CN112210573B

CN112210573B - 一种用基因编辑改造原代细胞的dna模板及定点插入方法

Info

Publication number: CN112210573B
Application number: CN202011099140.0A
Authority: CN
Inventors: 孙洁; 周春; 荆瑞瑞
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2040-10-14
Also published as: CN112210573A; WO2022078153A1

Abstract

本发明主要公开了一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法，其中，DNA模板包括质粒、构建于质粒上的需要导入的目的基因、靶序列上下游的同源性序列(同源臂)和guide RNA识别的DNA序列；然后利用电转技术将基因编辑蛋白和guide RNA的RNP复合体、DNA模板递送到细胞系或原代细胞，实现把目的基因定点插入到细胞系或原代细胞的基因组，对细胞系或原代细胞进行改造。该发明的一个实际应用是可以不依赖病毒生产定点插入的嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞，在免疫细胞治疗疾病的应用中具有更好的安全性和有效性。

Description

一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法

技术领域

本发明涉及目的基因的定点插入，具体是利用电转技术结合基因编辑技术通过非病毒方法将目的基因定点整合到细胞系或原代细胞的基因组中，实施例中产生的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞可以用于白血病的治疗。

背景技术

目前主要是通过传统的慢病毒或逆转录病毒手段将目的基因整合到人原代T/NK细胞基因组中，但是该方法的不足之处是目的基因会被随机插入，如果能够将外源目的基因定点插入到细胞基因组中，能够在一定程度上提高基因工程改造过的人原代T/NK细胞的安全性和有效性，在临床上发挥更大的作用。目前，CRISPR-Cas9/Cpf1系统在实现对基因敲除方面已经运用的很成熟。但是通过CRISPR-Cas9/Cpf1系统实现将目的基因定点插入细胞系特别是原代细胞的基因组的技术，虽然已经有了一定的发展，但是插入的效率仍然很低。

目前在人原代T/NK细胞上，通过CRISPR-Cas9/Cpf1系统将目的基因定点整合到人原代T细胞的方法，主要是依赖于腺相关病毒(AAV)提供的单链DNA，作为Cas9/Cpf1定点切割基因组后同源重组修复(HDR)的供体DNA模板。但是腺相关病毒(AAV)在临床治疗过程中仍然可能会对机体产生潜在的危险、制备也较为复杂和不经济。目前还有研究将双链的线性DNA作为同源重组修复的供体DNA模板，对人原代T/NK细胞进行改造，但是双链的线性DNA制备较为复杂，且GMP制备不成熟。我们通过改造环状(circular)质粒载体DNA,使之成为同源重组修复的供体DNA模板，更高效地将目的基因定点插入到细胞系和人原代T/NK细胞的基因组中，从而实现目的基因在细胞系和人原代T/NK细胞基因组中的定点整合，增加免疫细胞治疗疾病的安全性和有效性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法，本发明主要通过对CRISPR-Cas9/Cpf1定点插入系统中依赖的同源重组修复的供体DNA质粒载体模板进行改造，减小质粒载体的长度并在同源臂两端加入guide RNA识别的DNA序列(Cas9/Cpf1-cleavage sequence,CCS)，使得Cas9/Cpf1 RNP复合物能在定点切割基因组的同时把环状的供体DNA质粒载体切割成线性的供体DNA模板。该方法能够不依赖病毒递送同源重组修复的供体DNA模板，将基因定点整合到细胞系或人原代T/NK细胞的基因组中，此种方法制备的定点插入的CAR-T细胞与依赖AAV病毒产生的定点插入的CAR-T细胞具有同等的体外杀伤和体内抗肿瘤效果，实现了定点插入CAR-T技术的突破。

本发明采用以下技术方案：

一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板，包括质粒、构建于质粒上的需要导入的目的基因、靶序列上下游的同源性序列(同源臂)和guide RNA识别的DNA序列。

进一步地，所述质粒为pUC57、pUC57截短突变质粒pMini以及pMiniZ，pMini的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，pMiniZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。

进一步地，目的基因的每一侧均具有一个同源性序列和guide RNA识别的DNA序列。其中，基因编辑蛋白通常为Cas9/Cpf1，可将guide RNA的DNA序列表示为Cas9/Cpf1-cleavage sequence,CCS。

本发明还提供了一种基于权利要求1所述DNA模板的目的基因定点插入方法，包括如下步骤：

步骤1、选取要定点插入目的基因的基因组位点，并根据位点选择CRISPR-Cas9/Cpf1系统识别插入位点的guide RNA；

步骤2、设计合成供体DNA模板，供体DNA模板含有目的基因、目的基因两侧的同源臂序列以及guide RNA识别的DNA序列；

步骤3、合成识别插入位点的guide RNA，表达纯化基因编辑蛋白；

步骤4、将步骤3中的guide RNA和基因编辑蛋白体外结合后，再与步骤2中带有目的基因和同源臂以及识别位点的质粒载体混合，最后与细胞混合，电转，完成目的基因的定点插入和细胞的改造。

进一步地，所述步骤3中，质粒载体为pUC57截短突变质粒pMini，pMini的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步地，基因编辑蛋白为SpCas9或LbCpf1或AsCpf1等。

进一步地，步骤1中插入位点为TCRα或RAB11a位点，步骤2目的基因为CAR或EGFP基因，步骤5中细胞为HEK293T或人原代T/NK细胞。

进一步地，步骤2中同源臂为任意大小。

进一步地，步骤5中guide RNA和Cas9/Cpf1蛋白在体外室温或37℃结合10-20min。

进一步地，步骤5中采用CeletrixTM或BTX电转系统。

上述方案中，可以采用流式细胞术检测目的基因的表达，并与依赖病毒提供DNA模板产生定点插入的人原代CAR-T细胞对比体外和体内的抗肿瘤功能。

本发明的有益效果是：

通过非病毒方法将目的基因定点整合到人原代T细胞中，避免了通过病毒感染和非定点整合带来的潜在的风险，如肿瘤致病性。同时，定点插入产生的CAR-T细胞与随机插入的细胞相比，有更好的安全性和有效性。此外，该方法简化了人原代CAR-T细胞的生产工艺，节约了生产成本，具有很大的临床应用潜力和商业价值。

附图说明

图1为实施例中利用CRISPR-Cas9系统将目的基因CAR插入人原代T细胞TCRα位点的流程图。

图2a为实施例1中pUC57-RAB11a-EGFP，pMini-RAB11a-EGFP，pUC57-CCS-RAB11a-EGFP，pMini-CCS-RAB11a-EGFP供体DNA模板在293T细胞中把EGFP插入到RAB11a位点的效率；图2b为目的基因质粒载体上是否含有guide RNA识别的DNA序列(CCS)在293T细胞中EGFP基因的插入效率倍数变化结果统计图。

图3为实施例2中通过电转的方法将Cas9蛋白与guide RNA形成的RNP和pMini-CCS-RAB11a-EGFP质粒载体共电转到人原代T细胞中EGFP基因的插入效率。

图4a为实施例3中通过电转的方法将Cas9蛋白与guide RNA形成的RNP和pUC57-TRAC-CAR,pUC57-CCS-TRAC-CAR供体DNA模板共电转进人原代T细胞中CAR基因的插入效率；图4b为不同健康志愿者pUC57-TRAC-CAR,pUC57-CCS-TRAC-CAR与RNP共电转进人原代T细胞中CAR基因插入效率的倍数变化统计图。

图5a为实施例3中通过电转的方法将Cas9蛋白与guide RNA形成的RNP和pMini-TRAC-CAR,pMini-CCS-TRAC-CAR供体DNA模板共电转进人原代T细胞中CAR基因的插入效率；图5b为不同健康志愿者pMini-TRAC-CAR,pMini-CCS-TRAC-CAR与RNP共电转进人原代T细胞中插入效率的倍数统计图；图5c为pMini-CCS-TRAC-CAR与RNP共电转进人原代T细胞在不同志愿者中的插入效率。

图6为实施例3中pUC57-CCS-TRAC-CAR，pMini-CCS-TRAC-CAR，pMiniZ-CCS-TRAC-CAR供体DNA模板与RNP共同电转到人原代T细胞中CAR基因的插入效率统计图。

图7为实施例3中将靶向CD22和CD19两个抗原的双特异性CAR构建到pMini载体上，利用CRISPR-Cas9系统共电转到人原代T细胞的双特异性CAR基因的插入效率。

图8为实施例3中将RNP和pMini-TRAC-CAR,pMini-CCS-TRAC-CAR共电转进人原代T细胞中产生的CAR-T细胞经抗原刺激一周后CAR-T细胞的比例变化。

图9a为实施例3中不同比例的RNP和pMini-CCS-TRAC-CAR电转到人原代T细胞中的CAR基因插入效率，图9b为不同健康志愿者中不同比例的RNP和pMini-CCS-TRAC-CAR电转到人原代T细胞中的CAR基因插入效率的统计图。

图10为实施例3中不同健康志愿者中含有不同数目的CCS的pMini-CCS-TRAC-CAR供体DNA模板与RNP共电转到人原代T细胞中得到的CAR基因插入效率的统计结果图。

图11为实施例3中构建含有不同NLS的表达Cas9蛋白的载体，纯化后与guide RNA形成RNP复合物，与pMini-CCS-TRAC-CAR共同电转到人原代T细胞中的插入效率。

图12为实施例3中不同健康志愿者中不同同源臂长度的pMini-CCS-TRAC-CAR与RNP共电转到人原代T细胞中得到的CAR基因插入效率的统计结果图。

图13为实施例3中在电转过程中加入与细胞周期相关的小分子药物Brefedin A或者将CCND1蛋白共电转到人原代T细胞对CAR基因插入效率的影响。

图14为实施例3中使用带修饰和不带修饰的guide RNA与Cas9结合形成的RNP与pMini-CCS-TRAC-CAR共电转到人原代T细胞对CAR基因插入效率影响的统计结果图。

图15a为实施例3中AAV-TRAC-CAR和p-TRAC-CAR T细胞在遇到肿瘤抗原时杀伤能力结果示意图；15b为电转后AAV-TRAC-CAR和p-TRAC-CAR T细胞增殖能力的结果示意图；15c为AAV-TRAC-CAR和p-TRAC-CAR T细胞在遇到肿瘤抗原时的增殖能力的结果示意图。

图16为实施例3中通过t-SNE分析质谱流式检测AAV-TRAC-CAR和p-TRAC-CAR T细胞在接触抗原刺激前后的聚群分析。

图17实施例3中通过质谱流式检测AAV-TRAC-CAR和p-TRAC-CAR T细胞在接触抗原刺激前后的激活、分化和耗竭分子表达量的变化。图中，stim表示经过抗原刺激后的CAR-T细胞，con表示未经抗原刺激的CAR-T细胞。

图18a为实施例3中B淋巴细胞白血病小鼠模型在注射AAV-TRAC-CAR或p-TRAC-CART细胞后通过活体成像检测肿瘤的治愈情况；18b在小鼠注射B淋巴细胞白血病肿瘤细胞后，用AAV-TRAC-CAR或p-TRAC-CAR T细胞治疗后小鼠的生存情况。

图19为实施例4中将LbCpf1-RNP和AsCpf1-RNP电转到人原代T细胞中的TCR基因的敲除效率。

图20为实施例4将AsCpf1-RNP和pMini-CCS-TRAC-CAR共电转到人原代T细胞中CAR基因的插入效率。

图21为实施例5中体外扩增人原代NK细胞的标志物的检测。

图22为实施例5中将Cas9蛋白和guide RNA形成的RNP复合物和pMini-CCS-RAB11a-EGFP共电转进人原代NK细胞上EGFP基因的插入效率。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

实施例1

一、EGFP基因及RAB11a同源臂序列构建到pUC57或改造后的pMini质粒载体上1、改造pUC57质粒载体序列

pUC57质粒载体序列大小为2.7kb，主要包含三个部分：乳糖操纵子序列(LacZ)、氨苄青霉素抗药性基因及其启动子区(AMP)、原核生物复制起始区(ORI)。在已有的研究基础上，本实施例对pUC57质粒载体进行缩小，通过分子克隆的方法去掉乳糖操纵子序列(LacZ)序列，PCR克隆ORI区正向引物序列见SEQ ID NO：1，反向引物序列见SEQ ID NO：2，克隆AMP区正向引物序列见SEQ ID NO：3，反向引物序列见SEQ ID NO：4，通过同源重组构建pUC57截短突变质粒，命名为pMini。pMini序列见SEQ ID NO：5。

2、构建供体DNA模板pMini-CCS-RAB11a-EGFP、pUC57-CCS-RAB11a-EGFP、pUC57-RAB11a-EGFP和pMini-RAB11a-EGFP

pUC57和pMini质粒载体上含有KpnI和HindIII酶切位点，通过酶切切割pUC57和pMini，通过PCR扩增带有RAB11a目的基因和同源臂序列以及RAB11a guide RNA识别的DNA序列(CCS)构建到pUC57质粒载体上，用的正向引物序列见SEQ ID NO：6,反向引物序列见SEQ ID NO：7；构建到pMini载体上的正向引物序列见SEQ ID NO：8，反向引物序列见SEQ IDNO：9，PCR扩增回收后的用T4酶连接转化后，构建后的质粒载体通过二代测序比对，确认质粒载体构建正确，分别命名为pUC57-CCS-RAB11a-EGFP、pMini-CCS-RAB11a-EGFP、pUC57-RAB11a-EGFP和pMini-RAB11a-EGFP，其中，CCS表示含有Cas9/Cpf1的guide RNA序列或者Cas9蛋白的切割序，RAB11a-EGFP的核酸序列见SEQ ID NO：10,左侧同源臂序列见SEQ IDNO：11，右侧同源臂序列见SEQ ID NO：12。

3、携带有RAB11a guide RNA和Cas9基因的pX330质粒载体构建。

将识别RAB11a第一个基因外显子的guide RNA序列构建到pX330质粒载体中，RAB11a guide RNA序列见SEQ ID NO：13。

二、检测一中构建pUC57-CCS-RAB11a-EGFP、pMini-CCS-RAB11a-EGFP、pUC57-RAB11a-EGFP、pMini-RAB11a-EGFP供体DNA模板通过PEI转染在293T细胞中的EGFP基因的插入效率。

复苏293T细胞，用含有10％的FBS和1％的青霉素/链霉素(P/S)的DMEM培养基培养293T细胞，每2-3天传代一次，在转染前一天将293T细胞传代到6孔板中，每孔2*10E5个细胞，第二天，将携带有RAB guide RNA的pX330质粒载体和pUC57-CCS-RAB11a-EGFP或pMini-CCS-RAB11a-EGFP或pUC57-RAB11a-EGFP或pMini-RAB11a-EGFP共转染到293T细胞中，每个6孔板中加入1μg pX330质粒载体和1μg pUC57-CCS-RAB11a-EGFP、pMini-CCS-RAB11a-EGFP、pUC57-RAB11a-EGFP、pMini-RAB11a-EGFP质粒载体，PEI和质粒的质量比为3:1。共转染一周后，通过流式检测EGFP基因的插入效率，如图2a所示，目的基因质粒载体上有CCS的载体比不含CCS的载体基因插入效率高1.5-2倍，如图2b所示。

实施例2

一、合成RAB11a第一个基因外显子的guide RNA序列。

二、本实施例用的SpCas9(2NLS和4NLS)以及实施例4中用的LbCpf1或AsCpf1蛋白纯化，主要分为以下两个步骤：

1、构建Cas9/Cpf1质粒表达载体，用大肠杆菌质粒表达载体系统表达Cas9/Cpf1蛋白，将Cas9/Cpf1基因从pX330质粒载体上通过PCR扩增，正向引物序列见SEQ ID NO：14，反向引物序列见SEQ ID NO：15，LbCpf1的正向引物序列见SEQ ID NO：16,反向引物序列见SEQID NO：17，AsCpf1的正向引物序列见SEQ ID NO：18,反向引物序列见SEQ ID NO：19。PCR扩增后回收，将回收的SpCas9、LbCpf1、AsCpf1片段连接到KS表达质粒载体中，用T4 DNAligase连接，酶切位点是BamHI和NotI。SpCas9蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：20，LbCpf1的氨基酸序列见SEQ ID NO：21，AsCpf1蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：22。

2、纯化SpCas9(2NLS和4NLS)、LbCpf1、AsCpf1蛋白，用GE蛋白纯化系统纯化蛋白，扩增SpCas9、LbCpf1、AsCpf1质粒载体的大肠杆菌，裂解菌液后，用GST标签结合SpCas9、LbCpf1、AsCpf1蛋白，随后用GST酶切割GST标签，经过Heparin HP affinity柱子和Superdex^TM200 Increase柱子后得到纯度较高的SpCas9(2NLS和4NLS)、LbCpf1、AsCpf1蛋白。

三、将guide RNA和Cas9蛋白体外结合形成RNP后，再与质粒载体混合后，最后与人原代T细胞混合，电转，将EGFP基因定点整合到细胞中。

1、人原代T细胞的获取

从外周血中分离外周血单核细胞。抽取人静脉血10ml，用PBS稀释一倍后，加入20ml ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，用X-VIVO15培养基培养细胞，X-VIVO15培养基中加入10％的胎牛血清，1％青链霉素混合液(P/S)以及200U/ml IL2，同时用CD3/CD28 beads刺激外周血单核细胞的增殖。

2、电转guide RNA及Cas9蛋白

收集步骤1中培养的人原代T细胞，人原代T细胞离心沉淀后，用电转液或无血清的1640(原培)培养基清洗人原代T细胞1-2次，最后将细胞重悬到电转液或X-VIVO15培养基中。在体外先将60pmol guide RNA与30pmol的Cas9蛋白结合，室温或37度放置10min后形成RNP复合物，与供体DNA质粒混合后，再与人原代T细胞混合，用CeletrixTM或者BTX电转系统电转。电转后将T细胞在X-VIVO15培养基+10％胎牛血清和1％P/S和200U/ml IL2继续培养。

3、采用流式细胞术检测EGFP基因的表达情况，如图3所示，结果显示用pMini-CCS-RAB11a-EGFP供体DNA模板在人原代T细胞中的基因插入效率大约为8-9％。

实施例3

一、CAR基因及同源臂基因的合成

以目前在临床上应用的治疗白血病的靶向CD19的CD19-CAR为例，CAR基因其氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，主要包括识别特异性肿瘤抗原CD19的ScFv，CD28的胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3ζ的胞内段。左侧同源臂基因序列如SEQ ID NO：24所示，右侧同源臂基因序列如SEQ ID NO：25所示。利用PCR合成CAR基因及同源臂基因片段，PCR合成正向引物如SEQ ID NO：26所示，反向引物如SEQ ID NO：27所示。

二、CAR基因及同源臂序列构建到pUC57/pMini/pMiniZ质粒载体上

1、将目的基因CAR和TCRα两侧的同源臂序列克隆到pUC57/pMini/pMiniZ质粒载体上，同源臂两侧的基因的长度为800bp。pUC57/pMini/pMiniZ质粒载体上含有KpnI和HindIII酶切位点，通过酶切切割pMini质粒载体，其中pMiniZ载体是将pMini质粒载体上的氨苄青霉素抗药性基因(AmpR)换成博来霉素抗药性基因(ZeocinR)pMiniZ的序列见SEQ IDNO：28。pUC57/pMini质粒载体上含有KpnI和HindIII酶切位点，通过酶切切割pMini质粒载体，通过PCR扩增目的基因和同源臂正向引物序列见SEQ ID NO：29，反向引物序列见SEQ IDNO：30，PCR回收后的片段用KpnI和HindIII酶切后，通过T4连接酶连接，构建后的质粒载体通过二代测序比对，确认序列正确。

2.将含有不同数目的guide RNA识别的DNA序列(CCS)的CAR及同源臂序列构建到pMini质粒载体上，其中没有CCS序列的正向引物如SEQ ID NO：31，反向引物为SEQ ID NO：32，含有一个CCS的正向引物见SEQ ID NO：29，反向引物见SEQ ID NO：32，通过T4连接酶连接，构建成功后的质粒载体通过二代测序比对，确认序列正确。

三、检测TCRα位点人原代T细胞中的基因插入效率

1、合成识别插入TCRα位点的guide RNA，TCRα位点的guide RNA的序列见SEQ IDNO：33，表达纯化蛋白，并分离人原代T细胞，电转等操作过程见实施例2和图1。

2、电转细胞培养7天后，流式检测pUC57-TRAC-CAR、pUC57-CCS-TRAC-CAR或pMini-TRAC-CAR、pMini-CCS-TRAC-CAR作为供体DNA模板的基因定点插入效率。TCR敲除和CAR基因插入比例，通过PE-mouse-anti-human CD3检测TCR的敲除效率，用2％mouse serum封闭后，通过Goat IgG-Alexa Fluor检测CAR基因的定点插入细胞的比例。如图4a,5a所示，纵坐标代表T细胞上CD3的表达情况，横坐标代表CAR的表达情况，结果显示，将pUC57-TRAC-CAR和pMini-TRAC-CAR质粒载体作为CRISPR-Cas9的模板能够有0-3％的插入效率，而将pUC57-CCS-TRAC-CAR和pMini-CCS-TRAC-CAR质粒载体作为CRISPR-Cas9的模板能够增加基因插入的效率大约4-8倍如图4和图5a,b所示，在不同的健康志愿者中，pMini-CCS-TRAC-CAR质粒载体作为CRISPR-Cas9的模板在不同人中的插入效率在大约10％-16.8％之间，见图5c。

3、为了进一步研究载体上的不同元件对目的基因插入效率的影响，本实施例对比了pUC57-CCS-TRAC-CAR，pMini-CCS-TRAC-CAR，pMiniZ-CCS-TRAC-CAR与RNP共电转到人原代T细胞中，7天后检测目的基因的插入效率，结果显示三种供体DNA模板的目的基因的插入效率相似，如图6所示。

4、把靶向CD22和CD19两个抗原的双特异性CAR构建到pMini载体上，利用CRISPR-Cas9系统电转到人原代T细胞，电转过程见实施例2，其中双靶标的CAR的长度大约2.2kb,双靶标CAR的序氨基酸序列见SEQ ID NO：34，比单特异性靶标的CAR(1.5kb)的长度多了大约45％，电转效率大约为7.7％，见图7。

5、3T3-CD19作为抗原靶标刺激CAR-T细胞富集，CAR-T细胞与3T3-CD19(APC)的比例大约为4：1，刺激一周后，CAR-T细胞的比例可以达到50％以上，如图8所示，并且临床上已有应用通过抗原刺激增殖后的CAR-T细胞的先例，本实施例可以通过APC刺激CAR-T细胞增殖，得到足够的CAR-T细胞应用于临床。

6、为了研究不同pMini-CCS-TRAC-CAR和RNP的比例对CAR基因插入效率的影响，本实施例主要探究了如图9所示的pMini-CCS-TRAC-CAR和RNP的比例，结果显示，不同比例的RNP和pMini-CCS-TRAC-CAR都可以使基因的插入效率达到10％左右，其中，180pmol RNP,25μg的质粒载体达到最大的插入效率，见图9a,b。

7、已有研究表明不同的Cas9进入细胞核内依赖于核定位信号(NLS)序列，在本实施例中Cas9-NLS蛋白有助于携带pMini-CCS-TRAC-CAR进入细胞核增加基因插入效率，所以本实施例探究了增加或者减少CCS位点或者增加Cas9蛋白上的核定位信号是否会影响基因插入效率，结果显示只有一个或者没有CCS，目的基因的插入效率大约只有0-3％，而有三个CCS位点与两个CCS位点相比，并没有增加目的基因的插入效率，见图10，而将NLS从2个增加到4个，CAR基因的插入效率并没有增高，见图11。

8、已有研究表明，不同同源臂长度也会影响基因插入的效率，故本实施例中构建了含有不同同源臂长度的pMini载体，结果表明100bp，300bp，500bp，800bp的同源臂长度都可以让目的基因的插入效率达到10％左右，其中800bp的同源臂长度基因插入效率较其他同源臂长度相对较高，见图12。

9、为了进一步探究跟细胞周期相关的小分子药物或者蛋白对T细胞基因插入效率的影响，本实施例中在RNP和pMini-CCS-TRAC-CAR载体共同电转到T细胞后，加入0.1μM的Brefeldin A，24小时后，换上不含Brefeldin A的培养基，6天后检测目的基因的插入效率，结果显示加入0.1μM Brefeldin A后，目的基因的插入效率有些许的降低，见图13a，而加入30ng/ml的纯化的CCND1蛋白后，目的基因的插入效率比不加CCND1的增加了大约15-20％，如图13b所示。

10、已有研究报道，带甲基硫代磷酸修饰的guide RNA能够增加人原代T细胞的敲除效率，本实施例中以上的结果用的guide RNA都是用的带甲基硫代磷酸修饰的guideRNA，为了节约成本，本实施例也检测不带修饰的guide RNA对目的基因插入效率的影响，结果显示，不带修饰的guide RNA比带修饰的guide RNA的插入效率大约低了15％左右，如图14所示。因此，在未来临床研究中，也可以用不带修饰guide RNA作为目的基因插入的原料。

11、本实施案例中通过本发明质粒载体作为CRISPR-Cas9切割后HDR的模板产生的CAR-T细胞命名为p-TRAC-CAR T细胞，传统的腺相关病毒作为CRISPR-Cas9切割后HDR的模板产生的CAR-T细胞命名为AAV-TRAC-CAR T细胞，对比两种CAR-T细胞的增殖能力，结果如图15a所示，p-TRAC-CAR T细胞在前3天的增殖能力比AAV-TRAC-CAR T细胞相对较弱，但在12天左右几乎与AAV-TRAC-CAR T细胞相同。

12、两种CAR-T细胞在遇到肿瘤抗原3T3-CD19细胞系时的增殖能力检测。在24孔板里铺上3T3-CD19细胞，用DMEM培养基培养过夜后，将表达CAR的T细胞调成CAR⁺细胞为1million/ml，用3T3-CD19细胞刺激CAR-T细胞增殖，检测两种方法产生的CAR-T细胞的增殖能力，如图15b所示，p-TRAC-CAR T细胞在遇到肿瘤抗原在起始时的增殖能力弱于AAV-TRAC-CAR T细胞，但是在经过5-6周刺激后，p-TRAC-CAR T细胞的增殖数量与AAV-TRAC-CART细胞基本一致。

13、两种CAR-T细胞在遇到靶标白血病肿瘤细胞系NALM6-EGFP-Luciferase时的杀伤能力检测。在每个96孔圆形细胞培养板里放10000个NALM6-EGFP-Luciferase肿瘤细胞，CAR-T细胞按Effector：Target比例为2:1，1:1，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32加入，每组设三个重复，每个体积大约为100μl，共培养18小时后，加入荧光素底物，用酶标仪测量荧光素的发光情况，通过荧光素的发光情况计算p-TRAC-CAR T细胞和AAV-TRAC-CAR T细胞的杀伤能力。如图15c所示，p-TRAC-CAR T细胞的杀伤能力与AAV-TRAC-CAR T细胞的杀伤能力没有统计学差异。

14、通过质谱流式检测两种CAR-T细胞在经过抗原刺激前后40种标志物的变化，通过t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding(t-SNE)分析发现在抗原刺激前后p-TRAC-CAR T与AAV-TRAC-CAR T细胞具有相似的集群模式，见图16。其中，跟T细胞激活相关的标志物CD25和CD69，跟分化相关的标志物如CD45RA、CD45RO、CCR7，颗粒酶B(GZMB)，耗竭的标志物PD-1、LAG-3、TIM3的表达量在两种CAR-T细胞接受抗原刺激前后的表达量也基本一致，见图17。

15、p-TRAC-CAR与AAV-TRAC-CAR T细胞在白血病小鼠动物模型中的抗肿瘤能力检测。用NSG小鼠作为实验研究的动物模型，将6-8周的雌性或雄性NSG小鼠进行尾静脉注射50万个NALM6-EGFP-Luciferase肿瘤细胞，3-5天后注射10万个p-TRAC-CAR T细胞或AAV-TRAC-CAR T细胞，然后对小鼠进行活体成像，检测CAR-T细胞对小鼠体内肿瘤的杀伤能力，结果如图18a所示，小鼠的长期生存曲线如图18b所示，结果表明p-TRAC-CAR T细胞与AAV-TRAC-CAR T细胞在白血病小鼠模型体内的抗肿瘤能力没有统计学差异。

实施例4

合成识别插入TCRα位点的Cpf1的crRNA序列，表达纯化蛋白Cpf1，并分离人原代T细胞，分别将AsCpf1-RNP或LbCpf1-RNP电转人原代T细胞，AsCpf1-RNP和LbCpf1-RNP的比例为180pmol crRNA与30pmol的AsCpf1/LbCpf1蛋白，三天后检测TCR的敲除效率，如图19所示，结果显示AsCpf1的敲除效率优于LbCpf1的敲除效率，检测AsCpf1-RNP与pMini-CCS-TRAC-CAR供体DNA模板一起电转后的CAR的插入效率，结果如图20所示，CAR基因的插入效率大约为3.5％。

实施例5

将pMini-CCS-RAB11a-EGFP作为CRISPR-Cas9系统切割后HDR的模板，定点插入EGFP到人原代NK细胞的RAB11a位点。

一、人原代NK细胞的分离和培养

NK细胞无血清培养液配：KBM581培养液+自体血浆(后加)+IL-2(200μ/ml)+庆大霉素(80U/ml)。PBMC(20-30×10⁶)+NK细胞无血清培养液(30ml)+自体血浆(1.5ml)+K562滋养细胞(37℃复苏后PBS清洗一次，350g离心5min，用培养液重悬加入培养瓶)，在75cm²培养瓶中混合，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养3天后离心换液，离心后的细胞沉淀+NK细胞无血清培养液(30ml)+自体血浆(1.5ml)。培养7天后，加液使NK细胞浓度在0.8-1.0×10⁶Cell/ml，血浆按1％添加。11-12天检测NK细胞的富集情况，NK细胞上CD56阳性表达，CD3阴性表达，如图21所示。

二、电转培养11-12天的人原代NK细胞系

将guide RNA和Cas9蛋白体外结合成RNP后，再与pMini-CCS-RAB11a-EGFP质粒载体混合后，最后与人原代NK细胞混合，电转，将EGFP基因定点整合到细胞中。如图22所示，pMini-CCS-RAB11a-EGFP作为CRISPR-Cas9目的基因质粒载体。在人原代NK细胞中的插入效率为3.6％左右。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataaacaaat aggggttccg cgggtaccgc caagcttgtt tttccatagg ctccgcc 57

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcactgatt aagcattggt aagtagaaaa gatcaaagga tcttcc 46

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttaccaatg cttaatcagt gag 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggaaccc ctatttgttt att 23

<210> 5

<211> 1579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420

taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 600

gatcttttct acgttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 660

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 720

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 780

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 840

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 900

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 960

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 1020

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 1080

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 1140

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 1200

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 1260

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 1320

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 1380

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 1440

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 1500

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 1560

aacaaatagg ggttccgcg 1579

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgcgacgac gagtacgact accaagcttg gcgtaatcat ggtcatag 48

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgcgacgac gagtacgact accggtacca ctggccgtcg ttttac 46

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtagtcgta ctcgtcgtcg cggggtagct aggagttcca ggac 44

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtagtcgta ctcgtcgtcg cggacgatgt gggagaaggc agtc 44

<210> 10

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 60

gtaaacggcc acaagttcag cgtgcgcggc gagggcgagg gcgatgccac caacggcaag 120

ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 180

accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcgccac 240

gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cagcttcaag 300

gacgacggca cctacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 360

cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 420

gagtacaact tcaacagcca caacgtctat atcaccgccg acaagcagaa gaacggcatc 480

aaggccaact tcaagatccg ccacaacgtg gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 540

taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 600

agcacccagt ccgtgctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 660

gagttcgtga ccgccgccgg gatcact 687

<210> 11

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtagctagg agttccagga ctcagtttcc cctttgagcc tcctttagcg actaaagctt 60

gaagccccac gcatctcgac tctcgcgcac accgcccttg ttgggctcag gggcggggcg 120

ccgcccccgg aagtacttcc ccttaaaggc tggggcctgc cggaaatggc gcagcggcag 180

ggaggggctc ttcacccagt ccggcagttg aagctcggcg ctcgggttac ccctgcagcg 240

acgccccctg gtcccacaga taccactgct gctcccgccc tttcgctcct cggccgcgca 300

atgggc 306

<210> 12

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcgacgacg agtacgacta cctctttaaa ggtgaggcca tgggctctcg cactctacac 60

agtcctcgtt cggggacccg ggccactccc ggtggaccct cgtgccggcc acccctgcac 120

tgatataggc ctccctcagc ccttcctttt tgtgcggttc cgtctcctac ccagctcagc 180

ctcttctccc ccgctcagac aggggtcccc atcacatgcc gctctctgag cgacctctcc 240

ataggccttc gctggcctca gagcccctcc ctgcgtgtcc ttcccctggc ggactgcctt 300

ctcccacatc gt 312

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtagtcgta ctcgtcgtc 19

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 40

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atttctagct ctaaaacggt gtttcgtcct ttccaca 37

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccatgggcag caagctggag aagtttacaa 30

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcgtggccg ccggcctttt ggtgcttcac gctggtctgg gcgt 44

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tccacggagt cccagcagcc atgacacagg gcttta 36

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttcgtggccg ccggcctttt gttgcgcagc tcctggatgt a 41

<210> 20

<211> 1400

<212> PRT

<213> Bacillus coli

<400> 20

Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala

1 5 10 15

Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

20 25 30

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

35 40 45

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

50 55 60

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

65 70 75 80

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

85 90 95

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

100 105 110

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

115 120 125

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

130 135 140

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

145 150 155 160

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

165 170 175

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

180 185 190

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

195 200 205

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

210 215 220

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

245 250 255

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

260 265 270

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

275 280 285

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

290 295 300

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

305 310 315 320

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

325 330 335

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

355 360 365

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

370 375 380

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

385 390 395 400

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

405 410 415

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

420 425 430

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

435 440 445

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

450 455 460

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

465 470 475 480

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

485 490 495

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

500 505 510

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

515 520 525

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

530 535 540

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

545 550 555 560

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

565 570 575

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

580 585 590

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

595 600 605

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

610 615 620

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

625 630 635 640

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

645 650 655

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

660 665 670

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

675 680 685

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

690 695 700

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

705 710 715 720

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

725 730 735

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

740 745 750

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

755 760 765

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

770 775 780

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

785 790 795 800

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

805 810 815

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

820 825 830

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

835 840 845

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

850 855 860

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

865 870 875 880

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

885 890 895

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

900 905 910

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

915 920 925

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

930 935 940

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

945 950 955 960

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

965 970 975

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

980 985 990

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

995 1000 1005

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

1010 1015 1020

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1025 1030 1035 1040

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1045 1050 1055

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1060 1065 1070

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1075 1080 1085

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1090 1095 1100

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1105 1110 1115 1120

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1125 1130 1135

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1140 1145 1150

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1155 1160 1165

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1170 1175 1180

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1185 1190 1195 1200

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1205 1210 1215

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1220 1225 1230

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1235 1240 1245

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1250 1255 1260

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1265 1270 1275 1280

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1285 1290 1295

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1300 1305 1310

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1315 1320 1325

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1330 1335 1340

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1345 1350 1355 1360

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1365 1370 1375

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys

1380 1385 1390

Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1395 1400

<210> 21

<211> 1227

<212> PRT

<213> Bacillus coli

<400> 21

Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu

1 5 10 15

Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp Asn

20 25 30

Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys Gly

35 40 45

Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp Val

50 55 60

Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu Phe

65 70 75 80

Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Leu

85 90 95

Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn Glu

100 105 110

Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu Pro

115 120 125

Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe Asn

130 135 140

Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn Met

145 150 155 160

Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile Asn

165 170 175

Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys Val

180 185 190

Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys Ile

195 200 205

Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe Phe

210 215 220

Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile Ile

225 230 235 240

Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu

245 250 255

Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys Phe

260 265 270

Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser Phe

275 280 285

Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe Arg

290 295 300

Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys Leu

305 310 315 320

Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile Phe

325 330 335

Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe Gly

340 345 350

Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp Ile

355 360 365

His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp Arg

370 375 380

Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu Gln

385 390 395 400

Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu Ile

405 410 415

Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser Glu

420 425 430

Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Asn

435 440 445

Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys Ser

450 455 460

Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr Asn

465 470 475 480

Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile Leu

485 490 495

Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr Gln

500 505 510

Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro Gln

515 520 525

Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala Thr

530 535 540

Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys Lys

545 550 555 560

Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly Asn

565 570 575

Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Leu

580 585 590

Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser

595 600 605

Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly Asp

610 615 620

Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys Asp

625 630 635 640

Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn Phe

645 650 655

Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu Val

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Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys Glu

675 680 685

Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile Tyr

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Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His Thr

705 710 715 720

Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile Arg

725 730 735

Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys Lys

740 745 750

Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys Asn

755 760 765

Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr Lys

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Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile Ala

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Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val Arg

805 810 815

Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp Arg

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Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly Asn

835 840 845

Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn Gly

850 855 860

Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu Lys

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Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile Lys

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Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys Glu

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Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn Ser

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995 1000 1005

Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp Ser Lys

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Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser Arg Thr Asp Ala

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Asn Ile Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys Ala

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Glu Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu

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<210> 22

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<212> PRT

<213> Bacillus coli

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385 390 395 400

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Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser

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Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr

675 680 685

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Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu

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755 760 765

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Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His

785 790 795 800

Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr

805 810 815

Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His

820 825 830

Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn

835 840 845

Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe

850 855 860

Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln

865 870 875 880

Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu

885 890 895

Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg

900 905 910

Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu

915 920 925

Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu

930 935 940

Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val

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Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val

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Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln

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His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro

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Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr

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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

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Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val

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Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr

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Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro

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Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val

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Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys

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Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

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Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

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<210> 24

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<212> DNA

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<400> 24

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tgccactcaa ggaaacctga aatgcagggc tacttaataa tactgcttat tcttttattt 300

aataggatct tcttcaaaac cccagcaata taactctggc agagtaaagg caggcatggg 360

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gctgggcatt agcagaatgg gaggtttatg gtatgttggc attaagttgg gaaatctatc 480

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<210> 26

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<212> DNA

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<400> 26

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<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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gtcggtccag aactcgaccg ctccggcgac gtcgcgcgcg gtgagcaccg gaacggcact 360

ggtcaacttg gccatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 420

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 480

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ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 600

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<210> 29

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<212> DNA

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<400> 29

agtggtaccc agggttctgg atatctgtgg gctgaagaat gagtctcagc ac 52

<210> 30

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gccaagcttc agggttctgg atatctgtgg gctcttctcc tttctcattg ag 52

<210> 31

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

agtggtaccc agggttctgg atatctgtgg gagagcaatc tcctggtaat g 51

<210> 32

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gccaagcttc agggttctgg atatctgtgg ggtgccctct cctgccacct tc 52

<210> 33

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

caggguucug gauaucugu 19

<210> 34

<211> 735

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

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1 5 10 15

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Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser

35 40 45

Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly

50 55 60

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Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

165 170 175

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu

260 265 270

Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile

275 280 285

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp

290 295 300

Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr

305 310 315 320

Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Gln Ala

325 330 335

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

340 345 350

Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met

405 410 415

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln

420 425 430

Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

435 440 445

Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro

450 455 460

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

485 490 495

Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

500 505 510

Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn

515 520 525

Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys

530 535 540

Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val

545 550 555 560

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

565 570 575

Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser

580 585 590

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His

595 600 605

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg

610 615 620

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

625 630 635 640

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

645 650 655

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

660 665 670

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

675 680 685

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

690 695 700

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

705 710 715 720

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

725 730 735

Claims

1.一种基于质粒DNA模板的目的基因定点插入方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、选取要定点插入目的基因的基因组位点，并根据位点以及所用基因编辑蛋白设计guide RNA；

步骤2、设计合成质粒供体DNA模板，质粒供体DNA模板包括质粒序列、构建于质粒上的需要导入的目的基因、靶序列上下游的同源臂和guide RNA识别的DNA序列；

步骤4、将步骤3中的guide RNA和基因编辑蛋白体外结合后，再与步骤2中带有目的基因和同源臂以及识别位点的质粒载体混合，最后与原代T细胞或原代NK细胞混合，电转。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒为pUC57、pUC57截短突变质粒pMini以及pMiniZ，pMini的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，pMiniZ的核苷酸序列如SEQ IDNO：28所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，目的基因的每一侧均具有一个同源性序列和guide RNA识别的DNA序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基因编辑蛋白为SpCas9或LbCpf1或AsCpf1。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2中同源臂大小为100-800bp。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4中guide RNA和Cas9/Cpf1蛋白在体外室温或37℃结合10-20min。

7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4中的电转采用Celetrix或BTX电转系统。