{4}^{-} de ADN con respecto a 1 grupo NH_{3}^{+} de portador.
- c)
- La disolución se vuelve turbia al final del proceso. Se añadieron gota a gota alícuotas de tres \mul de NaCl 5 M a la disolución con agitación con vórtex hasta que desapareció la turbidez tal como se monitorizó a simple vista. Este proceso es lento, permitiendo 60 segundos entre la adición de cada nueva alícuota de NaCl 5 M. Entonces se somete la disolución a monitorización espectroscópica de dicroísmo circular (DC). También se analizaron las disoluciones de complejos de ADN/poli-L-lisina usando un microscopio electrónico JEOL-100C. Se completa el proceso de condensación cuando se observa el espectro de diagnóstico del complejo de ADN y se establece además por ME. Para las preparaciones posteriores del complejo de ADN que consiste en el mismo ADN de plásmido a la misma concentración de nucleótido, puede seguirse el protocolo sin monitorizar con DC. Cuando se usa una concentración diferente de ADN o un plásmido diferente debe repetirse la monitorización con DC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron en estos estudios seis conejos
Watanabe macho adultos (de 2,8-3,2 Kg de peso
corporal). Estos animales se han adquirido de una colonia
establecida en los Institutos Nacionales de Salud. Con el fin de
introducir el complejo de ADN en el animal, se lleva a cabo una
única inyección de 3-10 ml de la disolución de
complejo de ADN (NaCl \sim400-900 mM) en la vena
marginal de la oreja del conejo. Se extrajeron aproximadamente 1,5
ml de sangre de la arteria de la oreja a las 4 p.m. Se llevó a cabo
la determinación de la concentración del colesterol sérico en el
Laboratorio Clínico de Hospitales Universitarios de Cleveland a
partir de 300 \mul de suero. A diferentes puntos de tiempo tras
la introducción del complejo de ADN, se sometió un conejo a una
biopsia del hígado. Se aisló el ADN total a partir de la muestra
hepática y se sometió a amplificación por PCR con el fin de
detectar la presencia del ADN transferido. Se trató el conejo nº 774
con lovastatina (Mevacor, Merck y Dohme) por vía oral a una dosis
de 10 mg por
día.
día.
Con el fin de detectar la presencia del ADN
transferido en el hígado del animal tratado, se aisló el ADN total
a partir de la muestra hepática obtenida tras la biopsia. En el caso
del conejo nº 737, se amplificó entonces el ADN de interés por PCR
usando un cebador en el sentido 5' correspondiente a las posiciones
32-50 en el exón 1 de la UTR en 5' del gen de PEPCK
y un cebador en el sentido 3' complementario a los nucleótidos
589-607 del ADNc del receptor de LDL humano. El
fragmento amplificado corresponde a una banda de 1100 pb tras la
hibridación con un fragmento de 700 pb correspondiente al extremo
en 5' del ADNc del receptor de LDL humano marcado con
32P-dCTP. Se usarán cebadores apropiados
correspondientes al gen del receptor de hLDL del CMV quimérico para
la amplificación por PCR del plásmido transferido a partir del
tejido del hígado obtenido del conejo nº 774.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron alícuotas de 75 \mul
correspondientes a 1 \mug de ADN de cualquier complejo de
ADN/poli-L-lisina galactosilada,
ADN de plásmido o poli-L-lisina
galactosilada recién preparados, durante la noche a 4ºC para
recubrir cada pocillo de una placa de microtitulación de 96
pocillos. Al día siguiente se lavaron los pocillos tres veces con
solución salina tamponada con fosfato (PBS), entonces se bloquearon
durante 2 horas a 37ºC con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en
PBS y se lavaron 3 veces con el tampón de lavado que contenía BSA
al 1% y Tween-20 al 0,5% en PBS. Se añadieron a los
pocillos setenta y cinco \mul de suero del conejo nº 774 obtenido
a diferentes puntos de tiempo antes y tras la administración
repetida del complejo de ADN a diluciones de 1:3 y 1:30 y se
incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Entonces se lavaron los
pocillos con tampón de lavado y se incubaron con el anticuerpo
secundario a dilución 1:3000. El anticuerpo secundario consiste en
un anticuerpo monoclonal de ratón frente a inmunoglobulinas de
conejo conjugadas con fosfatasa alcalina (Sigma). Tras un lavado
final con tampón de lavado, se añadió el sustrato pNPP a 1 mg/ml en
tampón de glicina a los pocillos para desarrollar la reacción y se
tomaron lecturas espectrofotométricas a 410 nm en un lector de ELISA
automatizado Dynatech. Se eligieron para la comparación los valores
tomados a 120 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer conjunto de experimentos, se
condensaron 3 mg y 9 mg de pPCK-hLDLR con
poli-L-lisina galactosilada usando
la técnica desarrollada en el laboratorio y se inyectaron en la
circulación periférica de conejos Watanabe.
El promotor del gen para la forma citosólica de
la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK) de la rata se ha
caracterizado en detalle. Este promotor se utilizó en estos
experimentos porque se expresa a un alto nivel en el hígado y su
expresión puede controlarse mediante la dieta y hormonas. La
inanición y una dieta libre de hidratos de carbono, con alto
contenido en proteínas estimulan la transcripción del gen de PEPCK
mientras que una dieta con alto contenido en hidratos de carbono
reduce la transcripción del promotor de PEPCK. Además, el AMPc y
los glucocorticoides inducen, y la insulina inhibe, la expresión del
gen de PEPCK en el hígado. El promotor de PEPCK es por tanto
adecuado para la regulación de un gen estructural unido introducido
en el hígado y se usó en los primeros experimentos para la
expresión hepática del receptor de LDL.
En el primer enfoque, se inyectó el complejo de
poli-L-lisina/ADN que contenía 3 mg
de ADN. Se decidió esta dosis básica de ADN basándose en
experimentos previos realizados en ratas. Tal como se muestra en la
figura 13, la administración de una disolución de complejo de ADN
que contenía 3 mg del plásmido pPCK-hLDLR en un
estado relajado al conejo nº 676 no dio como resultado una
disminución significativa de los niveles de colesterol sérico
total. Una segunda inyección de complejos de ADN condensados
apropiadamente que contenían 3 mg del mismo ADN produjo una
reducción del 20% de los niveles de colesterol en sangre. Cuatro
semanas tras esta segunda administración, el colesterol volvió a
aproximadamente
\hbox{los niveles antes del tratamiento, alcanzando un pico a aproximadamente los 35 días.}
Una disminución del 20% en los niveles de
colesterol sérico total resultantes de la expresión del gen del
receptor de PCK-hLDL será probablemente útil pero no
aliviará totalmente el trastorno en los pacientes con HF. El número
de complejos de poli-L-lisina/ADN
correspondientes a 3 mg de ADN que se han introducido en el animal
en la primera aproximación a estos experimentos representa el 0,01%
del número total de receptores de asialoglicoproteínas en el
hígado. En consecuencia, ha de esperarse una correlación lineal
entre la concentración creciente de complejos de ADN y la expresión
del gen del receptor de PCK-hLDL.
\vskip1.000000\baselineskip
En el segundo experimento, se administraron al
conejo nº 737 9 mg del gen del PCK-hLDLR condensado
apropiadamente con poli-L-lisina
galactosilada. Tal como se muestra en la figura 14, el tratamiento
dio como resultado una reducción del 38% de los niveles de
colesterol sérico total que duró aproximadamente 5 semanas. Por
tanto, un aumento de 3 veces de la dosis del complejo de ADN dio
como resultado una reducción de 2 veces de los niveles de
colesterol sérico total.
\vskip1.000000\baselineskip
El promotor para la forma citosólica del gen de
PEPCK tiene la ventaja de dirigir la expresión en el hígado casi
específicamente y de un modo regulado. Aunque ni son fisiológicos ni
están regulados, los promotores virales confieren altos niveles de
expresión a genes estructurales unidos. Se ha usado con éxito el
potenciador/promotor del CMV quimérico para terapia génica en
conejos WHHL usando adenovirus para la transferencia génica.
Recientemente, Kozarsky et al han notificado que el
potenciador/promotor del CMV y el promotor de
\beta-actina/CMV quimérico fueron los promotores
de elección con el fin de obtener la mayor expresión del gen del
receptor de LDL humano transferido a conejos WHHL usando infección
adenoviral. Basándose en estas observaciones, se inyectó el gen del
hLDLR del CMV quimérico con el fin de aumentar el nivel de expresión
del gen del receptor de LDL humano en el hígado de conejos
WHHL.
La administración de una disolución de complejo
de ADN que contiene 3 mg del gen del receptor de hLDL del CMV
quimérico al conejo nº 16 dio como resultado una reducción máxima
del 30% de los niveles de colesterol sérico total (figura 15). Once
semanas tras la inyección, los niveles de colesterol siguen siendo
un 20% inferiores a los observados antes del tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron tres mg del
pCMV-hLDLR contenido en una disolución de complejo
de ADN en el conejo nº 775, produciendo una reducción máxima del
24% de la concentración del colesterol en sangre 3 semanas tras el
tratamiento (figura 16A).
Se notifica que la vida de los hepatocitos es de
aproximadamente 108-150 días, de modo que la
persistencia del ADN introducido es limitada. Además, puede ser de
interés un efecto terapéutico más largo tras una única inyección
del complejo de ADN. Por tanto, puede ser necesario inyectar a un
paciente múltiples veces para garantizar el nivel apropiado de
receptor de LDL en el hígado. Se sometió a prueba el efecto de
inyectar el complejo de ADN varias veces en el mismo animal. Se ha
vuelto a inyectar al conejo nº 775 dos veces 3 mg del complejo de
ADN del pCMV-hLDLR, estando espaciadas cada
inyección por 3 semanas. La administración repetida del complejo no
dio como resultado una reducción significativa adicional de los
niveles de colesterol sérico total.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron al conejo nº 774 3 mg del complejo
pCMV-hLDLR. Se observó una disminución del 36% de
los niveles de colesterol en sangre (figura 16B). Hasta la fecha se
han llevado a cabo cuatro inyecciones de nuevo una vez cada 2
semanas con la misma cantidad de complejo de ADN. Dos de ellas han
dado como resultado un efecto mínimo mientras que las otras dos una
reducción nula de los niveles de colesterol sérico total. Sin
embargo, tras cinco administraciones de la disolución de complejo
de ADN que contiene 3 mg del pCMV-hLDLR, la
concentración de colesterol ha caído aproximadamente un 48% con
respecto a los niveles antes del tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se describió en la introducción, existe
una ruta para la síntesis de colesterol dentro de la célula. Si la
represión de esta ruta metabólica falla incluso cuando se suministra
al hepatocito colesterol a través de la captación mediante el
receptor de LDL humano, podría inhibirse posiblemente el
aclaramiento adicional de colesterol. La lovastatina es un
inhibidor conocido de la HMG CoA reductasa, la enzima limitante de
la velocidad en la síntesis de colesterol. Por tanto, el
tratamiento con este fármaco de un conejo al que se ha inyectado
repetidas veces el complejo de ADN debe indicar si la síntesis de
colesterol era el factor limitante para una reducción adicional de
los niveles de colesterol sérico total. El conejo nº 774 se ha
tratado con 10 mg de lovastatina por día durante 10 semanas. Se ha
observado una reducción del 20% adicional de los niveles de
colesterol. La inhibición de la ruta endógena para la síntesis de
colesterol ha llevado por tanto la concentración de colesterol del
conejo nº 774 hasta el 40% de la anterior a la primera transferencia
génica (Figura 16B).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de controlar una posible reducción
artefactual de los niveles de colesterol sérico total inyectando a
conejos los complejos de
ADN/poli-L-lisina galactosilada en
una disolución con alta concentración de NaCl (\sim900 mM), se ha
administrado una disolución de complejo de ADN que contiene un ADN
irrelevante tal como el gen de la luciferasa en el conejo nº 775.
La figura 17 muestra que la inyección da como resultado una
reducción no significativa (\leq12%) y transitoria (\leq5 días)
de la concentración de colesterol sérico. Además, también se
inyectaron complejos de ADN inapropiadamente condensado que
codifican para el gen del PCK-hLDLR. Dan como
resultado también una disminución nula o mínima y transitoria de los
niveles de colesterol en sangre. Por tanto, se ha confirmado que la
reducción de los niveles de colesterol sérico total tras la
inyección de partículas de ADN apropiadamente condensado que
codifican para el gen del receptor de LDL humano no es un resultado
ni de la alta concentración de NaCl de la disolución ni de la
presencia de partículas de
ADN/poli-L-lisina
galactosilada.
\vskip1.000000\baselineskip
El complejo de ADN usado en este proyecto se
dirige hacia el receptor de la asialoglicoproteína hepática usando
galactosa como ligando. Se sabe que los macrófagos tienen un
receptor similar que puede eliminar partículas galactosiladas
mayores de 15 nm del torrente sanguíneo.
Con el fin de probar que el ADN del receptor de
LDL humano se suministró a los hepatocitos, se realizó una biopsia
del hígado en el conejo nº 737, 60 días tras la inyección de 3 mg
del gen del receptor de PEPCK-hLDL. Se aisló el ADN
total y se sometió a amplificación por PCR con los cebadores
descritos anteriormente, junto con el ADN total del hígado de un
conejo al que no se ha inyectado. Se detectó la banda esperada de
1.100 pb en el carril correspondiente al conejo tratado pero no en
el animal sin tratar.
\vskip1.000000\baselineskip
En el campo de la terapia génica, la
inmunogenicidad del vehículo de suministro es a menudo un problema.
Mientras que los vectores retrovirales pueden escapar de la
detección por el sistema inmunitario, se ha notificado que los
vectores adenovirales no lo hacen. El éxito de una segunda
administración de partículas adenovirales para la transferencia en
conejos Watanabe del gen del receptor de LDL humano se bloqueó
mediante la aparición de una respuesta inmunitaria frente a las
proteínas virales (REF Kozarsky).
El sistema para la transferencia génica mediada
por el receptor no se ha estudiado en profundidad con respecto a su
inmunogenicidad. Se ha notificado que tras la administración
repetida de un complejo de
ADN/poli-L-lisina-asialoorosomucoide
en ratones, pueden detectarse anticuerpos neutralizantes frente a
los componentes asialoorosomucoide y
poli-L-lisina del complejo pero no
frente al ADN a una dilución 1:1000 (REF). Ferkol et al
también notificó la detección de anticuerpos circulantes a una
dilución 1:2000 frente al fragmento
Fab-poli-L-lisina
pero no frente al resto de ADN de un complejo tras la
administración repetida en ratones.
Por tanto, se necesitaba someter a prueba si el
uso de poli-L-lisina galactosilada
para la condensación de ADN también era inmunogénico. Para este
fin, se evaluó la presencia de anticuerpos frente al complejo de
ADN-poli-L-lisina
galactosilada en sueros obtenidos del conejo nº 774 a diferentes
puntos de tiempo antes y tras la administración repetida del
complejo. En un primer experimento, la disolución del complejo de
ADN que contenía 1 \mug de ADN se adsorbió a los pocillos de una
placa de microtitulación y luego se incubaron con sueros a
diluciones 1:3, 1:30 y 1:300. Se detectaron los anticuerpos unidos
con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado
con fosfatasa alcalina. Hay un aumento de anticuerpos en el suero
del conejo nº 774 tras la administración repetida del complejo de
ADN. De hecho, empiezan a ser detectables tras la tercera inyección
del complejo de ADN pero no tras la primera o la segunda. Además,
ha de enfatizarse que sólo a diluciones 1:3 y 1:30 pudo detectarse
una
respuesta.
respuesta.
Se llevó a cabo un segundo experimento con el
fin de establecer qué resto del complejo de ADN es responsable de
la inducción de la respuesta inmunitaria débil aunque clara.
Entonces se adsorbió a los pocillos de la placa de microtitulación
o bien 1 \mug de ADN, complejo de ADN recién preparado que
contenía 1 \mug de ADN o bien la cantidad correspondiente de
poli-L-lisina galactosilada. Los
resultados muestran que el resto de
poli-L-lisina galactosilada explica
casi por completo la inducción de una respuesta inmunitaria frente
al complejo en conejos
Watanabe.
Watanabe.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados en este documento sugieren
fuertemente que el método ha podido corregir al menos parcialmente
la hiperlipidemia en conejos WHHL.
Las figuras 13-16 muestras
claramente que una única inyección del complejo de ADN que contiene
el gen del receptor de LDL humano da como resultado una disminución
significativa de los niveles de colesterol sérico total en conejos
WHHL. Esta reducción oscila desde el 20% en el conejo nº 676 hasta
el 38% en el conejo nº 737. En cambio, se muestra que la
administración de un ADN de plásmido no relevante tal como
pSV40-luciferasa (figura 17) o de un plásmido que
codifica el receptor de LDL humano que no está apropiadamente
condensado (figura 17) da como resultado una disminución nula o no
significativa del colesterol sérico.
Se han usado dos regiones de promotor diferentes
para la regulación de la expresión del gen del receptor de LDL
humano. Esto sugiere provisionalmente que la región reguladora del
CMV confiere niveles superiores de expresión en el hígado de
conejos que el promotor para la forma citosólica del gen de PEPCK de
rata. Esta observación puede no ser correcta para cada especie. La
actividad PEPCK en el hígado de conejos se caracteriza por ser sólo
del 10% debida a la isozima citosólica. Además, la estimulación del
gen citosólico da como resultado sólo una inducción de 2 veces de
la actividad. Por tanto, el promotor de PEPCK puede no ser la mejor
elección para esta especie. Pero el uso de un promotor fisiológico
y estrictamente regulado como el de para el gen de PEPCK puede ser
el de elección con respecto a un promotor fuerte pero viral como el
CMV en otra especie o para el tratamiento de otras
enfermedades
genéticas.
genéticas.
Con el fin de determinar el transcurso de tiempo
del efecto terapéutico, se sometieron los conejos nº 676, nº 737 y
nº 16 a una única inyección del complejo de ADN que contenía el gen
del receptor de LDL humano. La reducción de los niveles de
colesterol en sangre persistía durante 4 semanas en el conejo nº 676
y durante 5 semanas en el conejo nº 737. Basándose en experimentos
previos realizados en ratas en las se mostró la expresión del gen
de pPEPCK-factor IX humano transfectado durante
hasta 140 días, se esperaba una duración más larga del efecto.
Diferentes factores pueden explicar esta terminación prematura del
efecto correctivo de la hiperlipidemia. Se sabe bien que los
conejos son altamente inmunogénicos y que las ratas no lo son. La
síntesis en los conejos WHHL de una proteína humana tras la
introducción del gen receptor de LDL humano pudo desencadenar
posiblemente una respuesta inmunitaria frente a la proteína
foránea, aunque existe un 80% de homología entre ambas especies al
nivel de proteína. Además, los hepatocitos parecen tener una vida
limitada. Algunos estudios en ratas indican que la vida de las
células hepáticas es de 108-150 días. Basándose en
esta observación, el 40% del aumento de los niveles de colesterol 5
semanas tras la introducción del complejo de ADN pudo resultar de la
renovación fisiológica de las células del hígado. Sin embargo, este
hecho no puede explicar el 100% del aumento. Además, sería
contradictorio con la expresión a largo plazo observada en ratas a
las que se inyectó pPEPCK-FIX humano. Otra posible
explicación para la terminación prematura de los efectos
terapéuticos resultantes de la expresión del gen del receptor de
LDL humano sería la inactivación o degradación del ADN
transferido.
El número teórico de complejos de
poli-L-lisina-ADN
que pueden formarse con 3 mg de ADN representa el 0,01% del número
total de receptores de asialoglicoproteína en el hígado. En
consecuencia, se esperaría que un aumento en la dosis del complejo
de ADN de como resultado un efecto terapéutico potenciado. Para
estudiar la relación dosis-respuesta, se han
inyectado al conejo nº 676 3 mg de pPCK-hLDLR y al
conejo nº 737 9 mg del mismo ADN. Tal como se muestra en las
figuras 13 y 14, un aumento de 3 veces de la dosis de complejo de
ADN da como resultado una reducción superior a 2 veces de los
niveles de colesterol. Aunque estos datos no establecen una
correlación lineal, un aumento de la dosis da como resultado
claramente una respuesta potenciada.
Si se considera el complejo de
poli-L-lisina/ADN como un posible
fármaco, es deseable que pueda administrarse de manera repetida al
mismo animal. Por este motivo, el conejo nº 774 se ha sometido a
administración repetida de 3 mg del ADN del hLDLR del CMV una vez
cada 2 semanas. Tras una disminución inicial del 36% de los niveles
de colesterol sérico tras la primera inyección, el efecto de la
administración repetida del complejo de ADN no ha sido constante.
El conejo nº 775 se ha tratado 3 veces con 3 mg del ADN del hLDLR
del CMV. De nuevo, tras una reducción inicial del 24% de los
niveles de colesterol, los tratamientos segundo y tercero no han
dado como resultado un efecto claro. Puede encontrarse tres posibles
explicaciones para estos resultados. En primer lugar, que los
complejos de ADN no estaban apropiadamente condensados. El ADN tras
la condensación con poli-L-lisina
puede dar como resultado tres estructuras diferentes: agregada
(partículas condensadas fuera de la disolución), estrictamente
condensada y relajada. Sólo el ADN estrictamente condensado en
pequeñas partículas es eficaz para suministrar genes in
vivo. En segundo lugar, que los conejos están produciendo
anticuerpos neutralizantes frente al vehículo. Existen algunos
datos preliminares con respecto a la respuesta inmunitaria del
conejo nº 774 frente al complejo de
poli-L-lisina-ADN.
En tercer lugar, el aclaramiento adicional del colesterol de la
sangre está limitado por una insuficiencia en el metabolismo
endógeno del colesterol en el hepatocito del conejo Watanabe
mutante. Con el fin de someter a prueba esta última hipótesis, se
trató el conejo nº 774 con lovastatina (10 mg/día), un inhibidor
conocido de la HMG CoA reductasa, durante 10 semanas. La
observación de una reducción adicional del 20% de la concentración
de colesterol sugiere que la inhibición de la síntesis de
colesterol en el hepatocito no es completa incluso cuando se
suministra colesterol a la célula tras la captación de LDL mediante
el receptor de LDL
heterólogo.
heterólogo.
Resultados preliminares con respecto a la
inmunogenicidad del complejo de
ADN/poli-L-lisina galactosilada
indican que la administración repetida desencadena la aparición de
una respuesta inmunitaria en el conejo Watanabe. También muestran
que los anticuerpos circulantes pueden reconocer a la
poli-L-lisina galactosilada pero no
al resto de ADN. Estos resultados concuerdan con informes anteriores
con respecto a la inmunogenicidad de un complejo de
ADN/poli-L-lisina-asialoorosomucoide
y de un complejo de
ADN/poli-L-lisina-Fab.
Aunque está claro que el complejo diseñado en el laboratorio puede
de hecho provocar una respuesta inmunitaria tras la administración
repetida en el mismo animal, ha de observarse que sólo pudo
detectarse anticuerpos circulantes a diluciones muy inferiores (1:3
y 1:30 en comparación con 1:1000 y 1:2000 en su caso). Esta
observación podría ser indicativa de su mejor capacidad de escapar
de la detección por el sistema inmunitario. No obstante, se
necesita someter a prueba el suero de más animales sometidos a la
administración repetida del complejo de ADN para determinar la
presencia de anticuerpos neutralizantes frente al complejo con el
fin de concluir que la inmunogenicidad es responsable de que las
inyecciones repetidas no puedan disminuir adicionalmente los
niveles de colesterol en los conejos
Watanabe.
Watanabe.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se utilizaron tres ratas por conjunto
experimental en los experimentos que implicaban inyección directa en
el tejido del complejo de ADN. Se inyectaron cien microgramos de
ADN desnudo que contenía el gen de la luciferasa de SV40 en el
hígado y músculo abdominal de uno de los animales. Se complejó la
misma cantidad del plásmido SV40-luciferasa con
poli-L-lisina y se condensó tal como
se describió anteriormente y se inyectó también en el hígado y
músculo abdominal de los otros dos animales. Se sacrificaron las
ratas 48 horas tras la inyección. Se obtuvo un trozo de hígado y
músculo abdominal para la medición de la actividad luciferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Evaluación de inyecciones directas del
complejo de ADN en el hígado y músculo de ratas. Se ha
notificado la transferencia satisfactoria de ADN desnudo en células
musculares de ratones mediante inyección directa. Se observaron
niveles de expresión altos y prolongados de un gen quimérico que
contenía la región reguladora del virus del sarcoma de Roux (VSR)
unida al ADNc de la luciferasa en los experimentos. Se han
investigado las ventajas de utilizar ADN acomplejado con
poli-L-lisina y condensado con
respecto a utilizar ADN libre, cuando el ADN ha de transferirse en
el hígado o el músculo mediante inyección directa. Se han usado tres
ratas para estos experimentos. Se inyectaron cien microgramos de
ADN desnudo que codifica la luciferasa del SV40 en el hígado y
músculo abdominal de uno de los animales. Se inyectó la misma
cantidad del plásmido pSV40-luciferasa acomplejado
con poli-L-lisina y condensado tal
como se describió anteriormente también en el hígado y músculo
abdominal de los otros dos animales. Se sacrificaron las ratas 48
horas tras la inyección. Se homogeneizó un trozo de hígado y
músculo abdominal en tampón de lisis y se analizaron los lisados
celulares para determinar la actividad luciferasa. Todas las
mediciones de la luciferasa se realizaron por triplicado, se
expresaron como un promedio de los valores y se normalizaron para
la proteína total. La figura 9 muestra las unidades de luciferasa
integradas por mg de proteína en los dos conjuntos diferentes de
animales. La eficacia de la transfección de ADN acomplejado con
poli-L-lisina y condensado parece
ser ligeramente mayor cuando se inyectó en el hígado. Sin embargo,
parece dar como resultado una eficacia mucho mayor cuando se
introdujo en el tejido muscular. Se observa una actividad
luciferasa 20 veces superior en la muestra del músculo inyectado con
el ADN condensado en comparación con el inyectado con el ADN
desnudo. Se cree que el ADN sumamente condensado y empaquetado
puede protegerse frente a nucleasas y puede ser más estable. Además,
las poli-L-lisinas pueden aumentar
la eficacia del transporte nuclear una vez dentro de la célula. En
primer lugar, el pequeño tamaño del complejo puede permitir su paso
a través de los poros nucleares y en segundo lugar, se sabe que
cadenas de aminoácidos cargados positivamente como lisina y
arginina son señales de localización nuclear (NLS) en diversas
proteínas nucleares. Con respecto a las diferencias encontradas
entre la respuesta en el hígado y en el músculo, lo más probable es
que la estructura interconectada característica de las células del
músculo esquelético las haga una mejor diana para la difusión
pasiva de ADN de célula a célula. Esto permitiría fácilmente la
distribución del complejo de ADN a lo largo del tejido muscular y su
transporte a los
núcleos.
núcleos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La inserción de ADN foráneo en neuronas adultas
tiene potencial para el estudio de fisiología neuronal normal y
para el tratamiento de enfermedades neurales. La transferencia
génica en neuronas se ha logrado usando vectores virales, sin
embargo requiere metodologías sofisticadas y normalmente las células
transfectadas no pueden limitarse a ningún tipo de neurona
particular.
El transporte retrógrado axonal es un proceso
fisiológico continuo que se ha encontrado que transporta una gran
variedad de diferentes tipos de moléculas. Se sabe que muchas
moléculas se incorporan en la luz del axón a través de la
endocitosis, ya sean partículas adsorbidas o en fase fluida. En la
situación en la que se han cortado los axones, se postula que las
partículas solubles del espacio extracelular pueden difundir en el
axón y desplazarse hacia el
soma.
soma.
En los presentes experimentos se sometió a
prueba si ADN de plásmido desnudo o condensado en un esferoide
compacto, aplicado al extremo cortado de los axones de células del
ganglio retinal en el nervio óptico o al tectum del cerebro se
transporta de nuevo al soma y se expresa para dar proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron tres plásmidos bajo el control de
uno de tres promotores que son eficaces en una amplia variedad de
tipos de células eucariotas: RSV-lacZ,
CMV-lacZ y SV40-luc. Se prepararon a
diferentes concentraciones que oscilan desde 1 hasta 20
\mug/\mul. José Carlos Perales complejó
pCMV-lacZ y pSV40-luc con
poli-L-lisina (1:1) (PNAS,
1994).
1994).
Se realizó la evaluación del transporte
retrógrado del complejo del plásmido hacia los somas de células del
ganglio retinal utilizando microscopía epifluorescente. Se usó
FITC-poli-L-lisina
para formar complejos con pCMV-lacz. Para evaluar
el transporte retrógrado del plásmido puro, se digirió
pRSV-lacZ en un sitio utilizando Hind III. Entonces
se unió biotina-dUTP a los extremos OH en 3' de
pRSV-lacZ mediante la reacción con desoxinucleotidil
transferasa terminal. Entonces se precipitó el plásmido y se lavó
con biotina-dtyrp libre y se resuspendió en
2 \mug/\mul.
2 \mug/\mul.
Se anestesiaron ratas Wistar adultas y se
expusieron sus nervios ópticos. Se aplicaron 1,5 \mul de la
disolución de plásmido (diferentes concentraciones y plásmidos)
cubriendo el nervio óptico. Entonces se cortaron los axones del
nervio óptico evitando el suministro de sangre retinal. Se aplicaron
otros 1,5 \mul de la misma disolución de plásmido en espuma de
gel empapada. Entonces se cerró la conjuntiva. Se realizó el mismo
procedimiento en el ojo contralateral usando plásmido no
específico. Se sacrificaron los animales tres días más tarde. Para
la inyección directa en la zona tectal, se anestesiaron los animales
y se les inyectó estereoscópicamente en la zona tectal del cerebro
ADN desnudo o ADN condensado.
- Para ensayos de
\beta-galactosidasa líquida, se mantuvieron las
retinas a -70ºC hasta que se formaron lisados celulares mediante
descongelación y congelación repetida. Se centrifugó el tejido a
12000 rpm durante 2 min. y se recogió el sobrenadante y se analizó
para determinar el contenido en proteínas. Se incubaron volúmenes
que contenían 360 \mug de proteína durante la noche a 37ºC en
tampón A que contenía 15 mg/ml de rojo clorofenol
B-D-galactopiranósido (CPRG). Se
registró la absorbancia.
- Para ensayos de luciferasa, estos se
realizaron en sobrenadantes de lisis de retinas a los que se añadió
tampón de ensayo de luciferasa. Se pusieron las muestras en un
luminómetro que se inyectó con D-luciferina y
entonces se registró la luminiscencia.
- Para ensayos con
\beta-galactosidasa in situ (para
pRSV-lacZ y pCMV-lacZ), se fijaron
las retinas en formaldehído al 2%, glutaraldehído al 0,5%, PBS
durante 30 min., se lavaron en PBS y se incubaron durante 6 h a
37ºC en X-Gal 1 mg/ml, ferrocianuro de potasio 4 mM,
ferricianuro de potasio 4 mM, MgCl_{2} 2 mM, PBS pH 7,3, Nonidet
p-40 al 0,02%, desoxicolato al 0,01%. Entonces se
enjuagó el tejido y se analizó inmediatamente. Se realizaron
recuentos de las células marcadas de azul para estimar el porcentaje
de células transfectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
1) La administración del ADN de plásmido al
extremo cortado de axones ópticos de rata da como resultado su
transporte retrógrado al cuerpo celular. El campo doblemente marcado
(microscopía confocal) de una retina 2 días tras la administración
de complejo
FITC-poli-lisina/pCMV-lacZ
al extremo cortado del nervio óptico y después incubado en yoduro
de propidio mostró que el FITC (verde), yoduro de propidio (rojo) y
la mezcla de ambos núcleos doblemente marcados (amarillo), contados
en campos aleatorizados representaban aproximadamente el 45% de la
población de células del ganglio retinal.
Los campos microscópicos tomados a diferentes
aumentos mostraron células coloreadas de azul en la capa de células
del ganglio retinal tras el ensayo de
\beta-galactosidasa in situ en la retina.
Se administraron 20 \mug/\mul de pRSV-lacZ al
nervio óptico cortado y se realizó una comparación con el ojo
contralateral tratado con pSV40-luc. Se observó que
las células positivas para la \beta-galactosidasa
estaban en el intervalo de tamaño conocido sólo para las células
del ganglio en la retina. Estas células se contaron en campos
aleatorizados y se estimó que representaban el 35% de las células
del ganglio totales.
2) El ADN de plásmido en células del ganglio
retinal se expresa de manera dependiente de la dosis y el ADN
condensado se expresa con eficacia superior.
La actividad luciferasa en retinas de ratas a
cuyos nervios ópticos cortados se les administró
pSV40-luc en concentraciones crecientes, en
comparación con retinas simplemente axotomizadas, o tratadas con el
plásmido no específico pCMV-lacZ (1 \mug/\mul),
mostró un aumento de la actividad de pSV40-luc
dependiente de la concentración.
Los resultados de actividad
\beta-galactosidasa en retinas de ratas a cuyos
nervios ópticos cortados se les administró pCMVlacZ, en comparación
con retinas simplemente axotomizadas, o tratadas con plásmido no
específico pSV40-luc (10 \mug/\mul), mostraron
que la actividad más alta se registraba a partir de la concentración
máxima de pCMV-lacZ. pCMV-lacZ
acomplejado con poli-lisina produjo actividad
superior en \beta-galactosidasa que el plásmido
no
específico.
específico.
3) Este método puede usarse en la transferencia
de genes específicos a tipos neuronales precisos a través de sus
proyecciones.
4) Inyecciones intratectales de ADN de plásmido
condensado con polilisina y desnudo pueden lograr altos niveles de
expresión en el cuerpo celular de la neurona durante 20 días. Cuando
el ADN no está condensado con polilisina, el nivel de expresión
vuelve al inicial tras 10 días después de la inyección (figura
10).
\vskip1.000000\baselineskip
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1. Si se determinó el dicroísmo circular (DC)
los resultados se indican tal como sigue: los cambios espectrales
debidos a la condensación con policatión de ADN son insignificantes
(+); la condensación con policatión dio como resultado ADN en forma
de Psi debido a la agregación en complejos multimoleculares (o bien
toroidales o bien similares a varillas) (Psi ADN); la aparición de
un espectro aberrante asociado con un estado sumamente agregativo
(-).
2. Los resultados de la microscopía electrónica
se han indicado tal como sigue: la asociación del policatión con el
ADN da como resultado la agregación en complejos con aumento de
tamaño (> 60 nm) (Agregado); las estructuras resultantes de las
condensación son toroides relajados similares a varillas con aumento
de tamaño (Relajado); la unión del policatión da como resultado la
condensación apropiada (toroides <30 nm de diámetro)
(Condensado). El número de estructuras apropiadamente condensadas
(toroides) por campo microscópico no se ha determinado. Existe
aproximadamente una variación de 3 veces en el número de toroides
visibles en el EL con diferentes preparaciones del complejo de
ADN.
3. Las mediciones de turbidez se basan en la
inspección visual de la disolución final del complejo de ADN.
\ding{61} Una indicación relativa de la
actividad del gen introducido tras la introducción del complejo de
ADN:
El hFIX (factor IX humano) se mide mediante la
hibridación por inmunotransferencia de tipo Western o mediante un
ensayo de actividad funcional de muestras de plasma de rata.
La actividad \betaGal
(\beta-galactosidasa) se mide mediante
histoquímica in situ en secciones de tejidos o células
fijadas.
La actividad luc (luciferasa) se mide usando un
ensayo de actividad enzimática específica con extractos de
tejido.
La actividad de hLDLR (receptor de LDL humano)
se midió indirectamente tras la determinación de los niveles de
colesterol en suero total en un modelo de conejo para determinar la
carencia del receptor LDL.
La actividad de hGH (hormona del crecimiento
humana) se refiere a una medición directa de niveles de hGH en el
suero de animales transfectados con el complejo de ADN. Se usó un
radioinmunoanálisis específico para hGH.
La actividad concierte a todo el experimento
realizado con el mismo ADN. La actividad no detectable tras la
introducción del complejo de ADN se indica por "-".
a, diámetro medido de al menos 10
complejos de ADN en una fotografía impresa
(x240.000).
b, diámetro calculado de un complejo de ADN
unimolecular que adopta una esfera condensada. Se consideró que el
volumen específico parcial del Na-ADN era de 0,5
ml/g. Se ha añadido la contribución de la
poli-L-lisina galactosilada a una
razón de carga de 1:1. El peso molecular del ADN se calculó
basándose en un peso molecular promedio de 6.500 dalton/10 pb. La
fórmula usada es:
- peso molecular de ADN (daltons)/6,023 x 10^{23} x 0,5 (ml/g) = ml ocupado por una molécula de ADN de peso molecular X. Diámetro obtenido a partir de la fórmula para el volumen de una esfera.
c, diámetro calculado de un complejo de ADN
unimolecular que adopta una esfera condensada. El cálculo adoptó
una densidad hidrata de 1,25 \pm 0,1 g/ml tal como se determinó
por difracción de rayos X. Se ha añadido la contribución de una
poli-L-lisina galactosilada a una
razón de carga 1:1. El peso molecular de ADN se calculó basándose
en un peso molecular promedio de 6.500 dalton/10 pb. La fórmula
es:
- peso molecular ADN (dalton)/6,023 x 10^{23}/1,25 (g/ml) = ml ocupado por una molécula de ADN de peso molecular X. Diámetro obtenido a partir de la fórmula para el volumen de una esfera.
d, a partir de la bibliografía.
e, el tamaño de la procápside del fago incluye
la cubierta externa de proteína.
Claims (32)
1. Composición que comprende complejos de ácido
nucleico no agregados, consistiendo cada complejo esencialmente en
una única molécula de ácido nucleico y una o más moléculas
portadoras, comprendiendo dicha única molécula de ácido nucleico un
gen sintético expresable o un ADNc, y teniendo dicha molécula
portadora un resto de unión a ácido nucleico a través del cual se
acompleja con el ácido nucleico, en la que dicho complejo está
compactado hasta un diámetro que es inferior a 30 nm.
2. Composición según la reivindicación 1, que
comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en
la que el complejo de ácido nucleico está compactado hasta un
diámetro inferior a 23 nm.
4. Composición según la reivindicación 3, en la
que el complejo de ácido nucleico está compactado hasta un diámetro
no superior a 12 nm.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en la que el resto de unión a
ácido nucleico es un anticuerpo o un fragmento de unión específico
de un anticuerpo.
6. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en la que el resto de unión a
ácido nucleico es un policatión.
7. Composición según la reivindicación 6, en la
que el policatión es polilisina.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en la que el ácido nucleico es
ADN.
9. Composición según la reivindicación 8, en la
que la molécula de ácido nucleico es ADNc.
10. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en la que el ácido nucleico es
ARN.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, en la que el ácido nucleico
tiene de 100 a 100.000 bases, si es monocatenario, o de 100 a
100.000 pares de bases, si es bicatenario.
12. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en la que el ácido nucleico
es bicatenario.
13. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en la que el ácido nucleico
es un análogo de ADN o ARN que es más resistente a la degradación
in vivo.
14. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en la que el ácido nucleico
es un análogo de ADN o ARN que difunde más fácilmente a través de
membranas celulares.
15. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en la que el ácido nucleico
es un análogo de ADN en el que aparece el análogo de metilfosfonato
del mononucleótido que se produce de manera natural.
16. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, en la que el ácido nucleico
comprende un gen expresable que es funcional en una célula
diana.
17. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, en la que la molécula de
ácido nucleico codifica una proteína seleccionada del grupo que
consiste en enzimas que en forma mutada están asociadas a defectos
metabólicos específicos, receptores, toxinas, canales iónicos,
transportadores de membrana y proteínas citoesqueléticas.
18. Composición según la reivindicación 17, en
la que la molécula de ácido nucleico codifica el receptor de LDL
humano.
19. Composición según la reivindicación 18, en
la que la molécula de ácido nucleico codifica el factor IX
humano.
20. Composición según la reivindicación 17, en
la que la molécula de ácido nucleico codifica un canal de
cloruro.
21. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, en la que la molécula de
ácido nucleico es "antisentido" con respecto a una secuencia
de ácido nucleico diana de la célula diana, o de un virus que puede
infectar la célula diana, mediante lo cual puede hibridarse
suficientemente a la misma para inhibir la transcripción o la
traducción de la secuencia de ácido nucleico diana.
22. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-21, en la que dicha molécula
portadora tiene un resto de unión a célula diana a través del que
puede unirse a una célula diana y mediante lo cual el complejo puede
entrar más rápidamente en la célula diana.
23. Composición según 22, en la que el resto de
unión a célula diana es un anticuerpo o un fragmento de unión
específico de un anticuerpo.
24. Composición según la reivindicación 23, en
la que el anticuerpo se une específicamente a pIgR.
25. Composición según la reivindicación 23, en
la que el anticuerpo se une específicamente a CD4 o gp120.
26. Composición según la reivindicación 22, en
la que el resto de unión a célula diana es una lectina o un hidrato
de carbono.
27. Composición según la reivindicación 26, en
la que el resto de unión a célula diana es un hidrato de carbono
seleccionado del grupo que consiste en galactosa, lactosa, manosa y
manosa-6-fosfato.
28. Composición según la reivindicación 22, en
la que el resto de unión a célula diana es un péptido o una
proteína.
29. Composición según la reivindicación 28, en
la que el resto de unión a célula diana se selecciona del grupo que
consiste en insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de
necrosis tumoral, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona
foliculoestimulante, hormona luteinizante, glucagón, lactoferrina,
transferrina, apolipoproteína E, gp120 y albúmina.
30. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 22-29, en la que el resto de unión
a ácido nucleico está unido covalentemente al resto de unión a
célula diana.
31. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-30, en la que el ácido nucleico
está encapsulado en un liposoma.
32. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-31, para su uso como
medicamento.
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