JP6755465B2 - 共発現プラスミド - Google Patents

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Description

本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターＤＮＡ；分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ；異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ；ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターＤＮＡ；を順次含む分泌発現カセットを２種類含むことを特徴とする共発現プラスミドに関する。また、本発明は、上記共発現プラスミドで形質転換されたビフィドバクテリウム属細菌や、該細菌を含む医薬組成物等に関する。
癌等の疾病に対して、これまで数多くの治療薬が提案されているが、いずれもその効果には限界が指摘されており、より高い効果が期待される治療薬や治療法の開発が望まれている。近年、遺伝子輸送担体を用いる治療方法の開発が進んでいる。例えば、嫌気性腸内細菌について、全身投与後、低酸素の固形腫瘍に蓄積する性質を利用して、抗腫瘍活性を有するタンパク質又は抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有するタンパク質を発現する遺伝子を標的患部において発現できる形質転換微生物（例えば、特許文献１参照）等が提案され、全身投与では副作用が不可避な薬剤を、腫瘍局所に高濃度かつ効果的にデリバリーすることが可能な新たな技術として、その発展が期待されている。
また、プロモーター、シグナル配列をコードするＤＮＡ、ポリペプチドをコードするＤＮＡ、又はこれらＤＮＡを挿入するためのクローニング部位を含む発現カセット（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
国際公開ＷＯ２００９／１２８２７２号パンフレット 国際公開ＷＯ２０１０／１２６０７３号パンフレット
上記文献において提案されているシグナル配列をコードするＤＮＡは、膜タンパク質や分泌タンパク質に見いだされたシグナル配列であり、より分泌効率に優れたシグナル配列として特定することが期待されているとともに、より治療効果の高い、異種タンパク質分泌発現プラスミドや、かかる分泌発現プラスミドで形質転換された嫌気性腸内細菌の開発が望まれている。
本発明の課題は、固形腫瘍組織、虚血性疾患部位等の嫌気性部位において、より治療効果の高い嫌気性腸内細菌を提供することにある。
本発明者らは、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターＤＮＡ；分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ；異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ；ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターＤＮＡ；を順次含む分泌発現カセットを２種類含むことを特徴とする２種の異種ポリペプチドを共発現するプラスミドで形質転換したビフィドバクテリウム属細菌が、異種ポリペプチドの単独発現株と比較して、顕著に高い癌細胞増殖抑制活性を有することを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ビフィドバクテリウム属細菌内で発現する、以下の（１）〜（４）のＤＮＡを順次含む分泌発現カセットを、２種類含むことを特徴とする共発現プラスミド。
（１）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターＤＮＡ；
（２）分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ；
（３）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（４）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターＤＮＡ；
［２］分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの下流にリンカーペプチドをコードするＤＮＡが連結されていることを特徴とする上記［１］記載の共発現プラスミド。
［３］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターが、Ｐ３０プロモーター、Ｐ５４プロモーター及びＨｕプロモーターから選択される１又は２のプロモーターであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の共発現プラスミド。
［４］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターが、Ｈｕターミネーター及びＴ２ターミネーターから選択される１又は２のターミネーターであることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の共発現プラスミド。
［５］分泌シグナルペプチドが、以下のａ）又はｂ）のアミノ酸配列を有することを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の共発現プラスミド。
ａ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがビフィドバクテリウム属細菌において分泌シグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列；
［６］異種ポリペプチドが、一本鎖抗体であることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の共発現プラスミド。
［７］一本鎖抗体が、抗ＰＤ−１抗体であることを特徴とする上記［６］記載の共発現プラスミド。
［８］一本鎖抗体が、抗ＣＴＬＡ−４抗体であることを特徴とする上記［６］記載の共発現プラスミド。
［９］一本鎖抗体が、抗ＨＥＲ２抗体であることを特徴とする上記［６］記載の共発現プラスミド。
［１０］異種ポリペプチドが、サイトカインであることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の共発現プラスミド。
［１１］サイトカインが、ＴＮＦ−αであることを特徴とする上記［１０］記載の共発現プラスミド。
［１２］サイトカインが、ＩＦＮ−γであることを特徴とする上記［１０］記載の共発現プラスミド。
［１３］異種ポリペプチドが、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せであることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の共発現プラスミド。
［１４］異種ポリペプチドが、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γとの組合せであることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の共発現プラスミド。
［１５］異種ポリペプチドが、抗ＨＥＲ２抗体とＩＦＮ−γとの組合せであることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の共発現プラスミド。
［１６］上記［１］〜［１５］のいずれか記載の共発現プラスミドで形質転換されたビフィドバクテリウム属細菌。
［１７］ビフィドバクテリウム・ロンガムである上記［１６］記載のビフィドバクテリウム属細菌。
［１８］上記［１６］又は［１７］記載のビフィドバクテリウム属細菌を含む医薬組成物。
本発明によると、異種ポリペプチドの分泌に優れた発現カセットを、同一プラスミド内で２種類併用することにより、効率よく２種の異種ポリペプチドを菌体外に分泌しうるビフィドバクテリウム属細菌を提供することができ、上記２種類の異種ポリペプチドが抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体等の抗癌作用を有する抗体等である場合、２種の異種ポリペプチドの相乗効果により、かかるビフィドバクテリウム属細菌は抗癌剤として非常に有用である。
プラスミドｐＳＰ３Ｂ-ＴＮＦαの構成を表す図である。 プラスミドｐＨＧ-２の構成を表す図である。 プラスミドｐＴＮＦ１１の構成を表す図である。 （ａ）はプラスミドｐｈＩＦＮｇ３３の構成を、（ｂ）はプラスミドｐｈＩＦＮｇ３３ＴＬの構成をそれぞれ表す図である。 ＡＧ８ＴＬ株培養上清粗精製物のＫＰＬ−１細胞に対する細胞増殖抑制活性を示すグラフである。 ＡＧ８ＴＬ株培養上清粗精製物のＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞に対する細胞増殖抑制活性を示すグラフである。 ＡＧ８ＴＬ株の培養上清粗精製物の細胞増殖抑制活性の中和抗体添加による中和の効果を検討したグラフである。 （Ａ）はプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の構成を、（Ｂ）はｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の構成を、（Ｃ）はｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧの構成をそれぞれ表す図である。 （ａ）はプラスミドｐＰＣ１の構成を、（ｂ）はプラスミドｐＣＰ１の構成をそれぞれ表す図である。 （Ａ）は抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖの発現確認を、（Ｂ）は抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖの発現確認をそれぞれ示す図である。 ヒトＰＤ−１固相化プレートヘの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の特異的結合を示すグラフである。 ヒトＣＴＬＡ−４固相化プレートヘの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の特異的結合を示すグラフである。 ヒトＰＤ−１に対するヒトＰＤ−Ｌ１との結合反応における抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の競合的結合阻害を示すグラフである。 ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒトＣＤ８０との結合反応における抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の競合的結合阻害を示すグラフである。 ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒトＣＤ８６との結合反応における抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の競合的結合阻害を示すグラフである。 ＰＣ１株より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のヒトＰＤ−１過剰発現細胞への結合を示すグラフである。 ＰＣ１株より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のヒトＣＴＬＡ−４過剰発現細胞への結合を示すグラフである。 ウェスタン解析による、ＨＧ−２株における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γの分泌確認を示す図である。 ＨＧ−２株培養上清濃縮物の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＨＥＲ２陽性細胞増殖抑制活性を示すグラフである。 ＨＧ−２株培養上清濃縮物のＨＥＲ２陽性細胞に対する細胞増殖抑制活性を示すグラフである。 （Ａ）はＨＧ−２株のグラム染色図を示し、（Ｂ）はＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株のグラム染色図を示す。 （Ａ）はＨＧ−２株の抗ｈＩＦＮ−γ抗体による免疫組織染色図を示し、（Ｂ）はＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の抗ｈＩＦＮ−γ抗体による免疫組織染色図を示す。 （Ａ）はＨＧ−２株の抗ヒスチジンタグ抗体による免疫組織染色図を示し、（Ｂ）はＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の抗ヒスチジンタグ抗体による免疫組織染色図を示す。 共発現プラスミドｐＰＣ２−ｐＰＣ８の構成の概要を示す図である。 共発現プラスミドｐＰＣ２−ｐＰＣ８の構築方法の概要を示す図である。 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２発現プラスミドの構築方法の概要を示す図である。 ｐＰ３０ＳＰｘＬｙ−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓの構築方法の概要を示す図である。 ｐＰ３０ＳＰｘＬｙ−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ（ｐＣ１Ｆ−ｐＣ３Ｆ）の構築方法の概要を示す図である。 共発現プラスミドｐＰＣ２ＴＬ−ｐＰＣ８ＴＬの構成の概要を示す図である。 共発現プラスミドｐＰＣ２ＴＬ−ｐＰＣ８ＴＬの構築方法の概要を示す図である。 ウェスタン解析による、各株における抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ（ａ）及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ（ｂ）の分泌確認を示す図である。 抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１単独発現株（ｐＣ１ＴＬＢ、ｐＣ２ＴＬＢ、ｐＣ３ＴＬＢ）の構築方法の概要を示す図である。 Ｃ１Ｆ株、Ｃ２Ｆ株、及びＣ３Ｆ株由来ｓｃＦｖのヒトＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を、フローサイトメトリーを用いて解析した図である。 Ｃ１ＴＬＢ株、Ｃ２ＴＬＢ株、及びＣ３ＴＬＢ株由来ｓｃＦｖのヒトＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を、フローサイトメトリーを用いて解析した図である。 Ｐ１Ｈ株、Ｐ２Ｈ株、及びＰ３Ｈ株由来ｓｃＦｖのヒトＰＤ−１発現細胞への結合を、フローサイトメトリーを用いて解析した図である。 Ｐ１ＴＬ株、Ｐ２ＴＬ株及びＰ３ＴＬ株由来ｓｃＦｖのヒトＰＤ−１発現細胞への結合を、フローサイトメトリーを用いて解析した図である。 (ａ) 抗ヒトＰＤ−１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）のヒトＰＤ−１発現細胞への結合、（ｂ）抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（Ｌ３Ｄ１０）のヒトＣＴＬＡ−４発現細胞への結合、（ｃ）ＰＣ４由来ｓｃＦｖのヒトＰＤ−１発現細胞への結合、（ｄ）ＰＣ４由来ｓｃＦｖのヒトＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を、フローサイトメトリーを用いて解析した図である。 ＰＣ４株より精製したｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−ＨｉｓとｈＰＤ−１の結合に対するｈＰＤ−Ｌ１による結合阻害活性を示すグラフである。 ＰＣ４株より精製したｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧとｈＣＴＬＡ−４の結合に対するｈＣＤ８０による結合阻害活性を示すグラフである。 ＰＣ４株より精製したｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧとｈＣＴＬＡ−４の結合に対するｈＣＤ８６による結合阻害活性を示すグラフである。
本発明の共発現プラスミドとしては、（１）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターＤＮＡ；（２）分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ；（３）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ；（４）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターＤＮＡ；の各ＤＮＡを順次含む分泌発現カセットを２種類含み、かつ、ビフィドバクテリウム属細菌に形質転換された場合に、２種の異種ポリペプチドを共発現しうるプラスミドであれば特に制限されず、上記各ＤＮＡ断片の３’末端と、その下流の各ＤＮＡの５’末端とは、本発明の効果が得られる限り、直接連結していなくてもよいが、直接連結していることが好ましい。
本発明におけるプロモーターＤＮＡとしては、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターＤＮＡであれば特に制限されず、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターであるＨｕプロモーターＤＮＡや、Ｐ３０プロモーターＤＮＡ（J. Microbiology, 2012, 638-643）や、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｕタンパク質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターであるＰ５４プロモーターＤＮＡ（J.Bacteriology, 2005, 5799-5808、J. Microbiology, 2012, 638-643）や、ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来Ｇａｐ遺伝子のプロモーターＤＮＡ（Biotechnol. Lett. 2008 30:1983-1988）や、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来ＡｍｙＢ遺伝子のプロモーターＤＮＡ（Biotechnol. Lett. 2006 28:163-168）や、１６ＳｒＲＮＡプロモーターＤＮＡ（Biotechnol. Lett. 2008 30:165-172）、ＧＡＰＤＨ（ｐｒ−ＢＬ1363）遺伝子のプロモーターＤＮＡ（Appl Environ Microbiol. 2006 72(11):7401-7405）、ＰＲＰＬプロモーターＤＮＡ（Cancer Gene Ther. 2007 14:151-157）、ｐ５７２（β-glycosidase from B. animalis subsp lactis）遺伝子のプロモーターＤＮＡ（J. Microbiol Biotechnol. 2012Dec;22(12):1714-23）、ｐ９１９遺伝子のプロモーター(rplM promoter)ＤＮＡ（J Microbiol. 2012 Aug;50(4):638-43）、ｐ８９５遺伝子のプロモーター(rplR promoter)ＤＮＡ（J. Microbiology, 2012, 638-643）を例示することができる。また、上記異種ポリペプチドの分泌に優れた発現カセット毎に、プロモーターは異なることが好ましく、具体的には、ＨｕプロモーターＤＮＡとＰ３０プロモーターＤＮＡ、ＨｕプロモーターＤＮＡとＰ５４プロモーターＤＮＡ、Ｐ５４プロモーターＤＮＡとＰ３０プロモーターＤＮＡの組合せを挙げることができる。
本発明における分泌シグナルペプチドとしては、ａ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、すなわちそれぞれＳＰ７、ＳＰ４５、ＳＰ５０、ＳＰ５２、ＳＰ５５、ＳＰ５８、ＳＰ６４、ＳＰ６６、ＳＰ６７、ＳＰ６８、及びＳＰ６９を挙げることができ、中でも、配列番号５６に示されるＳＰ７や配列番号６６に示されるＳＰ６９を好適に挙げることができる。また、ｂ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、該ペプチドが、ビフィドバクテリウム属細菌において分泌シグナルペプチドとして機能するペプチド（変異分泌シグナルペプチド）を挙げることができる。上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、上記変異分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列としては、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７に示されるアミノ酸配列のいずれかとの配列同一性が９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。
上記ａ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記ａ）に示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡであれば特に制限されず、したがってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれるが、例えば、配列番号５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、及び７６のいずれかに示される塩基配列（配列表上段）からなるＤＮＡを挙げることができ、これらのＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法等の当業者に既知の方法により作製することができる。
上記ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記ｂ）に示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡであれば特に制限されず、したがってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれるが、これらのＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の方法により作製することもできる。例えば、配列番号５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、及び７６のいずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Manual、2nd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY.、1989.、Current Protocols in Molecular Biology、Supplement 1〜38、John Wiley & Sons（1987-1997）等に記載の方法に準じて行うことができる。
上記分泌シグナルペプチドは、異種ポリペプチドの発現・分泌効率の点から、リンカーペプチドと連結したシグナルペプチド−リンカー連結体として用いることが好ましい。かかるリンカーペプチドとしては、本発明における上記分泌シグナルペプチドのＣ末端に連結して用いられ、異種ポリペプチドの発現・分泌効率を高めることができるペプチドであれば特に制限されず、アミノ酸０〜３０残基のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に挙げることができるが、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株から同定された上記各分泌シグナルペプチドに続く以下に示される１１種類のアミノ酸配列について、各配列の０番目から３０番目のいずれかまでのアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを挙げることができる。
１）配列番号７９に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ７の下流）；
２）配列番号８１に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ４５の下流）；
３）配列番号８３に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ５０の下流）；
４）配列番号８５に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ５２の下流）；
５）配列番号８７に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ５５の下流）；
６）配列番号８９に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ５８の下流）；
７）配列番号９１に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ６４の下流）；
８）配列番号９３に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ６６の下流）；
９）配列番号９５に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ６７の下流）；
１０）配列番号９７に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ６８の下流）；
１１）配列番号９９に示されるリンカーペプチド配列（ＳＰ６９の下流）；
上記リンカーペプチドのアミノ酸残基数としては、０〜３０残基を挙げることができ、０〜２５残基が好ましく、０〜２０残基がより好ましく、０〜１５残基がさらに好ましく、０〜１０残基がさらに好ましく、１〜１０残基が特に好ましい。
また、各配列の０番目から３０番目のいずれかまでのアミノ酸配列からなるリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列としては、以下の配列を例示することができる。
１）配列番号７８に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ７の下流）；
２）配列番号８０に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ４５の下流）；
３）配列番号８２に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ５０の下流）；
４）配列番号８４に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ５２の下流）；
５）配列番号８６に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ５５の下流）；
６）配列番号８８に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ５８の下流）；
７）配列番号９０に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ６４の下流）；
８）配列番号９２に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ６６の下流）；
９）配列番号９４に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ６７の下流）；
１０）配列番号９６に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ６８の下流）；
１１）配列番号９８に示されるＤＮＡ配列（ＳＰ６９の下流）；
本発明の分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体をコードするＤＮＡ領域としては、上記各分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの５’末端から、各分泌シグナルペプチドの下流にある上記リンカーペプチドをコードするＤＮＡの３’末端までを含むＤＮＡ領域をいい、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの３’末端と、リンカーペプチドをコードするＤＮＡの５’末端とが連結しているので、ＳＰｘＬｙ（但し、ｘは、分泌シグナルペプチドの本明細書における番号、ｙは、リンカーペプチドのアミノ酸残基数）と称することがある。具体的には、ＳＰ７Ｌ２０、ＳＰ４５Ｌ２０、ＳＰ５０Ｌ２０、ＳＰ５２Ｌ２０、ＳＰ５５Ｌ２０、ＳＰ５８Ｌ２０、ＳＰ６４Ｌ２０、ＳＰ６６Ｌ２０、ＳＰ６７Ｌ２０、ＳＰ６８Ｌ２０、ＳＰ６９Ｌ２０等を挙げることができる。例えば、ＳＰ６７Ｌ２０は、配列番号７３のアミノ酸配列に配列番号９５の最初の２０個のアミノ酸配列が結合した分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体を表す。中でも、ＳＰ５０Ｌ１〜Ｌ１５、ＳＰ６７Ｌ１〜Ｌ１５、ＳＰ６８Ｌ１〜Ｌ１５、ＳＰ６９Ｌ１〜Ｌ１５が好ましく、ＳＰ５０Ｌ１〜Ｌ１０、ＳＰ６７Ｌ１〜Ｌ１０、ＳＰ６８Ｌ１〜Ｌ１０、ＳＰ６９Ｌ１〜Ｌ１０が好ましく、ＳＰ５０Ｌ５、ＳＰ６７Ｌ１、ＳＰ６７Ｌ１０、ＳＰ６８Ｌ１、ＳＰ６９Ｌ１が特に好ましい。なお、上記Ｌ１〜Ｌ１５は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５を表し、Ｌ１〜Ｌ１０は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０を表す。
上記異種ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、本発明における分泌発現カセットにおいて発現することができる、ビフィドバクテリウム属細菌以外に由来するポリペプチドであれば特に制限されず、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、β、γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リンホトキシン（ＬＴ）−β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）等のサイトカインをコードするＤＮＡや、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル（ＮＨ４）等の血管新生抑制物質をコードするＤＮＡを挙げることができる他、５−フルオロウラシルのプロドラッグである５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する酵素であるシトシン・デアミナーゼをコードするＤＮＡや、ニトロアロマティック骨格を有するプロドラッグ抗癌剤のニトロ基を還元して活性化させる酵素であるニトロレダクターゼＤＮＡ等を好適に挙げることができる。また、抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡも有利に使用することができる。かかる異種ポリペプチドをコードするＤＮＡには、ポリペプチドの単離処理等における便宜のため、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ等のアフィニティタグをコードするＤＮＡを適宜付加することもできる。
上記抗体としては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体を標的分子とするリウマチ治療薬に用いられる抗体や、α４−インテグリンを標的分子とする多発性硬化症治療薬に用いられる抗体や、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＫＩＲを標的とする抗癌作用を有する抗体、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ等のアゴニスト抗体や、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６)、ｃＭＥＴ、ＣＣＲ４に特異的に結合する抗体などを例示することができる。
中でも、抗ＰＤ−１抗体は、活性化したリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）に発現するＰＤ−１受容体に結合することにより、癌細胞が発現するＰＤ−Ｌ１やＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１受容体が結合するのを阻害する結果、腫瘍細胞への免疫反応が増強されることから、好適に例示することができる。また、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、自己免疫機能の抑制分子として知られているＣＴＬＡ−４の機能を抑制することにより抗腫瘍免疫応答を増強する。すなわち、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、抗原提示細胞に発現したＣＤ８０やＣＤ８６へのＣＴＬＡ−４の結合を阻止することにより、これらの分子の相互作用によって誘発される免疫応答の負の下方制御を阻止することで抗腫瘍免疫応答を増強すると考えられることから、好適に例示することができる。さらに、抗ＨＥＲ−２（ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ−ｒｅｌａｔｅｄ２）抗体は、癌遺伝子ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２）の遺伝子産物であるＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合し、その増殖シグナルを抑制することにより、抗腫瘍効果を発揮すると考えられることから、好適に例示することができる。
上記抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）等をコードするＤＮＡを挙げることができるが、それ自身で標的物質を認識・結合することができ、分子量が大きすぎず、ビフィドバクテリウム属細菌内に導入された場合にも発現可能である一本鎖抗体をコードするＤＮＡが好ましい。これら抗体を含む異種ポリペプチドをコードするＤＮＡは、その配列情報を、公知の文献やＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから適宜入手して、化学合成、遺伝子工学的手法等の公知の方法により作製することもできる。
本発明における上記異種ポリペプチドの２種の組合せとしては、ビフィドバクテリウム属細菌は生体に全身投与すると正常組織では増殖せず、固形腫瘍組織、虚血性疾患部位等の嫌気性部位に選択的に分布・生着するので、嫌気性疾患部位で局所的に共発現させた場合に相乗的な併用効果が期待される組合せが好ましく、具体的には、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γとの組合せや、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せや、抗ＨＥＲ２抗体とＩＦＮ−γとの組合せや、抗ＰＤ−１抗体とＩＦＮ−γとの組合せや、抗ＰＤ−１抗体と抗ＨＥＲ２抗体との組合せや、抗ＰＤ−１抗体と抗ＥｐＣＡＭ抗体との組合せを挙げることができる。
上記ターミネーターＤＮＡとしては、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターＤＮＡであれば特に制限されず、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＨｕターミネーターＤＮＡ；ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の乳酸脱水素酵素遺伝子のターミネーターであるｄ００１３ターミネーターＤＮＡ；ビフィドバクテリウム・アニマリス由来のＴ５７２ターミネーターＤＮＡ（J. Microbiol Biotechnol. 2012 Dec;22(12):1714-23）の他、人工的にデザインされたターミネーターであるＢＢａ＿Ｂ００１５（Ｔ２）ターミネーター）ＤＮＡ；を挙げることができる。また、上記異種ポリペプチドの分泌に優れた発現カセット毎に、ターミネーターは異なることが好ましく、具体的にはＨｕターミネーターＤＮＡとｄ００１３ターミネーターＤＮＡ、ＨｕターミネーターＤＮＡとＴ５７２ターミネーターＤＮＡ、ＨｕターミネーターＤＮＡとＴ２ターミネーターＤＮＡ、ｄ００１３ターミネーターＤＮＡとＴ５７２ターミネーターＤＮＡ、ｄ００１３ターミネーターＤＮＡとＴ２ターミネーターＤＮＡ、Ｔ５７２ターミネーターＤＮＡとＴ２ターミネーターＤＮＡとの組合せ等を挙げることができる。
本発明における分泌発現カセット、好ましくはリンカーペプチドをコードするＤＮＡを含む分泌発現カセットの作製方法としては、
（１）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターＤＮＡ；
（２）以下のａ）又はｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ；
ａ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列からなるペプチドがビフィドバクテリウム属細菌においてシグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列；
（３）リンカーペプチドをコードするＤＮＡ；
（４）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（５）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターＤＮＡ；
の各ＤＮＡを、（１）を上流側として（５）を下流側として、（１）〜（５）のＤＮＡを順次含むように連結する方法を例示することができ、本発明における分泌発現カセットの作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル講談社、高木康敬編遺伝子操作実験法講談社、モレキュラー・クローニング［コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８２）］、モレキュラー・クローニング第２版［コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）］、メソッズ・イン・エンザイモロジー １９４（１９９１）、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法、羊土社（１９９４）等に記載された方法にしたがって行うことができる。
本発明の分泌発現カセットを２種類含む共発現プラスミドを作製するために用いることができるプラスミドベクターとしては、本発明における発現カセットを２種類挿入することができ、ビフィドバクテリウム属細菌に形質転換された場合に２種の異種ポリペプチドを分泌発現できるプラスミドベクターであれば特に制限されず、ビフィドバクテリウム属細菌以外の菌、例えば大腸菌においても機能するｐＵＣｏｒｉ等の複製開始点をさらに有するシャトルプラスミドベクターを有利に用いることもできる。
ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットを有するプラスミドベクターの具体例としては、ｐＴＢ６（Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Feb;69(2):422-5）、ｐＭＢ１（Lett Appl Microbiol. 1990 Oct;11(4):220-3）、ｐＴＢ４（Bifidobacterium longum 由来のプラスミドｐＴＢ４の構造解析と応用一般演題 ポスター発表 プログラム - 日本分子生物学会、１９９４）、ｐＦＩ２５７６（J Microbiol Biotechnol. 2009 Apr;19(4):403-8）、ｐＣＩＢＡＯ（Appl Environ Microbiol. 2007 Dec;73(24):7858-66）、ｐＢＣ１（Plasmid. 2007 Mar;57(2):165-74）、ｐＤＯＪＨ１０Ｓ（Appl Environ Microbiol. 2006 Jan;72(1):527-35）、ＰＫＪ５０（Microbiology 1999 Mar;145(Pt ):585-92）を例示することができ、複製ユニットとしては、ｐＴＢ６由来のＯｒｉＶ領域及びＲｅｐＢ遺伝子からなるｐＴＢ６ｒｅｐユニットを好適に挙げることができる。ビフィドバクテリウム属細菌以外の菌、例えば大腸菌でそれぞれ機能するｐＵＣｏｒｉ等の複製開始点をさらに有するシャトルプラスミドベクターを用いることもできる。
また、上記プラスミドには、薬剤耐性等のマーカー遺伝子を含めることもできる。かかる薬剤耐性マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、アンピシリン等の各耐性遺伝子を例示することができる。
本発明におけるプラスミドを、ビフィドバクテリウム属細菌へ導入する方法としては、エレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入方法を挙げることができる。
本発明におけるビフィドバクテリウム属細菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B．pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（B. thermophirum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B．infantis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・コエリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B. globosum）、ビフィドバクテリウム・インディクム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス（B. lactentis）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシクム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス（B. Mongolia Enns）、ビフィドバクテリウム・パルブロラム（B. parvulorum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィラム（B.psychraerophilum）、ビフィドバクテリウム・プロラム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナレ（B. ruminale）、ビフィドバクテリウム・ルミナンチウム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・サエクラレ（B. saeculare）、ビフィドバクテリウム・スカルドヴィ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・サブタイル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・スイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・テルマシドフィラム（B. thermacidophilum）などを例示することができる。中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知られているビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティスを宿主細胞として用いることが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロンガムを用いることがより好ましい。これらの菌は、いずれも市販されているか、又は寄託機関等から容易に入手することができる。
また、それぞれの菌株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムについては、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ−１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ−６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１−２株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株が好ましい。ビフィドバクテリウム・ブレーベについては、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（ＪＣＭ１１９２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株が好ましい。ビフィドバクテリウム・インファンティスについては、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（ＪＣＭ１２２２）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株を挙げることができる。ビフィドバクテリウム・ラクテンティスについては、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（ＪＣＭ１２１０）を挙げることができる。ビフィドバクテリウム・ビフィダムの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３株を挙げることができる。
本発明のプラスミドや形質転換ビフィドバクテリウム属細菌の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル講談社、高木康敬編遺伝子操作実験法講談社、モレキュラー・クローニング［コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８２）]、モレキュラー・クローニング第２版［コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）]、メソッズ・イン・エンザイモロジー１９４（１９９１）、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法、羊土社（１９９４）等に記載された方法にしたがって行うことができる。
上記形質転換されたビフィドバクテリウム属細菌は、正常組織では増殖せず嫌気的環境下にある腫瘍組織内でのみ増殖し、腫瘍組織内で治療に有用な２種の異種ポリペプチドを発現することができる。
したがって、かかる形質転換されたビフィドバクテリウム属細菌は、嫌気的環境を有する腫瘍、好ましくは固形腫瘍の治療に有効な医薬組成物、とりわけ抗癌剤として使用することができる。したがって、本発明の医薬組成物としては、異種ポリペプチド、好ましくは抗癌作用を有するサイトカイン、抗体等を分泌しうる上記本発明のビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有している限り特に制限されず、分泌するポリペプチドの作用・効果を妨げない限り、任意成分としての薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等を含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物の投与対象は、哺乳類、好ましくはヒトであり、本発明の医薬組成物の適用対象としては、大腸癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸癌、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、脳腫瘍、悪性カルチノイド腫瘍、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマを例示することができる。
本発明の医薬組成物の剤型としては、液剤又は固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩水若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプル又はバイアル瓶などに充填した後凍結して凍結製剤とするか、又は凍結乾燥して凍結乾燥製剤とすることにより製造することができる。本発明の医薬組成物の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、局所投与を挙げることができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、疾患部位においてビフィドバクテリウム属細菌が生育でき、且つ、有効治療量のサイトカイン、活性抗体等を発現するのに十分な量である限り特に制限はされず、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができるが、経済上の観点及び副作用を可能な限り回避する観点から、必要な治療効果が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。
例えば、静脈内投与の場合には、特に、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、又は適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０１２ｃｆｕを１日１〜複数回に分け、１〜数日間、連続して又は適宜間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１〜１０００ｍＬを直接、又は適当な補液で希釈して、１日１〜数回に分け、１〜数日間連続して投与する。
また、例えば、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合は、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０１２ｃｆｕを１日１〜複数回、必要に応じ１〜複数日間、連続して、又は適宜間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり０．１〜１００ｍＬを直接、一日数回、必要に応じて１〜複数日間連続して投与する。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］
［ヒトＴＮＦ−α及びヒトＩＦＮ−γ共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＡＧ８ＴＬ株の作製］
（概要）
ヒトＴＮＦ−αを分泌する発現カセット（ヒトＴＮＦ−α分泌発現カセット）と、ヒトＩＦＮ−γを分泌する発現カセット（ヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセット）とを含み、大腸菌−ビフィドバクテリウム属細菌シャトルベクターである、共発現プラスミドｐＡＧ８ＴＬを作製した。かかるｐＡＧ８ＴＬを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーション法により行い、ヒトＴＮＦ−α及びヒトＩＦＮ−γ共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＡＧ８ＴＬ株を取得した。実施例１〜３において使用したプライマーを以下の表１に示す。
（ヒトＴＮＦ−α分泌発現カセットの構成）
ヒトＴＮＦ−α分泌発現カセットとして、（１）Ｐ３０プロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカー連結体ＳＰ７Ｌ２０をコードするＤＮＡ、（３）ヒトＴＮＦ−αタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び（４）ｄ００１３ターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（４）を下流（３’末端）側として、（１）〜（４）のＤＮＡを順次含むカセットを作製した。
（ヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットの構成）
ヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットとして、（１）ＨｕプロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカー連結体ＳＰ６９Ｌ２０をコードするＤＮＡ、（３）ヒトＩＦＮ−γタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び（４）ＨｕターミネーターＤＮＡ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来）を、（１）を上流（５’末端）側として（４）を下流（３’末端）側として、（１）〜（４）のＤＮＡを順次含むカセットを作製した。
（プラスミドｐＡＧ８ＴＬの作製）
プラスミドｐＡＧ８ＴＬの作製にあたり、まず、プラスミドｐＡＧ８を作製した。
（プラスミドｐＡＧ８の作製）
（ｈＴＮＦ−αインサート断片の調製）
国際公開２０１１／０９３４６５号パンフレットに記載されているプラスミドｐＳＰ３Ｂ−ＴＮＦα（図１参照）（１ｎｇ）を鋳型として、上記表１記載のＧＡ１００＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＧＡ１０１＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量２０μＬとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）キット（タカラバイオ株式会社製）（以下、「ＳＴＡＲキット」）を用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７５℃にて４０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行い、約０．５ｋｂｐのｈ（ヒト）ＴＮＦ−αインサート断片増幅産物を調製した。
（ヒトＩＦＮ−γタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクター断片の調製）
プラスミドｐＨＧ−２（図２）の直鎖化断片（配列番号１）を鋳型として、表１記載のＧＡ１０４＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＧＡ１０３＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量２０μＬとして、ＳＴＡＲキットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７５℃にて５分を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行い、約５ｋｂｐの５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ６９Ｌ２０−ヒトＩＦＮ−γタンパク質−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−ｐＴＢ ｒｅｐ ｕｎｉｔ−ＳＰＣＭｒ−ｐＵＣｏｒｉ−Ｐ３０プロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−３’ベクター断片増幅産物を調製した。
上記プラスミドｐＨＧ−２の直鎖化断片は、配列番号１の第１番から第４９７５番までの塩基配列において下記のとおり構成される。
ｄ００１３ターミネーター：配列番号１の第１６番から第１２９番までの塩基配列
Ｈｕプロモーター：配列番号１の第１３６番から第４９６番までの塩基配列
ＳＰ６９Ｌ２０：配列番号１の第４９７番から第６４６番までの塩基配列
ヒトＩＦＮ−γタンパク質：配列番号１の第６４７番から第１０７５番までの塩基配列
Ｈｉｓタグ：配列番号１の第１０７６番から第１０９３番までの塩基配列
Ｈｕターミネーター：配列番号１の第１０９７番から第１２１０番までの塩基配列
ビフィドバクテリウム属細菌複製起点ｐＴＢ６ ｒｅｐ ｕｎｉｔ：配列番号１の第１２１７番から第２８１２番までの塩基配列
スペクチノマイシン耐性遺伝子ＳＰＣＭｒ：配列番号１の第２８１９番から第３８９７番までの塩基配列
大腸菌複製起点、ｐＵＣｏｒｉ：配列番号１の第３９０４番から第４５７１番までの塩基配列
Ｐ３０プロモーター：配列番号１の第４５７２番から第４８０６番までの塩基配列
ＳＰ７Ｌ２０：配列番号１の第４８０７番から第４９６５番までの塩基配列。
（インフュージョン反応１）
上記で調製したベクター断片増幅産物及びインサート断片増幅産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ株式会社製）（以下、「ＨＤキット」）を用いて連結した。すなわち、マイクロチューブに、上記ベクター断片増幅産物５０ｎｇとインサート断片増幅産物１３ｎｇとを添加し、キット内の５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅｐｒｅｍｉｘ ２μＬ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １μＬをさらに添加し、０．１×ＴＥバッファー（１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）にて反応液容量を１０μＬに調整した。これを３７℃にて１５分間保温した後、さらに５０℃にて１５分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液１を調製した。
（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）
１μＬの上記インフュージョン反応液１を用いて、大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞（タカラバイオ株式会社製）の形質転換を製品説明書にしたがい行った。形質転換後の菌懸濁液は、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩振とう培養した。上記寒天培地上に形成された大腸菌コロニーを７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩培養し、これよりＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドにおける上記ヒトＴＮＦ−α分泌発現カセット及びヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットを含む領域１（５’−Ｐ３０プロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−ヒトＴＮＦ−αタンパク質−ｄ００１３ターミネーター−Ｈｕプロモーター−ＳＰ６９Ｌ２０−ヒトＩＦＮ−γタンパク質−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列を決定するため、Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシーケンス反応を行った。抽出したプラスミドをｐＡＧ８と名付けた。ｐＡＧ８のヒトＴＮＦ−α分泌発現カセット及びヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットを含む領域１の配列を配列番号２に示す。
（ｐＡＧ８ＴＬ株の調製）
上記ｐＡＧ８を鋳型として、表１記載のＧＡ２＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＧＡ６＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７５℃にて３分１５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約３．３ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物Ａを調製した。
上記ｐＡＧ８を鋳型として、表１記載のＧＡ５＿ｐｒｉｍｅｒ＿ｒｅｖ（フォワード）及びＧＡ１＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７５℃にて２分１０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約２．２ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物Ｂを調製した。
（インフュージョン反応２）
ＰＣＲ増幅産物Ａを５０ｎｇ、ＰＣＲ増幅産物Ｂを３３ｎｇ使用したほかは、上記（インフュージョン反応１）と同様の手順にて、上記ＰＣＲ増幅産物ＡとＰＣＲ増幅産物Ｂとを連結し、インフュージョン反応液２を調製した。
（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８ＴＬのＤＮＡの配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記インフュージョン反応液２を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおけるヒトＴＮＦ−α分泌発現カセット及びヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットを含む領域２（５’−Ｐ３０プロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−ヒトＴＮＦ−αタンパク質−ｄ００１３ターミネーター−Ｈｕプロモーター−ＳＰ６９Ｌ２０−ヒトＩＦＮ−γタンパク質−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドをｐＡＧ８ＴＬと名付けた。ｐＡＧ８ＴＬのヒトＴＮＦ−α分泌発現カセット及びヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットを含む領域２の配列を配列番号３に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）
上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドｐＡＧ８ＴＬ（２５０ｎｇ）を用いて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステム（ジーンパルサーＩＩ、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）により行なった。電気ショック（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）後は、キュベット（２ｍｍギャップ）に８００μＬのＩＭＲ液体培地と５０μＬのビタミンＣ添加液との混合液を即時に添加し、これを滅菌済みの２ｍＬマイクロチューブに回収した。この２ｍＬチューブの蓋をゆるめて、脱酸素・炭酸ガス発生剤（アネロパック（登録商標）・ケンキ、三菱ガス化学株式会社製）とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベーターにて３時間保温した。
保温後の各菌懸濁液を７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＩＭＲ寒天培地に塗布した。これらのプレートを上記脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベーターにて２日間培養した。
上記スペクチノマイシン含有ＩＭＲ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換体ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＧ８ＴＬ株（以下、ＡＧ８ＴＬ株という）とした。
［実施例２］
［ヒトＴＮＦ−α単独発現株ＴＮＦ１１株の作製］
共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＡＧ８ＴＬ株に対応するヒトＴＮＦ−α単独発現株ＴＮＦ１１株を以下のとおり作製した。
ｐＡＧ１２を鋳型として、表１記載のＧＡ１１３＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＧＡ６＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７５℃にて３分５０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約３．２ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物６０を調製した。
ｐＡＧ１２を鋳型として、表１記載のＧＡ５＿ｐｒｉｍｅｒ＿ｒｅｖ（フォワード）及びＧＡ１１６＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて１分１５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約１．２ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物６１を調製した。なお、鋳型に用いたプラスミドｐＡＧ１２は、ｐＡＧ８ＴＬのｈＩＦＮ−γのＳＰ／ＬｉｎｋｅｒがＳＰ６９Ｌ２０からＳＰ５６Ｌ２０に置換されたものである。
（インフュージョン反応３）
ＰＣＲ増幅産物６０を５０ｎｇ、ＰＣＲ増幅産物６１を２０ｎｇ使用したほかは、上記（インフュージョン反応１）と同様の手順にて、上記ＰＣＲ増幅産物６０とＰＣＲ増幅産物６１とを連結し、インフュージョン反応液３を調製した。
（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＴＮＦ１１のＤＮＡの配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記インフュージョン反応液３を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおけるヒトＴＮＦ−α分泌発現カセット（５’−Ｐ３０プロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−ヒトＴＮＦ−αタンパク質−ｄ００１３ターミネーター）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＴＮＦ１１と名付けた。ｐＴＮＦ１１のプラスミド構成を図３に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換２）
上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドｐＴＮＦ１１（５００ｎｇ）を用いたほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＴＮＦ１１株（以下、ＴＮＦ１１株という）とした。
［実施例３］
［ヒトＩＦＮ−γ単独発現株ｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株の作製］
共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＡＧ８ＴＬ株に対応するヒトＩＦＮ−γ単独発現株ｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株を、以下のとおり作製した。
共発現ＡＧ８ＴＬ株に対応するヒトＩＦＮ−γ単独発現株ｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株を作製した。プラスミドｐｈＩＦＮｇ３３ＴＬの作製にあたり、まず、プラスミドｐｈＩＦＮｇ３３を作製した。
（ｈＩＦＮ−γ遺伝子の人工ＤＮＡ合成）
ｈＩＦＮ−γ遺伝子については、ジェンスクリプトジャパン株式会社に合成を依頼した。ｈＩＦＮ−γ配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＣＡＡ３１６３９の成熟タンパク質のアミノ酸配列（Ｇｌｎ２４−Ｇｌｎ１６６）に基づき、コドンをビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５に最適化した（納品プラスミド：ｐＵＣ５７−ｈＩＦＮｇ）。配列番号４に人工合成したｈＩＦＮ−γのＤＮＡ配列を示した。
ｐＢＥｓｈｕｔｔｌｅ（配列番号５）を鋳型として、表１記載のｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ＿Ｒ１＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）及びＩＦＮＧ２＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７５℃にて３分５０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約３．９ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物ｖｅｃｔｏｒ１を調製した。
上記ｐＵＣ５７−ｈＩＦＮｇ（ｈＩＦＮｇ ｉｎ ｐＵＣ５７）を鋳型として、表１記載のＩＦＮＧ１＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＩＦＮＧ３＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７５℃にて３０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約０．５ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物ｉｎｓｅｒｔ１を調製した。
（インフュージョン反応４）
ＰＣＲ増幅産物ｖｅｃｔｏｒ１を５０ｎｇ、ＰＣＲ増幅産物ｉｎｓｅｒｔ１を１２ｎｇ使用したほかは、上記（インフュージョン反応１）と同様の手順にて、上記ＰＣＲ増幅産物ｖｅｃｔｏｒ１とＰＣＲ増幅産物ｉｎｓｅｒｔ１とを連結し、インフュージョン反応液４を調製した。
（大腸菌の形質転換及び非分泌型プラスミドｐｈＩＦＮｇのＤＮＡの配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記インフュージョン反応液４（２μＬ）を用いて大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲの形質転換を行い、組換え大腸菌からのプラスミド抽出、抽出したプラスミドＤＮＡの全長配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐｈＩＦＮｇ（非分泌型プラスミド）と名付けた。
（分泌型プラスミドｈＩＦＮｇ３３の作製）
上記ｐｈＩＦＮｇを鋳型として、表１記載のｈＩＦＮＧ４＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＨｕ−ｍＣＣＬ２１−ｖｅｃＲ１＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７５℃にて４分２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約４．３ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物ｖｅｃｔｏｒ２を調製した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡを鋳型として、表１記載のＳＰ６９−ｉｎｓ＿Ｆ１＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＳＰ６９−ｉｎｓ＿Ｒ２＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７５℃にて１５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約０．２ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物ｉｎｓｅｒｔ２を調製した。
（インフュージョン反応５）
ＰＣＲ増幅産物ｖｅｃｔｏｒ２を５０ｎｇ、ＰＣＲ増幅産物ｉｎｓｅｒｔ２を５ｎｇ使用したほかは、上記（インフュージョン反応１）と同様の手順にて、上記ＰＣＲ増幅産物ｖｅｃｔｏｒ２とＰＣＲ増幅産物ｉｎｓｅｒｔ２とを連結し、インフュージョン反応液５を調製した。
（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐｈＩＦＮｇ３３のＤＮＡの配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記インフュージョン反応液３（２μＬ）を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおけるヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ６９Ｌ２０−ヒトＩＦＮ−γタンパク質−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐｈＩＦＮｇ３３と名付けた。ｐｈＩＦＮｇ３３のプラスミド構成を図４（ａ）に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換３）
上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドｐｈＩＦＮｇ３３（６０５ｎｇ）を用いたことのほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐｈＩＦＮｇ３３株（ｈＩＦＮｇ３３株という）とした。
上記ｐｈＩＦＮｇ３３を鋳型として、表１記載のＧＡ５＿ｐｒｉｍｅｒ＿ｒｅｖ（フォワード）及びＧＡ１＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７５℃にて１分２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約１．２ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物Ｃを調製した。
上記ｐｈＩＦＮｇ３３を鋳型として、表１記載のＧＡ２＿ｐｒｉｍｅｒ（フォワード）及びＧＡ６＿ｐｒｉｍｅｒ（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７５℃にて３分２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約３．３ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物Ｄを調製した。
（インフュージョン反応６）
ＰＣＲ増幅産物Ｃを１８ｎｇ、ＰＣＲ増幅産物Ｄを５０ｎｇ使用したほかは、上記（インフュージョン反応１）と同様の手順にて、上記ＰＣＲ増幅産物ＣとＰＣＲ増幅産物Ｄとを連結し、インフュージョン反応液６を調製した。
（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐｈＩＦＮｇ３３ＴＬのＤＮＡの配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記インフュージョン反応液６を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおけるヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ６９Ｌ２０−ヒトＩＦＮ−γタンパク質−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐｈＩＦＮｇ３３ＴＬと名付けた。ｐｈＩＦＮｇ３３ＴＬのプラスミド構成を図４（ｂ）に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換４）
上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドｐｈＩＦＮｇ３３ＴＬ（４３５ｎｇ）を用いたことのほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株（ｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株という）とした。
［実施例４］
［ＡＧ８ＴＬ株におけるｈＴＮＦ−α及びｈＩＦＮ−γの分泌確認］
ＡＧ８ＴＬ株の培養上清中のヒトＴＮＦ−αタンパク質とヒトＩＦＮ−γタンパク質の分泌の有無をＥＬＩＳＡ法にて以下のとおり確認した。陰性コントロール株としてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株（以下、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株という）についても同様に実施した。
（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）
上記ＡＧ８ＴＬ株、ＴＮＦ１１株、及びｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株を、スペクチノマイシン（終濃度７５μｇ／ｍＬ）及びビタミンＣ添加液（１００ｍＬあたりアスコルビン酸３５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物２ｇ及び炭酸ナトリウム１１ｇを含む溶液）１００μＬを添加したＭＲＳ（ベクトン・ディッキンソン社製）液体培地１０ｍＬに植菌し、３７℃にて２４時間嫌気培養し、活性化培養液とした。次に、ＤＭＥＭ（Ｃａｔ Ｎｏ．１１８８５−０８４：ライフテクノロジーズ社製)：ＭＲＳを９：１の割合で混合した培地２０ｍＬに、ビタミンＣ添加液１００μＬ、スペクチノマイシンを７５μｇ／ｍＬになるよう添加し、上記活性化培養液１００μＬを植菌した。これを３７℃にて１８時間嫌気培養した。
（培養上清の回収及びＥＬＩＳＡ）
上記嫌気培養後の各株の培養液を遠心分離後、各株の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡに供した。同様の操作をＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株についても行い、陰性コントロールとした。ＴＮＦ−α測定用のＥＬＩＳＡキットとしては、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、ｈＩＦＮ−γ測定用のＥＬＩＳＡキットとしては、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−γ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＥＬＩＳＡの操作は、各ＥＬＩＳＡキットの製品マニュアルにしたがって実施した。結果を以下の表２に示す。
（結果）
表２から明らかなとおり、ＡＧ８ＴＬ株の培養上清中には、ｈＴＮＦ−αタンパク質とｈＩＦＮ−γタンパク質との両方がみとめられた。陽性対照の単独発現株であるＴＮＦ１１株培養上清中にはｈＴＮＦ−αタンパク質がみとめられ、ｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株の培養上清中にはヒトＩＦＮ−γタンパク質がみとめられた。
［実施例５］
［ＡＧ８ＴＬ株のＫＰＬ−１細胞増殖抑制活性の検討］
（培養上清粗精製物の調製）
実施例４の（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）と（培養上清の回収及びＥＬＩＳＡ）と同様の手順にて調製した上記ＡＧ８ＴＬ株、ＴＮＦ１１株、及びｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株の培養上清各７ｍＬをアミコンウルトラ−４，ＭＷＣＯ：１０ｋ（ミリポア社製）を用いて濃縮後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）にて３回洗浄、濃縮し、０．５ｍＬずつ各株の培養上清粗精製物として調製した。陰性コントロール株としてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の培養上清粗精製物についても同様に調製した。上記各株の培養上清粗精製物を細胞増殖抑制活性の測定に使用した。ｈＴＮＦ−α及びｈＩＦＮ−γの濃度は、上記ＴＮＦ−α測定用のＥＬＩＳＡキットと上記ｈＩＦＮ−γ測定用のＥＬＩＳＡキットを用いて見積もった。
（ＫＰＬ−１細胞の調製及び被験サンプルの添加）
ヒト乳癌細胞株であるＫＰＬ―１細胞（川崎医科大学紅林淳一教授より供与)を使用して、細胞増殖抑制活性の測定を行った。ＫＰＬ−１細胞を１００ｍｍペトリディッシュにて１０％ウシ胎児血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）／ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（シグマ−アルドリッチ社製）で培養した。かかる試験培地を除去後、ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）にて洗浄し、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ライフテクノロジーズ社製）を添加して細胞を回収し、遠心分離後、上清を除去し、上記試験培地にて６×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
上記細胞懸濁液を９６穴プレートの各ウェルに０．１ｍＬずつ分注し、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーターにて培養を開始した。翌日、上記試験培地にさらにＡＧ８ＴＬ株培養上清粗精製物（２０ｎｇ／ｍＬｈＩＦＮ−γ、５１．１ｎｇ／ｍＬｈＴＮＦ−αを含む）を添加した培地と交換し、刺激を開始した。ＡＧ８ＴＬ株の濃度と同じ濃度となるようにＴＮＦ１１株又はｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株の培養上清粗精製物を添加した各培地を陽性対照として同様に処理した。刺激開始から４日後に培地を除去し、１０分の１量のＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇキット−８（同仁化学研究所製）を添加した培地と交換して、さらに３時間反応させた。反応後、マルチモードプレートリーダー（ＤＳファーマバイオメディカル社製）にて４５０ｎｍ及び６３０ｎｍ（参照波長）での吸光度を測定した。ブランクは、培地とＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇキット−８のみを添加した細胞非添加ウェルの吸光度を差し引いたものとして算出した。なお、上記各培養上清粗精製物を添加せずにＫＰＬ―１細胞の培養を続けた試験培地における値を無処理区の吸光度として１００％とし、各ＫＰＬ−１細胞の増殖率を算出した。結果を図５に示す。
（結果）
図５から明らかなとおり、ＡＧ８ＴＬ株分泌物は、ＴＮＦ１１株単独又はｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株単独の分泌物に比べ、ＫＰＬ−１細胞の増殖を顕著に抑制した。すなわち、分泌物がｈＴＮＦ−αであるＴＮＦ１１株において増殖率は８９．９％を示し、分泌物がｈＩＦＮ−γであるｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株において増殖率は８３％を示したのに対し、分泌物がｈＴＮＦ−αとｈＩＦＮ−γであるＡＧ８ＴＬ株において増殖率は３５．５％を示し、ＡＧ８ＴＬ株がヒト乳癌細胞株に対して強い増殖抑制効果が有することが確認された。かかる結果は、ｈＴＮＦ−α分泌物とｈＩＦＮ−γ分泌物との併用効果によるものと考えられる。
［実施例６］
［ＡＧ８ＴＬ株のＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞増殖抑制活性の検討］
ＫＰＬ−１細胞の代わりに、ヒト膵臓癌由来細胞ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を用いたほかは、実施例５と同様の手順にてＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞に対する増殖抑制活性を検討した。ただし、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞の９６穴プレートへ分注した細胞懸濁液の播種濃度は、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。結果を図６に示す。
（結果）
図６から明らかなとおり、ＡＧ８ＴＬ株分泌物は、ＴＮＦ１１株単独又はｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株単独の分泌物に比べ、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞の増殖を顕著に抑制した。すなわち、分泌物がｈＴＮＦ−αであるＴＮＦ１１株において増殖率は５１．６％を示し、分泌物がｈＩＦＮ−γであるｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株において増殖率が７５．４％を示したのに対し、分泌物がｈＴＮＦ−αとｈＩＦＮ−γであるＡＧ８ＴＬ株において増殖率は２４．２％を示し、ＡＧ８ＴＬ株がヒト膵臓癌細胞株に対して強い増殖抑制効果が有することが確認された。かかる結果は、ｈＴＮＦ−α分泌物とｈＩＦＮ−γ分泌物との併用効果によるものと考えられる。
［実施例７］
［ＡＧ８ＴＬ株の増殖抑制活性の中和抗体による特異性検討］
ＡＧ８ＴＬ株の培養上清粗精製物の細胞増殖抑制活性が、ｈＴＮＦ−α及びｈＩＦＮ−γが分泌されたことによるものであることを確認するため、中和抗体であるＨｕｍａｎ ＩＦＮ−γ Ａｎｔｉｂｏｄｙ及びＨｕｍａｎ ＴＮＦ−α Ａｎｔｉｂｏｄｙ（共にＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた検討を以下のとおり行った。
実施例６と同様の手順にて、９６穴プレートにＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を播種し、その翌日にＡＧ８ＴＬ株、ＴＮＦ１１株、ｈＩＦＮｇ３３ＴＬ株、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株（陰性対照）のいずれかの培養上清粗精製物と、以下の表３に示す抗体との組合せを添加した培地と交換した。培地への添加物は以下の表３に示す。実施例５と同様の手順にて、細胞増殖率を算出した。結果を図７に示す。
（結果）
図７からも明らかなとおり、ＡＧ８ＴＬ株培養上清粗精製物添加時のＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞増殖率は１５．３％を示したが、抗ｈＩＦＮ−γ抗体単独添加時、抗ｈＴＮＦ−α抗体単独添加時の細胞増殖率は、それぞれ３１．８％、４４．４％と増加した。抗ｈＩＦＮ−γ抗体及び抗ｈＴＮＦ−α抗体の両抗体添加時の細胞増殖率は７４．１％とさらに増加した。これは、ＡＧ８ＴＬ株の分泌したｈＴＮＦ−α及びｈＩＦＮ−γの生物活性が抗体により中和された結果であり、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞増殖抑制は、ＡＧ８ＴＬ株の分泌するｈＴＮＦ−α及びｈＩＦＮ−γによるものであると考えられる。
［実施例８］
［抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＰＣ１株及びＣＰ１株の作製］
（概要）
抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を分泌する発現カセット（抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセット）と、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧを分泌する発現カセット（抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセット）とを含み、大腸菌−ビフィドバクテリウム属細菌シャトルベクターである、共発現プラスミドｐＰＣ１及びｐＣＰ１を作製した。かかるｐＰＣ１とｐＣＰ１とを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーション法により行い、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＰＣ１株とＣＰ１株とを取得した。実施例８において使用したプライマーを以下の表４に示す。
（抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の作製）
ｐＰＣ１及びｐＣＰ１の作製にあたり、まず、抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の分泌型プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を作製した。
（抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセットの構成）
抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセットとして、（１）ＨｕプロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカー連結体ＳＰ７Ｌ２０をコードするＤＮＡ、（３）抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のアミノ酸配列（重鎖配列、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３、軽鎖配列を含む）をコードするＤＮＡ、及び（４）Ｈｉｓタグ配列をコードするＤＮＡ、（５）ＨｕターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（５）を下流（３’末端）側として、（１）〜（５）のＤＮＡを順次含むカセット（上記抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のアミノ酸配列における重鎖配列、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３、軽鎖配列を含む）をコードするＤＮＡの塩基配列は、以下の表５（１）に示される文献を参照した。
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の人工ＤＮＡ合成）
配列番号１１に示された抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３については、ジェンスクリプトジャパン株式会社にて、大腸菌用プラスミドｐＵＣ５７にサブクローニングされ、プラスミドｐＵＣ５７−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３として人工遺伝子合成された。
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片の調製１）
上記プラスミドｐＵＣ５７−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（５００ｐｇ）を鋳型として、上記表４に記載のＩｎｓ−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｆ１プライマー（フォワード）及びＩｎｓ−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｒ１プライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量３０μＬとして、ＳＴＡＲキットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて６０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。増幅されたインサートＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（キアゲン株式会社製）（以下、「ＱＩＡＧｅｌ」を用いて精製し、約０．７ｋｂｐの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片（１）を調製した。
（ＳＰ７Ｌ２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクター断片（１）の調製）
配列番号１４に記載されているベクター直鎖化断片（５００ｐｇ）を鋳型として、上記表４に記載されている、ＴＧＡ−Ｈｕ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ−Ｆプライマー（フォワード）及びｖｅｃ−ＳＰ７Ｌ２０−Ｒ１プライマー（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量３０μＬとして、ＳＴＡＲキットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムは、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて５分を１サイクルとして、３０サイクル行った。増幅されたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにて電気泳動した後、ＱＩＡＧｅｌを用いて精製し、約４．０ｋｂｐの５’−Ｈｕターミネーター−ｐＴＢ６ｒｅｐ ｕｎｉｔ−ＳＰＣＭｒ−ｐＵＣｏｒｉ−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−３’ベクター断片（１）を調製した。
（インフュージョン反応７）
上記で調製されたベクター断片（１）と上記抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片（１）とを上記Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキットを用いて連結した。すなわち、マイクロチューブに、キット内の上記ベクターとインサートとを１：５のモル比にて添加後、２μＬの５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｅｍｉｘを添加し、反応液容量を１０μＬに調整した。これを５０℃にて１５分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液７を調製した。
（大腸菌の形質転換及びｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のＤＮＡ配列確認）
５μＬの上記インフュージョン反応液７を用いたほかは、前記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて、上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。ただし、形質転換後、寒天培地上に形成された大腸菌コロニーを７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地にて３０℃にて一晩振とう培養した。抽出したプラスミドにおける抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３と名付けた。ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の構成を図８（Ａ）に、配列を配列番号６に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換５）
上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（５５０ｎｇ）を用いたことのほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３株（以下ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３株という）とした。
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２分泌プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の作製）
ｐＰＣ１及びｐＣＰ１の作製にあたり、まず、ＦＬＡＧタグがない、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の分泌型プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を作製した。
（抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２分泌発現カセット及び抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットの構成）
抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２分泌発現カセットとして、（１）ＨｕプロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカー連結体ＳＰ７Ｌ２０をコードするＤＮＡ、（３）抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のアミノ酸配列（重鎖配列、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３、軽鎖配列を含む）をコードするＤＮＡ、及び（４）Ｈｉｓタグ配列をコードするＤＮＡ、（５）ＨｕターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（５）を下流（３’末端）側として、（１）〜（５）のＤＮＡを順次含むカセット（上記抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のアミノ酸配列における重鎖配列、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３、軽鎖配列を含む）をコードするＤＮＡの塩基配列は、上記の表５（２）に示される文献を参照した。
また、抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットとして、（１）ＨｕプロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカー連結体ＳＰ７Ｌ２０をコードするＤＮＡ、（３）抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のアミノ酸配列（重鎖配列、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３、軽鎖配列を含む）をコードするＤＮＡ、及び（４）ＦＬＡＧタグ配列をコードするＤＮＡ、（５）ＨｕターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（５）を下流（３’末端）側として、（１）〜（５）のＤＮＡを順次含むカセット（上記抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のアミノ酸配列における重鎖配列、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３、軽鎖配列を含む）をコードするＤＮＡの塩基配列は、上記の表５（３）に示される文献を参照した。
（ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の人工ＤＮＡ合成）
配列番号１２に示されたｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２については、ジェンスクリプトジャパン株式会社にて、大腸菌用プラスミドｐＵＣ５７にサブクローニングされ、プラスミドｐＵＣ５７−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２として人工遺伝子合成された。
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２インサート断片の調製）
上記プラスミドｐＵＣ５７−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を鋳型として、上記表４に記載のＩｎｓ−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−Ｆ１（フォワード）及びＩｎｓ−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いたほかは、上記（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片の調製１）と同様の手順にて、約０．８ｋｂｐの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２インサート断片を調製した。
（インフュージョン反応８）
上記ベクター断片（１）と上記抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２インサート断片とを用いたほかは、上記（インフュージョン反応７）におけるインフュージョン反応と同様の手順にてインフュージョン反応液を調製した。
（大腸菌の形質転換及びｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のＤＮＡ配列確認）
５μＬの上記インフュージョン反応液８を用いたほかは、前記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて、大腸菌ＨＳＴ０８コンピテント細胞の形質転換を行い、抽出したプラスミドにおける抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列を決定するためシーケンス反応を行い、抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２と名付けた。ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の構成を図８（Ｂ）に、配列を配列番号７に示す。
［抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ単独発現ビフィドバクテリウム属細菌株の作製］
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットを含むベクター断片の調製）
上記プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２（５００ｐｇ）を鋳型として、上記表４に記載のｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−ＦＬＡＧ−Ｆ１（フォワード）及びｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−ＦＬＡＧ−Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、ＰＣＲ産物の両末端１５ｂｐずつが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量３０μＬとして、前記ＳＴＡＲキットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて５分を１サイクルとして、３０サイクル行い、約４．８ｋｂｐの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットを含むベクター断片増幅産物を調製した。
（インフュージョン反応９）
上記で調製された抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットを含むベクター断片増幅産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキットを用いてインフュージョン反応を行い、自己閉環させた。すなわち、マイクロチューブに、上記ベクター断片増幅産物５μＬとＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２μＬを混合した反応液を３７℃にて１５分間、引き続き８０℃にて１５分間保温した。次にこの反応液の０．５μＬと、２μＬの５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｅｍｉｘを添加し、反応液容量を１０μＬに調整した。これを５０℃にて１５分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液９を調製した。
（大腸菌の形質転換及びｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧのＤＮＡ配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記５μＬのインフュージョン反応液９を用いて上記大腸菌ＨＳＴ０８コンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおける抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−ＦＬＡＧタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧと名付けた。ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧの構成を図８（Ｃ）に、配列を配列番号８に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換６）
２５６ｎｇの上記プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧを用いたほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ株（以下ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２株という）とした。
［抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２共発現株の作製］
抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の両方を分泌する共発現株ＰＣ１株及びＣＰ１株を作製した。ＰＣ１株は、図９（ａ）に示すように、大腸菌複製起点ｐＵＣｏｒｉの３’末端側に続く分泌発現カセットが、抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセット、これに続いて抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２分泌発現カセットの順に配置されたプラスミドを有しており、ＣＰ１株は図９（ｂ）に示すように、大腸菌複製起点ｐＵＣｏｒｉの３’末端側に続く分泌発現カセットが、抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２分泌発現カセット、これに続いて抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセットの順に配置されたプラスミドを有している。
［ＰＣ１株の作製］
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧインサート断片の調製）
プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ（５００ｐｇ）（配列番号８）を鋳型として、上記表４記載のＩｎＦ＿Ｈｕ Ｐｒｏｍ＿Ｆ１（フォワード）及びＩｎＦ＿Ｈｕ Ｔｅｒｍ−ｐＴＢ６＿Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量３０μＬとして、上記ＳＴＡＲキットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて２分を１サイクルとして、３０サイクル行った。増幅されたインサートＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにて電気泳動した後、ＱＩＡＧｅｌを用いて精製し、約１．４ｋｂｐの抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧインサート断片を調製した。
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセットを含むベクター断片の調製）
上記プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（５００ｐｇ）（配列番号６）を鋳型として、上記表４記載のＩｎＦ＿ｐＴＢ６ｒｅｐ＿Ｆ１（フォワード）及びＩｎＦ＿ＨｕＴｅｒｍ−ＨｕＰｒｏｍ＿Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計した。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量３０μＬとして、上記ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）キットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて５分を１サイクルとして、３０サイクル行った。増幅されたインサートＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにて電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ キットを用いて精製し、約４．７ｋｂｐの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセットを含むベクター断片（２）を調製した。
（インフュージョン反応１０）
上記で調製されたベクター断片（２）と上記抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧインサート断片とを上記Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ キットを用いて連結した。すなわち、マイクロチューブに、キット内の上記ベクターとインサートとを１：３のモル比にて添加後、２μＬの５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｅｍｉｘを添加し、反応液容量を１０μＬに調整した。これを５０℃にて１５分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液１０を調製した。
（大腸菌の形質転換及びｐＰＣ１のＤＮＡ配列確認）
２μＬの上記インフュージョン反応液１０を用いたほかは、前記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて、上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおける抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）及び抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−ＦＬＡＧタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドをｐＰＣ１と名付けた。ｐＰＣ１の構成を図９（ａ）に、ｐＰＣ１のＤＮＡ配列を配列番号９に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換７）
２５０ｎｇの上記プラスミドｐＰＣ１を用いたほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ１株（以下ＰＣ１株という）とした。
［ＣＰ１株の作製］
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片の調製２）
上記プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（５００ｐｇ）（配列番号６）を鋳型として、上記表４記載のＩｎＦ＿ＨｕＰｒｏｍ＿Ｆ１（フォワード）及びＩｎＦ＿ＨｕＴｅｒｍ−ｐＴＢ６＿Ｒ１リバース）のプライマーセットを用いたほかは、上記（抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧインサート断片の調製）と同様の手順でＰＣＲ増幅及びゲル抽出キットによる精製を行った。約１．４ｋｂｐの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片（２）を調製した。
（抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットを含むベクター断片の調製）
上記プラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ（配列番号８）を鋳型として、上記表４記載のＩｎＦ＿ｐＴＢ６ｒｅｐ＿Ｆ１（フォワード）及びＩｎＦ＿ＨｕＴｅｒｍ−ＨｕＰｒｏｍ＿Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いたほかは、上記（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片の調製２）と同様の手順でＰＣＲ増幅及びゲル抽出キットによる精製を行った。約４．８ｋｂｐの抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットを含むベクター断片（３）を調製した。
（インフュージョン反応１１）
上記で調製されたベクター断片（３）と上記抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３インサート断片（２）を用いたほかは、上記（インフュージョン反応１０）と同様の手順でインフュージョン反応液１１を調製した。
（大腸菌の形質転換及びｐＣＰ１のＤＮＡ配列確認）
２μＬの上記インフュージョン反応液１１を用いたほかは、前記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて、上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおける抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓタグ−Ｈｕターミネーター−３’）と抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセット（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰ７Ｌ２０−抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−ＦＬＡＧタグ−Ｈｕターミネーター−３’）の配列決定を上記（大腸菌の形質転換及びｐＰＣ１のＤＮＡ配列確認）と同様の手順で行った。抽出したプラスミドをｐＣＰ１と名付けた。ｐＣＰ１の構成を図９（ｂ）に、ｐＣＰ１のＤＮＡ配列を配列番号１０に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換８）
２５０ｎｇの上記プラスミドｐＣＰ１を用いたほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＣＰ１株（以下ＣＰ１株という）とした。
［実施例９］
［ＰＣ１株及びＣＰ１株における抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ分泌確認］
ＰＣ１株及びＣＰ１株の培養上清中の抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（ヒスチジンタグ付）及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２（ＦＬＡＧタグ付）の有無をウェスタンブロッティング法にて以下のとおり確認した。陰性コントロール株としてＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株についても同様に実施した。
（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）
上記ＰＣ１株及びＣＰ１株、ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３株、ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２株、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株について実施例４（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）と同様の手順にて上記ビフィドバクテリウム属細菌を培養し、培養上清を回収した。この培養上清中のタンパク質をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ、和光純薬工業株式会社製）により沈殿させ、アセトンにて洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーに溶解し、９５℃にて３分間熱処理を行い、各培養上清濃縮物とした。
（ウェスタン解析）
上記各培養上清濃縮物（培養液０．１ｍＬ相当）をミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸＴＭゲル（４〜２０％）（バイオラッド社製）にて電気泳動し、ゲルをＰＶＤＦ膜（メンブラン）（ｉＢｌｏｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｔａｃｋｓ、ライフテクノロジーズ社製）にｉＢｌｏｔトランスファーデバイス（ライフテクノロジーズ社製）を用いて転写した。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜をブロッキング（２％ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製）ｉｎ ＴＴＢＳ）した。電気泳動及び膜へのブロッティングは、２セット行い、一枚目のＰＶＤＦ膜は抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を検出するために一次抗体として抗ヒスチジン抗体（ＴＨＥ Ｈｉｓ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ，Ｍｏｕｓｅ）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）を、二次抗体としてＥＣＬ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｌｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥヘルスケア社製）を使用した。もう一つのＰＶＤＦ膜は抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を検出するために一次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ）（シグマ社製）を、二次抗体としてＥＣＬ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｌｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥヘルスケア社製）を使用した。抗体反応終了後のメンブランを、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｕｌｔｒａ（パーキンエルマー社製）を用いて発光させた。これをイメージング装置ＭＹＥＣＬ Ｉｍａｇｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて解析した。結果を図１０に示す。
（結果）
図１０から明らかなとおり、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のＣ末端にＨｉｓタグ融合している抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセット及び、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のＣ末端にＦＬＡＧタグ融合している抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧ分泌発現カセットを含むＰＣ１株（Ａ、Ｂともレーン１）及びＣＰ１株（Ａ、Ｂともレーン２）の培養上清中には、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３と抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の両方がみとめられた。また、ＰＣ１株（Ａ：レーン１）とＣＰ１株（Ａ：レーン２）のｈＰＤ−１ｓｃＦｖ分泌タンパク質の大きさとｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３単独発現株（Ａ：レーン３）のｈＰＤ−１ｓｃＦｖ分泌タンパク質の大きさは同じであり、ＰＣ１株（Ｂ：レーン１）とＣＰ１株（Ｂ：レーン２）のｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ分泌タンパク質の大きさとｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２単独発現株（Ｂ：レーン４）のｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ分泌タンパク質の大きさは同じであった。したがって、共発現ビフィドバクテリウム属細菌株ＰＣ１株及びＣＰ１株は培養上清中に抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖと抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖの両方を分泌できる組換えビフィドバクテリウム属細菌株であることが確認された。
［実施例１０］
［ＰＣ１株が分泌する抗体のｈＰＤ−１及びｈＣＴＬＡ−４への結合確認］
上記共発現株ＰＣ１株の培養上清より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）との結合活性の有無、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のヒトＣＴＬＡ−４との結合活性の有無につき、ＥＬＩＳＡ法にて確認した。
９６穴プレートに、１×ＰＢＳにて１μｇ／ｍＬに調整したｈＰＤ−１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ｈＰＤ−１ ＦｃＣｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ｈＣＴＬＡ−４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ｍＰＤ−１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ｈＰＤ−１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びｍＣＴＬＡ−４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）をそれぞれ１００μＬずつ分注し、４℃にて一晩静置することで固相化した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。上記プレートに１％ＢＳＡ溶液を３５０μＬずつ分注し室温にて２時間静置することでブロッキングを行った。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２をシグナル増強試薬（Ｓｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＨＩＫＡＲＩ、Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製）にて１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１ｎｇ／ｍＬに調整し、１００μＬずつ上記ブロッキング終了後プレートに分注した。ブランクのウェルにはシグナル増強試薬のみを１００μＬ分注した。プレートにシールを貼り、室温にて２時間静置後、固相化したｈＰＤ−１、ｍＰＤ−１及びｈＣＴＬＡ−４と、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３とを反応させた。同様に固相化したｈＣＴＬＡ−４、ｍＣＴＬＡ−４及びｈＰＤ−１と、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２とを反応させた。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
二次抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓｔａｇ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＭＢＬ社製）をシグナル増強試薬で２０００倍に薄め、これを抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を反応させたウェルに１００μＬ分注した。同様に、二次抗体（ＴＨＥ（登録商標）ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｂｉｏｔｉｎ］，ｍＡｂ，ｍｏｕｓｅ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）をシグナル増強試薬で２５００倍に薄め、これを抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を反応させたウェルに１００μＬ分注した。プレートにシールを貼り、室温にて２時間静置した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
アビジン−ビオチン標識酵素複合体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ社製）としてＡ液及びＢ液を３滴ずつシグナル増強試薬７．５ｍＬに添加した。これを各プレートに１００μＬずつ分注後、プレートにシールを貼り、室温にて３０分間静置した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
検出試薬としてＣｏｌｏｒ ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ及びＣｏｌｏｒ ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を等量ずつ混ぜ、２００μＬずつ分注し、遮光して室温にて２０分静置した。正確に２０分経過後Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を５０μＬずつ添加し呈色反応を停止した。４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ（参照波長）での吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ法によるヒトＰＤ−１固相化プレートヘの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の結合の結果を以下の表６及び図１１に示す。同様に、ヒトＣＴＬＡ−４固相化プレートヘの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２の結合の結果を以下の表７及び図１２に示す。
（結果）
表６及び図１１から明らかなとおり、共発現株ＰＣ１株の培養上清より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３はｈＰＤ−１と結合した。また、表７及び図１２より明らかなとおり、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２はｈＣＴＬＡ−４と結合した。一方、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３はｈＣＴＬＡ−４及びｍＰＤ−１とは結合せず、また抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２はｈＰＤ−１及びｍＣＴＬＡ−４とは結合しなかった。このことから、共発現株ＰＣ１株が分泌した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２は、対応する抗原タンパク質と特異的に結合していることが確認された。
［実施例１１］
［ヒトＰＤ−１に対するヒトＰＤ−Ｌ１の結合反応における抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖの競合的阻害活性］
ＰＤ−１にリガンドＰＤ−Ｌ１が結合すると、Ｔ細胞に負のシグナルが伝達され、免疫反応を抑制する（免疫寛容）とされている。そこで、ヒトＰＤ−１に対するヒトＰＤ−Ｌ１の結合反応における抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖの競合的阻害活性について検討した。
上記共発現株ＰＣ１株の培養上清より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を用いて、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）に対するヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）との結合に対する競合的結合阻害活性の確認をＥＬＩＳＡ法により行った。陰性コントロールとして抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を用いた。
９６穴プレートに、１×ＰＢＳにて１μｇ／ｍＬに調整したｈＰＤ−１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨｕｍａｎＰＤ−１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１００μＬずつ分注し４℃にて一晩静置することで固相化した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
上記プレートに１％ＢＳＡ溶液を３５０μＬずつ分注し室温にて２時間静置することでブロッキングを行った。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。ｈＰＤ−Ｌ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨｕｍａｎＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１ ＦｃＣｈｉｍｅｒａ）を上記シグナル増強試薬にて２０００ｎｇ／ｍＬに調整した。
ビフィドバクテリウム属細菌より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を上記シグナル増強試薬にて２００００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ及び２０ｎｇ／ｍＬに調整し、１２０μＬずつ調整したｈＰＤ−Ｌ１と等量混合し、１００μＬずつ上記ブロッキング終了後プレートに分注した。陰性コントロールとして、ビフィドバクテリウム属細菌より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２についても、上記と同様に調整した。ブランクのウェルにはシグナル増強試薬のみを１００μＬ分注した。プレートにシールを貼り、室温にて２時間静置し、固相化したｈＰＤ−１に対して抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３と混合したｈＰＤ−Ｌ１を反応した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。ｈＰＤ−Ｌ１に対する二次抗体（Ｂｉｏｔｉｎａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ２７４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）をシグナル増強試薬で０．２μｇ／ｍＬに調整し、これを１００μＬずつ分注した。プレートにシールを貼り、室温にて３０分間静置した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
上記アビジン−ビオチン標識酵素複合体としてＡ液及びＢ液を１滴ずつシグナル増強試薬２．５ｍＬに添加した。これを１００μＬずつ分注し、プレートにシールを貼り、室温にて３０分間静置した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。検出試薬としてＣｏｌｏｒ ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ及びＣｏｌｏｒ ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ（Ｒ＆Ｄ）を等量ずつ混ぜ、２００μＬずつ分注し、遮光して室温にて２０分静置した。正確に２０分経過後Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒ＆Ｄ）を５０μＬずつ添加し呈色反応を停止した。４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ（参照波長）での吸光度を測定した。測定結果を以下の表８及び図１３に示した。
（結果）
表８及び図１３から明らかなとおり、１０００ｎｇ／ｍＬのｈＰＤ−Ｌ１のｈＰＤ−１への結合に対する阻害率は、１００００ｎｇ／ｍＬの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３で６９．３％であった。以上の結果より、１０００ｎｇ／ｍＬのｈＰＤ−Ｌ１のｈＰＤ−１への結合に対して、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３は１００００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で競合的に結合阻害することが示された。
[実施例１１−１]
［ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒトＣＤ８０及びヒトＣＤ８６との結合反応におけるｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖの競合的阻害活性の確認］
上記共発現株ＰＣ１株の培養上清より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を用いて、ヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）に対するヒトＣＤ８０（ｈＣＤ８０）及びヒトＣＤ８６（ｈＣＤ８６）との結合に対する競合的結合阻害活性の確認をＥＬＩＳＡ法により行った。陰性コントロールとして抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を用いた。
９６穴プレートに、１×ＰＢＳにて１μｇ／ｍＬに調整したｈＣＴＬＡ−４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ，ｃａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を１００μＬずつ分注し４℃にて一晩静置することで固相化した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
上記プレートに１％ＢＳＡ溶液を３５０μＬずつ分注し、室温にて２時間静置することでブロッキングを行った。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。ｈＣＤ８０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｂ７−１／ＣＤ８０ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ）及びｈＣＤ８６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｂ７−２／ＣＤ８６ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ）を上記シグナル増強試薬にて２０００ｎｇ／ｍＬに調整した。
ビフィドバクテリウム属細菌より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を上記シグナル増強試薬にて２００００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ及び２０ｎｇ／ｍＬに調整し、１２０μＬずつ調整したｈＣＤ８０及びｈＣＤ８６と等量混合し、１００μＬずつ上記ブロッキング終了後プレートに分注した。陰性コントロールとして、ビフィドバクテリウム属細菌より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３についても、上記と同様に調整した。ブランクのウェルにはシグナル増強試薬のみを１００μＬ分注した。プレートにシールを貼り、室温にて２時間静置し、固相化したｈＣＴＬＡ−４に対して抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２と混合したｈＣＤ８０及びｈＣＤ８６を反応した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
ｈＣＤ８０に対する二次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｍａｎ Ｂ７−１／ＣＤ８０ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びｈＣＤ８６に対する二次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｂ７−２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を上記シグナル増強試薬で２．５μｇ／ｍＬ及び０．５μｇ／ｍＬに調整し、これを１０μＬずつ分注した。プレートにシールを貼り、室温にて３０分間静置した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。
上記アビジン−ビオチン標識酵素複合体として上記Ａ液及びＢ液を３滴ずつシグナル増強試薬７．５ｍＬに添加した。これを１００μＬずつ分注し、プレートにシールを貼り、室温にて３０分間静置した。液を除去後、１×ＰＢＳを３５０μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄した。検出試薬としてＣｏｌｏｒ ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ及びＣｏｌｏｒ ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ（Ｒ＆Ｄ）を等量ずつ混ぜ、２００μＬずつ分注し、遮光して室温にて２０分静置した。正確に２０分経過後Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒ＆Ｄ）を５０μＬずつ添加し呈色反応を停止した。４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ（参照波長）での吸光度を測定した。結果を以下の表９及び表１０並びに図１４及び図１５に示す。
（結果）
表９及び表１０並びに図１４及び図１５から明らかなとおり、１０００ｎｇ／ｍＬのｈＣＤ８０及びｈＣＤ８６のｈＣＴＬＡ−４への結合に対する阻害率は、１０００ｎｇ／ｍＬの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２でそれぞれ４３．７％及び７０．０％であり、１００００ｎｇ／ｍＬの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２でそれぞれ８１．７％及び１００．０％であった。１０００ｎｇ／ｍＬのｈＣＤ８０及びｈＣＤ８６のｈＣＴＬＡ−４への結合に対して、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２は１０００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で競合的に結合阻害することが示された。
［実施例１２］
［共発現ビフィドバクテリウム属細菌より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖの細胞への結合：抗原過剰発現細胞株を用いた検討］
上記共発現株ＰＣ１株の培養上清より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖとヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）発現細胞との結合の有無、及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖとヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）発現細胞との結合の有無を、以下の抗原タンパク質を過剰発現させた細胞を用いてフローサイトメトリー法で検討した。
ｈＰＤ−１過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈＰＤ−１はラットＣＤ２とバイシストロニックに発現）及び、ｈＣＴＬＡ−４過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈＣＴＬＡ−４はラットＣＤ２とバイシストロニックに発現）を使用した。ｈＰＤ−１過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｈＣＴＬＡ−４過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、非働化した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地にて培養を行い、１００ｍｍディッシュ（グライナー・ジャパン社製）に播種した。ｈＰＤ−１過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｈＣＴＬＡ−４過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清を除去し、ＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋フリー・リン酸緩衝液）にて２度洗浄し、ＰＢＳで１０倍に希釈したトリプシン・ＥＤＴＡ溶液（和光純薬工業社製）１ｍＬを加え１分間室温にて静置後、１０ｍＬの非働化した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、１５ｍＬ遠沈管（ＢＤファルコン社製）に移した。低速遠心機（トミー精工社製）で１０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、上清を除去し、１ｍＬの非働化した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、細胞数を計測した。さらにＤＭＥＭ培地を添加し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに細胞懸濁液を調製し、１．５ｍＬチューブ（イナ・オプティカ社製）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｔｕｂｅになるように分注した。１．５ｍＬチューブに分注したｈＰＤ−１過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｈＣＴＬＡ−４過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を微量冷却遠心機（トミー精工社製）にて５０００ｒｐｍ、４℃にて１分間遠心分離後、上清を除去した。チューブに残った細胞のペレットを０．５ｍＬのＰＢＳにて２度洗浄後、組換えビフィドバクテリウム属細菌より精製し、１０μｇ／ｍＬに調製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２を各チューブに１００μＬ添加し、氷上にて３０分間静置した。３０分後、ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）を５００μＬチューブに加え、上記微量冷却遠心機にて５０００ｒｐｍ、４℃にて１分間遠心分離後、上清を除去し洗浄を行った。同様の操作をもう一度行い洗浄操作を２度行った。ＦＡＣＳバッファーにて０．５μｇ／ｍＬに希釈したａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（ＭＢＬ社製）及び、ａｎｔｉ−ＤＤＤＤＫ−ｔａｇ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（ＭＢＬ社製）１００μＬを１．５ｍＬチューブに添加後、ピペッティングにてよく混合し、氷上にて３０分間静置した。３０分後、ＦＡＣＳバッファーを５００μＬチューブに加え、上記微量冷却遠心機にて５０００ｒｐｍ、４℃にて１分間遠心分離後、上清を除去し洗浄を行った。同様の操作をもう一度行い洗浄操作を２度行った。５００μＬのＦＡＣＳバッファーを添加後、５ｍＬポリスチレンラウンドボトムチューブ（ベクトン・ディッキンソン社製）にＦＡＣＳバッファーにて懸濁した細胞を移した。ＦＡＣＳバッファーにて５μｇ／ｍＬに希釈したヨウ化プロピジウム溶液を５μＬ添加し、ＢＤ ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製）及びフローサイトメトリー解析ソフトウェアＫａｌｕｚａ ｖｅｒ１．２（ベックマン・コールター社製）にて解析を行った。ＰＣ１株より精製した抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のヒトＰＤ−１過剰発現細胞への結合の結果を図１６に示す。同様に、共発現株ＰＣ１株より精製した抗ＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２のヒトＣＴＬＡ−４過剰発現細胞への結合の結果を図１７に示す。
（結果）
図１６から明らかなとおり、ＰＣ１株より精製した抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３は、ヒトＰＤ−１高発現細胞（ラットＣＤ２高発現細胞）に特異的に結合することが確認された。同様に、図１７から明らかなとおり、ＰＣ１株より精製した抗ＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２は、ヒトＣＴＬＡ−４高発現細胞（ラットＣＤ２高発現細胞）に特異的に結合することが確認された。これらの結果より、共発現株ＰＣ１株より精製したｓｃＦｖは、ヒトＰＤ−１及びヒトＣＴＬＡ−４過剰発現細胞に特異的に結合することが確認された。
［実施例１３］
［抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γ共発現ビフィドバクテリウム属細菌株ＨＧ−２株の作製］
（概要）
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖを分泌する発現カセット（抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ分泌発現カセット）と、ｈＩＦＮ−γを分泌する発現カセット（ヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセット）とを含み、大腸菌ービフィドバクテリウム属細菌シャトルベクターである、共発現プラスミドｐＨＧ−２を作製した（図２）。かかるｐＨＧ−２を用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーション法により行い、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γ共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＨＧ−２株を取得した。実施例１３において使用したプライマーを以下の表１１に示す。
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ分泌発現カセットとして、（１）Ｐ３０プロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカー連結体ＳＰ７Ｌ２０をコードするＤＮＡ、（３）抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（４）Ｈｉｓタグ配列をコードするＤＮＡ、（５）ｄ００１３ターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（５）を下流（３’末端）側として、（１）〜（５）のＤＮＡを順次含むカセットを作製した。
（プラスミドｐＨＧ−２の作製）
プラスミドｐＨＧ−２の作製にあたり、まず、プラスミドｐＨＧ−１を作製した。
（プラスミドｐＨＧ−１の作製）
（ｈＩＦＮｇインサート断片の調製）
プラスミドｐｈＩＦＮｇ３３（配列番号１６）を鋳型として、上記表１１記載のＨｕ−ＨｕＴ＿ｉｎｓ＿Ｆ１（フォワード）及びＨｕＴ−ｐＴＢ６＿ｉｎｓ＿Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計された。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量２０μＬとして、ＳＴＡＲキットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて７２秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行い、約１．１ｋｂｐのｈＩＦＮｇインサート断片増幅産物を調製した。
（抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクター断片の調製）
ｐＰ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２（配列番号１５）を鋳型として、表１１記載のｐＴＢ６＿Ｖｅｃ＿Ｆ１（フォワード）及びＨｕ−ｔｅｒｍ＿Ｖｅｃ＿Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマー配列は、インサート断片とベクター断片の末端１５ｂｐが重複するように設計された。各プライマー濃度を０．２μＭ、反応容量２０μＬとして、ＳＴＡＲキットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとしては、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて４分４５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行い、約４．６ｋｂｐのベクター断片増幅産物を調製した。
（インフュージョン反応１２）
上記で調製した４．６ｋｂｐのベクター断片増幅産物及び約１．１ｋｂｐのインサート断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結した。まずＣｌｏｎｔｅｃｈ社のウェブサイトＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｏｌａｒ Ｒａｔｉｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｉｎｆｕｓｉｏｎ／ｍｏｌａｒＲａｔｉｏ．ｄｏ）にて必要なインサート量及びベクター量を算出し、ベクター：インサート＝１：２のモル比とした。５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｅｍｉｘ２μＬ、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １μＬ、インサート及びベクターの必要量を混合し、０．１×ＴＥバッファー（１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で反応系の総量を１０μＬとした。３７℃にて１５分間反応後、５０℃にて１５分間反応し、４℃に静置した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液１２を調製した。
（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＨＧ−１のＤＮＡ配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記インフュージョン反応液１２を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ分泌発現カセット及びヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットのＤＮＡ配列の配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドｐＨＧ−１と名付けた。プラスミドｐＨＧ−１のＤＮＡ配列を配列番号１７に示す。
（ｐＨＧ−２株の調製）
プラスミドｐＨＧ−１の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ発現分泌カセットのターミネーターをＨｕターミネーターからｄ００１３ターミネーターへ交換した。上記ｐＨＧ−１を鋳型として、上記表１１記載のＨｕ＿Ｖｅｃ＿Ｆ１（フォワード）及びｂＨＥＲ２−Ｈｉｓ＿Ｖｅｃ＿Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて５分４５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約５．６ｋｂｐのベクター断片増幅産物を調製した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−ＡのゲノムＤＮＡを鋳型として、上記表１１記載のｄ００１３＋Ｔ＿ｉｎｓ＿Ｆ１（フォワード）及びｄ００１３＋Ｔ＿ｉｎｓ＿Ｒ１（リバース）のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅のプログラムとして、９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて３５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃にて３０秒伸長反応を行ったほかは、上記（プラスミドｐＡＧ８の作製）と同様の手順にて、約１４４ｂｐのインサート断片増幅産物を調製した。
（インフュージョン反応１３）
上記で調製されたベクター断片とインサート断片を用いたほかは、上記（インフュージョン反応１０）と同様の手順でインフュージョン反応液１３を調製した。
（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＨＧ−２のＤＮＡの配列確認）
上記（大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて上記インフュージョン反応液１３を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ分泌発現カセット及びヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットのＤＮＡ配列の配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドｐＨＧ−２と名付けた。プラスミドｐＨＧ−２のＤＮＡ配列を配列番号１００に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換９）
上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドｐＨＧ−２（５００ｎｇ）を用いたほかは、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨＧ−２（以下、ＨＧ−２株という）とした。
［実施例１４］
［ＨＧ−２株における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γの分泌確認］
ＨＧ−２株の培養上清中の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γの有無をウェスタンブロッティング法にて以下のとおり確認した。
（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）
上記ＨＧ−２株、ヒトＩＦＮ−γ分泌発現カセットの一方のみを持つ単独発現株であるＰ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２（プラスミドｐＰ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２導入株）株、ｈＩＦＮｇ３３株について実施例４（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）と同様の手順にて上記ビフィドバクテリウム属細菌を培養し、培養上清を回収した。この培養上清中のタンパク質をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ、和光純薬工業株式会社製）により沈殿させ、アセトンにて洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーに溶解し、９５℃にて３分間熱処理を行い、各培養上清濃縮物とした。
（ウェスタン解析）
上記各培養上清濃縮物（培養液０．１ｍＬ相当）を実施例９の（ウェスタン解析）と同様の手順にて、ブロッティング終了後の膜をブロッキングした。その後、一次抗体として抗ヒスチジン抗体である上記ＴＨＥ Ｈｉｓ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ，Ｍｏｕｓｅを、二次抗体として、上記ＥＣＬ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｌａｂｅｌｌｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙを使用し、抗体反応終了後のメンブランを、上記Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｕｌｔｒａを用いて発光させた。これをイメージング装置Ｆｌｕｏｒ − Ｓ Ｍａｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて解析した。結果を図１８に示す。
（結果）
図１８から明らかなとおり、ＨＧ−２株では、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖとｈＩＦＮ−γの両方が検出されており、その大きさは、それぞれの単独発現株の分泌物と同様であった。なお、レーンＭはマーカー、レーン１は抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ単独発現株（Ｐ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２株）からの分泌タンパク質、レーン２はｈＩＦＮ−γ単独発現株（ｈＩＦＮｇ３３株）からの分泌タンパク質、レーン３は抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γ共発現株（ＨＧ−２株）からの分泌タンパク質をロードした。
［実施例１５］
［ＨＧ−２株分泌物の生理活性の検討］
（培養上清濃縮物の調製とｈＩＮＦ−γタンパク質の発現量確認）
上記ＨＧ−２株、Ｐ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２株、ｈＩＦＮｇ３３株、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株についてそれぞれＭＲＳ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、１％ビタミンＣ添加液）液体培地に１％植菌し、３７℃にて２４時間嫌気培養した（活性化培養）。ＤＭＥＭ培地（低グルコース，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１８ｍＬにＭＲＳ液体培地２ｍＬを加えたＤＭＥＭ／ＭＲＳ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、０．５％ビタミンＣ添加液）培地に活性化培養液０．５％を植菌した。これを３７℃にて１８時間嫌気培養した（本培養）。この培養液２０ｍＬを遠心分離し、培養上清１３ｍＬを回収した後、ポアサイズ０．２μｍのフィルターで濾過して菌体を除去した。この培養上清１０ｍＬをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮した後、ＰＢＳ（−）に置換し５００μＬとした（ビフィドバクテリウム属細菌培養上清の濃縮物（ＰＢＳ置換））。各細菌培養上清濃縮物を前記ｈＩＦＮ−γ測定用のＥＬＩＳＡキットを用いて、ＥＬＩＳＡ法により培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した。測定結果を以下の表１２に示した。
（ＨＧ−２株分泌物中の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖの癌細胞増殖抑制活性）
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖの生理活性は、Ｐ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２株の培養上清よりＨｉｓタグ精製した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（ＰＢＳ置換）をＨＥＲ２陽性細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌）細胞）に添加し、細胞増殖抑制活性を測定した。即ち、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）にて３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で培養後、９６穴プレートに２×１０４ｃｅｌｌｓずつ播種し３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。その後古い培地を吸引除去し、新しいＲＰＭＩ１６４０培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）を９８μＬずつ添加した。次に、測定試料としてＰＢＳ（−）、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖを２４４ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬに調整したものを２μＬずつ添加した。このプレートを３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した。
上記５日間培養後の培地を吸引除去した後、新しいＲＰＭＩ１６４０培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）９ｍＬにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ キット−８を１ｍＬ添加したものを１００μＬずつ添加後、さらに３時間３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で保温し、波長４５０ｎｍと６３０ｎｍ（参照波長）での吸光度を測定することにより上記ＨＥＲ２陽性細胞に対する細胞増殖抑制活性を測定した。結果を図１９に示す。
（結果）
図１９から明らかなとおり、上記ビフィドバクテリウム・ロンガムＲｅ−１０５Ａ／ｐＰ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２より精製した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖは、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞に対し用量依存性の細胞増殖抑制活性を示し、組換えビフィドバクテリウム属細菌が分泌した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖは生理活性を有することを確認した。
［実施例１６］
（ＨＧ−２株が分泌した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γの癌細胞増殖抑制活性１）
共発現株により分泌されたタンパク質である抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＮＦ−γ）の生理活性は、ＨＥＲ２陽性細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７細胞）に実施例１５で得たビフィドバクテリウム属細菌（ＨＧ−２株）培養上清の濃縮物（ＰＢＳ置換）を添加し、増殖抑制活性を調べることにより判定した。すなわち、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）にて３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で培養後、９６穴プレートに２×１０４ｃｅｌｌｓずつ播種し３７、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。この細胞培養液より古い培地を吸引除去し、新しいＲＰＭＩ１６４０培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）を９０μＬずつ添加した。次に、測定試料としてＰＢＳ（−）、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株培養上清濃縮物（ネガティブコントロール）、Ｐ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２株培養上清濃縮物、ｈＩＮＦｇ３３株培養上清濃縮物（ｈＩＦＮ−γ濃度を２０００ｎｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈して調整）、ＨＧ−２株培養上清濃縮物、及びリコンビナントｈＩＦＮ−γ（ポジティブコントロール、ｈＩＦＮ−γ濃度を２０００ｎｇ／ｍＬになるように調整）を１０μＬずつ添加した。このプレートを３７℃にて５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した。
細胞増殖抑活性の測定は、上記（抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖの細胞増殖抑制活性）にて記載した同じ方法で実施した。結果を図２０に示す。
図２０から明らかなとおり、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ／ｈＩＦＮ−γ共発現株であるＨＧ−２株由来の培養上清濃縮物はＮＣＩ−Ｎ８７細胞に対し非常に強い細胞増殖抑制活性を示した。一方、ｈＩＦＮ−γ単独発現株のｈＩＮＦｇ３３株培養上清由来の濃縮物は、２００ｎｇ／ｍＬのｈＩＦＮ−γで、標準品として用いたリコンビナントｈＩＦＮ−γ（ＰｅｐｌｏＴｅｃｈ社製）と同様の細胞増殖抑制活性を示した。またＰ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２株由来の濃縮物は、実施例１５と同様の細胞増殖抑制活性が確認された。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ／ｈＩＦＮ−γ共発現株のＨＧ−２株の細胞増殖抑制活性は、同時に行ったｈＩＦＮ−γ単独発現株及びＰ３０ＳＰ７Ｌ２０−ｂＨＥＲ２株のいずれの活性よりも強く、共分泌されたｈＩＦＮ−γ及び抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ両タンパクの相乗的な併用効果によるものと考えられる。
［実施例１７］
［抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γ共発現株の腫瘍内分泌の確認］
ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７の担癌ヌードマウスを用いて、腫瘍内のビフィドバクテリウム属細菌の局在をグラム染色にて、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖとｈＩＦＮ−γの局在を抗ヒスチジンタグ抗体及び抗ｈＩＦＮ−γ抗体による免疫組織染色にて確認した。
ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，ＩＮＣ．社製）のＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業社製）で培養し、ヌードマウス（日本エスエルシー社製）に移植して担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが約４７０ｍｍ３の担癌マウスに抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γ共発現株（ＨＧ−２株）の簡易凍結製剤ならびにコントロールとして非発現株のＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の簡易凍結製剤を尾静脈から６ｘ１０８ｃｆｕの用量で投与した。なお、１０％マルトース溶液を１ｍＬずつ１日２回の頻度で５日間投与した。投与７日後に腫瘍を摘出し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラファインテック社製）で凍結包埋し、凍結ミクロトームＬｅｉｃａ ＣＭ１９００（Ｌｅｉｃａ社製）で薄切スライド標本を作製し、各組織染色に供した。
（グラム染色）
上記薄切スライド標本を風乾し、４％ＰＦＡ（和光純薬工業社製）に１０分間浸漬し固定した。固定後、前染色としてバーミーＭクリスタルバイオレット溶液（武藤化学社製）にて２分間染色した後、バーミーＭヨウ素・水酸化ナトリウム溶液（武藤化学社製）に１分間反応させた。バーミーＭアセトン・エチルアルコール混合液（武藤化学社製）にて脱色後、バーミーＭ０．１％フクシン液（武藤化学社製）にて１分間染色した。染色後、精製水にて洗浄し、９９．５％エタノール（和光純薬工業社製）で脱水し、レモゾール（和光純薬工業社製）で透徹後、エンテランニュー（ＭＥＲＣＫ ＫＧａＡ社製）で封入した。結果を図２１に示す。
（抗ヒスチジンタグ抗体及び抗ｈＩＦＮ−γ抗体による免疫組織染色）
上記薄切スライド標本を風乾し、４％ＰＦＡ（和光純薬工業社製）に約４時間浸漬し固定した。固定後、精製水にて１分間洗浄し、１×ＰＢＳ（−）で５分間の洗浄を３回実施した。組織の周辺の水分を拭き取り、Ｄａｋｏ ｐｅｎ（Ｄａｋｏ社製）で組織の周囲を囲み、３％ＢＳＡ−ＰＢＳを組織に滴下し６０分間反応させ、非特異的結合の阻害を実施した。Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（ＭＢＬ社製）及びＦＩＴＣ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−γ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で混合希釈し、抗体反応液として組織に滴下し４℃にて、一晩反応させた。抗体反応後、１×ＰＢＳ（−）にて５分間の洗浄を３回実施し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩで封入した。上記の染色した切片を顕微鏡ＤＭ５０００Ｂ（Ｌｅｉｃａ社製）で鏡検し画像を撮影した。結果を図２２及び２３に示す。
（結果）
図２１から明らかなとおり、グラム染色により、ＨＧ−２株（Ａ）及びＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株（Ｂ）それぞれについて腫瘍組織中に菌の存在が確認された（図２１（Ａ）及び（Ｂ）、矢印部分）。一方、抗ｈＩＦＮ−γ抗体による免疫組織染色により、共発現株ＨＧ−２株を投与した担癌マウスの腫瘍組織において、ｈＩＦＮ−γ陽性像が確認された（図２２、矢印で示す緑色部分）。また、ヒスチジンタグの免疫組織染色によりヒスチジンタグ陽性像（抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びｈＩＦＮ−γ）が確認された（図２３、矢印で示す赤色部分）。これらの結果より、ＨＧ−２株をヒト胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７担癌マウスに静脈内投与すると、腫瘍内にＨＧ−２株が生着し、ＨＧ−２株から分泌されたｈＩＦＮ−γ及び抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖタンパク質が腫瘍内に同時に存在していることが確認された。
［実施例１８］
［抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及び抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ共発現株の作製］
抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及び抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧを分泌する、大腸菌−ビフィドバクテリウム属細菌シャトルベクターである、共発現プラスミドｐＰＣ２、ｐＰＣ３、ｐＰＣ４、ｐＰＣ５、ｐＰＣ６、ｐＰＣ７、及びｐＰＣ８を作製し、これら７種類の共発現プラスミドそれぞれを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換を行った。
７種類の共発現プラスミドｐＰＣ２〜ｐＰＣ８における、抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット及び抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセットの構成を以下の表１３−１及び表１３−２に示した。プラスミド分子内の相同配列を回避するため、各発現カセット内のプロモーターＤＮＡ、ターミネーターＤＮＡ、タグ及びシグナルペプチド−リンカーペプチド連結体をコードするＤＮＡ配列は、同一の構成を含まないようにした。
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ分泌発現カセットの構成）
抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ分泌発現カセットとして、（１）ＨｕプロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体をコードするＤＮＡ、（３）抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（４）Ｈｉｓタグ配列をコードするＤＮＡ、及び（５）ＨｕターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（５）を下流（３’末端）側として、（１）〜（５）のＤＮＡを順次含むカセットを作製した。上記シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体としては、ＳＰ５０Ｌ５（配列番号６１のアミノ酸配列に配列番号８３の最初の５個のアミノ酸配列(Ala Thr Leu Thr Pro)が結合した分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体）、ＳＰ６７Ｌ１０（配列番号７３のアミノ酸配列に配列番号９５の最初の１０個のアミノ酸配列(Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly)が結合した分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体）、又はＳＰ６９Ｌ１（配列番号７７のアミノ酸配列に配列番号９９の最初の１個のアミノ酸配列(Asp)が結合した分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体）を使用した。
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ分泌発現カセットの構成）
抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ分泌発現カセットとして、（１）Ｐ３０プロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体をコードするＤＮＡ、（３）抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（４）ＦＬＡＧタグ配列をコードするＤＮＡ、及び（５）Ｔ２ターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（５）を下流（３’末端）側として、（１）〜（５）のＤＮＡを順次含むカセットを作製した。上記シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体としては、ＳＰ５０Ｌ５（配列番号６１のアミノ酸配列に配列番号８３の最初の５個のアミノ酸配列(Ala Thr Leu Thr Pro)が結合した分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体）、ＳＰ６７Ｌ１（配列番号７３のアミノ酸配列に配列番号９５の最初の１個のアミノ酸配列(Ala)が結合した分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体）、又はＳＰ６８Ｌ１（配列番号７５のアミノ酸配列に配列番号９７の最初の１個のアミノ酸配列(Asp)が結合した分泌シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体）を使用した。
共発現プラスミドｐＰＣ２〜ｐＰＣ８の、基本構成を図２４に示す。
また、作製方法の概要を図２５に示す。
（１）第１工程では、共発現プラスミドｐＰＣ２〜ｐＰＣ８の作製に使用した鋳型プラスミド（ｐＨｕＳＰｘＬｙ−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ（ＳＰｘＬｙ＝ＳＰ５０Ｌ５，ＳＰ６７Ｌ１０，ＳＰ６９Ｌ１））を作製した。
（２）第２工程では、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＨｕＳＰｘＬｙ−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ（ＳＰｘＬｙ＝ＳＰ５０Ｌ５，ＳＰ６７Ｌ１０，ＳＰ６９Ｌ１）の抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセットの下流にＴ２ターミネーター断片を挿入したプラスミドｐＨｕＳＰｘＬｙ−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ−Ｔ２（ＳＰｘＬｙ＝ＳＰ５０Ｌ５，ＳＰ６７Ｌ１０，ＳＰ６９Ｌ１）を作製した。
（３）第３工程では、第２工程にて作製したプラスミドのＨｕターミネーターとＴ２ターミネーターの間に、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット（但し、ターミネーターを除く）を挿入し、共発現プラスミドｐＰＣ２〜ｐＰＣ８の作製を行った。
（第１工程）
Ａ工程：実施例８にて作製したプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（ｓｃＦｖ配列の３’末端にヒスチジンタグが付加）を鋳型ＤＮＡとして作製した直鎖ベクター（vector）と、１０５−ＡゲノムＤＮＡから作製したＳＰ５０インサート（insert）、ＳＰ６７インサート、ＳＰ６９インサートとのＰＣＲ産物を調製した。プライマーは、ＰＣＲ産物の末端１５ｂｐが、次工程のＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応において連結する隣接ＰＣＲ産物の末端１５ｂｐと同配列になるよう設計した。伸長反応時間は１ｋｂｐあたり１分を目安とした。ここでのＰＣＲ増幅工程を「ＰＣＲ増幅工程１」とする)。
上記直鎖ベクターと各インサートを、ＨＤキットを用いてインフュージョン反応にて連結した。上記（実施例１：大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様の手順にて、インフュージョン反応液を用いて上記大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞の形質転換、組換え大腸菌からのプラスミド抽出を行い、抽出したプラスミドにおける“抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット領域”（ＨｕプロモーターからＨｕターミネーターを含む）の配列決定を行った（以下、インフュージョン反応から配列決定までは、同様の手順で行われる）。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ５０Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓと名付けた。
Ｂ工程：上記ｐＨｕＳＰ５０Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ２０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓから作製したＳＰ５０Ｌ５インサート、ＳＰ６７Ｌ１０インサート、ＳＰ６９Ｌ１インサートのＰＣＲ産物を調製した。
Ａ工程において作製した直鎖ベクターと、上記ＳＰ５０Ｌ５インサート、ＳＰ６７Ｌ１０インサート、ＳＰ６９Ｌ１インサートとを、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、“抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット領域”の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓと名付けた。
（第２工程）
（Ｔ２ターミネーターの作製）
（配列番号１０１）をジェンスクリプトジャパン株式会社に合成を依頼し、Ｔ２ターミネーターと名付けた。プラスミドベクターｐＵＣ５７に組込まれたＤＮＡ（Bba-B0015 in pUC57）として納品された。
上記ｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、ＰＣ１＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０２）をフォワードプライマーとして、ＰＣ２＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０３）をリバースプライマーとして用いていずれも上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物を調製してＡ１，Ａ２，又はＡ３の直鎖ベクターとした。ＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ、４７５１ｂｐ、４６９７ｂｐ、４６６１ｂｐであった。
上記Ｂｂａ−Ｂ００１５ ｉｎ ｐＵＣ５７を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣ３＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０４）をフォワードプライマーとして、ＰＣ４＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０５）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲ産物Ｂ（１５９ｂｐ）を調製した。
上記表１４に示す組合せで、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、各“抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット及びＴ２ターミネーター領域”（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰｘＬｙ−ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ−Ｔ２ターミネーター−３’）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ−Ｔ２、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ−Ｔ２及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ−Ｔ２と名付けた。
［プラスミドｐｈＣＴＬＡｚの作製］
実施例８にて作製したプラスミドｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧのＨｕプロモーターをＰ３０プロモーターに置換した。概要を図２６に示す。
ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２ＦＬＡＧを鋳型ＤＮＡとしてｖｅｃ＿Ｆ５＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０６）をフォワードプライマーとして、ｖｅｃ＿Ｒ２＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０７）をリバースプライマーとして用いて作製した直鎖ベクターのＰＣＲ産物（４４１０ｂｐ）と、１０５−ＡゲノムＤＮＡを鋳型としてＰ３０＿Ｆ１＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０８）をフォワードプライマーとして、Ｐ３０＿Ｒ１＿ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０９）をリバースプライマーとして用いてインサートのＰＣＲ産物（２４５ｂｐ）を調製した。かかる直鎖ベクター及びインサートを、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、抽出したプラスミドの全長配列の決定を行った。抽出したプラスミドをｐｈＣＴＬＡ１と名付けた。
（プラスミドｐｈＣＴＬＡｚ（ｚ＝４，１０，１１）の作製）
上記で作製したプラスミドｐｈＣＴＬＡ１のシグナルペプチド配列をＳＰ７からＳＰ５０、ＳＰ６７及びＳＰ６８に置換した。
表１５に示す鋳型ＤＮＡ及びプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ増幅を行い、ベクター及びインサートを調製した。
上記表１５記載のベクターと各インサートとを、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、“抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−ＦＬＡＧカセット領域”の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐｈＣＴＬＡ４（ＳＰ５０の場合）、ｐｈＣＴＬＡ１０（ＳＰ６７の場合）、ｐｈＣＴＬＡ１１（ＳＰ６８の場合）と名付けた。
（ｐＰ３０ＳＰｘ’Ｌｙ’−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓの作製）
作製概要を図２７に示した。
（抗ＣＴＬＡ−４一本鎖抗体の発現カセットの作製）
ＷＯ２０１５／１６６６４０における［ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｓｃＦｖ−ＣＴＬＡ−４−１の作製］を参照して、ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｓｃＦｖ−ＣＴＬＡ−４−１を作製し、本実施例においては、ｐＨｕＳＰ７Ｌ２０−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓと名付けた。
表１６に示す鋳型ＤＮＡ及びプライマーを使用して、上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物を調製した。
上記表１６記載のＰＣＲ産物Ａと、各Ｂとを、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、“抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓカセット領域”の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＰ３０ＳＰ５０Ｌ５−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓ、ｐＰ３０ＳＰ６７Ｌ１−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓ及びｐＰ３０ＳＰ６８Ｌ１−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓと名付けた。
［プラスミドｐＰ３０ＳＰｘ’Ｌｙ’−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの作製］
上記で作製したプラスミドｐＰ３０ＳＰｘ’Ｌｙ’−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−Ｈｉｓ（ＳＰｘ’Ｌｙ’＝ＳＰ５０Ｌ５，ＳＰ６７Ｌ１，ＳＰ６８Ｌ１）のヒスチジンタグをＦＬＡＧタグに変更した。概要を図２８に示す。以降、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖの場合にＳＰｘ’Ｌｙ’と表すことがある。
表１７に示す鋳型ＤＮＡ及びプライマーを使用して、上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物を調製した。
上記表１７記載のＰＣＲ産物Ａと、各ＰＣＲ産物Ｂとを、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、“抗ｈＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧカセット領域”の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＰ３０ＳＰ５０Ｌ５−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ（以下、ｐＣ１Ｆという）、ｐＰ３０ＳＰ６７Ｌ１−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ（以下、ｐＣ２Ｆという）及びｐＰ３０ＳＰ６８Ｌ１−ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ（以下、ｐＣ３Ｆという）と名付けた。
（第３工程）
表１８に示す鋳型ＤＮＡ及びプライマーを使用して、上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物を調製した。
上記表１８記載のＰＣＲ産物を上記表１９に示す組合せで前記同様にＨＤキットを用いて連結し、抽出したプラスミドの全長ＤＮＡ配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＰＣ２、ｐＰＣ３、ｐＰＣ４、ｐＰＣ５、ｐＰＣ６、ｐＰＣ７及びｐＰＣ８と名付けた。それぞれの概要を示す。
（ｐＰＣ２のｓｃＦｖ発現カセット配列（２６１８ｂｐ）（配列番号１３１））
１．．１３８４ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．５４４ ＳＰ５０Ｌ５
５４５．．１２４９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１２５０．．１２６７ Ｈｉｓタグ
１２６８．．１２７０ 停止コドン
１２７１．．１３８４ Ｈｕターミネーター

１３８５．．２６１８ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット
１３８５．．１６１９ Ｐ３０プロモーター
１６２０．．１７２１ ＳＰ６７Ｌ１
１７２２．．２４６２ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４６３．．２４８６ ＦＬＡＧタグ
２４８７．．２４８９ 停止コドン
２４９０．．２６１８ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ３のｓｃＦｖ発現カセット配列（２６４８ｂｐ）（配列番号１３２））
１．．１３８４ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．５４４ ＳＰ５０Ｌ５
５４５．．１２４９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１２５０．．１２６７ Ｈｉｓタグ
１２６８．．１２７０ 停止コドン
１２７１．．１３８４ Ｈｕターミネーター

１３８５．．２６４８ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット
１３８５．．１６１９ Ｐ３０プロモーター
１６２０．．１７５１ ＳＰ６８Ｌ１
１７５２．．２４９２ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４９３．．２５１６ ＦＬＡＧタグ
２５１７．．２５１９ 停止コドン
２５２０．．２６４８ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ４のｓｃＦｖ発現カセット配列（２６４５ｂｐ）（配列番号１３３））
１．．１３３０ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４９０ ＳＰ６７Ｌ１０
４９１．． １１９５ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１９６．．１２１３ Ｈｉｓタグ
１２１４．．１２１６ 停止コドン
１２１７．．１３３０ Ｈｕターミネーター

１３３１．．２６４５ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット
１３３１．．１５６５ Ｐ３０プロモーター
１５６６．．１７４８ ＳＰ５０Ｌ５
１７４９．．２４８９ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４９０．．２５１３ ＦＬＡＧタグ
２５１４．．２５１６ 停止コドン
２５１７．．２６４５ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ５のｓｃＦｖ発現カセット配列（２５９４ｂｐ）（配列番号１３４））
１．．１３３０ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４９０ ＳＰ６７Ｌ１０
４９１．．１１９５ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１９６．．１２１３ Ｈｉｓタグ
１２１４．．１２１６ 停止コドン
１２１７．．１３３０ Ｈｕターミネーター

１３３１．．２５９４ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット
１３３１．．１５６５ Ｐ３０プロモーター
１５６６．．１６９７ ＳＰ６８Ｌ１
１６９８．．２４３８ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４３９．．２４６２ ＦＬＡＧタグ
２４６３．．２４６５ 停止コドン
２４６６．．２５９４ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ６のｓｃＦｖ発現カセット配列（２６０９ｂｐ）（配列番号１３５））
１．．１２９４ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４５４ ＳＰ６９Ｌ１
４５５．．１１５９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１６０．．１１７７ Ｈｉｓタグ
１１７８．．１１８０ 停止コドン
１１８１．．１２９４ Ｈｕターミネーター

１２９５．．２６０９ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット
１２９５．．１５２９ Ｐ３０プロモーター
１５３０．．１７１２ ＳＰ５０Ｌ５
１７１３．．２４５３ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４５４．．２４７７ ＦＬＡＧタグ
２４７８．．２４８０ 停止コドン
２４８１．．２６０９ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ７のｓｃＦｖ発現カセット配列（２５２８ｂｐ）（配列番号１３６））
１．．１２９４ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４５４ ＳＰ６９Ｌ１
４５５．．１１５９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１６０．．１１７７ Ｈｉｓタグ
１１７８．．１１８０ 停止コドン
１１８１．．１２９４ Ｈｕターミネーター

１２９５．．２５２８ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット
１２９５．．１５２９ Ｐ３０プロモーター
１５３０．．１６３１ ＳＰ６７Ｌ１
１６３２．．２３７２ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２３７３．．２３９６ ＦＬＡＧタグ
２３９７．．２３９９ 停止コドン
２４００．．２５２８ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ８のｓｃＦｖ発現カセット配列（２５５８ｂｐ）（配列番号１３７））
１．．１２９４ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４５４ ＳＰ６９Ｌ１
４５５．．１１５９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１６０．．１１７７ Ｈｉｓタグ
１１７８．．１１８０ 停止コドン
１１８１．．１２９４ Ｈｕターミネーター

１２９５．．２５５８ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ発現カセット
１２９５．．１５２９ Ｐ３０プロモーター
１５３０．．１６６１ ＳＰ６８Ｌ１
１６６２．．２４０２ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４０３．．２４２６ ＦＬＡＧタグ
２４２７．．２４２９ 停止コドン
２４３０．．２５５８ Ｔ２ターミネーター
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１０）
上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドｐＰＣ２、ｐＰＣ３、ｐＰＣ４、ｐＰＣ５、ｐＰＣ６、ｐＰＣ７及びｐＰＣ８を５μＬずつ用いた他は、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ２（以下、ＰＣ２株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ３（以下、ＰＣ３株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ４（以下、ＰＣ４株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ５（以下、ＰＣ５株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ６（以下、ＰＣ６株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ７（以下、ＰＣ７株という）及びビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ８（以下、ＰＣ８株という）とした。
［実施例１９］
［ＰＣ２ＴＬ株−ＰＣ８ＴＬ株の作製］
臨床開発を念頭に、上記実施例１８にて作製したプラスミドよりｓｃＦｖのマーカータグ（ヒスチジンタグ／ＦＬＡＧタグ）及び大腸菌中でのプラスミド複製起点ｐＵＣｏｒｉを除去した、抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３及び抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１を共発現するプラスミドｐＰＣ２ＴＬ〜ｐＰＣ８ＴＬを作製した。これらのプラスミドにてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａの形質転換を行い、共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株を取得した。
共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株の基本的なプラスミド構成を図２９に示す。７種類のタグ無共発現プラスミドｐＰＣ２ＴＬ〜ｐＰＣ８ＴＬにおける、抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット及び抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセットの構成を以下の表２０及び表２１に示した。
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセットの構成）
抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３分泌発現カセットとして、（１）ＨｕプロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体をコードするＤＮＡ、（３）抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び（４）ＨｕターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（４）を下流（３’末端）側として、（１）〜（４）のＤＮＡを順次含むカセットを作製した。上記シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体としては、ＳＰ５０Ｌ５、ＳＰ６７Ｌ１０又はＳＰ６９Ｌ１を使用した。
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１分泌発現カセットの構成）
抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１分泌発現カセットとして、（１）Ｐ３０プロモーターＤＮＡ、（２）シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体をコードするＤＮＡ、（３）抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び（４）Ｔ２ターミネーターＤＮＡを、（１）を上流（５’末端）側として（４）を下流（３’末端）側として、（１）〜（４）のＤＮＡを順次含むカセットを作製した。上記シグナルペプチド−リンカーペプチド連結体としては、ＳＰ５０Ｌ５、ＳＰ６７Ｌ１又はＳＰ６８Ｌ１を使用した。
（ｐＰＣ２ＴＬ〜ｐＰＣ８ＴＬの作製方法）
プラスミドの作製方法の概要を図３０に示した。以下の４工程よりなる。
（１）第１工程では、共発現プラスミドｐＰＣ２ＴＬ−ｐＰＣ８ＴＬの作製に使用した鋳型プラスミドｐＨｕＳＰｘＬｙ−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬを作製した。
（２）第２工程では、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（タグ無）発現プラスミドの抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセットの下流にＴ２ターミネーター断片を挿入したプラスミドｐＨｕＳＰｘＬｙ−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ−Ｔ２（ＳＰｘＬｙ＝ＳＰ５０Ｌ５，ＳＰ６７Ｌ１０，ＳＰ６９Ｌ１）を作製した。
（３）第３工程では、第２工程にて作製したプラスミドのＨｕターミネーターとＴ２ターミネーターの間に、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１（タグ無）発現カセット（但し、ターミネーターを除く）を挿入したプラスミドｐＰＣ２ＴＬＳ〜ｐＰＣ８ＴＬＳを作製した。
（４）第４工程では、第３工程にて作製したプラスミドより大腸菌中でのプラスミド複製起点であるｐＵＣｏｒｉ断片を制限酵素にて切断、除去後、自己閉環した共発現プラスミド（タグなし、非シャトル）ｐＰＣ２ＴＬ〜ｐＰＣ８ＴＬの作製を行った。
（第１工程）
前記ｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓを鋳型ＤＮＡとして、ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ＿Ｆ１＿プライマー（配列番号１２６）をフォワードプライマーとして、ＧＡ６＿プライマーをリバースプライマーとして用いていずれも上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物Ａ−１（３２６１ｂｐ）を調製した。ｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、ＧＡ５＿ｐｒｉｍｅｒ＿ｒｅｖプライマーをフォワードプライマーとして、ｈＰＤ１ｓｃＦｖ０３−１＿プライマー（配列番号１２７）をリバースプライマーとして用いて上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物Ｂ−ＳＰ５０Ｌ５（１５０２ｂｐ）、Ｂ−ＳＰ６７Ｌ１０（１４４８ｂｐ）、Ｂ−ＳＰ６９Ｌ１（１４１２ｂｐ）をそれぞれ調製した
上記ＰＣＲ産物Ａ−１と、Ｂ−ＳＰ５０Ｌ５、Ｂ−ＳＰ６７Ｌ１０、Ｂ−ＳＰ６９Ｌ１それぞれとを、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、“抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット領域”（ＨｕプロモーターからＨｕターミネーターを含む）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬと名付けた。
（第２工程）
表２２に示す鋳型ＤＮＡ及びプライマーを使用して、上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物を調製した。
上記表２２記載のＰＣＲ産物を上記表２３に示す組合せで前記同様にＨＤキットを用いて連結し、“抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３（タグなし）発現カセット及びＴ２ターミネーター領域”（５’−Ｈｕプロモーター−ＳＰｘＬｙ−ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｕターミネーター−Ｔ２ターミネーター−３’）の配列決定を行った。抽出したプラスミドをｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ−Ｔ２、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ−Ｔ２及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ−Ｔ２と名付けた。
（第３工程）
表２４に示す鋳型ＤＮＡ及びプライマーを使用して、上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物を調製した。
上記表２４記載のＰＣＲ産物を上記表２５に示す組合せで前記同様にＨＤキットを用いて連結し、抽出したプラスミドの全長ＤＮＡ配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドをｐＰＣ２ＴＬＳ、ｐＰＣ３ＴＬＳ、ｐＰＣ４ＴＬＳ、ｐＰＣ５ＴＬＳ、ｐＰＣ６ＴＬＳ、ｐＰＣ７ＴＬＳ及びｐＰＣ８ＴＬＳと名付けた。
（第４工程）
上記プラスミド作製の第３工程にて作製したプラスミドｐＰＣ２ＴＬＳ〜ｐＰＣ８ＴＬＳ各２μｇに、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌII（サーモサイエンティフィク社製）を各１０ユニットずつ添加し、３７oＣで３時間の保温により切断した。ＢａｍＨＩ及びＢｇｌII認識部位は、図３０に示すとおり、大腸菌中でのプラスミド複製起点であるｐＵＣｏｒｉの隣接部分に１箇所ずつある。制限酵素処理後のＤＮＡ溶液の一部を用いて、プラスミドＤＮＡが予定のサイズ（約５．３ｋｂｐ及び約０．７ｋｂｐ）に切断されていることを、０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動にて確認した。
（アガロースゲル電気泳動による分離及び精製）
上記制限酵素処理後のＤＮＡを、アガロースゲルを用いた電気泳動にて分離し、約５．３ｋｂｐのＤＮＡバンドを切出し、ＱＩＡＧｅｌを用いてＤＮＡ抽出を行った。このＤＮＡ濃度をアガロースゲル電気泳動にて見積もった。
（ＤＮＡの自己閉環）
上記の約５．３ｋｂｐの精製ＤＮＡをＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ キット（サーモサイエンティフィック社製）を用いてセルフライゲーション反応を行った。反応終了後の溶液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン株式会社製）により精製し、ｐＰＣ２ＴＬ、ｐＰＣ３ＴＬ、ｐＰＣ４ＴＬ、ｐＰＣ５ＴＬ、ｐＰＣ６ＴＬ、ｐＰＣ７ＴＬ及びｐＰＣ８ＴＬを作製した。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１１）
上記プラスミド作製の第４工程にて調製したプラスミドｐＰＣ２ＴＬ、ｐＰＣ３ＴＬ、ｐＰＣ４ＴＬ、ｐＰＣ５ＴＬ、ｐＰＣ６ＴＬ、ｐＰＣ７ＴＬ及びｐＰＣ８ＴＬを５μＬ用いた他は、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体をビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ２ＴＬ（以下、ＰＣ２ＴＬ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ３ＴＬ（以下、ＰＣ３ＴＬ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ４ＴＬ（以下、ＰＣ４ＴＬ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ５ＴＬ（以下、ＰＣ５ＴＬ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ６ＴＬ（以下、ＰＣ６ＴＬ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ７ＴＬ（以下、ＰＣ７ＴＬ株という）及びビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＰＣ８ＴＬ（以下、ＰＣ８ＴＬ株という）とした。
（プラスミドＤＮＡの配列確認）
上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１１）にて取得したビフィドバクテリウム属細菌形質転換体の菌体に、リゾチーム（和光純薬工業社製）とＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（キアゲン株式会社製）とをそれぞれ４０ｍｇ／ｍＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬになるよう１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−０．１ｍＭ ＥＤＴＡ バッファー（ｐＨ８．０）にて調製した、リゾチーム−ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ混合液１．５ｍＬを加えて懸濁し、３７℃にて約１．５時間保温した。遠心分離にて上清を除去した菌体を用いて、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン株式会社製）にてプラスミドＤＮＡを抽出した。上記（実施例１：大腸菌の形質転換及びプラスミドｐＡＧ８のＤＮＡ配列確認）と同様に、抽出したプラスミドの全長ＤＮＡ配列決定を行った。抽出したプラスミドをプラスミドｐＰＣ２ＴＬ、ｐＰＣ３ＴＬ、ｐＰＣ４ＴＬ、ｐＰＣ５ＴＬ、ｐＰＣ６ＴＬ、ｐＰＣ７ＴＬ及びｐＰＣ８ＴＬと名付けた。概要を以下に示す。プラスミドｐＰＣ２ＴＬ、ｐＰＣ３ＴＬ、ｐＰＣ４ＴＬ、ｐＰＣ５ＴＬ、ｐＰＣ６ＴＬ、ｐＰＣ７ＴＬ及びｐＰＣ８ＴＬの発現カセット配列は、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の発現カセット配列及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１の発現カセット配列がいずれもタグ配列を含まないこと以外は、それぞれｐＰＣ２、ｐＰＣ３、ｐＰＣ４、ｐＰＣ５、ｐＰＣ６、ｐＰＣ７及びｐＰＣ８配列と同じである。
（ｐＰＣ２ＴＬのｓｃＦｖ発現カセット配列（２５７６ｂｐ）（配列番号１３８））
１．．１３６６ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．５４４ ＳＰ５０Ｌ５
５４５．．１２４９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１２５０．．１２５２ 停止コドン
１２５３．．１３６６ Ｈｕターミネーター

１３６７．．２５７６ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセット
１３６７．．１６０１ Ｐ３０プロモーター
１６０２．．１７０３ ＳＰ６７Ｌ１
１７０４．．２４４４ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４４５．．２４４７ 停止コドン
２４４８．．２５７６ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ３ＴＬのｓｃＦｖ発現カセット配列（２６０６ｂｐ）（配列番号１３９））
１．．１３６６ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．５４４ ＳＰ５０Ｌ５
５４５．．１２４９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１２５０．．１２５２ 停止コドン
１２５３．．１３６６ Ｈｕターミネーター

１３６７．．２６０６ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセット
１３６７．．１６０１ Ｐ３０プロモーター
１６０２．．１７３３ ＳＰ６８Ｌ１
１７３４．．２４７４ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４７５．．２４７７ 停止コドン
２４７８．．２６０６ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ４ＴＬのｓｃＦｖ発現カセット配列（２６０３ｂｐ）（配列番号１４０））
１．．１３１２ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４９０ ＳＰ６７Ｌ１０
４９１．． １１９５ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１９６．．１１９８ 停止コドン
１１９９．．１３１２ Ｈｕターミネーター

１３１３．．２６０３ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセット
１３１３．．１５４７ Ｐ３０プロモーター
１５４８．．１７３０ ＳＰ５０Ｌ５
１７３１．．２４７１ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４７２．．２４７４ 停止コドン
２４７５．．２６０３ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ５ＴＬのｓｃＦｖ発現カセット配列（２５５２ｂｐ）（配列番号１４１））
１．．１３１２ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４９０ ＳＰ６７Ｌ１０
４９１．．１１９５ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１９６．．１１９８ 停止コドン
１１９９．．１３１２ Ｈｕターミネーター

１３１３．．２５５２ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセット
１３１３．．１５４７ Ｐ３０プロモーター
１５４８．．１６７９ ＳＰ６８Ｌ１
１６８０．．２４２０ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４２１．．２４２３ 停止コドン
２４２４．．２５５２ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ６ＴＬのｓｃＦｖ発現カセット配列（２５６７ｂｐ）（配列番号１４２））
１．．１２７６ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４５４ ＳＰ６９Ｌ１
４５５．．１１５９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１６０．．１１６２ 停止コドン
１１６３．．１２７６ Ｈｕターミネーター

１２７７．．２５６７ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセット
１２７７．．１５１１ Ｐ３０プロモーター
１５１２．．１６９４ ＳＰ５０Ｌ５
１６９５．．２４３５ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２４３６．．２４３８ 停止コドン
２４３９．．２５６７ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ７ＴＬのｓｃＦｖ発現カセット配列（２４８６ｂｐ）（配列番号１４３））
１．．１２７６ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４５４ ＳＰ６９Ｌ１
４５５．．１１５９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１６０．．１１６２ 停止コドン
１１６３．．１２７６ Ｈｕターミネーター

１２７７．．２４８６ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセット
１２７７．．１５１１ Ｐ３０プロモーター
１５１２．．１６１３ ＳＰ６７Ｌ１
１６１４．．２３５４ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２３５５．．２３５７ 停止コドン
２３５８．．２４８６ Ｔ２ターミネーター
（ｐＰＣ８ＴＬのｓｃＦｖ発現カセット配列（２５１６ｂｐ）（配列番号１４４））
１．．１２７６ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３発現カセット
１．．３６１ Ｈｕプロモーター
３６２．．４５４ ＳＰ６９Ｌ１
４５５．．１１５９ 抗ヒトＰＤ−１ｓｃＦｖ０３
１１６０．．１１６２ 停止コドン
１１６３．．１２７６ Ｈｕターミネーター

１２７７．．２５１６ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現カセット
１２７７．．１５１１ Ｐ３０プロモーター
１５１２．．１６４３ ＳＰ６８Ｌ１
１６４４．．２３８４ 抗ヒトＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１
２３８５．．２３８７ 停止コドン
２３８８．．２５１６ Ｔ２ターミネーター
［実施例２０］
［共発現ビフィドバクテリウム属細菌株におけるｓｃＦｖ分泌確認］
共発現株ＰＣ２株〜ＰＣ８株の培養上清中の抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの分泌の有無をウェスタンブロッティング法にて以下のとおり確認した。陰性コントロール株として前記ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株についても同様に実施した。
（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）
上記ＰＣ２株〜ＰＣ８株、及び実施例８で作製したＰＣ１株、及びＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株について、実施例４（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）と同様の手順にて培養し、培養上清を回収した。培養上清のＴＣＡによる濃縮を、上記実施例９（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）と同様の手順にて行い、各培養上清濃縮物を得た。
（ウェスタン解析）
上記各培養上清濃縮物（各培養液０．０１ｍＬ相当）を用いて、実施例９（ウェスタン解析）と同様の方法にて、ウェスタン解析を行った。但し、ゲルから膜への転写はＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（バイオ・ラッド社製）を使用し、ブロッキング溶液は、前記２％ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔを用いた。抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓについての結果を図３１（Ａ）に、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧについての結果を図３１（Ｂ）に示す。
（結果）
図３１Ａ及びＢから明らかなとおり、ＰＣ２株（Ａ、Ｂともレーン１）、ＰＣ３株（Ａ、Ｂともレーン２）、ＰＣ４株（Ａ、Ｂともレーン３）、ＰＣ５株（Ａ、Ｂともレーン４）、ＰＣ６株（Ａ、Ｂともレーン５）、ＰＣ７株（Ａ、Ｂともレーン６）及びＰＣ８株（Ａ、Ｂともレーン７）及びＰＣ１株（Ａ、Ｂともレーン９）の培養上清中には、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓと抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの両方の分泌がみとめられた（ただし、ＰＣ１株は抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０２−ＦＬＡＧ）。また、ＰＣ２株〜ＰＣ８株から分泌された抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの量は、ＰＣ１株から分泌された一本鎖抗体量よりも多かった。
以上の結果より、共発現ビフィドバクテリウム属細菌株ＰＣ２株〜ＰＣ８株は、培養上清中に抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖと抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖの両方を分泌できる組換えビフィドバクテリウム属細菌株であり、前記ＰＣ１株より多くの一本鎖抗体を分泌することが確認された。
［実施例２１］
［共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株におけるｓｃＦｖの分泌確認］
上記共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株が分泌する抗体について、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）との結合活性の有無、及びヒトＣＴＬＡ−４との結合活性の有無につき、ＥＬＩＳＡ法にて確認した。
（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）
上記実施例１９で作製した共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株及びＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株について、実施例４（組換えビフィドバクテリウム属細菌の培養）と同様の手順にて培養し、培養上清を回収した。ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株の培養上清を、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の培養上清にて適宜希釈して、ＥＬＩＳＡ用試料とした。
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の分泌評価）
９６穴プレート（マキシソープ、Ｃ型、Ｎｕｎｃ社製）に、１μｇ／ｍＬのｈＰＤ−１液（抗原として使用。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＰＤ−１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社を１×ＰＢＳにて調製）をそれぞれ１００μＬずつ分注し、プレート上部にシールを貼り４℃にて一晩静置して抗原を固相化した。プレートより液を除去後、１×ＰＢＳを４００μＬずつ分注し、液を除去した。これを３回繰り返し洗浄（以下「ＰＢＳ洗浄」）した。
上記洗浄後のプレートに、１％ＢＳＡ溶液を３５０μＬずつ分注し室温にて２時間静置することでブロッキングを行い、ＰＢＳ洗浄した。
上記プレートに、ＥＬＩＳＡ用試料を分注し、ブランクのウェルには、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の培養上清１００μＬを分注した。また、陽性対照として、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の培養上清に抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３精製物を１００ｎｇ／ｍＬの濃度になるよう調整した溶液１００μＬを分注した。プレート上部にシールを貼り常温にて２時間静置して、固相化抗原へのｓｃＦｖ結合反応を行い、ＰＢＳ洗浄した。
上記固相化抗原へのｓｃＦｖ結合反応を行ったプレートに、０．２μｇ／ｍＬビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬ溶液（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＰｒｏｔｅｉｎＬ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製を、Ｓｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＨＩＫＡＲＩ：ナカライテスク社製のＢ液にてうすめ０．２μｇ／ｍＬに調製）１００μＬを添加した。プレート上部にシールを貼り常温にて１時間静置し（ｓｃＦｖの軽鎖κ鎖へのビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬの結合反応）、ＰＢＳ洗浄した。
上記ビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬの結合反応後のプレートに、アビジン−ビオチン標識酵素複合体調整溶液（アビジン−ビオチン標識酵素複合体ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ Ｋｉｔ：ベクターラボラトリーズ社製のＡ液及びＢ液３０μＬずつをＳｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＨＩＫＡＲＩのＢ液７．５ｍＬに添加・混合して調製した）１００μＬを添加し、プレート上部にシールを貼り常温にて３０分間静置し、ＰＢＳ洗浄した。
上記、酵素を結合させたプレートに、検出試薬（Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ及びＣｏｌｏｒ ＲｅａｇｅｎｔＢ：共にＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製を等量混合）２００μＬを添加し、遮光下常温にて静置した。正確に２０分経過後、前記停止液５０μＬを添加して呈色反応を停止した。プレートリーダーにて４５０ｎｍ、及び５７０ｎｍ（参照波長）での吸光度を測定した。
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１の分泌評価）
１）プレートに固相化する抗原として、１μｇ／ｍＬのｈＣＴＬＡ−４溶液（（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、バイオレジェンド社製）を１×ＰＢＳにて調製）を使用し、２）陽性対照として、ＢＥｓｈｕｔｔｌｅ株の培養上清に抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１精製物を用い、３）ビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬ溶液濃度を０．０５μｇ／ｍＬとした点を除き、上記（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の分泌評価）と同様の方法にて実施した。結果を表２６に示す。
（結果）
表２６から明らかなとおり、ＥＬＩＳＡ共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株の培養上清は、固相化したヒトＰＤ−１及びヒトＣＴＬＡ−４の両方に結合する活性を有していた。なお、かかるｓｃＦｖの結合活性は、対応する抗原に特異的であることを確認している（データ記載せず）。
[実施例２２]
上記共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＰＣ２株〜ＰＣ８株に対応する抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ単独発現株及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ単独発現株を表２７に示す。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１２）
上記実施例１８にて作製したプラスミドｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓを用いて、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体を、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ（以下、Ｐ１Ｈ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ（以下、Ｐ２Ｈ株という）及びビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ（以下Ｐ３Ｈ株という）とした。
同様に、実施例１８にて作製したプラスミドｐＣ１Ｆ，ｐＣ２Ｆ及びｐＣ３Ｆを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換を行い、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＣ１Ｆ（以下、Ｃ１Ｆ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＣ２Ｆ（以下、Ｃ２Ｆ株という）及びビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＣ３Ｆ（以下、Ｃ３Ｆ株という）を得た。
［実施例２３］
上記共発現ビフィドバクテリウム属細菌ＰＣ２ＴＬ−ＰＣ８ＴＬ株に対応する抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３単独発現株及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１単独発現株を表２８に示した。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１３）
上記実施例１９にて作製したプラスミドｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ、ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ及びｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬを用いて、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体を、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ５０Ｌ５−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ（以下、Ｐ１ＴＬ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ６７Ｌ１０−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ（以下、Ｐ２ＴＬ株という）及びビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＨｕＳＰ６９Ｌ１−ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３ＴＬ（以下Ｐ３ＴＬ株という）とした。
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１単独発現株の作製）
抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１発現プラスミドｐＣ１ＴＬＢ、ｐＣ２ＴＬＢ及びｐＣ３ＴＬＢの作製方法の概要を図３２に示した。プラスミドｐＣ１Ｆ、ｐＣ２Ｆ及びｐＣ３Ｆより、ＦＬＡＧタグ除去及びＴ２ターミネーターへの置換を行うＴ２置換工程と、プラスミドｐＣ１ＴＬ、ｐＣ２ＴＬ，ｐＣ３ＴＬからｐＵＣｏｒｉを除去するｐＵＣｏｒｉ除去工程との、２つの工程よりなる。
（Ｔ２置換工程）
表２９に示す鋳型ＤＮＡ及びプライマーを使用して、上記ＰＣＲ増幅１と同様にＰＣＲ産物を調製した。
ＰＣＲ産物の組合せは、Ａ１及びＢ（ｐＣ１ＴＬ作製用）、Ａ２及びＢ（ｐＣ２ＴＬ作製用）、Ａ３及びＢ（ｐＣ３ＴＬ作製用）の３種類とし、前記同様にＨＤキットを用いて連結し、抽出したプラスミドの全長ＤＮＡ配列決定を同様の手順にて行った。抽出したプラスミドをｐＣ１ＴＬ、ｐＣ２ＴＬ，ｐＣ３ＴＬと名付けた。
（ｐＵＣｏｒｉ除去工程）
上記ｐＣ１ＴＬ、ｐＣ２ＴＬ、ｐＣ３ＴＬからのｐＵＣｏｒｉ除去は、上記実施例１９の共発現プラスミドｐＰＣ２ＴＬ〜ｐＰＣ８ＴＬ作製の第３工程と同様の方法にて行い、ｐＣ１ＴＬＢ、ｐＣ２ＴＬＢ及びｐＣ３ＴＬＢを得た。
（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１４）
上記プラスミドｐＣ１ＴＬＢ、ｐＣ２ＴＬＢ及びｐＣ３ＴＬＢを用いて、上記（ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１）と同様の手順にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株の形質転換をエレクトロポレーションシステムにて実施した。得られた形質転換体を、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＣ１ＴＬＢ（以下、Ｃ１ＴＬＢ株という）、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＣ２ＴＬＢ（以下、Ｃ２ＴＬＢ株という）及びビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＣ３ＴＬＢ（以下、Ｃ３ＴＬＢ株という）とした。
［実施例２４］
（細胞への結合）
共発現株ＰＣ２株〜ＰＣ８株に対応する抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ単独発現株より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧを用いた細胞への結合を検討した。
抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ単独発現ビフィドバクテリウム属細菌Ｃ１Ｆ株、Ｃ２Ｆ株及びＣ３Ｆ株の各培養上清より、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧをＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにて精製した。細胞内ドメイン欠損ｈＣＴＬＡ−４を、レトロウイルスベクターを用いて過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、１μｇ／ｍＬに調製した精製ｓｃＦｖを１００μＬ添加し３０分間氷上にて静置した。細胞を洗浄後、ビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬを１００μＬ加え、３０分間静置し、細胞に結合したｓｃＦｖにｐｒｏｔｅｉｎＬを結合させた。細胞を洗浄後、０．５μｇ／ｍＬに調製したＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを１００μＬ加え３０分間静置した。細胞を洗浄後、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図３３に示す。
(結果)
図３３から明らかなとおり、Ｃ１Ｆ株、Ｃ２Ｆ株及びＣ３Ｆ株由来のｓｃＦｖは全て細胞内ドメイン欠損ｈＣＴＬＡ−４発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合した。これより、Ｃ１Ｆ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ４株及びＰＣ６株、Ｃ２Ｆ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ２株及びＰＣ７株、ならびにＣ３Ｆ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ３株、ＰＣ５株及びＰＣ８株より各々分泌される抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧもｈＣＴＬＡ−４発現細胞に結合できると推察された。図３３（ａ）よりｈＣＴＬＡ−４を発現しないＭｏｃｋ細胞にもわずかに結合が認められたが、図３７（ｄ）の結果から、共発現ＰＣ４株より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧではＭｏｃｋ細胞への結合は認められないことから、Ｃ１Ｆ株、Ｃ２Ｆ株及びＣ３Ｆ株由来のｓｃＦｖのＭｏｃｋ細胞への結合は非特異的な結合であると考えられる。
［実施例２５］
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１単独発現株より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１を用いた細胞への結合）
共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株に対応する、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１単独発現株Ｃ１ＴＬＢ株、Ｃ２ＴＬＢ株及びＣ３ＴＬＢ株の各培養上清より、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１をＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにて精製した。細胞内ドメイン欠損ｈＣＴＬＡ−４を、レトロウイルスベクターを用いて過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、１μｇ／ｍＬに調製した精製ｓｃＦｖを１００μＬ添加し３０分間氷上にて静置した。細胞を洗浄後、ビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬを１００μＬ加え、３０分間静置し、細胞に結合したｓｃＦｖにｐｒｏｔｅｉｎＬを結合させた。細胞を洗浄後、０．５μｇ／ｍＬに調製したＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを１００μＬ加え３０分間静置した。細胞を洗浄後、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図３４に示す。
(結果)
図３４から明らかなとおり、Ｃ１ＴＬＢ株、Ｃ２ＴＬＢ株及びＣ３ＴＬＢ株由来のｓｃＦｖは全てｈＣＴＬＡ−４発現細胞に結合した。これより、Ｃ１ＴＬＢ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ４ＴＬ株及びＰＣ６ＴＬ株、Ｃ２ＴＬＢ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ２ＴＬ株及びＰＣ７ＴＬ株、ならびにＣ３ＴＬＢ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ３ＴＬ株、ＰＣ５ＴＬ株及びＰＣ８ＴＬ株より各々分泌される抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１もｈＣＴＬＡ−４発現細胞に結合できると推察される。
［実施例２６］
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ単独発現株より精製した抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓを用いた細胞への結合）
共発現株ＰＣ２株〜ＰＣ８株に対応する、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ単独発現菌Ｐ１Ｈ株、Ｐ２Ｈ株及びＰ３Ｈ株の各培養上清より、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−ＨｉｓをＰｔｏｔｅｉｎＬにて精製した。ｈＰＤ−１をレトロウイルスベクターを用いて過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、１μｇ／ｍＬに調製した精製ｓｃＦｖを１００μＬ添加し３０分間氷上にて静置した。細胞を洗浄後、ビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬを１００μＬ加え、３０分間静置し、細胞に結合したｓｃＦｖにｐｒｏｔｅｉｎＬを結合させた。細胞を洗浄後、０．５μｇ／ｍＬに調製したＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを１００μＬ加え３０分間静置した。細胞を洗浄後、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図３５に示す。
(結果)
図３５から明らかなとおり、Ｐ１Ｈ株、Ｐ２Ｈ株及びＰ３Ｈ株由来のｓｃＦｖは全てｈＰＤ−１発現細胞に結合した。これより、Ｐ１Ｈ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ２株及びＰＣ３株、Ｐ２Ｈ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ４株及びＰＣ５株、ならびにＰ３Ｈ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ６株、ＰＣ７株及びＰＣ８株より各々分泌される抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−ＨｉｓもｈＰＤ−１発現細胞に結合できると推察される。
［実施例２７］
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３単独発現株より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を用いた細胞への結合）
共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株に対応する、ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３単独発現ビフィドバクテリウム属細菌Ｐ１ＴＬ株、Ｐ２ＴＬ株及びＰ３ＴＬ株の各培養上清より、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３をＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにて精製した。ｈＰＤ−１を、レトロウイルスベクターを用いて過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、１μｇ／ｍＬに調製した精製ｓｃＦｖを１００μＬ添加し３０分間氷上にて静置した。細胞を洗浄後、ビオチン化ＰｒｏｔｅｉｎＬを１００μＬ加え、３０分間静置し細胞に結合したｓｃＦｖにｐｒｏｔｅｉｎＬを結合させた。細胞を洗浄後、０．５μｇ／ｍＬに調製したＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを１００μＬ加え３０分間静置した。細胞を洗浄後、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図３６に示す。
（結果）
図３６から明らかなとおり、Ｐ１ＴＬ株、Ｐ２ＴＬ株及びＰ３ＴＬ株由来のｓｃＦｖは全てｈＰＤ−１発現細胞に結合した。これより、Ｐ１ＴＬ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ２ＴＬ株及びＰＣ３ＴＬ株、Ｐ２ＴＬ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ４ＴＬ株及びＰＣ５ＴＬ株、ならびにＰ３ＴＬ株と同一のｓｃＦｖを分泌する共発現株のＰＣ６ＴＬ株、ＰＣ７ＴＬ株及びＰＣ８ＴＬ株より各々分泌される抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ０３もｈＰＤ−１発現細胞に結合できると推察される。
［実施例２８］
（共発現株ＰＣ４株より精製したｓｃＦｖを用いた細胞への結合）
共発現株ＰＣ４株の培養上清よりＨｉｓ−ｔａｇ用精製カラムにて抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓを、またＦＬＡＧ−ｔａｇ用精製カラムにて抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧを精製した。上記［実施例２６］と同様の方法にて、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３のｈＰＤ−１発現細胞への結合を、また［実施例２４］と同様の方法にて、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１のｈＣＴＬＡ−４発現細胞への結合を検討した。ポジティブコントロールとしてＰＥ標識抗ｈＰＤ−１抗体（ｃｌｏｎｅ：ＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ｈＣＴＬＡ−４抗体（ｃｌｏｎｅ：Ｌ３Ｄ１０）を用いた。結果を図３７に示す。
図３７（ａ）より、ポジティブコントロールであるＰＥ標識抗ｈＰＤ−１抗体（ｃｌｏｎｅ：ＥＨ１２．２Ｈ７）は、ｈＰＤ−１発現細胞への結合は認められたが、Ｍｏｃｋ細胞やｈＣＴＬＡ−４発現細胞への結合は認められなかった。（ｂ）よりＰＥ標識抗ｈＣＴＬＡ−４抗体（ｃｌｏｎｅ：Ｌ３Ｄ１０）は、ｈＣＴＬＡ−４発現細胞への結合が認められたが、Ｍｏｃｋ細胞やｈＰＤ−１発現細胞への結合は認められなかった。図３７（ｃ）（ｄ）から明らかなとおり、共発現株ＰＣ４株より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧは、それぞれ対応する抗原発現細胞への結合が認められた。
［実施例２９］
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ単独発現株より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧを用いた抗原への親和性（ビアコア））
共発現株ＰＣ２株〜ＰＣ８株に対応する、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ単独発現ビフィドバクテリウム属細菌Ｃ１Ｆ、Ｃ２Ｆ及びＣ３Ｆの培養上清より抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧをＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにてそれぞれ精製した。精製した各抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧとｈＣＴＬＡ−４（ヒトＩｇＧ１Ｆｃとの融合タンパク）との結合カイネティックパラメータ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた表面プラズモン共鳴によりおこなった。カルボキシルメチルデキストランが金膜表面上にコートされた基盤にマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体（ＧＥヘルスケア社製）をアミンカップリング法にて結合し、リガンドとしてＦｃ融合組換えｈＣＴＬＡ−４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をキャプチャーした。アナライトとして精製したｓｃＦｖを０．７４０４、２．２２２２、６．６６６７、２０及び６０ｎＭに調製し、濃度が薄いものから連続的に結合させるシングルサイクルカイネティクス法で解析を行った。得られたデータの解析はＢＩＡ評価用ソフト（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。結果を表３０に示す。
（結果）
表３０より明らかなとおり、単発現株Ｃ１Ｆ、Ｃ２Ｆ及びＣ３Ｆから分泌されたｓｃＦｖは高いＫＤ値を示しており、ｈＣＴＬＡ‐４に対する親和性を有していた。共発現株のＰＣ４株及びＰＣ６株より分泌される抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖもＣ１Ｆ株由来のｓｃＦｖと同様のｈＣＴＬＡ−４に対する親和性を有すると推察される。同様に、共発現株のＰＣ２株及びＰＣ７株のｓｃＦｖはＣ２Ｆ株のｓｃＦｖと、ＰＣ３株、ＰＣ５株及びＰＣ８株のｓｃＦｖはＣ３Ｆ株のｓｃＦｖと同様のｈＣＴＬＡ−４に対する親和性を有すると推察される。
［実施例３０］
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１単独発現株より精製した抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１を用いた抗原への親和性（ビアコア））
共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株に対応する、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１単独発現ビフィドバクテリウム属細菌Ｃ１ＴＬＢ株、Ｃ２ＴＬＢ株及びＣ３ＴＬＢ株の培養上清より抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１をＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにてそれぞれ精製し、ｈＣＴＬＡ−４（ヒトＩｇＧ１Ｆｃとの融合タンパク）との結合カイネティックパラメータ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた表面プラズモン共鳴により行った。以下、実施例２９と同様に解析を行った。結果を表３０に示す。
（結果）
表３０から明らかなとおり、単発現株Ｃ１ＴＬＢ、Ｃ２ＴＬＢ及びＣ３ＴＬＢから分泌されたｓｃＦｖは高いＫＤ値を示しており、ｈＣＴＬＡ−４に対する親和性を有していた。共発現株のＰＣ４ＴＬ及びＰＣ６ＴＬ株より分泌されるｓｃＦｖもＣ１ＴＬＢ株由来のｓｃＦｖと同様のｈＣＴＬＡ−４に対する親和性を有すると推察される。同様に、共発現株のＰＣ２ＴＬ株及びＰＣ７ＴＬ株のｓｃＦｖはＣ２ＴＬＢ株のｓｃＦｖと、ＰＣ３ＴＬ株、ＰＣ５ＴＬ株及びＰＣ８ＴＬ株のｓｃＦｖはＣ３ＴＬＢ株のｓｃＦｖと同様のｈＣＴＬＡ−４に対する親和性を有すると推察される。
［実施例３１］
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ単独発現株より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓを用いた抗原への親和性（ビアコア））
共発現株ＰＣ２株〜ＰＣ８株に対応する、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ単独発現ビフィドバクテリウム属細菌Ｐ１Ｈ株、Ｐ２Ｈ株及びＰ３Ｈ株の培養上清より抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−ＨｉｓをＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにてそれぞれ精製し、ｈＰＤ−１（ヒトＩｇＧ１Ｆｃとの融合タンパク）との結合カイネティックパラメータ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた表面プラズモン共鳴によりおこなった。リガンドとしてＦｃ融合組換えｈＰＤ−１（Ｒ＆Ｄ）をキャプチャーした他は、実施例２９と同様に解析を行った。結果を表３１に示す。
(結果)
表３１から明らかなとおり、単発現株Ｐ１Ｈ、Ｐ２Ｈ及びＰ３Ｈから分泌されたｓｃＦｖは高いＫＤ値を示しており、ｈＰＤ−１に対する親和性を有していた。共発現株のＰＣ２株及びＰＣ３株より分泌されるｓｃＦｖもＰ１Ｈ株由来ｓｃＦｖと同様のｈＰＤ−１に対する親和性を有すると推察される。同様に、共発現株のＰＣ４株及びＰＣ５株のｓｃＦｖはＰ２Ｈ株のｓｃＦｖと、ＰＣ６株、ＰＣ７株及びＰＣ８株のｓｃＦｖはＰ３Ｈ株のｓｃＦｖと同様のｈＰＤ−１に対する親和性を有すると推察される。
［実施例３２］
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３単独発現株より精製した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３を用いた抗原への親和性（ビアコア））
共発現株ＰＣ２ＴＬ株〜ＰＣ８ＴＬ株に対応する、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３単独発現ビフィドバクテリウム属細菌Ｐ１ＴＬ株、Ｐ２ＴＬ株及びＰ３ＴＬ株の培養上清より抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３をＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにてそれぞれ精製し、ｈＰＤ−１（ヒトＩｇＧ１Ｆｃとの融合タンパク）との結合カイネティックパラメータ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた表面プラズモン共鳴によりおこなった。リガンドとしてＦｃ融合組換えｈＰＤ−１（Ｒ＆Ｄ）をキャプチャーした他は、実施例２９と同様に解析を行った。結果を表３１に示す。
(結果)
表３１から明らかなとおり、単発現株Ｐ１ＴＬ、Ｐ２ＴＬ及びＰ３ＴＬから分泌されたｓｃＦｖは高いＫＤ値を示しており、ｈＰＤ−１に対する親和性を有していた。共発現株のＰＣ２ＴＬ株及びＰＣ３ＴＬ株より分泌されるｓｃＦｖもＰ１ＴＬ株由来ｓｃＦｖと同様のｈＰＤ−１に対する親和性を有すると推察される。同様に、共発現株のＰＣ４ＴＬ株及びＰＣ５ＴＬ株のｓｃＦｖはＰ２ＴＬ株のｓｃＦｖと、ＰＣ６ＴＬ株、ＰＣ７ＴＬ株及びＰＣ８ＴＬ株のｓｃＦｖはＰ３ＴＬ株のｓｃＦｖと同様のｈＰＤ−１に対する親和性を有すると推察される。
［実施例３３］
（共発現株ＰＣ４株のｓｃＦｖによる抗原・リガンドの結合阻害活性）
共発現株ＰＣ４株の培養上清よりＨｉｓ−ｔａｇ用精製カラムにて抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓを、またＦＬＡＧ−ｔａｇ用精製カラムにて抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧを精製した。これらを用いて、各抗原との結合に対するリガンドとの競合活性（ＥＬＩＳＡ）の評価を行った。
（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の抗原との結合に対するヒトＰＤ−Ｌ１との競合活性）
試料添加操作を除き、実施例２１の（抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３の分泌評価）と同様の方法にて操作した。試料は、共発現株ＰＣ４株の培養上清よりＨｉｓ−ｔａｇ精製して得た２ｎＭ(固定濃度)の抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓと、各種濃度（６４０ｎＭ、３２０ｎＭ、１６０ｎＭ、８０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ、０ｎＭ）のヒトＰＤ−Ｌ１溶液（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１ＦｃＣｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、以下ｈＰＤ−Ｌ１という）との混合液を用いた。また、コントロールとして、２ｎＭの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ（Ｃ１Ｆ株由来）、６４０ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１を試料としたウェルも設けた。ｈＰＤ−１／抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓの結合に対するｈＰＤ−Ｌ１の結合阻害率を、式１により算出した。ＰＣ４株より精製したｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３とｈＰＤ−１の結合に対するｈＰＤ−Ｌ１による結合阻害活性について、結果を表３２に示す。
表３２からわかるように、ｈＰＤ−Ｌ１濃度が高くなるとともに吸光度は減少し、ｈＰＤ−Ｌ１の濃度依存的に、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓの抗原への結合は減少した。一方、２ｎＭの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの添加では、プレートへの結合は認められず、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓの固相化ヒトＰＤ−１への結合は、特異的結合であるといえる。また、ｈＰＤ−Ｌ１のみの添加でもプレートへの結合が認められないことより、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及びｈＰＤ−Ｌ１の混合液の添加によりプレートに結合したものは、抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓであるといえる。ｈＰＤ−１と抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓの結合に対するｈＰＤ−Ｌ１による結合阻害率を図３８に示した。ｈＰＤ−Ｌ１濃度依存的に、ｈＰＤ−１と抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓの結合は阻害されている。
（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１の抗原との結合に対するリガンドとの競合活性）
試料添加操作を除き、実施例２１の（抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１の分泌評価）と同様の方法にて操作した。試料は、共発現株ＰＣ４株よりＦＬＡＧ−ｔａｇ精製して得た１ｎＭの抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧと各種濃度のヒトＣＤ８０（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｂ７−１／ＣＤ８０ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、以下ｈＣＤ８０という）（３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、及び０ｎＭ）の混合液、及び１ｎＭの抗ｈＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧと各種濃度のヒトＣＤ８６（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｂ７−１／ＣＤ８６ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、以下ｈＣＤ８６という）（１００ｎＭ、８０ｎＭ，６０ｎＭ，４０ｎＭ，２０ｎＭ及び０ｎＭ）の混合液を用いた。また、コントロールとして、１ｎＭの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ（Ｐ２Ｈ株由来）、３０ｎＭのｈＣＤ８０のみ、或いは１００ｎＭのｈＣＤ８６のみを試料としたウェルも設けた。ｈＣＴＬＡ−４／抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの結合に対するｈＣＤ８０或いはｈＣＤ８６の結合阻害率を、式２により算出した。
（結果）
競合ＥＬＩＳＡの結果を、表３３（リガンドとしてｈＣＤ８０を使用）及び表３４（リガンドとしてｈＣＤ８６を使用）に示す。
表３３及び表３４からわかるように、ｈＣＤ８０或いはｈＣＤ８６の濃度が高くなるとともに吸光度は減少し、ｈＣＤ８０或いはｈＣＤ８６の濃度依存的に、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの抗原への結合は減少した。一方、１ｎＭの抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓの添加では、プレートへの結合は認めらなかった。これより、ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの固相化ヒトＣＴＬＡ−４への結合は、特異的結合であるといえる。また、ｈＣＤ８０のみ或いはｈＣＤ８６のみの添加でもプレートへの結合が認められないことより、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ及びｈＣＤ８０の混合液、或いは抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧ及びｈＣＤ８６の混合液の添加によりプレートに結合したものは、抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧであるといえる。
ｈＣＴＬＡ−４と抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの結合に対するｈＣＤ８０或いはｈＣＤ８６による結合阻害率を図３９及び図４０に示した。ｈＣＤ８０或いはｈＣＤ８６の濃度依存的に、ｈＣＴＬＡ−４と抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧの結合は阻害されている。
以上の結果より、共発現株ＰＣ４株より分泌した抗ｈＰＤ−１ｓｃＦｖ０３−Ｈｉｓ及び抗ｈＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖ０１−ＦＬＡＧは、それぞれ対応する抗原に対して、リガンドとの競合活性を有することが確認できた。

Claims (17)

  1. ビフィドバクテリウム属細菌内で発現する、以下の（１）〜（４）のＤＮＡを順次含む分泌発現カセットを、２種類含むことを特徴とする共発現プラスミドであって、
    （１）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターＤＮＡ；
    （２）分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ；
    （３）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
    （４）ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターＤＮＡ；
    かつ、分泌シグナルペプチドが、以下のａ）又はｂ）のアミノ酸配列を有することを特徴とする共発現プラスミド。
    ａ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列；
    ｂ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７に示されるアミノ酸配列のいずれかとの配列同一性が９５％以上である、アミノ酸配列からなるペプチドがビフィドバクテリウム属細菌において分泌シグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列；
  2. 分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの下流にリンカーペプチドをコードするＤＮＡが連結されていることを特徴とする請求項１記載の共発現プラスミド。
  3. ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターが、Ｐ３０プロモーター、Ｐ５４プロモーター及びＨｕプロモーターから選択される１又は２のプロモーターであることを特徴とする請求項１又は２記載の共発現プラスミド。
  4. ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターが、Ｈｕターミネーター及びＴ２ターミネーターから選択される１又は２のターミネーターであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の共発現プラスミド。
  5. 異種ポリペプチドが、一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の共発現プラスミド。
  6. 一本鎖抗体が、抗ＰＤ−１抗体であることを特徴とする請求項５記載の共発現プラスミド。
  7. 一本鎖抗体が、抗ＣＴＬＡ−４抗体であることを特徴とする請求項５記載の共発現プラスミド。
  8. 一本鎖抗体が、抗ＨＥＲ２抗体であることを特徴とする請求項５記載の共発現プラスミド。
  9. 異種ポリペプチドが、サイトカインであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の共発現プラスミド。
  10. サイトカインが、ＴＮＦ−αであることを特徴とする請求項９記載の共発現プラスミド。
  11. サイトカインが、ＩＦＮ−γであることを特徴とする請求項９記載の共発現プラスミド。
  12. 異種ポリペプチドが、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の共発現プラスミド。
  13. 異種ポリペプチドが、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γとの組合せであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の共発現プラスミド。
  14. 異種ポリペプチドが、抗ＨＥＲ２抗体とＩＦＮ−γとの組合せであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の共発現プラスミド。
  15. 請求項１〜１４のいずれか記載の共発現プラスミドで形質転換されたビフィドバクテリウム属細菌。
  16. ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項１５記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  17. 請求項１５又は１６記載のビフィドバクテリウム属細菌を含む医薬組成物。
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