KR20110065565A - 다수의 면역조절자를 발현하는 조작된 세포 및 그 용도 - Google Patents

다수의 면역조절자를 발현하는 조작된 세포 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치료법 분야에 관한 것이다. 가장 구체적으로는 본 발명은 활성화 리간드의 존재 하에 유전자 발현 조정 시스템의 제어 하에 인터루킨-12 (IL-12) 및 하나 이상의 면역조절자를 조건부로 발현하는 시험관 내 조작 면역 세포를 생성하는 방법 및 동물에서의 치료 목적의 용도를 제공한다.

Description

다수의 면역조절자를 발현하는 조작된 세포 및 그 용도{ENGINEERED CELLS EXPRESSING MULTIPLE IMMUNOMODULATORS AND USES THEREOF}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2008년 10월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/103,810호의 우선권을 주장하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
EFS 웹을 통해 전자 제출된 서열 목록에 대한 참고 사항
본 출원과 함께 출원된 전자 제출된 서열 목록 (명칭: sequence listing.ST25.txt; 크기: 213,102 바이트; 생성 일자: 2009년 10월 8일)의 내용이 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 발명은 암과 같은 질환 및 장애의 치료를 위한 유전자 치료법 분야에 관한 것이다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 면역조절자를 발현하기 위한 면역 세포 또는 치료법 지원 세포(therapy support cell; TSC)의 조작 및 치료제로서의 상기 세포의 용도를 제공한다.
인터루킨-12 (IL-12)는 다수의 생물학적 과정에 기여하는 것에 연루된 제I형 사이토카인 패밀리의 구성원으로서, 상기 생물학적 과정은 보호 면역 반응 및 종양생성의 억제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다 (Abdi et al., 2006; Adorini, 1999; Adorini, 2001; Adorini et al., 2002; Adorini et al., 1996; Akhtar et al., 2004; Akiyama et al., 2000; Al-Mohanna et al., 2002; Aliberti et al., 1996; Allavena et al., 1994; Alli and Khar, 2004; Alzona et al., 1996; Amemiya et al., 2006; Araujo et al., 2001; Arulanandam et al., 1999; Athie et al., 2000; Athie-Morales et al., 2004; Bertagnolli et al., 1992; Bhardwaj et al., 1996; Biedermann et al., 2006; Brunda and Gately, 1994; Buchanan et al., 1995; Romani et al., 1997; Rothe et al., 1996; Satoskar et al., 2000; Schopf et al., 1999; Thomas et al., 2000; Tsung et al., 1997; Wolf et al., 1994; Yuminamochi et al., 2007). 점점 많아지고 있는 일련의 증거는 IL-12가 인간 질환 (예를 들어, 암)을 제어 하기 위한 전도 유망한 표적이 될 수도 있음을 시사한다.
IL-12가 제1형 항-종양 NK 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 그의 강력한 지원 활성에 기반한 암 치료제로서 여전히 전도 유망하다는 사실에도 불구하고 (Trinchieri, 2003), 환자에서의 재조합 인간 IL-12 (rhIL-12)의 보고된 독성 (Atkins et al., 1997)은 임상 적용을 위한 GMP-등급 rhIL-12의 한정된 공급원과 함께, 성공적인 IL-12-기반의 치료적 접근을 방지하였다. 따라서, 유전자 치료법 접근법은 더욱 안전하고 더욱 옹호가능한 치료에 대한 선택 사항들을 대표할 수 있음이 합리적인 것으로 보인다. 실제, 재조합 바이러스-기반 (Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005) 또는 플라스미드-기반 IL-12 cDNA (Heinzerling et al., 2005), 또는 IL-12 유전자 변형 자가유래 섬유아세포 (Kang et al., 2001)의 종양내 또는 종양 주위 전달을 구현하는 I기 임상 실험은 안전하고 잘 허용되는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 이들 유전자 치료법을 받고 있는, 흑색종 또는 다양한 범위의 암종을 갖는 환자에서의 객관적 임상 반응은 희귀하고 가변적이며 일시적이었고, 주로 처리 부위에 집중되었다 (Heinzerling et al., 2005; Kang et al., 2001); (Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005). 질환 분해(disease resolution)가 부분적이거나 완전한 경우, 이들 환자에서의 항원-특이적 T 세포의 개선된 교차-프라이밍(cross-priming)과 일관되게, 증가된 빈도의 종양 침윤 림프구 (Heinzerling et al., 2005; Sangro et al., 2004) 및 상승된 수준의 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포 (Heinzerling et al, 2005)가 주목되었었다.
특이적 T 세포의 교차-프라이밍은 IL-12의 천연적이지만 조절된 공급원으로서 작용하는 수지상 세포(dendritic cell; DC)에 의해 최상으로 성취되기 때문에 (Berard et al., 2000), DC-기반 IL-12 유전자 치료법의 탁월한 전임상 효능에 대한 최근의 보고는 매우 흥미로운 것이었다 (Satoh et al., 2002; Tatsumi et al., 2003; Yamanaka et al., 2002). 예를 들어, (재조합 아데노바이러스 감염을 통하여) IL-12p70을 생산하도록 조작된 DC의 종양내 (intratumoral; i.t.) 주사는 쥐과 모델에서 종양 거부와 함께 광범위-반응성의 종양-특이적 CD8+ T 세포 레퍼토리(repertoire)의 교차-프라이밍을 극적으로 개선시키는 것으로 밝혀졌다 (Tatsumi et al., 2003). CMV-기반 프로모터 하의 mIL-12를 코딩하는 재조합 아데노바이러스 [rAd.cIL12, (Tatsumi et al., 2003)]의 이전의 사용을 가정하면, 조작된 DC의 IL-12 생산은 항시적 (constitutive)이었으며, 따라서 종양 병변 내에서의 초기의, 그리고 종양 배출 림프절 (tumor-draining lymph node) 내의 후기의 이 사이토카인의 면역학적 영향은 치료 결과와 관련하여 해결될 수 없었다. 따라서, 트랜스진 (transgene) 발현 수준 및 트랜스진 활성화 타이밍 둘 모두를 조절하기 위한 IL-12의 조건부 발현을 위하여 조작된 DC에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 그러한 세포의 사용에 있어서 전도 유망한 치료 결과를 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 프로모터의 제어 하에, 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 재조합 벡터를 제공한다. 일 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 프로모터는 조건부(conditional)이다. 다른 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 프로모터는 구성적(constitutive)이다. 다른 실시 양태에서, 벡터는 용해성 소분자 리간드, 예를 들어 다이아실하이드라진 (예를 들어, RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932)의 제공에 의해 조건부로 활성화될 수 있는 프로모터에 의해 구동되는 단백질(들)을 코딩하는 아데노바이러스 벡터이다. 이 벡터는 면역 세포 및 TSC로부터의 단백질(들)의 발현의 제어를 가능하게 한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치(gene switch)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하기 위한 벡터이며, 여기서 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시 양태에서, 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN 또는 그의 서브유닛(subunit), IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신 (Defensin), HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 S1OO으로부터 선택되는 벡터를 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들) 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하기 위한 벡터이며, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, (2) 상기 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 상기 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결되는 벡터를 제공한다.
추가로 본 발명은 하나 이상의 면역조절자의 기능을 갖는 단백질(들)을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 생성하는 방법이며, 이 방법은 상기 세포를 상기 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 재조합 벡터로 변형 (예를 들어, 형질감염 (transfection), 전기천공 등)시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 벡터는 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 면역조절자의 기능을 갖는 단백질(들) 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 생성하는 방법이며, 이 방법은 상기 세포를 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 변형시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, (2) 상기 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 상기 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결되는 방법을 제공한다.
추가로 본 발명은 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 재조합 벡터로 변형된 (예를 들어 형질감염, 전기천공 등), 하나 이상의 면역조절자의 기능을 갖는 단백질(들)을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단이며, 여기서 상기 벡터는 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 변형된, 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, (2) 상기 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 상기 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결되는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 함유하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물 중 세포의 각각의 집단은 상기 조성물 중 세포의 다른 집단(들)에서 발현되는 하나 이상의 면역조절자와는 상이한 하나 이상의 면역조절자를 발현하는 조성물을 제공한다. 일 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 두 집단을 함유한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 둘 초과의 집단을 함유한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 세 집단을 함유한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 네 집단을 함유한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC를 제공한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC이며, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, (2) 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결되는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC를 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명의 시험관 내 조작 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 함유하는 조성물이며, 여기서, 상기 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 집단 각각은 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 각각의 집단은 상기 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 다른 집단(들)에서 발현되는 하나 이상의 면역조절자와는 상이한 하나 이상의 면역조절자를 발현하는 조성물을 제공한다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 각각의 집단이 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 시험관 내 조작 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 함유하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, (2) 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된다. 일 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 두 집단을 함유한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 둘 초과의 집단을 함유한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 세 집단을 함유한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 네 집단을 함유한다.
또한 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
일 실시 양태에서, 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 스위치의 프로모터의 제어 하에 있으며, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터의 제어 하에 있다. 또 다른 실시 양태에서, 면역조절자(들)의 기능을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 둘 모두는 유전자 스위치의 다중 시스트론 (multicistronic) 프로모터의 제어 하에 있다. 또 다른 실시 양태에서, 면역조절자(들)의 기능을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 스위치의 프로모터의 제어 하에 있으며 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 스위치 프로모터와는 상이한 조건부 프로모터의 제어 하에 있다. 추가의 실시 양태에서, 면역조절자(들)의 기능을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 위한 유전자 조절 시스템 및 IL-12의 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드를 위한 유전자 조절 시스템은 직교성을 갖는다. 추가의 실시 양태에서, 각각의 단백질을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드를 위한 유전자 조절 시스템은 직교성을 갖는다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 암, 예를 들어 제한되지 않지만 흑색종 종양, 신경교종 종양, 신장암, 및 전립선암은 물론 본 명세서에 표 1에 열거된 암들의 치료법을 또한 제공한다. IL-12 유전자 치료법은 재조합 cDNA 벡터로서 적용될 때 동물 모델 연구에서 항-종양 효능을 입증하였지만(Faure et al., 1998; Sangro et al., 2005), 유전자-변형 DC와 관련하여 적용될 때에는 더욱 더 그러하다 (Satoh et al., 2002; Svane et al., 1999; Tatsumi et al., 2003; Yamanaka et al., 2002). 그러나, 현재까지 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 구현하는 IL-12 유전자 치료법의 인간 I상 임상 시험에서는 암 세팅에서 영속적이고 객관적인 임상 반응이 달성되지 못하였다 (Heinzerling et al., 2005; Kang et al., 2001; Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005). 본 명세서에 개시된 유전자 치료법은 전도 유망한 치료 양식을 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서, 면역 세포 또는 TSC의 각각의 집단은 하나 이상의 면역조절자의 상이한 세트를 발현함 - ; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서, 면역조절자 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어 하에 있음 - ; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서, 면역 세포 또는 TSC의 각각의 집단은 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질의 상이한 세트를 발현하며, 면역조절자 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어 하에 있음 - ; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 변형된 변형 세포의 집단을 포유류에 투여하는 단계; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 상기 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 변형된 변형 세포의 둘 이상의 집단을 포유류에 투여하는 단계 - 여기서, 변형 세포의 각각의 집단은 하나 이상의 면역조절자의 상이한 세트를 발현함 - ; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 변형된 변형 세포의 집단을 포유류에 투여하는 단계 - 여기서, 면역조절자 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어 하에 있음 - ; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 상기 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 변형된 변형 세포의 둘 이상의 집단을 포유류에 투여하는 단계 - 여기서, 변형 세포의 각각의 집단은 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질의 상이한 세트를 발현하며, 면역조절자 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어 하에 있음 - ; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 치료법의 시작 전에 환자에서 IFN-감마의 발현 또는 활성의 수준을 측정하며 그에 의해 대조 수준을 생성하고 이어서 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 선택적으로 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 투여하는 단계, 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계, 및 그 후 IFN-감마의 발현 수준을 측정하여 시험 수준을 생성하는 단계와, 대조 수준을 시험 수준과 비교하여 당해 치료 요법 (therapeutic regime)이 유효한지를 결정하는 단계에 의해 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC를 기반으로 하는 치료법의 효능을 결정하는 방법을 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 필요로 하는 환자로부터 얻은 제1 생물 샘플 중 인터페론-감마 (IFN-감마)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 시험관 내 조작 세포의 투여 전에 측정하고 그에 의해 대조 수준을 생성하는 단계;
(b) 필요로 하는 환자에게 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 선택적으로 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 조작된 시험관 내 조작 세포를 투여하는 단계;
(c) 필요로 하는 상기 환자에게 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계;
(d) 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 활성화 리간드의 투여 이후에 필요로 하는 상기 환자로부터 얻은 제2 생물 샘플 중 IFN-감마의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하고 그에 의해 시험 수준을 생성하는 단계; 및
(e) IFN-감마의 대조 수준을 그의 시험 수준과 비교하는 단계 - 여기서, IFN-감마의 발현, 활성 또는 이들 둘 모두의 시험 수준이 대조 수준에 비하여 증가하는 것은 당해 치료 요법이 그를 필요로 하는 상기 환자에서 유효함을 나타냄 -
를 포함하는, 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC를 기반으로 하는 치료 요법의 효능을 환자에서 결정하는 방법을 제공한다.
서열의 상세한 설명
면역조절자
사이토카인류
감염에 대한 염증 반응에 중요한 사이토카인인 인터루킨 1 (IL-1)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 M28983 (인간 IL-1α); M15330 (인간 IL-1β); AF201830 (인간 IL-1δ); AF201831 (인간 IL-1ε); AF201832 (인간 L-1ζ); AF201833 (인간 IL-1η); NM_010554 (생쥐 IL-1α); NM_008361 (생쥐 IL-1β); NM_019451 (생쥐 L-1δ) NM_019450 (생쥐 IL-lf6); NM_027163 (생쥐 IL-lf8); NM_153511 (생쥐 IL-lf9); NM_204524 (닭 IL-1β); NM_017019 (쥐 IL-1α); 및 NM_031512 (쥐 IL-1β)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 1 (IL-1)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA59134 (인간 IL-1α); AAA59135 (인간 IL-1β); AAF25210 (인간 IL-1δ); AAF25211 (인간 IL-1ε); AAF25212 (인간 IL-1ζ); AAF25213 (인간 IL-1η); NP_034684 (생쥐 IL-1α); NP_032387 (생쥐 IL-1β); NP_062324 (생쥐 L-1δ); NP_062323 (생쥐 IL-lf6); NP_081439 (생쥐 IL-lf8); NP_705731 (생쥐 IL-lf9), NP_989855 (닭 IL-1β); NP_058715 (쥐 IL-1α); 및 NP_113700 (쥐 IL-1β)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. [Laurent et al., Psychiatr. Genet. 7: 103 (1997)]에는 인간 인터루킨-1 베타 유전자에서의 다형성 돌연변이 (polymorphic mutation)가 확인되었다.
IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21을 포함하는 사이토카인 패밀리에 속하는 인터루킨 2 (IL-2)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U25676 (인간); NM_008366 (생쥐); NM_204153 (닭); 및 NM_053836 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 2 (IL-2)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA70092 (인간); NP_032392 (생쥐); NP_989484 (닭); 및 NP_446288 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Liu et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 133: 11 (2006)]에서는 돌연변이 인간 IL-2가 생성되었으며, [Lorberboum et al., J. Biol. Chem. 265: 16311 (1990)]에는 키메라 IL-2의 생성이 기술되어 있다.
나이브 (naive) 헬퍼 (helper) T 세포의 Th2 세포로의 분화를 유도하는 사이토카인인 인터루킨 4 (IL-4)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 M23442 (인간); NM_021283 (생쥐); NM_001007079 (닭); 및 NM_201270 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 4 (IL-4)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA59150 (인간); NP_067258 (생쥐); NP_001007080 (닭); 및 NP_958427 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Kawashima et al., J. Med. Genet. 35: 502 (1998)]에는 아토피성 피부염과 결부된, IL-4 유전자의 다형성이 기술되어 있다.
인터루킨 7 (IL-7)은 B 및 T 세포 발생에 중요한 사이토카인이다. IL-7의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 J04156 (인간); NM_008371 (생쥐); NM_001037833 (닭); 및 NM_013110 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 7 (IL-7)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA59156 (인간); NP_032397 (생쥐); NP_001032922 (닭); 및 NP_037242 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Feng et al., Genetics 775:545 (2007)]에서는 기능 결핍 (functional deficiency)으로 이어지는 IL-7의 점 돌연변이가 확인되었다.
인터루킨 9 (IL-9)는 T 세포에 의해 생성되는 사이토카인으로서 조혈 세포의 조절자이다. IL-9의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000590 (인간); NM_008373 (생쥐); NM_001037825 (닭); 및 NM_0O1105747 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 인터루킨명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 9 (IL-9)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000581 (인간); NP_032399 (생쥐); NP_OO1032914 (닭); 및 NP_001099217 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
IL-12는 활성화된 T 및 NK 세포에 있어서 성장 인자로서 작용하며 NK/림포카인-활성화 살해 세포 (Killer cell)의 용해 활성 (lytic activity)을 향상시키며 휴면 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 의한 IFN-감마의 생성을 촉진할 수 있는 사이토카인이다. IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000882 (인간 IL12A); NM_002187 (인간 IL12B); NM_008351 (생쥐 IL12a); NM_008352 (생쥐 IL12b); NM_213588 (닭 IL12A); NM_213571 (닭 IL12B); NM_053390 (쥐 IL12a); 및 NM_022611 (쥐 IL12b)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 12 (IL-12)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000873 (인간 IL12A); NP_002178 (인간 IL12B); NP_032377 (생쥐 IL12a); NP_032378 (생쥐 IL12b); NP_998753 (닭 IL12A); NP_998736 (닭 IL12B); NP_445842 (쥐 IL12a); 및 NP_072133 (쥐 IL12b)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 15 (IL-15)는 T 세포 및 자연 살해 세포의 활성화 및 증식을 조절하는 사이토카인이다. IL-15의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U14407 (인간); NM_008357 (생쥐); EU334509 (닭); 및 AF015719 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 15 (IL-15)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA21551 (인간); NP_032383 (생쥐); ABY55312 (닭); 및 AAB94536 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 12와 함께 대식세포에 의해 생성되는 사이토카인인 인터루킨 18 (IL-18)은 미생물 제품에 의한 감염 이후의 세포-매개 면역성을 유도한다. IL-18의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U90434 (인간); NM_008360 (생쥐); EU747333 (닭); 및 AY258448 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 18 (IL-18)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAB50010 (인간); NP_032386 (생쥐); ACE79188 (닭); 및 AAP14669 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
세포 증식을 유도함으로써 자연 살해 세포 및 세포독성 T 세포를 비롯한 면역계 세포에 강력한 조절적 영향을 미치는 사이토카인인 인터루킨 21 (IL-21)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AF254069 (인간); NM_021782 (생쥐); NM_001024835 (닭); 및 NM_001108943 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 21 (IL-21)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAG29348 (인간); NP_068554 (생쥐); NP_001020006 (닭); 및 NP_0O1102413 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 27 (IL-27)은 B 및 T 림프구의 활성을 조절하는데 있어서 중요한 기능을 하는 사이토카인이다. IL-27의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AY099296 (인간); NM_145636 (생쥐); 및 XM_344962 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 27 (IL-27)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAM34498 (인간); NP_663611 (생쥐); 및 XP_344963 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
특정 세포 표면 수용체 (IFNAR)에 결합하는 인터페론 단백질 군의 구성원이며 대식세포 및 자연 살해 (natural killer, NK) 세포 둘 모두를 자극하여 항-바이러스 반응을 초래하는 인터페론 베타 1 (IFNB1)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002176 (인간); NM_010510 (생쥐); NM_001024836 (닭); 및 NM_019127 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론 베타 1 (IFNB1)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002167 (인간); NP_034640 (생쥐); NP_001020007 (닭); 및 NP_062000 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론 감마 (IFN-감마)는 유일한 제II형 인터페론인 용해성 사이토카인으로서 항바이러스, 면역조절 및 항종양 활성을 갖는다. IFN-감마의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000619 (인간); NM_008337 (생쥐); 및 NM_138880 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론 감마 (IFN-감마)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000610 (인간); NP_032363 (생쥐); 및 NP_620235 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
지질 대사, 응고, 인슐린 허용성 및 내피세포 기능에 영향을 미치는, 주로 단구/대식세포에 의해 분비되는 다기능성 전염증성 사이토카인인 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor) (TNF-알파)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X02910 (인간); NM_013693 (생쥐); 및 BC107671 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
TNF-알파의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA26669 (인간); NP_038721 (생쥐); 및 AAI07672 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
케모카인류
케모카인 [C 모티프 (motif)] 리간드 1 (XCL1, 림포탁틴으로도 공지됨)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해서는 주화성을 갖지만 단구에 대해서는 주화성을 갖지 않으며, 말초 혈액 림프구 중 세포내 칼슘의 상승을 유도한다. XCL1의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002995 (인간); NM_OO851O (생쥐); 및 NM_134361 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
XCL1의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002986 (인간); NP_032536 (생쥐); 및 NP_599188 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 미국 특허 제6,022,534호에는 림포탁틴과, 세포독성 T 세포 및/또는 NK 세포를 유인하고/하거나 증식 또는 상주 세포(resident cell)를 유도하는 용도가 개시되어 있다. XCL1 융합 단백질 및 항-림포탁틴 항체의 단리 및 사용 방법이 또한 개시되어 있다.
다형핵 백혈구의 모집 및 활성화에 있어서 급성 염증 상태에 연루된, 소위 모노카인 (주로 단구 및 대식세포에 의해 생성되는 소정 유형의 사이토카인)이며 대식세포 염증 단백질-1 (macrophage inflammatory protein-1, MIP-1)로도 공지된 CC 케모카인 리간드 3 (CC chemokine ligand 3, CCL3)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002983 (인간); NM_011337 (생쥐); 및 NM_013025 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL3의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002974 (인간); NP_035467 (생쥐); 및 NP_037157 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
염증 및 천식에 연루된 전염증성 사이토카인인 CCL5 (RANTES)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AF043341 (인간); NM_013653 (생쥐); 및 NM_031116 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL5의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAC03541 (인간); NP_038681 (생쥐); 및 NP_112378 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
염증 및 암 침범 동안 대식세포 모집에 연루된 케모카인인 CC 케모카인 리간드 7 (CCL7)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_006273 (인간); NM_013654 (생쥐); 및 NM_001007612 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL7의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_006264 (인간); NP_038682 (생쥐); 및 NP_001007613 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
케모카인 (CXC 모티프) 리간드 9 (CXCL9, MIG로도 공지됨)는 감마 인터페론에 의해 유도가능한 T-세포 화학 유인 물질(chemoattractant)이다. CXCL9의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002416 (인간); NM_ O108599 (생쥐); 및 NM_145672 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CXCL9의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002407 (인간); NP_032625 (생쥐); 및 NP_663705 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL1O)은 면역계에서의 세포에 대한 화학유인, 내피 세포에의 T 세포의 유착, 항-종양 활성 및 혈관신생에서의 역할을 갖는 작은 사이토카인이다. CXCL1O의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X02530 (인간); NM_021274 (생쥐); 및 BC058444 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL1O)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA26370 (인간); NP_067249 (생쥐); 및 AAH58444 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기질 세포 유래 인자 1 (stromal cell-derived factor 1, SDF-1)로도 공지된 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (CXCL12)는 인터크라인 패밀리 (intercrine family)에 속하는 작은 사이토카인인데, 상기 패밀리의 구성원은 백혈구를 활성화시키며 LPS, TNF 또는 IL1과 같은 전염증성 자극에 의해 흔히 유도된다. CXCL12의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000609 (인간); NM_001012477 (생쥐); NM_204510 (닭); 및 NM_001033883 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CXCL12의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_00O6OO (인간); NP_001012495 (생쥐); NP_989841 (닭); 및 NP_001029055 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Hansson et al., Microbes and Infection 8:841 (2006)]에서는 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 7 (CCR7)과 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 19 (CCL19, MIP-3β로도 공지됨) 사이의 상호작용이 일차 면역 반응의 생성에 결정적임이 논의되어 있다. CCR7의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_001838 (인간); 및 NM_007719 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCR7의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_001829 (인간); 및 NP_031745 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL19의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_006274 (인간); 및 NM_011888 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL19의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_006265 (인간); 및 NP_036018 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD4+ T 세포가 그의 정상 상태인 '기준점 (set point)'에 도달하는데에는 필요하지만 CD8+ T 세포의 경우에는 필요하지 않은 CCR7의 잘 확립된 리간드인 CC 케모카인 리간드 21 (CCL21) - CCL21의 발현에서의 동요 (perturbation)는 자가면역에 대한 감수성을 변경시킬 수 있음 - 의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AB002409 (인간); NM_011335 (생쥐 CCL21a); NM_011124 (생쥐 CCL21b); 및 NM_023052 (생쥐 CCL21c)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL21의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 BAA21817 (인간); NP_035465 (생쥐 CCL21a); NP_035254 (생쥐 CCL21b); 및 NP_075539 (생쥐 CCL21c)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨-8 (IL-8)은 호중구-활성화 펩티드-1 또는 SCYB8로도 불리우는 케모카인이며 염증성 자극에 반응하여 몇몇 유형의 세포에 의해 분비되는 조직-유래 펩티드이다. 미국 특허 제6,133,426호 및 미국 특허 제6,177,980호에는 인간화 항-IL-8 항체의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 인간 IL-8의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000584로서 입수가능하며, 상기 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간 IL-8의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000575로서 입수가능하며, 상기 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다.
성장 인자류
과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)는 백혈구 세포 성장 인자로서의 기능을 하며 줄기 세포를 자극하여 과립구 (호중구, 호산구 및 호염기구) 및 단구가 생성되게 하는 사이토카인이다. GM-CSF의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 M11734 (인간); NM_009969 (생쥐); EU520303 (닭); NM_001037660 (쥐 Csf2ra); 및 NM_133555 (쥐 Csf2rb)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA52122 (인간); NP_034099 (생쥐); ACB11534 (닭); NP_001032749 (쥐 Csf2ra); 및 NP_598239 (Csf2rb)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
조혈 줄기 세포 또는 전구 세포 또는 이들 둘 모두 상에서 성장 인자 수용체로서의 기능을 할 수 있는 FMS-관련 타이로신 키나아제 리간드 (FLT3/FLK2 리간드, Flt3L)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U04806 (인간); 및 NM_013520 (생쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
FLT3/FLK2 리간드 (Flt3L)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA17999 (인간); 및 NP_038548 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 인간 암에서 상향조절되고 배양 세포에 형질전환된 표현형을 가역적으로 부여할 수 있는 형질전환 성장 인자 (transforming growth factor), 알파 (TGF-알파)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_001099691 (인간); NM_031199 (생쥐); NM_001001614 (닭); 및 NM_012671 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
TGF-알파의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_001093161 (인간); NP_112476 (생쥐); NP_001001614 (닭); 및 NP_036803 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
아쥬반트류 (Adjuvants)
베타-디펜신은 많은 그람(Gram)-음성 및 그람-양성 박테리아, 진균류 및 바이러스에 대한 선천성 면역 반응에 연루된 항미생물 펩티드이다. 베타-디펜신의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X92744 (인간 hBD-1); AJ000152 (인간 hBD-2); AF217245 (인간 베타 디펜신-3); AJ314835 (인간 베타 디펜신-4); AB089180 (인간 hBD- 5); AY122466 (인간 디펜신 베타 106, DEFB106); AF540979 (인간 베타 디펜신 107, DEFB 107); AF529416 (인간 베타 디펜신, DEFB 108); DQO12014 (인간 베타 디펜신 110, DEFB11O); DQO12015 (인간 베타 디펜신 111, DEFB111); DQO12016 (인간 베타 디펜신 112, DEFB112); DQ012017 (인간 베타 디펜신 113, DEFB113); DQ012018 (인간 베타 디펜신 114, DEFB114); DQ012019 (인간 베타 디펜신 115, DEFB115); DQO12020 (인간 베타 디펜신 116, DEFB116); DQO 12021 (인간 베타 디펜신 117, DEFB117); NM_007843 (생쥐 디펜신 베타 1); NM_010030 (생쥐 디펜신 베타 2, Defb2); NM_013756 (생쥐 디펜신 베타 3, Defb3); NM_019728 (생쥐 디펜신 베타 4, Defb4); NM_030734 (생쥐 디펜신 베타 5, Defb5); NM_054074 (생쥐 디펜신 베타 6, Defb6); NM_139220 (생쥐 디펜신 베타 7); NM_153108 (생쥐 디펜신 베타 8, Defb8); NM_139219 (생쥐 디펜신 베타 9, Defb9); 및 NM_139225 (생쥐 디펜신 베타 10, DefblO)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
베타-디펜신의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA63405 (인간 hBD-1); CAB65126 (인간 hBD-2); AAF73853 (인간 베타 디펜신-3); CAC85520 (인간 베타 디펜신-4); BAC10630 (인간 hBD- 5); AAM93908 (인간 디펜신 베타 106, DEFB106); AAN33115 (인간 베타 디펜신 107, DEFB 107); AAQ09525 (인간 베타 디펜신, DEFB 108); AAY59750 (인간 베타 디펜신 110, DEFB110); AAY59751 (인간 베타 디펜신 111, DEFB111); AAY59752 (인간 베타 디펜신 112, DEFB112); AAY59753 (인간 베타 디펜신 113, DEFB113); AAY59754 (인간 베타 디펜신 114, DEFB114); AAY59755 (인간 베타 디펜신 115, DEFB115); AAY59756 (인간 베타 디펜신 116, DEFB116); AAY59757 (인간 베타 디펜신 117, DEFB117); NP_031869 (생쥐 디펜신 베타 1); NP_034160 (생쥐 디펜신 베타 2, Defb2); NP_038784 (생쥐 디펜신 베타 3, Defb3); NP_062702 (생쥐 디펜신 베타 4, Defb4); NP_109659 (생쥐 디펜신 베타 5, Defb5); NP_473415 (생쥐 디펜신 베타 6, Defb6); NP_631966 (생쥐 디펜신 베타 7, Defb7); NP_694748 (생쥐 디펜신 베타 8, Defb8); NP_631965 (생쥐 디펜신 베타 9, Defb9); 및 NP_631971 (생쥐 디펜신 베타 10, DefblO)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 추가의 인간 및 쥐 디펜신 펩티드 서열에 대해서는 미국 특허 제5,242,902호를 또한 참조하라.
고-이동성 그룹 박스-1 (high-mobility group box-1, HMGB1) 단백질은 비히스톤(nonhistone) 염색체 단백질로서 이는 사이토카인으로서의 기능을 하여 괴사성 세포 사멸 및 암, 병원체에 의한 침범, 외상, 및 패혈증에 대한 국소 반응 및 전신 반응을 매개한다. HMGB1 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002128 (인간); NM_010439 (생쥐); NM_204902 (닭); 및 NM_012963 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
고-이동성 그룹 박스-1 (HMGB1)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002119 (인간); NP_034569 (생쥐); NP_990233 (닭); 및 NP_037095 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
식세포 S1OO 단백질은 염증 반응을 매개하여 염증 세포를 조직 손상 부위로 모집하며, 선천성 면역에 중요한 손상-결부 분자 패턴 (Damage-associated molecular pattern, DAMP) 분자의 구성원이다. [Foell et al., J. Leukocyte Biol. 81:1 (2006)]을 참조하라. S1OO 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 BCO14392 (인간 S1OO A1); BC002829 (인간 S1OO A2); BC012893 (인간 S1OO A3); BC016300 (인간 S1OO A4); Z18954 (인간 S1OOD); BCOO1431 (인간 S1OO A6); BC034687 (인간 S1OO A7); BC005928 (인간 S1OO A8); BC047681 (인간 S1OO A9); BCO15973 (인간 S1OO A1O); D38583 (인간 클라기자린 (clagizzarin)); NM_011309 (생쥐 S1OOa1); NM_009115 (생쥐 S1OOb); NM_013650 (생쥐 S100a8); NM_009114 (생쥐 S100a9); NM_011310 (생쥐 S100a3); NM_011311 (생쥐 S100a4); 및 NM_011312 (생쥐 S100a5)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
S1OO 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAH14392 (인간 S1OO A1); AAH02829 (인간 S1OO A2); AAH12893 (인간 S1OO A3); AAH16300 (인간 S1OO A4); CAA79479 (인간 S1OOD); AAHO1431 (인간 S1OO A6); AAH34687 (인간 S1OO A7); AAH05928 (인간 S1OO A8); AAH47681 (인간 S1OO A9); AAH15973 (인간 S1OO A1O); BAA07597 (인간 클라기자린); NP_035439 (생쥐 S1OOa1); NP_033141 (생쥐 S1OOb); NP_038678 (생쥐 S100a8); NP_033140 (생쥐 S100a9); NP_035440 (생쥐 S100a3); NP_035441 (생쥐 S100a4); 및 NP_035442 (생쥐 S100a5)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
당 만노스의 중합체인 식물 다당류, 만난(mannan)은 면역 반응의 생성에 유용하다. 미국 특허 제5,807,559호에는 종양-결부 탄수화물 구조체에 대하여 또는 감염제 (infectious agent) 및/또는 감염된 숙주 세포 상에서 발현되는 탄수화물 구조체에 대하여 T 세포 면역성을 생성하는데 유용할 수 있는 만난의 면역원성 콘쥬게이트(conjugate)가 개시되어 있다. 미국 특허 제5,773,425호에는 바이러스성 질환의 치유 및/또는 증상의 완화를 위하여 그리고 면역 반응의 증강을 위하여 만난을 사용하는 것이 개시되어 있다.
약화된 생 마이코박테리움 (Mycobacterium) 종인 바실레 칼메테-구에린 (Bacille Calmette - Guerin, BCG)이 중증의 치명적 결핵의 예방에 대한 백신으로서 사용된다. 미국 특허 제7,393,541호에는 포유류 대상에서 마이코박테리움에 대한 생체 내 (in vivo) T-세포 매개 면역 반응을 생성하기 위한 아쥬반트 백신 (adjuvant vaccine)의 생성이 개시되어 있다. [Hubbard and Collins, Infect. Immun. 59(2): 570]을 또한 참조하라. 미국 특허 제5,292,513호에는 증강된 살균 및 항바이러스 활성을 필요로 하는 환자에 있어서 생체 내에서 대식세포를 가열 살균한 BCG로 프라이밍하는 (priming) 방법이 개시되어 있다. BCG의 완전 게놈 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NC_008769로서 입수가능하다 (엠. 보비스 비씨지 균주 파스퇴르 (M. bovis BCG str. Pasteur) 1173P2, 완전 게놈).
박테리아 리포다당류 (lipopolysaccharides, LPS)는 그람-음성 박테리아에 의한 감염시 강한 면역 반응을 유도하는 내독소이다. 미국 특허 제4,148,877호에는 박테리아 배양물로부터 LPS를 분획화하는 것 및 이 분획물을 약물로 사용하여 박테리아 감염에 대한 허용성을 유도하는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,292,513호에는 증강된 살균 및 항바이러스 활성을 필요로 하는 환자에 있어서 생체 내에서 대식세포를 LPS로 프라이밍하는 방법이 개시되어 있다.
공동 자극 (co-stimulatory) 분자 (양성)
OX40 리간드 (OX40L)는 종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리 멤버 4 (tumor necrosis factor superfamily member 4, Tnfsf4)에 속하며, 수지상 세포 상에서 발현되며 Th2 세포 분화를 촉진한다. OX40 리간드의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X79929 (인간); U12763 (생쥐); 및 AF037067 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
OX40 리간드 (OX40L)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA56284 (인간); AAA21871 (생쥐); 및 AAC67236 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
4-1BB 리간드 (4-1BBL)는 종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리 멤버 9 (Tnfsf9)에 속하는데, 이는 제2형 막관통 당단백질이며 활성화된 T 림프구 상에서 발현된다. 4-1BBL의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_003811 (인간); NM_009404 (생쥐); 및 AY332409 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
4-1BB 리간드 (4-1BBL)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_003802 (인간); NP_033430 (생쥐); 및 AAQO1228 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD40 단백질은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 5에 속하며, T 세포-의존성 면역글로불린 클래스 스위칭, 기억-B 세포 발생 및 배 중심 (germinal center) 형성을 포함하는 매우 다양한 면역 및 염증 반응의 매개에서 필수적이다. CD40 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X60592 (인간); NM_170701 (생쥐); NM_204665 (닭); 및 NM_134360 (쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD40 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA43045 (인간); NP_733802 (생쥐); NP_989996 (닭); 및 NP_599187 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
글루코코르티코이드-유도성 종양 괴사 인자 수용체 패밀리-관련 단백질 (GITR)은 T 세포 자극을 통하여 효과적인 종양 면역성을 야기할 수 있다. 항-GITR 단클론 항체 (mAb)의 투여는 강력한 종양-특이적 면역성을 유발할 수 있으며, 확립된 종양을 명시적인 자가면역 질환의 초래 없이 퇴치하였다. [Ko et al., J. Exp. Med 7: 885 (2005)]을 참조하라. 미국 특허 제6,503,184 B1호에는 항-GITR 항체가 개시되어 있다.
GITR 리간드 (GITRL)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AY358868 (인간); 및 AY359852 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
GITR 리간드 (GITRL)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAQ89227 (인간); 및 AAQ55265 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
p30 또는 LIGHT로도 지칭되는 헤르페스 바이러스 진입 매개자 (Herpes virus entry mediator, HVEM) 결합 리간드 (HSVgD)는 T-세포의 공동 자극 (co-stimulation)에 연루된 TNF 패밀리 구성원이다. LIGHT는 2개의 수용체, 헤르페스 바이러스 진입 매개자 (HVEM) 및 림포톡신 (lymphotoxin)-β 수용체 (LT-βR)를 갖는다. HVEM에 대한 리간드이기 때문에 HSVgD는 T 세포에 대한 공동 자극 인자로서 작용함으로써 T 세포를 활성화시키고 이는 T 세포의 증식 및 사이토카인 분비로 이어진다. LIGHT의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해서는 미국 특허 제7,118,742호를 참조하라. 미국 특허 제5,654,174호에는 카르복시 말단 잔기가 결실된 gD 단백질 변이체가 개시되어 있다.
CD70은 CD27에 결합하는 사이토카인이다. 이것은 T-세포 활성화에서 그 역할을 한다. 이것은 공동 자극된 T-세포의 증식을 유도하며 세포용해성 T-세포의 생성을 증강시킨다. CD70의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_001252 (인간); NM_011617 (생쥐); 및 NM_001106878 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD70의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_001243 (인간); NP_035747 (생쥐); 및 NP_001100348 (쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
ICOS-L은 T-세포-특이적 세포 표면 수용체 ICOS에 대한 리간드이며 T-세포 증식 및 사이토카인 분비에 있어서 공동 자극 시그널 (signal)로서 작용한다. ICOS-L은 또한 플라즈마 세포 (plasma cell)로의 B 세포의 증식 및 분화를 유도한다. ICOS-L은 기억 T-세포 기능을 공동 자극함으로써 2차 면역 반응을 조정하는데 있어서뿐만 아니라 염증 상태에 대한 국소적 조직 반응을 매개하는데 있어서도 중요한 역할을 할 수 있다. ICOS-L의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_015259 (인간); 및 NM_015790 (생쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
ICOS-L의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_056074 (인간); 및 NP_056605 (생쥐)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
PD-L1 (CD274로도 공지됨) 단백질은 활성화된 단구, T 및 B 세포에서 발현된다. PD-L1은 IFN-감마로 처리시 단구에서 상향조절되며 IFN-감마를 다른 활성제와 함께 이용하여 처리시 수지상 세포 및 각질 세포에서 상향조절된다. PD-L1 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_014143 (인간); 및 NM_021893 (생쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
PD-L1 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_054862 (인간); 및 NP_068693 (생쥐)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
공동 자극 분자 (음성)
세포독성 T 림프구-결부 4 (cytotoxic T lymphocyte-associated 4, CTLA4)는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이며, 활성화된 T 세포에서 발현되는 공동 자극 분자이다. 미국 특허 제7,034,121호 및 미국 특허 제6,984,720호에는 CTLA4에 대한 항체의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있다. 또한 미국 특허 제6,984,720호에는 항-CTLA4 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 개시되어 있다.
PD-1 분자는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 구성원인데, 이는 PD-1 리간드 (PD-L1)에 결합한다. PD-L1에 의한 T-세포 상의 PD-1 수용체의 결합은 공동 자극 시그널을 상기 세포에 전달하며, 이는 상기 세포가 세포 주기를 통하여 진행하는 것을 방지하고, T 세포 증식을 증가시킨다. 항-PD-L1 항체를 이용하여 PD-L1과 T 세포 상의 수용체 사이의 상호작용을 억제하면 면역 세포 에너지로서 칭해지는 면역 반응이 하향 조절된다. 미국 특허 제7,029,674호에는 항-PD-L1 항체의 제조 방법 및 서열이 개시되어 있다.
주로 PD-L2는 PD-1 (또는 인간 상동체 PDCD1)에 대한 리간드로 공지되어 있다. 그러나, PD-12는 PDCD1-독립적 방식으로 T 림프구 증식 및 INF-감마 생성에 있어서 필수적인 공동 자극 시그널에 연루된 것으로 보고되었었다. PDCD1과의 상호작용은 사이토카인 생성, 및 세포 주기 진행의 차단에 의해 T-세포 증식을 억제한다. [Yamazaki et al., J. of Immunol. 169: 5538 (2002)] 및 [Ansari et al., J. Exp. Med. 198: 63 (2003)]에는 항-PD-L2 단클론 항체의 제조가 기술되어 있다.
역면역 억제제 (Counter Immune Suppressant) (허용성 억제제 (Tolerance Inhibitor))
형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β)는 2가지 막관통 세린/트레오닌 키나아제 수용체, 즉 제I형 및 제II형 중 하나와 상호작용함으로써 세포 증식 및 분화를 조절하는 다기능성 단백질이다. [Chen et al., Science 28: 1335 (1993)]을 참조하라. 제II형 TGF 수용체 (TGFR2)는 제I형 수용체를 인산화시켜서 활성화시키는데, 상기 제I형 수용체는 자가인산화 되고, 그 후 SMAD 전사 조절자에 결합하여 상기 조절자를 활성화시킨다. [Lynch MA et al., Cancer Res. 58: 4227 (1998)]에는 형질전환 성장 인자 β 제II형 수용체 유전자 (TGFBR2)에서의 돌연변이가 기술되어 있는데, 상기 돌연변이는 인간 난소암종과 결부되어 있다. [Brand et al., J. Biol. Chem. 255:11500-11503 (1993)]에는 예측된 세린/트레오닌 키나아제 세포질 도메인 (공개 데이터베이스로부터 수탁 번호 M85079로서 입수가능한 TGFβR2 cDNA H2-3FF의 뉴클레오티드 1172-2036, 그리고 수탁 번호 AAA61164로서 입수가능한 아미노산 서열)의 결실이 모든 3가지 TGF-β (1,2 및 3) 의존성 유전자 발현을 손상시킨다는 것이 기술되어 있다. TGF-β는 대부분의 인간 종양에서 생성되며 종양 항원-특이적 세포 면역성을 억제한다. [Foster et al., J. Immunother. 31:500 (2008)]에는 세포독성 T 림프구에서의 우성 음성 TGFβR2의 발현이 TGF-β의 억제 효과에 대한 허용성에 이르게 될 수 있음이 기술되어 있다.
TGFβ는 형질전환의 유도에서 TGFα와 함께 상승 작용식으로 작용한다. 이것은 또한 음성 자가분비 성장 인자로서 작용한다. TGFβ 활성화 및 시그널링의 이상조절 (dysregulation)은 아폽토시스 (apoptosis)로 이어질 수 있다. [Ziyadeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 8015 (2000)]에는 현성 신증 (overt nephropathy)이 발병된 제II형 당뇨병의 모델인 db/db 생쥐에서 항-TGFβ 항체의 투여가 신부전증 및 사구체 경화를 방지할 수 있음이 기술되어 있다. TGFβ 단클론 항체의 제조 및 사용 방법이 미국 특허 제6,419,928호에 기술되어 있다. [Barcellos-Hoff et al., Am J. Pathol. 147:5 (1995)]에는 TGFβ 항체의 생성 방법이 또한 기술되어 있다. TGFβ 융합 단백질 작제물의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 미국 특허 제6,756,215호에 기술되어 있다.
IL-10은 활성화된 Th2 세포, B 세포, 각질 세포, 단구, 및 대식세포에 의해 생성되는 사이토카인이다. IL-10은 활성화된 대식세포에 의해 그리고 헬퍼 T-세포에 의해 생성되는 IFN-감마, IL-2, IL-3, TNF 및 GM-CSF를 포함하는 다수의 사이토카인의 합성을 억제한다. IL-10은 활성화된 인간 B 세포의 성장 및 분화의 촉진, Th1 반응을 억제하여 이식 거부 및 T-세포 매개 자가면역 질환을 방지하는데 유용하다. [O'Farrell et al., EMBO J. 17:1006 (1998)]; [Kanbayashi et al., Cell Immunol. 171:153 (1996)]; [Fukushima et al., Br. J. Ophthalmol. 90:1535 (2006)]; 및 [van Lent et al., Ann. Rheum. Dis. 66:334 (2007)]에는 항-IL-10 항체의 제조가 기술되어 있다. 미국 특허 제7,326,567호에는 IL-10 항체의 폴리뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,837,232호에는 B-세포 매개 자가면역 장애를 항-IL-10 항체로 치료하는 방법이 개시되어 있다.
사이토카인 시그널링 억제자 (suppressor of cytokine signaling, SOCS) 패밀리의 단백질은 사이토카인 신호 전달을 조절하는 고전적인 음성 피드백 (feedback) 시스템의 일부분을 형성한다. [Alexander et al., Cell 98: 597 (1999)]에는 사이토카인 시그널링 억제자 1 (suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)이 인터페론-감마 시그널링의 결정적인 억제자이며 이 사이토카인의 잠재적으로 치명적인 신생아에 대한 작용을 방지한다는 것이 기술되어 있다. [Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:114 (1999)]에는 JAK/STAT3 경로를 통하여 시그널링되는 사이토카인의 음성 조절에 SOCS1이 연루되어 있음이 논의되어 있다. [Ohya et al J. Biol. Chem. 272: 27178 (1997)]에는 SOCS단백질이 인터루킨 6 (IL-6) 및 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor, LIF)에 의한 시그널링의 주요 조절자인 것으로 보인다는 것이 기술되어 있다. 미국 특허 제6,534,277호에는 항-SOCS1 항체의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있으며, 여기서, SOCS1 항체를 코딩하는 핵산 서열은 세포 내로 도입되어 상기 항체가 상기 세포 또는 그의 자손에 의해 발현되게 하며, 그 후 재조합 세포는 치료 효과를 위하여 생체 내에 투여된다. 미국 특허 제6,323,317호 및 미국 특허 제7,049,418호에도 항-SOCS1 항체가 개시되어 있다.
TGF-α는 EGF 수용체에 결합하여 TGF-β와 함께 상승 작용식으로 작용하여 연성 한천에서 고정-독립적 세포 증식을 촉진할 수 있는 유사분열 촉진(mitogenic) 폴리펩티드이다. [Ellis et al., N. Engl. J. Med. 317:158 (1987)]에는 TGF-α가 흑색종의 소정의 부종양성 발현에서 그 역할을 한다는 것이 기술되어 있다. 미국 특허 제4,742,003호 및 [Xian et al., The J. of Histochem. & Cytochem. 47:949 (1999)]에는 항-TGF-α 항체의 제조 방법이 기술되어 있다.
종양 괴사 인자 수용체 (TNFR1) 및 Fas 둘 모두는 사멸 도메인을 갖는 세포질 Fas-결부 단백질 (cytoplasmic Fas-associated protein with death domain (FADD))을 포함하는데, 상기 FADD는 세포 예정사 (programmed cell death (아폽토시스) 및 수용체 올리고머화를 위한 Fas 및 TNF-유도된 시그널링에 필수적이다. Fas 수용체의 세포질 영역 또는 도메인에 결합하는 능력을 가지며 FAS 매개 아폽토시스를 억제하는 FADD로 표기되는 포유류 단백질이 동정되었다. FADD의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁 번호 U24231로서 입수가능하며, 그 아미노산 서열은 수탁 번호 AAA86517로서 입수가능하고, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. FADD 단편 또는 그를 코딩하는 핵산 - 이는 기능적으로 온전한 천연 FADD의 우성 음성 억제자 (dominant negative inhibitor)임 - 이 미국 특허 제6,562,797 B1호에 기술되어 있다.
서열 목록의 설명
서열 번호 1은 mIL-12 및 m-IL21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 2는 hIL-12 및 hIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 3은 mIL-21 및 mIL-15를 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 4는 mIL-12를 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 5는 hIL-21 및 hIL-15를 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 6은 hIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 7은 mIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 8은 hIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 9는 mIL-21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 10은 mIL-21의 아미노산 서열이다.
서열 번호 11은 mIL-15를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 12는 mIL-15의 아미노산 서열이다.
서열 번호 13은 mIL-12의 mp40을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 14는 mIL-12의 mp40의 아미노산 서열이다.
서열 번호 15는 mIL-12의 mp35를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 16은 mIL-12의 mp35의 아미노산 서열이다.
서열 번호 17은 hIL-21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 18은 hIL-21의 아미노산 서열이다.
서열 번호 19는 hIL-15를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 20은 hIL-15의 아미노산 서열이다.
서열 번호 21은 hIL-12의 p40을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 22는 hIL-12의 p40의 아미노산 서열이다.
서열 번호 23은 hIL-12의 p35를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 24는 hIL-12의 p35의 아미노산 서열이다.
서열 번호 25는 초파리 (Drosophila)에서 발견되는 엑디손 반응 요소 (ecdysone response element)의 핵산 서열이다.
서열 번호 26은 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster)에서 발견되는 엑디손 반응 요소의 핵산 서열이다.
서열 번호 27은 드로소필라 멜라노가스터에서 발견되는 엑디손 반응 요소의 핵산 서열이다.
서열 번호 28은 호밍 엔도뉴클레아제 (homing endonuclease, HE) 효소의 제한효소 부위 (I-SceI)이다.
서열 번호 29는 인간 IL-12 코딩 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터, Ad-RTS-hIL-12 (SP1-RheoIL-12)의 DNA 서열이다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술용어, 표기 및 기타 과학적 용어 또는 전문 술어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부의 경우, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 명료함을 위하여 및/또는 간편한 참고 및 이해를 위하여 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에서의 그러한 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것에 비하여 반드시 상당한 차이를 의미하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 일반적으로 이해되는 분자 생물학의 용어의 정의 및/또는 방법 및/또는 프로토콜을 [Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Ver lag: New York, 1991]; [Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994]; [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994)]에서 찾아볼 수 있다. 필요에 따라, 구매가능한 키트 및/또는 시약의 사용을 포함하는 절차는 달리 나타내지 않으면 제조업자의 지도 및/또는 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 실시된다.
본 발명의 목적상 "단리된"(isolated)이라는 용어는 생물학적 물질 (세포, 핵산 또는 단백질)이 그의 원래 환경 (그가 자연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거된 것임을 나타낸다. 예를 들어, 식물 또는 동물 중에 자연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 단리된 것이 아니지만, 내부에 그가 자연적으로 존재하는 인접한 핵산류로부터 분리된 동일 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주된다.
생물 물질에 적용될 때 "정제된"이라는 용어는 당해 물질이 다른 화합물의 존재가 제외된, 절대 순도를 나타내는 형태로 존재할 것을 요구하는 것은 아니다. 이것은 오히려 상대적인 정의이다.
"핵산", "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 바꾸어서 사용될 수 있으며, 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 나선 중 어느 하나의 형태의, 리보뉴클레오시드 (아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 그의 임의의 포스포에스테르 유사체, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 나타낸다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자라는 용어는 이 분자의 1차 및 2차 구조만을 나타내며, 이것을 임의의 특정 3차 형태에 한정하는 것은 아니다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자 (예를 들어, 제한효소 단편), 플라스미드, 수퍼코일형 (supercoiled) DNA 및 염색체에서 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중 가닥 DNA 분자의 구조의 논의에 있어서, 서열은 DNA의 비-전사 가닥 (즉, mRNA에 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라서 5'으로부터 3' 방향으로의 서열만을 제공하는 통상적인 협정에 따라 본 명세서에서 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 겪은 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA, 및 반합성 DNA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
폴리뉴클레오티드 서열에 적용될 때 "단편"이라는 용어는 기준 핵산 (reference nucleic acid)에 비하여 길이가 감소된 뉴클레오티드 서열을 말하며, 이는 공통 부분에 걸쳐 기준 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 그러한 핵산 단편은 적절할 경우 이것이 구성 요소인 더욱 큰 폴리뉴클레오티드 내에 포함될 수도 있다. 그러한 단편은 길이가 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 18개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 39개, 40개, 42개, 45개, 48개, 50개, 51개, 54개, 57개, 60개, 63개, 66개, 70개, 75개, 78개, 80개, 90개, 100개, 105개, 120개, 135개, 150개, 200개, 300개, 500개, 720개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개 또는 그 이상의 범위인 연속 뉴클레오티로부터의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로는 그로 구성되어 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "단리된 핵산 단편"은 단일 가닥 또는 이중 가닥의, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경 뉴클레오티드 염기를 포함하는 RNA 또는 DNA의 중합체를 나타낸다. DNA의 중합체의 형태의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다.
"유전자"는 전사에 의해서만 생성되는 (예를 들어, 생활성 RNA 종), 또는 전사 및 번역에 의해 생성되는 (예를 들어, 폴리펩티드) 기능성 분자를 비롯한 기능성 분자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. "유전자"라는 용어는 cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 또한 "유전자"는 코딩 서열 이전의 조절 서열 (5' 비-코딩 서열) 및 그 이후의 조절 서열 (3' 비-코딩 서열)을 포함하여 특정 RNA, 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 단편을 나타낸다. "천연 유전자"는 자연에서 그 자신의 조절 서열과 함께 발견되는 유전자를 나타낸다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및/또는 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 나타낸다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원들로부터 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연에서 발견되는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 키메라 유전자는 상이한 공급원들로부터 유래되는 코딩 서열 및/또는 상이한 공급원들로부터 유래되는 조절 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내의 그의 자연적인 위치의 천연 유전자를 나타낸다. "외래 (foreign)" 유전자 또는 "이종 (heterologous)" 유전자는 숙주 유기체에서 보통은 발견되지 않지만 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 나타낸다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스진 (transgene)"은 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다. 예를 들어, 인터루킨-12 (IL-12) 유전자는 IL-12 단백질을 코딩한다. IL-12는 완전한 기능성의 IL-12p70을 만들도록 다이설파이드 결합을 통하여 연결된 35-kD 서브유닛 (subunit) (p35) 및 40-kD 서브유닛 (p40)의 헤테로이량체 (heterodimer)이다. IL-12 유전자는 p35 서브유닛 및 p40 서브유닛 둘 모두를 코딩한다.
"이종 DNA"는 세포 내에 또는 세포의 염색체 부위 내에 자연적으로는 위치하지 않는 DNA를 나타낸다. 이종 DNA는 세포에 대하여 외래성인 유전자를 포함할 수 있다.
"게놈"이라는 용어는 염색체, 및 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함한다.
핵산 분자는 적절한 온도 조건 및 용액 이온 강도 조건 하에서 단일 가닥 형태의 핵산 분자가 다른 핵산 분자에 어닐링될 수 있을 때 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA와 같은 그 다른 핵산 분자에 "혼성화가능"하다. 혼성화 및 세척 조건은 잘 공지되어 있으며 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)], 특히 그 안의 제11장 및 표 11.1에 예시되어 있다. 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격도"를 결정한다.
엄격도 조건은 원연 (distantly related) 유기체 유래의 상동 서열과 같은 중간 정도로 유사한 단편 내지 근연 (closely related) 유기체 유래의 기능성 효소를 복제하는 유전자와 같은 고도로 유사한 단편에 대하여 스크리닝하도록 조정될 수 있다. 상동 핵산에 대한 예비 스크리닝에 있어서, 55°의 Tm에 상응하는 낮은 엄격도(stringency)의 혼성화 조건, 예를 들어 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크 (milk), 및 포름아미드가 없거나 30% 포름아미드가 있음, 5X SSC, 0.5% SDS가 이용될 수 있다. 중간 정도의 엄격도의 혼성화 조건은 더욱 높은 Tm, 예를 들어 40% 포름아미드 - 5X 또는 6X SSC를 이용함 - 에 상응한다. 높은 엄격도의 혼성화 조건은 최고 Tm, 예를 들어 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC에 상응한다.
혼성화는, 혼성화의 엄격도에 따라 염기들 사이의 미스매치 (mismatch)가 가능하지만, 상보적 서열을 포함할 것을 요구한다. "상보적"이라는 용어는 서로에게 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 염기들 사이의 관계를 기술하기 위하여 사용된다. 예를 들어, DNA와 관련하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에서 개시되거나 사용된 완전 서열에 상보적인 단리된 핵산뿐만 아니라 실질적으로 유사한 핵산 서열도 또한 포함한다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm에서의 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 이용함으로써, 그리고 상기에 나타낸 조건들을 이용함으로써 검출된다. 다른 실시 양태에서, 상기 Tm은 60℃, 63℃, 또는 65℃이다.
혼성화 후 세척이 엄격도 조건을 또한 결정한다. 한 세트의 조건에서는 실온에서 15분 (min) 동안 6X SSC, 0.5% SDS로 시작하고 그 후 45℃에서 30분 동안 2X SSC, 0.5% SDS로 반복하고, 그 후 50℃에서 30분 동안 0.2X SSC, 0.5% SDS로 2회 반복하는 일련의 세척이 이용된다. 엄격한 조건의 바람직한 세트에서는 더욱 높은 온도가 이용되며, 여기서, 0.2X SSC, 0.5% SDS에서의 최종 2회의 30분 세척의 온도를 60℃로 증가시키는 것을 제외하고는 세척이 상기의 것과 동일하다. 고도로 엄격한 조건의 또 다른 바람직한 세트에서는 65℃에서의 0.1X SSC, 0.1% SDS에서의 2회의 최종 세척이 이용된다.
핵산의 혼성화에 적절한 엄격도는 당업계에 잘 알려진 변수들인 핵산의 길이 및 상보성 정도에 따라 달라진다. 두 뉴클레오티드 서열들 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 커질수록 그러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드 (hybrid)에 있어서의 Tm 값이 더욱 커진다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정성 (더욱 높은 Tm에 상응함)은 하기의 순서대로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100개의 뉴클레오티드 초과인 하이브리드에 있어서, Tm을 계산하는 방정식이 유도되었었다 (Sambrook et al., 9.50-0.51 참조). 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화에 있어서, 미스매치 위치는 더욱 중요하며, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그의 특이성을 결정한다 (Sambrook et al., 11.7-11.8).
본 발명의 일 실시 양태에서, 500 mM 미만의 염 및 적어도 37℃에서의 혼성화 단계 및 적어도 63℃의 온도에서의 2X SSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 이용함으로써 폴리뉴클레오티드를 검출한다. 또 다른 실시 양태에서, 혼성화 조건은 혼성화 단계에 있어서 200 mM 미만의 염 및 적어도 37℃를 포함한다. 추가의 실시 양태에서, 혼성화 조건은 혼성화 단계 및 세척 단계 둘 모두에 있어서 2X SSPE 및 63 ℃를 포함한다.
또 다른 실시 양태에 있어서, 혼성화 가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드이다. 바람직하게는 혼성화 가능한 핵산의 최소 길이는 적어도 약 15개의 뉴클레오티드; 예를 들어 적어도 약 20개의 뉴클레오티드; 예를 들어 적어도 30개의 뉴클레오티드이다. 더욱이, 당업자라면 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브의 길이와 같은 인자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
"프로브"라는 용어는 상보적 단일 가닥 표적 핵산과 염기 쌍을 형성하여 이중 가닥 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 핵산 분자를 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자에 혼성화 가능한 짧은 핵산을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 32P-뉴클레오티드, 또는 바이오틴과 같은 표지체가 공유 결합에 의해 콘쥬게이션된 뉴클레오티드로 표지될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 프로브로서 사용되어 핵산의 존재를 탐지할 수 있다. 올리고뉴클레오티드들 (이들 중 하나 또는 이들 둘 모두는 표지될 수 있음)은 전장 핵산 또는 핵산의 단편을 클로닝하기 위하여, DNA 서열 결정을 위하여, 또는 핵산의 존재의 탐지를 위하여 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 또한 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자와 삼중 나선을 형성하도록 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 핵산 합성기에서 합성에 의해 제조된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 자연 비-발생 포스포에스테르 유사 결합, 예를 들어 티오에스테르 결합 등에 의해 제조될 수 있다.
"프라이머"는 적합한 조건 하에서 DNA 합성을 위한 개시점으로서의 역할을 할 수 있는 이중 가닥 핵산 영역을 생성하도록 표적 핵산 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 그러한 프라이머는 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction)에서 또는 DNA 서열 결정에 사용될 수 있다.
"폴리머라아제 연쇄 반응"은 PCR로 약기되며 특정 핵산 서열을 효소에 의해 증폭시키는 시험관 내 방법을 나타낸다. PCR은 반복되는 일련의 온도 사이클을 포함하며, 이때 각각의 사이클은 하기의 세 단계를 포함한다: 표적 분자의 가닥들을 분리하기 위한 주형 핵산의 변성, 단일 가닥 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머의 주형 핵산에의 어닐링, 및 어닐링된 프라이머(들)의 DNA 폴리머라아제에 의한 연장, PCR은 표적 분자의 존재를 탐지하는 수단, 및 정량적 또는 반정량적 조건 하에서 핵산의 출발 풀 내의 상기 표적 분자의 상대적인 양을 결정하는 수단을 제공한다.
"역전사효소 연쇄 반응 (Reverse transcription-polymerase chain reaction)"은 RT-PCR로 약기되며, RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소에 의해 생성하고 이어서 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내의 특정 핵산 서열 또는 서열들을 효소에 의해 증폭시키는 - 이는 상기에 기술된 바와 같음 - 시험관 내 방법을 나타낸다. 또한 RT-PCR은 표적 분자의 존재를 탐지하는 수단, 및 정량적 또는 반정량적 조건 하에서 핵산의 출발 풀 내의 상기 표적 분자의 상대적인 양을 결정하는 수단을 제공한다.
DNA "코딩 서열"은 폴리펩티드를 코딩하고 적합한 조절 서열의 제어 하에 두어질 때 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포에서 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 있는 이중 가닥 DNA 서열을 나타낸다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내, 또는 코딩 서열의 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하며 결부된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 (leader) 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 (effector) 결합 부위 및 스템-루프 (stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 코딩 서열의 경계부는 5' (아미노) 말단의 시작 코돈 및 3' (카르복실) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵생물 서열, mRNA 유래의 cDNA, 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 코딩 서열이 진핵 세포에서의 발현용으로 의도될 경우, 폴리아데닐화 시그널 및 전사 종결 서열이 코딩 서열의 3'에 일반적으로 위치할 것이다.
"오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)"은 ORF로 약기되며, ATG 또는 AUG와 같은 번역 시작 시그널 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하는 그리고 폴리펩티드 서열로 잠재적으로 번역될 수 있는 소정 길이의 핵산 서열, DNA, cDNA 또는 RNA를 나타낸다.
본 명세서에서 "헤드-헤드 (head-to-head)"라는 용어는 두 폴리뉴클레오티드 서열의 배향을 서로에 관련시켜 기술하기 위하여 사용된다. 두 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단이 다른 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단에 인접하고 그로써 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 멀어지도록 진행될 때 헤드-헤드 배향으로 위치하는 것이다. "헤드-헤드"라는 용어는 (5')-(5') ((5') to (5'))으로 약기될 수 있으며, 기호 (← →) 또는 (3'←5'5'→3')로 또한 나타내어질 수 있다.
본 명세서에서 "테일-테일 (tail-to-tail)"이라는 용어는 두 폴리뉴클레오티드 서열의 배향을 서로에 관련시켜 기술하기 위하여 사용된다. 두 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단이 다른 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단에 인접하고 그로써 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드를 향하여 진행될 때 테일-테일 배향으로 위치하는 것이다. "테일-테일"이라는 용어는 (3')-(3') ((3') to (3'))으로 약기될 수 있으며, 기호 (→ ←) 또는 (5'→3'3'←5')로 또한 나타내어질 수 있다.
본 명세서에서 "헤드-테일 (head-to-tail)"이라는 용어는 두 폴리뉴클레오티드 서열의 배향을 서로에 관련시켜 기술하기 위하여 사용된다. 두 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단이 다른 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단에 인접하고 그로써 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 전사 방향과 동일한 방향으로 진행될 때 헤드-테일 배향으로 위치하는 것이다. "헤드-테일"이라는 용어는 (5')-(3') ((5') to (3'))으로 약기될 수 있으며, 기호 (→ →) 또는 (5'→3'5'→3')로 또한 나타내어질 수 있다.
"하류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 3'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 특히, 하류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 전사 시작점 이후의 서열을 나타낸다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 시작 부위의 하류에 위치한다.
"상류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 특히, 상류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 코딩 서열 또는 전사 시작점의 5' 측에 위치하는 서열에 관련된다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사 시작 부위의 상류에 위치한다.
"제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"라는 용어는 서로 바꾸어서 사용될 수 있으며, 이중 가닥 DNA 내의 특정 뉴클레오티드 서열 내에 결합하여 절단하는 효소를 나타낸다.
"상동 재조합"은 또 다른 DNA 분자 내로의 외래 DNA 서열의 삽입, 예를 들어 염색체 내로의 벡터의 삽입을 나타낸다. 바람직하게는, 벡터는 상동 재조합을 위한 특정 염색체 부위를 표적으로 한다. 특정 상동 재조합에 있어서, 벡터는 염색체의 서열에 대하여 상동성인 충분히 긴 영역을 포함하여서 이 벡터의 염색체 내로의 혼입 및 상보적 결합을 허용한다. 더욱 긴 상동성 영역, 및 더욱 큰 서열 유사성 정도는 상동 재조합의 효율을 증가시킬 수 있다.
당업계에 공지된 몇몇 방법을 이용하여 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 증식시킬 수 있다. 일단 적합한 숙주 시스템 및 성장 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터가 다량으로 증식 및 제조될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는 몇 가지 예를 들자면 하기 벡터 또는 그 유도체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 인간 또는 동물 바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스 (vaccinia virus) 또는 아데노바이러스 (adenovirus); 곤충 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스 (baculovirus); 효모 벡터; 박테리오파지 벡터 (예를 들어, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
"벡터"는 숙주 세포 내로의 핵산의 전달 및/또는 핵산의 클로닝을 위한 임의의 비히클 (vehicle)을 나타낸다. 벡터는 또 다른 DNA 절편이 부착되어서 그 부착된 절편의 복제가 야기되도록 하는 레플리콘 (replicon)일 수 있다. "레플리콘"은 생체 내에서의 자율적 DNA 복제 단위로서의 기능을 하는, 즉, 그 자신의 제어 하에 복제가 가능한 임의의 유전 요소 (예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 나타낸다. "벡터"라는 용어는 시험관 내에서, 엑스 비보에서 (ex vivo), 또는 생체 내에서 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 비히클 및 비바이러스 (nonviral) 비히클 둘 모두를 포함한다. 핵산의 조작, 반응 요소 (response element) 및 프로모터의 유전자 내로의 혼입 등을 위하여 당업계에 공지된 다수의 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 가능한 벡터는 예를 들어 박테리오파지, 예컨대 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예컨대 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체, 또는 블루스크립트 (Bluescript) 벡터를 비롯한 플라스미드 또는 변형 바이러스를 포함한다. 본 발명에서 유용한 벡터의 또 다른 예로는 국제 특허 공개 WO 2007/038276호에 기술된 바와 같이 울트라벡터 (UltraVector)™ 프로덕션 시스템 (Production System) (미국 버지니아주 블랙스버그 소재의 인트렉손 코포레이션 (Intrexon Corp.)이 있다. 예를 들어, 프로모터 및 반응 요소에 상응하는 DNA 단편의 적합한 벡터 내로의 삽입은 적절한 DNA 단편을 상보적 코헤시브 (cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터 내에 라이게이션시킴으로써 성취될 수 있다. 대안적으로, DNA 분자의 말단은 효소에 의해 변형될 수 있거나 임의의 부위가 뉴클레오티드 서열 (링커)의 DNA 말단 내로의 라이게이션에 의해 생성될 수 있다. 그러한 벡터는 선발가능한 마커가 세포 게놈 내로 혼입된 세포의 선발을 제공하는 선발가능한 마커 유전자를 포함하도록 조작될 수 있다. 그러한 마커는 코딩된 단백질을 포함 및 발현하는 숙주 세포를 마커에 의해 동정 및/또는 선발하는 것을 허용한다.
바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터가 살아있는 동물 대상뿐만 아니라 세포에서도 매우 다양한 유전자 전달 응용에서 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus) 벡터, 폭스 (pox) 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 헤르페스 심플렉스 (herpes simplex) 벡터, 엡스타인 바 (Epstein-Barr) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 제미니바이러스 (geminivirus) 벡터, 및 칼리모바이러스 (caulimovirus) 벡터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 하전된 지질 (사이토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 생중합체를 포함한다. 핵산에 더하여, 벡터는 하나 이상의 조절 영역 및/또는 선발가능한 마커 - 선발, 측정, 및 핵산 전달 결과 (어느 조직으로 전달되는지, 발현 지속 기간 등)에 유용함 - 를 또한 포함할 수 있다.
"플라스미드"라는 용어는 세포의 중추적 대사의 일부분이 아닌 그리고 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 유전자를 흔히 지니는 염색체외 요소 (extra-chromosomal element)를 나타낸다. 그러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의, 선형, 원형 또는 수퍼코일형의 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서, 다수의 뉴클레오티드 서열들은 프로모터 단편 및 선발 유전자 생성물을 위한 DNA 서열을 적절한 3' 미번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 작제물 내로 연결되었거나 재조합되었다.
"클로닝 벡터"는 또 다른 핵산 절편이 부착되어 부착된 절편의 복제를 야기할 수도 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 연속적으로 복제되는 그리고 복제 기점을 포함하는 소정 단위 길이의 핵산, 바람직하게는 DNA인 "레플리콘"을 나타낸다. 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형에서의 복제 및 또 다른 것에서의 발현이 가능할 수 있다 ("셔틀 벡터"). 클로닝 벡터는 벡터를 포함하는 세포의 선발에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 관심있는 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함할 수 있다.
"발현 벡터"라는 용어는 숙주 내로의 형질전환 이후 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하도록 디자인된 벡터, 플라스미드 또는 비히클을 나타낸다. 클로닝된 유전자, 즉 삽입된 핵산 서열은 일반적으로 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소의 제어 하에 두어진다. 원하는 숙주 세포에서 핵산이 발현되게 하는데 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많이 있으며 이는 당업자에게 친숙하다. 이들 유전자가 발현되게 할 수 있는 사실상 임의의 프로모터가 발현 벡터에서 사용될 수 있으며, 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 동물 프로모터, 포유류 프로모터, 합성 프로모터, 구성적 프로모터 (constitutive promoter), 조직 특이적 프로모터, 발병 또는 질환 관련 프로모터, 발생 특이적 프로모터 (developmental specific promoter), 유도성 프로모터, 광 조절 프로모터; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL1O, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, 알칼리 포스파타아제 프로모터 (사카로마이세스 (Saccharomyces)에서의 발현에 유용함); AOX1 프로모터 (피키아 (Pichia)에서의 발현에 유용함); β-락타마아제, lac, ara, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac, 및 trc 프로모터 (에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서의 발현에 유용함); 광 조절 프로모터, 종자 특이적 프로모터, 화분 특이적 프로모터, 난소 특이적 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터, CMV 35S 최소 프로모터, 카사바 베인 모자이크 바이러스 (cassava vein mosaic virus, CsVMV) 프로모터, 엽록소 a/b 결합 단백질 프로모터, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라아제 프로모터, 발아체 (shoot)-특이적 프로모터, 뿌리 특이적 프로모터, 키티나아제 프로모터, 스트레스 유도성 프로모터, 벼 튠그로간상 바이러스 (rice tungro bacilliform virus) 프로모터, 식물 수퍼-프로모터 (plant super-프로모터) 프로모터, 감자 류신 아미노펩티다아제 프로모터, 니트레이트 리덕타아제 프로모터, 만노핀 신타아제 프로모터, 노팔린 신타아제 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 제인 단백질 프로모터, 및 안토시아닌 프로모터 (식물 세포에서의 발현에 유용함); 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 당업계에 공지된 동물 및 포유류 프로모터: SV40 초기 (SV40e) 프로모터 영역, 라우스 사코마 바이러스 (Rous sarcoma virus, RSV))의 3'의 긴 말단 반복체 (long terminal repeat, LTR)에 포함된 프로모터, 아데노바이러스 (Ad)의 E1A 또는 주요 후기 프로모터 (major late 프로모터, MLP) 유전자의 프로모터, 사이토케갈로바이러스 (CMV) 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 티미딘 키나아제 (TK) 프로모터, 바큘로바이러스 IE1 프로모터, 신장 인자 1 알파 (EF1) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) 프로모터, 유비퀴틴 (Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 생쥐 메탈로티오네인-L 프로모터의 조절 서열 및 전사 제어 영역, 전신발현 프로모터 (ubiquitous promoter) (HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜뷸린 등), 중간 필라멘트 (데스민, 신경필라멘트, 케라틴, GFAP 등)의 프로모터, (MDR, CFTR 또는 제VIII형 인자 등의) 치료 유전자의 프로모터, 발병 또는 질환 관련 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내며, 트랜스제닉 (transgenic) 동물에서 이용되어 왔던 프로모터, 예를 들어 췌장 선방 세포에서 활성을 갖는 엘라스타아제 I 유전자 제어 영역; 췌장 베타 세포에서 활성을 갖는 인슐린 유전자 제어 영역, 림프구양 세포에서 활성을 갖는 면역글로불린 유전자 제어 영역, 고환 세포, 유방 세포, 림프구양 세포 및 비만 세포에서 활성을 갖는 생쥐 유선 종양 바이러스 제어 영역, 간에서 활성을 갖는 Apo AI 및 Apo AII 제어 영역, 간에서 활성을 갖는 알파-태아 단백질 유전자 제어 영역, 간에서 활성을 갖는 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역, 골수양 세포에서 활성을 갖는 베타-글로빈 유전자 제어 영역, 뇌의 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte) 세포에서 활성을 갖는 마이엘린 염기성 단백질 유전자 젱 영역, 골격근에서 활성을 갖는 마이오신 경쇄-2 유전자 제어 영역, 및 시상하부에서 활성을 갖는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (gonadotropic releasing hormone) 유전자 제어 영역, 피루베이트 키나아제 프로모터, 빌린 프로모터, 지방산 결합 장 단백질의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터 등.
벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 형질감염 (transfection), 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션 (lipofection) (리소좀 융합), 유전자 총 (gene gun)의 사용, 또는 DNA 벡터 트랜스포터 (transporter)에 의해 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, [Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963 (1992)]; [Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621 (1988)]; 및 [Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311] 참조).
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 리포펙션에 의해 생체 내에 또한 도입될 수 있다. 지난 십 년간, 시험관 내에서의 핵산의 캡슐화 및 형질감염에 있어서의 리포좀의 사용이 증가되어 왔다. 리포좀 매개 형질감염에서 조우되는 어려움 및 위험을 제한하도록 디자인된 합성 양이온성 지질을 사용하여 마커를 코딩하는 유전자의 생체 내 형질감염을 위한 리포좀을 제조할 수 있다 (Feigner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027 (1988); 및 Ulmer et al., Science 259:1745 (1993)). 양이온성 지질의 사용은 음으로 하전된 핵산의 캡슐화를 촉진할 수 있으며, 또한 음으로 하전된 세포 막과의 융합을 촉진할 수 있다 (Feigner et al., Science 337:387 (1989)). 핵산의 전달에 있어서 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물이 국제 특허 공개 WO95/18863호, 국제 특허 공개 WO96/17823호 및 미국 특허 제5,459,127호에 기술되어 있다. 생체 내에서 특정 기관 내로 외인성 유전자를 도입하기 위하여 리포펙션을 사용하는 것은 소정의 실제적인 이점을 갖는다. 특정 세포에 대한 리포좀의 분자적 표적화는 한 가지의 유익한 분야를 나타낸다. 특정 세포 유형이 형질감염되게 하는 것은 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같이 세포 이질성을 갖는 조직에서 특히 바람직함이 명백하다. 지질은 표적화를 위하여 다른 분자에 화학적으로 커플링될 수 있다 (Mackey et al. 1988). 표적화된 펩티드, 예를 들어 호르몬 또는 신경 전달 물질 (neurotransmitter) 및 단백질, 예를 들어 항체, 또는 비-펩티드 분자가 리포좀에 화학적으로 커플링될 수 있다.
기타 분자, 예를 들어 양이온성 올리고펩티드 (예를 들어, 국제 특허 공개 WO95/21931호), DNA 결합 단백질로부터 유래되는 펩티드 (예를 들어, 국제 특허 공개 WO96/25508호), 또는 양이온성 중합체 (예를 들어, 국제 특허 공개 WO95/21931호)가 생체 내에서의 핵산의 형질감염을 용이하게 하는데 또한 유용하다.
생체 내에서 벡터를 네이키드 (naked) DNA 플라스미드로서 도입하는 것이 또한 가능하다 (미국 특허 제5,693,622호, 미국 특허 제5,589,466호 및 미국 특허 제5,580,859호 참조). 수용체-매개 DNA 전달 접근법이 또한 이용될 수 있다 (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 (1992); 및 Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987)).
"형질감염"이라는 용어는 세포에 의한 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA의 흡수를 나타낸다. 세포는 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA가 세포 내로 도입되었을 때 그러한 RNA 또는 DNA로 "형질감염"되었다는 것이다. 세포는 형질감염된 RNA 또는 DNA가 표현형 변화를 초래할 때 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA로 "형질전환"되었다는 것이다. 형질전환 RNA 또는 DNA는 염색체 DNA 내로 통합되어 (공유 결합되어) 세포의 게놈을 구성할 수 있다.
"형질전환"은 숙주 유기체의 게놈 내로 핵산 단편이 전달되어 유전적으로 안정한 유전으로 이어짐을 나타낸다. 형질전환되는 핵산 단편을 포함하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환" 유기체로 지칭된다.
게다가, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 증폭 또는 발현이 추구되는 세포 숙주에서의 복제를 위한 하나 이상의 기점, 마커 또는 선발가능한 마커를 포함할 수 있다.
"선발가능한 마커"라는 용어는 마커 유전자의 효과를 기반으로 하여, 즉, 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 비색 분석 마커, 효소, 형광 마커 등에 대하여 선발될 수 있는, 확인 인자, 일반적으로 항생제 또는 화학물질 내성 유전자를 나타내며, 여기서, 상기 효과는 관심있는 핵산의 유전의 추적을 위하여 및/또는 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 유기체의 동정을 위하여 사용된다. 당업계에서 사용되는 그리고 공지된 선발가능한 마커 유전자의 예는 하기를 포함한다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 허용성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 아이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등.
"리포터 유전자"라는 용어는 리포터 유전자의 효과를 기반으로 하여 동정될 수 있는 확인 인자를 코딩하는 핵산을 나타내며, 여기서, 상기 효과는 관심있는 핵산의 유전을 추적하기 위하여, 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 유기체를 동정하기 위하여 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위하여 사용된다. 당업계에서 사용되는 그리고 공지된 리포터 유전자의 예는 하기를 포함한다: 루시퍼라아제 (Luc), 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (chloramphenicol acetyltransferase, CAT), β-갈락토시다아제 (LacZ), β-글루큐로니다아제 (Gus) 등. 선발가능한 마커 유전자는 리포터 유전자로도 간주될 수 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있으며, 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래되는 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 또는 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포 유형에서 유전자의 발현을 지시할 수 있거나, 상이한 발생 단계에서 그러할 수 있거나, 상이한 환경 또는 물리적 조건에 반응하여 그러할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 시점에서 대부분의 세포 유형에서 유전자 발현을 야기하는 프로모터는 일반적으로 "항시적 프로모터"로 지칭된다. 특정 세포 유형에서 유전자 발현을 야기하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 지칭된다. 발생 또는 세포 분화의 특정 단계에서 유전자 발현을 야기하는 프로모터는 일반적으로 "발생-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 지칭된다. 프로모터를 유도하는 약제 (agent), 생물 분자, 화학물질, 리간드, 광 등으로 세포를 처리하거나 세포를 그에 노출시킨 이후 유전자 발현을 유도 및 야기하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절성 프로모터"로 지칭된다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계는 완전히 정의된 것은 아니기 때문에 상이한 길이의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수도 있음이 또한 인식된다.
본 발명의 벡터들 중 임의의 것에서, 벡터는 본 명세서에 개시된 프로모터를 선택적으로 포함한다. 일 실시 양태에서, 프로모터는 본 명세서의 표 1a 내지 표 1b에 열거된 프로모터이다.
본 발명의 벡터들 중 임의의 것에서, 벡터는 조직-특이적 프로모터를 선택적으로 포함한다. 일 실시 양태에서, 조직-특이적 프로모터는 본 명세서에 개시된 조직 특이적 프로모터이다. 또 다른 실시 양태에서, 조직-특이적 프로모터는 본 명세서의 표 2a 내지 표 2b에 열거된 조직 특이적 프로모터이다.
전형적으로 프로모터 서열은 그의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 경계가 정해지며 배경보다 큰 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소 개수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류로 (5' 방향으로) 연장된다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위 (예를 들어 뉴클레아제 S1에 의한 맵핑 (mapping)에 의해 편리하게 정의됨)뿐만 아니라 RNA 폴리머라아제의 결합에 책임이 있는 단백질 결합 도메인 (콘센서스 (consensus) 서열)도 발견된다.
"치료적 스위치 프로모터 (therapeutic switch promoter, TSP)"는 유전자 스위치 구성요소의 발현을 제어 하는 프로모터를 나타낸다. 유전자 스위치 및 그의 다양한 구성요소는 본 명세서의 다른 곳에서 상세하게 기술되어 있다. 소정 실시 양태에서, TSP는 항시적이며, 즉, 계속 활성을 갖는다. 항시적 TSP는 항시적-편재적이거나 (즉, 일반적으로 임의의 조직 또는 세포에서 추가의 인자 또는 조절자를 필요로 하지 않고서 기능을 함) 또는 항시적-조직 또는 세포 특이적일 수 있다 (즉, 일반적으로 특정 조직 유형 또는 세포 유형에서 추가의 인자 또는 조절자를 필요로 하지 않고서 기능을 함). 소정 실시 양태에서, 본 발명의 TSP는 질환, 장애 또는 질병과 결부된 조건 하에서 활성화된다. 2가지 이상의 TSP가 연루된 본 발명의 소정 실시양태에서 프로모터는 항시적 프로모터와 활성화가능한 프로모터의 조합일 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, "질환, 장애 또는 질병과 결부된 조건 하에서 활성화되는 프로모터"는 한정됨이 없이 질환-특이적 프로모터, 특정한 생리학적 조건, 발생 조건, 분화 조건 또는 병리학적 조건에 반응하는 프로모터, 특정한 생물 분자에 반응하는 프로모터, 및 질환, 장애 또는 질병과 결부된 특정 조직 또는 세포 유형, 예를 들어 종양 조직 또는 악성 세포에 특이적인 프로모터를 포함한다. TSP는 자연 발생 프로모터의 서열, 자연 발생 프로모터로부터 유래되는 변형 서열, 또는 합성 서열 (예를 들어, 반응 요소를 최소 프로모터 서열 내로 삽입하여 프로모터의 반응성을 변경시킴)을 포함할 수 있다.
코딩 서열은 RNA 폴리머라아제가 코딩 서열을 mRNA로 전사하고 그 후 이것이 트랜스-RNA 스플라이싱되고 (코딩 서열이 인트론을 포함할 경우) 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질로 번역될 때 세포에서 전사 및 번역 제어 서열의 "제어 하에" 있다.
"전사 및 번역 제어 서열"은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결서열 (terminator) 등을 나타낸다. 진핵 세포에서, 폴리아데닐화 시그널은 제어 서열이다.
"반응 요소"라는 용어는 전사 인자의 DNA-결합 도메인과의 상호작용을 통하여 매개되는 반응성을 프로모터에 부여하는 하나 이상의 시스-작용 (시스-acting) DNA 요소를 나타낸다. 이 DNA 요소는 그의 서열이 팔린드롬 (palindromic) 서열 (완전한 또는 불완전한 팔린드롬)이거나 가변적인 개수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 서열 모티프 또는 하프 사이트 (half site)로 구성될 수 있다. 하프 사이트는 유사하거나 동일할 수 있으며 직접적 반복체 또는 역위 반복체로서 또는 단일 하프 사이트 또는 일렬로 있는 인접 하프 사이트들의 멀티머 (multimer)로서 배열될 수 있다. 반응 요소는 반응 요소가 혼입되는 세포 또는 유기체의 성질에 따라 상이한 유기체들로부터 단리된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 인자의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재 하에서 반응 요소의 당해 DNA 서열에 결합하여 이 반응 요소의 조절 하에서 하류 유전자(들)의 전사를 개시 또는 억제한다. 천연 엑디손 수용체의 반응 요소의 DNA 서열의 예는 하기를 포함한다: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (서열 번호 25) (Cherbas et. al, Genes Dev. 5:120 (1991) 참조); AGGTCAN(n)AGGTCA (여기서, N(n)은 하나 이상의 스페이서 뉴클레오티드 (서열 번호 26)일 수 있음) (D'Avino et al., MoI. Cell. Endocrinol. 113:1 (1995) 참조); 및 GGGTTGAATGAATTT (서열 번호 27) (Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994) 참조).
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열들이 회합되어 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받게 되는 것을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있을 때 (즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사적 제어 하에 있음) 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "발현"이라는 용어는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유래되는 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 또한 발현은 단백질 또는 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 나타낼 수 있다.
"카세트", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"라는 용어는 특정 제한효소 부위의 핵산 도는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입되거나 상동 재조합에 의해 삽입될 수 있는 DNA 절편을 나타낸다. DNA의 절편은 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 카세트 및 제한효소 부위는 전사 및 전사에 있어서 적당한 리딩 프레임으로 카세트가 삽입되는 것을 보장하도록 디자인된다. "형질전환 카세트"는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며 상기 폴리뉴클레오티드에 더하여 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다. 또한 본 발명의 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주 세포에서 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 증강된 발현을 허용하는 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 목적상, "유전자 스위치"라는 용어는 프로모터와 결부된 반응 요소 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 하나 이상의 리간드의 존재 하에서 조정하는 리간드-의존성 전사 인자-기반 시스템과 상기 반응 요소의 조합을 나타낸다. "유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 프로모터와 결부된 반응 요소 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 하나 이상의 리간드의 존재 하에서 조정하는 리간드-의존성 전사 인자-기반 시스템과 상기 반응 요소의 조합을 나타낸다.
본 발명의 치료적 스위치 프로모터는 특정 질환, 장애 또는 질병의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 임의의 프로모터일 수 있다. 예는 한정됨이 없이 특정 질환, 장애 또는 질병 동안에만 증가된 발현을 나타내는 유전자의 프로모터, 및 특정 세포 상태 (예를 들어, 증식, 아폽토시스, pH 변화, 산화 상태, 산소 수준) 하에서 증가된 발현을 나타내는 유전자의 프로모터를 포함한다. 유전자 스위치가 하나 초과의 전사 인자 서열을 포함하는 일부 실시 양태에서, 치료 방법의 특이성은 질환-특이적 또는 질병-특이적 프로모터를 조직-특이적 또는 세포 유형-특이적 프로모터와 조합하여 치료적 생성물이 발현되는 조직을 한정함으로써 증가될 수 있다. 따라서, 조직-특이적 또는 세포 유형-특이적 프로모터는 치료적 스위치 프로모터의 정의 내에 포함된다.
질환-특이적 프로모터의 일례로서, 암 치료에 유용한 프로모터는 발암 유전자 (oncogene)의 프로모터를 포함한다. 발암 유전자 부류의 예는 성장 인자, 성장 인자 수용체, 단백질 키나아제, 세포 예정사 조절자 및 전사 인자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 발암 유전자의 구체예는 sis, erb B, erb B-2, ras, abl, myc 및 bcl-2 및 TERT를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 암-관련 유전자의 예는 종양 결부 항원 유전자 및 신생 세포에서 과발현되는 기타 유전자 (예를 들어, MAGE-1, 암배아 항원, 티로시나아제, 전립선 특이 항원, 전립선 특이적 막 항원, p53, MUC-1, MUC-2, MUC-4, HER-2/neu, T/Tn, MART-1, gp1OO, GM2, Tn, sTn, 및 톰슨-프리덴라이히 항원 (Thompson-Friedenreich antigen, TF))를 포함한다.
당업계에 공지된 그리고 본 발명에서 치료적 스위치 프로모터로서 유용한 프로모터 서열 및 기타 조절 요소 (예를 들어, 인핸서)의 예가 각각의 프로모터와 결부된 질환/장애 (표 1a 내지 표 1b) 또는 조직 특이성 (표 2a 내지 표 2b)과 함께 표 1a 내지 표 1b 및 표 2a 내지 표 2b에 열거된 참고 문헌에 개시되어 있다. 이들 참고 문헌에 개시된 프로모터 서열은 본 명세서에 그의 전체 내용이 참고로 포함된다.
[표 1a]
Figure pct00001
[표 1b]
Figure pct00002
[표 2a]
Figure pct00003
[표 2b]
Figure pct00004
특정 질환 또는 장애 동안 발현 수준 변화를 나타내며 따라서 본 발명에서 유용한 프로모터를 제공할 수 있는 다른 유전자는 한정됨이 없이 표 3a 내지 표 3g에 열거된 유전자 (결부된 질환/장애와 함께임)를 포함한다.
[표 3a]
Figure pct00005
[표 3b]
Figure pct00006
[표 3c]
Figure pct00007

[표 3d]
Figure pct00008

[표 3e]
Figure pct00009
[표 3f]
Figure pct00010
[표 3g]
Figure pct00011
일단 질환, 장애 또는 질병 동안 조정되는 발현 패턴을 갖는 유전자가 동정되면, 이 유전자의 프로모터는 본 발명의 유전자 스위치에서 사용될 수 있다. 프로모터 영역을 포함하는 많은 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 공개 데이터베이스, 예를 들어 젠뱅크 (GenBank)에서 입수가능하다. 따라서, 일단 적절한 유전자가 동정되면 당해 프로모터 서열은 쉽게 확인되어 얻어질 수 있다. 본 발명의 또 다른 태양은 적합한 유전자를 동정하는 것에 관한 것인데, 상기 유전자의 프로모터는 단리되어 유전자 스위치 내에 두어질 수 있다. 따라서, 프로모터가 단리되어 후속 세팅 또는 환경에서 사용될 수 있다면 유전자의 아이덴티티 (identity)는 본 발명의 특정 실시 양태에 결정적이지 않을 수도 있다. 따라서 본 발명은 아직 동정되어야 할 유전자 유래의 프로모터의 사용을 포함한다. 일단 적합한 유전자가 동정되면, 프로모터 기능에 필요한 유전자 서열을 결정하는 것은 일상적인 기술 또는 실험의 문제이다. 실제, 관심있는 유전자의 프로모터 영역의 결정에 도움을 주기 위하여 몇몇 상업적 프로토콜이 존재한다. 예로서, 최근에 딩 (Ding) 등은 인간 Sprouty4 유전자의 5'-측면 (flanking) 서열을 점진적으로 결실시킴으로써 신규한 Sprouty4 유전자의 프로모터 서열을 밝혀내었다 (Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol 287: L52 (2004), 이는 참고로 포함됨). 간략하게는, 일단 전사 개시 부위가 결정되었으면, 일방향 방식으로 5'-측면 절편의 절편들을 클로닝하기 위하여 공통 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 단편들을 생성하였다. 생성된 절편들을 루시퍼라아제 리포터 벡터 내에 클로닝하고, 루시퍼라아제 활성을 측정하여 인간 Sprouty4 유전자의 프로모터 영역을 결정하였다.
유전자 프로모터를 획득 및 확인하는 프로토콜의 또 다른 예는 하기 단계들을 포함한다: (1) 유사한/동일한 조직 유형의 질환에 걸린 그리고 질환에 걸리지 않은 세포/조직 샘플을 획득하는 단계; (2) 샘플로부터 전체 RNA 또는 mRNA를 단리하는 단계; (3) 질환에 걸린 그리고 질환에 걸리지 않은 RNA의 차별적 마이크로어레이 분석 (differential microarray analysis)을 수행하는 단계; (4) 질환-특이적 후보 전사체를 동정하는 단계; (5) 질환-특이적 전사체와 결부된 게놈 서열을 동정하는 단계; (6) 질환-특이적 전사체의 예측 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 DNA 서열을 획득 또는 합성하는 단계; (7) 상이한 길이의 단계 6으로부터의 DNA를 사용하여 프로모터 리포터 벡터를 디자인 및 생성하는 단계; 및 (8) 질환에 걸린 그리고 질환에 걸리지 않은 세포/조직에서뿐만 아니라 관련이 없는 세포/조직에서도 프로모터 리포터 벡터를 시험하는 단계.
유전자 스위치 내로 삽입되는 프로모터의 공급원은 천연 또는 합성 공급원일 수 있으며, 프로모터 공급원은 본 명세서에 기술된 본 발명의 범주를 한정하지 않아야 한다. 환언하면, 프로모터는 세포로부터 직접적으로 클로닝될 수 있거나, 프로모터는 상이한 공급원으로부터 이전에 클로닝되었을 수 있거나, 프로모터는 합성되었을 수 있다.
유전자 스위치 시스템
유전자 스위치는 특정 리간드의 첨가 또는 제거에 의해 유전자 발현을 조절하는 임의의 유전자 스위치일 수 있다. 일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 유전자 발현 수준이 존재하는 리간드 수준에 의존적인 것이다. 본 발명의 유전자 스위치에서 사용될 수 있는 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 예는 한정됨이 없이, 각각의 리간드 (예를 들어, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 레티노이드, 엑디손, 및 그의 유사체 및 모방체)에 의해 활성화되는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원 및 테트라사이클린에 의해 활성화되는 rTTA를 포함한다. 본 발명의 일 태양에서, 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치이다. 그러한 시스템의 예는 한정됨이 없이, 미국 특허 제6,258,603호, 미국 특허 제7,045,315호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0014711호, 미국 특허 출원 공개 제2007/0161086호 및 국제 특허 공개 WO01/70816호에 기술되어 있는 시스템을 포함한다. 키메라 엑디손 수용체 시스템의 예는 미국 특허 제7,091,038호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0110861호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0033600호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0096942호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0266457호, 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0100416호와, 국제 특허 공개 WO01/70816호, 국제 특허 공개 WO02/066612호, 국제 특허 공개 WO02/066613호, 국제 특허 공개 WO02/066614호, 국제 특허 공개 WO02/066615호, 국제 특허 공개 WO02/29075호 및 국제 특허 공개 WO2005/108617호에 기술되어 있는데, 이들 각각은 전체적으로 참고로 포함된다. 비-스테로이드계 엑디손 작동제-조절 시스템의 일례로는 레오스위치(등록상표) 포유류 유도성 발현 시스템 (미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)이 있다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 유전자 스위치는 FK506 결합 단백질 (FKBP)과 FKBP 라파마이신 결부 단백질 (FKBP rapamycin associated protein, FRAP)과의 헤테로이량체화를 기반으로 하며 라파마이신 또는 그의 비-면역억제성 유사체를 통하여 조절된다. 그러한 시스템의 예는 한정됨이 없이 아르젠트 (ARGENT)™ 트랜스크립셔널 테크놀로지 (Transcriptional Technology) (미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 에이알아이에이디 파마슈티칼스 (ARIAD Pharmaceuticals))와 미국 특허 제6,015,709호, 미국 특허 제6,117,680호, 미국 특허 제6,479,653호, 미국 특허 제6,187,757호, 및 미국 특허 제6,649,595호에 기술된 시스템을 포함한다.
일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 치료적 스위치 프로모터의 제어 하에, 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하는 단일 전사 인자 서열을 포함한다. 상기 전사 인자 서열은 자연 발생적이거나 인공적인 리간드-의존성 전사 인자 복합체인 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩할 수 있다. 인공 전사 인자는 전사 인자의 천연 서열이 예를 들어 이 서열의 돌연변이에 의해 또는 상이한 전사 인자들 유래의 도메인들의 조합에 의해 변경된 것이다. 일 실시 양태에서, 상기 전사 인자는 그룹 H (Group H) 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체, 편재 수용체 (ubiquitous receptor, UR), 고아 수용체 1 (orphan receptor 1, OR-1), 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1 (NER-1), 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15 (retinoid X receptor interacting protein-15, RIP- 15), 간 X 수용체 β (liver X receptor β, LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질 (RLD-1), 간 X 수용체 (liver X receptor, LXR), 간 X 수용체 α (LXRα), 파네소이드 X 수용체 (farnesoid X receptor, FXR), 수용체 상호작용 단백질 14 (receptor interacting protein 14, RIP-14), 또는 파네솔 수용체 (farnesol receptor, HRR-1) 유래의 것이다. 또 다른 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 엑디손 수용체 유래의 것이다.
A. 엑디손-기반 유전자 스위치
EcR 및 기타 그룹 H 핵 수용체는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원이며, 여기서, 일반적으로 모든 구성원은 아미노-말단 트랜스활성화 (transactivation) 도메인 (AD, "TA" 또는 "TD"로서도 상호교환가능하게 지칭됨) - 이는 선택적으로 헤테로이량체화 파트너 (heterodimerization partner, HP)에 융합되어 공동활성화 단백질 (coactivation protein, CAP)을 형성함 - , DNA 결합 도메인 (DNA binding domain, DBD), 및 경첩 영역을 통하여 DBD에 융합되어 리간드-의존성 전사 인자 (LTF)를 형성하는 LBD의 존재를 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용될 때, "DNA 결합 도메인"이라는 용어는 DNA 결합 도메인이 특정 반응 요소와 회합하는 기능을 하는 한, DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩티드 서열에서 전체 길이의 DNA 결합 단백질까지를 포함한다. 또한 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원은 하기 4개 또는 5개의 도메인의 존재를 특징으로 한다: A/B, C, D, E, 및 일부의 구성원에서 F (미국 특허 제4,981,784호 및 Evans, Science 240:889 (1988)). "A/B" 도메인은 트랜스활성화 도메인에 상응하며, "C"는 DNA 결합 도메인에 상응하며, "D"는 경첩 영역에 상응하며, "E"는 리간드 결합 도메인에 상응한다. 상기 패밀리의 일부 구성원은 "F"에 상응하는 LBD의 카르복시-말단측 상의 또 다른 트랜스활성화 도메인을 또한 가질 수 있다.
하기 폴리펩티드 서열은 엑디손 수용체 (엑디스테로이드 수용체) (20-히드록시-엑디손 수용체) (20E 수용체) (EcRH) (핵 수용체 수퍼패밀리 1 그룹 H 구성원 1)의 폴리펩티드 서열로서 보고되었으며, 젠 뱅크 수탁 번호 P34021을 갖는다.
드로소필라 멜라노가스터 (광대 파리 (Fruit fly)) 유래의 엑디손 수용체 (878개의 아미노산) (서열 번호 5)
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DBD는 반응 요소에 대한 특이성을 부여하는, 2개의 아미노산 모티프인 P-박스 및 D-박스 사이에 2개의 시스테인 징크 핑거 (zinc finger)가 존재하는 것을 특징으로 한다. 이들 도메인은 천연이거나, 변형되거나, 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인들의 키메라일 수 있다. EcR, 예를 들어 핵 수용체 패밀리의 하위세트는 헤테로이량체화 특성에 책임이 있는 덜 충분히 규정된 영역을 또한 보유한다. 핵 수용체의 도메인이 사실상 모듈 형태이기 때문에 LBD, DBD, 및 AD는 상호교환될 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 전사 인자는 AD, 치료 단백질 또는 치료 폴리뉴클레오티드 - 그의 발현은 조정됨 - 와 결부된 반응 요소를 인식하는 DBD, 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함한다. 이 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 치환 돌연변이를 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 유전자 스위치는 제1 치료적 스위치 프로모터 (TSP-1)의 제어 하에 제1 전사 인자 서열, 예를 들어 CAP, 및 제2 치료적 스위치 프로모터 (TSP-2)의 제어 하에 제2 전사 인자 서열, 예를 들어 LTF를 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 단백질 복합체 (LDTFC)를 형성하도록 상호작용하며, 즉, "이중 스위치 (dual switch)"-기반 또는 "2하이브리드 (two-hybrid)"-기반 유전자 스위치이다. 제1 및 제2 TSP는 동일하거나 상이할 수 있다. 이 실시 양태에서, 치료 분자 발현에 필요한 유전자 스위치에서 2개의 상이한 TSP가 존재한다는 것은 치료 방법의 특이성을 증강시킨다 (도 2). 또한 도 2는 단순히 적절한 TSP를 삽입함으로써 임의의 질환, 장애 또는 질병을 치료하기 위하여 치료적 유전자 스위치를 변형시키는 능력을 보여 준다.
추가의 실시 양태에서, 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열 둘 모두, 예를 들어 CAP 또는 LTF는 단일한 치료적 스위치 프로모터 (예를 들어, 도 1의 TSP-1)의 제어 하에 있다. 이 프로모터의 활성화는 단일 오픈 리딩 프레임을 갖는 CAP 및 LTF 둘 모두를 생성할 것이다. 이는 전사 링커, 예를 들어 IRES (내부 리보좀 진입 부위 (internal ribosomal entry site))의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이 실시 양태에서, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 둘 모두의 부분은 TSP-1의 활성화시에 합성된다. TSP-1은 항시적 프로모터이거나 질환, 장애 또는 질병과 결부된 상태 하에서만 활성화되는 프로모터일 수 있다.
추가의 실시 양태에서, 하나의 전사 인자 서열, 예를 들어 LTF는 단지 질환, 장애 또는 질병과 결부된 상태 하에서 활성화되는 치료적 스위치 프로모터 (예를 들어, 도 4에서 TSP-2 또는 TSP-3)의 제어 하에 있으며, 다른 하나의 전사 인자 서열, 예를 들어 CAP는 항시적 치료적 스위치 프로모터 (예를 들어, 도 4에서 TSP-1)의 제어 하에 있다. 이 실시 양태에서, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 한 부분은 항시적으로 존재하는 반면, 제2 부분은 질환, 장애 또는 질병과 결부된 상태 하에서만 합성될 것이다.
또 다른 실시 양태에서, 하나의 전사 인자 서열, 예를 들어, CAP는 제1 TSP (예를 들어, 도 3에서 TSP-1)의 제어 하에 있으며, 2가지 이상의 상이한 제2 전사 인자 서열, 예를 들어 LTF-1 및 LTF-2는 상이한 TSP (예를 들어, 도 3에서 TSP-2 및 TSP-3)의 제어 하에 있다. 이 실시 양태에서, LTF 각각은 상이한 인자-조절 프로모터 서열을 인식하는 상이한 DBD를 가질 수 있다 (예를 들어, DBD-A는 인자-조절 프로모터-1 (factor-regulated promoter-1, FRP-1)과 결부된 반응 요소에 결합하며, DBD-B는 인자-조절 프로모터-2 (FRP-2)와 결부된 반응 요소에 결합함). 인자-조절 프로모터 각각은 상이한 치료 유전자에 작동가능하게 결합될 수 있다. 이러한 방식으로, 다중 치료가 동시에 제공될 수 있다.
일 실시 양태에서, 제1 전사 인자 서열은 AD와, 발현이 조정되는 치료적 생성물 서열과 결부된 반응 요소를 인식하는 DBD와, 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 제2 전사 인자 서열은 척추동물 레티노이드 X 수용체 (retinoid X receptor, RXR), 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질 (ultraspiracle protein, USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 및 USP로부터 선택되는 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체로부터 선택되는 핵 수용체 LBD를 포함하는 전사 인자를 코딩한다 (국제 특허 공개 WO01/70816 A2호 및 미국 특허 제2004/0096942 A1호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 절단 돌연변이 (truncation mutation), 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 또 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 유전자 스위치는 핵 수용체 LBD와, 발현이 조정되는 치료적 생성물 서열과 결부된 반응 요소를 인식하는 DBD를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 전사 인자 서열, 및 AD 및 핵 수용체 LBD를 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 핵 수용체 LBD들 중 하나는 그룹 H 핵 수용체 LBD이다. 바람직한 실시 양태에서, 제1 폴리펩티드에는 실질적으로 AD가 없으며, 제2 폴리펩티드에는 실질적으로 DBD가 없다. 본 발명의 목적상, "실질적으로 없는"은 당해 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하기에 충분한 당해 도메인 서열을 포함하지 않음을 의미한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 제1 전사 인자 서열은 헤테로이량체화 파트너 및 AD ("CAP")를 포함하는 단백질을 코딩하며, 제2 전사 인자 서열은 DBD 및 LBD ("LTF")를 포함하는 단백질을 코딩한다.
단지 하나의 핵 수용체 LBD가 그룹 H LBD일 때, 다른 하나의 핵 수용체 LBD는 그룹 H LBD와 이량체를 형성하는 임의의 다른 핵 수용체 유래의 것일 수 있다. 예를 들어, 그룹 H 핵 수용체 LBD가 EcR LBD일 때, 다른 핵 수용체 LBD "파트너"는 EcR, 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질 (USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 또는 USP로부터 선택되는 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 LBD 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체 유래의 것일 수 있다 (본 명세서에 전체 내용이 참고로 포함된 국제 특허 공개 WO01/70816 A2호, 국제 특허 출원 PCT/US02/05235호 및 미국 특허 제2004/0096942 A1호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 절단 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 또 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 양태에서, 척추동물 RXR LBD는 인간 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 생쥐 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 쥐 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus), 닭 갈루스 갈루스 (Gallus gallus), 돼지 수스 스크로파 도메스티카 (Sus scrofa domestica), 개구리 제노푸스 라에비스 (Xenopus laevis), 제브라피시 (zebrafish) 다니오 레리오 (Danio rerio), 피낭동물 (tunicate) 폴리안드로카르파 미사키엔시스 (Polyandrocarpa misakiensis), 또는 해파리 트리페달리아 시소포라 (Tripedalia cysophora) RXR 유래의 것이다.
일 실시 양태에서, 무척추동물 RXR 리간드 결합 도메인은 메뚜기 로쿠스타 미그라토리아 (Locusta migratoria) 울트라스피라클 폴리펩티드 ("LmUSP"), 참진드기 (ixodid tick) 암블리오마 아메리카눔 (Amblyomma americanum) RXR 상동체 1 ("AmaRXRl"), 참진드기 암블리오마 아메리카눔 RXR 상동체 2 ("AmaRXR2"), 농게 (fiddler crab) 셀루카 푸길라토르 (Celuca pugilator) RXR 상동체 ("CpRXR"), 딱정벌레 테네브리오 몰리토르 (Tenebrio molitor) RXR 상동체 ("TmRXR"), 꿀벌 아피스 멜리페라 (Apis mellifera) RXR 상동체 ("AmRXR"), 진딧물 마이주스 페르시카에 (Myzus persicae) RXR 상동체 ("MpRXR"), 또는 비-쌍시류 (non-Dipteran)/비-인시류 (non-Lepidopteran) RXR 상동체 유래의 것이다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR LBD는 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편, 무척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편, 또는 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편로부터 선택되는 적어도 2가의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 2가지의 상이한 종의 RXR 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있거나, 또는 상기 종들이 동일할 때 2가지 이상의 폴리펩티드 단편은 상기 종들의 RXR 폴리펩티드 단편의 2가지 이상의 상이한 아이소폼 (isoform) 유래의 것일 수 있다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편 및 하나의 무척추동물 종의 RXR 폴리펩티드 단편을 포함한다.
리간드는 핵 수용체(들)의 LBD와 조합될 때 - 이는 다시 치료적 생성물 서열과 결부된 FRP의 반응 요소에 결합됨 - 치료적 생성물 서열의 발현의 외부의 일시적 조절을 제공한다. 본 발명의 다양한 구성요소가 서로에게 결합되는 결합 기작 또는 그 순서, 즉, 예를 들어 LBD에의 리간드의 결합, 반응 요소에의 DBD의 결합, 프로모터에의 AD의 결합 등의 결합 기작 또는 그 순서는 결정적이지 않다.
특정 실시예에서, 그룹 H 핵 수용체 및 그의 핵 수용체 LBD 파트너의 LBD에 리간드가 결합하는 것은 치료적 생성물 서열의 발현을 가능하게 한다. 이 기작은 그룹 H 핵 수용체 (GHNR) 또는 그의 파트너에 리간드가 결합하고 그 결과 활성 호모이량체 복합체 (예를 들어, GHNR + GHNR 또는 파트너 + 파트너)가 형성될 가능성을 배제하는 것은 아니다. 바람직하게는 당해 수용체 도메인들 중 하나 이상은 다양하여서 하이브리드 유전자 스위치를 생성한다. 전형적으로, 3가지 도메인, DBD, LBD, 및 AD 중 하나 이상은 다른 도메인의 공급원과는 상이한 공급원으로부터 선택될 수 있어서 하이브리드 유전자 및 생성된 하이브리드 단백질은 트랜스활성화 (transactivating) 활성, 리간드의 상보적 결합 및 특정 반응 요소의 인식을 위한 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 최적화되게 된다. 게다가, 반응 요소 그 자체는 다른 DNA 결합 단백질 도메인, 예를 들어 효모 유래의 GAL-4 단백질 [Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)] 또는 에스케리키아 콜라이 유래의 LexA 단백질 [Brent et al., Cell 43:729 (1985)]에 대한 반응 요소, 또는 하이브리드 수용체를 수용하도록 특정 상호작용을 위하여 디자인되고, 변형되고, 선택된 단백질과의 표적화된 상호작용에 특이적인 합성 반응 요소 (예를 들어, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997))로 변형 또는 치환될 수 있다. 2하이브리드 (two-hybrid) 시스템의 또 다른 이점은 이 시스템이 원하는 최종 결과에 따라 유전자가 발현되게 하는데 사용되는 프로모터의 선택을 허용한다는 것이다. 그러한 이중 제어는 특히 세포독성 단백질이 생성될 때 유전자 치료 분야에서 특히 중요할 수 있으며, 그 이유는 발현 타이밍과, 발현이 일어나는 세포 둘 모두가 제어될 수 있기 때문이다. 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자가 대상의 세포 내에 도입될 때, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 시스템의 존재에 의해 제어된다. 프로모터는 항시적으로 또는 유도가능하게 조절될 수 있거나, 또는 조직-특이적이거나 (즉, 특정 세포 유형에서만 발현됨) 유기체의 소정의 발생 단계에 특이적일 수 있다.
제1 하이브리드 단백질의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재 하에 반응 요소의 DNA 서열에 결합하여 이 반응 요소의 조절 하에 하류 유전자(들)의 전사를 개시하거나 억제한다.
기능성 LDTFC, 예를 들어 EcR 복합체는 이뮤노필린 (immunophilin)과 같은 추가의 단백질(들)을 또한 포함할 수 있다. 전사 인자로 공지된 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가의 구성원 (예를 들어 DHR38 또는 베타FTZ-1)은 또한 EcR, USP, 및/또는 RXR에 대한 리간드 의존적 또는 리간드 독립적 파트너일 수 있다. 추가로, 다른 보조인자, 예를 들어 일반적으로 보조활성자 (coactivator) (어댑터 (adapter) 또는 매개자 (mediator)로도 지칭됨)로 공지된 단백질이 필요할 수 있다. 이들 단백질은 DNA에 서열 특이적으로 결합하지 않으며, 기본 전사에 연루되어 있지 않다. 상기 단백질들은 활성자의 DNA 결합의 촉진을 포함하는 다양한 기작을 통하여, 염색질 구조에 영향을 줌으로써 또는 활성자-개시 복합체 상호작용을 매개함으로써 전사 활성에 대한 그의 영향을 발휘할 수 있다. 그러한 보조활성자의 예는 RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP, 및 기타 보조활성자 C 반응 요소 B 결합 단백질, CBP/p300을 포함한다 (검토를 위해서, Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)). 또한, 일반적으로 보조억제자 (corepressor)로 공지된 단백질 보조인자 (억제자, 사일런서 (silencer), 또는 사일런싱 (silencing) 매개자로도 공지됨)는 리간드의 부재 하에 전사 활성화를 효과적으로 억제하기 위하여 요구될 수 있다. 이들 보조억제자는 리간드 미결합 (unliganded) EcR과 상호작용하여 당해 반응 요소에서의 활성을 사일런싱시킬 수 있다. 현재의 증거는 리간드의 결합이 수용체의 형상 (conformation)을 변화시키며, 이는 보조억제자를 방출시키고 상기에 기술된 보조활성자를 모집하고 그에 의해 이들의 사일런싱 활성을 없앤다는 것을 시사하고 있다. 보조억제자의 예는 N-CoR 및 SMRT를 포함한다 (검토를 위해서, Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)). 이들 보조인자는 세포 또는 유기체 내에서 내인성일 수 있거나, 또는 조절되는 방식으로 또는 조절되지 않는 방식으로 발현될 트랜스진으로서 외부에서 첨가될 수 있다.
B. 람파마이신 기반의 유전자 스위치
본 발명은 리간드-의존성 전사 인자 복합체로서 FK506 결합 단백질을 이용하고 리간드로서 라파마이신을 이용하는 유전자 스위치 시스템을 추가로 제공한다. 일 실시양태에서, 이 유전자 스위치를 코딩하는 작제물은 라파마이신 또는 그의 유사체에 결합하며 적어도 하나의 FK506-결합 단백질 (FKBP) 도메인 및 그에 대하여 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인을 포함하는 제1 키메라 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 (여기서, FKBP 도메인은
(a) (1) 자연 발생 FKBP,
(2) 최대 10개의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 치환 아미노산으로 대체된 자연 발생 FKBP의 변이체, 및
(3) (1) 또는 (2)의 FKBP를 코딩하는 DNA 서열에 선택적으로 혼성화되는 DNA 서열에 의해 코딩되는 FKBP로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함함)와;
(b) (a) 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및 (b) 제1 키메라 단백질 둘 모두와 복합체를 형성하며 적어도 하나의 FKBP:라파마이신 결합 (FRB) 도메인 및 그에 대하여 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인을 포함하는 제2 키메라 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 (여기서, FRB 도메인은
(4) 자연 발생 FRB 도메인,
(5) 최대 10개의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 치환 아미노산으로 대체된 자연 발생 FRP 도메인의 변이체, 및
(6) (4) 또는 (5)의 FRB를 코딩하는 DNA 서열에 선택적으로 혼성화되는 DNA 서열에 의해 코딩되는 FRB
로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함함)를 포함한다.
이 유전자 스위치 시스템에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 각각은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 치료적 스위치 프로모터의 제어 하에 있다. 더욱이, 소정의 실시 양태에서, 제1 키메라 단백질 및 제2 키메라 단백질 중의 FKBP 및/또는 FRB 도메인에 대하여 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인은 하나 이상의 "작용 (action)" 또는 "이펙터 (effector) 도메인일 수 있다. 이펙터 도메인은 DNA 결합 도메인, 전사 활성화 도메인, 세포 국지화 도메인 및 시그널링 도메인 (클러스터링 (clustering) 또는 멀티머화 (multimerization)시에 세포의 성장, 증식, 분화, 아폽토시스, 유전자 전사 등이 가능한 도메인)을 포함하는 매우 다양한 단백질 도메인으로부터 선택될 수 있다.
소정의 실시양태에서, 하나의 융합 단백질은 적어도 하나의 DNA 결합 도메인 (예를 들어, GAL4 또는 ZFHD1 DNA-결합 도메인)을 포함하며, 또 다른 융합 단백질은 적어도 하나의 전사 활성화 도메인 (예를 들어, VP16 또는 p65 전사 활성화 도메인)을 포함한다. 융합 단백질들의 리간드-매개 회합은 전사 인자 복합체의 형성을 나타내며 융합 단백질들 중 하나 상의 DNA-결합 도메인에 의해 인식되는 (즉, 상기 DNA-결합 도메인과의 결합이 가능한) DNA 서열에 연결된 표적 유전자의 전사가 개시되게 한다. 유전자 발현 시스템, 및 리간드에 관한 정보는 미국 특허 제6,187,757 B1호, 미국 특허 제6,649,595 B1호, 미국 특허 제6,509,152 B1호, 미국 특허 제6,479,653 B1호, 및 미국 특허 제6,117,680 B1호에 개시되어 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 리간드의 부재 하에 자가 응집되는 두 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 스위치 시스템을 제공하며, 여기서, (a) 제1 융합 단백질은 선택된 리간드에 결합하는 조건부 응집 도메인과, 전사 활성화 도메인을 포함하며, (b) 선택된 리간드에 결합되는 조건부 응집 도메인과, DNA 결합 도메인을 포함하고, (c) 리간드의 부재 하에서 세포는 상기 DNA 결합 도메인이 결합되는 조절 DNA에 작동가능하게 연결된 유전자를 발현한다. 유전자 스위치 시스템을 포함하는 변형된 세포는 리간드의 존재 하에 유전자의 억압에 충분한 양으로 확장된다. 리간드 제거는 세포 사멸을 야기하는 코딩 단백질의 발현을 유도한다. 상기 두 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 적어도 하나의 조건부 프로모터의 제어 하에 있다. 조건부 응집 도메인을 이용하는 유전자 발현 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2002/0048792호에 개시되어 있다.
C. 원핵생물 리프레서 (Repressor)/ 오퍼레이터 (Operator) 기반의 유전자 스위치 시스템
일 실시 양태에서, 본 발명은 (a) 원핵생물 테트라사이클린 ("tet") 리프레서 및 진핵생물 전사 활성자 단백질 도메인을 포함하는 트랜스활성자 (transactivator) 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 치료 단백질 또는 치료 폴리펩티드를 코딩하며 최소 프로모터 및 적어도 하나의 tet 오퍼레이터 서열에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 스위치 시스템을 제공한다. 트랜스활성자 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 치료적 스위치 프로모터를 포함할 수 있다. 치명적 단백질의 발현은 테트라사이클린의 부재 하에서는 상향조절된다 (예를 들어, Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551]; [Gossen et al. (1993) TIBS 18 : 471-475; Furth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9302-9306; 및 Shockett et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6522-6526). TetO 발현 시스템은 미국 특허 제5,464,758 B1호에 개시되어 있다.
또 다른 실시 양태에서, 유전자 스위치 시스템은 박테리아인 에스케리키아 콜라이 유래의 락토스 ("Lac") 리프레서-오퍼레이터 시스템을 포함한다. 본 발명의 유전자 스위치 시스템은 (a) 원핵생물 lac I 리프레서 및 진핵생물 전사 활성자 단백질 도메인을 포함하는 트랜스활성자 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 치료 단백질 또는 치료 폴리펩티드를 코딩하며 치료적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. Lac 시스템에서, lac 오페론은 락토스, 또는 합성 유사체, 예를 들어 아이소프로필-b-D-티오갈락토사이드의 부재 하에서 불활성화된다.
추가의 유전자 스위치 시스템은 하기에 기술된 것을 포함한다: 미국 특허 제7,091,038호; 국제 특허 공개 WO2004078924호; 유럽 특허 제1266015호; 미국 특허 출원 공개 제20010044151호; 미국 특허 출원 공개 제20020110861호; 미국 특허 출원 공개 제20020119521호; 미국 특허 출원 공개 제20040033600호; 미국 특허 출원 공개 제20040197861호; 미국 특허 출원 공개 제20040235097호; 미국 특허 출원 공개 제20060020146호; 미국 특허 출원 공개 제20040049437호; 미국 특허 출원 공개 제20040096942호; 미국 특허 출원 공개 제20050228016호; 미국 특허 출원 공개 제20050266457호; 미국 특허 출원 공개 제20060100416호; 국제 특허 공개 제WO 2001/70816호; 국제 특허 공개 WO2002/29075호; 국제 특허 공개 WO2002/066612호; 국제 특허 공개 WO2002/066613호; 국제 특허 공개 WO2002/066614호; 국제 특허 공개 WO2002/066615호; 국제 특허 공개 WO2005/108617호; 미국 특허 제6,258,603호; 미국 특허 출원 공개 제20050209283호; 미국 특허 출원 공개 제20050228016호; 미국 특허 출원 공개 제20060020146호; 유럽 특허 제0965644호; 미국 특허 제7,304,162호; 미국 특허 제7,304,161호; 멕시코 특허 제234742호; 한국 특허 제10-0563143호; 오스트레일리아 특허 제765306호; 오스트레일리아 특허 출원 제2002-248500호; 및 오스트레일리아 특허 출원 제2002-306550호.
D. 유전자 스위치 시스템들의 조합
본 발명은 유효량의 하나 이상의 리간드에 의해 활성화되는 상이한 리간드-의존성 전사 인자 복합체들을 포함하는 2가지 이상의 유전자 스위치 시스템을 포함하는 핵산 조성물, 변형된 세포, 및 생물반응기를 제공하며, 여기서, 상기 2가지 이상의 유전자 스위치 시스템은 제1 유전자 스위치 및 제2 유전자 스위치를 포함하고, 상기 둘 모두의 유전자 스위치는 하나 이상의 리간드에의 결합시에 하나 이상의 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 선택적으로 유도한다. 임의의 개수의 유전자 스위치 시스템 및/또는 그의 조합이 본 발명의 범주 내에 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 하기 a 및 b를 함유하는 핵산 조성물을 제공한다.
a. 하기 i, ii 및 iii을 포함하는 제1 유전자 스위치:
i. 하기 1 및 2를 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결부된 인자-조절 프로모터를 활성화시키는 트랜스활성화 도메인, 및
2. 헤테로이량체 파트너 도메인;
ii.하기 1 및 2를 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결부된 인자-조절 프로모터를 인식하는 DNA-결합 도메인, 및
2. 리간드 결합 도메인; 및
iii.하기 1 및 2를 포함하는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 유전자 발현 카세트
1. 제2 하이브리드 폴리펩티드의 트랜스활성화 도메인에 의해 활성화되는 인자-조절 프로모터, 및
2. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드; 및
b. 하기 i, ii 및 iii을 포함하는 제3 유전자 발현 카세트:
i. 하기 1 및 2를 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결부된 인자-조절 프로모터를 활성화시키는 트랜스활성화 도메인, 및
2. 헤테로이량체 파트너 도메인;
ii. 하기 1 및 2를 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 제2 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결부된 인자-조절 프로모터를 인식하는 DNA-결합 도메인, 및
2. 리간드 결합 도메인; 및
iii. 하기 1 및 2를 포함하는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 유전자 발현 카세트:
1. 제2 하이브리드 폴리펩티드의 트랜스활성화 도메인에 의해 활성화되는 인자-조절 프로모터, 및
2. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드.
다수의 유도가능한 유전자 발현 시스템은 상이한 질환, 장애 또는 질병과 결부된 상태 하에서의 주어진 치료 폴리뉴클레오티드 또는 치료 폴리펩티드의 발현, 또는 동일한 질환, 장애 또는 질병과 결부된 동일한 상태 하에서의 또는 상이한 질환, 장애 또는 질병과 결부된 상이한 상태 하에서의 다수의 치료학적 폴리펩티드 또는 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 제공한다.
소정의 실시 양태에서, 2가지 이상의 유전자 스위치 시스템의 조합은 (1) 이중-스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 발현 시스템 및 (2) 단일-스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 조합은 (1) 단일- 또는 이중-스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치 및 (2) 라파마이신 기반 유전자 스위치일 수 있다. 대안적으로, 유전자 스위치 시스템들의 조합은 상기에 개시된 2가지의 동일한 라파마이신 기반 유전자 스위치 시스템일 수 있다. 유전자 스위치 시스템들의 임의의 가능한 조합이 본 발명의 범위 이내에 있다.
리간드
본 명세서에서 사용될 때, "리간드"라는 용어는 LDTFC-기반 유전자 스위치, 예를 들어 EcD 복합체 기반 유전자 스위치에 적용될 경우 유전자 스위치를 활성화시켜 그 안에 코딩된 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 능력을 갖는 작은 용해성 ㅂ부분자를 설명하는 것이다. 본 발명의 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 리간드는 리간드 결합 도메인, 헤테로이량체 파트너 도메인, DNA 결합 도메인 및 트랜스활성화 도메인 중 하나 이상을 포함하는 단백질 복합체에 결합한다. 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 활성화시키기 위한 리간드의 선택은 이용되는 유전자 스위치의 유형에 따라 달라진다.
리간드의 예는 한정됨이 없이 엑디스테로이드, 예를 들어 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 뮤리스테론 A 등, 9-시스-레틴산, 레틴산의 합성 유사체, N,N'-다이아실하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제6,013,836호; 미국 특허 제5,117,057호; 미국 특허 제5,530,028호; 및 미국 특허 제5,378,726호와 미국 특허 출원 공개 제2005/0209283호 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0020146호에 개시된 것; 미국 특허 출원 공개 제2004/0171651호에 개시되어 있는 옥사다이아졸린; 다이벤조일알킬 시아노하이드라진, 예를 들어 유럽 특허 출원 제461,809호에 개시된 것; N-알킬-N,N'-다이아로일하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것; N-아실-N-알킬카르보닐하이드라진, 예를 들어 유럽 특허 출원 제234,994호에 개시된 것; N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제4,985,461호에 개시된 것; 아미도케톤, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2004/0049037호에 개시된 것 - 상기 특허 또는 특허 출원 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨 - , 및 3,5-다이-tert-부틸-4-하이드록시-N-아이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파기드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파- 6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트 (ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 파메솔, 담즙산, 1,1-바이포스포네이트 에스테르, 유약 호르몬 III 등을 포함하는 기타 유사 물질을 포함한다. 본 발명에서 유용한 다이아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819 (3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-다이메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), RG-115932 ((R)-3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)- N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), 및 RG-115830 (3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드)을 포함한다. 예를 들어 미국 특허 출원 제12/155,111호 및 국제 특허 출원 PCT/US2008/006757호를 참조하는데, 이들 둘 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
예를 들어, 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치를 위한 리간드는 임의의 적합한 리간드로부터 선택될 수 있다. 자연 발생 엑디손 또는 엑디손 유사체 (예를 들어, 20-하이드록시엑디손, 뮤리스테론 A, 포나스테론 A, 포나스테론 B, 포나스테론 C, 26-요오도포나스테론 A, 이노코스테론 또는 26-메실이노코스테론) 및 비-스테로이드계 유도제 둘 모두가 본 발명의 유전자 스위치를 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 미국 특허 제6,379,945 B1호에는 헬리오티스 비레센스 (Heliothis virescens)로부터 단리된 곤충 스테로이드 수용체 ("HEcR")가 기술되어 있으며, 이는 예를 들어 더욱 낮은 제조 비용, 대사 안정성, 곤충, 식물 또는 포유류에는 없다는 것, 및 환경적 용인성을 포함하는 다수의 이유 때문에 스테로이드계 유도제 및 소정의 비-스테로이드계 유도제 둘 모두에 대하여 반응성인 이 시스템 및 많은 기타 시스템에서 스테로이드에 비하여 독특한 이점을 갖는다. 미국 특허 제6,379,945 B1호에는 엑디손-기반 유전자 스위치를 위한 리간드로서 2가지 다이벤조일하이드라진류, 1,2-다이벤조일-1-tert-부틸-하이드라진 및 테부페노지드 (N-(4- 에틸벤조일)-N'-(3,5-다이메틸벤조일)-N'-tert-부틸-하이드라진)의 유용성이 기술되어 있다. 또한 리간드로서 본 발명에 포함되는 것은 다른 다이벤조일하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제5,117,057 B1호에 개시된 것이 있다. 드로소필라 멜라노가스터 유래의 엑디손 수용체를 위한 화학적 리간드로서 테부페노지드를 사용하는 것이 미국 특허 제6,147,282호에 또한 개시되어 있다. 엑디손 리간드의 추가적인 비제한적 예로는 3,5-다이-tert-부틸-4-하이드록시-N-아이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파기드, 1,2-다이아실 하이드라진, N'-치환-N,N'-2치환 하이드라진, 다이벤조일알킬 시아노하이드라진, N-치환-N-알킬-N,N-다이아로일 하이드라진, N-치환-N-아실-N-알킬, 카르보닐 하이드라진 또는 N-아로일-N'-알킬-N'-아로일 하이드라진이 있다. (미국 특허 제6,723,531호).
일 실시 양태에서, 엑디손 기반 유전자 스위치 시스템을 위한 리간드로는 다이아실하이드라진 리간드 또는 키랄 다이아실하이드라진 리간드가 있다. 본 유전자 스위치 시스템에서 사용되는 리간드는 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00012
상기 식에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시 또는 아릴옥시이며;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
R1 및 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다.
또 다른 실시 양태에서, 리간드는 거울상 이성질체가 풍부한 하기 화학식 II의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다:
[화학식 II]
Figure pct00013
상기 식에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
R1 및 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이되;
단, R1은 R2와 같지 않으며;
R1 및 R2를 갖는 비대칭 탄소 원자에서의 절대 배열은 주로 S이다.
소정의 실시 양태에서, 리간드는 거울상 이성질체가 풍부한 하기 화학식 III의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다:
[화학식 III]
Figure pct00014
상기 식에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
R1 및 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이되;
단, R1은 R2와 같지 않으며;
R1 및 R2를 갖는 비대칭 탄소 원자에서의 절대 배열은 주로 R이다.
일 실시 양태에서, 리간드는 거울상 이성질체 과잉율 (enantiomeric excess)이 95% 이상인 (R)-3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다.
화학식 I의 다이아실하이드라진 리간드 및 화학식 II 또는 화학식 III의 키랄 다이아실하이드라진 리간드는, 엑디손-기반 유전자 스위치 시스템과 함께 사용될 때, 본 발명의 치료적 폴리펩티드 또는 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현의 외부의 일시적 조절 수단을 제공한다. 2008년 5월 29일자로 출원되고 본 명세서에 참고로 전적으로 포함된 미국 특허 출원 제12/155,111호를 참조하라.
본 발명에서 사용되는 리간드는 염을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때 "염(들)"이라는 용어는 무기 및/또는 유기 산 및 염기에 의해 형성되는 산성 및/또는 염기성 염을 나타낸다. 게다가, 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물이 염기성 잔기 및 산성 잔기 둘 모두를 포함할 때 쯔비터이온 ("내부 염")이 형성될 수 있으며 이는 본 명세서에서 사용되는 "염(들)"이라는 용어 내에 포함된다. 예를 들어 제조 동안 이용될 수 있는 단리 또는 정제 단계에서 약학적으로 허용가능한 (즉, 비독성이며 생리학적으로 허용가능한) 염이 사용되지만, 기타 염이 또한 유용하다. 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물의 염은 화합물을 예를 들어 염이 침전되는 것과 같은 매질에서 또는 수성 매질에서 당량과 같은 소정 양의 산 또는 염기와 반응시키고 이어서 동결건조시킴으로써 형성될 수 있다.
염기성 잔기를 포함하는 리간드는 다양한 유기 및 무기 산과 염을 형성할 수 있다. 예시적인 산 부가염은 아세테이트 (예를 들어 아세트산 또는 트라이할로아세트산, 예를 들어 트라이플루오로아세트산에 의해 형성되는 것), 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트 (hemisulfate), 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염 (염산에 의해 형성됨), 브롬화수소산염 (브롬화수소에 의해 형성됨), 요오드화수소산염, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트 (말레산에 의해 형성됨), 메탄설포네이트 (메탄설폰산에 의해 형성됨), 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 석시네이트, 설페이트 (예를 들어, 황산에 의해 형성되는 것), 설포네이트 (예를 들어 본 명세서에 언급된 것), 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 예를 들어 토실레이트, 운데카노에이트 등을 포함한다.
산성 잔기를 포함하는 리간드는 다양한 유기 및 무기 염기와 염을 형성할 수 있다. 예시적인 염기성 염은 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예를 들어 나트륨, 리튬 및 칼륨 염, 알칼리 토금속 염, 예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기 (예를 들어 유기 아민)와의 염, 예를 들어 벤자틴, 다이사이클로헥실아민, 하이드라바민 (N,N-비스(데하이드로아비에틸)에틸렌다이아민), N-메틸-D-글루카민, N-메틸-D-글루카미드, t-부틸 아민, 및 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 라이신과 같은 아미노산과의 염 등을 포함한다.
FK506 결합 도메인을 이용하는 유도가능한 유전자 발현 시스템을 위한 ㄹ리리간드의 비제한적 예로는 FK506, 사이클로스포린 A 또는 라파마이신이 있다. FK506, 라파마이신 및 이들의 유사체는 미국 특허 제6,649,595 B2호 및 미국 특허 제6,187,757호에 개시되어 있다. 미국 특허 제7,276,498호 및 미국 특허 제7,273,874호를 또한 참조하라.
본 명세서에 기술된 리간드는 단독으로 투여될 수 있거나 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 일 실시 양태에서, 약학 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 연고, 엘릭시르 (elixir), 또는 주사가능한 조성물의 형태이다.
유전자 스위치와 관련하여 "엑디손 수용체-기반"이라는 용어는 자연 발생 또는 합성 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인의 적어도 기능성 부분을 포함하며 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인에 결합하는 리간드에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 유전자 스위치를 나타낸다. 엑디손-반응성 시스템의 예가 미국 특허 제7,091,038호 및 미국 특허 제6,258,603호에 기술되어 있다. 일 실시 양태에서, 이 시스템은 레오스위치(등록상표) 테라퓨틱 시스템 (RTS)인데, 이는 2가지 융합 단백질, 돌연변이 유발된 엑디손 수용체 (EcR)의 DEF 도메인이 Gal4 DNA 결합 도메인과 융합된 것, 및 키메라 RXR의 EF 도메인이 VP16 전사 활성화 도메인과 융합된 것을 포함하는데, 이는 도 1에 도시된 바와 같이 항시적 프로모터 하에서 발현된다.
"조정하는" 및 "조정하다"라는 용어는 핵산 또는 유전자의 발현을 유도, 감소 또는 억제하여 단백질 또는 폴리펩티드 생성을 각각 유도, 감소 또는 억제함을 의미한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포에서 유전자가 발현되게 하기에 적합한 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시 양태에서 사용될 수 있는 인핸서는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 인핸서, 신장 인자 1 (elongation factor 1, EF1) 인핸서, 효모 인핸서, 바이러스 유전자 인핸서 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
종결 제어 영역, 즉, 종결서열 또는 폴리아데닐화 서열이 바람직한 숙주에 대하여 천연인 다양한 유전자로부터 또한 유래될 수 있다. 선택적으로, 종결 부위는 불필요할 수 있지만, 포함될 경우가 가장 바람직하다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 종결 제어 영역이 포함될 수 있거나, 이는 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 시그널, SV40 후기 폴리아데닐화 시그널, SV40 폴리아데닐화 시그널, 소과 성장 호르몬 (bovine growth hormone, BGH) 폴리아데닐화 시그널, 바이러스 터미네이터 서열 등으로부터 유래될 수 있다.
"3' 비-코딩 서열" 또는 "3' 비번역 영역 (untranslated region, UTR)"이라는 용어는 코딩 서열의 하류 (3')에 위치하는 DNA 서열을 나타내며, 폴리아데닐화 [폴리(A)] 인식 서열과, mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 시그널을 코딩하는 기타 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 폴리아데닐화 시그널은 폴리아데닐산 트랙트(tract)가 mRNA 전구체의 3' 말단에 부가되는 것에 영향을 주는 것을 특징으로 한다.
"조절 영역"은 제2 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 나타낸다. 조절 영역은 특정 핵산 (동질적 영역)의 발현에 자연적으로 책임이 있는 서열을 포함할 수 있거나, 상이한 단백질들 또는 심지어 합성 단백질들 (이질적 영역)의 발현에 책임이 있는 상이한 기원의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 특이적 방식 또는 비특이적 방식으로 그리고 유도가능한 방식 또는 유도 불가능한 방식으로 유전자의 전사를 촉진 또는 억압하는 유도된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 기원, RNA 스플라이스 부위, 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열, 및 폴리펩티드를 표적 세포의 분비 통로 내로 인도하는 시그널 서열을 포함한다.
"이종 공급원" 유래의 조절 영역은 발현되는 핵산과 자연적으로는 결부되지 않는 조절 서열을 나타낸다. 이종 조절 영역 중에 포함되는 것으로는 상이한 종들 유래의 조절 영역, 상이한 유전자 유래의 조절 영역, 하이브리드 조절 서열, 및 자연에서는 나타나지 않지만 당업자에 의해 디자인된 조절 서열이 있다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라아제-촉매된 전사로부터 생겨난 생성물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보적 카피일 경우, 이것은 일차 전사체로 불리거나, 또는 이것은 일차 전사체의 전사후 프로세싱으로부터 유도된 RNA 서열일 수 있으며 성숙 RNA로 불린다. "메신저 RNA (mRNA)"는 인트론이 없는 RNA를 말하며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. "cDNA"는 mRNA에 상보적이며 mRNA로부터 유도되는 이중-가닥 DNA를 말한다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하며 따라서 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 말한다. "안티센스 RNA"는 표적 일차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이며 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 말한다. 안티센스 RNA의 상보성은 특정 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉, 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열, 또는 코딩 서열에서의 것일 수 있다. "기능성 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 번역되지 않지만 세포 과정에 대해 영향을 미치는 기타 RNA를 말한다.
"폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있으며 공유 결합된 아미노산 잔기로 이루어진 중합체성 화합물을 말한다.
"단리된 폴리펩티드", "단리된 펩티드" 또는 "단리된 단백질"은 그것의 자연 상태에서 그들과 정상적으로 연합되는 화합물들(예를 들어, 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질)이 실질적으로 없는 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. "단리된"은 다른 화합물과의 인공적 또는 합성 혼합물을 배제하는 것을 의미하지 않거나, 또는 생물학적 활성을 방해하지 않으며 예를 들어, 불완전한 정제, 안정제의 첨가 또는 약학적으로 허용가능한 제제로의 배합으로 인한 것일 수 있는 불순물의 존재를 배제하는 것을 의미하지 않는다.
"치환 돌연변이 폴리펩티드" 또는 "치환 돌연변이"는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩티드에 대하여 상이한 아미노산으로 적어도 하나의 야생형 또는 자연 발생 아미노산이 치환된 것을 포함하는 돌연변이 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 치환 돌연변이 폴리펩티드는 단지 하나의 야생형 또는 자연 발생 아미노산 치환을 포함할 수 있으며 "점 돌연변이" 또는 "단일 점 돌연변이" 폴리펩티드로 불릴 수 있다. 대안적으로, 치환 돌연변이 폴리펩티드는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩티드에 대하여 둘 이상의 아미노산으로 둘 이상의 야생형 또는 자연 발생 아미노산이 치환된 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드는 야생형 또는 자연 발생 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드에 대하여 상이한 아미노산으로 적어도 하나의 야생형 또는 자연 발생 아미노산이 치환된 것을 포함한다.
치환 돌연변이 폴리펩티드가 둘 이상의 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 치환을 포함할 경우, 이 치환은 치환을 위해 결실된 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 등가의 개수, 즉, 2개의 비-야생형 또는 비-자연 발생 아미노산으로 대체된 2개의 야생형 또는 자연 발생 아미노산을 포함하거나, 또는 치환을 위해 결실된 야생형 아미노산의 비-등가의 개수, 즉, 1개의 비-야생형 아미노산으로 대체된 2개의 야생형 아미노산 (치환+결실 돌연변이) 또는 3개의 비-야생형 아미노산으로 대체된 2개의 야생형 아미노산 (치환+삽입 돌연변이)을 포함할 수 있다.
치환 돌연변이는 기준 폴리펩티드 서열 내의 대체된 아미노산 잔기와 번호 및 새로운 치환된 아미노산 잔기를 나타내기 위하여 약칭된 명명법 시스템을 이용하여 개시될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 20번째 아미노산 잔기가 치환된 치환 돌연변이는 "x20z"로 약칭될 수 있으며, 여기서, "x"는 대체될 아미노산이며, "20"은 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 위치 또는 번호이며, "z"는 새로운 치환된 아미노산이다. 따라서, "E20A" 또는 "Glu20Ala"로 서로 바꾸어서 약칭되는 치환 돌연변이는 돌연변이가 폴리펩티드의 위치 20에서 글루탐산 (보통 당업계에서 "E" 또는 "Glu"로 약칭됨) 대신 알라닌 잔기 (보통 당업계에서 "A" 또는 "Ala"로 약칭됨)를 포함함을 나타낸다.
치환 돌연변이는 당업계에 알려진 돌연변이유발을 위한 임의의 기술에 의해 제조될 수 있으며, 시험관 내에서 부위-지시 돌연변이유발 (Hutchinson et al., J.Biol.Chem. 253:6551 (1978); Zoller et al., DNA 3:479(1984); Oliphant et al., Gene 44:177(1986); Hutchinson et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:710(1986)), TAB(등록상표) 링커(파마시아(Pharmacia))의 이용, 제한 엔도뉴클레아제 분해, 단편 결실 및 치환, PCR-매개/올리고뉴클레오티드-지시 돌연변이유발, 및 기타를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. PCR-기반 기술이 부위-지시 돌연변이유발에 바람직하다 (Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.Erlich, ed.,Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70).
폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "단편"은 그 아미노산 서열이 기준 폴리펩티드의 서열보다 짧으며 이들 기준 폴리펩티드의 전체 부분에 걸쳐, 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 그러한 단편은 적절할 경우, 그들이 일부가 되는 더 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 그러한 단편은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240, 또는 300개 이상의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유도되며 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 보유한 임의의 유사체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이를 말한다. 폴리펩티드 또는 단백질의 상이한 변이체가 자연에 존재할 수 있다. 이들 변이체는 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 차이를 특징으로 하는 대립유전자 변이체이거나, 또는 차등 스플라이싱 또는 번역후 변형에 관련될 수 있다. 당업자는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 대체를 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 이들 변이체는 특히, (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 치환되는 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 또는 단백질에 부가되는 변이체, (c) 아미노산 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 변이체, 및 (d) 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 다른 폴리펩티드와 융합되는 변이체를 포함할 수 있다. 유전적 (억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소적 기술을 비롯한 이들 변이체를 얻기 위한 기술이 당업자에게 알려져 있다. 일 실시 양태에서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 14개의 아미노산을 포함한다.
용어 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 부분 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 한 부분으로부터의 서열과 다른 서열 사이의 일치성은 당업계에 알려진 기술에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 쉽게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 상동성은 상동성 영역 사이에 안정한 듀플렉스를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화시키고, 이어서 단일-가닥-특이적 뉴클레아제(들)로 분해하고 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 모든 그 문법적 형태와 철자 변형의 용어 "상동성"은 수퍼패밀리 (예를 들어, 면역글로불린 수퍼패밀리)로부터의 단백질 및 상이한 종으로부터의 상동성 단백질(예를 들어, 미오신 경쇄 등)을 비롯한, "공통 진화 기원"을 보유하는 단백질 사이의 관계를 말한다 (Reeck et al., Cell 50:667(1987)). 그러한 단백질 (및 그들의 코딩 유전자)은 그들의 높은 서열 유사도에 의해 반영되는 것처럼, 서열 상동성을 가진다. 하지만, 일반 용법에서 그리고 본 출원에서, 용어 "상동성"은 "매우"와 같은 부사로 수식될 경우, 서열 유사성을 가리키며 공통 진화 기원을 나타내지는 않을 수 있다.
따라서, 모든 그 문법적 형태의 용어 "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 공유하지 않을 수 있는 단백질의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 또는 일치성의 정도를 말한다 (Reeck et al., Cell 50:667(1987)). 일 실시 양태에서, 두 개의 DNA 서열은 뉴클레오티드의 적어도 약 50% (예를 들어, 적어도 약 75%, 90%, 또는 95%)가 DNA 서열의 한정된 길이에 걸쳐 매칭될 때 "실질적으로 상동성"이거나 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 은행에서 입수가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교하거나, 또는 예를 들어, 그 특정 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건 하에서의 서던 (Southern) 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건의 정의는 당업자의 수준 내이다 (예를 들어, Sambrook et al., 1989).
본 명세서에 사용될 때, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 하나 이상의 아미노산의 치환을 야기하지만, DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 특성에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"은 또한 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 핵산 단편이 안티센스 또는 공동억제 기술에 의해 유전자 발현의 변경을 매개하는 능력에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"은 또한 생성된 전사체의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변경을 말한다. 따라서 본 발명은 특정 예시 서열보다 많은 것을 포괄함이 이해된다. 제안된 변경의 각각은 당업계의 일상적 기술 내이며, 코딩된 생성물의 생물학적 활성의 보유의 결정도 그러하다.
더욱이, 당업자는 본 발명에 의해 포괄되는 실질적으로 유사한 서열이 또한 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 2X SSC, 0.1% SDS로 세척되고 이어서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척됨) 하에서, 본 명세서에서 예시된 서열과 혼성화하는 그들의 능력에 의해 정의됨을 인식한다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 DNA 서열이 본 명세서에서 보고된 핵산 단편의 DNA 서열에 적어도 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 핵산 단편이다.
두 개의 아미노산 서열은 아미노산의 약 40% 초과가 동일하거나, 또는 60% 초과가 유사(기능적으로 동일)할 때 "실질적으로 상동성"이거나 또는 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게는, 유사하거나 상동성인 서열은 예를 들어, GCG (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), GCG 패키지용 프로그램 매뉴얼, 버전 7, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 파일업 프로그램을 이용한 정렬에 의해 확인된다.
용어 "상응하는"은 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하든지 상이하든지 간에, 유사하거나 상동성인 서열을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 핵산 또는 아미노산 서열 정렬은 공간을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "상응하는"은 서열 유사성을 지칭하며, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 넘버링을 지칭하지 않는다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분"은 당업자에 의한 서열의 수동 평가에 의해, 또는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J.Mol.Biol. 215:403 (1993)); ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 입수가능함)와 같은 알고리즘을 이용한 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 확인에 의해, 그 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 확인하기 위해 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열의 충분한 부분을 포함한다. 일반적으로, 공지의 단백질 또는 유전자에 상동성인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 추정적으로 확인하기 위하여, 10개 이상의 연속적 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오티드의 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 20-30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 유전자 확인 (예를 들어, 서던 혼성화) 및 분리 (예를 들어, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파아지 플라크의 원위치 혼성화)의 서열-의존적 방법에 사용될 수 있다. 또한, 12-15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위하여 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분"은 그 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 확인 및/또는 단리하기 위해 충분한 서열을 포함한다.
당업계에 알려진 바와 같이, 용어 "퍼센트 동일성"은 서열을 비교하여 결정되는, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한 그러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정할 때, 경우에 따라, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련도를 의미한다. "동일성"과 "유사성"은 Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)에서 개시된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는 공지 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열 간의 최상의 매치를 제공하도록 디자인된다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 성문화된다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 레이저진(LASERGENE) 생물정보 컴퓨터 계산 세트(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타, 인크(DNASTAR, Inc.))의 메가라인(Megalign) 프로그램과 같은 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 실행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 디폴트 파라미터(갭 페널티 =10, 갭 길이 페널티=10)를 이용하여 클러스탈 정렬법(Clustal method of alignment) (Higgins et al, CABIOS. 5:151 (1989))을 이용하여 실시될 수 있다. 클러스탈법을 이용한 쌍방식 정렬을 위한 디폴트 파라미터는 선택될 수 있다: KTUPLE 1, 갭 페널티=3, 윈도우=5 및 DIAGONALS SAVED=5).
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 말한다. "서열 분석 소프트웨어"는 구매가능하거나 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 세트 (위스콘신 패키지 버전 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (GCG), 미국 위스콘신주 매디슨 소재), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)), 및 디엔에이스타 (디엔에이스타, 인크., 미국 위스콘신주 53715 매디슨 파크 스트리트 1228 에스 소재)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 본 출원의 맥락에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용될 경우, 분석의 결과는 달리 특정되지 않으면 기준이 된 프로그램의 "디폴트 값"에 기반할 것임이 이해될 것이다. 본 명세서에 사용될 때 "디폴트 값"은 처음에 동기화될 때 소프트웨어에 원래 로딩되는 값 또는 파라미터의 임의의 세트를 의미할 것이다.
DNA의 서열에 관련될 때 "화학적으로 합성된"은 구성요소 뉴클레오티드가 시험관 내에서 조립되었음을 의미한다. DNA의 수동 화학 합성은 잘 확립된 절차를 이용하여 이루어질 수 있거나, 또는 자동 화학 합성이 많은 구매가능한 기계 중 하나를 이용하여 실시될 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 편향성(codon bias)을 반영하기 위한 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기반하여 최적 유전자 발현을 위해 맞추어질 수 있다. 당업자는 코돈 사용이 숙주에 의해 선호되는 코돈에 대해 편향되면 성공적인 유전자 발현이 가능함을 이해한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 입수가능한 숙주 세포로부터 유래된 유전자의 조사에 기반할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 둘 이상의 개별 작동가능한 유전자 조절 시스템은 a) 선택된 농도에서, 그 각각의 리간드에 의한 주어진 시스템 각각의 조절이 그 시스템의 유전자의 발현의 양의 측정가능한 변화를 야기할 때, 그리고 b) 변화가 실제 조절의 동시성 또는 순차성에 관계없이, 세포, 조직 또는 유기체에서 동시에 작동가능한 모든 다른 시스템의 발현에서의 변화와 통계적으로 유의하게 상이할 때, "직교"라고 말해진다. 바람직하게는, 각각의 개별적으로 작동가능한 유전자 조절 시스템의 조절은 세포, 조직 또는 유기체 내의 모든 다른 작동가능한 시스템보다 적어도 2배 큰, 예를 들어, 적어도 5배, 10배, 100배, 또는 500배 큰 유전자 발현 변화를 일으킨다. 이상적으로는, 선택된 농도에서 그 각각의 리간드에 의한 주어진 시스템 각각의 조절은 그 시스템의 유전자의 발현 양의 측정가능한 변화를 일으키며 세포, 조직, 또는 유기체에서 작동가능한 모든 다른 시스템의 발현에서 측정가능한 변화를 야기하지 않는다. 그러한 경우에, 다수의 유도성 유전자 조절 시스템은 "완전히 직교"라고 말해진다. 유용한 직교 리간드 및 직교 수용체-기반 유전자 발현 시스템은 미국 특허 출원 공개 2002/0110861 Al호에 개시된다.
용어 "외인성 유전자"는 개체에 외래성인 유전자, 즉, 형질전환 과정을 통해 개체에 도입된 유전자, 내인성 돌연변이 유전자의 비돌연변이 버전 또는 내인성 비돌연변이 유전자의 돌연변이 버전을 의미한다. 형질전환 방법은 본 발명에 중요하지 않으며 당업자에게 알려진 개체에 적합한 임의의 방법일 수 있다. 외인성 유전자는 DNA 형태 또는 역전사효소에 의해서와 같이 DNA 중간체를 통해 기능할 수 있는 RNA 형태로 개체 내로 도입되는 자연 또는 합성 유전자일 수 있다. 그러한 유전자는 표적 세포 내로 도입되거나, 개체 내로 직접 도입되거나, 또는 형질전환된 세포를 개체 내로 옮김으로써 간접적으로 도입될 수 있다.
용어 "치료 생성물"은 그러한 생성물이 발현되는 숙주 세포에 유익한 기능을 부여하는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 말한다. 치료 폴리펩티드는 길이가 3개 아미노산만큼 작은 펩티드, 단일- 또는 다중-쇄 단백질, 및 융합 단백질을 한정됨이 없이 포함할 수 있다. 치료 폴리뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA, 리보자임, 및 RNA 외부 가이드 서열(external guide sequences)을 한정됨이 없이 포함할 수 있다. 치료 생성물은 자연 발생 서열, 합성 서열 또는 자연 및 합성 서열의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "리간드-의존성 전사 인자 복합체" 또는 "LDTFC"는 하나 이상의 단백질 서브유닛을 포함하는 전사 인자를 말하며, 이 복합체는 본 명세서에 정의되는 바와 같이 "인자-조절된 프로모터"에 의해 구동되는 유전자 발현을 조절할 수 있다. 모델 LDTFC는 "엑디손 수용체 복합체"이며 일반적으로 핵 수용체 패밀리의 적어도 두 구성원, 엑디손 수용체("EcR") 및 울트라스피라클("USP") 단백질을 가진 헤테로이량체성 단백질 복합체를 말한다 [Yao et al, Nature 366:476 (1993); Yao et al, Cell 71:63 (1992)]. EcR 복합체와 같은 기능적 LDTFC는 또한 이뮤노필린(immunophilin)과 같은 추가의 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자로 알려진, 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가 구성원 (예를 들어, DHR38, betaFTZ -1 또는 기타 곤충 상동체)은 또한 EcR 및/또는 USP를 위한 리간드 의존성 또는 독립적 파트너일 수 있다. EcR 복합체와 같은 LDTFC는 또한 EcR 단백질과 울트라스피라클 단백질, 레틴산-X-수용체("RXR") 단백질 또는 USP와 RXR의 키메라의 척추동물 상동체의 헤테로이량체일 수 있다. 용어 "LDTFC" 및 "EcR 복합체"는 또한 EcR 단백질 또는 USP의 호모이량체 복합체, 및 단일 폴리펩티드 또는 동일한 기능을 수행하는 삼량체, 사량체 및 다른 다량체를 포함한다.
EcR 복합체와 같은 LDTFC는 EcR을 포함하지만 복합체의 다른 단백질을 배제하지 않는 복합체의 단백질 중 하나에 결합된 활성 엑디스테로이드 또는 비-스테로이드성 리간드에 의해 활성화될 수 있다. EcR 복합체와 같은 LDTFC는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 단백질을 포함하며 여기서, 모든 구성원은 아미노-말단 전사촉진 도메인("AD", "TD", 또는 "TA", 본 명세서에서 서로 바꾸어서 사용됨), DNA 결합 도메인("DBD"), 및 리간드 결합 도메인("LBD")을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 서브유닛의 존재를 특징으로 한다. AD는 "헤테로이량체화 파트너" 또는 "HP"와의 융합으로 존재할 수 있다. 본 발명의 AD와 HP를 포함하는 융합 단백질은 본 명세서에서 "공동활성화 단백질" 또는 "CAP"로 불린다. DBD와 LBD는 본 명세서에서 "리간드-유도성 전사 인자"("LTF")로 불리는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 융합 파트너는 링커, 예를 들어, 경첩 영역에 의해 분리될 수 있다. LTF 패밀리의 일부 구성원은 또한 LBD의 카르복시-말단 측에 다른 전사촉진 도메인을 가질 수 있다. DBD는 두 개의 시스테인-징크 핑거의 존재를 특징으로 하며 그 사이에 두 개의 아미노산 모티프인 P-박스와 D-박스가 있으며, 이는 엑디손 반응 요소에 대한 특이성을 부여한다. 이들 도메인은 천연이거나, 변경되거나, 또는 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인들의 키메라일 수 있다.
외인성 유전자, 반응 요소, 및 LDTFC, 예를 들어, EcR 복합체를 구성하는 DNA 서열은 고세균, 원핵 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 또는 다른 장내균, 또는 진핵 세포, 예를 들어, 식물 또는 동물 세포 내로 통합될 수 있다. 하지만, 유전자에 의해 발현된 다수의 단백질은 세균에서 부정확하게 프로세싱되므로, 진핵 세포가 바람직하다. 세포는 단일 세포 또는 다세포 유기체 형태일 수 있다. 외인성 유전자, 반응 요소, 및 수용체 복합체를 위한 뉴클레오티드 서열은 또한, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스와 같은 기능성 바이러스 RNA 형태로, RNA 분자로서 통합될 수 있다. 진핵 세포 중에서, 척추동물 세포가 바람직하며 그 이유는 그들은 EcR을 위한 본 발명의 리간드에 대한 반응을 부여하는 분자가 자연적으로 결핍되기 때문이다. 그 결과, 그들은 본 발명의 리간드에 "실질적으로 불감성"이다. 따라서, 본 발명에 유용한 리간드는 형질전환된 세포, 또는 전체 유기체에 대해 무시할만한 생리학적 또는 기타 효과를 가질 것이다. 따라서, 리간드 자체의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않고, 세포가 성장하고 원하는 생성물을 발현할 수 있다.
용어 "엑디손 수용체 복합체"는 일반적으로 핵 수용체 패밀리의 적어도 두 구성원인 엑디손 수용체("EcR")와 울트라스피라클("USP") 단백질을 가진 헤테로이량체성 단백질 복합체를 말한다 [Yao et al, Nature 366:476 (1993); Yao et al., Cell 71:63 (1992)]. 기능성 EcR 복합체는 또한 이뮤노필린과 같은 추가 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자로 알려진, 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가 구성원(예를 들어, DHR38, betaFTZ -1 또는 기타 곤충 상동체)은 또한 EcR 및/또는 USP를 위한 리간드 의존성 또는 독립적 파트너일 수 있다. EcR 복합체는 또한 EcR 단백질과 울트라스피라클 단백질, 레틴산-X-수용체("RXR") 단백질 또는 USP와 RXR의 키메라의 척추동물 상동체의 헤테로이량체일 수 있다. 용어 EcR 복합체는 또한 EcR 단백질 또는 USP의 호모이량체 복합체를 포함한다.
EcR 복합체는 EcR을 포함하지만 복합체의 다른 단백질을 배제하지 않는, 복합체의 단백질 중 하나에 결합된 활성 엑디스테로이드 또는 비-스테로이드성 리간드에 의해 활성화될 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "리간드"는 EcR-기반 유전자 스위치에 적용될 때, 그안에 코딩된 폴리펩티드의 발현을 자극하기 위해 유전자 스위치를 활성화하는 능력을 가진 작고 용해성인 분자를 설명한다. 리간드의 예는 엑디스테로이드, 예를 들어, 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 뮤리스테론 A, 등, 9-시스-레틴산, 레틴산의 합성 유사체, 미국 특허 제6,013,836호; 미국 특허 제5,117,057호; 미국 특허 제5,530,028호; 및 미국 특허 제5,378,726호 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0209283호 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0020146호에 개시된 것과 같은 N,N'-다이아실하이드라진; 미국 특허 출원 공개 제2004/0171651호에 개시된 옥사다이아졸린; 유럽 출원 제461,809호에 개시된 것과 같은 다이벤조일알킬 시아노하이드라진; 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것과 같은 N-알킬-N,N'-다이아로일하이드라진; 유럽 출원 제234,994호에 개시된 것과 같은 N-아실-N-알킬카르보닐하이드라진; 미국 특허 제4,985,461호에 개시된 것과 같은 N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진; 미국 특허 출원 공개 제 2004/0049037호에 개시된 것과 같은 아미도케톤; 및 3,5-다이-tert-부틸-4-하이드록시-N-아이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸할파기드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트 (ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 파메솔, 담즙산, 1,1-바이포스포네이트 에스테르, 유충 호르몬 III 등을 비롯한 기타 유사 물질을 한정됨이 없이 포함한다. 본 발명에서 유용한 다이아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819 (3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-다이메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드), RG-115932 ((R)-3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드), 및 RG-115830 (3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드)를 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 추가의 다이아실하이드라진에 대해서는, 2008년 5월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제12/155,111호, 및 2008년 5월 29일자로 출원된 국제 특허 출원 제PCT/US2008/006757호를 참고한다.
EcR 복합체는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 단백질을 포함하며 여기서, 모든 구성원은 아미노-말단 전사촉진 도메인("TA"), DNA 결합 도메인("DBD"), 및 경첩 영역에 의해 분리된 리간드 결합 도메인("LBD")의 존재를 특징으로 한다. 이 패밀리의 일부 구성원은 또한 LBD의 카르복시-말단 측에 다른 전사촉진 도메인을 가질 수 있다. DBD는 두 개의 시스테인 징크 핑거의 존재를 특징으로 하며, 그 사이에는 두 개의 아미노산 모티프인 P-박스와 D-박스가 있으며, 이들은 엑디손 반응 요소에 대한 특이성을 부여한다. 이들 도메인은 천연, 변형, 또는 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인의 키메라일 수 있다.
외인성 유전자, 반응 요소, 및 EcR 복합체를 구성하는 DNA 서열은 고세균, 원핵 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 또는 다른 장내균, 또는 진핵 세포, 예를 들어, 식물 또는 동물 세포 내로 통합될 수 있다. 하지만, 유전자에 의해 발현된 다수의 단백질은 세균에서 부정확하게 프로세싱되므로, 진핵 세포가 바람직하다. 세포는 단일 세포 또는 다세포 유기체 형태일 수 있다. 외인성 유전자, 반응 요소, 및 수용체 복합체를 위한 뉴클레오티드 서열은 또한, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스와 같은 기능적 바이러스 RNA 형태로, RNA 분자로서 통합될 수 있다. 진핵 세포 중에서, 척추동물 세포가 바람직하며 그 이유는 그들은 EcR을 위한 본 발명의 리간드에 대한 반응을 부여하는 분자가 자연적으로 결핍되기 때문이다. 그 결과, 그들은 본 발명의 리간드에 "실질적으로 불감성"이다. 따라서, 본 발명에 유용한 리간드는 형질전환된 세포, 또는 전체 유기체에 대해 무시할만한 생리학적 또는 기타 효과를 가질 것이다. 따라서, 리간드 자체의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않고, 세포가 성장하고 원하는 생성물을 발현할 수 있다.
외인성 유전자(예를 들어, IL-12)에 연결된 반응 요소에 결합되는 EcR 복합체와 사용될 경우, EcR 리간드는 외인성 유전자의 발현의 외부적 시간적 조절을 위한 수단을 제공한다. 다양한 구성요소가 서로, 즉, 수용체 복합체에 리간드가 그리고 반응 요소에 수용체 복합체가, 결합하는 순서는 중요하지 않다. 전형적으로, 외인성 유전자의 발현 조절은 특정 조절, 또는 제어, DNA 요소에의 EcR 복합체의 결합에 대한 반응이다. 핵 수용체 패밀리의 다른 구성원처럼, EcR 단백질은 적어도 3개의 도메인, 전사촉진 도메인, DNA 결합 도메인, 및 리간드 결합 도메인을 보유한다. 핵 수용체 패밀리의 서브세트처럼, 이 수용체는 또한 헤테로이량체화 특성에 책임있는 잘 한정되지 않은 영역을 보유한다. USP 또는 RXR 단백질과의 헤테로이량체화 후, EcR 단백질의 리간드 결합 도메인에의 리간드의 결합은 헤테로이량체성 단백질의 DNA 결합 도메인이 활성화된 형태의 반응 요소에 결합하도록 하여, 외인성 유전자의 발현 또는 억제를 야기한다. 이 기작은 EcR 또는 USP에의 리간드 결합의 가능성, 및 활성 호모이량체 복합체(예를 들어, EcR+EcR 또는 USP+USP)의 결과적인 형성을 배제하지 않는다. 일 실시 양태에서, 수용체 도메인 중 하나 이상이 변화되어 키메라 유전자 스위치를 생성할 수 있다. 전형적으로, 세 개의 도메인 중 하나 이상은 다른 도메인의 공급원과 상이한 공급원으로부터 선택되어, 키메라 수용체가 전사촉진 활성, 리간드의 상보적 결합, 및 특정 반응 요소의 인식을 위해 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 최적화되도록 할 수 있다. 또한, 반응 요소 자체는 키메라 EcR 복합체를 수용하기 위하여 효모로부터의 GAL-4 단백질 [Sadowski et al, Nature 335:563 (1988)] 또는 이. 콜라이로부터의 LexA 단백질 [Brent et al, Cell 43:729 (1985)]과 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인을 위한 반응 요소로 변경되거나 치환될 수 있다. 키메라 시스템의 다른 장점은 그들이 원하는 최종 결과에 따라 외인성 유전자를 구동하기 위해 사용되는 프로모터의 선택을 허용한다는 것이다. 그러한 이중 조절은 유전자 치료법 분야에서 특히 중요할 수 있으며, 특히 세포독성 단백질이 생산될 때 특히 중요할 수 있으며, 그 이유는 발현의 타이밍과 발현이 일어나는 세포 둘 모두가 조절될 수 있기 때문이다. 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 외인성 유전자가 개체의 세포 내로 도입될 경우, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 리간드의 존재에 의해 조절된다. 프로모터는 항시적으로 또는 유도적으로 조절될 수 있거나 또는 조직-특이적이거나(즉, 특정 유형의 세포에서만 발현됨) 유기체의 소정 발달 단계에 특이적일 수 있다.
소정의 실시 양태에서, 본 방법에서 개시된 치료적 스위치 프로모터는 항시적이다. 소정의 실시 양태에서, 치료적 스위치 프로모터는 질환, 장애 또는 병태와 관련된 조건 하에서 활성화되며, 예를 들어, 프로모터는 질환에 대한 반응으로, 특정 생리학적, 발생학적, 분화, 또는 병리학적 상태에 대한 반응으로, 및/또는 하나 이상의 특정 생물학적 분자에 대한 반응으로 활성화되고/되거나 프로모터는 특정 조직 또는 세포 유형에서 활성화된다. 소정의 실시 양태에서, 질환, 장애 또는 병태는 치료 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 반응성이다. 예를 들어, 소정의 비제한적 실시 양태에서 치료 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 치료, 예방, 완화, 증상을 감소하거나, 진행을 방지하거나, 질환, 장애 또는 병태를 치유하는데 유용하지만, 이들 중 어느 하나 또는 전부를 이룰 필요는 없다. 소정의 실시 양태에서, 질환, 장애 또는 병태와 관련된 조건 하에서 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 발현을 허용하기 위하여 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 일 실시 양태에서, 치료 방법은 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드가 발현되고 상기 질환, 장애 또는 병태를 치료, 완화 또는 예방하기에 충분한 수준으로 개체에 보급되도록 수행된다. 본 명세서에 사용될 때, "보급되는"은 폴리펩티드가 개체에서 효과 또는 활성을 갖기에 충분하게 변경된 세포로부터 발현되고 방출됨을 의미한다. 보급은 전신성, 국소적 또는 그 사이의 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드는 혈류 또는 림프계를 통해 전신적으로 보급될 수 있다. 대안적으로, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드는 치료될 조직 또는 기관에서 국소적으로 보급될 수 있다.
전사 인자 및 리포터 단백질과 같은, 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 많은 게놈 및 cDNA 핵산 서열이 당업계에 잘 알려져 있다. 당업자는 사실상 모든 공지 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 대해 접근가능하며, 서열을 공개한 기관인 공중 기탁기관으로부터 직접 핵산 분자를 입수하거나, 또는 일상적 방법을 이용하여 분자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 하기의 서열 수탁 번호의 설명을 참고한다.
유전자 스위치는 특정 리간드의 첨가 또는 제거에 의해 유전자 발현을 조절하는 임의의 유전자 스위치 시스템일 수 있다. 일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 유전자 발현의 수준이 존재하는 리간드의 수준에 의존하는 것이다. 본 발명의 유전자 스위치에서 사용될 수 있는 리간드-의존성 전사 인자의 예는 그들의 각 리간드에 의해 활성화된 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원(예를 들어, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 레티노이드, 엑디손, 및 그 유사체와 모방체) 및 테트라사이클린에 의해 활성화된 rTTA를 한정됨이 없이 포함한다. 본 발명의 일 태양에서, 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치이다. 그러한 시스템의 예는 미국 특허 제6.258.603호, 미국 특허 제7,045,315호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0014711호, 미국 특허 출원 공개 제07/0161086호, 및 국제 특허 공개 WO 01/70816호에 개시된 시스템을 한정됨이 없이 포함한다. 키메라 엑디손 수용체 시스템의 예는 미국 특허 제7,091,038호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0110861호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0033600호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0096942호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0266457호, 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0100416호, 및 국제 특허 공개 WO01/70816호, 국제 특허 공개 WO02/066612호, 국제 특허 공개 WO02/066613호, 국제 특허 공개 WO02/066614호, 국제 특허 공개 WO02/066615호, 국제 특허 공개 WO02/29075호, 및 국제 특허 공개 WO 2005/108617호에 개시된다. 비-스테로이드성 엑디손 작동제-조절 시스템의 예는 레오스위치 (RheoSwitch)(등록상표) 포유류 유도성 발현 시스템(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))이다.
일 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 조절하에서 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 단일 전사 인자 서열을 포함한다. 전사 인자 서열은 자연 발생 또는 인공적 전사 인자인 리간드-의존성 전사 인자를 코딩할 수 있다. 인공적 전사 인자는 전사 인자의 자연 서열이 예를 들어, 서열의 돌연변이에 의해 또는 상이한 전사 인자들로부터의 도메인의 조합에 의해 변경된 것이다. 일 실시 양태에서, 전사 인자는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인(LBD)을 포함한다. 일 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 EcR, 편재 수용체, 고아 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 또는 파네솔 수용체로부터 온다. 다른 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 엑디손 수용체로부터 온다.
EcR 및 다른 그룹 H 핵 수용체는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원이며 여기서, 모든 구성원은 일반적으로 아미노-말단 전사촉진 도메인(TD), DNA 결합 도메인(DBD), 및 경첩 영역에 의해 DBD로부터 분리된 LBD의 존재를 특징으로 한다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "DNA 결합 도메인"은 DNA 결합 도메인이 특정 반응 요소와 연합하기 위해 기능하는 한, DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩티드 서열에서 최대 DNA 결합 단백질의 전체 길이까지를 포함한다. 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원은 또한 4개 또는 5개 도메인, A/B, C, D, E, 그리고 일부 구성원에서는 F의 존재를 특징으로 한다 [미국 특허 제4,981,784호 및 Evans, Science 240:889 (1988)]. "A/B" 도메인은 전사촉진 도메인에 상응하며, "C"는 DNA 결합 도메인에 상응하며, "D"는 경첩 영역에 상응하며, "E"는 리간드 결합 도메인에 상응한다. 패밀리의 일부 구성원은 또한 "F"에 상응하는 LBD의 카르복시-말단 측 상에 다른 전사촉진 도메인을 가질 수 있다.
DBD는 두 개의 시스테인 징크 핑거의 존재를 특징으로 하며, 그 사이에는 두 개의 아미노산 모티프인 P-박스와 D-박스가 있으며, 이들은 반응 요소에 대한 특이성을 부여한다. 이들 도메인은 천연, 변경, 또는 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인의 키메라일 수 있다. 핵 수용체 패밀리의 서브세트처럼, EcR은 또한 헤테로이량체화 특성을 책임지는 잘 정의되지 않은 영역을 보유한다. 핵 수용체의 도메인은 특성이 모듈성이므로, LBD, DBD, 및 TD는 상호교환될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 전사 인자는 TD, 그 발현이 조절될 외인성 유전자와 연합된 반응 요소를 인식하는 DBD, 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함한다. 소정의 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 치환 돌연변이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 조절하의 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 조절하의 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자, 즉, "이중 스위치"- 또는 "2-하이브리드"-기반 유전자 스위치로 기능하는 단백질 복합체를 형성한다. 제1 및 제2 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
소정의 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 조절하에 제1 전사 인자 서열과 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제 2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자, 즉 "단일 유전자 스위치"로서 기능하는 단백질 복합체를 형성한다. 제1 전사 인자 서열과 제2 전사 인자 서열은 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)에 의해 연결될 수 있다. IRES는 EMCV IRES일 수 있다.
일 실시 양태에서, 제1 전사 인자 서열은 TD, 그 발현이 조절될 외인성 유전자와 연합된 반응 요소를 인식하는 DBD, 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 제2 전사 인자 서열은 척추동물 RXR LBD, 무척추동물 RXR LBD, 울트라스피라클 단백질 LBD, 및 두 개의 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 LBD로부터 선택된 핵 수용체 LBD를 포함하는 전사 인자를 코딩하며, 여기서, 제1 폴리펩티드 단편은 척추동물 RXR LBD, 무척추동물 RXR LBD, 또는 울트라스피라클 단백질 LBD로부터 오며, 제2 폴리펩티드 단편은 상이한 척추동물 RXR LBD, 무척추동물 RXR LBD, 또는 울트라스피라클 단백질 LBD로부터 온다.
다른 실시 양태에서, 유전자 스위치는 핵 수용체 LBD 및 그 발현이 조절될 외인성 유전자와 연합된 반응 요소를 인식하는 DBD를 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 전사 인자 서열, 및 TD와 핵 수용체 LBD를 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 핵 수용체 LBD 중 하나는 그룹 H 핵 수용체 LBD이다. 바람직한 실시 양태에서, 제1 폴리펩티드는 실질적으로 TD가 없으며 제2 폴리펩티드는 DBD가 실질적으로 없다. 본 발명의 목적을 위하여, "실질적으로 없는"은 문제의 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하기 위해 문제의 도메인의 충분한 서열을 함유하지 않음을 의미한다.
본 발명의 다른 태양에서, 제1 전사 인자 서열은 헤테로이량체 파트너 및 TD를 포함하는 단백질을 코딩하며 제2 전사 인자 서열은 DBD와 LBD를 포함하는 단백질을 코딩한다.
단지 하나의 핵 수용체 LBD가 그룹 H LBD일 경우, 다른 핵 수용체 LBD는 그룹 H LBD와 이량체를 형성하는 임의의 다른 핵 수용체로부터 올 수 있다. 예를 들어, 그룹 H 핵 수용체 LBD가 EcR LBD일 경우, 다른 핵 수용체 LBD "파트너"는 EcR, 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질(USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 및 USP로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 LBD 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체로부터 올 수 있다(국제 특허 공개 WO01/70816 A2호, 국제 특허 출원 PCT/US02/05235호 및 미국 특허 출원 공개 2004/0096942 Al호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 추가로 절단 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이, 또는 다른 변경을 포함할 수 있다.
일 실시 양태에서, 척추동물 RXR LBD는 인간 호모 사피엔스( Homo sapiens ), 생쥐 무스 무스큘러스( Mus musculus ), 쥐 래터스 노르베지쿠스( Rattus norvegicus), 닭 갈루스 갈루스 ( Gallus gallus ), 돼지 수스 스크로파 도메스티카( Sus scrofa domestica ), 개구리 제노푸스 래비스 ( Xenopus laevis ), 제브라피쉬 다니오 레리오( Danio rerio ), 멍게 폴리안드로카르파 미사키엔시스( Polyandrocarpa misakiensis ), 또는 해파리 트리페달리아 시소포라( Tripedalia cysophora) RXR로부터 온다.
일 실시 양태에서, 무척추동물 RXR 리간드 결합 도메인은 메뚜기 로쿠스타 미그라토리아( Locusta migratoria ) 울트라스피라클 폴리펩티드 ("LmUSP"), 참진드기 앰블리옴마 아메리카눔 ( Amblyomma americanum ) RXR 상동체 1 ("AmaRXRl"), 참진드기 앰블리옴마 아메리카눔 RXR 상동체 2 ("AmaRXR2"), 농게 세루카 푸지레이터( Celuca pugilator ) RXR 상동체 ("CpRXR"), 딱정벌레 테네브리오 모리토르( Tenebrio molitor ) RXR 상동체("TmRXR"), 꿀벌 아피스 멜리페라( Apis mellifera) RXR 상동체("AmRXR"), 진딧물 미주스 페르시케 ( Myzus persicae ) RXR 상동체 ("MpRXR"), 또는 비-쌍시류/비-인시류(non-Dipteran/non-Lepidopteran) RXR 상동체로부터 온다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR LBD는 척추동물 종(vertebrate species) RXR 폴리펩티드 단편, 무척추동물 종(invertebrate species) RXR 폴리펩티드 단편, 및 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편으로부터 선택된 적어도 2개의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 2개의 상이한 종 RXR 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있거나, 종이 동일할 경우, 둘 이상의 폴리펩티드 단편은 그 종 RXR 폴리펩티드 단편의 둘 이상의 상이한 아이소형태로부터 올 수 있다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편과 하나의 무척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편과 하나의 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편을 포함한다.
외인성 유전자에 연결된 반응 요소에 결합되는 핵 수용체(들)의 LBD와 조합될 경우, 리간드는 외인성 유전자의 발현의 외부적 시간적 조절을 제공한다. 본 발명의 다양한 구성요소가 서로, 즉, 예를 들어, LBD에 리간드가, 반응 요소에 DBD가, 프로모터에 TD가 결합하는 결합 기작 또는 순서는 중요하지 않다.
구체적 예에서, 그룹 H 핵 수용체의 LBD와 그 핵 수용체 LBD 파트너에의 리간드의 결합은 외인성 유전자의 발현을 가능하게 한다. 이 기작은 그룹 H 핵 수용체(GHNR) 또는 그 파트너에의 리간드 결합, 및 활성 호모이량체 복합체(예를 들어, GHNR + GHNR 또는 파트너 + 파트너)의 결과적인 형성에 대한 가능성을 배제하지 않는다. 바람직하게는, 수용체 도메인 중 하나 이상이 변화되어 하이브리드 유전자 스위치를 생성한다. 전형적으로, 세 가지 도메인 DBD, LBD 및 TD 중 하나 이상이 다른 도메인의 공급원과 상이한 공급원으로부터 선택되어, 하이브리드 유전자 및 생성되는 하이브리드 단백질이 전사촉진 활성, 리간드의 상보적 결합, 및 특정 반응 요소의 인식에 대해 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 최적화될 수 있다. 또한, 반응 요소 자체는 하이브리드 수용체를 수용하기 위하여 변경되거나, 효모로부터의 GAL-4 단백질 [Sadowski et al, Nature 335:563 (1988)] 또는 이. 콜라이로부터의 LexA 단백질 [Brent et al, Cell 43:729 (1985)], 또는 그러한 특이적 상호작용을 위해 디자인되고, 변경되고 선택된 단백질과의 표적화된 상호작용에 대해 특이적인 합성 반응 요소[예를 들어, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)]와 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인을 위한 반응 요소로 치환될 수 있다.
기능적 EcR 복합체는 또한 이뮤노필린과 같은 추가 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자로 알려진, 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가 구성원(예를 들어, DHR38, 또는 betaFTZ -1)은 또한 EcR, USP 및/또는 RXR을 위한 리간드 의존성 또는 독립적 파트너일 수 있다. 부가적으로, 일반적으로 보조활성화인자(어댑터 또는 매개자로도 불림)로 알려진 단백질과 같은 다른 보조인자가 요구될 수 있다. 이들 단백질은 DNA에 서열-특이적으로 결합하지 않으며 기본 전사에 관여하지 않는다. 그들은 활성화인자의 DNA-결합의 자극, 크로마틴 구조에 영향을 줌으로써, 또는 활성화인자-개시 복합체 상호작용의 매개에 의해서를 비롯한 다양한 기작을 통해 전사 활성화에 그들의 효과를 나타낼 수 있다. 그러한 보조활성화인자의 예는 RIP 140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP 및 불규칙 보조활성화인자 C 반응 요소 B 결합 단백질, CBP/p300 [검토를 위해서, Glass et al , Curr . Opin . Cell Biol 9:222 (1997)]를 포함한다. 또한, 보조억제인자로 일반적으로 알려진 단백질 보조인자(억제인자, 사일런서(silencer), 또는 침묵 매개자로도 알려짐)는 리간드의 부재하에서 전사 활성화를 효과적으로 억제하기 위해 요구될 수 있다. 이들 보조억제인자는 반응 요소에서 활성을 침묵시키기 위해 리간드화되지 않은 EcR과 상호작용할 수 있다. 현재의 증거는 리간드의 결합이 수용체의 형태를 변화시켜, 보조억제인자의 방출 및 상기 개시된 보조활성화인자의 보충을 야기하여, 그들의 침묵화 활성을 파기함을 제안한다. 보조억제인자의 예는 N-CoR 및 SMRT를 포함한다[검토를 위해서, Horwitz et al . , Mol Endocrinol . 10:1167 (1996)]. 이들 보조인자는 세포 또는 유기체 내에서 내인성일 수 있으며, 또는 조절 또는 비조절 방식으로 발현될 트랜스유전자로서 외인성으로 첨가될 수 있다.
외인성 유전자는 유전자 스위치에 의해 코딩되는 리간드-의존성 전사 인자의 DBD에 의해 인식되는 적어도 하나의 반응 요소를 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 실시 양태에서, 프로모터는 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 또는 그 이상 카피의 반응 요소를 포함한다. 원하는 반응 요소를 포함하는 프로모터는 자연 발생 프로모터 또는 당업계에 알려진 기술을 이용하여 생성된 인공적 프로모터, 예를 들어, 최소 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 반응 요소일 수 있다.
세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위하여, 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드 벡터 또는 단일- 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 그러한 벡터는 세포 내로 DNA 및 RNA를 도입하기 위해 잘 알려진 기술에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 가능하거나 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우에는, 바이러스 증식은 일반적으로 보완성 숙주 세포에서만 일어날 것이다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "숙주 세포" 또는 "숙주"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 하나 이상을 보유한 본 발명의 세포를 의미하기 위해 사용된다.
따라서, 최소한, 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함해야 한다. 벡터의 다른 구성요소는 선발가능한 마커, 크로마틴 변경 도메인, 벡터에 또한 존재할 수 있는 다른 폴리펩티드(예를 들어, 치사 폴리펩티드)의 발현을 구동시키는 추가의 프로모터, 게놈 통합 부위, 재조합 부위, 및 분자 삽입 피봇을 포함할 수 있지만 이로 한정되는 것은 아니다. 벡터는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 폴리뉴클레오티드 바깥에 이들 추가 요소를 임의의 수로 포함하여, 벡터가 원하는 치료 방법의 특정 목표에 맞춰질 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 세포 내로 도입되는 벡터는 추가로 "선발가능한 마커 유전자"를 포함하며, 이것은 발현될 경우, 본 발명의 유전자 스위치 구조체가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되었음을 나타낸다. 이러한 방식에서, 선택자 유전자는 게놈 통합에 대한 긍정적 마커일 수 있다. 본 발명의 방법에 중요하지 않지만, 선발가능한 마커 유전자의 존재는 벡터 구조체가 세포의 게놈 내로 통합된 살아있는 세포의 집단을 실무자가 선발하도록 한다. 따라서, 본 발명의 소정의 실시 양태는 벡터가 성공적으로 통합된 세포를 선발하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "선발하다" 또는 그 변형은, 세포와 함께 사용될 경우, 특정 유전적 구성 또는 표현형을 가진 세포를 선발하기 위한 표준 공지 방법을 의미하고자 한다. 전형적인 방법은 G418, 네오마이신 및 암피실린과 같은 항생제의 존재 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 선발가능한 마커 유전자의 다른 예는 다이하이드로폴레이트 리덕타아제, 하이그로마이신 또는 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 선발 방법은 티미딘 키나아제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제를 선발제로 사용하도록 하는 선발가능한 마커 유전자를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 항생제 내성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하는 세포는 이어서 배양에서 항생제를 견딜 수 있을 것이다. 유사하게, 항생제 허용성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하지 않는 세포는 배양에서 항생제를 견디지 못할 것이다.
본 명세서에 사용될 때, "크로마틴 변경 도메인"(CMD)은 DNA 인슐레이터(insulator)와 같은, 그러나 이로 한정되지 않는, 크로마틴 구조를 유지 및/또는 변경하는 것과 관련된 다양한 단백질과 상호작용하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. Ciavatta et al , Proc . Nat'l Acad . ScL U.S.A., 103:9958 (2006) 참고. CMD의 예는 닭 β-글로불린 인슐레이터 및 닭 과민성 부위 4(cHS4)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 유전자 프로그램(즉, 프로모터, 코딩 서열, 및 3' 조절 영역) 사이에서 상이한 CMD 서열의 사용은 예를 들어, 존재하는 다유전자적 및 단일유전자적 셔틀 벡터 사이에서 유전자 프로그램을 "교환"하기 위해 다양한 미생물 또는 시험관 내 리컴비니어링(recombineering) 기술과 조합하여 "미니 상동성 암(arm)"으로서 차등적 CMD DNA 서열의 사용을 촉진할 수 있다. 크로마틴 변경 도메인의 다른 예는 당업계에 알려져 있거나 쉽게 확인될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 구체적 벡터는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 발현 벡터이다. 일반적으로, 그러한 벡터는 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, 숙주에서의 발현을 위해 효과적인 시스-작용성 조절 영역을 포함한다. 적절한 트랜스-작용 인자는 숙주에 의해 공급되거나, 보완적 벡터에 의해 공급되거나 숙주 내로의 도입시에 벡터 자체에 의해 공급된다.
단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 매우 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 벡터는 염색체, 에피좀 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들어, 세균 플라스미드로부터, 박테리오파아지로부터, 효모 에피좀으로부터, 효모 염색체 요소로부터, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, 파포바 바이러스, 예를 들어, SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터, 및 그 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 플라스미드와 박테리오파아지 유전 요소로부터 유래된 것, 예를 들어, 코스미드 및 파지미드를 포함한다. 모두 본 발명의 이 태양에 따라 발현을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 유지, 증식 또는 발현하기에 적합한 임의의 벡터가 이와 관련하여 발현을 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터에서 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, mRNA 전사를 지시하는 프로모터를 비롯한 적절한 발현 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결된다. 추가적 프로모터의 대표는 항시적 프로모터 및 조직 특이적 또는 유도성 프로모터를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 항시적 진핵 프로모터의 예는 생쥐 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터 (Hamer et αl., J. MoI . Appl . Gen . 1:273 (1982)); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터 (McKnight, Cell 31:355 (1982)); SV40 초기 프로모터 (Benoist et αl., Nature 290:304 (1981)]); 및 백시니아 바이러스 프로모터를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동하기 위해 사용될 수 있는 프로모터의 추가적 예는 조직-특이적 프로모터 및 특정 단백질을 위한 다른 내인성 프로모터, 예를 들어, 알부민 프로모터(간세포), 프로인슐린 프로모터(췌장 베타 세포) 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 발현 구조체는 전사, 개시 및 종결을 위한 부위 및 전사된 영역 내에, 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 함유할 것이다. 구조체에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 시작에서 번역 개시 AUG 및 번역될 폴리펩티드의 말단에 적절하게 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 수 있다.
또한, 구조체는 발현이 되게 할 뿐만 아니라 조절하는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 그러한 영역은 다른 것 중에서도, 억제자 결합 부위 및 인핸서와 같이, 전사를 조절함으로써 작동할 것이다.
진핵 벡터의 예는 스트라타진 (Stratagene)으로부터 입수가능한 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG ; 아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech)로부터 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL ; 및 클론테크 (Clontech)로부터 입수가능한 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, 및 pCMV-EGFP를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 많은 다른 벡터가 알려져 있으며 구매가능하다.
유전자 프로그램의 요소의 신속한 삽입 및 제거를 위한 분자 삽입 피봇을 포함하는 특히 유용한 벡터가 미국 특허 출원 공개 제2004/0185556호, 미국 특허 출원 제11/233,246호 및 국제 특허 공개 WO 2005/040336호 및 국제 특허 공개 WO 2005/116231호에 개시된다. 그러한 벡터의 예는 국제 특허 공개 WO 2007/038276호에 개시된 바와 같이, 울트라벡터(UltraVector)TM 생산 시스템 (미국 버지니아주 블랙스버그 소재의 인트렉손 코포레이션(Intrexon Corp.))이다. 본 명세서에 사용될 때, "유전자 프로그램"은 프로모터(P), 발현 서열(E) 및 3' 조절 서열(3)을 포함하는 유전 요소의 조합이어서, "PE3"는 유전자 프로그램이다. 유전자 프로그램 내의 요소들은 유전자 프로그램의 요소들의 각각에 인접하는 분자 피봇 사이에서 쉽게 교환될 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, 분자 피봇은 선형 방식으로 정렬된 적어도 2개의 비-가변성 희귀 또는 비보편적 제한효소 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 일 실시 양태에서, 분자 피봇은 선형 방식으로 정렬된 적어도 3개의 비-가변성 희귀 또는 비보편적 제한효소 부위를 포함한다. 전형적으로 임의의 하나의 분자 피봇은 동일한 유전자 프로그램 내의 임의의 다른 분자 피봇의 희귀 또는 비보편적 제한효소 부위를 포함하지 않을 것이다. 주어진 제한 효소가 작용하는 6개 초과의 뉴클레오티드의 동족 서열은 "희귀" 제한효소 부위로 불린다. 하지만, 통계적으로 예측되는 것보다 더 드물게 발생하는 6 bp의 제한효소 부위가 있으며, 이들 부위 및 그들을 절단하는 엔도뉴클레아제는 "비보편적" 제한효소 부위로 불린다. 희귀 또는 비보편적 제한 효소의 예는 AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, Nru I, Acl I, Cla I, Csp45 I, Age I, Bst1107 I, BstB I, Hpa I, Aat II, EcoR V, Nhe I, Spe I, Avi II, Avr II, Mfe I, Afe I, Fsp I, Kpn I, Sca I, BspE I, Nde I, Bfr I, Xho I, Pml I, ApaL I, Kas I, Xma I, BsrB I, Nsi I, Sac II, Sac I, Blp I, PspoM I, Pci I, Stu I, Sph I, BamH I, Bsu36 I, Xba I, BbvC I, Bgl II, Nco I, Hind III, EcoR I, BsrG I 및 Sse8781 I을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
벡터는 또한 호밍(homing) 엔도뉴클레아제 (HE) 효소로 불리는 두번째 부류의 제한 효소를 위한 제한효소 부위를 포함할 수 있다. HE 효소는 큰, 비대칭 제한효소 부위 (12-40 염기쌍)를 가지며, 그들의 제한효소 부위는 자연에서 드물다. 예를 들어, I-SceI으로 알려진 HE는 18 bp 제한효소 부위(5'TAGGGATAACAGGGTAAT3' (서열 번호 28))를 가지며, 임의 서열의 7 x 1010 염기쌍마다 단 한번 발생하는 것으로 예상된다. 이러한 발생률은 포유류 게놈의 크기의 20배인 게놈에서 단지 한 부위에 해당한다. HE 부위의 희귀 특성은, HE 부위가 클로닝 벡터 플라스미드 내의 적절한 위치에 포함된다면 유전공학자가 유전자 프로그램의 일체성을 파괴하지 않고 유전자 프로그램을 절단할 수 있는 가능성을 크게 증가시킨다.
숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 벡터와 프로모터의 선택은 잘 알려진 절차이며, 벡터 제작 및 숙주 내로의 도입, 및 숙주에서의 그 발현을 위해 요구되는 기술은 당업계에서 일상적인 기술이다.
세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 일시적 형질감염, 안정한 형질감염이거나, 또는 벡터의 유전자좌-특이적 삽입일 수 있다. 숙주 세포 내로의 벡터의 일시적 및 안정한 형질감염은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염, 또는 기타 방법에 의해 이루어질 수 있다. 그러한 방법은 Davis et al ., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al, 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al , 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.과 같은 많은 표준 실험 매뉴얼에서 개시된다. 이들 안정한 형질감염 방법은 세포의 게놈 내로 벡터가 무작위 삽입되도록 한다. 추가로, 벡터의 카피수와 배향이 또한 일반적으로 말해서 무작위이다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 벡터는 게놈 내의 생물-중성(bio-neutral) 부위 내로 삽입된다. 생물-중성 부위는 폴리뉴클레오티드의 삽입이, 있다 하더라도, 세포의 정상 기능을 거의 방해하지 않는 게놈 내의 부위이다. 생물-중성 부위는 입수가능한 생물정보학을 이용하여 분석될 수 있다. 많은 생물-중성 부위가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, ROSA-등가 좌이다. 다른 생물-중성 부위는 당업계에 공지된 일상적 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 게놈 삽입 부위(들)의 특성화는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 세포 내로 벡터를 도입할 때 폴리뉴클레오티드의 위치, 카피수 및/또는 배향을 조절하기 위하여, 유전자좌-특이적 삽입 방법이 이용될 수 있다. 유전자좌-특이적 삽입 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 상동성 재조합 및 리콤비나아제-매개 게놈 삽입을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 물론, 만일 유전자좌-특이적 삽입 방법이 본 발명의 방법에 사용되려면, 벡터는 상동성 재조합과 같은, 그러나 이로 한정되지 않는, 이러한 유전자좌-특이적 삽입을 돕는 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 1,2,3,4, 또는 그 이상의 게놈 통합 부위(GIS)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, "게놈 통합 부위"는 뉴클레오티드 서열이 게놈 내에 벡터의 삽입을 허용하는 세포내의 게놈의 부분과 동일하거나 거의 동일한 벡터 서열의 부분으로 정의된다. 특히, 벡터는 적어도 폴리뉴클레오티드에 인접하는 2개의 게놈 삽입 부위를 포함할 수 있다. 물론, GIS는 추가 요소, 또는 심지어 벡터 상에 존재하는 모든 요소에 인접할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 유전자좌-특이적 삽입은 리콤비나아제-부위 특이적 유전자 삽입에 의해 실시될 수 있다. 요약하면, PhiC31 인테그라아제(integrase)와 같은, 그러나 이로 한정되지 않는 세균 리콤비나아제 효소는 인간 게놈 내의 "허위(pseudo)" 재조합 부위에 작용할 수 있다. 이들 허위 재조합 부위는 리콤비나아제를 이용한 유전자좌-특이적 삽입을 위한 표적일 수 있다. 리콤비나아제-부위 특이적 유전자 삽입은 Thyagarajan et al , MoI . Cell Biol . 21:3926 (2001)에 개시된다. 리콤비나아제-부위 특이적 유전자 삽입을 위해 사용될 수 있는 리콤비나아제와 그들의 각 부위의 다른 예는 R4 및 TP901-1과 같은 세린 리콤비나아제 및 WO 2006/083253호에 개시된 리콤비나아제를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
추가 실시 양태에서, 벡터는 내화합물성(chemo-resistance) 유전자, 예를 들어, 다중약물 허용성 유전자 mdr1, 다이하이드로폴레이트 리덕타아제, 또는 O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 내화합물성 유전자는 항시적 (예를 들어, CMV) 또는 유도성 (예를 들어, 레오스위치(등록상표)) 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 이 실시 양태에서, 만일 개체 내에서 변경된 세포를 유지하면서 개체에서 질환을 치료하는 것이 바람직하다면, 적합한 내화합물성 유전자의 발현으로 인하여 에이전트로부터 변경된 세포가 보호되고 질환 또는 장애의 치료, 완화 또는 예방을 위해 계속 사용될 수 있는 한편, 임상의는 질환 세포를 파괴하기 위해 화학요법제를 적용할 수 있다. 유도성 프로모터 하에 내화합물성 유전자를 배치함으로써, 내화합물성 유전자의 불필요한 발현이 피해질 수 있으나, 계속된 치료가 필요한 경우 여전히 이용가능할 것이다. 만일 변경된 세포 자체가 질병을 갖게 되면, 그들은 후술하는 바처럼 치사 폴리펩티드의 발현을 유도함으로써 파괴될 수 있을 것이다.
본 발명의 방법은 개체의 세포 내로 유전자 스위치 및 외인성 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 실시된다. 상기한 것과 같은, 당업계에 알려진 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 엑스 비보( ex vivo )에서 세포 내로 도입될 경우, 세포는 생검, 스크래핑(scraping), 및 외과적 조직 제거를 포함하지만 이로 한정되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 기술에 의해 개체로부터 얻어질 수 있다. 단리된 세포는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기에 충분한 양의 시간 동안, 예를 들어, 2,4,6,8,10,12,18,24,36,48 시간 또는 그 이상 동안 배양될 수 있다. 짧은 기간 동안 일차 세포를 배양하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 세포는 부착되거나 현탁액으로서 플레이트에서 (예를 들어, 마이크로웰 플레이트에서) 배양될 수 있다.
엑스 비보 치료 방법의 경우, 세포는 개체로부터 단리되어 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기에 적합한 조건 하에서 배양된다. 일단 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되면, 세포는 리간드-의존성 전사 인자가 발현되기에 충분한 기간, 예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, 또는 24시간 또는 그 이상동안 인큐베이션된다. 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입 후 일부 시점에서(상당 수준의 리간드-의존성 전사 인자가 발현되기 전 또는 후), 세포는 다시 개체 내로 도입된다. 재도입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 정맥내 투입 또는 조직 또는 공동 내로의 직접 주사에 의해 실시될 수 있다. 일 실시 양태에서, 세포 내에 폴리뉴클레오티드의 존재는 세포를 개체 내로 다시 도입하기 전에 결정된다. 다른 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드를 함유한 세포가 선택되고(예를 들어, 폴리뉴클레오티드에서 선발가능한 마커의 존재에 기초함) 폴리뉴클레오티드를 함유한 세포만이 개체 내로 재도입된다. 세포가 개체에 재도입된 후, 리간드는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위해 개체에 투여된다. 대안적 실시 양태에서, 리간드는 세포가 개체에 재도입되기 전에 세포에 첨가되어, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드가 세포의 재도입 전에 발현되도록 할 수 있다. 리간드는 전신성으로(예를 들어, 경구로, 정맥내로) 또는 국소적으로(예를 들어, 복강내로, 척추강내로, 뇌실내로, 세포가 재도입되는 조직 또는 기관 내로 직접 주사), 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 리간드 투여의 최적 타이밍은 일상적 기술만을 이용하여 각 세포 유형과 질병 또는 질환에 대해 결정될 수 있다.
본 발명의 생체 내 치료 방법은 개체의 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 직접 생 체 내 도입하는 것에 관련된다. 폴리뉴클레오티드는 전신성으로 또는 국소적으로(예를 들어, 질병 또는 질환의 부위에서) 개체 내로 도입될 수 있다. 일단 폴리뉴클레오티드가 개체에 도입되면, 리간드는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위해 투여될 수 있다. 리간드는 전신성으로(예를 들어, 경구로, 정맥내로) 또는 국소적으로(예를 들어, 복강내로, 척추강내로, 뇌실내로, 질병 또는 질환이 발생중인 조직 또는 기관 내로 직접 주사), 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 리간드 투여의 최적 타이밍은 일상적 기술만을 이용하여 각 세포 유형과 질병 또는 질환에 대해 결정될 수 있다.
생체 내 사용을 위해, 본 명세서에 개시된 리간드는 예를 들어, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 연고, 엘릭시르, 및 주사용 조성물과 같은 약학적으로 허용가능한 담체에 취해질 수 있다. 약학 조성물은 0.01 중량% 내지 99 중량%의 리간드를 함유할 수 있다. 조성물은 단일 또는 다중 용량 형태일 수 있다. 임의의 특정 약학 조성물 내의 리간드의 양은 유효 용량, 즉, 원하는 유전자 발현 또는 억제를 유발하는데 필요한 용량에 의존할 것이다.
약학적 에이전트를 투여하기 위한 적합한 경로는 경구, 직장, 국 소(피부, 볼 및 설하 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 종양내, 피내, 척추강내 및 경막외 포함) 및 경비위관에 의한 것을 포함한다. 바람직한 투여 경로가 치료되는 상태에 의존할 것이며 수용체의 상태와 같은 인자에 따라 변할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "rAD.RheoIL12"는 레오스위치(등록상표) 치료 시스템(RTS)의 유전자 스위치의 조절하에 IL-12 유전자를 보유한 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 벡터를 말하며, 활성화 리간드의 존재 하에서 IL-12 단백질을 생산할 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "rAd.cIL12"는 항시적 프로모터의 조절하에 IL-12 유전자를 함유한 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 조절 벡터를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "IL-12p70"은 p40과 p35로 일반적으로 불리는 2개의 서브유닛을 자연적으로 가진 IL-12 단백질을 말한다. 용어 IL-12p70은 IL-12의 두 서브유닛(p40과 p35)을 포함하는 융합 단백질을 포괄하며, 여기서, 융합 단백질은 서브유닛 사이의 링커 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "면역조절자의 기능을 가진 단백질"은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R 또는 그 서브유닛 DN, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCLlO (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, BCG, TGF-알파, PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L 및 SlOO으로부터 선택된 면역조절자의 임의의 생물활성의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%)를 갖는 단백질을 말한다. 이와 유사하게, 용어 "IL-12의 기능을 가진 단백질"은 인간 IL-12의 임의의 생물활성의 적어도 20% (예를 들어, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%)를 갖는 단백질을 말한다. 그러한 면역조절자의 생물활성은 잘 알려져 있다. 하기 표를 참고한다.
[표 4a] 면역조절자 및 그들의 기능
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[표 4b]
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[표 4c]
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[표 4d]
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[표 4e]
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[표 4f]
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[표 4g]
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IL-12의 생물활성은 잘 알려져 있으며, 천연 T 세포의 Th1 세포로의 분화, T 세포의 성장 및 기능 자극, T 및 천연 살해(NK) 세포로부터 인터페론-감마(IFN-감마) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 생산, INF-감마의 IL-4 매개 억제의 감소, NK 세포와 CD8+ 세포독성 T 림프구의 세포독성 활성의 향상, IL-12R-β1 및 IL-12R-β2의 발현 자극, MHC I 및 II 분자의 상향조절을 통한 종양 항원의 제시의 촉진, 및 항-혈관신생 활성을 한정됨이 없이 포함한다. 용어 "IL-12의 기능을 가진 단백질"은 야생형 서열이 아미노산의 추가, 결실, 또는 치환 중 하나 이상에 의해 변경된 야생형 IL-12 서열의 돌연변이 및 IL-12의 생물활성 중 하나 이상을 모방하는 비-IL-12 단백질을 포괄한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "활성화하는" 또는 "활성화하다"는 관심 유전자(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IOR 또는 그 서브유닛 DN, IL- 15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCLl(림포탁틴), CXCLl (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCLlO (IP-1O), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 SlOO으로부터 선택됨)의 발현을 야기하는, 유전자 스위치의 세포 활성의 임의의 측정가능한 증가를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 질환을 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질환의 징후 또는 증상을 완화시키기 위한 노력으로, 포유류(인간 또는 비-인간)에 하나 이상의 약물 또는 시험관 내에서 조작된 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있는 프로토콜을 실시하는 것을 말한다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요구하는 것으로 반드시 이해되어서는 안되며, 치유를 요하지 않으며, 개체에 대한 단지 한계 효과만을 갖는 프로토콜을 구체적으로 포함한다.
본 명세서에 사용될 때, "면역 세포"는 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 천연 살해 세포 및 림프구(예를 들어, B 및 T 세포)를 포함한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "수지상 세포" 및 "DC"는 서로 바꾸어서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "치료법 지원 세포"(TSC)는 면역조절자의 기능을 가진 하나 이상의 단백질 및, 선택적으로 IL-12의 기능을 가진 단백질을 종양 미세환경에 전달하기 위해 본 발명의 벡터로 변경(예를 들어, 형질감염, 전기천공, 등)될 수 있는 세포이다. 그러한 TSC는 줄기 세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "시험관 내에서 조작된 면역 세포" 또는 "시험관 내에서 조작된 면역 세포 집단" 또는 "조작된 면역 세포 집단" 또는 "면역조절자를 발현하는 면역 세포" 또는 "IL-12를 발현하는 면역 세포"는 면역조절자 및/또는 IL-12를 조건적으로 발현하는 면역 세포, 예를 들어, 수지상 세포를 말하며, 그 경우는 활성화 리간드에 의해 활성화될 수 있는 유전자 스위치의 조절하에 있을 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "시험관 내에서 조작된 TSC" 또는 "시험관 내에서 조작된 TSC 집단" 또는 "조작된 TSC의 집단" 또는 "면역조절자를 발현하는 TSC" 또는 "IL-12를 발현하는 TSC"는 활성화 리간드에 의해 활성화될 수 있는 유전자 스위치의 조절하에 있을 수 있는, 면역조절자 및/또는 IL-12를 조건적으로 발현하는 치료법 지원 세포, 예를 들어, 줄기 세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "변경된 세포"는 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전 및 리포펙션(리소좀 융합)을 포함하지만 이로 한정되지 않는 과정에 의해 변경된 세포를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "MOI" 또는 "감염다중도"는 특정 실험에서 단일 세포를 감염시키는 아데노바이러스 입자의 평균 수(예를 들어, 재조합 아데노바이러스 또는 대조 아데노바이러스)를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "종양"은 전암 또는 암 세포 및/또는 조직이건 간에, 생체 내 또는 시험관 내에서의 모든 양성 또는 악성 세포 성장 및 증식을 말한다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암의 예는 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 결장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발성 뇌 암종, 두경부 암, 신경교종, 아교모세포종, 간암, 방광암, 비소세포 폐암, 머리 또는 목 암종, 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 윌름(Wilms') 종양, 자궁 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 결장 암종, 전립선 암종, 비뇨생식기 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종, 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 융모막암종, 균상식육종, 악성 고칼슘혈증, 자궁 과형성, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 신경아세포종, 횡문근육종, 카포시 육종, 진성다혈구증, 본태성 혈소판증가증, 호킨스병, 비-호킨스 림프종, 연부조직육종, 중피종, 골육종, 원발성 고분자글로불린혈증, 및 망막모세포종, 등을 포함한다.
본 발명은 면역조절자의 기능을 가진 단백질 및, 선택적으로 IL-12를 조건적으로 발현하기 위하여 세포, 예를 들어, 면역 세포 및 TSC의 조작, 및 암 또는 종양 또는 둘 모두의 치료를 위한 치료적 용도 및/또는 응용을 제공한다. 면역조절자의 기능을 가진 단백질 및 선택적으로 IL-12를 조건적으로 발현하는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 TSC는 단백질(들)의 항시적 생산에 비하여 안전한 개선이다. 부가적으로, 면역조절자 및 선택적으로 IL-12 발현의 타이밍과 수준을 조절하는 능력은 치료 효능의 개선된 조절을 제공한다. 따라서, 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 TSC는 인간 또는 비-인간 유기체에서 암 또는 종양의 치료를 위한 치료제로서 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 대안적으로, 면역 세포, TSC 또는 그 서브세트의 시험관 내에서 조작된 집단은 면역 조절자 및 선택적으로 IL-12 단백질 생산을 인간 또는 비-인간 유기체의 신체 내의 특정 영역(정상 조직, 암, 또는 종양)에 조건적으로 전달하기 위해 비히클로서 사용될 수 있다. 면역 세포는 자가 조직의 또는 비자가조직의 수지상 세포일 수 있다. 수지상 세포는 골수로부터 또는 말초 혈액 순환으로부터 단리될 수 있다. 인간 환자에서, 수지상 세포 집단은 백혈구 성분 채집술(leukophoresis) 절차를 통해 단리될 수 있으며, 여기서는 백혈구 분획은 단리되어 제거되며 다른 혈액 구성요소는 환자에게 재주입된다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 인간 조혈 줄기 세포를 면역조절자의 기능을 가진 단백질 및 선택적으로 IL-12의 기능을 가진 단백질을 발현하는 본 발명의 벡터로 형질감염시키고, 형질감염된 줄기 세포를 분화시켜 수지상 세포를 생성함으로써 제조될 수 있다. 미국 특허 제6,734,014호를 참고한다.
일 실시 양태에서, 유전자 스위치를 함유한 핵산 아데노바이러스 벡터가 제공되며, 여기서, VP16-RXR 및 Gal4-EcR을 위한 코딩 서열은 인간 유비퀴틴 C 프로모터의 조절하에 아데노바이러스 셔틀 벡터내로 삽입되는 EMCV 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 서열에 의해 분리된다. IRES 서열에 의해 분리되고, 합성 유도성 프로모터의 조절하에 배치된 IL12의 p40 및 p35 서브유닛을 위한 코딩 서열은 유비퀴틴 C 프로모터의 상류에 삽입된다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 이. 콜라이 BJ5183 세포에서 아데노바이러스 골격 (AdEasy1)과 재조합된 두 개의 융합 단백질 및 유도성 IL-12 서브유닛을 위한 전사 유닛 (VP16-RXR 및 Gal4-EcR)을 보유한 셔틀 벡터를 제공한다. 재조합 클론을 확인한 후, rAd.RheoIL12 게놈을 보유한 플라스미드는 XL10-골드 세포에서 성장되고 정제되며, 플라스미드 골격이 분해되고 HEK293 세포 내로 형질감염에 의해 패키징된다.
구체적 실시 양태에서, 생성된 일차 바이러스 스톡은 HEK 293 세포의 재감염에 의해 증폭되며 CsCl 밀도-구배 원심분리에 의해 정제된다.
일 실시 양태에서 면역조절자 및/또는 IL-12 유전자는 야생형 유전자 서열이다. 다른 실시 양태에서, 면역조절자 및/또는 IL-12 유전자는 변경된 유전자 서열, 예를 들어, 키메라 서열 또는 바람직한 코돈을 사용하도록 변경된 서열이다.
일 실시 양태에서, 면역조절자 및/또는 IL-12 유전자는 인간 야생형 서열이다. 다른 실시 양태에서, 이 서열은 야생형 인간 서열과 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 인간 서열과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다. 추가의 실시 양태에서, 이 유전자 서열은 인간 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시 양태에서, 이 유전자는 야생형 인간 폴리펩티드와 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 인간 폴리펩티드와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다.
일 실시 양태에서, IL-12 유전자는 야생형 생쥐 IL-12 서열이다. 다른 실시 양태에서, 이 서열은 야생형 생쥐 IL-12와 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 생쥐 IL-12와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다. 추가의 실시 양태에서, 이 IL-12 유전자 서열은 생쥐 IL-12 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시 양태에서, 이 유전자는 야생형 생쥐 IL-12와 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 생쥐 IL-12와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다.
DC는 인간, 생쥐 또는 기타 포유류 유래의 골수로부터 단리될 수 있다. 수지상 세포는 인간, 생쥐 또는 기타 포유류의 혈액으로부터 단리될 수 있다. 인간 환자에 있어서, 수지상 세포 집단은 당업계에 공지된 바와 같이 백혈구 성분 채집 (leukophoresis) 절차를 통하여 단리될 수 있으며, 여기서, 백혈구 세포 분획이 단리되어 제거되고 다른 혈액 성분은 환자에게 재주입된다. 일 실시 양태에서, DC는 이전에 기술된 바와 같이 쥐과 골수로부터 유래된다 (Tatsumi et al., 2003). 간략하게는 야생형 또는 EGFP Tg 생쥐 골수 (bone marrow, BM)는 37℃에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 7일 동안 1000 단위/ml의 재조합 쥐과 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 및 재조합 mIL-4 (미국 뉴저지주 로키 힐 소재의 페프로테크 (Peprotech))가 보충된 조절 배지 (conditioned medium, CM)에서 배양된다. 그 후 CD11c+ DC는 예를 들어 특이적 MACSTM 비드를 이용하여, 제조업자 (미국 캘리포니아주 오번 소재의 밀테니이 바이오테크 (Miltenyi Biotec))의 지시에 따라 단리된다. 이러한 방식으로 생성된 CD11c+ DC는 CD11b, CD40, CD80, 및 클래스 I 및 클래스 II MHC 항원의 공동 발현 및 형상에 기반하면 순도가 >95%이다.
본 발명의 일 실시 양태는 인간 또는 비-인간 유기체에서 유전자 치료법으로서 암, 또는 종양 또는 이들 둘 모두의 치료를 위한 치료적 응용에 적합한, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질 및 선택적으로 IL-12를 조건부로 발현하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 엑디손 수용체의 적어도 일부분을 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 엑디손 수용체 기반의 유전자 스위치를 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 레오스위치를 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치 및 유전자 스위치를 조정하는 리간드를 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 포함하는 키트를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 키트는 다이아실하이드라진 리간드를 추가로 포함한다. 다른 실시 양태에서, 본 키트는 RG-115830 또는 RG-115932를 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 TSC 및 면역 세포의 조작된 집단을 제공한다. 일 실시 양태에서, 7일에 배양된 DC를 항시성 또는 유도성 프로모터로 구동되는 면역조절자 및/또는 IL-12를 코딩하는 재조합 아데노바이러스로 처리되거나, 또는 일련의 감염 다중도 (multiplicity of infection, MOI)에 걸쳐 모크 (mock) 대조 아데노바이러스 벡터 (rAdψ5)로 감염된다. 48시간 후, 감염된 DC를 수확하고, 62.5 pg/ml의 더욱 낮은 검출 한계를 이용하여 특이적 ELISA 키트 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 비디-파밍젠 (BD-PharMingen))를 이용하여 면역조절자 및/또는 IL-12의 생성에 대하여 그리고 표현형에 대하여 분석한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 면역조절자 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현할 수 있는 유전자 스위치를 갖는 벡터, 예를 들어 DNA 벡터를 포함하며, 활성화 리간드를 추가로 포함하는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 집단 및 TSC를 제공한다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명은 조작된 DC를 환자에게 투여하는 단계 및 그 후 활성화 리간드, 예를 들어 RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932를 상기 인간에게 투여하는 단계에 의해 암, 예를 들어 흑색종 또는 신경교종의 치료 방법을 제공한다. 환자는 암을 가진 인간 또는 동물일 수 있다. 치료 방법 및 생성물, 조작된 세포, 키트 및 리간드는 인간 치료법 및 수의학적 동물 치료법에서 응용성을 갖는다. 따라서, 본 생성물 및 방법은 인간 및 수의학적 동물 목적용으로 사용되는 것이 고려된다.
일 태양에서, 본 발명은 면역조절자 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단를 함유하는, 인간 또는 비-인간에게 투여하기에 적합한 약학 조성물을 제공하며, 여기서, 본 제형은 종양내 투여에 의해 투여하기에 적합하다. 본 발명은 활성화 리간드, 예를 들어 RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932를 함유하는 약학 조성물을 추가로 제공하며, 여기서, 본 조성물은 복강내 투여, 경구 투여 또는 피하 투여에 의해 투여하기에 적합하다.
본 명세서에 기술된 특정 실시 양태에서, 본 발명은
a. 포유류에 있어서 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단를 종양내 투여하는 단계; 및
b. 상기 포유류에게 치료적 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계
를 순서대로 포함하는 종양 치료 방법을 제공한다.
일 실시 양태에서, 활성화 리간드는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC와 실질적으로 동일한 시점에서, 예를 들어 상기 세포를 투여하기 1시간 전 또는 상기 세포를 투여한지 1시간 후에 투여된다. 다른 실시 양태에서, 활성화 리간드는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC를 투여한 후 약 24시간 이하의 시점에서 투여된다. 또 다른 실시 양태에서, 활성화 리간드는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC 이후 약 48시간 이하의 시점에서 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 RG-115932이다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 일일 약 1 내지 50 mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 일일 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 7 내지 28일의 기간 동안 매일 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 14일의 기간 동안 매일 투여된다. 다른 실시 양태에서, 약 1 x 106 내지 1 x 108개의 세포가 투여된다. 다른 실시 양태에서, 약 1 x 107개의 세포가 투여된다.
일 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-2 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-2는 이펙터 및 조절 T 세포, NK 세포 및 NK-T 세포에 강력한 조절 효과를 발휘한다. 세포에서의 IL-2 및 IL-12의 발현은 각각의 다른 수용체를 상호 상향조절하고 별도의 시그널링 경로에 의한 상보적인 생물학적 영향에 의해 상이하게 유도될 것으로 예상된다. 또한 IL-2와 IL-12의 조합은 면역 자극의 지속 기간을 연장하고 동물이 더욱 잘 견딜 수 있는 세포의 유효 용량을 감소시킬 것으로 예상된다. Dietrich 2002, Wigginton 2002, 2001, 1996 및 Koyama, 1997, McDermott and Atkins 2008]; Berntsen et al 2008; Tarhini et al 2008; Heemskerk et al 2008; Horton et al 2008을 참조하라. IL-2의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 U25676 (인간); NM_008366 (생쥐); NM_204153 (닭); 및 NM_053836 (쥐)으로 입수가능하다. IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 NM_000882 (인간 IL12A); NM_002187 (인간 IL12B); NM_008351 (생쥐 IL12a); NM_008352 (생쥐 IL12b); NM_213588 (닭 IL12A); NM_213571 (닭 IL12B); NM_053390 (쥐 IL12a); 및 NM_022611 (쥐 IL12b)로 입수가능하다. 서열 번호 13, 15, 21 및 23의 서열은 인간 및 생쥐 IL-12와 그의 서브유닛을 코딩한다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-18 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-18은 IFN-감마 생성을 유도하며 T 헬퍼 세포 발생 및 NK 활성화를 촉진한다. 게다가, IL-18은 GM-CSF 생성을 증대시킬 수 있고 IL-1O 생성을 감소시킬 수 있다. IL-18 및 IL-12는 어느 하나의 사이토카인이 단독으로 투여될 때 관찰되는 한계를 극복할 것으로 예상된다. 수지상 세포에서의 IL-12 및 IL-18의 발현은 수지상 세포가 어느 하나의 사이토카인 단독으로 변환될 때보다 더욱 강한 종양 항원-특이적 Th1 반응을 촉진할 것으로 예상된다.
IL-12 및 IL-18 둘 모두를 분비하도록 조작된 DC의 종양내 주사는 최고 수준의 INF-γ 생성 및 완전한 종양 거부를 매개하였다 (Tatsumi 2003). Vujanovic, 2006을 참조하라. 또한 Coughlin, 1998, Subleski, 206, Tatsumi, 2003, 및 Sabel, 2007; Shiratori et al 2007; Lian et al 2007; Iinuma et al 2006을 참조하라. IL-12 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. IL-18의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 U90434 (인간); NM_008360 (생쥐); EU747333 (닭); 및 AY258448 (쥐)로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-15 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-15는 일부의 생물 활성을 IL-2와 공유하는데, IL-2는 또한 IL-15가 암에 대한 치료법에 잠재적으로 유용해지도록 한다. IL-15는 NK 세포 및 활성화된 T 세포의 증식을 촉진하며, 이펙터 T 세포의 확장을 지원한다. IL-15 표현은 NK 세포에 의한 증강된 IFN-감마 생성에 있어서 IL-12와 함께 상승 작용한다는 것이 보고되었다. Koka, 2004; Basak 2008; Lasek et al 2004. IL-15 및 IL-12의 종양내 전달은 흑색종 모델에서 유의한 종양 퇴화를 유도하였다 (Lasek 1999). IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. 서열 번호 11 및 19의 서열은 인간 및 생쥐 IL-15를 코딩한다. 도 2 및 도 4는 인간 및 생쥐 IL-12 및 IL-15에 사용될 수 있는 발현 시스템의 플라스미드 지도이다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-21 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-21 및 그의 수용체는 IL-2 및 IL-15와 서열 상동성을 공유한다. IL-21은 NK 세포의 확장 및 성숙을 촉진한다. IL-21을 이용하여 NK 세포를 처리하면 IL-12 수용체가 유의하게 상향조절되기 때문에 IL-21의 생물적 효과는 IL-12와 함께 잠재적으로 상승 작용을 한다. 게다가, IL-21은 IL-12 신호 전달을 증강시킬 수 있으며 IFN-감마 생성 증가를 위하여 협력하였다. IL-12 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. IL-21의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 AF254069 (인간); NM_021782 (생쥐); NM_001024835 (닭); 및 NM_0O1108943 (쥐)으로 입수가능하다. 서열 번호 6, 7, 8, 9, 및 17의 서열은 인간 및 생쥐 IL-21을 코딩한다. 서열 번호 1 및 2는 생쥐 및 인간 IL-12 및 IL-21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 작제물이다. 도 7 및 도 8은 각각 인간 및 생쥐 IL-12 및 IL-21의 발현을 위하여 사용될 수 있는 발현 시스템의 플라스미드 지도이다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 TNF-알파 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. TNF-알파는 면역 세포의 강력한 활성자이다. 게다가, TNF-알파는 T 세포 상에서의 IFN-감마 및 IL-12 수용체의 증강된 발현에 있어서 IL-12와 함께 상승 작용할 수 있다. 동물 모델에서, IL-12 및 TNF-알파 둘 모두의 적용은 DN8+ T 세포에 의한 종양 침윤, 유의한 IFN-감마 생성 및 후속적인 종양 퇴화로 이어졌다. Sabel, 2003, 2004, 2007, Taniguchi, 1998, Lasek, 2000; 및 Xia et al 2008을 참조하라. IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. TNF-알파를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 X02910 (인간); NM_013693 (생쥐); 및 BC107671 (쥐)로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-7 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-7은 IL-2 패밀리의 구성원이며, T 세포 및 B 세포 림프구 생성 (lympophoiesis)에 중요하다. IL-7은 나이브 및 기억 CD8+ T 세포의 생존 ㅁ미및 증식의 항상성을 조절한다. IL-7은 종양에 대한 CTL 생성을 증강시키는 것으로 입증되었다. 게다가, IL-12는 IL-7 매개된 증식을 증강시키도록 CD8+ T 세포 상에서 유도되어 작용한다. 또한, IL-7 및 IL-12는 CD8+ T 세포의 세포독성을 상승 작용식으로 증강시킨다는 것이 보고되었다. Mehrotra, 1995; Sharma et al 2003; Tirapu et al 2002. 따라서, IL-7 및 IL-12의 공동발현은 더욱 최적인 항종양 반응을 제공할 것으로 예상된다. IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 J04156 (인간); NM_008371 (생쥐); NM_001037833 (닭); 및 NM_013110 (쥐)으로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 GM-CSF 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. GM-CSF는 조혈 전구 세포의 분화 및 증식을 조절하며, 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포 (antigen presenting cell, APC)의 성숙에서 특히 중요한 역할을 한다. 또한 GM-CSF는 수지상 세포가 항원을 프로세싱하고 제시하는 능력을 증강시킨다. GM-CSF는 동물 연구에서 IL-12와는 상이하게 기능하며, 이들 둘 모두는 유의한 항종양 반응을 유발한다. IL-12 (T 세포 활성화)와 GM-CSF (수지상 세포 활성화)의 조합은 항종양 면역성이 더욱 강력해지도록 할 것으로 예상된다. 동물 연구에서, IL-12 처리와 조합된 GM-CSF가 다수의 암 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하였다. Wang, 2001; Chang, 2007; Jean, 2004; Nair, 2006; Hill 2002; Small et al 2007. 인간 임상 시험에서, GM-CSF + IL-12는 골수종 환자의 치료에 성공적으로 사용되었으며, 여기서, 상기 둘 모두의 사이토카인의 조합된 작용은 순환 B 세포를 감소시켰다. Rasmussen, 2003; Hansson, 2007; Abdalla, 2007. 단일 세포에서의 GM-CSF 및 IL-12의 공동발현에 의해 순환 B 세포의 감소와 같은 원하지 않는 전신 효과가 회피될 것으로 예상된다. IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. GM-CSF의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 M11734 (인간); NM_009969 (생쥐); EU520303 (닭); NM_001037660 (쥐 Csf2ra); 및 NM_133555 (쥐 Csf2rb)로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 케모카인 (예를 들어, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), 또는 CCL21 (6Ckine)) 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. 케모카인은 다양한 염증 및 비염증 상태 하에서 백혈구 및 기타 세포 유형의 왕래 (trafficking) 및 활성화를 조절하는 화학주성 사이토카인이다. 염증성 사이토카인은 염증 및 조직 손상에 있어서 백혈구의 모집을 제어한다. 항상성 케모카인은 조혈 동안 골수 및 흉선에서뿐만 아니라 이차 림프 기관으로의 그리고 이차 림프 기관 내에서의 내비게이팅 (navigating) 백혈구 (예를 들어, 수지상 세포)와 같이 항존 (housekeeping) 기능을 충족시킨다. 동물 연구에 있어서, IL-12 및 CXCL1O을 발현하는 2가지 별도의 아데노바이러스를 종양내로 동시 주입하면 CT26 쥐과 결장직장 선암종 세포주로부터 유래되는 종양 결절이 100% 퇴화되었다. Narvaiza et al., 2000. Emtage et al., 1999에는 IL2 및 XCL1 (림포탁틴) 또는 IL-12 및 XCL1을 발현하는 2가지 이중 재조합 아데노바이러스 벡터가 기술되어 있다. 생쥐에서 유방 선암종에 상기 벡터들을 종양내 주사하면 강력한 항종양 반응이 유발되었고 보호 면역이 생기게 되었다. 다른 동물 연구에서, IL-12 및 CCL27을 발현하는 아데노바이러스 벡터들의 동시 형질도입은 종양 퇴화 및 장기간 특이 면역으로 이어졌다. Gao et al., 2007. 따라서, 본 발명에 따른 IL-12 및 케모카인의 동시발현은 상승 작용적 항종양 활성으로 이어질 것으로 예상된다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 항혈관신생 사이토카인 (예를 들어, IP-10 및 Mig) 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IP-10 및 Mig는 T 세포 및 NK 세포에 있어서 화학주성물질이며 이들이 혈관신생을 억제하는 능력은 NK 세포에 의존적이다. 동물 연구에 의하면, 하나가 IP10을 발현하며 다른 것이 IL-12를 발현하는 두 아데노바이러스를 이용한 병용 요법이 두드러진 항종양 시너지로 이어졌음이 밝혀졌다. (Narvaiza et al., 2000). 다른 연구에서, IPlO 또는 MIG 및/또는 IL-12를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 유방 선암종 및 섬유육종의 쥐과 모델에 있어서 종양내에 투여하였다. IP-10 또는 MIG를 IL-12와 조합하여 투여하면, IP1O, MIG, IL-12 단독 또는 대조 처리 동물과 비교할 때 종양이 상당히 상당히 퇴화되었으며 종양을 지닌 동물의 생존 시간이 증가하였고, 이때 IP-10, IL12 조합이 가장 효과적이었다 (Palmer, 2001). 또한 Mazzolini, 2003; 및 Huang, 2004을 참조하라. 따라서, 항혈관신생 사이토카인 및 IL-12의 동시발현이 상승작용적 항종양 활성으로 이어질 것이라 예상된다.
효과적인 IL-12-매개 유전자 치료법을 증명하기 위하여, 조건부 cDNA 발현 시스템이 사용되는데 이는 종양내 주사 후 다양한 시점에서 면역 세포 또는 TSC에 의한 면역조절자 및/또는 IL-12 생성이 시작되게 한다. C57BL/6 생쥐에 있어서 공격적 B16 흑색종 모델에서의 결과를 기반으로 하면 하기 결론이 만들어진다: 1) 상승된 수준의 IL-12가 활성화 리간드 RG-115830의 존재 하에서는 DC.RheoIL12로부터 분비되지만 상기 리간드의 부재 하에서는 그러하지 않음; 2) DC 주사 24시간 내에 RG-115830이 처리 동물에 투여되는 한 종양내 DC.RheoIL12-기반 치료법은 종양내 DC.cIL 12-기반 치료법만큼 효과적임 (그리고 이후의 시점에 리간드가 제공되면 RG-115830 치료법은 실패함); 3) DC에서의 IL-12 발현은 종양 미세환경에서의 이들 세포의 생존을 연장시키는 것으로 보이며 이는 종양-배출 림프절로 이동하는 더욱 많은 개수의 종양내-주사 DC와 결부됨; 및 4) 치료 결과에 상관되는 가장 강한 면역이라는 것은 당해 치료법에 의해 교차-프라이밍되는 종양-특이적 CD8+ T 세포의 수준이며 종양 미세환경 내에서 유지되는 주사된 DC의 개수가 아님. 전체적으로는, 이들 데이터는 항-종양 T 세포의 종양 미세환경 내로의 주사 DC-매개 모집 등과 같이 제1형 CD8+ T 세포 이펙터의 구심성 (교차-프라이밍)에 대한 긍정적인 영향을 기반으로 하면 그리고 이후의 원심성 이벤트 (event)에 대해서는 그러하지 않다는 것을 기반으로 하면, 예를 들어 DC.IL12-기반 치료법이 성공적일 가능성이 있음을 시사한다.
종양내 주사 이전에, 세포 (면역 세포 또는 TSC)는 세포의 활성을 촉진하는 인자로 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 OX40L, 4-1BBL, CD40, CD40L, GITRL, CD70, LIGHT 또는 ICOS-L을 포함하는 양성 공동 자극 분자 또는 항-CTLA4, 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 항체와 같은 음성 공동 자극 분자와 같은 공동 자극 분자로 ㅊ처철처리될 수 있다. 예를 들어, 세포 (예를 들어, 면역 세포 또는 TSC)는 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하는 세포, 예를 들어, CD40 리간드 분자를 발현하는 J588 림프종 세포와 함께 인큐베이션될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 세포 (면역 세포 또는 TSC)는 반대 면역 억제 분자 (허용성 억제제), 예를 들어 항-TGF-베타 항체 (미세환경 내에서의 TGF 시그널링을 억제하기 위하여), 항-IL10 항체, TGFbRII DN (유전자 변형 세포 내에서의 TGF 시그널링의 억제를 위하여), IL-1OR DN, dnFADD (세포 내에서의 세포 사멸 경로를 억제하기 위하여), 항-SOCS1 항체, siRNA 또는 방해용 물질 (decoy) (세포 내에서의 억제 사이토카인 시그널링을 억제하기 위하여) 또는 항-TGFa 항체로 처리될 수 있다.
도 1 내지 도 8에 예시된 폴리뉴클레오티드 서열을 지니는 재조합 아데노바이러스가 생성된다. 예를 들어, hIL-21은 좌측 ITR의 상류 부위에서의 제한효소 절단에 의해 선형화된 hIL-21 발현 벡터, 및 HEK293 세포와 같은 허용 세포주 내의 적절한 (예, E3 결실) 아데노바이러스 골격의 동시 형질감염에 의해 생성된다. 쥐과 면역조절 유전자를 지니는 아데노바이러스 벡터는 쥐과 치료 모델에서 사용하기 위한 쥐과 수지상 세포 또는 TSC의 형질도입에 사용된다. 인간 치료 응용에 있어서, 면역조절 유전자의 인간 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 벡터 내에 삽입된다. 인간 치료 응용을 위한 아데노바이러스 벡터는 GMP 상태 하에 생성된다. III/IV기 흑색종 환자에 있어서의 치료 개요 (임상 시험)의 예로는 하기가 있다: 이 사례에서의 치료는 아데노바이러스가 형질도입된 수지상 세포의 종양내 주사 및 활성제 약물 (리간드)의 14일간의 매일 경구 투여를 포함한다. 대상은 임상 시험 30일 이전 내지 1주일 이전에 스크리닝된다. 각각의 대상에게 고지에 입각한 동의서에 서명하도록 요청한 후 임의의 절차를 개시한다. 연구자는 그 성질, 목표, 지속 기간, 잠재적인 위험, 및 상기 임상 시험 동안 수행되는 절차와, 대상의 진료 기록이 FDA에 의해 검토될 수도 있다는 가능성을 모든 대상에게 고지할 것이다. 대상 (총 16 내지 20명)은 4개의 코호트 (cohort)로 임의로 분류된다. 모든 코호트는 제1 용량의 리간드를 경구 투여한지 대략 3시간 후 최대 5x107개의 형질도입된 수지상 세포의 종양내 주사를 받을 것이다. 4개의 코호트는 받는 리간드의 매일 경구 용량이 상이하다: 예, 코호트 1= 0.01 mg/kg; 코호트 2= 0.3 mg/kg; 코호트 3= 1 mg/kg; 코호트 4=3 mg/kg. 처리 코스 동안, 활성제 약물 및 그의 주요 대사산물의 단일 용량 및 정상 상태의 약동학적 특성의 평가를 위하여 명시된 시간 간격으로 혈액을 채취한다. 또한, 바이러스 벡터, RTS 구성요소 및 종양에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응의 평가를 위하여 명시된 시점에서 혈액을 채취한다. 혈청 화학 검사, 소변 검사 및 혈액 검사 (안전 프로파일)을 위하여 명시된 시점에서 혈액을 채취하고 소변을 수집한다. 종양 및/또는 배출 림프절 생검체를 명시된 시점에서 취하여 트랜스진 발현 및 종양에 대한 면역 반응을 당해 치료법의 결과로서 평가한다. 이상 반응 (adverse event)의 경우 환자에 대하여 초기 종결에 대한 기준을 확립하고, 이상 반응을 기록한다. 환자를 이상 반응 및 치료 결과에 대하여 1개월, 2개월, 3개월 및 4개월에서 추적한다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 항시적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 항시적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사한다. 바람직한 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-면역조절용 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터이다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) IL-12를 항시적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) IL-12를 항시적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사한다. 바람직한 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터이다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) IL-12를 항시적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 바람직한 실시 양태에서, 조작된 수지상 세포는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터를 발현하도록 조작된다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) IL-12를 항시적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) IL-12를 항시적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사하며, (c) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 바람직한 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터이다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포 및 IL-12 발현 벡터가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포 및 IL-12 발현 벡터가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포 및 IL-12 발현 벡터의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 항시적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 항시적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사한다. 바람직한 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-IL-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터이다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 항시적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 바람직한 실시 양태에서, 조작된 수지상 세포는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터를 발현하도록 조작된다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 항시적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 항시적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사하며, (c) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 바람직한 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터이다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포 및 면역조절자 발현 벡터가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포 및 면역조절자 발현 벡터가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포 및 면역조절자 발현 벡터의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
본 발명의 방법들 중 임의의 방법에서, 질환 또는 장애는 본 출원에 개시된 질환 또는 장애일 수 있다. 일 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 본 명세서의 표 1에 열거된 질환 또는 장애이다. 다른 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 본 명세서의 표 3a 내지 표 3g에 열거된 질환 또는 장애이다.
본 발명의 방법들 중 임의의 방법에서, 암 또는 종양은 본 출원에 개시된 질환 또는 장애일 수 있다. 일 실시 양태에서, 암 또는 종양은 본 명세서의 표 1에 열거된 암 또는 종양이다. 다른 실시 양태에서, 암 또는 종양은 본 명세서의 표 3a 내지 표 3g에 열거된 암 또는 종양이다.
환자 유래의 생물 샘플에서의 Th1/Tc1형 사이토카인, IFN-감마의 활성 또는 발현 수준을 측정함으로써 세포 집단에 대한 면역조절자 및/또는 IL-12의 발현의 영향을 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 목적상, 본 발명은 암 환자에서 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC-기반의 치료 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하며, 이는
a. 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 투여 전에 인간 환자로부터 얻어진 제1 생물 샘플에서 인터페론-감마 (IFN-감마)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하는 단계;
b. 상기 환자에게 시험관 내에서 조작된 세포를 종양내 투여하는 단계;
c. 상기 환자에게 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계;
d. 상기 활성화 리간드의 투여 이후의 시점에서 상기 환자로부터 얻어진 제2 생물 샘플에서 IFN-감마의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하고 그에 의해 시험 수준에 대한 데이터를 생성하는 단계; 및
e. 대조의 수준을 IFN-감마의 시험 수준과 비교하는 단계
를 포함하고, 여기서, 대조 수준에 비하여 시험 수준 면에서 IFN-감마의 발현 수준, 활성 수준, 또는 이들 둘 모두가 증가함을 보여주는 데이터는 이 치료적 치료 요법이 상기 환자에서 효과적임을 나타낸다. 또한 본 발명은
f. 생검체를 취하여 종양 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocyte, TIL)를 계수하는 단계 및/또는
g. 종양이 본 치료에 반응하여 퇴화하는 것을 관찰하는 단계
의 추가적인 단계를 선택적으로 포함할 수 있다.
"대상"이라는 용어는 온전한 곤충, 식물 또는 동물을 의미한다. 또한 대상이 진균류 또는 효모일 때 리간드가 동일하게 잘 작용할 것으로 기대된다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물은 척추동물, 예를 들어 포유류, 예컨대 인간, 설치류, 원숭이류 및 기타 동물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 이때 인간 또는 생쥐가 더욱 바람직하다. 기타 동물은 수의학적 동물, 예를 들어 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 돼지 등을 포함한다.
이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 임상 현장에서 종양내로 투여되는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 TSC 기반의 유전자 치료법의 사용을 지원할 것으로 예상되는데, 이는 일차적인 연구 종점으로서의 목적하는 임상 반응, 및 이차적인 연구 종점으로서의 교차-프라이밍된 항-종양 CD8+ T 세포 (IFN-감마를 생성함)에 초점을 맞춘다. 생체 내에서 면역조절자 및/또는 IL-12의 발현을 시작하고 중단하는 능력은, 단백질 발현의 타이밍 및 수준 둘 모두가 리간드 투여에 의해 제어될 수 있다는 점에서 그리고 또한 면역조절자 및/또는 IL-12 발현의 타이밍이 본 방법의 치료적 유효성에 결정적일 것으로 예상된다는 점에서 안전 및 치료적 제어의 요소를 본 치료법에 부가한다.
또한 본 발명은 인간 질환의 효과적이고 효율적인 치료를 위한 혁신적인 접근법으로서 조건부로 발현되는 관심있는 유전자를 포함하는, 시험관 내에서 조작된 세포의 치료적 응용을 지원한다.
본 발명의 목적상, 만일 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌 및 본 명세서의 임의의 교시 또는 시사 사이에 상충되는 것이 있을 경우 본 명세서가 지배할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 완전히 전체적으로 참고로 포함된다.
전술한 실시 양태 및 실시예는 어떠한 점에서든 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것이 아니며, 본 명세서에 제시된 특허청구범위는 본 명세서에서 명백하게 제시되어 있든 그렇지 않든 간에 모든 실시 양태 및 실시예를 포함하고자 하는 것임이 이해되어야 한다.
2008년 10월 8일자로 출원되고 발명의 명칭이 "조작된 수지상 세포 및 암 치료에 있어서의 용도 (Engineered Dendritic Cells And Uses For Treatment Of Cancer)"인 미국 특허 출원 제12/247,738호가 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2008년 9월 29일자로 출원되고 발명의 명칭이 "치료적 유전자-스위치 작제물 및 치료적 생물 분자의 발현을 위한 생물반응기와 그 용도 (Therapeutic Gene-Switch Constructs And Bioreactors For The Expression Of Biotherapeutic Molecules, And Uses Thereof)"인 미국 특허 출원 제12/241,018호가 또한 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 면역조절자를 발현하기 위한 면역 세포 또는 치료법 지원 세포(therapy support cell; TSC)의 조작 및 치료제로서의 상기 세포의 용도를 제공한다. 그러므로 본 발명은 그러한 세포의 사용에 있어서 전도 유망한 치료 결과를 제공한다.
도 1은 hIL-12를 코딩하는 2시스트론 전사체 (bicistronic transcript)에 있어서의 조절 프로모터(regulated promoter) 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 2는 hIL-21 및 hIL-15를 코딩하는 2시스트론 전사체에 있어서 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 3은 mIL-12를 코딩하는 2시스트론 전사체에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 4는 mIL-21 및 mIL-15를 코딩하는 2시스트론 전사체에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 5는 hIL-21을 위한 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 6은 mIL-21을 위한 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 7은 hIL-12 및 hIL-21을 코딩하는 3시스트론 전사체(tricistronic transcript)에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 8은 mIL-12 및 mIL-21을 코딩하는 3시스트론 전사체에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 9는 E1 및 E3 영역이 결실되었고 레오스위치(등록상표) 테라퓨틱 시스템 (Therapeutic System) (RTS)-IL-12 구성요소들이 E1 영역을 대체하는 벡터 rAd.RheoIL12의 구조를 도시한다. "IL12"로 표지된 박스는 IRES에 의해 분리된 IL-12p40 및 IL-12p35 코딩 서열을 나타낸다.
실시예 1
렌카 (Renca) 신장 세포 암 종양 모델에서 종양-특이적 면역 반응 및 항종양 활성을 유도할 수 있는 가장 효과적인 사이토카인 및 수지상 세포의 용량을 결정하기 위하여 연구에 착수한다.
2가지 종양 세포주, 렌카 및 렌카-HA를 이 연구에 사용한다. 렌카-HA는 렌카 세포를 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA)으로 렌카 세포를 형질감염시킴으로써 만들어진다. 렌카-HA 모델의 이점은 항원-특이적 T 세포를 추적하는 능력이며, 그 이유는 CD8 및 CD4 특이적 HA-유래 에피토프 둘 모두가 공지되어 있고 이들이 사용되어 왔었기 때문이다.
특정 목표 - 수지상 세포의 종양내 투여 후 HA-특이적 면역 반응의 유도를 결정.
렌카-HA 종양을 BALB/c 생쥐에서 피하에 확립한다. 종양이 감지가능해질 때, 수지상 세포를 종양 내에 주사한다. 수지상 세포 투여는 총 3회의 투여에 있어서 7일 간격으로 2회 반복한다.
하기 생쥐 군을 사용한다 (각각의 군은 3마리의 생쥐를 포함함):
1. 미처리 생쥐;
2. 대조 플라스미드로 형질도입된 5x105개의 수지상 세포로 처리한 생쥐;
3. 대조 플라스미드로 형질도입된 106개의 수지상 세포로 처리한 생쥐;
4. 대조 플라스미드로 형질도입된 5x106개의 수지상 세포로 처리한 생쥐;
5. IL-12로 형질도입된 수지상 세포를 사용한, 군 2 내지 군 4와 동일한 것;
6. IL-15로 형질도입된 수지상 세포를 사용한, 군 2 내지 군 4와 동일한 것;
7. IL-21을 형질도입시킨 수지상 세포를 사용한, 군 2 내지 군 4와 동일한 것.
상이한 사이토카인들의 조합의 영향을 시험하기 위하여 생쥐를 하기로 동시에 처리한다:
8. IL-12로 형질도입된 5x1O5개의 수지상 세포 및 IL-15로 형질도입된 5x1O5개의 수지상 세포,
9. IL-12로 형질도입된 5x105개의 수지상 세포 및 IL-21로 형질도입된 5x105개의 수지상 세포, 및
10. IL-15로 형질도입된 5x1O5개의 수지상 세포 및 IL-21로 형질도입된 5x1O5개의 수지상 세포.
마지막으로 투여한지 4일 후, 종양 보유 생쥐의 림프절을 수집하고, MHC 클래스 I 매칭 펩티드 (CD8+ T 세포 반응을 검출하기 위하여) 또는 MHC 클래스 II 매칭 펩티드 (CD4+ T 세포 반응을 검출하기 위하여) 중 어느 하나로 세포를 자극한다.
하기 분석을 이용한다:
1. 엘리스폿 (ELISPOT) IFN-γ 및 IL-2;
2. T-세포 증식;
3. 림프절 세포에 의한 TNFα, IL-1O, IL-4, 및 GM-CSF 방출의 검출.
게다가, 림프절 세포의 NK 활성을 표적으로서 YAC 세포를 이용하여 평가한다.
이와 동시에, 세포를 항-CD3/CD28 항체로 자극하여 T 세포의 비특이적 반응을 평가한다
항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 수지상 세포의 가장 효과적인 용량을 결정한다.
특정 목표 2 - 사이토카인 유전자로 형질도입된 수지상 세포의 항종양 활성의 평가.
통계적으로 유의한 면역 반응 유도를 보여준 사이토카인 형질도입 수지상 세포만을 추가의 실험에서 사용한다.
렌카-HA 종양 보유 생쥐의 처리를 특정 목표 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 이전의 실험에서 특이적 활성을 나타내는 사이토카인으로 형질도입된 DC의 단회 투약을 이용한다. 대조로서, 대조 아데노바이러스로 형질도입된 수지상 세포를 이용한다. 통계적 유의도를 달성하기 위하여, 각각의 군은 10마리의 생쥐를 포함한다.
종양 성장을 평가한다. 렌카-HA 종양은 항종양 효과의 면역학적 모니터링 및 초기 시험에 유용한 면역원성 에피토프를 포함한다. 그러나, 당해 치료법의 잠재적인 항종양 활성을 확증하기 위하여 비-형질감염 종양 세포를 사용할 필요가 있다. 따라서, 상기에 기술된 실험을 렌카 종양 모델을 이용하여 반복한다.
실시예 2
III 및 IV기 흑색종을 갖는 대상에서, RTS의 제어 하에 hIL-12 및 하나 이상의 기타 면역조절자를 발현하도록 조작된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 종양내 주사(들)의 면역학적 효과, 트랜스진 기능, 허용성, 및 안전성을 하기에 기술하는 것과 같은 절차를 통하여 평가할 것이다.
III 및 IV기 흑색종을 갖는 연구 대상을 포함하는 연구를 대상들의 4개의 코호트 (cohort) (군)에서 행할 것인데, 각각의 대상은 인간 인터루킨-12 (hIL-12), 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하도록 조작된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 (그가 유래된 동일 대상 내로 재삽입됨) 수지상 세포 (DC)의 단일한 종양내 주사 (흑색종 종양 내로)를 활성제 약물 (활성화 리간드)의 일일 경구 용량과 조합되어 5 x 107개의 용량으로 받는다. 이 연구는 인간 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 유도가능한 발현을 위하여 아데노바이러스 백터로 엑스 비보로 (ex vivo) (세포를 대상으로부터 꺼낸 후) 형질도입된 수지상 세포의 주사를 이용할 것이다. IL-12 및 하나 이상의 또는 기타 면역조절자의 생성은 활성제 약물 (RG-115932)의 경구 투여에 의한 RTS의 활성화를 통하여 주사 DC로부터 "개시된다" (유도된다). 안전성 및 허용성은 신체 조사 (ECOG 수행 상태를 포함함), 생명 징후 측정, 혈청 화학 검사, 소변 검사, 혈액 검사, 이상 반응 "부작용", 및 아데노바이러스, RTS의 구성요소 및 활성제 약물에 대한 항체 및 세포 면역 반응을 통하여 평가할 것이다. 추이를 평가하기 위하여, 표적 종양, 배출 림프절 및 말초 순환계의 생검체에서 경구 활성제 약물 및 그의 주요 대사 산물의 단일 용량 및 정상 상태 약동학/ADME, hIL-12 수준, 기타 면역조절자 수준, 및 세포 면역 반응 (T 세포)의 분석치와, 혈청 사이토카인 프로파일을 측정할 것이다.
예를 들어, III 및 IV기 흑색종을 갖는 16명의 대상을 4개의 코호트로 나누며, 이때 코호트 1 및 2는 3명의 대상을 포함하며 코호트 3 및 4는 5명의 대상을 포함한다. 모든 대상은 RTS의 제어 하에 인간 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 코딩하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 5 x 107개의 자가유래 DC의 단일한 종양내 주사를 받을 것이다. 예를 들어, 대상에게 RTS 제어 하의 인간 IL-12 및 면역조절자, 예를 들어 IL-15 또는 IL-21을 코딩하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 자가유래 DC의 종양내 주사물을 투여한다.
대상은 활성제 약물의 단일한 일일 경구 용량 (코호트 1: 0.01 mg/kg, 코호트 2: 0.1 mg/kg, 코호트 3: 1.0 mg/kg 또는 코호트 4: 3 mg/kg)을 받을 것인데, 제1 용량은 1일에 DC를 주사하기 약 3시간 전에 시작하며 연속 13일 동안 더 계속된다. 아데노바이러스로 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 추가의 주사(들)를 활성제 약물의 14개의 단일 (1회) 일일 경구 용량과 조합하여 재치료 기준을 만족하는 적격인 대상에게 투여할 수 있다. 시험관 내에서 조작된 수지상 세포를 주사한 후 최대 1개월 동안 코호트 1의 각각의 군 내의 모든 대상에 대하여 안전성, 허용성 및 수지상 세포 기능을 평가한 후 대상이 그 다음 최고 용량의 활성제 약물을 받도록 등록한다. 안전성 평가는 조작된 수지상 세포의 초기 주사 후 3개월 동안 모든 대상에서 계속할 것인데, 만일 독성이 관찰되거나 대상이 추가의 수지상 세포 주사(들)를 받을 경우 추적 기간을 총 6개월로 연장하여 대상 안전성을 모니터링할 가능성이 있다.
그러한 연구는 흑색종을 갖는 대상에서 경구 활성제 약물과 조합된, 아데노바이러스로 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 단일 또는 다중 종양내 주사들(들)의 안전성 및 허용성을 입증한다. 본 연구는 활성제 약물의 경구 투여에 의해 RTS의 활성화에 응답하는 표적 종양 및/또는 배출 림프절에서의 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 hIL-12 발현 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현을 측정함으로써 대상에서 RTS의 기능성을 입증한다. 더욱이, 본 연구는 활성제 약물의 경구 투여 이후 표적 종양, 배출 림프절 및 말초 순환계에서의 세포 면역 반응의 견지에서 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 면역학적 효과를 입증한다.
흑색종을 예시적인 암으로서 선택한다. 특히 고형 종양 중 흑색종은 면역치료적 접근법에 반응하는 것으로 밝혀졌으며, 흑색종 종양은 종양내 주사 및 생검에 있어서 쉽게 접근가능하다. 이 연구에 포함된 대상은 III 또는 IV기의 절제불능 흑색종을 가지며, 상기 흑색종은 적어도 0.5 cm의 직경, 임의의 종양 두께, 많은 림프절의 연루, 통과 전이 (in-transit metastasis), 또는 원격 전이를 갖는다.
레오스위치 테라퓨틱 시스템, hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 보유하는 아데노바이러스의 제조
엑스 비보 아데노바이러스 벡터 형질감염에 의해 재조합 DNA를 수지상 세포 (DC)에 전달한다. 종양내에 주사된 미성숙 수지상 세포 유래의 하나 이상의 다른 면역조절자 및 인간 IL-12 (p70)의 발현을 위하여 상기 재조합 DNA를 사용하는데, 이는 종양 환경에서 DC의 생존성을 부여하고 DC의 성숙을 촉진하여 이것이 후속적으로 배출 림프절로 이동하게 한다. 이는 T 헬퍼 세포가 Th1형으로 분화되는 성향 및 또한 종양 항원과의 교차 프라이밍에 의한 종양-특이적 세포독성 T 세포의 활성화에 이르게 된다.
재조합 아데노바이러스 벡터로서 사용되는 재조합 DNA는 레오스위치(등록상표) 테라퓨틱 시스템 (RTS)의 제어 하에 인간 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자가 발현되게 한다. RTS는 인간 유비퀴틴 C 프로모터로부터 발현되는 2시스트론 메시지 (message)를 포함하며, 2가지 융합 단백질, Gal4-EcR 및 VP16-RXR을 코딩한다. Gal4-EcR은 효모 Gal4의 DNA 결합 도메인 (아미노산 1-147)과 곤충인 코리스토네우라 푸미페라나 (Choristoneura fumiferana) 유래의 엑디손 수용체의 DEF 도메인 사이의 융합물이다. 다른 실시 양태에서, RTS는 인간 유비퀴틴 C 프로모터로부터 발현되는 2시스트론 메시지로 이루어지며 2가지 융합 단백질, Gal4-EcR 및 VP16-RXR을 코딩한다. Gal4-EcR은 효모 Gal4의 DNA 결합 도메인 (아미노산 1-147)과 곤충인 코리스토네우라 푸미페라나 유래의 엑디손 수용체의 DEF 도메인 사이의 융합물이다. VP16-RXR은 HSV-VP16의 전사 활성화 도메인과, 인간 및 메뚜기 서열로부터 유래되는 키메라 RXR의 EF 도메인 사이의 융합물이다. 이들 Gal4-EcR 및 VP16-RXR 서열은 EMCV 유래의 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)에 의해 분리된다. 이들 두 융합 단백질은 Gal4-EcR이 소분자 약물 (RG-115932)에 결합할 때 이량체화되며, 6개의 Gal4-결합 부위 및 합성 최소 프로모터를 포함하는 Gal4-반응성 프로모터로부터의 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 전사를 활성화시킨다. 상기에 기술된 RTS 전사 단위는 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자 전사 단위의 하류에 위치한다. 이러한 전 RTS-hIL12-면역조절자 카세트를 E1 영역을 결실시킨 부위의 아데노바이러스 5 게놈 내로 포함시킨다. 아데노바이러스 골격에는 E3 유전자가 또한 결여되어 있다. 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hIL-12의 지도가 미국 특허 출원 공개 제2009/0123441 A1호의 도 8에 예시되어 있다.
본 연구에서 사용되는 재조합 아데노바이러스 벡터는 바이러스 벡터 서열에 더하여 하기의 예시적인 조절 요소를 포함한다: 인간 유비퀴틴 C 프로모터, EMCV로부터 유래되는 내부 리보좀 진입 부위, 6개 카피의 Gal4-결합 부위, 3개 카피의 SP-1 결합 부위, 및 합성 최소 프로모터 서열을 포함하는 유도성 프로모터, SV40 폴리아데닐화 부위, 및 인간 알파-글로빈 유전자로부터 유래되는 전사 종결 서열. 다른 조절 요소가 대안으로서 이용될 수 있음을 이해하여야 한다.
예시적인 재조합 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hIL-12-면역조절자(들)을 하기 방식으로 제조한다. EMCV-IRES (내부 리보좀 진입 부위)에 의해 분리된 수용체 융합 단백질, VP16-RXR 및 Gal4-EcR의 코딩 서열을 인간 유비퀴틴 C 프로모터 (항시적 프로모터)의 제어 하의 아데노바이러스 셔틀 벡터 내로 삽입한다. 후속적으로, IRES에 의해 분리된 hIL-12의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛의 코딩 서열과, 하나 이상의 다른 면역조절자의 코딩 서열을 유비퀴틴 C 프로모터 및 수용체 서열의 상류에 삽입되는 6개 카피의 Gal4-결합 부위를 포함하는 합성 유도성 프로모터의 제어 하에 둔다. 셔틀 벡터는 좌측 말단으로부터 지도 단위 16 (map unit 16, mu16)가지의 아데노바이러스 혈청형 5형 서열을 포함하는데, 이로부터 E1 서열을 결실시키고 RTS, IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자로 대체한다 (RTS-hIL-12). RTS-hIL-12-면역조절자(들)를 지닌 셔틀 벡터는 활성제 약물-의존성 IL-12 및 다른 면역조절자(들)의 발현을 위하여 HT-1080에서의 일시적 형질감염에 의해 시험한다. 그 후 셔틀 벡터를 HEK 293 세포 내로의 동시 형질감염에 의해 아데노바이러스 골격과 조합시켜 재조합 아데노바이러스 Ad-RTS-hIL-12-면역조절자(들)를 얻는다. 아데노바이러스 골격은 E3 유전자 및 게놈의 좌측 말단의 mu 0으로부터 mu 9.2까지의 서열 결실을 포함한다. 셔틀 벡터 및 아데노바이러스 골격은 mu 9.2로부터 mu 16까지의 중복 서열을 포함하는데, 상기 중복 서열은 이들 사이의 재조합 및 재조합 아데노바이러스 벡터의 생성을 허용한다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E3 영역이 결핍되어 있기 때문에, 이 바이러스는 정상적인 포유류 세포에서는 복제-결핍성이다. 그러나, 이 바이러스는 아데노바이러스-5 E1 영역을 보유하는 HEK 293 세포에서는 복제될 수 있고 따라서 E1 기능을 트랜스로 (in trans) 제공할 수 있다.
예시적인 재조합 아데노바이러스 벡터를 하기 방식으로 제조한다: 인간 IL12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 유도가능한 발현을 위한 DNA 요소를 지닌 선형화 셔틀 벡터, 및 아데노바이러스 골격을 HEK293 세포 내로 동시 형질감염시킨다. 셔틀 벡터와 바이러스 골격 상의 중복 서열들 사이의 재조합에 의해 재조합 아데노바이러스를 생성하고, 이를 HEK293 세포 내에서 바이러스 입자로 패키징시킨다. HEK293 세포를 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장시킨다.
제안된 연구에 사용되는 바이러스를 CsCl 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 재조합 아데노바이러스는 2라운드의 플라크 정제를 받으며, 생성된 시드 스톡 (seed stock)을 이용하여, 충분히 특성화된 주 세포 은행 (master cell bank)으로부터의 HEK293 세포 내에서 증폭시킴으로써 주 바이러스 은행 (master viral bank, MVB)을 생성한다. MVB는 광범위한 cGMP/GLP 방출 시험을 받는데, 이는 복제가능 아데노바이러스 (replication competent adenovirus, RCA), 살균성 (sterility), 마이코플라즈마 (mycoplasma), 우발성 바이러스, 레트로바이러스, 인간 바이러스 HIV 1/2, HTLV 1/2, HAV, HBV, HCV, EBV, B 19, CMV, HHV-6, 7 및 8, 소 및 돼지 바이러스, 전 벡터 서열결정 및 인간 세포주에서의 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 AD-유도 발현에 의한 기능 시험을 포함한다.
MVB로부터의 바이러스를 cGMP 설비에서 정제 바이러스의 생성에 사용할 수 있으며, 이는 다시 아이덴티티 (identity), RCA, 살균성, 마이코플라즈마, 우발성 바이러스, 바이러스 입자 대 감염 단위의 비, 숙주 세포 DNA의 오염, 내독소 및 단백질 및 인간 세포주에서의 IL-12 및 하나 이상의 면역조절자의 AD-유도 발현에 의한 기능 시험을 포함하는 방출 시험을 받을 수 있다.
레오스위치(등록상표) 테라퓨틱 시스템 (RTS)과 hIL-12 트랜스진 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 포함하는 아데노바이러스에 의한 자가유래 수지상 세포의 형질감염
인간 대상으로부터 유래된 수지상 세포를 엑스 비보에서 형질도입시키고 종양 내로 주사한다. DC는 바이러스 형질감염 전에 생육성, 순도 (전형적으로 DC 표현형을 나타내는 세포가 >80%임), 살균성, 마이코플라즈마 및 내독소에 대하여 특성화할 것이다. 바이러스 형질도입 후에, 상기 세포를 반복적으로 세척하여 임의의 비흡수 바이러스를 제거한다. 마지막 세척물로부터의 상청액을 PCR에 의해 잔류 바이러스 함량에 대하여 시험할 것이다. DC를 아데노바이러스 벡터 (비-통합 벡터)에 의해 엑스 비보에서 형질도입시키고 종양내 주사 및 후속적인 배출 림프절로의 이동 후 DC의 수명은 짧기 때문에, 상기 바이러스 DNA는 임의의 비-표적 세포 내로 포함될 것으로는 예상되지 않는다. DC의 아데노바이러스 형질도입에 사용한 프로토콜은 80-90% 형질도입율을 생성할 것으로 예상되며 이는 매우 효율적인 것으로 여겨진다.
백혈구 성분 채집술에 의한 PBMC 의 수확: 대상은 유피씨아이 아웃페이션트 (UPCI Outpatient)의 아페레시스 유닛 (Apheresis Unit)에서 표준적인 90 내지 120분간의 백혈구 성분 채집술을 받는다. 백혈구 성분 채집 절차는 하나의 팔에서 혈관으로부터 혈액을 채취하는 것; 원심분리기 (세포 분리기)에 혈액을 통과시키는 것 - 여기서, 혈액의 성분들이 분리되며 하나 이상의 성분이 제거됨 - ; 및 남아있는 성분들을 동일한 팔 또는 다른 팔의 대상 혈관에 반환하는 것을 포함한다. 세포 분리 장치를 통하여 혈액을 프로세싱할 때 임의의 한 시점에서 대상의 전체 혈액 부피 중 15% 이하를 채혈한다. 세포 분리기에서, 혈액을 혈장, 혈소판, 백혈구 세포 및 적혈구 세포로 분리한다. 백혈구 세포 (WBC)를 제거하고, 모든 다른 성분들을 대상의 순환계 내로 반환한다. 이 절차에 있어서 두 말초 정맥 주사선을 사용하려는 시도가 매번 이루어진다. 이것이 가능하지 않을 경우, 중심 정맥 주사선 (central line)이 필요할 수 있다. 대상은 백혈구 성분 채집술을 받도록 의사가 깨끗이 해야 하며, 상기 절차 이전에 생명 징후 (혈압을 포함함)에 대하여 일상적으로 스크리닝한다.
프로세싱: 수집 후, 류카팩 (leukapack)을 CPL로 수동으로 전달하고, 엘루트라TM (ELUTRA™)에서 원심분리에 의한 정화 (elutriation)에 의해 즉각적으로 프로세싱한다. 이는 임상 용도로 인가된 페쇄 시스템이다. 단구 분획을 회수하고, 세포의 회수 및 생존성을 확립한 후 세포를 IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 6일간의 배양을 위하여 아스트롬 (Aastrom) 카트리지로 옮긴다. 모든 프로세싱 및 세척 절차를 살균 조건 하에서 수행한다.
초기 도말: 단일 류카팩으로부터 회수한 단구를 트립판 블루 염료의 존재 하에 계수하여 생육성 세포의 개수를 결정한다. 단구를 유세포 분석법에 의해 순도에 대하여 평가한다. 단구를 SOP-CPL-0166 당 1,000 IU/mL의 IL-4 및 1,000 IU/mL의 GM-CSF를 함유하는 무혈청, 무항생제 셀제닉스 (CellGenix) 배지 중에 5 내지 10 x 106개의 세포/mL로 재현탁하고, 아스트롬 카트리지 내에 넣는다. 50 ml의 최소 로딩 부피 및 최소 세포 개수가 카세트 접종에 요구된다.
배양: 미성숙 DC 생성을 위한, 완전 페쇄형의 cGMP-상용성 자동 배양 장치인 레플리셀 시스템 (Replicell System) 내의 인큐베이터 내에 아스트롬 카트리지를 넣는다.
미성숙 DC 의 수확: 6일째에, 아스트롬 카트리지를 인큐베이터로부터 꺼내고, 미성숙 DC를 수확한다. 이 세포를 1,500 rpm에서의 원심분리에 의해 회수하고, 셀제닉스 배지에서 세척하고, 트립판 블루 염료의 존재 하에 계수하고, 형태적 특징 및 표현형적 특징에 대하여 조사한다.
생육성: 이것은 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에 의한 세포 계수를 수행함으로써 결정한다. 일반적으로, 수확된 세포의 >95%가 생육가능하며, 즉, 트립판 블루 염류가 배제된다. 생육성이 70% 미만일 경우, 미성숙 DC는 버린다.
표현형 결정: 배양에서 생성된 세포를 혈구계에서의 현미경 관찰에 의해 계수하고, 트립판 블루 염료를 이용하여 예비 감별 계수치 (DC 대 림프구)를 얻는다. DC 대 림프구를 게이팅 온 (gating on)하고 미성숙 DC의 높은 전방 및 측방 산란 특성을 그의 확인을 위한 기준으로서 이용하여 감별 계수치의 확인을 한다. 미성숙 DC는 일상적으로 수지상 세포 형태를 갖는 >80%의 세포를 포함하며 DC 표현형을 갖는다.
IL -12 p70 효력의 분석: 성숙 DC (mDC)는 고유한 면역성 시그널 (예를 들어, LPS)을 첨가하거나 첨가하지 않고서 CD40L의 활성화시에 또는 자발적으로 IL-12p70을 생산하는 능력을 갖는다. 표준화된 IL-12p70 생성 분석법은 최근에 확립되었으며, 다양한 조건 하에 생성된 DC 백신의 적은 샘플 또는 많은 로트에 응용가능하다. 현재의 효력 분석법은 독특한 두 단계로 이루어지는데, 제1 단계는 자극자로서 인간 CD40 리간드 유전자로 안정하게 형질감염된 J588 림프종 세포와 함께 반응 DC (responder DC)를 공동 인큐베이션하는 것을 포함한다. 제2 단계는 루미넥스 시스템에서 J558/CD40L +/- LPS로 자극한 DC에 의해 분비되는 IL-12p70의 수준에 대하여 이들 공동 배양물 유래의 상청액을 시험하는 것을 포함한다. 이 효력 분석법은 18.5% (n=30)의 분석간 변동 계수 (inter-assay CV) 및 광범위한 동적 범위를 가지며, 이는 대단히 상이한 수준의 IL-12p70 생성을 특징으로 하는 ㄷ다당다야양한 DC 생성물의 평가를 용이하게 한다. 13명의 정상적인 공여자의 단구로부터 생성된 DC 생성물을 이용하여 확립한 분석법에 있어서의 정상적인 범위는 8-999 pg/mL이었으며, 이때 평균은 270 pg/mL이었다.
수지상 세포에 있어서의 생성 및 방출
시험관 내에서 생성된 수지상 세포의 각각의 로트를 내독소뿐만 아니라 미생물 오염물 (호기성 및 혐기성 박테리아, 진균류 및 마이코플라즈마)의 존재에 대해서도 시험하고 표현형 및 기능 면에서 특성화한다. 대상에게 주사될 모든 수지상 세포는 신선하며, 냉동 보존을 겪지 않는다.
DC 의 품질 보증 시험: 상기에 기술된 바와 같이 생성한 DC를 살균성, 생육성, 순도, 효력 및 안정성에 대하여 평가한다. 세포 생성물의 방출에 대한 기준을 확립하고 이를 엄격하게 따른다.
생육성: 배양에서 생성된 세포를 혈구계에서의 현미경적 관찰에 의해 계수하고, 트립판 블루 염료를 이용하여 감별 계수치 (DC 대 림프구)를 얻는다. 이 계수치는 시험 배양물 중 생육성 세포의 백분율을 제공한다. 트립판 블루에 의한 배제 의해 세포 생육성이 70% 초과이고 단구-유래 DC 마커로서 HLA-DR 및 CD86을 발현하는 세포가 최소 70%인 것이 방출 기준의 통과에 요구된다. 추가의 마커, 예를 들어 DC 성숙 상태를 평가하기 위한 CD83 및 CCR7 및 림프구 오염을 평가하기 위한 CD3 및 CD19를 탐색적 분석을 위하여 포함시킬 수 있다.
순도: FITC- 및 PE-콘쥬게이션된 mAb로 염색된 세포의 2색 (two-color) 유세포 분석법을 이용하여 형태적으로 확인된 DC 집단이 DC에 있어서 정의된 표면 항원을 발현하며 단구 및 T 및 B 세포 계열 항원이 결여됨을 결정한다. 백신 제조에 있어서, 생성된 DC는 HLA-DR 및 CD86을 발현하여야 하며, CD3, CD19 또는 CD14는 발현하지 않아야 한다. mDC인 것으로 여겨지기 위해서는 세포는 CD83+ 및 CCR7+을 발현하여야 한다.
효력: DC에 있어서의 효력 측정치를 한정하기 위하여, 본 출원인은 상기에 기술된 바와 같이 DC가 IL-12p70을 생성하는 능력을 결정한다.
살균성: 유니버시티 오브 피츠버그 (University of Pittsburgh) 의료 센터 미생물학 실험실에서 비디 박텍 시스템 (BD Bactec system) (미국 메릴랜드주 스팍스 소재의 디킨슨 컴퍼니 (Dickinson Co.))을 이용하여 박테리아 (호기성 및 혐기성) 및 진균류 배양에 의해 DC를 시험한다. 미생물 배양의 최종 결과는 14일 후에 ㅇT수가능하다. 백신 용도의 DC의 방출 이전에, 그람 염색을 수행하며, 이는 미생물의 존재에 대하여 음성이어야 한다.
IMCPL은 핵산 혼성화 기술을 기반으로 하는 젠-프로브 마이크로플라즈마 티슈 컬쳐 래피드 디텍션 시스템 (Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture Rapid Detection System) (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 젠-프로브, 인크.(Gen-Probe, Inc.))의 이용에 의해 마이코플라즈마에 대하여 시험한다. 리물루스 아뫼보사이트 라이세이트 파이로젠 플러스 (Limulus Amoebocyte Lysate Pyrogen Plus) 분석 (미국 메릴랜드주 워커빌 소재의 바이오 위트테이커, 인크. (Bio Whittaker, Inc.))을 이용하여 내독소 시험을 수행한다. 내독소 시험은 최종 생성물의 수확시에 그리고 최종 생성물의 방출 이전에 세포 배양물에서 수행한다. 허용가능한 내독소 수준은 체중 1 kg 당 <5 EU이다. 비형질도입 및 형질도입 수지상 세포를 추가의 분석을 위하여 냉동 보관한다.
모든 형질도입 세포는 트랜스진을 발현할 것으로 예상된다. 80% 초과의 DC가 형질도입될 것으로 예상된다. 천연 코딩 서열이 트랜스진 내에서 유지되기 때문에 생성물은 생물학적 활성을 갖는다. 종양 내로 주사된 바이러스-형질도입된 DC는미성숙 DC 표현형의 것이며, DC가 성숙을 겪게 될 때까지는 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하지 않으며, 따라서, 이 단계에서 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현은 대부분 트랜스진으로부터의 것이다. IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 트랜스진의 발현은 용량-의존적 방식으로 소분자 활성제 약물 RG-115932에 의해 유도되기 때문에, 형질도입된 DC에서의 트랜스진의 발현 수준을 원하는 수준으로 제어할 수 있다. 인간 대상에게의 투여용으로 제조된 형질도입된 DC의 작은 부분을 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현의 활성제 약물-의존성 유도에 대하여 시험관 내에서 시험할 수 있다. IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현을 4 ng/ml의 민감성으로 ELISA에 의해 분석할 수 있다.
제안된 연구에서 사용된 벡터에 의해 형질도입된 세포로부터의 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 시험관 내 유도는 ELISA로 결정할 때 24시간 후에 106개의 세포 당 약 500 ng의 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 생성할 것으로 예상된다. 생쥐 흑색종 모델을 이용한 전임상 연구에서, 106개 이상의 형질도입된 DC의 종양내 주사가 효능을 나타낸다. 그러나, 요구되는 종양내 주사는 이 양 미만의 수준에서 효능을 나타낼 수 있으며 따라서 5 x 107개의 형질도입된 DC의 주사는 더 적거나 더 많은 양이 필요한지를 결정하기 위한 출발 시점으로서 이용될 수 있을 것으로 예상된다.
예를 들어, 시험관 내에서, IL12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 유전자를 지니는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 인간 및 생쥐 세포주 및 일차 수지 세포는 용량 의존적 방식으로 활성제 약물에 반응하는 IL12 발현 유도를 나타낸다.
6.3. 활성제 약물의 제형화
본 명세서에서 사용되는 활성제 약물을 하기 제형들 중 임의의 하나로 제형화한다:
(1) 100% 라브라졸 (Labrasol);
(2) (a) 멘톨, (b) 티몰, (c) 유칼립톨, (d) 아스파탐, (e) 소듐 사카린, (f) 시트르산, (g) 페퍼민트 맛, (h) 크림 맛, (i) 라브라졸을 함유하는 리스테린 착향 라브라졸 (Listerine flavored Labrasol) (미국 소재의 래티튜드 파마슈티칼스 인크. (Latitude Pharmaceuticals Inc.);
(3) 미글리올 (Miglyol) 812 및 포스포리폰 (phospholipon) 9OG (미국 소재의 래티튜드 파마슈티칼스 인크.); 또는
(4) 미글리올 812, 포스포리폰 9OG 및 비타민 E 토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시네이트 (미국 소재의 래티튜드 파마슈티칼스 인크.).
전달
다양한 농도 및 특정 프로토콜을 생각할 수 있지만, 환자를 치료하는 한 가지 예는 경구 활성제 약물 (RG-115932)과 조합된, RTS의 제어 하의 hIL-12 (인간 인터루킨 12) 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하도록 조작하고 살균 염수 중에 현탁시킨 5 x 107개의 농도의 형질도입된 자가유래 수지상 세포 (AdDC)의 종양내 주사(들)를 받는 환자를 포함한다.
초기 처리
1일에서의 입원 방문: 1일에, 기초 신체 검사 (생명 징후, 체중, 및 ECOG 상태를 포함함)를 수행한다. 소변을 수집하고, 기초 혈청 화학 검사, 소변 검사 및 혈액 검사 (안전성 프로파일)를 위하여 혈액을 채취한다. 시험관 내 조작 수지상 세포를 종양내 주사하기 대략 3시간 전에, 각각의 대상에게 식사 직후 활성제 약물을 투약한다 (코호트 1 - 0.01 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, 및 3 mg/kg). 1일에 활성자 약물 및 그의 주요 대사 산물의 단일 용량의 약동학적 특성의 평가를 위하여 명시된 시간 간격으로 (사전 투약, AD를 투약한지 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 및 24시간 후) 혈액을 채취한다. 각각의 대상은 RTS의 제어 하에 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하도록 조작된, 5 x 107개의 세포의 농도의 아데노바이러스 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 1회 종양내 주사를 받는다. 대상을 국소 주사 부위 반응 및/또는 과민 반응에 대하여 주의깊게 모니터링한다. 2일 내지 14일에서의 입원 방문: 2일 내지 14일에, 각각의 대상에게 식사 직후 활성자 약물을 투약한다. 생명 징후 및 이상 반응을 2일 내지 14일에 매일 수집한다. 4일 ± 24시간에, hIL-12 및 세포 면역 반응의 측정을 위하여 종양 및/또는 배출 림프절의 생검체를 대략 50%의 대상으로부터 제거한다. 8일에 체중을 측정한다. 8일 ± 24시간에, hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자 및 세포 면역 반응을 측정을 위하여 4일에 생검을 수행하지 않은 대상으로부터 종양 및/또는 배출 림프절의 생검체를 제거한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응의 분석을 위하여 4일 ± 24시간 및 8일 ± 24시간에 혈액을 채취한다. 또한 혈청 사이토카인 프로파일을 얻어서 다른 사이토카인의 발현이 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 트랜스진을 이용한 처리에 의해 영향을 받는지를 결정한다. 8일에 기초 혈청 화학 검사, 소변 분석 및 혈액 검사 (안전성 프로파일)를 위하여 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 활성제 약물 및 그의 주요 대사 산물의 정상 상태에서의 약동학적 특성/ADME의 평가를 위하여 8일에 명시된 시간 간격으로 (사전투약, AD 투약한지 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 및 24시간 후) 혈액을 채취한다.
14일에서의 입원 방문: 14일에, 각각의 대상에게 식사 직후 활성제 약물을 투약한다. 각각의 대상은 신체 검사 (생명 징후, 키, 체중 및 ECOG 상태를 포함함)를 받는다. 혈청 화학 검사, 소변 검사 및 혈액 검사 (안전성 프로파일)를 위하여 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응의 분석을 위하여 14일 ± 24시간에 혈액을 채취한다. 또한 혈청 사이토카인 프로파일을 얻어서 다른 사이토카인의 발현이 영향을 받는지를 결정한다.
명시된 입원 및 외래 방문에서 혈액을 대상으로부터 수집하여 아데노바이러스 및 RTS의 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응을 측정한다. 기초 혈청 사이토카인 프로파일을 위하여 혈액을 얻는다. AdVeGFP 감염성 차단 유형 분석을 이용하여 아데노바이러스 벡터에 대한 항체 반응을 검출한다 (Gambotto, Robins et al. 2004). RTS 구성요소에 대한 항체 반응을 환자 유래의 혈청 및 발현 벡터로부터 생성된 RTS를 이용하여 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA에 의해 평가한다. 게다가, IL-12, IFN-감마, IP-IO, 및 다른 Thl/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNF-알파, IL-4, IL-5, 및 IL-10에 대하여 루미넥스에 의해 혈청에서 복합적인 사이토카인 시험을 행한다. 이들 항체 및 사이토카인 분석은 약 10 ml의 혈액을 필요로 한다.
아데노바이러스 및/또는 RTS의 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응: 혈액을 명시된 입원 및 외래 방분시에 대상으로부터 수집하여 아데노바이러스 및 RTS의 구성요소와 종양 항원에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응을 평가한다. AdVeGFP 감염성 차단형의 분석을 이용하여 아데노바이러스 벡터에 대한 항체 반응을 검출한다 (Nwanegbo, et al. 2004). 대상 유래의 혈청 및 발현 벡터로부터 생성된 RTS 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA에 의해 RTS 구성요소에 대한 항체 반응을 평가한다. 게다가, IL-12, IFN-감마, IP-1O, 및 다른 Thl/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNFα, IL-4, IL-5, 및 IL-10에 대하여 루미넥스에 의해 혈청에서 복합적인 사이토카인 시험을 행한다. 이들 항체 및 사이토카인 분석은 약 10 ml의 혈액을 필요로 한다.
세포 면역 반응 분석에서는 약 50-60 ml의 혈액을 이용하며, CD4 및 CD8 T 세포 하위세트를 그로부터 분리한다. AdV-유래 항원 및 RTS-유래 항원 - 만약에 있다면 - 에 의해 활성화되는 T 세포에 의한 IFN-감마 생성에 대한 ELISPOT 분석에서, 상기 분리한 T 세포를 AdV 공벡터 (empty AdV vector), AdV-RTS, 또는 AdV-RTS-hIL12-면역조절자(들) 벡터로 형질도입된 자가유래 DC와 혼합한다. 공유되는 흑색종 항원을 발현하는 DC 및/또는 그러한 종양 세포를 이용하여 유사한 분석을 수행하여 종양에 대한 초기 면역 반응을 평가한다. 필요할 경우 추가의 분석을 또한 수행할 수 있다.
임신 검사: 임신 가능성이 있는 여성은 스크리닝 방문시에 그리고 재치료 시기의 첫 번째 입원 방문 전에 소변 임신 검사를 시행한다. 이 검사는 초기 치료 기간 및 모든 재치료 기간 둘 모두 동안 활성제 약물을 투여하기 적어도 72시간 전, 48시간 전, 24시간 전 또는 12시간 전에 수행한다. 소변 임신 검사가 양성이라면, 혈청 임신 검사에 의해 확인을 한다. 임신이 확인될 경우, 대상을 임상 시험에 들어가지 못하게 하거나 재치료기를 계속하지 못하도록 한다. 임신 검사는 필요한 만큼 많은 횟수로 재수행할 수 있다.
수반되는 의약에 관한 조사: 스크리닝할 때, 그리고 재치료기의 첫 번째 입원 방문 전에, 동반되는 의약의 목록을 제공하도록 각각의 대상에게 요청하여 임상 시험 및 추적 시기 동안 일어나는 이상 반응에 대한 임의의 가능한 관계를 결정한다.
재치료 기준: 대상이 불리한 반응 - 이는 제한하는 것임 - 이 없이 AdDC 접종 이전에 겨닌다면 그리고 잠재적인 재치료시에 질환 또는 증상 감퇴의 진행이 전혀 없는 것으로 보이면, 이들은 재치료에 대하여 고려된다. 주요 연구자, 및 치료 의사의 의견상, 14 연속일 동안 활성제 약물 (코호트 1로부터의 최대 허용 용량)과 조합된 AdDC의 추가적인 종양내 주사(들)에 대하여 잠재적인 임상 이득이 있으면, 하기 기준을 충족할 경우 재치료를 대상에게 제공한다:
1. 제한 독성이 전혀 없었음,
2. 대상의 질환은 안정적이거나 임상적 또는 주관적 개선 징후를 나타냄, 및
3. 레오스위치(등록상표) 테라퓨틱 시스템의 아데노바이러스 구성요소에 대한 항체 또는 세포 면역 반응의 증거가 전혀 없음.
트랜스진 기능 및 면역학적 효과의 평가: hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 트랜스진 발현, 및 세포 면역 반응의 생체 내 평가를 위하여, 스크리닝 동안 (-12일 내지 -7일), 임상 시험의 4일, 8일 및 14일째, 및 추적한지 1개월에 종양 및 결부된 배출 림프절의 펀치 또는 절제 생검체를 수집한다. hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 트랜스진 발현, 및 세포 면역 반응의 생체 내 평가를 위하여 -12일 내지 -7일에 그리고 재치료 기간 중 14일에 종양 및 결부된 배출 림프절의 미세 니들 흡인 생검체를 수집한다. 생검체를 표준 광학 현미경 검사법 및 면역조직화학적 방법에 의해 평가하여 종양 및 배출 림프절 내로의 T 세포의 세포 침윤을 평가한다. 생검체 조각을 연구 대상 배경을 모르는 병리학자가 판독한다. 종양 및 배출 림프절에 의한 유도된 IL-12 발현과 내인성 IL-12 발현을 구별하기 위하여, 적절하게 디자인된 프라이머를 이용하여 RNA에 대한 RT-PCR을 사용한다. 스크리닝시에, 임상 시험 4일, 8일 및 14일째에, 추적 1개월째에 그리고 재치료 기간 중 -12일 내지 -7일, 8일 및 14일 째에 혈청 사이토카인 프로파일을 위하여 혈액을 채취한다 (표 3a 내지 표 3g 내지 표 5). 혈청 사이토카인 프로파일을 얻어서 다른 사이토카인의 발현이 hIL-12 트랜스진을 이용한 치료에 의해 영향을 받는지를 결정한다. 복합적인 사이토카인 검사를 IL-12, IFN-감마, IP-1O, 및 다른 Thl/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNFa, IL-4, IL-5 및 IL-1O에 대하여 루미넥스에 의해 혈청에서 행한다. 이들 항체 및 사이토카인 분석은 약 10 ml의 혈액을 필요로 한다.
활성제 약물의 단회 투약 및 정상 상태 약동학" 단회 투약시의 약동학적 특성의 평가를 위하여 임상 시험 1일째에 그리고 활성제 약물 및 그의 주요 대사 산물의 정상 상태 약동학/ADME의 측정을 위하여 임상 시험 8일째에 명시된 시간 간격으로 (사전투약, 아침 투약을 한지 0.5시간 후, 1시간 후, 1.5시간 후, 2시간 후, 4시간 후, 6시간 후, 8시간 후, 12시간 후, 16시간 후 및 24시간 후) 혈액을 채취한다. 활성제 약물 및 주요 대사 산물의 하기의 정상 상태 약동학 종점을 얻기 위하여 HPLC로 혈장을 평가한다: Cmax (관찰된 최대 혈장 농도), Tmax (관찰된 최대 혈장 농도까지의 시간), Ctrough (0시간 및 24시간에서의 농도들의 평균으로서 계산된 관찰된 최소 혈장 농도), C24h (24시간에서의 혈장 농도), AUC24h (0시간으로부터 24시간까지의 혈장 농도-시간 곡선 하의 면적), Ke (겉보기 제거 속도), 및 T112 (겉보기 반감기).
전술한 실시 양태 및 실례는 어떠한 점에서도 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것이 아니며 본 명세서에 제시된 특허청구범위는 본 명세서에 명백하게 제시되든 제시되지 않든 모든 실시 양태 및 실례를 포함하고자 하는 것으로 이해되어야 한다.
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aac 480 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 acc agc tga 489 Thr Ser <210> 20 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 21 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 tcc act gat att tta aag gac cag aaa gaa ccc aaa aat aag acc ttt 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 cta aga tgc gag gcc aag aat tat tct gga cgt ttc acc tgc tgg tgg 432 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 ctg acg aca atc agt act gat ttg aca ttc agt gtc aaa agc agc aga 480 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 ggc tct tct gac ccc caa ggg gtg acg tgc gga gct gct aca ctc tct 528 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 gca gag aga gtc aga ggg gac aac aag gag tat gag tac tca gtg gag 576 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 tgc cag gag gac agt gcc tgc cca gct gct gag gag agt ctg ccc att 624 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 gag gtc atg gtg gat gcc gtt cac aag ctc aag tat gaa aac tac acc 672 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 agc agc ttc ttc atc agg gac atc atc aaa cct gac cca ccc aag aac 720 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 ttg cag ctg aag cca tta aag aat tct cgg cag gtg gag gtc agc tgg 768 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 gag tac cct gac acc tgg agt act cca cat tcc tac ttc tcc ctg aca 816 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 ttc tgc gtt cag gtc cag ggc aag agc aag aga gaa aag aaa gat aga 864 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 gtc ttc acg gac aag acc tca gcc acg gtc atc tgc cgc aaa aat gcc 912 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 agc att agc gtg cgg gcc cag gac cgc tac tat agc tca tct tgg agc 960 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 gaa tgg gca tct gtg ccc tgc agt tag 987 Glu Trp Ala Ser Val 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Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325 <210> 23 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hIL-12, p35 <220> <221> CDS <222> (1)..(657) <400> 23 atg ggt cca gcg cgc agc ctc ctc ctt gtg gct acc ctg gtc ctc ctg 48 Met Gly Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 gac cac ctc agt ttg gcc aga aac ctc ccc gtg gcc act cca gac cca 96 Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro 20 25 30 gga atg ttc cca tgc ctt cac cac tcc caa aac ctg ctg agg gcc gtc 144 Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val 35 40 45 agc aac atg ctc cag aag gcc aga caa act cta gaa ttt tac cct tgc 192 Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys 50 55 60 act tct gaa gag att gat cat gaa gat atc aca aaa gat aaa acc agc 240 Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser 65 70 75 80 aca gtg gag gcc tgt tta cca ttg gaa tta acc aag aat gag agt tgc 288 Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys 85 90 95 cta aat tcc aga gag acc tct ttc ata act aat ggg agt tgc ctg gcc 336 Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala 100 105 110 tcc aga aag acc tct ttt atg atg gcc ctg tgc ctt agt agt att tat 384 Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr 115 120 125 gaa gac ttg aag atg tac cag gtg gag ttc aag acc atg aat gca aag 432 Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys 130 135 140 ctt ctg atg gat cct aag agg cag atc ttt cta gat caa aac atg ctg 480 Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu 145 150 155 160 gca gtt att gat gag ctg atg cag gcc ctg aat ttc aac agt gag act 528 Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr 165 170 175 gtg cca caa aaa tcc tcc ctt gaa gaa ccg gat ttt tat aaa act aaa 576 Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys 180 185 190 atc aag ctc tgc ata ctt ctt cat gct ttc aga att cgg gca gtg act 624 Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr 195 200 205 att gat aga gtg atg agc tat ctg aat gct tcc taa 660 Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 210 215 <210> 24 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 24 Met Gly Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro 20 25 30 Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg 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tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt 480 gtgaatcgat agtactaaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag 540 caaaataggc tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac atttctctat cgataatgca 600 ggtcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact gtcctccgag 660 cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg 720 agactcttcg aaggaagagg ggcggggtcg atcgaccccg cccctcttcc ttcgaaggaa 780 gaggggcggg gtcgaagacc tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgagct 840 catcttcctg tagatcacgc gtgccaccat gggtcaccag cagttggtca tctcttggtt 900 ttccctggtt tttctggcat ctcccctcgt ggccatatgg gaactgaaga aagatgttta 960 tgtcgtagaa ttggattggt atccggatgc ccctggagaa atggtggtcc tcacctgtga 1020 cacccctgaa gaagatggta tcacctggac cttggaccag agcagtgagg tcttaggctc 1080 tggcaaaacc ctgaccatcc aagtcaaaga gtttggagat gctggccagt acacctgtca 1140 caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct cctgctgctt cacaaaaagg aagatggaat 1200 ttggtccact gatattttaa aggaccagaa agaacccaaa aataagacct ttctaagatg 1260 cgaggccaag aattattctg gacgtttcac ctgctggtgg ctgacgacaa tcagtactga 1320 tttgacattc agtgtcaaaa gcagcagagg ctcttctgac ccccaagggg tgacgtgcgg 1380 agctgctaca ctctctgcag agagagtcag aggggacaac aaggagtatg agtactcagt 1440 ggagtgccag gaggacagtg cctgcccagc tgctgaggag agtctgccca ttgaggtcat 1500 ggtggatgcc gttcacaagc tcaagtatga aaactacacc agcagcttct tcatcaggga 1560 catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt gcagctgaag ccattaaaga attctcggca 1620 ggtggaggtc agctgggagt accctgacac ctggagtact ccacattcct acttctccct 1680 gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag caagagagaa aagaaagata gagtcttcac 1740 ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg caaaaatgcc agcattagcg tgcgggccca 1800 ggaccgctac tatagctcat cttggagcga atgggcatct gtgccctgca gttaggttgg 1860 gcgagctcga attcattgat cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc tcgggatccg 1920 aattccgccc cccccccccc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag 1980 gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga 2040 gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg 2100 ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt 2160 gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca 2220 ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc 2280 agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat 2340 tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc 2400 ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga 2460 accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac aaccatgggt 2520 ccagcgcgca gcctcctcct tgtggctacc ctggtcctcc tggaccacct cagtttggcc 2580 agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa 2640 aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac 2700 ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg 2760 gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc 2820 tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg 2880 tgccttagta gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 2940 gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag 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ttgggtcaat atgtaatttt 3840 cagtgttaga ctagtaaatt gtccgctaaa ttctggccgt ttttggcttt tttgttagac 3900 gagctagcgc cgccaccatg ggccctaaaa agaagcgtaa agtcgccccc ccgaccgatg 3960 tcagcctggg ggacgagctc cacttagacg gcgaggacgt ggcgatggcg catgccgacg 4020 cgctagacga tttcgatctg gacatgttgg gggacgggga ttccccgggt ccgggattta 4080 ccccccacga ctccgccccc tacggcgctc tggatatggc cgacttcgag tttgagcaga 4140 tgtttaccga tgcccttgga attgacgagt acggtgggga attcgagatg cctgtggaca 4200 ggatcctgga ggcagagctt gctgtggaac agaagagtga ccagggcgtt gagggtcctg 4260 ggggaaccgg gggtagcggc agcagcccaa atgaccctgt gactaacatc tgtcaggcag 4320 ctgacaaaca gctattcacg cttgttgagt gggcgaagag gatcccacac ttttcctcct 4380 tgcctctgga tgatcaggtc atattgctgc gggcaggctg gaatgaactc ctcattgcct 4440 ccttttcaca ccgatccatt gatgttcgag atggcatcct ccttgccaca ggtcttcacg 4500 tgcaccgcaa ctcagcccat tcagcaggag taggagccat ctttgatcgg gtgctgacag 4560 agctagtgtc caaaatgcgt gacatgagga tggacaagac agagcttggc tgcctgaggg 4620 caatcattct gtttaatcca gaggtgaggg gtttgaaatc 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accagccaca aatgggactt gcggctggag ctgcccaaga 31320 ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc gggaccccac atgatatccc gggtcaacgg 31380 aatacgcgcc caccgaaacc gaattctcct ggaacaggcg gctattacca ccacacctcg 31440 taataacctt aatccccgta gttggcccgc tgccctggtg taccaggaaa gtcccgctcc 31500 caccactgtg gtacttccca gagacgccca ggccgaagtt cagatgacta actcaggggc 31560 gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt gcggtcgccc gggcagggta taactcacct 31620 gacaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa cgacgagtcg gtgagctcct cgcttggtct 31680 ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg cgccggccgc tcttcattca cgcctcgtca 31740 ggcaatccta actctgcaga cctcgtcctc tgagccgcgc tctggaggca ttggaactct 31800 gcaatttatt gaggagtttg tgccatcggt ctactttaac cccttctcgg gacctcccgg 31860 ccactatccg gatcaattta ttcctaactt tgacgcggta aaggactcgg cggacggcta 31920 cgactgaatg ttaagtggag aggcagagca actgcgcctg aaacacctgg tccactgtcg 31980 ccgccacaag tgctttgccc gcgactccgg tgagttttgc tactttgaat tgcccgagga 32040 tcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg gcttaccgcc cagggagagc ttgcccgtag 32100 cctgattcgg gagtttaccc agcgccccct gctagttgag cgggacaggg gaccctgtgt 32160 tctcactgtg atttgcaact gtcctaaccc tggattacat caagatctta ttccctttaa 32220 ctaataaaaa aaaataataa agcatcactt acttaaaatc agttagcaaa tttctgtcca 32280 gtttattcag cagcacctcc ttgccctcct cccagctctg gtattgcagc ttcctcctgg 32340 ctgcaaactt tctccacaat ctaaatggaa tgtcagtttc ctcctgttcc tgtccatccg 32400 cacccactat cttcatgttg ttgcagatga agcgcgcaag accgtctgaa gataccttca 32460 accccgtgta tccatatgac acggaaaccg gtcctccaac tgtgcctttt cttactcctc 32520 cctttgtatc ccccaatggg tttcaagaga gtccccctgg ggtactctct ttgcgcctat 32580 ccgaacctct agttacctcc aatggcatgc ttgcgctcaa aatgggcaac ggcctctctc 32640 tggacgaggc cggcaacctt acctcccaaa atgtaaccac tgtgagccca cctctcaaaa 32700 aaaccaagtc aaacataaac ctggaaatat ctgcacccct cacagttacc tcagaagccc 32760 taactgtggc tgccgccgca cctctaatgg tcgcgggcaa cacactcacc atgcaatcac 32820 aggccccgct aaccgtgcac gactccaaac ttagcattgc cacccaagga cccctcacag 32880 tgtcagaagg aaagctagcc ctgcaaacat caggccccct caccaccacc gatagcagta 32940 cccttactat cactgcctca ccccctctaa ctactgccac tggtagcttg ggcattgact 33000 tgaaagagcc catttataca caaaatggaa aactaggact aaagtacggg gctcctttgc 33060 atgtaacaga cgacctaaac actttgaccg tagcaactgg tccaggtgtg actattaata 33120 atacttcctt gcaaactaaa gttactggag ccttgggttt tgattcacaa ggcaatatgc 33180 aacttaatgt agcaggagga ctaaggattg attctcaaaa cagacgcctt atacttgatg 33240 ttagttatcc gtttgatgct caaaaccaac taaatctaag actaggacag ggccctcttt 33300 ttataaactc agcccacaac ttggatatta actacaacaa aggcctttac ttgtttacag 33360 cttcaaacaa ttccaaaaag cttgaggtta acctaagcac tgccaagggg ttgatgtttg 33420 acgctacagc catagccatt aatgcaggag atgggcttga atttggttca cctaatgcac 33480 caaacacaaa tcccctcaaa acaaaaattg gccatggcct agaatttgat tcaaacaagg 33540 ctatggttcc taaactagga actggcctta gttttgacag cacaggtgcc attacagtag 33600 gaaacaaaaa taatgataag ctaactttgt ggaccacacc agctccatct cctaactgta 33660 gactaaatgc agagaaagat gctaaactca ctttggtctt aacaaaatgt ggcagtcaaa 33720 tacttgctac agtttcagtt ttggctgtta aaggcagttt ggctccaata tctggaacag 33780 ttcaaagtgc tcatcttatt ataagatttg acgaaaatgg agtgctacta aacaattcct 33840 tcctggaccc agaatattgg aactttagaa atggagatct tactgaaggc acagcctata 33900 caaacgctgt tggatttatg cctaacctat cagcttatcc aaaatctcac ggtaaaactg 33960 ccaaaagtaa cattgtcagt caagtttact taaacggaga caaaactaaa cctgtaacac 34020 taaccattac actaaacggt acacaggaaa caggagacac aactccaagt gcatactcta 34080 tgtcattttc atgggactgg tctggccaca actacattaa tgaaatattt gccacatcct 34140 cttacacttt ttcatacatt gcccaagaat aaagaatcgt ttgtgttatg tttcaacgtg 34200 tttatttttc aattgcagaa aatttcaagt catttttcat tcagtagtat agccccacca 34260 ccacatagct tatacagatc accgtacctt aatcaaactc acagaaccct agtattcaac 34320 ctgccacctc cctcccaaca cacagagtac acagtccttt ctccccggct ggccttaaaa 34380 agcatcatat catgggtaac agacatattc ttaggtgtta tattccacac ggtttcctgt 34440 cgagccaaac gctcatcagt gatattaata aactccccgg gcagctcact taagttcatg 34500 tcgctgtcca gctgctgagc cacaggctgc tgtccaactt gcggttgctt aacgggcggc 34560 gaaggagaag tccacgccta catgggggta gagtcataat cgtgcatcag gatagggcgg 34620 tggtgctgca gcagcgcgcg aataaactgc tgccgccgcc gctccgtcct gcaggaatac 34680 aacatggcag tggtctcctc agcgatgatt cgcaccgccc gcagcataag gcgccttgtc 34740 ctccgggcac agcagcgcac cctgatctca cttaaatcag cacagtaact gcagcacagc 34800 accacaatat tgttcaaaat cccacagtgc aaggcgctgt atccaaagct catggcgggg 34860 accacagaac ccacgtggcc atcataccac aagcgcaggt agattaagtg gcgacccctc 34920 ataaacacgc tggacataaa cattacctct tttggcatgt tgtaattcac cacctcccgg 34980 taccatataa acctctgatt aaacatggcg ccatccacca ccatcctaaa ccagctggcc 35040 aaaacctgcc cgccggctat acactgcagg gaaccgggac tggaacaatg acagtggaga 35100 gcccaggact cgtaaccatg gatcatcatg ctcgtcatga tatcaatgtt ggcacaacac 35160 aggcacacgt gcatacactt cctcaggatt acaagctcct cccgcgttag aaccatatcc 35220 cagggaacaa cccattcctg aatcagcgta aatcccacac tgcagggaag acctcgcacg 35280 taactcacgt tgtgcattgt caaagtgtta cattcgggca gcagcggatg atcctccagt 35340 atggtagcgc gggtttctgt ctcaaaagga ggtagacgat ccctactgta cggagtgcgc 35400 cgagacaacc gagatcgtgt tggtcgtagt gtcatgccaa atggaacgcc ggacgtagtc 35460 atatttcctg aagcaaaacc aggtgcgggc gtgacaaaca gatctgcgtc tccggtctcg 35520 ccgcttagat cgctctgtgt agtagttgta gtatatccac tctctcaaag catccaggcg 35580 ccccctggct tcgggttcta tgtaaactcc ttcatgcgcc gctgccctga taacatccac 35640 caccgcagaa taagccacac ccagccaacc tacacattcg ttctgcgagt cacacacggg 35700 aggagcggga agagctggaa gaaccatgtt ttttttttta ttccaaaaga ttatccaaaa 35760 cctcaaaatg aagatctatt aagtgaacgc gctcccctcc ggtggcgtgg tcaaactcta 35820 cagccaaaga acagataatg gcatttgtaa gatgttgcac aatggcttcc aaaaggcaaa 35880 cggccctcac gtccaagtgg acgtaaaggc taaacccttc agggtgaatc tcctctataa 35940 acattccagc accttcaacc atgcccaaat aattctcatc tcgccacctt ctcaatatat 36000 ctctaagcaa atcccgaata ttaagtccgg ccattgtaaa aatctgctcc agagcgccct 36060 ccaccttcag cctcaagcag cgaatcatga ttgcaaaaat tcaggttcct cacagacctg 36120 tataagattc aaaagcggaa cattaacaaa aataccgcga tcccgtaggt cccttcgcag 36180 ggccagctga acataatcgt gcaggtctgc acggaccagc gcggccactt ccccgccagg 36240 aaccatgaca aaagaaccca cactgattat gacacgcata ctcggagcta tgctaaccag 36300 cgtagccccg atgtaagctt gttgcatggg cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa 36360 aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga aagcacatcg tagtcatgct catgcagata 36420 aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga aaaagacacc atttttctct caaacatgtc 36480 tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc 36540 tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata agcataagac ggactacggc catgccggcg 36600 tgaccgtaaa aaaactggtc accgtgatta aaaagcacca ccgacagctc ctcggtcatg 36660 tccggagtca taatgtaaga ctcggtaaac acatcaggtt gattcacatc ggtcagtgct 36720 aaaaagcgac cgaaatagcc cgggggaata catacccgca ggcgtagaga caacattaca 36780 gcccccatag gaggtataac aaaattaata ggagagaaaa acacataaac acctgaaaaa 36840 ccctcctgcc taggcaaaat agcaccctcc cgctccagaa caacatacag cgcttccaca 36900 gcggcagcca taacagtcag ccttaccagt aaaaaagaaa acctattaaa aaaacaccac 36960 tcgacacggc accagctcaa tcagtcacag tgtaaaaaag ggccaagtgc agagcgagta 37020 tatataggac taaaaaatga cgtaacggtt aaagtccaca aaaaacaccc agaaaaccgc 37080 acgcgaacct acgcccagaa acgaaagcca aaaaacccac aacttcctca aatcgtcact 37140 tccgttttcc cacgttacgt cacttcccat tttaagaaaa ctacaattcc caacacatac 37200 aagttactcc gccctaaaac ctacgtcacc cgccccgttc ccacgccccg cgccacgtca 37260 caaactccac cccctcatta tcatattggc ttcaatccaa aataaggtat attattgatg 37320 atg 37323

Claims (97)

  1. 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현시키기 위한 벡터이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 하나 이상의 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1OR DN 또는 그의 서브유닛 (subunit), IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15-R 알파, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신 (Defensin), HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, BCG, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 S1OO으로부터 선택되는 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 아데노바이러스 벡터인 벡터.
  3. 제2항에 있어서, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 상기 하나 이상의 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 IL-12의 기능을 갖는 상기 단백질(들)을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 유전자 스위치의 조절 프로모터의 제어 하에 있는 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 엑디손 수용체 (ecdysone receptor, EcR)-기반 유전자 스위치인 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 제어 하에 있는 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 있는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하는 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 면역조절자(들)를 코딩하는 벡터.
  8. 제3항에 있어서, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-12를 코딩하는 벡터.
  9. 하나 이상의 면역조절자의 기능을 갖는 단백질(들)을 발현하는 면역 세포 또는 치료법 지원 세포 (therapy support cell, TSC)의 집단을 생성하는 방법이며, 이 방법은 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 재조합 벡터로 면역 세포를 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 벡터는 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 하나 이상의 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1OR DN 또는 그의 서브유닛, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15-R 알파, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 S1OO으로부터 선택되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 IL-12의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 유전자 스위치의 제어 하에 있는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 제어 하에 있는 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 있는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 면역조절자를 코딩하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-12를 코딩하는 방법.
  17. 제9항에 있어서, 상기 세포는 인간 수지상 세포인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 수지상 세포는 골수 수지상 세포인 방법.
  19. 하나 이상의 면역조절자의 기능을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 재조합 벡터로 변형시켰으며 하나 이상의 면역조절자의 기능을 갖는 단백질(들)을 발현하는 면역 세포 또는 TSC의 집단이며, 여기서 상기 벡터는 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1OR DN 또는 그의 서브유닛, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15-R 알파, IFN-감마, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 S1OO으로부터 선택되는 집단.
  20. 제19항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터인 집단.
  21. 제19항에 있어서, 상기 벡터는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 집단.
  22. 제19항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 IL-12의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 유전자 스위치의 제어 하에 있는 집단.
  23. 제19항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치인 집단.
  24. 제19항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 제어 하에 있는 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 있는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하는 집단.
  25. 제19항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 면역조절자를 코딩하는 집단.
  26. 제21항에 있어서, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-12를 코딩하는 집단.
  27. 제19항에 있어서, 상기 세포는 인간 수지상 세포인 집단.
  28. 제27항에 있어서, 상기 수지상 세포는 골수 수지상 세포인 집단.
  29. 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 시험관 내 조작 면역 세포 또는 TSC이며, 여기서 상기 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1OR DN 또는 그의 서브유닛, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15-R 알파, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 S1OO으로부터 선택되는, 시험관 내 조작 면역 세포 또는 TSC.
  30. 제29항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터인 시험관 내 조작 면역 세포.
  31. 제29항에 있어서, 상기 벡터는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 시험관 내 조작 면역 세포.
  32. 제29항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 IL-12의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 유전자 스위치의 제어 하에 있는 시험관 내 조작 면역 세포.
  33. 제29항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치인 시험관 내 조작 면역 세포.
  34. 제29항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 제어 하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하도록 상호작용하는 시험관 내 조작 면역 세포.
  35. 제29항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 면역조절자를 코딩하는 시험관 내 조작 면역 세포.
  36. 제31항에 있어서, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-12를 코딩하는 시험관 내 조작 면역 세포.
  37. 제29항에 있어서, 인간 수지상 세포인 시험관 내 조작 면역 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 수지상 세포는 골수 수지상 세포인 시험관 내 조작 면역 세포.
  39. 제19항의 시험관 내 조작 면역 세포 또는 TSC의 집단을 함유하는 약학 조성물.
  40. 제29항의 시험관 내 조작 면역 세포 또는 TSC를 함유하는 약학 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 종양내 투여, 복강내 투여 또는 피하 투여에 적합한 약학 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 상기 세포 집단은 104개 이상의 세포를 포함하는 약학 조성물.
  43. 제39항에 있어서, 상기 세포 집단은 107개 이상의 세포를 포함하는 약학 조성물.
  44. (a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계; 및
    (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 포유류에 투여함으로써, 면역조절자의 기능을 갖는 상기 하나 이상의 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1OR DN 또는 그의 서브유닛, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15R 알파, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 S1OO으로부터 선택되는, 포유류에서 종양을 치료하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 종양은 양성 종양인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 종양은 악성 종양인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 종양은 흑색종인 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 종양은 악성 흑색종 피부암인 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 시험관 내 조작 면역 세포는 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결되고 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및 (2) 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하고 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  50. 제44항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 벡터는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 IL-12의 기능을 갖는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 유전자 스위치의 제어 하에 있는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 제어 하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하도록 상호작용하는 방법.
  55. 제44항에 있어서, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 면역조절자를 코딩하는 방법.
  56. 제51항에 있어서, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-12를 코딩하는 방법.
  57. 제44항에 있어서, 상기 면역 세포는 인간 수지상 세포인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 수지상 세포는 골수 수지상 세포인 방법.
  59. 제44항에 있어서, 상기 리간드는 다이아실하이드라진인 방법.
  60. 제44항에 있어서, 상기 리간드는 RG-115819, RG-115932 및 RG-115830으로부터 선택되는 방법.
  61. 제44항에 있어서, 상기 리간드는 아미도케톤 또는 옥사다이아졸린인 방법.
  62. 제44항에 있어서, 상기 리간드를 상기 시험관 내 조작 면역 세포 이전 또는 이후 1시간 미만의 시간에 투여하는 방법.
  63. 제44항에 있어서, 상기 리간드를 상기 시험관 내 조작 면역 세포 이후 24시간 미만의 시간에 투여하는 방법.
  64. 제44항에 있어서, 상기 리간드를 상기 시험관 내 조작 면역 세포 이후 48시간 미만의 시간에 투여하는 방법.
  65. 환자에서 시험관 내 조작 면역 세포 기반 치료 요법의 효능을 결정하는 방법이며, 이 방법은
    (a) 시험관 내 조작 면역 세포의 투여 이전에 필요로 하는 상기 환자로부터 얻은 제1 생물 샘플에서 인터페론 감마 (IFN-γ)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하여, 대조 수준을 생성하는 단계;
    (b) 필요로 하는 상기 환자에게 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 선택적으로, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 조작된 시험관 내 조작 면역 세포를 투여하는 단계;
    (c) 필요로 하는 상기 환자에게 유효량의 활성활 리간드를 투여하는 단계;
    (d) 시험관 내 조작 면역 세포의 투여 이후에 필요로 하는 상기 환자로부터 얻은 제2 생물 샘플에서 IFN-γ의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하여, 시험 수준을 생성하는 단계; 및
    (e) IFN-γ의 대조 수준을 그의 시험 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    여기서, 대조 수준에 비하여 IFN-γ의 발현, 활성 또는 이들 둘 모두의 시험 수준이 증가한 것은 치료 요법이 필요로 하는 상기 환자에서 유효함을 나타내며, 상기 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1OR DN 또는 그의 서브유닛, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15R 알파, CCL3 (MIP-1a), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP3), XCL1 (림포탁틴), CXCL1 (MGSA-알파), CCR7, CCL19 (MIP-3b), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP-10), CXCL12 (SDF-1), CCL21 (6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 S100으로부터 선택되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 필요로 하는 상기 환자는 인간 환자인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 환자는 암 환자인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 암 환자는 흑색종 환자인 방법.
  69. 제65항에 있어서, IFN-γ의 수준을 ELISA에 의해 측정하는 방법.
  70. 제65항에 있어서, 상기 면역 세포는 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 선택적으로, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작되며 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 면역조절자 및 선택적으로, IL-12의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 프로모터에 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 EcR-기반의 유전자 스위치인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 리간드는 EcR 리간드 결합 도메인에 결합하는 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 리간드는 다이아실하이드라진인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 리간드는 RG-115819, RG-115830 및 RG-115932으로부터 선택되는 방법.
  76. 제72항에 있어서, 상기 리간드는 아미도케톤 또는 옥사다이아졸린인 방법.
  77. 제72항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 제어 하에 있는 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 있는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하도록 상호작용하는 방법.
  78. 제70항에 있어서, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-12를 코딩하는 방법.
  79. 제65항에 있어서, 상기 면역 세포는 인간 수지상 세포인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 수지상 세포는 골수 수지상 세포인 방법.
  81. 제65항에 있어서, 상기 활성화 리간드를 종양내 투여하거나, 경구 투여하거나, 복강내 투여하거나 피하 투여하는 방법.
  82. 제65항에 있어서, 상기 활성화 리간드를 상기 시험관 내 조작 수지상 세포 이전 또는 이후 1시간 미만의 시간에 투여하는 방법.
  83. 제65항에 있어서, 상기 활성화 리간드를 상기 시험관 내 조작 수지상 세포 이후 24시간 미만의 시간에 투여하는 방법.
  84. 제65항에 있어서, 상기 활성화 리간드를 상기 시험관 내 조작 수지상 세포 이후 48시간 미만의 시간에 투여하는 방법.
  85. (a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 선택적으로, IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 제어 하는 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하도록 조작된 면역 세포, 및 (b) 유전자 스위치를 활성화시키는 리간드를 포함하는 키트.
  86. 제85항에 있어서, 리간드는 RG-115819, RG-115932 또는 RG-115830인 키트.
  87. 제1항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 제어 하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하도록 상호작용하는 벡터.
  88. 제87항에 있어서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열은 EMCV 내부 리보좀 진입 부위 (internal ribosomal entry site, IRES)에 의해 연결되는 벡터.
  89. 제29항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 제어 하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하도록 상호작용하는 시험관 내 조작 면역 세포.
  90. 제89항에 있어서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열은 EMCV 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)에 의해 연결되는 시험관 내 조작 면역 세포.
  91. 제53항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 제어 하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하는 방법.
  92. 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열은 EMCV 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)에 의해 연결되는, 제91항의 시험관 내 조작 면역 세포.
  93. 제72항에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 제어 하에 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 리간드-의존성 전사 인자로서의 기능을 하는 단백질 복합체를 형성하도록 상호작용하는 방법.
  94. 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열은 EMCV 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)에 의해 연결되는, 제93항의 시험관 내 조작 면역 세포.
  95. 시험관 내 조작 면역 세포 또는 치료법 지원 세포의 둘 이상의 집단을 함유하는 조성물을 포함하는 조성물이며, 여기서 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 집단들 각각은 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열, 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 각각의 집단은 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 다른 집단(들)에서 발현되는 하나 이상의 면역조절자와는 상이한 하나 이상의 면역조절자를 발현하는 조성물.
  96. (a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서, 면역 세포 또는 TSC의 각각의 집단은 하나 이상의 면역조절자의 상이한 세트를 발현함 - ; 및
    (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 포유류에 투여하여, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양을 치료하는 방법.
  97. (a) 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서, 면역 세포 또는 TSC의 각각의 집단은 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질의 상이한 세트를 발현하며, 면역조절자 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어 하에 있음 - ; 및
    (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 포유류에 투여하여, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양을 치료하는 방법.
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