CN109337928B

CN109337928B - 通过过表达腺相关病毒受体提高基因治疗效率的方法

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Publication number: CN109337928B
Application number: CN201810005506.XA
Authority: CN
Inventors: 李大力; 尹树明; 邵婷婷; 王立人; 马列; 张晓辉; 刘明耀
Original assignee: Shanghai Bangyao Biological Technology Co ltd; East China Normal University
Current assignee: Shanghai Bangyao Biological Technology Co ltd; East China Normal University
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2038-01-03
Also published as: CN109337928A

Abstract

本发明提供了一种通过过表达腺相关病毒受体提高基因治疗效率的方法，具体地，本发明提供了一种感染增强元件，所述元件具有如下结构：Z1‑Z2‑Z3‑Z4(I)，其中，Z1为任选的信号肽元件；Z2为PKD‑1结构域、PKD‑2结构域、或PKD‑1‑PKD‑2结构域；Z3为无或PKD‑3结构域；Z4为跨膜元件；“‑”表示连接上述各元件的肽键；附加条件是，当Z3为PKD‑3元件时，Z4不是AAVR的跨膜元件。本发明的感染增强元件可显著提高AAV病毒载体系统的感染效率，同时也提高了基因编辑效率，并可显著降低苯丙酮尿症患病小鼠血苯丙氨酸含量，从而治疗苯丙酮尿症。

Description

通过过表达腺相关病毒受体提高基因治疗效率的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及通过过表达腺相关病毒受体提高基因治疗效率的方法。

背景技术

随着对于疾病发病机理认识的加深和基因组学研究的深入，目前已证实3276个单基因的失调与疾病有关。对于基因失调类疾病，尤其是对于遗传性疾病，现有治疗手段或者不能从根本上(即DNA层面)进行治疗，或者治疗效率低下，因此治疗不仅耗时耗力且效果难以令人满意，给患者和临床治疗带来障碍。

基因治疗作为一种从根本治疗遗传性疾病的方法，自上世纪七十年代被提出后，一直被认为是遗传性疾病的有效治疗手段。传统的基因治疗分为两种：基因替代性疗法和RNA干扰技术。

基因替代性疗法针对功能缺失性基因突变而导致的疾病，基因替代性疗法通过将外源基因表达系统导入病人体内，替代病人体内原有功能丧失或降低的基因行使生理功能。该方法是最早以及最广泛的基因治疗手段。目前该方法已被成功进行血友病的临床治疗实验。基因替代性疗法依赖外源基因表达系统进行治疗，因此治疗效果往往不具有持续性，目前使用的腺相关表达载体虽然能够长期存在于不分裂的细胞中，但是机体内不断的细胞更新以及体内的免疫机制的清除作用，会持续降低基因替代疗法的治疗效果。此外，基因替代疗法利用外源蛋白表达系统，治疗过程中随机整合的发生会带来致癌的风险。

另一类基因治疗方法是RNA干扰策略，该策略可较好地治疗由于功能获得性突变引发的疾病。然而，由于RNA干扰技术存在的低效和脱靶现象。

无论是传统基因治疗策略还是依赖于核酸酶技术的基因治疗，都需要高效安全的载体运输体系。目前可应用于基因治疗的载体系统可分为非病毒载体系统和病毒载体系统两类。

非病毒载体系统主要由裸DNA载体系统、脂质体和纳米材料传输体系等。非病毒载体系统优势在于：注射的载体不会引起机体的免疫反应和炎症的发生，但其缺点在于作为基因治疗载体系统传输效率较低，无法用于治疗需要较高修复率才能修复的遗传性疾病。

常用的病毒载体系统可分为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体系统。这一类载体系统优势在于感染效率高，可取的较好的治疗效果，但是由于这一载体系统是利用病毒作为运输工具，注射这一类载体系统之后，会引起肝脏的炎症和机体免疫反应的发生。

目前基因治疗基础和临床研究应用最广泛的是AAV载体系统。AAV载体系统免疫原性低因而安全性较高。AAV既可以感染分裂的细胞也可以感染不分裂的细胞并且可以长期存在于不分裂的细胞中，AAV随机整合概率极低，可以定点整合在AAVS1安全位点。虽然AAV治疗系统的免疫原性较低安全性较高，但为了提高治疗效果往往需要注射较高的病毒滴度，会造成一定水平的肝脏炎症和免疫反应发生，这些问题都会成为通过AAV载体进行的基因治疗的隐患。

从AAV被应用于基因治疗开始，就有通过对AAV感染机制研究。在早期的研究中，发现AAV病毒感染细胞时，需要先结合在初级受体(包括多聚糖和蛋白聚糖例如硫酸乙酰肝素)。早期研究中，分别有通过硫酸肝素促进细胞对AAV2的识别和通过唾液酸化糖蛋白促进AAV9的感染效率，但由于初级受体是多数病毒进入细胞的途径，因此这类基于初级受体的方法并不具有特异性。此外，在寻找AAV次级受体的研究中，发现利用FGFR1受体提高AAV2的感染，以及利用肝脏生长受体(c-MET)提高AAV2和AAV3的感染，然而AAV2和AAV3因其亲嗜性等原因在临床没有更多的基因治疗的应用前景。

综上所述，本领域尚缺乏令人满意的高效感染的AAV病毒载体系统，以满足临床上的基因治疗的严格要求。

因此，本领域迫切需要开发一种高效感染的AAV病毒载体系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效感染的AAV病毒载体系统，及其制法和应用。

本发明第一方面提供了一种感染增强元件，所述元件具有如下结构：

Z1-Z2-Z3-Z4(I)

其中，Z1为任选的信号肽元件；

Z2为PKD-1结构域、PKD-2结构域、或PKD-1-PKD-2结构域；

Z3为无或PKD-3结构域；

Z4为跨膜元件；

“-”表示连接上述各元件的肽键；

附加条件是，当Z3为PKD-3元件时，Z4不是AAVR的跨膜元件。

在另一优选例中，所述Z4为LDL的跨膜元件。

在另一优选例中，所述Z4选自下组：LDL的跨膜元件和AAVR的跨膜元件。

在另一优选例中，所述信号肽元件包括AAVR蛋白的信号肽元件。

本发明第二方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有从5'-3'的式II结构：

X1-X0-P1-X2-X3-X4 (II)

其中，X1为ITR元件；

X0为任选的增强子；

P1为第一启动子；

X2为权利要求1所述的感染增强元件的编码序列；

X3为polyA元件；

X4为ITR元件；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述第一启动子选自下组：PGK启动子、LP1启动子、或其组合。

在另一优选例中，所述第一启动子为组成型启动子或诱导型启动子。

在另一优选例中，PolyA元件选自下组：bGHPA、SV40PA、或其组合。

本发明第三方面提供了一种载体产品，所述载体产品包括第一载体，所述第一载体含有本发明第二方面所述的核酸构建物；

任选的第二载体，所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒，所述表达Cas9核酸酶的表达盒具有5'-3'的式III结构：

Y1-Y0-P2-Y2-Y3-Y4 (III)

其中，Y1为ITR元件；

Y0为任选的增强子；

P1为第二启动子序列；

Y2为编码Cas9核酸酶的编码序列；

Y3为polyA元件；

Y4为ITR元件；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；和

任选的第三载体；所述第三载体含有表达sgRNA的第三表达盒；

任选的第四载体，所述第四载体含有表达供体DNA的表达盒；所述表达供体DNA的表达盒具有5'-3'的式IV结构：

Z1-Z2-Z3 (IV)

其中，Z1为ITR元件；

Z2为供体DNA元件；

Z3为ITR元件；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，各核苷酸连接序列各自独立地为1-60nt。

在另一优选例中，各核苷酸连接序列不影响各元件的正常转录和翻译。

在另一优选例中，所述第一载体、第二载体、第三载体、第四载体中的任何两个或三个为同一载体。

在另一优选例中，所述第二载体含有表达sgRNA的表达盒。

在另一优选例中，所述PolyA元件选自下组：bGHPA、SV40PA、或其组合

在另一优选例中，所述第二启动子选自下组：PGK、LP1、或其组合。

在另一优选例中，所述sgRNA和供体DNA靶向同一位点或靶点。

在另一优选例中，所述Cas9核酸酶选自下组：Cas9、Cas9n、或其组合。

在另一优选例中，所述Cas9核酸酶的来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、或其组合。

在另一优选例中，所述载体选自下组：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述构建物整合到载体的多克隆位点。

在另一优选例中，所述载体是环状的。

在另一优选例中，所述载体为病毒载体。

在另一优选例中，所述病毒载体包括腺相关病毒载体(AAV病毒载体)。

在另一优选例中，所述的载体还包含一筛选标记表达盒。

在另一优选例中，所述供体DNA上带有筛选标记。

本发明第四方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞被本发明第三方面所述的载体产品所转化或转染。

在另一优选例中，所述基因工程细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述原核细胞包括大肠杆菌。

在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)、人细胞、或其组合。

本发明第五方面提供了一种感染细胞的方法，包括步骤：

(i)提供一细胞；

(ii)将第一载体转染所述细胞，获得经第一载体感染的细胞；经过T1时间后，用腺相关病毒载体感染所述经第一载体感染的细胞；

其中，所述第一载体含有本发明第二方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述的腺相关病毒载体选自下组：第二载体、第三载体、第四载体、或其组合，其中所述的第二载体、第三载体和第四载体如上定义。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，用所述的腺相关病毒载体和所述第一载体同时或先后感染细胞。

在另一优选例中，所述细胞包括哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞包括胚肾细胞系。

在另一优选例中，所述细胞包括HEK293T。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的T1为0-72h，较佳地，0.5-24h，更佳地，1-12h。

本发明第六方面提供了一种组合物，包括：

(i)第一药物组合物，所述药物组合物包括(a)第一载体；和药学上可接受的载体；

(ii)第二药物组合物，所述药物组合物包括(b)第二载体；和药学上可接受的载体；

(iii)任选的第三药物组合物，所述药物组合物包括(c)第三载体；和药学上可接受的载体；和

(iv)任选的第四药物组合物，所述药物组合物包括(d)第四载体；和药学上可接受的载体；

其中，所述第一载体含有本发明第二方面所述的核酸构建物；所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒；所述第三载体含有表达sgRNA的表达盒；所述第四载体含有表达供体DNA的表达盒。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物、第二药物组合物和任选的第三药物组合物、任选的第四药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。

在另一优选例中，所述第一药物组合物、所述第二药物组合物和任选的第三药物组合物、任选的第四药物组合物可先后施用。

在另一优选例中，所述组分(i)与组分(ii)的摩尔比1-1000：1-1000，较佳地1-100：1-100，更佳地1-10：1-10。

在另一优选例中，所述组分(i)与组分(iii)的摩尔比1-1000：1-1000，较佳地1-100：1-100，更佳地1-10：1-10。。

在另一优选例中，所述组分(i)与组分(iv)的摩尔比1-1000：1-1000，较佳地1-100：1-100，更佳地1-10：1-10。

在另一优选例中，所述组合物中，所述第一载体的含量为0.001％-99％，较佳地，0.1％-90％，更佳地，1％-70％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述第二载体的含量为0.001％-99％，较佳地，0.1％-90％，更佳地，1％-70％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述第三载体的含量为0.001％-99％，较佳地，0.1％-90％，更佳地，1％-70％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(i)和组分(ii)占所述组合物总重的0.001-99wt％，较佳地0.1％-90％，更佳地，1％-70％。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、和口服剂型。

在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。

在另一优选例中，所述组合物还包括其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物。

在另一优选例中，其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物选自下组：BH4、LNAA、或其组合。

本发明第七方面提供了一种药盒，包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的第一载体，或含有第一载体的药物；和

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的第二载体，或含有第二载体的药物；

(c1)任选的第三容器，以及位于所述第三容器中的第三载体，或含有第三载体的药物；和

(d1)任选的第四容器，以及位于所述第四容器中的第四载体，或含有第四载体的药物；

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器和任选的第三容器、任选的第四容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含第一载体的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含第二载体的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第三容器的药物是含第三载体的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第四容器的药物是含第四载体的单方制剂。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

在另一优选例中，所述说明书记载了选自下组的一个或多个说明：

(a)将第一载体、第二载体、和任选的第三载体、任选的第四载体同时或先后使用可降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的方法；

(b)将第一载体、第二载体、和任选的第三载体、任选的第四载体同时或先后使用可治疗苯丙酮尿症的方法；

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述药盒还包括(e1)第五容器，以及位于所述第五容器中的其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物，或含有其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物。

本发明第八方面提供了一种本发明第六方面所述的组合物的用途，用于制备药物或制剂，所述药物或制剂用于(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量。

在另一优选例中，所述药物或制剂还包括其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物。

在另一优选例中，所述其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物选自下组：BH4、LNAA、或其组合。

本发明第九方面提供了一种提高腺相关病毒对细胞的感染效率的方法，包括步骤：

(a)用本发明第二方面所述的核酸构建物或含所述构建物的第一载体，转染一细胞，获得经第一载体感染的细胞，其中所述的细胞是待用腺相关病毒感染的细胞；和

(b)用腺相关病毒载体感染所述的细胞。

在另一优选例中，所述方法为体外方法。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

在另一优选例中，所述的腺相关病毒载体为基因治疗载体。

在另一优选例中，所述的方法是体内方法。

在另一优选例中，所述方法是施用于待治疗的个体(包括人或非人哺乳动物)。

本发明第十方面提供了一种降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的方法，包括步骤：

给需要的对象施用第一载体、第二载体和任选的第三载体、任选的第四载体，或本发明第六方面所述的组合物或本发明第七方面所述的药盒，其中，所述第一载体含有本发明第二方面所述的核酸构建物；所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒；所述第三载体含有表达sgRNA的表达盒；所述第四载体含有表达供体DNA的表达盒。

在另一优选例中，所述对象包括患有苯丙酮尿症的人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

在另一优选例中，所述各载体的施用剂量各自独立地为1-10⁶拷贝/kg体重。

在另一优选例中，所述各载体的施用频率为1-2次/天，较佳地为1天/次。

在另一优选例中，所述第一载体、第二载体和任选的第三载体、任选的第四载体同时或先后施用。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

本发明第十一方面提供了一种治疗苯丙酮尿症的方法，包括步骤：

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的不同结构的腺相关病毒受体基因示意图。图中，各元件或符号的含义如下：PKD-1：PKD结构域1；2或PKD-2：PKD结构域2；3或PKD-3：PKD结构域3；4或PKD-4：PKD结构域4；5或PKD-5：PKD结构域5；SP：信号肽；TM：跨膜结构域；LDL：低密度脂蛋白受体的跨膜结构域。

图2显示了腺相关病毒受体基因的腺相关病毒表达载体图谱。

图3显示了通过体外过表达改造后的腺相关病毒受体基因，可提高GFP腺相关病毒的感染。

图4显示了在不同结构的经改造后的腺相关病毒受体构建物的情况下，腺相关病毒对HEK293T细胞的感染比例。

图5显示了表达GFP的腺相关病毒载体图谱。

图6显示了通过体内过表达腺相关病毒受体基因，可提高GFP腺相关病毒对肝脏(或肝细胞)的感染。

图7显示了通过敲入Pah基因的cDNA治疗苯丙酮尿症小鼠模型治疗策略示意图。

图8显示了表达saCas9及sgRNA的腺相关病毒载体的图谱。

图9显示了提供同源重组模板的腺相关病毒载体的图谱。

图10显示了通过腺相关病毒进行基因治疗的基因编辑比例。

图11显示了实验小鼠血苯丙氨酸含量变化情况。

图12显示了实验小鼠血苯丙氨酸含量相对于初始含量的变化倍数。

图13显示了通过腺相关病毒进行基因治疗同源重组的比例。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种新的感染增强元件，该元件为特定的AAV受体元件，由信号肽元件；PKD-1结构域、PKD-2结构域、或PKD-1-PKD-2结构域或PKD-1-PKD-2-PKD-3结构域；以及跨膜元件(如AAVR的跨膜元件或LDL的跨膜元件)组成。本发明的感染增强元件可显著提高AAV病毒载体系统的感染效率，并可显著降低血苯丙氨酸含量，从而治疗苯丙酮尿症。

此外，本发明还意外的发现减少病毒量居然可以显著提高AAV病毒载体系统的感染。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，“GFP腺相关病毒”指携带有GFP表达盒的腺相关病毒(AAV)。

术语“CRISPR/Cas系统”，其包括短的高度保守的重复序列(CRISPR位点)和位于该位点附近的双链DNA核酸酶(Cas蛋白)，该核酸酶能在向导RNA(guidance RNA，即gRNA)引导下对靶位点进行切割。在本发明中，所述CRISPR位点包括突变位点附近的N₂₀NNGRRT，或者在反义链上突变位点附近的YRRCNNN₂₀。而所述gRNA则是CRISPR位点中的18个重复的N位点(即PAM序列)。

术语“苯丙酮尿症”，常染色体隐性遗传病，该遗传病是由于编码参与苯丙氨酸代谢过程的酶的基因的突变而导致苯丙氨酸代谢异常，体内苯丙氨酸积累，脑部发育阶段血液内高苯丙氨酸含量会导致患儿智力发育障碍。

术语“兼并突变”，DNA序列(密码子)发生变化后所编码的蛋白氨基酸序列不变，又称同义突变。其原因是因为存在多个DNA密码子同时编码同一个氨基酸的现象。兼并突变改变了修复序列上的一些DNA序列使之与野生型不同(一般是靶点所对应的序列)，但是编码的蛋白是相同的，这样导入的Cas9，不会切割已经修复的序列。由于兼并序列比较随机，同一个氨基酸可以有多个DNA密码子组合所以无法给出确定的DNA组合。

术语“基因损伤”，指双链DNA序列发生双链断裂，或其中任意一条单链发生断裂的现象。

术语“同源重组供体序列”，指带有与血友病突变位点上下游DNA序列高度同源的DNA序列，其可将造成血友病的突变改变为编码野生型FIX蛋白对应氨基酸的DNA序列。同源重组发生后同源重组供体序列能够替换原突变位点以及其上下游的序列，所以可以用于修复突变序列。

AAVR

术语“AAV受体”或“AAVR”可互换使用，指KIA0319L基因(人源)及AU040320(鼠源)，该基因为编码对应的跨膜蛋白，已被证明该基因在多种血清型的腺相关病毒的感染过程中发挥重要作用。AAVR的胞外端主要由5个免疫球蛋白样(immunoglobulin-like，Ig-like)结构域构成，也称为多囊性肾病(polycystic kidney disease，PKD)结构域。

以小鼠AAVR为例，其氨基酸序列的登录号为NP_598647.1 dyslexia-associatedprotein KIAA0319-like protein isoform 2[Mus musculus]

MEKRLGVKPSPASWVLPGYCWQTSVKLPRSLYLLYSFFCFSVLWLSTDADESRCQQGKTLYGAGLRTEGE

NHLRLLAGSLPFHACRAACCRDSACHALWWLEGMCFQADCSKPQSCQPFRTDSSNSMLIIFQKSQTTDDL

GLLPEDDEPHLLRLGWGRTSWRRQSLLGAPLTLSVPSSHHQSLLRDRQKRDLSVVPTHGAMQHSKVNHSE

EAGALSPTSAEVRKTITVAGSFTSNHTTQTPEWPKNVSIHPEPSEHSSPVSGTPQVKSTEHSPTDAPLPV

APSYSYATPTPQASSQSTSAPHPVVKELVVSAGKSVQITLPKNEVQLNAFVLPEAEPGETYTYDWQLITH

PTDYSGEVERKHSQSLQLSKLTPGLYEFKVTVDGQNAHGEGYVNVTVKPEPRKNRPPVAVVSPQFQEISL

PTTSTIIDGSQSTDDDKIVQYHWEELKGPLREEKISEDTAILKLSKLVPGNYTFSLTVVDSDGATNSTTA

SLTVNKAVDYPPVANAGPNQVITLPQNSITLFGNQSTDDHGITSYEWSLSPSSKGKVVEMQGVRTPALQL

SAMQEGDYTYQLTVTDTAGQQATAQVTVIVQPENNKPPQADAGPDKELTLPVDSTTLDGSKSTDDQRVVS

YLWEQSRGPDGVQLENANSSVATVTGLQVGTYVFTLTVKDERNLQSQSSVNVIVKEEINKPPVAKIAGNV

VVTLPTSTAELDGSRSSDDKGIVSYLWTRDETSPAAGEVLNHSDHHPVLFLSNLVEGTYTFHLKVTDAKG

ESDTDRTTVEVKPDPRKSNLVEIILDVNVSQLTERLKGMLIRQIGVLLGVLDSDIIVQKIQPYTEQSTKM

LFFVQNDPPHQLFKGHEVAAMLKSELQKQKADFLIFRALEISTVTCQLNCSDHGHCDSFTKRCVCDPFWM

ENFIKVQLRDGDSNCEWSVLYVIIASFVIVVALGILSWTTICCCKRQKGKPKRKSRYKILDATDQESLEL

KPTSRAGSKQKGPTLSSSLMHSESELDSDDAIFTWPDREKGKLLYGQNGSVPNGQTPLKSRSAREEIL

(SEQ ID NO.：1)

以小鼠AAVR为例，其各结构域的信息如下：

表1AAVR结构域

应理解，在本发明中，术语“AAVR”还包括其他物种的AAVR，尤其是人和非人哺乳动物的AAVR。代表性的例子包括(但并不限于)：灵长动物(例如，人、猴、猿)、牛、猪、羊、啮齿动物(如大鼠)的AAVR。这些不同物种的AAVR的序列可获自已发表的文章或公共数据库，其中包括(但并不限于)：Genbank、NCBI Gene、DDBJ和EMBL。人的AAVR也称为KIA0319L。

与小鼠AAVR的结构域类似，其他物种的AAVR也具有相应的结构域，即信号肽(SP)、结构域1、结构域2、结构域3、结构域4、结构域5和跨膜结构域。这可以通过序列比对或结构域分析而得出。应理解，在本发明中，也可使用来自其他物种(包括人和非人哺乳动物)的AAVR的结构域。

此外，除了采用野生型的AAVR的相应结构域，也可以采用突变型的AAVR的相应结构域(包括天然形成的突变型和人工产生的突变型)。

感染增强元件

本发明提供了一种感染增强元件，它是一种经改造的特定的AAV受体元件，包括(a)任选的信号肽元件；(b)PKD-1结构域、PKD-2结构域、PKD-1-PKD-2结构域或PKD-1-PKD-2-PKD-3结构域；以及(c)跨膜元件(如AAVR的跨膜元件或LDL的跨膜元件)组成。

本发明还提供了编码所述感染增强元件的编码序列(如DNA、RNA序列)。

如本文所用，术语“本发明的感染增强元件”、“本发明的增强AAV感染的增强元件”等可互换使用，指本发明所述的感染增强元件。出乎意料的的是，一方面，虽然本发明的感染增强元件的长度大为缩短，但仍具有显著的增强AAV感染的功能；另一方面，由于该感染增强元件的长度大为缩小，因此为AAV载体腾出更大的用于装载外源基因的空间或容量。

典型地，本发明的感染增强元件具有如下结构：

Z1-Z2-Z3-Z4 (I)

其中，Z1为信号肽元件(如AAVR蛋白的信号肽元件)；

Z2为PKD-1结构域、PKD-2结构域、或PKD-1-PKD-2结构域；

Z3为无或PKD-3结构域；

Z4为跨膜元件；

“-”表示连接上述各元件的肽键。

附加条件是，当Z3为PKD-3元件时，Z4不是AAVR的跨膜元件。

在另一优选例中，所述Z4为LDL的跨膜元件。优选地，LDL氨基酸序列：FLSIFFPIALVALLVLGAVLLWR(SEQ ID NO.:9)(在AAVR M2中，换成LDL跨膜元件，紧接着PKD-3后面)。

优选地，本发明的感染增强元件含有PKD-1结构域、PKD-2结构域和PKD-3结构域。

此外，本发明的感染增强元件可以含有位于N端的信号肽，也可以不含有信号肽(即为成熟形式的感染增强元件)。

由于本发明的感染增强元件的C端或C侧具有跨膜元件，因此，表达后的感染增强元件会锚定在细胞膜上，其中Z2和Z3位于细胞膜外侧。

在本发明中，所述信号肽元件和/或跨膜元件可以来自AAVR(例如，AAVR蛋白的信号肽、PKD的跨膜区)，也可以来自其他蛋白。例如，对于跨膜元件而言，代表性的例子包括(但并不限于)：LDL的跨膜区。

在本发明优选例中，当所述的跨膜元件为来自人蛋白(如LDL)的跨膜区时，有助于降低对靶细胞(如人细胞)的副作用。

应理解，在本发明中，在Z4的下游(即C端)，还可额外地或任选地含有其他胞内元件。

参见图1。图中示出了本发明的几种感染增强元件。其中，AAVR M1感染增强元件中，不仅去除了4号和5号两个免疫球蛋白样结构，还进一步去除3号免疫球蛋白样结构域。AAVR M2：去除4号和5号免疫球蛋白结构域，并用LDL受体的跨膜结构域替代原有跨膜结构域；AAVR M4和AAVR M5的结构如图所示。

这些改良的感染增强元件均进一步缩短AAV受体基因的序列长度，有助于后续将该基因更好的包装在AAV中，增强AAV受体基因在体内的应用性；另一方面，通过对原有的AAV受体蛋白的改造，可意外地降低过表达的内源蛋白的功能并提升AAV感染的比例。

本发明的构建物和载体

本发明提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有从5'-3'的式II结构：

X1-X0-P1-X2-X3-X4 (II)

其中，X1为ITR元件；

X0为任选的增强子；

P1为第一启动子，所述第一启动子选自下组：PGK、LP1、或其组合；

X2为本发明的感染增强元件的编码序列；

X3为polyA元件，优选地选自下组：bGHPA、SV40PA、或其组合；

X4为ITR元件；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

本发明的构建物中所用的各种元件可以用常规方法，如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得，然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。

将本发明的构建物插入外源载体(例如质粒、病毒载体)，就构成了本发明的载体。

在本发明中，一类特别优选的载体是表达载体，较佳地是病毒载体，尤其是AAV载体，包括各种血清型的AAV，如AAV1至AVAV13。代表性的AAV载体包括(但并不限于)：AAV2、AAV3、AAV8、或其组合。

优选地，本发明的AAV表达载体由PGK启动子启动表达AAV受体基因，其中，将全合成的本发明感染增强元件的编码序列(如AAVR M1,M2、M4、或M5等的编码序列)，并通过无缝连接的方式分别拼接到AAV表达载体上。

评价感染增强效果的方法

本发明还提供了一种评价本发明感染增强元件或类似增强感染元件的效果的方法，

典型地，以AAVR为例，一个实施方案包括：

(1)分析AAV受体基因的序列信息，通过对序列信息的分析预测其结构域的功能，并设计相关的改造方案。

(2)克隆获得改造后的AAVR基因序列，并构建该改造后基因的AAV表达系统。

(3)转染293T细胞，并在转染12小时后加定量的含GFP的AAV病毒，加病毒12小时后，拍照检测荧光数量，72小时后，流式分析感染GFP阳性细胞数目。其中，GFP荧光越高，表示感染增强元件的增强感染的效果越好。

应用

在本发明中，还提供了本发明感染增强元件以及相应构建物的应用。

一种典型的应用是提高AAV-CRISPR/Cas系统的基因编辑效率。另一个典型的应用是临床上基因治疗的效率。

在本发明的一个实施例中，以PKU疾病和实验动物(小鼠)为例，提供了一种提高对AAV-CRISPR/Cas系统的基因编辑效率的方法，它包括以下步骤：

(1)包装纯化表达本发明感染增强元件的AAV病毒，通过qPCR测定纯化后病毒的滴度。

(2)针对苯丙酮尿症(PKU)小鼠模型的基因序列设计sgRNA，并根据靶点位置设计同源重组模板，克隆靶向Pah基因的CRISPR/Cas系统，和含同源重组修复模板的AAV载体。

(3)分别包装纯化CRISPR/Cas系统和修复模板的AAV病毒，并检测滴度。

(4)向成年的PKU小鼠共注射AAV受体病毒、CRISPR/Cas修复系统病毒和修复模板病毒。

(5)注射一定时间后检测治疗后，检测患病小鼠的疾病表征的回复情况。

在该实施方案中，采用苯丙酮尿症疾病小鼠模型评价基因治疗效果。

药物组合物和药盒

本发明提供了含有活性成分(a)第一载体；(b)第二载体；任选的(c)第三载体；(d)任选的第四载体；以及(e)药学上可接受的载体的药物组合物。其中，所述第一载体含有本发明的核酸构建物；所述第二载体为含有表达Cas9核酸酶的表达盒；所述第三载体含有表达sgRNA的表达盒；所述第四载体通常为基因治疗载体，例如第四载体可含有表达供体DNA的表达盒。这类药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。

药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。一种优选的剂型是注射制剂。此外，本发明药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。

具体地，本发明还提供了一种可用于(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药盒，该药盒含有：

(a)第一容器，以及位于所述第一容器中的第一载体；

(b)第二容器，以及位于所述第二容器中的第二载体；

(c)第三容器，以及位于所述第三容器中的第三载体；

(d)第四容器，以及位于所述第四容器中的第四载体；

其中，所述第一载体含有本发明所述的核酸构建物；所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒；所述第三载体含有表达sgRNA的表达盒；所述第四载体含有表达供体DNA的表达盒，所述的供体DNA为具有正常功能的苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因。

本发明的药物可以与其他治疗剂联用。例如，其他治疗苯丙酮尿症药物，或其他降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物。

治疗方法

本发明还提供了基于本发明的感染增强元件或相应表达载体进行基因治疗的方法。

例如，本发明方法可用于治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量。

在本发明中，当进行基因治疗时，需要将对象(如人或非人哺乳动物)施用有效量的活性成分(a)第一载体；(b)第二载体，任选的(c)第三载体，任选的(d)第四载体；其中，所述第一载体含有本发明第二方面所述的核酸构建物；所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒；所述第三载体含有表达sgRNA的表达盒；所述第四载体含有用于所需的病症的表达供体DNA的表达盒。

在应用时，本发明的所述的第一载体、第二载体、第三载体、和第四载体中的任何二个、三个为同一载体。或者，所述的第一载体、第二载体、第三载体、和第四载体中均为不同的载体。

在本发明中，所述第二载体、第三载体、和第四载体均为AAV载体。更佳地，第一载体也是AAV载体。

优选地，第一载体与第二载体是不同的载体。

优选地，第一载体与第四载体是不同的载体。

优选地，第二、第三、和第四载体中的任二个或任三个是同一载体。

在本发明中，可以以任何次序来施用所述的第一载体、第二载体、第三载体、和第四载体。例如，可以先后或同时施用。优选地，可以先施用第一载体，然后或同时施用其他载体(第二载体、第三载体、第四载体、或其组合)。

在本发明中，在施用第二载体、第三载体、和第四载体(均为AAV载体)时，AAV的施用量可以大幅下降，通常可以是现有常规用量的1/n，其中n≥2，例如为1/3、1/5、1/10或更少。

更为重要的是，在本发明中，所述的第一载体、第二载体、第三载体、和第四载体(均为AAV载体)的总用量，与常规的AAV基因治疗载体的用量相比，仍是大幅下降的，通常为现有常规用量的1/m，其中m≥1.5，例如为1/2、1/3、1/5或更少。

本发明的上述载体可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等。优选以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。

在本发明中，可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、瘤内或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、肌内给药或静脉内给药。

从易于给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物，尤其是注射剂。

此外，本发明的两种活性成分或药物还可与其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物(如BH4、LNAA)联用。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次开发了一种尺寸极小的感染增强元件，该感染增强元件可显著提高AAV病毒载体系统的感染效率，进而显著提高基因治疗效果。例如，以PKU为例，可显著降低模型动物中的血苯丙氨酸含量，从而治疗苯丙酮尿症。

(2)本发明首次意外发现减少病毒量居然可以显著提高AAV病毒载体系统的感染。

(3)通过本发明过表达腺相关病毒受体的方法，可以有效提高病毒对靶器官的感染并显著降低AAV病毒的用量。利用病毒进行基因治疗时，病毒载体会引起患者肝脏炎症的发生，过高的炎症水平不仅会给患者带来危险，还会导致治疗效果的丧失。目前已有的基因治疗包括基因替代性疗法和依托基因编辑的基因治疗，这两种基因治疗的方式都需要病毒作为传输载体向体内传输基因治疗系统。理论上，高滴度的病毒会增加病毒对于靶器官的感染，但是注射高滴度量的病毒已被证实会引起肝脏的炎症反应，同时会影响治疗的效果。因此通过本发明中过表达腺相关病毒受体，可以有效降低治疗中病毒的用量，提高病毒对于靶器官的感染并提高基因治疗的安全性。

(4)通过本发明提高基因治疗效率的方法，可以在致病基因突变位点的原位修复导致其失活或者丢失的突变。理论上原位修复后的基因和野生型基因相同，且只需要修复患者一部分的细胞使患者体内基因正常表达量趋近正常水平，从而大大缓解患者的病情，修复后的细胞可以长时间发挥正常的功能，从而免去治疗过程中反复注射治疗药物的痛苦。在已有的基因治疗过程中，由于CRISPR/Cas系统在体内的基因编辑效率有限，目前已有的报道都是针对一些只需要修复小部分细胞就能治疗的遗传性疾病，如酪氨酸败血症和血友病等，并且编辑效率较低，只能缓解疾病的症状并不能根治遗传病，而对于大多数如苯丙酮尿症一类的遗传病来说，目前所能达到的效率并不能满足治疗的需要，本发明所提供的技术方法可以最高提升5倍的基因编辑效率。

(5)本发明提供的治疗苯丙酮尿症的方法，可以治疗由于编码苯丙氨酸羟化酶的Pah基因的突变引起的苯丙酮尿症。现有对于苯丙酮尿症的基因治疗都是通过病毒载体过表达该基因的基因替代性疗法，该疗法治疗时间有限，并且可能会带来插入突变和基因沉默，给该策略的基因治疗的临床实验带来风险。本发明所提供的方法中的两个策略，即在Pah基因前端敲入该基因完整cDNA序列的方法和原位修复12号外显子的点突变方法，这两种方法都可以治疗该遗传病。相比较已有的基因替代性疗法，能够实现长期的治疗效果。

(6)本发明中针对腺相关病毒受体基因做出的改造在保留该受体原有的提高腺相关病毒的感染效率的基础上，降低了腺相关病毒片段长度，使其更加容易包装到病毒载体内。原有的腺相关病毒载体序列较大，该改造后的受体尺寸更小，但其对腺相关病毒感染的提升没有受到明显影响。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。

通用方法

流式分析感染GFP阳性细胞数目

转染293T细胞，并在转染12小时后加定量的含GFP的AAV病毒，加病毒12小时后，拍照检测荧光数量，72小时后，流式分析感染GFP阳性细胞数目。

具体地，先将293T细胞接种到24孔板内，每孔接种量25万，至细胞密度约为70％时，分别向每孔转染300ng不同改造方案的AAV受体基因表达载体，同时阴性对照组转染300ng空载质粒，阳性对照组转染MiniAAVR基因表达载体。转染质粒12小时后，每孔加入等量的AAV-GFP病毒，感染病毒12小时后，用荧光显微镜进行拍照，感染病毒72小时后，将培养基上清吸干，每孔加100μL胰酶消化，消化后用100μL培养基重悬细胞，通过流式分析得到GFP阳性细胞的比率。

AAV包装和纯化

(1)10cm培养皿接种293T细胞，待细胞密度达到约为70％时，每皿转染AAV8衣壳质粒10μg、AAV-helper质粒10μg和AAV表达载体10μg。

(2)转染72小时后，收集培养基到50ml离心管，5,000rpm/min离心15min，上清收集至500ml离心瓶，按照1：10添加PEG8000，冰上放置2小时，10，000rpm/min离心获得的沉淀用PBS重悬收集。

(3)上清沉淀下的细胞与培养皿残留细胞用lysis Buffer重悬，CsCl₄梯度离心获得病毒沉淀，收集病毒沉淀溶液加入50KD滤柱，3,500rpm/min离心，离心过程中，用PBS稀释病毒溶液，离心至最终体积约为1-2ml。

qPCR滴度测定法

1)在表达载体上设计合适的引物，PCR获得特异性产物，割胶回收纯化后测定浓度。

2)按比例分别稀释出，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl，0.0001ng/μl标准品。

3)取5μL的病毒原液到离心管中，并加入5μL的10×DNase buffer、1μL的DNase、39μL的超纯水，置于37℃水浴锅中反应30min去除病毒纯化过程中没有除尽的质粒DNA；

4)将样品置于95℃条件中反应10min使DNase降解；

5)再往离心管中加入5μL的10×DNase buffer、40μL的超纯水、1μL的蛋白酶K，放在37℃水浴锅中反应30min使病毒衣壳裂解；

6)将样品置于95℃条件中反应10min使蛋白酶降解；此时共有病毒稀释液100μL，取1μL进行RT-PCR检测滴度。

7)RT-PCR反应结束后，使用软件绘制出标准曲线，根据标准曲线计算出反应体系中病毒DNA的浓度(ng/μL＝μg/mL)，并根据公式计算病毒滴度：每毫升病毒基因组数(vg/mL)＝病毒DNA浓度(μg/mL)×10^-6×6.23×10²³(个/mol)/目的DNA片段分子量(g/mol)。

实施例1改造腺相关病毒受体，在人类HEK293T细胞中过表达，提高携带GFP的腺相关病毒的感染效率

1.按照改造策略构建AAV表达载体

改造腺相关病毒受体，改造方案如图1所示。从NCBI中获得腺相关受体(AU040320)的cDNA序列，在该序列基础上删除PKD结构域3，同时对跨膜段进行修饰或替换。在确定改造后的腺相关病毒受体序列，构建改造后的腺相关病毒受体表达载体。本实施例中所使用的质粒为AAV表达载体，启动子为PGK，PGK启动子启动表达改造后的AAV受体基因。

由此可见，腺相关病毒受体AAV表达载体(AAV-AAVR)基本组成为：PGK-AAVReceptor。(图2)

2.将载体转染入人类胚肾细胞系HEK293T

在转染24小时前，用0.25％的胰酶消化HEK293T细胞，将细胞接入24孔板中，每一个孔接入大约1.2×10⁵个细胞。约24小时候待细胞密度达到约60-70％时进行转染。转染步骤如下：取约800ng AAV-AAVR质粒，加入50μL无血清DMEM培养基中，混匀质粒与DMEM的混合物，然后加入PEI转染试剂。静置15分钟，最后将混合液加入到HEK293T细胞培养液中(此步骤为操作24孔板单个孔的量)。

3.用AAV-GFP病毒感染HEK293T

转染质粒24小时后，每孔加入MOI＝2000的包装的AAV-GFP病毒(图5)，加入病毒后混匀培养液。感染24小时后，对感染的细胞进行拍照(图3)。36小时后，吸取培养基上清，用0.25％的胰酶消化HEK293T细胞，将消化下的细胞进行流式分选结果如图4。

结果表明，本发明的感染增强元件，包括AAVR M1、AAVR M2、AAVR M4和AAVR M5均可增强AAV-GFP病毒的感染效率，提高幅度为约200-1000％不等。此外，即使仅保留PKD1或PKD2结构域，仍可明显提升AAV-GFP病毒的感染效率。

实施例2在小鼠体内过表达AAV受体基因，增强GFP的腺相关病毒的感染效率

1.包装AAV受体基因的腺相关病毒，并检测包装后所得病毒的滴度。

2.向野生型小鼠注射腺相关病毒。

注射腺相关病毒的小鼠有三组，第一组不注射病毒，第二组注射2.5x10^10vgAAV-GFP，第三组共注射2.5x10^10vg AAV-GFP和5x10^10vg AAV Receptor，第四组共注射2.5x10^10vg AAV-GFP和1x10^11vg AAV Receptor。

3.检测AAV-GFP对肝脏的感染情况

注射病毒两周后，取小鼠肝组织样本制成冰冻组织切片，组织切片用PBS浸泡十分钟，DAPI孵育五分钟，孵育结束吸取DAPI，用PBS洗三次，每次10分钟。对肝脏样本进行拍照。(图6)

实施例3过表达腺相关受体，提高通过腺相关病毒治疗苯丙酮尿症的治疗效率

在本实施例中，以PKU为例，验证本发明感染增强元件对基因治疗效果的改善作用。苯丙酮尿症是一种苯丙氨酸代谢障碍的常染色体隐性遗传病，根据该遗传病突变型数据库，构建患者突变型人数最多的PAH^R408W突变小鼠。

总体方案包括以下步骤：

在步骤(2)中，在一号内含子处通过在正义链上寻找突变位点附近的N₂₀NNGRRT，或者在反义链上寻找突变位点附近的YRRCNNN₂₀，来确定CRISPR/Cas基因编辑系统所原位修复的靶点。其中前20个碱基为CRISPR/Cas系统中sgRNA与靶点的互补配对序列。最后的NNGRRT(N代表随意碱基，G为鸟嘌呤，R为嘌呤，T为胸腺嘧啶)为s.auCas9所识别的PAM序列。该步骤中方案(1)只修复PAH^R408W突变基因的单点突变，针对突变位点附近序列设计sgRNA，通过筛选获得活性高的靶点序列，并将突变位点左右400bp作为同源重组修复模板供体，该供体上带有兼并突变，对原有DNA序列上的靶点序列进行了兼并突变，通过CRISPR/Cas系统在突变碱基附近引发DNA损伤，并在随后发生的同源重组过程中，按照修复模板进行修复，从而治疗由于该点突变引发的遗传性疾病，该方案还可用于多种的由于点突变引起的疾病的基因治疗过程。方案(2)在PAH基因的一号内含子位置敲入Pah基因的cDNA，替换原有缺陷的Pah基因已达到治疗的目的。首先在一号内含子附近设计sgRNA，筛选获得活性高的靶点序列，将靶点左右各600bp作为同源臂插入Pah基因的cDNA序列，该方案可用于治疗基因突变引起的疾病的治疗。也可以在安全位点(AAVS1,Rosa26等)敲入突变基因的正确的cDNA序列，来治疗由于功能缺失突变导致的疾病，敲入的策略和方案(2)中基本相同，左右同源长度选为800bp，通过同源重组将正确的基因表达元件整合到基因组中，从而治疗相对应的疾病。

步骤(3)中所述AAV的包装纯化步骤与步骤(1)中相同。

步骤(4)中，注射小鼠的周龄8-10周，通过尾静脉方式将PBS稀释后的病毒液注射到小鼠体内，AAV受体病毒注射量为5x10^10vg/ml，CRISPR/Cas修复系统病毒注射量为3x10^11vg/ml和修复模板病毒2x10^11vg/ml。注射两周后可以通过活体肝切除术获得小鼠肝脏的部分的组织，通过液氮研磨成粉末，消化后提取肝脏组织的基因组DNA，针对切割位点附近的序列设计引物，对切割位点附近进行PCR，测序并通过统计结果获得最终的切割效率。

步骤(5)中，对治疗后苯丙酮尿症小鼠的治疗效果进行评估，注射病毒后，两周后，对注射病毒后小鼠进行活体肝切除术，获得的肝脏样本，提取肝脏基因组，对切割位点附近进行PCR，连接载体测序统计得出切割效率。注射后一个月，通过眼眶取血获得小鼠血液干血样本，检测小鼠血液苯丙氨酸含量，血液苯丙氨酸含量高于1200μmol/L为典型苯丙酮尿症，低于1200μmol/L高于600μmol/L为中度苯丙酮尿症，低于360μmol/L为血苯丙氨酸含量的治疗阈值。3个月后，对治疗后小鼠毛色进行拍照鉴定治疗后苯丙氨酸小鼠的毛色回复情况。

材料和方法

1.苯丙酮尿症小鼠

本实施例中苯丙酮尿症小鼠(获自华东师范大学)在Pah基因上带有R408W纯和突变。

2.sgRNA靶点的选择

通过CRISPR/Cas系统小鼠肝脏的Pah位点进行基因敲入的示意图如图7所示。从NCBI获取Pah的DNA序列，本实例中查询序列为小鼠Pah基因的CDS区域。在此CDS序列的正义链或反义链中寻找5'N₂₀NNGRRT3'或5'YRRCNNN₂₀3'的序列。其中前20个碱基N为sgRNA与靶序列互补配对的碱基。而最后三个碱基NNGRRT(YRRCNN)为s.auCas9所识别的PAM(proto-spacer-adjacent-motif)序列不计入sgRNA序列中。由于pX458载体中驱动sgRNA转录的启动子为U6启动子所以在sgRNA序列的5'端加入一个“G”以保证sgRNA的转录表达。本实施例中所选定的sgRNA序列为5'TTGGGCTTCCACTGCTAGGA3'(SEQ ID NO.:2)在sgRNA的5'端加入caccg，在sgRNA反向互补链的5'端加入aaac以形成粘性末端。体外合成sgRNA的两条链并退火形成带有粘性末端的双链sgRNA。所合成的双链序列为sgmPAH-For 5'CACCGTTGGGCTTCCACTGCTAGGA3'(SEQ ID NO.:3)，sgmPAH—Rev 5'AAACTCCTAGCAGTGGAAGCCCAAC3'(SEQ ID NO.：4)。利用限制性内切酶BbSI线性化AAV表达载体，通过T4连接酶连入sgRNA完成AAV的构建。

3.同源重组模板AAV载体的构建

将模板序列连接入AAV载体序列构建成带有供体序列的载体AAV-Pah Donor如图9所示，作为供体。

4.Cas9腺病毒载体的构建

本实施例中的核酸酶选用来自于，古细菌II型(CRISPR)-CRISPR-associatedprotein(Cas)系统的Cas9核酸酶。通过PCR将Cas9序列扩增后连接入AAV载体中如图8所示构建成表达Cas9核酸酶的腺病毒载体AAV-Cas9。

5.病毒递送载体的包装和浓缩纯化

6.通过尾静脉注射方法在体内敲入小鼠Pah基因

注射表达CRISPR/Cas系统的腺相关病毒以及提供敲入Pah cDNA序列的腺相关病毒：第一组将3x10^11vg AAV-LP1-saCas9-U6-sgRNA和2x10^10^11vg AAV-Pah cDNA混合后调整体积为700μL，尾静脉注射入小鼠体内，第二组除注射与第一组等量的腺相关病毒之外，共注射低滴度腺相关病毒受体8x10^9vg AAV-AAV Receptor，第三组除注射与第一组等量的腺相关病毒之外，共注射高滴度腺相关病毒受体6x10^10vg AAV-AAV Receptor。

7.检测治疗后苯丙酮尿症小鼠血苯丙氨酸含量变化

注射腺相关病毒之前，通过眼眶丛静脉取血获得血液样本，将血液滴在滤纸上制成干血滤纸片，所得干血样本通过荧光茚三酮检测样本中苯丙氨酸含量。注射病毒后，每隔一个月检测一次小鼠血液苯丙氨酸含量，检测方法同上。结果如图11和图12所示，共注射腺相关病毒受体基因之后，共注射高滴度腺相关病毒受体病毒组小鼠血苯丙氨酸含量出现明显下降，同时降低比率也较只注射CRISPR/Cas腺相关病毒降低比率更多。

8.注射腺相关病毒组小鼠肝脏体内基因修复情况检测

尾静脉注射一个月后，将小鼠安乐死处理。取小鼠肝脏研磨，提取肝脏基因组DNA。在靶点上游设计PCR引物P1，在靶点下游设计PCR引物P2。

其中：P1引物序列为5'TCCCTTCCTTCCTTCCTTCCTT3'(SEQ ID NO.：5)

P2引物序列为5'GCTGTCTGTCTTTCCTGCTCT3'(SEQ ID NO.：6)

以提取的肝脏基因组DNA为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增。所得PCR产物利用试剂盒纯化(天根)。将纯化后的PCR产物连接peasy-blunt simple载体，测序检测CRISPR/Cas系统在小鼠体内原位修复基因的效率。

结果如图13所示，第一组只注射CRISPR/Cas9和修复模板腺相关病毒组约有9.8％的肝脏细胞发生了基因原位编辑，第二组共注射低滴度腺相关受体病毒，约有5.7％的肝细胞发生了基因原位编辑，第三组共注射高滴度腺相关受体病毒，约有52％的肝细胞发生了基因原位编辑(图10)。

同时采用正向引物在同源臂外，反向引物在同源臂内进行PCR检测插入基因的情况.在同源臂内设计正向引物P3，在同源臂外设计反向引物P4。

其中：P3引物序列为5'GCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATA 3'(SEQ ID NO.：7)

P4引物序列为5'CAAATACGACACGCCTGTTGTCTTGACT 3'(SEQ ID NO.：8)

结果如图13所示，共注射高滴度腺相关受体的腺相关病毒治疗组PCR获得了敲入的条带，随后将条带PCR产物连接peasy-blunt simple载体，测序结果显示，该PCR产物为成功敲入Pah cDNA的基因序列。

上述实验结果(图10)结果表明，采用本发明的感染增强元件后，基因编辑效率(或治疗效果)提高了约5倍。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120> 通过过表达腺相关病毒受体提高基因治疗效率的方法

<130> P2017-2062

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1048

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Met Glu Lys Arg Leu Gly Val Lys Pro Ser Pro Ala Ser Trp Val Leu

1 5 10 15

Pro Gly Tyr Cys Trp Gln Thr Ser Val Lys Leu Pro Arg Ser Leu Tyr

20 25 30

Leu Leu Tyr Ser Phe Phe Cys Phe Ser Val Leu Trp Leu Ser Thr Asp

35 40 45

Ala Asp Glu Ser Arg Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Tyr Gly Ala Gly

50 55 60

Leu Arg Thr Glu Gly Glu Asn His Leu Arg Leu Leu Ala Gly Ser Leu

65 70 75 80

Pro Phe His Ala Cys Arg Ala Ala Cys Cys Arg Asp Ser Ala Cys His

85 90 95

Ala Leu Trp Trp Leu Glu Gly Met Cys Phe Gln Ala Asp Cys Ser Lys

100 105 110

Pro Gln Ser Cys Gln Pro Phe Arg Thr Asp Ser Ser Asn Ser Met Leu

115 120 125

Ile Ile Phe Gln Lys Ser Gln Thr Thr Asp Asp Leu Gly Leu Leu Pro

130 135 140

Glu Asp Asp Glu Pro His Leu Leu Arg Leu Gly Trp Gly Arg Thr Ser

145 150 155 160

Trp Arg Arg Gln Ser Leu Leu Gly Ala Pro Leu Thr Leu Ser Val Pro

165 170 175

Ser Ser His His Gln Ser Leu Leu Arg Asp Arg Gln Lys Arg Asp Leu

180 185 190

Ser Val Val Pro Thr His Gly Ala Met Gln His Ser Lys Val Asn His

195 200 205

Ser Glu Glu Ala Gly Ala Leu Ser Pro Thr Ser Ala Glu Val Arg Lys

210 215 220

Thr Ile Thr Val Ala Gly Ser Phe Thr Ser Asn His Thr Thr Gln Thr

225 230 235 240

Pro Glu Trp Pro Lys Asn Val Ser Ile His Pro Glu Pro Ser Glu His

245 250 255

Ser Ser Pro Val Ser Gly Thr Pro Gln Val Lys Ser Thr Glu His Ser

260 265 270

Pro Thr Asp Ala Pro Leu Pro Val Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Gln Ala Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ala Pro His Pro Val

290 295 300

Val Lys Glu Leu Val Val Ser Ala Gly Lys Ser Val Gln Ile Thr Leu

305 310 315 320

Pro Lys Asn Glu Val Gln Leu Asn Ala Phe Val Leu Pro Glu Ala Glu

325 330 335

Pro Gly Glu Thr Tyr Thr Tyr Asp Trp Gln Leu Ile Thr His Pro Thr

340 345 350

Asp Tyr Ser Gly Glu Val Glu Arg Lys His Ser Gln Ser Leu Gln Leu

355 360 365

Ser Lys Leu Thr Pro Gly Leu Tyr Glu Phe Lys Val Thr Val Asp Gly

370 375 380

Gln Asn Ala His Gly Glu Gly Tyr Val Asn Val Thr Val Lys Pro Glu

385 390 395 400

Pro Arg Lys Asn Arg Pro Pro Val Ala Val Val Ser Pro Gln Phe Gln

405 410 415

Glu Ile Ser Leu Pro Thr Thr Ser Thr Ile Ile Asp Gly Ser Gln Ser

420 425 430

Thr Asp Asp Asp Lys Ile Val Gln Tyr His Trp Glu Glu Leu Lys Gly

435 440 445

Pro Leu Arg Glu Glu Lys Ile Ser Glu Asp Thr Ala Ile Leu Lys Leu

450 455 460

Ser Lys Leu Val Pro Gly Asn Tyr Thr Phe Ser Leu Thr Val Val Asp

465 470 475 480

Ser Asp Gly Ala Thr Asn Ser Thr Thr Ala Ser Leu Thr Val Asn Lys

485 490 495

Ala Val Asp Tyr Pro Pro Val Ala Asn Ala Gly Pro Asn Gln Val Ile

500 505 510

Thr Leu Pro Gln Asn Ser Ile Thr Leu Phe Gly Asn Gln Ser Thr Asp

515 520 525

Asp His Gly Ile Thr Ser Tyr Glu Trp Ser Leu Ser Pro Ser Ser Lys

530 535 540

Gly Lys Val Val Glu Met Gln Gly Val Arg Thr Pro Ala Leu Gln Leu

545 550 555 560

Ser Ala Met Gln Glu Gly Asp Tyr Thr Tyr Gln Leu Thr Val Thr Asp

565 570 575

Thr Ala Gly Gln Gln Ala Thr Ala Gln Val Thr Val Ile Val Gln Pro

580 585 590

Glu Asn Asn Lys Pro Pro Gln Ala Asp Ala Gly Pro Asp Lys Glu Leu

595 600 605

Thr Leu Pro Val Asp Ser Thr Thr Leu Asp Gly Ser Lys Ser Thr Asp

610 615 620

Asp Gln Arg Val Val Ser Tyr Leu Trp Glu Gln Ser Arg Gly Pro Asp

625 630 635 640

Gly Val Gln Leu Glu Asn Ala Asn Ser Ser Val Ala Thr Val Thr Gly

645 650 655

Leu Gln Val Gly Thr Tyr Val Phe Thr Leu Thr Val Lys Asp Glu Arg

660 665 670

Asn Leu Gln Ser Gln Ser Ser Val Asn Val Ile Val Lys Glu Glu Ile

675 680 685

Asn Lys Pro Pro Val Ala Lys Ile Ala Gly Asn Val Val Val Thr Leu

690 695 700

Pro Thr Ser Thr Ala Glu Leu Asp Gly Ser Arg Ser Ser Asp Asp Lys

705 710 715 720

Gly Ile Val Ser Tyr Leu Trp Thr Arg Asp Glu Thr Ser Pro Ala Ala

725 730 735

Gly Glu Val Leu Asn His Ser Asp His His Pro Val Leu Phe Leu Ser

740 745 750

Asn Leu Val Glu Gly Thr Tyr Thr Phe His Leu Lys Val Thr Asp Ala

755 760 765

Lys Gly Glu Ser Asp Thr Asp Arg Thr Thr Val Glu Val Lys Pro Asp

770 775 780

Pro Arg Lys Ser Asn Leu Val Glu Ile Ile Leu Asp Val Asn Val Ser

785 790 795 800

Gln Leu Thr Glu Arg Leu Lys Gly Met Leu Ile Arg Gln Ile Gly Val

805 810 815

Leu Leu Gly Val Leu Asp Ser Asp Ile Ile Val Gln Lys Ile Gln Pro

820 825 830

Tyr Thr Glu Gln Ser Thr Lys Met Leu Phe Phe Val Gln Asn Asp Pro

835 840 845

Pro His Gln Leu Phe Lys Gly His Glu Val Ala Ala Met Leu Lys Ser

850 855 860

Glu Leu Gln Lys Gln Lys Ala Asp Phe Leu Ile Phe Arg Ala Leu Glu

865 870 875 880

Ile Ser Thr Val Thr Cys Gln Leu Asn Cys Ser Asp His Gly His Cys

885 890 895

Asp Ser Phe Thr Lys Arg Cys Val Cys Asp Pro Phe Trp Met Glu Asn

900 905 910

Phe Ile Lys Val Gln Leu Arg Asp Gly Asp Ser Asn Cys Glu Trp Ser

915 920 925

Val Leu Tyr Val Ile Ile Ala Ser Phe Val Ile Val Val Ala Leu Gly

930 935 940

Ile Leu Ser Trp Thr Thr Ile Cys Cys Cys Lys Arg Gln Lys Gly Lys

945 950 955 960

Pro Lys Arg Lys Ser Arg Tyr Lys Ile Leu Asp Ala Thr Asp Gln Glu

965 970 975

Ser Leu Glu Leu Lys Pro Thr Ser Arg Ala Gly Ser Lys Gln Lys Gly

980 985 990

Pro Thr Leu Ser Ser Ser Leu Met His Ser Glu Ser Glu Leu Asp Ser

995 1000 1005

Asp Asp Ala Ile Phe Thr Trp Pro Asp Arg Glu Lys Gly Lys Leu

1010 1015 1020

Leu Tyr Gly Gln Asn Gly Ser Val Pro Asn Gly Gln Thr Pro Leu

1025 1030 1035

Lys Ser Arg Ser Ala Arg Glu Glu Ile Leu

1040 1045

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

ttgggcttcc actgctagga 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

caccgttggg cttccactgc tagga 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

aaactcctag cagtggaagc ccaac 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tcccttcctt ccttccttcc tt 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gctgtctgtc tttcctgctc t 21

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gccactccca ctgtcctttc ctaata 26

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

caaatacgac acgcctgttg tcttgact 28

<210> 9

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Phe Leu Ser Ile Phe Phe Pro Ile Ala Leu Val Ala Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Leu Trp Arg

20

Claims

1.一种用于(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b) 降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的组合物，其特征在于，包括：

(i) 第一药物组合物，所述药物组合物包括(a)第一载体；和药学上可接受的载体；

(ii) 第二药物组合物，所述药物组合物包括(b)第二载体；和药学上可接受的载体；

(iii) 第三药物组合物，所述药物组合物包括(c) 第三载体；和药学上可接受的载体；和

(iv) 第四药物组合物，所述药物组合物包括(d)第四载体；和药学上可接受的载体；

其中，所述第一载体含有一核酸构建物，所述核酸构建物具有从5'-3'的式II结构：

X1-X0-P1-X2-X3-X4 (II)

其中，X1为ITR元件；

X0为任选的增强子；

P1为第一启动子；

X2为感染增强元件的编码序列；

X3为polyA 元件；

X4为ITR元件；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；所述感染增强元件具有如下结构：

Z1-Z2-Z3-Z4 (I)

其中，Z1为任选的信号肽元件；

Z2为PKD-1结构域、PKD-2结构域、或PKD-1-PKD-2结构域；

Z3为无或PKD-3结构域；

Z4为跨膜元件；

“-”表示连接上述各元件的肽键；

附加条件是，当Z3为PKD-3元件时，Z4不是AAVR的跨膜元件；

所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒；所述第三载体含有表达sgRNA的表达盒；所述第四载体含有表达供体DNA的表达盒，并且所述Cas9核酸酶选自下组：Cas9、Cas9n、或其组合，所述的供体DNA为具有正常功能的苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述Z4选自下组：LDL的跨膜元件和AAVR的跨膜元件。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一启动子选自下组：PGK启动子、LP1启动子、或其组合。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，PolyA元件选自下组：bGHPA、SV40PA、或其组合。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述表达供体DNA的表达盒具有5'-3'的式IV结构：

Z1-Z2-Z3 (IV)

其中，Z1为ITR元件；

Z2为供体DNA元件；

Z3为ITR元件；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述表达Cas9核酸酶的表达盒具有5'-3'的式III结构：

Y1-Y0-P2-Y2-Y3-Y4 (III)

其中，Y1为ITR元件；

Y0为任选的增强子；

P1为第二启动子序列；

Y2为编码Cas9核酸酶的编码序列；

Y3为polyA 元件；

Y4为ITR元件；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述第二启动子选自下组：PGK、LP1、或其组合。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b) 降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b) 降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物选自下组： BH4、 LNAA、或其组合。

10.一种用于(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b) 降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药盒，其特征在于，包括：

(a1) 第一容器，以及位于所述第一容器中的第一载体，或含有第一载体的药物；和

(b1) 第二容器，以及位于所述第二容器中的第二载体，或含有第二载体的药物；

(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的第三载体，或含有第三载体的药物；和

(d1)第四容器，以及位于所述第四容器中的第四载体，或含有第四载体的药物；

其中，所述第一载体含有一核酸构建物；所述核酸构建物具有从5'-3'的式II结构：

X1-X0-P1-X2-X3-X4 (II)

其中，X1为ITR元件；

X0为任选的增强子；

P1为第一启动子；

X2为感染增强元件的编码序列；

X3为polyA 元件；

X4为ITR元件；

Z1-Z2-Z3-Z4 (I)

其中，Z1为任选的信号肽元件；

Z2为PKD-1结构域、PKD-2结构域、或PKD-1-PKD-2结构域；

Z3为无或PKD-3结构域；

Z4为跨膜元件；

“-”表示连接上述各元件的肽键；

附加条件是，当Z3为PKD-3元件时，Z4不是AAVR的跨膜元件；

11.一种权利要求1所述的组合物在制备用于(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b) 降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物或制剂中的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述药物或制剂还包括其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b) 降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述其他(a)治疗苯丙酮尿症；和/或(b)降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物选自下组：BH4、LNAA、或其组合。