KR20170088866A - 공발현 플라스미드 - Google Patents

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코이치로 시오야
사토시 고바야시
유코 시마타니
타케시 마사키
히토미 시미즈
토미오 마츠무라
마사미 오카베
켄고 이노우에
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가부시키가이샤 아네로파마·사이엔스
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Abstract

본 발명은 고형 종양 조직, 허혈성 질환 부위 등의 혐기성 부위에 있어서, 보다 치료 효과가 높은 혐기성 장내 세균을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명에 있어서, 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터 DNA; 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA; 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA; 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA;를 순차적으로 포함하는 분비 발현 카세트를 2 종류 포함하는, 2종의 이종 폴리펩티드를 공발현하는 플라스미드로 형질 전환된 비피도박테리움 세균이, 효율적으로 2종의 항암 작용을 갖는 항체 등의 이종 폴리펩티드를 균체 밖으로 분비한다.

Description

공발현 플라스미드{COEXPRESSION PLASMID}
본 발명은 비피도박테리움 속(屬) 세균에서 기능하는 프로모터 DNA； 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA； 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA； 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA； 를 순차적으로 포함하는 분비 발현 카세트를 2 종류 포함하는 것을 특징으로 하는 공발현(共發現) 플라스미드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 공발현 플라스미드로 형질 전환된 비피도박테리움 속 세균이나, 그 세균을 포함하는 의약 조성물 등에 관한 것이다.
암 등의 질병에 대하여, 지금까지 수많은 치료약이 제안되고 있지만, 모두 그 효과에는 한계가 지적되고 있어, 보다 높은 효과가 기대되는 치료약이나 치료법의 개발이 요구되고 있다. 최근, 유전자 수송 담체를 이용하는 치료 방법의 개발이 진행되고 있다. 예를 들어, 혐기성 장내 세균에 대하여, 전신 투여 후, 저산소의 고형 종양에 축적하는 성질을 이용하여, 항종양 활성을 갖는 단백질 또는 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 변환하는 활성을 갖는 단백질을 발현하는 유전자를 표적 환부에 있어서 발현할 수 있는 형질 전환 미생물(예를 들어, 특허 문헌 1 참조) 등이 제안되어, 전신 투여에서는 부작용이 불가피한 약제를, 종양 국소에 고농도이면서 효과적으로 수송(delivery)하는 것이 가능한 새로운 기술로서 그 발전이 기대되고 있다.
또한, 프로모터, 신호 서열(signal sequence)을 코딩하는 DNA, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 또는 이들 DNA를 삽입하기 위한 클로닝 부위를 포함하는 발현 카세트(예를 들어, 특허 문헌 2 참조)가 제안되고 있다.
(특허 문헌 1) 국제 공개 팜플렛 WO2009/128272호 (특허 문헌 2) 국제 공개 팜플렛 WO2010/126073호
상기 문헌에 있어서 제안되고 있는 신호 서열을 코딩하는 DNA는, 막 단백질이나 분비 단백질에 발견된 신호 서열로, 보다 분비 효율이 뛰어난 신호 서열로서 특정하는 것이 기대되고 있는 동시에, 보다 치료 효과가 높은 이종 단백질 분비 발현 플라스미드나, 이러한 분비 발현 플라스미드로 형질 전환된 혐기성 장내 세균의 개발이 기대되고 있다.
본 발명의 과제는 고형 종양 조직, 허혈성 질환 부위 등의 혐기성 부위에 있어서, 보다 치료 효과가 높은 혐기성 장내 세균을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터 DNA； 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA； 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA； 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA； 를 순차적으로 포함하는 분비 발현 카세트를 2 종류 포함하는 것을 특징으로 하는 2종의 이종(異種) 폴리펩티드를 공발현(共發現)하는 플라스미드로 형질 전환된 비피도박테리움 속 세균이 이종 폴리펩티드의 단독 발현주(發現株)와 비교하여, 현저하게 높은 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 아래와 같다.
［1］ 비피도박테리움 속 세균 내에서 발현하는 아래의 (1)~(4)의 DNA를 순차적으로 포함하는 분비 발현 카세트를, 2 종류 포함하는 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
(1) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터 DNA；
(2) 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA；
(3) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA；
(4) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA；
［2］ 상기 ［1］에 있어서, 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA의 하류에 링커 펩티드를 코딩하는 DNA가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［3］ 상기 ［1］ 또는 ［2］에 있어서, 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터가 P30 프로모터, P54 프로모터 및 Hu프로모터에서 선택되는 1개 또는 2개의 프로모터인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［4］ 상기 ［1］ 내지 ［3］ 중 어느 하나에 있어서, 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터가 Hu터미네이터 및 T2 터미네이터에서 선택되는 1개 또는 2개의 터미네이터인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［5］ 상기 ［1］ 내지 ［4］ 중 어느 하나에 있어서, 분비 신호 펩티드가 아래의 a) 또는 b)의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
a) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열；
b) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로서, 그 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가 비피도박테리움 속 세균에 있어서 분비 신호 펩티드로서 기능하는 아미노산 서열；
［6］ 상기 ［1］ 내지 ［5］ 중 어느 하나에 있어서, 이종 폴리펩티드가 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［7］ 상기 ［6］에 있어서, 단일 사슬 항체가 항PD-1 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［8］ 상기 ［6］에 있어서, 단일 사슬 항체가 항CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［9］ 상기 ［6］에 있어서, 단일 사슬 항체가 항HER2 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［10］ 상기 ［1］ 내지 ［5］ 중 어느 하나에 있어서, 이종 폴리펩티드가 사이토카인인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［11］ 상기 ［10］에 있어서, 사이토카인이 TNF-α인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［12］ 상기 ［10］에 있어서, 사이토카인이 IFN-γ인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［13］ 상기 ［1］ 내지 ［5］ 중 어느 하나에 있어서, 이종 폴리펩티드가 항PD-1 항체와 항CTLA-4 항체의 조합인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［14］ 상기 ［1］ 내지 ［5］ 중 어느 하나에 있어서, 이종 폴리펩티드가 TNF-α와 IFN-γ의 조합인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［15］ 상기 ［1］ 내지 ［5］ 중 어느 하나에 있어서, 이종 폴리펩티드가 항HER2 항체와 IFN-γ의 조합인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
［16］ 상기 ［1］ 내지 ［15］ 중 어느 하나에 따른 공발현 플라스미드로 형질 전환된 비피도박테리움 속 세균.
［17］ 상기 ［16］에 있어서, 비피도박테리움ㆍ롱검인 비피도박테리움 속 세균.
［18］ 상기 ［16］ 또는 ［17］에 따른 비피도박테리움 속 세균을 포함하는 의약 조성물.
본 발명에 의하면, 이종 폴리펩티드의 분비가 뛰어난 발현 카세트를, 동일 플라스미드 내에서 2 종류 병용함으로써, 효율적으로 2종의 이종 폴리펩티드를 균체 밖으로 분비할 수 있는 비피도박테리움 속 세균을 제공할 수 있고, 상기 2 종류의 이종 폴리펩티드가 항PD-1 항체, 항CTLA-4 항체 등의 항암 작용을 갖는 항체 등인 경우, 2종의 이종 폴리펩티드의 상승 효과에 의해, 이러한 비피도박테리움 속 세균은 항암제로서 매우 유용하다.
도 1은 플라스미드 pSP3B-TNFα의 구성을 나타내는 도면이다.
도 2는 플라스미드 pHG-2의 구성을 나타내는 도면이다.
도 3은 플라스미드 pTNF11의 구성을 나타내는 도면이다.
도 4는 (a)는 플라스미드 phIFNg33의 구성을, (b)는 플라스미드 phIFNg33TL의 구성을 각각 나타내는 도면이다.
도 5는 AG8TL주 배양 상청 조정제물(粗精製物)의 KPL-1 세포에 대한 세포 증식 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 AG8TL주 배양 상청 조정제물의 MIA PaCa-2 세포에 대한 세포 증식 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 AG8TL주의 배양 상청 조정제물의 세포 증식 억제 활성의 중화 항체(中和抗體) 첨가에 의한 중화의 효과를 검토한 그래프이다.
도 8은 (A)는 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 구성을, (B)는 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02의 구성을, (C)는 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG의 구성을 각각 나타내는 도면이다.
도 9는 (a)는 플라스미드 pPC1의 구성을, (b)는 플라스미드 pCP1의 구성을 각각 나타내는 도면이다.
도 10은 (A)는 항hPD-1scFv의 발현 확인을, (B)는 항hCTLA-4scFv의 발현 확인을 각각 나타내는 도면이다.
도 11은 인간 PD-1 고상화(固相化) 플레이트에 대한 항hPD-1scFv03의 특이적 결합을 나타내는 그래프이다.
도 12는 인간 CTLA-4 고상화 플레이트에 대한 항hCTLA-4scFv02의 특이적 결합을 나타내는 그래프이다.
도 13은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1과의 결합 반응에서의 항hPD-1scFv03의 경합적 결합 저해를 나타내는 그래프이다.
도 14는 인간 CTLA-4에 대한 인간 CD80과의 결합 반응에서의 항hCTLA-4scFv02의 경합적 결합 저해를 나타내는 그래프이다.
도 15는 인간 CTLA-4에 대한 인간 CD86과의 결합 반응에서의 항hCTLA-4scFv02의 경합적 결합 저해를 나타내는 그래프이다.
도 16은 PC1주에서 정제한 항hPD-1scFv03의 인간 PD-1 과잉 발현 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프이다.
도 17은 PC1주에서 정제한 항hCTLA-4scFv02의 인간 CTLA-4 과잉 발현 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프이다.
도 18은 웨스턴 해석에 의한, HG-2주에서의 항HER2scFv 및 hIFN-γ의 분비 확인을 나타내는 도면이다.
도 19는 HG-2주 배양 상청 농축물의 항HER2scFv의 HER2 양성 세포 증식 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 20은 HG-2주 배양 상청 농축물의 HER2 양성 세포에 대한 세포 증식 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 21은 (A)는 HG-2주의 그람 염색도를 나타내고, (B)는 BEshuttle주의 그람 염색도를 나타낸다.
도 22는 (A)는 HG-2주의 항hIFN-γ항체에 의한 면역 조직 염색도를 나타내고, (B)는 BEshuttle주의 항hIFN-γ항체에 의한 면역 조직 염색도를 나타낸다.
도 23은 (A)는 HG-2주의 항히스티딘 태그 항체에 의한 면역 조직 염색도를 나타내고, (B)는 BEshuttle주의 항히스티딘 태그 항체에 의한 면역 조직 염색도를 나타낸다.
도 24는 공발현 플라스미드 pPC2-pPC8의 구성의 개요를 나타내는 도면이다.
도 25는 공발현 플라스미드 pPC2-pPC8의 구축 방법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 26은 항인간 CTLA-4scFv02 발현 플라스미드의 구축 방법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 27은 pP30SPxLy-hCTLA-4scFv01-His의 구축 방법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 28은 pP30SPxLy-hCTLA-4scFv01-FLAG(pC1F-pC3F)의 구축 방법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 29는 공발현 플라스미드 pPC2TL-pPC8TL의 구성의 개요를 나타내는 도면이다.
도 30은 공발현 플라스미드 pPC2TL-pPC8TL의 구축 방법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 31은 웨스턴 해석에 의한, 각 주에서의 항hPD-1scFv03-His(a) 및 항hCTLA-4scFv01-FLAG(b)의 분비 확인을 나타내는 도면이다.
도 32는 항hCTLA-4scFv01 단독 발현주(pC1TLB, pC2TLB, pC3TLB)의 구축 방법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 33은 C1F주, C2F주, 및 C3F주 유래 scFv의 인간 CTLA-4 발현 세포에 대한 결합을, 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하여 해석한 도면이다.
도 34는 C1TLB주, C2TLB주, 및 C3TLB주 유래 scFv의 인간 CTLA-4 발현 세포에 대한 결합을, 유세포 분석을 이용하여 해석한 도면이다.
도 35는 P1H주, P2H주, 및 P3H주 유래 scFv의 인간 PD-1 발현 세포에 대한 결합을, 유세포 분석을 이용하여 해석한 도면이다.
도 36은 P1TL주, P2TL주 및 P3TL주 유래 scFv의 인간 PD-1 발현 세포에 대한 결합을, 유세포 분석을 이용하여 해석한 도면이다.
도 37은 (a) 항인간 PD-1 항체(EH12. 2 H7)의 인간 PD-1 발현 세포에 대한 결합, (b) 항인간 CTLA-4 항체(L3D10)의 인간 CTLA-4 발현 세포에 대한 결합, (c) PC4 유래 scFv의 인간 PD-1 발현 세포에 대한 결합, (d) PC4 유래 scFv의 인간 CTLA-4 발현 세포에 대한 결합을, 유세포 분석을 이용하여 해석한 도면이다.
도 38은 PC4주에서 정제한 hPD-1scFv03-His와 hPD-1의 결합에 대한 hPD-L1에 의한 결합 저해 활성을 나타내는 그래프이다.
도 39는 PC4주에서 정제한 hCTLA-4scFv01-FLAG와 hCTLA-4의 결합에 대한 hCD80에 의한 결합 저해 활성을 나타내는 그래프이다.
도 40은 PC4주에서 정제한 hCTLA-4scFv01-FLAG와 hCTLA-4의 결합에 대한 hCD86에 의한 결합 저해 활성을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 공발현 플라스미드로서는 (1) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터 DNA； (2) 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA； (3) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA； (4) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA；의 각 DNA를 순차적으로 포함하는 분비 발현 카세트를 2 종류 포함하는 한편, 비피도박테리움 속 세균으로 형질 전환되었을 경우에, 2종의 이종 폴리펩티드를 공발현할 수 있는 플라스미드이면 특별히 제한되지 않고, 상기 각 DNA 단편(斷片)의 3' 말단과 그 하류의 각 DNA의 5' 말단은, 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한, 직접 연결되어 있지 않을 수도 있지만, 직접 연결되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 프로모터 DNA로서는 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터 DNA이면 특별히 제한되지 않고, 비피도박테리움ㆍ롱검 유래의 히스톤 유사 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 따른 프로모터인 Hu프로모터 DNA나, P30 프로모터 DNA(J. Microbiology, 2012, 638-643)나, Elongation Factor Tu단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 따른 프로모터인 P54 프로모터 DNA(J.Bacteriology, 2005, 5799-5808, J. Microbiology, 2012, 638-643)나, 비피도박테리움ㆍ브레브 유래 Gap 유전자의 프로모터 DNA(Biotechnol. Lett. 2008 30:1983-1988)나, 비피도박테리움ㆍ롱검 유래 AmyB 유전자의 프로모터 DNA(Biotechnol. Lett. 2006 28:163-168)나, 16 SrRNA 프로모터 DNA(Biotechnol. Lett. 2008 30:165-172), GAPDH(pr-BL1363) 유전자의 프로모터 DNA(Appl Environ Microbiol. 2006 72(11):7401-7405), PRPL 프로모터 DNA(Cancer Gene Ther. 2007 14:151-157), p572(β-glycosidase from B. animalis subsp lactis) 유전자의 프로모터 DNA(J. Microbiol Biotechnol. 2012 Dec； 22(12):1714-23), p919 유전자의 프로모터(rplM promoter) DNA(J Microbiol. 2012 Aug； 50(4):638-43), p895 유전자의 프로모터(rplR promoter) DNA(J. Microbiology, 2012, 638-643)를 예시할 수 있다. 또한, 상기 이종 폴리펩티드의 분비가 뛰어난 발현 카세트마다, 프로모터는 상이한 것이 바람직하고, 구체적으로는 Hu프로모터 DNA와 P30 프로모터 DNA, Hu프로모터 DNA와 P54 프로모터 DNA, P54 프로모터 DNA와 P30 프로모터 DNA의 조합을 들 수 있다.
본 발명에서의 분비 신호 펩티드로서는 a) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 즉 각각 SP7, SP45, SP50, SP52, SP55, SP58, SP64, SP66, SP67, SP68, 및 SP69를 들 수 있고, 그 중에서도, 서열 번호 56으로 표시되는 SP7이나 서열 번호 66으로 표시되는 SP69를 바람직하게 들 수 있다. 또한, b) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드로서, 그 펩티드가 비피도박테리움 속 세균에 있어서 분비 신호 펩티드로서 기능하는 펩티드(변이 분비 신호 펩티드)를 들 수 있다. 상기 「1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열」이란, 예를 들어 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 보다 더 바람직하게는 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 의미하고, 상기 변이 분비 신호 펩티드의 아미노산 서열로서는 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나와의 서열 동일성이 90% 이상인 것이 바람직하고, 95% 이상인 것이 보다 바람직하고, 98% 이상인 것이 보다 더 바람직하다.
상기 a)에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA로서는 상기 a)에 나타나는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 갖는 DNA이면 특별히 제한되지 않고, 따라서 코돈의 축중(縮重)에 의해 상이한 DNA도 포함되지만 예를 들어, 서열 번호 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 및 76 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열(서열표 상단)로 이루어지는 DNA를 들 수 있고, 이러한 DNA는 화학 합성, 유전자 공학적 수법 등의 당업자에게 이미 알려진 방법에 의해 제작할 수 있다.
상기 b)에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA로서는 상기 b)에 나타나는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 갖는 DNA이면 특별히 제한되지 않고, 따라서 코돈의 축중에 의해 상이한 DNA도 포함되지만, 이러한 DNA는 화학 합성, 유전자 공학적 수법, 돌연변이 유발 등의 당업자에게 이미 알려진 방법에 의해 제작할 수도 있다. 예를 들어, 서열 번호 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 및 76 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA에 대하여, 변이원이 되는 약제와 접촉 작용시키는 방법, 자외선을 조사하는 방법, 유전자 공학적인 수법 등을 이용하여, 이들 DNA에 변이를 도입함으로써, 변이 DNA를 수득할 수 있다. 유전자 공학적 방법의 하나인 부위 특이적 변이 유발법은 특정 위치에 특정 변이를 도입할 수 있는 수법이므로 유용하고, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38, John Wiley & Sons(1987-1997) 등에 기재된 방법에 준해 수행할 수 있다.
상기 분비 신호 펩티드는 이종 폴리펩티드의 발현ㆍ분비 효율의 관점에서, 링커 펩티드와 연결된 신호 펩티드-링커 연결체로 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 링커 펩티드로서는 본 발명에서의 상기 분비 신호 펩티드의 C말단에 연결하여 이용되고, 이종 폴리펩티드의 발현ㆍ분비 효율을 높일 수 있는 펩티드이면 특별히 제한되지 않고, 아미노산 0~30잔기의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 바람직하게 들 수 있지만, 구체적으로는 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주로부터 동정(同定)된 상기 각 분비 신호 펩티드에 계속되는 아래에 나타나는 11 종류의 아미노산 서열에 있어서, 각 서열의 0번째에서 30번째 중 어느 하나까지의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드를 들 수 있다.
1) 서열 번호 79로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP7의 하류)；
2) 서열 번호 81로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP45의 하류)；
3) 서열 번호 83으로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP50의 하류)；
4) 서열 번호 85로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP52의 하류)；
5) 서열 번호 87로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP55의 하류)；
6) 서열 번호 89로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP58의 하류)；
7) 서열 번호 91로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP64의 하류)；
8) 서열 번호 93으로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP66의 하류)；
9) 서열 번호 95로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP67의 하류)；
10) 서열 번호 97로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP68의 하류)；
11) 서열 번호 99로 표시되는 링커 펩티드 서열(SP69의 하류)；
상기 링커 펩티드의 아미노산 잔기 수로서는 0~30잔기를 들 수 있고 0~25잔기가 바람직하고, 0~20잔기가 보다 바람직하고, 0~15잔기가 보다 더 바람직하고, 0~10잔기가 보다 더 바람직하고, 1~10잔기가 특히 바람직하다.
또한, 각 서열의 0번째에서 30번째 중 어느 하나까지의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드를 코딩하는 DNA 서열로서는 아래의 서열을 예시할 수 있다.
1) 서열 번호 78로 표시되는 DNA 서열(SP7의 하류)；
2) 서열 번호 80으로 표시되는 DNA 서열(SP45의 하류)；
3) 서열 번호 82로 표시되는 DNA 서열(SP50의 하류)；
4) 서열 번호 84로 표시되는 DNA 서열(SP52의 하류)；
5) 서열 번호 86으로 표시되는 DNA 서열(SP55의 하류)；
6) 서열 번호 88로 표시되는 DNA 서열(SP58의 하류)；
7) 서열 번호 90으로 표시되는 DNA 서열(SP64의 하류)；
8) 서열 번호 92로 표시되는 DNA 서열(SP66의 하류)；
9) 서열 번호 94로 표시되는 DNA 서열(SP67의 하류)；
10) 서열 번호 96으로 표시되는 DNA 서열(SP68의 하류)；
11) 서열 번호 98로 표시되는 DNA 서열(SP69의 하류)；
본 발명의 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체를 코딩하는 DNA 영역으로서는 상기 각 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA의 5' 말단에서, 각 분비 신호 펩티드의 하류에 있는 상기 링커 펩티드를 코딩하는 DNA의 3' 말단까지를 포함하는 DNA 영역을 말하고, 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA의 3' 말단과, 링커 펩티드를 코딩하는 DNA의 5' 말단이 연결되어 있으므로, SPxLy(단, x는 분비 신호 펩티드의 본 명세서에서의 번호, y는 링커 펩티드의 아미노산 잔기 수)로 칭할 수 있다. 구체적으로는 SP7L20, SP45L20, SP50L20, SP52L20, SP55L20, SP58L20, SP64L20, SP66L20, SP67L20, SP68L20, SP69L20 등을 들 수 있다. 예를 들어, SP67L20은 서열 번호 73의 아미노산 서열에 서열 번호 95의 최초 20개의 아미노산 서열이 결합한 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체를 나타낸다. 그 중에서도, SP50L1~L15, SP67L1~L15, SP68L1~L15, SP69L1~L15가 바람직하고, SP50L1~L10, SP67L1~L10, SP68L1~L10, SP69L1~L10이 바람직하고, SP50L5, SP67L1, SP67L10, SP68L1, SP69L1이 특히 바람직하다. 그리고 상기 L1~L15는 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15를 나타내고, L1~L10은 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10을 나타낸다.
상기 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로서는 본 발명에서의 분비 발현 카세트에 있어서 발현할 수 있는 비피도박테리움 속 세균 이외에 유래하는 폴리펩티드이면 특별히 제한되지 않고, 인터페론(IFN)-α,β,γ, 과립구 대식세포 증식 자극인자(GM-CSF), 인터루킨(IL)-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-27, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 림프독소(LT)-β, 과립구 집락 자극인자(G-CSF), 대식세포 증식 자극인자(M-CSF), 대식세포 이동저해인자(MIF) 등의 사이토카인을 코딩하는 DNA나, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 크링글(NH4) 등의 혈관 신생 억제 물질을 코딩하는 DNA를 들 수 있는 것 외에, 5-플루오로우라실의 프로드러그(prodrug)인 5-플루오로시토신을 5-플루오로우라실로 변환하는 효소인 시토신ㆍ데아미나아제를 코딩하는 DNA나, 니트로아로마틱(nitroaromatic) 골격을 갖는 프로드러그 항암제의 니트로기를 환원하여 활성화시키는 효소인 니트로리덕타아제(nitroreductase) DNA 등을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에는 폴리펩티드의 단리 처리 등에서의 편의성을 위해, 히스티딘(His) 태그, FLAG 태그 등의 어피니티 태그(Affinity Tag)를 코딩하는 DNA를 적절히 부가할 수도 있다.
상기 항체로서는 인터루킨 6(IL-6) 수용체를 표적 분자로 하는 류머티즘 치료약에 이용되는 항체나, α4-인테그린(integrin)을 표적 분자로 하는 다발성 경화증 치료약에 이용되는 항체나, CD20, CD33, PD-1, CTLA-4, PD-L1, CD80, CD86, LAG3, TIM3, KIR을 표적으로 하는 항암 작용을 갖는 항체, OX40, CD137, ICOS 등의 아고니스트 항체나, HER2, EGFR, CEA, HGF, EpCAM(CD326), cMET, CCR4에 특이적으로 결합하는 항체 등을 예시할 수 있다.
그 중에서도, 항PD-1 항체는 활성화된 림프구(T세포, B세포)에 발현하는 PD-1 수용체에 결합함으로써, 암 세포가 발현하는 PD-L1이나 PD-L2와 PD-1 수용체가 결합하는 것을 저해하는 결과, 종양 세포에 대한 면역 반응이 증강되므로, 바람직하게 예시할 수 있다. 또한, 항CTLA-4 항체는 자기면역 기능의 억제 분자로서 알려져 있는 CTLA-4의 기능을 억제함으로써 항종양 면역 응답을 증강한다. 즉, 항CTLA-4 항체는 항원 제시 세포에 발현된 CD80나 CD86에 대한 CTLA-4의 결합을 저지함으로써, 이러한 분자의 상호작용에 의해 유발되는 면역 응답의 부의 하부 제어를 저지함으로써 항종양 면역 응답을 증강한다고 생각되므로, 바람직하게 예시할 수 있다. 또한, 항HER-2(human EGFR-related2) 항체는 암 유전자 HER2/neu(c-erbB-2)의 유전자 산물인 HER2 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 증식 신호를 억제함으로써, 항종양 효과를 발휘한다고 생각되므로, 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로서는 키메라 항체, 인간화 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 단일 사슬 항체(scFv：single chain Fv) 등을 코딩하는 DNA를 들 수 있지만, 그것 자체로 표적 물질을 인식ㆍ결합할 수 있고, 분자량이 너무 크지 않고, 비피도박테리움 속 세균 내에 도입되었을 경우에도 발현 가능한 단일 사슬 항체를 코딩하는 DNA가 바람직하다. 이들 항체를 포함하는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 그 서열 정보를, 공지된 문헌이나 GenBank 등의 데이터베이스로부터 적절히 입수하여, 화학 합성, 유전자 공학적 수법 등의 공지된 방법에 의해 제작할 수도 있다.
본 발명에서의 상기 이종 폴리펩티드의 2종의 조합으로서는 비피도박테리움 속 세균은 생체에 전신 투여하면 정상 조직에서는 증식하지 않고, 고형 종양 조직, 허혈성 질환 부위 등의 혐기성 부위에 선택적으로 분포ㆍ생착(生着)하므로 혐기성 질환 부위에서 국소적으로 공발현시켰을 경우에 상승적인 병용 효과가 기대되는 조합이 바람직하고, 구체적으로는 TNF-α와 IFN-γ의 조합이나, 항PD-1 항체와 항CTLA-4 항체의 조합이나, 항HER2 항체와 IFN-γ의 조합이나, 항PD-1 항체와 IFN-γ의 조합이나, 항PD-1 항체와 항HER2 항체의 조합이나, 항PD-1 항체와 항EpCAM 항체의 조합을 들 수 있다.
상기 터미네이터 DNA로서는 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는 비피도박테리움ㆍ롱검 유래의 Hu터미네이터 DNA； 비피도박테리움ㆍ롱검 유래의 젖산 탈수소 효소 유전자의 터미네이터인 d0013 터미네이터 DNA； 비피도박테리움ㆍ애니멀리스 유래의 T572 터미네이터 DNA(J. Microbiol Biotechnol. 2012 Dec； 22(12):1714-23) 외에, 인공적으로 디자인된 터미네이터인 BBa_B0015 (T2) 터미네이터) DNA；를 들 수 있다. 또한, 상기 이종 폴리펩티드의 분비가 뛰어난 발현 카세트마다, 터미네이터는 상이한 것이 바람직하고, 구체적으로는 Hu터미네이터 DNA와 d0013 터미네이터 DNA, Hu터미네이터 DNA와 T572 터미네이터 DNA, Hu터미네이터 DNA와 T2 터미네이터 DNA, d0013 터미네이터 DNA와 T572 터미네이터 DNA, d0013 터미네이터 DNA와 T2 터미네이터 DNA, T572 터미네이터 DNA와 T2 터미네이터 DNA의 조합 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 분비 발현 카세트, 바람직하게는 링커 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 분비 발현 카세트의 제작 방법으로서는
(1) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터 DNA；
(2) 아래의 a) 또는 b)에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA；
a) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열；
b) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열이며, 그 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가 비피도박테리움 속 세균에 있어서 신호 펩티드로서 기능하는 아미노산 서열；
(3) 링커 펩티드를 코딩하는 DNA；
(4) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA；
(5) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA；
의 각 DNA를, (1)을 상류측으로 하고, (5)를 하류측으로 하여, (1)~(5)의 DNA를 순차적으로 포함하도록 연결하는 방법을 예시할 수 있고, 본 발명에서의 분비 발현 카세트의 제작은 시판의 실험서 예를 들어, 유전자 메뉴얼 코단샤, 타카기 야스유키 편찬 유전자 조작 실험법 코단샤, 모레큘러ㆍ클로닝［콜드ㆍ스프링ㆍ하버ㆍ래버러토리(1982)］, 모레큘러ㆍ클로닝 제 2판［콜드ㆍ스프링ㆍ하버ㆍ래버러토리(1989)］, 메쏘드ㆍ인ㆍ엔지몰로지 194(1991), 실험 의학 별책ㆍ효모에 의한 유전자 실험법, 요도샤(1994) 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명의 분비 발현 카세트를 2 종류 포함하는 공발현 플라스미드를 제작하기 위해 이용할 수 있는 플라스미드 벡터로서는 본 발명에서의 발현 카세트를 2 종류 삽입할 수 있고, 비피도박테리움 속 세균에 형질 전환되었을 경우에 2종의 이종 폴리펩티드를 분비 발현할 수 있는 플라스미드 벡터이면 특별히 제한되지 않고, 비피도박테리움 속 세균 이외의 균, 예를 들어 대장균에 있어서도 기능하는 pUCori 등의 복제 개시점을 더 갖는 셔틀 플라스미드 벡터를 유리하게 이용할 수도 있다.
비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 플라스미드 복제 유닛을 갖는 플라스미드 벡터의 구체적인 예로서는 pTB6(Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Feb； 69(2):422-5), pMB1(Lett Appl Microbiol. 1990 Oct； 11(4):220-3), pTB4(Bifidobacterium longum 유래의 플라스미드 pTB4의 구조 해석과 응용 일반 연제(一般演題) 포스터 발표 프로그램 - 일본 분자생물학회, 1994), pFI2576(J Microbiol Biotechnol. 2009 Apr； 19(4):403-8), pCIBAO(Appl Environ Microbiol. 2007 Dec； 73(24):7858-66), pBC1(Plasmid. 2007 Mar； 57(2):165-74), pDOJH10S(Appl Environ Microbiol. 2006 Jan； 72(1):527-35), PKJ50(Microbiology 1999 Mar； 145 (Pt ):585-92)를 예시할 수 있고, 복제 유닛으로서는 pTB6 유래의 OriV 영역 및 RepB 유전자로 이루어지는 pTB6rep 유닛을 바람직하게 들 수 있다. 비피도박테리움 속 세균 이외의 균, 예를 들어 대장균에서 각각 기능하는 pUCori 등의 복제 개시점을 더 갖는 셔틀 플라스미드 벡터를 이용할 수도 있다.
또한, 상기 플라스미드에는 약제 내성 등의 마커 유전자를 포함할 수도 있다. 이러한 약제 내성 마커 유전자로서는 스펙티노마이신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 암피실린 등의 각 내성 유전자를 예시할 수 있다.
본 발명에서의 플라스미드를, 비피도박테리움 속 세균에 도입하는 방법으로서는 일렉트로포레이션(electroporation)법 등의 공지된 유전자 도입 방법을 들 수 있다.
본 발명에서의 비피도박테리움 속 세균으로서는 비피도박테리움ㆍ롱검, 비피도박테리움ㆍ브레브(B. breve), 비피도박테리움ㆍ아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움ㆍ비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움ㆍ슈도롱검(B. pseudolongum), 비피도박테리움ㆍ서모필룸(B. thermophilum), 비피도박테리움ㆍ인판티스(B. infantis), 비피도박테리움ㆍ애니멀리스(B. animalis), 비피도박테리움ㆍ앙굴라툼(B. angulatum), 비피도박테리움ㆍ아스테로이데스(B. asteroides), 비피도박테리움ㆍ보움(B. boum), 비피도박테리움ㆍ카테눌라툼(B. catenulatum), 비피도박테리움ㆍ코에리넘(B. choerinum), 비피도박테리움ㆍ코리네폼(B. coryneforme), 비피도박테리움ㆍ쿠니쿨리(B. cuniculi), 비피도박테리움ㆍ덴티콜렌스(B. denticolens), 비피도박테리움ㆍ덴티움(B. dentium), 비피도박테리움ㆍ갈리쿰(B. gallicum), 비피도박테리움ㆍ갈리나룸(B. gallinarum), 비피도박테리움ㆍ글로보숨(B. globosum), 비피도박테리움ㆍ인디쿰(B. indicum), 비피도박테리움ㆍ이노피나툼(B. inopinatum), 비피도박테리움ㆍ락티스(B. lactis), 비피도박테리움ㆍ락텐티스(B. lactentis), 비피도박테리움ㆍ마그눔(B. magnum), 비피도박테리움ㆍ메리시쿰(B. merycicum), 비피도박테리움ㆍ미니뭄(B. minimum), 비피도박테리움ㆍ몽골리아 엔스(B. Mongolia Enns), 비피도박테리움ㆍ파뷸로룸(B. parvulorum), 비피도박테리움ㆍ슈도카테눌라툼(B. pseudocatenulatum), 비피도박테리움ㆍ사이크라에로피룸(B.psychraerophilum), 비피도박테리움ㆍ풀로룸(B. pullorum), 비피도박테리움ㆍ루미나레(B. ruminale), 비피도박테리움ㆍ루미난티움(B. ruminantium), 비피도박테리움ㆍ사에쿨라레(B. saeculare), 비피도박테리움ㆍ스카르도비(B. scardovii), 비피도박테리움ㆍ서브타일(B. subtile), 비피도박테리움ㆍ수이스(B. suis), 비피도박테리움ㆍ써마시도필룸(B. thermacidophilum) 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도, 연령에 관계없이 인간의 장내에 상주하고 있다고 알려져 있는 비피도박테리움ㆍ롱검, 비피도박테리움ㆍ브레브, 비피도박테리움ㆍ아돌레센티스, 비피도박테리움ㆍ비피덤, 비피도박테리움ㆍ인판티스를 숙주 세포로 이용하는 것이 바람직하고, 비피도박테리움ㆍ롱검을 이용하는 것이 보다 바람직하다. 이러한 균은 모두 시판되고 있거나, 또는 기탁 기관 등으로부터 용이하게 입수할 수 있다.
또한, 각각의 균주에 대해서도 특별히 한정되지 않고 예를 들어, 비피도박테리움ㆍ롱검에 대해서는 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주, 비피도박테리움ㆍ롱검 aE-194 b주, 비피도박테리움ㆍ롱검 bs-601주, 비피도박테리움ㆍ롱검 M101-2주, 비피도박테리움ㆍ롱검 ATCC-15707주를 들 수 있고, 그 중에서 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주가 바람직하다. 비피도박테리움ㆍ브레브에 대해서는 예를 들어, 비피도박테리움ㆍ브레브 표준주(JCM1192), 비피도박테리움ㆍ브레브 aS-1주, 비피도박테리움ㆍ브레브 I-53-8 W주를 들 수 있고, 그 중에서도, 비피도박테리움ㆍ브레브 표준주, 비피도박테리움ㆍ브레브 aS-1주가 바람직하다. 비피도박테리움ㆍ인판티스에 대해서는 예를 들어, 비피도박테리움ㆍ인판티스 표준주(JCM1222), 비피도박테리움ㆍ인판티스 I-10-5주를 들 수 있다. 비피도박테리움ㆍ락텐티스에 대해서는 예를 들어, 비피도박테리움ㆍ락텐티스 표준주(JCM1210)를 들 수 있다. 비피도박테리움ㆍ비피덤의 주에 대해서는 예를 들어, 비피도박테리움ㆍ비피덤 ATCC-11863주를 들 수 있다.
본 발명의 플라스미드나 형질 전환 비피도박테리움 속 세균의 제작은 시판의 실험서 예를 들어, 유전자 메뉴얼 코단샤, 타카기 야스유키 편찬 유전자 조작 실험법 코단샤, 모레큘러ㆍ클로닝［콜드ㆍ스프링ㆍ하버ㆍ래버러토리(1982)], 모레큘러ㆍ클로닝 제 2판［콜드ㆍ스프링ㆍ하버ㆍ래버러토리(1989)], 메쏘드ㆍ인ㆍ엔지몰로지 194(1991), 실험 의학 별책ㆍ효모에 의한 유전자 실험법, 요도샤(1994) 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.
상기 형질 전환된 비피도박테리움 속 세균은 정상 조직에서는 증식하지 않고 혐기적 환경하에 있는 종양 조직내에서만 증식하고, 종양 조직내에서 치료에 유용한 2종의 이종 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
따라서, 이러한 형질 전환된 비피도박테리움 속 세균은 혐기적 환경을 갖는 종양, 바람직하게는 고형 종양의 치료에 유효한 의약 조성물, 특히 항암제로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물로서는 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 항암 작용을 갖는 사이토카인, 항체 등을 분비할 수 있는 상기 본 발명의 비피도박테리움 속 세균을 유효 성분으로서 함유 하고 있는 한 특별히 제한되지 않고, 분비하는 폴리펩티드의 작용ㆍ효과를 방해하지 않는 한, 임의 성분으로서의 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 대상은 포유류, 바람직하게는 인간이며, 본 발명의 의약 조성물의 적용 대상으로서는 대장암, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 담관암, 췌암, 췌장도세포암, 융모암, 결장암, 신세포암, 부신피질암, 방광암, 정소암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁암, 융모암, 갑상선암, 편평상피암, 피부암, 뇌종양, 악성 카르시노이드 종양, 골육종, 연부 조직 육종, 신경아세포종, 월름즈 종양, 망막아세포종, 흑색종를 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 제형으로서는 액제 또는 고형 제제를 들 수 있다. 액제는 본 발명의 비피도박테리움 속 세균의 배양액을 정제하고, 이것에 필요에 따라서 적당한 생리 식염수 혹은 보액(補液) 또는 의약 첨가물을 첨가하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전함으로써 제조할 수 있다. 고형 제제는 액제에 적당한 보호제를 첨가하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전한 후 동결하여 동결 제제로 하거나, 또는 동결건조하여 동결건조 제제로 함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여 방법으로서는 경구 투여, 비경구 투여 모두 가능하지만, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어, 정맥내 투여, 국소 투여를 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여량은 질환 부위에 있어서 비피도박테리움 속 세균을 생육할 수 있는 한편, 유효 치료량의 사이토카인, 활성 항체 등을 발현하는데 충분한 양인 한 특별히 제한되지 않고, 질환의 정도, 환자의 체중, 연령, 성별에 따라 적절히 선택하고, 개선의 정도에 따라 적절히 증감할 수 있지만, 경제상의 관점 및 부작용을 가능한 한 회피하는 관점에서, 필요한 치료 효과를 얻을 수 있는 범위에서 가능한 한 적은 것이 바람직하다.
예를 들어, 정맥내 투여의 경우에는 특히, 균괴(菌塊)에 의한 색전(塞栓) 등의 위험을 저감하는 것이 요구되므로, 가능한 한 저농도의 주사용 제제를 여러 차례 나누어 분주하거나, 또는 적당한 보액으로 희석하여 지속 주입하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 성인의 경우, 본 발명의 비피도박테리움 속 세균의 균체를, 체중 1 kg 당 104~1012 cfu를 1일 1차례~여러 차례로 나누어 1일~며칠간, 연속하여 또는 적절히 간격을 두고 투여한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 비피도박테리움 속 세균의 균체를 104~1010 cfu/mL함유하는 제제를, 성인 1명 당 1~1000 mL를 직접, 또는 적당한 보액으로 희석하여, 1일 1~몇차례로 나누어 1일~며칠간 연속해서 투여한다.
또한 예를 들어, 질환 조직에 직접 투여하는 국소 투여의 경우는 가능한 한 질환 조직 전체에 균이 생착, 증식하는 것이 요구되므로, 고농도의 주사제를, 질환 조직의 복수 부분에 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 성인의 경우, 본 발명의 비피도박테리움 속 세균의 균체를, 체중 1 kg 당 104~1012 cfu를 1일 1차례~여러 차례, 필요에 따라 1일~며칠간, 연속해서, 또는 적절히 간격을 두고 투여한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 비피도박테리움 속 세균의 균체를 104~1010 cfu/mL함유하는 제제를, 성인 1명 당 0. 1~100 mL를 직접, 하루 몇차례, 필요에 따라서 1일~며칠간 연속해서 투여한다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이러한 예시에 한정되는 것은 아니다.
［실시예 1］
［인간 TNF-α및 인간 IFN-γ공발현 비피도박테리움 속 세균 AG8TL주의 제작］
(개요)
인간 TNF-α를 분비하는 발현 카세트(인간 TNF-α분비 발현 카세트)와 인간 IFN-γ를 분비하는 발현 카세트(인간 IFN-γ분비 발현 카세트)를 포함해, 대장균 비피도박테리움 속 세균 셔틀 벡터인, 공발현 플라스미드 pAG8TL을 제작했다. 이러한 pAG8TL을 이용하여 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션법에 의해 수행하고, 인간 TNF-α및 인간 IFN-γ공발현 비피도박테리움 속 세균 AG8TL주를 수득했다. 실시예 1~3에 있어서 사용한 프라이머를 아래의 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
(인간 TNF-α분비 발현 카세트의 구성)
인간 TNF-α분비 발현 카세트로서, (1) P30 프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 연결체 SP7L20을 코딩하는 DNA, (3) 인간 TNF-α단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, 및 (4) d0013 터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (4)를 하류(3' 말단) 측으로 하여 (1)~(4)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트를 제작했다.
(인간 IFN-γ분비 발현 카세트의 구성)
인간 IFN-γ분비 발현 카세트로서, (1) Hu프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 연결체 SP69L20을 코딩하는 DNA, (3) 인간 IFN-γ단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, 및 (4) Hu터미네이터 DNA(비피도박테리움ㆍ롱검 유래)를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (4)를 하류(3' 말단) 측으로 하여 (1)~(4)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트를 제작했다.
(플라스미드 pAG8TL의 제작)
플라스미드 pAG8TL의 제작 시, 우선, 플라스미드 pAG8을 제작했다.
(플라스미드 pAG8의 제작)
(hTNF-α인서트 단편의 조제)
국제 공개 팜플렛 2011/093465호에 기재되어 있는 플라스미드 pSP3B-TNFα(도 1 참조)(1 ng)를 주형(鑄型)으로 하고, 상기 표 1에 기재된 GA100_primer(포워드) 및 GA101_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복되도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 20 μL로 하고, PrimeSTAR HS(Premix) 키트(다카라 바이오 가부시키가이샤 제품)(이하, 「STAR 키트」)를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 75℃에서 40초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행하여, 약 0. 5 kbp의 h(인간) TNF-α인서트 단편 증폭 산물을 조제했다.
(인간 IFN-γ단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 단편의 조제)
플라스미드 pHG-2(도 2)의 직쇄화 단편(서열 번호 1)을 주형으로 하고, 표 1에 기재된 GA104_primer(포워드) 및 GA103_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복되도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 20 μL로 하고, STAR 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 75℃에서 5분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행하고, 약 5 kbp의 5'-Hu프로모터-SP69L20-인간 IFN-γ단백질-His 태그-Hu터미네이터-pTB rep unit-SPCMr-pUCori-P30 프로모터-SP7L20-3'벡터 단편 증폭 산물을 조제했다.
상기 플라스미드 pHG-2의 직쇄화 단편은 서열 번호 1의 제 1번에서 제 4975번까지의 염기 서열에 있어서 아래와 같이 구성된다.
d0013 터미네이터：서열 번호 1의 제 16번에서 제 129번까지의 염기 서열
Hu프로모터：서열 번호 1의 제 136번에서 제 496번까지의 염기 서열
SP69L20：서열 번호 1의 제 497번에서 제646번까지의 염기 서열
인간 IFN-γ단백질：서열 번호 1의 제647번에서 제 1075번까지의 염기 서열
His 태그：서열 번호 1의 제 1076번에서 제 1093번까지의 염기 서열
Hu터미네이터：서열 번호 1의 제 1097번에서 제 1210번까지의 염기 서열
비피도박테리움 속 세균 복제 기점 pTB6 rep unit：서열 번호 1의 제 1217번에서 제 2812번까지의 염기 서열
스펙티노마이신 내성 유전자 SPCMr：서열 번호 1의 제 2819번에서 제 3897번까지의 염기 서열
대장균 복제 기점, pUCori：서열 번호 1의 제 3904번에서 제 4571번까지의 염기 서열
P30 프로모터：서열 번호 1의 제 4572번에서 제 4806번까지의 염기 서열
SP7L20：서열 번호 1의 제 4807번에서 제 4965번까지의 염기 서열.
(인퓨전 반응 1)
상기에서 조제한 벡터 단편 증폭 산물 및 인서트 단편 증폭 산물을 In-Fusion(등록상표) HD Cloning 키트(다카라 바이오 가부시키가이샤 제품)(이하, 「HD 키트」)를 이용하여 연결했다. 즉, 마이크로 튜브에, 상기 벡터 단편 증폭 산물 50 ng과 인서트 단편 증폭 산물 13 ng을 첨가하고, 키트내의 5×In-Fusion HD Enzymepremix 2 μL, Cloning Enhancer 1 μL를 더 첨가하여, 0. 1×TE버퍼(1 mM Tris-HCl, 0. 1 mM EDTA, pH7. 5)에서 반응액 용량을 10 μL로 조정했다. 이것을 37℃에서 15분간 보온한 후, 추가로 50℃에서 15분간 보온했다. 그 외의 순서는 키트의 제품 설명서에 따라, 인퓨전 반응액 1을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)
1 μL의 상기 인퓨전 반응액 1을 이용하여, 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포(다카라 바이오 가부시키가이샤 제품)의 형질 전환을 제품 설명서에 따라 수행했다. 형질 전환 후의 균현탁액은 75 μg/mL스펙티노마이신 함유 LB한천 배지에 도포하여, 37℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 상기 한천 배지상에 형성된 대장균 콜로니를 75 μg/mL스펙티노마이신 함유 LB액체 배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고, 이로부터 QIAprepSpin Miniprep 키트(퀴아젠사 제품)를 이용하여 플라스미드를 추출했다. 추출한 플라스미드에서의 상기 인간 TNF-α분비 발현 카세트 및 인간 IFN-γ분비 발현 카세트를 포함하는 영역 1(5'-P30 프로모터-SP7L20-인간 TNF-α단백질-d0013 터미네이터-Hu프로모터-SP69L20-인간 IFN-γ단백질-His 태그-Hu터미네이터-3')의 서열을 결정하기 위해, Big Dye(등록상표) Terminator ｖ3. 1 Cycle Sequencing 키트(어플라이드 바이오 시스템즈사 제품)을 이용하여 순차 반응을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pAG8이라고 명명했다. pAG8의 인간 TNF-α분비 발현 카세트 및 인간 IFN-γ분비 발현 카세트를 포함하는 영역 1의 서열을 서열 번호 2로 표시한다.
(pAG8TL주의 조제)
상기 pAG8을 주형으로 하고, 표 1에 기재된 GA2_primer(포워드) 및 GA6_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 75℃에서 3분 15초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 3. 3 kbp의 PCR 증폭 산물(A)을 조제했다.
상기 pAG8을 주형으로 하고, 표 1에 기재된 GA5_primer_reｖ(포워드) 및 GA1_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 75℃에서 2분 10초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 2. 2 kbp의 PCR 증폭 산물 B를 조제했다.
(인퓨전 반응 2)
PCR 증폭 산물 A를 50 ng, PCR 증폭 산물 B를 33 ng사용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 1)와 동일한 순서로, 상기 PCR 증폭 산물 A와 PCR 증폭 산물 B를 연결하고, 인퓨전 반응액 2를 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8TL의 DNA의 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 인퓨전 반응액 2를 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 인간 TNF-α분비 발현 카세트 및 인간 IFN-γ분비 발현 카세트를 포함하는 영역 2(5'-P30 프로모터-SP7L20-인간 TNF-α단백질-d0013 터미네이터-Hu프로모터-SP69L20-인간 IFN-γ단백질-Hu터미네이터-3')의 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드를 pAG8TL이라고 명명했다. pAG8TL의 인간 TNF-α분비 발현 카세트 및 인간 IFN-γ분비 발현 카세트를 포함하는 영역 2의 서열을 서열 번호 3으로 표시한다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)
상기 형질 전환된 대장균에서 추출한 플라스미드 pAG8TL(250 ng)을 이용하여, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템(Gene Pulser II, 바이오ㆍ래드래버러토리즈 가부시키가이샤 제품)에 의해 수행했다. 전기 쇼크(2 kV, 25 μF, 200Ω) 후는 큐벳(2 mm 갭)에 800 μL의 IMR 액체 배지와 50 μL의 비타민 C첨가액의 혼합액을 즉시 첨가하고, 이것을 멸균 완료된 2 mL마이크로 튜브에 회수했다. 이 2 mL 튜브의 뚜껑을 열어, 탈산소ㆍ탄산 가스 발생제(아네로팩(등록상표)ㆍ겐키 미츠비시 가스카가쿠 가부시키가이샤 제품)와 함께 밀폐 용기에 넣어 37℃로 설정한 인큐베이터에서 3시간 보온했다.
보온 후의 각 균현탁액을 75 μg/mL 스펙티노마이신 함유 IMR 한천 배지에 도포했다. 이러한 플레이트를 상기 탈산소ㆍ탄산 가스 발생제와 함께 밀폐 용기에 넣어 37℃로 설정한 인큐베이터에서 2일간 배양했다.
상기 스펙티노마이신 함유 IMR 한천 배지상에 형성한 콜로니를 형질 전환체 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pAG8TL주(이하, AG8TL주라고 한다)로 했다.
［실시예 2］
［인간 TNF-α단독 발현주 TNF11주의 제작］
공발현 비피도박테리움 속 세균 AG8TL주에 대응하는 인간 TNF-α단독 발현주 TNF11주를 아래와 같이 제작했다.
pAG12를 주형으로 하고, 표 1에 기재된 GA113_primer(포워드) 및 GA6_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 75℃에서 3분 50초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 3. 2 kbp의 PCR 증폭 산물 60을 조제했다.
pAG12를 주형으로 하고, 표 1에 기재된 GA5_primer_reｖ(포워드) 및 GA116_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 72℃에서 1분 15초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 1. 2 kbp의 PCR 증폭 산물 61을 조제했다. 그리고 주형에 이용한 플라스미드 pAG12는 pAG8TL의 hIFN-γ의 SP/Linker가 SP69L20에서 SP56L20으로 치환된 것이다.
(인퓨전 반응 3)
PCR 증폭 산물 60을 50 ng, PCR 증폭 산물 61을 20 ng사용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 1)와 동일한 순서로, 상기 PCR 증폭 산물 60과 PCR 증폭 산물 61을 연결하여, 인퓨전 반응액 3을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pTNF11의 DNA의 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 인퓨전 반응액 3을 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 인간 TNF-α분비 발현 카세트(5'-P30 프로모터-SP7L20-인간 TNF-α단백질-d0013 터미네이터)의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pTNF11이라고 명명했다. pTNF11의 플라스미드 구성을 도 3에 나타낸다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 2)
상기 형질 전환된 대장균에서 추출한 플라스미드 pTNF11(500 ng)를 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pTNF11주(이하, TNF11주라고 한다)로 했다.
［실시예 3］
［인간 IFN-γ단독 발현주 hIFNg33TL주의 제작］
공발현 비피도박테리움 속 세균 AG8TL주에 대응하는 인간 IFN-γ단독 발현주 hIFNg33TL주를, 아래와 같이 제작했다.
공발현 AG8TL주에 대응하는 인간 IFN-γ단독 발현주 hIFNg33TL주를 제작했다. 플라스미드 phIFNg33TL의 제작 시, 우선, 플라스미드 phIFNg33을 제작했다.
(hIFN-γ유전자의 인공 DNA 합성)
hIFN-γ유전자에 대해서는 진스크립트 재팬 가부시키가이샤에 합성을 의뢰했다. hIFN-γ서열은 Accession＃CAA31639의 성숙 단백질의 아미노산 서열(Gln24-Gln166)을 바탕으로, 코돈을 비피도박테리움ㆍ롱검 NCC2705로 최적화했다(납품 플라스미드：pUC57-hIFNg). 서열 번호 4로 인공 합성한 hIFN-γ의 DNA 서열을 나타냈다.
pBEshuttle(서열 번호 5)를 주형으로 하고, 표 1에 기재된 pCDshuttle_R1_primer(리버스) 및 IFNG2_primer(포워드)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 75℃에서 3분 50초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 3. 9 kbp의 PCR 증폭 산물vector1을 조제했다.
상기 pUC57-hIFNg(hIFNg in pUC57)를 주형으로 하고, 표 1에 기재된 IFNG1_primer(포워드) 및 IFNG3_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 75℃에서 30초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 0. 5 kbp의 PCR 증폭 산물 insert1을 조제했다.
(인퓨전 반응 4)
PCR 증폭 산물vector1을 50 ng, PCR 증폭 산물 insert1을 12 ng사용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 1)와 동일한 순서로, 상기 PCR 증폭 산물vector1과 PCR 증폭 산물 insert1을 연결하고, 인퓨전 반응액 4를 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 비분비형 플라스미드 phIFNg의 DNA의 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 인퓨전 반응액 4(2 μL)을 이용하여 대장균 HST16CR의 형질 전환을 수행하고, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출, 추출한 플라스미드 DNA의 전체 길이 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 phIFNg(비분비형 플라스미드)라고 명명했다.
(분비형 플라스미드 hIFNg33의 제작)
상기 phIFNg를 주형으로 하고, 표 1에 기재된 hIFNG4_primer(포워드) 및 Hu-mCCL21-vecR1_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 75℃에서 4분 20초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 4. 3 kbp의 PCR 증폭 산물vector2를 조제했다.
비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주 genomicDNA를 주형으로 하고, 표 1에 기재된 SP69-ins_F1_primer(포워드) 및 SP69-ins_R2_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 75℃에서 15초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 0. 2 kbp의 PCR 증폭 산물 insert2를 조제했다.
(인퓨전 반응 5)
PCR 증폭 산물vector2를 50 ng, PCR 증폭 산물 insert2를 5 ng사용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 1)와 동일한 순서로, 상기 PCR 증폭 산물vector2와 PCR 증폭 산물 insert2를 연결하고, 인퓨전 반응액 5를 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 플라스미드 phIFNg33의 DNA의 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 인퓨전 반응액 3(2 μL)을 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 인간 IFN-γ분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP69L20-인간 IFN-γ단백질-His 태그-Hu터미네이터-3')의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 phIFNg33라고 명명했다. phIFNg33의 플라스미드 구성을 도 4(a)에 나타낸다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 3)
상기 형질 전환된 대장균에서 추출한 플라스미드 phIFNg33(605 ng)을 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/phIFNg33주(hIFNg33주라고 한다)로 했다.
상기 phIFNg33을 주형으로 하고, 표 1에 기재된 GA5_primer_reｖ(포워드) 및 GA1_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 75℃에서 1분 20초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 1. 2 kbp의 PCR 증폭 산물 C를 조제했다.
상기 phIFNg33을 주형으로 하고, 표 1에 기재된 GA2_primer(포워드) 및 GA6_primer(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 75℃에서 3분 20초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 3. 3 kbp의 PCR 증폭 산물 D를 조제했다.
(인퓨전 반응 6)
PCR 증폭 산물 C를 18 ng, PCR 증폭 산물 D를 50 ng사용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 1)와 동일한 순서로, 상기 PCR 증폭 산물 C와 PCR 증폭 산물 D를 연결하고, 인퓨전 반응액(6)을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 플라스미드 phIFNg33TL의 DNA의 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 인퓨전 반응액(6)을 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 인간 IFN-γ분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP69L20-인간 IFN-γ단백질-Hu터미네이터-3')의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 phIFNg33TL이라고 명명했다. phIFNg33TL의 플라스미드 구성을 도 4(b)에 나타낸다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 4)
상기 형질 전환된 대장균에서 추출한 플라스미드 phIFNg33TL(435 ng)을 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/phIFNg33TL주(hIFNg33TL주라고 한다)로 했다.
［실시예 4］
［AG8TL주에서의 hTNF-α및 hIFN-γ의 분비 확인］
AG8TL주의 배양 상청 중의 인간 TNF-α단백질과 인간 IFN-γ단백질의 분비의 유무를 ELISA법으로 아래와 같이 확인했다. 음성 대조군주로서 비피도박테리움ㆍ롱검 105 A/pBEshuttle주(이하, BEshuttle주라고 한다)에 대해서도 동일하게 수행했다.
(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)
상기 AG8TL주, TNF11주, 및 hIFNg33TL주, BEshuttle주를, 스펙티노마이신(종농도 75 μg/mL) 및 비타민 C첨가액(100 mL당 아스코르브산 35 g, L-시스테인 염산염 일수화물 2 g 및 탄산나트륨 11 g을 포함하는 용액) 100 μL를 첨가한 MRS(벡톤ㆍ디킨슨사 제품) 액체 배지 10 mL에 식균하고, 37℃에서 24시간 혐기 배양해, 활성화 배양액으로 했다. 그 다음, DMEM(Cat No. 11885-084：라이프 테크놀로지스사 제품)：MRS를 9：1의 비율로 혼합한 배지 20 mL에, 비타민 C첨가액 100 μL, 스펙티노마이신을 75 μg/mL가 되도록 첨가하여, 상기 활성화 배양액 100 μL를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기 배양했다.
(배양 상청의 회수 및 ELISA)
상기 혐기 배양 후의 각 주의 배양액을 원심 분리 후, 각 주의 배양 상청을 회수하여, ELISA에 제공했다. 같은 조작을 BEshuttle주에 대해서도 수행하여, 음성 대조군으로 했다. TNF-α 측정용 ELISA 키트로서는 Quantikine Human TNFα／TNFSF1A I mmunoassay(R＆D systems사 제품)를, hIFN-γ측정용 ELISA 키트로서는 Quantikine Human IFN-γ I mmunoassay(R＆D systems사 제품)를 이용했다. ELISA의 조작은 각 ELISA 키트의 제품 메뉴얼에 따라 수행했다. 결과를 아래의 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002
(결과)
표 2에서 명백한 바와 같이, AG8TL주의 배양 상청 중에는 hTNF-α단백질과 hIFN-γ단백질의 양쪽 모두가 확인되었다. 양성 대조군의 단독 발현주인 TNF11주 배양 상청 중에는 hTNF-α단백질이 확인되었고, hIFNg33TL주의 배양 상청 중에는 인간 IFN-γ단백질이 확인되었다.
［실시예 5］
［AG8TL주의 KPL-1 세포 증식 억제 활성의 검토］
(배양 상청 조정제물의 조제)
실시예 4의 (재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)과 (배양 상청의 회수 및 ELISA)와 동일한 순서로 조제한 상기 AG8TL주, TNF11주, 및 hIFNg33TL주의 배양 상청 각 7 mL를 아미콘울트라-4, MWCO：10 k(밀리포어사 제품)를 이용하여 농축 후, PBS 버퍼(pH7. 4)로 3회 세정, 농축하여, 0. 5 mL씩 각 주의 배양 상청 조정제물로서 조제했다. 음성 대조군주로서 비피도박테리움ㆍ롱검 105 A/pBEshuttle주의 배양 상청 조정제물에 대해서도 동일하게 조제했다. 상기 각 주의 배양 상청 조정제물을 세포 증식 억제 활성의 측정에 사용했다. hTNF-α및 hIFN-γ의 농도는 상기 TNF-α측정용 ELISA 키트와 상기 hIFN-γ측정용 ELISA 키트를 이용하여 추측했다.
(KPL-1 세포의 조제 및 피험 샘플의 첨가)
인간 유방암 세포주인 KPL-1 세포(가와사키 의과대학 쿠레바야시 준이치 교수로부터 공여)를 사용하여, 세포 증식 억제 활성의 측정을 수행했다. KPL-1 세포를 100 mm페트리 접시에서 10% 소 태아 혈청(EQUITECH-BIO사 제품)/둘베코 수정 이글 배지(고(高)글루코스)(씨그마-알드리치사 제품)로 배양했다. 이러한 시험 배지를 제거 후, PBS(-)(와코준야쿠코교 가부시키가이샤 제품)로 세정하고, 0. 25%Trypsin-EDTA(라이프 테크놀로지스사 제품)를 첨가해 세포를 회수하여, 원심 분리 후, 상청을 제거해, 상기 시험 배지에서 6×103cells/mL가 되도록 세포를 현탁하여, 세포 현탁액을 조제했다.
상기 세포 현탁액을 96 구멍 플레이트의 각 웰에 0. 1 mL씩 분주하고, 37℃로 설정한 CO2 인큐베이터에서 배양을 개시했다. 다음날, 상기 시험 배지에 추가로 AG8TL주 배양 상청 조정제물(20 ng/mLhIFN-γ, 51. 1ng/mLhTNF-α를 포함한다)을 첨가한 배지와 교환하여, 자극을 개시했다. AG8TL주의 농도와 동일한 농도가 되도록 TNF11주 또는 hIFNg33TL주의 배양 상청 조정제물을 첨가한 각 배지를 양성 대조군으로 하여 동일하게 처리했다. 자극 개시부터 4일 후에 배지를 제거하고, 10분의 1 양의 Cell Counting 키트-8(도진카가쿠겐큐쇼 제품)을 첨가한 배지와 교환하여, 추가로 3시간 반응시켰다. 반응 후, 멀티 모드 플레이트 리더(DS파마바이오메디칼사 제품)에서 450 nm 및 630 nm(참조 파장)에서의 흡광도를 측정했다. 블랭크는 배지와 Cell Counting 키트-8만을 첨가한 세포비첨가 웰의 흡광도를 뺀 것으로부터 산출했다. 그리고 상기 각 배양 상청 조정제물을 첨가하지 않고 KPL-1 세포의 배양을 계속한 시험 배지에서의 값을 무처리구의 흡광도로서 100%로 하고, 각 KPL-1 세포의 증식률을 산출했다. 결과를 도 5에 나타낸다.
(결과)
도 5에서 명백한 바와 같이, AG8TL주 분비물은 TNF11주 단독 또는 hIFNg33TL주 단독의 분비물에 비해, KPL-1 세포의 증식을 현저하게 억제했다. 즉, 분비물이 hTNF-α인 TNF11주에 있어서 증식률은 89. 9%를 나타내고, 분비물이 hIFN-γ인 hIFNg33TL주에 있어서 증식률은 83%를 나타낸 반면, 분비물이 hTNF-α와 hIFN-γ인 AG8TL주에 있어서 증식률은 35. 5%를 나타내고, AG8TL주가 인간 유방암 세포주에 대해서 강한 증식 억제 효과를 갖는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 hTNF-α분비물과 hIFN-γ분비물과의 병용 효과에 의한 것이라고 생각된다.
［실시예 6］
［AG8TL주의 MIA PaCa-2 세포 증식 억제 활성의 검토］
KPL-1 세포 대신에, 인간 췌장암 유래 세포 MIA PaCa-2 세포(도쿠리쯔교세이호진 리카가쿠켄큐쇼 바이오시겐센터에서 입수)를 이용한 것 외에는 실시예 5와 동일한 순서로 MIA PaCa-2 세포에 대한 증식 억제 활성을 검토했다. 다만, MIA PaCa-2 세포의 96 구멍 플레이트에 분주한 세포 현탁액의 파종 농도(播種濃度)는 1×104cells/mL로 했다. 결과를 도 6에 나타낸다.
(결과)
도 6에서 명백한 바와 같이, AG8TL주 분비물은 TNF11주 단독 또는 hIFNg33TL주 단독의 분비물에 비해, MIA PaCa-2 세포의 증식을 현저하게 억제했다. 즉, 분비물이 hTNF-α인 TNF11주에 있어서 증식률은 51. 6%를 나타내고, 분비물이 hIFN-γ인 hIFNg33TL주에 있어서 증식률이 75. 4%를 나타낸 반면, 분비물이 hTNF-α와 hIFN-γ인 AG8TL주에 있어서 증식률은 24. 2%를 나타내고, AG8TL주가 인간 췌장 암 세포주에 대해서 강한 증식 억제 효과가 갖는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 hTNF-α분비물과 hIFN-γ분비물의 병용 효과에 의한 것이라고 생각된다.
［실시예 7］
［AG8TL주의 증식 억제 활성의 중화 항체에 의한 특이성 검토］
AG8TL주의 배양 상청 조정제물의 세포 증식 억제 활성이 hTNF-α및 hIFN-γ가 분비된 것에 의한 것임을 확인하기 위해, 중화 항체인 Human IFN-γ Antibody 및 Human TNF-α Antibody(모두 R＆D systems사 제품)를 이용한 검토를 아래와 같이 수행했다.
실시예 6과 동일한 순서로, 96 구멍 플레이트에 MIA PaCa-2 세포를 파종하고, 그 다음날 AG8TL주, TNF11주, hIFNg33TL주, BEshuttle주(음성 대조군) 중 어느 하나의 배양 상청 조정제물과 아래의 표 3에 나타내는 항체의 조합을 첨가한 배지와 교환했다. 배지로의 첨가물은 아래의 표 3에 나타낸다. 실시예 5와 동일한 순서로, 세포 증식률을 산출했다. 결과를 도 7에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00003
(결과)
도 7에서도 명백한 바와 같이, AG8TL주 배양 상청 조정제물 첨가 시의 MIA PaCa-2 세포 증식률은 15. 3%를 나타냈지만, 항hIFN-γ항체 단독 첨가 시, 항hTNF-α항체 단독 첨가 시의 세포 증식률은 각각 31. 8%, 44. 4%로 증가했다. 항hIFN-γ항체 및 항hTNF-α항체의 양 항체 첨가 시의 세포 증식률은 74. 1%로 더 증가했다. 이것은 AG8TL주의 분비된 hTNF-α 및 hIFN-γ의 생물 활성이 항체에 의해 중화된 결과이며, MIA PaCa-2 세포 증식 억제는 AG8TL주의 분비하는 hTNF-α및 hIFN-γ에 의한 것으로 생각된다.
［실시예 8］
［항hPD-1scFv03 및 항hCTLA-4scFv02 공발현 비피도박테리움 속 세균 PC1주 및 CP1주의 제작］
(개요)
항hPD-1scFv03을 분비하는 발현 카세트(항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트)와 항hCTLA-4scFv02 FLAG를 분비하는 발현 카세트(항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트)를 포함하여, 대장균 비피도박테리움 속 세균 셔틀 벡터인, 공발현 플라스미드 pPC1 및 pCP1을 제작했다. 이러한 pPC1과 pCP1을 이용하여 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션법에 의해 수행하고, 항hPD-1scFv03및 항hCTLA-4scFv02 공발현 비피도박테리움 속 세균 PC1주와 CP1주를 수득했다. 실시예 8에 있어서 사용한 프라이머를 아래의 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00004
(항인간 PD-1scFv03 분비 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 제작)
pPC1 및 pCP1의 제작 시, 우선, 항인간 PD-1scFv03의 분비형 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03을 제작했다.
(항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트의 구성)
항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트로 하고, (1) Hu프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 연결체 SP7L20을 코딩하는 DNA, (3) 항hPD-1scFv03의 아미노산 서열(중쇄 서열, 링커(GGGGS)3, 경쇄 서열을 포함한다)을 코딩하는 DNA, 및 (4) His 태그 서열을 코딩하는 DNA, (5) Hu터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (5)를 하류(3' 말단) 측으로 하여, (1)~(5)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트(상기 항hPD-1scFv03의 아미노산 서열에서의 중쇄 서열, 링커(GGGGS)3, 경쇄 서열을 포함한다)를 코딩하는 DNA의 염기 서열은 아래의 표 5 (1)에 나타나는 문헌을 참조했다.
(항hPD-1scFv03의 인공 DNA 합성)
서열 번호 11로 표시된 항hPD-1scFv03에 대해서는 진스크립트 재팬 가부시키가이샤에서, 대장균용 플라스미드 pUC57에 서브 클로닝되어, 플라스미드 pUC57-hPD-1scFv03으로서 인공 유전자 합성되었다.
　　[표 5]
Figure pct00005
(항hPD-1scFv03 인서트 단편의 조제 1)
상기 플라스미드 pUC57-hPD-1scFv03(500 pg)을 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 Ins-hPD-1scFv03-F1프라이머(포워드) 및 Ins-hPD-1scFv03-R1프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복되도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 30 μL로 하고, STAR 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 60초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행했다. 증폭된 인서트 PCR 산물을 2% 아가로스 겔로 전기 영동한 후, QIAquick Gel Extraction 키트(퀴아젠 가부시키가이샤 제품)(이하, 「QIAGel」를 이용하여 정제하고, 약 0. 7 kbp의 항hPD-1scFv03 인서트 단편 (1)을 조제했다.
(SP7L20의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 단편 (1)의 조제)
서열 번호 14에 기재되어 있는 벡터 직쇄화 단편 (500 pg)을 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재되어 있는 TGA-Hu-Terminator-F프라이머(포워드) 및 vec-SP7L20-R1프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 30 μL로 하고, STAR 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램은 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 5분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행했다. 증폭된 PCR 산물을 0. 8% 아가로스 겔로 전기 영동한 후, QIAGel을 이용하여 정제하고, 약 4. 0 kbp의 5'-Hu터미네이터-pTB6rep unit-SPCMr-pUCori-Hu프로모터-SP7L20-3'벡터 단편 (1)을 조제했다.
(인퓨전 반응 7)
상기에서 조제된 벡터 단편 (1)과 상기 항hPD-1scFv03 인서트 단편 (1)을 상기 In-Fusion(등록상표) HD Cloning 키트를 이용하여 연결했다. 즉, 마이크로 튜브에, 키트내의 상기 벡터와 인서트를 1：5의 몰비로 첨가 후, 2 μL의 5×In-Fusion HD Enzyme premix를 첨가하여, 반응액 용량을 10 μL로 조정했다. 이것을 50℃에서 15분간 보온했다. 그 외의 순서는 키트의 제품 설명서에 따라, 인퓨전 반응액 7을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 DNA 서열 확인)
5 μL의 상기 인퓨전 반응액 7을 이용한 것 외에는 상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로, 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 다만, 형질 전환 후, 한천 배지상에 형성된 대장균 콜로니를 75 μg/mL스펙티노마이신 함유 LB액체 배지에서 30℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 추출한 플라스미드에서의 항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP7L20-항hPD-1scFv03-His 태그-Hu터미네이터-3')의 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP7L20-hPD-1scFv03이라고 명명했다. pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 구성을 도 8(A)에, 서열을 서열 번호 6으로 표시한다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 5)
상기 형질 전환된 대장균에서 추출한 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03(550 ng)을 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP7L20-hPD-1scFv03주(이하 hPD-1scFv03주라고 한다)로 했다.
(항hCTLA-4scFv02 분비 플라스미드 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02의 제작)
pPC1 및 pCP1의 제작 시, 우선, FLAG 태그가 없는 항hCTLA-4scFv02의 분비형 플라스미드 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02를 제작했다.
(항인간 CTLA-4scFv02 분비 발현 카세트 및 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트의 구성)
항인간 CTLA-4scFv02 분비 발현 카세트로서, (1) Hu프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 연결체 SP7L20을 코딩하는 DNA, (3) 항hCTLA-4scFv02의 아미노산 서열(중쇄 서열, 링커(GGGGS)3, 경쇄 서열을 포함한다)를 코딩하는 DNA, 및 (4) His 태그 서열을 코딩하는 DNA, (5) Hu터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (5)를 하류(3' 말단) 측으로 하여, (1)~(5)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트(상기 항hCTLA-4scFv02의 아미노산 서열에서의 중쇄 서열, 링커(GGGGS)3, 경쇄 서열을 포함한다)를 코딩하는 DNA의 염기 서열은 상기의 표 5 (2)에 나타나는 문헌을 참조했다.
또한, 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트로서, (1) Hu프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 연결체 SP7L20을 코딩하는 DNA, (3) 항hCTLA-4scFv02의 아미노산 서열(중쇄 서열, 링커(GGGGS)3, 경쇄 서열을 포함한다)를 코딩하는 DNA, 및 (4) FLAG 태그 서열을 코딩하는 DNA, (5) Hu터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (5)를 하류(3' 말단) 측으로 하여, (1)~(5)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트(상기 항hCTLA-4scFv02의 아미노산 서열에서의 중쇄 서열, 링커(GGGGS)3, 경쇄 서열을 포함한다)를 코딩하는 DNA의 염기 서열은 상기의 표 5 (3)에 나타나는 문헌을 참조했다.
(hCTLA-4scFv02의 인공 DNA 합성)
서열 번호 12로 표시된 hCTLA-4scFv02에 대해서는 진스크립트 재팬 가부시키가이샤에서, 대장균용 플라스미드 pUC57에 서브 클로닝되어, 플라스미드 pUC57-hCTLA-4scFv02로서 인공 유전자 합성되었다.
(항hCTLA-4scFv02 인서트 단편의 조제)
상기 플라스미드 pUC57-hCTLA-4scFv02를 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 Ins-hCTLA-4scFv02-F1(포워드) 및 Ins-hCTLA-4scFv02-R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용한 것 외에는 상기 (항hPD-1scFv03 인서트 단편의 조제 1)와 동일한 순서로, 약 0. 8 kbp의 항hCTLA-4scFv02 인서트 단편을 조제했다.
(인퓨전 반응 8)
상기 벡터 단편 (1)과 상기 항hCTLA-4scFv02 인서트 단편을 이용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 7)에서의 인퓨전 반응과 동일한 순서로 인퓨전 반응액을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02의 DNA 서열 확인)
5 μL의 상기 인퓨전 반응액 8을 이용한 것 외에는 상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로, 대장균 HST08 컴피턴트 세포의 형질 전환을 수행하고, 추출한 플라스미드에서의 항인간 CTLA-4scFv02 분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP7L20-항hCTLA-4scFv02-His 태그-Hu터미네이터-3')의 서열을 결정하기 위해 순차 반응을 수행하고, 추출한 플라스미드를 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02라고 명명했다. pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02의 구성을 도 8(B)에, 서열을 서열 번호 7로 표시한다.
항hCTLA-4scFv02 FLAG 단독 발현 비피도박테리움 속 세균주의 제작］
(항hCTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편의 조제)
상기 플라스미드 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02(500 pg)를 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 hCTLA-4scFv02-FLAG-F1(포워드) 및 hCTLA-4scFv02-FLAG-R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 PCR 산물의 양 말단 15 bp씩이 중복되도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 30 μL로 하고, 상기 STAR 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 5분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행하고, 약 4. 8 kbp의 항hCTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편 증폭 산물을 조제했다.
(인퓨전 반응 9)
상기에서 조제된 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편 증폭 산물을 In-Fusion(등록상표) HD Cloning 키트를 이용하여 인퓨전 반응을 수행하고, 자기 폐환(自己閉環)시켰다. 즉, 마이크로 튜브에, 상기 벡터 단편 증폭 산물 5 μL와 Cloning Enhancer 2 μL를 혼합한 반응액을 37℃에서 15분간, 이어서 80℃에서 15분간 보온했다. 그 후, 이 반응액의 0. 5 μL와 2 μL의 5×In-Fusion HD Enzyme premix를 첨가하여, 반응액 용량을 10 μL로 조정했다. 이것을 50℃에서 15분간 보온했다. 그 외의 순서는 키트의 제품 설명서에 따라, 인퓨전 반응액 9를 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG의 DNA 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 5 μL의 인퓨전 반응액 9를 이용하여 상기 대장균 HST08 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP7L20-항인간 CTLA-4scFv02-FLAG 태그-Hu터미네이터-3')의 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG라고 명명했다. pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG의 구성을 도 8(C)에, 서열을 서열 번호 8로 표시한다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 6)
256 ng의 상기 플라스미드 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG를 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG주(이하 hCTLA-4scFv02주라고 한다)로 했다.
［항hPD-1scFv03및 항hCTLA-4scFv02 공발현주의 제작］
항hPD-1scFv03및 항hCTLA-4scFv02의 양쪽을 분비하는 공발현주 PC1주 및 CP1주를 제작했다. PC1주는 도 9(a)에 나타낸 바와 같이, 대장균 복제 기점 pUCori의 3' 말단 측에 계속되는 분비 발현 카세트가 항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트, 이것에 계속되어 항인간 CTLA-4scFv02 분비 발현 카세트의 순서로 배치된 플라스미드를 갖고 있고, CP1주는 도 9(b)에 나타낸 바와 같이, 대장균 복제 기점 pUCori의 3' 말단 측에 계속되는 분비 발현 카세트가 항인간 CTLA-4scFv02 분비 발현 카세트, 이것에 계속되어 항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트의 순서로 배치된 플라스미드를 갖고 있다.
［PC1주의 제작］
(항hCTLA-4scFv02 FLAG 인서트 단편의 조제)
플라스미드 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG(500 pg)(서열 번호 8)를 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 InF_Hu Prom_F1(포워드) 및 InF_Hu Term-pTB6_R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복되도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 30 μL로 하고, 상기 STAR 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행했다. 증폭된 인서트 PCR 산물을 0. 8% 아가로스 겔로 전기 영동한 후, QIAGel을 이용하여 정제하고, 약 1. 4 kbp의 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 인서트 단편을 조제했다.
(항hPD-1scFv03 분비 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편의 조제)
상기 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03(500 pg)(서열 번호 6)를 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 InF_pTB6rep_F1(포워드) 및 InF_HuTerm-HuProm_R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복되도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 30 μL로 하여, 상기 PrimeSTAR HS(Premix) 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 5분을 1 사이클로 하여 30 사이클 수행했다. 증폭된 인서트 PCR 산물을 0. 8% 아가로스 겔로 전기 영동한 후, QIAquick Gel Extraction 키트를 이용하여 정제하고, 약 4. 7 kbp의 항hPD-1scFv03 분비 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편 (2)을 조제했다.
(인퓨전 반응 10)
상기에서 조제된 벡터 단편 (2)와 상기 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 인서트 단편을 상기 In-Fusion(등록상표) HD Cloning 키트를 이용하여 연결했다. 즉, 마이크로 튜브에, 키트내의 상기 벡터와 인서트를 1：3의 몰비로 첨가 후, 2 μL의 5×In-Fusion HD Enzyme premix를 첨가하여, 반응액 용량을 10 μL로 조정했다. 이것을 50℃에서 15분간 보온했다. 그 외의 순서는 키트의 제품 설명서에 따라, 인퓨전 반응액 10을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 pPC1의 DNA 서열 확인)
2 μL의 상기 인퓨전 반응액 10을 이용한 것 외에는 상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로, 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP7L20-항hPD-1scFv03-His 태그-Hu터미네이터-3') 및 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP7L20-항hCTLA-4scFv02-FLAG 태그-Hu터미네이터-3')의 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드를 pPC1이라고 명명했다. pPC1의 구성을 도 9(a)에, pPC1의 DNA 서열을 서열 번호 9로 표시한다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 7)
250 ng의 상기 플라스미드 pPC1을 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC1주(이하 PC1주라고 한다)로 했다.
［CP1주의 제작］
(항hPD-1scFv03 인서트 단편의 조제 2)
상기 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03(500 pg)(서열 번호 6)을 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 InF_HuProm_F1(포워드) 및 InF_HuTerm-pTB6_R1리버스)의 프라이머 세트를 이용한 것 외에는 상기 (항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 인서트 단편의 조제)와 동일한 순서로 PCR 증폭 및 겔 추출 키트에 의한 정제를 수행했다. 약 1. 4 kbp의 항hPD-1scFv03 인서트 단편 (2)을 조제했다.
(항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편의 조제)
상기 플라스미드 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG(서열 번호 8)를 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 InF_pTB6rep_F1(포워드) 및 InF_HuTerm-HuProm_R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용한 것 외에는 상기 (항hPD-1scFv03 인서트 단편의 조제 2)와 동일한 순서로 PCR 증폭 및 겔 추출 키트에 의한 정제를 수행했다. 약 4. 8 kbp의 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편 (3)을 조제했다.
(인퓨전 반응 11)
상기에서 조제된 벡터 단편 (3)과 상기 항hPD-1scFv03 인서트 단편 (2)를 이용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 10)와 동일한 순서로 인퓨전 반응액 11을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 pCP1의 DNA 서열 확인)
2 μL의 상기 인퓨전 반응액 11을 이용한 것 외에는 상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로, 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP7L20-항hPD-1scFv03-His 태그-Hu터미네이터-3')와 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트(5'-Hu프로모터-SP7L20-항hCTLA-4scFv02-FLAG 태그-Hu터미네이터-3')의 서열 결정을 상기 (대장균의 형질 전환 및 pPC1의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드를 pCP1이라고 명명했다. pCP1의 구성을 도 9(b)에, pCP1의 DNA 서열을 서열 번호 10으로 표시한다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 8)
250 ng의 상기 플라스미드 pCP1을 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pCP1주(이하 CP1주라고 한다)로 했다.
［실시예 9］
［PC1주 및 CP1주에서의 항hPD-1scFv 및 항hCTLA-4scFv분비 확인］
PC1주 및 CP1주의 배양 상청 중의 항hPD-1scFv03(히스티딘 태그됨) 및 항hCTLA-4scFv02(FLAG 태그됨)의 유무를 웨스턴 블로팅법으로 아래와 같이 확인했다. 음성 대조군주로서 BEshuttle주에 대해서도 동일하게 수행했다.
(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)
상기 PC1주 및 CP1주, hPD-1scFv03주, hCTLA-4scFv02주, BEshuttle주에 대해 실시예 4(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)와 동일한 순서로 상기 비피도박테리움 속 세균을 배양하여, 배양 상청을 회수했다. 이 배양 상청 중의 단백질을 트리클로로 아세트산(TCA, 와코준야쿠코교 가부시키가이샤 제품)에 의해 침전시켜, 아세톤으로 세정 후, SDS-PAGE용 버퍼에 용해하고, 95℃에서 3분간 열처리를 수행하여, 각 배양 상청 농축물로 했다.
(웨스턴 해석)
상기 각 배양 상청 농축물(배양액 0. 1 mL 상당)을 미니프로테안(mini-protean)(등록상표) TGXTM 겔(4~20%)(바이오래드사 제품)로 전기 영동하고, 겔을 PVDF막(membrane)(iBlot Transfer Stacks, 라이프 테크놀로지스사 제품)에 iBlot 트랜스퍼 디바이스(라이프 테크놀로지스사 제품)를 이용하여 전사했다. 블로팅 종료 후의 PVDF막을 블로킹(2%ECL Prime Blocking agent(GE헬스케어 재팬 가부시키가이샤 제품) in TTBS) 했다. 전기 영동 및 막에 대한 블로팅은 2 세트 수행하고, 첫번째의 PVDF막은 항hPD-1scFv03을 검출하기 위해서 1차 항체로서 항히스티딘 항체(THE His Tag Antibody, mAb, Mouse)(GenScript사 제품)를, 2차 항체로서 ECL peroxidase labelled anti-mouse antibody(GE헬스케어사 제품)를 사용했다. 다른 하나의 PVDF막은 항hCTLA-4scFv02를 검출하기 위해서 1차 항체로서 항FLAG 항체 Monoclonal ANTI-FLAG M2 Antibody(produced in mouse)(씨그마사 제품)를, 2차 항체로서 ECL peroxidase labelled anti-mouse antibody(GE헬스케어사 제품)를 사용했다. 항체 반응 종료 후의 membrane을, Western Lightning Ultra(파킨에르마사 제품)를 이용하여 발광시켰다. 이것을 이메징 장치 MYECL Imager(Thermo Scientific사 제품)로 해석했다. 결과를 도 10에 나타낸다.
(결과)
도 10에서 명백한 바와 같이, 항hPD-1scFv03의 C말단에 His 태그 융합하고 있는 항인간 PD-1scFv03 분비 발현 카세트 및, 항hCTLA-4scFv02의 C말단에 FLAG 태그 융합하고 있는 항인간 CTLA-4scFv02 FLAG 분비 발현 카세트를 포함하는 PC1주(A, B 모두 lane 1) 및 CP1주(A, B 모두 lane 2)의 배양 상청 중에는 항hPD-1scFv03과 항hCTLA-4scFv02의 양쪽 모두가 확인되었다. 또한, PC1주(A：lane 1)와 CP1주(A：lane 2)의 hPD-1scFv분비 단백질의 크기와 hPD-1scFv03 단독 발현주(A：lane 3)의 hPD-1scFv분비 단백질의 크기는 동일하고, PC1주(B：lane 1)와 CP1주(B：lane 2)의 hCTLA-4scFv분비 단백질의 크기와 hCTLA-4scFv02 단독 발현주(B：lane 4)의 hCTLA-4scFv분비 단백질의 크기는 동일했다. 따라서, 공발현 비피도박테리움 속 세균주 PC1주 및 CP1주는 배양 상청 중에 항hPD-1scFv와 항hCTLA-4scFv의 양쪽을 분비할 수 있는 재조합 비피도박테리움 속 세균주인 것이 확인되었다.
［실시예 10］
［PC1주가 분비하는 항체의 hPD-1및 hCTLA-4에 대한 결합 확인］
상기 공발현주 PC1주의 배양 상청에서 정제한 항hPD-1scFv03의 인간 PD-1(hPD-1)과의 결합 활성의 유무, 항hCTLA-4scFv02의 인간 CTLA-4와의 결합 활성의 유무에 대해, ELISA법으로 확인했다.
96 구멍 플레이트에, 1×PBS로 1 μg/mL로 조정한 hPD-1(Recombinant Human hPD-1 FcChimera, R＆D Systems사 제품), hCTLA-4(Recombinant Human CTLA-4-Fc Chimera, Biolegend사 제품), mPD-1(Recombinant Human hPD-1 Fc Chimera, R＆D Systems사 제품) 및 mCTLA-4(Recombinant mouse CTLA-4-Fc Chimera, Biolegend사 제품)를 각각 100 μL씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 고상화했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다. 상기 플레이트에 1% BSA 용액을 350 μL씩 분주하고, 실온에서 2시간 정치함으로써 블로킹을 수행했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
항hPD-1scFv03및 항hCTLA-4scFv02를 신호 증강 시약(Signal Enhancer HIKARI, Nacalai tesque사 제품)으로 1000 ng/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL 및 1 ng/mL로 조정하고, 100 μL씩 상기 블로킹 종료 후 플레이트에 분주했다. 블랭크의 웰에는 신호 증강 시약만을 100 μL분주했다. 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 2시간 정치 후, 고상화된 hPD-1, mPD-1및 hCTLA-4와 항hPD-1scFv03을 반응시켰다. 마찬가지로 고상화된 hCTLA-4, mCTLA-4 및 hPD-1과 항hCTLA-4scFv02를 반응시켰다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
2차 항체(Anti-Histag-Biotin, MBL사 제품)를 신호 증강 시약으로 2000배로 희석하고 이것을 항hPD-1scFv03을 반응시킨 웰에 100 μL분주했다. 마찬가지로 2차 항체(THE(등록상표) DYKDDDDK Tag Antibody［Biotin］, mAb, mouse, GenScript사 제품)를 신호 증강 시약으로 2500배로 희석하고 이것을 항hCTLA-4scFv02를 반응시킨 웰에 100 μL분주했다. 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 2시간 정치했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
아비딘-비오틴 표지 효소 복합체(VECTASTAIN ABC 키트, Vector사 제품)로서 A액 및 B액을 3방울씩 신호 증강 시약 7. 5 mL에 첨가했다. 이것을 각 플레이트에 100 μL씩 분주 후, 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 30분간 정치했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
검출 시약으로서 Color SolutionA 및 Color SolutionB(R＆D Systems사 제품)를 등량씩 혼합하여 200 μL씩 분주하고, 차광하여 실온에서 20분 정치했다. 정확하게 20분 경과후 Stop Solution(R＆D Systems사)을 50 μL씩 첨가하여 정색(呈色) 반응을 정지했다. 450 nm 및 570 nm(참조 파장)에서의 흡광도를 측정했다. ELISA법에 따른 인간 PD-1 고상화 플레이트에 대한 항hPD-1scFv03의 결합의 결과를 아래의 표 6 및 도 11에 나타낸다. 마찬가지로 인간 CTLA-4 고상화 플레이트에 대한 항hCTLA-4scFv02의 결합의 결과를 아래의 표 7 및 도 12에 나타낸다.
　　[표 6]
Figure pct00006
　　[표 7]
Figure pct00007
(결과)
표 6 및 도 11에서 명백한 바와 같이, 공발현주 PC1주의 배양 상청에서 정제한 항hPD-1scFv03은 hPD-1과 결합했다. 또한, 표 7 및 도 12에서 명백한 바와 같이, 항hCTLA-4scFv02는 hCTLA-4와 결합했다. 한편, 항hPD-1scFv03은 hCTLA-4및 mPD-1과는 결합하지 않고, 또 항hCTLA-4scFv02는 hPD-1및 mCTLA-4와는 결합하지 않았다. 이로부터, 공발현주 PC1주가 분비한 항hPD-1scFv03 및 항hCTLA-4scFv02는 대응하는 항원 단백질과 특이적으로 결합하고 있는 것이 확인되었다.
［실시예 11］
［인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합 반응에서의 항hPD-1scFv의 경합적 저해 활성］
PD-1에 리간드 PD-L1가 결합하면, T세포에 부의 신호가 전달되어 면역 반응을 억제한다(면역 관용)고 되어 있다. 따라서, 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합 반응에서의 항hPD-1scFv의 경합적 저해 활성에 대해 검토했다.
상기 공발현주 PC1주의 배양 상청에서 정제한 항hPD-1scFv03을 이용하여, 인간 PD-1(hPD-1)에 대한 인간 PD-L1(hPD-L1)과의 결합에 대한 경합적 결합 저해 활성의 확인을 ELISA법에 의해 수행했다. 음성 대조군으로서 항hCTLA-4scFv02를 이용했다.
96 구멍 플레이트에, 1×PBS로 1 μg/mL로 조정한 hPD-1(Recombinant HumanPD-1 Fc Chimera, R＆D Systems사 제품)을 100 μL씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 고상화했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
상기 플레이트에 1% BSA 용액을 350 μL씩 분주하고, 실온에서 2시간 정치함으로써 블로킹을 수행했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다. hPD-L1(R＆D Systems, Recombinant HumanB7-H1/PD-L1 FcChimera)를 상기 신호 증강 시약으로 2000 ng/mL로 조정했다.
비피도박테리움 속 세균에서 정제한 항hPD-1scFv03을 상기 신호 증강 시약으로 20000 ng/mL, 2000 ng/mL, 200 ng/mL 및 20 ng/mL로 조정하고, 120 μL씩 조정한 hPD-L1과 등량 혼합하여, 100 μL씩 상기 블로킹 종료 후 플레이트에 분주했다. 음성 대조군으로서 비피도박테리움 속 세균에서 정제한 항hCTLA-4scFv02에 대해서도, 상기와 동일하게 조정했다. 블랭크의 웰에는 신호 증강 시약만을 100 μL분주했다. 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 2시간 정치하고, 고상화된 hPD-1에 대해서 항hPD-1scFv03과 혼합한 hPD-L1을 반응했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다. hPD-L1에 대한 2차 항체(Biotinanti-humanCD274, Biolegend사 제품)를 신호 증강 시약으로 0. 2 μg/mL로 조정하고, 이것을 100 μL씩 분주했다. 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 30분간 정치했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
상기 아비딘-비오틴 표지 효소 복합체로서 A액 및 B액을 1방울씩 신호 증강 시약 2. 5 mL에 첨가했다. 이것을 100 μL씩 분주하고, 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 30분간 정치했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다. 검출 시약으로서 Color SolutionA 및 Color SolutionB(R＆D)를 등량씩 혼합해 200 μL씩 분주하고, 차광하여 실온에서 20분 정치했다. 정확하게 20분 경과후 Stop solution(R＆D)를 50 μL씩 첨가하여 정색 반응을 정지했다. 450 nm 및 570 nm(참조 파장)에서의 흡광도를 측정했다. 측정 결과를 아래의 표 8 및 도 13에 나타냈다.
　　[표 8]
Figure pct00008
(결과)
표 8 및 도 13에서 명백한 바와 같이, 1000 ng/mL의 hPD-L1의 hPD-1에 대한 결합에 대한 저해율은 10000 ng/mL의 항hPD-1scFv03에서 69. 3%였다. 이상의 결과로부터, 1000 ng/mL의 hPD-L1의 hPD-1에 대한 결합에 대해서, 항hPD-1scFv03은 10000 ng/mL이상의 농도에서 경합적으로 결합 저해하는 것이 나타났다.
[실시예 11-1]
［인간 CTLA-4에 대한 인간 CD80 및 인간 CD86과의 결합 반응에서의 hCTLA-4scFv의 경합적 저해 활성의 확인］
상기 공발현주 PC1주의 배양 상청에서 정제한 항hCTLA-4scFv02를 이용하여, 인간 CTLA-4(hCTLA-4)에 대한 인간 CD80(hCD80) 및 인간 CD86(hCD86)과의 결합에 대한 경합적 결합 저해 활성의 확인을 ELISA법에 의해 수행했다. 음성 대조군으로서 항hPD-1scFv03을 이용했다.
96 구멍 플레이트에, 1×PBS로 1 μg/mL로 조정한 hCTLA-4(Recombinant Human CTLA-4-Fc Chimera, carrier-free, BioLegend사 제품)를 100 μL씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 고상화했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
상기 플레이트에 1% BSA 용액을 350 μL씩 분주하고, 실온에서 2시간 정치함으로써 블로킹을 수행했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다. hCD80(R＆D Systems, Recombinant Human B7-1/CD80 Fc Chimera) 및 hCD86(R＆D Systems, Recombinant Human B7-2/CD86 Fc Chimera)을 상기 신호 증강 시약으로 2000 ng/mL로 조정했다.
비피도박테리움 속 세균에서 정제한 항hCTLA-4scFv02를 상기 신호 증강 시약으로 20000 ng/mL, 2000 ng/mL, 200 ng/mL 및 20 ng/mL로 조정하고, 120 μL씩 조정한 hCD80 및 hCD86과 등량 혼합해, 100 μL씩 상기 블로킹 종료 후 플레이트에 분주했다. 음성 대조군으로서 비피도박테리움 속 세균에서 정제한 항hPD-1scFv03에 대해서도, 상기와 동일하게 조정했다. 블랭크의 웰에는 신호 증강 시약만을 100 μL분주했다. 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 2시간 정치하고, 고상화된 hCTLA-4에 대해서 항hCTLA-4scFv02과 혼합한 hCD80 및 hCD86를 반응했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
hCD80에 대한 2차 항체(R＆D Systems, Human B7-1/CD80 Biotinylated Antibody) 및 hCD86에 대한 2차 항체(R＆D　Systems, Biotinylated Anti-human B7-2 Antibody)를 상기 신호 증강 시약으로 2. 5 μg/mL 및 0. 5 μg/mL로 조정하고, 이것을 10 μL씩 분주했다. 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 30분간 정치했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다.
상기 아비딘-비오틴 표지 효소 복합체로서 상기 A액 및 B액을 3방울씩 신호 증강 시약 7. 5 mL에 첨가했다. 이것을 100 μL씩 분주하고, 플레이트에 씰을 붙여, 실온에서 30분간 정치했다. 용액을 제거 후, 1×PBS를 350 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정했다. 검출 시약으로서 Color SolutionA 및 Color SolutionB(R＆D)를 등량씩 혼합해 200 μL씩 분주하고, 차광하여 실온에서 20분 정치했다. 정확하게 20분 경과후 Stop solution(R＆D)을 50 μL씩 첨가해 정색 반응을 정지했다. 450 nm 및 570 nm(참조 파장)에서의 흡광도를 측정했다. 결과를 아래의 표 9 및 표 10 및 도 14 및 도 15에 나타낸다.
　　[표 9]
Figure pct00009
　　[표 10]
Figure pct00010
(결과)
표 9 및 표 10 및 도 14 및 도 15에서 명백한 바와 같이, 1000 ng/mL의 hCD80 및 hCD86의 hCTLA-4에 대한 결합에 대한 저해율은 1000 ng/mL의 항hCTLA-4scFv02에서 각각 43. 7%및 70. 0%이며, 10000 ng/mL의 항hCTLA-4scFv02에서 각각 81. 7%및 100. 0%였다. 1000ng/mL의 hCD80 및 hCD86의 hCTLA-4에 대한 결합에 대해서, 항hCTLA-4scFv02는 1000 ng/mL이상의 농도로 경합적으로 결합 저해하는 것이 나타났다.
［실시예 12］
［공발현 비피도박테리움 속 세균에서 정제한 항hPD-1scFv 및 항hCTLA-4scFv의 세포에 대한 결합：항원 과잉 발현 세포주를 이용한 검토］
상기 공발현주 PC1주의 배양 상청에서 정제한 항hPD-1scFv와 인간 PD-1(hPD-1) 발현 세포의 결합 유무, 및 항hCTLA-4scFv와 인간 CTLA-4(hCTLA-4) 발현 세포의 결합 유무를, 아래의 항원 단백질을 과잉 발현시킨 세포를 이용하여 유세포 분석법으로 검토했다.
hPD-1 과잉 발현 HEK293T 세포(hPD-1은 쥐 CD2와 바이시스트로닉(Bicistronic)으로 발현) 및, hCTLA-4 과잉 발현 HEK293T 세포(hCTLA-4는 쥐 CD2와 바이시스트로닉으로 발현)를 사용했다. hPD-1 과잉 발현 HEK293T 세포 및 hCTLA-4 과잉 발현 HEK293T 세포는 비활성화된 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 배양을 수행하고, 100 mm디쉬(그라이너ㆍ재팬사 제품)에 파종했다. hPD-1 과잉 발현 HEK293T 세포 및 hCTLA-4 과잉 발현 HEK293T 세포의 배양 상청을 제거하고, PBS(Ca2 ＋, Mg2 ＋ 프리ㆍ인산 완충액)로 2번 세정하고, PBS로 10배로 희석한 트립신ㆍEDTA 용액(와코준야쿠코교사 제품) 1 mL를 첨가하여 1분간 실온에서 정치 후, 10 mL의 비활성화된 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 첨가하여 15 mL 원침관(遠沈管)(BD팔콘사 제품)으로 옮겼다. 저속 원심기(토미세이코사 제품)로 1000 rpm, 5분간 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 1 mL의 비활성화된 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 첨가하여 세포수를 계측했다. 또한 DMEM 배지를 첨가하여, 1×105cells/mL로 세포 현탁액을 조제하고, 1. 5 mL 튜브(이나ㆍ옵티카사 제품)에 1×105cells/mL/tube가 되도록 분주했다. 1. 5 mL 튜브에 분주한 hPD-1 과잉 발현 HEK293T 세포 및 hCTLA-4 과잉 발현 HEK293T 세포를 미량 냉각 원심기(토미세이코사 제품)로 5000 rpm, 4℃에서 1분간 원심 분리 후, 상청을 제거했다. 튜브에 남은 세포의 펠릿을 0. 5 mL의 PBS로 2번 세정 후, 재조합 비피도박테리움 속 세균에서 정제하고, 10 μg/mL로 조제한 항hPD-1scFv03 및 항hCTLA-4scFv02를 각 튜브에 100 μL첨가하여, 빙상(氷上)에서 30분간 정치했다. 30 분후, FACS 버퍼(1% BSA, 0. 1%NaN3을 포함하는 PBS)를 500 μL 튜브에 가해 상기 미량 냉각 원심기에서 5000 rpm, 4℃에서 1분간 원심 분리 후, 상청을 제거하여 세정을 수행했다. 동일한 조작을 한번 더 수행하여 세정 조작을 2번 수행했다. FACS 버퍼로 0. 5 μg/mL로 희석한 anti-His-tag Alexa Fluor488 항체(MBL사 제품) 및, anti-DDDDK-tag Alexa Fluor 488 항체(MBL사 제품) 100 μL를 1. 5 mL 튜브에 첨가 후, 피펫팅으로 잘 혼합하여, 빙상에서 30분간 정치했다. 30 분 후, FACS 버퍼를 500 μL 튜브에 가해 상기 미량 냉각 원심기로 5000 rpm, 4℃에서 1분간 원심 분리 후, 상청을 제거하여 세정을 수행했다. 동일한 조작을 한번 더 수행하여 세정 조작을 2번 수행했다. 500 μL의 FACS 버퍼를 첨가 후, 5 mL폴리스티렌 라운드 바텀 튜브(벡톤ㆍ디킨슨사 제품)에 FACS 버퍼로 현탁시킨 세포를 옮겼다. FACS 버퍼로 5 μg/mL에 희석한 프로피디움 요오드화물 용액을 5 μL첨가하여, BD FACS canto II 유세포측정기(벡톤ㆍ디킨슨사 제품) 및 유세포 분석 해석 소프트웨어 Kaluza ver1. 2(벡크만쿨터사 제품)로 해석을 수행했다. PC1주에서 정제한 항PD-1scFv03의 인간 PD-1 과잉 발현 세포에 대한 결합의 결과를 도 16에 나타낸다. 마찬가지로 공발현주 PC1주에서 정제한 항CTLA-4scFv02의 인간 CTLA-4 과잉 발현 세포에 대한 결합의 결과를 도 17에 나타낸다.
(결과)
도 16에서 명백한 바와 같이, PC1주에서 정제한 항PD-1scFv03은 인간 PD-1고발현 세포(쥐 CD2고발현 세포)에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다. 마찬가지로 도 17에서 명백한 바와 같이, PC1주에서 정제한 항CTLA-4scFv02는 인간 CTLA-4고발현 세포(쥐 CD2고발현 세포)에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다. 이러한 결과로부터, 공발현주 PC1주에서 정제한 scFv는 인간 PD-1및 인간 CTLA-4 과잉 발현 세포에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다.
［실시예 13］
［항HER2scFv 및 hIFN-γ공발현 비피도박테리움 속 세균주 HG-2주의 제작］
(개요)
항HER2scFv를 분비하는 발현 카세트(항HER2scFv분비 발현 카세트)와 hIFN-γ를 분비하는 발현 카세트(인간 IFN-γ분비 발현 카세트)를 포함하여, 대장균 비피도박테리움 속 세균 셔틀 벡터인, 공발현 플라스미드 pHG-2를 제작했다(도 2). 이러한 pHG-2를 이용하여 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션법에 의해 수행하고, 항HER2scFv 및 hIFN-γ공발현 비피도박테리움 속 세균 HG-2주를 수득했다. 실시예 13에 있어서 사용한 프라이머를 아래의 표 11에 나타낸다.
　　[표 11]
Figure pct00011
항HER2scFv분비 발현 카세트로서, (1) P30 프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 연결체 SP7L20을 코딩하는 DNA, (3) 항HER2scFv의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, (4) His 태그 서열을 코딩하는 DNA, (5) d0013 터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (5)를 하류(3' 말단) 측으로 하여, (1)~(5)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트를 제작했다.
(플라스미드 pHG-2의 제작)
플라스미드 pHG-2의 제작 시, 우선, 플라스미드 pHG-1을 제작했다.
(플라스미드 pHG-1의 제작)
(hIFNg 인서트 단편의 조제)
플라스미드 phIFNg33(서열 번호 16)을 주형으로 하고, 상기 표 11에 기재된 Hu-HuT_ins_F1(포워드) 및 HuT-pTB6_ins_R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복되도록 설계되었다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 20 μL로 하고, STAR 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 72℃에서 72초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행하고, 약 1. 1 kbp의 hIFNg 인서트 단편 증폭 산물을 조제했다.
(항HER2scFv단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 단편의 조제)
pP30SP7L20-bHER2(서열 번호 15)를 주형으로 하고, 표 11에 기재된 pTB6_Vec_F1(포워드) 및 Hu-term_Vec_R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복되도록 설계되었다. 각 프라이머 농도를 0. 2 μM, 반응 용량 20 μL로 하여, STAR 키트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서는 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 72℃에서 4분 45초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행하고, 약 4. 6 kbp의 벡터 단편 증폭 산물을 조제했다.
(인퓨전 반응 12)
상기에서 조제한 4. 6 kbp의 벡터 단편 증폭 산물 및 약 1. 1 kbp의 인서트 단편을 In-Fusion(등록상표) HD Cloning 키트(다카라 바이오 가부시키가이샤 제품)를 이용하여 연결했다. 우선 Clontech사의 웹 사이트 In-Fusion(등록상표) Molar Ratio Calculator(http：／／bioinfo. clontech. com/infusion/molarRatio. do)에서 필요한 인서트량 및 벡터량을 산출해, 벡터：인서트=1：2의 몰비로 했다. 5×In-Fusion HD Enzymes premix2 μL, Cloning Enhancer 1 μL, 인서트 및 벡터의 필요량을 혼합하여, 0. 1×TE버퍼(1 mm Tris-HCl, 0. 1 mm EDTA, pH7. 5)로 반응계의 총량을 10 μL로 했다. 37℃에서 15분간 반응 후, 50℃에서 15분간 반응하여, 4℃에 정치했다. 그 외의 순서는 키트의 제품 설명서에 따라, 인퓨전 반응액 12를 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pHG-1의 DNA 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 인퓨전 반응액 12를 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 항HER2scFv분비 발현 카세트 및 인간 IFN-γ분비 발현 카세트의 DNA 서열의 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드 pHG-1이라고 명명했다. 플라스미드 pHG-1의 DNA 서열을 서열 번호 17로 표시한다.
(pHG-2주의 조제)
플라스미드 pHG-1의 항HER2scFv발현 분비 카세트의 터미네이터를 Hu터미네이터에서 d0013 터미네이터로 교환했다. 상기 pHG-1을 주형으로 하고, 상기 표 11에 기재된 Hu_Vec_F1(포워드) 및 bHER2-His_Vec_R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 72℃에서 5분 45초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 5. 6 kbp의 벡터 단편 증폭 산물을 조제했다.
비피도박테리움ㆍ롱검 105-A의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 표 11에 기재된 d0013＋T_ins_F1(포워드) 및 d0013＋T_ins_R1(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행했다. 증폭의 프로그램으로서 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 72℃에서 35초를 1 사이클로 하여 30 사이클 수행한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 수행한 것 외에는 상기 (플라스미드 pAG8의 제작)와 동일한 순서로, 약 144 bp의 인서트 단편 증폭 산물을 조제했다.
(인퓨전 반응 13)
상기에서 조제된 벡터 단편과 인서트 단편을 이용한 것 외에는 상기 (인퓨전 반응 10)와 동일한 순서로 인퓨전 반응액 13을 조제했다.
(대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pHG-2의 DNA의 서열 확인)
상기 (대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로 상기 인퓨전 반응액 13을 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행했다. 추출한 플라스미드에서의 항HER2scFv분비 발현 카세트 및 인간 IFN-γ분비 발현 카세트의 DNA 서열의 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드 pHG-2라고 명명했다. 플라스미드 pHG-2의 DNA 서열을 서열 번호 100으로 표시한다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 9)
상기 형질 전환된 대장균에서 추출한 플라스미드 pHG-2(500 ng)를 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHG-2(이하, HG-2주라고 한다)로 했다.
［실시예 14］
［HG-2주에서의 항HER2scFv 및 hIFN-γ의 분비 확인］
HG-2주의 배양 상청 중의 항HER2scFv 및 hIFN-γ의 유무를 웨스턴 블로팅법으로 아래와 같이 확인했다.
(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)
상기 HG-2주, 인간 IFN-γ분비 발현 카세트의 한쪽만을 갖는 단독 발현주인 P30SP7L20-bHER2(플라스미드 pP30SP7L20-bHER2 도입주) 주, hIFNg33주에 대해 실시예 4(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)와 동일한 순서로 상기 비피도박테리움 속 세균을 배양하고, 배양 상청을 회수했다. 이 배양 상청 중의 단백질을 트리클로로 아세트산(TCA, 와코준야쿠코교 가부시키가이샤 제품)에 의해 침전시켜, 아세톤으로 세정 후, SDS-PAGE용 버퍼에 용해하고, 95℃에서 3분간 열처리를 수행하여, 각 배양 상청 농축물로 했다.
(웨스턴 해석)
상기 각 배양 상청 농축물(배양액 0. 1 mL 상당)을 실시예 9의 (웨스턴 해석)과 동일한 순서로, 블로팅 종료 후의 막을 블로킹했다. 그 후, 1차 항체로서 항히스티딘 항체인 상기 THE His Tag Antibody, mAb, Mouse를, 2차 항체로서 상기 ECL peroxidaselabelled anti-mouse antibody를 사용하고, 항체 반응 종료 후의 membrane을, 상기 Western Lightning Ultra를 이용하여 발광시켰다. 이것을 이메징 장치 Fluor - S Max(BIO-RAD사 제품)로 해석했다. 결과를 도 18에 나타낸다.
(결과)
도 18에서 명백한 바와 같이, HG-2주에서는 항HER2scFv와 hIFN-γ의 양쪽 모두가 검출되고 있고, 그 크기는 각각의 단독 발현주의 분비물과 동일했다. 그리고 lane M는 마커, lane 1은 항HER2scFv단독 발현주(P30SP7L20-bHER2주)로부터의 분비 단백질, lane 2는 hIFN-γ단독 발현주(hIFNg33주)로부터의 분비 단백질, lane 3은 항HER2scFv 및 hIFN-γ공발현주(HG-2주)로부터의 분비 단백질을 로딩했다.
［실시예 15］
［HG-2주 분비물의 생리 활성의 검토］
(배양 상청 농축물의 조제와 hINF-γ단백질의 발현량 확인)
상기 HG-2주, P30SP7L20-bHER2주, hIFNg33주, BEshuttle주에 대해 각각 MRS(75 μg/mL스펙티노마이신, 1%비타민 C첨가액) 액체 배지에 1% 식균하고, 37℃에서 24시간 혐기 배양했다(활성화 배양). DMEM 배지(저(低)글루코스, Life technologies사 제품) 18 mL에 MRS 액체 배지 2 mL를 첨가한 DMEM/MRS(75 μg/mL스펙티노마이신, 0. 5%비타민 C첨가액) 배지에 활성화 배양액 0. 5%를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기 배양했다(본 배양). 이 배양액 20 mL를 원심 분리하고, 배양 상청 13 mL를 회수한 후, 구멍지름 0. 2 μm의 필터로 여과해 균체를 제거했다. 이 배양 상청 10 mL를 Amicon Ultra-4(Millipore사 제품)로 농축한 후, PBS(-)로 치환하여 500 μL로 했다(비피도박테리움 속 세균 배양 상청의 농축물(PBS 치환)). 각 세균 배양 상청 농축물을 상기 hIFN-γ측정용 ELISA 키트를 이용하여, ELISA법에 의해 배양 상청 중의 IFN-γ량을 측정했다. 측정 결과를 아래의 표 12에 나타냈다.
　　[표 12]
Figure pct00012
(HG-2주 분비물 중의 항HER2scFv의 암 세포 증식 억제 활성)
항HER2scFv의 생리 활성은 P30SP7L20-bHER2주의 배양 상청에서 His 태그 정제한 항HER2scFv(PBS 치환)를 HER2 양성 세포(NCI-N87(위암) 세포)에 첨가하여, 세포 증식 억제 활성을 측정했다. 즉, NCI-N87 세포를 RPMI1640 배지(10%(v／v) FBS)에서 37℃에서 5% CO2의 조건 하에서 배양 후, 96 구멍 플레이트에 2×104 cells씩 파종하여 37℃에서 5% CO2의 조건 하에서 24시간 배양했다. 그 후 낡은 배지를 흡인 제거하고, 새로운 RPMI1640 배지(10%(v／v) FBS)를 98 μL씩 첨가했다. 그 다음, 측정 시료로서 PBS(-), 항HER2scFv를 244 ng/mL~1 mg/mL로 조정한 것을 2 μL씩 첨가했다. 이 플레이트를 37℃에서 5% CO2의 조건 하에서 5일간 배양했다.
상기 5일간 배양 후의 배지를 흡인 제거한 후, 새로운 RPMI1640 배지(10%(v／v) FBS) 9 mL에 Cell Counting 키트-8을 1 mL첨가한 것을 100 μL씩 첨가 후, 추가로 3시간 37℃에서 5% CO2의 조건 하에서 보온해, 파장 450 nm와 630 nm(참조 파장)에서의 흡광도를 측정함으로써 상기 HER2 양성 세포에 대한 세포 증식 억제 활성을 측정했다. 결과를 도 19에 나타낸다.
(결과)
도 19에서 명백한 바와 같이, 상기 비피도박테리움ㆍ롱검 Re-105A/pP30SP7L20-bHER2에서 정제한 항HER2scFv는 NCI-N87 위암 세포에 대해 용량 의존성의 세포 증식 억제 활성을 나타내고, 재조합 비피도박테리움 속 세균이 분비한 항HER2scFv는 생리 활성을 갖는 것을 확인했다.
［실시예 16］
(HG-2주가 분비한 항HER2scFv 및 hIFN-γ의 암 세포 증식 억제 활성 1)
공발현주에 의해 분비된 단백질인 항HER2scFv 및 hINF-γ)의 생리 활성은 HER2 양성 세포(NCI-N87 세포)에 실시예 15에서 얻은 비피도박테리움 속 세균(HG-2주) 배양 상청의 농축물(PBS 치환)을 첨가하여, 증식 억제 활성을 조사함으로써 판정했다. 즉, NCI-N87 세포를 RPMI1640 배지(10%(v／v) FBS)에서 37℃에서 5% CO2의 조건 하에서 배양 후, 96 구멍 플레이트에 2×104 cells씩 파종하고 37, 5% CO2의 조건 하에서 24시간 배양했다. 이 세포 배양액에서 낡은 배지를 흡인 제거하고, 새로운 RPMI1640 배지(10%(v／v) FBS)를 90 μL씩 첨가했다. 그 다음, 측정 시료로서 PBS(-), BEshuttle주 배양 상청 농축물(음성 대조군), P30SP7L20-bHER2주 배양 상청 농축물, hINFg33주 배양 상청 농축물(hIFN-γ농도를 2000 ng/mL가 되도록 PBS로 희석해 조정), HG-2주 배양 상청 농축물, 및 재조합(recombinant) hIFN-γ(양성 대조군, hIFN-γ농도를 2000 ng/mL가 되도록 조정)를 10 μL씩 첨가했다. 이 플레이트를 37℃에서 5% CO2의 조건 하에서 5일간 배양했다.
세포 증식억제활성의 측정은 상기 (항HER2scFv의 세포 증식 억제 활성)에서 기재한 것과 동일한 방법으로 수행했다. 결과를 도 20에 나타낸다.
도 20에서 명백한 바와 같이, 항HER2scFv／hIFN-γ공발현주인 HG-2주 유래의 배양 상청 농축물은 NCI-N87 세포에 대해 매우 강한 세포 증식 억제 활성을 나타냈다. 한편, hIFN-γ단독 발현주의 hINFg33주 배양 상청유래의 농축물은 200 ng/mL의 hIFN-γ에서, 표준품으로서 이용한 재조합 hIFN-γ(PeploTech사 제품)와 동일한 세포 증식 억제 활성을 나타냈다. 또 P30SP7L20-bHER2주 유래의 농축물은 실시예 15와 동일한 세포 증식 억제 활성이 확인되었다. 항HER2scFv／hIFN-γ공발현주의 HG-2주의 세포 증식 억제 활성은 동시에 수행한 hIFN-γ단독 발현주 및 P30SP7L20-bHER2주의 어느 활성보다 강하고, 공분비된 hIFN-γ및 항HER2scFv양 단백질의 상승적인 병용 효과에 의한 것이라고 생각된다.
［실시예 17］
［항HER2scFv 및 hIFN-γ공발현주의 종양 내분비의 확인］
인간 위암 세포주 NCI-N87의 담암담암 누드 마우스를 이용하여, 종양 내의 비피도박테리움 속 세균의 국재(局在)를 그람 염색으로, 항HER2scFv와 hIFN-γ의 국재를 항히스티딘 태그 항체 및 항hIFN-γ항체에 의한 면역 조직 염색으로 확인했다.
인간 위암 세포주 NCI-N87(ATCC)를 10%FBS(EQUITECH-BIO, INC. 사 제품)의 RPMI1640 배지(와코준야쿠코교사 제품)에서 배양하고, 누드 마우스(일본 에스엘씨사 제품)에 이식해 담암 마우스를 제작했다. 종양 크기가 약 470 mm3인 담암 마우스에 항HER2scFv 및 hIFN-γ공발현주(HG-2주)의 간이 동결 제제 및 대조군으로서 비발현주의 BEshuttle주의 간이 동결 제제를 미정맥으로부터 6 x108cfu의 용량으로 투여했다. 그리고 10% 말토오스 용액을 1 mL씩 1일 2회의 빈도로 5일간 투여했다. 투여 7일 후에 종양을 적출하여, O. C. T. compound(사쿠라 파인테크사 제품)로 동결포매(包埋)하고, 동결 마이크로톰(microtome) Leica CM1900(Leica사 제품)으로 박절(薄切) 슬라이드 표본을 제작하여, 각 조직 염색에 제공했다.
(그람 염색)
상기 박절 슬라이드 표본을 풍건(風乾)하고, 4% PFA(와코준야쿠코교사 제품)에 10분간 침지하여 고정했다. 고정 후, 전염색(前染色)으로서 버 미(Bartholomew & Mittwer) M 크리스탈 바이올렛 용액(무토우카가쿠사 제품)에서 2분간 염색한 후, 버 미 M 요오드ㆍ수산화 나트륨 용액(무토우카가쿠사 제품)에 1분간 반응시켰다. 버 미 M 아세톤ㆍ에틸 알코올 혼합액(무토우카가쿠사 제품)에서 탈색 후, 버 미 M 0. 1% 푸크신액(무토우카가쿠사 제품)으로 1분간 염색했다. 염색 후, 정제수로 세정하고, 99. 5% 에탄올(와코준야쿠코교사 제품)로 탈수해, 레모졸(Lemosol)(와코준야쿠코교사 제품)로 투철(透徹) 후, 엔텔란뉴(Entellan(R)new)(MERCK kgaA사 제품)로 봉입했다. 결과를 도 21에 나타낸다.
(항히스티딘 태그 항체 및 항hIFN-γ항체에 의한 면역 조직 염색)
상기 박절 슬라이드 표본을 풍건하고, 4%PFA(와코준야쿠코교사 제품)에 약 4시간 침지해 고정했다. 고정 후, 정제수에서 1분간 세정해, 1×PBS(-)로 5분간의 세정을 3회 수행했다. 조직의 주변의 수분을 닦아내고, Dako pen(Dako사 제품)으로 조직의 주위를 둘러싸고, 3% BSA-PBS를 조직에 적하하여 60분간 반응시켜, 비특이적 결합의 저해를 수행했다. Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor(등록상표) 594(MBL사 제품) 및 FITC Anti-human IFN-γ항체(BioLegend사 제품)를 Can Get Signal(등록상표) i mmunostain(TOYOBO사 제품)과 혼합 희석하여, 항체 반응액으로서 조직에 적하하여 4℃에서, 하룻밤 반응시켰다. 항체 반응 후, 1×PBS(-)로 5분간의 세정을 3회 수행하고, VECTASHIELD(등록상표) Mounting Medium with DAPI로 봉입했다. 상기의 염색한 절편을 현미경 DM5000B(Leica사 제품)로 현미경 검사하여 화상을 촬영했다. 결과를 도 22 및 23에 나타낸다.
(결과)
도 21에서 명백한 바와 같이, 그람 염색에 의해, HG-2주(A) 및 BEshuttle주(B) 각각에 대하여 종양 조직 중에 균의 존재가 확인되었다(도 21(A) 및 (B), 화살표 부분). 한편, 항hIFN-γ항체에 의한 면역 조직 염색에 의해, 공발현주 HG-2주를 투여한 담암 마우스의 종양 조직에 있어서, hIFN-γ양성상(陽性像;hot nodule)이 확인되었다(도 22, 화살표로 나타내는 녹색 부분). 또한, 히스티딘 태그의 면역 조직 염색에 의해 히스티딘 태그 양성상(항HER2scFv 및 hIFN-γ)이 확인되었다(도 23, 화살표로 나타내는 적색 부분). 이러한 결과로부터, HG-2주를 인간 위암 NCI-N87담암 마우스에 정맥내 투여하면, 종양 내에 HG-2주가 생착하고, HG-2주에서 분비된 hIFN-γ및 항HER2scFv단백질이 종양 내에 동시에 존재하고 있는 것이 확인되었다.
［실시예 18］
［항인간 PD-1scFv03-His 및 항인간 CTLA-4scFv01-FLAG공발현주의 제작］
항인간 PD-1scFv03-His 및 항인간 CTLA-4scFv01-FLAG를 분비하는 대장균 비피도박테리움 속 세균 셔틀 벡터인, 공발현 플라스미드 pPC2, pPC3, pPC4, pPC5, pPC6, pPC7, 및 pPC8을 제작하고, 이들 7 종류의 공발현 플라스미드 각각을 이용하여 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 수행했다.
7 종류의 공발현 플라스미드 pPC2~pPC8에서의, 항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트 및 항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트의 구성을 아래의 표 13-1및 표 13-2에 나타냈다. 플라스미드 분자내의 상동 서열(homologous sequence)을 회피하기 위해, 각 발현 카세트 내의 프로모터 DNA, 터미네이터 DNA, 태그 및 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체를 코딩하는 DNA 서열은 동일한 구성을 포함하지 않게 했다.
[표 13-1]
Figure pct00013
[표 13-2]
Figure pct00014
(항hPD-1scFv03-His 분비 발현 카세트의 구성)
항hPD-1scFv03-His 분비 발현 카세트로서, (1) Hu프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체를 코딩하는 DNA, (3) 항hPD-1scFv03 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, (4) His 태그 서열을 코딩하는 DNA, 및 (5) Hu터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (5)를 하류(3' 말단) 측으로 하여, (1)~(5)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트를 제작했다. 상기 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체로서는 SP50L5 (서열 번호 61의 아미노산 서열에 서열 번호 83의 최초의 5개의 아미노산 서열(Ala Thr Leu Thr Pro)이 결합한 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체), SP67L10(서열 번호 73의 아미노산 서열에 서열 번호 95의 최초의 10개의 아미노산 서열(Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly)이 결합한 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체), 또는 SP69L1(서열 번호 77의 아미노산 서열에 서열 번호 99의 최초의 1개의 아미노산 서열(Asp)이 결합한 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체)을 사용했다.
(항hCTLA-4scFv01-FLAG 분비 발현 카세트의 구성)
항hCTLA-4scFv01-FLAG 분비 발현 카세트로서, (1) P30 프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체를 코딩하는 DNA, (3) 항hCTLA-4scFv01의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, (4) FLAG 태그 서열을 코딩하는 DNA, 및 (5) T2 터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (5)를 하류(3' 말단) 측으로 하여, (1)~(5)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트를 제작했다. 상기 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체로서는 SP50L5 (서열 번호 61의 아미노산 서열에 서열 번호 83의 최초의 5개의 아미노산 서열(Ala Thr Leu Thr Pro)이 결합한 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체), SP67L1(서열 번호 73의 아미노산 서열에 서열 번호 95의 최초의 1개의 아미노산 서열(Ala)이 결합한 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체), 또는 SP68L1(서열 번호 75의 아미노산 서열에 서열 번호 97의 최초의 1개의 아미노산 서열(Asp)이 결합한 분비 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체)을 사용했다.
공발현 플라스미드 pPC2~pPC8의, 기본 구성을 도 24에 나타낸다.
또한, 제작 방법의 개요를 도 25에 나타낸다.
(1) 제 1 공정에서는 공발현 플라스미드 pPC2~pPC8의 제작에 사용한 주형 플라스미드(pHuSPxLy-hPD-1scFv03-His(SPxLy=SP50L5, SP67L10, SP69L1))를 제작했다.
(2) 제 2 공정에서는 항hPD-1scFv03-His 발현 플라스미드 pHuSPxLy-hPD-1scFv03-His(SPxLy=SP50L5, SP67L10, SP69L1)의 항hPD-1scFv03-His 발현 카세트의 하류에 T2 터미네이터 단편을 삽입한 플라스미드 pHuSPxLy-hPD-1scFv03-His-T2(SPxLy=SP50L5, SP67L10, SP69L1)를 제작했다.
(3) 제 3 공정에서는 제 2 공정에서 제작한 플라스미드의 Hu터미네이터와 T2 터미네이터의 사이에, 항hCTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트(단, 터미네이터를 제외)를 삽입하여, 공발현 플라스미드 pPC2~pPC8의 제작을 수행했다.
(제 1 공정)
A공정：실시예 8에서 제작한 플라스미드 pHuSP7L20-hPD-1scFv03(scFv서열의 3' 말단에 히스티딘 태그가 부가)을 주형 DNA로서 제작한 직쇄 벡터(vector)와, 105-A게놈 DNA로부터 제작한 SP50 인서트(insert), SP67 인서트, SP69 인서트의 PCR 산물을 조제했다. 프라이머는 PCR 산물의 말단 15 bp가 다음 공정의 In-fusion 반응에 있어서 연결하는 인접 PCR 산물의 말단 15 bp와 동일 서열이 되도록 설계했다. 신장 반응시간은 1 kbp당 1분을 기준으로 했다. 여기서의 PCR 증폭 공정을 「PCR 증폭 공정 1」이라고 한다).
상기 직쇄 벡터와 각 인서트를, HD 키트를 이용하여 인퓨전 반응으로 연결했다. 상기 (실시예 1：대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일한 순서로, 인퓨전 반응액을 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질 전환, 재조합 대장균으로부터의 플라스미드 추출을 수행하고, 추출한 플라스미드에서의"항hPD-1scFv03-His 발현 카세트 영역"(Hu프로모터로부터 Hu터미네이터를 포함한다)의 서열 결정을 수행했다(이하, 인퓨전 반응으로부터 서열 결정까지는 동일한 순서로 수행된다). 추출한 플라스미드를 pHuSP50L20-hPD-1scFv03-His, pHuSP67L20-hPD-1scFv03-His 및 pHuSP69L20-hPD-1scFv03-His라고 명명했다.
B공정：상기 pHuSP50L20-hPD-1scFv03-His, pHuSP67L20-hPD-1scFv03-His 및 pHuSP69L20-hPD-1scFv03-His로부터 제작한 SP50L5 인서트, SP67L10 인서트, SP69L1 인서트의 PCR 산물을 조제했다.
A공정에서 제작한 직쇄 벡터와 상기 SP50L5 인서트, SP67L10 인서트, SP69L1 인서트를, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, "항hPD-1scFv03-His 발현 카세트 영역"의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His, pHuSP67L10-hPD-1scFv03-His 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03-His라고 명명했다.
(제 2 공정)
(T2 터미네이터의 제작)
(서열 번호 101)을 진스크립트 재팬 가부시키가이샤에 합성을 의뢰해, T2 터미네이터라고 명명했다. 플라스미드 벡터 pUC57에 내장된 DNA(Bba-B0015 in pUC57)로서 납품되었다.
상기 pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His, pHuSP67L10-hPD-1scFv03-His 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03-His를 각각 주형 DNA로 하고, PC1_primer(서열 번호 102)를 포워드 프라이머로 하고, PC2_primer(서열 번호 103)를 리버스 프라이머로 이용하여 모두 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물을 조제해 A1, A2, 또는 A3의 직쇄 벡터로 했다. PCR 산물의 크기는 각각, 4751 bp, 4697 bp, 4661 bp였다.
상기 Bba-B0015 in pUC57를 주형 DNA로 하고, PC3_primer(서열 번호 104)를 포워드 프라이머로 하고, PC4_primer(서열 번호 105)를 리버스 프라이머로 이용하여 PCR 산물 B(159 bp)를 조제했다.
[표 14]
Figure pct00015
상기 표 14에 나타내는 조합으로, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, 각 "항hPD-1scFv03-His 발현 카세트 및 T2 터미네이터 영역"(5'-Hu프로모터-SPxLy-인간 PD-1scFv03-His-T2 터미네이터-3')의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His-T2, pHuSP67L10-hPD-1scFv03-His-T2 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03-His-T2라고 명명했다.
［플라스미드 phCTLAz의 제작］
실시예 8에서 제작한 플라스미드 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG의 Hu프로모터를 P30 프로모터로 치환했다. 개요를 도 26에 나타낸다.
pHuSP7L20-hCTLA-4scFv02 FLAG를 주형 DNA로 하고, vec_F5_primer(서열 번호 106)를 포워드 프라이머로 하고, vec_R2_primer(서열 번호 107)를 리버스 프라이머로 이용하여 제작한 직쇄 벡터의 PCR 산물(4410 bp)과 105-A게놈 DNA를 주형으로 하고, P30_F1_primer(서열 번호 108)를 포워드 프라이머로 하고, P30_R1_primer(서열 번호 109)를 리버스 프라이머로 이용하여 인서트의 PCR 산물(245 bp)을 조제했다. 이러한 직쇄 벡터 및 인서트를, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, 추출한 플라스미드의 전체 길이 서열의 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 phCTLA1이라고 명명했다.
(플라스미드 phCTLAz(z=4, 10, 11)의 제작)
상기에서 제작한 플라스미드 phCTLA1의 신호 펩티드 서열을 SP7에서 SP50, SP67 및 SP68로 치환했다.
표 15에 나타내는 주형 DNA 및 프라이머를 사용하여, PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 증폭을 수행하고, 벡터 및 인서트를 조제했다.
[표 15]
Figure pct00016
상기 표 15에 기재된 벡터와 각 인서트를, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, "항hCTLA-4scFv02-FLAG 카세트 영역"의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 phCTLA4(SP50의 경우), phCTLA10(SP67의 경우), phCTLA11(SP68의 경우)라고 명명했다.
(pP30SPx'Ly'-hCTLA-4scFv01-His의 제작)
제작 개요를 도 27에 나타냈다.
(항CTLA-4단일 사슬 항체의 발현 카세트의 제작)
WO2015/166640에서의［pHuSP7L20-scFv-CTLA-4-1의 제작］을 참조하여, pHuSP7L20-scFv-CTLA-4-1을 제작하고, 본 실시예에 있어서는 pHuSP7L20-hCTLA-4scFv01-His라고 명명했다.
표 16에 나타내는 주형 DNA 및 프라이머를 사용하여, 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물을 조제했다.
[표 16]
Figure pct00017
상기 표 16에 기재된 PCR 산물 A와 각 B를, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, "항hCTLA-4scFv01-His 카세트 영역"의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pP30SP50L5-hCTLA-4scFv01-His, pP30SP67L1-hCTLA-4scFv01-His 및 pP30SP68L1-hCTLA-4scFv01-His라고 명명했다.
［플라스미드 pP30SPx'Ly'-hCTLA-4scFv01-FLAG의 제작］
상기에서 제작한 플라스미드 pP30SPx'Ly'-hCTLA-4scFv01-His(SPx'Ly'=SP50L5, SP67L1, SP68L1)의 히스티딘 태그를 FLAG 태그로 변경했다. 개요를 도 28에 나타낸다. 이후, 항hCTLA-4scFv의 경우에 SPx'Ly'로 나타내는 경우가 있다.
표 17에 나타내는 주형 DNA 및 프라이머를 사용하여, 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물을 조제했다.
[표 17]
Figure pct00018
상기 표 17에 기재된 PCR 산물 A와 각 PCR 산물 B를, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, "항hCTLA-4 scFv01-FLAG 카세트 영역"의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pP30SP50L5-hCTLA-4scFv01-FLAG(이하, pC1F라고 한다), pP30SP67L1-hCTLA-4scFv01-FLAG(이하, pC2F라고 한다) 및 pP30SP68L1-hCTLA-4scFv01-FLAG(이하, pC3F라고 한다)라고 명명했다.
(제 3 공정)
표 18에 나타내는 주형 DNA 및 프라이머를 사용하여, 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물을 조제했다.
[표 18]
Figure pct00019
[표 19]
Figure pct00020
상기 표 18에 기재된 PCR 산물을 상기 표 19에 나타내는 조합으로 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, 추출한 플라스미드의 전체 길이 DNA 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pPC2, pPC3, pPC4, pPC5, pPC6, pPC7 및 pPC8이라고 명명했다. 각각의 개요를 나타낸다.
(pPC2의 scFv발현 카세트 서열(2618 bp)(서열 번호 131))
1.. 1384　항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 544　　　SP50L5
545.. 1249　　항인간 PD-1scFv03
1250.. 1267　His 태그
1268.. 1270　정지 코돈
1271.. 1384　Hu터미네이터
1385.. 2618　항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트
1385.. 1619　P30 프로모터
1620.. 1721　SP67L1
1722.. 2462　항인간 CTLA-4scFv01
2463.. 2486　FLAG 태그
2487.. 2489　정지 코돈
2490.. 2618　T2 터미네이터
(pPC3의 scFv발현 카세트 서열(2648 bp)(서열 번호 132))
1.. 1384　항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 544　　　SP50L5
545.. 1249　　항인간 PD-1scFv03
1250.. 1267　His 태그
1268.. 1270　정지 코돈
1271.. 1384　Hu터미네이터
1385.. 2648　항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트
1385.. 1619　P30 프로모터
1620.. 1751　SP68L1
1752.. 2492　항인간 CTLA-4scFv01
2493.. 2516　FLAG 태그
2517.. 2519　정지 코돈
2520.. 2648　T2 터미네이터
(pPC4의 scFv발현 카세트 서열(2645 bp)(서열 번호 133))
1.. 1330　항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 490　　　SP67L10
491.. 1195　항인간 PD-1scFv03
1196.. 1213　His 태그
1214.. 1216　정지 코돈
1217.. 1330　Hu터미네이터
1331.. 2645　항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트
1331.. 1565　P30 프로모터
1566.. 1748　SP50L5
1749.. 2489　항인간 CTLA-4scFv01
2490.. 2513　FLAG 태그
2514.. 2516　정지 코돈
2517.. 2645　T2 터미네이터
(pPC5의 scFv발현 카세트 서열(2594 bp)(서열 번호 134))
1.. 1330　항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 490　　　SP67L10
491.. 1195　　항인간 PD-1scFv03
1196.. 1213　His 태그
1214.. 1216　정지 코돈
1217.. 1330　Hu터미네이터
1331.. 2594　항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트
1331.. 1565　P30 프로모터
1566.. 1697　SP68L1
1698.. 2438　항인간 CTLA-4scFv01
2439.. 2462　FLAG 태그
2463.. 2465　정지 코돈
2466.. 2594　T2 터미네이터
(pPC6의 scFv발현 카세트 서열(2609 bp)(서열 번호 135))
1.. 1294　항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 454　　　SP69L1
455.. 1159　　항인간 PD-1scFv03
1160.. 1177　His 태그
1178.. 1180　정지 코돈
1181.. 1294　Hu터미네이터
1295.. 2609　항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트
1295.. 1529　P30 프로모터
1530.. 1712　SP50L5
1713.. 2453　항인간 CTLA-4scFv01
2454.. 2477　FLAG 태그
2478.. 2480　정지 코돈
2481.. 2609　T2 터미네이터
(pPC7의 scFv발현 카세트 서열(2528 bp)(서열 번호 136))
1.. 1294　항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 454　　　SP69L1
455.. 1159　　항인간 PD-1scFv03
1160.. 1177　His 태그
1178.. 1180　정지 코돈
1181.. 1294　Hu터미네이터
1295.. 2528　항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트
1295.. 1529　P30 프로모터
1530.. 1631　SP67L1
1632.. 2372　항인간 CTLA-4scFv01
2373.. 2396　FLAG 태그
2397.. 2399　정지 코돈
2400.. 2528　T2 터미네이터
(pPC8의 scFv발현 카세트 서열(2558 bp)(서열 번호 137))
1.. 1294　항인간 PD-1scFv03-His 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 454　　　SP69L1
455.. 1159　　항인간 PD-1scFv03
1160.. 1177　His 태그
1178.. 1180　정지 코돈
1181.. 1294　Hu터미네이터
1295.. 2558　항인간 CTLA-4scFv01-FLAG 발현 카세트
1295.. 1529　P30 프로모터
1530.. 1661　SP68L1
1662.. 2402　항인간 CTLA-4scFv01
2403.. 2426　FLAG 태그
2427.. 2429　정지 코돈
2430.. 2558　T2 터미네이터
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 10)
상기 형질 전환된 대장균에서 추출한 플라스미드 pPC2, pPC3, pPC4, pPC5, pPC6, pPC7 및 pPC8을 5 μL씩 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC2(이하, PC2주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC3(이하, PC3주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC4(이하, PC4주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC5 (이하, PC5주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC6(이하, PC6주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC7(이하, PC7주라고 한다) 및 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC8(이하, PC8주라고 한다)로 했다.
［실시예 19］
［PC2TL주-PC8TL주의 제작］
임상 개발을 염두에 두고, 상기 실시예 18에서 제작한 플라스미드에서 scFv의 마커 태그(히스티딘 태그/FLAG 태그) 및 대장균 중에서의 플라스미드 복제 기점 pUCori를 제거한, 항인간 PD-1scFv03및 항인간 CTLA-4scFv01을 공발현하는 플라스미드 pPC2TL~pPC8TL을 제작했다. 이러한 플라스미드에서 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A의 형질 전환을 수행하고, 공발현주 PC2TL주~PC8TL주를 수득했다.
공발현주 PC2TL주~PC8TL주의 기본적인 플라스미드 구성을 도 29에 나타낸다. 7 종류의 태그없는 공발현 플라스미드 pPC2TL~pPC8TL에서의, 항인간 PD-1scFv03 발현 카세트 및 항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트의 구성을 아래의 표 20 및 표 21에 나타냈다.
[표 20]
Figure pct00021
[표 21]
Figure pct00022
(항hPD-1scFv03 분비 발현 카세트의 구성)
항hPD-1scFv03 분비 발현 카세트로서, (1) Hu프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체를 코딩하는 DNA, (3) 항hPD-1scFv03 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, 및 (4) Hu터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (4)를 하류(3' 말단) 측으로 하여 (1)~(4)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트를 제작했다. 상기 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체로서는 SP50L5, SP67L10 또는 SP69L1을 사용했다.
(항hCTLA-4scFv01 분비 발현 카세트의 구성)
항hCTLA-4scFv01 분비 발현 카세트로서, (1) P30 프로모터 DNA, (2) 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체를 코딩하는 DNA, (3) 항hCTLA-4scFv01의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, 및 (4) T2 터미네이터 DNA를, (1)을 상류(5' 말단) 측으로 하고, (4)를 하류(3' 말단) 측으로 하여 (1)~(4)의 DNA를 순차적으로 포함하는 카세트를 제작했다. 상기 신호 펩티드-링커 펩티드 연결체로서는 SP50L5, SP67L1개 또는 SP68L1을 사용했다.
(pPC2TL~pPC8TL의 제작 방법)
플라스미드의 제작 방법의 개요를 도 30에 나타냈다. 이하의 4 공정으로 이루어진다.
(1) 제 1 공정에서는 공발현 플라스미드 pPC2TL-pPC8TL의 제작에 사용한 주형 플라스미드 pHuSPxLy-hPD-1scFv03 TL을 제작했다.
(2) 제 2 공정에서는 항hPD-1scFv03(태그 없음) 발현 플라스미드의 항PD-1scFv03 발현 카세트의 하류에 T2 터미네이터 단편을 삽입한 플라스미드 pHuSPxLy-hPD-1scFv03TL-T2(SPxLy=SP50L5, SP67L10, SP69L1)을 제작했다.
(3) 제 3 공정에서는 제 2 공정에서 제작한 플라스미드의 Hu터미네이터와 T2 터미네이터의 사이에, 항hCTLA-4scFv01(태그 없음) 발현 카세트(단, 터미네이터를 제외)를 삽입한 플라스미드 pPC2TLS~pPC8TLS를 제작했다.
(4) 제 4 공정에서는 제 3 공정에서 제작한 플라스미드에서 대장균 중에서의 플라스미드 복제 기점인 pUCori 단편을 제한 효소로 절단, 제거 후, 자기 폐환된 공발현 플라스미드(태그 없음, 비셔틀) pPC2TL~pPC8TL의 제작을 수행했다.
(제 1 공정)
상기 pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His를 주형 DNA로 하고, pCDshuttle_F1_프라이머(서열 번호 126)를 포워드 프라이머로 하고, GA6_프라이머를 리버스 프라이머로 이용하여 모두 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물 A-1(3261 bp)을 조제했다. pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His, pHuSP67L10-hPD-1scFv03-His 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03-His를 각각 주형 DNA로 하고, GA5_primer_reｖ프라이머를 포워드 프라이머로 하고, hPD1scFv03-1_프라이머(서열 번호 127)를 리버스 프라이머로 이용하여 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물 B-SP50L5 (1502 bp), B-SP67L10(1448 bp), B-SP69L1(1412 bp)를 각각 조제했다
상기 PCR 산물 A-1과 B-SP50L5, B-SP67L10, B-SP69L1 각각을, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, "항hPD-1scFv03 발현 카세트 영역"(Hu프로모터로부터 Hu터미네이터를 포함한다)의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP50L5-hPD-1scFv03 TL, pHuSP67L10-hPD-1scFv03 TL 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03 TL이라고 명명했다.
(제 2 공정)
표 22에 나타내는 주형 DNA 및 프라이머를 사용하여, 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물을 조제했다.
[표 22]
Figure pct00023
[표 23]
Figure pct00024
상기 표 22에 기재된 PCR 산물을 상기 표 23에 나타내는 조합으로 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, "항hPD-1scFv03(태그 없음) 발현 카세트 및 T2 터미네이터 영역"(5'-Hu프로모터-SPxLy-인간 PD-1scFv03-Hu터미네이터-T2 터미네이터-3')의 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP50L5-hPD-1scFv03TL-T2, pHuSP67L10-hPD-1scFv03TL-T2 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03TL-T2라고 명명했다.
(제 3 공정)
표 24에 나타내는 주형 DNA 및 프라이머를 사용하여, 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물을 조제했다.
[표 24]
Figure pct00025
[표 25]
Figure pct00026
상기 표 24에 기재된 PCR 산물을 상기 표 25에 나타내는 조합으로 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, 추출한 플라스미드의 전체 길이 DNA 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드를 pPC2TLS, pPC3TLS, pPC4TLS, pPC5TLS, pPC6TLS, pPC7TLS 및 pPC8TLS라고 명명했다.
(제 4 공정)
상기 플라스미드 제작의 제 3 공정에서 제작한 플라스미드 pPC2TLS~pPC8TLS 각 2 μg에, 제한 효소 BamHI 및 BglII(써모사이언티픽사 제품)를 각 10 유닛씩 첨가하여, 37℃에서 3시간의 보온에 의해 절단했다. BamHI 및 BglII 인식 부위는 도 30에 나타낸 바와 같이, 대장균 중에서의 플라스미드 복제 기점인 pUCori의 인접 부분에 1부분씩 있다. 제한 효소 처리 후의 DNA 용액의 일부를 이용하여, 플라스미드 DNA가 예정된 크기(약 5. 3 kbp 및 약 0. 7 kbp)로 절단되어 있는 것을, 0. 8% 아가로스 겔을 이용하여 전기 영동으로 확인했다.
(아가로스 겔 전기 영동에 의한 분리 및 정제)
상기 제한 효소 처리 후의 DNA를, 아가로스 겔을 이용한 전기 영동으로 분리하고, 약 5. 3 kbp의 DNA 밴드를 잘라내어, QIAGel을 이용하여 DNA 추출을 수행했다. 이 DNA 농도를 아가로스 겔 전기 영동으로 추측했다.
(DNA의 자기 폐환)
상기의 약 5. 3 kbp의 정제 DNA를 Rapid DNA Ligation 키트(써모사이언티픽사 제품)를 이용하여 자가결찰 반응을 수행했다. 반응 종료 후의 용액을, QIAquick PCR Purification Kit(퀴아젠 가부시키가이샤 제품)에 의해 정제하고, pPC2TL, pPC3TL, pPC4TL, pPC5TL, pPC6TL, pPC7TL 및 pPC8TL을 제작했다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 11)
상기 플라스미드 제작의 제 4 공정에서 조제한 플라스미드 pPC2TL, pPC3TL, pPC4TL, pPC5TL, pPC6TL, pPC7TL 및 pPC8TL을 5 μL 이용한 것 외에는 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC2TL(이하, PC2TL주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC3TL(이하, PC3TL주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC4TL(이하, PC4TL주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC5TL(이하, PC5TL주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC6TL(이하, PC6TL주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC7TL(이하, PC7TL주라고 한다) 및 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pPC8TL(이하, PC8TL주라고 한다)로 했다.
(플라스미드 DNA의 서열 확인)
상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 11)에서 수득한 비피도박테리움 속 세균 형질 전환체의 균체에, 리소자임(와코준야쿠코교사 제품)과 ProteinaseK(퀴아젠 가부시키가이샤 제품)를 각각 40 mg/mL 및 0. 4mg/mL가 되도록 1 mM의 Tris-HCl-0. 1 mM EDTA 버퍼(pH8. 0)로 조제한, 리소자임-ProteinaseK 혼합액 1. 5 mL를 더해 현탁하여, 37℃에서 약 1. 5시간 보온했다. 원심 분리로 상청을 제거한 균체를 이용하여, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠 가부시키가이샤 제품)에서 플라스미드 DNA를 추출했다. 상기 (실시예 1：대장균의 형질 전환 및 플라스미드 pAG8의 DNA 서열 확인)와 동일하게, 추출한 플라스미드의 전체 길이 DNA 서열 결정을 수행했다. 추출한 플라스미드를 플라스미드 pPC2TL, pPC3TL, pPC4TL, pPC5TL, pPC6TL, pPC7TL 및 pPC8TL이라고 명명했다. 개요를 아래에 나타낸다. 플라스미드 pPC2TL, pPC3TL, pPC4TL, pPC5TL, pPC6TL, pPC7TL 및 pPC8TL의 발현 카세트 서열은 항hPD-1scFv03의 발현 카세트 서열 및 항hCTLA-4scFv01의 발현 카세트 서열이 모두 태그 서열을 포함하지 않는 것 이외에는 각각 pPC2, pPC3, pPC4, pPC5, pPC6, pPC7 및 pPC8 서열과 동일하다.
(pPC2TL의 scFv발현 카세트 서열(2576 bp)(서열 번호 138))
1.. 1366　항인간 PD-1scFv03 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 544　　　SP50L5
545.. 1249　　항인간 PD-1scFv03
1250.. 1252　정지 코돈
1253.. 1366　Hu터미네이터
1367.. 2576　항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트
1367.. 1601　P30 프로모터
1602.. 1703　SP67L1
1704.. 2444　항인간 CTLA-4scFv01
2445.. 2447　정지 코돈
2448.. 2576　T2 터미네이터
(pPC3TL의 scFv발현 카세트 서열(2606 bp)(서열 번호 139))
1.. 1366　항인간 PD-1scFv03 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 544　　　SP50L5
545.. 1249　　항인간 PD-1scFv03
1250.. 1252　정지 코돈
1253.. 1366　Hu터미네이터
1367.. 2606　항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트
1367.. 1601　P30 프로모터
1602.. 1733　SP68L1
1734.. 2474　항인간 CTLA-4scFv01
2475.. 2477　정지 코돈
2478.. 2606　T2 터미네이터
(pPC4TL의 scFv발현 카세트 서열(2603 bp)(서열 번호 140))
1.. 1312　항인간 PD-1scFv03 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 490　　　SP67L10
491.. 1195　항인간 PD-1scFv03
1196.. 1198　정지 코돈
1199.. 1312　Hu터미네이터
1313.. 2603　항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트
1313.. 1547　P30 프로모터
1548.. 1730　SP50L5
1731.. 2471　항인간 CTLA-4scFv01
2472.. 2474　정지 코돈
2475.. 2603　T2 터미네이터
(pPC5TL의 scFv발현 카세트 서열(2552 bp)(서열 번호 141))
1.. 1312　항인간 PD-1scFv03 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 490　　　SP67L10
491.. 1195　　항인간 PD-1scFv03
1196.. 1198　정지 코돈
1199.. 1312　Hu터미네이터
1313.. 2552　항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트
1313.. 1547　P30 프로모터
1548.. 1679　SP68L1
1680.. 2420　항인간 CTLA-4scFv01
2421.. 2423　정지 코돈
2424.. 2552　T2 터미네이터
(pPC6TL의 scFv발현 카세트 서열(2567 bp)(서열 번호 142))
1.. 1276　항인간 PD-1scFv03 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 454　　　SP69L1
455.. 1159　　항인간 PD-1scFv03
1160.. 1162　정지 코돈
1163.. 1276　Hu터미네이터
1277.. 2567　항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트
1277.. 1511　P30 프로모터
1512.. 1694　SP50L5
1695.. 2435　항인간 CTLA-4scFv01
2436.. 2438　정지 코돈
2439.. 2567　T2 터미네이터
(pPC7TL의 scFv발현 카세트 서열(2486 bp)(서열 번호 143))
1.. 1276　항인간 PD-1scFv03 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 454　　　SP69L1
455.. 1159　　항인간 PD-1scFv03
1160.. 1162　정지 코돈
1163.. 1276　Hu터미네이터
1277.. 2486　항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트
1277.. 1511　P30 프로모터
1512.. 1613　SP67L1
1614.. 2354　항인간 CTLA-4scFv01
2355.. 2357　정지 코돈
2358.. 2486　T2 터미네이터
(pPC8TL의 scFv발현 카세트 서열(2516 bp)(서열 번호 144))
1.. 1276　항인간 PD-1scFv03 발현 카세트
1.. 361　　　　　Hu프로모터
362.. 454　　　SP69L1
455.. 1159　　항인간 PD-1scFv03
1160.. 1162　정지 코돈
1163.. 1276　Hu터미네이터
1277.. 2516　항인간 CTLA-4scFv01 발현 카세트
1277.. 1511　P30 프로모터
1512.. 1643　SP68L1
1644.. 2384　항인간 CTLA-4scFv01
2385.. 2387　정지 코돈
2388.. 2516　T2 터미네이터
［실시예 20］
［공발현 비피도박테리움 속 세균주에서의 scFv분비 확인］
공발현주 PC2주~PC8주의 배양 상청 중의 항hPD-1scFv03-His 및 항hCTLA-4scFv01-FLAG의 분비의 유무를 웨스턴 블로팅법으로 아래와 같이 확인했다. 음성 대조군주로서 상기 BEshuttle주에 대해서도 동일하게 수행했다.
(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)
상기 PC2주~PC8주, 및 실시예 8에서 제작한 PC1주, 및 BEshuttle주에 대해, 실시예 4(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)와 동일한 순서로 배양하여, 배양 상청을 회수했다. 배양 상청의 TCA에 의한 농축을, 상기 실시예 9(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)와 동일한 순서로 수행하여, 각 배양 상청 농축물을 얻었다.
(웨스턴 해석)
상기 각 배양 상청 농축물(각 배양액 0. 01 mL 상당)을 이용하여, 실시예 9의 (웨스턴 해석)과 동일한 방법으로, 웨스턴 해석을 수행했다. 단, 겔에서 막으로의 전사는 Trans-Blot Turbo(바이오ㆍ래드사 제품)를 사용하고, 블로킹 용액은 상기 2%ECL Advance Blocking Agent를 이용했다. 항hPD-1scFv03-His에 대한 결과를 도 31(A)에, 항hCTLA-4scFv01-FLAG에 대한 결과를 도 31(B)에 나타낸다.
(결과)
도 31 A 및 B에서 명백한 바와 같이, PC2주(A, B 모두 lane 1), PC3주(A, B 모두 lane 2), PC4주(A, B 모두 lane 3), PC5주(A, B 모두 lane 4), PC6주(A, B 모두 lane 5), PC7주(A, B 모두 lane 6) 및 PC8주(A, B 모두 lane 7) 및 PC1주(A, B 모두 lane 9)의 배양 상청 중에는 항hPD-1scFv03-His와 항hCTLA-4scFv01-FLAG의 양쪽 모두의 분비가 확인되었다(다만, PC1주는 항hCTLA-4scFv02-FLAG). 또한, PC2주~PC8주에서 분비된 항hPD-1scFv03-His 및 항hCTLA-4scFv01-FLAG의 양은 PC1주에서 분비된 단일 사슬 항체량보다 많았다.
이상의 결과로부터, 공발현 비피도박테리움 속 세균주 PC2주~PC8주는 배양 상청 중에 항hPD-1scFv와 항hCTLA-4scFv의 양쪽을 분비할 수 있는 재조합 비피도박테리움 속 세균주이며, 상기 PC1주보다 많은 단일 사슬 항체를 분비하는 것이 확인되었다.
［실시예 21］
［공발현주 PC2TL주~PC8TL주에서의 scFv의 분비 확인］
상기 공발현주 PC2TL주~PC8TL주가 분비하는 항체에 대해, 인간 PD-1(hPD-1)과의 결합 활성의 유무, 및 인간 CTLA-4와의 결합 활성의 유무에 대해, ELISA법으로 확인했다.
(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)
상기 실시예 19에서 제작한 공발현 비피도박테리움 속 세균 PC2TL주~PC8TL주 및 BEshuttle주에 대해, 실시예 4(재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양)와 동일한 순서로 배양하여, 배양 상청을 회수했다. PC2TL주~PC8TL주의 배양 상청을, BEshuttle주의 배양 상청에서 적절히 희석하여, ELISA용 시료로 했다.
(항hPD-1scFv03의 분비 평가)
96 구멍 플레이트(맥시 소프(MaxiSorp), C형, Nunc사 제품)에, 1 μg/mL의 hPD-1액(항원으로서 사용. Recombinant Human PD-1 Fc Chimera, R＆D Systems사를 1×PBS로 조제)를 각각 100 μL씩 분주하고, 플레이트 상부에 씰을 붙여 4℃에서 하룻밤 정치하여 항원을 고상화했다. 플레이트에서 용액을 제거 후, 1×PBS를 400 μL씩 분주하여, 용액을 제거했다. 이것을 3회 반복 세정 (이하 「PBS 세정」)했다.
상기 세정 후의 플레이트에, 1% BSA 용액을 350 μL씩 분주하고, 실온에서 2시간 정치함으로써 블로킹을 수행하고, PBS 세정했다.
상기 플레이트에, ELISA용 시료를 분주하고, 블랭크의 웰에는 BEshuttle주의 배양 상청 100 μL를 분주했다. 또한, 양성 대조군으로서 BEshuttle주의 배양 상청에 항hPD-1scFv03 정제물을 100 ng/mL의 농도가 되도록 조정한 용액 100 μL를 분주했다. 플레이트 상부에 씰을 붙여 상온에서 2시간 정치하고, 고상화 항원에 대한 scFv결합 반응을 수행하고, PBS 세정했다.
상기 고상화 항원에 대한 scFv결합 반응을 수행한 플레이트에, 0. 2 μg/mL비오틴화 ProteinL 용액(Biotinylated ProteinL：Thermo Scientific사 제품을, Signal Enhancer HIKARI：나카라이테스크(nacalai tesque)사 제품의 B액으로 희석하여 0. 2 μg/mL로 조제) 100 μL를 첨가했다. 플레이트 상부에 씰을 붙여 상온에서 1시간 정치하여(scFv의 경쇄 κ쇄에 대한 비오틴화 ProteinL의 결합 반응), PBS 세정했다.
상기 비오틴화 ProteinL의 결합 반응 후의 플레이트에, 아비딘-비오틴 표지 효소 복합체 조정 용액(아비딘-비오틴 표지 효소 복합체 VECTASTAIN ABC Kit：벡터래버러토리즈사 제품의 A액 및 B액 30 μL씩을 Signal Enhancer HIKARI의 B액 7. 5 mL에 첨가ㆍ혼합해 조제한) 100 μL를 첨가하여, 플레이트 상부에 씰을 붙여 상온에서 30분간 정치하고, PBS 세정했다.
상기, 효소를 결합시킨 플레이트에, 검출 시약(Color Reagent A 및 Color ReagentB：모두 R＆D Systems사 제품을 등량 혼합) 200 μL를 첨가하여, 차광하 상온에서 정치했다. 정확하게 20분 경과후, 상기 정지액 50 μL를 첨가해 정색 반응을 정지했다. 플레이트 리더로 450 nm, 및 570 nm(참조 파장)에서의 흡광도를 측정했다.
(항hCTLA-4scFv01의 분비 평가)
1) 플레이트에 고상화하는 항원으로서 1 μg/mL의 hCTLA-4 용액((Recombinant Human CTLA-4-Fc Chimera, 바이오레전드사 제품)를 1×PBS로 조제)을 사용하여, 2) 양성 대조군으로서 BEshuttle주의 배양 상청에 항hCTLA-4scFv01 정제물을 이용하여 3) 비오틴화 ProteinL 용액 농도를 0. 05 μg/mL로 한 점을 제외하고, 상기 (항hPD-1scFv03의 분비 평가)와 동일한 방법으로 수행했다. 결과를 표 26에 나타낸다.
[표 26]
Figure pct00027
(결과)
표 26에서 명백한 바와 같이, ELISA공발현주 PC2TL주~PC8TL주의 배양 상청은 고상화된 인간 PD-1및 인간 CTLA-4의 양쪽 모두에 결합하는 활성을 갖고 있었다. 그리고 이러한 scFv의 결합 활성은 대응하는 항원에 특이적인 것이 확인되었다(데이터 기재 없음).
[실시예 22]
상기 공발현 비피도박테리움 속 세균 PC2주~PC8주에 대응하는 항hPD-1scFv03-His 단독 발현주 및 항hCTLA-4scFv01-FLAG 단독 발현주를 표 27에 나타낸다.
[표 27]
Figure pct00028
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 12)
상기 실시예 18에서 제작한 플라스미드 pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His, pHuSP67L10-hPD-1scFv03-His 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03-His를 이용하여, 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP50L5-hPD-1scFv03-His(이하, P1H주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP67L10-hPD-1scFv03-His(이하, P2H주라고 한다) 및 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP69L1-hPD-1scFv03-His(이하 P3H주라고 한다)로 했다.
동일하게 실시예 18에서 제작한 플라스미드 pC1F, pC2F 및 pC3F를 이용하여 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 수행하고, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pC1F(이하, C1F주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pC2F(이하, C2F주라고 한다) 및 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pC3F(이하, C3F주라고 한다)를 얻었다.
［실시예 23］
상기 공발현 비피도박테리움 속 세균 PC2TL-PC8TL주에 대응하는 항hPD-1scFv03 단독 발현주 및 항hCTLA-4scFv01 단독 발현주를 표 28에 나타냈다.
[표 28]
Figure pct00029
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 13)
상기 실시예 19에서 제작한 플라스미드 pHuSP50L5-hPD-1scFv03 TL, pHuSP67L10-hPD-1scFv03 TL 및 pHuSP69L1-hPD-1scFv03 TL을 이용하여, 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP50L5-hPD-1scFv03 TL(이하, P1TL주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP67L10-hPD-1scFv03 TL(이하, P2TL주라고 한다) 및 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pHuSP69L1-hPD-1scFv03 TL(이하 P3TL주라고 한다)로 했다.
(항hCTLA-4scFv01 단독 발현주의 제작)
항hCTLA-4scFv01 발현 플라스미드 pC1TLB, pC2TLB 및 pC3TLB의 제작 방법의 개요를 도 32에 나타냈다. 플라스미드 pC1F, pC2F 및 pC3F에서, FLAG 태그 제거 및 T2 터미네이터로의 치환을 실시하는 T2 치환 공정과 플라스미드 pC1TL, pC2TL, pC3TL로부터 pUCori를 제거하는 pUCori 제거 공정의, 2개의 공정으로 이루어진다.
(T2 치환 공정)
표 29에 나타내는 주형 DNA 및 프라이머를 사용하여, 상기 PCR 증폭 1과 동일하게 PCR 산물을 조제했다.
[표 29]
Figure pct00030
PCR 산물의 조합은 A1 및 B(pC1TL 제작용), A2 및 B(pC2TL 제작용), A3 및 B(pC3TL 제작용)의 3 종류로 하고, 상기와 같이 HD 키트를 이용하여 연결하고, 추출한 플라스미드의 전체 길이 DNA 서열 결정을 동일한 순서로 수행했다. 추출한 플라스미드를 pC1TL, pC2TL, pC3TL이라고 명명했다.
(pUCori 제거 공정)
상기 pC1TL, pC2TL, pC3TL로부터의 pUCori 제거는 상기 실시예 19의 공발현 플라스미드 pPC2TL~pPC8TL 제작의 제 3 공정과 동일한 방법으로 수행하고, pC1TLB, pC2TLB 및 pC3TLB를 얻었다.
(비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 14)
상기 플라스미드 pC1TLB, pC2TLB 및 pC3TLB를 이용하여, 상기 (비피도박테리움 속 세균의 형질 전환 1)와 동일한 순서로, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A주의 형질 전환을 일렉트로포레이션 시스템으로 실시했다. 얻어진 형질 전환체를, 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pC1TLB(이하, C1TLB주라고 한다), 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pC2TLB(이하, C2TLB주라고 한다) 및 비피도박테리움ㆍ롱검 105-A/pC3TLB(이하, C3TLB주라고 한다)로 했다.
［실시예 24］
(세포에 대한 결합)
공발현주 PC2주~PC8주에 대응하는 항hCTLA-4scFv01-FLAG 단독 발현주에서 정제한 항hCTLA-4scFv01-FLAG를 이용한 세포에 대한 결합을 검토했다.
항hCTLA-4scFv01-FLAG 단독 발현 비피도박테리움 속 세균 C1F주, C2F주 및 C3F주의 각 배양 상청에서, 항hCTLA-4scFv01-FLAG를 ProteinL 컬럼으로 정제했다. 세포내 도메인 결손 hCTLA-4를, 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 과잉 발현시킨 HEK293T 세포에, 1 μg/mL로 조제한 정제 scFv를 100 μL 가하여 30분간 빙상에서 정치했다. 세포를 세정 후, 비오틴화 ProteinL을 100 μL 가하여 30분간 정치하고, 세포에 결합한 scFv에 proteinL을 결합시켰다. 세포를 세정 후, 0. 5 μg/mL로 조제한 Brilliant Violet421Streptavidin을 100 μL 가하여 30분간 정치했다. 세포를 세정 후, 유세포 분석을 이용하여 해석했다. 결과를 도 33에 나타낸다.
(결과)
도 33에서 명백한 바와 같이, C1F주, C2F주 및 C3F주 유래의 scFv는 모두 세포내 도메인 결손 hCTLA-4 발현 HEK293T 세포에 결합했다. 이로부터, C1F주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC4주 및 PC6주, C2F주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC2주 및 PC7주, 및 C3F주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC3주, PC5주 및 PC8주에서 각각 분비되는 항hCTLA-4scFv01-FLAG나 hCTLA-4 발현 세포에 결합할 수 있다고 추측되었다. 도 33(a)에서 hCTLA-4를 발현하지 않는 Mock 세포에도 약간 결합이 확인되었지만, 도 37(d)의 결과로부터, 공발현 PC4주에서 정제한 항hCTLA-4scFv01-FLAG에서는 Mock 세포에 대한 결합은 확인되지 않으므로, C1F주, C2F주 및 C3F주 유래의 scFv의 Mock 세포에 대한 결합은 비특이적인 결합이라고 생각된다.
［실시예 25］
(항hCTLA-4scFv01 단독 발현주에서 정제한 항hCTLA-4scFv01을 이용한 세포에 대한 결합)
공발현주 PC2TL주~PC8TL주에 대응하는 항hCTLA-4scFv01 단독 발현주 C1TLB주, C2TLB주 및 C3TLB주의 각 배양 상청에서, 항hCTLA-4scFv01을 ProteinL 컬럼으로 정제했다. 세포내 도메인 결손 hCTLA-4를, 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 과잉 발현시킨 HEK293T 세포에, 1 μg/mL로 조제한 정제 scFv를 100 μL 가하여 30분간 빙상에서 정치했다. 세포를 세정 후, 비오틴화 ProteinL을 100 μL 가하여 30분간 정치하고, 세포에 결합한 scFv에 proteinL을 결합시켰다. 세포를 세정 후, 0. 5 μg/mL로 조제한 Brilliant Violet421Streptavidin을 100 μL 가하여 30분간 정치했다. 세포를 세정 후, 유세포 분석을 이용하여 해석했다. 결과를 도 34에 나타낸다.
(결과)
도 34에서 명백한 바와 같이, C1TLB주, C2TLB주 및 C3TLB주 유래의 scFv는 모두 hCTLA-4 발현 세포에 결합했다. 이로부터, C1TLB주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC4TL주 및 PC6TL주, C2TLB주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC2TL주 및 PC7TL주, 및 C3TLB주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC3TL주, PC5TL주 및 PC8TL주에서 각각 분비되는 항hCTLA-4scFv01이나 hCTLA-4 발현 세포에 결합할 수 있다고 추측된다.
［실시예 26］
(항hPD-1scFv03-His 단독 발현주에서 정제한 항PD-1scFv03-His를 이용한 세포에 대한 결합)
공발현주 PC2주~PC8주에 대응하는 항PD-1scFv03-His 단독 발현균P1H주, P2H주 및 P3H주의 각 배양 상청에서, 항PD-1scFv03-His를 PtoteinL로 정제했다. hPD-1을 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 과잉 발현시킨 HEK293T 세포에, 1 μg/mL로 조제한 정제 scFv를 100 μL 가하여 30분간 빙상에서 정치했다. 세포를 세정 후, 비오틴화 ProteinL을 100 μL 가하여 30분간 정치하고, 세포에 결합한 scFv에 proteinL을 결합시켰다. 세포를 세정 후, 0. 5 μg/mL로 조제한 Brilliant Violet421Streptavidin을 100 μL 가하여 30분간 정치했다. 세포를 세정 후, 유세포 분석을 이용하여 해석했다. 결과를 도 35에 나타낸다.
(결과)
도 35에서 명백한 바와 같이, P1H주, P2H주 및 P3H주 유래의 scFv는 모두 hPD-1 발현 세포에 결합했다. 이로부터, P1H주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC2주 및 PC3주, P2H주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC4주 및 PC5주, 및 P3H주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC6주, PC7주 및 PC8주에서 각각 분비되는 항PD-1scFv03-His도 hPD-1 발현 세포에 결합할 수 있다고 추측된다.
［실시예 27］
(항hPD-1scFv03 단독 발현주에서 정제한 항hPD-1scFv03을 이용한 세포에 대한 결합)
공발현주 PC2TL주~PC8TL주에 대응하는 PD-1scFv03 단독 발현 비피도박테리움 속 세균 P1TL주, P2TL주 및 P3TL주의 각 배양 상청에서, 항hPD-1scFv03을 ProteinL 컬럼으로 정제했다. hPD-1을, 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 과잉 발현시킨 HEK293T 세포에, 1 μg/mL로 조제한 정제 scFv를 100 μL 가하여 30분간 빙상에서 정치했다. 세포를 세정 후, 비오틴화 ProteinL을 100 μL 가하여 30분간 정치하여 세포에 결합한 scFv에 proteinL을 결합시켰다. 세포를 세정 후, 0. 5 μg/mL로 조제한 Brilliant Violet421Streptavidin을 100 μL 가하여 30분간 정치했다. 세포를 세정 후, 유세포 분석을 이용하여 해석했다. 결과를 도 36에 나타낸다.
(결과)
도 36에서 명백한 바와 같이, P1TL주, P2TL주 및 P3TL주 유래의 scFv는 모두 hPD-1 발현 세포에 결합했다. 이로부터, P1TL주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC2TL주 및 PC3TL주, P2TL주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC4TL주 및 PC5TL주, 및 P3TL주와 동일한 scFv를 분비하는 공발현주의 PC6TL주, PC7TL주 및 PC8TL주에서 각각 분비되는 항PD-1scFv03도 hPD-1 발현 세포에 결합할 수 있다고 추측된다.
［실시예 28］
(공발현주 PC4주에서 정제한 scFv를 이용한 세포에 대한 결합)
공발현주 PC4주의 배양 상청에서 His-tag용 정제 컬럼으로 항hPD-1scFv03-His를, 또 FLAG-tag용 정제 컬럼으로 항hCTLA-4scFv01-FLAG를 정제했다. 상기［실시예 26］과 동일한 방법으로, 항hPD-1scFv03의 hPD-1 발현 세포에 대한 결합을, 또한 ［실시예 24］와 동일한 방법으로, 항hCTLA-4scFv01의 hCTLA-4 발현 세포에 대한 결합을 검토했다. 양성 대조군으로서 PE표지 항hPD-1 항체(clone：EH12. 2 H7) 및 PE표지 항hCTLA-4 항체(clone：L3D10)를 이용했다. 결과를 도 37에 나타낸다.
도 37 (a)에서, 양성 대조군인 PE표지 항hPD-1 항체(clone：EH12. 2 H7)는 hPD-1 발현 세포에 대한 결합은 확인되었지만, Mock 세포나 hCTLA-4 발현 세포에 대한 결합은 확인되지 않았다. (b)에서 PE표지 항hCTLA-4 항체(clone：L3D10)는 hCTLA-4 발현 세포에 대한 결합이 확인되었지만, Mock 세포나 hPD-1 발현 세포에 대한 결합은 확인되지 않았다. 도 37(c)(d)에서 명백한 바와 같이, 공발현주 PC4주에서 정제한 항hPD-1scFv03-His 및 항hCTLA-4scFv01-FLAG는 각각 대응하는 항원 발현 세포에 대한 결합이 확인되었다.
［실시예 29］
(항hCTLA-4scFv01-FLAG 단독 발현주에서 정제한 항hCTLA-4scFv01-FLAG를 이용한 항원에 대한 친화성(비아코어))
공발현주 PC2주~PC8주에 대응하는 항hCTLA-4scFv01-FLAG 단독 발현 비피도박테리움 속 세균 C1F, C2F 및 C3F의 배양 상청에서 항hCTLA-4scFv01-FLAG를 ProteinL 컬럼으로 각각 정제했다. 정제한 각 항hCTLA-4scFv01-FLAG와 hCTLA-4(인간 IgG1Fc와의 융합 단백)의 결합 키네틱파라미터(kinetic parameter) 측정을, Biacore 시스템(GE헬스케어사 제품)을 이용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행했다. 카르복실메틸덱스트란(carboxyl methyl dextran)이 금막 표면상에 코팅된 기판에 마우스항인간 IgG(Fc) 단일 클론 항체(GE헬스케어사 제품)를 아민 커플링법으로 결합하고, 리간드로서 Fc융합 재조합 hCTLA-4(Biolegend)를 캡쳐했다. 애널라이트(analyte)로서 정제한 scFv를 0. 7404, 2. 2222, 6. 6667, 20 및 60 nM로 조제하고, 농도가 작은 것에서부터 연속적으로 결합시키는 싱글사이트 키네틱스(Single-site kinetics)법으로 해석을 수행했다. 얻어진 데이터의 해석은 BIA 평가용 소프트(GE헬스케어사 제품)를 이용했다. 결과를 표 30에 나타낸다.
[표 30]
Figure pct00031
(결과)
표 30에서 명백한 바와 같이, 단발현주(單發現株) C1F, C2F 및 C3F에서 분비된 scFv는 높은 KD값을 나타내고 있고, hCTLA-4에 대한 친화성을 갖고 있었다. 공발현주의 PC4주 및 PC6주에서 분비되는 항hCTLA-4scFv도 C1F주 유래의 scFv와 동일한 hCTLA-4에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다. 마찬가지로 공발현주의 PC2주 및 PC7주의 scFv는 C2F주의 scFv와 PC3주, PC5주 및 PC8주의 scFv는 C3F주의 scFv와 같은 hCTLA-4에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다.
［실시예 30］
(항hCTLA-4scFv01 단독 발현주에서 정제한 항hCTLA-4scFv01을 이용한 항원에 대한 친화성(비아코어))
공발현주 PC2TL주~PC8TL주에 대응하는 항hCTLA-4scFv01 단독 발현 비피도박테리움 속 세균 C1TLB주, C2TLB주 및 C3TLB주의 배양 상청에서 항hCTLA-4scFv01을 ProteinL 컬럼으로 각각 정제하고, hCTLA-4(인간 IgG1Fc와의 융합 단백)과의 결합 키네틱파라미터 측정을, Biacore 시스템을 이용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행했다. 이하, 실시예 29와 동일하게 해석을 수행했다. 결과를 표 30에 나타낸다.
(결과)
표 30에서 명백한 바와 같이, 단발 현주 C1TLB, C2TLB 및 C3TLB에서 분비된 scFv는 높은 KD값을 나타내고 있고, hCTLA-4에 대한 친화성을 갖고 있었다. 공발현주의 PC4TL 및 PC6TL주에서 분비되는 scFv도 C1TLB주 유래의 scFv와 같은 hCTLA-4에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다. 마찬가지로 공발현주의 PC2TL주 및 PC7TL주의 scFv는 C2TLB주의 scFv와 PC3TL주, PC5TL주 및 PC8TL주의 scFv는 C3TLB주의 scFv와 같은 hCTLA-4에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다.
［실시예 31］
(항hPD-1scFv03-His 단독 발현주에서 정제한 항hPD-1scFv03-His를 이용한 항원에 대한 친화성(비아코어))
공발현주 PC2주~PC8주에 대응하는 항hPD-1scFv03-His 단독 발현 비피도박테리움 속 세균 P1H주, P2H주 및 P3H주의 배양 상청에서 항hPD-1scFv03-His를 ProteinL 컬럼으로 각각 정제하고, hPD-1(인간 IgG1Fc와의 융합 단백)과의 결합 키네틱파라미터 측정을, Biacore 시스템을 이용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행했다. 리간드로서 Fc융합 재조합 hPD-1(R＆D)을 캡쳐한 것 외에는 실시예 29와 동일하게 해석을 수행했다. 결과를 표 31에 나타낸다.
[표 31]
Figure pct00032
(결과)
표 31에서 명백한 바와 같이, 단발 현주 P1H, P2H 및 P3H에서 분비된 scFv는 높은 KD값을 나타내고 있고, hPD-1에 대한 친화성을 갖고 있었다. 공발현주의 PC2주 및 PC3주에서 분비되는 scFv도 P1H주 유래 scFv와 동일한 hPD-1에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다. 마찬가지로 공발현주의 PC4주 및 PC5주의 scFv는 P2H주의 scFv와 PC6주, PC7주 및 PC8주의 scFv는 P3H주의 scFv와 동일한 hPD-1에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다.
［실시예 32］
(항hPD-1scFv03 단독 발현주에서 정제한 항hPD-1scFv03을 이용한 항원에 대한 친화성(비아코어))
공발현주 PC2TL주~PC8TL주에 대응하는 항hPD-1scFv03 단독 발현 비피도박테리움 속 세균 P1TL주, P2TL주 및 P3TL주의 배양 상청에서 항hPD-1scFv03을 ProteinL 컬럼으로 각각 정제하고, hPD-1(인간 IgG1Fc와의 융합 단백)과의 결합 키네틱파라미터 측정을, Biacore 시스템을 이용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행했다. 리간드로서 Fc융합 재조합 hPD-1(R＆D)을 캡쳐한 것 외에는 실시예 29와 동일하게 해석을 수행했다. 결과를 표 31에 나타낸다.
(결과)
표 31에서 명백한 바와 같이, 단발 현주 P1TL, P2TL 및 P3TL에서 분비된 scFv는 높은 KD값을 나타내고 있고, hPD-1에 대한 친화성을 갖고 있었다. 공발현주의 PC2TL주 및 PC3TL주에서 분비되는 scFv도 P1TL주 유래 scFv와 동일한 hPD-1에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다. 마찬가지로 공발현주의 PC4TL주 및 PC5TL주의 scFv는 P2TL주의 scFv와 PC6TL주, PC7TL주 및 PC8TL주의 scFv는 P3TL주의 scFv와 동일한 hPD-1에 대한 친화성을 갖는다고 추측된다.
［실시예 33］
(공발현주 PC4주의 scFv에 의한 항원ㆍ리간드의 결합 저해 활성)
공발현주 PC4주의 배양 상청에서 His-tag용 정제 컬럼으로 항hPD-1scFv03-His를, 또한 FLAG-tag용 정제 컬럼으로 항hCTLA-4scFv01-FLAG를 정제했다. 이들을 이용하여, 각 항원과의 결합에 대한 리간드와의 경합 활성(ELISA)의 평가를 수행했다.
(항hPD-1scFv03의 항원과의 결합에 대한 인간 PD-L1과의 경합 활성)
시료 첨가 조작을 제외하고, 실시예 21의 (항hPD-1scFv03의 분비 평가)와 동일한 방법으로 조작했다. 시료는 공발현주 PC4주의 배양 상청에서 His-tag 정제하여 얻은 2 nM(고정 농도)의 항hPD-1scFv03-His와 각종 농도(640 nM, 320 nM, 160 nM, 80 nM, 40 nM, 20 nM, 5 nM, 0. 5 nM, 0 nM)의 인간 PD-L1용액(Recombinant Human B7-H1/PD-L1FcChimera, R＆D systems, 이하 hPD-L1이라고 한다)의 혼합액을 이용했다. 또한, 대조군으로서 2 nM의 항hCTLA-4scFv01-FLAG(C1F주 유래), 640 nM의 hPD-L1을 시료로 한 웰도 마련했다. hPD-1/항hPD-1scFv03-His의 결합에 대한 hPD-L1의 결합 저해율을, 식 1에 의해 산출했다. PC4주에서 정제한 hPD-1scFv03과 hPD-1의 결합에 대한 hPD-L1에 의한 결합 저해 활성에 대해, 결과를 표 32에 나타낸다.
[수학식 1]
Figure pct00033
[표 32]
Figure pct00034
표 32로부터 알 수 있는 바와 같이, hPD-L1농도가 높아지는 동시에 흡광도는 감소하고, hPD-L1의 농도 의존적으로, 항hPD-1scFv03-His의 항원에 대한 결합은 감소했다. 한편, 2 nM의 항hCTLA-4scFv01-FLAG의 첨가로는 플레이트에 대한 결합은 확인되지 않고, 항hPD-1scFv03-His의 고상화 인간 PD-1에 대한 결합은 특이적 결합이라고 할 수 있다. 또한, hPD-L1만의 첨가로도 플레이트에 대한 결합이 확인되지 않는 것으로부터, 항hPD-1scFv03-His 및 hPD-L1의 혼합액의 첨가에 의해 플레이트에 결합한 것은 항hPD-1scFv03-His라고 할 수 있다. hPD-1과 항hPD-1scFv03-His의 결합에 대한 hPD-L1에 의한 결합 저해율을 도 38에 나타냈다. hPD-L1농도 의존적으로, hPD-1과 항hPD-1scFv03-His의 결합은 저해되고 있다.
(항hCTLA-4scFv01의 항원과의 결합에 대한 리간드와의 경합 활성)
시료 첨가 조작을 제외하고, 실시예 21의 (항hCTLA-4scFv01의 분비 평가)와 동일한 방법으로 조작했다. 시료는 공발현주 PC4주에서 FLAG-tag 정제하여 얻은 1 nM의 항hCTLA-4scFv01-FLAG와 각종 농도의 인간 CD80(Recombinant Human B7-1/CD80 Fc Chimera, R＆D Systems, 이하 hCD80이라고 한다)(30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 및 0 nM)의 혼합액, 및 1 nM의 항hCTLA-4 scFv01-FLAG와 각종 농도의 인간 CD86(Recombinant Human B7-1/CD86 Fc Chimera, R＆D Systems, 이하 hCD86라고 한다)(100 nM, 80 nM, 60 nM, 40 nM, 20 nM 및 0 nM)의 혼합액을 이용했다. 또한, 대조군으로서 1 nM의 항hPD-1scFv03-His(P2H주 유래), 30 nM의 hCD80만, 혹은 100 nM의 hCD86만을 시료로 한 웰도 마련했다. hCTLA-4/항hCTLA-4scFv01-FLAG의 결합에 대한 hCD80 혹은 hCD86의 결합 저해율을, 식 2에 의해 산출했다.
[수학식 2]
Figure pct00035
(결과)
경합 ELISA의 결과를, 표 33(리간드로서 hCD80을 사용) 및 표 34(리간드로서 hCD86를 사용)에 나타낸다.
[표 33]
Figure pct00036
[표 34]
Figure pct00037
표 33 및 표 34로부터 알 수 있는 바와 같이, hCD80 혹은 hCD86의 농도가 높아지는 동시에 흡광도는 감소하고, hCD80 혹은 hCD86의 농도 의존적으로, 항hCTLA-4scFv01-FLAG의 항원에 대한 결합은 감소했다. 한편, 1 nM의 항hPD-1scFv03-His의 첨가로는 플레이트에 대한 결합은 확인되지 않았다. 이로부터, hCTLA-4scFv01-FLAG의 고상화 인간 CTLA-4에 대한 결합은 특이적 결합이라고 할 수 있다. 또한, hCD80만 혹은 hCD86만의 첨가로도 플레이트에 대한 결합이 확인되지 않는 것으로부터, 항hCTLA-4scFv01-FLAG 및 hCD80의 혼합액, 혹은 항hCTLA-4scFv01-FLAG 및 hCD86의 혼합액의 첨가에 의해 플레이트에 결합한 것은 항hCTLA-4scFv01-FLAG라고 할 수 있다.
hCTLA-4와 항hCTLA-4scFv01-FLAG의 결합에 대한 hCD80 혹은 hCD86에 의한 결합 저해율을 도 39및 도 40에 나타냈다. hCD80 혹은 hCD86의 농도 의존적으로, hCTLA-4와 항hCTLA-4scFv01-FLAG의 결합은 저해되고 있다.
이상의 결과로부터, 공발현주 PC4주에서 분비된 항hPD-1scFv03-His 및 항hCTLA-4scFv01-FLAG는 각각 대응하는 항원에 대하여, 리간드와의 경합 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Anaeropharma Science Inc. <120> coexpression plasmid <130> 2015C9105 <150> JP2014-245424 <151> 2014-12-03 <160> 144 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 4975 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Linearized pHG-2 fragment <220> <221> misc_feature <223> Inventor:KOSEKI, Koichi; SHIOYA, Koichiro; KOBAYASHI, Satoshi; SH IMATANI, Yuko ;MASAKI, Takeshi; SHIMIZU, Hitomi; MATSUMURA, Tomio ; OKABE, Masami; INOUE, Kengo <400> 1 atcatcgccc tgtgaaaccg cttctcattt ccatttgcga tatggtctga atacgacgaa 60 accccggcgc gaggccgggg tttcgtaagc tgtgcgtgac tatagcacga ccagcgcgat 120 tcggtgcacg gatccgtctt cctgctggcc tatgcattgg gttccgcagt gcccactcca 180 ggcggtctgg gcggtgtgga agcggcgctg acattcgcgt tcgtggcggt cggagtgccg 240 cagggcgtgg cgctttccgc cactttgctg caccgcgtgg tgttctactg gctgcgcatt 300 ccgctgggcg cggcggccat gaagtggctt gacaagcata atcttgtctg attcgtctat 360 tttcataccc ccttcgggga aatagatgtg aaaaccctta taaaacgcgg gttttcgcag 420 aaacatgcgc tagtatcatt gatgacaaca tggactaagc aaaagtgctt 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cctcatacga gccggtcaac cccgaacgca ggactcccca gacgccctcc gatggcctga 1380 tctgacgtcc gaaaaaaggc gctgtgcgcc ctttttaaat cttttataaa tctttttaca 1440 ttcttttagc ccctccgcag ccttactctc ccaacgggtt tcagccgaaa cctacaccaa 1500 aaggggagcg aacctacacc aaaaggggag cgaacctaca ccaaaagggg agcgaaccta 1560 caccaaaagg ggagctatat acaccttttg ttatttaagg tgcaagttgt gctatgctga 1620 ggccatgtcc aatgagatcg tgaagttcag caaccagttc aacaacgtcg cgctgaagaa 1680 gttcgacgcc gtgcacctgg acgtgctcat ggcgatcgcc tcaagggtga gggagaaggg 1740 cacggccacg gtggagttct cgttcgagga gctgcgcggc ctcatgcgat tgaggaagaa 1800 cctgaccaac aagcagctgg ccgacaagat cgtgcagacg aacgcgcgcc tgctggcgct 1860 gaactacatg ttcgaggatt cgggcaagat catccagttc gcgctgttca cgaagttcgt 1920 caccgacccg caggaggcga ctctcgcggt tggggtcaac gaggagttcg cgttcctgct 1980 caacgacctg accagccagt tcacgcgctt cgagctggcc gagttcgccg acctcaagag 2040 caagtacgcc aaggagttct accgcagggc caagcagtac cgcagctccg gaatctggaa 2100 gatcggccgc gacgagttct gccgactgct tggcgttcca ccgtcggcaa taacccagac 2160 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acctcgtcta cgaggcgctg agcgaggaat ggcgcaaaag ggacggcgag 2400 atcagcgacc catgggccaa cgacgaggcg gacggatacc agccgccctc atacgagccg 2460 gtcaaccccg aacgcaggac tccccagacg ccctccgatg gcctgatctg acgtccgaaa 2520 aaaggcgctg tgcgcccttt ttaaatcttt tataaatctt tttacattct tttagcccct 2580 ccgcagcctt actctcccaa cgggtttcag ccgaaaccta caccaaaagg ggagcgaacc 2640 tacaccaaaa ggggagcgaa cctacaccaa aaggggagcg aacctacacc aaaaggggag 2700 ctatatacac cttttgttat ttaaggtgca agttgtgcta tgctgaggcc atgtccaatg 2760 agatcgtgaa gttcagcaac cagttcaaca acgtcgcgct gaagaagttc gacgccgtgc 2820 acctggacgt gctcatggcg atcgcctcaa gggtgaggga gaagggcacg gccacggtgg 2880 agttctcgtt cgaggagctg cgcggcctca tgcgattgag gaagaacctg accaacaagc 2940 agctggccga caagatcgtg cagacgaacg cgcgcctgct ggcgctgaac tacatgttcg 3000 aggattcggg caagatcatc cagttcgcgc tgttcacgaa gttcgtcacc gacccgcagg 3060 aggcgactct cgcggttggg gtcaacgagg agttcgcgtt cctgctcaac gacctgacca 3120 gccagttcac gcgcttcgag ctggccgagt tcgccgacct caagagcaag tacgccaagg 3180 agttctaccg cagggccaag cagtaccgca gctccggaat ctggaagatc ggccgcgacg 3240 agttctgccg actgcttggc gttccaccgt cggcaataac ccagacacga tatctgaatc 3300 agaaggttct tcagccaatt caggaggagt gtgggcctct ccttggcctg aagatcgagc 3360 gccagtacgt gaaacgcagg ctgtcgggct tcgtgttcac attcgcccgc gagacccctc 3420 cggtgatcga cgccaggccc gtggaggcga ggaagacgga cggcgacggc aagggccatt 3480 ggacgagcgt tgccgggtac ggcgaggtgt tcacgaccac ggcgttgttc gacgtgacgg 3540 ccgcccgggc tcacttcgac ggcaccgttg aagccgggga gtgccgtttc tgcgcgtttg 3600 acgcgcgcaa ccgcgaacat catgcgcgga acgccggaag gctgttctag cggccgtgtc 3660 cgcgcctctg gggcggttgc gcctgccatg ggtcgatctg ccgctgttcg gcctcacgct 3720 ggtctgtgcg ctgcctgatc tccctgagca ggtcggcctt ggtcctgggg gcgcttcgct 3780 cctcgaacgg gccgctctcc cccaggtcct cgggctcgct caggtccaac ggctcgtcac 3840 cggacggctc gggccggttc tctccctgtg ccgggttctc cgcctgtgcg cgttgttcgg 3900 ccatgcgcag tgcgagggcc ttcacctgtt cggggcttgt cgactcgatt ttcgttcgtg 3960 aatacatgtt ataataacta taactaataa cgtaacgtga ctggcaagag atatttttaa 4020 aacaatgaat aggtttacac ttactttagt tttatggaaa tgaaagatca tatcatatat 4080 aatctagaat aaaattaact aaaataatta ttatctagat aaaaaattta gaagccaatg 4140 aaatctataa ataaactaaa ttaagtttat ttaattaaca actatggata taaaataggt 4200 actaatcaaa atagtgagga ggatatattt gaatacatac gaacaaatta ataaagtgaa 4260 aaaaatactt cggaaacatt taaaaaataa ccttattggt acttacatgt ttggatcagg 4320 agttgagagt ggactaaaac caaatagtga tcttgacttt ttagtcgtcg tatctgaacc 4380 attgacagat caaagtaaag aaatacttat acaaaaaatt agacctattt caaaaaaaat 4440 aggagataaa agcaacttac gatatattga attaacaatt attattcagc aagaaatggt 4500 accgtggaat catcctccca aacaagaatt tatttatgga gaatggttac aagagcttta 4560 tgaacaagga tacattcctc agaaggaatt aaattcagat ttaaccataa tgctttacca 4620 agcaaaacga aaaaataaaa gaatatacgg aaattatgac ttagaggaat tactacctga 4680 tattccattt tctgatgtga gaagagccat tatggattcg tcagaggaat taatagataa 4740 ttatcaggat gatgaaacca actctatatt aactttatgc cgtatgattt taactatgga 4800 cacgggtaaa atcataccaa aagatattgc gggaaatgca gtggctgaat cttctccatt 4860 agaacatagg gagagaattt tgttagcagt tcgtagttat cttggagaga atattgaatg 4920 gactaatgaa aatgtaaatt taactataaa ctatttaaat aacagattaa aaaaattata 4980 aaaaaattga aaaaatggtg gaaacacttt tttcaatttt tttagatctt gagcaaaagg 5040 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 5100 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5160 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 5220 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 5280 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 5340 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 5400 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 5460 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 5520 tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 5580 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 5640 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctac 5697 <210> 18 <211> 33 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DNA <213> Artificial <220> <223> GA116_primer <400> 27 gactagtgtg caccgaatcg cgctg 25 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IFNG1_primer <400> 28 gaaggatgct ttatgcagga cccgtacgtc aagg 34 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IFNG2_primer <400> 29 catcatcacc accactgacc ttctgctcgt agcg 34 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IFNG3_primer <400> 30 gtggtggtga tgatggtgct gggaggcgcg acggcc 36 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hIFNG4_primer <400> 31 caggacccgt acgtcaagg 19 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SP69-ins_F1_primer <400> 32 caagaaggat gctttatgaa ttatttacga caaaaaattt cgg 43 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SP69-ins_R2_primer <400> 33 gacgtacggg tcctgaccgc tatcagtcgt ggtgtaac 38 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pCDshuttle_R1_primer <400> 34 cataaagcat ccttcttggg tcag 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hu-mCCL21-vecR1_primer <400> 35 aaagcatcct tcttgggtca gg 22 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ins-hPD-1scFv03-F1 <400> 36 caggtccagc tggtcgaatc gggcggcggc 30 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ins-hPD-1scFv03-R1 <400> 37 acgagcagaa ggtcagtggt ggtgatgatg gtgctt 36 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TGA-Hu-Terminator-F <400> 38 tgaccttctg ctcgtagcga ttac 24 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> vec-SP7L20-R1 <400> 39 gaccagctgg acctgcaccg aactcgcctt cgggaa 36 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ins-hCTLA-4scFv02-F1 <400> 40 caggtccagc tggtcgaatc gggcggcggc 30 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ins-hCTLA-4scFv02-R1 <400> 41 acgagcagaa ggtcagtgat gatgatgatg atgctt 36 <210> 42 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hCTLA-4scFv02-FLAG-F1 <400> 42 gactacaagg acgacgacga caagtgacct tctgctcgta gcgat 45 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 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ctagtccgga ataatacggt tggacaac 38 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hu_Vec_F1 <400> 52 ggatccgtct tcctgctgg 19 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> bHER2-His_Vec_R1 <400> 53 tcagtgatga tgatgatgat gcttg 25 <210> 54 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> d0013+T_ins_F1 <400> 54 catcatcatc actgaaaccg cttctcattt ccatttg 37 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> d0013+T_ins_R1 <400> 55 caggaagacg gatccgtgca ccgaatcgcg ct 32 <210> 56 <211> 99 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(99) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP7 <400> 56 atg gcg ttg atg atg agc gtt aag act att att tcc aca tca gtg gcg 48 Met Ala Leu Met Met Ser Val Lys Thr Ile Ile Ser Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 att atc gcc acg ggt gcc atg ttt gcg tgc gta gcc ccg ttt gcc tct 96 Ile Ile Ala Thr Gly Ala Met Phe Ala Cys Val Ala Pro Phe Ala Ser 20 25 30 gcc 99 Ala <210> 57 <211> 33 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 57 Met Ala Leu Met Met Ser Val Lys Thr Ile Ile Ser Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 Ile Ile Ala Thr Gly Ala Met Phe Ala Cys Val Ala Pro Phe Ala Ser 20 25 30 Ala <210> 58 <211> 102 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(102) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP45 <400> 58 atg aag cac ctc tcc cac cgc acc atc gcc atc atc gtc gcg ttg ctc 48 Met Lys His Leu Ser His Arg Thr Ile Ala Ile Ile Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 tcc acg ctg tca ctg gca ctt gcc gtc atc tcc ctt ccg cac cag gcg 96 Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Ala Val Ile Ser Leu Pro His Gln Ala 20 25 30 tac gca 102 Tyr Ala <210> 59 <211> 34 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 59 Met Lys His Leu Ser His Arg Thr Ile Ala Ile Ile Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Ala Val Ile Ser Leu Pro His Gln Ala 20 25 30 Tyr Ala <210> 60 <211> 168 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(168) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP50 <400> 60 atg atc gtg gcc tac ccg cac aca gtg cag tat gcg ggg aaa cgt acc 48 Met Ile Val Ala Tyr Pro His Thr Val Gln Tyr Ala Gly Lys Arg Thr 1 5 10 15 agg aaa gga cga atg atg ata acg aca tgg cgg caa cgg ggc atg gcc 96 Arg Lys Gly Arg Met Met Ile Thr Thr Trp Arg Gln Arg Gly Met Ala 20 25 30 atc gta gcg atg ctg acc ggt ctg ata ata atg gtg gga gtg gtg ttc 144 Ile Val Ala Met Leu Thr Gly Leu Ile Ile Met Val Gly Val Val Phe 35 40 45 ggc tcg gcg aat acg gcg tat gcc 168 Gly Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Ala 50 55 <210> 61 <211> 56 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 61 Met Ile Val Ala Tyr Pro His Thr Val Gln Tyr Ala Gly Lys Arg Thr 1 5 10 15 Arg Lys Gly Arg Met Met Ile Thr Thr Trp Arg Gln Arg Gly Met Ala 20 25 30 Ile Val Ala Met Leu Thr Gly Leu Ile Ile Met Val Gly Val Val Phe 35 40 45 Gly Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Ala 50 55 <210> 62 <211> 105 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(105) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP52 <400> 62 atg agt ttc cat gta tcc gcg caa tcg gtt cgc gcg gtg gcc ggt gga 48 Met Ser Phe His Val Ser Ala Gln Ser Val Arg Ala Val Ala Gly Gly 1 5 10 15 ctc gtc gcc gca gcg aca ttg ctg tca ggc ctt gcc ctt gcg ccg acc 96 Leu Val Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala Pro Thr 20 25 30 gca atg gcc 105 Ala Met Ala 35 <210> 63 <211> 35 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 63 Met Ser Phe His Val Ser Ala Gln Ser Val Arg Ala Val Ala Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala Pro Thr 20 25 30 Ala Met Ala 35 <210> 64 <211> 144 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(144) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP55 <400> 64 atg gtt cgt cgc gcc cag gct gct ctt cgg tcc gtt gaa cac acc agc 48 Met Val Arg Arg Ala Gln Ala Ala Leu Arg Ser Val Glu His Thr Ser 1 5 10 15 gtg agg cag ctg cga gtc ctg gct gcg att gta ttt ctg ttc gcc atg 96 Val Arg Gln Leu Arg Val Leu Ala Ala Ile Val Phe Leu Phe Ala Met 20 25 30 gtc atc gcc act gtg gct cct gca gtc acg gct ccg atg gcc ttc gcc 144 Val Ile Ala Thr Val Ala Pro Ala Val Thr Ala Pro Met Ala Phe Ala 35 40 45 <210> 65 <211> 48 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 65 Met Val Arg Arg Ala Gln Ala Ala Leu Arg Ser Val Glu His Thr Ser 1 5 10 15 Val Arg Gln Leu Arg Val Leu Ala Ala Ile Val Phe Leu Phe Ala Met 20 25 30 Val Ile Ala Thr Val Ala Pro Ala Val Thr Ala Pro Met Ala Phe Ala 35 40 45 <210> 66 <211> 96 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP58 <400> 66 atg gca atg gca cgg cgt tgg acc ccg cag cgg ttt gtt aca ctg cgt 48 Met Ala Met Ala Arg Arg Trp Thr Pro Gln Arg Phe Val Thr Leu Arg 1 5 10 15 cgc atc cgc gta atc gcc tgt atc gcg gcg acc agt atc gcg ctg gct 96 Arg Ile Arg Val Ile Ala Cys Ile Ala Ala Thr Ser Ile Ala Leu Ala 20 25 30 <210> 67 <211> 32 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 67 Met Ala Met Ala Arg Arg Trp Thr Pro Gln Arg Phe Val Thr Leu Arg 1 5 10 15 Arg Ile Arg Val Ile Ala Cys Ile Ala Ala Thr Ser Ile Ala Leu Ala 20 25 30 <210> 68 <211> 93 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(93) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP64 <400> 68 atg aag tca cta atc agg aat gta gcg gcg ggc gtc ctc gca gcc gcc 48 Met Lys Ser Leu Ile Arg Asn Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 acg atg ctc ggc atc gcc ggc ctc ggc gcc acc acc gcc tcc gcg 93 Thr Met Leu Gly Ile Ala Gly Leu Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala 20 25 30 <210> 69 <211> 31 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 69 Met Lys Ser Leu Ile Arg Asn Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Met Leu Gly Ile Ala Gly Leu Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala 20 25 30 <210> 70 <211> 78 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(78) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP66 <400> 70 gtg aag cat tgg aag aag atg gca gca tcg ttg att gca ata tca acg 48 Val Lys His Trp Lys Lys Met Ala Ala Ser Leu Ile Ala Ile Ser Thr 1 5 10 15 atg gtg gca gta gtt ccg acg acg tat gcc 78 Met Val Ala Val Val Pro Thr Thr Tyr Ala 20 25 <210> 71 <211> 26 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 71 Val Lys His Trp Lys Lys Met Ala Ala Ser Leu Ile Ala Ile Ser Thr 1 5 10 15 Met Val Ala Val Val Pro Thr Thr Tyr Ala 20 25 <210> 72 <211> 99 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(99) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP67 <400> 72 atg aag ata aac aat aag ggc aag ggc gct ctt atc gcg gca att acc 48 Met Lys Ile Asn Asn Lys Gly Lys Gly Ala Leu Ile Ala Ala Ile Thr 1 5 10 15 gcc gcg gca acg cta ttg tca tgc ggg ctg gcc gct gca agt gcc agt 96 Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Cys Gly Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser 20 25 30 gcg 99 Ala <210> 73 <211> 33 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 73 Met Lys Ile Asn Asn Lys Gly Lys Gly Ala Leu Ile Ala Ala Ile Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Cys Gly Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser 20 25 30 Ala <210> 74 <211> 129 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(129) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP68 <400> 74 atg gtt tat aac att cac ata ttg caa aca agg aaa acc ggt cgt gtg 48 Met Val Tyr Asn Ile His Ile Leu Gln Thr Arg Lys Thr Gly Arg Val 1 5 10 15 gtt gct gct gcg gct gca tcc gtg ctg tgt tgc atg ggg gct gta ttt 96 Val Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Leu Cys Cys Met Gly Ala Val Phe 20 25 30 cca gcg act atc gga gtg act gcg gcg tcg gcc 129 Pro Ala Thr Ile Gly Val Thr Ala Ala Ser Ala 35 40 <210> 75 <211> 43 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 75 Met Val Tyr Asn Ile His Ile Leu Gln Thr Arg Lys Thr Gly Arg Val 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Leu Cys Cys Met Gly Ala Val Phe 20 25 30 Pro Ala Thr Ile Gly Val Thr Ala Ala Ser Ala 35 40 <210> 76 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> SP69 <400> 76 atg aat tat tta cga caa aaa att tcg gct agt gct atc gcg gtg ttg 48 Met Asn Tyr Leu Arg Gln Lys Ile Ser Ala Ser Ala Ile Ala Val Leu 1 5 10 15 tcg act tgt ggg ttg att ttg gcg cca atg ccg gtc ttt gcg 90 Ser Thr Cys Gly Leu Ile Leu Ala Pro Met Pro Val Phe Ala 20 25 30 <210> 77 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 77 Met Asn Tyr Leu Arg Gln Lys Ile Ser Ala Ser Ala Ile Ala Val Leu 1 5 10 15 Ser Thr Cys Gly Leu Ile Leu Ala Pro Met Pro Val Phe Ala 20 25 30 <210> 78 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP7) <400> 78 gat tcc gcg cag acg agt gct gtg gtg tcc tca cgt tct ttc ccg aag 48 Asp Ser Ala Gln Thr Ser Ala Val Val Ser Ser Arg Ser Phe Pro Lys 1 5 10 15 gcg agt tcg gtg aag aag aat ttg ttc gcc gaa tcc acc tcc 90 Ala Ser Ser Val Lys Lys Asn Leu Phe Ala Glu Ser Thr Ser 20 25 30 <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 79 Asp Ser Ala Gln Thr Ser Ala Val Val Ser Ser Arg Ser Phe Pro Lys 1 5 10 15 Ala Ser Ser Val Lys Lys Asn Leu Phe Ala Glu Ser Thr Ser 20 25 30 <210> 80 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP45) <400> 80 gtc gac ggc aca gac ggc aca agc ggc acg aac agt acg tct cag gga 48 Val Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Gly Thr Asn Ser Thr Ser Gln Gly 1 5 10 15 agc gac ggc gat tcc gcg cca atc gcc ggc ccg gtg ccg aac 90 Ser Asp Gly Asp Ser Ala Pro Ile Ala Gly Pro Val Pro Asn 20 25 30 <210> 81 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 81 Val Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Gly Thr Asn Ser Thr Ser Gln Gly 1 5 10 15 Ser Asp Gly Asp Ser Ala Pro Ile Ala Gly Pro Val Pro Asn 20 25 30 <210> 82 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP50) <400> 82 gcg acg ttg acg ccc gcc gac gaa aga tat cac gtg gcg ttt cca tac 48 Ala Thr Leu Thr Pro Ala Asp Glu Arg Tyr His Val Ala Phe Pro Tyr 1 5 10 15 aac gat atg gaa tat tac gtc ggt gtc gcg ggg ctg gac gct 90 Asn Asp Met Glu Tyr Tyr Val Gly Val Ala Gly Leu Asp Ala 20 25 30 <210> 83 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 83 Ala Thr Leu Thr Pro Ala Asp Glu Arg Tyr His Val Ala Phe Pro Tyr 1 5 10 15 Asn Asp Met Glu Tyr Tyr Val Gly Val Ala Gly Leu Asp Ala 20 25 30 <210> 84 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP52) <400> 84 gcc gat tca gcc acc gct gac aac gcg ccc agc gtt gcc ggt cac gcg 48 Ala Asp Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ala Pro Ser Val Ala Gly His Ala 1 5 10 15 tat aac gaa ctg ccg tat aac aat cct gat gtc acc gtc acc 90 Tyr Asn Glu Leu Pro Tyr Asn Asn Pro Asp Val Thr Val Thr 20 25 30 <210> 85 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 85 Ala Asp Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ala Pro Ser Val Ala Gly His Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Glu Leu Pro Tyr Asn Asn Pro Asp Val Thr Val Thr 20 25 30 <210> 86 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP55) <400> 86 gac agc agc acc agc tcg tcc agt tca tca agc tcg tcc agc gtt gac 48 Asp Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Asp 1 5 10 15 tac gcc acc tgg gcc gaa gtc tcc aag gcg atg gac aag cag 90 Tyr Ala Thr Trp Ala Glu Val Ser Lys Ala Met Asp Lys Gln 20 25 30 <210> 87 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 87 Asp Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Asp 1 5 10 15 Tyr Ala Thr Trp Ala Glu Val Ser Lys Ala Met Asp Lys Gln 20 25 30 <210> 88 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP58) <400> 88 gga tca ttc gcg ttc acc gcg cgt aaa tcc gtg gcc ctg aac atc aac 48 Gly Ser Phe Ala Phe Thr Ala Arg Lys Ser Val Ala Leu Asn Ile Asn 1 5 10 15 ggg caa acc acc caa gtc acc aca tat gcg atg acg gcc acc 90 Gly Gln Thr Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Met Thr Ala Thr 20 25 30 <210> 89 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 89 Gly Ser Phe Ala Phe Thr Ala Arg Lys Ser Val Ala Leu Asn Ile Asn 1 5 10 15 Gly Gln Thr Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Met Thr Ala Thr 20 25 30 <210> 90 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP64) <400> 90 gaa gat gct acc ggc acg ctg acc gtc acc agc tcg gat gcc gcg ttc 48 Glu Asp Ala Thr Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Ser Asp Ala Ala Phe 1 5 10 15 aac ggc aag aag gtg aac gcc tac cag atg ttc tcc gct tcc 90 Asn Gly Lys Lys Val Asn Ala Tyr Gln Met Phe Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 91 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 91 Glu Asp Ala Thr Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Ser Asp Ala Ala Phe 1 5 10 15 Asn Gly Lys Lys Val Asn Ala Tyr Gln Met Phe Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 92 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP66) <400> 92 atg gaa tcg gaa gat tcc caa cca cag aca acc gat acc gcg aca gtg 48 Met Glu Ser Glu Asp Ser Gln Pro Gln Thr Thr Asp Thr Ala Thr Val 1 5 10 15 cag act act aag gct gct gaa ccg acg ctg ctc gcc agc tgg 90 Gln Thr Thr Lys Ala Ala Glu Pro Thr Leu Leu Ala Ser Trp 20 25 30 <210> 93 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 93 Met Glu Ser Glu Asp Ser Gln Pro Gln Thr Thr Asp Thr Ala Thr Val 1 5 10 15 Gln Thr Thr Lys Ala Ala Glu Pro Thr Leu Leu Ala Ser Trp 20 25 30 <210> 94 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP67) <400> 94 gca ggt gtg gat tac ctg cct acc atc ggc caa gtg ccg aca tac acc 48 Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly Gln Val Pro Thr Tyr Thr 1 5 10 15 aag ttc cag ccc aca gcc gat ccg ggc aag aac gct agc gat 90 Lys Phe Gln Pro Thr Ala Asp Pro Gly Lys Asn Ala Ser Asp 20 25 30 <210> 95 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 95 Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly Gln Val Pro Thr Tyr Thr 1 5 10 15 Lys Phe Gln Pro Thr Ala Asp Pro Gly Lys Asn Ala Ser Asp 20 25 30 <210> 96 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP68) <400> 96 gat gaa ccc gtc gaa ttg gtc gtc aac ggc gga ttc gaa gac gat ctt 48 Asp Glu Pro Val Glu Leu Val Val Asn Gly Gly Phe Glu Asp Asp Leu 1 5 10 15 aat ggt tgg aag tct gga acg gtg tgg aat agc tcc gca tcg 90 Asn Gly Trp Lys Ser Gly Thr Val Trp Asn Ser Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 97 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 97 Asp Glu Pro Val Glu Leu Val Val Asn Gly Gly Phe Glu Asp Asp Leu 1 5 10 15 Asn Gly Trp Lys Ser Gly Thr Val Trp Asn Ser Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 98 <211> 90 <212> DNA <213> Bifidobacterium spp. <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <220> <221> misc_feature <223> Linker peptide (SP69) <400> 98 gat gat tca acg cca tct tca acg cca tcg gat ggc agt tac acc acg 48 Asp Asp Ser Thr Pro Ser Ser Thr Pro Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Thr 1 5 10 15 act gat agc ggt gat ggc acg tat tcc att ccc atg ttg aac 90 Thr Asp Ser Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Ile Pro Met Leu Asn 20 25 30 <210> 99 <211> 30 <212> PRT <213> Bifidobacterium spp. <400> 99 Asp Asp Ser Thr Pro Ser Ser Thr Pro Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Thr 1 5 10 15 Thr Asp Ser Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Ile Pro Met Leu Asn 20 25 30 <210> 100 <211> 5697 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pHG-2 <400> 100 tagccggcat tttcgcgata cattccccgg aatgttgcgc aacggggaac gcgcaccaca 60 ccgcaaccac agtgcgccac gcccagtccg gccctgtgcg ctataatagg tcagttattc 120 gcgcgcgcgt ggcgccctct acaccccgag ccgcgaggac acgtggattc cggacggcca 180 tgccccacat ggcaaaccga gaacccgcac acctagcatt acaaggagag ccattatggc 240 gttgatgatg agcgttaaga ctattatttc cacatcagtg gcgattatcg ccacgggtgc 300 catgtttgcg tgcgtagccc cgtttgcctc tgccgattcc gcgcagacga gtgctgtggt 360 gtcctcacgt tctttcccga aggcgagttc ggtggaagtg cagctggtcg aatcgggcgg 420 cggcctggtg cagccgggcg gctccctgcg tctgtcgtgc gccgcctcgg gcttcaacat 480 caaggatacc tacatccact gggtgcgcca ggccccgggc aagggcctgg aatgggtggc 540 ccgtatctac ccgaccaacg gctacacccg ctacgccgat tccgtgaagg gccgcttcac 600 catctccgcc gataccagca agaacaccgc ctacctgcag atgaactccc tgcgcgccga 660 agataccgcc gtgtactact gctcgcgctg gggcggcgac ggcttctacg ccatggacta 720 ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc cagcggcggc ggcggctccg gcggcggcgg 780 ctcgggcggc ggcggctccg acatccagat gacccagtcc ccgtcgtccc tgagcgcctc 840 ggtgggcgat cgcgtgacca tcacctgccg cgcctcccag gatgtgaaca ccgccgtggc 900 ctggtaccag cagaagccgg gcaaggcccc gaagctgctg atctactcgg cctccttcct 960 gtactccggc gtgccgtccc gtttctccgg ctcccgctcg ggcaccgact tcaccctgac 1020 catctcgtcc ctgcagccgg aagacttcgc cacctactac tgccagcagc attacaccac 1080 cccgccgacc ttcggccagg gcaccaaggt ggaaatcaag catcatcatc atcatcactg 1140 aaaccgcttc tcatttccat ttgcgatatg gtctgaatac gacgaaaccc cggcgcgagg 1200 ccggggtttc gtaagctgtg cgtgactata gcacgaccag cgcgattcgg tgcacggatc 1260 cgtcttcctg ctggcctatg cattgggttc cgcagtgccc actccaggcg gtctgggcgg 1320 tgtggaagcg gcgctgacat tcgcgttcgt ggcggtcgga gtgccgcagg gcgtggcgct 1380 ttccgccact ttgctgcacc gcgtggtgtt ctactggctg cgcattccgc tgggcgcggc 1440 ggccatgaag tggcttgaca agcataatct tgtctgattc gtctattttc ataccccctt 1500 cggggaaata gatgtgaaaa cccttataaa acgcgggttt tcgcagaaac atgcgctagt 1560 atcattgatg acaacatgga ctaagcaaaa gtgcttgtcc cctgacccaa gaaggatgct 1620 ttatgaatta tttacgacaa aaaatttcgg ctagtgctat cgcggtgttg tcgacttgtg 1680 ggttgatttt ggcgccaatg ccggtctttg cggatgattc aacgccatct tcaacgccat 1740 cggatggcag ttacaccacg actgatagcg gtcaggaccc gtacgtcaag gaagccgaaa 1800 acctgaagaa gtacttcaac gccggccata gcgatgtcgc cgataacggc accctgttcc 1860 tgggcatcct gaagaactgg aaggaagagt ccgaccgcaa gatcatgcag tcccagatcg 1920 tgagcttcta cttcaagctg ttcaagaact tcaaggacga tcagtcgatc cagaagtccg 1980 tggagaccat caaggaagac atgaacgtca agttcttcaa cagcaacaag aagaagcgcg 2040 acgatttcga gaagctgacc aactactccg tgaccgatct gaacgtccag cgtaaggcca 2100 tccacgagct gatccaggtc atggccgaac tgtccccggc cgccaagacc ggcaagcgta 2160 agcgttccca gatgctgttc cgtggccgtc gcgcctccca gcaccatcat caccaccact 2220 gaccttctgc tcgtagcgat tacttcgagc attactgacg acaaagaccc cgaccgagat 2280 ggtcggggtc tttttgttgt ggtgctgtga cgtgttgtcc aaccgtatta ttccggacta 2340 gtcctccagg acctcgtcta cgaggcgctg agcgaggaat ggcgcaaaag ggacggcgag 2400 atcagcgacc catgggccaa cgacgaggcg gacggatacc agccgccctc atacgagccg 2460 gtcaaccccg aacgcaggac tccccagacg ccctccgatg gcctgatctg acgtccgaaa 2520 aaaggcgctg tgcgcccttt ttaaatcttt tataaatctt tttacattct tttagcccct 2580 ccgcagcctt actctcccaa cgggtttcag ccgaaaccta caccaaaagg ggagcgaacc 2640 tacaccaaaa ggggagcgaa cctacaccaa aaggggagcg aacctacacc aaaaggggag 2700 ctatatacac cttttgttat ttaaggtgca agttgtgcta tgctgaggcc atgtccaatg 2760 agatcgtgaa gttcagcaac cagttcaaca acgtcgcgct gaagaagttc gacgccgtgc 2820 acctggacgt gctcatggcg atcgcctcaa gggtgaggga gaagggcacg gccacggtgg 2880 agttctcgtt cgaggagctg cgcggcctca tgcgattgag gaagaacctg accaacaagc 2940 agctggccga caagatcgtg cagacgaacg cgcgcctgct ggcgctgaac tacatgttcg 3000 aggattcggg caagatcatc cagttcgcgc tgttcacgaa gttcgtcacc gacccgcagg 3060 aggcgactct cgcggttggg gtcaacgagg agttcgcgtt cctgctcaac gacctgacca 3120 gccagttcac gcgcttcgag ctggccgagt tcgccgacct caagagcaag tacgccaagg 3180 agttctaccg cagggccaag cagtaccgca gctccggaat ctggaagatc ggccgcgacg 3240 agttctgccg actgcttggc gttccaccgt cggcaataac ccagacacga tatctgaatc 3300 agaaggttct tcagccaatt caggaggagt gtgggcctct 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ccgtcaaggg ccgcttcacc atctcgcgtg acaactccaa gaacaccctg tacctgcaga 1860 tgaactccct gcgtgccgaa gacaccgccg tgtactactg cgcccgcgat ccgcgtggcg 1920 ccaccctgta ctactactac tacggcatgg atgtctgggg ccagggcacc accgtgaccg 1980 tctcgtccgg cggcggcggc tccggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc tccgacatcc 2040 agatgaccca gtccccgagc tcgctgagcg cctcggtggg cgatcgcgtc accatcacct 2100 gccgtgcctc ccagagcatc aactcctacc tggactggta ccagcagaag ccgggcaagg 2160 ccccgaagct gctgatctac gccgcctcca gcctgcagag cggcgtgccg tcgcgcttct 2220 cgggctccgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatctc gtccctgcag ccggaggatt 2280 tcgccaccta ctactgccag cagtactact ccaccccgtt caccttcggc ccgggcacca 2340 aggtcgagat caagtgacca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 2400 ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac tagagtcaca ctggctcacc 2460 ttcgggtggg cctttctgcg tttata 2486 <210> 144 <211> 2516 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pPC8TL scFv expression cassettes sequence <400> 144 gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60 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gcctcccagt cggtgtccag ctacctggcc tggtaccagc agaagccggg 960 ccaggccccg cgtctgctga tctacgacgc ctccaaccgc gccaccggca tcccggcccg 1020 cttctccggc tcgggctccg gcaccgactt caccctgacc atctcgtccc tggaaccgga 1080 ggacttcgcc gtctactact gccagcagtc ctcgaactgg ccgcgcacct tcggccaggg 1140 caccaaggtc gagatcaagt gaccttctgc tcgtagcgat tacttcgagc attactgacg 1200 acaaagaccc cgaccgagat ggtcggggtc tttttgttgt ggtgctgtga cgtgttgtcc 1260 aaccgtatta ttccggtagc cggcattttc gcgatacatt ccccggaatg ttgcgcaacg 1320 gggaacgcgc accacaccgc aaccacagtg cgccacgccc agtccggccc tgtgcgctat 1380 aataggtcag ttattcgcgc gcgcgtggcg ccctctacac cccgagccgc gaggacacgt 1440 ggattccgga cggccatgcc ccacatggca aaccgagaac ccgcacacct agcattacaa 1500 ggagagccat tatggtttat aacattcaca tattgcaaac aaggaaaacc ggtcgtgtgg 1560 ttgctgctgc ggctgcatcc gtgctgtgtt gcatgggggc tgtatttcca gcgactatcg 1620 gagtgactgc ggcgtcggcc gatcaggtcc agctggtcga atcgggcggc ggcgtcgtcc 1680 agccgggccg ttccctgcgt ctgtcgtgcg ccgcctcggg cttcaccttc tccagctacg 1740 gcatgcactg 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Claims (18)

  1. 비피도박테리움 속 세균 내에서 발현하는 아래의 (1)~(4)의 DNA를 순차적으로 포함하는 분비 발현 카세트를, 2 종류 포함하는 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
    (1) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터 DNA；
    (2) 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA；
    (3) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA；
    (4) 비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터 DNA；
  2. 제 1항에 있어서,
    분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA의 하류에 링커 펩티드를 코딩하는 DNA가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 프로모터가 P30 프로모터, P54 프로모터 및 Hu프로모터에서 선택되는 1개 또는 2개의 프로모터인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    비피도박테리움 속 세균에서 기능하는 터미네이터가 Hu터미네이터 및 T2 터미네이터에서 선택되는 1개 또는 2개의 터미네이터인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    분비 신호 펩티드가 아래의 a) 또는 b)의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
    a) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열；
    b) 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로서, 그 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가 비피도박테리움 속 세균에 있어서 분비 신호 펩티드로서 기능하는 아미노산 서열；
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 폴리펩티드가 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  7. 제 6항에 있어서,
    단일 사슬 항체가 항PD-1 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  8. 제 6항에 있어서,
    단일 사슬 항체가 항CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  9. 제 6항에 있어서,
    단일 사슬 항체가 항HER2 항체인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 폴리펩티드가 사이토카인인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  11. 제 10항에 있어서,
    사이토카인이 TNF-α인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  12. 제 10항에 있어서,
    사이토카인이 IFN-γ인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  13. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 폴리펩티드가 항PD-1 항체와 항CTLA-4 항체의 조합인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  14. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 폴리펩티드가 TNF-α와 IFN-γ의 조합인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  15. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 폴리펩티드가 항HER2 항체와 IFN-γ의 조합인 것을 특징으로 하는 공발현 플라스미드.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 공발현 플라스미드로 형질 전환된 비피도박테리움 속 세균.
  17. 제 16항에 있어서,
    비피도박테리움ㆍ롱검인 비피도박테리움 속 세균.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 따른 비피도박테리움 속 세균을 포함하는 의약 조성물.
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