CN107002070A - 共表达质粒 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供在实体肿瘤组织、缺血性疾病部位等厌氧性部位中治疗效果更高的厌氧性肠道细菌。用含有2种分泌表达盒而进行2种异种多肽的共表达的质粒转化后的双歧杆菌细菌高效地将2种具有抗癌作用的抗体等异种多肽分泌到菌体外，其中，所述分泌表达盒依次含有在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA、编码分泌信号肽的DNA、编码异种多肽的DNA和在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA。

Description

共表达质粒
技术领域
本发明涉及一种共表达质粒，其特征在于，含有2种分泌表达盒，所述分泌表达盒依次含有在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA、编码分泌信号肽的DNA、编码异种多肽的DNA和在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA。此外，本发明涉及用上述共表达质粒转化后的双歧杆菌属细菌、含有该细菌的药物组合物等。
背景技术
对于癌等疾病，截至目前已经提出了数量繁多的治疗药，但所有的治疗药均被指出其效果有限，期望着可期待更高效果的治疗药、治疗方法的开发。近年，使用基因输送载体的治疗方法的开发取得进展。例如，关于厌氧性肠道细菌，提出了一种转化微生物，可以利用其的在全身给药后蓄积在低氧的实体肿瘤中的性质在目标患处表达具有抗肿瘤活性的蛋白质的基因、或表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的基因(参考例如专利文献1)等，作为能够将全身给药时难免产生副作用的药剂高浓度且有效地递送到肿瘤局部的新技术，其发展备受期待。
此外，提出了含有启动子、编码信号序列的DNA、编码多肽的DNA、或用于插入这些DNA的克隆位点的表达盒(参考例如专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2009/128272号小册子
专利文献2:国际公开WO2010/126073号小册子
发明内容
上述文献中提出的编码信号序列的DNA为在膜蛋白、分泌蛋白中发现的信号序列，期待确定一种分泌效率更优异的信号序列，并且期望开发出治疗效果更高的异种蛋白分泌表达质粒、和用该分泌表达质粒转化后的厌氧性肠道细菌。
本发明的课题在于，提供一种在实体肿瘤组织、缺血性疾病部位等厌氧性部位中治疗效果更高的厌氧性肠道细菌。
用于解决课题的手段
本发明人们已确认：用特征在于含有2种分泌表达盒的、进行2种异种多肽的共表达的质粒转化后的双歧杆菌属细菌与异种多肽的单独表达株相比，具有显著高的癌细胞增殖抑制活性，所述分泌表达盒依次含有在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA、编码分泌信号肽的DNA、编码异种多肽的DNA和在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA，至此完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种共表达质粒，其特征在于，其含有2种分泌表达盒，所述分泌表达盒依次含有在双歧杆菌属细菌中进行表达的、以下的(1)～(4)的DNA：
(1)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA；
(2)编码分泌信号肽的DNA；
(3)编码异种多肽的DNA；
(4)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA。
[2]根据上述[1]所述的共表达质粒，其特征在于，在编码分泌信号肽的DNA的下游连接有编码接头肽的DNA。
[3]根据上述[1]或[2]所述的共表达质粒，其特征在于，在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子为选自P30启动子、P54启动子及Hu启动子中的1种或2种启动子。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子为选自Hu终止子及T2终止子中的1种或2种终止子。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，分泌信号肽具有以下的a)或b)的氨基酸序列：
a)序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列；
b)序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列中缺失、替换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且由该氨基酸序列构成的肽在双歧杆菌属细菌中作为分泌信号肽发挥作用的氨基酸序列；
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为单链抗体。
[7]根据上述[6]所述的共表达质粒，其特征在于，单链抗体为抗PD－1抗体。
[8]根据上述[6]所述的共表达质粒，其特征在于，单链抗体为抗CTLA－4抗体。
[9]根据上述[6]所述的共表达质粒，其特征在于，单链抗体为抗HER2抗体。
[10]根据上述[1]～[5]中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为细胞因子。
[11]根据上述[10]所述的共表达质粒，其特征在于，细胞因子为TNF－α。
[12]根据上述[10]所述的共表达质粒，其特征在于，细胞因子为IFN－γ。
[13]根据上述[1]～[5]中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为抗PD－1抗体与抗CTLA－4抗体的组合。
[14]根据上述[1]～[5]中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为TNF－α与IFN－γ的组合。
[15]根据上述[1]～[5]中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为抗HER2抗体与IFN－γ的组合。
[16]一种双歧杆菌属细菌，其通过上述[1]～[15]中任一项所述的共表达质粒进行了转化。
[17]根据上述[16]所述的双歧杆菌属细菌，其为长双歧杆菌。
[18]一种药物组合物，其含有上述[16]或[17]所述的双歧杆菌属细菌。
发明效果
根据本发明，通过在同一质粒中并用2种异种多肽的分泌优异的表达盒，从而可以提供可高效地将2种异种多肽分泌到菌体外的双歧杆菌属细菌，在上述2种异种多肽为抗PD－1抗体、抗CTLA－4抗体等具有抗癌作用的抗体等的情况下，由于2种异种多肽的协同效果，从而该双歧杆菌属细菌作为抗癌剂是非常有用的。
附图说明
图1为示出质粒pSP3B-TNFα的结构的图。
图2为示出质粒pHG-2的结构的图。
图3为示出质粒pTNF11的结构的图。
图4：(a)为示出质粒phIFNg33的结构的图，(b)为示出质粒phIFNg33TL的结构的图。
图5为示出AG8TL株培养上清粗纯化物对KPL－1细胞的细胞增殖抑制活性的图表。
图6为示出AG8TL株培养上清粗纯化物对MIA PaCa－2细胞的细胞增殖抑制活性的图表。
图7为研究AG8TL株的培养上清粗纯化物的细胞增殖抑制活性的、通过添加中和抗体而产生的中和效果的图表。
图8：(A)为示出质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03的结构的图，(B)为示出pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02的结构的图，(C)为示出pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG的结构的图。
图9：(a)为示出质粒pPC1的结构的图，(b)为示出质粒pCP1的结构的图。
图10：(A)为示出抗hPD－1scFv的表达确认的图，(B)为示出抗hCTLA－4scFv的表达确认的图。
图11为示出抗hPD－1scFv03与人PD－1固定化板的特异性结合的图表。
图12为示出抗hCTLA－4scFv02与人CTLA－4固定化板的特异性结合的图表。
图13为示出在人PD－L1与人PD－1的结合反应中、抗hPD－1scFv03的竞争性结合抑制的图表。
图14为示出在人CD80与人CTLA－4的结合反应中、抗hCTLA－4scFv02的竞争性结合抑制的图表。
图15为示出在人CD86与人CTLA－4的结合反应中、抗hCTLA－4scFv02的竞争性结合抑制的图表。
图16为示出由PC1株纯化出的抗hPD－1scFv03与人PD－1过表达细胞的结合的图表。
图17为示出由PC1株纯化出的抗hCTLA－4scFv02与人CTLA－4过表达细胞的结合的图表。
图18为示出通过蛋白印迹解析来确认HG－2株中的抗HER2scFv及hIFN－γ的分泌的图。
图19为示出HG－2株培养上清浓缩物中的抗HER2scFv的HER2阳性细胞增殖抑制活性的图表。
图20为示出HG－2株培养上清浓缩物对HER2阳性细胞的细胞增殖抑制活性的图表。
图21：(A)示出HG－2株的革兰氏染色图，(B)示出BE穿梭菌株的革兰氏染色图。
图22：(A)示出HG－2株的利用抗hIFN－γ抗体进行的免疫组织染色图，(B)示出BE穿梭菌株的利用抗hIFN－γ抗体进行的免疫组织染色图。
图23：(A)示出HG－2株的利用抗组氨酸标签抗体进行的免疫组织染色图，(B)示出BE穿梭菌株的利用抗组氨酸标签抗体的免疫组织染色图。
图24为示出共表达质粒pPC2－pPC8的结构的概要的图。
图25为示出共表达质粒pPC2－pPC8的构建方法的概要的图。
图26为示出抗人CTLA－4scFv02表达质粒的构建方法的概要的图。
图27为示出pP30SPxLy－hCTLA－4scFv01－His的构建方法的概要的图。
图28为示出pP30SPxLy－hCTLA－4scFv01－FLAG(pC1F－pC3F)的构建方法的概要的图。
图29为示出共表达质粒pPC2TL－pPC8TL的结构的概要的图。
图30为示出共表达质粒pPC2TL－pPC8TL的构建方法的概要的图。
图31为示出通过蛋白印迹解析来确认各株中的抗hPD－1scFv03－His(a)及抗hCTLA－4scFv01－FLAG(b)的分泌的图。
图32为示出抗hCTLA－4scFv01单独表达株(pC1TLB、pC2TLB、pC3TLB)的构建方法的概要的图。
图33为用流式细胞术来解析来自C1F株、C2F株及C3F株的scFv与人CTLA－4表达细胞的结合的图。
图34为用流式细胞术来解析来自C1TLB株、C2TLB株及C3TLB株的scFv与人CTLA－4表达细胞的结合的图。
图35为用流式细胞术来解析来自P1H株、P2H株及P3H株的scFv与人PD－1表达细胞的结合的图。
图36为用流式细胞术来解析来自P1TL株、P2TL株及P3TL株的scFv与人PD－1表达细胞的结合的图。
图37：(a)为用流式细胞术来解析抗人PD－1抗体(EH12.2H7)与人PD－1表达细胞的结合的图，(b)为用流式细胞术来解析抗人CTLA－4抗体(L3D10)与人CTLA－4表达细胞的结合的图，(c)为用流式细胞术来解析来自PC4的scFv与人PD－1表达细胞的结合的图，(d)为用流式细胞术来解析来自PC4的scFv与人CTLA－4表达细胞的结合的图。
图38为示出hPD－L1对由PC4株纯化出的hPD－1scFv03－His与hPD－1的结合的结合抑制活性的图表。
图39为示出hCD80对由PC4株纯化出的hCTLA－4scFv01－FLAG与hCTLA－4的结合的结合抑制活性的图表。
图40为示出hCD86对由PC4株纯化出的hCTLA－4scFv01－FLAG与hCTLA－4的结合的结合抑制活性的图表。
具体实施方式
作为本发明的共表达质粒，只要含有2种分泌表达盒且所述分泌表达盒依次含有(1)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA、(2)编码分泌信号肽的DNA、(3)编码异种多肽的DNA、和(4)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA的各DNA、并且在转化到双歧杆菌属细菌中时可进行2种异种多肽的共表达，则没有特别限制，只要能够得到本发明的效果，则上述各DNA片段的3’末端和其下游的各DNA的5’末端也可以不直接连接，但优选直接进行连接。
作为本发明中的启动子DNA，只要为在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA则没有特别限制，可以例示出：来自长双歧杆菌的作为编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的表达相关启动子的Hu启动子DNA；P30启动子DNA(J.Microbiology,2012,638-643)；作为编码延伸因子Tu蛋白的基因的表达相关启动子的P54启动子DNA(J.Bacteriology,2005,5799-5808、J.Microbiology,2012,638-643)；来自短双歧杆菌的Gap基因的启动子DNA(Biotechnol.Lett.2008 30:1983-1988)；来自长双歧杆菌AmyB基因的启动子DNA(Biotechnol.Lett.2006 28:163-168)；16SrRNA启动子DNA(Biotechnol.Lett.2008 30:165-172)；GAPDH(pr－BL1363)基因的启动子DNA(Appl Environ Microbiol.2006 72(11):7401-7405)；PRPL启动子DNA(Cancer Gene Ther.2007 14:151-157)；p572(β-glycosidasefrom B.animalis subsp lactis)基因的启动子DNA(J.Microbiol Biotechnol.2012Dec；22(12):1714-23)；p919基因的启动子(rplM promoter)DNA(J Microbiol.2012 Aug；50(4):638-43)；p895基因的启动子(rplR promoter)DNA(J.Microbiology,2012,638-643)。此外，优选在每个上述异种多肽的分泌优异的表达盒中启动子不同，具体地，可以列举Hu启动子DNA与P30启动子DNA、Hu启动子DNA与P54启动子DNA、P54启动子DNA与P30启动子DNA的组合。
作为本发明中的分泌信号肽，可以列举：a)由序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列构成的肽，即分别可以列举SP7、SP45、SP50、SP52、SP55、SP58、SP64、SP66、SP67、SP68及SP69，其中，可以优选列举序列号56所示的SP7、序列号66所示的SP69。此外，可以列举：b)由在序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列中缺失、替换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的肽，并且该肽在双歧杆菌属细菌中作为分泌信号肽发挥作用(变异分泌信号肽)。上述“缺失、替换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失、替换或附加例如1～5个、优选为1～3个、更优选为1～2个、进一步优选为1个氨基酸的氨基酸序列，作为上述变异分泌信号肽的氨基酸序列，优选与序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77所示的氨基酸序列中的任一序列的同源性为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上。
作为编码由上述a)所示的氨基酸序列构成的分泌信号肽的DNA，只要为具有对应于上述a)所示的氨基酸序列的碱基序列的DNA则没有特别限制，因此也包含由于密码子的简并而不同的DNA，可以列举例如：由序列号56、58、60、62、64、66、68、70、72、74及76中的任一者所示的碱基序列(序列表上段)构成的DNA，这些DNA可以通过化学合成、基因工序方法等本领域技术人员已知的方法来制作。
作为编码由上述b)所示的氨基酸序列构成的分泌信号肽的DNA，只要为具有对应于上述b)所示的氨基酸序列的碱基序列的DNA则没有特别限制，因此也包含由于密码子的简并而不同的DNA，这些DNA也可以通过化学合成、基因工序方法、突变诱导等本领域技术人员已知的方法来制作。例如，对由序列号56、58、60、62、64、66、68、70、72、74及76中的任一者所示的碱基序列构成的DNA，使用与作为突变原的药剂接触作用的方法、照射紫外线的方法、基因工序方法等向这些DNA中导入变异，从而可以取得变异DNA。作为基因工序方法之一的定点诱变法为可以向特定位置导入特定变异的方法，因此是有用的，可以基于MolecularCloning:A laboratory Manual、2nd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold SpringHarbor、NY.、1989.、Current Protocols in Molecular Biology、Supplement 1～38、JohnWiley&Sons(1987-1997)等中记载的方法来进行。
从异种多肽的表达·分泌效率的观点出发，上述分泌信号肽优选以与连接肽连接的信号肽-接头连接体形式来使用。作为该接头肽，只要为连接在本发明中的上述分泌信号肽的C末端使用、可以提高异种多肽的表达·分泌效率的肽则没有特别限制，可以优选列举由0～30个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽，具体地，对于连接在由长双歧杆菌105－A株鉴定出的上述各分泌信号肽之后的以下所示的11种氨基酸序列，可以列举由各序列的第0位～第30位中的任一个为止的氨基酸序列构成的接头肽。
1)序列号79所示的接头肽序列(SP7的下游)；
2)序列号81所示的接头肽序列(SP45的下游)；
3)序列号83所示的接头肽序列(SP50的下游)；
4)序列号85所示的接头肽序列(SP52的下游)；
5)序列号87所示的接头肽序列(SP55的下游)；
6)序列号89所示的接头肽序列(SP58的下游)；
7)序列号91所示的接头肽序列(SP64的下游)；
8)序列号93所示的接头肽序列(SP66的下游)；
9)序列号95所示的接头肽序列(SP67的下游)；
10)序列号97所示的接头肽序列(SP68的下游)；
11)序列号99所示的接头肽序列(SP69的下游)；
作为上述接头肽的氨基酸残基数，可以列举0～30个残基，优选0～25个残基，更优选0～20个残基，进一步优选0～15个残基，进一步优选0～10个残基，特别优选1～10个残基。
此外，作为编码由从各序列的第0位～第30位中的任一个为止的氨基酸序列构成的接头肽的DNA序列，可以例示出以下的序列。
1)序列号78所示的DNA序列(SP7的下游)；
2)序列号80所示的DNA序列(SP45的下游)；
3)序列号82所示的DNA序列(SP50的下游)；
4)序列号84所示的DNA序列(SP52的下游)；
5)序列号86所示的DNA序列(SP55的下游)；
6)序列号88所示的DNA序列(SP58的下游)；
7)序列号90所示的DNA序列(SP64的下游)；
8)序列号92所示的DNA序列(SP66的下游)；
9)序列号94所示的DNA序列(SP67的下游)；
10)序列号96所示的DNA序列(SP68的下游)；
11)序列号98所示的DNA序列(SP69的下游)；
作为编码本发明的分泌信号肽－接头肽连接体的DNA区域，是指包含从编码上述各分泌信号肽的DNA的5’末端起、至编码位于各分泌信号肽的下游的上述接头肽的DNA的3’末端为止的DNA区域，由于编码分泌信号肽的DNA的3’末端和编码接头肽的DNA的5’末端是连接的，因此有时称为SPxLy(其中，x为分泌信号肽在本说明书中的序号，y为接头肽的氨基酸残基数)。具体地，可以列举SP7L20、SP45L20、SP50L20、SP52L20、SP55L20、SP58L20、SP64L20、SP66L20、SP67L20、SP68L20、SP69L20等。例如，SP67L20表示在序列号73的氨基酸序列上结合有序列号95的最初的20个氨基酸序列的分泌信号肽－接头肽连接体。其中，优选SP50L1～L15、SP67L1～L15、SP68L1～L15、SP69L1～L15，优选SP50L1～L10、SP67L1～L10、SP68L1～L10、SP69L1～L10，特别优选SP50L5、SP67L1、SP67L10、SP68L1、SP69L1。需要说明的是，上述L1～L15表示L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15，L1～L10表示L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10。
作为编码上述异种多肽的DNA，只要是可以在本发明的分泌表达盒中表达的、来自于双歧杆菌属细菌以外的多肽则没有特别限制，可以列举：编码干扰素(IFN)－α、β、γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)、白介素(IL)－1α、IL－1β、IL－2、IL－3、IL－4、IL－6、IL－7、IL－10、IL－12、IL－13、IL－15、IL－18、IL－21、IL－22、IL－27、肿瘤坏死因子(TNF)－α、淋巴毒素(LT)－β、粒细胞集落刺激因子(G－CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M－CSF)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)等细胞因子的DNA；编码内皮抑素、血管抑素、Kringle(NH4)等血管新生抑制物质的DNA，除此以外还可以优选列举：编码将作为5－氟尿嘧啶的前药的5－氟胞嘧啶变换为5－氟尿嘧啶的酶、即胞嘧啶脱氨酶的DNA；作为将具有硝基芳香骨架的抗癌剂前药的硝基还原、活化的酶的硝基还原酶DNA等。此外，还可以有效地使用编码抗体多肽的DNA。为了多肽的分离处理等的方便，还可以在该编码异种多肽的DNA中适当附加编码组氨酸(His)标签、FLAG标签等亲和标签的DNA。
作为上述抗体，可以例示出：以白介素－6(IL－6)受体为靶分子的风湿治疗药中使用的抗体；以α4－整联蛋白为靶分子的多发性硬化症治疗药中使用的抗体；以CD20、CD33、PD－1、CTLA－4、PD－L1、CD80、CD86、LAG3、TIM3、KIR为靶标的具有抗癌作用的抗体；OX40、CD137、ICOS等拮抗剂抗体；与HER2、EGFR、CEA、HGF、EpCAM(CD326)、cMET、CCR4特异性结合的抗体等。
其中，抗PD－1抗体通过与活化的淋巴细胞(T细胞、B细胞)中表达的PD－1受体结合来抑制癌细胞所表达的PD－L1、PD－L2与PD－1受体结合，结果与肿瘤细胞的免疫反应得到增强，因此可以优选例示出来。此外，抗CTLA－4抗体通过抑制作为自身免疫功能的抑制分子而已知的CTLA－4的功能来增强抗肿瘤免疫应答。即，可以认为：抗CTLA－4抗体通过抑制CTLA－4与抗原提呈细胞中表达的CD80、CD86的结合来抑制由这些分子的相互作用诱发的免疫应答的负的下调，从而来增强抗肿瘤免疫应答，因此可以优选例示出来。进而认为，抗HER－2(human EGFR－related2)抗体与作为癌基因HER2/neu(c－erbB－2)的基因产物的HER2蛋白质特异性结合并抑制其增殖信号，从而发挥抗肿瘤效果，因此可以优选例示出来。
作为编码上述抗体多肽的DNA，可以列举出编码嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv：single chain Fv)等的DNA，优选编码可以通过其自身识别·结合靶物质、分子量不过高、导入到至双歧杆菌属细菌中时也可以表达的单链抗体的DNA。就编码包含这些抗体在内的异种多肽的DNA而言，还可以从公知的文献、GenBank等的数据库适当获取其序列信息，通过化学合成、基因工序方法等公知的方法来制作。
作为本发明中的2种上述异种多肽的组合，优选对生物体进行双歧杆菌属细菌的全身给药时、在正常组织中不增殖且选择性分布·定植在实体肿瘤组织、缺血性疾病部位等厌氧性部位而在厌氧性疾病部位局部性共表达时，可期待协同的并用效果的组合，具体地，可以列举：TNF－α与IFN－γ的组合；抗PD－1抗体与抗CTLA－4抗体的组合；抗HER2抗体与IFN－γ的组合；抗PD－1抗体与IFN－γ的组合；抗PD－1抗体与抗HER2抗体的组合；抗PD－1抗体与抗EpCAM抗体的组合。
作为上述终止子DNA，只要为在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA则没有特别限制，具体地，可以列举：来自长双歧杆菌的Hu终止子DNA；来自长双歧杆菌的作为乳酸脱氢酶基因的终止子的d0013终止子DNA；来自动物型双歧杆菌的T572终止子DNA(J.Microbiol Biotechnol.2012Dec；22(12):1714-23)、以及作为人工设计的终止子的BBa＿B0015(T2)终止子)DNA。此外，优选在每个上述异种多肽的分泌优异的表达盒中终止子不同，具体地，可以列举：Hu终止子DNA与d0013终止子DNA、Hu终止子DNA与T572终止子DNA、Hu终止子DNA与T2终止子DNA、d0013终止子DNA与T572终止子DNA、d0013终止子DNA与T2终止子DNA、T572终止子DNA与T2终止子DNA的组合等。
作为本发明的分泌表达盒、优选含有编码接头肽的DNA的分泌表达盒的制作方法，可以列举如下方法：对于
(1)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA；
(2)编码由以下的a)或b)所示的氨基酸序列构成的分泌信号肽的DNA；
a)序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列；
b)序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列中缺失、替换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且由该氨基酸序列构成的肽在双歧杆菌属细菌中作为信号肽发挥作用的氨基酸序列；
(3)编码接头肽的DNA；
(4)编码异种多肽的DNA；
(5)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA；
的各DNA，按照以(1)为上游侧且以(5)为下游侧的方式将(1)～(5)的DNA依次包含连接，本发明的分泌表达盒的制作可以基于市售的实验书、例如基因手册(遺伝子マニュアル)讲谈社、高木康敬编基因操作实验法(遺伝子操作実験法)讲谈社、分子克隆(MolecularCloning)[Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]、分子克隆(Molecular Cloning)第2版[Cold Spring Harbor Laboratory(1989)]、Methods in Enzymology194(1991)、实验医学副刊·利用酵母的基因实验法(実験医学別冊·酵母による遺伝子実験法)、羊土社(1994)等中记载的方法来进行。
作为可以用于制作本发明的含有2种分泌表达盒的共表达质粒的质粒载体，只要是可以插入本发明的2种表达盒、在转化到双歧杆菌属细菌时可以分泌表达2种异种多肽的质粒载体则没有特别限制，还可以有效地使用进一步具有在双歧杆菌属细菌以外的菌、例如大肠杆菌中也发挥作用的pUCori等复制起点的穿梭质粒载体。
作为具有在双歧杆菌属细菌中发挥作用的质粒复制单元的质粒载体的具体例子，可以例示出：pTB6(Biosci Biotechnol Biochem.2005 Feb；69(2):422-5)；pMB1(LettAppl Microbiol.1990Oct；11(4):220-3)；pTB4(来自长双歧杆菌的质粒pTB4的结构解析和应用(Bifidobacterium longum由来のプラスミドpTB4の構造解析と応用)自由演讲题目海报展示大纲-日本分子生物学会、1994)；pFI2576(J Microbiol Biotechnol.2009Apr；19(4):403-8)、pCIBAO(Appl Environ Microbiol.2007 Dec；73(24):7858-66)；pBC1(Plasmid.2007Mar；57(2):165-74)；pDOJH10S(Appl Environ Microbiol.2006Jan；72(1):527-35)；PKJ50(Microbiology 1999 Mar；145(Pt):585-92)，作为复制单元，可以优选列举来自pTB6的由OriV区域及RepB基因构成的pTB6rep单元。还可以使用进一步具有在双歧杆菌属细菌以外的菌、例如大肠杆菌中分别发挥作用的pUCori等复制起点的穿梭质粒载体。
此外，上述质粒中还可以含有药物抗性等标记基因。作为该药物抗性标记基因，可以例示出：壮观霉素、氯霉素、红霉素、氨苄青霉素等的各抗性基因。
作为将本发明中的质粒导入到双歧杆菌属细菌中的方法，可以列举电穿孔法等公知的基因导入方法。
作为本发明中的双歧杆菌属细菌，可以例示出：长双歧杆菌、短双歧杆菌(B.breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophirum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、动物型双歧杆菌(B.animalis)、角双歧杆菌(B.angulatum)、星状双歧杆菌(B.asteroides)、波恩双歧杆菌(B.boum)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、小猪双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、兔双歧杆菌(B.cuniculi)、龋齿双歧杆菌(B.denticolens)、齿双歧杆菌(B.dentium)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)、鸡胚双歧杆菌(B.gallinarum)、球形双歧杆菌(B.globosum)、印度双歧杆菌(B.indicum)、异形双歧杆菌(B.inopinatum)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)、乳双歧杆菌(B.lactentis)、大双歧杆菌(B.magnum)、瘤胃双岐杆菌(B.merycicum)、最小双歧杆菌(B.minimum)、摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(B.MongoliaEnns)、双微小粒双歧杆菌(B.parvulorum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、噬冷双歧杆菌(B.psychraerophilum)、鸡双歧杆菌(B.pullorum)、栖瘤胃双歧杆菌(B.ruminale)、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)、沙库来双歧杆菌(B.saeculare)、史卡杜维双歧杆菌(B.scardovii)、沙布提双岐杆菌(B.subtile)、猪双歧杆菌(B.suis)、热嗜酸性双岐杆菌(B.thermacidophilum)等。其中，优选使用已知不分年龄地长存于人肠道内的长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌作为宿主细胞，更优选使用长双歧杆菌。这些菌均在市场上有售，或者能容易地从保藏机构等获取。
此外，对于各菌株也没有特别限定，例如，对于长双歧杆菌，可以列举：长双歧杆菌105－A株、长双歧杆菌aE－194b株、长双歧杆菌bs－601株、长双歧杆菌M101－2株、长双歧杆菌ATCC－15707株，其中优选长双歧杆菌105－A株。对于短双歧杆菌，可以列举例如：短双歧杆菌标准株(JCM1192)、短双歧杆菌aS－1株、短双歧杆菌I－53－8W株，其中优选短双歧杆菌标准株、短双歧杆菌aS－1株。对于婴儿双歧杆菌，可以列举例如：婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌I－10－5株。对于乳双歧杆菌，可以列举例如：乳双歧杆菌标准株(JCM1210)。对于两歧双歧杆菌的菌株，可以列举例如：两歧双歧杆菌ATCC－11863株。
本发明的质粒、转化双歧杆菌属细菌的制作可以基于市售的实验书、例如基因手册讲谈社、高木康敬编基因操作实验法讲谈社、分子克隆(Molecular Cloning)[ColdSpring Harbor Laboratory(1982)]、分子克隆(Molecular Cloning)第2版[Cold SpringHarbor Laboratory(1989)]、Methods in Enzymology194(1991)、实验医学副刊·利用酵母的基因实验法(実験医学別冊·酵母による遺伝子実験法)、羊土社(1994)等中记载的方法来进行。
上述进行转化后的双歧杆菌属细菌在正常组织中不增殖、而仅在厌氧环境下的肿瘤组织中增殖，可以在肿瘤组织中表达对治疗有用的2种异种多肽。
因此，该转化后的双歧杆菌属细菌可以作为对具有厌氧环境的肿瘤、优选实体肿瘤的治疗有效的药物组合物、尤其是抗癌剂来使用。因此，作为本发明的药物组合物，只要含有可分泌异种多肽、优选具有抗癌作用的细胞因子、抗体等的上述本发明的双歧杆菌属细菌作为有效成分则没有特别限制，只要不妨碍所分泌的多肽的作用和效果，则可以含有作为任选成分的药理学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等。
本发明的药物组合物的给药对象为哺乳类、优选为人，作为本发明的药物组合物的适用对象，可以例示出大肠癌、头颈癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、精巢癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、绒毛膜癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、脑瘤、恶性类癌肿瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤。
作为本发明的药物组合物的剂型，可以列举液体制剂或固体制剂。液体制剂可以通过纯化本发明的双歧杆菌属细菌的培养液，根据需要向其中加入适当的生理盐水或补液或药物添加剂，填充至安瓿或小药瓶等中来制备。固体制剂可以通过向液体制剂中添加适当的保护剂，填充至安瓿或小药瓶等中，从而制造。固体制剂可以在液体制剂中添加适当的保护剂并填充至安瓿或小药瓶等后进行冷冻而制成冷冻制剂，或者，进行冷冻干燥而制成冷冻干燥制剂，从而制造。作为本发明的药物组合物的给药方法，经口给药、非经口给药均可，优选非经口给药，可以列举例如：静脉内给药、局部给药。
就本发明的药物组合物的给药量而言，只要足以保证双歧杆菌属细菌可以在疾病部位生育且表达有效治疗量的细胞因子、活性抗体则没有特别限制，可以根据疾病的程度、患者的体重、年龄、性别进行适当选择，并根据改善的程度适当增减，但从经济性的观点及尽可能规避副作用的观点出发，优选在能够保证所需的治疗效果的范围内尽量少。
例如，静脉内给药时，因为要求降低细菌凝块引起的栓塞等的风险，故而优选采用尽量低浓度的注射用制剂分多次注射，或用适当的补液稀释之后连续注射。例如，对于成人，将本发明的双歧杆菌属细菌的菌体按照每1kg体重104～1012cfu的量分成1天1次～多次给药、1天～数天连续给药或以适当间隔给药。更具体地，将包含104～1010cfu/mL的本发明的双歧杆菌属细菌的菌体的制剂，按照成人1人1～1000mL的量直接或用适当的补液进行稀释后，分成1天1次～多次连续给药1天～数天。
另外，例如，对于直接向病患组织给药的局部给药，因为要求尽量使菌在病患组织整体上定植、增殖，故而优选将高浓度的注射剂施用至疾病组织的多处的方式。例如，对于成人，将本发明的双歧杆菌属细菌的菌体，按照每1kg体重104～1012cfu的量分成1天1次～多次给药，根据需要1天～数天连续给药或以适当间隔给药。更具体地来说，将包含104～1010cfu/mL的本发明的双歧杆菌属细菌的菌体的制剂，按照成人1人0.1～100mL的量直接分成1天多次，根据需要给药1天～连续数天给药。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。
[实施例1]
[人TNF－α及人IFN－γ共表达双歧杆菌属细菌AG8TL株的制作]
(概要)
制作了共表达质粒pAG8TL，该共表达质粒pAG8TL为含有分泌人TNF－α的表达盒(人TNF－α分泌表达盒)和分泌人IFN－γ的表达盒(人IFN－γ分泌表达盒)的大肠杆菌－双歧杆菌属细菌穿梭载体。使用该pAG8TL，利用电穿孔法进行长双歧杆菌105－A株的转化，取得人TNF－α及人IFN－γ共表达双歧杆菌属细菌AG8TL株。将实施例1～3中使用的引物示于以下的表1。
[表1]
(人TNF－α分泌表达盒的结构)
作为人TNF－α分泌表达盒，制作了对于(1)P30启动子DNA、(2)编码信号肽－接头连接体SP7L20的DNA、(3)编码人TNF－α蛋白的氨基酸序列的DNA及(4)d0013终止子DNA按照以(1)为上游(5’末端)侧、以(4)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(4)的DNA的盒。
(人IFN－γ分泌表达盒的结构)
作为人IFN－γ分泌表达盒，制作了对于(1)Hu启动子DNA、(2)编码信号肽－接头连接体SP69L20的DNA、(3)编码人IFN－γ蛋白的氨基酸序列的DNA及(4)Hu终止子DNA(来自长双歧杆菌)按照以(1)为上游(5’末端)侧、以(4)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(4)的DNA的盒。
(质粒pAG8TL的制作)
在制作质粒pAG8TL时，首先制作质粒pAG8。
(质粒pAG8的制作)
(hTNF－α嵌入片段的制备)
以国际公开2011/093465号小册子中记载的质粒pSP3B－TNFα(参考图1)(1ng)为模板，使用上述表1记载的GA100＿引物(正向)及GA101＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照嵌入片段与载体片段的末端15bp重复的方式来进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为20μL，使用PrimeSTAR HS(Premix)试剂盒(宝生物株式会社制)(以下记作“STAR试剂盒”)进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、75℃下40秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，从而制备约0.5kbp的h(人)TNF－α嵌入片段扩增产物。
(含有编码人IFN－γ蛋白的氨基酸序列的DNA的载体片段的制备)
将质粒pHG－2(图2)的直链化片段(序列号1)作为模板，使用表1记载的GA104＿引物(正向)及GA103＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照嵌入片段与载体片段的末端15bp重复的方式来进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为20μL，使用STAR试剂盒进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、75℃下5分钟为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，从而制备约5kbp的5’－Hu启动子－SP69L20－人IFN－γ蛋白－His标签－Hu终止子－pTB rep unit－SPCMr－pUCori－P30启动子－SP7L20－3’载体片段扩增产物。
上述质粒pHG－2的直链化片段在序列号1的第1位～第4975位的碱基序列中按照下述方式构成。
d0013终止子：序列号1的第16位～第129位的碱基序列
Hu启动子：序列号1的第136位～第496位的碱基序列
SP69L20：序列号1的第497位～第646位的碱基序列
人IFN－γ蛋白：序列号1的第647位～第1075位的碱基序列
His标签：序列号1的第1076位～第1093位的碱基序列
Hu终止子：序列号1的第1097位～第1210位的碱基序列
双歧杆菌属细菌复制起点pTB6rep unit：序列号1的第1217位～第2812位的碱基序列
壮观霉素抗性基因SPCMr：序列号1的第2819位～第3897位的碱基序列
大肠杆菌复制起点、pUCori：序列号1的第3904位～第4571位的碱基序列
P30启动子：序列号1的第4572位～第4806位的碱基序列
SP7L20：序列号1的第4807位～第4965位的碱基序列。
(In Fusion反应1)
将上述制备的载体片段扩增产物及嵌入片段扩增产物用In－Fusion(注册商标)HD Cloning试剂盒(宝生物株式会社制)(以下记作“HD试剂盒”)进行连接。即，在微型管中添加上述载体片段扩增产物50ng和嵌入片段扩增产物13ng，进一步添加试剂盒内的5×In－Fusion HD Enzymepremix 2μL、Cloning Enhancer 1μL，用0.1×TE缓冲液(1mMTris－HCl、0.1mM EDTA、pH7.5)将反应液体积调整为10μL。将其在37℃下保温15分钟后，进一步在50℃下保温15分钟。其它步骤按照试剂盒的产品说明书，从而制备In Fusion反应液1。
(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)
使用1μL的上述In Fusion反应液1，按照产品说明书进行大肠杆菌HST16CR感受态细胞(宝生物株式会社制)的转化。转化后的菌悬浮液涂布在含有75μg/mL壮观霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下振荡培养一晚。将上述琼脂培养基上形成的大肠杆菌菌落用含有75μg/mL壮观霉素的LB液体培养基在37℃下培养一晚，用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(QIAGEN公司制)从其中提取质粒。为了确定所提取的质粒中的含有上述人TNF－α分泌表达盒及人IFN－γ分泌表达盒的区域1(5’－P30启动子－SP7L20－人TNF－α蛋白－d0013终止子－Hu启动子－SP69L20－人IFN－γ蛋白－His标签－Hu终止子－3’)的序列，用Big Dye(注册商标)Terminator v3.1Cycle Sequencing试剂盒(Applied Biosystems公司制)进行测序反应。将所提取的质粒命名为pAG8。将pAG8的含有人TNF－α分泌表达盒及人IFN－γ分泌表达盒的区域1的序列示于序列号2。
(pAG8TL株的制备)
以上述pAG8为模板，使用表1记载的GA2＿引物(正向)及GA6＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、75℃下3分15秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约3.3kbp的PCR扩增产物A。
以上述pAG8为模板，使用表1记载的GA5＿引物＿rev(正向)及GA1＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、75℃下2分10秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约2.2kbp的PCR扩增产物B。
(In Fusion反应2)
使用PCR扩增产物A 50ng、PCR扩增产物B 33ng，除此以外，通过与上述(In Fusion反应1)同样的步骤将上述PCR扩增产物A和PCR扩增产物B连接，从而制备In Fusion反应液2。
(大肠杆菌的转化及质粒pAG8TL的DNA的序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，使用上述In Fusion反应液2进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、从重组大肠杆菌中提取质粒。通过同样的步骤进行所提取的质粒中的含有人TNF－α分泌表达盒及人IFN－γ分泌表达盒的区域2(5’－P30启动子－SP7L20－人TNF－α蛋白－d0013终止子－Hu启动子－SP69L20－人IFN－γ蛋白－Hu终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为pAG8TL。将pAG8TL的含有人TNF－α分泌表达盒及人IFN－γ分泌表达盒的区域2的序列示于序列号3。
(双歧杆菌属细菌的转化1)
使用从上述转化后的大肠杆菌提取出的质粒pAG8TL(250ng)，利用电穿孔系统(Gene Pulser II、Bio-Rad Laboratories株式会社制)进行长双歧杆菌105－A株的转化。电冲击(2kV、25μF、200Ω)后，立即向反应杯(2mm间隙)中添加800μL的IMR液体培养基与50μL的维生素C添加液的混合液，将其回收到灭菌后的2mL微型管中。拧松该2mL管的盖子，与脱氧·二氧化碳发生剂(Anaero Pack(注册商标)·Kenki、三菱瓦斯化学株式会社制)一起放入密闭容器中，在设定为37℃的培养器中保温3小时。
将保温后的各菌悬浮液涂布在含有75μg/mL壮观霉素的IMR琼脂培养基上。将这些板与上述脱氧·二氧化碳发生剂一起放入密闭容器中，在设定为37℃的培养器中培养2天。
将上述含壮观霉素的IMR琼脂培养基上形成的菌落作为转化体长双歧杆菌105－A/pAG8TL株(以下称为AG8TL株)。
[实施例2]
[人TNF－α单独表达株TNF11株的制作]
如下制作对应于共表达双歧杆菌属细菌AG8TL株的人TNF－α单独表达株TNF11株。
以pAG12为模板，使用表1记载的GA113＿引物(正向)及GA6＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、75℃下3分50秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约3.2kbp的PCR扩增产物60。
以pAG12为模板，使用表1记载的GA5＿引物＿rev(正向)及GA116＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下1分15秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约1.2kbp的PCR扩增产物61。需要说明的是，用作模板的质粒pAG12是pAG8TL的hIFN－γ的SP/Linker由SP69L20替换为SP56L20后的质粒。
(In Fusion反应3)
使用PCR扩增产物60 50ng、PCR扩增产物61 20ng，除此以外，通过与上述(InFusion反应1)同样的步骤将上述PCR扩增产物60和PCR扩增产物61连接，从而制备InFusion反应液3。
(大肠杆菌的转化及质粒pTNF11的DNA的序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，用上述InFusion反应液3进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。进行所提取的质粒中的人TNF－α分泌表达盒(5’－P30启动子－SP7L20－人TNF－α蛋白－d0013终止子)的序列确定。将所提取的质粒命名为pTNF11。将pTNF11的质粒结构示于图3。
(双歧杆菌属细菌的转化2)
使用从上述转化后的大肠杆菌提取出的质粒pTNF11(500ng)，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pTNF11株(以下称为TNF11株)。
[实施例3]
[人IFN－γ单独表达株hIFNg33TL株的制作]
如下制作对应于共表达双歧杆菌属细菌AG8TL株的人IFN－γ单独表达株hIFNg33TL株。
制作对应于共表达AG8TL株的人IFN－γ单独表达株hIFNg33TL株。在制作质粒phIFNg33TL时，首先制作质粒phIFNg33。
(hIFN－γ基因的人工DNA合成)
对于hIFN－γ基因，委托GenScript Japan株式会社来合成。hIFN－γ序列基于Accession#CAA31639的成熟蛋白的氨基酸序列(Gln24－Gln166)且使密码子适合于长双歧杆菌NCC2705(交货质粒：pUC57－hIFNg)。序列号4示出人工合成的hIFN－γ的DNA序列。
以pBEshuttle(序列号5)为模板，使用表1记载的pCDshuttle＿R1＿引物(反向)及IFNG2＿引物(正向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、75℃下3分50秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约3.9kbp的PCR扩增产物vector1。
以上述pUC57－hIFNg(hIFNg in pUC57)为模板，使用表1记载的IFNG1＿引物(正向)及IFNG3＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、75℃下30秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约0.5kbp的PCR扩增产物insert1。
(In Fusion反应4)
使用PCR扩增产物vector1 50ng、PCR扩增产物insert1 12ng，除此以外，通过与上述(In Fusion反应1)同样的步骤将上述PCR扩增产物vector1和PCR扩增产物insert1连接，从而制备In Fusion反应液4。
(大肠杆菌的转化及非分泌型质粒phIFNg的DNA的序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，用上述InFusion反应液4(2μL)进行大肠杆菌HST16CR的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取、所提取的质粒DNA的全长序列确定。将所提取的质粒命名为phIFNg(非分泌型质粒)。
(分泌型质粒hIFNg33的制作)
以上述phIFNg为模板，使用表1记载的hIFNG4＿引物(正向)及Hu－mCCL21－vecR1＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、75℃下4分20秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约4.3kbp的PCR扩增产物vector2。
以长双歧杆菌105－A株genomicDNA为模板，使用表1记载的SP69－ins＿F1＿引物(正向)及SP69－ins＿R2＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、75℃下15秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约0.2kbp的PCR扩增产物insert2。
(In Fusion反应5)
使用PCR扩增产物vector2 50ng、PCR扩增产物insert2 5ng，除此以外，通过与上述(In Fusion反应1)同样的步骤将上述PCR扩增产物vector2和PCR扩增产物insert2连接，从而制备In Fusion反应液5。
(大肠杆菌的转化及质粒phIFNg33的DNA的序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，用上述InFusion反应液3(2μL)进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。进行所提取的质粒中的人IFN－γ分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP69L20－人IFN－γ蛋白－His标签－Hu终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为phIFNg33。将phIFNg33的质粒结构示于图4(a)。
(双歧杆菌属细菌的转化3)
使用从上述转化后的大肠杆菌提取出的质粒phIFNg33(605ng)，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/phIFNg33株(称为hIFNg33株)。
以上述phIFNg33为模板，使用表1记载的GA5＿引物＿rev(正向)及GA1＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、75℃下1分20秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约1.2kbp的PCR扩增产物C。
以上述phIFNg33为模板，使用表1记载的GA2＿引物(正向)及GA6＿引物(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、75℃下3分20秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约3.3kbp的PCR扩增产物D。
(In Fusion反应6)
使用PCR扩增产物C 18ng、PCR扩增产物D 50ng，除此以外，通过与上述(In Fusion反应1)同样的步骤将上述PCR扩增产物C和PCR扩增产物D连接，从而制备In Fusion反应液6。
(大肠杆菌的转化及质粒phIFNg33TL的DNA的序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，用上述InFusion反应液6进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。进行所提取的质粒中的人IFN－γ分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP69L20－人IFN－γ蛋白－Hu终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为phIFNg33TL。将phIFNg33TL的质粒结构示于图4(b)。
(双歧杆菌属细菌的转化4)
使用从上述转化后的大肠杆菌提取出的质粒phIFNg33TL(435ng)，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/phIFNg33TL株(称为hIFNg33TL株)。
[实施例4]
[AG8TL株中的hTNF－α及hIFN－γ的分泌确认]
利用ELISA法如下确认AG8TL株的培养上清中有无人TNF－α蛋白和人IFN－γ蛋白的分泌。作为阴性对照株，对于长双歧杆菌105A/pBE穿梭菌株(以下称为BE穿梭菌株)也同样实施。
(重组双歧杆菌属细菌的培养)
将上述AG8TL株、TNF11株及hIFNg33TL株、BE穿梭菌株接种到添加有壮观霉素(终浓度75μg/mL)及维生素C添加液(每100mL含有抗坏血酸35g、L－半胱氨酸盐酸盐一水合物2g及碳酸钠11g的溶液)100μL的MRS(Becton·Dickinson公司制)液体培养基10mL中，在37℃下厌氧培养24小时，作为活化培养液。然后，在DMEM(Cat No.11885－084：LifeTechnologies公司制)：MRS以9：1的比例混合而成的培养基20mL中添加维生素C添加液100μL、壮观霉素75μg/mL，接种上述活化培养液100μL。将其在37℃下厌氧培养18小时。
(培养上清的回收及ELISA)
将上述厌氧培养后的各株的培养液离心分离后，回收各株的培养上清，供于ELISA。对BE穿梭菌株也进行同样的操作，作为阴性对照。作为TNF－α测定用的ELISA试剂盒，使用Quantikine Human TNFα/TNFSF1A Immunoassay(R&D systems公司制)，作为hIFN－γ测定用的ELISA试剂盒，使用Quantikine Human IFN－γImmunoassay(R&Dsystems公司制)。ELISA的操作按照各ELISA试剂盒的制品手册来实施。将结果示于以下的表2。
[表2]
(ng/mL培养上清)
重组双歧杆菌属细菌 hTNF-α分泌量 hIFN-γ分泌量
AG8TL 501 376
TNF11 515 N.D.
hIFNg33TL N.D. 346
BE穿梭 N.D. N.D.
(结果)
由表2可明确，在AG8TL株的培养上清中观察到hTNF－α蛋白和hIFN－γ蛋白两者。在阳性对照的作为单独表达株的TNF11株培养上清中观察到hTNF－α蛋白，在hIFNg33TL株的培养上清中观察到人IFN－γ蛋白。
[实施例5]
[AG8TL株的KPL－1细胞增殖抑制活性的研究]
(培养上清粗纯化物的制备)
通过与实施例4的(重组双歧杆菌属细菌的培养)和(培养上清的回收及ELISA)同样的步骤，将所制备的上述AG8TL株、TNF11株及hIFNg33TL株的培养上清各7mL用AmiconUltra－4，MWCO：10k(Millipore公司制)浓缩后，用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3次并浓缩，制备各0.5mL的各株的培养上清粗纯化物。对作为阴性对照株的长双歧杆菌105A/pBE穿梭菌株的培养上清粗纯化物也同样进行制备。将上述各株的培养上清粗纯化物用于细胞增殖抑制活性的测定。对于hTNF－α及hIFN－γ的浓度，使用上述TNF－α测定用的ELISA试剂盒和上述hIFN－γ测定用的ELISA试剂盒来估计。
(KPL－1细胞的制备及被检样品的添加)
使用作为人乳癌细胞株的KPL―1细胞(川崎医科大学红林淳一教授提供)进行细胞增殖抑制活性的测定。将KPL－1细胞在100mm皮氏培养皿中用10％胎牛血清(EQUITECH－BIO公司制)/Dulbecco’s改良伊戈尔培养基(高葡萄糖)(Sigma-Aldrich公司制)进行培养。除去该试验培养基后，用PBS(－)(和光纯药工业株式会社制)洗涤，添加0.25％胰蛋白酶－EDTA(Life Technologies公司制)，回收细胞，离心分离后除去上清，用上述试验培养基悬浮细胞且得到6×103个细胞/mL，从而制备细胞悬浮液。
将上述细胞悬浮液在96孔板的各孔中分注各0.1mL，在设定为37℃的CO2培养器中开始培养。第二天，与在上述试验培养基中进一步添加有AG8TL株培养上清粗纯化物(含有20ng/mLhIFN－γ、51.1ng/mLhTNF－α)的培养基进行交换，开始刺激。将添加有与AG8TL株的浓度相同的浓度的TNF11株或hIFNg33TL株的培养上清粗纯化物的各培养基作为阳性对照，并同样进行处理。刺激开始起4天后除去培养基，与添加十分之一量的Cell Countingkit－8(同仁化学研究所制)的培养基进行交换，进一步反应3小时。反应后，通过多功能酶标仪(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd制)测定450nm及630nm(参比波长)处的吸光度。以减去作为空白对照的、仅添加培养基和Cell Counting kit－8的细胞非添加孔的吸光度的形式而算出。需要说明的是，将不添加上述各培养上清粗纯化物而继续进行KPL―1细胞培养的试验培养基中的值作为无处理区的吸光度，将其设为100％而算出各KPL－1细胞的增殖率。将结果示于图5。
(结果)
由图5可明确，AG8TL株分泌物与TNF11株单独或hIFNg33TL株单独的分泌物相比，显著抑制KPL－1细胞的增殖。即，分泌物为hTNF－α的TNF11株的情况下，增殖率显示为89.9％，分泌物为hIFN－γ的hIFNg33TL株的情况下，增殖率显示为83％，与此相对地，分泌物为hTNF－α和hIFN－γ的AG8TL株的情况下，增殖率显示为35.5％，由此确认AG8TL株对人乳癌细胞株具有强增殖抑制效果。可以认为，该结果是由hTNF－α分泌物和hIFN－γ分泌物的并用效果产生的。
[实施例6]
[AG8TL株的MIA PaCa－2细胞增殖抑制活性的研究]
使用来自人胰脏癌的细胞MIA PaCa－2细胞(由riken bioresource center取得)代替KPL－1细胞，除此以外，通过与实施例5同样的步骤来研究对MIA PaCa－2细胞的增殖抑制活性。其中，MIA PaCa－2细胞向96孔板分注时的细胞悬浮液的播种浓度设为1×104个细胞/mL。将结果示于图6。
(结果)
由图6可明确，AG8TL株分泌物与TNF11株单独或hIFNg33TL株单独的分泌物相比，显著抑制MIA PaCa－2细胞的增殖。即，分泌物为hTNF－α的TNF11株的情况下，增殖率显示为51.6％，分泌物为hIFN－γ的hIFNg33TL株的情况下，增殖率显示为75.4％，与此相对地，分泌物为hTNF－α和hIFN－γ的AG8TL株的情况下，增殖率显示为24.2％，由此确认AG8TL株对人胰脏癌细胞株具有强增殖抑制效果。可以认为，该结果是由hTNF－α分泌物和hIFN－γ分泌物的并用效果产生的。
[实施例7]
[利用中和抗体进行的、AG8TL株的增殖抑制活性的特异性研究]
为了确认AG8TL株的培养上清粗纯化物的细胞增殖抑制活性是由于分泌hTNF－α及hIFN－γ而产生的，使用作为中和抗体的Human IFN－γ抗体及Human TNF－α抗体(均为R&D systems公司制)如下进行研究。
通过与实施例6同样的步骤在96孔板中播种MIA PaCa－2细胞，第二天交换为添加有AG8TL株、TNF11株、hIFNg33TL株、BE穿梭菌株(阴性对照)中的任一种的培养上清粗纯化物和以下的表3所示的抗体的组合的培养基。培养基中的添加物如以下的表3所示。通过与实施例5同样的步骤算出细胞增殖率。将结果示于图7。
[表3]
(结果)
由图7可明确，添加AG8TL株培养上清粗纯化物时的MIA PaCa－2细胞增殖率显示为15.3％，单独添加抗hIFN－γ抗体时、单独添加抗hTNF－α抗体时的细胞增殖率分别增加至31.8％、44.4％。添加抗hIFN－γ抗体及抗hTNF－α抗体这两种抗体时的细胞增殖率进一步增加至74.1％。这是AG8TL株所分泌的hTNF－α及hIFN－γ的生物活性被抗体中和的结果，可以认为MIA PaCa－2细胞增殖抑制是由于AG8TL株所分泌的hTNF－α及hIFN－γ产生的。
[实施例8]
[抗hPD－1scFv03及抗hCTLA－4scFv02共表达双歧杆菌属细菌PC1株及CP1株的制作]
(概要)
制作含有分泌抗hPD－1scFv03的表达盒(抗人PD－1scFv03分泌表达盒)和分泌抗hCTLA－4scFv02FLAG的表达盒(抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒)的、作为大肠杆菌－双歧杆菌属细菌穿梭载体的共表达质粒pPC1及pCP1。使用该pPC1和pCP1利用电穿孔法进行长双歧杆菌105－A株的转化，取得抗hPD－1scFv03及抗hCTLA－4scFv02共表达双歧杆菌属细菌PC1株和CP1株。将实施例8中使用的引物示于以下的表4。
[表4]
(抗人PD－1scFv03分泌质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03的制作)
在制作pPC1及pCP1时，首先制作抗人PD－1scFv03的分泌型质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03。
(抗人PD－1scFv03分泌表达盒的结构)
作为抗人PD－1scFv03分泌表达盒，对于(1)Hu启动子DNA、(2)编码信号肽－接头连接体SP7L20的DNA、(3)编码抗hPD－1scFv03的氨基酸序列(含有重链序列、接头(GGGGS)3、轻链序列)的DNA及(4)编码His标签序列的DNA、(5)Hu终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(5)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(5)的DNA的盒(含有上述抗hPD－1scFv03的氨基酸序列中的重链序列、接头(GGGGS)3、轻链序列)的编码DNA的碱基序列参考了以下的表5(1)所示的文献。
(抗hPD－1scFv03的人工DNA合成)
对于序列号11所示的抗hPD－1scFv03，委托GenScript Japan株式会社亚克隆到大肠杆菌用质粒pUC57中，作为质粒pUC57－hPD－1scFv03来进行了人工基因合成。
[表5]
(抗hPD－1scFv03嵌入片段的制备1)
以上述质粒pUC57－hPD－1scFv03(500pg)为模板，使用上述表4中记载的Ins－hPD－1scFv03－F1引物(正向)及Ins－hPD－1scFv03－R1引物(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照嵌入片段与载体片段的末端15bp重复的方式来进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为30μL，使用STAR试剂盒进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下60秒为1个循环，进行30个循环。将所扩增的嵌入PCR产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳后，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN株式会社制)(以下记作“QIAGel”)进行纯化，从而制备约0.7kbp的抗hPD－1scFv03嵌入片段(1)。
(含有编码SP7L20的氨基酸序列的DNA的载体片段(1)的制备)
以序列号14中记载的载体直链化片段(500pg)为模板，使用上述表4中记载的TGA－Hu－Terminator－F引物(正向)及vec－SP7L20－R1引物(反向)的引物组进行PCR扩增。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为30μL，使用STAR试剂盒进行PCR扩增。关于扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分钟为1个循环，进行30个循环。将所扩增的PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳后，用QIAGel纯化，从而制备约4.0kbp的5’－Hu终止子－pTB6rep unit－SPCMr－pUCori－Hu启动子－SP7L20－3’载体片段(1)。
(In Fusion反应7)
将上述制备的载体片段(1)和上述抗hPD－1scFv03嵌入片段(1)用上述In－Fusion(注册商标)HD Cloning试剂盒连接。即，在微型管中以1：5的摩尔比添加试剂盒内的上述载体和嵌入物后，添加2μL的5×In－Fusion HD Enzyme premix，将反应液体积调整为10μL。将其在50℃下保温15分钟。其它步骤按照试剂盒的产品说明书，从而制备In Fusion反应液7。
(大肠杆菌的转化及pHuSP7L20－hPD－1scFv03的DNA序列确认)
使用5μL的上述In Fusion反应液7，除此以外，通过与前述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤进行大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。其中，转化后，将琼脂培养基上形成的大肠杆菌菌落用含有75μg/mL壮观霉素的LB液体培养基在30℃下振荡培养一晩。通过同样的步骤进行所提取的质粒中的抗人PD－1scFv03分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP7L20－抗hPD－1scFv03－His标签－Hu终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为pHuSP7L20－hPD－1scFv03。将pHuSP7L20－hPD－1scFv03的结构示于图8(A)，将序列示于序列号6。
(双歧杆菌属细菌的转化5)
使用从上述转化后的大肠杆菌提取出的质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03(550ng)，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pHuSP7L20－hPD－1scFv03株(以下称为hPD－1scFv03株)。
(抗hCTLA－4scFv02分泌质粒pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02的制作)
在制作pPC1及pCP1时，首先制作无FLAG标签的抗hCTLA－4scFv02的分泌型质粒pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02。
(抗人CTLA－4scFv02分泌表达盒及抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒的结构)
作为抗人CTLA－4scFv02分泌表达盒，对于(1)Hu启动子DNA、(2)编码信号肽－接头连接体SP7L20的DNA、(3)编码抗hCTLA－4scFv02的氨基酸序列(含有重链序列、接头(GGGGS)3、轻链序列)的DNA及(4)编码His标签序列的DNA、(5)Hu终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(5)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(5)的DNA的盒(含有上述抗hCTLA－4scFv02的氨基酸序列中的重链序列、接头(GGGGS)3、轻链序列)的编码DNA的碱基序列参考了上述的表5(2)所示的文献。
此外，作为抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒，对于(1)Hu启动子DNA、(2)编码信号肽－接头连接体SP7L20的DNA、(3)编码抗hCTLA－4scFv02的氨基酸序列(含有重链序列、接头(GGGGS)3、轻链序列)的DNA及(4)编码FLAG标签序列的DNA、(5)Hu终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(5)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(5)的DNA的盒(含有上述抗hCTLA－4scFv02的氨基酸序列中的重链序列、接头(GGGGS)3、轻链序列)的编码DNA的碱基序列参考了上述的表5(3)所示的文献。
(hCTLA－4scFv02的人工DNA合成)
对于序列号12所示的hCTLA－4scFv02，委托GenScript Japan株式会社亚克隆到大肠杆菌用质粒pUC57中，作为质粒pUC57－hCTLA－4scFv02来进行人工基因合成。
(抗hCTLA－4scFv02嵌入片段的制备)
以上述质粒pUC57－hCTLA－4scFv02为模板，使用上述表4中记载的Ins－hCTLA－4scFv02－F1(正向)及Ins－hCTLA－4scFv02－R1(反向)的引物组，除此以外，通过与上述(抗hPD－1scFv03嵌入片段的制备1)同样的步骤制备约0.8kbp的抗hCTLA－4scFv02嵌入片段。
(In Fusion反应8)
使用上述载体片段(1)和上述抗hCTLA－4scFv02嵌入片段，除此以外，通过与上述(In Fusion反应7)中的In Fusion反应同样的步骤来制备In Fusion反应液。
(大肠杆菌的转化及pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02的DNA序列确认)
使用5μL的上述In Fusion反应液8，除此以外，通过与前述(大肠杆菌的转化及质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03的DNA序列确认)同样的步骤来进行大肠杆菌HST08感受态细胞的转化，为了确定所提取的质粒中的抗人CTLA－4scFv02分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP7L20－抗hCTLA－4scFv02－His标签－Hu终止子－3’)的序列而进行测序反应，将提取的质粒命名为pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02。将pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02的结构示于图8(B)，将序列示于序列号7。
[抗hCTLA－4scFv02FLAG单独表达双歧杆菌属细菌株的制作]
(含有抗hCTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒的载体片段的制备)
以上述质粒pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02(500pg)为模板，使用上述表4中记载的hCTLA－4scFv02－FLAG－F1(正向)及hCTLA－4scFv02－FLAG－R1(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照PCR产物的两末端各15bp重复的方式来进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为30μL，使用前述STAR试剂盒进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分钟为1个循环，进行30个循环，从而制备含有约4.8kbp的抗hCTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒的载体片段扩增产物。
(In Fusion反应9)
将上述所制备的含有抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒的载体片段扩增产物用In－Fusion(注册商标)HD Cloning试剂盒进行In Fusion反应，使其自身闭环。即，在微型管中添加将上述载体片段扩增产物5μL和Cloning Enhancer 2μL混合而成的反应液，在37℃下保温15分钟，接着在80℃下保温15分钟。然后，添加该反应液0.5μL和2μL的5×In－Fusion HD Enzyme premix，将反应液体积调整为10μL。将其在50℃下保温15分钟。其它步骤按照试剂盒的产品说明书，从而制备In Fusion反应液9。
(大肠杆菌的转化及pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG的DNA序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03的DNA序列确认)同样的步骤，使用5μL上述的In Fusion反应液9进行上述大肠杆菌HST08感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。通过同样的步骤进行所提取的质粒中的抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP7L20－抗人CTLA－4scFv02－FLAG标签－Hu终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG。将pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG的结构示于图8(C)，将序列示于序列号8。
(双歧杆菌属细菌的转化6)
使用256ng的上述质粒pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG株(以下称为hCTLA－4scFv02株)。
[抗hPD－1scFv03及抗hCTLA－4scFv02共表达株的制作]
制作分泌抗hPD－1scFv03及抗hCTLA－4scFv02两者的共表达株PC1株及CP1株。PC1株具有如图9(a)所示那样的、连接在大肠杆菌复制起点pUCori的3’末端侧的分泌表达盒依次配置有抗人PD－1scFv03分泌表达盒、连接在其后的抗人CTLA－4scFv02分泌表达盒的质粒，CP1株具有如图9(b)所示那样的、连接在大肠杆菌复制起点pUCori的3’末端侧的分泌表达盒依次配置有抗人CTLA－4scFv02分泌表达盒、连接在其后的抗人PD－1scFv03分泌表达盒的质粒。
[PC1株的制作]
(抗hCTLA－4scFv02FLAG嵌入片段的制备)
以质粒pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG(500pg)(序列号8)为模板，使用上述表4记载的InF＿Hu Prom＿F1(正向)及InF＿Hu Term－pTB6＿R1(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照嵌入片段与载体片段的末端15bp重复的方式来进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为30μL，用上述STAR试剂盒进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下2分钟为1个循环，进行30个循环。将扩增出的嵌入PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳后，用QIAGel纯化，从而制备约1.4kbp的抗人CTLA－4scFv02FLAG嵌入片段。
(含有抗hPD－1scFv03分泌表达盒的载体片段的制备)
以上述质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03(500pg)(序列号6)为模板，使用上述表4记载的InF＿pTB6rep＿F1(正向)及InF＿HuTerm－HuProm＿R1(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照嵌入片段与载体片段的末端15bp重复的方式来进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为30μL，用上述PrimeSTAR HS(Premix)试剂盒进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分钟为1个循环，进行30个循环。将扩增出的嵌入PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳后，用QIAquick Gel Extraction试剂盒纯化，从而制备约4.7kbp的含有抗hPD－1scFv03分泌表达盒的载体片段(2)。
(In Fusion反应10)
将上述所制备的载体片段(2)和上述抗人CTLA－4scFv02FLAG嵌入片段用上述In－Fusion(注册商标)HD Cloning试剂盒连接。即，在微型管中按照1：3的摩尔比添加试剂盒内的上述载体和嵌入物后，添加2μL的5×In－Fusion HD Enzyme premix，将反应液体积调整为10μL。将其在50℃下保温15分钟。其它步骤按照试剂盒的产品说明书，从而制备InFusion反应液10。
(大肠杆菌的转化及pPC1的DNA序列确认)
使用2μL的上述In Fusion反应液10，除此以外，通过与前述(大肠杆菌的转化及质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03的DNA序列确认)同样的步骤进行大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。通过同样的步骤进行所提取的质粒中的抗人PD－1scFv03分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP7L20－抗hPD－1scFv03－His标签－Hu终止子－3’)及抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP7L20－抗hCTLA－4scFv02－FLAG标签－Hu终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为pPC1。将pPC1的结构示于图9(a)，将pPC1的DNA序列示于序列号9。
(双歧杆菌属细菌的转化7)
使用250ng的上述质粒pPC1，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pPC1株(以下称为PC1株)。
[CP1株的制作]
(抗hPD－1scFv03嵌入片段的制备2)
以上述质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03(500pg)(序列号6)为模板，使用上述表4记载的InF＿HuProm＿F1(正向)及InF＿HuTerm－pTB6＿R1反向)的引物组，除此以外，通过与上述(抗人CTLA－4scFv02FLAG嵌入片段的制备)同样的步骤进行PCR扩增及利用凝胶提取试剂盒进行纯化。从而制备约1.4kbp的抗hPD－1scFv03嵌入片段(2)。
(含有抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒的载体片段的制备)
以上述质粒pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG(序列号8)为模板，使用上述表4记载的InF＿pTB6rep＿F1(正向)及InF＿HuTerm－HuProm＿R1(反向)的引物组，除此以外，通过与上述(抗hPD－1scFv03嵌入片段的制备2)同样的步骤进行PCR扩增及利用凝胶提取试剂盒进行纯化。从而制备约4.8kbp的含有抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒的载体片段(3)。
(In Fusion反应11)
使用上述所制备的载体片段(3)和上述抗hPD－1scFv03嵌入片段(2)，除此以外，通过与上述(In Fusion反应10)同样的步骤来制备In Fusion反应液11。
(大肠杆菌的转化及pCP1的DNA序列确认)
使用2μL的上述In Fusion反应液11，除此以外，通过与前述(大肠杆菌的转化及质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03的DNA序列确认)同样的步骤进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。通过与上述(大肠杆菌的转化及pPC1的DNA序列确认)同样的步骤，来进行所提取的质粒中的抗人PD－1scFv03分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP7L20－抗hPD－1scFv03－His标签－Hu终止子－3’)和抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒(5’－Hu启动子－SP7L20－抗hCTLA－4scFv02－FLAG标签－Hu终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为pCP1。将pCP1的结构示于图9(b)，将pCP1的DNA序列示于序列号10。
(双歧杆菌属细菌的转化8)
使用250ng的上述质粒pCP1，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pCP1株(以下称为CP1株)。
[实施例9]
[PC1株及CP1株中的抗hPD－1scFv及抗hCTLA－4scFv分泌确认]
通过蛋白印迹法如下确认PC1株及CP1株的培养上清中有无抗hPD－1scFv03(组氨酸标签付)及抗hCTLA－4scFv02(FLAG标签付)。对作为阴性对照株的BE穿梭菌株也同样地实施。
(重组双歧杆菌属细菌的培养)
对于上述PC1株及CP1株、hPD－1scFv03株、hCTLA－4scFv02株、BE穿梭菌株，通过与实施例4(重组双歧杆菌属细菌的培养)同样的步骤培养上述双歧杆菌属细菌并回收培养上清。将该培养上清中的蛋白质用三氯乙酸(TCA、和光纯药工业株式会社制)沉淀，用丙酮洗涤后，溶解于SDS－PAGE用缓冲液，在95℃下进行3分钟热处理，作为各培养上清浓缩物。
(蛋白印迹解析)
将上述各培养上清浓缩物(相当于培养液0.1mL)用Mini-PROTEAN(注册商标)TGXTM凝胶(4～20％)(Bio-Rad Laboratories,Inc.制)进行电泳，用iBlot Transfer device(Life Technologies公司制)将凝胶转印到PVDF膜(membrane)(iBlot Transfer Stacks、Life Technologies公司制)。将印迹结束后的PVDF膜封闭(2％ECL Prime Blocking agent(GE Healthcare Japan株式会社制)in TTBS)。电泳及向膜的印迹共进行2组，对于第一枚PVDF膜，为了检测抗hPD－1scFv03而使用作为一抗的抗组氨酸抗体(THE His Tag抗体Antibody，mAb，Mouse)(GenScript公司制)、作为二抗的ECL过氧化物酶标记的抗小鼠抗体(GE Healthcare公司制)。另一枚PVDF膜为了检测抗hCTLA－4scFv02而使用作为一抗的抗FLAG抗体单克隆抗－FLAG M2抗体(产生于小鼠)(Sigma公司制)、作为二抗的ECL过氧化物酶标记的抗小鼠抗体(GE Healthcare公司制)。对于抗体反应结束后的膜片，使用WesternLightning Ultra(PerkinElmer公司制)使其发光。将其用成像装置MYECL Imager(ThermoScientific公司制)解析。将结果示于图10。
(结果)
由图10可明确，含有在抗hPD－1scFv03的C末端融合有His标签的抗人PD－1scFv03分泌表达盒及在抗hCTLA－4scFv02的C末端融合有FLAG标签的抗人CTLA－4scFv02FLAG分泌表达盒的PC1株(A、B中均为泳道1)及CP1株(A、B中均为泳道2)的培养上清中，均观察到抗hPD－1scFv03和抗hCTLA－4scFv02两者。此外，PC1株(A：泳道1)和CP1株(A：泳道2)的hPD－1scFv分泌蛋白的大小与hPD－1scFv03单独表达株(A：泳道3)的hPD－1scFv分泌蛋白的大小相同，PC1株(B：泳道1)和CP1株(B：泳道2)的hCTLA－4scFv分泌蛋白的大小与hCTLA－4scFv02单独表达株(B：泳道4)的hCTLA－4scFv分泌蛋白的大小相同。由此确认，共表达双歧杆菌属细菌株PC1株及CP1株为可以在培养上清中分泌抗hPD－1scFv和抗hCTLA－4scFv两者的重组双歧杆菌属菌株。
[实施例10]
[PC1株所分泌的抗体与hPD－1及hCTLA－4的结合确认]
利用ELISA法，来确认从上述共表达株PC1株的培养上清纯化出的抗hPD－1scFv03有无与人PD－1(hPD－1)的结合活性、抗hCTLA－4scFv02有无与人CTLA－4的结合活性。
在96孔板中，分别分注各100μL用1×PBS制备的1μg/mL的hPD－1(重组人hPD－1FcChimera、R&D Systems公司制)、hCTLA－4(重组人CTLA－4－Fc Chimera、Biolegend公司制)、mPD－1(重组人hPD－1Fc Chimera、R&D Systems公司制)及mCTLA－4(重组小鼠CTLA－4－Fc Chimera、Biolegend公司制)，在4℃下静置一晚从而进行固定化。除去液体后，各分注350μL 1×PBS，除去液体。将其重复洗涤3次。在上述板中各分注1％BSA溶液350μL，在室温下静置2小时，从而进行封闭。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
将抗hPD－1scFv03及抗hCTLA－4scFv02用信号增强试剂(Signal EnhancerHIKARI、Nacalai tesque公司制)调节为1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL及1ng/mL，在上述封闭结束后，在板中各分注100μL。在空白对照的孔中，仅分注信号增强试剂100μL。在板上贴上密封带，在室温下静置2小时后，使固定化的hPD－1、mPD－1及hCTLA－4与抗hPD－1scFv03反应。同样地，使固定化的hCTLA－4、mCTLA－4及hPD－1与抗hCTLA－4scFv02反应。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
将二抗(Anti－Histag－Biotin、MBL公司制)用信号增强试剂稀释成2000倍，将其以100μL分注到与抗hPD－1scFv03反应的孔中。同样地，将二抗(THE(注册商标)DYKDDDDKTag抗体[Biotin]，mAb，mouse、GenScript公司制)用信号增强试剂稀释至2500倍，将其以100μL分注到与抗hCTLA－4scFv02反应的孔中。在板上贴上密封带，在室温下静置2小时。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
作为亲和素－生物素标记酶复合物(VECTASTAIN ABC试剂盒、Vector公司制)，将A液及B液各3滴添加到信号增强试剂7.5mL中。将其在各板中各分注100μL后，在板上贴上密封带，在室温下静置30分钟。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
作为检测试剂，将Color SolutionA及Color SolutionB(R&D Systems公司制)等量混合，各分注200μL，遮光，在室温下静置20分钟。在准确地经过20分钟后，各添加终止液(R&D Systems公司)50μL，使呈色反应停止。测定450nm及570nm(参比波长)处的吸光度。将利用ELISA法测定的抗hPD－1scFv03与人PD－1固定化板的结合结果示于以下的表6及图11。同样地，将抗hCTLA－4scFv02与人CTLA－4固定化板的结合结果示于以下的表7及图12。
[表6]
抗hPD－1scFv03与人PD－1固定化板的结合(OD值)
[表7]
抗hCTLA－4scFv02与人CTLA－4固定化板的结合(OD值)
(结果)
由表6及图11可明确，从共表达株PC1株的培养上清纯化出的抗hPD－1scFv03与hPD－1结合。此外，由表7及图12可明确，抗hCTLA－4scFv02与hCTLA－4结合。另一方面，抗hPD－1scFv03不与hCTLA－4及mPD－1结合，此外，抗hCTLA－4scFv02不与hPD－1及mCTLA－4结合。由该结果可以确认，共表达株PC1株所分泌的抗hPD－1scFv03及抗hCTLA－4scFv02与对应的抗原蛋白质特异性结合。
[实施例11]
[在人PD－L1与人PD－1的结合反应中、抗hPD－1scFv的竞争性抑制活性]
当配体PD－L1与PD－1结合时，负信号被传递到T细胞，从而抑制免疫反应(免疫耐受)。因此，对在人PD－L1与人PD－1的结合反应中、抗hPD－1scFv的竞争性抑制活性进行了研究。
使用从上述共表达株PC1株的培养上清纯化出的抗hPD－1scFv03，通过ELISA法进行对于人PD－L1(hPD－L1)与人PD－1(hPD－1)的结合的竞争性结合抑制活性的确认。作为阴性对照，使用抗hCTLA－4scFv02。
在96孔板中，各分注用1×PBS调节为1μg/mL的hPD－1(Recombinant HumanPD－1Fc Chimera、R&D Systems公司制)100μL，在4℃下静置一晚，从而进行固定化。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
在上述板中，各分注1％BSA溶液350μL，在室温下静置2小时，从而进行封闭。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。将hPD－L1(R&D Systems，Recombinant HumanB7－H1/PD－L1FcChimera)用上述信号增强试剂调节为2000ng/mL。
将从双歧杆菌属细菌纯化出的抗hPD－1scFv03用上述信号增强试剂调节为20000ng/mL、2000ng/mL、200ng/mL及20ng/mL，与分别调节为120μL的hPD－L1等量混合，在上述封闭结束后，在板中各分注100μL。对作为阴性对照的从双歧杆菌属细菌纯化出的抗hCTLA－4scFv02，也与上述同样地制备。在空白对照的孔中，仅分注信号增强试剂100μL。在板上贴上密封带，在室温下静置2小时，使与抗hPD－1scFv03混合后的hPD－L1和固定化的hPD－1反应。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。将针对hPD－L1的二抗(Biotinanti－humanCD274、Biolegend公司制)用信号增强试剂调节为0.2μg/mL，将其各分注100μL。在板上贴上密封带，在室温下静置30分钟。除去液体后，各分注1×PBS350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
作为上述亲和素－生物素标记酶复合物，将A液及B液各1滴添加到信号增强试剂2.5mL中。将其各分注100μL，在板上贴上密封带，在室温下静置30分钟。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。作为检测试剂，将Color SolutionA及ColorSolutionB(R&D)等量混合，各分注200μL，遮光，在室温下静置20分钟。准确经过20分钟后，各添加终止液(R&D)50μL，使呈色反应停止。测定450nm及570nm(参比波长)处的吸光度。将测定结果示于以下的表8及图13。
[表8]
在人PD－L1与人PD－1的结合反应中，抗PD－1scFv03的竞争性结合抑制
(结果)
由表8及图13可明确，关于对1000ng/mL的hPD－L1与hPD－1的结合的抑制率，在10000ng/mL的抗hPD－1scFv03的情况下为69.3％。根据以上的结果，对1000ng/mL的hPD－L1与hPD－1的结合，抗hPD－1scFv03在10000ng/mL以上的浓度时显示竞争性结合抑制。
[实施例11－1]
[在人CD80及人CD86与人CTLA－4的结合反应中、hCTLA－4scFv的竞争性抑制活性的确认]
使用从上述共表达株PC1株的培养上清纯化出的抗hCTLA－4scFv02，通过ELISA法进行人CD80(hCD80)及人CD86(hCD86)与人CTLA－4(hCTLA－4)的结合的竞争性结合抑制活性的确认。作为阴性对照，使用抗hPD－1scFv03。
在96孔板中，各分注用1×PBS调节为1μg/mL的hCTLA－4(Recombinant HumanCTLA－4－Fc Chimera，carrier－free、BioLegend公司制)100μL，在4℃下静置一晚，从而进行固定化。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
在上述板中，各分注1％BSA溶液350μL，在室温下静置2小时，从而进行封闭。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。将hCD80(R&D Systems，Recombinant Human B7－1/CD80Fc Chimera)及hCD86(R&D Systems，Recombinant HumanB7－2/CD86Fc Chimera)用上述信号增强试剂调节为2000ng/mL。
将从双歧杆菌属细菌纯化出的抗hCTLA－4scFv02用上述信号增强试剂调节为20000ng/mL、2000ng/mL、200ng/mL及20ng/mL，与各120μL调节后的hCD80及hCD86等量混合，在上述封闭结束后，在板中各分注100μL。作为阴性对照，对于从双歧杆菌属细菌纯化出的抗hPD－1scFv03，也与上述同样进行调节。在空白对照的孔中，仅分注信号增强试剂100μL。在板上贴上密封带，在室温下静置2小时，使与抗hCTLA－4scFv02混合后的hCD80及hCD86和固定化的hCTLA－4反应。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
将针对hCD80的二抗(R&D Systems，人B7－1/CD80生物素化抗体)及针对hCD86的二抗(R&D Systems，生物素化抗人B7－2抗体)用上述信号增强试剂调节为2.5μg/mL及0.5μg/mL，将其各分注10μL。在板上贴上密封带，在室温下静置30分钟。除去液体后，各分注1×PBS350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。
作为上述亲和素－生物素标记酶复合物，将上述A液及B液各3滴添加到信号增强试剂7.5mL中。将其各分注100μL，在板上贴上密封带，在室温下静置30分钟。除去液体后，各分注1×PBS 350μL，除去液体。将其重复洗涤3次。作为检测试剂，将Color SolutionA及Color SolutionB(R&D)等量混合，各分注200μL，遮光，在室温下静置20分钟。准确经过20分钟后，各添加终止液(R&D)50μL，使呈色反应停止。测定450nm及570nm(参比波长)处的吸光度。将结果示于以下的表9、表10以及图14、图15。
[表9]
在人CD80与人CTLA－4的结合反应中、抗hCTLA－4scFv02的竞争性结合抑制
[表10]
在人CD86与人CTLA－4的结合反应中、hCTLA－4scFv02的竞争性结合抑制
(结果)
由表9、表10以及图14、图15可明确，关于对1000ng/mL的hCD80及hCD86与hCTLA－4的结合的抑制率，在1000ng/mL的抗hCTLA－4scFv02的情况下分别为43.7％及70.0％，在10000ng/mL的抗hCTLA－4scFv02的情况下，分别为81.7％及100.0％。表明抗hCTLA－4scFv02在1000ng/mL以上的浓度时对1000ng/mL的hCD80及hCD86与hCTLA－4的结合进行竞争性结合抑制。
[实施例12]
[与从共表达双歧杆菌属细菌纯化出的抗hPD－1scFv及抗hCTLA－4scFv与细胞的结合：使用抗原过表达细胞株的研究]
使用以下的过表达抗原蛋白的细胞，通过流式细胞术法来研究从上述共表达株PC1株的培养上清纯化出的抗hPD－1scFv是否与人PD－1(hPD－1)表达细胞结合、以及抗hCTLA－4scFv是否与人CTLA－4(hCTLA－4)表达细胞结合。
使用hPD－1过表达HEK293T细胞(hPD－1在大鼠CD2和双顺反子中表达)及hCTLA－4过表达HEK293T细胞(hCTLA－4在大鼠CD2和双顺反子中表达)。hPD－1过表达HEK293T细胞及hCTLA－4过表达HEK293T细胞在含有灭活的10％胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，播种到100mm培养盘(Greiner Bio-One日本公司制)中。除去hPD－1过表达HEK293T细胞及hCTLA－4过表达HEK293T细胞的培养上清，用PBS(无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液)洗涤2次，加入用PBS稀释为10倍的胰蛋白酶·EDTA溶液(和光纯药工业公司制)1mL，在室温下静置1分钟后，加入10mL含有灭活的10％胎牛血清的DMEM培养基，转移到15mL离心管(BD Falcon公司制)中。用低速离心机(TOMY SEIKO Co,Ltd.,制)在1000rpm下离心分离5分钟后，除去上清，加入1mL的含有灭活的10％胎牛血清的DMEM培养基，计测细胞数。进一步添加DMEM培养基而制备1×105个细胞/mL的细胞悬浮液，按照1×105个细胞/mL/管的方式分注到1.5mL管(Ina-optika corporation制)中。将分注到1.5mL管中的hPD－1过表达HEK293T细胞及hCTLA－4过表达HEK293T细胞用微量冷却离心机(TOMY SEIKO Co,Ltd.,制)在5000rpm、4℃下离心分离1分钟后，除去上清。将管中残留的细胞的颗粒用0.5mL的PBS洗涤2次后，在各管中添加100μL的从重组双歧杆菌属细菌纯化出的、调节为10μg/mL的抗hPD－1scFv03及抗hCTLA－4scFv02，在冰上静置30分钟。30分钟后，在管中加入FACS缓冲液(含有1％BSA、0.1％NaN3的PBS)500μL，用上述微量冷却离心机在5000rpm、4℃下离心分离1分钟后，除去上清，进行洗涤。再进行一次同样的操作，进行2次洗涤操作。在1.5mL管中添加用FACS缓冲液稀释为0.5μg/mL的抗－His－tag Alexa Fluor488抗体(MBL公司制)及抗－DDDDK－tag Alexa Fluor488抗体(MBL公司制)100μL后，通过吹打充分混合，在冰上静置30分钟。30分钟后，在管中加入FACS缓冲液500μL，用上述微量冷却离心机在5000rpm、4℃下离心分离1分钟后，除去上清，进行洗涤。再进行一次同样的操作，进行2次洗涤操作。添加500μL的FACS缓冲液后，将用FACS缓冲液悬浮的细胞转移到5mL聚苯乙烯圆底管(Becton·Dickinson公司制)中。添加用FACS缓冲液稀释为5μg/mL的碘化丙啶溶液5μL，用BD FACS canto II流式细胞仪(Becton·Dickinson公司制)及流式细胞术解析软件Kaluza ver1.2(Beckman·Coulter公司制)进行解析。将由PC1株纯化出的抗PD－1scFv03与人PD－1过表达细胞的结合的结果示于图16。同样地，将由共表达株PC1株纯化出的抗CTLA－4scFv02与人CTLA－4过表达细胞的结合的结果示于图17。
(结果)
由图16可明确，确认由PC1株纯化出的抗PD－1scFv03与人PD－1高表达细胞(大鼠CD2高表达细胞)特异性结合。同样地，由图17可明确，确认由PC1株纯化出的抗CTLA－4scFv02与人CTLA－4高表达细胞(大鼠CD2高表达细胞)特异性结合。由这些结果可确认，由共表达株PC1株纯化出的scFv与人PD－1及人CTLA－4过表达细胞特异性结合。
[实施例13]
[抗HER2scFv及hIFN－γ共表达双歧杆菌属细菌株HG－2株的制作]
(概要)
制作含有分泌抗HER2scFv的表达盒(抗HER2scFv分泌表达盒)和分泌hIFN－γ的表达盒(人IFN－γ分泌表达盒)的、作为大肠杆菌－双歧杆菌属细菌穿梭载体的共表达质粒pHG－2(图2)。使用该pHG－2利用电穿孔法进行长双歧杆菌105－A株的转化，取得抗HER2scFv及hIFN－γ共表达双歧杆菌属细菌HG－2株。将实施例13中使用的引物示于以下的表11。
[表11]
引物名称 DNA序列(5’->3’) 序列号
pTB6_Vec_F1 ACTAGTCCTCCAGGACCTCGTCTAC 序列号48
Hu-term_Vec_R1 CCGGAATAATACGGTTGGACAAC 序列号49
Hu-HuT_ins_F1 accgtattattccggGGATCCGTCTTCCTGCTGG 序列号50
HuT-pTB6_ins_R1 tcctggaggactagtCCGGAATAATACGGTTGGACAAC 序列号51
Hu_Vec_F1 GGATCCGTCTTCCTGCTGG 序列号52
bHER2-His_Vec_R1 TCAGTGATGATGATGATGATGCTTG 序列号53
d0013+T_ins_F1 catcatcatcactgaAACCGCTTCTCATTTCCATTTG 序列号54
d0013+T_ins_R1 caggaagacggatccGTGCACCGAATCGCGCT 序列号55
作为抗HER2scFv分泌表达盒，制作对于(1)P30启动子DNA、(2)编码信号肽－接头连接体SP7L20的DNA、(3)编码抗HER2scFv的氨基酸序列的DNA、(4)编码His标签序列的DNA、(5)d0013终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(5)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(5)的DNA的盒。
(质粒pHG－2的制作)
在制作质粒pHG－2时，首先制作质粒pHG－1。
(质粒pHG－1的制作)
(hIFNg嵌入片段的制备)
以质粒phIFNg33(序列号16)为模板，使用上述表11记载的Hu－HuT＿ins＿F1(正向)及HuT－pTB6＿ins＿R1(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照嵌入片段与载体片段的末端15bp重复的方式进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为20μL，使用STAR试剂盒进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下72秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，从而制备约1.1kbp的hIFNg嵌入片段扩增产物。
(含有编码抗HER2scFv蛋白的氨基酸序列的DNA的载体片段的制备)
以pP30SP7L20－bHER2(序列号15)为模板，使用表11记载的pTB6＿Vec＿F1(正向)及Hu－term＿Vec＿R1(反向)的引物组进行PCR扩增。引物序列按照嵌入片段与载体片段的末端15bp重复的方式进行设计。将各引物浓度设为0.2μM，将反应体积设为20μL，使用STAR试剂盒进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下4分45秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，从而制备约4.6kbp的载体片段扩增产物。
(In Fusion反应12)
将上述所制备的4.6kbp的载体片段扩增产物及约1.1kbp的嵌入片段用In－Fusion(注册商标)HD Cloning试剂盒(宝生物株式会社制)连接。首先，利用Clontech公司的网站In－Fusion(注册商标)Molar Ratio Calculator(http：//bioinfo.clontech.com/infusion/molarRatio.do)算出需要的嵌入物量及载体量，并设为载体：嵌入物＝1：2的摩尔比。将5×In－Fusion HD Enzymes premix2μL、Cloning Enhancer 1μL、需要量的嵌入物及载体混合，用0.1×TE缓冲液(1mM Tris－HCl、0.1mM EDTA、pH7.5)将反应体系的总量调节为10μL。在37℃下反应15分钟后，在50℃下反应15分钟，在4℃下静置。其它步骤按照试剂盒的产品说明书，从而制备In Fusion反应液12。
(大肠杆菌的转化及质粒pHG－1的DNA序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，使用上述In Fusion反应液12进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。通过同样的步骤进行所提取的质粒中的抗HER2scFv分泌表达盒及人IFN－γ分泌表达盒的DNA序列的序列确定。将所提取的质粒命名为pHG－1。将质粒pHG－1的DNA序列示于序列号17。
(pHG－2株的制备)
将质粒pHG－1的抗HER2scFv表达分泌盒的终止子由Hu终止子替换为d0013终止子。以上述pHG－1为模板，使用上述表11记载的Hu＿Vec＿F1(正向)及bHER2－His＿Vec＿R1(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下5分45秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约5.6kbp的载体片段扩增产物。
以长双歧杆菌105－A的基因组DNA为模板，使用上述表11记载的d0013+T＿ins＿F1(正向)及d0013+T＿ins＿R1(反向)的引物组进行PCR扩增。作为扩增的程序，以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下35秒为1个循环，进行30个循环后，在72℃下进行30秒延伸反应，除此以外，通过与上述(质粒pAG8的制作)同样的步骤制备约144bp的嵌入片段扩增产物。
(In Fusion反应13)
使用上述所制备的载体片段和嵌入片段，除此以外，通过与上述(In Fusion反应10)同样的步骤制备In Fusion反应液13。
(大肠杆菌的转化及质粒pHG－2的DNA的序列确认)
通过与上述(大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，使用上述In Fusion反应液13进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取。通过同样的步骤进行所提取的质粒中的抗HER2scFv分泌表达盒及人IFN－γ分泌表达盒的DNA序列的序列确定。将所提取的质粒命名为pHG－2。将质粒pHG－2的DNA序列示于序列号100。
(双歧杆菌属细菌的转化9)
使用从上述转化后的大肠杆菌提取出的质粒pHG－2(500ng)，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pHG－2(以下称为HG－2株)。
[实施例14]
[HG－2株中的抗HER2scFv及hIFN－γ的分泌确认]
通过蛋白印迹法如下确认HG－2株的培养上清中有无抗HER2scFv及hIFN－γ。
(重组双歧杆菌属细菌的培养)
对于上述HG－2株、仅具有人IFN－γ分泌表达盒一者的作为单独表达株的P30SP7L20－bHER2(质粒pP30SP7L20－bHER2导入株)株、hIFNg33株，通过与实施例4(重组双歧杆菌属细菌的培养)同样的步骤培养上述双歧杆菌属细菌，回收培养上清。将该培养上清中的蛋白质用三氯乙酸(TCA、和光纯药工业株式会社制)沉淀，用丙酮洗涤后，溶解于SDS－PAGE用缓冲液，在95℃下进行3分钟热处理，作为各培养上清浓缩物。
(蛋白印迹解析)
对于上述各培养上清浓缩物(相当于培养液0.1mL)，通过与实施例9的(蛋白印迹解析)同样的步骤对印迹结束后的膜进行封闭。然后，使用作为抗组氨酸抗体的上述THEHis Tag抗体，mAb，Mouse作为一抗，使用上述ECL过氧化物酶标记的抗小鼠抗体作为二抗，对于抗体反应结束后的膜片，使用上述Western Lightning Ultra使其发光。将其用成像装置Fluor－S Max(BIO－RAD公司制)解析。将结果示于图18。
(结果)
由图18可明确，HG－2株中检测到抗HER2scFv和hIFN－γ两者，其大小分别与单独表达株的分泌物同样。需要说明的是，泳道M中加入的是标记，泳道1中加入的是来自抗HER2scFv单独表达株(P30SP7L20－bHER2株)的分泌蛋白，泳道2中加入的是来自hIFN－γ单独表达株(hIFNg33株)的分泌蛋白，泳道3中加入的是来自抗HER2scFv及hIFN－γ共表达株(HG－2株)的分泌蛋白。
[实施例15]
[HG－2株分泌物的生理活性的研究]
(培养上清浓缩物的制备和hINF－γ蛋白的表达量确认)
对于上述HG－2株、P30SP7L20－bHER2株、hIFNg33株、BE穿梭菌株，分别在MRS(75μg/mL壮观霉素、1％维生素C添加液)液体培养基中接种1％，在37℃下厌氧培养24小时(活化培养)。在将MRS液体培养基2mL加入到DMEM培养基(低葡萄糖，Life technologies公司制)18mL中而成的DMEM/MRS(75μg/mL壮观霉素、0.5％维生素C添加液)培养基中接种活化培养液0.5％。将其在37℃下厌氧培养18小时(主培养)。将该培养液20mL离心分离，回收培养上清13mL后，用孔径0.2μm的过滤器过滤而除去菌体。将该培养上清10mL用Amicon Ultra－4(Millipore公司制)浓缩后交换为PBS(－)并达到500μL(双歧杆菌属细菌培养上清的浓缩物(PBS交换))。将各细菌培养上清浓缩物用前述hIFN－γ测定用的ELISA试剂盒通过ELISA法测定培养上清中的IFN－γ量。将测定结果示于以下的表12。
[表12]
双歧杆菌属细菌培养上清浓缩物的人IFN－γ浓度测定
(HG－2株分泌物中的抗HER2scFv的癌细胞增殖抑制活性)
关于抗HER2scFv的生理活性，将从P30SP7L20－bHER2株的培养上清中进行His标签纯化而得的抗HER2scFv(PBS交换)添加到HER2阳性细胞(NCI－N87(胃癌)细胞)中，测定细胞增殖抑制活性。即，将NCI－N87细胞在RPMI1640培养基(10％(v/v)FBS)中在37℃、5％CO2的条件下培养后，在96孔板中各播种2×104个细胞，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。然后，吸除旧培养基并各添加新RPMI1640培养基(10％(v/v)FBS)98μL。然后，各添加2μL的作为测定试样的PBS(－)、调节为244ng/mL～1mg/mL的抗HER2scFv。将该板在37℃、5％CO2的条件下培养5天。
吸除上述培养5天后的培养基后，各添加在新RPMI1640培养基(10％(v/v)FBS)9mL中加入有Cell Counting kit－8 1mL的液体100μL后，进一步在37℃、5％CO2的条件下保温3小时，测定波长450nm和630nm(参比波长)处的吸光度，从而测定对上述HER2阳性细胞的细胞增殖抑制活性。将结果示于图19。
(结果)
由图19可明确，从上述长双歧杆菌Re－105A/pP30SP7L20－bHER2纯化出的抗HER2scFv对NCI－N87胃癌细胞显示出用量依赖性的细胞增殖抑制活性，确认重组双歧杆菌属细菌所分泌的抗HER2scFv具有生理活性。
[实施例16]
(HG－2株所分泌的抗HER2scFv及hIFN－γ的癌细胞增殖抑制活性1)
对于作为由共表达株分泌的蛋白质的抗HER2scFv及hINF－γ的生理活性，通过在HER2阳性细胞(NCI－N87细胞)中添加实施例15所得到的双歧杆菌属细菌(HG－2株)培养上清的浓缩物(PBS交换)并调查增殖抑制活性来进行判定。即，将NCI－N87细胞在RPMI1640培养基(10％(v/v)FBS)中在37℃、5％CO2的条件下培养后，在96孔板中各播种2×104个细胞，在37、5％CO2的条件下培养24小时。从该细胞培养液中吸除旧培养基，各添加新RPMI1640培养基(10％(v/v)FBS)90μL。然后，各添加10μL的作为测定试样的PBS(－)、BE穿梭菌株培养上清浓缩物(阴性对照)、P30SP7L20－bHER2株培养上清浓缩物、hINFg33株培养上清浓缩物(用PBS将hIFN－γ浓度稀释、调节为2000ng/mL)、HG－2株培养上清浓缩物及重组hIFN－γ(阳性对照，将hIFN－γ浓度调节为2000ng/mL)。将该板在37℃、5％CO2的条件下培养5天。
细胞增殖抑活性的测定通过与上述(抗HER2scFv的细胞增殖抑制活性)中记载的方法相同的方法来实施。将结果示于图20。
由图20可明确，来自作为抗HER2scFv/hIFN－γ共表达株的HG－2株的培养上清浓缩物对NCI－N87细胞显示出非常强的细胞增殖抑制活性。另一方面，来自hIFN－γ单独表达株hINFg33株培养上清的浓缩物在200ng/mL的hIFN－γ的情况下，与作为标准品使用的重组hIFN－γ(PeploTech公司制)显示同样的细胞增殖抑制活性。此外，来自P30SP7L20－bHER2株的浓缩物确认到与实施例15同样的细胞增殖抑制活性。抗HER2scFv/hIFN－γ共表达株HG－2株的细胞增殖抑制活性比同时进行的hIFN－γ单独表达株及P30SP7L20－bHER2株的活性都强，可以认为这是由共分泌的hIFN－γ及抗HER2scFv两蛋白的协同的并用效果产生的。
[实施例17]
[抗HER2scFv及hIFN－γ共表达株的肿瘤内分泌的确认]
使用人胃癌细胞株NCI－N87的荷瘤裸小鼠，通过革兰氏染色来确认肿瘤内的双歧杆菌属细菌的定位，通过利用抗组氨酸标签抗体及抗hIFN－γ抗体的免疫组织染色来确认抗HER2scFv和hIFN－γ的定位。
将人胃癌细胞株NCI－N87(ATCC)用10％FBS(EQUITECH－BIO，INC.公司制)的RPMI1640培养基(和光纯药工业公司制)进行培养，移植到裸小鼠(日本SLC公司制)中，制作荷瘤小鼠。对肿瘤尺寸为约470mm3的荷瘤小鼠，从尾静脉以6x108cfu的用量给药抗HER2scFv及hIFN－γ共表达株(HG－2株)的简易冷冻制剂以及作为对照的非表达株的BE穿梭菌株的简易冷冻制剂。需要说明的是，将10％麦芽糖溶液按照每次1mL、1天2次的频率给药5天。给药7天后摘出肿瘤，用O.C.T.复合物(Sakura Finetek公司制)冷冻包埋，用冷冻切片机Leica CM1900(Leica公司制)制作切片标本，供于各组织染色。
(革兰氏染色)
将上述切片标本风干，在4％PFA(和光纯药工业公司制)中浸渍10分钟而固定。固定后，作为预染色，用バーミーM结晶紫溶液(武藤化学公司制)染色2分钟后，与バーミーM碘·氢氧化钠溶液(武藤化学公司制)反应1分钟。用バーミーM丙酮·乙醇混合液(武藤化学公司制)脱色后，用バーミーM0.1％品红液(武藤化学公司制)染色1分钟。染色后，用纯化水洗涤，用99.5％乙醇(和光纯药工业公司制)脱水，用Lemosol(和光纯药工业公司制)透明后，用Entellan new(MERCK KGaA公司制)密封。将结果示于图21。
(利用抗组氨酸标签抗体及抗hIFN－γ抗体的免疫组织染色)
将上述切片标本风干，在4％PFA(和光纯药工业公司制)中浸渍约4小时而固定。固定后，用纯化水洗涤1分钟，用1×PBS(－)实施3次各5分钟的洗涤。拭去组织周围的水分，用Dako pen(Dako公司制)包围组织的周围，将3％BSA－PBS滴加到组织上并反应60分钟，实施非特异性结合的抑制。将抗－His－tag mAb－Alexa Fluor(注册商标)594(MBL公司制)及FITC抗－人IFN－γ抗体(BioLegend公司制)用Can Get Signal(注册商标)immunostain(TOYOBO公司制)混合、稀释，作为抗体反应液滴加到组织上，在4℃下反应一晩。在抗体反应后，用1×PBS(－)实施3次各5分钟的洗涤，用VECTASHIELD(注册商标)Mounting Mediumwith DAPI密封。将上述染色后的切片用显微镜DM5000B(Leica公司制)镜检，拍摄图像。将结果示于图22及23。
(结果)
由图21可明确，通过革兰氏染色，对于HG－2株(A)及BE穿梭菌株(B)分别确认了肿瘤组织中存在菌(图21(A)及(B)、箭头部分)。另一方面，通过利用抗hIFN－γ抗体的免疫组织染色，在给药共表达株HG－2株的荷瘤小鼠的肿瘤组织中确认到hIFN－γ阳性像(图22、箭头所示的绿色部分)。此外，通过组氨酸标签的免疫组织染色确认到组氨酸标签阳性像(抗HER2scFv及hIFN－γ)(图23、箭头所示的红色部分)。由这些结果可确认，对人胃癌NCI－N87荷瘤小鼠静脉内给药HG－2株时，HG－2株在肿瘤内定植，由HG－2株分泌的hIFN－γ及抗HER2scFv蛋白同时存在于肿瘤内。
[实施例18]
[抗人PD－1scFv03－His及抗人CTLA－4scFv01－FLAG共表达株的制作]
制作分泌抗人PD－1scFv03－His及抗人CTLA－4scFv01－FLAG的、作为大肠杆菌－双歧杆菌属细菌穿梭载体的共表达质粒pPC2、pPC3、pPC4、pPC5、pPC6、pPC7及pPC8，使用这7种共表达质粒分别进行长双歧杆菌105－A株的转化。
将7种共表达质粒pPC2～pPC8中的抗人PD－1scFv03－His表达盒及抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒的结构示于以下的表13－1及表13－2。为了避免质粒分子内的相同序列，使编码各表达盒内的启动子DNA、终止子DNA、标签及信号肽－接头肽连接体的DNA序列不含相同结构。
[表13-1]
[表13-2]
(抗hPD－1scFv03－His分泌表达盒的结构)
作为抗hPD－1scFv03－His分泌表达盒，制作对于(1)Hu启动子DNA、(2)编码信号肽－接头肽连接体的DNA、(3)编码抗hPD－1scFv03氨基酸序列的DNA、(4)编码His标签序列的DNA及(5)Hu终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(5)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(5)的DNA的盒。作为上述信号肽－接头肽连接体，使用SP50L5(在序列号61的氨基酸序列上结合有序列号83的最初的5个氨基酸序列(Ala Thr Leu Thr Pro)的分泌信号肽－接头肽连接体)、SP67L10(在序列号73的氨基酸序列上结合有序列号95的最初的10个氨基酸序列(Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly)的分泌信号肽－接头肽连接体)或SP69L1(在序列号77的氨基酸序列上结合有序列号99的最初的1个氨基酸序列(Asp)的分泌信号肽－接头肽连接体)。
(抗hCTLA－4scFv01－FLAG分泌表达盒的结构)
作为抗hCTLA－4scFv01－FLAG分泌表达盒，制作对于(1)P30启动子DNA、(2)编码信号肽－接头肽连接体的DNA、(3)编码抗hCTLA－4scFv01的氨基酸序列的DNA、(4)编码FLAG标签序列的DNA及(5)T2终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(5)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(5)的DNA的盒。作为上述信号肽－接头肽连接体，使用SP50L5(在序列号61的氨基酸序列上结合有序列号83的最初的5个氨基酸序列(Ala Thr Leu Thr Pro)的分泌信号肽－接头肽连接体)、SP67L1(在序列号73的氨基酸序列上结合有序列号95的最初的1个氨基酸序列(Ala)的分泌信号肽－接头肽连接体)或SP68L1(在序列号75的氨基酸序列上结合有序列号97的最初的1个氨基酸序列(Asp)的分泌信号肽－接头肽连接体)。
将共表达质粒pPC2～pPC8的基本结构示于图24。
此外，将制作方法的概要示于图25。
(1)第1工序中，制作用于制作共表达质粒pPC2～pPC8的模板质粒(pHuSPxLy－hPD－1scFv03－His(SPxLy＝SP50L5，SP67L10，SP69L1))。
(2)第2工序中，制作在抗hPD－1scFv03－His表达质粒pHuSPxLy－hPD－1scFv03－His(SPxLy＝SP50L5、SP67L10、SP69L1)的抗hPD－1scFv03－His表达盒的下游插入有T2终止子片段的质粒pHuSPxLy－hPD－1scFv03－His－T2(SPxLy＝SP50L5、SP67L10、SP69L1)。
(3)第3工序中，在第2工序所制作的质粒的Hu终止子和T2终止子之间插入抗hCTLA－4scFv01－FLAG表达盒(其中，不含终止子)，进行共表达质粒pPC2～pPC8的制作。
(第1工序)
A工序：制备以实施例8所制作的质粒pHuSP7L20－hPD－1scFv03(在scFv序列的3’末端附加有组氨酸标签)为模板DNA而制作的直链载体(vector)和由105－A基因组DNA制作的SP50嵌入物(insert)、SP67嵌入物、SP69嵌入物的PCR产物。引物按照PCR产物的末端15bp与下一工序In－fusion反应中所连接的邻接PCR产物的末端15bp为相同序列的方式来设计。延伸反应时间的标准设为每1kbp为1分钟。将此时的PCR扩增工序作为“PCR扩增工序1”。
将上述直链载体和各嵌入物用HD试剂盒通过In Fusion反应而连接。通过与上述(实施例1：大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样的步骤，使用In Fusion反应液进行上述大肠杆菌HST16CR感受态细胞的转化、重组大肠杆菌中的质粒的提取，进行所提取的质粒中的“抗hPD－1scFv03－His表达盒区域”(包含从Hu启动子至Hu终止子)的序列确定(以下，从In Fusion反应至序列确定为止通过同样的步骤进行)。将所提取的质粒命名为pHuSP50L20－hPD－1scFv03－His、pHuSP67L20－hPD－1scFv03－His及pHuSP69L20－hPD－1scFv03－His。
B工序：制备由上述pHuSP50L20－hPD－1scFv03－His、pHuSP67L20－hPD－1scFv03－His及pHuSP69L20－hPD－1scFv03－His所制作的SP50L5嵌入物、SP67L10嵌入物、SP69L1嵌入物的PCR产物。
与前述同样地，将A工序中制作的直链载体与上述SP50L5嵌入物、SP67L10嵌入物、SP69L1嵌入物用HD试剂盒连接，进行“抗hPD－1scFv03－His表达盒区域”的序列确定。将所提取的质粒命名为pHuSP50L5－hPD－1scFv03－His、pHuSP67L10－hPD－1scFv03－His及pHuSP69L1－hPD－1scFv03－His。
(第2工序)
(T2终止子的制作)
委托GenScript Japan株式会社进行(序列号101)的合成，命名为T2终止子。以整合到质粒载体pUC57中的DNA(Bba-B0015in pUC57)形式交货。
分别以上述pHuSP50L5－hPD－1scFv03－His、pHuSP67L10－hPD－1scFv03－His及pHuSP69L1－hPD－1scFv03－His为模板DNA，使用PC1＿引物(序列号102)作为正向引物、使用PC2＿引物(序列号103)作为反向引物，均与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物，作为A1、A2、或A3的直链载体。PCR产物的尺寸分别为4751bp、4697bp、4661bp。
以上述Bba－B0015in pUC57为模板DNA，使用PC3＿引物(序列号104)作为正向引物、使用PC4＿引物(序列号105)作为反向引物，来制备PCR产物B(159bp)。
[表14]
要构建的质粒 In Fusion反应时的组合
pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His-T2 A1和B
pHuSP67L10-hPD-1scFv03-His-T2 A2和B
pHuSP69L1-hPD-1scFv03-His-T2 A3和B
按照上述表14所示的组合，与前述同样地用HD试剂盒进行连接，进行各“抗hPD－1scFv03－His表达盒及T2终止子区域”(5’－Hu启动子－SPxLy－人PD－1scFv03－His－T2终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为pHuSP50L5－hPD－1scFv03－His－T2、pHuSP67L10－hPD－1scFv03－His－T2及pHuSP69L1－hPD－1scFv03－His－T2。
[质粒phCTLAz的制作]
将实施例8中制作的质粒pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG的Hu启动子替换为P30启动子。将概要示于图26。
制备以pHuSP7L20－hCTLA－4scFv02FLAG为模板DNA，使用vec＿F5＿引物(序列号106)作为正向引物、使用vec＿R2＿引物(序列号107)作为反向引物而制作的直链载体的PCR产物(4410bp)，以及以105－A基因组DNA为模板，使用P30＿F1＿引物(序列号108)作为正向引物、使用P30＿R1＿引物(序列号109)作为反向引物而制备嵌入的PCR产物(245bp)。与前述同样地，将该直链载体及嵌入物用HD试剂盒连接，进行所提取的质粒的全长序列的确定。将所提取的质粒命名为phCTLA1。
(质粒phCTLAz(z＝4、10、11)的制作)
将上述所制作的质粒phCTLA1的信号肽序列从SP7替换为SP50、SP67及SP68。
使用表15所示的模板DNA及引物，与PCR扩增1同样进行PCR扩增，从而制备载体及嵌入物。
[表15]
PCR中使用的模板和引物
与前述同样地，将上述表15记载的载体和各嵌入物用HD试剂盒连接，进行“抗hCTLA－4scFv02－FLAG盒区域”的序列确定。将所提取的质粒命名为phCTLA4(SP50时)、phCTLA10(SP67时)、phCTLA11(SP68时)。
(pP30SPx’Ly’－hCTLA－4scFv01－His的制作)
将制作概要示于图27。
(抗CTLA－4单链抗体的表达盒的制作)
参考WO2015/166640中的[pHuSP7L20－scFv－CTLA－4－1的制作]来制作pHuSP7L20－scFv－CTLA－4－1，在本实施例中，命名为pHuSP7L20－hCTLA－4scFv01－His。
使用表16所示的模板DNA及引物，与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物。
[表16]
与前述同样地，将上述表16记载的PCR产物A和各B用HD试剂盒连接，进行“抗hCTLA－4scFv01－His盒区域”的序列确定。将所提取的质粒命名为pP30SP50L5－hCTLA－4scFv01－His、pP30SP67L1－hCTLA－4scFv01－His及pP30SP68L1－hCTLA－4scFv01－His。
[质粒pP30SPx’Ly’－hCTLA－4scFv01－FLAG的制作]
将上述所制作的质粒pP30SPx’Ly’－hCTLA－4scFv01－His(SPx’Ly’＝SP50L5、SP67L1、SP68L1)的组氨酸标签变更为FLAG标签。将概要示于图28。以下，在抗hCTLA－4scFv的情况下有时表示为SPx’Ly’。
使用表17所示的模板DNA及引物，与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物。
[表17]
与前述同样地，将上述表17记载的PCR产物A和各PCR产物B用HD试剂盒连接，进行“抗hCTLA－4scFv01－FLAG盒区域”的序列确定。将所提取的质粒命名为pP30SP50L5－hCTLA－4scFv01－FLAG(以下称为pC1F)、pP30SP67L1－hCTLA－4scFv01－FLAG(以下称为pC2F)及pP30SP68L1－hCTLA－4scFv01－FLAG(以下称为pC3F)。
(第3工序)
使用表18所示的模板DNA及引物，与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物。
[表18]
[表19]
要构建的质粒 In Fusion反应时的组合
pPC2 A7和B2
pPC3 A7和B3
pPC4 A8和B1
pPC5 A8和B3
pPC6 A9和B1
pPC7 A9和B2
pPC8 A9和B3
对于上述表18记载的PCR产物，与前述同样地，按照上述表19所示的组合用HD试剂盒连接，进行所提取的质粒的全长DNA序列确定。将所提取的质粒命名为pPC2、pPC3、pPC4、pPC5、pPC6、pPC7及pPC8。示出各自的概要。
(pPC2的scFv表达盒序列(2618bp)(序列号131))
1..1384 抗人PD－1scFv03－His表达盒
1..361 Hu启动子
362..544 SP50L5
545..1249 抗人PD－1scFv03
1250..1267 His标签
1268..1270 停止密码子
1271..1384 Hu终止子
1385..2618 抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒
1385..1619 P30启动子
1620..1721 SP67L1
1722..2462 抗人CTLA－4scFv01
2463..2486 FLAG标签
2487..2489 停止密码子
2490..2618 T2终止子
(pPC3的scFv表达盒序列(2648bp)(序列号132))
1..1384 抗人PD－1scFv03－His表达盒
1..361 Hu启动子
362..544 SP50L5
545..1249 抗人PD－1scFv03
1250..1267 His标签
1268..1270 停止密码子
1271..1384 Hu终止子
1385..2648 抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒
1385..1619 P30启动子
1620..1751 SP68L1
1752..2492 抗人CTLA－4scFv01
2493..2516 FLAG标签
2517..2519 停止密码子
2520..2648 T2终止子
(pPC4的scFv表达盒序列(2645bp)(序列号133))
1..1330 抗人PD－1scFv03－His表达盒
1..361 Hu启动子
362..490 SP67L10
491..1195 抗人PD－1scFv03
1196..1213 His标签
1214..1216 停止密码子
1217..1330 Hu终止子
1331..2645 抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒
1331..1565 P30启动子
1566..1748 SP50L5
1749..2489 抗人CTLA－4scFv01
2490..2513 FLAG标签
2514..2516 停止密码子
2517..2645 T2终止子
(pPC5的scFv表达盒序列(2594bp)(序列号134))
1..1330 抗人PD－1scFv03－His表达盒
1..361 Hu启动子
362..490 SP67L10
491..1195 抗人PD－1scFv03
1196..1213 His标签
1214..1216 停止密码子
1217..1330 Hu终止子
1331..2594 抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒
1331..1565 P30启动子
1566..1697 SP68L1
1698..2438 抗人CTLA－4scFv01
2439..2462 FLAG标签
2463..2465 停止密码子
2466..2594 T2终止子
(pPC6的scFv表达盒序列(2609bp)(序列号135))
1..1294 抗人PD－1scFv03－His表达盒
1..361 Hu启动子
362..454 SP69L1
455..1159 抗人PD－1scFv03
1160..1177 His标签
1178..1180 停止密码子
1181..1294 Hu终止子
1295..2609 抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒
1295..1529 P30启动子
1530..1712 SP50L5
1713..2453 抗人CTLA－4scFv01
2454..2477 FLAG标签
2478..2480 停止密码子
2481..2609 T2终止子
(pPC7的scFv表达盒序列(2528bp)(序列号136))
1..1294 抗人PD－1scFv03－His表达盒
1..361 Hu启动子
362..454 SP69L1
455..1159 抗人PD－1scFv03
1160..1177 His标签
1178..1180 停止密码子
1181..1294 Hu终止子
1295..2528 抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒
1295..1529 P30启动子
1530..1631 SP67L1
1632..2372 抗人CTLA－4scFv01
2373..2396 FLAG标签
2397..2399 停止密码子
2400..2528 T2终止子
(pPC8的scFv表达盒序列(2558bp)(序列号137))
1..1294 抗人PD－1scFv03－His表达盒
1..361 Hu启动子
362..454 SP69L1
455..1159 抗人PD－1scFv03
1160..1177 His标签
1178..1180 停止密码子
1181..1294 Hu终止子
1295..2558 抗人CTLA－4scFv01－FLAG表达盒
1295..1529 P30启动子
1530..1661 SP68L1
1662..2402 抗人CTLA－4scFv01
2403..2426 FLAG标签
2427..2429 停止密码子
2430..2558 T2终止子
(双歧杆菌属细菌的转化10)
分别使用从上述转化后的大肠杆菌提取出的质粒pPC2、pPC3、pPC4、pPC5、pPC6、pPC7及pPC8 5μL，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pPC2(以下称为PC2株)、长双歧杆菌105－A/pPC3(以下称为PC3株)、长双歧杆菌105－A/pPC4(以下称为PC4株)、长双歧杆菌105－A/pPC5(以下称为PC5株)、长双歧杆菌105－A/pPC6(以下称为PC6株)、长双歧杆菌105－A/pPC7(以下称为PC7株)及长双歧杆菌105－A/pPC8(以下称为PC8株)。
[实施例19]
[PC2TL株－PC8TL株的制作]
顾及到临床开发，制作从上述实施例18所制作的质粒中除去scFv的标记标签(组氨酸标签/FLAG标签)及大肠杆菌中的质粒复制起点pUCori的、进行抗人PD－1scFv03及抗人CTLA－4scFv01共表达的质粒pPC2TL～pPC8TL。利用这些质粒进行长双歧杆菌105－A的转化，取得共表达株PC2TL株～PC8TL株。
将共表达株PC2TL株～PC8TL株的基本质粒结构示于图29。将7种无标签共表达质粒pPC2TL～pPC8TL中的抗人PD－1scFv03表达盒及抗人CTLA－4scFv01表达盒的结构示于以下的表20及表21。
[表20]
[表21]
(抗hPD－1scFv03分泌表达盒的结构)
作为抗hPD－1scFv03分泌表达盒，制作对于(1)Hu启动子DNA、(2)编码信号肽－接头肽连接体的DNA、(3)编码抗hPD－1scFv03氨基酸序列的DNA及(4)Hu终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(4)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(4)的DNA的盒。作为上述信号肽－接头肽连接体，使用SP50L5、SP67L10或SP69L1。
(抗hCTLA－4scFv01分泌表达盒的结构)
作为抗hCTLA－4scFv01分泌表达盒，制作对于(1)P30启动子DNA、(2)编码信号肽－接头肽连接体的DNA、(3)编码抗hCTLA－4scFv01的氨基酸序列的DNA及(4)T2终止子DNA，以(1)为上游(5’末端)侧、以(4)为下游(3’末端)侧且依次含有(1)～(4)的DNA的盒。作为上述信号肽－接头肽连接体，使用SP50L5、SP67L1或SP68L1。
(pPC2TL～pPC8TL的制作方法)
将质粒的制作方法的概要示于图30。包含以下的4个工序。
(1)第1工序中，制作用于制作共表达质粒pPC2TL－pPC8TL的模板质粒pHuSPxLy－hPD－1scFv03TL。
(2)第2工序中，制作在抗hPD－1scFv03(标签无)表达质粒的抗PD－1scFv03表达盒的下游插入有T2终止子片段的质粒pHuSPxLy－hPD－1scFv03TL－T2(SPxLy＝SP50L5、SP67L10、SP69L1)。
(3)第3工序中，制作在第2工序所制作的质粒的Hu终止子和T2终止子之间有插入抗hCTLA－4scFv01(标签无)表达盒(其中，不含终止子)的质粒pPC2TLS～pPC8TLS。
(4)第4工序中，用限制酶从第3工序所制作的质粒中切断、除去作为大肠杆菌中的质粒复制起点的pUCori片段后，自身闭环，从而进行共表达质粒(无标签、非穿梭)pPC2TL～pPC8TL的制作。
(第1工序)
以前述pHuSP50L5－hPD－1scFv03－His为模板DNA，使用pCDshuttle＿F1＿引物(序列号126)作为正向引物、使用GA6＿引物作为反向引物，均与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物A－1(3261bp)。分别以pHuSP50L5－hPD－1scFv03－His、pHuSP67L10－hPD－1scFv03－His及pHuSP69L1－hPD－1scFv03－His为模板DNA，使用GA5＿引物＿rev引物作为正向引物、使用hPD1scFv03－1＿引物(序列号127)作为反向引物，与上述PCR扩增1同样地分别制备PCR产物B－SP50L5(1502bp)、B－SP67L10(1448bp)、B－SP69L1(1412bp)。
与前述同样地，将上述PCR产物A－1和B－SP50L5、B－SP67L10、B－SP69L1分别用HD试剂盒连接，进行“抗hPD－1scFv03表达盒区域”(包含从Hu启动子至Hu终止子)的序列确定。将所提取的质粒命名为pHuSP50L5－hPD－1scFv03TL、pHuSP67L10－hPD－1scFv03TL及pHuSP69L1－hPD－1scFv03TL。
(第2工序)
使用表22所示的模板DNA及引物，与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物。
[表22]
[表23]
要构建的质粒 In Fusion反应时的组合
pHuSP50L5-hPD-1scFv03TL-T2 A4和B
pHuSP67L10-hPD-1scFv03TL-T2 A5和B
pHuSP69L1-hPD-1scFv03TL-T2 A6和B
对于上述表22记载的PCR产物，与前述同样地，按照上述表23所示的组合用HD试剂盒连接，进行“抗hPD－1scFv03(无标签)表达盒及T2终止子区域”(5’－Hu启动子－SPxLy－人PD－1scFv03－Hu终止子－T2终止子－3’)的序列确定。将所提取的质粒命名为pHuSP50L5－hPD－1scFv03TL－T2、pHuSP67L10－hPD－1scFv03TL－T2及pHuSP69L1－hPD－1scFv03TL－T2。
(第3工序)
使用表24所示的模板DNA及引物，与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物。
[表24]
[表25]
对于上述表24记载的PCR产物，与前述同样地，按照上述表25所示的组合用HD试剂盒连接，通过同样的步骤进行所提取的质粒的全长DNA序列确定。将所提取的质粒命名为pPC2TLS、pPC3TLS、pPC4TLS、pPC5TLS、pPC6TLS、pPC7TLS及pPC8TLS。
(第4工序)
在上述质粒制作中的第3工序所制作的质粒pPC2TLS～pPC8TLS各2μg中分别添加限制酶BamHI及BglII(Thermo Scientific公司制)各10单位，在37℃下保温3小时，从而进行切断。BamHI及BglII识别位点如图30所示，在作为大肠杆菌中的质粒复制起点的pUCori的邻接部分各具有1个位点。使用限制酶处理后的DNA溶液的一部分，使用0.8％琼脂糖凝胶通过电泳来确认质粒DNA已经被切断为预定尺寸(约5.3kbp及约0.7kbp)。
(利用琼脂糖凝胶电泳的分离及纯化)
使用琼脂糖凝胶通过电泳对上述限制酶处理后的DNA进行分离，切出约5.3kbp的DNA条带，用QIAGel进行DNA提取。通过琼脂糖凝胶电泳估计该DNA浓度。
(DNA的自身闭环)
用Rapid DNA Ligation试剂盒(Thermo Scientific公司制)，对上述的约5.3kbp的纯化DNA进行自连接反应。将反应结束后的溶液通过QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN株式会社制)纯化，从而制作pPC2TL、pPC3TL、pPC4TL、pPC5TL、pPC6TL、pPC7TL及pPC8TL。
(双歧杆菌属细菌的转化11)
使用上述质粒制作中的第4工序所制备的质粒pPC2TL、pPC3TL、pPC4TL、pPC5TL、pPC6TL、pPC7TL及pPC8TL 5μL，除此以外，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pPC2TL(以下称为PC2TL株)、长双歧杆菌105－A/pPC3TL(以下称为PC3TL株)、长双歧杆菌105－A/pPC4TL(以下称为PC4TL株)、长双歧杆菌105－A/pPC5TL(以下称为PC5TL株)、长双歧杆菌105－A/pPC6TL(以下称为PC6TL株)、长双歧杆菌105－A/pPC7TL(以下称为PC7TL株)及长双歧杆菌105－A/pPC8TL(以下称为PC8TL株)。
(质粒DNA的序列确认)
在上述(双歧杆菌属细菌的转化11)所取得的双歧杆菌属细菌转化体的菌体中，加入用1mM的Tris－HCl－0.1mM EDTA缓冲液(pH8.0)将溶菌酶(和光纯药工业公司制)和ProteinaseK(QIAGEN株式会社制)分别调节为40mg/mL及0.4mg/mL的溶菌酶－ProteinaseK混合液1.5mL而进行悬浮，在37℃下保温约1.5小时。使用通过离心分离除去上清后的菌体，用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN株式会社制)提取质粒DNA。与上述(实施例1：大肠杆菌的转化及质粒pAG8的DNA序列确认)同样地进行所提取的质粒的全长DNA序列确定。将所提取的质粒命名为质粒pPC2TL、pPC3TL、pPC4TL、pPC5TL、pPC6TL、pPC7TL及pPC8TL。将概要示于以下。质粒pPC2TL、pPC3TL、pPC4TL、pPC5TL、pPC6TL、pPC7TL及pPC8TL的表达盒序列中，抗hPD－1scFv03的表达盒序列及抗hCTLA－4scFv01的表达盒序列均不含标签序列，除此以外，分别与pPC2、pPC3、pPC4、pPC5、pPC6、pPC7及pPC8序列相同。
(pPC2TL的scFv表达盒序列(2576bp)(序列号138))
1..1366抗人PD－1scFv03表达盒
1..361 Hu启动子
362..544 SP50L5
545..1249 抗人PD－1scFv03
1250..1252 停止密码子
1253..1366 Hu终止子
1367..2576 抗人CTLA－4scFv01表达盒
1367..1601 P30启动子
1602..1703 SP67L1
1704..2444 抗人CTLA－4scFv01
2445..2447 停止密码子
2448..2576 T2终止子
(pPC3TL的scFv表达盒序列(2606bp)(序列号139))
1..1366 抗人PD－1scFv03表达盒
1..361 Hu启动子
362..544 SP50L5
545..1249 抗人PD－1scFv03
1250..1252 停止密码子
1253..1366 Hu终止子
1367..2606 抗人CTLA－4scFv01表达盒
1367..1601 P30启动子
1602..1733 SP68L1
1734..2474 抗人CTLA－4scFv01
2475..2477 停止密码子
2478..2606 T2终止子
(pPC4TL的scFv表达盒序列(2603bp)(序列号140))
1..1312 抗人PD－1scFv03表达盒
1..361 Hu启动子
362..490 SP67L10
491..1195 抗人PD－1scFv03
1196..1198 停止密码子
1199..1312 Hu终止子
1313..2603 抗人CTLA－4scFv01表达盒
1313..1547 P30启动子
1548..1730 SP50L5
1731..2471 抗人CTLA－4scFv01
2472..2474 停止密码子
2475..2603 T2终止子
(pPC5TL的scFv表达盒序列(2552bp)(序列号141))
1..1312 抗人PD－1scFv03表达盒
1..361 Hu启动子
362..490 SP67L10
491..1195 抗人PD－1scFv03
1196..1198 停止密码子
1199..1312 Hu终止子
1313..2552 抗人CTLA－4scFv01表达盒
1313..1547 P30启动子
1548..1679 SP68L1
1680..2420 抗人CTLA－4scFv01
2421..2423 停止密码子
2424..2552 T2终止子
(pPC6TL的scFv表达盒序列(2567bp)(序列号142))
1..1276 抗人PD－1scFv03表达盒
1..361 Hu启动子
362..454 SP69L1
455..1159 抗人PD－1scFv03
1160..1162 停止密码子
1163..1276 Hu终止子
1277..2567 抗人CTLA－4scFv01表达盒
1277..1511 P30启动子
1512..1694 SP50L5
1695..2435 抗人CTLA－4scFv01
2436..2438 停止密码子
2439..2567 T2终止子
(pPC7TL的scFv表达盒序列(2486bp)(序列号143))
1..1276 抗人PD－1scFv03表达盒
1..361 Hu启动子
362..454 SP69L1
455..1159 抗人PD－1scFv03
1160..1162 停止密码子
1163..1276 Hu终止子
1277..2486 抗人CTLA－4scFv01表达盒
1277..1511 P30启动子
1512..1613 SP67L1
1614..2354 抗人CTLA－4scFv01
2355..2357 停止密码子
2358..2486 T2终止子
(pPC8TL的scFv表达盒序列(2516bp)(序列号144))
1..1276 抗人PD－1scFv03表达盒
1..361 Hu启动子
362..454 SP69L1
455..1159 抗人PD－1scFv03
1160..1162 停止密码子
1163..1276 Hu终止子
1277..2516 抗人CTLA－4scFv01表达盒
1277..1511 P30启动子
1512..1643 SP68L1
1644..2384 抗人CTLA－4scFv01
2385..2387 停止密码子
2388..2516 T2终止子
[实施例20]
[共表达双歧杆菌属细菌株中的scFv分泌确认]
通过蛋白印迹法如下确认共表达株PC2株～PC8株的培养上清中有无抗hPD－1scFv03－His及抗hCTLA－4scFv01－FLAG的分泌。对作为阴性对照株的前述BE穿梭菌株也同样实施。
(重组双歧杆菌属细菌的培养)
对于上述PC2株～PC8株、实施例8中制作的PC1株及BE穿梭菌株，通过与实施例4(重组双歧杆菌属细菌的培养)同样的步骤进行培养，回收培养上清。通过与上述实施例9(重组双歧杆菌属细菌的培养)同样的步骤进行培养上清的利用TCA的浓缩，得到各培养上清浓缩物。
(蛋白印迹解析)
使用上述各培养上清浓缩物(相当于各培养液0.01mL)，通过与实施例9(蛋白印迹解析)同样的方法进行蛋白印迹解析。其中，从凝胶向膜的转印使用Trans－Blot Turbo(Bio·Rad公司制)，封闭溶液使用前述2％ECL Advance Blocking Agent。将关于抗hPD－1scFv03－His的结果示于图31(A)，将关于抗hCTLA－4scFv01－FLAG的结果示于图31(B)。
(结果)
由图31A及B可明确，PC2株(A、B中均为泳道1)、PC3株(A、B中均为泳道2)、PC4株(A、B中均为泳道3)、PC5株(A、B中均为泳道4)、PC6株(A、B中均为泳道5)、PC7株(A、B中均为泳道6)及PC8株(A、B中均为泳道7)及PC1株(A、B中均为泳道9)的培养上清中均观察到抗hPD－1scFv03－His和抗hCTLA－4scFv01－FLAG两者的分泌(其中，PC1株中为抗hCTLA－4scFv02－FLAG)。此外，PC2株～PC8株分泌的抗hPD－1scFv03－His及抗hCTLA－4scFv01－FLAG的量也比PC1株分泌的单链抗体量多。
由以上的结果可确认，共表达双歧杆菌属细菌株PC2株～PC8株为可以在培养上清中分泌抗hPD－1scFv和抗hCTLA－4scFv两者的重组双歧杆菌属细菌株，且分泌比前述PC1株多的单链抗体。
[实施例21]
[共表达株PC2TL株～PC8TL株中的scFv的分泌确认]
对于上述共表达株PC2TL株～PC8TL株所分泌的抗体，利用ELISA法确认与人PD－1(hPD－1)有无结合活性及与人CTLA－4有无结合活性。
(重组双歧杆菌属细菌的培养)
对于上述实施例19所制作的共表达双歧杆菌属细菌PC2TL株～PC8TL株及BE穿梭菌株，通过与实施例4(重组双歧杆菌属细菌的培养)同样的步骤进行培养，回收培养上清。将PC2TL株～PC8TL株的培养上清用BE穿梭菌株的培养上清适当稀释，作为ELISA用试样。
(抗hPD－1scFv03的分泌评价)
在96孔板(MaxiSorp、C型、Nunc公司制)中分别分注1μg/mL的hPD－1液(作为抗原使用。将Recombinant Human PD－1Fc Chimera、R&D Systems公司用1×PBS调节而成)各100μL，在板上部贴上密封带，在4℃下静置一晚，进行抗原的固定化。从板中除去液体后，各分注1×PBS400μL，除去液体。将其重复洗涤3次(以下记作“PBS洗涤”)。
在上述洗涤后的板中，各分注1％BSA溶液350μL，在室温下静置2小时而进行封闭，进行PBS洗涤。
在上述板中分注ELISA用试样，在空白对照的孔中分注BE穿梭菌株的培养上清100μL。此外，作为阳性对照，向BE穿梭菌株的培养上清中分注将抗hPD－1scFv03纯化物调节为100ng/mL的浓度的溶液100μL。在板上部贴上密封带，在常温下静置2小时，进行与固定化抗原的scFv结合反应，进行PBS洗涤。
在进行与上述固定化抗原的scFv结合反应后的板中，添加0.2μg/mL生物素化蛋白L溶液(将生物素化蛋白L：Thermo Scientific公司制用Signal Enhancer HIKARI：NacalaiTesque公司制的B液稀释，调节为0.2μg/mL)100μL。在板上部贴上密封带，在常温下静置1小时(生物素化蛋白L与scFv的轻链κ链的结合反应)，进行PBS洗涤。
在进行上述生物素化蛋白L的结合反应后的板中，添加亲和素－生物素标记酶复合物调节溶液(将亲和素－生物素标记酶复合物VECTASTAIN ABC Kit：VECTORLaboratories公司制的A液及B液各30μL添加到Signal Enhancer HIKARI的B液7.5mL中并混合，从而制备)100μL，在板上部贴上密封带，在常温下静置30分钟，进行PBS洗涤。
在上述结合有酶的板中添加检测试剂(将Color Reagent A及Color ReagentB：均为R&D Systems公司制等量混合)200μL，在遮光、常温下静置。准确经过20分钟后，添加前述停止液50μL，使呈色反应停止。用酶标仪测定450nm及570nm(参比波长)处的吸光度。
(抗hCTLA－4scFv01的分泌评价)
1)作为固定化在板上的抗原，使用1μg/mL的hCTLA－4溶液(将(RecombinantHuman CTLA－4－Fc Chimera、BioLegend公司制)用1×PBS调节)，2)作为阳性对照，在BE穿梭菌株的培养上清中使用抗hCTLA－4scFv01纯化物，3)除了将生物素化蛋白L溶液浓度设为0.05μg/mL这一点以外，通过与上述(抗hPD－1scFv03的分泌评价)同样的方法来实施。将结果示于表26。
[表26]
scFv与固定化抗原的结合活性
n.t.：不实施，P.C.：阳性对照
(结果)
由表26可明确，通过ELISA可知，共表达株PC2TL株～PC8TL株的培养上清具有与固定化的人PD－1及人CTLA－4两者结合的活性。需要说明的是，已经确认，该scFv的结合活性对于对应的抗原是特异性的(数据未记载)。
[实施例22]
将对应于上述共表达双歧杆菌属细菌PC2株～PC8株的抗hPD－1scFv03－His单独表达株及抗hCTLA－4scFv01－FLAG单独表达株示于表27。
[表27]
(双歧杆菌属细菌的转化12)
使用上述实施例18所制作的质粒pHuSP50L5－hPD－1scFv03－His、pHuSP67L10－hPD－1scFv03－His及pHuSP69L1－hPD－1scFv03－His，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pHuSP50L5－hPD－1scFv03－His(以下称为P1H株)、长双歧杆菌105－A/pHuSP67L10－hPD－1scFv03－His(以下称为P2H株)及长双歧杆菌105－A/pHuSP69L1－hPD－1scFv03－His(以下称为P3H株)。
同样地，使用实施例18所制作的质粒pC1F、pC2F及pC3F进行长双歧杆菌105－A株的转化，得到长双歧杆菌105－A/pC1F(以下称为C1F株)、长双歧杆菌105－A/pC2F(以下称为C2F株)及长双歧杆菌105－A/pC3F(以下称为C3F株)。
[实施例23]
将对应于上述共表达双歧杆菌属细菌PC2TL－PC8TL株的抗hPD－1scFv03单独表达株及抗hCTLA－4scFv01单独表达株示于表28。
[表28]
(双歧杆菌属细菌的转化13)
使用上述实施例19制作的质粒pHuSP50L5－hPD－1scFv03TL、pHuSP67L10－hPD－1scFv03TL及pHuSP69L1－hPD－1scFv03TL，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pHuSP50L5－hPD－1scFv03TL(以下称为P1TL株)、长双歧杆菌105－A/pHuSP67L10－hPD－1scFv03TL(以下称为P2TL株)及长双歧杆菌105－A/pHuSP69L1－hPD－1scFv03TL(以下P3TL株)。
(抗hCTLA－4scFv01单独表达株的制作)
将抗hCTLA－4scFv01表达质粒pC1TLB、pC2TLB及pC3TLB的制作方法的概要示于图32。包括从质粒pC1F、pC2F及pC3F中除去FLAG标签及替换为T2终止子的T2替换工序以及从质粒pC1TL、pC2TL、pC3TL中除去pUCori的pUCori除去工序这2个工序。
(T2替换工序)
使用表29所示的模板DNA及引物，与上述PCR扩增1同样地制备PCR产物。
[表29]
PCR产物 模板DNA Fow.引物 Rev.引物 PCR产物尺寸
A1 pC1F PC1_引物 PC9_引物 4538bp
A2 pC2F PC1_引物 PC9_引物 4457bp
A3 pC3F PC1_引物 PC9_引物 4487bp
B BBa-B0015 in pUC57 PC8_引物 PC4_引物 150bp
PCR产物的组合设为A1及B(pC1TL制作用)、A2及B(pC2TL制作用)、A3及B(pC3TL制作用)这3种，与前述同样地用HD试剂盒连接，通过同样的步骤进行进行所提取的质粒的全长DNA序列确定。将所提取的质粒命名为pC1TL、pC2TL，pC3TL。
(pUCori除去工序)
从上述pC1TL、pC2TL、pC3TL中除去pUCori通过与上述实施例19的共表达质粒pPC2TL～pPC8TL的制作中的第3工序同样的方法来进行，得到pC1TLB、pC2TLB及pC3TLB。
(双歧杆菌属细菌的转化14)
使用上述质粒pC1TLB、pC2TLB及pC3TLB，通过与上述(双歧杆菌属细菌的转化1)同样的步骤利用电穿孔系统实施长双歧杆菌105－A株的转化。将得到的转化体作为长双歧杆菌105－A/pC1TLB(以下称为C1TLB株)、长双歧杆菌105－A/pC2TLB(以下称为C2TLB株)及长双歧杆菌105－A/pC3TLB(以下称为C3TLB株)。
[实施例24]
(与细胞的结合)
使用从对应于共表达株PC2株～PC8株的抗hCTLA－4scFv01－FLAG单独表达株纯化出的抗hCTLA－4scFv01－FLAG，来研究与细胞的结合。
通过蛋白L柱，从抗hCTLA－4scFv01－FLAG单独表达双歧杆菌属细菌C1F株、C2F株及C3F株的各培养上清中纯化抗hCTLA－4scFv01－FLAG。在使用逆转录病毒载体而过表达细胞内结构域缺损hCTLA－4的HEK293T细胞中，添加调节为1μg/mL的纯化scFv 100μL，在冰上静置30分钟。洗涤细胞后，加入生物素化蛋白L 100μL，静置30分钟，使蛋白L与结合在细胞上的scFv结合。洗涤细胞后，加入调节为0.5μg/mL的Brilliant Violet421Streptavidin100μL，静置30分钟。洗涤细胞后，用流式细胞术来解析。将结果示于图33。
(结果)
由图33可明确，来自C1F株、C2F株及C3F株的scFv均与表达细胞内结构域缺损hCTLA－4的HEK293T细胞结合。由此推测，分泌与C1F株相同的scFv的共表达株PC4株及PC6株、分泌与C2F株相同的scFv的共表达株PC2株及PC7株、以及分泌与C3F株相同的scFv的共表达株PC3株、PC5株及PC8株所分别分泌的抗hCTLA－4scFv01－FLAG均可以与hCTLA－4表达细胞结合。虽然由图33(a)确认到与不分泌hCTLA－4的Mock细胞也微弱结合，但根据图37(d)的结果，由共表达PC4株纯化出的抗hCTLA－4scFv01－FLAG则未观察到与Mock细胞的结合，因此可以认为来自C1F株、C2F株及C3F株的scFv与Mock细胞的结合为非特异性结合。
[实施例25]
(使用从抗hCTLA－4scFv01单独表达株纯化出的抗hCTLA－4scFv01的、与细胞的结合)
通过蛋白L柱，从对应于共表达株PC2TL株～PC8TL株的抗hCTLA－4scFv01单独表达株C1TLB株、C2TLB株及C3TLB株的各培养上清纯化抗hCTLA－4scFv01。在使用逆转录病毒载体而过表达细胞内结构域缺损hCTLA－4的HEK293T细胞中，添加调节为1μg/mL的纯化scFv100μL，在冰上静置30分钟。洗涤细胞后，加入生物素化蛋白L 100μL，静置30分钟，使蛋白L与结合在细胞上的scFv结合。洗涤细胞后，加入调节为0.5μg/mL的BrilliantViolet421Streptavidin 100μL，静置30分钟。洗涤细胞后，用流式细胞术来解析。将结果示于图34。
(结果)
由图34可明确，来自C1TLB株、C2TLB株及C3TLB株的scFv均与hCTLA－4表达细胞结合。由此推测，分泌与C1TLB株相同的scFv的共表达株PC4TL株及PC6TL株、分泌与C2TLB株相同的scFv的共表达株PC2TL株及PC7TL株、以及分泌与C3TLB株相同的scFv的共表达株PC3TL株、PC5TL株及PC8TL株所分别分泌的抗hCTLA－4scFv01也可以与hCTLA－4表达细胞结合。
[实施例26]
(使用从抗hPD－1scFv03－His单独表达株纯化出的抗PD－1scFv03－His的、与细胞的结合)
通过蛋白L，从对应于共表达株PC2株～PC8株的抗PD－1scFv03－His单独表达菌P1H株、P2H株及P3H株的各培养上清中纯化抗PD－1scFv03－His。在使用逆转录病毒载体而过表达hPD－1的HEK293T细胞中，添加调节为1μg/mL的纯化scFv 100μL，在冰上静置30分钟。洗涤细胞后，加入生物素化蛋白L 100μL，静置30分钟，使蛋白L与结合在细胞上的scFv结合。洗涤细胞后，加入调节为0.5μg/mL的Brilliant Violet421Streptavidin 100μL，静置30分钟。洗涤细胞后，用流式细胞术来解析。将结果示于图35。
(结果)
由图35可明确，来自P1H株、P2H株及P3H株的scFv均与hPD－1表达细胞结合。由此推测，分泌与P1H株相同的scFv的共表达株PC2株及PC3株、分泌与P2H株相同的scFv的共表达株PC4株及PC5株、以及分泌与P3H株相同的scFv的共表达株PC6株、PC7株及PC8株所分别分泌的抗PD－1scFv03－His均可以与hPD－1表达细胞结合。
[实施例27]
(使用从抗hPD－1scFv03单独表达株纯化出的抗hPD－1scFv03的、与细胞的结合)
通过蛋白L柱，从对应于共表达株PC2TL株～PC8TL株的PD－1scFv03单独表达双歧杆菌属细菌P1TL株、P2TL株及P3TL株的各培养上清纯化抗hPD－1scFv03。在使用逆转录病毒载体而过表达hPD－1的HEK293T细胞中，添加调节为1μg/mL的纯化scFv 100μL，在冰上静置30分钟。洗涤细胞后，加入生物素化蛋白L 100μL，静置30分钟，使蛋白L与结合在细胞上的scFv结合。洗涤细胞后，加入调节为0.5μg/mL的Brilliant Violet421Streptavidin 100μL，静置30分钟。洗涤细胞后，用流式细胞术来解析。将结果示于图36。
(结果)
由图36可明确，来自P1TL株、P2TL株及P3TL株的scFv均与hPD－1表达细胞。由此推测，分泌与P1TL株相同的scFv的共表达株PC2TL株及PC3TL株、分泌与P2TL株相同的scFv的共表达株PC4TL株及PC5TL株、以及分泌与P3TL株相同的scFv的共表达株PC6TL株、PC7TL株及PC8TL株所分别分泌的抗PD－1scFv03均可以与hPD－1表达细胞结合。
[实施例28]
(使用由共表达株PC4株纯化出的scFv的、与细胞的结合)
从共表达株PC4株的培养上清中，通过His－tag用纯化柱来纯化抗hPD－1scFv03－His，此外通过FLAG－tag用纯化柱来纯化抗hCTLA－4scFv01－FLAG。通过与上述[实施例26]同样的方法研究抗hPD－1scFv03与hPD－1表达细胞的结合，此外通过与[实施例24]同样的方法研究抗hCTLA－4scFv01与hCTLA－4表达细胞的结合。作为阳性对照，使用PE标记抗hPD－1抗体(clone：EH12.2H7)及PE标记抗hCTLA－4抗体(clone：L3D10)。将结果示于图37。
根据图37(a)，确认到作为阳性对照的PE标记抗hPD－1抗体(clone：EH12.2H7)与hPD－1表达细胞的结合，但未确认到与Mock细胞、hCTLA－4表达细胞的结合。根据(b)，确认到PE标记抗hCTLA－4抗体(clone：L3D10)与hCTLA－4表达细胞的结合，但未确认到与Mock细胞、hPD－1表达细胞的结合。由图37(c)、(d)可明确，确认到由共表达株PC4株纯化出的抗hPD－1scFv03－His及抗hCTLA－4scFv01－FLAG分别与对应的抗原表达细胞结合。
[实施例29]
(使用从抗hCTLA－4scFv01－FLAG单独表达株纯化出的抗hCTLA－4scFv01－FLAG的、与抗原的亲和性(Biacore))
通过蛋白L柱从对应于共表达株PC2株～PC8株的抗hCTLA－4scFv01－FLAG单独表达双歧杆菌属细菌C1F、C2F及C3F的培养上清中分别纯化抗hCTLA－4scFv01－FLAG。通过使用Biacore系统(GE Healthcare公司制)的表面等离子激元共振进行纯化出的各抗hCTLA－4scFv01－FLAG和hCTLA－4(与人IgG1Fc的融合蛋白)的结合动力学参数测定。通过胺偶联法使小鼠抗人IgG(Fc)单克隆抗体(GE Healthcare公司制)与在金膜表面上包被有羧甲基葡聚糖的基材结合，并捕获Fc融合重组hCTLA－4(Biolegend)作为配体。将作为待测物的纯化出的scFv调节为0.7404、2.2222、6.6667、20及60nM，通过从低浓度起连续结合的单循环动力学法进行解析。得到的数据的解析使用BIA评价用软件(GE Healthcare公司制)。将结果示于表30。
[表30]
样品 ka(1/MS) Kd(1/s) KD(M)
C1F 9.18E+05 9.96E-04 1.08E-09
C2F 4.52E+05 1.03E-03 2.28E-09
C3F 3.47E+05 1.03E-03 2.97E-09
C1TLB 6.61E+05 9.80E-04 1.48E-09
C2TLB 9.81E+05 9.61E-04 9.80E-10
C3TLB 7.73E+05 9.96E-04 1.29E-09
(结果)
由表30可明确，由单表达株C1F、C2F及C3F分泌的scFv显示高的KD值，与hCTLA‐4具有亲和性。推测由共表达株PC4株及PC6株分泌的抗hCTLA－4scFv也与来自C1F株的scFv同样地，与hCTLA－4具有亲和性。同样地，可推测共表达株PC2株及PC7株的scFv与C2F株的scFv同样地与hCTLA－4具有亲和性，PC3株、PC5株及PC8株的scFv与C3F株的scFv同样地与hCTLA－4具有亲和性。
[实施例30]
(使用从抗hCTLA－4scFv01单独表达株纯化出的抗hCTLA－4scFv01的、与抗原的亲和性(Biacore))
通过蛋白L柱，从对应于共表达株PC2TL株～PC8TL株的抗hCTLA－4scFv01单独表达双歧杆菌属细菌C1TLB株、C2TLB株及C3TLB株的培养上清分别纯化抗hCTLA－4scFv01，通过使用Biacore系统的表面等离子激元共振进行hCTLA－4(与人IgG1Fc的融合蛋白)的结合动力学参数测定。以下与实施例29同样进行解析。将结果示于表30。
(结果)
由表30可明确，由单表达株C1TLB、C2TLB及C3TLB分泌的scFv显示高的KD值，与hCTLA－4具有亲和性。推测由共表达株PC4TL及PC6TL株分泌的scFv也与来自C1TLB株的scFv同样地，与hCTLA－4具有亲和性。同样地，可推测共表达株PC2TL株及PC7TL株的scFv与C2TLB株的scFv同样地与hCTLA－4具有亲和性，PC3TL株、PC5TL株及PC8TL株的scFv与C3TLB株的scFv同样地与hCTLA－4具有亲和性。
[实施例31]
(使用由抗hPD－1scFv03－His单独表达株纯化出的抗hPD－1scFv03－His的、与抗原的亲和性(Biacore))
通过蛋白L柱，由对应于共表达株PC2株～PC8株的抗hPD－1scFv03－His单独表达双歧杆菌属细菌P1H株、P2H株及P3H株的培养上清分别纯化抗hPD－1scFv03－His，通过使用Biacore系统的表面等离子激元共振进行与hPD－1(与人IgG1Fc的融合蛋白)的结合动力学参数测定。捕获Fc融合重组hPD－1(R&D)作为配体，除此以外，与实施例29同样进行解析。将结果示于表31。
[表31]
样品 ka(1/MS) Kd(1/s) KD(M)
P1H 4.79E+0.5 1.29E-03 2.69E-09
P2H 4.60E+0.5 1.86E-03 4.04E-09
P3H 4.33E+0.5 1.99E-03 4.60E-09
P1TL 3.44E+0.5 1.34E-03 3.89E-09
P2TL 3.35E+0.5 1.96E-03 5.85E-09
P3TL 3.03E+0.5 2.07E-03 6.83E-09
(结果)
由表31可明确，由单表达株P1H、P2H及P3H分泌的scFv显示高的KD值，与hPD－1具有亲和性。推测由共表达株PC2株及PC3株分泌的scFv也与来自P1H株的scFv同样地，与hPD－1具有亲和性。同样地，可推测共表达株PC4株及PC5株的scFv与P2H株的scFv同样地与hPD－1具有亲和性，PC6株、PC7株及PC8株的scFv与P3H株的scFv同样地与hPD－1具有亲和性。
[实施例32]
(使用从抗hPD－1scFv03单独表达株纯化出的抗hPD－1scFv03的、与抗原的亲和性(Biacore))
通过蛋白L柱，从对应于共表达株PC2TL株～PC8TL株的抗hPD－1scFv03单独表达双歧杆菌属细菌P1TL株、P2TL株及P3TL株的培养上清分别纯化抗hPD－1scFv03，通过使用Biacore系统的表面等离子激元共振进行hPD－1(与人IgG1Fc的融合蛋白)的结合动力学参数测定。捕获Fc融合重组hPD－1(R&D)作为配体，除此以外，与实施例29同样地进行解析。将结果示于表31。
(结果)
由表31可明确，由单表达株P1TL、P2TL及P3TL分泌的scFv显示高的KD值，与hPD－1具有亲和性。推测由共表达株PC2TL株及PC3TL株分泌的scFv也与来自P1TL株的scFv同样地，与hPD－1具有亲和性。同样地，可推测共表达株PC4TL株及PC5TL株的scFv与P2TL株的scFv同样地与hPD－1具有亲和性，PC6TL株、PC7TL株及PC8TL株的scFv与P3TL株的scFv同样地与hPD－1具有亲和性。
[实施例33]
(共表达株PC4株的scFv对抗原-配体的结合抑制活性)
从共表达株PC4株的培养上清中，通过His－tag用纯化柱纯化抗hPD－1scFv03－His，此外通过FLAG－tag用纯化柱纯化抗hCTLA－4scFv01－FLAG。使用这些来进行对于与各抗原的结合的、与配体的竞争活性(ELISA)的评价。
(对于与抗hPD－1scFv03的抗原的结合的、与人PD－L1的竞争活性)
除试样添加操作以外，通过与实施例21的(抗hPD－1scFv03的分泌评价)同样的方法进行操作。试样使用从共表达株PC4株的培养上清进行His－tag纯化而得到的2nM(固定浓度)的抗hPD－1scFv03－His和各种浓度(640nM、320nM、160nM、80nM、40nM、20nM、5nM、0.5nM、0nM)的人PD－L1溶液(Recombinant Human B7－H1/PD－L1FcChimera、R&Dsystems，以下称为hPD－L1)的混合液。此外，作为对照，还设置了以2nM的抗hCTLA－4scFv01－FLAG(来自C1F株)、640nM的hPD－L1为试样的孔。通过式1算出hPD－L1对hPD－1/抗hPD－1scFv03－His的结合的结合抑制率。关于hPD－L1对由PC4株纯化出的hPD－1scFv03与hPD－1的结合的结合抑制活性，将结果示于表32。
[数学式1]
[表32]
由表32可知，随着hPD－L1浓度的提高，吸光度下降，抗hPD－1scFv03－His与抗原的结合呈现hPD－L1浓度依赖性地下降。另一方面，在添加2nM的抗hCTLA－4scFv01－FLAG的情况下，未确认到与板的结合，可以说抗hPD－1scFv03－His与固定化人PD－1的结合是特异性结合。此外，仅添加hPD－L1的情况下也未确认到与板的结合，从而可以说，添加抗hPD－1scFv03－His及hPD－L1的混合液从而与板发生结合的是抗hPD－1scFv03－His。将hPD－L1对hPD－1与抗hPD－1scFv03－His的结合的结合抑制率示于图38。hPD－1与抗hPD－1scFv03－His的结合受到hPD－L1浓度依赖性的抑制。
(对于与抗原的结合，抗hCTLA－4scFv01与配体的竞争活性)
除了试样添加操作以外，通过与实施例21的(抗hCTLA－4scFv01的分泌评价)同样的方法进行操作。试样使用从共表达株PC4株进行FLAG－tag纯化而得到的1nM的抗hCTLA－4scFv01－FLAG与各种浓度的人CD80(Recombinant Human B7－1/CD80 Fc Chimera、R&DSystems，以下称为hCD80)(30nM、20nM、10nM、5nM、3nM及0nM)的混合液、以及1nM的抗hCTLA－4scFv01－FLAG与各种浓度的人CD86(Recombinant Human B7－1/CD86FcChimera、R&D Systems，以下称为hCD86)(100nM、80nM、60nM、40nM、20nM及0nM)的混合液。此外，作为对照，还设置了仅以1nM的抗hPD－1scFv03－His(来自P2H株)为试样的孔、仅以30nM的hCD80为试样的孔或仅以100nM的hCD86为试样的孔。通过式2算出hCD80或hCD86对hCTLA－4/抗hCTLA－4scFv01－FLAG的结合的结合抑制率。
[数学式2]
*配体：hCD80或hCD86
(结果)
将竞争ELISA的结果示于表33(使用hCD80作为配体)及表34(使用hCD86作为配体)。
[表33]
hCD80对由PC4株纯化出的hCTLA－4scFv01－FLAG与hCTLA－4的结合的结合抑制活性
[表34]
hCD86对由PC4株纯化出的hCTLA－4scFv01－FLAG与hCTLA－4的结合的结合抑制活性
由表33及表34可知，随着hCD80或hCD86的浓度提高，吸光度下降，抗hCTLA－4scFv01－FLAG与抗原的结合呈现hCD80或hCD86的浓度依赖性下降。另一方面，在添加1nM的抗hPD－1scFv03－His的情况下未确认到与板的结合。从而，可以说hCTLA－4scFv01－FLAG与固定化人CTLA－4的结合是特异性结合。此外，仅添加hCD80或仅添加hCD86的情况下也未确认到与板的结合，从而可以说，添加抗hCTLA－4scFv01－FLAG及hCD80的混合液、或者添加抗hCTLA－4scFv01－FLAG及hCD86的混合液从而与板发生结合的是抗hCTLA－4scFv01－FLAG。
将hCD80或hCD86对hCTLA－4与抗hCTLA－4scFv01－FLAG的结合的结合抑制率示于图39及图40。hCTLA－4与抗hCTLA－4scFv01－FLAG的结合受到hCD80或hCD86的浓度依赖性的抑制。
由以上的结果可以确认，由共表达株PC4株分泌的抗hPD－1scFv03－His及抗hCTLA－4scFv01－FLAG对各自对应的抗原具有与配体的竞争活性。
序列表
<110> 阿内罗药物科学株式会社(Anaeropharma Science Inc.)
<120> 共表达质粒
<130> 2015C9105
<150> JP2014-245424
<151> 2014-12-03
<160> 144
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 4975
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 线形化的 pHG-2 片段
<220>
<221> misc_feature
<223> 发明人:小关弘惠知; 盐谷公一郎; 小林聪; 嶋谷裕子;柾木健; 清水瞳; 松村富穗; 冈部正实; 井上谦吾
<400> 1
atcatcgccc tgtgaaaccg cttctcattt ccatttgcga tatggtctga atacgacgaa 60
accccggcgc gaggccgggg tttcgtaagc tgtgcgtgac tatagcacga ccagcgcgat 120
tcggtgcacg gatccgtctt cctgctggcc tatgcattgg gttccgcagt gcccactcca 180
ggcggtctgg gcggtgtgga agcggcgctg acattcgcgt tcgtggcggt cggagtgccg 240
cagggcgtgg cgctttccgc cactttgctg caccgcgtgg tgttctactg gctgcgcatt 300
ccgctgggcg cggcggccat gaagtggctt gacaagcata atcttgtctg attcgtctat 360
tttcataccc ccttcgggga aatagatgtg aaaaccctta taaaacgcgg gttttcgcag 420
aaacatgcgc tagtatcatt gatgacaaca tggactaagc aaaagtgctt gtcccctgac 480
ccaagaagga tgctttatga attatttacg acaaaaaatt tcggctagtg ctatcgcggt 540
gttgtcgact tgtgggttga ttttggcgcc aatgccggtc tttgcggatg attcaacgcc 600
atcttcaacg ccatcggatg gcagttacac cacgactgat agcggtcagg acccgtacgt 660
caaggaagcc gaaaacctga agaagtactt caacgccggc catagcgatg tcgccgataa 720
cggcaccctg ttcctgggca tcctgaagaa ctggaaggaa gagtccgacc gcaagatcat 780
gcagtcccag atcgtgagct tctacttcaa gctgttcaag aacttcaagg acgatcagtc 840
gatccagaag tccgtggaga ccatcaagga agacatgaac gtcaagttct tcaacagcaa 900
caagaagaag cgcgacgatt tcgagaagct gaccaactac tccgtgaccg atctgaacgt 960
ccagcgtaag gccatccacg agctgatcca ggtcatggcc gaactgtccc cggccgccaa 1020
gaccggcaag cgtaagcgtt cccagatgct gttccgtggc cgtcgcgcct cccagcacca 1080
tcatcaccac cactgacctt ctgctcgtag cgattacttc gagcattact gacgacaaag 1140
accccgaccg agatggtcgg ggtctttttg ttgtggtgct gtgacgtgtt gtccaaccgt 1200
attattccgg actagtcctc caggacctcg tctacgaggc gctgagcgag gaatggcgca 1260
aaagggacgg cgagatcagc gacccatggg ccaacgacga ggcggacgga taccagccgc 1320
cctcatacga gccggtcaac cccgaacgca ggactcccca gacgccctcc gatggcctga 1380
tctgacgtcc gaaaaaaggc gctgtgcgcc ctttttaaat cttttataaa tctttttaca 1440
ttcttttagc ccctccgcag ccttactctc ccaacgggtt tcagccgaaa cctacaccaa 1500
aaggggagcg aacctacacc aaaaggggag cgaacctaca ccaaaagggg agcgaaccta 1560
caccaaaagg ggagctatat acaccttttg ttatttaagg tgcaagttgt gctatgctga 1620
ggccatgtcc aatgagatcg tgaagttcag caaccagttc aacaacgtcg cgctgaagaa 1680
gttcgacgcc gtgcacctgg acgtgctcat ggcgatcgcc tcaagggtga gggagaaggg 1740
cacggccacg gtggagttct cgttcgagga gctgcgcggc ctcatgcgat tgaggaagaa 1800
cctgaccaac aagcagctgg ccgacaagat cgtgcagacg aacgcgcgcc tgctggcgct 1860
gaactacatg ttcgaggatt cgggcaagat catccagttc gcgctgttca cgaagttcgt 1920
caccgacccg caggaggcga ctctcgcggt tggggtcaac gaggagttcg cgttcctgct 1980
caacgacctg accagccagt tcacgcgctt cgagctggcc gagttcgccg acctcaagag 2040
caagtacgcc aaggagttct accgcagggc caagcagtac cgcagctccg gaatctggaa 2100
gatcggccgc gacgagttct gccgactgct tggcgttcca ccgtcggcaa taacccagac 2160
acgatatctg aatcagaagg ttcttcagcc aattcaggag gagtgtgggc ctctccttgg 2220
cctgaagatc gagcgccagt acgtgaaacg caggctgtcg ggcttcgtgt tcacattcgc 2280
ccgcgagacc cctccggtga tcgacgccag gcccgtggag gcgaggaaga cggacggcga 2340
cggcaagggc cattggacga gcgttgccgg gtacggcgag gtgttcacga ccacggcgtt 2400
gttcgacgtg acggccgccc gggctcactt cgacggcacc gttgaagccg gggagtgccg 2460
tttctgcgcg tttgacgcgc gcaaccgcga acatcatgcg cggaacgccg gaaggctgtt 2520
ctagcggccg tgtccgcgcc tctggggcgg ttgcgcctgc catgggtcga tctgccgctg 2580
ttcggcctca cgctggtctg tgcgctgcct gatctccctg agcaggtcgg ccttggtcct 2640
gggggcgctt cgctcctcga acgggccgct ctcccccagg tcctcgggct cgctcaggtc 2700
caacggctcg tcaccggacg gctcgggccg gttctctccc tgtgccgggt tctccgcctg 2760
tgcgcgttgt tcggccatgc gcagtgcgag ggccttcacc tgttcggggc ttgtcgactc 2820
gattttcgtt cgtgaataca tgttataata actataacta ataacgtaac gtgactggca 2880
agagatattt ttaaaacaat gaataggttt acacttactt tagttttatg gaaatgaaag 2940
atcatatcat atataatcta gaataaaatt aactaaaata attattatct agataaaaaa 3000
tttagaagcc aatgaaatct ataaataaac taaattaagt ttatttaatt aacaactatg 3060
gatataaaat aggtactaat caaaatagtg aggaggatat atttgaatac atacgaacaa 3120
attaataaag tgaaaaaaat acttcggaaa catttaaaaa ataaccttat tggtacttac 3180
atgtttggat caggagttga gagtggacta aaaccaaata gtgatcttga ctttttagtc 3240
gtcgtatctg aaccattgac agatcaaagt aaagaaatac ttatacaaaa aattagacct 3300
atttcaaaaa aaataggaga taaaagcaac ttacgatata ttgaattaac aattattatt 3360
cagcaagaaa tggtaccgtg gaatcatcct cccaaacaag aatttattta tggagaatgg 3420
ttacaagagc tttatgaaca aggatacatt cctcagaagg aattaaattc agatttaacc 3480
ataatgcttt accaagcaaa acgaaaaaat aaaagaatat acggaaatta tgacttagag 3540
gaattactac ctgatattcc attttctgat gtgagaagag ccattatgga ttcgtcagag 3600
gaattaatag ataattatca ggatgatgaa accaactcta tattaacttt atgccgtatg 3660
attttaacta tggacacggg taaaatcata ccaaaagata ttgcgggaaa tgcagtggct 3720
gaatcttctc cattagaaca tagggagaga attttgttag cagttcgtag ttatcttgga 3780
gagaatattg aatggactaa tgaaaatgta aatttaacta taaactattt aaataacaga 3840
ttaaaaaaat tataaaaaaa ttgaaaaaat ggtggaaaca cttttttcaa tttttttaga 3900
tcttgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 3960
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 4020
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 4080
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 4140
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 4200
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 4260
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 4320
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 4380
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 4440
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 4500
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 4560
atcttttcta ctagccggca ttttcgcgat acattccccg gaatgttgcg caacggggaa 4620
cgcgcaccac accgcaacca cagtgcgcca cgcccagtcc ggccctgtgc gctataatag 4680
gtcagttatt cgcgcgcgcg tggcgccctc tacaccccga gccgcgagga cacgtggatt 4740
ccggacggcc atgccccaca tggcaaaccg agaacccgca cacctagcat tacaaggaga 4800
gccattatgg cgttgatgat gagcgttaag actattattt ccacatcagt ggcgattatc 4860
gccacgggtg ccatgtttgc gtgcgtagcc ccgtttgcct ctgccgattc cgcgcagacg 4920
agtgctgtgg tgtcctcacg ttctttcccg aaggcgagtt cggtggtgcg ctcct 4975
<210> 2
<211> 2063
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAG8 hTNF-α 表达盒-hIFN-γ 表达盒
<400> 2
tagccggcat tttcgcgata cattccccgg aatgttgcgc aacggggaac gcgcaccaca 60
ccgcaaccac agtgcgccac gcccagtccg gccctgtgcg ctataatagg tcagttattc 120
gcgcgcgcgt ggcgccctct acaccccgag ccgcgaggac acgtggattc cggacggcca 180
tgccccacat ggcaaaccga gaacccgcac acctagcatt acaaggagag ccattatggc 240
gttgatgatg agcgttaaga ctattatttc cacatcagtg gcgattatcg ccacgggtgc 300
catgtttgcg tgcgtagccc cgtttgcctc tgccgattcc gcgcagacga gtgctgtggt 360
gtcctcacgt tctttcccga aggcgagttc ggtggtgcgc tcctcctccc gtaccccgtc 420
cgataagccg gtcgcccatg tggtcgccaa cccgcaggcc gagggccagc tgcagtggct 480
gaaccgtcgc gccaacgccc tgctggccaa cggcgtggaa ctgcgcgaca accagctggt 540
cgtgccgtcc gagggcctgt acctgatcta ctcccaggtg ctgttcaagg gccagggctg 600
cccgtccacc cacgtcctgc tgacccatac catctcccgc atcgccgtgt cctaccagac 660
caaggtcaac ctgctgtccg ccatcaagtc cccgtgccag cgtgagaccc cggaaggcgc 720
cgaggccaag ccgtggtacg aaccgatcta cctgggcggc gtgttccagc tggaaaaggg 780
cgatcgtctg tccgccgaga tcaaccgtcc ggactacctg gatttcgccg agtccggcca 840
ggtctacttc ggcatcatcg ccctgtgaaa ccgcttctca tttccatttg cgatatggtc 900
tgaatacgac gaaaccccgg cgcgaggccg gggtttcgta agctgtgcgt gactatagca 960
cgaccagcgc gattcggtgc acggatccgt cttcctgctg gcctatgcat tgggttccgc 1020
agtgcccact ccaggcggtc tgggcggtgt ggaagcggcg ctgacattcg cgttcgtggc 1080
ggtcggagtg ccgcagggcg tggcgctttc cgccactttg ctgcaccgcg tggtgttcta 1140
ctggctgcgc attccgctgg gcgcggcggc catgaagtgg cttgacaagc ataatcttgt 1200
ctgattcgtc tattttcata cccccttcgg ggaaatagat gtgaaaaccc ttataaaacg 1260
cgggttttcg cagaaacatg cgctagtatc attgatgaca acatggacta agcaaaagtg 1320
cttgtcccct gacccaagaa ggatgcttta tgaattattt acgacaaaaa atttcggcta 1380
gtgctatcgc ggtgttgtcg acttgtgggt tgattttggc gccaatgccg gtctttgcgg 1440
atgattcaac gccatcttca acgccatcgg atggcagtta caccacgact gatagcggtc 1500
aggacccgta cgtcaaggaa gccgaaaacc tgaagaagta cttcaacgcc ggccatagcg 1560
atgtcgccga taacggcacc ctgttcctgg gcatcctgaa gaactggaag gaagagtccg 1620
accgcaagat catgcagtcc cagatcgtga gcttctactt caagctgttc aagaacttca 1680
aggacgatca gtcgatccag aagtccgtgg agaccatcaa ggaagacatg aacgtcaagt 1740
tcttcaacag caacaagaag aagcgcgacg atttcgagaa gctgaccaac tactccgtga 1800
ccgatctgaa cgtccagcgt aaggccatcc acgagctgat ccaggtcatg gccgaactgt 1860
ccccggccgc caagaccggc aagcgtaagc gttcccagat gctgttccgt ggccgtcgcg 1920
cctcccagca ccatcatcac caccactgac cttctgctcg tagcgattac ttcgagcatt 1980
actgacgaca aagaccccga ccgagatggt cggggtcttt ttgttgtggt gctgtgacgt 2040
gttgtccaac cgtattattc cgg 2063
<210> 3
<211> 2045
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAG8TL hTNF-α 表达盒-hIFN-γ 表达盒
<400> 3
tagccggcat tttcgcgata cattccccgg aatgttgcgc aacggggaac gcgcaccaca 60
ccgcaaccac agtgcgccac gcccagtccg gccctgtgcg ctataatagg tcagttattc 120
gcgcgcgcgt ggcgccctct acaccccgag ccgcgaggac acgtggattc cggacggcca 180
tgccccacat ggcaaaccga gaacccgcac acctagcatt acaaggagag ccattatggc 240
gttgatgatg agcgttaaga ctattatttc cacatcagtg gcgattatcg ccacgggtgc 300
catgtttgcg tgcgtagccc cgtttgcctc tgccgattcc gcgcagacga gtgctgtggt 360
gtcctcacgt tctttcccga aggcgagttc ggtggtgcgc tcctcctccc gtaccccgtc 420
cgataagccg gtcgcccatg tggtcgccaa cccgcaggcc gagggccagc tgcagtggct 480
gaaccgtcgc gccaacgccc tgctggccaa cggcgtggaa ctgcgcgaca accagctggt 540
cgtgccgtcc gagggcctgt acctgatcta ctcccaggtg ctgttcaagg gccagggctg 600
cccgtccacc cacgtcctgc tgacccatac catctcccgc atcgccgtgt cctaccagac 660
caaggtcaac ctgctgtccg ccatcaagtc cccgtgccag cgtgagaccc cggaaggcgc 720
cgaggccaag ccgtggtacg aaccgatcta cctgggcggc gtgttccagc tggaaaaggg 780
cgatcgtctg tccgccgaga tcaaccgtcc ggactacctg gatttcgccg agtccggcca 840
ggtctacttc ggcatcatcg ccctgtgaaa ccgcttctca tttccatttg cgatatggtc 900
tgaatacgac gaaaccccgg cgcgaggccg gggtttcgta agctgtgcgt gactatagca 960
cgaccagcgc gattcggtgc acggatccgt cttcctgctg gcctatgcat tgggttccgc 1020
agtgcccact ccaggcggtc tgggcggtgt ggaagcggcg ctgacattcg cgttcgtggc 1080
ggtcggagtg ccgcagggcg tggcgctttc cgccactttg ctgcaccgcg tggtgttcta 1140
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tacccccttc ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca 1680
tgcgctagta tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag 1740
aaggatgctt tatggcgttg atgatgagcg ttaagactat tatttccaca tcagtggcga 1800
ttatcgccac gggtgccatg tttgcgtgcg tagccccgtt tgcctctgcc gattccgcgc 1860
agacgagtgc tgtggtgtcc tcacgttctt tcccgaaggc gagttcggtg caggtccagc 1920
tggtcgaatc gggcggcggc gtcgtccagc cgggccgttc cctgcgtctg gattgcaagg 1980
cctcgggcat caccttctcg aactccggca tgcactgggt gcgccaggcc ccgggcaagg 2040
gcctggaatg ggtcgccgtg atctggtacg atggctcgaa gcgctactac gccgattccg 2100
tgaagggccg cttcaccatc tcgcgcgaca actccaagaa caccctgttc ctgcagatga 2160
actccctgcg cgccgaagac accgccgtgt actactgcgc caccaacgat gactactggg 2220
gccagggcac cctggtcacc gtgtccagcg gcggcggcgg ctccggcggc ggcggctcgg 2280
gcggcggcgg cagcgaaatc gtgctgaccc agtccccggc caccctgtcc ctgtccccgg 2340
gcgaacgtgc caccctgtcg tgccgcgcct cccagtcggt gtccagctac ctggcctggt 2400
accagcagaa gccgggccag gccccgcgtc tgctgatcta cgacgcctcc aaccgcgcca 2460
ccggcatccc ggcccgcttc tccggctcgg gctccggcac cgacttcacc ctgaccatct 2520
cgtccctgga accggaggac ttcgccgtct actactgcca gcagtcctcg aactggccgc 2580
gcaccttcgg ccagggcacc aaggtcgaga tcaagcacca tcatcaccac cactgacctt 2640
ctgctcgtag cgattacttc gagcattact gacgacaaag accccgaccg agatggtcgg 2700
ggtctttttg ttgtggtgct gtgacgtgtt gtccaaccgt attattccgg actagtcctc 2760
caggacctcg tctacgaggc gctgagcgag gaatggcgca aaagggacgg cgagatcagc 2820
gacccatggg ccaacgacga ggcggacgga taccagccgc cctcatacga gccggtcaac 2880
cccgaacgca ggactcccca gacgccctcc gatggcctga tctgacgtcc gaaaaaaggc 2940
gctgtgcgcc ctttttaaat cttttataaa tctttttaca ttcttttagc ccctccgcag 3000
ccttactctc ccaacgggtt tcagccgaaa cctacaccaa aaggggagcg aacctacacc 3060
aaaaggggag cgaacctaca ccaaaagggg agcgaaccta caccaaaagg ggagctatat 3120
acaccttttg ttatttaagg tgcaagttgt gctatgctga ggccatgtcc aatgagatcg 3180
tgaagttcag caaccagttc aacaacgtcg cgctgaagaa gttcgacgcc gtgcacctgg 3240
acgtgctcat ggcgatcgcc tcaagggtga gggagaaggg cacggccacg gtggagttct 3300
cgttcgagga gctgcgcggc ctcatgcgat tgaggaagaa cctgaccaac aagcagctgg 3360
ccgacaagat cgtgcagacg aacgcgcgcc tgctggcgct gaactacatg ttcgaggatt 3420
cgggcaagat catccagttc gcgctgttca cgaagttcgt caccgacccg caggaggcga 3480
ctctcgcggt tggggtcaac gaggagttcg cgttcctgct caacgacctg accagccagt 3540
tcacgcgctt cgagctggcc gagttcgccg acctcaagag caagtacgcc aaggagttct 3600
accgcagggc caagcagtac cgcagctccg gaatctggaa gatcggccgc gacgagttct 3660
gccgactgct tggcgttcca ccgtcggcaa taacccagac acgatatctg aatcagaagg 3720
ttcttcagcc aattcaggag gagtgtgggc ctctccttgg cctgaagatc gagcgccagt 3780
acgtgaaacg caggctgtcg ggcttcgtgt tcacattcgc ccgcgagacc cctccggtga 3840
tcgacgccag gcccgtggag gcgaggaaga cggacggcga cggcaagggc cattggacga 3900
gcgttgccgg gtacggcgag gtgttcacga ccacggcgtt gttcgacgtg acggccgccc 3960
gggctcactt cgacggcacc gttgaagccg gggagtgccg tttctgcgcg tttgacgcgc 4020
gcaaccgcga acatcatgcg cggaacgccg gaaggctgtt ctagcggccg tgtccgcgcc 4080
tctggggcgg ttgcgcctgc catgggtcga tctgccgctg ttcggcctca cgctggtctg 4140
tgcgctgcct gatctccctg agcaggtcgg ccttggtcct gggggcgctt cgctcctcga 4200
acgggccgct ctcccccagg tcctcgggct cgctcaggtc caacggctcg tcaccggacg 4260
gctcgggccg gttctctccc tgtgccgggt tctccgcctg tgcgcgttgt tcggccatgc 4320
gcagtgcgag ggccttcacc tgttcggggc ttgtcgactc gattttcgtt cgtgaataca 4380
tgttataata actataacta ataacgtaac gtgactggca agagatattt ttaaaacaat 4440
gaataggttt acacttactt tagttttatg gaaatgaaag atcatatcat atataatcta 4500
gaataaaatt aactaaaata attattatct agataaaaaa tttagaagcc aatgaaatct 4560
ataaataaac taaattaagt ttatttaatt aacaactatg gatataaaat aggtactaat 4620
caaaatagtg aggaggatat atttgaatac atacgaacaa attaataaag tgaaaaaaat 4680
acttcggaaa catttaaaaa ataaccttat tggtacttac atgtttggat caggagttga 4740
gagtggacta aaaccaaata gtgatcttga ctttttagtc gtcgtatctg aaccattgac 4800
agatcaaagt aaagaaatac ttatacaaaa aattagacct atttcaaaaa aaataggaga 4860
taaaagcaac ttacgatata ttgaattaac aattattatt cagcaagaaa tggtaccgtg 4920
gaatcatcct cccaaacaag aatttattta tggagaatgg ttacaagagc tttatgaaca 4980
aggatacatt cctcagaagg aattaaattc agatttaacc ataatgcttt accaagcaaa 5040
acgaaaaaat aaaagaatat acggaaatta tgacttagag gaattactac ctgatattcc 5100
attttctgat gtgagaagag ccattatgga ttcgtcagag gaattaatag ataattatca 5160
ggatgatgaa accaactcta tattaacttt atgccgtatg attttaacta tggacacggg 5220
taaaatcata ccaaaagata ttgcgggaaa tgcagtggct gaatcttctc cattagaaca 5280
tagggagaga attttgttag cagttcgtag ttatcttgga gagaatattg aatggactaa 5340
tgaaaatgta aatttaacta taaactattt aaataacaga ttaaaaaaat tataaaaaaa 5400
ttgaaaaaat ggtggaaaca cttttttcaa tttttttaga tcttgagcaa aaggccagca 5460
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 5520
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 5580
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 5640
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 5700
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 5760
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 5820
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 5880
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 5940
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 6000
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 6060
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta c 6111
<210> 11
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1scFv03
<400> 11
atgcaggtcc agctggtcga atcgggcggc ggcgtcgtcc agccgggccg ttccctgcgt 60
ctggattgca aggcctcggg catcaccttc tcgaactccg gcatgcactg ggtgcgccag 120
gccccgggca agggcctgga atgggtcgcc gtgatctggt acgatggctc gaagcgctac 180
tacgccgatt ccgtgaaggg ccgcttcacc atctcgcgcg acaactccaa gaacaccctg 240
ttcctgcaga tgaactccct gcgcgccgaa gacaccgccg tgtactactg cgccaccaac 300
gatgactact ggggccaggg caccctggtc accgtgtcca gcggcggcgg cggctccggc 360
ggcggcggct cgggcggcgg cggcagcgaa atcgtgctga cccagtcccc ggccaccctg 420
tccctgtccc cgggcgaacg tgccaccctg tcgtgccgcg cctcccagtc ggtgtccagc 480
tacctggcct ggtaccagca gaagccgggc caggccccgc gtctgctgat ctacgacgcc 540
tccaaccgcg ccaccggcat cccggcccgc ttctccggct cgggctccgg caccgacttc 600
accctgacca tctcgtccct ggaaccggag gacttcgccg tctactactg ccagcagtcc 660
tcgaactggc cgcgcacctt cggccagggc accaaggtcg agatcaagca ccatcatcac 720
caccactga 729
<210> 12
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA-4scFv02
<400> 12
atgcaggtcc agctggtcga atcgggcggc ggcgtcgtcc agccgggccg tagcctgcgt 60
ctgtcgtgcg ccgcctcggg cttcaccttc tccagctaca ccatgcactg ggtgcgtcag 120
gccccgggca agggcctgga gtgggtcacc ttcatctcct acgacggcaa caacaagtac 180
tacgccgatt ccgtgaaggg ccgcttcacc atctcccgtg acaacagcaa gaacaccctg 240
tacctgcaga tgaactccct gcgcgccgaa gacaccgcca tctactactg cgcccgtacc 300
ggctggctgg gcccgttcga ttactggggc cagggcaccc tggtgaccgt ctcgtcgggc 360
ggcggcggct cgggcggcgg cggctccggc ggcggcggca gcgagatcgt gctgacccag 420
tccccgggca ccctgtcgct gtccccgggc gaacgcgcca ccctgtcctg ccgtgccagc 480
cagtcggtcg gcagctcgta cctggcctgg taccagcaga agccgggcca ggccccgcgt 540
ctgctgatct acggcgcctt ctcccgtgcc accggcatcc cggaccgttt ctccggcagc 600
ggctcgggca ccgatttcac cctgaccatc tcccgcctgg agccggaaga tttcgccgtc 660
tactactgcc agcagtacgg ctccagcccg tggaccttcg gccagggcac caaggtggaa 720
atcaagcatc atcatcatca tcactga 747
<210> 13
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA-4 scFv02FLAG
<400> 13
atgcaggtcc agctggtcga atcgggcggc ggcgtcgtcc agccgggccg tagcctgcgt 60
ctgtcgtgcg ccgcctcggg cttcaccttc tccagctaca ccatgcactg ggtgcgtcag 120
gccccgggca agggcctgga gtgggtcacc ttcatctcct acgacggcaa caacaagtac 180
tacgccgatt ccgtgaaggg ccgcttcacc atctcccgtg acaacagcaa gaacaccctg 240
tacctgcaga tgaactccct gcgcgccgaa gacaccgcca tctactactg cgcccgtacc 300
ggctggctgg gcccgttcga ttactggggc cagggcaccc tggtgaccgt ctcgtcgggc 360
ggcggcggct cgggcggcgg cggctccggc ggcggcggca gcgagatcgt gctgacccag 420
tccccgggca ccctgtcgct gtccccgggc gaacgcgcca ccctgtcctg ccgtgccagc 480
cagtcggtcg gcagctcgta cctggcctgg taccagcaga agccgggcca ggccccgcgt 540
ctgctgatct acggcgcctt ctcccgtgcc accggcatcc cggaccgttt ctccggcagc 600
ggctcgggca ccgatttcac cctgaccatc tcccgcctgg agccggaaga tttcgccgtc 660
tactactgcc agcagtacgg ctccagcccg tggaccttcg gccagggcac caaggtggaa 720
atcaaggact acaaggacga cgacgacaag tga 753
<210> 14
<211> 4019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 线形化的载体片段
<400> 14
tgaccttctg ctcgtagcga ttacttcgag cattactgac gacaaagacc ccgaccgaga 60
tggtcggggt ctttttgttg tggtgctgtg acgtgttgtc caaccgtatt attccggact 120
agtcctccag gacctcgtct acgaggcgct gagcgaggaa tggcgcaaaa gggacggcga 180
gatcagcgac ccatgggcca acgacgaggc ggacggatac cagccgccct catacgagcc 240
ggtcaacccc gaacgcagga ctccccagac gccctccgat ggcctgatct gacgtccgaa 300
aaaaggcgct gtgcgccctt tttaaatctt ttataaatct ttttacattc ttttagcccc 360
tccgcagcct tactctccca acgggtttca gccgaaacct acaccaaaag gggagcgaac 420
ctacaccaaa aggggagcga acctacacca aaaggggagc gaacctacac caaaagggga 480
gctatataca ccttttgtta tttaaggtgc aagttgtgct atgctgaggc catgtccaat 540
gagatcgtga agttcagcaa ccagttcaac aacgtcgcgc tgaagaagtt cgacgccgtg 600
cacctggacg tgctcatggc gatcgcctca agggtgaggg agaagggcac ggccacggtg 660
gagttctcgt tcgaggagct gcgcggcctc atgcgattga ggaagaacct gaccaacaag 720
cagctggccg acaagatcgt gcagacgaac gcgcgcctgc tggcgctgaa ctacatgttc 780
gaggattcgg gcaagatcat ccagttcgcg ctgttcacga agttcgtcac cgacccgcag 840
gaggcgactc tcgcggttgg ggtcaacgag gagttcgcgt tcctgctcaa cgacctgacc 900
agccagttca cgcgcttcga gctggccgag ttcgccgacc tcaagagcaa gtacgccaag 960
gagttctacc gcagggccaa gcagtaccgc agctccggaa tctggaagat cggccgcgac 1020
gagttctgcc gactgcttgg cgttccaccg tcggcaataa cccagacacg atatctgaat 1080
cagaaggttc ttcagccaat tcaggaggag tgtgggcctc tccttggcct gaagatcgag 1140
cgccagtacg tgaaacgcag gctgtcgggc ttcgtgttca cattcgcccg cgagacccct 1200
ccggtgatcg acgccaggcc cgtggaggcg aggaagacgg acggcgacgg caagggccat 1260
tggacgagcg ttgccgggta cggcgaggtg ttcacgacca cggcgttgtt cgacgtgacg 1320
gccgcccggg ctcacttcga cggcaccgtt gaagccgggg agtgccgttt ctgcgcgttt 1380
gacgcgcgca accgcgaaca tcatgcgcgg aacgccggaa ggctgttcta gcggccgtgt 1440
ccgcgcctct ggggcggttg cgcctgccat gggtcgatct gccgctgttc ggcctcacgc 1500
tggtctgtgc gctgcctgat ctccctgagc aggtcggcct tggtcctggg ggcgcttcgc 1560
tcctcgaacg ggccgctctc ccccaggtcc tcgggctcgc tcaggtccaa cggctcgtca 1620
ccggacggct cgggccggtt ctctccctgt gccgggttct ccgcctgtgc gcgttgttcg 1680
gccatgcgca gtgcgagggc cttcacctgt tcggggcttg tcgactcgat tttcgttcgt 1740
gaatacatgt tataataact ataactaata acgtaacgtg actggcaaga gatattttta 1800
aaacaatgaa taggtttaca cttactttag ttttatggaa atgaaagatc atatcatata 1860
taatctagaa taaaattaac taaaataatt attatctaga taaaaaattt agaagccaat 1920
gaaatctata aataaactaa attaagttta tttaattaac aactatggat ataaaatagg 1980
tactaatcaa aatagtgagg aggatatatt tgaatacata cgaacaaatt aataaagtga 2040
aaaaaatact tcggaaacat ttaaaaaata accttattgg tacttacatg tttggatcag 2100
gagttgagag tggactaaaa ccaaatagtg atcttgactt tttagtcgtc gtatctgaac 2160
cattgacaga tcaaagtaaa gaaatactta tacaaaaaat tagacctatt tcaaaaaaaa 2220
taggagataa aagcaactta cgatatattg aattaacaat tattattcag caagaaatgg 2280
taccgtggaa tcatcctccc aaacaagaat ttatttatgg agaatggtta caagagcttt 2340
atgaacaagg atacattcct cagaaggaat taaattcaga tttaaccata atgctttacc 2400
aagcaaaacg aaaaaataaa agaatatacg gaaattatga cttagaggaa ttactacctg 2460
atattccatt ttctgatgtg agaagagcca ttatggattc gtcagaggaa ttaatagata 2520
attatcagga tgatgaaacc aactctatat taactttatg ccgtatgatt ttaactatgg 2580
acacgggtaa aatcatacca aaagatattg cgggaaatgc agtggctgaa tcttctccat 2640
tagaacatag ggagagaatt ttgttagcag ttcgtagtta tcttggagag aatattgaat 2700
ggactaatga aaatgtaaat ttaactataa actatttaaa taacagatta aaaaaattat 2760
aaaaaaattg aaaaaatggt ggaaacactt ttttcaattt ttttagatct tgagcaaaag 2820
gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2880
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 2940
gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3000
ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3060
atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3120
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3180
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3240
gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3300
ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3360
ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3420
agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3480
atccgtcttc ctgctggcct atgcattggg ttccgcagtg cccactccag gcggtctggg 3540
cggtgtggaa gcggcgctga cattcgcgtt cgtggcggtc ggagtgccgc agggcgtggc 3600
gctttccgcc actttgctgc accgcgtggt gttctactgg ctgcgcattc cgctgggcgc 3660
ggcggccatg aagtggcttg acaagcataa tcttgtctga ttcgtctatt ttcatacccc 3720
cttcggggaa atagatgtga aaacccttat aaaacgcggg ttttcgcaga aacatgcgct 3780
agtatcattg atgacaacat ggactaagca aaagtgcttg tcccctgacc caagaaggat 3840
gctttatggc gttgatgatg agcgttaaga ctattatttc cacatcagtg gcgattatcg 3900
ccacgggtgc catgtttgcg tgcgtagccc cgtttgcctc tgccgattcc gcgcagacga 3960
gtgctgtggt gtcctcacgt tctttcccga aggcgagttc ggtgcaggtc cagctggtc 4019
<210> 15
<211> 4616
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pP30SP7L20-bHER2
<400> 15
tagccggcat tttcgcgata cattccccgg aatgttgcgc aacggggaac gcgcaccaca 60
ccgcaaccac agtgcgccac gcccagtccg gccctgtgcg ctataatagg tcagttattc 120
gcgcgcgcgt ggcgccctct acaccccgag ccgcgaggac acgtggattc cggacggcca 180
tgccccacat ggcaaaccga gaacccgcac acctagcatt acaaggagag ccattatggc 240
gttgatgatg agcgttaaga ctattatttc cacatcagtg gcgattatcg ccacgggtgc 300
catgtttgcg tgcgtagccc cgtttgcctc tgccgattcc gcgcagacga gtgctgtggt 360
gtcctcacgt tctttcccga aggcgagttc ggtggaagtg cagctggtcg aatcgggcgg 420
cggcctggtg cagccgggcg gctccctgcg tctgtcgtgc gccgcctcgg gcttcaacat 480
caaggatacc tacatccact gggtgcgcca ggccccgggc aagggcctgg aatgggtggc 540
ccgtatctac ccgaccaacg gctacacccg ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac 600
catctccgcc gataccagca agaacaccgc ctacctgcag atgaactccc tgcgcgccga 660
agataccgcc gtgtactact gctcgcgctg gggcggcgac ggcttctacg ccatggacta 720
ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc cagcggcggc ggcggctccg gcggcggcgg 780
ctcgggcggc ggcggctccg acatccagat gacccagtcc ccgtcgtccc tgagcgcctc 840
ggtgggcgat cgcgtgacca tcacctgccg cgcctcccag gatgtgaaca ccgccgtggc 900
ctggtaccag cagaagccgg gcaaggcccc gaagctgctg atctactcgg cctccttcct 960
gtactccggc gtgccgtccc gtttctccgg ctcccgctcg ggcaccgact tcaccctgac 1020
catctcgtcc ctgcagccgg aagacttcgc cacctactac tgccagcagc attacaccac 1080
cccgccgacc ttcggccagg gcaccaaggt ggaaatcaag catcatcatc atcatcactg 1140
accttctgct cgtagcgatt acttcgagca ttactgacga caaagacccc gaccgagatg 1200
gtcggggtct ttttgttgtg gtgctgtgac gtgttgtcca accgtattat tccggactag 1260
tcctccagga cctcgtctac gaggcgctga gcgaggaatg gcgcaaaagg gacggcgaga 1320
tcagcgaccc atgggccaac gacgaggcgg acggatacca gccgccctca tacgagccgg 1380
tcaaccccga acgcaggact ccccagacgc cctccgatgg cctgatctga cgtccgaaaa 1440
aaggcgctgt gcgccctttt taaatctttt ataaatcttt ttacattctt ttagcccctc 1500
cgcagcctta ctctcccaac gggtttcagc cgaaacctac accaaaaggg gagcgaacct 1560
acaccaaaag gggagcgaac ctacaccaaa aggggagcga acctacacca aaaggggagc 1620
tatatacacc ttttgttatt taaggtgcaa gttgtgctat gctgaggcca tgtccaatga 1680
gatcgtgaag ttcagcaacc agttcaacaa cgtcgcgctg aagaagttcg acgccgtgca 1740
cctggacgtg ctcatggcga tcgcctcaag ggtgagggag aagggcacgg ccacggtgga 1800
gttctcgttc gaggagctgc gcggcctcat gcgattgagg aagaacctga ccaacaagca 1860
gctggccgac aagatcgtgc agacgaacgc gcgcctgctg gcgctgaact acatgttcga 1920
ggattcgggc aagatcatcc agttcgcgct gttcacgaag ttcgtcaccg acccgcagga 1980
ggcgactctc gcggttgggg tcaacgagga gttcgcgttc ctgctcaacg acctgaccag 2040
ccagttcacg cgcttcgagc tggccgagtt cgccgacctc aagagcaagt acgccaagga 2100
gttctaccgc agggccaagc agtaccgcag ctccggaatc tggaagatcg gccgcgacga 2160
gttctgccga ctgcttggcg ttccaccgtc ggcaataacc cagacacgat atctgaatca 2220
gaaggttctt cagccaattc aggaggagtg tgggcctctc cttggcctga agatcgagcg 2280
ccagtacgtg aaacgcaggc tgtcgggctt cgtgttcaca ttcgcccgcg agacccctcc 2340
ggtgatcgac gccaggcccg tggaggcgag gaagacggac ggcgacggca agggccattg 2400
gacgagcgtt gccgggtacg gcgaggtgtt cacgaccacg gcgttgttcg acgtgacggc 2460
cgcccgggct cacttcgacg gcaccgttga agccggggag tgccgtttct gcgcgtttga 2520
cgcgcgcaac cgcgaacatc atgcgcggaa cgccggaagg ctgttctagc ggccgtgtcc 2580
gcgcctctgg ggcggttgcg cctgccatgg gtcgatctgc cgctgttcgg cctcacgctg 2640
gtctgtgcgc tgcctgatct ccctgagcag gtcggccttg gtcctggggg cgcttcgctc 2700
ctcgaacggg ccgctctccc ccaggtcctc gggctcgctc aggtccaacg gctcgtcacc 2760
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acaatgaata ggtttacact tactttagtt ttatggaaat gaaagatcat atcatatata 3000
atctagaata aaattaacta aaataattat tatctagata aaaaatttag aagccaatga 3060
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attccatttt ctgatgtgag aagagccatt atggattcgt cagaggaatt aatagataat 3660
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ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 4200
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<212> DNA
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<220>
<223> phIFNg33
<400> 16
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<211> 25
<212> DNA
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<223> GA116_primer
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gactagtgtg caccgaatcg cgctg 25
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<212> DNA
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<220>
<223> IFNG1_primer
<400> 28
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<211> 34
<212> DNA
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<220>
<223> IFNG2_primer
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<210> 30
<211> 36
<212> DNA
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<220>
<223> IFNG3_primer
<400> 30
gtggtggtga tgatggtgct gggaggcgcg acggcc 36
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIFNG4_primer
<400> 31
caggacccgt acgtcaagg 19
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP69-ins_F1_primer
<400> 32
caagaaggat gctttatgaa ttatttacga caaaaaattt cgg 43
<210> 33
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP69-ins_R2_primer
<400> 33
gacgtacggg tcctgaccgc tatcagtcgt ggtgtaac 38
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCDshuttle_R1_primer
<400> 34
cataaagcat ccttcttggg tcag 24
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu-mCCL21-vecR1_primer
<400> 35
aaagcatcct tcttgggtca gg 22
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ins-hPD-1scFv03-F1
<400> 36
caggtccagc tggtcgaatc gggcggcggc 30
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ins-hPD-1scFv03-R1
<400> 37
acgagcagaa ggtcagtggt ggtgatgatg gtgctt 36
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGA-Hu-Terminator-F
<400> 38
tgaccttctg ctcgtagcga ttac 24
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vec-SP7L20-R1
<400> 39
gaccagctgg acctgcaccg aactcgcctt cgggaa 36
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ins-hCTLA-4scFv02-F1
<400> 40
caggtccagc tggtcgaatc gggcggcggc 30
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ins-hCTLA-4scFv02-R1
<400> 41
acgagcagaa ggtcagtgat gatgatgatg atgctt 36
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA-4scFv02-FLAG-F1
<400> 42
gactacaagg acgacgacga caagtgacct tctgctcgta gcgat 45
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA-4scFv02-FLAG-R1
<400> 43
gtcgtccttg tagtccttga tttccacctt ggt 33
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> InF_pTB6 rep_F1
<400> 44
actagtcctc caggacctcg tctacgaggc 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> InF_Hu Prom_F1
<400> 45
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc 30
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> InF_Hu Term-Hu Prom_R1
<400> 46
ggccagcagg aagacccgga ataatacggt tggac 35
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> InF_Hu Term-pTB6_R1
<400> 47
tcctggagga ctagtccgga ataatacggt tggac 35
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pTB6_Vec_F1
<400> 48
actagtcctc caggacctcg tctac 25
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu-term_Vec_R1
<400> 49
ccggaataat acggttggac aac 23
<210> 50
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu-HuT_ins_F1
<400> 50
accgtattat tccggggatc cgtcttcctg ctgg 34
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HuT-pTB6_ins_R1
<400> 51
tcctggagga ctagtccgga ataatacggt tggacaac 38
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu_Vec_F1
<400> 52
ggatccgtct tcctgctgg 19
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bHER2-His_Vec_R1
<400> 53
tcagtgatga tgatgatgat gcttg 25
<210> 54
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> d0013+T_ins_F1
<400> 54
catcatcatc actgaaaccg cttctcattt ccatttg 37
<210> 55
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> d0013+T_ins_R1
<400> 55
caggaagacg gatccgtgca ccgaatcgcg ct 32
<210> 56
<211> 99
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(99)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP7
<400> 56
atg gcg ttg atg atg agc gtt aag act att att tcc aca tca gtg gcg 48
Met Ala Leu Met Met Ser Val Lys Thr Ile Ile Ser Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
att atc gcc acg ggt gcc atg ttt gcg tgc gta gcc ccg ttt gcc tct 96
Ile Ile Ala Thr Gly Ala Met Phe Ala Cys Val Ala Pro Phe Ala Ser
20 25 30
gcc 99
Ala
<210> 57
<211> 33
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 57
Met Ala Leu Met Met Ser Val Lys Thr Ile Ile Ser Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Ile Ile Ala Thr Gly Ala Met Phe Ala Cys Val Ala Pro Phe Ala Ser
20 25 30
Ala
<210> 58
<211> 102
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(102)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP45
<400> 58
atg aag cac ctc tcc cac cgc acc atc gcc atc atc gtc gcg ttg ctc 48
Met Lys His Leu Ser His Arg Thr Ile Ala Ile Ile Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
tcc acg ctg tca ctg gca ctt gcc gtc atc tcc ctt ccg cac cag gcg 96
Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Ala Val Ile Ser Leu Pro His Gln Ala
20 25 30
tac gca 102
Tyr Ala
<210> 59
<211> 34
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 59
Met Lys His Leu Ser His Arg Thr Ile Ala Ile Ile Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Ala Val Ile Ser Leu Pro His Gln Ala
20 25 30
Tyr Ala
<210> 60
<211> 168
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(168)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP50
<400> 60
atg atc gtg gcc tac ccg cac aca gtg cag tat gcg ggg aaa cgt acc 48
Met Ile Val Ala Tyr Pro His Thr Val Gln Tyr Ala Gly Lys Arg Thr
1 5 10 15
agg aaa gga cga atg atg ata acg aca tgg cgg caa cgg ggc atg gcc 96
Arg Lys Gly Arg Met Met Ile Thr Thr Trp Arg Gln Arg Gly Met Ala
20 25 30
atc gta gcg atg ctg acc ggt ctg ata ata atg gtg gga gtg gtg ttc 144
Ile Val Ala Met Leu Thr Gly Leu Ile Ile Met Val Gly Val Val Phe
35 40 45
ggc tcg gcg aat acg gcg tat gcc 168
Gly Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Ala
50 55
<210> 61
<211> 56
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 61
Met Ile Val Ala Tyr Pro His Thr Val Gln Tyr Ala Gly Lys Arg Thr
1 5 10 15
Arg Lys Gly Arg Met Met Ile Thr Thr Trp Arg Gln Arg Gly Met Ala
20 25 30
Ile Val Ala Met Leu Thr Gly Leu Ile Ile Met Val Gly Val Val Phe
35 40 45
Gly Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Ala
50 55
<210> 62
<211> 105
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(105)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP52
<400> 62
atg agt ttc cat gta tcc gcg caa tcg gtt cgc gcg gtg gcc ggt gga 48
Met Ser Phe His Val Ser Ala Gln Ser Val Arg Ala Val Ala Gly Gly
1 5 10 15
ctc gtc gcc gca gcg aca ttg ctg tca ggc ctt gcc ctt gcg ccg acc 96
Leu Val Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala Pro Thr
20 25 30
gca atg gcc 105
Ala Met Ala
35
<210> 63
<211> 35
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 63
Met Ser Phe His Val Ser Ala Gln Ser Val Arg Ala Val Ala Gly Gly
1 5 10 15
Leu Val Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala Pro Thr
20 25 30
Ala Met Ala
35
<210> 64
<211> 144
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(144)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP55
<400> 64
atg gtt cgt cgc gcc cag gct gct ctt cgg tcc gtt gaa cac acc agc 48
Met Val Arg Arg Ala Gln Ala Ala Leu Arg Ser Val Glu His Thr Ser
1 5 10 15
gtg agg cag ctg cga gtc ctg gct gcg att gta ttt ctg ttc gcc atg 96
Val Arg Gln Leu Arg Val Leu Ala Ala Ile Val Phe Leu Phe Ala Met
20 25 30
gtc atc gcc act gtg gct cct gca gtc acg gct ccg atg gcc ttc gcc 144
Val Ile Ala Thr Val Ala Pro Ala Val Thr Ala Pro Met Ala Phe Ala
35 40 45
<210> 65
<211> 48
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 65
Met Val Arg Arg Ala Gln Ala Ala Leu Arg Ser Val Glu His Thr Ser
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Arg Val Leu Ala Ala Ile Val Phe Leu Phe Ala Met
20 25 30
Val Ile Ala Thr Val Ala Pro Ala Val Thr Ala Pro Met Ala Phe Ala
35 40 45
<210> 66
<211> 96
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(96)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP58
<400> 66
atg gca atg gca cgg cgt tgg acc ccg cag cgg ttt gtt aca ctg cgt 48
Met Ala Met Ala Arg Arg Trp Thr Pro Gln Arg Phe Val Thr Leu Arg
1 5 10 15
cgc atc cgc gta atc gcc tgt atc gcg gcg acc agt atc gcg ctg gct 96
Arg Ile Arg Val Ile Ala Cys Ile Ala Ala Thr Ser Ile Ala Leu Ala
20 25 30
<210> 67
<211> 32
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 67
Met Ala Met Ala Arg Arg Trp Thr Pro Gln Arg Phe Val Thr Leu Arg
1 5 10 15
Arg Ile Arg Val Ile Ala Cys Ile Ala Ala Thr Ser Ile Ala Leu Ala
20 25 30
<210> 68
<211> 93
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(93)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP64
<400> 68
atg aag tca cta atc agg aat gta gcg gcg ggc gtc ctc gca gcc gcc 48
Met Lys Ser Leu Ile Arg Asn Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
acg atg ctc ggc atc gcc ggc ctc ggc gcc acc acc gcc tcc gcg 93
Thr Met Leu Gly Ile Ala Gly Leu Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala
20 25 30
<210> 69
<211> 31
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 69
Met Lys Ser Leu Ile Arg Asn Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Thr Met Leu Gly Ile Ala Gly Leu Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala
20 25 30
<210> 70
<211> 78
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(78)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP66
<400> 70
gtg aag cat tgg aag aag atg gca gca tcg ttg att gca ata tca acg 48
Val Lys His Trp Lys Lys Met Ala Ala Ser Leu Ile Ala Ile Ser Thr
1 5 10 15
atg gtg gca gta gtt ccg acg acg tat gcc 78
Met Val Ala Val Val Pro Thr Thr Tyr Ala
20 25
<210> 71
<211> 26
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 71
Val Lys His Trp Lys Lys Met Ala Ala Ser Leu Ile Ala Ile Ser Thr
1 5 10 15
Met Val Ala Val Val Pro Thr Thr Tyr Ala
20 25
<210> 72
<211> 99
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(99)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP67
<400> 72
atg aag ata aac aat aag ggc aag ggc gct ctt atc gcg gca att acc 48
Met Lys Ile Asn Asn Lys Gly Lys Gly Ala Leu Ile Ala Ala Ile Thr
1 5 10 15
gcc gcg gca acg cta ttg tca tgc ggg ctg gcc gct gca agt gcc agt 96
Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Cys Gly Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser
20 25 30
gcg 99
Ala
<210> 73
<211> 33
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 73
Met Lys Ile Asn Asn Lys Gly Lys Gly Ala Leu Ile Ala Ala Ile Thr
1 5 10 15
Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Cys Gly Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser
20 25 30
Ala
<210> 74
<211> 129
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(129)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP68
<400> 74
atg gtt tat aac att cac ata ttg caa aca agg aaa acc ggt cgt gtg 48
Met Val Tyr Asn Ile His Ile Leu Gln Thr Arg Lys Thr Gly Arg Val
1 5 10 15
gtt gct gct gcg gct gca tcc gtg ctg tgt tgc atg ggg gct gta ttt 96
Val Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Leu Cys Cys Met Gly Ala Val Phe
20 25 30
cca gcg act atc gga gtg act gcg gcg tcg gcc 129
Pro Ala Thr Ile Gly Val Thr Ala Ala Ser Ala
35 40
<210> 75
<211> 43
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 75
Met Val Tyr Asn Ile His Ile Leu Gln Thr Arg Lys Thr Gly Arg Val
1 5 10 15
Val Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Leu Cys Cys Met Gly Ala Val Phe
20 25 30
Pro Ala Thr Ile Gly Val Thr Ala Ala Ser Ala
35 40
<210> 76
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> SP69
<400> 76
atg aat tat tta cga caa aaa att tcg gct agt gct atc gcg gtg ttg 48
Met Asn Tyr Leu Arg Gln Lys Ile Ser Ala Ser Ala Ile Ala Val Leu
1 5 10 15
tcg act tgt ggg ttg att ttg gcg cca atg ccg gtc ttt gcg 90
Ser Thr Cys Gly Leu Ile Leu Ala Pro Met Pro Val Phe Ala
20 25 30
<210> 77
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 77
Met Asn Tyr Leu Arg Gln Lys Ile Ser Ala Ser Ala Ile Ala Val Leu
1 5 10 15
Ser Thr Cys Gly Leu Ile Leu Ala Pro Met Pro Val Phe Ala
20 25 30
<210> 78
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP7)
<400> 78
gat tcc gcg cag acg agt gct gtg gtg tcc tca cgt tct ttc ccg aag 48
Asp Ser Ala Gln Thr Ser Ala Val Val Ser Ser Arg Ser Phe Pro Lys
1 5 10 15
gcg agt tcg gtg aag aag aat ttg ttc gcc gaa tcc acc tcc 90
Ala Ser Ser Val Lys Lys Asn Leu Phe Ala Glu Ser Thr Ser
20 25 30
<210> 79
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 79
Asp Ser Ala Gln Thr Ser Ala Val Val Ser Ser Arg Ser Phe Pro Lys
1 5 10 15
Ala Ser Ser Val Lys Lys Asn Leu Phe Ala Glu Ser Thr Ser
20 25 30
<210> 80
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP45)
<400> 80
gtc gac ggc aca gac ggc aca agc ggc acg aac agt acg tct cag gga 48
Val Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Gly Thr Asn Ser Thr Ser Gln Gly
1 5 10 15
agc gac ggc gat tcc gcg cca atc gcc ggc ccg gtg ccg aac 90
Ser Asp Gly Asp Ser Ala Pro Ile Ala Gly Pro Val Pro Asn
20 25 30
<210> 81
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 81
Val Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Gly Thr Asn Ser Thr Ser Gln Gly
1 5 10 15
Ser Asp Gly Asp Ser Ala Pro Ile Ala Gly Pro Val Pro Asn
20 25 30
<210> 82
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP50)
<400> 82
gcg acg ttg acg ccc gcc gac gaa aga tat cac gtg gcg ttt cca tac 48
Ala Thr Leu Thr Pro Ala Asp Glu Arg Tyr His Val Ala Phe Pro Tyr
1 5 10 15
aac gat atg gaa tat tac gtc ggt gtc gcg ggg ctg gac gct 90
Asn Asp Met Glu Tyr Tyr Val Gly Val Ala Gly Leu Asp Ala
20 25 30
<210> 83
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 83
Ala Thr Leu Thr Pro Ala Asp Glu Arg Tyr His Val Ala Phe Pro Tyr
1 5 10 15
Asn Asp Met Glu Tyr Tyr Val Gly Val Ala Gly Leu Asp Ala
20 25 30
<210> 84
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP52)
<400> 84
gcc gat tca gcc acc gct gac aac gcg ccc agc gtt gcc ggt cac gcg 48
Ala Asp Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ala Pro Ser Val Ala Gly His Ala
1 5 10 15
tat aac gaa ctg ccg tat aac aat cct gat gtc acc gtc acc 90
Tyr Asn Glu Leu Pro Tyr Asn Asn Pro Asp Val Thr Val Thr
20 25 30
<210> 85
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 85
Ala Asp Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ala Pro Ser Val Ala Gly His Ala
1 5 10 15
Tyr Asn Glu Leu Pro Tyr Asn Asn Pro Asp Val Thr Val Thr
20 25 30
<210> 86
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP55)
<400> 86
gac agc agc acc agc tcg tcc agt tca tca agc tcg tcc agc gtt gac 48
Asp Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Asp
1 5 10 15
tac gcc acc tgg gcc gaa gtc tcc aag gcg atg gac aag cag 90
Tyr Ala Thr Trp Ala Glu Val Ser Lys Ala Met Asp Lys Gln
20 25 30
<210> 87
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 87
Asp Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Asp
1 5 10 15
Tyr Ala Thr Trp Ala Glu Val Ser Lys Ala Met Asp Lys Gln
20 25 30
<210> 88
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP58)
<400> 88
gga tca ttc gcg ttc acc gcg cgt aaa tcc gtg gcc ctg aac atc aac 48
Gly Ser Phe Ala Phe Thr Ala Arg Lys Ser Val Ala Leu Asn Ile Asn
1 5 10 15
ggg caa acc acc caa gtc acc aca tat gcg atg acg gcc acc 90
Gly Gln Thr Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Met Thr Ala Thr
20 25 30
<210> 89
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 89
Gly Ser Phe Ala Phe Thr Ala Arg Lys Ser Val Ala Leu Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Thr Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Met Thr Ala Thr
20 25 30
<210> 90
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP64)
<400> 90
gaa gat gct acc ggc acg ctg acc gtc acc agc tcg gat gcc gcg ttc 48
Glu Asp Ala Thr Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Ser Asp Ala Ala Phe
1 5 10 15
aac ggc aag aag gtg aac gcc tac cag atg ttc tcc gct tcc 90
Asn Gly Lys Lys Val Asn Ala Tyr Gln Met Phe Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 91
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 91
Glu Asp Ala Thr Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Ser Asp Ala Ala Phe
1 5 10 15
Asn Gly Lys Lys Val Asn Ala Tyr Gln Met Phe Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 92
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP66)
<400> 92
atg gaa tcg gaa gat tcc caa cca cag aca acc gat acc gcg aca gtg 48
Met Glu Ser Glu Asp Ser Gln Pro Gln Thr Thr Asp Thr Ala Thr Val
1 5 10 15
cag act act aag gct gct gaa ccg acg ctg ctc gcc agc tgg 90
Gln Thr Thr Lys Ala Ala Glu Pro Thr Leu Leu Ala Ser Trp
20 25 30
<210> 93
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 93
Met Glu Ser Glu Asp Ser Gln Pro Gln Thr Thr Asp Thr Ala Thr Val
1 5 10 15
Gln Thr Thr Lys Ala Ala Glu Pro Thr Leu Leu Ala Ser Trp
20 25 30
<210> 94
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP67)
<400> 94
gca ggt gtg gat tac ctg cct acc atc ggc caa gtg ccg aca tac acc 48
Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly Gln Val Pro Thr Tyr Thr
1 5 10 15
aag ttc cag ccc aca gcc gat ccg ggc aag aac gct agc gat 90
Lys Phe Gln Pro Thr Ala Asp Pro Gly Lys Asn Ala Ser Asp
20 25 30
<210> 95
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 95
Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly Gln Val Pro Thr Tyr Thr
1 5 10 15
Lys Phe Gln Pro Thr Ala Asp Pro Gly Lys Asn Ala Ser Asp
20 25 30
<210> 96
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP68)
<400> 96
gat gaa ccc gtc gaa ttg gtc gtc aac ggc gga ttc gaa gac gat ctt 48
Asp Glu Pro Val Glu Leu Val Val Asn Gly Gly Phe Glu Asp Asp Leu
1 5 10 15
aat ggt tgg aag tct gga acg gtg tgg aat agc tcc gca tcg 90
Asn Gly Trp Lys Ser Gly Thr Val Trp Asn Ser Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 97
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 97
Asp Glu Pro Val Glu Leu Val Val Asn Gly Gly Phe Glu Asp Asp Leu
1 5 10 15
Asn Gly Trp Lys Ser Gly Thr Val Trp Asn Ser Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 98
<211> 90
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<223>
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头肽(SP69)
<400> 98
gat gat tca acg cca tct tca acg cca tcg gat ggc agt tac acc acg 48
Asp Asp Ser Thr Pro Ser Ser Thr Pro Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Thr
1 5 10 15
act gat agc ggt gat ggc acg tat tcc att ccc atg ttg aac 90
Thr Asp Ser Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Ile Pro Met Leu Asn
20 25 30
<210> 99
<211> 30
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）
<400> 99
Asp Asp Ser Thr Pro Ser Ser Thr Pro Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Thr
1 5 10 15
Thr Asp Ser Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Ile Pro Met Leu Asn
20 25 30
<210> 100
<211> 5697
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pHG-2
<400> 100
tagccggcat tttcgcgata cattccccgg aatgttgcgc aacggggaac gcgcaccaca 60
ccgcaaccac agtgcgccac gcccagtccg gccctgtgcg ctataatagg tcagttattc 120
gcgcgcgcgt ggcgccctct acaccccgag ccgcgaggac acgtggattc cggacggcca 180
tgccccacat ggcaaaccga gaacccgcac acctagcatt acaaggagag ccattatggc 240
gttgatgatg agcgttaaga ctattatttc cacatcagtg gcgattatcg ccacgggtgc 300
catgtttgcg tgcgtagccc cgtttgcctc tgccgattcc gcgcagacga gtgctgtggt 360
gtcctcacgt tctttcccga aggcgagttc ggtggaagtg cagctggtcg aatcgggcgg 420
cggcctggtg cagccgggcg gctccctgcg tctgtcgtgc gccgcctcgg gcttcaacat 480
caaggatacc tacatccact gggtgcgcca ggccccgggc aagggcctgg aatgggtggc 540
ccgtatctac ccgaccaacg gctacacccg ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac 600
catctccgcc gataccagca agaacaccgc ctacctgcag atgaactccc tgcgcgccga 660
agataccgcc gtgtactact gctcgcgctg gggcggcgac ggcttctacg ccatggacta 720
ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc cagcggcggc ggcggctccg gcggcggcgg 780
ctcgggcggc ggcggctccg acatccagat gacccagtcc ccgtcgtccc tgagcgcctc 840
ggtgggcgat cgcgtgacca tcacctgccg cgcctcccag gatgtgaaca ccgccgtggc 900
ctggtaccag cagaagccgg gcaaggcccc gaagctgctg atctactcgg cctccttcct 960
gtactccggc gtgccgtccc gtttctccgg ctcccgctcg ggcaccgact tcaccctgac 1020
catctcgtcc ctgcagccgg aagacttcgc cacctactac tgccagcagc attacaccac 1080
cccgccgacc ttcggccagg gcaccaaggt ggaaatcaag catcatcatc atcatcactg 1140
aaaccgcttc tcatttccat ttgcgatatg gtctgaatac gacgaaaccc cggcgcgagg 1200
ccggggtttc gtaagctgtg cgtgactata gcacgaccag cgcgattcgg tgcacggatc 1260
cgtcttcctg ctggcctatg cattgggttc cgcagtgccc actccaggcg gtctgggcgg 1320
tgtggaagcg gcgctgacat tcgcgttcgt ggcggtcgga gtgccgcagg gcgtggcgct 1380
ttccgccact ttgctgcacc gcgtggtgtt ctactggctg cgcattccgc tgggcgcggc 1440
ggccatgaag tggcttgaca agcataatct tgtctgattc gtctattttc ataccccctt 1500
cggggaaata gatgtgaaaa cccttataaa acgcgggttt tcgcagaaac atgcgctagt 1560
atcattgatg acaacatgga ctaagcaaaa gtgcttgtcc cctgacccaa gaaggatgct 1620
ttatgaatta tttacgacaa aaaatttcgg ctagtgctat cgcggtgttg tcgacttgtg 1680
ggttgatttt ggcgccaatg ccggtctttg cggatgattc aacgccatct tcaacgccat 1740
cggatggcag ttacaccacg actgatagcg gtcaggaccc gtacgtcaag gaagccgaaa 1800
acctgaagaa gtacttcaac gccggccata gcgatgtcgc cgataacggc accctgttcc 1860
tgggcatcct gaagaactgg aaggaagagt ccgaccgcaa gatcatgcag tcccagatcg 1920
tgagcttcta cttcaagctg ttcaagaact tcaaggacga tcagtcgatc cagaagtccg 1980
tggagaccat caaggaagac atgaacgtca agttcttcaa cagcaacaag aagaagcgcg 2040
acgatttcga gaagctgacc aactactccg tgaccgatct gaacgtccag cgtaaggcca 2100
tccacgagct gatccaggtc atggccgaac tgtccccggc cgccaagacc ggcaagcgta 2160
agcgttccca gatgctgttc cgtggccgtc gcgcctccca gcaccatcat caccaccact 2220
gaccttctgc tcgtagcgat tacttcgagc attactgacg acaaagaccc cgaccgagat 2280
ggtcggggtc tttttgttgt ggtgctgtga cgtgttgtcc aaccgtatta ttccggacta 2340
gtcctccagg acctcgtcta cgaggcgctg agcgaggaat ggcgcaaaag ggacggcgag 2400
atcagcgacc catgggccaa cgacgaggcg gacggatacc agccgccctc atacgagccg 2460
gtcaaccccg aacgcaggac tccccagacg ccctccgatg gcctgatctg acgtccgaaa 2520
aaaggcgctg tgcgcccttt ttaaatcttt tataaatctt tttacattct tttagcccct 2580
ccgcagcctt actctcccaa cgggtttcag ccgaaaccta caccaaaagg ggagcgaacc 2640
tacaccaaaa ggggagcgaa cctacaccaa aaggggagcg aacctacacc aaaaggggag 2700
ctatatacac cttttgttat ttaaggtgca agttgtgcta tgctgaggcc atgtccaatg 2760
agatcgtgaa gttcagcaac cagttcaaca acgtcgcgct gaagaagttc gacgccgtgc 2820
acctggacgt gctcatggcg atcgcctcaa gggtgaggga gaagggcacg gccacggtgg 2880
agttctcgtt cgaggagctg cgcggcctca tgcgattgag gaagaacctg accaacaagc 2940
agctggccga caagatcgtg cagacgaacg cgcgcctgct ggcgctgaac tacatgttcg 3000
aggattcggg caagatcatc cagttcgcgc tgttcacgaa gttcgtcacc gacccgcagg 3060
aggcgactct cgcggttggg gtcaacgagg agttcgcgtt cctgctcaac gacctgacca 3120
gccagttcac gcgcttcgag ctggccgagt tcgccgacct caagagcaag tacgccaagg 3180
agttctaccg cagggccaag cagtaccgca gctccggaat ctggaagatc ggccgcgacg 3240
agttctgccg actgcttggc gttccaccgt cggcaataac ccagacacga tatctgaatc 3300
agaaggttct tcagccaatt caggaggagt gtgggcctct ccttggcctg aagatcgagc 3360
gccagtacgt gaaacgcagg ctgtcgggct tcgtgttcac attcgcccgc gagacccctc 3420
cggtgatcga cgccaggccc gtggaggcga ggaagacgga cggcgacggc aagggccatt 3480
ggacgagcgt tgccgggtac ggcgaggtgt tcacgaccac ggcgttgttc gacgtgacgg 3540
ccgcccgggc tcacttcgac ggcaccgttg aagccgggga gtgccgtttc tgcgcgtttg 3600
acgcgcgcaa ccgcgaacat catgcgcgga acgccggaag gctgttctag cggccgtgtc 3660
cgcgcctctg gggcggttgc gcctgccatg ggtcgatctg ccgctgttcg gcctcacgct 3720
ggtctgtgcg ctgcctgatc tccctgagca ggtcggcctt ggtcctgggg gcgcttcgct 3780
cctcgaacgg gccgctctcc cccaggtcct cgggctcgct caggtccaac ggctcgtcac 3840
cggacggctc gggccggttc tctccctgtg ccgggttctc cgcctgtgcg cgttgttcgg 3900
ccatgcgcag tgcgagggcc ttcacctgtt cggggcttgt cgactcgatt ttcgttcgtg 3960
aatacatgtt ataataacta taactaataa cgtaacgtga ctggcaagag atatttttaa 4020
aacaatgaat aggtttacac ttactttagt tttatggaaa tgaaagatca tatcatatat 4080
aatctagaat aaaattaact aaaataatta ttatctagat aaaaaattta gaagccaatg 4140
aaatctataa ataaactaaa ttaagtttat ttaattaaca actatggata taaaataggt 4200
actaatcaaa atagtgagga ggatatattt gaatacatac gaacaaatta ataaagtgaa 4260
aaaaatactt cggaaacatt taaaaaataa ccttattggt acttacatgt ttggatcagg 4320
agttgagagt ggactaaaac caaatagtga tcttgacttt ttagtcgtcg tatctgaacc 4380
attgacagat caaagtaaag aaatacttat acaaaaaatt agacctattt caaaaaaaat 4440
aggagataaa agcaacttac gatatattga attaacaatt attattcagc aagaaatggt 4500
accgtggaat catcctccca aacaagaatt tatttatgga gaatggttac aagagcttta 4560
tgaacaagga tacattcctc agaaggaatt aaattcagat ttaaccataa tgctttacca 4620
agcaaaacga aaaaataaaa gaatatacgg aaattatgac ttagaggaat tactacctga 4680
tattccattt tctgatgtga gaagagccat tatggattcg tcagaggaat taatagataa 4740
ttatcaggat gatgaaacca actctatatt aactttatgc cgtatgattt taactatgga 4800
cacgggtaaa atcataccaa aagatattgc gggaaatgca gtggctgaat cttctccatt 4860
agaacatagg gagagaattt tgttagcagt tcgtagttat cttggagaga atattgaatg 4920
gactaatgaa aatgtaaatt taactataaa ctatttaaat aacagattaa aaaaattata 4980
aaaaaattga aaaaatggtg gaaacacttt tttcaatttt tttagatctt gagcaaaagg 5040
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 5100
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5160
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 5220
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 5280
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 5340
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 5400
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 5460
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 5520
tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 5580
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 5640
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctac 5697
<210> 101
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2 terminator
<400> 101
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120
gcgtttata 129
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC1_primer
<400> 102
actagtcctc caggacctcg tc 22
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC2_primer
<400> 103
ccggaataat acggttggac 20
<210> 104
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC3_primer
<400> 104
accgtattat tccggccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtc 46
<210> 105
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC4_primer
<400> 105
tcctggagga ctagttataa acgcagaaag gcccac 36
<210> 106
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vec_F5_primer
<400> 106
acaaggagag ccattatggc gttgatgatg agcg 34
<210> 107
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vec_R2_primer
<400> 107
ggctaggatc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tcc 43
<210> 108
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P30_F1_primer
<400> 108
ctacggatcc tagccggcat tttcgcgata cattcc 36
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P30_R1_primer
<400> 109
aatggctctc cttgtaatgc tagg 24
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA3_primer
<400> 110
caggtccagc tggtcgaatc g 21
<210> 111
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP50-ins_F2_primer
<400> 111
acaaggagag ccattatgat cgtggcctac ccg 33
<210> 112
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP50-ins_R6_primer
<400> 112
gaccagctgg acctgttcca tatcgttgta tggaaacgc 39
<210> 113
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP67-ins_F2_primer
<400> 113
acaaggagag ccattatgaa gataaacaat aagggcaagg 40
<210> 114
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP67-ins_R6_primer
<400> 114
gaccagctgg acctggggct ggaacttggt gtatgtc 37
<210> 115
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP68-ins_F2_primer
<400> 115
acaaggagag ccattatggt ttataacatt cacatattgc aaac 44
<210> 116
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP68-ins_R6_primer
<400> 116
gaccagctgg acctgcttcc aaccattaag atcgtcttcg 40
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA6_primer
<400> 117
caccgcctac atacctcgct 20
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA5_primer_rev
<400> 118
ggtatgtagg cggtgctaca g 21
<210> 119
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA16_primer
<400> 119
tcgtcgtcgt ccttgtagtc cttgatctcg accttggtg 39
<210> 120
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA15_primer
<400> 120
caaggacgac gacgacaagt gaccttctgc tcgtagcg 38
<210> 121
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC5_primer
<400> 121
aagtgaccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtc 37
<210> 122
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC6_primer
<400> 122
accgtattat tccggtagcc ggcattttcg cgatacattc c 41
<210> 123
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC7_primer
<400> 123
gatgcctggt cacttgtcgt cgtcgtc 27
<210> 124
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC8_primer
<400> 124
aagtgaccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtc 37
<210> 125
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PC9_primer
<400> 125
gatgcctggt cacttgatct cgaccttggt g 31
<210> 126
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCDshuttle_F1_primer
<400> 126
tgaccttctg ctcgtagcg 19
<210> 127
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD1scFv03-1_primer
<400> 127
acgagcagaa ggtcacttga tctcgacctt ggtgc 35
<210> 128
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP50L5-ins_R1_hPD1_03
<400> 128
gaccagctgg acctggggcg tcaacgtcgc g 31
<210> 129
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP68L1-ins_R1_hPD1_03
<400> 129
gaccagctgg acctgatcgg ccgacgccgc 30
<210> 130
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP67L1-ins_R1_hPD1_03
<400> 130
gaccagctgg acctgtgccg cactggcact tg 32
<210> 131
<211> 2618
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC2的scFv表达盒序列
<400> 131
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgatcgtg gcctacccgc acacagtgca gtatgcgggg aaacgtacca ggaaaggacg 420
aatgatgata acgacatggc ggcaacgggg catggccatc gtagcgatgc tgaccggtct 480
gataataatg gtgggagtgg tgttcggctc ggcgaatacg gcgtatgccg cgacgttgac 540
gccccaggtc cagctggtcg aatcgggcgg cggcgtcgtc cagccgggcc gttccctgcg 600
tctggattgc aaggcctcgg gcatcacctt ctcgaactcc ggcatgcact gggtgcgcca 660
ggccccgggc aagggcctgg aatgggtcgc cgtgatctgg tacgatggct cgaagcgcta 720
ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac catctcgcgc gacaactcca agaacaccct 780
gttcctgcag atgaactccc tgcgcgccga agacaccgcc gtgtactact gcgccaccaa 840
cgatgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agcggcggcg gcggctccgg 900
cggcggcggc tcgggcggcg gcggcagcga aatcgtgctg acccagtccc cggccaccct 960
gtccctgtcc ccgggcgaac gtgccaccct gtcgtgccgc gcctcccagt cggtgtccag 1020
ctacctggcc tggtaccagc agaagccggg ccaggccccg cgtctgctga tctacgacgc 1080
ctccaaccgc gccaccggca tcccggcccg cttctccggc tcgggctccg gcaccgactt 1140
caccctgacc atctcgtccc tggaaccgga ggacttcgcc gtctactact gccagcagtc 1200
ctcgaactgg ccgcgcacct tcggccaggg caccaaggtc gagatcaagc accatcatca 1260
ccaccactga ccttctgctc gtagcgatta cttcgagcat tactgacgac aaagaccccg 1320
accgagatgg tcggggtctt tttgttgtgg tgctgtgacg tgttgtccaa ccgtattatt 1380
ccggtagccg gcattttcgc gatacattcc ccggaatgtt gcgcaacggg gaacgcgcac 1440
cacaccgcaa ccacagtgcg ccacgcccag tccggccctg tgcgctataa taggtcagtt 1500
attcgcgcgc gcgtggcgcc ctctacaccc cgagccgcga ggacacgtgg attccggacg 1560
gccatgcccc acatggcaaa ccgagaaccc gcacacctag cattacaagg agagccatta 1620
tgaagataaa caataagggc aagggcgctc ttatcgcggc aattaccgcc gcggcaacgc 1680
tattgtcatg cgggctggcc gctgcaagtg ccagtgcggc acaggtccag ctggtcgaat 1740
cgggcggcgg cgtcgtccag ccgggccgtt ccctgcgtct gtcgtgcgcc gcctcgggct 1800
tcaccttctc cagctacggc atgcactggg tgcgtcaggc cccgggcaag ggcctggagt 1860
gggtggccgt catctggtac gacggctcca acaagtacta cgccgattcc gtcaagggcc 1920
gcttcaccat ctcgcgtgac aactccaaga acaccctgta cctgcagatg aactccctgc 1980
gtgccgaaga caccgccgtg tactactgcg cccgcgatcc gcgtggcgcc accctgtact 2040
actactacta cggcatggat gtctggggcc agggcaccac cgtgaccgtc tcgtccggcg 2100
gcggcggctc cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggctc cgacatccag atgacccagt 2160
ccccgagctc gctgagcgcc tcggtgggcg atcgcgtcac catcacctgc cgtgcctccc 2220
agagcatcaa ctcctacctg gactggtacc agcagaagcc gggcaaggcc ccgaagctgc 2280
tgatctacgc cgcctccagc ctgcagagcg gcgtgccgtc gcgcttctcg ggctccggca 2340
gcggcaccga cttcaccctg accatctcgt ccctgcagcc ggaggatttc gccacctact 2400
actgccagca gtactactcc accccgttca ccttcggccc gggcaccaag gtcgagatca 2460
aggactacaa ggacgacgac gacaagtgac caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 2520
gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctct actagagtca 2580
cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg cgtttata 2618
<210> 132
<211> 2648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC3的scFv表达盒序列
<400> 132
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgatcgtg gcctacccgc acacagtgca gtatgcgggg aaacgtacca ggaaaggacg 420
aatgatgata acgacatggc ggcaacgggg catggccatc gtagcgatgc tgaccggtct 480
gataataatg gtgggagtgg tgttcggctc ggcgaatacg gcgtatgccg cgacgttgac 540
gccccaggtc cagctggtcg aatcgggcgg cggcgtcgtc cagccgggcc gttccctgcg 600
tctggattgc aaggcctcgg gcatcacctt ctcgaactcc ggcatgcact gggtgcgcca 660
ggccccgggc aagggcctgg aatgggtcgc cgtgatctgg tacgatggct cgaagcgcta 720
ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac catctcgcgc gacaactcca agaacaccct 780
gttcctgcag atgaactccc tgcgcgccga agacaccgcc gtgtactact gcgccaccaa 840
cgatgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agcggcggcg gcggctccgg 900
cggcggcggc tcgggcggcg gcggcagcga aatcgtgctg acccagtccc cggccaccct 960
gtccctgtcc ccgggcgaac gtgccaccct gtcgtgccgc gcctcccagt cggtgtccag 1020
ctacctggcc tggtaccagc agaagccggg ccaggccccg cgtctgctga tctacgacgc 1080
ctccaaccgc gccaccggca tcccggcccg cttctccggc tcgggctccg gcaccgactt 1140
caccctgacc atctcgtccc tggaaccgga ggacttcgcc gtctactact gccagcagtc 1200
ctcgaactgg ccgcgcacct tcggccaggg caccaaggtc gagatcaagc accatcatca 1260
ccaccactga ccttctgctc gtagcgatta cttcgagcat tactgacgac aaagaccccg 1320
accgagatgg tcggggtctt tttgttgtgg tgctgtgacg tgttgtccaa ccgtattatt 1380
ccggtagccg gcattttcgc gatacattcc ccggaatgtt gcgcaacggg gaacgcgcac 1440
cacaccgcaa ccacagtgcg ccacgcccag tccggccctg tgcgctataa taggtcagtt 1500
attcgcgcgc gcgtggcgcc ctctacaccc cgagccgcga ggacacgtgg attccggacg 1560
gccatgcccc acatggcaaa ccgagaaccc gcacacctag cattacaagg agagccatta 1620
tggtttataa cattcacata ttgcaaacaa ggaaaaccgg tcgtgtggtt gctgctgcgg 1680
ctgcatccgt gctgtgttgc atgggggctg tatttccagc gactatcgga gtgactgcgg 1740
cgtcggccga tcaggtccag ctggtcgaat cgggcggcgg cgtcgtccag ccgggccgtt 1800
ccctgcgtct gtcgtgcgcc gcctcgggct tcaccttctc cagctacggc atgcactggg 1860
tgcgtcaggc cccgggcaag ggcctggagt gggtggccgt catctggtac gacggctcca 1920
acaagtacta cgccgattcc gtcaagggcc gcttcaccat ctcgcgtgac aactccaaga 1980
acaccctgta cctgcagatg aactccctgc gtgccgaaga caccgccgtg tactactgcg 2040
cccgcgatcc gcgtggcgcc accctgtact actactacta cggcatggat gtctggggcc 2100
agggcaccac cgtgaccgtc tcgtccggcg gcggcggctc cggcggcggc ggcagcggcg 2160
gcggcggctc cgacatccag atgacccagt ccccgagctc gctgagcgcc tcggtgggcg 2220
atcgcgtcac catcacctgc cgtgcctccc agagcatcaa ctcctacctg gactggtacc 2280
agcagaagcc gggcaaggcc ccgaagctgc tgatctacgc cgcctccagc ctgcagagcg 2340
gcgtgccgtc gcgcttctcg ggctccggca gcggcaccga cttcaccctg accatctcgt 2400
ccctgcagcc ggaggatttc gccacctact actgccagca gtactactcc accccgttca 2460
ccttcggccc gggcaccaag gtcgagatca aggactacaa ggacgacgac gacaagtgac 2520
caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 2580
tttgtcggtg aacgctctct actagagtca cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg 2640
cgtttata 2648
<210> 133
<211> 2645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC4的scFv表达盒序列
<400> 133
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgaagata aacaataagg gcaagggcgc tcttatcgcg gcaattaccg ccgcggcaac 420
gctattgtca tgcgggctgg ccgctgcaag tgccagtgcg gcaggtgtgg attacctgcc 480
taccatcggc caggtccagc tggtcgaatc gggcggcggc gtcgtccagc cgggccgttc 540
cctgcgtctg gattgcaagg cctcgggcat caccttctcg aactccggca tgcactgggt 600
gcgccaggcc ccgggcaagg gcctggaatg ggtcgccgtg atctggtacg atggctcgaa 660
gcgctactac gccgattccg tgaagggccg cttcaccatc tcgcgcgaca actccaagaa 720
caccctgttc ctgcagatga actccctgcg cgccgaagac accgccgtgt actactgcgc 780
caccaacgat gactactggg gccagggcac cctggtcacc gtgtccagcg gcggcggcgg 840
ctccggcggc ggcggctcgg gcggcggcgg cagcgaaatc gtgctgaccc agtccccggc 900
caccctgtcc ctgtccccgg gcgaacgtgc caccctgtcg tgccgcgcct cccagtcggt 960
gtccagctac ctggcctggt accagcagaa gccgggccag gccccgcgtc tgctgatcta 1020
cgacgcctcc aaccgcgcca ccggcatccc ggcccgcttc tccggctcgg gctccggcac 1080
cgacttcacc ctgaccatct cgtccctgga accggaggac ttcgccgtct actactgcca 1140
gcagtcctcg aactggccgc gcaccttcgg ccagggcacc aaggtcgaga tcaagcacca 1200
tcatcaccac cactgacctt ctgctcgtag cgattacttc gagcattact gacgacaaag 1260
accccgaccg agatggtcgg ggtctttttg ttgtggtgct gtgacgtgtt gtccaaccgt 1320
attattccgg tagccggcat tttcgcgata cattccccgg aatgttgcgc aacggggaac 1380
gcgcaccaca ccgcaaccac agtgcgccac gcccagtccg gccctgtgcg ctataatagg 1440
tcagttattc gcgcgcgcgt ggcgccctct acaccccgag ccgcgaggac acgtggattc 1500
cggacggcca tgccccacat ggcaaaccga gaacccgcac acctagcatt acaaggagag 1560
ccattatgat cgtggcctac ccgcacacag tgcagtatgc ggggaaacgt accaggaaag 1620
gacgaatgat gataacgaca tggcggcaac ggggcatggc catcgtagcg atgctgaccg 1680
gtctgataat aatggtggga gtggtgttcg gctcggcgaa tacggcgtat gccgcgacgt 1740
tgacgcccca ggtccagctg gtcgaatcgg gcggcggcgt cgtccagccg ggccgttccc 1800
tgcgtctgtc gtgcgccgcc tcgggcttca ccttctccag ctacggcatg cactgggtgc 1860
gtcaggcccc gggcaagggc ctggagtggg tggccgtcat ctggtacgac ggctccaaca 1920
agtactacgc cgattccgtc aagggccgct tcaccatctc gcgtgacaac tccaagaaca 1980
ccctgtacct gcagatgaac tccctgcgtg ccgaagacac cgccgtgtac tactgcgccc 2040
gcgatccgcg tggcgccacc ctgtactact actactacgg catggatgtc tggggccagg 2100
gcaccaccgt gaccgtctcg tccggcggcg gcggctccgg cggcggcggc agcggcggcg 2160
gcggctccga catccagatg acccagtccc cgagctcgct gagcgcctcg gtgggcgatc 2220
gcgtcaccat cacctgccgt gcctcccaga gcatcaactc ctacctggac tggtaccagc 2280
agaagccggg caaggccccg aagctgctga tctacgccgc ctccagcctg cagagcggcg 2340
tgccgtcgcg cttctcgggc tccggcagcg gcaccgactt caccctgacc atctcgtccc 2400
tgcagccgga ggatttcgcc acctactact gccagcagta ctactccacc ccgttcacct 2460
tcggcccggg caccaaggtc gagatcaagg actacaagga cgacgacgac aagtgaccag 2520
gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt 2580
gtcggtgaac gctctctact agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt 2640
ttata 2645
<210> 134
<211> 2594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC5的scFv表达盒序列
<400> 134
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgaagata aacaataagg gcaagggcgc tcttatcgcg gcaattaccg ccgcggcaac 420
gctattgtca tgcgggctgg ccgctgcaag tgccagtgcg gcaggtgtgg attacctgcc 480
taccatcggc caggtccagc tggtcgaatc gggcggcggc gtcgtccagc cgggccgttc 540
cctgcgtctg gattgcaagg cctcgggcat caccttctcg aactccggca tgcactgggt 600
gcgccaggcc ccgggcaagg gcctggaatg ggtcgccgtg atctggtacg atggctcgaa 660
gcgctactac gccgattccg tgaagggccg cttcaccatc tcgcgcgaca actccaagaa 720
caccctgttc ctgcagatga actccctgcg cgccgaagac accgccgtgt actactgcgc 780
caccaacgat gactactggg gccagggcac cctggtcacc gtgtccagcg gcggcggcgg 840
ctccggcggc ggcggctcgg gcggcggcgg cagcgaaatc gtgctgaccc agtccccggc 900
caccctgtcc ctgtccccgg gcgaacgtgc caccctgtcg tgccgcgcct cccagtcggt 960
gtccagctac ctggcctggt accagcagaa gccgggccag gccccgcgtc tgctgatcta 1020
cgacgcctcc aaccgcgcca ccggcatccc ggcccgcttc tccggctcgg gctccggcac 1080
cgacttcacc ctgaccatct cgtccctgga accggaggac ttcgccgtct actactgcca 1140
gcagtcctcg aactggccgc gcaccttcgg ccagggcacc aaggtcgaga tcaagcacca 1200
tcatcaccac cactgacctt ctgctcgtag cgattacttc gagcattact gacgacaaag 1260
accccgaccg agatggtcgg ggtctttttg ttgtggtgct gtgacgtgtt gtccaaccgt 1320
attattccgg tagccggcat tttcgcgata cattccccgg aatgttgcgc aacggggaac 1380
gcgcaccaca ccgcaaccac agtgcgccac gcccagtccg gccctgtgcg ctataatagg 1440
tcagttattc gcgcgcgcgt ggcgccctct acaccccgag ccgcgaggac acgtggattc 1500
cggacggcca tgccccacat ggcaaaccga gaacccgcac acctagcatt acaaggagag 1560
ccattatggt ttataacatt cacatattgc aaacaaggaa aaccggtcgt gtggttgctg 1620
ctgcggctgc atccgtgctg tgttgcatgg gggctgtatt tccagcgact atcggagtga 1680
ctgcggcgtc ggccgatcag gtccagctgg tcgaatcggg cggcggcgtc gtccagccgg 1740
gccgttccct gcgtctgtcg tgcgccgcct cgggcttcac cttctccagc tacggcatgc 1800
actgggtgcg tcaggccccg ggcaagggcc tggagtgggt ggccgtcatc tggtacgacg 1860
gctccaacaa gtactacgcc gattccgtca agggccgctt caccatctcg cgtgacaact 1920
ccaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgcgtgc cgaagacacc gccgtgtact 1980
actgcgcccg cgatccgcgt ggcgccaccc tgtactacta ctactacggc atggatgtct 2040
ggggccaggg caccaccgtg accgtctcgt ccggcggcgg cggctccggc ggcggcggca 2100
gcggcggcgg cggctccgac atccagatga cccagtcccc gagctcgctg agcgcctcgg 2160
tgggcgatcg cgtcaccatc acctgccgtg cctcccagag catcaactcc tacctggact 2220
ggtaccagca gaagccgggc aaggccccga agctgctgat ctacgccgcc tccagcctgc 2280
agagcggcgt gccgtcgcgc ttctcgggct ccggcagcgg caccgacttc accctgacca 2340
tctcgtccct gcagccggag gatttcgcca cctactactg ccagcagtac tactccaccc 2400
cgttcacctt cggcccgggc accaaggtcg agatcaagga ctacaaggac gacgacgaca 2460
agtgaccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 2520
ctgttgtttg tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact ggctcacctt cgggtgggcc 2580
tttctgcgtt tata 2594
<210> 135
<211> 2609
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC6的scFv表达盒序列
<400> 135
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgaattat ttacgacaaa aaatttcggc tagtgctatc gcggtgttgt cgacttgtgg 420
gttgattttg gcgccaatgc cggtctttgc ggatcaggtc cagctggtcg aatcgggcgg 480
cggcgtcgtc cagccgggcc gttccctgcg tctggattgc aaggcctcgg gcatcacctt 540
ctcgaactcc ggcatgcact gggtgcgcca ggccccgggc aagggcctgg aatgggtcgc 600
cgtgatctgg tacgatggct cgaagcgcta ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac 660
catctcgcgc gacaactcca agaacaccct gttcctgcag atgaactccc tgcgcgccga 720
agacaccgcc gtgtactact gcgccaccaa cgatgactac tggggccagg gcaccctggt 780
caccgtgtcc agcggcggcg gcggctccgg cggcggcggc tcgggcggcg gcggcagcga 840
aatcgtgctg acccagtccc cggccaccct gtccctgtcc ccgggcgaac gtgccaccct 900
gtcgtgccgc gcctcccagt cggtgtccag ctacctggcc tggtaccagc agaagccggg 960
ccaggccccg cgtctgctga tctacgacgc ctccaaccgc gccaccggca tcccggcccg 1020
cttctccggc tcgggctccg gcaccgactt caccctgacc atctcgtccc tggaaccgga 1080
ggacttcgcc gtctactact gccagcagtc ctcgaactgg ccgcgcacct tcggccaggg 1140
caccaaggtc gagatcaagc accatcatca ccaccactga ccttctgctc gtagcgatta 1200
cttcgagcat tactgacgac aaagaccccg accgagatgg tcggggtctt tttgttgtgg 1260
tgctgtgacg tgttgtccaa ccgtattatt ccggtagccg gcattttcgc gatacattcc 1320
ccggaatgtt gcgcaacggg gaacgcgcac cacaccgcaa ccacagtgcg ccacgcccag 1380
tccggccctg tgcgctataa taggtcagtt attcgcgcgc gcgtggcgcc ctctacaccc 1440
cgagccgcga ggacacgtgg attccggacg gccatgcccc acatggcaaa ccgagaaccc 1500
gcacacctag cattacaagg agagccatta tgatcgtggc ctacccgcac acagtgcagt 1560
atgcggggaa acgtaccagg aaaggacgaa tgatgataac gacatggcgg caacggggca 1620
tggccatcgt agcgatgctg accggtctga taataatggt gggagtggtg ttcggctcgg 1680
cgaatacggc gtatgccgcg acgttgacgc cccaggtcca gctggtcgaa tcgggcggcg 1740
gcgtcgtcca gccgggccgt tccctgcgtc tgtcgtgcgc cgcctcgggc ttcaccttct 1800
ccagctacgg catgcactgg gtgcgtcagg ccccgggcaa gggcctggag tgggtggccg 1860
tcatctggta cgacggctcc aacaagtact acgccgattc cgtcaagggc cgcttcacca 1920
tctcgcgtga caactccaag aacaccctgt acctgcagat gaactccctg cgtgccgaag 1980
acaccgccgt gtactactgc gcccgcgatc cgcgtggcgc caccctgtac tactactact 2040
acggcatgga tgtctggggc cagggcacca ccgtgaccgt ctcgtccggc ggcggcggct 2100
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tcgagatcaa gtgaccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 2520
tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctctactag agtcacactg gctcaccttc 2580
gggtgggcct ttctgcgttt ata 2603
<210> 141
<211> 2552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC5TL的scFv表达盒序列
<400> 141
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgaagata aacaataagg gcaagggcgc tcttatcgcg gcaattaccg ccgcggcaac 420
gctattgtca tgcgggctgg ccgctgcaag tgccagtgcg gcaggtgtgg attacctgcc 480
taccatcggc caggtccagc tggtcgaatc gggcggcggc gtcgtccagc cgggccgttc 540
cctgcgtctg gattgcaagg cctcgggcat caccttctcg aactccggca tgcactgggt 600
gcgccaggcc ccgggcaagg gcctggaatg ggtcgccgtg atctggtacg atggctcgaa 660
gcgctactac gccgattccg tgaagggccg cttcaccatc tcgcgcgaca actccaagaa 720
caccctgttc ctgcagatga actccctgcg cgccgaagac accgccgtgt actactgcgc 780
caccaacgat gactactggg gccagggcac cctggtcacc gtgtccagcg gcggcggcgg 840
ctccggcggc ggcggctcgg gcggcggcgg cagcgaaatc gtgctgaccc agtccccggc 900
caccctgtcc ctgtccccgg gcgaacgtgc caccctgtcg tgccgcgcct cccagtcggt 960
gtccagctac ctggcctggt accagcagaa gccgggccag gccccgcgtc tgctgatcta 1020
cgacgcctcc aaccgcgcca ccggcatccc ggcccgcttc tccggctcgg gctccggcac 1080
cgacttcacc ctgaccatct cgtccctgga accggaggac ttcgccgtct actactgcca 1140
gcagtcctcg aactggccgc gcaccttcgg ccagggcacc aaggtcgaga tcaagtgacc 1200
ttctgctcgt agcgattact tcgagcatta ctgacgacaa agaccccgac cgagatggtc 1260
ggggtctttt tgttgtggtg ctgtgacgtg ttgtccaacc gtattattcc ggtagccggc 1320
attttcgcga tacattcccc ggaatgttgc gcaacgggga acgcgcacca caccgcaacc 1380
acagtgcgcc acgcccagtc cggccctgtg cgctataata ggtcagttat tcgcgcgcgc 1440
gtggcgccct ctacaccccg agccgcgagg acacgtggat tccggacggc catgccccac 1500
atggcaaacc gagaacccgc acacctagca ttacaaggag agccattatg gtttataaca 1560
ttcacatatt gcaaacaagg aaaaccggtc gtgtggttgc tgctgcggct gcatccgtgc 1620
tgtgttgcat gggggctgta tttccagcga ctatcggagt gactgcggcg tcggccgatc 1680
aggtccagct ggtcgaatcg ggcggcggcg tcgtccagcc gggccgttcc ctgcgtctgt 1740
cgtgcgccgc ctcgggcttc accttctcca gctacggcat gcactgggtg cgtcaggccc 1800
cgggcaaggg cctggagtgg gtggccgtca tctggtacga cggctccaac aagtactacg 1860
ccgattccgt caagggccgc ttcaccatct cgcgtgacaa ctccaagaac accctgtacc 1920
tgcagatgaa ctccctgcgt gccgaagaca ccgccgtgta ctactgcgcc cgcgatccgc 1980
gtggcgccac cctgtactac tactactacg gcatggatgt ctggggccag ggcaccaccg 2040
tgaccgtctc gtccggcggc ggcggctccg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggctccg 2100
acatccagat gacccagtcc ccgagctcgc tgagcgcctc ggtgggcgat cgcgtcacca 2160
tcacctgccg tgcctcccag agcatcaact cctacctgga ctggtaccag cagaagccgg 2220
gcaaggcccc gaagctgctg atctacgccg cctccagcct gcagagcggc gtgccgtcgc 2280
gcttctcggg ctccggcagc ggcaccgact tcaccctgac catctcgtcc ctgcagccgg 2340
aggatttcgc cacctactac tgccagcagt actactccac cccgttcacc ttcggcccgg 2400
gcaccaaggt cgagatcaag tgaccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga 2460
ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctctactaga gtcacactgg 2520
ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta ta 2552
<210> 142
<211> 2567
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC6TL的scFv表达盒序列
<400> 142
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgaattat ttacgacaaa aaatttcggc tagtgctatc gcggtgttgt cgacttgtgg 420
gttgattttg gcgccaatgc cggtctttgc ggatcaggtc cagctggtcg aatcgggcgg 480
cggcgtcgtc cagccgggcc gttccctgcg tctggattgc aaggcctcgg gcatcacctt 540
ctcgaactcc ggcatgcact gggtgcgcca ggccccgggc aagggcctgg aatgggtcgc 600
cgtgatctgg tacgatggct cgaagcgcta ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac 660
catctcgcgc gacaactcca agaacaccct gttcctgcag atgaactccc tgcgcgccga 720
agacaccgcc gtgtactact gcgccaccaa cgatgactac tggggccagg gcaccctggt 780
caccgtgtcc agcggcggcg gcggctccgg cggcggcggc tcgggcggcg gcggcagcga 840
aatcgtgctg acccagtccc cggccaccct gtccctgtcc ccgggcgaac gtgccaccct 900
gtcgtgccgc gcctcccagt cggtgtccag ctacctggcc tggtaccagc agaagccggg 960
ccaggccccg cgtctgctga tctacgacgc ctccaaccgc gccaccggca tcccggcccg 1020
cttctccggc tcgggctccg gcaccgactt caccctgacc atctcgtccc tggaaccgga 1080
ggacttcgcc gtctactact gccagcagtc ctcgaactgg ccgcgcacct tcggccaggg 1140
caccaaggtc gagatcaagt gaccttctgc tcgtagcgat tacttcgagc attactgacg 1200
acaaagaccc cgaccgagat ggtcggggtc tttttgttgt ggtgctgtga cgtgttgtcc 1260
aaccgtatta ttccggtagc cggcattttc gcgatacatt ccccggaatg ttgcgcaacg 1320
gggaacgcgc accacaccgc aaccacagtg cgccacgccc agtccggccc tgtgcgctat 1380
aataggtcag ttattcgcgc gcgcgtggcg ccctctacac cccgagccgc gaggacacgt 1440
ggattccgga cggccatgcc ccacatggca aaccgagaac ccgcacacct agcattacaa 1500
ggagagccat tatgatcgtg gcctacccgc acacagtgca gtatgcgggg aaacgtacca 1560
ggaaaggacg aatgatgata acgacatggc ggcaacgggg catggccatc gtagcgatgc 1620
tgaccggtct gataataatg gtgggagtgg tgttcggctc ggcgaatacg gcgtatgccg 1680
cgacgttgac gccccaggtc cagctggtcg aatcgggcgg cggcgtcgtc cagccgggcc 1740
gttccctgcg tctgtcgtgc gccgcctcgg gcttcacctt ctccagctac ggcatgcact 1800
gggtgcgtca ggccccgggc aagggcctgg agtgggtggc cgtcatctgg tacgacggct 1860
ccaacaagta ctacgccgat tccgtcaagg gccgcttcac catctcgcgt gacaactcca 1920
agaacaccct gtacctgcag atgaactccc tgcgtgccga agacaccgcc gtgtactact 1980
gcgcccgcga tccgcgtggc gccaccctgt actactacta ctacggcatg gatgtctggg 2040
gccagggcac caccgtgacc gtctcgtccg gcggcggcgg ctccggcggc ggcggcagcg 2100
gcggcggcgg ctccgacatc cagatgaccc agtccccgag ctcgctgagc gcctcggtgg 2160
gcgatcgcgt caccatcacc tgccgtgcct cccagagcat caactcctac ctggactggt 2220
accagcagaa gccgggcaag gccccgaagc tgctgatcta cgccgcctcc agcctgcaga 2280
gcggcgtgcc gtcgcgcttc tcgggctccg gcagcggcac cgacttcacc ctgaccatct 2340
cgtccctgca gccggaggat ttcgccacct actactgcca gcagtactac tccaccccgt 2400
tcaccttcgg cccgggcacc aaggtcgaga tcaagtgacc aggcatcaaa taaaacgaaa 2460
ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcta 2520
ctagagtcac actggctcac cttcgggtgg gcctttctgc gtttata 2567
<210> 143
<211> 2486
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC7TL的scFv表达盒序列
<400> 143
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgaattat ttacgacaaa aaatttcggc tagtgctatc gcggtgttgt cgacttgtgg 420
gttgattttg gcgccaatgc cggtctttgc ggatcaggtc cagctggtcg aatcgggcgg 480
cggcgtcgtc cagccgggcc gttccctgcg tctggattgc aaggcctcgg gcatcacctt 540
ctcgaactcc ggcatgcact gggtgcgcca ggccccgggc aagggcctgg aatgggtcgc 600
cgtgatctgg tacgatggct cgaagcgcta ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac 660
catctcgcgc gacaactcca agaacaccct gttcctgcag atgaactccc tgcgcgccga 720
agacaccgcc gtgtactact gcgccaccaa cgatgactac tggggccagg gcaccctggt 780
caccgtgtcc agcggcggcg gcggctccgg cggcggcggc tcgggcggcg gcggcagcga 840
aatcgtgctg acccagtccc cggccaccct gtccctgtcc ccgggcgaac gtgccaccct 900
gtcgtgccgc gcctcccagt cggtgtccag ctacctggcc tggtaccagc agaagccggg 960
ccaggccccg cgtctgctga tctacgacgc ctccaaccgc gccaccggca tcccggcccg 1020
cttctccggc tcgggctccg gcaccgactt caccctgacc atctcgtccc tggaaccgga 1080
ggacttcgcc gtctactact gccagcagtc ctcgaactgg ccgcgcacct tcggccaggg 1140
caccaaggtc gagatcaagt gaccttctgc tcgtagcgat tacttcgagc attactgacg 1200
acaaagaccc cgaccgagat ggtcggggtc tttttgttgt ggtgctgtga cgtgttgtcc 1260
aaccgtatta ttccggtagc cggcattttc gcgatacatt ccccggaatg ttgcgcaacg 1320
gggaacgcgc accacaccgc aaccacagtg cgccacgccc agtccggccc tgtgcgctat 1380
aataggtcag ttattcgcgc gcgcgtggcg ccctctacac cccgagccgc gaggacacgt 1440
ggattccgga cggccatgcc ccacatggca aaccgagaac ccgcacacct agcattacaa 1500
ggagagccat tatgaagata aacaataagg gcaagggcgc tcttatcgcg gcaattaccg 1560
ccgcggcaac gctattgtca tgcgggctgg ccgctgcaag tgccagtgcg gcacaggtcc 1620
agctggtcga atcgggcggc ggcgtcgtcc agccgggccg ttccctgcgt ctgtcgtgcg 1680
ccgcctcggg cttcaccttc tccagctacg gcatgcactg ggtgcgtcag gccccgggca 1740
agggcctgga gtgggtggcc gtcatctggt acgacggctc caacaagtac tacgccgatt 1800
ccgtcaaggg ccgcttcacc atctcgcgtg acaactccaa gaacaccctg tacctgcaga 1860
tgaactccct gcgtgccgaa gacaccgccg tgtactactg cgcccgcgat ccgcgtggcg 1920
ccaccctgta ctactactac tacggcatgg atgtctgggg ccagggcacc accgtgaccg 1980
tctcgtccgg cggcggcggc tccggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc tccgacatcc 2040
agatgaccca gtccccgagc tcgctgagcg cctcggtggg cgatcgcgtc accatcacct 2100
gccgtgcctc ccagagcatc aactcctacc tggactggta ccagcagaag ccgggcaagg 2160
ccccgaagct gctgatctac gccgcctcca gcctgcagag cggcgtgccg tcgcgcttct 2220
cgggctccgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatctc gtccctgcag ccggaggatt 2280
tcgccaccta ctactgccag cagtactact ccaccccgtt caccttcggc ccgggcacca 2340
aggtcgagat caagtgacca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 2400
ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac tagagtcaca ctggctcacc 2460
ttcgggtggg cctttctgcg tttata 2486
<210> 144
<211> 2516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pPC8TL的scFv表达盒序列
<400> 144
gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60
gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120
tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180
gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240
ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300
tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360
tatgaattat ttacgacaaa aaatttcggc tagtgctatc gcggtgttgt cgacttgtgg 420
gttgattttg gcgccaatgc cggtctttgc ggatcaggtc cagctggtcg aatcgggcgg 480
cggcgtcgtc cagccgggcc gttccctgcg tctggattgc aaggcctcgg gcatcacctt 540
ctcgaactcc ggcatgcact gggtgcgcca ggccccgggc aagggcctgg aatgggtcgc 600
cgtgatctgg tacgatggct cgaagcgcta ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac 660
catctcgcgc gacaactcca agaacaccct gttcctgcag atgaactccc tgcgcgccga 720
agacaccgcc gtgtactact gcgccaccaa cgatgactac tggggccagg gcaccctggt 780
caccgtgtcc agcggcggcg gcggctccgg cggcggcggc tcgggcggcg gcggcagcga 840
aatcgtgctg acccagtccc cggccaccct gtccctgtcc ccgggcgaac gtgccaccct 900
gtcgtgccgc gcctcccagt cggtgtccag ctacctggcc tggtaccagc agaagccggg 960
ccaggccccg cgtctgctga tctacgacgc ctccaaccgc gccaccggca tcccggcccg 1020
cttctccggc tcgggctccg gcaccgactt caccctgacc atctcgtccc tggaaccgga 1080
ggacttcgcc gtctactact gccagcagtc ctcgaactgg ccgcgcacct tcggccaggg 1140
caccaaggtc gagatcaagt gaccttctgc tcgtagcgat tacttcgagc attactgacg 1200
acaaagaccc cgaccgagat ggtcggggtc tttttgttgt ggtgctgtga cgtgttgtcc 1260
aaccgtatta ttccggtagc cggcattttc gcgatacatt ccccggaatg ttgcgcaacg 1320
gggaacgcgc accacaccgc aaccacagtg cgccacgccc agtccggccc tgtgcgctat 1380
aataggtcag ttattcgcgc gcgcgtggcg ccctctacac cccgagccgc gaggacacgt 1440
ggattccgga cggccatgcc ccacatggca aaccgagaac ccgcacacct agcattacaa 1500
ggagagccat tatggtttat aacattcaca tattgcaaac aaggaaaacc ggtcgtgtgg 1560
ttgctgctgc ggctgcatcc gtgctgtgtt gcatgggggc tgtatttcca gcgactatcg 1620
gagtgactgc ggcgtcggcc gatcaggtcc agctggtcga atcgggcggc ggcgtcgtcc 1680
agccgggccg ttccctgcgt ctgtcgtgcg ccgcctcggg cttcaccttc tccagctacg 1740
gcatgcactg ggtgcgtcag gccccgggca agggcctgga gtgggtggcc gtcatctggt 1800
acgacggctc caacaagtac tacgccgatt ccgtcaaggg ccgcttcacc atctcgcgtg 1860
acaactccaa gaacaccctg tacctgcaga tgaactccct gcgtgccgaa gacaccgccg 1920
tgtactactg cgcccgcgat ccgcgtggcg ccaccctgta ctactactac tacggcatgg 1980
atgtctgggg ccagggcacc accgtgaccg tctcgtccgg cggcggcggc tccggcggcg 2040
gcggcagcgg cggcggcggc tccgacatcc agatgaccca gtccccgagc tcgctgagcg 2100
cctcggtggg cgatcgcgtc accatcacct gccgtgcctc ccagagcatc aactcctacc 2160
tggactggta ccagcagaag ccgggcaagg ccccgaagct gctgatctac gccgcctcca 2220
gcctgcagag cggcgtgccg tcgcgcttct cgggctccgg cagcggcacc gacttcaccc 2280
tgaccatctc gtccctgcag ccggaggatt tcgccaccta ctactgccag cagtactact 2340
ccaccccgtt caccttcggc ccgggcacca aggtcgagat caagtgacca ggcatcaaat 2400
aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 2460
cgctctctac tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttata 2516

Claims (18)

1.一种共表达质粒，其特征在于，其含有2种分泌表达盒，所述分泌表达盒依次含有在双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌中进行表达的、以下的(1)～(4)的DNA：
(1)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子DNA；
(2)编码分泌信号肽的DNA；
(3)编码异种多肽的DNA；
(4)在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子DNA。
2.根据权利要求1所述的共表达质粒，其特征在于，在编码分泌信号肽的DNA的下游连接有编码接头肽的DNA。
3.根据权利要求1或2所述的共表达质粒，其特征在于，在双歧杆菌属细菌中发挥作用的启动子为选自P30启动子、P54启动子及Hu启动子中的1种或2种启动子。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，在双歧杆菌属细菌中发挥作用的终止子为选自Hu终止子及T2终止子中的1种或2种终止子。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，分泌信号肽具有以下的a)或b)的氨基酸序列：
a)序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列；
b)序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75及77中的任一者所示的氨基酸序列中缺失、替换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且由该氨基酸序列构成的肽在双歧杆菌属细菌中作为分泌信号肽发挥作用的氨基酸序列。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为单链抗体。
7.根据权利要求6所述的共表达质粒，其特征在于，单链抗体为抗PD－1抗体。
8.根据权利要求6所述的共表达质粒，其特征在于，单链抗体为抗CTLA－4抗体。
9.根据权利要求6所述的共表达质粒，其特征在于，单链抗体为抗HER2抗体。
10.根据权利要求1～5中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为细胞因子。
11.根据权利要求10所述的共表达质粒，其特征在于，细胞因子为TNF－α。
12.根据权利要求10所述的共表达质粒，其特征在于，细胞因子为IFN－γ。
13.根据权利要求1～5中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为抗PD－1抗体与抗CTLA－4抗体的组合。
14.根据权利要求1～5中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为TNF－α与IFN－γ的组合。
15.根据权利要求1～5中任一项所述的共表达质粒，其特征在于，异种多肽为抗HER2抗体与IFN－γ的组合。
16.一种双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌，其通过权利要求1～15中任一项所述的共表达质粒进行了转化。
17.根据权利要求16所述的双歧杆菌属细菌，其为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。
18.一种药物组合物，其含有权利要求16或17所述的双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌。
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