CN102575227A - 表达多种免疫调节剂的工程改造细胞及其应用 - Google Patents

表达多种免疫调节剂的工程改造细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗领域。更具体地说，本发明提供产生体外工程改造的免疫细胞的方法和在动物中的治疗性应用，所述细胞在有激活配体存在下，在基因表达调节系统控制下条件性表达白介素-12(IL-12)和一种或多种免疫调节剂。

Description

表达多种免疫调节剂的工程改造细胞及其应用
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发明背景
发明领域
本发明涉及治疗疾病和病症，例如癌症的基因治疗领域。在一个实施方式中，本发明提供工程改造免疫细胞或治疗支持细胞(TSC)以表达一种或多种免疫调节剂和这些细胞作为治疗剂的应用。
背景
白介素-12(IL-12)是参与许多生物学过程，包括但不限于：保护性免疫应答和抑制肿瘤发生的I型细胞因子家族成员(Abdi等.，2006；Adorini，1999；Adorini，2001；Adorini等.，2002；Adorini等.，1996；Akhtar等.，2004；Akiyama等.，2000；Al-Mohanna等.，2002；Aliberti等.，1996；Allavena等.，1994；Alli和Khar，2004；Alzona等.，1996；Amemiya等.，2006；Araujo等.，2001；Arulanandam等.，1999；Athie等.，2000；Athie-Morales等.，2004；Bertagnolli等.，1992；Bhardwaj等.，1996；Biedermann等.，2006；Brunda和Gately，1994；Buchanan等.，1995；Romani等.，1997；Rothe等.，1996；Satoskar等.，2000；Schopf等.，1999；Thomas等.，2000；Tsung等.，1997；Wolf等.，1994；Yuminamochi等.，2007)。越来越多的证据提示IL-12可能是控制人疾病的有希望靶标(例如，癌症)。
虽然IL-12因对1型抗肿瘤NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞(Trinchieri，2003)的强效抑制活性而有希望作为癌症治疗剂，但重组人IL-12(rhIL-12)在患者中报道的毒性(Atkins等.，1997)以及GMP-级rhIL-12对于临床应用的来源有限阻碍了成功的IL-12治疗方法。因此，基因治疗方法可能代表了更安全、更能维持的治疗方法看来是合理的。实际上，发现实施肿瘤内或肿瘤周围递送重组病毒-(Sangro等.，2004；Triozzi等.，2005)或依据质粒的IL-12 cDNA(Heinzerling等.，2005)或IL-12基因修饰的自体成纤维细胞(Kang等.，2001)的I期临床试验是安全而良好耐受的。
然而，接受这些基因治疗的患黑色素瘤或各种癌的患者中的目标临床反应是罕见、可变、瞬时的并且在很大程度上集中在治疗部位(Heinzerling等.，2005；Kang等.，2001；Sangro等.，2004；Triozzi等.，2005)。在疾病消退是部分或完全的情况下，注意到肿瘤浸润淋巴细胞频率增加(Heinzerling等，2005；Sangro等.，2004)和循环肿瘤特异性CD8+T细胞的水平升高(Heinzerling等.，2005)，与这些患者中抗原特异性T细胞的交叉致敏提高一致。
由于特异性T细胞的交叉致敏最好通过用作IL-12的天然但受调节来源的树突细胞(DC)完成(Berard等.，2000)，基于DC的IL-12基因治疗的优秀临床前效力的最近报道引起极大兴趣(Satoh等.，2002；Tatsumi等.，2003；Yamanaka等.，2002)。例如，肿瘤内(i.t.)注射经工程改造以产生IL-12p70(通过重组腺病毒感染)的DC显示导致小鼠模型中广泛反应性、肿瘤特异性CD8+T细胞库的交叉致敏极大改善并伴有肿瘤排斥(Tatsumi等.，2003)。假定以前利用在CMV启动子控制下的编码mIL-12的重组腺病毒(rAd.cIL12，(Tatsumi等.，2003))，工程改造DC产生IL-12是组成型的，因此该细胞因子早期在肿瘤病损中和晚期在肿瘤引流淋巴结中关于治疗结果的免疫学影响无法解决。因此，出于调节转基因表达水平和选择转基因活化时间的目的，需要为条件化表达IL-12而工程改造的DC。本发明为利用此类细胞提供有希望的治疗结果。
发明概述
本发明提供在一个或多个启动子控制下，编码具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的蛋白质的重组载体。在一个实施方式中，所述一个或多个启动子是条件性的。在另一实施方式中，所述一个或多个启动子是组成型的。在另一实施方式中，所述载体是编码一种或多种蛋白质的腺病毒载体，通过提供可溶性小分子配体，例如二酰基肼(例如，RG-115819、RG-115830或RG-115932)条件激活的启动子驱动所述一种或多种蛋白质表达。该载体能控制免疫细胞和TSC表达一种或多种蛋白质。
在一个实施方式中，本发明提供条件性表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关(gene switch)的多核苷酸，其中编码基因开关的所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。在一个实施方式中，所述免疫调节剂选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
在另一实施方式中，本发明提供表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质的载体，其包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，(2)编码具有所述一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的所述一种或多种蛋白质的多核苷酸，和(3)编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一种多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
本发明还提供制备表达具有一种或多种免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的细胞，例如免疫细胞或TSC群体的方法，所述方法通过用条件性表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质的重组载体修饰(例如，转染、电穿孔等)细胞，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
在另一实施方式中，本发明提供制备表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质的细胞，例如免疫细胞或TSC群体的方法，所述方法通过用包含编码基因开关的多核苷酸的重组载体修饰细胞，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，(2)编码具有所述一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的所述一种或多种蛋白质的多核苷酸，和(3)编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一种多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
本发明还提供制备表达具有一种或多种免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的细胞，例如免疫细胞或TSC群体的方法，所述细胞用条件性表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质的重组载体修饰(例如，转染、电穿孔等)，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
在另一实施方式中，本发明提供表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质的细胞，例如免疫细胞或TSC的群体，所述细胞用重组载体修饰，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，(2)编码具有所述一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的所述一种或多种蛋白质的多核苷酸，和(3)编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一种多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
在另一实施方式中，本发明提供包含两种或更多种本发明细胞，例如免疫细胞或TSC的群体的组合物，其中所述组合物中的各细胞群体表达的一种或多种免疫调节剂与该组合物中其它一种或多种细胞群体表达的一种或多种免疫调节剂不同。在一个实施方式中，所述组合物包含两种细胞群体。在另一实施方式中，所述组合物包含多于两种细胞群体。在另一实施方式中，所述组合物包含三种细胞群体。在另一实施方式中，所述组合物包含四种细胞群体。
在另一实施方式中，本发明提供体外工程改造的细胞，例如免疫细胞或TSC，所述细胞包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。在另一实施方式中，本发明提供体外工程改造的细胞，例如免疫细胞或TSC，所述细胞包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，(2)编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的多核苷酸，和(3)编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一种多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
在另一实施方式中，本发明提供包含两种或更多种本发明的体外工程改造细胞，例如免疫细胞或TSC的群体的组合物，其中所述组合物中各体外工程改造细胞群体包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，其中所述组合物中各体外工程改造细胞群体表达的一种或多种免疫调节剂与该组合物中其它一种或多种体外工程改造细胞群体表达的一种或多种免疫调节剂不同。在一个实施方式中，本发明提供包含两种或更多种体外工程改造细胞，例如免疫细胞或TSC的群体的组合物，所述细胞群体各自包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，(2)编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的多核苷酸，和(3)编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一种多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。在一个实施方式中，所述组合物包含两种体外工程改造细胞群体。在另一实施方式中，所述组合物包含多于两种体外工程改造细胞群体。在另一实施方式中，所述组合物包含三种体外工程改造细胞群体。在另一实施方式中，所述组合物包含四种体外工程改造细胞群体。
本发明还提供包含本文所述细胞，例如免疫细胞或TSC群体的药物组合物。
在一个实施方式中，编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸在基因开关的启动子的控制下，编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸在组成型启动子的控制下。在另一实施方式中，编码具有一种或多种免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸和编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸均在基因开关的多顺反子启动子的控制下。在另一实施方式中，编码具有一种或多种免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸在基因开关的启动子的控制下，编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸在不同于基因开关启动子的条件性启动子的控制下。在又一个实施方式中，编码具有一种或多种免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸的基因调节系统与具有IL-12的功能的多核苷酸的基因调节系统是正交的。在又一个的实施方式中，编码各蛋白质的各多核苷酸的基因调节系统是正交的。
在一个实施方式中，本发明还提供癌症的治疗方法，所述癌症例如但不限于：黑色素瘤、神经胶质瘤、肾癌和前列腺癌以及表1所列的癌症。作为重组cDNA载体施用时，IL-12基因治疗在动物模型研究中显示抗肿瘤效力(Faure等.，1998；Sangro等.，2005)，但在基因修饰的DC中施用时，更是如此(Satoh等.，2002；Svane等.，1999；Tatsumi等.，2003；Yamanaka等.，2002)。然而，迄今为止，利用质粒或病毒载体的IL-12基因治疗的人I期试验未能在癌症环境中实现持久的目标临床反应(Heinzerling等.，2005；Kang等.，2001；Sangro等.，2004；Triozzi等.，2005)。本文所述的基因治疗提供有希望的治疗模式。
在一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的肿瘤的方法，包括以下步骤：
(a)将免疫细胞或TSC群体肿瘤内给予肿瘤微环境，所述细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质；和
(b)将治疗有效量的激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质表达并治疗所述肿瘤。
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的肿瘤的方法，包括以下步骤：
(a)将两种或更多种免疫细胞或TSC群体肿瘤内给予肿瘤微环境，所述细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质，其中各群免疫细胞或TSC表达不同集合的一种或多种免疫调节剂；和
(b)将治疗有效量的一种或多种激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质表达并治疗所述肿瘤。
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的肿瘤的方法，包括以下步骤：
(a)将免疫细胞或TSC群体肿瘤内给予肿瘤微环境，所述细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质，其中具有所述免疫调节剂或IL-12的功能的至少一种蛋白质在配体激活的条件性启动子的控制下；和
(b)将治疗有效量的激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质和/或具有IL-12的功能的蛋白质表达并治疗所述肿瘤。
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的肿瘤的方法，包括以下步骤：
(a)将两种或更多种免疫细胞或TSC群体肿瘤内给予肿瘤微环境，所述细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质，其中各群免疫细胞或TSC表达不同集合的具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质，其中具有所述免疫调节剂或IL-12的功能的至少一种蛋白质在配体激活的条件性启动子的控制下；和
(b)将治疗有效量的一种或多种激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质和/或具有IL-12的功能的蛋白质表达并治疗所述肿瘤。
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或病症的方法，包括以下步骤：
(a)将修饰细胞群体给予所述哺乳动物，所述细胞经修饰以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质；和
(b)将治疗有效量的激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质表达并治疗所述疾病或病症。
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或病症的方法，包括以下步骤：
(a)将两种或更多种修饰细胞群体给予所述哺乳动物，所述细胞经修饰以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质，其中各群修饰细胞表达不同集合的一种或多种免疫调节剂；和
(b)将治疗有效量的一种或多种激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质表达并治疗所述疾病或病症。
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或病症的方法，包括以下步骤：
(a)将修饰细胞群体给予所述哺乳动物，所述细胞经修饰以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质，其中具有所述免疫调节剂或IL-12的功能的至少一种蛋白质在配体激活的条件性启动子的控制下；和
(b)将治疗有效量的激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质和/或具有IL-12的功能的蛋白质表达并治疗所述疾病或病症。
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或病症的方法，包括以下步骤：
(a)将两种或更多种修饰细胞群体给予所述哺乳动物，所述细胞经修饰以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质，其中各群修饰细胞表达不同集合的具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质，其中具有所述免疫调节剂或IL-12的功能的至少一种蛋白质在配体激活的条件性启动子的控制下；和
(b)将治疗有效量的一种或多种激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质和/或具有IL-12的功能的蛋白质表达并治疗所述疾病或病症。
本发明还提供测定基于工程改造的细胞，例如免疫细胞或TSC的治疗效力的方法，该方法通过检测治疗开始前患者的IFN-γ表达或活性水平，从而获得对照水平，然后给予工程改造的细胞以表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和任选表达具有IL-12的功能的蛋白质，给予有效量的激活配体，然后检测IFN-γ的表达水平以产生测试水平，比较对照水平与测试水平以测定治疗方案是否有效。
在一个实施方式中，本发明提供测定基于体外工程改造的细胞，例如免疫细胞或TSC的治疗方案在患者中的效力的方法，包括：
(a)给予体外工程改造的细胞之前，检测从有此需要的所述患者获得的第一生物学样品中干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平或活性水平或二者，从而获得对照水平；
(b)给予有此需要的患者体外工程改造的细胞，所述细胞经工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和任选表达具有IL-12的功能的蛋白质；
(c)给予有此需要的所述患者有效量的激活配体；
(d)给予体外工程改造的免疫细胞和激活配体之后，检测从有此需要的所述患者获得的第二生物学样品中IFN-γ的表达水平或活性水平或二者，从而获得测试水平；和
(e)比较IFN-γ的对照水平或测试水平，其中IFN-γ的表达、活性或二者的测试水平相比于对照水平增加表明该治疗方案在有此需要的所述患者中有效。
附图详述
图1显示编码hIL-12的双顺反子转录物的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图2显示编码hIL-21和hIL-15的双顺反子转录物的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图3显示编码mIL-12的双顺反子转录物的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图4显示编码mIL-21和mIL-15的双顺反子转录物的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图5显示hIL-21的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图6显示mIL-21的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图7显示编码hIL-12和hIL-21的三顺反子转录物的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图8显示编码mIL-12和mIL-21的三顺反子转录物的调控启动子表达系统的质粒图谱。
图9显示的是载体rAd.RheoIL12的结构，其中E1和E3区已被删除，RheoSwitch
Figure BPA00001388484100101
治疗系统(RTS)-IL-12元件取代了E1区。标记为“IL-12”的框代表由IRES隔开的IL-12p40和IL-12p35编码序列。
序列详述
免疫调节剂
细胞因子
白介素1(IL-1)是抵御感染的炎性应答的重要细胞因子，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：M28983(人IL-1α)；M15330(人IL-1β)；AF201830(人IL-1δ)；AF201831(人IL-1ε)；AF201832(人1L-1ζ)；AF201833(人IL-1η)；NM_010554(小鼠IL-1α)；NM_008361(小鼠IL-1β)；NM_019451(小鼠L-1δ)；NM_019450(小鼠IL-1f6)；NM_027163(小鼠IL-1f8)；NM_153511(小鼠IL-1f9)；NM_204524(鸡IL-1β)；NM_017019(大鼠IL-1α)；和NM_031512(大鼠IL-1β)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素1(IL-1)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAA59134(人IL-1α)；AAA59135(人IL-1β)；AAF25210(人IL-1δ)；AAF25211(人IL-1ε)；AAF25212(人1L-1ζ)；AAF25213(人IL-1η)；NP_034684(小鼠IL-1α)；NP_032387(小鼠IL-1β)；NP_062324(小鼠L-1δ)；NP_062323(小鼠IL-1f6)；NP_081439(小鼠IL-1f8)；NP_705731(小鼠IL-1f9)；NP_989855(鸡IL-1β)；NP_058715(大鼠IL-1α)；和NP_113700(大鼠IL-1β)，它们的序列通过引用纳入本文。Laurent等.，Psychiatr.Genet.7：103(1997)鉴定人白介素-1β基因中的多态性突变。
白介素2(IL-2)属于细胞因子家族，包括IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：U25676(人)；NM_008366(小鼠)；NM_204153(鸡)；和NM_053836(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素2(IL-2)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAA70092(人)；NP_032392(小鼠)；NP_989484(鸡)；和NP_446288(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
Liu等.，Appl.Biochem.Biotechnol.133：77(2006)产生突变型人IL-2，Lorberboum等.，J.Biol.Chem.265：16311(1990)描述了嵌合型IL-2的产生。
白介素4(IL-4)是诱导原初辅助T细胞分化成TH2细胞的细胞因子，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：M23442(人)；NM_021283(小鼠)；NM_001007079(鸡)；和NM_201270(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素4(IL-4)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAA59150(人)；NP_067258(小鼠)；NP_001007080(鸡)；和NP_958427(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
Kawashima等.，J.Med.Genet.35：502(1998)描述了特应性皮炎相关的IL-4基因多态性。
白介素7(IL-7)是B和T细胞发育至关重要的细胞因子。IL-7的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：J04156(人)；NM_008371(小鼠)；NM_001037833(鸡)；和NM_013110(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素7(IL-7)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAA59156(人)；NP_032397(小鼠)；NP_001032922(鸡)；和NP_037242(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
Feng等.，Genetics 175：545(2007)鉴定了IL-7中导致功能缺陷的点突变。
白介素9(IL-9)是T细胞产生的细胞因子，是造血细胞的调节剂。IL-9的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_000590(人)；NM_008373(小鼠)；NM_001037825(鸡)；和NM_001105747(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素9(IL-9)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_000581(人)；NP_032399(小鼠)；NP_001032914(鸡)；和NP_001099217(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
IL-12是一种细胞因子，其可用作激活的T和NK细胞的生长因子，增强NK/淋巴因子激活的杀伤细胞的裂解活性，以及刺激静息外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ。IL-12的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_000882(人IL12A)；NM_002187(人IL12B)；NM_008351(小鼠IL12a)；NM_008352(小鼠IL12b)；NM_213588(鸡IL12A)；NM_213571(鸡IL12B)；NM_053390(大鼠IL12a)；和NM_022611(大鼠IL12b)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素12(IL-12)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_000873(人IL12A)；NP_002178(人IL12B)；NP_032377(小鼠IL12a)；NP_032378(小鼠IL12b)；NP_998753(鸡IL12A)；NP_998736(鸡IL12B)；NP_445842(大鼠IL12a)；和NP_072133(大鼠IL12b)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素15(IL-15)是调节T和天然杀伤细胞激活和增殖的细胞因子。IL-15的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：U14407(人)；NM_008357(小鼠)；EU334509(鸡)；和AF015719(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素15(IL-15)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAA21551(人)；NP_032383(小鼠)；ABY55312(鸡)；和AAB94536(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素18(IL-18)是巨噬细胞产生的细胞因子，微生物产物感染后，其与白介素12一起诱导细胞介导的免疫力。IL-18的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：U90434(人)；NM_008360(小鼠)；EU747333(鸡)；和AY258448(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素18(IL-18)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAB50010(人)；NP_032386(小鼠)；ACE79188(鸡)；和AAP14669(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素21(IL-21)是通过诱导细胞增殖而对免疫系统的细胞，包括天然杀伤细胞和细胞毒性T细胞具有强效调节作用的细胞因子，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AF254069(人)；NM_021782(小鼠)；NM_001024835(鸡)；和NM_001108943(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素21(IL-21)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAG29348(人)；NP_068554(小鼠)；NP_001020006(鸡)；和NP_001102413(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素27(IL-27)是在调节B和T淋巴细胞活性中起重要作用的细胞因子。IL-27的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AY099296(人)；NM_145636(小鼠)；和XM_344962(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素27(IL-27)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAM34498(人)；NP_663611(小鼠)；和XP_344963(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
干扰素β1(IFNB1)是结合特异性细胞表面受体(IFNAR)的一组干扰素蛋白的成员，并刺激巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞引发抗病毒反应，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_002176(人)；NM_010510(小鼠)；NM_001024836(鸡)；和NM_019127(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
干扰素β1(IFNB1)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_002167(人)；NP_034640(小鼠)；NP_001020007(鸡)；和NP_062000(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
干扰素γ(IFN-γ)是可溶性细胞因子，其是唯一的II型干扰素并具有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤活性。IFN-γ的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_000619(人)；NM_008337(小鼠)；和NM_138880(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
干扰素γ(IFN-γ)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_000610(人)；NP_032363(小鼠)；和NP_620235(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
肿瘤坏死因子(TNF-α)是主要由单核细胞/巨噬细胞分泌的多功能促炎细胞因子，其对脂质代谢、凝血、胰岛素耐受和内皮功能有影响，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：X02910(人)；NM_013693(小鼠)；和BC107671(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
TNF-α的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：CAA26669(人)；NP_038721(小鼠)；和AAI07672(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
趋化因子
趋化因子(C基序)配体1(XCL1，也称为淋巴细胞趋化因子)对CD4+和CD8+T细胞有趋化作用，但对单核细胞没有，其诱导外周血淋巴细胞中的胞内钙升高。XCL1的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_002995(人)；NM_008510(小鼠)；和NM_134361(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
XCL1的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_002986(人)；NP_032536(小鼠)；和NP_599188(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。美国专利第6,022,534号公开了淋巴细胞趋化因子，其用于吸引细胞毒性T细胞和/或NK细胞，和/或诱导固有细胞增殖。还公开了分离和利用抗淋巴细胞趋化因子抗体及XCL1融合蛋白的方法。
CC趋化因子配体3(CCL3)也称为巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)，其参与多形核白细胞募集和激活中的急性炎性状态，即所谓的单核因子(主要由单核细胞和巨噬细胞产生的一类细胞因子)，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_002983(人)；NM_011337(小鼠)；和NM_013025(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CCL3的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_002974(人)；NP_035467(小鼠)；和NP_037157(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CCL5(RANTES)是参与炎症和哮喘的促炎细胞因子，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AF043341(人)；NM_013653(小鼠)；和NM_031116(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CCL5的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAC03541(人)；NP_038681(小鼠)；和NP_112378(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CC趋化因子配体7(CCL7)是参与炎症和癌症侵入期间巨噬细胞募集的趋化因子，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_006273(人)；NM_013654(小鼠)；和NM_001007612(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CCL7的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_006264(人)；NP_038682(小鼠)；和NP_001007613(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
趋化因子(CXC基序)配体9(CXCL9，也称为MIG)是γ干扰素可诱导的T细胞化学引诱物。CXCL9的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_002416(人)；NM_0108599(小鼠)；和NM_145672(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CXC9的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_002407(人)；NP_032625(小鼠)；和NP_663705(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)是在免疫系统细胞的化学引诱、T细胞与内皮细胞粘附、抗肿瘤活性和血管发生中起作用的小细胞因子。CXCL10的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：X02530(人)；NM_021274(小鼠)；和BC058444(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：CAA26370(人)；NP_067249(小鼠)；和AAH58444(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)也称为基质细胞衍生因子1(SDF-1)，其是属于互泌素家族的小细胞因子，该家族的成员激活白细胞，常由促炎刺激物，例如LPS、TNF或IL1诱导。CXCL12的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_000609(人)；NM_001012477(小鼠)；NM_204510(鸡)；和NM_001033883(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CXCL12的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_000600(人)；NP_001012495(小鼠)；NP_989841(鸡)；和NP_001029055(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
Hansson等.，Microbes and Infection 8：841(2006)讨论了趋化因子(C-C基序)受体7(CCR7)和趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19，也称为MIP-3β)之间的相互作用对于初级免疫应答至关重要。CCR7的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_001838(人)；和NM_007719(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CCR7的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_001829(人)；和NP_031745(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CCL19的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_006274(人)；和NM_011888(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CCL19的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_006265(人)；和NP_036018(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CC趋化因子配体21(CCL21)是CD4+，但非CD8+T细胞达到它们的稳态“设定点”必需的已知CCR7配体，扰乱CCL21表达可改变对于自身免疫力的敏感性，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AB002409(人)；NM_011335(小鼠CCL21a)；NM_011124(小鼠CCL21b)；和NM_023052(小鼠CCL21c)；它们的序列通过引用纳入本文。
CCL21的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：BAA21817(人)；NP_035465(小鼠CCL21a)；NP_035254(小鼠CCL21b)；和NP_075539(小鼠CCL21c)，它们的序列通过引用纳入本文。
白介素-8(IL-8)是一种趋化因子，也称为嗜中性粒细胞激活肽-1或SCYB8，其是几类细胞响应于炎性刺激而分泌的组织衍生肽。美国专利号6,133,426和6,177,980公开了人源化抗-IL-8抗体的氨基酸和多核苷酸序列。人IL-8的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_000584，其序列通过引用纳入本文。
人IL-8的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_000575，其序列通过引用纳入本文。
生长因子
粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种细胞因子，其起到白细胞生长因子作用、刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。GM-CSF的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：M11734(人)；NM_009969(小鼠)；EU520303(鸡)；NM_001037660(大鼠Csf2ra)；和NM_133555(大鼠Csf2rb)，它们的序列通过引用纳入本文。
粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAA52122(人)；NP_034099(小鼠)；ACB11534(鸡)；NP_001032749(大鼠Csf2ra)；和NP_598239(Csf2rb)，它们的序列通过引用纳入本文。
FMS-相关酪氨酸激酶配体(FLT3/FLK2配体，Flt3L)可在造血干细胞或祖细胞或二者上起到生长因子受体的作用，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：U04806(人)；和NM_013520(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
FLT3/FLK2配体(Flt3L)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAA17999(人)；和NP_038548(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
在一些人癌症中上调的转化生长因子α(TGF-α)能可逆地赋予培养的细胞转化表型，其多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_001099691(人)；NM_031199(小鼠)；NM_001001614(鸡)；和NM_012671(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
TGF-α的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_001093161(人)；NP_112476(小鼠)；NP_001001614(鸡)；和NP_036803(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
佐剂
β-防卫素是涉及抵御许多革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌和病毒的先天免疫应答的抗微生物肽。β-防卫素的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：X92744(人hBD-1)；AJ000152(人hBD-2)；AF217245(人β防卫素-3)；AJ314835(人β防卫素-4)；AB089180(人hBD-5)；AY122466(人防卫素β106，DEFB106)；AF540979(人β防卫素107，DEFB107)；AF529416(人β防卫素，DEFB108)；DQ012014(人β防卫素110，DEFB110)；DQ012015(人β防卫素111，DEFB111)；DQ012016(人β防卫素112，DEFB112)；DQ012017(人β防卫素113，DEFB113)；DQ012018(人β防卫素114，DEFB114)；DQ012019(人β防卫素115，DEFB115)；DQ012020(人β防卫素116，DEFB116)；DQ012021(人β防卫素117，DEFB117)；NM_007843(小鼠防卫素β1)；NM_010030(小鼠防卫素β2，Defb2)；NM_013756(小鼠防卫素β3，Defb3)；NM_019728(小鼠防卫素β4，Defb4)；NM_030734(小鼠防卫素β5，Defb5)；NM_054074(小鼠防卫素β6，Defb6)；NM_139220(小鼠防卫素β7)；NM_153108(小鼠防卫素β8，Defb8)；NM_139219(小鼠防卫素β9，Defb9)；和NM_139225(小鼠防卫素β10，Defb10)；它们的序列通过引用纳入本文。
β-防卫素的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：CAA63405(人hBD-1)；CAB65126(人hBD-2)；AAF73853(人β防卫素-3)；CAC85520(人β防卫素-4)；BAC10630(人hBD-5)；AAM93908(人防卫素β106，DEFB106)；AAN33115(人β防卫素107，DEFB107)；AAQ09525(人β防卫素，DEFB108)；AAY59750(人β防卫素110，DEFB110)；AAY59751(人β防卫素111，DEFB111)；AAY59752(人β防卫素112，DEFB112)；AAY59753(人β防卫素113，DEFB113)；AAY59754(人β防卫素114，DEFB114)；AAY59755(人β防卫素115，DEFB115)；AAY59756(人β防卫素116，DEFB116)；AAY59757(人β防卫素117，DEFB117)；NP_031869(小鼠defeninβ1)；NP_034160(小鼠防卫素β2，Defb2)；NP_038784(小鼠防卫素β3，Defb3)；NP_062702(小鼠防卫素β4，Defb4)；NP_109659(小鼠防卫素β5，Defb5)；NP_473415(小鼠防卫素β6，Defb6)；NP_631966(小鼠防卫素β7，Defb7)；NP_694748(小鼠防卫素β8，Defb8)；NP_631965(小鼠防卫素β9，Defb9)；和NP_631971(小鼠防卫素β10，Defb10)，它们的序列通过引用纳入本文。其它人和大鼠防卫素肽序列还可参见美国专利第5,242,902号。
高迁移率族蛋白-1(HMGB1)蛋白是非组蛋白染色体蛋白，其起到细胞因子的作用，介导针对坏死性细胞死亡和癌症、病原体入侵、外伤和脓毒症的局部和全身性反应。HMGB1蛋白的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_002128(人)；NM_010439(小鼠)；NM_204902(鸡)；和NM_012963(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
高迁移率族蛋白-1(HMGB1)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_002119(人)；NP_034569(小鼠)；NP_990233(鸡)；和NP_037095(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
吞噬细胞S100蛋白介导炎性反应并将炎性细胞募集至组织损伤部位，该蛋白是对于先天免疫力至关重要的损伤相关分子模式(DAMP)分子的成员。参见Foell等.，J.Leukocyte Biol.81：1(2006)。S100蛋白质的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：BC014392(人S100A1)；BC002829(人S100A2)；BC012893(人S100A3)；BC016300(人S100A4)；Z18954(人S100D)；BC001431(人S100A6)；BC034687(人S100A7)；BC005928(人S100A8)；BC047681(人S100A9)；BC015973(人S100A10)；D38583(人钙囊素(clagizzarin))；NM_011309(小鼠S100a1)；NM_009115(小鼠S100b)；NM_013650(小鼠S100a8)；NM_009114(小鼠S100a9)；NM_011310(小鼠S100a3)；NM_011311(小鼠S100a4)；和NM_011312(小鼠S100a5)，它们的序列通过引用纳入本文。
S100蛋白质的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAH14392(人S100A1)；AAH02829(人S100A2)；AAH12893(人S100A3)；AAH16300(人S100A4)；CAA79479(人S100D)；AAH01431(人S100A6)；AAH34687(人S100A7)；AAH05928(人S100A8)；AAH47681(人S100A9)；AAH15973(人S100A10)；BAA07597(人钙囊素(clagizzarin))；NP_035439(小鼠S100a1)；NP_033141(小鼠S100b)；NP_038678(小鼠S100a8)；NP_033140(小鼠S100a9)；NP_035440(小鼠S100a3)；NP_035441(小鼠S100a4)；和NP_035442(小鼠S100a5)，它们的序列通过引用纳入本文。
甘露聚糖是一种植物多糖，其是甘露糖的聚合物，可用于产生免疫应答。美国专利第5,807,559号公开了甘露聚糖的免疫原性偶联物，其可用于产生针对肿瘤相关碳水化合物结构或针对感染因子和/或受感染宿主细胞上表达的碳水化合物结构的T细胞免疫力。美国专利第5,773,425号公开了甘露聚糖在缓解症状和/或治愈病毒性疾病和增强免疫应答中的应用。
卡介苗(BCG)是一种活的减毒分枝杆菌，用作防止严重和致命肺结核的疫苗。美国专利第7,393,541号公开了产生佐剂疫苗以便产生针对哺乳动物对象中分枝杆菌的体内T-细胞介导免疫应答。还参见Hubbard和Collins，Infect.Immun.59(2)：570。美国专利第5,292,513号公开了利用热杀伤BCG在需要提升杀细菌和抗病毒活性的患者中体内致敏巨噬细胞的方法。BCG的完整基因组序列可从公开数据库获得，登录号为：NC_008769(牛分枝杆菌BCGPasteur 1173P2株(M.bovis BCG str.Pasteur 1173P2)，完整基因组)。
细菌脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌感染后诱导强烈免疫应答的内毒素。美国专利第4,148,877号公开了从细菌培养物中分级分离LPS，以及各部分作为药物来诱导针对细菌感染的抵抗力的应用。美国专利第5,292,513号公开了用LPS在需要提升杀细菌和抗病毒活性的患者中体内致敏巨噬细胞的方法。
共刺激分子(正)
OX40配体(OX40L)属于肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(Tnfsf4)，表达在树突细胞上并促进Th2细胞分化。OX40配体的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：X79929(人)；U12763(小鼠)；和AF037067(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
OX40配体(OX40L)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：CAA56284(人)；AAA21871(小鼠)；和AAC67236(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
4-1BB配体(4-1BBL)属于肿瘤坏死因子(配体)超家族成员9(Tnfsf9)，其是2型跨膜糖蛋白，表达在激活的T淋巴细胞上。4-1BBL的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_003811(人)；NM_009404(小鼠)；和AY332409(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
4-1BB配体(4-1BBL)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_003802(人)；NP_033430(小鼠)；和AAQ01228(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CD40蛋白属于肿瘤坏死因子受体超家族成员5，在介导各种免疫和炎性应答中至关重要，包括T细胞依赖性免疫球蛋白类转化、记忆B细胞发育和生发中心形成。CD40蛋白的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：X60592(人)；NM_170701(小鼠)；NM_204665(鸡)；和NM_134360(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CD40蛋白的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：CAA43045(人)；NP_733802(小鼠)；NP_989996(鸡)；和NP_599187(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
糖皮质激素-诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关蛋白(GITR)能通过T细胞刺激引发有效的肿瘤免疫力。给予抗-GITR单克隆抗体(mAb)可引发强效肿瘤特异性免疫力并消除已有的肿瘤而不引发明显的自身免疫疾病。参见Ko等.，J.Exp.Med.7：885(2005)。美国专利号6,503,184B1公开了抗-GITR抗体。
GITR配体(GITRL)的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AY358868(人)；和AY359852(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
GITR配体(GITRL)的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：AAQ89227(人)；和AAQ55265(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
疱疹病毒进入介质(HVEM)结合配体(HSVgD)也称为p30，或者LIGHT，其是参与T细胞共刺激的TNF家族成员。LIGHT具有两种受体，疱疹病毒进入介质(HVEM)和淋巴毒素-β受体(LT-βR)。作为HVEM的配体，HSVgD通过用作T细胞的共刺激因子而激活T细胞，其导致T细胞增殖和细胞因子分泌。LIGHT的多核苷酸和氨基酸序列参见美国专利第7,118,742号。美国专利第5,654,174号描述了羧基末端残基缺失的变体gD蛋白。
CD70是结合CD27的细胞因子。其在T-细胞活化中起作用，诱导共刺激的T细胞增殖和增强细胞裂解性T-细胞产生。CD70的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_001252(人)；NM_011617(小鼠)；和NM_001106878(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
CD70的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_001243(人)；NP_035747(小鼠)；和NP_001100348(大鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
ICOS-L是T-细胞-特异性细胞表面受体ICOS的配体，其用作T-细胞增殖和细胞因子分泌的共刺激信号。ICOS-L还诱导B-细胞增殖和分化成浆细胞。ICOS-L能在介导针对炎性条件的局部组织应答以及通过共刺激记忆T细胞功能调节第二免疫应答中起到至关重要作用。ICOS-L的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_015259(人)；和NM_015790(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
ICOS-L的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_056074(人)；和NP_056605(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
PD-L1(也称为CD274)蛋白表达在激活的单核细胞、T和B细胞中。用IFN-γ处理后，PD-L1在单核细胞中上调，用IFN-γ以及其它激活剂处理后，在树突细胞和角化细胞中上调。PD-L1蛋白的多核苷酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NM_014143(人)；和NM_021893(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
PD-L1蛋白的氨基酸序列可从公开数据库获得，登录号为：NP_054862(人)；和NP_068693(小鼠)，它们的序列通过引用纳入本文。
共刺激分子(负)
细胞毒性T淋巴细胞-相关抗原4(CTLA4)是免疫球蛋白超家族成员，其是激活的T细胞表达的共刺激分子。美国专利号7,034,121和6,984,720公开了CTLA4的抗体的制备方法和应用。美国专利第6,984,720号公开了抗-CTLA4抗体的重链和轻链的氨基酸序列。
PD-1分子是结合PD-1配体(PD-L1)的免疫球蛋白基因超家族成员。PDL1结合T细胞上的PD-1受体将共刺激信号传递给该细胞，从而阻止细胞通过细胞周期的进展，并增强T细胞增殖。用抗-PD-L1抗体抑制PD-L1和T细胞上受体之间的相互作用导致称为免疫细胞无反应的免疫应答下调。美国专利第7,029,674号公开了抗-PD-L1抗体的制备方法和序列。
PD-L2主要是PD-1(或人同系物PDCD1)的配体。然而，有报道说PD-12以不依赖PDCD1的方式参与对于T淋巴细胞增殖和IFN-γ产生至关重要的共刺激信号。与PDCD1相互作用通过阻断细胞周期进展和细胞因子产生而抑制T-细胞增殖。Yamazaki等.，J.of Immunol.169：5538(2002)和Ansari等.，J.Exp.Med.198：63(2003)描述了抗-PD-L2单克隆抗体的制备。
对抗免疫抑制剂(Counter Immune Suppressants)(耐受抑制剂)
转化生长因子-β(TGF-β)是通过与两种跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，I型和II型之一相互作用来调节细胞增殖和分化的多功能蛋白。参见Chen等.，Science 28：1335(1993)。II型TGF受体(TGFR2)磷酸化和激活自身磷酸化的I型受体，然后结合并激活SMAD转录调节物。Lynch MA等.，CancerRes.58：4227(1998)描述了与人卵巢癌相关的转化生长因子β受体II型基因(TGFBR2)中的突变。Brand等.，J.Biol.Chem.268：11500-11503(1993)描述了预计的丝氨酸/苏氨酸激酶胞质结构域缺失(TGFβR2 cDNA H2-3FF的核苷酸1172-2036，可从公共数据库获得，登录号为M85079，氨基酸序列的登录号为AAA61164)损害所有三种TGF-β(1、2和3)依赖性基因表达。TGF-β在大多数人肿瘤中产生，抑制肿瘤抗原特异性细胞免疫。Foster等.，J.Immunother.31：500(2008)描述了细胞毒性T淋巴细胞中显性阴性TGFβR2的表达可导致对TGF-β抑制性作用的耐受。
TGFβ与TGFα协同作用诱导转化。其还用作负自分泌生长因子。TGFβ激活和信号传导的失调可导致凋亡。Ziyadeh等.，Proc.Natl.Acad.Sci.97：8015(2000)描述了给予抗-TGFβ抗体能阻止db/db小鼠(产生明显肾病的II型糖尿病模型)中的肾脏机能不全和肾小球硬化症。TGFβ单克隆抗体的制备和使用方法描述于美国专利第6,419,928号。Barcellos-Hoff等.，Am J.Pathol.147：5(1995)还描述了产生TGFβ抗体的方法。TGFβ融合蛋白构建物的氨基酸和核苷酸序列描述于美国专利第6,756,215号。
IL-10是激活的Th2细胞、B细胞、角质形成细胞、单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子。IL-10抑制许多细胞因子的合成，包括激活的巨噬细胞和辅助T细胞产生的IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。IL-10可用于促进激活的人B细胞的生长和分化，抑制Th1应答以阻止移植物排异和T细胞介导的自身免疫疾病。O′Farrell等.，EMBO J.17：1006(1998)；Kanbayashi等.，Cell Immunol.171：153(1996)；Fukushima等.，Br.J.Ophthalmol.90：1535(2006)；和van Lent等.，Ann.Rheum.Dis.66：334(2007)描述了抗-IL10抗体的制备。美国专利第7,326,567号公开了IL-10抗体的多核苷酸序列。美国专利第5,837,232号公开了用抗-IL-10抗体治疗B-细胞介导自身免疫疾病的方法。
细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)家族蛋白形成调节细胞因子信号传导的经典负反馈系统的一部分。Alexander等.Cell 98：597(1999)描述了细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1)是干扰素-γ信号传导的关键抑制剂，并阻止该细胞因子可能的致命新生儿作用。Hilton等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：114(1999)讨论了SOCS1参与通过JAK/STAT3途径传导信号的细胞因子的负调节。Ohya等.J.Biol.Chem.272：27178(1997)描述了SOCS蛋白表现为通过白介素6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)信号传导的主要调节物。美国专利第6,534,277号公开了抗-SOCS1抗体的制备和使用方法，其中编码SOCS1抗体的核酸序列引入细胞，从而细胞或其后代表达该抗体，然后为治疗作用体内给予重组细胞。美国专利号6,323,317和7,049,418还公开了抗-SOCS1抗体。
TGF-α是能结合EGF受体并与TGF-β协同作用以促进软琼脂中不依赖贴壁的细胞增殖的促有丝分裂多肽。Ellis等.，N.Engl.J.Med.317：158(1987)描述了TGF-α在黑色素瘤的某些伴癌表现中起作用。美国专利第4,742,003号和Xian等.，The J.of Histochem.& Cytochem.47：949(1999)描述了抗-TGF-α抗体的制备方法。
肿瘤坏死因子受体(TNFR1)和Fas均含有胞质死亡结构域的Fas-相关蛋白，其对于程序性细胞死亡(凋亡)和受体寡聚的Fas和TNF-诱导的信号传导至关重要。已鉴定到称为FADD的哺乳动物蛋白，其具有结合Fas受体的胞质区或结构域并抑制Fas介导凋亡的能力。FADD的多核苷酸序列可从公共数据库获得，其登录号是U24231，其氨基酸序列的登录号是AAA86517，这些序列通过引用纳入本文。美国专利号6,562,797B1描述了FADD片段或编码它的核酸，其是功能完整的天然FADD的显性阴性抑制剂。
序列表描述
SEQ ID NO：1是编码mIL-12和m-IL21的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是编码hIL-12和h-IL21的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是编码mIL-21和m-IL15的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是编码mIL-12的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是编码hIL-12和hIL-15的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是编码hIL-21的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是编码mIL-21的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是编码hIL-21的构建物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是编码mIL-21的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是mIL-21的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是编码mIL-15的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是mIL-15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是编码mIL-12的mp40的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：14是mIL-12的mp40的的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是编码mIL-12的mp35的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是mIL-12的mp35的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是编码hIL-21的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：18是hIL-21的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19是编码hIL-15的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：20是hIL-15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21是编码hIL-12的p40的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：22是hIL-12的p40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23是编码hIL-12的p35的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是hIL-12的p35的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是在果蝇(Drosophila)中发现的蜕皮素反应元件的核酸序列。
SEQ ID NO：26是在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中发现的蜕皮素反应元件的核酸序列。
SEQ ID NO：27是在黑腹果蝇中发现的蜕皮素反应元件的核酸序列。
SEQ ID NO：28寻靶内切核酸酶(HE)(I-SceI)的限制性位点。
SEQ ID NO：29是包含人IL-12编码序列的腺病毒载体的DNA序列：Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)。
发明详述
定义
除非另外定义，本文所用的所有本领域术语、符号和其他科学术语或专有名词都与本发明所属领域的技术人员所理解的常用意义相同。在某些情况下，为了澄清和/或为了便于参考和理解，本文以通常理解的意思定义了术语，本文的这种定义的内容不应被理解为必然意味着与本领域通常所理解的有实质差别。分子生物学术语和/或方法和/或方案通常所理解的定义可在Rieger等，《经典遗传学和分子遗传性词典》(Glossary ofGenetics：Classical and Molecular)，第5版，纽约SV出版社(Springer-Verlag：New York)，1991；Lewin，《基因V》(Genes V)，牛津大学出版社：纽约，1994；Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)以及Ausubel等，《当代分子生物学手册》(Current Protocols in Molecular Biology)(1994)中找到。使用商品化试剂盒和/或试剂过程中用到的方法通常按照厂家的指导和/或说明书和/或参数执行，除非另外说明。
出于本发明的目的，术语“分离的”指已从其原始环境(其天然存在的环境)中提取出来的生物学材料(细胞、核酸或蛋白质)。例如，以天然状态存在于植物或动物内的多核苷酸不是分离的，但是当同一多核苷酸从其天然存在的临近核酸中分离出来后就被认为是“分离的”。
适用于生物学材料的术语“纯化的”不要求该材料的存在形式显示绝对纯度，排除其它化合物的存在。其不过是一种相对的定义。
“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，指单链形式或双链螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或它们的任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅指该分子的一级和二级结构，并不将其局限于任何具体的三级形式。因此，该术语包括在线形或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋化DNA和染色体中发现的双链DNA，等等。讨论具体双链DNA分子的结构时，本文可根据沿DNA的非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)仅以5’到3’方向给出序列的正常惯例描述序列。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。DNA包括但不限于：cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。
应用于多核苷酸序列的术语“片段”指相对于参比核酸长度缩短并在共同部分包含与参比核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的这种核酸片段可以适当地包含在作为其成分的较大多核苷酸中。这种片段包含长度为至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多个本发明核酸的连续核苷酸的寡核苷酸或由它们构成。
本文所用的“分离的核酸片段”指单链或双链RNA或DNA聚合物，任选含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可包含cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段。
“基因”指包含编码功能分子的核苷酸的多核苷酸，包括仅通过转录(例如，生物活性RNA分子)或通过转录和翻译(例如，多肽)产生的功能分子。术语“基因”包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还指表达特定RNA、蛋白质或多肽的核酸片段，其包含在编码序列之前(5’-非编码序列)和之后(3’-非编码序列)的调控序列。“天然基因”指天然发现的包含其本身调控序列的基因。“嵌合型基因”指非天然基因的任何基因，其包含未在自然界中一起发现的调控和/或编码序列。因此，嵌合型基因可包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自同一来源的调控序列和编码序列，但排列方式不同于天然发现的。嵌合型基因可包含来自不同来源的编码序列和/或来自不同来源的调控序列。“内源性基因”指在生物体的基因组中其天然位置发现的天然基因。“外来”基因或“异源”基因指不是宿主机体中正常发现的，而是通过基因传递引入该宿主机体的基因。外来基因可包含插入非天然机体中的天然基因，或嵌合型基因。“转基因”是通过转化方法引入基因组的基因。例如，白介素-12(IL-12)基因编码IL-12蛋白。IL-12是35-kD亚基(p35)和40-kD亚基(p40)的异源二聚体，两个亚基以二硫键相连形成完整的功能性IL-12p70。IL-12基因编码p35和p40两个亚基。
“异源DNA”指不是天然位于细胞中，或细胞的染色体位点中的DNA。异源DNA可包括细胞的外来基因。
术语“基因组”包括染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
当单链形式的核酸分子可在合适的温度和溶液离子强度的条件下与另一核酸分子退火时，称该核酸分子可与该另一核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA“杂交”。杂交和洗涤条件是本领域熟知的，例子见Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(1989)，特别是其中的第11章和表格11.1。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严谨性”。
可调整严谨性条件以筛选适度相似的片段，例如远亲生物体的同源性序列，筛选高度相似片段，例如复制极其相关生物体的功能酶的基因。对于初步筛选同源性核酸，可采用对应于Tm为55℃的低严谨性杂交条件，例如，5XSSC、0.1％SDS、0.25％奶，无甲酰胺；或者30％甲酰胺、5X SSC、0.5％SDS。中等严谨性杂交条件对应于较高的Tm，例如，40％甲酰胺，和5X或6X SSC。高度严谨性杂交条件对应于最高Tm，例如50％甲酰胺，5X或6X SSC。
杂交要求两个核酸含有互补序列，虽然取决于杂交的严谨性，但碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述能彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明还包括与本文所公开或所用完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互补的分离核酸片段。
在本发明的一个实施方式中，采用包括在Tm为55℃实施杂交步骤的杂交条件并利用上述条件检测多核苷酸。在其它实施方式中，Tm是60℃、63℃或65℃。
杂交后洗涤也决定了严谨性条件。一组条件采用一系列洗涤，开始为6XSSC、0.5％SDS，室温下15分钟(min)；然后替换为2X SSC、0.5％SDS、45℃，30分钟；然后是0.2X SSC、0.5％SDS，50℃，30分钟，重复两次。优选的一组严谨性条件利用较高的温度，其中洗涤与上述相同，除了在0.2XSSC、0.5％SDS中的最后两次30分钟洗涤的温度升高至60℃。优选的另一组高严谨性条件采用65℃，在0.1X SSC、0.1％SDS中进行最后两次洗涤。
杂交核酸的适度严谨性取决于本领域熟知的变量，即核酸长度和互补程度。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性越高，具有那些序列的核酸杂交体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已有计算Tm的方程(参见Sambrook等，同上，9.50-0.51)。对于与较短核酸，即寡核苷酸杂交，错配的位置更重要，寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
在本发明的一个实施方式中，采用杂交条件检测多核苷酸，所述杂交条件包括在低于500mM盐和至少37℃进行杂交步骤，在2X SSPE中，至少63℃温度进行洗涤步骤。在另一实施方式中，杂交条件包括在低于200mM盐和至少37℃进行杂交步骤。在又一个实施方式中，杂交条件包括杂交和洗涤步骤均为2X SSPE和63℃。
在另一实施方式中，可杂交核酸的长度是至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最低长度优选至少约15个核苷酸；例如至少约20个核苷酸；例如至少30个核苷酸。此外，技术人员应知道可根据诸如探针长度等因素，视需要调节温度和洗涤溶液盐浓度。
术语“探针”指可与互补的单链靶核酸碱基配对形成双链分子的单链核酸分子。
本文所用的术语“寡核苷酸”指可与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分子杂交的短核酸。寡核苷酸可以作标记，例如32P-核苷酸，或是已共价偶联了标记物，例如生物素的核苷酸。标记的寡核苷酸可用作探针来检测核酸的存在。寡核苷酸(其中一条和两条可作标记)可用作PCR引物，用于克隆全长核酸或其片段、用于DNA测序或用于检测核酸的存在。寡核苷酸还可用于和DNA分子形成三螺旋。通常合成制备寡核苷酸，优选用核酸合成仪。因此，可将寡核苷酸制备成含非天然产生的磷酸酯类似键，例如硫酯键等。
“引物”指与靶核酸序列杂交以形成双链核酸区域的寡核苷酸，该区域可用作合适条件下DNA合成的起点。这种引物可用于聚合酶链式反应或DNA测序中。
“聚合酶链式反应”缩写成PCR，指酶促扩增特定核酸序列的体外方法。PCR包括一系列重复的温度循环，其中每个循环包括3个阶段：模板核酸变性以分离靶分子诸链，单链PCR寡核苷酸引物与模板核酸退火，和DNA聚合酶使得退火引物延伸。PCR提供检测核酸的初始组合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量条件下测定靶分子相对量的方法。
“逆转录-聚合酶链式反应”缩写成RT-PCR，指从一种或多种RNA分子酶促产生一种或多种cDNA靶分子，然后酶促扩增上述一种或多种cDNA靶分子内一种或多种特定核酸序列的体外方法。RT-PCR还提供检测核酸的初始组合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量条件下测定靶分子相对量的方法。
DNA“编码序列”指编码多肽的双链DNA序列，当其置于合适调控序列的控制下，能在细胞中体内或体外转录和翻译成多肽。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、其中或下游(3’非编码序列)的核酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不限于：原核生物序列、来自mRNA的cDNA、基因组DNA序列和甚至是合成DNA序列。如果编码序列要在真核细胞中表达，聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’。
“开放读框”缩写成ORF，指一定长度的核酸序列，可以是DNA、cDNA或RNA，其包含翻译起始信号或起始密码子，例如ATG或AUG和终止密码子，其有翻译成多肽序列的可能。
本文利用术语“头-对-头”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的5’端毗连另一多核苷酸的编码链的5’端时，该两条多核苷酸以头-对-头取向布置，从而各多核苷酸的转录方向以远离另一多核苷酸的5’端的方向进行。术语“头-对-头”可缩写为(5’)-到-(5’)，还可以符号(←→)或(3’←5’5’→3’)表示。
本文利用术语“尾-对-尾”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的3’端毗连另一多核苷酸的编码链的3’端时，该两条多核苷酸以尾-对-尾取向布置，从而各多核苷酸的转录方向朝另一多核苷酸进行。术语“尾-对-尾”可缩写为(3’)-到-(3’)，还可以符号(→←)或(5’→3’3’←5’)表示。
本文利用术语“头-对-尾”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的5’端毗连另一多核苷酸的编码链的3’端时，该两条多核苷酸以头-对-尾取向布置，从而各多核苷酸的转录方向与另一多核苷酸的转录方向相同。术语“头-对-尾”可缩写为(5’)-到-(3’)，还可以符号(→→)或(5’→3’5’→3’)表示。
术语“下游”指相对参比核苷酸序列3’定位的核苷酸序列。具体地说，下游核苷酸序列通常涉及转录起点后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起点的下游。
术语“上游”指相对参比核苷酸序列5’定位的核苷酸序列。具体地说，上游核苷酸序列通常涉及位于编码序列或转录起点的5’侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起点的上游。
术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”可互换使用，指能结合双链DNA内的特定核苷酸序列并在其中进行切割的酶。
“同源重组”指将外来DNA序列插入另一DNA分子，例如将载体插入染色体。载体优选靶向用于同源重组的特异性染色体位点。对于特异性同源重组，载体可含有足够长的染色体序列的同源性区域，从而载体能互补结合并掺入染色体。同源性区域越长，序列相似性越高可提高同源重组的效率。
可采用本领域已知的几种方法来扩增本发明的多核苷酸。一旦确立合适的宿主系统和生长条件，可大量扩增和制备重组表达载体。如本文所述，可用的表达载体包括但不限于以下载体或它们的衍生物：人或动物病毒，例如痘病毒或腺病毒；昆虫病毒，例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ噬菌体)和质粒及粘粒DNA载体，等等。
“载体”指用于将核酸克隆和/或传递入宿主细胞的任何运载体。载体可以是可与另一DNA区段相连从而复制所连区段的复制子。“复制子”指用作DNA体内复制的自主单元，即能在其本身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于在体外、离体或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒运载体。本领域已知的大量载体可用于操作核酸、将反应元件和启动子掺入基因，等等。可能的载体包括，例如质粒或修饰的病毒，包括，例如噬菌体，如λ噬菌体衍生物，或质粒，如pBR322或pUC质粒衍生物，或Bluescript载体。可用于本发明的载体的另一例子是如WO 2007/038276所述的弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司(Intrexon Corp.，Blacksburg，VA)的UltraVectorTM产生系统。例如，可通过将合适DNA片段连接入具有互补粘性末端的所选载体实现将对应于反应元件和启动子的DNA片段插入合适载体。或者，可对DNA分子的两端作酶促修饰，或者可通过将核苷酸序列(接头)连接入DNA末端来产生任何位点。这种载体可经工程改造而含有可选择标记基因以供选择已将标记掺入细胞基因组的细胞。这种标记能鉴定和/或选择掺入标记并表达其所编码蛋白质的宿主细胞。
病毒载体，特别是逆转录病毒载体已用于细胞以及活的动物对象中的各种基因递送应用。可用的病毒载体包括但不限于：逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、E-B病毒、腺病毒、双粒病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、荷电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。除核酸外，载体还可包含一个或多个调控区域和/或用于选择、检测和监测核酸传递结果(传递至何种组织、表达持续时间等)的可选择标记。
术语“质粒”指常携带基因的染色体外元件，其不是细胞中间代谢的一部分，通常是环状双链DNA分子的形式。这种元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA，线形、环状或超螺旋的自发复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列连接或重组入独特构建物中，该构建物能将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3’非翻译序列引入细胞。
“克隆载体”指“复制子”，其是单位长度的核酸，优选DNA，其顺序复制并包含复制起点，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一核酸区段可与其相连从而能复制所连接的区段。克隆载体能在一类细胞中复制，在另一类中表达(穿梭载体)。克隆载体可包含一条或多条序列以便用于选择包含该载体的细胞和/或一个或多个多克隆位点以便插入感兴趣序列。
术语“表达载体”指载体、质粒或运载体，其设计成能在转化入宿主后表达所插入的核酸序列。克隆的基因，即，插入的核酸序列通常置于调控元件，例如启动子、最小启动子、增强子等的控制下。可用于驱动核酸在所需宿主细胞中表达的启动调控区或启动子多种多样，并为本领域技术人员所熟悉。基本上能驱动这些基因表达的任何启动子可用于表达载体，包括但不限于：病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、病因或疾病相关启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、光调节启动子(light regulated promoter)；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、碱性磷酸酶启动子(用于在酵母(Saccharomyces)中表达)；AOX1启动子(用于在毕赤酵母(Pichia)中表达)；β-内酰胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc启动子(用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达)；光调节-、种子特异性-、花粉特异性-、子房特异性的、花椰菜花叶病毒35S、CMV 35S最小、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、枝条-特异性、根特异性、几丁质酶、应激诱导型、水稻东格鲁杆状病毒、植物超级启动子、马铃薯亮氨酸氨肽酶、硝酸盐还原酶、甘露碱合酶、胭脂碱合酶、泛素、玉米蛋白和花青甙启动子(可用于在植物细胞中表达)；本领域已知的动物和哺乳动物启动子，包括但不限于SV40早期(SV40e)启动子区域、劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复(LTR)中所含的启动子、腺病毒(Ad)的E1A启动子或主要晚期启动子(MLP)基因、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子的调控序列和转录调控区、遍在启动子(ubiquitouspromoter)(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间丝的启动子(索蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)、治疗基因的启动子(MDR、CFTR或VIII型因子等的)、病因或疾病相关启动子、和显示组织特异性并已用于转基因动物中的启动子，例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区；白蛋白基因、在肝中有活性的Apo AI和ApoAII调控区、在肝中有活性的甲胎蛋白基因调控区、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区、在骨髓细胞中有活性的β-球蛋白基因调控区、在大脑的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱蛋白基因调控区、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区、和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因调控区、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白的启动子、平滑肌细胞α-肌动蛋白的启动子，等等。此外，可通过加入增强子或调节序列等来修饰这些表达序列。
可通过本领域已知的方法，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、利用基因枪或DNA载体运输蛋白将载体引入所需的宿主细胞(参见，例如Wu等，J.Biol.Chem.267：963(1992)；Wu等，J.Biol.Chem.263：14621(1988)；和Hartmut等，加拿大专利申请号2,012,311)。
还可通过脂质转染体内引入本发明的多核苷酸。在过去10年，利用脂质体在体外包装和转染核酸逐渐增多。可利用合成的阳离子脂质制备用于体内转染编码标记的基因的脂质体，该脂质设计成能减少脂质体介导转染遇到的困难和危险(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：7413(1987)；Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027(1988)；和Ulmer等，Science 259：1745(1993))。使用阳离子脂质可促进包装带负电的核酸，还促进与带负电细胞膜融合(Felgner等，Science 337：387(1989))。WO95/18863、WO96/17823和U.S.5,459,127描述了传递核酸特别有用的脂质化合物和组合物。采用脂质转染将外源性基因体内引入特定组织具有一定实际优点。脂质体分子靶向特定细胞代表了一类优点。直接转染特定细胞类型明显在具有细胞异质性的组织，例如胰腺、肝脏、肾脏和脑中特别理想。可为靶向目的将脂质与其它分子化学偶联(Mackey等，1988，同上)。可将靶向的肽，例如激素或神经递质和蛋白质，例如抗体，或非肽分子化学偶联于脂质体。
其它分子也可用于促进核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(如WO95/21931)、衍生自DNA结合蛋白质的肽(如WO96/25508)或阳离子聚合物(如WO95/21931)。
还可能将载体作为裸DNA质粒体内引入(参见，美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。还可采用受体介导的DNA递送方法(Curiel等，Hum.Gene Ther.3：147(1992)；和Wu等，J.Biol.Chem.262：4429(1987))。
术语“转染”指细胞摄取外源性或异源的RNA或DNA。当这种RNA或DNA被引入细胞时，称该细胞被外源性或异源的RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA实现表型改变时，称细胞被外源性或异源RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA可以整合(共价相连)入构成细胞基因组的染色体DNA。
“转化”指将核酸片段传递入宿主生物体的基因组，从而导致遗传学稳定的遗传性。含有转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因”或“重组”或“转化”的生物体。
此外，包含本发明多核苷酸的重组载体可包含它们要在其中扩增或表达的细胞宿主的一个或多个复制起点，标记或可选择标记。
术语“可选择标记”指鉴定因子，通常是能基于标记基因的作用而选择的抗生素或化学耐受基因(即耐受抗生素、耐受除草剂)、比色标记、酶、荧光标记等，其中该作用用于示踪感兴趣核酸的遗传性和/或鉴定遗传了该感兴趣核酸的细胞或生物体。本领域已知并使用的可选择标记的例子包括：提供氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨酰膦除草剂、磺酰胺等耐受性的基因；和用作表型标记的基因，即，花青甙调节基因、异戊烯转移酶基因(isopentanyl transferase gene)等。
术语“报告基因”指编码能依据报告基因的作用而得到鉴定的鉴定因子的核酸，其中该作用用于示踪感兴趣核酸的遗传性，鉴定已遗传了感兴趣核酸的细胞或生物体，和/或检测基因表达诱导或转录。本领域已知并使用的报告基因的例子包括但不限于：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。可选择标记基因也可视作报告基因。
“启动子”和“启动子序列”可互换使用，指能控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。编码序列通常位于启动子序列的3’端。启动子可以完全来自天然基因，或由来自天然发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应知道不同启动子可在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或对不同环境或生理条件起反应而指导基因表达。导致基因在大多数细胞类型中，在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。导致基因在特定细胞类型中表达的启动子通常称为“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。导致基因在特定发育或细胞分化阶段表达的启动子通常称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。在用诱导启动子的药剂、生物分子、化学品、配体、光等接触或用这些物质处理细胞后得到诱导并导致基因表达的启动子通常称为“诱导型启动子”或“可调节启动子”。还应知道，由于在大多数情况中，调控序列的确切边界并未完全限定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
在本发明的任何载体中，载体任选包含本文公开的启动子。在一个实施方式中，所述启动子是本文表1所列的启动子。
在本发明的任何载体中，载体任选包含组织特异性启动子。在一个实施方式中，所述组织特异性启动子是本文公开的组织特异性启动子。在另一实施方式中，所述组织特异性启动子是本文表2所列的组织特异性启动子。
启动子序列在其3’末端通常结合有转录起始位点并向上延伸(5’方向)，从而包含在可检测背景水平启动转录所需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列中可发现转录起始位点(通过，例如核酸酶S1作图不难限定)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
“治疗开关启动子”(TSP)指控制基因开关组件表达的启动子。本文它处详细描述了基因开关和它们的各种组件。在某些实施方式中，TSP是组成型的，即组成型活化的。组成型TSP可以是组成型遍在的(即，在任何组织或细胞中广泛起作用，无需其它因子或调节剂)或组成型组织或细胞特异性的(即，在特定组织类型或细胞类型中广泛起作用，无需其它因子或调节剂)。在某些实施方式中，本发明的TSP在疾病、病症或病状相关条件下活化。在涉及两种或更多种TSP的本发明某些实施方式中，启动子可以是组成型或可活化启动子的组合。本文所用的“在疾病、病症或病状相关条件下活化的启动子”包括但不限于：疾病-特异性启动子、对特定生理、发育、分化或病理状况起反应的启动子、对特定生物分子起反应的启动子和对疾病、病症或病状相关的特定组织或细胞类型，例如肿瘤组织或恶性细胞起反应的启动子。TSP可包含天然产生启动子的序列、衍生自天然产生启动子的修饰序列或合成序列(例如，将反应元件插入最小启动子序列来改变启动子的反应性)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后经反式RNA剪接(如果编码序列含有内含子)并翻译成该编码序列所编码的蛋白质时，称编码序列受到细胞中转录和翻译调控序列的“控制”。
“转录和翻译调控序列”指在宿主细胞中表达编码序列的DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等。在真核细胞中，聚腺苷酸化信号是调控序列。
术语“反应元件”指一个或多个顺式作用的DNA元件，其赋予受与转录因子的DNA结合结构域相互作用介导的启动子反应性。该DNA元件的序列可以是回文的(完美或不完美的)，或者其由被数量不同的核苷酸隔开的序列基序或半位点构成。半位点可以是相似或相同的，排列成正向或反向重复或排列成一个半位点或串联的毗连半位点的多聚体。依据要掺入反应元件的细胞或生物体的性质，反应元件可包含从不同生物体分离的最小启动子。有或没有配体存在下，转录因子的DNA结合结构域结合反应元件的DNA序列以启动或阻遏受该反应元件调节的下游基因转录。天然蜕皮素受体的反应元件的DNA序列的例子包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO：25)(参见Cherbas等，Genes Dev.5：120(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一个或多个间隔核苷酸(SEQ ID NO：26)(参见D′Avino等，Mol.Cell.Endocrinol.113：1(1995))；和GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO：27)(参见Antoniewski等，Mol.Cell Biol.14：4465(1994))。
术语“操作性连接”指核酸序列与一个核酸片段的结合，使得一个的功能受另一个的影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时(即，该编码序列受启动子的转录控制)，称该启动子操作性连接于该编码序列。编码序列可以正义或反义方向操作性连接于调节序列。
本文所用的术语“表达”指通过衍生自核酸或多核苷酸的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还指将mRNA翻译成蛋白质或多肽。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”指可插入核酸或多核苷酸特定限制性位点或通过同源重组获得的DNA区段。DNA区段包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且将盒和限制性位点设计成能确保该盒插入合适的读框以供转录和翻译。“转化盒”指包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且除该多核苷酸外，还具有有助于转化具体宿主细胞的元件的特定载体。本发明的盒、表达盒、基因表达盒和转化盒还可包含能增强编码感兴趣多肽的多核苷酸在宿主细胞中表达的元件。这些元件可包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、反应元件、终止序列、聚腺苷酸化序列等。
出于本发明的目的，术语“基因开关”是指启动子相关的反应元件与配体依赖性转录因子系统的组合，在存在一种或多种配体的情况下，转录因子系统可调节有反应元件和启动子掺入的基因的表达。术语“编码基因开关的多核苷酸”是指启动子相关的反应元件与编码配体依赖性转录因子系统的多核苷酸的组合，在存在一种或多种配体的情况下，转录因子系统可调节有反应元件和启动子掺入的基因的表达。
本发明的治疗开关启动子可以是可用于治疗、缓解或预防特定疾病、病症或病状的任何启动子。例子包括但不限于：只在特定疾病、病症或病状期间显示表达增加的基因的启动子和在特定细胞条件下(例如，增殖、凋亡、pH改变、氧化状态、氧水平)显示表达增加的基因的启动子。在基因开关包含多条转录因子序列的一些实施方式中，可通过组合疾病或病症-特异性启动子与组织或细胞类型特异性启动子以限制表达治疗产物的组织从而增加该治疗方法的特异性。因此，治疗开关启动子的定义包括组织-或细胞类型-特异性启动子。
作为疾病特异性启动子的例子，治疗癌症有用的启动子包括致癌基因的启动子。致癌基因类别的例子包括但不限于：生长因子、生长因子受体、蛋白激酶、程序性细胞死亡调节因子和转录因子。致癌基因的具体例子包括但不限于：sis、erb B、erb B-2、ras、abl、myc和bcl-2及TERT。其它癌症相关基因的例子包括肿瘤相关抗原基因和在肿瘤细胞中过表达的其它基因(例如，MAGE-1、癌胚抗原、酪氨酸酶、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn和汤普森-弗莱德里系抗原(Thompson-Friedenreich antigen)(TF))。
表1和2所列参考文献公开了本领域已知并可用作本发明治疗开关启动子的启动子序列和其它调节元件(例如增强子)，以及各启动子相关的疾病/病症(表1)或组织特异性(表2)。这些参考文献中公开的启动子序列通过引用全文纳入本文。
表1
Figure BPA00001388484100391
Figure BPA00001388484100401
表2
Figure BPA00001388484100411
在特定疾病或病症期间显示表达水平改变，因此可提供用于本发明的启动子的其它基因包括但不限于表3所列的基因(连同相关的疾病/病症)。
表3
Figure BPA00001388484100421
Figure BPA00001388484100441
Figure BPA00001388484100461
Figure BPA00001388484100471
一旦鉴定到表达模式在疾病、病症或病状期间受调节的基因，该基因的启动子可用于本发明的基因开关中。许多基因的序列，包括启动子区域是本领域已知的并可从公开数据库，例如GenBank获得。因此，一旦鉴定到合适的基因，则不难鉴定和获得启动子序列。本发明的另一方面涉及鉴定可分离其启动子并置于基因开关中的合适基因。因此，基因的身份对于本发明的具体实施方式不是至关重要的，只要该启动子能分离并可用于随后的配置和环境中。因此，本发明包括利用尚未鉴定的基因的启动子。一旦鉴定了合适的基因，那么测定启动子功能所需的遗传序列只是常规技术或实验的问题。实际上，有几种可商品化购得的方法协助测定感兴趣基因的启动子区域。例如，Ding等最近通过使得人Sprouty4基因的5′-侧接序列逐渐缺失而阐明了新型Sprouty4基因的启动子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287：L52(2004)，其通过引用纳入本文)。简言之，一旦测定了转录起始位点，则利用普通PCR引物产生PCR片段，从而以单向方式克隆5’-侧接区段的区段。将产生的区段克隆入萤光素酶受体载体，检测萤光素酶活性来测定人Sprouty4基因的启动子区域。
获取和验证基因启动子的另一示范性方法包括以下步骤：(1)获得组织类型相似/相同的患病和未患病细胞/组织样品；(2)分离该样品的总RNA或mRNA；(3)对患病和未患病RNA实施差别微阵列分析；(4)鉴定候选疾病-特异性转录物；(5)鉴定疾病特异性转录物相关的基因组序列；(6)获得或合成该疾病特异性DNA的预计转录起点上游和下游的DNA序列；(7)利用步骤6所得不同长度的DNA设计和产生启动子报道载体；和(8)检验患病和未患病细胞/组织以及无关细胞/组织中的启动子报告基因载体。
插入基因开关的启动子的来源可以是天然或合成的，启动子的来源应不限于本文所述的本发明范围。换言之，可从细胞直接克隆启动子，或者早已从不同来源克隆的启动子，或者可以合成启动子。
基因开关系统
基因开关可以是通过加入或除去特定配体而调节基因表达的任何基因开关。在一个实施方式中，基因开关是其中基因表达水平依赖于存在的配体水平的基因开关。可用于本发明基因开关中的配体依赖性转录因子复合物的例子包括但不限于：由其各自配体活化的核受体超家族的成员(例如，糖皮质激素、雌激素、黄体酮、类视黄醇、蜕皮素及其类似物和模拟物)和四环素活化的rTTA。在本发明的一方面。基因开关是基于EcR的基因开关。这种体系的例子包括但不限于：美国专利号6,258,603、7,045,315、美国专利申请公布号2006/0014711、2007/0161086和国际申请公布号WO 01/70816所述的系统。嵌合型蜕皮素受体系统的例子描述于美国专利号7,091,038、美国专利申请公布号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416和国际申请公布号WO 01/70816、WO 02/066612、WO02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO2005/108617，各自通过引用全文纳入本文。非类固醇蜕皮素激动剂-调节的系统的例子是马萨诸塞州伊普斯威奇市新英格兰生物实验室的RheoSwitch
Figure BPA00001388484100481
哺乳动物诱导型表达系统(RheoSwitch
Figure BPA00001388484100482
Mammalian InducibleExpression System，New England Biolabs，Ipswich，MA)。在本发明的另一方面，基因开关基于FK506结合蛋白(FKBP)与FBBP雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的异二聚化，并通过雷帕霉素或其非免疫抑制性类似物调节。这种系统的例子包括但不限于：马萨诸塞州剑桥ARIAD药物公司的ARGENTTM转录技术(ARGENTTM Transcriptional Technology，ARIAD Pharmaceuticals，Cambridge，MA)和美国专利号6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757和6,649,595描述的系统。
在一个实施方式中，基因开关包含在治疗开关启动子控制下编码配体依赖性转录因子复合物的一条转录因子序列。该转录因子序列可编码天然产生的配体依赖性转录因子复合物或人工配体依赖性转录因子复合物。人工转录因子是其中转录因子的天然序列被改变，例如通过序列突变或通过组合不同转录因子的结构域获得的转录因子。在一个实施方式中，转录因子包含H组核受体配体结合结构域。在一个实施方式中，H组核受体配体结合结构域来自蜕皮素受体、遍在受体(UR)、孤儿受体1(OR-1)、类固醇激素核受体1(NER-1)、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15(RIP-15)、肝X受体β(LXRβ)、类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)、肝X受体(LXR)、肝脏X受体α(LXRα)、类法呢醇X受体(FXR)、受体相互作用蛋白14(RIP-14)、或法呢醇受体(HRR-1)。在另一实施方式中，H组核受体LBD来自蜕皮素受体。
A.基于蜕皮素的基因开关
EcR和其它H组核受体是核受体超家族的成员，其中所有成员的特征通常在于存在任选融合于异二聚伴侣(HP)以形成共活化蛋白(CAP)的氨基-末端反式激活域(AD，也可互换称为TA或TD)，DNA结合结构域(DBD)和经绞链区融合于DBD的LBD从而形成配体依赖性转录因子(LTF)。本文所用的术语“DNA结合结构域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列，到最多DNA结合蛋白的全长，只要DNA结合结构域能起到结合特定反应元件的作用。核受体超家族的成员的特征还在于存在4或5个结构域：A/B、C、D、E，和在一些成员中的F(参见US 4,981,784和Evans，Science 240：889(1988))。“A/B”结构域对应于反式激活域，“C”对应于DNA结合结构域，“D”对应于绞链区，和“E”对应于配体结合结构域。该家族的一些成员还可在LBD的羧基末端侧具有对应于“F”的另一反式激活域。
以下多肽序列报道为蜕皮素受体(蜕皮类固醇受体)(20-羟基-蜕皮素受体)(20E受体)(EcRH)(核受体亚家族1H组成员1)的多肽序列，其Genbank登录号为P34021。
黑腹果蝇(果蝇)的蜕皮素受体(878aa)(SEQ ID NO：5)
Figure BPA00001388484100491
DBD的特征在于存在两个半胱氨酸锌指，在其间是两个氨基酸基序，P-盒和D-盒，其赋予反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或是异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。与该核受体家族的亚组相似，EcR还具有未明确确定的负责异源二聚特性的区域。因为核受体的结构域在自然界中是模块，LBD、DBD和TD可互换。
在另一实施方式中，转录因子包含AD、识别与要调节其表达的治疗蛋白或治疗多核苷酸相关的反应元件的DBD和H组核受体LBD。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
在另一实施方式中，基因开关包含在第一治疗开关启动子(TSP-1)控制下的第一转录因子序列，例如CAP和在第二治疗开关启动子(TSP-2)控制下的第二转录因子序列，例如LTF，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成蛋白质复合物(LDTFC)，即，“双重开关”或“双杂交体”基因开关。第一和第二TSP可以相同或不同。在该实施方式中，基因开关中存在治疗分子表达所需的两种不同TSP提高了治疗方法的特异性(参见图2)。图2还证明通过插入合适的TSP能修饰治疗基因开关从而简单地治疗任何疾病、病症或病状。
在又一个实施方式中，该第一和第二转录因子序列，例如CAP或LTF在一个治疗开关启动子(例如，图1中的TSP-1)的控制下。活化该启动子会产生含一个开放读框的CAP和LTF。利用转录接头，例如IRES(内部核糖体进入位点)可实现。在该实施方式中，配体依赖性转录因子复合物的两部分是TSP-1活化后合成的。TSP-1可以是组成型启动子或只在疾病、病症或病状相关条件下活化。
在又一个实施方式中，一个转录因子序列，例如LTF在只在疾病、病症或病状相关条件下活化的治疗开关启动子(例如，图4中的TSP-2或TSP-3)的控制下，而另一转录因子序列，例如CAP在组成型治疗开关启动子(例如，图4中的TSP-1)的控制下。在该实施方式中，配体依赖性转录因子复合物的一部分是组成型存在的，而第二部分只在疾病、病症或病状相关条件下合成。
在另一实施方式中，一个转录因子序列，例如CAP在第一TSP(例如，图3中的TSP-1)的控制下，而两个或更多个不同的第二转录因子序列，例如LTF-1和LTF-2在不同TSP(例如，图3中的TSP-2和TSP-3)的控制下。在该实施方式中，LTF各自可具有识别不同因子调节的启动子序列的不同DBD(例如，DBD-A结合因子调节启动子-1(FRP-1)相关反应元件，DBD-B结合因子调节启动子-2(FRP-2)相关反应元件)。各因子调节启动子可操作性连接于不同治疗基因。以此方式，可同时提供多种治疗。
在一个实施方式中，第一转录因子序列编码包含AD、识别与要调节其表达的治疗产物序列相关的反应元件的DBD和H组核受体LBD的多肽，第二转录因子序列编码包含核受体LBD的转录因子，所述LBD选自：脊椎动物类维生素A受体(RXR)、无脊椎动物RXR、超螺旋蛋白(USP)、或包含至少两个不同核受体配体结合结构域多肽片段的嵌合型核受体，其中所述片段选自：脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP(参见WO 01/70816A2和US 2004/0096942A1)。“伴侣”核受体配体结合结构域还可包含截短突变、缺失突变、取代突变或另一修饰。
在另一实施方式中，基因开关包含编码第一多肽的第一转录因子序列和编码第二多肽的第二转录因子序列，所述第一多肽包含核受体LBD和识别与要调节其表达的治疗产物序列相关的反应元件的DBD，而所述第二多肽包含AD和核受体LBD，其中核受体LBD之一是H组核受体LBD。在优选的实施方式中，所述第一多肽基本上不含AD，所述第二多肽基本上不含DBD。出于本发明的目的，“基本上不含”表示所述蛋白含有的所述结构域的序列不足以提供活化或结合活性。
在本发明的另一方面，第一转录因子序列编码包含异二聚伴侣和AD的蛋白(CAP)，第二转录因子序列编码包含DBD和LBD的蛋白(LTF)。
当只有一个核受体LBD是H组LBD，另一核受体LBD可以来自与H组LBD构成二聚体的任何其它核受体。例如，当H组核受体LBD是EcRLBD时，另一核受体LBD“伴侣”可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超螺旋蛋白(USP)、或包含至少两个不同核受体LBD多肽片段的嵌合型核受体，所述片段选自脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR或USP(参见通过引用全文纳入本文的WO 01/70816A2，国际专利申请号PCT/US02/05235和US 2004/0096942A1)。“伴侣”核受体配体结合结构域还可包含截短突变、缺失突变、取代突变或另一修饰。
在一个实施方式中，脊椎动物RXR LBD来自人(智人(Homo sapiens))、小鼠(家鼠(Mus musculus))、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(原鸡(Gallusgallus))、猪(家猪(Sus scrofa domestica))、蛙(爪蟾(Xenopus laevis))、斑马鱼(鮐(Danio rerio))、海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)、或水母(Tripedaliacysophora)RXR。
在一个实施方式中，无脊椎动物RXR配体结合结构域来自蝗虫(Locusta migratoria)超螺旋多肽(“LmUSP”)、硬蜱(美洲钝眼蜱(Amblyommaamericanum))RXR同源物1(“AmaRXR1”)、硬蜱(美洲钝眼蜱)RXR同源物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹(Celuca pugilator)RXR同源物(“CpRXR”)、甲虫(黄粉甲虫(Tenebrio molitor))RXR同源物(“TmRXR”)、蜜蜂(Apis mellifera)RXR同源物(“AmRXR”)、蚜虫(Myzus persicae)RXR同源物(“MpRXR”)、或非-双翅类/非-鳞翅类RXR同源物。
在一个实施方式中，嵌合型RXR LBD包含至少两个选自下组的多肽片段：脊椎动物物种RXR多肽片段、无脊椎动物物种RXR多肽片段和非-双翅类/非-鳞翅类无脊椎动物物种RXR同源物多肽片段。本发明所用的嵌合型RXR配体结合结构域可包含至少两个不同物种的RXR多肽片段，或者当物种相同时，两个或更多个多肽片段可以来自该物种RXR多肽片段的两种或更多种不同的同种型。
在一个实施方式中，嵌合型RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物物种的RXR多肽片段和一个无脊椎动物物种的RXR多肽片段。
在另一实施方式中，嵌合型RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物物种的RXR多肽片段和一个非-双翅类/非-鳞翅类无脊椎动物物种的RXR同源物多肽片段。
当配体与核受体的LBD联用，受体进而结合与治疗产物序列相关FRP的反应元件时，其能外在瞬时调节治疗产物序列的表达。本发明各种组分彼此结合的结合机制或顺序，即，例如配体与LBD结合，DBD与反应元件结合、AD与启动子结合等不重要。
在具体的实例中，配体结合H组核受体的LBD及其核受体LBD伴侣使得治疗产物序列表达。该机制不排除配体结合H组核受体(GHNR)或其伴侣，以及导致活性同源二聚体复合物(例如GHNR+GHNR或伴侣+伴侣)形成的可能性。优选改变受体结构域中的一个或多个从而产生杂合基因开关。该三个结构域，DBD、LBD和AD中的一个或多个通常可从与其它结构域来源不同的来源选择，从而能在所选宿主细胞或生物体内为反式激活活性、与配体互补结合和识别特异性反应元件而优化杂交基因和得到的杂交蛋白。此外，可用其它DNA结合蛋白质结构域，例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature 335：563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell43：729(1985))的反应元件或与蛋白质靶向相互作用的特异性合成反应元件来修饰或取代反应元件本身来容纳杂合受体，所述蛋白质是为这种特异性相互作用而设计、修饰和选择的(参见，例如Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：3616(1997))。双杂交系统的另一优点是它们能根据所需的最终结果选择用于驱动基因表达的启动子。这种双重控制在基因治疗领域尤其重要，特别是当产生细胞毒性蛋白时，因为既可控制表达的时机又可控制发生表达的细胞。当操作性连接于合适启动子的基因引入对象的细胞时，该外源性基因的表达受到本发明系统存在的控制。启动子可以是组成型或诱导型调节的，或者可以是组织-特异性的(即，只在特定细胞类型中表达)或是生物体的某些发育阶段特异性的。
有或没有配体存在下，第一杂交蛋白的DNA结合结构域结合反应元件的DNA序列以启动或阻遏该反应元件调节下的下游基因转录。
功能性LDTFC，例如EcR复合物还可包含其它蛋白质，例如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1)也可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非依赖性伴侣。此外，可能需要其它辅因子，例如通常称为辅助活化物(也称为衔接头或介导物)的蛋白质。这些蛋白质不序列特异性地结合DNA，也不涉及基础转录。它们可通过各种机制对转录活化施加其影响，包括刺激活化物的DNA-结合，通过影响染色质结构，或通过介导活化物启动复合物相互作用。这种辅助活化物的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及泛宿主性辅助活化物C反应元件B结合蛋白，CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。蛋白质辅因子通常也称为辅阻遏物(也称为阻遏物、沉寂子或沉默介导物)，其可能是没有配体存在下有效抑制转录活化所需。这些辅阻遏物可与未结合配体(unliganded)的EcR相互作用以使得反应元件活性沉默。目前的证据提示配体结合改变了受体的构象，从而导致辅阻遏物释放和上述辅助活化物募集，藉此消除它们的沉默活性。辅阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT(综述参见Horwitz等，Mol Endocrinol.10：1167(1996))。这些辅因子可以是细胞或生物体内源性的，或者可以是作为转基因而外源性加入从而以调节或未调节的方式表达。
B.基于雷帕霉素的基因开关
本发明还提供利用FK506结合蛋白作为配体依赖性转录因子复合物和利用雷帕霉素作为配体的基因开关系统。在一个实施方式中，编码基因开关的构建物包含：
(a)编码第一嵌合蛋白的第一多核苷酸，所述蛋白结合雷帕霉素或其类似物并包含至少一个FK506-结合蛋白(FKBP)结构域和至少一个与其异源的蛋白质结构域，其中FKBP结构域包含选自以下的肽序列：
(1)天然产生的FKBP
(2)天然产生的FKBP的变体，其中有最多10个氨基酸残基缺失、插入或被取代氨基酸替换，和
(3)DNA序列编码的FKBP，所述DNA序列与编码(1)或(2)所述FKBP的DNA序列选择性杂交；
(b)编码第二嵌合蛋白的第二多核苷酸，所述蛋白与(a)雷帕霉素或雷帕霉素类似物和(b)所述第一嵌合蛋白形成复合物，并包含至少一个FKBP：雷帕霉素结合(FRB)结构域和至少一个异源蛋白结构域，其中FRB结构域包含选自以下的肽序列：
(4)天然产生的FRB结构域，
(5)天然产生的FRB结构域的变体，其中有最多10个氨基酸残基缺失、插入或被取代氨基酸替换，和
(6)DNA序列编码的FRB结构域，所述DNA序列与编码(4)或(5)所述FRB的DNA序列选择性杂交。
在该基因开关系统中，第一多核苷酸和第二多核苷酸各自在一个或多个本文它处所述的治疗开关启动子的控制下。此外，在某些实施方式中，所述第一和第二嵌合蛋白质中FKBP和/或FRB结构域的至少一个异源蛋白结构域可以是一个或多个“作用”或“效应”结构域。效应结构域可以选自各种蛋白质结构域，包括DNA结合结构域、转录活化结构域、细胞定位结构域和信号传导结构域(即，能在群集或聚合后触发细胞生长、增殖、分化、凋亡、基因转录等的结构域)。
在某些实施方式中，一种融合蛋白含有至少一个DNA结合结构域(例如，GAL4或ZFHD1 DNA-结合结构域)，另一融合蛋白含有至少一个转录活化结构域(例如，VP16或p65转录活化结构域)。配体介导的融合蛋白结合代表转录因子复合物的形成并启动与融合蛋白之一上的DNA结合结构域所识别(即，能与之结合)的DNA序列相连的靶基因转录。美国专利号6,187,757B1、6,649,595B1、6,509,152B1、6,479,653B1和6,117,680B1公开了基因表达系统以及配体的信息。
在其它实施方式中，本发明提供包含多核苷酸的基因开关系统，所述多核苷酸编码在没有配体存在下自我凝聚的两种融合蛋白，其中(a)所述第一融合蛋白包含结合所选配体的条件型凝聚结构域和转录活化结构域，(b)所述第二融合蛋白包含结合所选配体的条件型凝聚结构域和DNA结合结构域，和(c)没有配体存在下，细胞表达操作性连接于调控DNA的基因，所述调控DNA结合所述DNA结合结构域。有配体存在下，包含基因开关系统的修饰细胞的扩增量足以阻遏该基因。除去配体诱导造成细胞死亡的所编码蛋白质表达。编码两种融合蛋白的核酸在至少一个条件型启动子的控制下。美国公布号2002/0048792公开了利用条件型凝聚结构域的基因表达系统。
C.基于原核阻遏子/操纵子的基因开关系统
在一个实施方式中，本发明提供了基因开关系统，包含：(a)编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸，该蛋白包含原核四环素(“tet”)阻遏子和真核转录激活蛋白结构域；和(b)编码治疗蛋白或治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接于最小启动子和至少一个tet操纵子序列。编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸可包含本文它处所述的治疗开关启动子。没有四环素存在下，致死性蛋白的表达上调(参见，例如Gossen等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：5547-5551；Gossen等，(1993)TIBS 18：471-475；Furth等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：9302-9306；和Shockett等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：6522-6526)。美国专利号5,464,758B1公开了TetO表达系统。
在另一实施方式中，基因开关系统包含细菌大肠杆菌(Escherichia coli)的乳糖(“Lac”)阻遏子-操纵子系统。本发明的基因开关系统还可包含：(a)编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸，其包含原核lac I阻遏子和真核转录激活蛋白结构域；和(b)编码治疗蛋白或治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接于治疗开关启动子。在Lac系统中，没有乳糖或者合成类似物，例如异丙基-b-D-硫代半乳糖苷存在下lac操纵子是失活的。
其它基因开关系统包括以下文献所述的：US 7,091,038；WO2004078924；EP1266015；US20010044151；US20020110861；US20020119521；US20040033600；US20040197861；US20040235097；US20060020146；US20040049437；US20040096942；US20050228016；US20050266457；US20060100416；WO2001/70816；WO2002/29075；WO2002/066612；WO2002/066613；WO2002/066614；WO2002/066615；WO2005/108617；US 6,258,603；US20050209283；US20050228016；US20060020146；EP0965644；US 7,304,162；US 7,304,161；MX234742；KR10-0563143；AU765306；AU2002-248500；和AU2002-306550。
D.基因开关系统的组合
本发明提供包含两种或更多种含有不同配体依赖性转录因子复合物的基因开关系统的核酸组合物、修饰细胞和生物反应器，所述转录因子复合物被有效量的一种或多种配体激活，其中所述两种或更多种基因开关系统包含第一基因开关和第二基因开关，二者在结合一种或多种配体后选择性诱导一种或多种治疗多肽或治疗多核苷酸表达。任何数量和/或组合的基因开关系统属于本发明范围。
在一个实施方式中，本发明提供包含以下的核酸组合物：
a第一基因开关系统，其包含：
i.包含编码第一杂交多肽的多核苷酸的第一基因表达盒，其包含：
1.反式激活域，其激活操作性连接于编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸的因子调节的启动子；和
2.异二聚伴侣结构域，
ii.包含编码第二杂交多肽的多核苷酸的第二基因表达盒，其包含：
1.DNA-结合结构域，其识别操作性连接于编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸的因子调节的启动子；和
2.配体结合结构域；和
iii.包含编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸的第三基因表达盒，其包含：
1.由所述第二杂交多肽的反式激活域激活的因子调节的启动子；和
2.编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸，和
b.第二基因表达系统，其包含：
i.包含编码第一杂交多肽的多核苷酸的第一基因表达盒，其包含：
1.反式激活域，其激活操作性连接于编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸的因子调节的启动子；和
2.异二聚伴侣结构域，
ii.包含编码第二杂交多肽的多核苷酸的第二基因表达盒，其包含：
1.识别操作性连接于编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸的因子调节的启动子的DNA-结合结构域；和
2.配体结合结构域；和
iii.包含编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸的第三基因表达盒，其包含：
1.由所述第二杂交多肽的反式激活域激活的因子调节的启动子；和
2.编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸。
多种可诱导基因表达系统在不同疾病、病症或病状相关条件下表达给定的治疗多核苷酸或治疗多肽，或者在相同疾病、病症或病状相关的相同条件下或在不同疾病、病症或病状相关的不同条件下表达多种治疗多肽或治疗多核苷酸。
在某些实施方式中，两种或更多种基因开关系统的组合可以是(1)基于双-开关蜕皮素受体的表达系统和(2)基于单-开关蜕皮素受体的基因开关。在其它实施方式中，该组合可以是(1)基于单-或双-开关蜕皮素受体的基因开关和(2)基于雷帕霉素的基因开关。或者，基因开关系统的组合可以是上述两个相同的基于雷帕霉素的基因开关。本发明包括基因开关系统的任何可能的组合。
配体
应用于基于LDTFC的基因开关，例如基于EcD复合物的基因开关的本文所用术语“配体”描述了小的可溶性分子，其具有激活基因开关以刺激其中编码的多肽表达的能力。本发明的配体依赖性转录因子复合物的配体结合包含配体结合结构域、异二聚伴侣结构域、DNA结合结构域和反式激活域中一个或多个的蛋白质复合物。选择激活配体依赖性转录因子复合物的配体取决于所用基因开关的类型。
配体的例子包括但不限于：蜕皮类固醇，例如蜕皮素、20-羟基蜕皮素、松甾酮A、米乐甾酮(muristerone A)等，9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N，N′-二酰基肼，例如美国专利号6,013,836；5,117,057；5,530,028；和5,378,726及美国申请公布号2005/0209283和2006/0020146公开的那些；美国申请公布号2004/0171651描述的
Figure BPA00001388484100581
二唑啉(oxadiazoline)；二苯甲酰基烷基氰基肼，例如欧洲申请号461,809公开的那些；N-烷基-N，N′-二芳酰基肼，例如美国专利号5,225,443公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼，例如欧洲申请号234,994公开的那些；N-芳酰基-N-烷基-N′-芳酰基肼，例如美国专利号4,985,461描述的那些；酰氨基酮(amidoketone)，例如美国申请公布号2004/0049037描述的那些；这些文献各自通过引用纳入本文，和其它类似的材料，包括3，5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷、氧基类固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆固醇-3-硫酸酯、金合欢醇(famesol)、胆汁酸、1，1-二膦酸酯、保幼激素III等。可用于本发明的二酰基肼配体的例子包括：RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)、RG-115932((R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见，例如通过引用全文纳入本文的美国专利申请序列号12/155,111和PCT申请号PCT/US2008/006757。
例如，可从任何合适的配体选择基于蜕皮素受体的基因开关的配体。天然产生的蜕皮素或蜕皮素类似物(例如，20-羟基蜕皮素、米乐甾酮A(muristerone A)、松甾酮(ponasterone)A、松甾酮B、松甾酮C、26-碘代松甾酮A、牛膝甾酮或26-甲磺酰基牛膝甾酮)和非类固醇诱导物可用作本发明基因开关的配体。美国专利号6,379,945B1描述了从烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)分离的昆虫类固醇受体(″HEcR″)，其可用作对类固醇和某些非类固醇诱导物起反应的基因开关。在该系统和对类固醇及非类固醇诱导物均起反应的许多其它系统中，非类固醇诱导物明显优于类固醇，原因众多，例如：生产成本较低、代谢稳定性、没有昆虫、植物或哺乳动物存在和环境上可接受。美国专利号描述了利用两种联苯甲酰肼、1，2-联苯甲酰基-1-叔丁基肼和虫酰肼(tebufenozide)(N-(4-乙基苯甲酰基)-N′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-N′-叔丁基肼)作为基于蜕皮素的基因开关的配体。本发明还包括其它联苯甲酰肼作为配体，例如美国专利号5,117,057B1所述的。美国专利号6,147,282还公开了利用虫酰肼作为黑腹果蝇的蜕皮素受体的化学配体。此外，蜕皮素配体的非限制性例子是3，5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷(harpagide)、1，2-二酰基肼、N′-取代的-N，N′-二取代的肼、联苯甲酰烷基氰基肼、N-取代的-N-烷基-N，N-二芳酰基肼、N-取代的-N-酰基-N-烷基，羰基肼或N-芳酰基-N′-烷基-N′-芳酰基肼(参见美国专利号6,723,531)。
在一个实施方式中，基于蜕皮素的基因开关系统的配体是二酰基肼配体或手性二酰基肼配体。基因开关系统中所用的配体可以是式I所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式：
式中：
A是烷氧基、芳基烷基氧基或芳氧基；
B是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和
R1和R2独立为任选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
在另一实施方式中，配体可以是式II所示对映体富集的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式：
式中：
A是烷氧基、芳基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
B是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和
R1和R2独立为任选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
前提是R1不等于R2；
其中携带R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要是S。
在某些实施方式中，配体可以是式III所示对映体富集的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式：
Figure BPA00001388484100603
式中：
A是烷氧基、芳基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
B是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和
R1和R2独立为任选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
前提是R1不等于R2；
其中携带R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要是R。
在一个实施方式中，配体可以是具有对映体过量为至少95％的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-肼或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式。
当与基于蜕皮素的基因开关系统联用时，式I所示二酰基肼配体和式II或III所示手性二酰基肼配体提供外部瞬时调节本发明治疗多肽或治疗多核苷酸表达的手段。参见2008年5月29日提交的美国申请号12/155,111，其通过引用完全纳入本文。
本发明所用的配体可形成盐。本文所用的术语“盐”表示用无机和/或有机酸和碱形成的酸性和/或碱性盐。此外，当式I、II或III所示化合物同时含有碱性部分和酸性部分时，可以形成两性离子(“内盐”)，其属于本文所用的术语“盐”。药学上可接受的(即，无毒、生理学上可接受的)盐可用于，例如制备期间可能采用的分离或纯化步骤中，但是其它盐也可用。可在介质中，通过，例如将化合物与一定量(例如相等量)的酸或碱反应来形成式I、II或II所示化合物的盐，所述介质可以是例如盐在其中沉淀的介质或在水性介质中然后冻干。
含有碱性部分的配体可与各种有机和无机酸形成盐。示范性酸加成盐包括乙酸盐(例如与乙酸或三卤代乙酸，如三氟乙酸形成的那些)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(与盐酸形成的)、氢溴酸盐(氢溴酸形成的)、氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐(马来酸形成的)、甲磺酸盐(甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如，硫酸形成的)、磺酸盐(例如，本文所述那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐，例如甲磺酸盐，十一烷酸盐等。
含有酸性部分的配体可与各种有机和无机碱形成盐。示范性碱性盐包括铵盐、碱金属盐，例如钠、锂和钾盐，碱土金属盐，例如钙和镁盐，有机碱的盐(例如，有机胺)，例如苄星青霉素(benzathine)、二环己基胺、哈胺(hydrabamine)(与N，N-二(脱氢松香基(abietyl))乙二胺形成)、N-甲基-D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖酰胺(glucamides)、叔丁胺、和与氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸等形成的盐。
利用FK506结合结构域的可诱导基因表达系统的配体的非限制性例子是FK506、环孢菌素A或雷帕霉素。美国专利号6,649,595B2和6,187,757公开了FK506、雷帕霉素和它们的类似物。也参见美国专利号7,276,498和7,273,874。
本文所述的配体可单独给予或作为包含药学上可接受的运载体的药物组合物的一部分给予。在一个实施方式中，药物组合物是溶液、混悬液、片剂、胶囊、软膏、酏剂或可注射组合物。
有关基因开关的术语“基于蜕皮素受体的”指包含天然的或合成的蜕皮素受体配体结合域的至少一个功能部分的基因开关，该基因开关可对结合蜕皮素受体配体结合域的配体起反应而调节基因的表达。蜕皮素反应性系统的例子在美国专利号7,091,038和6,258,603中有描述。在一个实施方式中，系统是RheoSwitch
Figure BPA00001388484100621
治疗系统(RTS)，该系统包含两个融合蛋白：突变的蜕皮素受体(EcR)的DEF区与Gal4 DNA结合域的融合蛋白以及嵌合型RXR的EF区与VP 16转录激活域的融合蛋白，在如图1所示的组成型启动子的控制下表达。
术语“调节”是指诱导、降低或抑制核酸或基因的表达，导致蛋白质或多肽合成的相应诱导、降低或抑制。
本发明的多核苷酸或载体还可以包含至少一个适于驱动基因在宿主细胞内表达的启动子。
可用于本发明的实施方式中的增强子包括而不限于：SV40增强子、巨细胞病毒(CMV)增强子、延伸因子1(EF1)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子等。
终止控制区，即终止子或聚腺苷酸化序列还可以来源于优选宿主天然的各种基因。终止位点非必需，但最优选包含终止位点。在本发明的一个实施方式中，终止控制区可包含或来源于合成的序列、合成的聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号、病毒终止子序列等。
术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”是指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，可包含聚腺苷酸化[poly(A)]识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的常见特征是可影响多聚腺苷酸向mRNA前体3’端的添加。
“调节区”是指可调节二级核酸序列表达的核酸序列。调节区可包含天然负责表达特定核酸的序列(同源区)或者包含负责表达不同蛋白或者合成蛋白的不同来源的序列(异源区)。更具体地说，序列可以是原核、真核或病毒基因的序列，或者是衍生序列，其以特异性或非特异性方式以及以可诱导或非可诱导的方式刺激或抑制基因转录。调节区包含复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和引导多肽进入靶细胞的分泌通道的信号序列。
“异源”来源的调节区是指与所表达核酸非天然相关的调节区。在异源调节区内包含不同物种的调节区、不同基因的调节区、杂合的调节序列以及本领域普通技术人员设计的自然界中不存在的调节序列。
“RNA转录物”是指RNA聚合酶催化转录DNA序列得到的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时称为初级转录物，RNA转录物也可以是初级转录物经过转录后加工形成的RNA序列，称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指不含内含子的能被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指来自于mRNA的并与该mRNA互补的双链DNA。“正义”RNA指包含mRNA的RNA转录物，因此能被细胞翻译成蛋白质。“反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全长或部分互补的RNA转录物，可阻断靶基因的表达。反义RNA的互补性可位于特定基因转录物的任何部分，即，在5’非编码序列、3’非编码序列或编码序列。“功能性RNA”是指反义RNA、核糖体RNA或不能被翻译但是对细胞过程有影响的其它RNA。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指由共价连接的氨基酸残基组成的聚合物。
“分离的多肽”、“分离的肽”或“分离的蛋白质”指基本不含在其天然状态下与其相关的那些化合物(例如，其它蛋白或多肽、核酸、碳水化合物、脂质)的多肽或蛋白质。“分离的”并不意味着排除与其它化合物的人工或合成混合物，或者存在不干扰其生物学活性的杂质，例如，杂质可因纯化不完全、添加稳定剂或向药学上可接受的制剂中添加化合物所致。
“取代突变型多肽”或“取代突变体”可理解为包含至少一个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的氨基酸取代的突变型多肽。取代突变型多肽可以只包含一个野生型或天然氨基酸取代，称为“点突变”或“单点突变”多肽。另外，取代突变型多肽可包含两个或更多个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的两个或多个氨基酸取代。根据本发明，包含取代突变的H组核受体配体结合域多肽包含至少一个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然H组核受体配体结合域多肽的氨基酸取代。
当取代突变型多肽包含两个或更多个野生型或天然氨基酸的取代时，该取代可包括为取代而缺失的等数目的野生型或天然氨基酸，即，两个野生型或天然氨基酸被两个非野生型或非天然的氨基酸取代，或者为取代而缺失的不同数目的野生型氨基酸，即，两个野生型氨基酸被一个非野生型氨基酸取代(取代+缺失突变)，或者两个野生型氨基酸被三个非野生型氨基酸取代(取代+插入突变)。
取代突变体可用缩写命名系统描述以显示参比多肽序列内被取代的氨基酸残基及其编号以及新取代的氨基酸残基。例如，多肽的第20个氨基酸残基被取代的取代突变体可以缩写成“x20z”，其中“x”是被取代的氨基酸，“20”是多肽内氨基酸残基的位置或编号，“z”是新取代的氨基酸。因此，可互换缩写成“E20A”或“Glu20Ala”的取代突变体是指多肽第20位的谷氨酸(在本领域中通常被缩写为“E”或“Glu”)被丙氨酸残基(在本领域中通常被缩写为“A”或“Ala”)。
取代突变可利用本领域熟知的任何诱变技术制备，其中包括而不限于体外定点诱变(Hutchinson等，J.Biol.Chem.255：6551(1978)；Zoller等，DNA 5：479(1984)；Oliphant等，Gene 44：117(1986)；Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.ScL USA 83：710(1986))，使用TAB
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连接子(法玛西亚公司(Pharmacia))，限制性内切酶消化/片段缺失和取代、PCR介导的/寡核苷酸定向诱变等。优选用以PCR为基础的技术进行定点诱变(参见Higuchi，1989，“利用PCR改造DNA”(″Using PCR to Engineer DNA″)，《PCR技术：原理及在DNA扩增中的应用》(PCR Technology：Principles and Applicationsfor DNA Amplification)，H.Erlich编，斯托克顿出版社(Stockton Press)，第6章，61-70页)。
用于多肽的术语“片段”指其氨基酸序列比参比多肽短的多肽，在这些参比多肽的完整序列上包含与其一致的氨基酸序列。合适情况下，此类片段可包含在较大的多肽内，成为较大多肽的一部分。本发明多肽的此类片段的长度可以是至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、300或更多个氨基酸。
多肽或蛋白质的“变体”是指衍生自多肽或氨基酸的任何类似物、片段、衍生物或突变体，它保留了多肽或蛋白质的至少一种生物特性。自然界中存在着多肽或蛋白质的不同变体。这些变体可以是等位基因突变，其特征是编码蛋白质的结构基因的核苷酸序列不同，或者包含不同的剪接或翻译后修饰。本领域技术人员能制备具有单个或多个氨基酸取代、缺失、插入或替代的变体。这些变体包括如下种类：(a)一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守氨基酸取代的变体，(b)一个或多个氨基酸被添加到多肽或蛋白质内的变体，(c)一个或多个氨基酸含有取代基的变体，和(d)多肽或蛋白质与另一多肽如血清白蛋白融合的变体。获得这些突变的技术是本领域普通技术人员熟知的，包括遗传学(抑制、缺失、突变等)、化学和酶学技术。在一个实施方式中，变体多肽包含至少约14个氨基酸。
术语“同源性“指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。通过本领域熟知的技术可确定一部分的序列与另一序列之间的对应性。例如，可比对序列信息来直接比较两个多肽之间的序列信息并利用已有的计算机程序确定同源性。另外，可以在适合同源区之间形成稳定双螺旋的条件下使多核苷酸杂交，然后利用一种或多种单链特异性核酸酶消化并确定被消化片段的大小来确定同源性。
本文所用的术语“同源的”的所有语法形式和拼写变化指具有“共同进化起源”的蛋白质之间的关系，包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白质和来自不同物种的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)(Reeck等，Cell 50：667(1987))。此类蛋白质(及其编码基因)具有序列同源性，这反映在其高度的序列相似性上。然而，在通常的应用和本申请中，当术语“同源的”用副词如“高度地”修饰时是指序列相似性但没有共同的进化起源。
因此，术语“序列相似性”的所有语法形式指具有或不具有共同进化起源的蛋白质的核酸或氨基酸序列之间的相同性或对应性程度(参见Reeck等，Cell 50：667(1987))。在一个实施方式中，当至少约50％(例如，至少约75％、90％或95％)的核苷酸在DNA序列给定长度上匹配时称两个DNA序列是“基本同源的”或“基本相似的”。可以利用序列数据库中已有的标准软件，或者Sourthern杂交实验，例如，在为该特定系统确定的严格条件下通过比较序列来鉴定基本同源的序列。确定合适的杂交条件是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，同上)。
本文所用的“基本相似”指核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变并导致一个或多个氨基酸被取代，但是未影响DNA序列所编码蛋白质的功能特性。“基本相似的”还指核酸片段，其中有一个或多个核苷酸碱基改变，但不影响核酸片段通过反义或共抑制技术介导基因表达发生变化的能力。“基本相似”还指本发明核酸片段上的修饰，如缺失或插入一个或多个核苷酸碱基，但是这种修饰不会实质影响得到的转录物的功能特性。因此，应当理解，本发明包括的序列要比具体示范的序列要多。打算的各种修饰都可以通过本领域的常规技术完成，同时保留编码产物的生物学活性。
此外，技术人员应当认识到，本发明包括的基本相似的序列还可以通过在严格条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，先用2X SSC、0.1％SDS然后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤)与本文所列举的序列杂交的能力来定义。本发明的基本相似的核酸片段是DNA序列与本文报道的核酸片段的DNA序列有至少约70％、80％、90％或95％相同的那些核酸片段。
当约40％以上的氨基酸是相同的或60％以上的氨基酸是相似的(功能相同的)时，两个氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。相似或同源的序列优选通过比对来鉴定，例如，利用GCG(计算遗传学体团公司(Genetics Computer Group)，《GCG软件包程序手册》(Program Manual forthe GCG Package)，7版，麦迪逊，威斯康辛州(Madison，Wisconsin)套装程序。
本文所用的术语“相应的”指相似或同源的序列，无论准确位置与测定相似性或同源性的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列比对可包含间隔。因此，术语“相应的”指序列相似性，并不代表氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
氨基酸或核苷酸序列的“实质部分”包含足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列用于推测性地鉴定该多肽或基因，通过本领域技术人员手工评价序列或利用算法如BLAST(局部序列比对基本检索工具；Altschul等，J.MoI.Biol.215：403(1993)，网址：ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)通过计算机自动序列比较和鉴定。一般而言，为了推测性地鉴定多肽或核酸序列与已知蛋白或基因同源需要10个或更多个连续氨基酸或30个或更多个核苷酸的序列。另外，对于核苷酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如，Southern杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬菌体斑的原位杂交)方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可用作PCR扩增引物以便获取包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“实质部分”包含足够的序列用于特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
本领域熟知的术语“相同性百分比”指通过比较序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列亲缘关系远近程度，如通过这种序列串之间的匹配确定的。利用已知的方法不难计算“相同性”和“相似性”，包括但不限于以下描述的那些方法：《计算机分子生物学》(Computational Molecular Biology)(Lesk，A.M.编辑)，牛津大学出版社，纽约(1988)；《生物计算：信息学和基因组工程》(Biocomputing：Informatics andGenome Projects)(Smith，D.W.编辑)，学术出版社，纽约(1993)；《序列数据的计算机分析》第I部分(Computer Analysis of Sequence Data)(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana出版社，新泽西(1994)；《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)(von Heinje，G.编辑)学术出版社(1987)；以及《序列分析引物》(Sequence AnalysisPrimer)(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)，Stockton出版社，纽约(1991)。测定相同性的优选方法能够给出被测序列之间的最佳匹配。测定相同性和相似性的方法已编在公开的计算机程序中。序列比对和相同性百分比计算可用序列分析软件完成，如LASERGENE生物信息学计算包的Megalign程序(DNA之星公司(DNASTAR Inc.)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)。序列的多重比对可用Clustal比对算法完成(Higgins等，CABIOS.5：151(1989))，使用默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)。利用Clustal方法进行成对比对可选择如下默认参数：KTUPLE 1，GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是已经商品化的或独立开发的。经典的序列分析软件包括但不限于GCG程序包(Wisconsin Package，9.0版，Genetics Computer Group(GCG)，麦迪逊，威斯康星州)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.MoI.Biol.215：403(1990))，和DNASTAR(DNASTAR有限公司，威斯康星州麦迪逊帕克大街1228号53715美国)。就本申请而言，应当清楚序列分析软件用于分析时得到的分析结果是基于参考程序的“默认值”得出的，除非另外说明。本文所用的“默认值”指在首次初始化时最初加载到软件上的任何数值或参数。
与DNA序列相关的“化学合成”指核苷酸组分在体外装配。人工化学合成DNA可利用已有方法完成，自动化学合成可利用多种商用机器中的一种完成。因此，根据反映宿主密码子偏好的核苷酸序列的优化可以改造基因以获得最佳的基因表达。技术人员知道如果使用宿主偏爱的密码子就可能获得成功的基因表达。可根据已有序列信息的宿主细胞来源的基因检测结果确定优选密码子。
在本文中，以下情况时称两个或更多个独立操作的基因调节系统是“正交的”：a)各给定系统由其各自选定浓度的配体调节，导致该系统的基因表达水平出现可检测的改变，和b)与细胞、组织或机体内同时操作的所有其它系统的表达改变相比，该改变有统计学意义上的差异，无论实际的调节是同时或者是先后发生。各独立操作的基因调节系统的调节优选使得基因表达改变，比细胞、组织或机体内所有操作的其它系统至少高2倍，例如，至少高5倍、10倍、100倍或500倍。理想地，各给定系统由其各自的配体在选定浓度下的调节使得该系统的基因表达水平发生可测量的改变，而在细胞、组织或机体内操作的所有其它系统的表达不产生可测量的改变。在这种情况下，多重可诱导基因调节系统称为“完全正交”。可用的正交配体和基于正交受体的基因表达系统在US 2002/0110861A中有描述。
术语“外源基因”表示对于对象外来的基因，即，通过转化过程引入对象的基因是内源性突变基因的未突变形式或内源性未突变基因的突变形式。转化方法并非本发明的关键，可以是本领域技术人员熟知的适合于对象的任何方法。外源基因可以是天然的或合成的基因，以DNA或RNA的形式引入对象，通过DNA中间体如通过反转录酶起作用。此类基因可引入靶细胞，直接引入对象或者通过将转化细胞转移到对象内而间接引入。
术语“治疗性产物”指能在表达这种产物的宿主细胞内发挥有益功能的治疗性多肽或治疗性多核苷酸。治疗性多肽可包括但不限于长度最少3个氨基酸的肽、单链或多链蛋白质以及融合蛋白。治疗性多核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸、小干扰RNA、核酶以及RNA外部引导序列。治疗性产物可包含天然序列、合成序列或天然序列和合成序列的组合。
术语“配体-依赖性转录因子复合物”或“LDTFC”指包含一个或多个蛋白质亚基的转录因子，该复合物能调节本文所述“因子调节的启动子”所驱动的基因表达。模型LDTFC是“蜕皮素受体复合物”，其通常指具有核受体家族的至少两个成员，蜕皮素受体(“EcR”)和超螺旋(ultraspiracle)(“USP”)蛋白的异源二聚蛋白质复合物(参见Yao等，Nature 366：476(1993))；Yao等，Cell 71：63(1992))。功能性LDTFC，例如EcR复合物还可包含其它蛋白质，例如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1或其它昆虫同源物)也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖性伴侣。LDTFC，例如EcR复合物还可以是EcR蛋白和超螺旋蛋白的脊椎动物同源物，视黄酸-X-受体(“RXR”)蛋白的异二聚体或USP和RXR的嵌合体。术语“LDTFC”和“EcR复合物”还包括EcR蛋白或USP的同质二聚复合物以及起到相同功能的单一多肽或三聚体、四聚体和其它多聚体。
可通过结合该复合物的蛋白质之一的活性蜕皮类固醇或非类固醇配体活化LDTFC，例如EcR复合物，包括EcR，但不排除该复合物的其它蛋白质。LDTFC，例如EcR复合物包含作为核受体超家族成员的蛋白质，其中所有成员的特征在于存在包含氨基-末端反式激活域(″AD″、″TD″或″TA″，在本文可互换使用)、DNA结合结构域(“DBD”)和配体结合结构域(“LBD”)的一个或多个多肽亚基。AD可表示含“异二聚伴侣”或“HP”的融合体。本文将本发明的包含AD和HP的融合蛋白称为“共活化蛋白”或“CAP”。DBD和LBD可表达为融合蛋白，本文中称为“配体诱导型转录因子”(“LTF”)。可通过接头，例如绞链区隔开融合伴侣。LTF家族的一些成员在LBD的羧基末端侧还可具有另一反式激活域。DBD的特征在于存在两个半胱氨酸锌指，在其间是两个氨基酸基序，P-盒和D-盒，其赋予蜕皮素反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或是异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。
构成外源性基因、反应元件和LDTFC，例如EcR复合物的DNA序列可掺入古细菌、原核细胞，例如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，或其它肠细菌，或真核细胞，例如植物或动物细胞。然而，基因表达的许多蛋白质在细菌中加工不正确，因此优选真核细胞。细胞可以是单细胞或多细胞生物体的形式。外源性基因、反应元件和受体复合物的核苷酸序列也可作为RNA分子掺入，优选功能性病毒RNA的形式，例如烟草花叶病毒。真核细胞中优选脊椎动物细胞，因为它们天然缺乏对EcR的本发明配体起反应的分子。所以，它们对于本发明配体“基本上不敏感”。因此，可用于本发明的配体对转化细胞或整个生物体的生理学或其它影响可以忽略。因此，细胞可生长并表达所需产物，而基本上不受配体本身存在的影响。
术语“蜕皮素受体复合物”通常是指包含核受体家族至少两个成员，蜕皮激素受体(“EcR”)和超螺旋蛋白(“USP”)，的异源二聚体蛋白复合物(参见Yao等，Nature 366：476(1993))；Yao等，Cell 71：63(1992))。功能性EcR复合物还可以包含其他蛋白，如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1或其它昆虫同源物)也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖性伴侣。EcR复合物还可以是EcR蛋白和超螺旋蛋白的脊椎动物同源物，视黄酸-X-受体(“RXR”)蛋白的异二聚体或USP和RXR的嵌合体。术语EcR复合物还包括EcR蛋白或USP的同质二聚复合物。
EcR复合物可通过有活性的蜕皮类固醇或非类固醇配体结合到复合物的一个蛋白上而活化，其中包括EcR，但是也不排除复合物的其他蛋白。在本文中，术语“配体”在用于以EcR为基础的基因开关时是指能够活化基因开关从而刺激其编码的多肽表达的可溶性小分子。配体的例子包括而不限于蜕皮类固醇，如蜕皮素、20-羟基蜕皮酮、松甾酮A、幕黎甾酮等，9-顺式维甲酸，维甲酸的合成类似物，N，N′-二酰肼，如美国专利号6,013,836；5,117,057；5,530,028和5,378,726以及已公开的美国专利申请号2005/0209283和2006/0020146所描述的那些；如已公开的美国专利申请号2004/0171651所描述的噁二唑啉；二苯甲酰烷基氰基肼类(dibenzoylalkylcyanohydrazine)如欧洲专利申请号461,809所描述的那些；N-烷基-N，N′-二芳酰基肼如美国专利申请号5,225,443所公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼如欧洲专利申请号234,994所公开的那些；N-芳酰基-N-烷基-N′-芳酰基肼如美国专利申请号4,985,461所公开的那些；酰氨基酮(amidoketone)如已公开的美国专利申请号2004/0049037所描述的那些；以及其他类似的材料，其中包括3，5-二叔丁酰基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕甙、羟固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸盐(ECHS)、7-酮胆固醇-3-硫酸盐、法尼醇、胆汁酸、1，1-双磷酸酯、保幼激素III等。可用于本发明的二酰基肼的例子包括RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)，RG-115932((R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)以及RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见2008年5月29日提交的美国专利申请12/155,111和2008年5月29日提交的PCT/US2008/006757所描述的可用于实现本发明的其他二酰基肼。
EcR复合物包括作为核受体超家族成员的蛋白质，其中所有成员所共有的特征是存在氨基端反式激活域(“TA”)、DNA结合域(“DBD”)和配体结合域(“LBD”)，它们中间被铰链区分开。该家族的某些成员可能在LBD的羧基端还含有另一个反式激活域。DBD的特征是存在两个半胱氨酸锌指，二者之间是两个氨基酸基序，P-盒以及D-盒，决定了蜕皮素反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的，也可以是经过修饰的，或者是异源受体蛋白不同区的嵌合体。
构成外源性基因、反应元件和EcR复合物的DNA序列可掺入古细菌、原核细胞，例如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌，或其它肠细菌，或真核细胞，例如植物或动物细胞。然而，基因表达的许多蛋白质在细菌中加工不正确，因此优选真核细胞。细胞可以是单细胞或多细胞生物体的形式。外源性基因、反应元件和受体复合物的核苷酸序列也可作为RNA分子掺入，优选功能性病毒RNA的形式，例如烟草花叶病毒。真核细胞中优选脊椎动物细胞，因为它们天然缺乏对EcR的本发明配体起反应的分子。所以，它们对于本发明配体“基本不敏感”。因此，可用于本发明的配体对转化细胞或整个生物体的生理学或其它影响可以忽略。因此，细胞可生长并表达所需产物，而基本上不受配体本身存在的影响。
EcR配体在与EcR复合物一起使用时，后者反过来会结合到与外源基因(例如，IL-12)相连的反应元件上，为外源基因表达的外部瞬时调节提供了方式。各种组分互相结合的顺序，即，配体与受体复合物的结合以及受体复合物和反应元件的结合，不是关键因素。一般来说，外源基因表达的调节是对EcR复合物与特异性的控制或调节DNA元件的结合所作出的反应。EcR蛋白与核受体家族的其他成员一样也包含至少三个结构域，激活域、DNA结合域和配体结合域。这个受体与核受体家族的一个亚群一样，也包含还未完全清楚的负责异源二聚化特性的区域。在USP或RXR蛋白异源二聚化后，配体与EcR蛋白配体结合域的结合可使异源二聚化蛋白的DNA结合域与活化形式的反应元件结合，从而导致外源基因的表达或抑制。这种机制并不排除配体与EcR或USP结合从而形成活化同源二聚体复合物(例如，EcR+EcR或USP+USP)的可能性。在一个实施方式中，一个或多个受体结构域可以被改变以形成嵌合的基因开关。一般来说，可从与其他结构域不同的来源中选择三个结构域中的一个或多个，这样在所选择的宿主细胞内嵌合受体在反式激活活性、配体的互补结合以及特异性反应元件的识别方面可以达到最佳化。另外，反应元件本身也可以被修饰或者用其他DNA结合蛋白结构域如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature335：563(1988)或大肠杆菌的LexA蛋白((参见Brent等，Cell 43：129(1985))的反应元件来取代以容纳嵌合的EcR复合物。嵌合系统的另一优点是可以根据想要达到的最终结果来选择启动子以驱动外源基因。这种双重控制在基因治疗领域是特别重要的，尤其是产生细胞毒性蛋白时，因为表达的时间选择以及产生表达的细胞都是可控的。当与合适启动子操作性相连的外源基因引入对象的细胞时，外源基因的表达可因本发明的配体的存在而受控制。启动子可以是组成型或诱导型调节的，或者是组织特异性的(即，只在特定类型的细胞内表达)或机体某些发育阶段特异性的。
在某些实施方式中，这些方法中描述的治疗性开关启动子是组成型的。在某些实施方式中，治疗性开关启动子在疾病、病症或症状相关的条件下激活，例如，启动子对疾病起反应、对特定生理、发育、分化或病理学状况起反应和/或对一种或多种特定生物学分子起反应而激活；和/或启动子在特定组织或细胞类型中激活。在某些实施方式中，所述疾病、病症或症状对治疗性多肽或多核苷酸有反应。例如，在某些非限制性实施方式中，治疗性多核苷酸或多肽用于治疗、预防、缓解、减轻症状，阻止进展或治愈疾病、病症或症状，但无需达到所有这些情况中的任一种。在某些实施方式中，引入第一和第二多核苷酸以便在疾病、病症或症状相关条件下表达配体依赖性转录因子复合物。在一个实施方式中，实施治疗方法以便表达治疗性多肽或治疗性多核苷酸并通过对象扩散至足以治疗、缓解或预防所述疾病、病症或症状的水平。本文所用的“扩散”表示多肽表达并从修饰的细胞充分释放从而在对象中有作用或活性。扩散可以是全身性、局部或介于二者之间。例如，治疗性多肽或治疗性多核苷酸可以经血流或淋巴系统全身性扩散。或者，治疗性多肽或治疗性多核苷酸可以在待治疗的组织或器官中局部扩散。
编码各种多肽如转录因子和报告蛋白的许多基因组和cDNA核酸序列是本领域熟知的。本领域技术人员可以得到几乎所有已知基因的核酸序列信息，从公共库或发表该序列的研究所直接获得核酸分子，或者利用常规方法制备分子。参见，例如，下文有关序列登录号的描述。
基因开关可以是通过加入或除去特定配体而调节基因表达的任何基因开关系统。在一个实施方式中，基因开关是其中基因表达水平依赖于存在的配体水平的基因开关。可用于本发明基因开关中的配体依赖性转录因子的例子包括但不限于：由其各自配体活化的核受体超家族的成员(例如，糖皮质激素、雌激素、黄体酮、类视黄醇、蜕皮素及其类似物和模拟物)和四环素活化的rTTA。在本发明的一方面。基因开关是基于EcR的基因开关。此类体系的例子包括但不限于：美国专利号6,258,603、7,045,315、美国专利申请公布号2006/0014711、2007/0161086和国际申请公布号WO 01/70816所述的系统。嵌合型蜕皮素受体系统的例子描述于美国专利号7,091,038、美国专利申请公布号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416和国际申请公布号WO 01/70816、WO 02/066612、WO02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO2005/108617，各自通过引用全文纳入本文。非类固醇蜕皮素激动剂-调节的系统的例子是马萨诸塞州伊普斯威奇市新英格兰生物实验室的Rheo Switch
Figure BPA00001388484100741
哺乳动物诱导型表达系统(RheoSwitch
Figure BPA00001388484100742
Mammalian InducibleExpression System，New England Biolabs，Ipswich，MA)。
在一个实施方式中，编码基因开关的多核苷酸包含启动子控制下编码配体依赖性转录因子的单个转录因子序列。转录因子序列可编码配体依赖性转录因子，该转录因子是天然的或人工的转录因子。人工的转录因子是天然序列已发生改变的转录因子，例如，通过序列突变或不同转录因子来源的结构域的组合。在一个实施方式中，转录因子包含H组核受体配体结合域(LBD)。在一个实施方式中，H组核受体LBD来源于EcR、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝脏X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝脏X受体、肝脏X受体α、类法呢醇X受体(farnesoid X receptor)、受体相互作用蛋白14或法尼醇受体。在另一实施方式中，H组核受体LBD来源于蜕皮素受体。
EcR和其他H组核受体是核受体超家族的成员，在该超家族内所有成员所具有的共同特征是存在氨基端反式激活域(TD)、DNA结合结构域(DBD)以及被铰链区从DBD分开的LBD。在本文中，术语“DNA结合结构域”包含DNA结合蛋白的最小多肽序列，一直到全长DNA结合蛋白，只要DNA结合结构域能起到结合特定反应元件的作用即可。核受体超家族成员的另一特征是存在4个或5个结构域：A/B、C、D、E，某些成员还存在F(参见US 4,981,784和Evans，Science 240：889(1988))。“A/B”结构域对应于激活域，“C”结构域对应于DNA结合结构域，“D”对应于铰链区，以及“E”对应于配体结合结构域。该家族的某些成员在LBD的羧基端还有另一个反式激活域，对应于“F”。
DBD的特征是存在两个半胱氨酸锌指，二者之间是两个氨基酸基序，P-盒以及D-盒，赋予反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的，经修饰的，或者是异源受体蛋白不同结构域的嵌合体。与核受体家族的亚组一样，EcR还包含负责异源二聚化特性的还未完全清楚的区域。由于核受体的结构域在自然界中是模块，因此LBD、DBD和TD之间可交换。
在另一实施方式中，转录因子包含TD、识别外源基因相关反应元件的DBD以及H组核受体LBD，其中外源基因的表达可被调节。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
在另一实施方式中，编码基因开关的多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成蛋白复合物，行使配体依赖性转录因子的功能，即，以“双开关”或“双杂合子”为基础的基因开关。第一和第二启动子可相同，也可不同。
在某些实施方式中，编码基因开关的多核苷酸还可包含一个启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中第一转录因子序列和第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成蛋白复合物，行使配体依赖性转录因子的功能，即，“单基因开关”。第一转录因子序列和第二转录因子序列可通过内部核糖体进入位点(IRES)相连。所述IRES可以是EMCVIRES。
在一个实施方式中，第一转录因子序列所编码的多肽包含TD、可识别外源基因相关的反应元件的DBD以及H组核受体LBD，其中外源基因的表达可被调节，第二转录因子序列所编码的转录因子包含选自脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD、超螺旋蛋白LBD和包含两个多肽片段的嵌合LBD的核受体LBD，其中第一多肽片段来自脊椎动物RXR LBD，第二多肽片段来自不同的脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD或超螺旋蛋白LBD。
在另一实施方式中，基因开关包含编码第一多肽的第一转录因子序列和编码第二多肽的第二转录因子序列，其中第一多肽包含核受体LBD和可识别其表达被调节的外源基因相关的反应元件的DBD，第二多肽包含TD和核受体LBD，其中一个核受体LBD是H组核受体LBD。在一个优选实施方式中，第一多肽基本不含TD，第二多肽基本不含DBD。出于本发明的目的，“基本不含”表示蛋白质不含提供活化或结合活性的足够结构域序列。
在本发明的另一方面，第一转录因子序列所编码的蛋白质包含异源二聚体伴侣和TD，第二转录因子序列所编码的蛋白质包含DBD和LBD。
当只有一个核受体LBD是H组LBD时，其它核受体LBD可以来自能和H组LBD形成二聚体的任何其它核受体。例如，当H组核受体LBD是EcR LBD时，其他核受体LBD“伴侣”可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超螺旋蛋白(USP)或包含至少两个选自脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP的不同核受体LBD多肽片段的嵌合核受体(参见WO01/70816A2、国际专利申请号PCT/US02/05235和US 2004/0096942A1)。“伴侣”核受体配体结合区还可包含截短突变、缺失突变、取代突变或其它修饰。
在一个实施方式中，脊椎动物RXR LBD来源于人(智人(Homosapiens))、小鼠(家鼠(Mus musculus))、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(原鸡(Gallus gallus))、猪(家猪(Sus scrofa domestica))、蛙(爪蟾(Xenopus laevis))、斑马鱼(鮐(Danio rerio))、海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)或水母(Tripedalia cysophora)RXR。
在一个实施方式中，无脊椎动物RXR配体结合区来自于蝗虫(飞蝗(Locusta migratoria))超螺旋多肽(“LmUSP”)、硬蜱(美洲钝眼蜱(Amblyommaamericanum))RXR同源物1(“AmaRXR1”)，硬蜱(美洲钝眼蜱(Amblyommaamericanum))RXR同源物2(“AmaRXR2”)，招潮蟹(Celuca pugilator)RXR同源物(“CpRXR”)，甲虫(黄粉甲虫(Tenebrio molitor))RXR同源物(“TmRXR”)，蜜蜂(Apis mellifera)RXR同源物(“AmRXR”)，蚜虫(烟蚜(Myzuspersicae))RXR同源物(“MpRXR”)，或非双翅类/非鳞翅类RXR同源物。
在一个实施方式中，嵌合RXR LBD包含至少两个选自下组的多肽片段：脊椎动物RXR多肽片段、无脊椎动物RXR多肽片段以及非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物RXR同源物多肽片段。可用于本发明的嵌合RXR配体结合结构域包含至少两个不同物种的RXR多肽片段，或者当物种相同时，两个或更多个多肽片段可来自该物种RXR多肽片段的两个或更多个不同亚型。
在一个实施方式中，嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物RXR多肽片段和一个无脊椎动物RXR多肽片段。
在另一实施方式中，嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物RXR多肽片段和一个非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物RXR同源物多肽片段。
配体在与核受体的LBD结合时，后者反过来会结合到与外源基因相连的反应元件上，这样就为外源基因表达的外部瞬时调节提供了方式。本发明的各种组分彼此结合的机制或顺序，即，例如，配体与LBD结合、DBD与反应元件结合、TD与启动子的结合等，不是关键因素。
在一个具体例子中，配体与H组核受体LBD及其核受体LBD伴侣的结合可启动外源基因的表达。这个机制并不排除配体与H组核受体(GHNR)或其伴侣结合并形成有活性的同源二聚体复合物的可能性(例如GHNR+GHNR，或伴侣+伴侣)。优选改变一个或多个受体结构域以形成杂合基因开关。一般来说，可从与其它结构域不同的来源中选择DBD、LBD和TD三个结构域中的一个或多个，这样优化了所选择的宿主细胞或机体内杂合基因及其产生的杂合蛋白的反式激活活性、配体的互补结合以及特异性反应元件的识别。此外，可用其它DNA结合蛋白质结构域，例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature 335：563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell 43：729(1985))的反应元件或与蛋白质靶向相互作用的特异性合成反应元件来修饰或取代反应元件本身以容纳杂合受体，所述蛋白质是为这种特异性相互作用而设计、修饰和选择的(参见，例如Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：3616(1997))。
功能性EcR复合物还可包含一种或多种其它蛋白质，例如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1)也可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非依赖性伴侣。此外，可能需要其它辅因子，例如通常称为辅助活化物(也称为衔接头或介导物)的蛋白质。这些蛋白质不序列特异性地结合DNA，也不涉及基础转录。它们可通过各种机制对转录活化施加其影响，包括刺激活化物的DNA-结合，通过影响染色质结构，或通过介导活化物启动复合物相互作用。这种辅助活化物的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及泛宿主性辅助活化物C反应元件B结合蛋白，CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。蛋白质辅因子通常也称为辅阻遏物(也称为阻遏物、沉寂子或沉默介导物)，其可能是没有配体存在下有效抑制转录活化所需。这些辅阻遏物可与未结合配体(unliganded)的EcR相互作用以使得反应元件活性沉默。目前的证据提示配体结合改变了受体的构象，从而导致辅阻遏物释放和上述辅助活化物募集，藉此消除它们的沉默活性。辅阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT(综述参见Horwitz等，Mol Endocrinol.10：1167(1996))。这些辅因子可以是细胞或生物体内源性的，或者可以是作为转基因而外源性加入从而以调节或未调节的方式表达。
外源性基因操作性连接于包含至少一个反应元件的启动子，该反应元件为基因开关编码的配体依赖性转录因子的DBD所识别。在一个实施方式中，启动子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多拷贝的反应元件。包含所需反应元件的启动子可以是天然产生的启动子或采用本领域熟知技术产生的人工启动子，例如操作性连接于最小启动子的一个或多个反应元件。
为将多核苷酸引入细胞，可利用载体。载体可以是，例如质粒载体或单链或双链RNA或DNA病毒载体。此类载体可以通过熟知技术引入细胞以便将DNA和RNA引入细胞。病毒载体可以是能复制的或复制缺陷型的。后一情况中，病毒通常只在互补的宿主细胞中增殖。本文所用的术语“宿主细胞”或“宿主”用于表示含有一种或多种本发明多核苷酸的本发明细胞。
因此，载体至少必须包含本发明多核苷酸。载体的其它组分可包括但不限于：可选择标记、染色质修饰结构域、驱动载体上还可能存在的其它多肽(例如，致死多肽)表达的其它启动子、基因组整合位点、重组位点和分子插入支点(molecular insertion pivot)。载体可在或不在该多核苷酸内包含任何数量的这些额外元件，从而该载体可为所需治疗方法的特定目标而作改进。
在本发明的一个实施方式中，引入细胞的载体还包含“可选择标记基因”，当其表达时，表示本发明的基因开关构建物已整合入宿主细胞的基因组。在此方式中，选择因子基因(selector gene)可以是基因组整合的阳性标记物。虽然对于本发明方法不是至关重要的，但选择因子基因的存在使得实施者能选择载体构建物已整合入细胞基因组的活细胞群。因此，本发明的某些实施方式包括选择载体已成功整合的细胞。当与细胞联用时，本文所用的术语“选择”或其改变形式，其应表示选择具有特定遗传组成或表型的细胞的标准熟知方法。典型的方法包括但不限于：有抗生素，例如G418、新霉素和氨苄青霉素存在下培养细胞。可选择标记基因的其它例子包括但不限于：赋予对二氢叶酸还原酶、潮霉素或霉酚酸耐受性的基因。选择的其它方法包括但不限于：允许利用胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或腺嘌呤磷酸核糖转移酶作为选择剂的可选择标记基因。然后包含含有一种或多种抗生素耐受性基因的载体构建物的细胞能耐受培养基中的抗生素。类似地，不包含含有一种或多种抗生素耐受性基因的载体构建物的细胞不能耐受培养基中的抗生素。
本文所用的“染色质修饰结构域”(CMD)指与维持和/或改变染色质结构相关的各种蛋白质相互作用的核苷酸序列，例如但不限于DNA绝缘子。参见Ciavatta等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.，103：9958(2006)。CMD的例子包括但不限于：鸡β-球蛋白绝缘子和鸡超敏位点4(cHS4)。例如，利用在一个或多个基因程序(gene program)之间不同的CMD序列(即，启动子、编码序列和3’调控区)有助于联用差别CMD DNA序列作为“最小同源臂”与各种微生物或体外重组技术，从而在现有多基因和单基因穿梭载体之间“交流”基因程序。染色质修饰结构域的其它例子是本领域已知或者容易鉴定的。
本发明所用的具体载体是编码蛋白质或多核苷酸的表达载体。这种载体通常包含操作性连接于待表达多核苷酸的顺式-作用调控区以便在宿主中有效表达。合适的反式作用因子由宿主、互补载体(complementing vector)或在引入宿主后由载体本身提供。
可利用各种表达载体表达蛋白质或多核苷酸。这种载体包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒，例如腺伴随病毒、慢病毒、杆状病毒、乳多空病毒，例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，以及衍生自它们组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件，例如粘粒和噬菌粒的那些载体。按照本发明的该方面，所有载体可用于表达。就此而言，适于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸或蛋白质的任何载体通常可用于表达。
表达载体中的多核苷酸序列操作性连接于合适的表达控制序列，包括例如指导mRNA转录的启动子。其它代表性启动子包括但不限于：组成型启动子和组织特异性或诱导型启动子。组成型真核生物启动子的例子包括但不限于：小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1：273(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature 290：304(1981))；和牛痘病毒启动子。可用于驱动蛋白质或多核苷酸表达的启动子的其它例子包括但不限于组织特异性启动子和特定蛋白质的其它内源性启动子，例如白蛋白启动子(肝细胞)、胰岛素原启动子(胰腺β细胞)等。表达构建物通常含有转录、起始和终止位点以及在转录区域中用于翻译的核糖体结合位点。构建物表达的成熟转录物的编码部分可包含开始处的翻译起始AUG，和适当位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
此外，构建物可含有调节以及引起表达的调控区。这些区域通常通过控制转录起作用，例如阻遏物结合位点和增强子等。
真核载体的例子包括但不限于：斯特拉塔基因公司(Stratagene)的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；安法玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和克隆技术公司(Clontech)的pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFP。许多其它载体是熟知且可商品化购得的。
包含分子插入支点以供快速插入和除去基因程序元件的尤其有用载体描述于：美国专利申请公布号2004/0185556、美国专利申请号11/233,246和国际申请公布号WO 2005/040336及WO 2005/116231。这种载体的例子是WO 2007/038276所述的弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司的UltraVectorTM产生系统。本文所用的“基因程序”是包含启动子(P)、表达序列(E)和3′调控序列(3)的遗传元件的组合，例如“PE3”是基因程序。该基因程序内的诸元件不难在侧接该基因程序各元件的分子支点之间交流。本文所用的分子支点定义为包含至少两个以线形方式排列的不可变罕有或稀有限制性位点的多核苷酸。在一个实施方式中，分子支点包含至少三个以线形方式排列的不可变罕有或稀有限制性位点。通常，任一分子支点不会包含同一基因程序中任何其它分子支点的罕有或稀有限制性位点。给定限制性酶在其上起作用的大于6个核苷酸的同源序列称为“罕有”限制性位点。然而，有的6bp限制性位点比统计学预计的更罕见，这些位点和切割它们的核酸内切酶称为“稀有”限制性位点。罕有或稀有限制性酶的例子包括但不限于：AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、Nru I、Acl I、Cla I、Csp45I、Age I、Bst1107 I、BstB I、Hpa I、Aat II、EcoR V、Nhe I、Spe I、Avi II、Avr II、Mfe I、Afe I、Fsp I、Kpn I、Sca I、BspE I、Nde I、Bfr I、Xho I、Pml I、ApaL I、Kas I、Xma I、BsrB I、Nsi I、Sac II、Sac I、Blp I、PspoMI、Pci I、Stu I、Sph I、BamH I、Bsu36 I、Xba I、BbvC I、Bgl II、Nco I、Hind III、EcoR I、BsrG I和Sse8781 I。
载体还可包含第二类限制性酶，称为归巢核酸内切酶(HE)的限制性位点。HE酶具有大的不对称限制性位点(12-40个碱基对)，它们的限制性位点是天然罕见的。例如，称为I-SceI的HE具有18bp的限制性位点(5′TAGGGATAACAGGGTAAT3′(SEQ ID NO：28))，预计在随机序列的每7x1010个碱基对中产生一个。这种发生率等于在哺乳动物基因组大小的20倍的基因组中只有一个位点。如果克隆载体质粒的适当位置包含HE位点，则HE位点的罕有特性极大增加了遗传工程师切割某基因程序而不破坏该基因程序完整性的可能性。
选择合适的载体和启动子在宿主细胞中表达是熟知的方法，载体构建和引入宿主及其在宿主中表达的必需技术是本领域的常规技术。
将多核苷酸引入细胞可以是瞬时转染、稳定转染，或者可以是基因座特异性插入载体。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法实现载体转染入宿主细胞的瞬时转染和稳定转染。许多标准实验室手册描述了这些方法，例如Davis等，《分子生物学基本方法》(Basic Methods in MolecularBiology)(1986)；Keown等，1990，Methods Enzymol.185：527-37；Sambrook等，2001，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约。这些稳定的转染方法导致载体随机插入细胞的基因组。此外，载体的拷贝数量和取向一般也是随机的。
在本发明的一个实施方式中，载体插入基因组的生物中立位点(bio-neutral site)。生物中立位点是基因组中多核苷酸的插入极少干扰(如果有的话)细胞正常功能的位点。可采用可得的生物信息学方法分析生物中立位点。许多生物中立位点是本领域已知的，例如ROSA-等价基因座。可采用本领域熟知的常规技术鉴定其它生物中立位点。采用本领域已知的方法鉴定基因组插入位点。为控制将载体引入细胞时多核苷酸的位置、拷贝数量和/或取向，可采用基因座特异性插入的方法。基因座特异性插入方法是本领域熟知的，包括但不限于：同源重组和重组酶介导的基因组插入。当然，如果本发明方法中要采用基因座特异性插入方法，载体可包含有助于这种基因座特异性插入，例如但不限于同源重组的元件。例如，载体可包含1、2、3、4或更多个基因组整合位点(GIS)。本文所用的“基因组整合位点”定义为载体序列的一部分，其核苷酸序列与允许载体插入基因组的细胞内的基因组诸部分相同或几乎相同。特别是，载体可包含至少侧接该多核苷酸的两个基因组插入位点。当然，GIS可侧接其它元件，甚至载体上存在的所有元件。
在另一实施方式中，可通过重组酶位点特异性基因插入进行基因座特异性插入。简言之，细菌重组酶，例如但不限于PhiC31整合酶可作用于人基因组内的“伪”重组位点。这些伪重组位点可以是利用重组酶的基因座特异性插入的靶点。重组酶-位点特异性基因插入描述于Thyagarajan等，Mol.Cell Biol.21：3926(2001)。重组酶的其它例子和它们可用于重组酶-位点特异性基因插入的各位点包括但不限于丝氨酸重组酶，例如R4和TP901-1和WO 2006/083253描述的重组酶。
在又一个实施方式中，载体可包含化学耐受性基因，例如多元抗药性基因mdr1、二氢叶酸还原酶或O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。化学耐受性基因可以在组成型(例如，CMV)或诱导型(例如，RheoSwitch
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)启动子的控制下。在该实施方式中，如果需要治疗对象的疾病而同时将修饰细胞维持在该对象中，临床医师可应用化疗剂来破坏患病细胞，而修饰细胞因表达合适的化学耐受性基因而免遭该化疗剂作用并且可继续用于治疗、缓解或预防疾病或病症。将化学-耐受性基因置于诱导型启动子控制下，可避免该化学耐受性基因不必要的表达，但如果需要持续治疗，其仍可用。如果修饰细胞本身变得患病，也可通过诱导致死性多肽表达来破坏它们，如下所述。
通过将编码基因开关和外源性基因的多核苷酸引入对象的细胞来实施本发明方法。可采用本领域已知的将多核苷酸引入细胞的任何已知方法，例如上述那些。
当要将多核苷酸离体引入细胞时，可通过本领域已知的任何技术获得对象的细胞，包括但不限于：活检、刮除术和外科组织取出。可以培养分离的细胞足够时间以使多核苷酸引入细胞，例如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小时或更长时间。短期培养原代细胞的方法是本领域熟知的。例如，可在平板(例如，微孔平板)中贴壁或悬浮培养细胞。
对于离体治疗方法，从对象分离细胞并在适于将多核苷酸引入细胞的条件下培养。一旦多核苷酸引入细胞，将该细胞温育足够的时间以使配体依赖性转录因子表达，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、或24小时或更长时间。在多核苷酸引入细胞后的某时间点(配体依赖性转录因子表达显著水平之前或之后)，将该细胞引回该对象。可通过本领域已知的任何方法实施重新引入，例如静脉内输注或直接注射入组织或体腔。在一个实施方式中，先测定细胞中是否存在多核苷酸，再将该细胞引回对象。在另一实施方式中，选择含有多核苷酸的细胞(例如，根据多核苷酸中可选择标记的存在)，只将含有该多核苷酸的那些细胞重新引入对象。细胞重新引入对象后，将配体给予对象以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸表达。在其它实施方式中，甚至可在细胞重新引入对象前将配体给予细胞，从而能在重新引入细胞之前表达治疗多肽或治疗多核苷酸。可通过任何合适的方法，全身性(例如，口服、静脉内)或局部(例如，腹膜内、鞘内、心室内、直接注射入重新引入细胞的组织或器官)给予配体。可仅采用常规技术测定各类细胞和疾病或病症的最佳配体给予时机。
本发明的体内治疗方法包括将多核苷酸直接体内引入对象的细胞。可将多核苷酸全身性或局部(例如，疾病或病症的部位)引入对象。一旦多核苷酸引入对象，可给予配体以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸的表达。可通过任何合适的方法，全身性(例如，口服、静脉内)或局部(例如，腹膜内、鞘内、心室内、直接注射入发生疾病或病症的组织或器官)给予配体。可仅采用常规技术测定各类细胞和疾病或病症的最佳配体给予时机。
对于体内应用，本文所述配体可以吸收入药学上可接受的运载体，例如溶液、悬液、片剂、胶囊、软膏、酏剂和可注射组合物。药物组合物可含有占重量百分比0.01％到99％的配体。组合物可以是单剂量或多剂量形式。任何具体的药物组合物中配体的含量应取决于有效剂量，即，引发所需基因表达或阻遏的所需剂量。
给予药物制品的合适途径包括口服、直肠、局部(包括经皮、口腔含化和舌下)、经阴道、胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、肿瘤内、皮内、鞘内和硬膜外)和经鼻胃管。本领域技术人员应理解优选的给药途径取决于所治疗的病症，可能会因例如受者的病症等因素而有所不同。
本文所用的术语“rAD.RheoIL12”指包含RheoSwitch
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治疗系统(RTS)的基因开关控制下的IL-12基因的腺病毒多核苷酸，其在有活化配体存在下能生成IL-12蛋白。本文所用的术语“rAD.cIL12”指包含组成型启动子控制下的IL-12基因的腺病毒多核苷酸控制载体。
本文所用的术语“IL-12p70”指IL-12蛋白，其天然形式含有两个亚基，通常被称作p40和p35。术语IL-12p70包括含有IL-12两个亚基(p40和p35)的融合蛋白，其中融合蛋白的两个亚基之间可包含接头氨基酸。
在本文中，术语“具有免疫调节剂的功能的蛋白质”指具有选自以下的免疫调节剂的任何生物学活性的至少20％(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)的蛋白质：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R或其亚基DN、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。同样，术语“具有IL-12功能的蛋白质”指具有人IL-12任何生物学活性的至少20％(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％)的蛋白质。此类免疫调节剂的生物学活性是熟知的。参见下表。
表4.免疫调节剂和它们的功能
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IL-12的生物学活性也是熟知的，包括但不限于原初T细胞分化成Th1细胞，刺激T细胞生长和功能，从T细胞和天然杀伤(NK)细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，降低IL-4介导的IFN-γ抑制，增强NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性，刺激IL-12R-β1和IL-12R-β2的表达，促进通过MHC I和II分子上调的肿瘤抗原呈递和抗血管生成活性。术语“具有IL-12功能的蛋白质”包括野生型IL-12序列的突变体以及模拟IL-12的一种或多种生物学活性的非-IL-12蛋白质，其中通过一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代改变所述野生型序列。
本文所用的术语“激活”指基因开关的细胞活性中任何可检测的增加，从而导致感兴趣基因的表达(例如，选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R或其亚基DN、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100)。
本文所用的术语“治疗”疾病指执行某种方案以图缓解疾病的征兆或症状，可包括将一种或多种药物或体外工程改造的细胞给予哺乳动物(人或非人)。因此，“治疗”无需理解成需要完全缓解征兆或症状，无需治愈，特别是包括对对象仅有边缘效应的方案。
本文所用的“免疫细胞”包括树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、天然杀伤细胞和淋巴细胞(例如，B和T细胞)。
本文所用的术语“树突细胞”和“DC”可互换使用。
本文所用的术语“治疗支持细胞”(TSC)指用本发明的载体修饰(例如，转染、电穿孔)的细胞，该细胞可将具有免疫调节功能的一种或多种蛋白和任选的具有IL-12功能的蛋白运送到肿瘤微环境中。这种TSC包括但不限于：干细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞。
本文所用的术语“体外工程改造的免疫细胞”或“体外工程改造的免疫细胞群”或“工程改造的免疫细胞群”或“表达免疫调节剂的免疫细胞”或“表达IL-12的免疫细胞”指免疫细胞，例如树突细胞，这些细胞在基因开关被活化配体活化时可条件性地表达基因开关控制下的免疫调节剂和/或IL-12。
本文所用的术语“体外工程改造的TSC”或“体外工程改造的TSC群”或“工程改造的TSC群”或“表达免疫调节剂的TSC”或“表达IL-12的TSC”指治疗支持细胞，例如干细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞，这些细胞在基因开关被活化配体活化时可条件性地表达基因开关控制下的免疫调节剂和/或IL-12。
本文所用的术语“修饰的细胞”指通过某种方法改进的细胞，所述方法包括但不限于：转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀和脂质转染(溶酶体融合)。
本文所用的术语“MOI”或“感染复数”指在具体实验中感染单个细胞的腺病毒粒子(例如，重组腺病毒或对照腺病毒)的平均数。
本文所用的术语“肿瘤”指体内或体外的所有良性或恶性细胞增生和增殖，无论是癌前病变细胞或癌细胞和/或组织。
本发明可治疗的癌症的例子包括：乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发脑癌、头颈癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌，非小细胞肺癌、头或颈癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌，前列腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食管癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾脏细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、绒毛膜癌、蕈样真菌病、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、多毛细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、真性红细胞增多症、原发血小板增多症、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、成骨肉瘤、原发巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤等。
本发明提供对细胞，例如免疫细胞和TSC作工程改造以条件性表达具有免疫调节剂功能和任选的IL-12功能的蛋白质以及治疗癌症或肿瘤或二者中的治疗性用途和/或应用。能条件性地表达具有免疫调节剂和任选的IL-12功能的蛋白质的体外工程改造免疫细胞和TSC，与一种或多种蛋白质的组成型生产相比是一种安全的改进。此外，对免疫调节剂和任选的IL-12表达的时间选择和水平的控制能力可以更有效地控制治疗效果。因此，体外工程改造的免疫细胞和TSC可制备成药物组合物，作为治疗人或非人机体的癌症或肿瘤的疗剂。或者，体外工程改造的免疫细胞群、TSC群或其亚群可用作载体将免疫调节剂和任选的IL-12蛋白产物条件性地转移到人或非人机体体内的特定区域(正常组织，癌或肿瘤)。免疫细胞可以是自身的或非自身的树突细胞。树突细胞可分离自骨髓或外周血循环。对于人类患者，树突细胞群可通过白细胞去除术分离，其中可将白细胞组分分离出来，并将其它血液组分回输到患者体内。
在另一实施方式中，树突细胞可通过用本发明载体转染人造血干细胞并使转染的干细胞分化成树突细胞来制备，其中本发明的载体可表达具有IL-12功能的蛋白质。参见美国专利6,734,014。
在一个实施方式中，提供含有基因开关的核酸腺病毒载体，其中VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列被EMCV内部核糖体进入位点(IRES)序列分开，被插入腺病毒穿梭载体内，受人泛素C启动子的控制。被IRES序列分开的IL-12p40和p35亚基的编码序列被插入泛素C启动子的上游，置于合成的诱导型启动子的控制之下。
在另一实施方式中，本发明提供了携带两个融合蛋白转录单位(VP16-RXR和Gal4-EcR)和可诱导IL-12亚基的穿梭载体，其中可诱导IL-12亚基在大肠杆菌BJ5183细胞内与腺病毒骨架(AdEasy1)重组。证明了重组克隆后，可在XL10-Gold细胞内扩增携带rAd.RheoIL12基因组的质粒并从中纯化，将质粒骨架消化下来以后通过转染入HEK 293细胞进行包装。
在一个具体实施方式中，得到的初级病毒储存液可通过再次感染HEK293细胞进行扩增，然后通过氯化铯密度梯度离心进行纯化。
在一个实施方式中，免疫调节剂和/或IL-12基因是野生型基因序列。在另一个实施方式中，免疫调节剂和/或IL-12基因是经过修饰的基因序列，例如，嵌合序列或已用优选密码子作修饰的序列。
在一个实施方式中，免疫调节剂和/或IL-12基因是人野生型序列。在另一实施方式中，序列与野生型人序列至少有85％相同性，例如，与野生型人序列有至少90％、95％或99％相同性。在另一实施方式中，基因序列编码人多肽。在另一实施方式中，基因编码的多肽与野生型人多肽至少有85％相同性，例如，与野生型人多肽具有至少90％、95％或99％相同性。
在一个实施方式中，IL-12基因是野生型小鼠IL-12序列。在另一个实施方式中，序列与野生型小鼠IL-12至少有85％相同性，例如，与野生型小鼠IL-12具有至少90％、95％或99％相同性。在另一实施方式中，IL-12基因序列编码小鼠IL-12多肽。在另一实施方式中，基因编码的多肽与野生型小鼠IL-12至少具有85％相同性，例如，与野生型小鼠IL-12具有至少90％、95％或99％相同性。
DC可分离自人、小鼠或其它哺乳动物的骨髓。树突细胞可分离自人、小鼠或其它哺乳动物的血液。对于人类患者，树突细胞群可通过本领域熟知的白细胞去除术分离，其中可将白细胞组分分离出来，并将其他血液组分回输到患者体内。在一个实施方式中，按照以前描述的方法(Tatsumi等，2003)从小鼠骨髓分离DC。简言之，野生型或EGFP Tg小鼠骨髓(BM)在添加1000单位/毫升重组小鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和重组mIL-4(新泽西州落基山制备技术公司(Peprotech，Rocky Hill，NJ))的条件培养基(CM)内培养，在37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养7天。然后分离CD11c+DC，例如，利用特异性MACSTM珠按照厂家的说明书操作(加州奥本市MB公司(Miltenyi Biotec，Auburn，CA))。根据形态学和CD11b、CD40、CD80和I类、II类MHC抗原的共表达情况分析，以这种方式制备出的CD11c+DC纯度可到达95％以上。
本发明的一个实施方式提供作为人或非人机体中基因治疗，适合治疗癌症或肿瘤或二者的治疗性应用的，条件性表达具有免疫调节剂和任选的IL-12功能的蛋白质的工程改造免疫细胞和TSC。在一个实施方式中，本发明提供含有具有开关的工程改造免疫细胞和TSC。
在另一实施方式中，本发明提供了包含蜕皮素受体至少一部分的工程改造免疫细胞和TSC。在另一实施方式中，本发明提供包含基于蜕皮素受体的基因开关的工程改造免疫细胞和TSC。在另一实施方式中，本发明提供包含RheoSwitch的工程改造免疫细胞和TSC。在另一实施方式中，本发明提供包含工程改造免疫细胞和TSC以及调节基因开关的配体的试剂盒，其中工程改造的免疫细胞和TSC包含基因开关。在另一实施方式中，试剂盒还包含二酰基肼配体。在另一实施方式中，试剂盒还包含RG-115830或RG-115932。
在一个实施方式中，本发明提供工程改造的免疫细胞和TSC群。在一个实施方式中，培养7天的DC用组成型或诱导型启动子控制的编码免疫调节剂和/或IL-12的重组腺病毒感染，或者用对照空载体腺病毒载体(rAdψ5)感染，用不同的感染复数(MOI)感染。48小时后，收获感染的DC并分析表型或利用特异性ELISA试剂盒(加州圣地亚哥BDP公司(BD-PharMingen，San Diego，CA))分析免疫调节剂和/或IL-12的产生，较低的检测水平为62.5pg/ml。
在另一实施方式中，本发明提供了包含载体如DNA载体，还包含激活配体的体外工程改造免疫细胞和TSC，其中载体包含能条件性地表达具有免疫调节剂和/或IL-12功能的蛋白质的基因开关。
在另一实施方式中，本发明提供治疗癌症，如黑色素瘤或神经胶质瘤的方法，该方法包括给予患者工程改造的DC，然后给予所述患者激活配体，例如RG-115919、RG-115830或RG-115932。患者可以是患癌症的人或动物。治疗方法以及产品、工程改造的细胞、试剂盒和配体已用于人的治疗和兽医治疗。因此，产品和方法可以考虑用于人和动物。
本发明一方面提供适于给予人或非人动物的药物组合物，其包含条件性表达具有免疫调节剂和/或IL-12功能的蛋白质的体外工程改造免疫细胞或TSC群，其中所述制剂适于通过肿瘤内给药。本发明还提供了包含激活配体如RG-115819、RG-115830或RG-115932的药物组合物，其中组合物适于通过腹膜内、口服或皮下给药。
在本文所述的特定实施方式中，本发明提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括以下顺序的步骤：
a.将体外工程改造的免疫细胞或TSC群肿瘤内给予哺乳动物；和
b.给予所述哺乳动物治疗有效量的激活配体。
在一个实施方式中，激活配体和体外工程改造的免疫细胞或TSC基本同时给予，例如，在给予细胞之前或之后的一小时内。在另一实施方式中，激活配体在给予体外工程改造的免疫细胞或TSC之后约24小时或不到24小时给予。在还有另一实施方式中，激活配体在给予体外工程改造的免疫细胞或TSC之后约48小时或不到48小时给予。在另一实施方式中，配体是RG-115932。在另一实施方式中，配体的给药剂量约为1-50mg/kg/天。在另一实施方式中，配体的给药剂量约为30mg/kg/天。在另一实施方式中，配体每日给药，持续7-28天。在另一实施方式中，配体每日给药，持续14天。在另一实施方式中，给予约1x 106-1x 108个细胞。在另一实施方式中，给予约1x 107个细胞。
在一个实施方式中，树突细胞经工程改造条件性表达IL-2和IL-12。IL-2对效应和调节T细胞、NK和NK-T细胞施加强效免疫调节作用。预计在细胞中表达IL-2和IL-12会导致其它各受体的互惠上调，因不同信号传导途径而诱导不同的互补生物学效应。预计IL-2和IL-12的组合还延长免疫刺激的持续时间并降低细胞的有效剂量从而动物更耐受。参见Dietrich2002，Wigginton 2002，2001，1996和Koyama，1997，McDermott和Atkins2008；Berntsen等2008；Tarhini等2008；Heemskerk等2008；Horton等2008。可得的IL-2的多核苷酸序列见以下登录号：U25676(人)；NM_008366(小鼠)；NM_204153(鸡)；和NM_053836(大鼠)。可得的IL-12的多核苷酸序列见以下登录号：NM_000882(人IL12A)；NM_002187(人IL12B)；NM_008351(小鼠IL12a)；NM_008352(小鼠IL12b)；NM_213588(鸡IL12A)；NM_213571(鸡IL12B)；NM_053390(大鼠IL12a)；和NM_022611(大鼠IL12b)。SEQ ID NO：13、15、21和23编码人和小鼠IL-12及其亚基。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造条件性表达IL-18和IL-12。IL-18诱导IFN-γ产生并促进T辅助细胞发育和NK激活。此外，IL-18可提升GM-CSF产生并降低IL-10产生。预计表达IL-18和IL-12会克服单独给予各细胞因子时观察到的局限性。相比于用各细胞因子单独转导树突细胞，预计在树突细胞中表达IL-12和IL-18会刺激更强烈的肿瘤抗原特异性Th1应答。
肿瘤内注射经工程改造以分泌IL-12和IL-18的DC介导最高水平的INF-γ产生和完全肿瘤排斥(Tatsumi 2003)。参见Vujanovic，2006。还参见Coughlin，1998，Subleski，206，Tatsumi，2003，和Sabel，2007；Shiratori等2007；Lian等2007；Iinuma等2006。IL-12多核苷酸序列参见上文。可得的IL-18多核苷酸序列见以下登录号：U90434(人)；NM_008360(小鼠)；EU747333(鸡)；和AY258448(大鼠)。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造以条件性表达IL-15和IL-12。IL-15与IL-2共有某些生物学活性，从而可能用于抵御癌症的治疗。IL-15刺激NK细胞和激活T细胞的增殖，支持效应T细胞扩增。有报道说IL-15呈递与IL-12协同作用增强NK细胞的IFN-γ产生。Koka，2004；Basak 2008；Lasek等2004。肿瘤内递送IL-15和IL-12在黑色素瘤模型中诱导明显的肿瘤消退(Lasek 1999)。IL-12多核苷酸序列见上文。SEQ ID NO：11和19编码人和小鼠IL-15。图2和4是可用于人和小鼠IL-12和IL-15的表达系统的质粒图。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造以条件性表达IL-21和IL-12。IL-21及其受体与IL-2和IL-15共有序列同源性。IL-21促进NK细胞的扩增和成熟。由于NK细胞和IL-21的治疗导致IL-12受体明显上调，IL-21的生物学效应可能与IL-12协同作用。此外，IL-21能增强IL-12信号传导并与之合作以增加IFN-γ产生。IL-12多核苷酸序列见上文。可得的IL-21多核苷酸序列见以下登录号：AF254069(人)；NM_021782(小鼠)；NM_001024835(鸡)；和NM_001108943(大鼠)。SEQ ID NO：6、7、8、9和17编码人和小鼠IL-21。SEQ ID NO：1和2是编码小鼠和人IL-12和IL-21的多核苷酸构建物。图7和8分别是可用于人和小鼠IL-12和IL-21的表达系统的质粒图。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造以条件性表达TNF-α和IL-12。TNF-α是免疫细胞的强效激活剂并介导抗肿瘤特性。此外，TNF-α与IL-12协同作用以增强T细胞上IFN-γ和IL-12受体的表达。在动物研究中，施用IL-12和TNF-α导致DN8+T细胞的肿瘤浸润，明显的IFN-γ产生和随后的肿瘤消退。参见Sabel，2003，2004，2007，Taniguchi，1998，Lasek，2000；和Xia等2008。IL-12多核苷酸序列见上文。可得的编码TNF-α的多核苷酸序列见以下登录号：X02910(人)；NM_013693(小鼠)；和BC107671(大鼠)。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造以条件性表达IL-7和IL-12。IL-7是IL-2家族的成员，对于T细胞和B细胞淋巴细胞溶解至关重要。IL-7调节原初和记忆CD8+T细胞的存活和增殖稳态。IL-7证实能增强抗肿瘤的CTL产生。此外，IL-12直接作用于CD8+T细胞以增强IL-7介导的增殖。此外，有报道说IL-7和IL-12协同增强CD8+T细胞细胞毒性。Mehrotra，1995；Sharma等2003；Tirapu等2002。因此，预计IL-7和IL-12共同表达将提供更优化的抗肿瘤应答。编码IL-12的多核苷酸序列见上文。可得的编码IL-7的多核苷酸序列见以下登录号：J04156(人)；NM_008371(小鼠)；NM_001037833(鸡)；和NM_013110(大鼠)。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造以条件性表达GM-CSF和IL-12。GM-CSF调节造血祖细胞分化和增殖，在专门的抗原呈递细胞(APC)，例如树突细胞的成熟中起到特别重要的作用。GM-CSF还增强树突细胞加工和呈递抗原的能力。GM-CSF的功能不同于IL-12，二者均在动物研究中引发明显的抗肿瘤应答。预计IL-12(T细胞激活)和GM-CSF(树突细胞激活)导致更强效的抗肿瘤免疫力。在动物研究中，联用GM-CSF与IL-12治疗在多个癌症模型中显著抑制肿瘤生长。Wang，2001；Chang，2007；Jean，2004；Nair，2006；Hill 2002；Small等2007。在人类试验中，GM-CSF+IL-12成功用于治疗骨髓瘤患者，其中两种细胞因子的组合作用导致循环B细胞减少。Rasmussen，2003；Hansson，2007；Abdalla，2007。预计GM-CSF和IL-12共表达于一个细胞将避免不利的全身性作用，例如循环B细胞减少。编码IL-12的多核苷酸序列见上文。可得的GM-CSF多核苷酸序列见以下登录号：M11734(人)；NM_009969(小鼠)；EU520303(鸡)；NM_001037660(大鼠Csf2ra)；和NM_133555(大鼠Csf2rb)。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造以条件性表达趋化因子(例如，CCL3(MIP-1a)，CCL5(RANTES)，CCL7(MCP3)，XCL1(淋巴细胞趋化因子)，CCL19(MIP-3b)，CXCL9(MIG)，CXCL10(IP-10)，CXCL12(SDF-1)，或CCL21(6Ckine))和IL-12。趋化因子是在各种炎性和非炎性条件下调节白细胞和其它细胞类型运输和激活的化学引诱细胞因子。炎性细胞因子在炎症和组织损伤中控制白细胞募集。稳态趋化因子执行持家功能，例如造血期间引导白细胞(例如，树突细胞)到达和进入二级淋巴器官以及骨髓和胸腺。在动物研究中，肿瘤内共同注射表达IL-12和CXCL10的两种不同腺病毒导致衍生自CT26鼠结肠直肠腺癌细胞系的肿瘤结节100％消退。Narvaiza等.，2000。Emtage等，1999描述了表达IL2和XCL1(淋巴细胞趋化因子)或IL-12和XCL1的两种双重组腺病毒载体。在乳腺癌肿瘤小鼠中肿瘤内注射载体引发强效抗肿瘤应答并成熟保护性免疫力。在其它动物研究中，共同转导表达IL-12和CCL27的腺病毒载体导致肿瘤消退和长期特异性免疫力。Gao等.，2007。因此，根据本发明，预计趋化因子和IL-12的共同表达会导致协同抗肿瘤活性。
在另一实施方式中，树突细胞经工程改造以条件性表达抗血管生成细胞因子(例如，IP-10和Mig)和IL-12。IP-10和Mig是T细胞和NK细胞的化学引诱物，它们抑制血管生成的能力取决于NK细胞。动物研究显示两种腺病毒的组合治疗(一种表达IP10，另一种表达IL-12)导致显著的抗肿瘤协同作用。Narvaiza等.，2000。在其它研究中，表达IP10或MIG和/或IL-12的腺病毒载体肿瘤内给予腺癌和纤维肉瘤的鼠模型。与单独的IP10、MIG、IL-12或对照治疗动物相比，发现联合给予IP-10或MIG与IL-12导致显著肿瘤消退并增加携带肿瘤动物的存活时间，其中IP-10、IL-12组合最有效。Palmer，2001。还参见Mazzolini，2003；和Huang 2004。因此，预计抗血管生成细胞因子和IL-12的共同表达导致协同抗肿瘤活性。
为证明有效的IL-12介导基因治疗，利用条件型cDNA表达系统，从而能开启免疫细胞或TSC在肿瘤内注射后的各时间点产生免疫调节剂和/或IL-12。根据C57BL/6小鼠的侵袭性B16黑色素瘤模型的结果，得到以下结论：1)有激活配体RG-115830存在下，而非没有配体存在下DC.RheoIL12分泌的IL-12水平升高；2)肿瘤内DC.RheoIL12治疗与肿瘤内DC.cIL12治疗一样有效，只要在DC注射24小时内(配体提供时间较晚，RG-115830治疗失败)将RG-115830给予治疗的动物；3)DC中的IL-12表达看来延长这些细胞在肿瘤微环境中的存活并与迁移至肿瘤引流淋巴结的更高数量的肿瘤内注射DC相关；和4)治疗结果相关的最强免疫力是通过治疗交叉致敏的肿瘤特异性CD8+T细胞水平而非肿瘤微环境中维持的注射DC数量。总之，这些数据提示，根据DC.IL12治疗对1-型CD8+T细胞效应物的传入(交叉致敏)而非对后续传入事件，例如注射DC介导的抗肿瘤T细胞募集入肿瘤微环境等的正面影响，它们可能成功。
在肿瘤内注射前，可用因子处理细胞(免疫细胞或TSC)以刺激这些细胞的活性。例如，细胞可用共刺激分子如正性共刺激分子处理，其中包括OX40L、4-1BBL、CD40、CD40L、GITRL、CD70、LIGHT或ICOS-L，或者用负性共刺激分子处理，例如抗-CTLA4、抗-PD-L1、或抗-PD-L2抗体。例如，细胞(例如，免疫细胞或TSC)可与表达一种或多种共刺激分子的细胞共孵育，例如，表达CD40配体分子的J588淋巴瘤细胞。在另一个实施方式中，细胞(免疫细胞或TSC)可用对抗免疫抑制分子(耐受抑制因子)处理，例如，抗TGF-β抗体(用于抑制微环境内的TGF信号传导)、抗IL-10抗体、TGF-βRII DN(抑制基因修饰细胞内的TGF信号传导)、IL-10R DN、dnFADD(抑制细胞内的细胞死亡通路)、抗-SOCS1抗体、siRNA或诱饵(抑制细胞内的抑制性细胞因子信号传导)、或抗-TGFa抗体。
产生图1-8所示携带多核苷酸序列的重组腺病毒。例如，通过在允许细胞系，例如HEK293细胞中共同转染hIL-21表达载体与合适的(例如，E3缺失的)腺病毒骨架，在左ITR上游位点作限制性消化进行线形化来产生hIL-21。携带鼠免疫调节性基因的腺病毒载体用于转导鼠树突细胞或TSC以便用于鼠治疗模型。对于人治疗应用，将编码免疫调节性基因的人同源物的多核苷酸插入合适载体。GMP条件下产生人治疗应用的腺病毒载体。III/IV期黑色素瘤患者的治疗结果(临床试验)的例子如下所示：在该例中，治疗涉及肿瘤内注射腺病毒转导的树突细胞和14次每日口服给予激活剂药物(配体)。在临床试验前30天到1周筛选对象。在任何流程开始前要求每位对象签署知情同意书。调查人员会通知所有对象试验期间要进行的流程的性质、目的、持续时间、可能的危险以及FDA可能检查他们的医学记录。将对象(总共16-20人)随机分成4组。所有组在口服给予第一剂量的配体后约3小时接受最高5x107个转导树突细胞的肿瘤内注射。4组接受的配体的每日口服剂量不同：实例组1＝0.01mg/kg；组2＝0.3mg/kg；组3＝1mg/kg；组4＝3mg/kg。治疗期间，以规定的时间间隔采血以便评估激活剂药物的单剂量和稳态药代动力学及其主要代谢物。还在规定的时间点采血以便评估抗病毒载体、RTS组分和肿瘤的体液和细胞免疫应答。在规定的时间点收集尿液并采血作血清化学、尿液分析和血液学分析(安全特征)。在规定时间点作肿瘤和/或引流淋巴结生物活检以评估治疗导致的转基因表达和针对肿瘤的免疫应答。建立患者的早期终止标准以防不良事件，并记录不良事件。在1、2、3和4个月追踪患者的不良事件和治疗结果。
在另一实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予经工程改造以组成型或条件性表达免疫调节剂，例如本文公开的免疫调节剂的树突细胞，和(b)将组成型或条件性表达免疫调节剂，例如本文公开的免疫调节剂的载体肿瘤内注射给该对象。在优选的实施方式中，树突细胞经工程改造以表达Ad-免疫调节剂载体，特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。在另一优选的实施方式中，肿瘤内注射给对象的载体是Ad-免疫调节剂载体，特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。
在另一实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予经工程改造以组成型或条件性表达IL-12的树突细胞，和(b)将组成型或条件性表达IL-12的载体肿瘤内注射给该对象。在优选的实施方式中，树突细胞经工程改造以表达Ad-IL-12载体，特别是Ad-RTS-IL-12载体。在另一优选的实施方式中，肿瘤内注射给对象的载体是Ad-IL-12载体，特别是Ad-RTS-IL-12载体。
在另一实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予经工程改造以组成型或条件性表达IL-12的树突细胞，和(b)给予该对象一种或多种抗癌症化疗剂。在优选的实施方式中，树突细胞经工程改造以表达Ad-IL-12载体，特别是Ad-RTS-IL-12载体。可在给予工程改造的树突细胞之前，在给予工程改造的树突细胞之后或者在给予工程改造的树突细胞的同时给予一种或多种抗癌化疗剂。在优选的实施方式中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、苏尼替尼(sunitinib)、苏尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
在另一实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予经工程改造以组成型或条件性表达IL-12的树突细胞，(b)将组成型或条件性表达IL-12的载体肿瘤内注射给该对象，和(c)给予该对象一种或多种抗癌化疗剂。在优选的实施方式中，树突细胞经工程改造以表达Ad-IL-12载体，特别是Ad-RTS-IL-12载体。在另一优选的实施方式中，肿瘤内注射给对象的载体是Ad-IL-12载体，特别是Ad-RTS-IL-12载体。可在给予表达IL-12的工程改造树突细胞和载体之前，在给予表达IL-12的工程改造树突细胞和载体之后或者在给予表达IL-12的工程改造树突细胞和载体的同时给予一种或多种抗癌化疗剂。在优选的实施方式中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、苏尼替尼、苏尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
在另一实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予经工程改造以组成型或条件性表达免疫调节剂，例如本文公开的免疫调节剂的树突细胞，和(b)将组成型或条件性表达免疫调节剂，例如本文公开的免疫调节剂的载体肿瘤内注射给该对象。在优选的实施方式中，树突细胞经工程改造以表达Ad-免疫调节剂载体，特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。在另一优选的实施方式中，肿瘤内注射给对象的载体是Ad-免疫调节剂载体，特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。
在另一实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予经工程改造以组成型或条件性表达免疫调节剂，例如本文公开的免疫调节剂的树突细胞，和(b)给予该对象一种或多种抗癌化疗剂。在优选的实施方式中，树突细胞经工程改造以表达Ad-免疫调节剂载体，特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。可在给予工程改造的树突细胞之前，在给予工程改造的树突细胞之后或者在给予工程改造的树突细胞的同时给予一种或多种抗癌化疗剂。在优选的实施方式中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、苏尼替尼、苏尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
在另一实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予经工程改造以组成型或条件性表达免疫调节剂，例如本文公开的免疫调节剂的树突细胞，(b)将组成型或条件性表达免疫调节剂，例如本文公开的免疫调节剂的载体肿瘤内注射给该对象，和(c)给予该对象一种或多种抗癌化疗剂。在优选的实施方式中，树突细胞经工程改造以表达Ad-免疫调节剂载体，特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。在另一优选的实施方式中，肿瘤内注射给对象的载体是Ad-免疫调节剂载体，特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。可在给予表达免疫调节剂的工程改造树突细胞和载体之前，在给予表达免疫调节剂的工程改造树突细胞和载体之后或者在给予表达免疫调节剂的工程改造树突细胞和载体的同时给予一种或多种抗癌化疗剂。在优选的实施方式中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、苏尼替尼、苏尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
在本发明的任何方法中，疾病或病症可以是本申请公开的疾病或病症。在一个实施方式中，疾病或病症是本文表1所列的疾病或病症。在另一实施方式中，疾病或病症是本文表3所列的疾病或病症。
在本发明的任何方法中，癌症或肿瘤可以是本申请公开的疾病或病症。在一个实施方式中，癌症或肿瘤是本文表1所列的癌症或肿瘤。在另一实施方式中，癌症或肿瘤是本文表3所列的癌症或肿瘤。
有可能通过检测患者生物学样品内的Th1/Tc1型细胞因子、IFN-γ的表达水平或活性来检测免疫调节剂和/或IL-12表达对细胞群的效应。
出于本发明的目的，本发明提供测定体外工程改造的免疫或TSC治疗方案在癌症患者中的效力的方法，包括：
a.在给予体外工程改造细胞，例如免疫细胞或TSC之前，测定从人患者获得的第一生物学样品的干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平或活性水平或二者，从而得到对照水平；
b.通过肿瘤内给予所述患者体外工程改造的细胞；
c.给予所述患者有效量的激活配体；
d.在给予所述激活配体后的某个时间点，测定从所述患者获得的第二生物学样品的IFN-γ的表达水平或活性水平或二者，从而得到测试水平的数据；和
e.比较IFN-γ的对照水平和测试水平，其中数据显示测试水平的IFN-γ的表达水平、活性水平或二者与对照水平相比升高则说明治疗方案对所述患者是有效的。本发明还任选包括以下附加步骤：
f.作生物活检并计数肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，和/或
g.观察对肿瘤起反应的肿瘤消退。
术语“对象”表示完整的昆虫、植物或动物。当对象是真菌或酵母时。预计配体也同样能起作用。本发明所用的动物包括但不限于：脊椎动物，例如哺乳动物，如人、啮齿类、猴和其它动物，优选人或小鼠。其它动物包括饲养动物，例如狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪等。
不希望束缚于理论，但可以预计，本发明支持肿瘤内给予体外工程改造免疫和TSC的基因治疗应用于临床，致力于以客观临床反应作为主要研究终点，交叉致敏的抗肿瘤CD8+T细胞(产生IFN-γ)作为次要研究终点。开启和关闭免疫调节剂和/或IL-12在体内表达的能力为提高治疗的安全性和治疗控制增加了砝码，其中通过给予配体可控制蛋白质表达的时间选择和水平，并且预期免疫调节剂和/或IL-12表达的时间选择对于本方法的疗效至关重要。
本发明还支持含有条件性表达的感兴趣基因的体外工程改造细胞作为有效治疗人类疾病的创新方法的治疗应用。
出于本发明的目的，在本文所引用的任何参考文献的教导或提示与本说明书矛盾时，以后者为准。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物通过引用全文纳入本文。
应该知道上述实施方式和示例不打算限制本发明范围的任何方面，本文的权利要求应包括本文明确或未明确提出的所有实施方式和示例。
2008年10月8日提交的名为“工程改造的树突细胞和治疗癌症的应用(Engineered Dendritic Cells And Uses For Treatment Of Cancer)”的美国申请号12/247,738通过引用全文纳入本文。2008年9月29日提交的名为“表达生物治疗性分子的治疗性基因开关构建物和生物反应器及其应用(TherapeuticGene-Switch Constructs And Bioreactors For The Expression OfBiotherapeutic Molecules，And Uses Thereof)”的美国申请号12/241,018通过引用全文纳入本文。
实施例1
进行研究来确定能在Renca肾细胞癌症肿瘤模型中诱导肿瘤特异性免疫应答和抗肿瘤活性的树突细胞剂量和最有效的细胞因子。
本项研究利用两种肿瘤细胞系：Renca和Renca-HA。后一种细胞系是用流感病毒血凝素(HA)转染Renca细胞制成的。Renca-HA模型的优点是能追踪抗原特异性T细胞，因为已知并利用了CD8和CD4特异性HA-衍生表位。
具体目标-测定肿瘤内给予树突细胞后HA-特异性免疫应答的诱导。
在BALB/c小鼠中皮下产生Renca-HA肿瘤。当肿瘤变得可触知时，肿瘤内注射树突细胞。树突细胞给予以7-天间隔反复给予两次，总共作3次给药。
利用下组小鼠(各组包括3只小鼠)：
1.未治疗组；
2.用对照质粒转导的5x105个树突细胞治疗的小鼠；
3.用对照质粒转导的106个树突细胞治疗的小鼠；
4.用对照质粒转导的5x106个树突细胞治疗的小鼠；
5.与组2-4相同，但利用IL-12转导的树突细胞；
6.与组2-4相同，但利用IL-15转导的树突细胞；和
7.与组2-4相同，但利用IL-21转导的树突细胞。
为检验不同细胞因子组合的效力，同时用以下治疗小鼠：
8.用IL-12转导的5x105个树突细胞，和用IL-15转导的5x105个树突细胞，
9.用IL-12转导的5x105个树突细胞，和用IL-21转导的5x105个树突细胞，
10.用IL-15转导的5x105个树突细胞，和用IL-21转导的5x105个树突细胞。
最后一次给药后4天，收集携带肿瘤的小鼠的淋巴结，用I类MHC匹配肽(检测CD8+T细胞应答)或II类MHC匹配肽(检测CD4+T细胞应答)刺激细胞。
采用以下试验：
1.ELISPOT IFN-γ和IL-2；
2.T-细胞增殖；
3.检测淋巴结细胞释放的TNFα、IL-10、IL-4和GM-CSF。
此外，利用YAC细胞作为靶标评估淋巴结的NK活性。
同时，用抗-CD3/CD28抗体刺激细胞以评估T细胞的非特异性应答。
测定能诱导抗原特异性免疫应答的树突细胞的最有效剂量。
具体目标2-评估用细胞因子基因转导的树突细胞的抗肿瘤活性。
只有表现出统计学明显的免疫应答诱导的那些细胞因子转导的树突细胞用于进一步的实验。
如具体目标1所述治疗携带Renca-HA肿瘤的小鼠。利用在以前实验中显示特定活性的细胞因子转导的一剂量DC。作为对照，利用对照腺病毒转导的树突细胞。为实现统计学显著性，各组包括10只小鼠。
评估肿瘤生长。Renca-HA肿瘤含有可用于免疫学监测和初步检验抗肿瘤效应的免疫原性表位。然而，为验证治疗可能的抗肿瘤活性，需要利用未转导的肿瘤细胞。因此，利用Renca肿瘤模型重复上述实验。
实施例2
III期和IV期黑色素瘤对象中肿瘤内注射腺病毒转导的自身树突细胞的安全性、耐受性、转基因功能和免疫学效应通过如下面所描述的方法进行评价，其中自身树突细胞通过工程改造在RTS控制下表达hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂。
包含III期和IV期黑色素瘤的研究对象的研究分四组，各对象接受单次肿瘤内注射(注射到黑色素瘤内)的腺病毒转导的自身(重新植入其来源的同一对象体内)树突细胞(DC)，剂量为5x 107，同时每日给予口服剂量的激活药物(激活配体)，其中树突细胞经工程改造表达人白介素12(hIL-12)。本研究注射用腺病毒载体离体转导(细胞从对象体内取出后)的树突细胞以便诱导表达人IL-12和一种或多种其它免疫调节剂。通过口服激活药物(RG-115932)激活RTS，注射的DC“打开”(诱导)IL-12和一种或多种其它免疫调节剂的产生。通过体检(包括ECOG体能状况)、生命体征检测、血清化学检测、尿液分析、血液学检测、不良事件“副作用”以及对腺病毒、RTS组分和激活药物产生的抗体和细胞免疫反应评价安全性和耐受性。为了评估进展情况，需要测定激活药物的单次剂量和稳态药代动力学/ADME及其主要代谢物，分析靶肿瘤、引流淋巴结和外周循环活检组织内的hIL-12水平、其它免疫调节剂水平和细胞免疫应答(T细胞)，以及血清细胞因子谱。
例如，将16位III期和IV黑色素瘤对象分成4组，其中组1和组2各有3位对象，组3和组4有5位对象。所有对象接受单次肿瘤内注射5x107个自身DC，该DC用编码RTS控制下的人IL-12和一种或多种其它免疫调节剂的腺病毒载体转导。例如，给对象肿瘤内注射用编码RTS控制下的人IL-12和免疫调节剂，例如IL-15或IL-21的腺病毒载体转导的自身DC。
对象在第1天DC注射前约3小时接受每日一次口服剂量的激活药物(组1：0.01mg/kg，组2：0.1mg/kg，组3：1.0mg/kg或组4：3mg/kg)，然后持续13天。符合再次治疗标准的合格对象再注射转导腺病毒的自身树突细胞，并每日口服活化药物(每日一次)，共14次。在注射体外工程改造的树突细胞后的一个月内评价组1所有对象的安全性、耐受性和树突细胞功能，然后这些患者将接受更高剂量的激活药物。对于所有对象，安全性评价都将从开始注射工程改造的树突细胞起持续3个月，如果有可能的话将随访期延长至6个月以检测对象的安全性，是否观察到毒性反应或者对象又接受了树突细胞注射。
此类研究证明了单次或多次肿瘤内注射腺病毒转导的自身树突细胞结合口服活化药物在黑色素瘤对象体内的安全性和耐受性。本研究提供了口服激活药物的稳态药代动力学/ADME。本研究通过测定靶肿瘤和/或引流淋巴结内的腺病毒转导的自身树突细胞的hIL-12表达和一种或多种其它免疫调节剂的表达证明了RTS在对象中的功能，其中hIL-12的表达是对通过口服激活药物而活化RTS所产生的反应。另外，本研究还证明了腺病毒转导的自身树突细胞的免疫学效应，该效应表现在口服激活药物后靶肿瘤、引流淋巴结和外周循环中的细胞系免疫反应。
选择黑色素瘤作为示范性癌症。黑色素瘤显示对免疫治疗起反应，尤其在实体瘤中，黑色素瘤易于进行肿瘤内注射和生物活检。本研究所纳入的对象患有不可切除的III期或IV期黑色素瘤，直径最小0.5cm，肿瘤厚度不一，有不同数目的淋巴结被累及，正在发生转移或有远端转移。
制备包含RheoSwitch治疗系统、hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂的腺病毒
重组DNA通过离体腺病毒载体转导被转移到树突细胞(DC)内。重组DNA用于肿瘤内注射的未成熟树突细胞表达人IL-12(p70)和一种或多种其它免疫调节剂，IL-12可使肿瘤微环境中的DC存活并刺激其成熟，导致这些细胞随后迁移到引流淋巴结内。这将导致T辅助细胞向Th1型T细胞定向分化，并且通过与肿瘤抗原的交叉致敏而激活肿瘤特异性的细胞毒T细胞。
以重组腺病毒载体的形式提供重组DNA可使人IL-12和一种或多种其它免疫调节剂在RheoSwitch
Figure BPA00001388484101071
治疗系统(RTS)的控制下表达。RTS包含受人泛素C启动子控制的双顺反子信号，编码两个融合蛋白：Gal4-EcR和VP16-RXR。Gal4-EcR是酵母Gal4 DNA结合区(氨基酸1-147)和昆虫云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)蜕皮激素受体DEF区的融合蛋白。在另一个实施方式中，RTS包含受人泛素C启动子控制的双顺反子信号，编码两个融合蛋白：Gal4-EcR和VP16-RXR。Gal4-EcR是酵母Gal4 DNA结合区(氨基酸1-147)和昆虫云杉卷叶蛾蜕皮激素受体DEF区的融合蛋白。VP16-RXR是HSV-VP16转录活化区和人和洋槐序列来源的嵌合RXR EF区的融合蛋白。这些Gal4-EcR和VP16-RXR序列被EMCV来源的内部核糖体进入位点(IRES)分开。当Gal4-EcR与小分子药物(RG-115932)结合时这两个融合蛋白二聚化，激活Gal4反应性启动子启动hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂的转录，该启动子包含6个Gal4结合位点和一个合成的最小启动子。上述RTS转录单位位于hIL-12和一种或多种免疫调节剂转录单位下游。这个完整的RTS-hIL12-免疫调节剂表达盒被插入到腺病毒5基因组的位点内，该位点上的E1区已被删除。腺病毒骨架还缺乏E3基因。腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12的图谱显示在US 2009/0123441A1的图8中。
除了病毒载体序列以外，本研究所用的重组腺病毒载体还包含下列示例性调节元件：人泛素C启动子，来源于EMCV的内部核糖体进入位点，包含6个拷贝的Gal4结合位点、3个拷贝的SP-1结合位点和一个合成最小启动子序列的可诱导启动子，SV40聚腺苷酸化位点，以及来源于人α-球蛋白基因的转录终止序列。应当清楚的是，其他调节元件作为替代也可以使用。
通过如下方式已制备出示范性重组腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12-免疫调节剂。被EMCV-IRES(内部核糖体进入位点)分开的受体融合蛋白VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列被插入到腺病毒穿梭载体内，置于人泛素C启动子(组成型启动子)控制之下。然后将IRES分开的hIL-12的p40和p35亚基和一种或多种免疫调节剂的编码序列插入到泛素C启动子和受体序列的上游，置于包含6个拷贝Gal4结合位点的可诱导合成启动子的控制之下。穿梭载体包含血清型5腺病毒序列，长度从左侧末端到图谱单位16(mu16)，该序列上的E1序列被删除，由RTS和IL-12和一种或多种免疫调节剂序列(RTS-hIL-12)取代。通过瞬时转染HT-1080细胞并测定激活药物依赖性的IL-12和其它免疫调节剂表达情况来评价携带RTS-hIL-12-免疫调节剂的穿梭载体。然后通过共转染HEK 293细胞使穿梭载体与腺病毒骨架重组，得到重组腺病毒Ad-RTS-hIL-12-免疫调节剂。腺病毒骨架包含基因组左侧末端mu0到9.2的序列缺失和E3基因序列缺失。穿梭载体和腺病毒骨架包含mu9.2到mu16之间的重叠序列以便于二者之间发生重组形成重组腺病毒载体。由于重组腺病毒载体缺乏E1和E3区，因此病毒在正常哺乳动物细胞内是复制缺陷型的。但是，病毒可在包含腺病毒5E1区因而能提供反式E1功能的HEK 293细胞内复制。
通过如下方式已制备出示范性的重组腺病毒载体。将线性化的穿梭载体和腺病毒骨架共转染到HEK 293细胞内，其中穿梭载体携带用于诱导型表达人IL-12和一种或多种其它免疫调节剂的DNA元件。穿梭载体和病毒骨架的重叠序列之间发生同源重组，形成重组腺病毒，并且在HEK 293细胞内被包装成病毒颗粒。HEK293细胞可在含胎牛血清的DMEM中生长。
用于本研究的病毒通过CsCl密度梯度离心纯化。重组腺病毒经过两轮噬菌斑纯化，通过在特征完全清楚的主细胞库来源的HEK293细胞内扩增，可利用得到的种子库生产主病毒库(MVB)。MVB经过了严格的cGMP/GLP放行试验，其中包括增殖性腺病毒(RCA)、无菌、支原体、外来病毒、逆转录病毒、人病毒HIV1/2、HTLV1/2、HAV、HBV、HCV、EBV、B19、CMV、HHV-6、7和8、牛和猪病毒、完整载体测序以及通过在人细胞系内进行AD诱导的IL-12和一种或多种免疫调节剂表达而完成的功能检测。
来自于MVB的病毒可用于在cGMP设施中生产纯化的病毒，然后再次经历放行试验，其中包括鉴定、RCA、无菌、支原体、外来病毒、病毒颗粒-感染单位比例、宿主细胞DNA、内毒素和蛋白质污染、以及通过在人细胞系内进行AD诱导的IL-12和一种或多种免疫调节剂表达而完成的功能检测。
用包含hIL-12转基因和一种或多种免疫调节剂及RheoSwitch治疗系统(RTS)的腺病毒转导自身树突细胞
来源于人对象的树突细胞离体转导后注射到肿瘤内。在转导病毒前对DC的特征进行鉴定，其中包括活力、纯度(一般80％以上的细胞具有DC表型)、无菌、支原体和内毒素检测。转导病毒后，重复洗涤细胞以去除未吸附的病毒。最后一次洗涤的上清液通过PCR检测其中的病毒残留量。由于DC是在离体经过腺病毒载体(非整合病毒)转导的，DC注射到瘤内以及随后迁移到引流淋巴结内的生命周期较短，因此预计病毒不会插入到任何非靶细胞内。腺病毒转导DC所用的方法预计可以达到80-90％的转导效率，被认为是非常高效的。
通过白细胞去除术收获PBMC：对象在UPCI门诊部的成分输血室接受90-120分钟的标准白细胞去除术。白细胞去除过程包括从一个手臂的静脉抽取血液；血液通过离心(细胞分离机)，其中血液组分被分开，去除一种一个或多个组分；以及将其余血液组分回输回对象同一手臂或另一手臂的静脉。在血液通过细胞分离装置进行处理的过程中，任何时候抽取的血液都不要超过对象血液总体积的15％。在细胞分离机中，血液被分离成血浆、血小板、白细胞和红细胞。去除白细胞(WBC)并将其他所有组分回输到对象的循环中。每次进行该过程时要使用两个外周静脉血管。如果无法做到，也可以使用中央静脉血管。必须由医生决定对象是否能够进行白细胞去除术，在进行该过程前需对患者的生命体征进行常规筛查(包括血压)。
处理：收集以后白细胞血袋人工送到CPL，立即通过ELUTRATM离心淘洗进行处理。这是一种经过临床验证的闭合系统。回收单核细胞成分，检测完回收率和细胞活力后转移到Aastrom盒用IL-4和GM-CSF培养6天。所有处理和洗涤过程都必须在无菌条件下进行。
初始接种：回收自一个白细胞血袋的单核细胞通过台盼蓝染色计数以确定活细胞数。利用流式细胞术分析单核细胞的纯度。单核细胞以5-10x106细胞/mL的浓度重悬于无血清、无抗生素CellGenix培养基中，按照SOP-CPL-0166添加1,000IU/mL的IL-4和1,000IU/mL的GM-CSF，放置到Aastrom盒中。按照盒式接种的要求，使用50ml的最小加载体积和最低细胞数。
培养：Aastrom盒放置在细胞复制系统(Replicell System)的孵育箱中，这是一种完全闭合的符合cGMP要求的自动培养装置，可用于未成熟DC产生。
收获未成熟DC：在第6天，从孵育箱中取出Aastrom盒，收获未成熟DC。通过1500rpm离心回收细胞，用CellGenix培养基洗涤，台盼蓝染色后计数，检查细胞的形态和表型特征。
活力：台盼蓝染色后利用血细胞计数器进行细胞计数，从而确定细胞的活力。一般来说，收获的细胞中95％以上都是活细胞，即，不含台盼蓝染料。如果活力低于70％，则废弃未成熟DC。
表型分析：培养出的细胞加载到血细胞计数器上，显微镜下观察并计数，利用台盼蓝染色进行初步的细胞分类计数(DC对淋巴细胞)。通过流式细胞仪检测确认细胞分类计数结果，对DC和淋巴细胞设门，将高前向角和高侧向散射特性作为未成熟DC的判定标准。一般来说，未成熟DC中80％以上的细胞具有树突细胞形态和DC表型。
IL-12p70效能测定：研究证明，成熟DC(mDC)能够自发地或在用CD40L活化时生成IL-12p70，无论是否添加先天免疫信号(如LPS)。最近建立了一种检测IL-12p70生成的标准化分析方法，可用于分析小样品或各种条件下制备的大批量DC疫苗。目前所用的效能测定方法包括两步，第一步包括应答DC与稳定转染人CD40配体基因的J588淋巴瘤细胞共孵育，后者作为刺激细胞。第二步包括利用Luminex系统检测这些共培养物上清液中用J588/CD40L+/-LPS刺激的DC所分泌的IL-12p70水平。这种效能测定方法的批间CV为18.5％(n＝30)，动态范围较宽，这有利于评价IL-12p70产生水平相差巨大的不同DC产品。利用该方法检测了13个正常供者的单核细胞制备出的DC产物，结果显示其正常范围是8-999pg/mL，均值为270pg/mL。
树突细胞的生产和放行标准
每一批体外工程树突细胞都有检测是否存在微生物污染(需氧菌和厌氧菌，真菌和支原体)以及内毒素，并且要进行表型和功能鉴定。所有要被注射到对象体内的树突细胞都必须是新鲜的，没有经过冻存。
DC的质量保证试验：按照上述方法制备的DC需要进行无菌性、活力、纯度、效能和稳定性检测。要建立细胞产品的放行标准并严格遵守。
活力：通过培养制备出的细胞加载到血细胞计数器上通过显微镜观察进行计数，利用台盼蓝染料染色来获得分类计数(DC对淋巴细胞)。该计数可用于计算被测培养物内的活细胞百分比。符合放行标准的细胞要求活力超过70％(通过台盼蓝染色计数确定)，并且至少有70％的细胞表达单核细胞来源的DC标记物HLA-DR和CD86。检测分析也可使用其他标记物如用于评价DC成熟状况的CD83和CCR7，以及用于评价淋巴细胞污染的CD3和CD19。
纯度：细胞用FITC和PE标记的mAb染色，利用双色流式细胞检测方法确定经过形态学鉴定的DC群是否表达DC特异性的表面抗原并且不表达单核细胞和T、B细胞抗原。在用于疫苗制备时，生产出的DC必须表达HLA-DR和CD86，并且一定不表达CD3、CD19或CD14。细胞只有表达CD83+和CCR7+才被认为是mDC。
效能：为了确定DC的效能，我们按照上述方法测定其生成IL-12p70的能力。
无菌性：利用BD Bactec系统(马里兰州斯帕克市BD公司(BectonDickinson Co.，Sparks，MD))在匹兹堡大学医学中心微生物实验室对DC进行细菌(需氧菌和厌氧菌)和真菌培养。14天后可获得微生物培养的最终结果。在放行用于疫苗的DC前，需要进行革兰氏染色并且微生物检测必须阴性。
支原体IMCPL检测使用Gen-Probe支原体组织培养快速检测系统(加州圣迪戈市GP公司(Gen-Probe，Inc.San Diego，CA))，该系统是基于核酸杂交技术设计的。内毒素检测用鲎变形细胞溶解产物加热原试验(LimulusAmoebocyte Lysate Pyrogen Plus assay)(马里兰州沃克威尔市BW公司(BioWhittaker，Inc.，Walkerville，MD))完成。在收获时和在放行终产品之前，对细胞培养物进行内毒素检测。内毒素的可接受水平为＜5EU/kg体重。未转导的和已转导的树突细胞将冻存起来用于以后的分析。
预计所有转导细胞都将表达转基因。超过80％的DC预计被转导。产物是有生物学活性的，因为转基因中包含天然编码序列。注射到肿瘤内的病毒转导的DC具有未成熟DC表型，在成熟之前不表达IL-12和一种或多种其它免疫调节剂，因此在这个阶段，IL-12和一种或多种其它免疫调节剂的表达大部分来自于转基因。由于IL-12和一种或多种其它免疫调节剂转基因的表达可被小分子激活药物RG-115932以剂量依赖性的方式诱导，因为可以将转导DC内的转基因表达控制在理想的水平上。用于输注给人类患者的一小部分转导DC可用于体外检测激活配体依赖性的IL-12和一种或多种其它免疫调节剂的诱导表达情况。通过灵敏度为4ng/ml的ELISA可分析IL-12和一种或多种其它免疫调节剂的表达水平。
据预测，研究计划所用载体转导的细胞经过体外诱导IL-12和一种或多种其它免疫调节剂表达后，根据ELISA检测结果，在24小时内，每106个细胞可产出约500ng IL-12和一种或多种其它免疫调节剂。在黑色素瘤小鼠模型的临床前研究中，瘤内注射106或更多转导的DC是有效的。但是，据估计，能产生疗效的瘤内注射所需要的量可能在该数值以下，因此可将注射5x107转导DC当作起点以确定需要更低或更高的量。
例如，在体外，用携带IL-12和一种或多种其它免疫调节剂的基因的重组腺病毒载体转导的人和小鼠细胞系以及原代树突细胞可以剂量依赖性的方式对激活药物产生反应而诱导IL-12表达。
6.3.激活药物制剂
本文所用的活化药物可以制备成下列任何一种形式的制剂：
(1)100％Labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)；
(2)李斯特灵调味Labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)(Listerineflavored Labrasol)(美国LP公司(Latitude Pharmaceuticals Inc.，USA))，其中包含(a)薄荷醇，(b)麝香草酚，(c)桉叶脑，(d)，阿斯巴甜，(e)糊精钠，(f)柠檬酸，(g)胡椒薄荷香料，(h)乳膏香料，(i)labrasol(辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)；
(3)二辛酸/癸酸丙二醇酯(Miglyol 812)和磷脂(phospholipon 90G)(美国LP公司)；或者
(4)二辛酸/癸酸丙二醇酯(Miglyol 812)，磷脂(phospholipon 90G)和维生素E生育酚聚乙二醇琥珀酸盐(美国LP公司)。
递送
虽然可以设想出各种浓度和特殊方案，但是一个治疗患者的例子包括患者瘤内注射转导的自身树突细胞(AdDC)，浓度为5x 107，混悬于无菌盐水中，树突细胞经过改造可表达hIL-12(人白介素12)和一种或多种其它免疫调节剂，其表达受RTS控制，并结合口服激活药物(RG-115932)。
初始治疗
第1天住院患者就诊：在第1天，进行基线体检(包括生命体征，体重和ECOG状况)。收集尿液并采集血样用于基线血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。肿瘤内注射体外工程改造树突细胞前约3小时，各对象在餐后立刻给予激活药物(组1-0.01mg/kg，0.3mg/kg，1.0mg/kg和3mg/kg)。在第1天以规定的时间间隔(给药前，注射AD后0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24小时)抽取血样用于分析单次剂量激活药物及其主要代谢物的药代动力学。各对象接受腺病毒转导的自身树突细胞的单次瘤内注射，浓度为5x 107细胞，该细胞经工程受RTS控制的改造表达hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂。仔细监测对象的局部注射位点反应和/或超敏反应。2-14天住院患者就诊：从第2天到第14天，各对象在餐后立即服用激活药物。从第2天到第14天，每天检查生命体征并记录不良事件。在4天±24小时时，从约50％对象体内提取肿瘤和/或引流淋巴结活检组织用于测定hIL-12和细胞免疫反应。在第8天，称量体重。在8天±24小时时，从第4天未做组织活检的对象体内提取肿瘤和/或引流淋巴结活检组织用于测定hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂及细胞免疫反应。在4天±24小时和8天±24小时时，抽取对象血样用于分析抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。另外还测定血清细胞因子表达模式以确定其他细胞因子的表达是否受hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂转基因治疗的影响。在第8天，收集尿液并抽取血样用于血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。在第8天以规定的时间间隔(给药前，注射AD后0.5、1、2、4、6、8、12、16和24小时)抽取血样用于分析激活药物及其主要代谢物的稳态药代动力学/ADME。
14天住院患者就诊：在第14天，各对象在餐后立即服用激活药物。所有患者都接受体检(包括生命体征，身高，体重和ECOG状况)。收集尿液并抽取血液用于血清化学检测、尿液分析和血液学检测(安全性概况)。在14天±24小时时，抽取血液用于分析抗腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。另外还测定血清细胞因子表达模式以确定其他细胞因子的表达是否受影响。
在指定住院患者和门诊患者就诊时抽取对象血液用于测定抗腺病毒和RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。采集血液用于基线血清细胞因子表达模式分析。AdVeGFP感染性阻断类型试验用于检测抗腺病毒载体的抗体反应(Gambotto，Robins等，2004)。抗RTS组分的抗体反应通过蛋白质印迹和/或ELISA检测，使用患者的血清和表达载体产生的RTS蛋白。另外，多重细胞因子检测将用Luminex完成，测定血清中的IL-12、IFN-γ、IP-10以及其他Th1/Th2细胞因子如IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-10。这些抗体和细胞因子检测需要约10ml血液。
针对腺病毒和/或RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应：在指定住院患者和门诊患者就诊时抽取对象血液用于评价抗腺病毒和RTS组分及肿瘤抗原的潜在抗体和细胞免疫反应。AdVeGFP感染性封闭类型试验用于检测抗腺病毒的抗体反应(Nwanegbo等，2004)。抗RTS组分的抗体反应通过蛋白质印迹和/或ELISA来分析，采用对象的血清和表达载体产生的RTS蛋白。另外，通过Luminex进行多重细胞因子检测用于分析血清中的IL-12、IFN-γ、IP-10、以及其他Th1/Th2细胞因子如IL-2、TNFa、IL-4、IL-5和IL-10。这些抗体和细胞因子检测需要约10ml血液。
细胞免疫反应分析需要约50-60ml血液，从中分离CD4和CD8T细胞亚群。分离出的T细胞与转导空Adv载体、AdV-RTS或AdV-RTS-hIL-12-免疫调节剂载体的自身树突细胞混合，利用ELISPOT方法测定AdV和RTS来源的抗原活化的T细胞所产生的INF-γ，如果有的话。同样的方法用于分析肿瘤细胞和/或表达共有黑色素瘤抗原的DC，以检测对肿瘤的早期免疫反应。根据需要也可进行其他检测。
妊娠检验：在筛选就诊时以及再次治疗的首次入院就诊之前对有生育能力的女性进行尿液妊娠检验。在初次治疗以及所有再次治疗期间，给予活化药物之前至少72、48、24或12小时进行该项检验。如果尿液妊娠试验阳性，那么进行血清妊娠试验进一步确认。如果确认已经怀孕，那么患者将不被允许参加临床试验或者继续纳入再次治疗期。妊娠检验可根据需要进行多次。
合并用药问询：在筛选时或者再次治疗期的首次入院就诊之前，将要求各对象提供同时用药列表以确定临床试验期间以及随访期内合并用药与不良事件之间任何可能的关系。
再次治疗的标准：如果对象耐受先前的AdDC接种，未发生有限的不良反应，并且疾病未恶化或者再次治疗时症状有可能减轻，则该对象考虑进行再次治疗。根据主要研究者和治疗医师的意见，再次肿瘤内注射AdDC以及连续给予14天的激活药物(组1的最大耐受剂量)可能会产生临床疗效，如果满足如下标准则可对对象进行再次治疗：
1.未出现限制性毒性，
2.患者的病情稳定或者显现出临床的或客观的症状改善迹象，以及
3.未产生对RheoSwitch
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治疗系统的腺病毒组分的抗体或细胞免疫反应。
转基因功能和免疫学效应的评价：在筛查期间(-12天到-7天)、临床试验的第4、8和14天、以及随访的第1个月(参见表3-5)收集肿瘤及其相关引流淋巴结的针刺或切除活检组织用于评价体内的hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂转基因表达水平和细胞免疫反应。在再次治疗期的-12天到-7天以及第14天，利用细针穿刺抽取肿瘤及其相关引流淋巴结的活检组织用于评价体内的hIL-12和一种或多种其它免疫调节剂转基因表达水平和细胞免疫反应。利用标准光学显微镜和免疫组化技术检测活检组织以评价进入到肿瘤和引流淋巴结内的T细胞浸润情况。活检组织切片由不清楚研究对象背景的病理学家读片。为了区分肿瘤和引流淋巴结内DC的内源性IL-12表达水平和诱导的IL-12表达水平，将利用合适的引物对RNA进行RT-PCR。在筛查时、临床试验的第4、8和14天、随访的第1个月、以及再次治疗期的-12天到-7天、第8天和第14天(参见表3-5)，抽取血样用于血清细胞因子表达模式分析。通过分析血清细胞因子表达模式可以确定其他细胞因子的表达是否受hIL-12转基因治疗的影响。通过Luminex进行多重细胞因子检测用于分析血清中的IL-12、IFN-γ、IP-10、以及其他Th1/Th2细胞因子如IL-2、TNFa、IL-4、IL-5和IL-10。这些抗体和细胞因子检测需要约10ml血液。
激活药物的单次剂量和稳态药代动力学：在临床试验的第一天，以特定的时间间隔(给药前、上午给药后的0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24小时)抽取血液用于评价单次剂量的药代动力学，在临床试验的第8天抽取血液用于测定活化药物及其主要代谢物的稳态药代动力学/ADME。利用HPLC分析血浆以获得激活药物及主要代谢物的下列稳态药代动力学终点：Cmax(最大血浆观测浓度)，Tmax(达到最大血浆观测浓度的时间)，Ctrough(最小血浆观测浓度，计算为0小时和24小时浓度平均值)，C24h(24小时时的血浆浓度)，AUC24h(0-24小时的血浆浓度-时间曲线下面积)，Ke(表观消除速率)和T112(表观半衰期)。
应当理解的是，上述实施方式和实施例并不意味着从任何方面对本发明的范围进行限制，本文所附权利要求将包含所有实施方式和实施例，无论本文是否加以描述。
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Claims (97)

1.一种载体，其条件性表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，其中所述一种或多种免疫调节剂选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、IFN-α2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体还包含编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸。
4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的所述一种或多种蛋白质的所述多核苷酸和编码具有IL-12的功能的所述一种或多种蛋白质的所述多核苷酸在所述基因开关的调节启动子的控制下。
5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮素受体(EcR)的基因开关。
6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成行使配体依赖性转录因子功能的蛋白质复合物。
7.如权利要求1所述的载体，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的所述多核苷酸编码一种或多种人免疫调节剂。
8.如权利要求3所述的载体，其特征在于，编码具有IL-12的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人IL-12。
9.一种产生表达具有一种或多种免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的免疫细胞或治疗支持细胞(TSC)群体的方法，包括用条件性表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质的重组载体修饰所述免疫细胞，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，其中所述一种或多种免疫调节剂选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、IFN-α2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体还包含编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸和编码具有IL-12的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸在所述基因开关的控制下。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮素受体(EcR)的基因开关。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成行使配体依赖性转录因子功能的蛋白质复合物。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人免疫调节剂。
16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，编码具有IL-12的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人IL-12。
17.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞是人树突细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述树突细胞是骨髓树突细胞。
19.一种表达具有一种或多种免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的免疫细胞或TSC群体，所述细胞用条件性表达具有一种或多种免疫调节剂的一种或多种功能的一种或多种蛋白质的重组载体修饰，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，其中所述免疫调节剂选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10RDN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-α1、IFN-α2、IL-15-R-α、IFN-γ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
20.如权利要求19所述的群体，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
21.如权利要求19所述的群体，其特征在于，所述载体还包含编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸。
22.如权利要求19所述的群体，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸和编码具有IL-12的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸在所述基因开关的控制下。
23.如权利要求19所述的群体，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
24.如权利要求19所述的群体，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成行使配体依赖性转录因子功能的蛋白质复合物。
25.如权利要求19所述的群体，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人免疫调节剂。
26.如权利要求21所述的群体，其特征在于，编码具有IL-12的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人IL-12。
27.如权利要求19所述的群体，其特征在于，所述细胞是人树突细胞。
28.如权利要求27所述的群体，其特征在于，所述树突细胞是骨髓树突细胞。
29.一种体外工程改造的免疫细胞或TSC，所述细胞包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中编码具有开关的所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，其中所述免疫调节剂选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10RDN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15R α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1RNAi、a PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
30.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
31.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述载体还包含编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸。
32.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸和编码具有IL-12的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸在所述基因开关的控制下。
33.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
34.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成行使配体依赖性转录因子功能的蛋白质复合物。
35.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人免疫调节剂。
36.如权利要求31所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，编码具有IL-12的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人IL-12。
37.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞是人树突细胞。
38.如权利要求37所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述树突细胞是骨髓树突细胞。
39.一种药物组合物，其包含权利要求19所述的体外工程改造免疫细胞或TSC群体。
40.一种药物组合物，其包含权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞或TSC。
41.如权利要求39或40所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物适于肿瘤内、腹膜内或皮下给予。
42.如权利要求39所述的药物组合物，其特征在于，所述细胞群体包含至少104个细胞。
43.如权利要求39所述的药物组合物，其特征在于，所述细胞群体包含至少107个细胞。
44.一种治疗哺乳动物的肿瘤的方法，包括：
(a)将免疫细胞或TSC群体肿瘤内给予肿瘤微环境，所述细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质；和
(b)将治疗有效量的一种或多种激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质表达并治疗所述肿瘤，其中所述免疫调节剂选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15Rα、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是良性肿瘤。
46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是恶性肿瘤。
47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是黑色素瘤。
48.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是恶性黑色素瘤皮肤癌。
49.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述体外工程改造的免疫细胞包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
50.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述载体还包含编码具有IL-12的功能的蛋白质的多核苷酸。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸和编码具有IL-12的功能的所述蛋白质的所述多核苷酸在所述基因开关的控制下。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成行使配体依赖性转录因子功能的蛋白质复合物。
55.如权利要求44所述的方法，其特征在于，编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人免疫调节剂。
56.如权利要求51所述的方法，其特征在于，编码具有IL-12的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人IL-12。
57.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是人树突细胞。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述树突细胞是骨髓树突细胞。
59.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
60.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述配体选自：RG-115819、RG-115932和RG-115830。
61.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或
Figure FPA00001388484000071
二唑啉。
62.如权利要求44所述的方法，其特征在于，在所述体外工程改造的免疫细胞之前或之后的1小时内给予所述配体。
63.如权利要求44所述的方法，其特征在于，在所述体外工程改造的免疫细胞之前或之后的24小时内给予所述配体。
64.如权利要求44所述的方法，其特征在于，在所述体外工程改造的免疫细胞之前或之后的48小时内给予所述配体。
65.一种测定基于体外工程改造的免疫细胞的治疗方案在患者中的效力的方法，包括：
(a)给予体外工程改造的免疫细胞之前，检测从有此需要的所述患者获得的第一生物学样品中干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平或活性水平或二者，从而获得对照水平；
(b)给予有此需要的患者体外工程改造的免疫细胞，所述细胞经工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和任选表达具有IL-12的功能的蛋白质；
(c)给予有此需要的所述患者有效量的激活配体；
(d)给予体外工程改造的免疫细胞和激活配体之后，检测从有此需要的所述患者获得的第二生物学样品中IFN-γ的表达水平或活性水平或二者，从而获得测试水平；和
(e)比较IFN-γ的对照水平与测试水平，其中IFN-γ的表达、活性或二者的测试水平相比于对照水平增加表明该治疗方案在有此需要的所述患者中有效，
其中所述免疫调节剂选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α1、INF-α2、IL-15R α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防卫素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，有此需要的所述患者是人患者。
67.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述患者是癌症患者。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述癌症患者是黑色素瘤患者。
69.如权利要求65所述的方法，其特征在于，通过ELISA检测IFN-γ水平。
70.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和任选表达具有IL-12的功能的蛋白质，所述免疫细胞包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和任选的IL-12的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
72.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
74.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
75.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述配体选自：RG-115819、RG-115932和RG-115830。
76.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或二唑啉。
77.如权利要求72所述的方法，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含第一启动子控制下的第一转录因子序列和第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用形成行使配体依赖性转录因子功能的蛋白质复合物。
78.如权利要求70所述的方法，其特征在于，编码具有IL-12的功能的蛋白质的所述多核苷酸编码人IL-12。
79.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是人树突细胞。
80.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述树突细胞是骨髓树突细胞。
81.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述激活配体经肿瘤内、口服、腹膜内或皮下给予。
82.如权利要求65所述的方法，其特征在于，在所述体外工程改造的树突细胞之前或之后的1小时内给予所述激活配体。
83.如权利要求65所述的方法，其特征在于，在所述体外工程改造的树突细胞之前或之后的24小时内给予所述激活配体。
84.如权利要求65所述的方法，其特征在于，在所述体外工程改造的树突细胞之前或之后的48小时内给予所述激活配体。
85.一种试剂盒，其包含(a)工程改造以含有载体的免疫细胞，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，而所述基因开关控制具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和任选的具有IL-12的功能的蛋白质的表达，和(b)激活所述基因开关的配体。
86.如权利要求85所述的试剂盒，其特征在于，所述配体是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
87.如权利要求1所述的载体，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含一个启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用以形成行使配体依赖性转录因子的功能的蛋白质复合物。
88.如权利要求87所述的载体，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)相连。
89.如权利要求29所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含一个启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用以形成行使配体依赖性转录因子的功能的蛋白质复合物。
90.如权利要求89所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)相连。
91.如权利要求53所述的方法，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含一个启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用以形成行使配体依赖性转录因子的功能的蛋白质复合物。
92.如权利要求91所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)相连。
93.如权利要求72所述的方法，其特征在于，编码基因开关的所述多核苷酸包含一个启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列所编码的蛋白质相互作用以形成行使配体依赖性转录因子的功能的蛋白质复合物。
94.如权利要求93所述的体外工程改造免疫细胞，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)相连。
95.一种组合物，其包含两种或更多种体外工程改造免疫细胞或治疗支持细胞的群体，其中所述组合物中各体外工程改造细胞群体包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)与启动子操作性相连的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码具有免疫调节剂的功能的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸与所述配体依赖性转录因子激活的启动子相连，其中所述组合物中各体外工程改造细胞群体表达的一种或多种免疫调节剂与该组合物中其它一种或多种体外工程改造细胞群体表达的一种或多种免疫调节剂不同。
96.一种治疗哺乳动物的肿瘤的方法，包括：
(a)将两种或更多种免疫细胞或TSC群体肿瘤内给予肿瘤微环境，所述细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质，
其中各群免疫细胞或TSC表达不同集合的一种或多种免疫调节剂；和
(b)将治疗有效量的一种或多种激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质表达并治疗所述肿瘤。
97.一种治疗哺乳动物的肿瘤的方法，包括：
(a)将两种或更多种免疫细胞或TSC群体肿瘤内给予肿瘤微环境，所述细胞经体外工程改造以条件性表达具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质和具有IL-12的功能的蛋白质，
其中各群免疫细胞或TSC表达不同集合的具有免疫调节剂的功能的一种或多种蛋白质，
其中具有所述免疫调节剂或IL-12的功能的至少一种蛋白质在配体激活的条件性启动子的控制下；和
(b)将治疗有效量的一种或多种激活配体给予所述哺乳动物；
从而诱导具有所述免疫调节剂的功能的蛋白质和/或具有IL-12的功能的蛋白质表达并治疗所述肿瘤。
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