KR20220038362A - 재조합 ad35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선 - Google Patents

재조합 ad35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선 Download PDF

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KR20220038362A
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안드레 리버
창 리
홍지에 왕
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프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
유니버시티 오브 워싱톤
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Abstract

본 개시내용은 무엇보다도 헬퍼-의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 벡터를 제공한다. 다양한 구현예에서, 헬퍼-의존적 Ad35 벡터는 치료적 페이로드를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 페이로드는 대체 단백질, 항체, CAR, TCR, 작은 RNA, 및 게놈 편집 시스템을 암호화할 수 있다. 특정 구현예에서, 헬퍼-의존적 Ad35 벡터는 페이로드를 숙주 세포 게놈 내로 통합하기 위해 조작된다. 본 개시내용은 헬퍼-의존적 Ad35 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 유전자 요법 방법을 추가로 포함한다.

Description

재조합 AD35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 2일 출원된 미국 가출원 번호 제62/869,907호, 2019년 11월 14일 출원된 미국 가출원 번호 제62/935,507호, 및 2020년 4월 13일 출원된 미국 가출원 번호 제63/009,385호의 이익을 주장하며, 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 보조금 번호 HL130040, HL141781, 및 CA204036 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 F053-0107PCT_ST25.txt이다. 텍스트 파일은　945 KB이며, 2020년 7월 2일 생성되었고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
많은 의학적 병태는 유전적 돌연변이에 의해 유발되고/되거나, 적어도 부분적으로, 유전자 요법에 의해 치료가능하다. 이러한 병태는 예를 들어, 혈색소병증, 면역 결핍, 및 암을 포함한다. 혈색소병증으로 알려진 유전 질환은 전세계적으로 가장 널리 퍼진 유전 질환 유형 중 하나이며, 저개발 국가에서 태어난 환자 중에서 생존율이 상당히 감소된다. 혈색소병증의 예는 겸상적혈구병 및 지중해빈혈을 포함한다. 면역 결핍은 1차성 또는 2차성일 수 있다. 80 개 초과의 1차성 면역 결핍 질환이 세계보건기구(World Health Organization)에 의해 인식되고 있다. 유전적 돌연변이에 의해 유발되고/되거나, 적어도 부분적으로, 유전자 요법에 의해 치료가능한 의학적 병태에 대한 예방적 및 치료적 치료가 필요하다.
유전자 요법은 혈색소병증, 면역 결핍, 및 암을 포함하나 이에 제한되지 않는 유전적 구성요소가 있는 많은 병태를 치료할 수 있다. 분자 생물학은 유전적 조작을 위한 다양한 도구를 포함하지만, 예를 들어, 생체외 및 생체내에서 유전자 요법 맥락에서 이러한 도구의 적용은 유전자 요법 벡터에서 사용하기 위한 유전적 작제물의 개발, 뿐만 아니라 벡터 자체의 개발과 적어도 부분적으로 연관된 새로운 기회 및 도전을 불러일으킨다.
본 개시내용은 무엇보다도, 표적 세포에서 염기 편집기의 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 게놈(예를 들어, "재조합" 또는 "조작된" 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 게놈)을 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, 표적 세포에서 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA(gRNA)인 CRISPR 효소를 포함하는 CRISPR 시스템의 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 게놈을 포함하며, 임의적으로 여기서 CRISPR 시스템의 적어도 하나의 구성요소의 발현은 자기-불활성화된다. 본 개시내용은 무엇보다도, 표적 세포에서 염기 편집 효소 및/또는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 염기 편집 시스템의 발현을 위한 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 게놈을 포함하며, 임의적으로 여기서 염기 편집 시스템의 적어도 하나의 구성요소의 발현은 자기-불활성화된다. 본 개시내용은 무엇보다도, 표적 세포에서 발현 산물(예를 들어, 치료 발현 산물)의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 게놈을 포함하며, 여기서 조절 서열은 miRNA 결합 부위를 포함하거나 또는 여기서 조절 서열은 β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR), 예컨대 β-글로빈 긴 LCR를 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, 표적 세포에서 복수의 치료 발현 산물, 예를 들어, 질환 또는 병태의 치료에 함께 기여하는 치료 발현 산물을 발현하는 조합 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 게놈을 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, β-글로빈 긴 LCR을 포함하는 페이로드(payload)의 표적 세포 게놈 내로의 통합을 위한 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 게놈을 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, 특정 기존 벡터에 대한(예를 들어, Ad5 벡터에 대한) 면역원성이 감소된 아데노바이러스 벡터, 및 이의 아데노바이러스 게놈을 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, Ad35 아데노바이러스 벡터, Ad35 아데노바이러스 게놈, HDAd35 아데노바이러스 벡터, HDAd35 아데노바이러스 게놈, 지지 벡터, 지지 게놈, Ad35 헬퍼 벡터, 및 ad Ad35 헬퍼 게놈을 포함하며, 여기서 HDAd35 벡터는 특정 기존 벡터에 대한(예를 들어, Ad5 벡터 또는 Ad5/35 벡터에 대한) 면역원성이 감소될 수 있다.
본 개시내용은 무엇보다도, 조혈 줄기 세포의 생체내 유전자 편집 및 관련된 유전자 요법 개선을 위해 CD46을 표적화하는 재조합 Ad35 벡터를 기재한다. 본원에 개시된 벡터 설계의 특정 구현예에서, 모든 단백질은 혈청형 35로부터 유래된다. 본원에 기재된 Ad35 벡터의 특정 구현예에서, 바이러스 유전자는 벡터에 남아있지 않다. 특정 구현예에서, ITR 및 패키징 서열은 Ad35로부터 유래된다. 특정 구현예에서, Ad35 전달 벡터는 치료 용도와 연관된 구성요소로 대체되고 제거된 모든 바이러스 단백질 암호화 유전자가 있다.
특정 구현예에서, Ad35 벡터는 헬퍼-의존적이며, 본 개시내용은 또한 새로-설계된 Ad35 헬퍼 벡터를 제공한다. 특정 구현예는 Ad35를 만들기 위해 헬퍼-의존적 및 이식유전자 플라스미드의 최적화된 비율을 제공한다.
본 개시내용 내에 기재된 관련된 유전자 요법 개선은 다음 중 하나 이상에 관한 것이다: (i) CD46 결합을 증가시키는 Ad35 놉(knob) 단백질의 신규 돌연변이; (ii) 생체내 변형된 세포의 양성 선택을 허용하는 벡터 특징; (iii) 임상적으로 관련된 시간 창 내에서 치료 단백질의 발현을 조절하는 microRNA 제어 시스템; (iv) 정의된 부위에서 표적화된 게놈 삽입을 용이하게 하기 위한 상동성 아암(arm)의 사용; (v) 게놈 억제인자 영역을 불활성화시켜, 내인성 유전자의 증가된 발현을 허용하기 위한 CRISPR의 사용; (vi) 표적화된 CD46-발현 세포에 Ad35 벡터의 전달을 증가시키기 위한 동원 전략의 사용; (vii) 유전자 발현을 증가시키기 위한 미니- 또는 긴-형태의 유전자좌 제어 영역의 사용; (viii) 트랜스포사제(transposase) 시스템과 함께 삽입될 수 있는 트랜스포존의 크기를 증가시키기 위한 재조합효소 시스템의 사용; (ix) 벡터 전달 전에 스테로이드 전달(예를 들어, 글루코코르티코이드, 덱사메타손); 및 (x) 치료 단백질을 생성 및 분비하는 적혈구. 이러한 관련 유전자 요법 개선은 각각 본원에 기재된 Ad35 벡터로 실행될 수 있고 또한 다른 바이러스 벡터 전달 시스템과 함께 활용될 수 있다. 일 예로서, CD46 결합을 증가시키는 돌연변이된 Ad35 놉 단백질은 렌티바이러스 또는 거품 전달 시스템과 함께 활용될 수 있다.
본원에 기재된 발전은 또한 다음에 관한 것이다: (i) HDAd5/35++ 벡터를 사용한 SB100x-매개 이식유전자 추가를 위한 생체내 HSC 형질도입/선택 기술; (ii) 적혈구 bcl11a-인핸서(예를 들어, BCL11A 발현 감소) 및 HBG1/2 프로모터 영역(γ-글로빈의 발현 증가)을 동시에 표적화함으로써 HbF 재활성화 증가; (iii) 생체내 CRISPR 게놈 조작; (iv) 지중해빈혈의 교정; (v) γ 유전자 추가 및 재활성화의 조합(SB100x 시스템); (vi) CRISPR/Cas9의 자기-불활성화; (vii) 자기-방출 카세트가 있는 HDAd를 공여자 벡터로 사용한 표적화된 통합; (viii) 분비된 치료 단백질의 고수준 생산을 위한 공장으로서 적혈구 세포를 사용한 생체내 HSC 유전자 요법; (ix) 암을 치료하기 위한 치료 접근법(예방적 및 치료적); 및 (x) HDAd35++ 벡터.
특정 구현예는 CD46에 대한 표적화된 결합을 증가시켜, 치료 유전자의 보다 표적화되고 특이적인 전달을 허용하는 돌연변이된 놉 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예는 표적화된 게놈 삽입을 용이하게 하기 위한 상동성 아암의 사용에 관한 것이며, 이는 전형적으로 이식유전자 수준의 더 높은 발현을 허용하는 개방 염색질인 게놈 안전 항구(safe harbor) 내로의 염색체 통합을 제공하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서, 1.8　b 상동성 아암은 잘 작동하며, 0.8을 하한으로 한다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 1.8　b 초과의 상동성 아암에서 통합에 영향을 미치기 시작할 수 있다.
특정 구현예는 조건화에 대한 필요성을 완화하기 위한 동원 레지멘의 사용에 관한 것이다.
특정 구현예는 (i) 저용량 O6-벤질구아닌 및 비스-클로로에틸니트로소우레아를 사용한 단기간 치료에 의해 치료 효과를 증가시킬 수 있는 MGMTP140K 시스템, (ii) SB100X 트랜스포사제-기반 통합 기구, 및 (iii) 마이크로-LCR-구동된 γ-글로빈 유전자를 사용한, Ad35 생체내 유전자 요법을 제공한다.
특정 구현예는 (i) 내인성 유전자의 억제를 역전시키기 위해 HBG1/2 프로모터 내의 BCL11A 결합 부위를 표적화하는 CRISPR/Cas9 카세트, (ii) 5kb β-글로빈 미니-LCR에 의해 구동된 γ-글로빈 유전자 카세트, 및 FRT 및 트랜스포존 부위에 의해 플랭킹된 후자의 2 개 카세트와 함께 형질도입된 세포의 생체내 선택을 허용하는 EF1α- MGMTP140K 발현 카세트를 포함하는 Ad35 아데노바이러스 벡터(HDAd-comb)를 포함한다.
특정 구현예는 적혈구에서 태아 γ-글로빈 발현의 재활성화를 목표로 하는 성인 CD34+ 세포에서 CRISPR/Cas9-매개 게놈 편집 접근법을 기재한다. CD34+ 세포의 적혈구 분화를 수반하는 모델은 γ-글로빈 재활성화를 평가하는 데 있어서 한계가 있기 때문에, CRISPR/Cas9를 발현하는 인간 β-글로빈 유전자좌-유전자이식, 헬퍼-의존적 인간 CD46-표적화 아데노바이러스 벡터(HDAd-HBG-CRISPR)는 γ-글로빈 프로모터 내의 억제인자 결합 영역을 파괴하는 데 사용되었다.
특정 구현예는 통합 CD46 표적화된 Ad35 벡터 시스템을 제공한다: 이식유전자는 (i) γ 글로빈 유전자의 발현을 구동하는 β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR), 및 (ii) 생체내 유전자-변형된 HSC의 양성 선택을 위한 MGMTP140K 카세트의 발현을 구동하는 EF1-α(구성적 프로모터)를 포함하였다.
특정 구현예는 통합 CD46 표적화된 Ad35 벡터 시스템을 제공한다: 이식유전자는 (i) γ 글로빈 유전자(임의적으로 3' UTR 포함)의 발현을 구동하는 21.5 kb(긴) 인간 β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR(HS1-HS5)) 및 β-글로빈 프로모터(1.6 kb), 및 (ii) 생체내 유전자-변형된 HSC의 양성 선택을 위한 MGMTP140K 카세트의 발현을 구동하는 EF1- α(구성적 프로모터)를 포함하였다. 일부 구현예는 3'HS1(인간 β-글로빈 3'HS1; 3 kb, 예를 들어, 여기서 3'HS1은 염색체 11의 위치 5206867-5203839의 서열을 가짐)을 추가로 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 3'HS1은 서열번호: 287에 제시된 바와 같은 하기 핵산 서열, 또는 서열번호: 287에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열, 예를 들어, 서열번호: 287에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 이러한 구현예는 재조합효소 시스템(예를 들어, Flp/Frt; Cre/Lox)과 조합하여 과활성 트랜스포사제(예를 들어, SB100X)를 활용할 수 있다. 따라서, 일 특정 구현예에서, Ad35 벡터 시스템은 예를 들어, 긴 인간 β-글로빈 유전자좌 제어 영역(21.5 kb), 인간 β-글로빈 프로모터(1.6 kb), 3' UTR과 함께 인간 γ 글로빈 유전자(2.7 kb), 인간 β-글로빈 3' UTR, 및 3'HS1(3 kb)을 포함하는 전위성 이식유전자 삽입물을 포함할 수 있다. 전위성 이식유전자 삽입물은 MGMTP140K의 발현을 구동하는 EF1- α(구성적 프로모터)를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, Ad35 벡터 시스템은 예를 들어, 32.4 kb의 전위성 이식유전자 삽입물을 포함할 수 있다.
특정 구현예는 치료 이식유전자의 발현을 제어하기 위해 HSPC가 종양에 모집될 때만 활성화되는 miRNA 조절 시스템을 제공한다. 본 개시내용의 이러한 특징은 항 PDL1-γ1을 이식유전자로서 사용하여 입증된다. 이러한 시스템은 종양 미세환경의 맥락에서 치료 이식유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 유전자의 발현이 microRNA 부위(예를 들어, microRNA가 상호작용할 수 있는 것이 있는 핵산 서열)의 존재에 의해 조절되는 방법 또는 조성물을 지칭할 수 있으며, 예는 실시예 5에 제공되었다. 특정 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 유전자가 표적 세포, 예컨대 HSPC 예를 들어, 종양 침윤 HSPC에서 배타적으로 발현되도록 유전자의 발현을 조절하였다. 일부 구현예에서, 관심 단백질 또는 핵산(예를 들어, 항암제 예컨대 CAR, TCR, 항체, 및/또는 체크포인트 억제제, 예를 들어, 체크포인트 억제제인 αPD-L1 항체(예를 들어, αPD-L1γ1 항체))을 암호화하는 핵산(예를 들어, 치료 유전자)은 microRNA 부위, 복수의 동일한 microRNA 부위, 또는 복수의 별개의 microRNA 부위를 포함하거나, 이와 회합하거나, 또는 이와 작동가능하게 연결된다. 당업자는 관심 유전자를 암호화하는 서열을 갖는 핵산 또는 이의 부분과 microRNA 부위를 회합하는 수단 및 기술에 친숙할 것이지만, 특정 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 예를 들어, 관심 유전자(예를 들어, αPD-L1γ1 항체를 암호화하는 서열)는 관심 유전자의 발현이 종양-침윤 백혈구 세포가 아니지만, 종양-침윤 백혈구에서 발현을 억제하지 않는 세포에서 발현을 억제하는 하나 이상의 microRNA 부위의 존재에 의해 조절되도록 핵산에 존재할 수 있다. 특정한 특정 예에서, 관심 유전자(예를 들어, αPD-L1γ1 항체를 암호화하는 서열)는 관심 유전자의 발현이 종양-침윤 백혈구 세포가 아니지만, 종양-침윤 백혈구에서 발현을 억제하지 않는 세포에서 발현을 억제하는 하나 이상의 miR423-5p microRNA 부위의 존재에 의해 조절되도록 핵산에 존재할 수 있다. 다양한 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 하나 이상의 microRNA 부위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 microRNA 부위를 포함하거나, 또는 여기서 관심 단백질 또는 핵산의 발현이 이에 의해 조절되는 핵산을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 하나 이상의 miR423-5p microRNA 부위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 miR423-5p microRNA 부위를 포함하거나, 또는 여기서 관심 단백질 또는 핵산의 발현이 이에 의해 조절되는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 특정 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 αPD-L1γ1 항체를 암호화하고 하나 이상의 miR423-5p microRNA 부위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 miR423-5p microRNA 부위, 예를 들어, miR423-5p microRNA 부위를 포함하거나, 또는 여기서 αPD-L1γ1 항체의 발현이 이에 의해 조절되는 핵산을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 조혈 줄기 세포의 생체내 유전자 편집 및 관련 유전자 요법 개선을 위해 CD46을 표적화하는 재조합 Ad35 벡터를 기재한다. 특정 구현예에서, Ad35 전달 벡터는 치료 용도와 연관된 구성요소로 대체되고 제거된 모든 바이러스 단백질 암호화 유전자가 있다. 바이러스 단백질을 암호화하는 모든 유전자의 제거는 30 kb의 벡터 운반 용량을 제공하며, 다른 바이러스 벡터 전달 플랫폼으로 이용가능한 것보다 상당히 더 많은 공간이다. 특정 구현예에서, Ad35 벡터는 헬퍼-의존적이고, 본 개시내용은 또한 새로-설계된 Ad35 헬퍼 벡터를 제공한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자 편집"은 핵산 서열을 변형시키기 위한 벡터 또는 제제의 임의의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에는 microRNA 제어 시스템 및 본원에 개시된 microRNA(또한 본원에서 miRNA로 지칭됨) 부위(또한 본원에서 표적 부위로 지칭됨)를 포함하는 다른 핵산을 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 제공된 핵산이거나 또는 이를 포함하고/하거나, 항체 예컨대 αPD-L1 항체(예를 들어, αPD-L1γ1 항체)를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 개시된 제제를 암호화하는 벡터가 추가로 제공된다. 본 개시내용의 다양한 구현예 중 임의의 것에서, 벡터는 Ad5/35 벡터일 수 있으며, 임의적으로 여기서 Ad5/35 벡터는 헬퍼-의존적 Ad5/35(HDAd5/35)이다. 본 개시내용의 다양한 구현예 중 임의의 것에서, 벡터는 본원에 제공된 변이(예를 들어, 아미노산 돌연변이)를 포함하는 Ad5/35 벡터(예를 들어, HDAd5/35 벡터)일 수 있으며, 이들 중 특정 벡터는 Ad5/35++(예를 들어, HDAd5/35++)로 지정될 수 있다. 의심의 여지를 피하기 위해, 당업자는 Ad5/35 이외(예를 들어, Ad5/35++ 이외 또는 HDAd5/35++ 이외)의 벡터가 명시된 구현예를 포함하여, 임의의 벡터를 사용한 임의의 구현예가 관련 텍스트에 언급된 바와 같은 이러한 벡터 이외에, Ad5/35 벡터(예를 들어, HDAd5/35, Ad5/35++, 및 HDAd5/35++ 벡터 중 임의의 것 포함)인 벡터를 개시하는 것으로 구체적으로 판독해야 한다는 것을 본 개시내용으로부터 인식하도록 의도된다.
본 개시내용의 다양한 구현예 중 임의의 것에서, 벡터는 Ad35 벡터일 수 있으며, 임의적으로 여기서 Ad35 벡터는 HDAd35이다. 본 개시내용의 다양한 구현예 중 임의의 것에서, 벡터는 본원에 제공된 변이(예를 들어, 아미노산 돌연변이)를 포함하는 Ad35 벡터(예를 들어, HDAd35 벡터) 일 수 있으며, 이들 중 특정 벡터는 Ad35++(예를 들어, HDAd35++)로 지정될 수 있다. 의심의 여지를 피하기 위해, 당업자는 Ad35 벡터 이외(예를 들어, Ad35++ 이외 또는 HDAd35++ 이외)의 벡터가 명시된 구현예를 포함하여, 임의의 벡터를 사용한 임의의 구현예가 관련 텍스트에 언급된 바와 같은 이러한 벡터 이외에, Ad35 벡터(예를 들어, HDAd35, Ad35++, 및 HDAd35++ 벡터 중 임의의 것 포함)인 벡터를 개시하는 것으로 구체적으로 판독해야야 한다는 것을 본 개시내용으로부터 인식하도록 의도된다.
나타낸 바와 같이, 본원에 기재된 벡터는 겸상적혈구병의 치료, γ 글로빈 유전자 추가 및 재활성화, 및 γ 글로빈 재활성화를 위한 다중 표적 부위의 표적화를 포함하는 많은 용도를 갖는다. 또한, 인자 VIII(FVIII) 이외에, 개시된 접근법의 적용은 예를 들어 다음을 포함하는 다른 분비된 단백질에 사용될 수 있다: (i) 다른 응고 인자, 구체적으로 FXI, FVII, 폰빌레브란트(von Willebrand) 인자(VWF), 및 희귀 응혈 인자(즉, 인자 I, II, V, X, XI, 또는 XIII); (ii) 폼페병(산 알파(α)-글루코시다제), 고세병(글루코레세브로시다제), 파브리병(α-갈락토시다제 A), 및 I형 점액다당류증(α-L-이두로니다제)과 같은 리소좀 축적 질환에 대한 효소 대체 요법(ERT)에 현재 사용되는(교차-교정 메커니즘의 이점 취득) 효소; (iii) 면역결핍(예를 들어 SCID-ADA(아데노신 데아미나제)); (iv) 심혈관 질환, 예를 들어 가족성 아포지질단백질 E　결핍 및 아테롬성동맥경화증(ApoE);　(v)　 HIV, 만성　HCV, 또는 HBV　감염에 대한 바이러스 유인 수용체(예를 들어 HIV-　가용성 CD4, 또는 광범위한 중화 항체(bNAb))의 발현에 의한 바이러스 감염;　(vi)　암(예를 들어 단클론 항체(예를 들어 트라스투주맙) 또는 체크포인트 억제제(예를 들어 aPDL1)의 제어된 발현 또는 치료 용량의 화학요법을 허용하기 위한 HSC의 보호 및 (vii) 판코니 빈혈에 대한 FANCA 유전자; (viii) A형 혈우병, B형 혈우병, 또는 폰빌레브란트병으로부터 임의적으로 선택된 응고 인자 결핍, (ix) 혈소판 장애, (x) 빈혈, (xi) 알파-1 항트립신 결핍, 또는 (xii) 면역 결핍. 다른 추가적인 용도는 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재되어 있다.
따라서, 일 구현예는 조혈 줄기 세포의 생체내 유전자 편집을 위해 CD46을 표적화하는 재조합 혈청형 35 아데노바이러스(Ad35) 벡터를 제공한다.
또 다른 구현예는 치료 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 적혈구이다. 예로서, 치료 단백질은 일부 경우에 바이러스 감염을 차단하거나 또는 감소시키는 응고 인자 또는 단백질을 포함한다. 임의적으로, 적혈구는 치료 단백질을 분비한다.
또한 본원에 기재된 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도가 제공된다. 이들 용도는 적혈구 bcl11a-인핸서 및 HBG 프로모터 영역을 동시에 표적화함으로써 HbF 재활성화 증가; γ-글로빈 유전자 추가 및 내인성 γ-글로빈 유전자 재활성화의 조합; 생체내 CRISPR 게놈 조작; 치료 유전자 제공; (i) 혈색소병증, (ii) 판코니 빈혈, (iii) A형 혈우병, B형 혈우병, 또는 폰빌레브란트병으로부터 임의적으로 선택된 응고 인자 결핍, (iv) 혈소판 장애, (v) 빈혈, (vi) 알파-1 항트립신 결핍, 또는 (v) 면역 결핍 치료; 지중해빈혈 치료; 암 치료, 암 재발 예방 또는 지연 또는 고위험 생식 계열 돌연변이의 보균자에서 암 발병 예방 또는 지연, 임의적으로 여기서 암은 유방암 또는 난소암인 것; CRISPR/Cas9의 자기-불활성화; 공여자 벡터로서 자기-방출 카세트가 있는 HDAd를 사용한 표적화된 통합을 위한 것을 포함한다. 이들 용도 중 임의의 것은 임의적으로 동원을 포함할 수 있으며, 예를 들면 여기서 동원은 Gro-베타, GM-CSF, S-CSF, 및/또는 AMD3100의 투여를 포함한다.
또한 또 다른 용도 구현예는 스테로이드(예를 들어, 글루코코르티코이드 또는 덱사메타손), IL-6 수용체 길항제, 및/또는 IL-1R 수용체 길항제를 Ad35 벡터 및/또는 적혈구를 받는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 본원에 기재된 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구 중 임의의 것의 용도이다.
또한 O6BG 및 TMZ(테모졸로미드) 또는 BCNU(카르무스틴)를 Ad35 벡터 및/또는 적혈구를 받는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구 중 임의의 것을 이용하는 용도 구현예가 제공된다. 이러한 용도 구현예의 예에 의해, 대상체는 역형성 성상세포종, 유방암, 결장직장암, 미만성 내재성 뇌간 신경교종, 유잉 육종, 다형성 교모세포종(GBM), 악성 뇌교종, 흑색종, 전이성 악성 흑색종, 비인두암, 또는 소아암에 대한 치료로서 O6BG 및 TMZ 또는 BCNU를 받고 있다.
또한 또 다른 구현예는 다음을 포함하는 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 벡터 생산 시스템이다: Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부를 플랭킹하는 재조합효소 DR을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈, 및 5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈.
또한 Ad35 섬유 샤프트; Ad35 섬유 놉; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부를 플랭킹하는 재조합효소 DR을 포함하는 Ad35 게놈을 포함하는 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 벡터 구현예가 제공된다.
또한 Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부를 플랭킹하는 재조합효소 DR을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈 구현예가 제공된다.
또한 5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열로, 여기서 게놈은 Ad35 바이러스 구조적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 것을 포함하는, 핵산 서열; 및 Ad35 섬유 샤프트 및/또는 Ad35 섬유 놉을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터 구현예가 제공된다.
또한 5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈 구현예가 제공되며, 여기서 Ad35 공여자 게놈은 야생형 Ad35 게놈에 의해 암호화된 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 구현예는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 생산하는 방법으로, 상기 방법은 세포의 배양물로부터 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부를 플랭킹하는 재조합효소 DR을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈, 및 5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈을 포함한다.
또한 Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 이내의 재조합효소 DR을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈, 및 5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 게놈을 포함하는 재조합 Ad35 생산 시스템 구현예가 제공된다.
또 다른 구현예는 Ad35 섬유 샤프트; Ad35 섬유 놉; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 이내의 재조합효소 DR을 포함하나 Ad35 게놈을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 벡터이다.
또 다른 구현예는 Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 이내의 DR을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈이다.
또 다른 구현예는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 생산하는 방법으로, 상기 방법은 세포의 배앙물로부터 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 이내의 재조합효소 DR을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈, 및 5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 게놈을 포함한다.
또한 또 다른 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 공여자 벡터, 또는 공여자 게놈을 포함하는 세포이며, 임의적으로 여기서 세포는 HEK293 세포이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 구현예 중 임의의 하나의 공여자 게놈을 포함하는 세포이며, 임의적으로 여기서 세포는 적혈구이고, 임의적으로 여기서 세포는 조혈 줄기 세포, T-세포, B-세포, 또는 골수성 세포이고, 임의적으로 여기서 세포는 발현 산물을 분비한다.
또한 세포를 변형시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 제공된 Ad35 공여자 벡터 구현예 중 임의의 하나에 따른 Ad35 공여자 벡터를 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한 대상체의 세포를 변형시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 Ad35 공여자 벡터 구현예 중 임의의 하나에 따른 Ad35 공여자 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 방법은 대상체로부터 세포의 단리를 포함하지 않는다.
또한 또 다른 구현예는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이며, 상기 방법은 본원에 제공된 Ad35 공여자 벡터 구현예 중 임의의 하나에 따른 Ad35 공여자 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 투여는 정맥내이다.
정의
단수형 : 본원에 사용된 바와 같이, 단수형은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭한다. 예로서, "요소"는 정확히 하나의 요소의 구현예 및 하나 초과의 요소를 포함하는 구현예를 개시한다.
약 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 값과 관련하여 사용될 때, 참조된 값의 맥락에서 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥과 친숙한 당업자는 해당 문맥에서 "약"에 의해 포함된 적절한 변동 정도를 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용어 "약"은 참조된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 이내에서 값의 범위를 포함할 수 있다.
투여 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로 조성물이거나, 또는 조성물에 포함된 제제의 전달을 달성하기 위해 대상체 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
입양 세포 요법 : 본원에 사용된 바와 같이, "입양 세포 요법" 또는 "ACT"는 치료 활성이 있는 세포를 대상체, 예를 들어, 병태, 장애, 또는 질환에 대한 치료를 필요로 하는 대상체 내로 전달하는 것을 수반한다. 일부 구현예에서, ACT는 세포의 생체외 및/또는 시험관내 조작 및/또는 확장 후에 세포를 대상체 내로 전달하는 것을 포함한다.
친화도 : 본원에 사용된 바와 같이, "친화도"는 특정 결합제(예를 들어, 바이러스 벡터), 및/또는 이의 결합 모이어티와, 결합 표적(예를 들어, 세포) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합제 및 이의 결합 표적(예를 들어, 바이러스 벡터와 바이러스 벡터의 표적 세포) 사이의 1:1 상호작용을 지칭한다. 당업자는 친화도의 변화가 참조와의 비교에 의해 기재될 수 있거나(예를 들어, 참조에 대한 증가 또는 감소), 또는 수치상으로 기재될 수 있음을 이해한다. 친화도는 평형 해리 상수(KD) 및/또는 평형 결합 상수(KA)를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 다양한 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 몫인 반면, KA는 kon/koff의 몫이며, 여기서 kon은 예를 들어, 바이러스 벡터와 표적 세포의 결합 속도 상수를 지칭하고, koff는 예를 들어, 표적 세포로부터 바이러스 벡터의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 당업자에게 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다.
제제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제제"는 원자, 분자, 화합물, 아미노산, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 핵산, 단백질, 단백질 복합체, 액체, 용액, 당류, 다당류, 지질, 또는 이의 조합 또는 복합체 중 하나 이상의 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 화학적 독립체를 치징할 수 있다.
동종이계 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이계"는 하나의 대상체로부터 유래된 다음 또 다른 대상체에게 도입된 임의의 물질, 예를 들어, 동종이계 T 세포 이식을 지칭한다.
사이에 또는 부터 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이에"는 경계를 포함하여, 표시된 상부 및 하부, 또는 제1 및 제2 경계 사이에 속하는 내용물을 지칭한다. 유사하게, 용어 "부터"는, 값의 범위의 맥락에서 사용될 때, 범위가 경계를 포함하여, 표시된 상부 및 하부, 또는 제1 및 제2 경계 사이에 속하는 내용물을 포함함을 나타낸다.
결합 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합"은 2 개 이상의 제제 사이 또는 중에서 비공유 회합을 지칭한다. "직접" 결합은 제제 사이의 물리적 접촉을 수반하고; 간접 결합은 하나 이상의 증간 제제와의 물리적 접촉 방식의 물리적 상호작용을 수반한다. 2 개 이상의 제제 사이의 결합은 상호작용하는 제제가 단리에서 또는 더 복잡한 시스템의 맥락에서(예를 들어, 담체 제제와 및/또는 생물학적 시스템 또는 세포에서 공유적으로 또는 달리 회합되는 동안) 연구되는 경우를 포함하여, 다양한 맥락 중 임의의 것에서 발생하고/하거나 평가할 수 있다.
암: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 세포가 상대적으로 비정상적, 비제어적, 및/또는 자율적 성장을 나타내어, 암 증식에 대한 제어의 상당한 손실을 특징으로 하는 비정상적으로 상승된 증식률 및/또는 비정상적인 성장 표현형을 나타내도록 하는, 병태, 장애, 또는 질환을 지칭한다. 일부 구현예에서, 암은 하나 이상의 종양을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성, 및/또는 비-전이성인 세포이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 혈액 종양이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체 : 본원에 사용된 바와 같이, "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 (i) 표적 항원에 결합하는 모이어티를 포함하는 세포외 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) CAR이 세포외 결합 모이어티와 표적 항원의 결합에 의해 자극될 때 활성화 신호를 보내는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 단백질을 지칭한다. 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포는 CAR T 세포로 지칭될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 특정 CAR이 T 세포에 의해 발현될 때, CAR 세포외 결합 모이어티와 표적 항원의 결합은 T 세포를 활성화할 수 있다. CAR은 또한 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역수용체로 알려져 있다.
조합 요법 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조합 요법"은 2 개 이상의 제제 또는 레지멘이 함께 대상체의 병태, 장애, 또는 질환을 치료하도록 2 개 이상의 제제 또는 레지멘을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 치료제 또는 레지멘은 동시에, 순차적으로, 또는 중복 투약 레지멘으로 투여될 수 있다. 당업자 조합 요법이 2 개의 제제 또는 레지멘이 단일 조성물로 함께 투여되거나, 또는 동시에 투여되는 것을 포함하지만 요구하지 않음을 이해할 것이다.
발현 또는 활성 제어 : 본원에 사용된 바와 같이, 제1 요소(예를 들어, 단백질, 예컨대 전사 인자, 또는 핵산 서열, 예컨대 프로모터)는 제2 요소의 발현 또는 활성이 적어도 하나의 조건 세트 하에 제1 요소의 상태(예를 들어, 존재, 부재, 형태, 화학적 변형, 상호작용, 또는 다른 활성)에 따라 전체적으로 또는 부분적으로 의존하는 경우 제2 요소(예를 들어, 단백질과 같은 제제를 암호화하는 핵산 또는 단백질)의 발현 또는 활성을 "제어"하거나 또는 "구동"한다. 발현 또는 활성의 제어는 예를 들어, 제1 요소의 상태 변화가, 적어도 하나의 조건 세트 하에, 참조 대조군과 비교하여 제2 요소의 발현 또는 활성의 적어도 10%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 100-배)의 변화를 초래한다는 점에서, 실질적인 제어 또는 활성일 수 있다.
에 상응하는 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에 상응하는"은 적절한 참조 화합물 또는 조성물과의 비교를 통해 화합물 또는 조성물에서 구조적 요소의 위치/동일성을 지정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 중합체의 단량체성 잔기(예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 잔기 또는 폴리뉴클레오티드의 핵산 잔기)는 적절한 참조 중합체의 잔기"에 상응하는" 것으로 식별될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 제공된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 잔기가 종종 관련된 참조 서열의 체계에 따라 지정(예를 들어, 넘버링 또는 라벨링)됨을 이해한다(예를 들어, 이러한 지정이 제공된 서열의 문자 넘버링을 반영하지 않는 경우에도). 예시로서, 참조 서열이 위치 100-110에서 특정 아미노산 모티프를 포함하고, 두번째 관련 서열이 위치 110-120에서 동일한 모티프를 포함하는 경우, 두번째 관련 서열의 모티프 위치는 참조 서열의 위치 100-110"에 상응한다"고 할 수 있다. 당업자는 상응하는 위치가 예를 들어, 서열의 정렬에 의해 용이하게 식별될 수 있고, 이러한 정렬이 예를 들어, BLAST, CS-BLAST, CUDASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM, 또는 SWIPE와 같은 소프트웨어 프로그램을 포함하나 이에 제한되지 않는, 알려진 다양한 툴, 전략, 및/또는 알고리즘 중 임의의 것에 의해 통상적으로 달성됨을 이해한다.
투약 레지멘: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투약 레지멘"은 대상체에게 투여되는 하나 이상의 동일하거나 또는 상이한 단위 용량의 세트를 지칭할 수 있으며, 전형적으로 일정 기간 동안 다른 대상체의 투여로부터 분리되는 것 중 각각의 복수의 단위 용량 투여를 포함한다. 다양한 구현예에서, 투약 레지멘의 하나 이상 또는 모든 단위 용량은 동일할 수 있거나 또는 달라질 수 있다(예를 들어, 시간 경과에 따라 증가하거나, 시간 경과에 따라 감소하거나, 또는 대상체 및/또는 의사의 결정에 따라 조정될 수 있음). 다양한 구현예에서, 각각의 용량 사이의 시간 기간 중 하나 이상 또는 모두는 동일할 수 있거나 또는 달라질 수 있다(예를 들어, 시간 경과에 따라 증가하거나, 시간 경과에 따라 감소하거나, 또는 대상체 및/또는 의사의 결정에 따라 조정될 수 있음). 일부 구현예에서, 주어진 치료제는 하나 이상의 용량을 수반할 수 있는 권고된 투약 레지멘을 갖는다. 전형적으로, 시판되는 약물의 적어도 하나의 권고된 투약 레지멘은 당업자에게 알려져 있다. 일부 구현예에서, 투약 레지멘은 관련 집단에 걸쳐 투여될 때 원하거나 또는 유리한 결과와 상관관계가 있다(즉, 치료 투약 레지멘임).
하류 및 상류: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하류"는 제1 DNA 영역이, 제2 DNA 영역에 비해, 제1 DNA 영역 및 제2 DNA 영역을 포함하는 핵산의 C-말단에 더 가깝다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상류"는 제1 DNA 영역이, 제2 DNA 영역에 비해, 제1 DNA 영역 및 제2 DNA 영역을 포함하는 핵산의 N-말단에 더 가깝다는 것을 의미한다.
유효량: "유효량"은 대상체에서 원하는 생리학적 변화를 초래하는 데 필요한 제형의 양이다. 유효량은 종종 연구 목적을 위해 투여된다.
조작된 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조작된"은 인간의 손으로 조작된 측면을 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 자연에서 그 순서로 함께 연결되지 않은 2 개 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오티드에서 서로 직접적으로 연결되도록 사람의 손으로 조작될 때 "조작된" 것으로 간주된다. 당업자는 "조작된" 핵산 또는 아미노산 서열이 재조합 핵산 또는 아미노산 서열일 수 있고, "유전적으로 조작된" 것으로 지칭될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는 첫번째 서열과 작동가능하게 연결된 것으로 자연에서 발견되지만 두번째 서열과 작동가능하게 연결된 것으로 자연에서 발견되지 않는 코딩 서열 및/또는 조절 서열을 포함하며, 이는 인간의 손으로 두번째 서열에 작동가능하게 연결된 조작된 폴리펩티드에 있다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유기체는 유전적 정보가 변경되도록 조작된 경우(예를 들어, 이전에 존재하지 않는 새로운 유전적 물질이 예를 들어 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입, 또는 다른 메커니즘에 의해 도입되었거나, 또는 이전에 존재하는 유전적 물질이 예를 들어 치환, 결실, 또는 교배에 의해 변경 또는 제거됨) "조작된" 또는 "유전적으로 조작된" 것으로 간주된다. 통상적인 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 세포의 완전하거나 또는 불완전한 자손 또는 카피는 직접 조작이 이전 독립체의 것이었을지라도 전형적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
부형제: 본원에 사용된 바와 같이, "부형제"는 예를 들어 원하는 일관성 또는 안정화 효과를 제공하거나 또는 이에 기여하기 위해 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 비-치료제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 적합한 약제학적 부형제는 예를 들어, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다.
발현 : 본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 단백질과 같은 암호화된 제제의 핵산 서열로부터 생산을 초래하는 하나 이상의 생물학적 과정을 개별적으로 및/또는 점증적으로 지칭한다. 발현은 구체적으로 전사 및 번역 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
플랭크 : 본원에 사용된 바와 같이, 제2 요소 및 제3 요소와 인접한 서열에 존재하는 제1 요소(예를 들어, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)는 제2 요소 및 제3 요소 사이의 인접한 서열에 위치하는 경우 제2 요소 및 제3 요소에 의해 "플랭킹된다". 따라서, 이러한 배열에서, 제2 요소 및 제3 요소는 제1 요소를 "플랭킹"하는 것으로 지칭될 수 있다. 플랭킹 요소는 플랭킹된 요소에 바로 인접하거나 또는 하나 이상의 관련 단위에 의해 플랭킹된 요소로부터 분리될 수 있다. 인접한 서열이 핵산 또는 아미노산 서열이고, 관련 단위가 각각 염기 또는 아미노산 잔기인 다양한 예에서, 플랭킹된 요소, 및 독립적으로, 제1 및/또는 제2 플랭킹 요소 사이에 있는 인접한 서열의 단위 수는 예를 들어, 50 개 이하 단위, 예를 들어, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0 개 단위 이하일 수 있다.
단편: 본원에 사용된 바와 같이, "단편"은 참조 제제(때때로 "모체" 제제로 지칭됨)의 별개의 부분을 포함하고/하거나 이로 이루어진 구조를 지칭한다. 일부 구현예에서, 단편은 참조 제제에서 발견된 하나 이상의 모이어티가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 단편은 참조 제제에서 발견된 하나 이상의 모이어티를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 참조 제제는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 같은 중합체이다. 일부 구현예에서, 중합체의 단편은 참조 중합체의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 개 이상의 단량체성 단위(예를 들어, 잔기)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 중합체의 단편은 참조 중합체에서 발견된 단량체성 단위(예를 들어, 잔기)의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 참조 중합체의 단편은 참조 중합체의 상응하는 부분과 반드시 동일하지는 않다. 예를 들어, 참조 중합체의 단편은 참조 중합체에 대해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 잔기의 서열을 갖는 중합체일 수 있다. 단편은 참조 제제의 물리적 단편화에 의해 생성될 수 있거나, 또는 생성될 수 없다. 일부 경우에, 단편은 참조 제제의 물리적 단편화에 의해 생성된다. 일부 경우에, 단편은 참조 제제의 물리적 단편화에 의해 생성되지 않고 대신에 예를 들어, 새로운 합성 또는 다른 수단에 의해 생성될 수 있다.
유전자, 이식유전자 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 임의적으로 코딩 서열의 발현을 제어하는 조절 서열의 일부 또는 전부와 함께, 코딩 서열(즉, RNA 생성물 및/또는 폴리펩티드 생성물과 같은 발현 산물을 암호화하는 DNA 서열)이거나 또는 이를 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자는 인트론과 같으나 이에 제한되지 않는 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자는 코딩(예를 들어, 엑손) 및 비-코딩(예를 들어, 인트론) 서열을 둘 다 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 프로모터인 조절 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자는 (i) 소스 게놈과 같이, 참조 맥락에서 코딩 서열의 상류에 미리결정된 수의 뉴클레오티드를 확장하는 DNA 뉴클레오티드, 및 (ii) 소스 게놈과 같이, 참조 맥락에서 코딩 서열의 하류에 미리결정된 수의 뉴클레오티드를 확장하는 DNA 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 다양한 구현예에서, 미리결정된 수의 뉴클레오티드는 500 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 75 kb, 또는 100 kb일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "이식유전자"는 유전자가 존재하거나 또는 유전자가 조작에 의해 배치될 수 있는 참조 맥락에 대해 내인성 또는 고유하지 않은 유전자를 지칭한다.
유전자 산물 또는 발현 산물 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 산물" 또는 "발현 산물"은 일반적으로 유전자로부터 전사된 RNA(처리전 및/또는 처리후) 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 암호화된 폴리펩티드(변형전 및/또는 변형후)를 지칭한다.
숙주 세포, 표적 세포 : 본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 이식유전자와 같은 외인성 DNA(재조합 또는 달리)가 도입된 세포를 지칭한다. 당업자는 "숙주 세포"가 외인성 DNA가 초기에 도입된 세포 및/또는 이의 완전하거나 또는 불완전한 자손 또는 카피일 수 있음을 이해한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자 또는 이식유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 의도되거나 또는 잠재적인 숙주 세포는 표적 세포로 지칭될 수 있다.
다양한 구현예에서, 숙주 세포 또는 표적 세포는 다양한 표면 마커의 존재, 부재, 또는 발현 수준에 의해 식별된다.
세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이거나 또는 이를 발현한다는 진술은 특정 마커의 세포 상에서 또는 내에서 검출가능한 존재를 지칭한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭할 수 있으며, 여기서 염색은 달리 동일한 조건 하에 이소형-일치 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준과 실질적으로 유사한 수준, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출가능하다.
세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이거나 또는 마커의 발현이 결여되어 있다는 진술은 특정 마커의 세포 상에서 또는 내에서 실질적으로 검출가능한 존재의 부재를 지칭한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭할 수 있으며, 여기서 염색은 달리 동일한 조건 하에 이소형-일치된 조건과 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준보다 실질적으로 낮은 수준, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
동일성 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 2 개의 제공된 서열 사이의 퍼센트 동일성을 계산하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 용어 "% 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이, 2 개 이상의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된 바와 같이 단백질 및 핵산 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성"(종종 "유사성"으로 지칭됨)은 다음에 기재된 것들을 포함하여 알려진 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992). 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 테스트된 서열 사이의 최고 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 성문화되어 있다. 예를 들면, 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 대한 퍼센트 동일성의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 2 개의 서열(또는 하나 또는 두 서열의 보체)을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고 비교 목적을 위해 동일하지 않은 서열은 무시될 수 있다). 그런 다음 상응하는 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산이 비교된다. 제1 서열에서 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)에 의해 점유되면, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2 개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이며, 임의적으로 갭의 수, 및 2 개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있을 수 있는 각 갭의 길이를 설명한다. 2 개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성 결정은 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 BLAST(기본 로컬 정렬 검색 도구)를 사용하여 달성될 수 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 LASERGENE 생물정보학 컴퓨터 묶음의 Megalign 프로그램(DNASTAR, Inc., 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 또한 디폴트 매개변수(갭 패널티=10, 갭 길이 패널티=10)에 따른 Clustal 정렬 방법(Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989)을 사용하여 수행될 수 있다. 관련 프로그램은 또한 GCG 프로그램 묶음(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), 위스콘신주 매디슨 소재); BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); DNASTAR(DNASTAR, Inc., 위스콘신주 매디슨 소재); 및 Smith-Waterman 알고리즘을 포함하는 FASTA 프로그램(Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(S): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y를 포함한다. 본 개시내용의 맥락 내에서 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "디폴트 값"에 기반한 것으로 이해될 것이다. "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어와 함께 원래 로드되는 임의의 값 또는 매개변수 세트를 의미할 것이다.
" 개선하다 ," " 증가하다 ," " 억제하다 ," 또는 " 감소하다 ": 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개선하다", "증가하다", "억제하다", 및 "감소하다", 및 이의 문법적 등가물은 참조와의 정성적 또는 정량적 차이를 나타낸다.
단리된: 본원에 사용된 바와 같이, "단리된"은 (1) 처음에 생산될 때(자연에서든 및/또는 실험적 설정에서든) 회합된 구성요소의 적어도 일부로부터 분리되고/되거나, (2) 인간의 손에 의해 설계, 생산, 제조, 및/또는 제작된 물질 및/또는 독립체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 독립체는 처음에 회합된 다른 구성요소의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과로 순수하다. 본원에 사용된 바와 같이, 물질은 다른 구성요소가 실질적으로 없는 경우 "순수"하다. 일부 구현예에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질은 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정 다른 구성요소와 조합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있으며; 이러한 구현예에서, 물질의 단리 또는 순도 퍼센트는 이러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 예를 하나 들자면, 일부 구현예에서, 자연에서 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 중합체는 a) 기원 또는 유래원에 의해 자연에서 천연 상태로 수반하는 구성요소의 일부 또는 전부와 연관되지 않고; b) 자연에서 생산하는 종과 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없고; c) 자연에서 생산하는 종의 것이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템으로부터의 구성요소에 의해 발현되거나 또는 달리 연관될 때 "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들면, 일부 구현예에서, 화학적으로 합성되거나 또는 자연에서 생산하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 하나 이상의 정제 기술에 적용된 폴리펩티드는 a) 자연에서 연관되고/되거나; b) 처음에 생산될 때 연관된 것이 있는 다른 구성요소로부터 분리된 정도로 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
작동가능하게 연결된 : 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 구성요소 요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있도록 적어도 제1 요소 및 제2 요소의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 조절 서열은 조절 서열 및 코딩 서열이 조절 서열에 의해 코딩 서열에 대한 발현의 제어를 허용하는 방식으로 회합되는 경우 핵산 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된"다. 일부 구현예에서, "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 (예를 들어, 단일 핵산에서) 코딩 서열과 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 회합된다. 일부 구현예에서, 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 트랜스로 제어하고 코딩 서열과 동일한 핵산에서 조절 서열의 포함은 작동가능한 연결의 요건이 아니다.
약제학적으로 허용되는 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는," 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 제형을 위한 하나 이상의, 또는 모든 구성요소(들)에 적용되는 바와 같이, 각 구성요소가 조성물의 다른 성분과 호환가능해야 하며 이의 수용자에게 해롭지 않음을 의미한다.
약제학적으로 허용되는 담체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 제제(예를 들어, 약제학적 제제)의 제형을 용이하게 하거나, 제제의 생체이용률을 변형시키거나, 또는 대상체의 하나의 기관 또는 부분에서 또 다른 기관 또는 부분까지 제제의 수송을 용이하게 하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로-허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클을 지칭한다. 약제학적으로-허용되는 담체로서 제공할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 무발열원수; 등장성 염수; 링거 용액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약제학적 제형에 이용되는 다른 무독성 호환성 물질.
약제학적 조성물 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 조성물을 지칭한다.
프로모터 : 본원에 사용된 바와 같이, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 코딩 서열의 전사의 개시 및/또는 가공성에 직접적으로 또는 간적적으로(예를 들어, 프로모터-결합된 단백질 또는 물질을 통해) 참여하는 DNA 조절 영역일 수 있다. 프로모터는 적합한 조건 하에, 하나 이상의 전사 인자 및/또는 조절 모이어티와 프로모터의 결합 시 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있다. 코딩 서열의 전사 개시에 참여하는 프로모터는 코딩 서열에 "작동가능하게 연결될" 수 있다. 특정 경우에, 프로모터는 전사 개시 부위(이의 3' 말단)에서 상류(5' 방향) 위치로 확장되는 DNA 조절 영역일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있으며, 이렇게 지정된 서열이 전사 사건을 시작하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소 중 하나 또는 둘 다를 포함하도록 한다. 프로모터는 인핸서 및 억제인자 서열과 같은 발현 제어 서열일 수 있거나, 이를 포함하거나, 또는 이와 작동가능하게 회합되거나 또는 이에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 조건부(예를 들어, 유도성) 프로모터는 단방향성 또는 양방향성일 수 있다. 프로모터는 특정 종의 게놈에서 발생하는 것으로 알려진 서열과 동일한 서열일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있으며, 여기서 전사 조절 영역을 함유하는 서열은 하나의 공급원으로부터 수득될 수 있고 전사 개시 영역을 함유하는 서열은 제2 공급원으로부터 수득될 수 있다. 이식유전자 내의 코딩 서열에 제어 요소를 연결하기 위한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(일반적인 분자 생물학적 및 재조합 DNA 기술은 Sambrook, Fritsch, 및 Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기재되어 있다).
참조: 본원에 사용된 바와 같이, "참조"는 비교가 수행되는 것과 관련된 표준 또는 대조군을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제제, 샘플, 서열, 대상체, 동물, 또는 개인, 또는 이의 집단, 또는 이를 나타내는 척도 또는 특성은 참조, 제제, 샘플, 서열, 대상체, 동물, 또는 개인, 또는 이의 집단, 또는 이를 나타내는 척도 또는 특성과 비교된다. 일부 구현예에서, 참조는 측정된 값이다. 일부 구현예에서, 참조는 확립된 표준 또는 예상된 값이다. 일부 구현예에서, 참조는 역사적 참조이다. 참조는 정성적의 정량적일 수 있다. 전형적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 및 비교되는 값은 비슷한 조건 하에 척도를 나타낸다. 당업자는 신뢰성 및/또는 비교를 정당화하기 위한 충분한 유사성이 존재하는 경우 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 적절한 참조는 예를 들어, 하나 이상의 특정 값(예를 들어, 제제 또는 조건의 존재 또는 부재), 또는 이를 나타내는 척도 또는 특성을 평가하는 목적을 위해, 당업자가 비교할 수 있는 것으로 인식할 조건 하에, 제제, 샘플, 서열, 대상체, 동물, 또는 개인, 또는 이의 집단일 수 있다.
조절 서열 : 핵산 코딩 서열의 발현의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 제어하는 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 조절 서열은 유전자 발현의 하나 이상의 측면(예를 들어, 세포-유형-특이적 발현, 유도성 발현 등)을 제어하거나 또는 영향을 미칠 수 있다.
대상체: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 래트, 또는 마우스)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태에 취약하다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있지 않다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태의 임의의 증상 또는 특성을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특성인 하나 이상의 특징을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태에 대해 테스트된 대상체, 및/또는 요법이 투여된 대상체이다. 일부 경우에, 인간 대상체는 "환자" 또는 "개인"으로 상호교환가능하게 지칭될 수 있다.
치료제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 대상체에게 투여될 때 원하는 약리학적 효과를 도출하는 임의의 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 제제는 적절한 집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 입증하는 경우 치료제인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 적절한 집단은 모델 유기체 집단 또는 인간 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 집단은 특정 연령군, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 상태 등과 같은 다양한 기준에 의해 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 질환, 장애, 또는 병태의 치료에 사용될 수 있는 물질이다. 일부 구현예에서, 치료제는 인간에게 투여하기 위해 시판될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인되었거나 또는 승인될 필요가 있는 제제이다. 일부 구현예에서, 치료제는 인간에게 투여하기 위해 의학적 처방이 필요한 제제이다.
치료 유효량: 본원에 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 투여되기 위한 원하는 효과를 생성하는 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어는 치료 투약 레지멘에 따라 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있거나 또는 이에 취약한 집단에게 투여될 때 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하기에 충분한 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료 유효량은 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발병률 및/또는 중증도를 감소시키고/시키거나, 이의 발병을 지연시키는 것이다. 당업자는 용어 "치료 유효량"이 실제로 특정 개인에서 달성될 성공적인 치료를 필요로 하지 않음을 이해할 것이다. 오히려, 치료 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 상당한 수의 대상체에서 특정한 원하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 유효량에 대한 언급은 하나 이상의 특이적 조직(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태에 걸린 조직) 또는 체액(예를 들어, 혈액, 타액, 혈청, 땀, 눈물, 소변 등)에서 측정된 바와 같은 양에 대한 언급일 수 있다. 당업자는 일부 구현예에서, 특정 제제 또는 요법의 치료 유효량이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 치료적으로 유효한 제제는 예를 들어, 투약 레지멘의 일부로서 복수의 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다.
치료 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애, 또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 및/또는 원인의 발병을 부분적으로 또는 완전히 완화하고/하거나, 개선하고/하거나, 덜어주고/주거나, 억제하고/하거나, 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나, 이의 발병률을 감소시키거나, 또는 임의의 이러한 결과를 달성하려는 목적을 위해 투여되는 요법의 투여를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애, 또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애, 또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체의 치료일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 또는 병태의 발병 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체의 치료일 수 있다. "예방적 치료"는 치료가 병태가 발병할 위험을 줄이거나, 방지하거나, 또는 감소시키는 목적을 위해 투여되도록 치료될 병태의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 또는 치료될 병태의 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료를 포함한다. 따라서, 예방적 치료는 병태에 대한 예방 치료로서 기능을 한다. "치료적 치료"는 병태의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료를 포함하며 병태의 중증도 또는 진행을 줄이려는 목적을 위해 대상체에게 투여된다.
단위 용량 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단위 용량"은 단일 용량 및/또는 약제학적 조성물의 물리적으로 별개의 단위로 투여되는 양을 지칭한다. 많은 구현예에서, 단위 용량은 미리결정된 양의 활성제, 예를 들면 미리결정된 바이러스 역가(주어진 부피에서 바이러스, 비리온, 또는 바이러스 입자의 수)를 함유한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 제제의 전체 단일 용량을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 단위 용량은 총 단일 용량을 달성하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 의도된 효과를 달성하기 위해 다중 단위 용량의 투여가 필요하거나, 또는 필요할 것으로 예상된다. 단위 용량은 예를 들어, 미리결정된 양의 하나 이상의 치료 모이어티, 미리결정된 양의 고체 형태의 하나 이상의 치료 모이어티, 미리결정된 양의 하나 이상의 치료 모이어티를 함유하는 지속 방출 제형 또는 약물 전달 장치 등을 함유하는 액체(예를 들어, 허용되는 담체)의 부피일 수 있다. 단위 용량은 치료 모이어티(들) 이외에 다양한 구성요소 중 임의의 것을 포함하는 제형에 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 허용되는 담체(예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체), 희석제, 안정화제, 완충제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 많은 구현예에서, 특정 치료제의 적절한 총 일일 투여량은 단위 용량의 일부, 또는 복수를 포함할 수 있고, 예를 들어, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 의사에 의해 결정될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 임의의 특정 대상체 또는 유기체에 대한 특이적 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 이용되는 특이적 활성 화합물의 활성; 이용되는 특이적 조성물; 대상체의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 및 식단; 이용되는 특이적 활성 화합물의 투여 시간, 및 배출률; 치료 지속기간; 이용되는 특이적 화합물(들)과 조합하거나 또는 동시에 사용되는 약물 및/또는 추가적인 요법을 포함하는 다양한 인자, 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 달라질 수 있다.
본원에 제출된 많은 도면은 컬러로 더 잘 이해된다. 출원인은 도면의 컬러 버전을 원본 제출의 일부로 간주하고 이후 절차에서 도면의 컬러 이미지를 제시할 권리를 보유한다.
도 1. 예시적인 벡터 도식. 예시적인 벡터 도식은 제공된 Ad35 벡터의 구현예에서 유용한 통합된 카세트 및 일시적 발현 카세트에서 구성요소의 가능한 배열을 나타낸다. 통합된 카세트는 frt 부위 사이에 트랜스포존 및 다른 구성요소를 포함한다. HDAd 벡터는 γ-글로빈, GFP, mCherry, 및 hFVIII(ET3)과 같은 발현 산물(Exp. Product); EF1α, PGK 프로모터, 또는 β 프로모터와 같은 프로모터(들); mgmtP140K와 같은 선택 마커(들); 프로모터, polyA 꼬리, 및/또는 절연체(예컨대 cHS4)와 같은 조절 요소(Reg. Elements)를 포함할 수 있다. 일시적 발현 카세트는 유사한 구성요소, 뿐만 아니라 DNA 절단 분자(들)(예를 들어, spCas9) 또는 염기 편집기(들) 및 게놈 표적화 가이드(GTG; 예를 들어 sgRNA)를 포함한다. 트랜스포사제 벡터는 표적화 재조합효소(예를 들어, FlpE) 및 트랜스포사제(예를 들어, SB100x)를 포함한다. 벡터는 일 배향/방향으로 예시되어 있지만, 대안적으로 역방향으로 제공될 수 있다.
도 2a-2f. 혈색소병증의 HSPC 유전자 요법을 위한 통합 HDAd5/35++ 벡터.　 (도 2a) 벡터 구조. HDAd-γ-글로빈/mgmt에서, 11.8-kb 트랜스포존은 HDAd-SB 벡터로부터 제공된 과활성 잠자는 미녀(Sleeping Beauty) 트랜스포사제(SB100X)를 통해 통합을 위한 도립된 트랜스포존 반복부(IR) 및 FRT 부위에 의해 플랭킹된다(오른쪽 패널). γ-글로빈 발현 카세트는 4 개의 DNase 과민성(HS) 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR의 4.3-kb 버전 및 0.7-kb β-글로빈 프로모터을 함유한다. 3'-UTR을 포함하는 76-Ile　HBG1　유전자를 사용하였다(적혈구에서 mRNA 안정화를 위함). LCR/β-프로모터 및 EF1A 프로모터 사이의 간섭을 피하기 위해, 1.2-kb 닭 HS4 염색질 절연체(Ins)를 카세트 사이에 삽입하였다. HDAd-SB 벡터는 보편적으로 활성인 PGK 및 EF1A 프로모터 각각의 제어 하에 활성-향상된 SB100X 트랜스포사제 및 Flpe 재조합효소에 대한 유전자를 함유한다. (도 2b) 동원된 CD46tg 마우스의 생체내 형질도입. HSPC를 4 일 동안 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사 이어서 AMD3100의 1회 s.c. 주사에 의해 동원하였다. AMD3100 주사 30 및 60 분 후, 동물에게 HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB의 1:1 혼합물을 i.v. 주사하였다(2 회 주사, 각각 4 Х 1010 개의 바이러스 입자). 마우스를 인간 γ-글로빈 및 MGMTP140K에 대한 면역 반응을 피하기 위해 다음 4 주 동안 면역억제성(IS) 약물로 처리하였다. O6-BG/BCNU 처리를 4 주차에 시작하고 2 주마다 3 회 반복하였다. 각 주기마다 BCNU 농도를 5에서 7.5 내지 10 mg/kg으로 증가시켰다. 면역억제는 마지막 O6-BG/BCNU 주사 후 2 주에 재개하였다. (도 2c) 유세포 분석에 의해 측정된 인간 γ-글로빈+　말초 RBC의 백분율. (도 2d) 말초 혈액 단핵 세포(MNC), 전체 세포, 적혈구 Ter119+ 세포, 및 비적혈구 Ter119- 세포에서 인간 γ-글로빈+ 세포의 백분율. (도 2e) 18 주차에 RBC에서 HPLC에 의해 측정된 성체 마우스 글로빈 쇄(α, β-주요, β-소수)와 비교한 인간 γ-글로빈 단백질의 백분율. (도 2f) 18 주차에 총 말초 혈액 세포에서 RT-qPCR에 의해 측정된 성체 마우스 β-주요 글로빈 mRNA와 비교한 인간 γ-글로빈 mRNA의 백분율. 어떠한 처리도 받지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 도 2c-2f에서, 각 기호는 개별 동물을 나타낸다.
도 3. 생체내 형질도입/선택 후 hCD46tg 대조군 마우스 및 대표적인 CD46tg 마우스로부터의 RBC에서 글로빈 쇄의 HPLC 분석. 숫자(볼트)는 피크 강도를 나타낸다. 각 그룹으로부터 총 4 마리의 마우스를 유사한 결과로 분석하였다. 데이터는 도 2e에 요약되어 있다. 도 3에서, 곡선하 면적(AUC) 값은 상응하는 피크의 왼쪽으로 상쇄된다.
도 4a-4c. 생체내 형질도입 후 18 주차에 수확된 골수 Lin- 세포로 이식받은 마우스("2차 수용자")의 분석. (도 4a) PBMC에서 인간 CD46-양성 세포의 백분율에 기반하여 표시된 시점에 혈액 샘플에서 측정된 생착. (도 4b) 20 주차에 골수, 비장, 및 PBMC에서 생착. (도 4c) RBC에서 HPLC에 의해 측정된 인간 γ- 대 마우스 α-글로빈 단백질의 비율. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. 통계적 분석은 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 수행하였다.
도 5a-5e. 20 주차에 2차 수용자의 골수 세포에서 이식유전자 통합 분석. (도 5a) 골수 세포의 마우스 염색체 상의 통합 부위의 국소화. 대표적인 마우스가 제시된다. 각 라인은 통합 부위이다. 이 샘플에서 통합 부위의 수는 2,197이다. (도 5b) 게놈 영역에서 통합 분포. 5 마리 마우스의 통합 부위 데이터를 풀링하고 사용하여 그래프를 생성하였다. (도 5c) 연속적 게놈 창 및 무작위화 마우스 게놈 창과 중첩되는 통합의 수 및 크기를 비교하였다. 풀링된 데이터를 도 5b)에서와 같이 사용하였다. 유사성에 대한 Pearson의 χ2　검정　P　값은 0.06381이며, 통합 패턴이 무작위에 가깝다는 것을 암시한다. (도 5d) 이식유전자 카피 수. 형질도입되지 않은 대조군 마우스 및 20 주차에 2차 수용자로부터의 총 골수 세포의 게놈 DNA를 인간 γ-글로빈-특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 적용하였다. 개별 동물에 대한 세포 당 카피 수가 제시되어 있다. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. (도 5e) 개별 클론 전구체 콜로니에서 이식유전자 카피 수. 골수 Lin- 세포를 메틸셀룰로스에 플레이팅하고, 개별 콜로니를 15 일 후에 선별하였다. qPCR을 게놈 DNA에 대해 수행하였다. 세포 당 이식유전자 카피 수로서 표현된 개별 콜로니에서 정규화된 qPCR 신호가 제시되어 있다(n　= 113). 각 기호는 단일 세포로부터 유래된 개별 콜로니에서 카피 수를 나타낸다.
도 6. VCN을 측정하기 위한 단일 세포-유래 전구체 콜로니의 qPCR(도 7e 참조).
도 7a-7e. CD46tg 마우스에서 생체내 HSPC 형질도입/선택 후 혈액학적 매개변수(HDAd 주사 후 18 주).　 (도 7a) WBC 계수. (도 7b) 미처리 마우스 및 HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB 주사 후 18 주차 마우스의 대표적인 혈액 도말. 스케일 바: 20 μm. WBC의 핵은 보라색으로 염색된다. (도 7c) 혈액학적 매개변수. Hb, 헤모글로빈; HCT, 적혈구용적률; MCV, 평균 미립자 부피; MCH, 평균 미립자 헤모글로빈; MCHC, 평균 미립자 헤모글로빈 농도; RDW, 적혈구 분포 폭.　 n　≥ 3, *P　< 0.05. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. (도 7d) 18 주차에 희생된 미처리(naive) 마우스(대조군) 및 처리된 마우스의 세포 골수 조성물. 계통 마커-양성 세포(Ter119+, CD3+, CD19+, 및 Gr-1+ 세포) 및 HSPC(LSK 세포)의 백분율이 제시되어 있다. (도 7e) 생체내 형질도입 후 18 주차에 수확된 골수 Lin- 세포의 콜로니-형성 가능성. 2,500 개의 Lin-세포의 플레이팅 후 형성된 콜로니의 수가 제시되어 있다. 도 7a 및 도 7c-7e에서, 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. NE, 호중구; LY, 림프구; MO, 단핵구; BA, 호염구.
도 8. CD46++/Bhhth-3 지중해빈혈 모델의 생성. 암컷 CD46tg 마우스를 수컷 Hbbth-3 마우스와 교배시켰다. F1 하이브리드 마우스를 hCD46+/+ 마우스와 역교배시켜 hCD46+/+에 대해 동형접합성인 Hbbth-3 마우스를 생성하였다
도 9a-9c. CD46+/+/Hbbth-3 마우스 지중해빈혈 모델의 표현형.　 (도 9a) CD46tg(n　= 3) 및 Hbbth-3 마우스(n　= 3)와 비교한 CD46+/+/Hbbth-3 마우스(n　= 7)의 혈액학적 매개변수. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. *P　≤ 0.05, **P　≤ 0.0002, ***P　≤ 0.00003. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. RET, 망상적혈구. (도 9b) May-Grunwald/Giemsa로 염색한 후 대표적인 말초 혈액 도말. 스케일 바: 20 μm. (도 9c) CD46tg 마우스의 비장 및 간 절편(왼쪽 상단 2 개 패널)과 비교하여 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 간 및 비장 절편(왼쪽 하단 2 개 패널)에서 H&E 염색에 의한 골수외 혈구형성. 스케일 바: 20 μm. 간에서 적혈구모세포의 클러스터는 왼쪽 하단 패널에 표시된다. 중간 하단 패널에서 원은 비장의 거핵구를 표시한다. 비장에서 Perl의 프러시안 블루 염색에 의한 철분 침착(입상 푸른빛 침전물)은 CD46tg의 경우 오른쪽 상단 패널 및 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 경우 오른쪽 하단 패널에 제시되어 있다. 스케일 바: 25　μm.
도 10. "건강한" CD46tg 마우스와 비교하여 지중해빈혈 마우스(Hbbth-3 및 CD46+/+/Hbbth-3)의 백혈구 분석. WBC: 백혈구, NEU: 호중구, LY: 림프구, MONO: 단핵구. *p≤0.05, ** p≤0.0002, ***p ≤0.00003. 이들은 처리 전 마우스의 기준선 수준이다. (CD46tg의 경우 n=8, Hbbth3의 경우 n=4, CD46++/Hbbth3의 경우 n=20). 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. 통계적 분석은 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 수행하였다.
도 11. CD46+/+/Hbbth-3 마우스에서 HSPC의 동원. 마지막 AMD3100 주사 1 시간 후에 말초 혈액에서 동원된 LSK(계통-/Sca-1+/c-Kit+/) 세포의 수가 제시되어 있다. n=17 동원된 마우스; n=3 미처리 마우스. 통계적 분석은 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 수행하였다.
도 12. 동원된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 생체내 형질도입/선택. 동원된 CD46+/+/Hbbth3 마우스의 생체내 형질도입. HSPC를 6 일 동안 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사(1-6 일) 이어서 AMD3100/플레릭사포르(Plerixafor)의 3 회 s.c 주사(5-7 일)에 의해 동원하였다. 플레릭사포르 주사 30 및 60 분 후, 동물에게 HDAd-γ-글로빈/mgtm + HDAd-SB의 1:1 혼합물을 정맥내로 주사하였다(2 회 주사, 각각 4x1010 vp). 생체내 형질도입 후, 인간 γ-글로빈 및 MGMTP140K 단백질에 대한 면역 반응을 피하기 위해 면역-억제를 17 주 동안 투여하였다. 17 주차에, 처리된 마우스는 2차 이식을 위한 공여자로서 제공되거나 또는 O6-BG/BCNU로 생체내 선택에 적용되었다. 2차 C57Bl/6 수용자를 면역억제 하에 16 주 동안 추적한 다음 희생시켰다. 생체내 선택에 적용된 마우스는 격주마다 증가하는(5, 7.5, 10, 10　mg/kg) O6-BG/BCNU 처리를 받았다. 마지막 O6-BG/BCNU 용량 2 주 후에 면역-억제를 재개하였다. 29 주차에, 마우스를 희생시키고, 이들의 골수를 C57Bl/6 2차 수용자 내로 이식하였다.
도 13a-13f. O6BG/BCNU 처리를 받지 않은 생체내-형질도입된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 분석. (도 13a) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 RBC에서 인간 γ-글로빈의 백분율. 실험을 3 회 수행하고, 상이한 기호 모양으로 표시하였다. (도 13b) 적혈구(Ter119+) 및 비적혈구(Ter119-) 혈액 세포에서 γ-글로빈 발현. 일원 ANOVA 검정에 의해 ***P　≤ 0.00003. (도 13c) 건강한(CD46tg) 마우스(n　= 3), 동원 및 생체내 형질도입 전의 CD46+/+/Hbbth-3 마우스(n　= 14), 및 생체내 형질도입을 겪고 16 주차에 분석된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스(n　= 8)의 RBC 분석. *P　≤ 0.05. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. (도 13d) 조직학적 표현형. 상단: 혈액 도말. 중간: 망상적혈구 검출을 위해 브릴리언트 크레실 블루(Brilliant cresyl blue)를 사용한 말초 혈액 도말의 초생체 염색. 대표적인 도말에서 양성으로 염색된 망상적혈구의 백분율은 다음과 같았다: CD46tg의 경우, 8% ± 0.8%; 형질도입 전 CD46+/+/Hbbth-3의 경우, 39% ± 1.3%; 및 형질도입 후 16 주차 CD46+/+/Hbbth-3의 경우, 26% ± 0.45%. 하단: 골수외 혈구형성. 스케일 바: 20 μm. (도 13e 및 도 13f) 2차 수용자의 분석. 16 주차에 생체내-형질도입된 마우스의 총 골수를 준치사량의 부술판 예조건화를 받은 C57BL/6 마우스 내로 이식하였다. 마우스는 관찰 기간 동안 면역억제를 받았다. (도 13e) 인간 CD46+(hCD46+) PBMC의 백분율에 기반한 생착. (C57BL/6 수용자는 hCD46을 발현하지 않는다.) (도 13f) 인간 γ-글로빈+　RBC의 백분율. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다.
도 14a-14f. 생체내 선택 후 생체내-형질도입된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스에서 γ-글로빈 발현의 분석.　 (도 14a) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 RBC에서 인간 γ-글로빈의 백분율. 화살표는 O6-BG/BCNU 처리 시점을 나타낸다. 상이한 기호는 3 개의 독립적인 실험을 나타낸다. 16 주차까지의 데이터는 도 13a에서의 것들과 동일하다. (도 14b) 유세포 분석에 의해 분석된 희생 시(29 주) 조혈 조직에서 γ-글로빈-발현 세포의 백분율. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.0002, ***P ≤ 0.00003. (도 14c) MACS-정제된 Ter119 세포에서 γ-글로빈 발현. 29 주차에 1차 수용자로부터의 골수 세포를 Ter119+ 세포에 대해 면역자기적으로 선택하였다. γ-글로빈 발현을 유세포 분석에 의해 Ter119+　및 Ter119- 세포에서 측정하였다. ***P≤ 0.0002. (도 13d) 생체내 선택 전 대 후(16 주 vs. 29 주)에 말초 혈액, 골수, 및 비장에서 γ-글로빈+　적혈구(Ter119+) 및 비적혈구(Ter119-) 세포의 배수 강화.　 n　= 5, **P≤ 0.0002. (도 14e) RBC에서 HPLC에 의해 측정된 마우스 α-글로빈 단백질과 비교한 인간 γ-글로빈 단백질의 백분율. 통계적 분석은 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 수행하였다. (도 14f) 말초 혈액 세포에서 RT-qPCR에 의해 측정된 성체 마우스 β-주요 글로빈 mRNA에 대한 인간 γ-글로빈 mRNA의 수준. 미처리 CD46+/+/Hbbth-3 마우스를 대조군으로 사용하였다. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다.
도 15a-15d. RBC에서 글로빈 쇄의 HPLC 분석. (도 15a) 대조군 CD46tg 마우스에서 마우스 글로빈 피크의 대표적인 크로마토그램. 성체 마우스 알파(α), 베타(β)-소수, 및 β-주요 글로빈에 대한 피크가 표지된다. (도 15b-15d) CD46+/+/Hbbth-3 마우스(#71)의 RBC 크로마토그램. 이들 마우스는 β-소수 및 β-주요 유전자 결실에 대해 이형접합성임을 유의한다. 약 29 분의 추가 피크가 이와 연관될 수 있다. (도 15d)에서, 인간 γ-글로빈에 특이적인 피크가 표지된다. 대표적인 크로마토그램이 제시되어 있다. 숫자(볼트)는 피크 강도를 나타낸다. 도 15c 및 15d에서, AUC 값은 상응하는 피크의 왼쪽으로 상쇄된다.
도 16. 29 주차에 처리된 CD46++/Hbbth-3 마우스의 DNA 분석. 골수 세포 당 이식유전자(γ-글로빈) 카피 수. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다.
도 17a-17e. 생체내 HSPC 형질도입/선택에 의한 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 표현형 교정. (도 17a) 건강한(CD46tg) 마우스, 동원 및 생체내 형질도입 전의 CD46+/+/Hbbth-3 마우스, 및 생체내 형질도입/선택을 겪은 (HDAd 투입 후 29 주차에 분석됨) CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 RBC 분석(n　= 5). *P≤ 0.05, **P≤ 0.0002, ***P≤ 0.00003. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. (도 17b) 망상적혈구 검출을 위해 브릴리언트 크레실 블루를 사용한 말초 혈액 도말의 초생체 염색. 화살표는 특징적인 잔여 RNA 및 미세-세포기관을 함유하는 망상적혈구를 나타낸다. 대표적인 도말에서 양성으로 염색된 망상적혈구의 백분율은 다음과 같았다: CD46의 경우, 7%; 처리전 CD46+/+/Hbbth-3의 경우, 31%; 및 처리후 CD46+/+/Hbbth-3의 경우, 12%. 스케일 바: 20 μm. (도 17c) 상단: 혈액 도말. 스케일 바: 20 μm. 중간: 골수 사이토스핀. 화살표는 상이한 성숙 단계에서 적혈구모세포 및 처리된 마우스에서 전적혈구모세포가 우세한 적혈구생성의 역행을 나타낸다. 스케일 바: 25　μm. 하단: Perl의 염색에 의한 조직 혈철소증. 철분 침착은 비장 조직 절편에서 헤모시데린의 세포질 청색 색소로 제시된다. (도 17c) 및 (도 18d)에서 대조군 마우스(CD46tg 및 CD46+/+/Hbbth-3, 형질도입 전)에 대한 혈액 도말 이미지는 동일한 샘플로부터의 것이다. (도 17d) 1 개의 대표적인 CD46tg 및 1 개의 미처리 CD46+/+/Hbbth-3 마우스 및 5 개의 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 거시적 비장 이미지. (도 17e) 희생 시, 비장 크기를 비장 체중 대 총 체중의 비(mg/g)로 결정하였다. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. *P≤ 0.05. 통계적 분석은 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 18a-18e. 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스로부터의 골수 세포가 이식된 2차 C57BL/6 수용자의 분석. (도 18a) 부술판 조건화 또는 전신 조사(TBI) 후 PMBC에서 인간 CD46+　(hCD46+) 세포의 백분율에 기반한 주변부에서 측정된 생착률. (C57BL/6 수용자는 hCD46을 발현하지 않는다.) (도 18b) 인간 γ-글로빈-발현 말초 혈액 RBC의 백분율. 모든 마우스는 이식 후 4 주부터 시작하여 면역억제를 받았다. (도 18c) hCD46+(공여자-유래) 세포에서 γ-글로빈+ 세포의 백분율. (도 18c 및 도 18d) 이식 후 20 주차에 2차 C57BL/6 수용자에서 γ-글로빈/CD46 발현(부술판 예조건화). CD46+ 세포를 3 개의 대표적인 2차 마우스의 키메라 골수로부터 면역자기적으로 분리하고 유세포 분석에 의해 γ-글로빈 발현에 대해 분석하였다. 특히, 인간과 달리, huCD46tg 마우스는 RBC 상에서 CD46을 발현한다. (도 18c) 희생 시 1차 및 2차 수용자의 γ-글로빈/CD46 마킹률. (도 18d) 2차 수용자의 조혈 조직으로부터의 CD46+-선택된 세포에서 γ-글로빈 발현(20 주). 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. (도 18e) 신규(두번째) 차례의 HSPC 동원/생체내 형질도입을 받은 2차 수용자에서 γ-글로빈 발현(n　= 5). 2차 수용자(부술판-예조건화)를 이식 후 20 주차에 γ-글로빈 및 CD46 발현에 대해 분석하였다("생체내 형질도입 전"). 그런 다음 이들 마우스를 동원하고 HDAd-γ-글로빈 및 HDAd-SB 벡터로 생체내 형질도입하였다. 생체내 형질도입 4 주 후, 마우스를 희생시키고 분석하였다("생체내 형질도입 후 4 주"). ***P≤ 0.00003. 통계적 분석은 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 19a-19d. CD46+/+/Hbbth-3 마우스 모델에서 생체내 형질도입/선택의 안전성. (도 19a) 생체내 선택 동안 및 후에 WBC 및 혈소판(PLT) 계수. O6BG/BCNU 처리는 별표로 표시된다.　 n　≥ 3. (도 19b) 순환 WBC 하위집단의 절대 수. 　n　≥ 3. (도 19c) 29 주차에 희생된 대조군 및 처리된 마우스에서 세포 골수 조성물. 계통 마커-양성 세포(Ter119+, CD3+, CD19+, 및 Gr-1+ 세포) 및 HSPC(LSK 세포)의 백분율이 제시된다. (도 19d) 29 주차에 수확된 골수 세포의 콜로니-형성 가능성. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.0002, ***P ≤ 0.00003. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. NEU: 호중구; LY: 림프구; MO: 단핵구.
도 20a-20f. 두번째 차례의 형질도입에 대한 항-HDAd5/35++ 항체의 효과. (도 20a) CD46tg 마우스를 동원하고 HDAd-mgmt/GFP + HDAd-SB를 주사하였다. 혈청 샘플을 나타낸 바와 같이 수집하였다. (도 20b, 도 20c) 동원/형질도입 후 4 일차 및 4 주차에 PBMC의 유세포 분석 분석. (도 20d) 4 주차에 두번째 차례의 동원/형질도입 및 후속 GFP 분석. (도 20e) OD450에 기반한 항-HDAd5/35++ 항체 역가. OD450=0.2 역가는 중화하는 것으로 간주된다. (도 20f) 상이한 코호트에서 측정된 GFP-양성 PBMC의 백분율(도 20b-20d 참조). Ctrl은 미처리 CD46tg 마우스이다. (도 20e) 및 (도 20f)에서 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. 통계적 분석은 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 수행하였다.
도 21a-21d. HDAd 주사 후 18 주차(생체내 선택 10 주)에 벡터 DNA 생물분포(도 21a) 프라이머 설계. 연회색 프라이머는 이식유전자 카세트에 특이적이고 통합 및 에피솜 벡터 DNA를 둘 다 검출할 것이다. 진회색 프라이머는 플라스미드 pHCA로부터 유래된 벡터 스터퍼(stuffer) DNA를 검출할 것이다. SB100x-매개 통합 시, 진회색 프라이머에 대해 상응하는 표적 영역은 손실될 것이다. 따라서 진회색 프라이머를 사용하여 에피솜 벡터 카피를 측정한다. (도 21b) 통합된 이식유전자 카피 수의 표준 곡선. (도 21c) HCA(에피솜 벡터) 카피 수에 대한 표준 곡선. (도 21d) 세포 당 통합된 이식유전자 카피 수. 에피솜 벡터 카피(진회색 프라이머)를 총 벡터 카피에서 차감하였다(연회색 프라이머). 벡터-특이적 신호는 GAPDH로 정규화하였다. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다.
도 22a-22c. O6BG/BCNU 처리의 돌연변이원성을 평가하기 위한 시험관내 검정. (도 22a) 동결보존으로부터 밤새 회복시킨 후, CD34+ 세포를 2 일 후 세포의 50%에서 GFP 발현이 매개되는 3000 vp/세포의 MOI에서 HDAd-mgmt/GFP 또는 HDAd 대조군으로 형질도입하였다. 그런 다음 세포를 10　mM O6BG 이어서 25　mM BCNU(또는 DMSO 용매)로 2 시간 동안 처리하였다. 세척 후, 세포를 CFU 검정을 위해 메틸셀룰로스에 플레이팅하였다(35　mm 접시 당 3000 개 세포). 콜로니 및 풀링된 세포를 14 일 후에 계수하고 게놈 DNA를 전체 엑솜 서열분석에 적용하였다. (도 22b) 플레이트 당 풀링된 세포의 수. 각 기호는 개별 35　mm 접시에서 세포 수를 나타낸다. 통계적 분석은 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 수행하였다. (도 22c) HDAd-mgmt/GFP + O6BG/BCNU 그룹으로부터의 대표적인 콜로니. 에피솜 바이러스 게놈의 손실로 인해 콜로니 주변부에서 GFP가 희미해지는 대부분의 세포에서 GFP 발현을 입증한다. 스케일 바는 1　mm이다.
도 23. 벡터 구조. HDAd-짧은-LCR: 이 벡터는 DNase 과민성 부위(HS) 1 내지 4의 코어 영역으로 이루어진 4.3　kb 미니-LCR 및 0.66　kb β-글로빈 프로모터를 함유한다. 트랜스포존의 길이는 11.8　kb이다. HDAd-긴-LCR. γ-글로빈 유전자는 21.5　kb β-글로빈 LCR(chr11: 5292319-5270789), 1.6　kb β -글로빈 프로모터(예를 들면, chr11: 5228631-5227023 또는 chr11: 5228631-5227018) 및 또한 β-글로빈 유전자좌로부터 유래된 3'HS1 영역(chr11: 5206867-5203839)의 제어 하에 있다. 적혈구 세포에서 RNA 안정화를 위해, γ-글로빈 유전자 UTR을 γ-글로빈 유전자의 3' 단부에 연결하였다. 벡터는 또한 mgmtP140K에 대한 발현 카세트를 함유하여 형질도입된 HSPC 및 HSPC 자손의 생체내 선택을 허용한다. γ-글로빈 및 mgmt 발현 카세트는 닭 글로빈 HS4 절연체(cHS4)에 의해 분리된다. 32.4　kb LCR- γ-글로빈/mgmt 트랜스포존은 SB100x에 의해 인식된 도립 반복부(IR) 및 Flpe 재조합효소에 의한 트랜스포존의 원형화를 허용하는 ftr 부위에 의해 플랭킹된다. HDAd-SB: 통합에 필요한 제2 벡터는 활성-향상된 잠자는 미녀 SB100x 트랜스포사제 및 Flpe 재조합효소에 대한 발현 카세트를 함유한다.
도 24a-24f. HDAd-긴-LCR을 사용한 생체외 HSPC 형질도입 연구 후 32.4　kb 트랜스포존의 SB100x-매개 통합. (도 24a) 실험적 레지멘: CD46-유전자이식 마우스로부터의 골수 Lin- 세포를 HDAd-긴-LCR 및 HDAd-SB로 500　vp/세포의 총 MOI에서 형질도입하였다. 배양 1 일후, 마우스 당 1x106 개의 형질도입된 세포를 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스 내로 이식하였다. 4 주차에, O6BG/BCNU 처리를 시작하고 2 주마다 4 회 반복하였다. 각 주기마다, BCNU 농도를 5　mg/kg에서 7.5　mg/kg, 내지 10　mg/kg(2 회)까지 증가시켰다. 20 주차에, 마우스를 희생시켰다. (도 24b) 유세포 분석에 의해 측정된 인간 γ-글로빈-양성 말초 적혈구(RBC)의 백분율. 각 기호는 개별 동물이다. (도 24c) 이식 후 20 주차에 적혈구(Ter119+) 골수 세포(하부 패널)에서 인간 γ-글로빈-발현을 나타내는 대표적인 유세포 분석 데이터. 상단 패널은 모의-형질도입된 세포로 이식된 마우스를 나타낸다. (도 24d) iPCR 분석의 도식: 5 마이크로그램의 게놈 DNA을 SacI로 소화시키고, 재결찰시키고, 표시된 프라이머를 사용하여 중첩 역PCR에 적용하였다(재료 및 방법 참조). (도 24e) 통합 접합부를 함유하는 클로닝된 플라스미드의 아가로스 겔 전기영동. 표시된 밴드를 절제하고 서열분석하였다. 통합 부위의 염색체 국소화는 겔 아래에 제시된다. (도 24f) 접합부 서열의 예: 5' 단부 벡터 서열, 잠자는 미녀 IR/DR 서열, 통합 접합부(chr15, 6805206) 서열번호: 1; 5' 단부 벡터 서열, 잠자는 미녀 IR/DR 서열, 통합 접합부(chrX, 16897322) 서열번호: 2; 3' 단부 벡터 서열, 잠자는 미녀 IR/DR 서열, 통합 접합부(chr4, 10207667) 서열번호: 3. 벡터체 및 IR/DR 서열은 각각 평문 및 밑줄로 지정된다. 염색체 서열은 굵은 글씨로 지정된다. IR 및 염색체 DNA의 접합부에서 SB100x에 의해 사용되는 TA 디뉴클레오티드는 괄호에 표시된다.
도 25a-25e. 32.4　kb 트랜스포존을 함유하는 HDAd-긴-LCR 및 11.8　kb 트랜스포존을 함유하는 HDAd-짧은-LCR을 사용한 생체내 HSPC 형질도입. (도 25a) 처리 레지멘: hCD46tg 마우스를 동원하고 HDAd-짧은-LCR + HDAd-SB 또는 HDAd-긴-LCR +HDAd-SB를 IV 주사하였다(두 바이러스의 1:1 혼합물의 각각 4x1010 vp 2 회). 5 주 후, O6BG/BCNU 처리를 시작하였다. 각 주기마다, BCNU 농도를 5　mg/kg에서 7.5　mg/kg, 및 10　mg/kg까지 증가시켰다. O6BG 농도는 4 개 처리 모두에서 30　mg/kg이었다. 분석을 위해 동물이 희생된 20 주까지 마우스를 추적하였다. 골수 Lin- 세포를 2차 수용자 내로의 이식을 위해 사용하였다. 그런 다음 2차 수용자를 16 주 동안 추적하였다. (도 25b) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 적혈구 (RBC)에서 인간 γ-글로빈-양성 세포의 백분율. 각 기호는 개별 동물이다. 모의-형질도입된 마우스에서, 0.1% 미만의 세포는 γ -글로빈-양성이었다. (도 25c) 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 RBC에서 HPLC에 의해 측정된 γ-글로빈 단백질 쇄 수준. 마우스 α-글로빈 단백질 쇄에 대한 인간 γ-글로빈의 백분율이 제시된다. (도 25d) 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 전체 혈액에서 qRT-PCR에 의해 측정된 γ-글로빈 mRNA 수준. 마우스 α -글로빈 mRNA에 대한 인간 γ-글로빈 mRNA의 백분율이 제시된다. (도 25e) 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 수확된 골수 단핵 세포에서 세포 당 벡터 카피 수. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 26a-26d. 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 혈액학적 매개변수. (도 26a) 백혈구(WBC), 호중구(NE), 백혈구(LY), 단핵구(MO), 호산구(EO), 및 호염구(BA). (도 26b) 적혈구생성 매개변수. RBC: 적혈구, Hb: 헤모글로빈, MCV: 평균 미립자 부피, MCH: 평균 미립자 헤모글로빈, MCHC: 평균 미립자 헤모글로빈 농도, RDW: 적혈구 분포 폭. 세 그룹 사이의 차이는 유의하지 않았다. (도 26c) 세포 골수 조성물. (도 26d) 골수 Lin- 세포의 콜로니-형성 가능성. 그룹 사이의 차이는 도 26a-26d에서 유의하지 않았다.
도 27. 삽입 부위 분석의 도식. 잠자는 미녀 도립 반복부(IR)와 관련하여 HDAd-긴-LCR 벡터에서 NheI 및 KpnI 부위의 국소화가 표시된다. 이들 효소는 근접하지만, SB IR/DR의 외부를 절단하고 통합되지 않은 벡터의 배경을 감소시키는 데 사용된다. 골수 Lin- 세포로부터의 게놈 DNA를 NheI 및 KpnI로 소화시키고, 열 불활성화 후, NlaIII으로 추가로 소화시켰다. NlaIII은 4-절단기이며 작은 DNA 단편을 생성할 것이다. 그런 다음 소화된 DNA를 서열이 알려지고 소화된 NlaIII 단편에 대한 호환가능한 단부가 있는 이중 가닥 올리고와 결찰시켰다. 열-불활성화 및 정리 후, 링커-결찰된 생성물을 선형 증폭에 사용하여, SB 왼쪽 아암으로부터 프라이밍된 단일-가닥(ss) DNA 집단을 생성하였다. 프라이머는 비오티닐화되어, ssDNA는 스트렙타비딘 비드로 수집될 수 있다. 광범위한 세척 후, ssDNA를 비드로부터 융출시키고 2 차례의 중첩 PCR에 의해 추가로 증폭시켰다. PCR 앰플리콘을 겔 정제하고, 클로닝하고, 서열분석하고 마우스 게놈 서열에 맵핑하여 통합 부위를 표시하였다.
도 28a-28d. LAM-PCR/NGS에 의한 HSPC에서 벡터 통합 부위의 분석. HDAd-긴-LCR + HDAd-SB를 사용한 생체내 형질도입 후 20 주차에 수확된 골수 세포로부터 단리된 게놈 DNA. (도 28a) 통합 부위의 염색체 분포. 통합 부위는 수직선으로 표시된다. (도 28b) 접합부 서열의 예: 잠자는 미녀 IR/DR 서열, 통합 접합부(chr7, 79796094) 서열번호: 4; 잠자는 미녀 IR/DR 서열, 통합 접합부(반복 영역) 서열번호: 5. IR/DR 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 지정된다. 염색체 서열은 평문으로 지정된다. IR 및 염색체 DNA의 접합부에서 SB100x에 의해 사용된 TA 디뉴클레오티드는 굵은 글씨이다. (도 28c) 통합 부위를 마우스 게놈에 맵핑하고 유전자에 대한 이의 위치를 분석하였다. 1 kb 상류 전사 시작 부위(TSS)(0.0%), 엑손의 5'UTR(0.0%), 단백질 코딩 서열(0.0%), 인트론(17.0%), 3'UTR(0.0%), 3'UTR에서 1 kb 하류(0.0%), 및 유전자간(83.0%)이 발생한 통합 사건의 백분율이 제시된다. (도 28d) 마우스 게놈 창에서의 통합 패턴. 연속적 게놈 창 및 무작위화 마우스 게놈 창과 중첩된 통합의 수 및 크기를 비교하였다. 이는 통합 패턴이 연속 및 무작위 창에서 유사함을 나타낸다. 임의의 주어진 창에서 최대 통합 수는 3 이하였으며; 창 당 하나의 통합은 발생률이 더 높다.
도 29a-29i. 2차 수용자의 분석. 생체내 형질도입된 CD46tg 마우스로부터 20 주차에 수확된 골수 Lin- 세포를 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스 내로 이식하였다. 2차 수용자를 16 주 동안 추적하였다. (도 29a) 이식 후 4, 8, 12, 및 16 주차에 CD46-양성 PBMC의 백분율에 기반한 생착률. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않았다. (도 29b) 유세포 분석에 의해 측정된 γ-글로빈- 발현 말초 혈액 RBC의 백분율. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다. (도 29c) 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 수확된 골수 MNC에서 세포 당 벡터 카피 수. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다. (도 29d) 2차 수용자의 RBC에서 HPLC에 의한 인간 γ-글로빈 쇄의 분석. 성체 마우스 α-글로빈에 대한 인간 γ-글로빈의 백분율이 제시된다. *** p<0.0001. (도 29e) 마우스 α-글로빈 mRNA에 비해 전체 혈액 세포에서 γ-글로빈 mRNA 수준. (도 29f) 모든 골수 MNC에서 적혈구(Ter119+ 세포)를 발현하는 γ-글로빈의 백분율. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. (도 29g) p.t. 16 주차에 γ-글로빈 mRNA 수준 골수 MNC 마우스 α 및 β-주요 글로빈 mRNA에 대한 인간 γ-글로빈 m-RNA의 백분율이 제시된다. (도 29h) 적혈구 특이성. 적혈구(Ter119+) 및 비-적혈구(Ter119-) 세포에서 γ-글로빈+ 세포의 백분율. (도 29i) 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 수확된 골수 MNC에서 세포 당 벡터 카피 수(VCN). 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다.
도 30a-30d. 이식 후 16 주차에 2차 수용자에서 혈액학적 매개변수. (도 30a) 백혈구. (도 30b) 적혈구생성 매개변수. RBC: 적혈구, Hb: 헤모글로빈, MCV: 평균 미립자 부피, MCH: 평균 미립자 헤모글로빈, MCHC: 평균 미립자 헤모글로빈 농도, RDW: 적혈구 분포 폭. (도 30c) 세포 골수 조성물. (도 30d) 골수 Lin- 세포의 콜로니-형성 가능성. 그룹 사이의 차이는 도 30a - 30d에서 유의하지 않았다. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 31a-31d. 인간 CD34+ 세포를 사용한 시험관내 연구. (도 31a) 실험의 도식: CD34+ 세포를 HDAd-긴-LCR + HD-SB 또는 HDAd-짧은-LCR + HDAd-SB로 형질도입하고 적혈구 분화(ED)에 적용하였다. O6BG-BCNU를 사용한 시험관내 선택을 ED의 5 일차에 시작하였다. 18 일차에 세포를 유세포 분석(도 31b) 및 HPLC(도 31c)에 의해 분석하였다. (도 31d) 18 차에 벡터 카피 수. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. * p<0.05; ** p<0.0001
도 32a-32h. HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR을 사용한 Hbbth3/CD46 마우스의 생체내 HSC 유전자 요법 후 인간 γ -글로빈 발현. (도 32a) 처리 레지멘. 도 25a-25e와 대조적으로, 도 32a-32d는 지중해빈혈 Hbbth3/CD46 마우스 내의 결과를 나타낸다. (도 32b) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 적혈구(RBC)에서 인간 γ -글로빈-양성 세포의 백분율. 각 기호는 개별 동물이다. (도 32c) 생체내 HSPC 형질도입 후 18 주차에 RBC에서 HPLC에 의해 측정된 γ -글로빈 단백질 쇄 수준. 마우스 α -글로빈 단백질 쇄에 대한 인간 γ-글로빈의 백분율이 제시된다. (도 32d) 미처리 Hbbth3/CD46 마우스(왼쪽 패널) 및 처리 후 21 주차에 마우스의 대표적인 크로마토그램. 마우스 α- 및 β-쇄 뿐만 아니라 추가된 인간 γ -글로빈이 표시된다.
도 32e - 32h. HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR을 사용한 Hbbth3/CD46+/+ 마우스의 생체내 HSPC 유전자 요법 후 인간 γ-글로빈 발현. (도 32e) 처리 레지멘: 도 25에 제시된 연구와 대조적으로, 이 연구는 지중해빈혈 Hbbth3/CD46 마우스를 사용하여 수행하였다. (도 32f) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 적혈구(RBC)에서 인간 γ-글로빈-양성 세포의 백분율. 각 기호는 개별 동물이다. (도 32g) 생체내 HSPC 형질도입 후 10 내지 16 주차에 RBC에서 HPLC에 의해 측정된 γ-글로빈 단백질 쇄 수준. 마우스 α-글로빈 단백질 쇄에 대한 인간 γ-글로빈의 백분율이 제시된다. (도 32h) 미처리 Hbbth3/CD46+/+ 마우스(왼쪽 패널) 및 처리 후 16 주차에 마우스의 대표적인 크로마토그램. 마우스 α- 및 β- 쇄 뿐만 아니라 추가된 인간 γ-글로빈이 표시된다. 특히, 2 개의 독립적인 연구를 Hbbth3/CD46+/+ 마우스를 사용하여 수행하였다. 첫번째 연구: HD-긴-LCR의 경우 N=6 및 HDAd-짧은-LCR의 경우 N=2를 21 주 동안 추적하였다. 두번째 연구: HD-긴-LCR의 경우 N=4 및 HDAd-짧은-LCR의 경우 N=5를 16 주 동안 추적하였다. 도 32f는 21 주까지 조합된 데이터를 나타낸다. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. * p<0.05; ** p<0.0001
도 33a, 33b. 희생 시 골수의 분석. 골수를 Hbbth3/CD46+/+ 마우스를 사용한 생체내 HSPC 형질도입 후 16 주차에 수집하였다. (도 33a) 골수 MNC에서 세포 당 벡터 카피 수. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다. (도 33b) 적혈구(Ter119+) 세포에서 γ-글로빈의 평균 형광 강도(MFI). 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 34. 처리 전 및 긴 LCR로 처리 후 10 주차에, C57BL6(정상 마우스) 및 Townes SCA 마우스의 정규화된 적혈구 형태학을 나타내는 현미경 사진.
도 35. 처리 전 Townes 마우스, 및 처리 후(긴 LCR) 10 주차에 Townes 마우스에 대한 정규화된 적혈구생성(망상적혈구 계수)을 나타내는 현미경 사진.
도 36a-36c. 표현형 교정. (도 36a, 36b) 왼쪽 패널은 Griemsa 염색으로 염색된 혈액 도말을 나타내고 오른쪽 패널은 May-Grunwald 염색으로 염색된 혈액 도말을 나타내는 혈액 세포 형태학. 망상적혈구에서 잔여 핵 및 세포질은 보라색으로 염색된다. (도 36a) 처리 전 및 14 주 차의 비교. (도 36b) CD46tg, 처리 전 Hbbth3/CD46 마우스, 18 주차에 HDAd-긴-LCR로 처리된 Hbbth3/CD46 마우스, 및 21 주차에 HDAd-긴-LCR로 처리된 Hbbth3/CD46 마우스에 대한 Giemsa 염색 및 망상적혈구의 비교. (도 36c) 골수 사이토스핀. 처리된 전적혈구모세포 우세와 함께 적혈구생성의 bac k-이동이 보인다. 스케일 바는 20　μm이다.
도 37a, 37b. 표현형 교정(16 주). (도 37a) 왼쪽 패널:
Figure pct00001
염색으로 염색된 혈액 도말(5 분). 오른쪽 패널: 망상적혈구에 대해 브릴리언트 크레실 블루로 염색된 혈액 도말. 망상적혈구에서 잔여 핵 및 세포질은 보라색 염색으로 보인다. (도 37b)
Figure pct00002
염색으로 염색된 골수 사이토스핀(15 분). (도 37a 및 37b) 상부 패널: 정상 골수 세포 분포 - 적혈구 계통은 적혈구 분화의 모든 단계에 의해 나타난다. 중간 패널: 백혈구 계통보다 적혈구 계통의 우세 - 적혈구 계통은 주로 전적혈구모세포 및 호염기성 적혈구모세포로 이루어진다. 하단 패널: 정상 골수 세포 분포 - 적혈구 계통은 주로 성숙한 다염성 및 정염성 적혈구모세포에 의해 나타난다. 스케일 바는 25　μm이다.
도 38: 1 주차(상단 패널) 및 10 주차(하단 패널)에 긴 LCR 벡터, 짧은 LCR 벡터, 및 대조군 CD46tg의 정규화된 적혈구 매개변수에 대한 그래프 묘사가 제시된다.
도 39a, 39b. Hbbth3/CD46+/+ 마우스의 생체내 HSPC 유전자 요법 전 및 후의 혈액학적 매개변수(16 주). (도 39a) 망상적혈구 계수. (도 39b) 혈액학적 매개변수. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. * p<0.05; ** p<0.0001
도 40a, 40b. 비장 및 간에서 골수외 조혈의 표현형 교정. (도 40ai) 희생 시 비장 크기(16 주). 왼쪽 패널: 대표적인 비장 이미지. 오른쪽 패널: 요약. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. 통계적 분석은 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. ** p<0.0001. 두 벡터 사이의 차이는 유의하다. (도 40b) 간 및 비장 절편에서 헤마톡실린/에오신 염색에 의한 골수외 혈구형성. Hbbth3/CD46+/+ 마우스에서 간의 적혈구모세포 및 비장에서 거핵구의 클러스터는 검은색 화살표로 표시된다. 스케일 바는 20　μm이다. 대표적인 이미지가 제시된다.
도 41. 비장 및 간에서 혈철소증의 표현형 교정(16 주). 철분 침착은 비장 및 간 절편에서 헤모시데린의 세포질 청색 색소로 Perl의 염색에 의해 제시된다. 스케일 바는 20　μm이다. 대표적인 절편이 제시된다. (Exp: 2.24　ms, 이득: 4.1x, 포화: 1.50, 감마: 0.60).
도 42a-42c. 희생 시 골수의 분석(21 주). 골수를 Hbbth3/CD46tg 마우스의 생체내 HSC 형질도입 후 21 주차에 수확하였다. (도 42a) 골수 MNC에서 세포 당 벡터 카피 수. (도 42b, 42c) γ-글로빈 발현의 적혈구 특이성. (도 42b) γ-글로빈 발현 적혈구(Ter119+) 및 비-적혈구(Ter119-) 세포의 백분율. *p<0.05. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 43. 아데노바이러스 공여자 벡터의 투여 전에 CD46tg 및 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 간 및 비장 절편에서 헤마톡실린/에오신 염색에 의한 골수외 혈구형성. 철분 침착은 비장에서 헤모시데린의 세포질 청색 색소로서 Perl의 염색에 의해 제시된다.
도 44a-44e. 생체내 HSPC 형질도입/선택에 의한 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 표현형 교정. (도 44a) 건강한(CD46tg) 마우스, 동원 및 생체내 형질도입 전의 CD46+/+/Hbbth-3 마우스, 및 생체내 형질도입/선택을 겪은 CD46+/+/Hbbth-3 마우스(HDAd 주입 후 29 주차에 분석됨)의 RBC 분석(n = 5). *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.0002, ***P ≤ 0.00003. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. (도 44b) 망상적혈구 검출을 위해 브릴리언트 크레실 블루를 사용한 말초 혈액 도말의 초생체 염색. 화살표는 특징적 잔여 RNA 및 미세-세포기관을 함유하는 망상적혈구를 나타낸다. 대표적인 도말에서 양성으로 염색된 망상적혈구의 백분율은 다음과 같았다: CD46의 경우, 7%; 처리 전 CD46+/+/Hbbth-3의 경우, 31%; 및 처리 후 CD46+/+/Hbbth-3의 경우, 12%. 스케일 바: 20 μm. (도 44c) 상단: 혈액 도말. 스케일 바: 20 μm. 중간: 골수 사이토스핀. 화살표는 상이한 성숙 단계에서 적혈구모세포 및 처리된 마우스에서 우세한 전적혈구모세포가 적혈구 생성에서 역행을 나타낸다. 스케일 바: 25 μm. 하단: Perl의 염색에 의한 조직 혈철소증. 철분 침착은 비장 조직 절편에서 헤모시데린의 세포질 청색 색소로서 제시된다. c 및 도 5d에서 대조군 마우스(CD46tg 및 CD46+/+/Hbbth-3, 형질도입 전)에 대한 혈액 도말 이미지는 동일한 샘플로부터 유래된다. (도 44d) 1 개의 대표적인 CD46tg 및 1 개의 미처리 CD46+/+/Hbbth-3 마우스 및 5 개의 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 거시적 비장 이미지. (도 44e) 희생 시, 비장 크기는 총 체중에 대한 비장 중량의 비(mg/g)로 결정하였다. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. 데이터는 평균 Å} SEM으로 제시된다. *P ≤ 0.05. 통계적 분석은 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 45. 생체내 형질도입 후 16 주차에 CD46 및 처리된 Hbbth3/CD46 마우스의 세포 골수 조성물. 그룹 사이의 차이는 유의하지 않았다. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 46. 인간 γ-글로빈 게이팅 전략. CD46/Hbbth3 마우스로부터의 고정 및 투과된 RBC를 적혈구 마커 Ter-119 및 세포내 γ -글로빈에 대해 염색하였다.
도 47a, 47b. CD34+ 세포의 전사체(transcriptome)에 대한 SB100x-매개 통합의 효과. (도 47a) 실험 도식. CD34+ 세포를 EF1α 프로모터 단독 또는 HDAd-SB와의 조합으로 제어 하에 GFP/mgmt 카세트를 함유하는 HDAd5/35++ 벡터로 형질감염시켰다. 형질도입된 세포를 16 일 동안 적혈구 분화 배지에서 확장시켰다. 2 차례의 O6BG/BCNU 선택(50　μM O6BG + 35　μM BCNU)을 통합된 트랜스포존이 있는 GFP- 양성 세포에 대해 강화시켰다. 16 일차에, GFP-양성 세포를 FACS 분류하였다(샘플 #6). 비교를 위해(샘플 #5), mgmt/GFP 벡터 단독으로 형질도입되고 선택에 적용된 CD34+ 세포를 사용하였다. 대조군 세포는 SB100x를 발현하지 않았기 때문에, 에피솜 mgmt/GFP 벡터가 손실되었고 따라서 GFP 음성이었다. 두 샘플로부터의 총 RNA를 Omega Bioservices에 의해 수행된 RNA-Seq에 적용하였다. (도 47b) mRNA 발현이 변경된 유전자(log2 배수 변화)를 이들의 p 값에 기반하여 순위를 매겼다.
도 48. 생체내 형질도입 후 16 주차에 골수 MNC에서 mgmt mRNA 발현 수준. 인간 mgmtP140K 및 마우스 mRPL10 수준을 총 골수 MNC에서 qRT-PCR에 의해 측정하였다. (mRPL10은 마우스 하우스키핑 유전자이다). 상대적 수준을 VCN에 의해 추가로 나누었다(도 33 참조). 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
도 49. 마우스에서 벡터 hCD46tg의 생체내 HSC 형질도입: "긴" 대 "짧은" 벡터 LCR. 마우스에서 벡터 Hbbth3/CD46의 생체내 형질도입. 그룹 1은 7 마리의 마우스에서 HDAd-긴-LCR-γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB/Flpe의 생체내 형질도입을 나타낸다. 그룹 2는 3 마리의 마우스에서 HDAd-짧은-LCR γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB/Flpe의 생체내 형질도입을 나타낸다. O6BG, BCNU에 대해 3 회 선택 주기만이 필요하였다.
도 50. Thbb 마우스 테스트(W6). 그래픽 결과는 짧은 LCR 벡터에 비해 긴 LCR 벡터로 형질도입될 때 마우스 사이에 차이가 없고 인간 γ-글로빈 발현이 거의 없음을 나타낸다.
도 51. Thbb 마우스 테스트(W8). 그래픽 결과는 짧은 LCR 벡터에 비해 긴 LCR로 형질도입될 때 마우스 사이의 차이를 나타내지만, 짧은 LCR 바이러스가 마우스에서 사멸되었는지는 불분명하다.
도 52. 마우스에서 인간 γ-글로빈 발현 RBC의 백분율을 나타내는 그래픽 묘사. 그래프는 생체내 선택의 3 주기 후에만 100% 마킹을 예시한다.
도 53. 마우스 HBA에 대한 상대적 인간 γ-글로빈을 나타내는 HPLC의 그래픽 묘사(10 주). 그래프는 짧은 LCR과 비교하여 긴 LCR에 대한 상당히 더 높은 γ-글로빈 수준을 나타낸다.
도 54. 긴 LCR 벡터를 함유하는 마우스 #57의 예시적인 10 주 혈액 HPLC의 그래픽 묘사.
도 55a-55e. HDR-매개 통합을 위한 AAVS1-특이적 CRISPR/Cas9 벡터 및 공여자 벡터의 특성화. (도 55a) HDAd-CRISPR 벡터 구조: AAVS1-특이적 sgRNA는 U6 프로모터로부터 PolIII에 의해 전사되고 spCas9 유전자는 EF1α 프로모터의 제어 하에 있다. Cas9 발현은 HDAd 생산자 116 세포에서 Cas9 발현을 억제하지만 CD34+ 세포에서 Cas9 발현에 부정적으로 영향을 미치지 않는 miR-183-5p 및 miR-218-5p에 의해 제어된다(Sayadaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 1, 14057, 2015). 상응하는 micro RNA 표적 부위(miR-T)를 β-글로빈 유전자의 3' 비번역 영역(3'UTR) 내로 포매시켰다. (도 55b) 2000　vp/세포의 MOI에서 HDAd-CRISPR 형질도입 3 일 후 T7E1 검정에 의해 측정된 인간 CD34+ 세포에서 표적 부위 절단 빈도. 특이적 절단 생성물은 474 bp 및 294 bp이다. 절단 효능은 겔 아래에 제시된다. (도 55c) HDAd-CRISPR-형질도입된 CD34+ 세포에서 발견된 상위 13 개의 가장 빈번한 indel(서열번호: 6-18, 위에서 아래 순서). 연회색으로 강조된 서열은 중간 회색으로 강조하는 표시된 TAM 서열이 있는 가이드 RNA의 표적을 나타낸다. CRISPR/Cas9 절단 부위는 수직 화살표로 표시된다. 녹색은 NHEJ에 의해 유발된 삽입이다. (도 55d) AAVS1 부위 내로 통합을 위한 공여자 벡터의 구조(HDAd-GFP-공여자). mgmtP140K 유전자는 자기-절단 피코르나바이러스 2A 펩티드를 통해 GFP 유전자에 연결되어 있다. 유전자는 EF1α 프로모터의 제어 하에 있다. PA: 폴리-아데닐화 신호. 이식유전자 카세트는 이전에 공개된 연구(Lombardo 등, Nat Methods 8, 861-869, 2011)와 유사한 AAVS1 유전자좌에 상동성인 0.8　kb 영역에 의해 플랭킹된다. 상동성 영역의 상류 및 하류는 공여자 카세트를 방출하는 AAVS1-특이적 CRISPR/Cas9에 대한 인식 부위이다. (도 55e) 공여자 카세트의 방출. CD34+ 세포를 HDAd-GFP-공여자(1000 또는 2000 vp/세포의 MOI) 단독으로 또는 HDAd-CRISPR(MOI 1000 vp/세포)과 조합하여 형질감염시켰다. 3 일 후에 게놈 DNA를 GFP-특이적 프로브와 함께 서던 블롯에 적용하였다. (선형) 전장 HDAd-공여자-GFP 게놈을 36　kb에서 실행한다. 방출된 카세트를 4.7　kb에서 실행한다. 절단 빈도는 겔 아래에 제시된다.
도 56a-56f. HUDEP-2 세포에서 표적화된 통합 vs. SB100x-매개 통합. (도 56a) 실험 도식. HUDEP-2 세포를 각 바이러스에 대해 1000 vp/세포의 MOI에서 표시된 HDAd 벡터로 형질감염시켰다. 21 일 동안 확장 후, GFP 양성 세포를 96 웰 플레이트 내로 분류하였다. 단일 세포-유래 클론을 2 주 동안 추가 확장에 의해 수득하였다. GFP 발현을 세포 집단에서 형질도입후 2 및 21 일차, 또는 세포 클론에서 35 일차에 측정하였다. (도 56b) 2 및 21 일차에 공여자 벡터 단독 또는 표적화 vs SB100x 통합 메커니즘이 있는 벡터로 처리된 세포에서 GFP 유세포 분석. (도 56c) 표적화 vs SB100x 통합이 있는 총 GFP+ 세포에서 GFP의 평균 형광 강도(21 일). 제시된 데이터(평균 ± SD)는 3 개의 독립적 실험을 나타낸다. (도 56d) 단일 클론에서 GFP의 평균 형광 강도. 각 기호는 하나의 세포 클론을 나타낸다. 제시된 데이터(평균 ± SD)는 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다. (도 56e) 표적화 또는 SB100x-매개 통합이 있는 대표적인 세포 클론에서 GFP 발현을 나타내는 유세포 분석. (도 56f) GFP 프라이머를 사용한 qPCR에 의한 세포 클론에서 벡터 카피 수.
도 57a, 57b. 표적화된 통합 벡터로 형질도입된 HUDEP-2 클론의 통합 분석. (도 57a) 역PCR에 의한 통합 부위 분석. 상부 다이어그램은 활용된 NcoI 부위, 및 프라이머의 위치를 나타낸다(반 화살표. 진회색: 5'- 접합부에 대한 EF1α 프라이머; 연회색: 3' 접합부에 대한 pA 프라이머). 표적화된 통합에 대한 각 측면에서 예상된 앰플리콘 크기가 표시된다. 하부 겔 사진은 iPCR 결과를 나타낸다. 각 레인은 하나의 세포 클론을 나타낸다. New England Biolab의 1kb 래더(ladder)를 사용하였다. Ef1α 프라이머가 채택된 이후에 내인성 Ef1α의 추가 밴드가 검출되었다. 클론 #20의 경우, 앰플리콘 크기가 예측과 다를지라도, 클로닝 및 서열분석은 표적 통합이 있는 클론임을 입증하였다. (도 57b) In-Out PCR 분석. 상부 다이어그램은 프라이머의 위치를 나타낸다. 다양한 통합 패턴에 대한 예상된 생성물 크기가 나열된다. 하부 겔 사진은 대부분의 클론이 단일대립유전자성 표적화된 통합이 있음을 입증한다. (도 57a)의 결과와 관련하여, 클론 #17, #20 및 #36의 예상치 못한 앰플리콘 크기는 연쇄체(concatemeric) 통합으로부터 발생할 가능성이 있었다.
도 58a-58c. AAVS1/CD46tg 마우스에서 AAVS1 표적 부위의 절단. (도 58a) 시험관내 분석. 표시된 MOI의 시험관내 HDAd-CRISPR 형질도입 3 일 후 측정된 AAVS1/CD46tg 마우스의 골수 계통-음성 세포에서 표적 부위 절단 빈도. (도 58b) 이식 후 14 주차에 총 골수 단핵 세포로부터 DNA의 심층 서열분석에 의해 수득된 총 AAVS1 indel의 백분율. 각 기호는 개별 동물이다. (도 58c) 마우스에서 발견된 상위 29 개의 가장 빈번한 indel(서열번호: 19-23, 21, 21, 26-30, 27, 32, 28, 34-47), 위에서 아래 순서). 대표적인 데이터가 제시된다. 황색 서열은 청색으로 표시된 TAM 서열이 있는 가이드 RNA의 표적을 나타낸다. CRISPR/Cas9 절단 부위는 수직 화살표로 표시된다.
도 59a-59d. HDAd-AAVS1 및 HDAd-GFP-공여자를 사용한 AAVS1/CD46 Lin- 세포의 생체외 형질도입 및 치명적으로 조사된 수용자 내로 후속 이식. (도 59a) 실험 도식: 골수를 AAVS1/CD46tg 마우스로부터 수확하고 계통-음성 세포(Lin-)를 MACS에 의해 단리하였다. Lin- 세포를 HDAd-CRISPR 및 HDAd-GFP-공여자 단독으로 또는 500　vp/세포의 총 MOI에서 조합하여 형질도입하였다. 배양 1 일 후, 마우스 당 1x106 개의 형질도입된 세포를 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스 내로 이식하였다. 4 주차에, O6BG/BCNU 처리를 시작하고 2 주마다 3 회 반복하였다. 각 주기마다, BCNU 농도를 5　mg/kg에서 7.5　mg/kg 내지 10　mg/kg까지 증가시켰다. 14 주차에, 마우스를 희생시키고 골수 Lin- 세포를 치명적으로 조사된 2차 C57Bl/6 수용자 내로 이식하기 위해 사용한 다음, 16 주 동안 추적하였다. (도 59b) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 GFP-양성 세포의 백분율. HDAd-CRISPR 단독, HDAd-GFP-공여자 단독, 및 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자로 형질도입된 Lin- 세포를 이식한 그룹이 제시된다. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. (도 59c) Lin- 세포가 이식된 대표적인 마우스로부터의 PBMC에서 GFP+ 세포의 백분율. 4 주(선택 전) 및 12 주(선택 후)의 데이터가 제시된다. (도 59d) 계통-양성 세포 CD3+(T-세포), CD19+(B-세포), Gr-1+(골수성 세포), 및 HSC(LSK 세포)에서 GFP+ 세포의 백분율.
도 60a-60e. 생체외 형질도입된 Lin- 세포의 생착 분석. (도 60a) 유세포 분석에 의해 측정된 PBMC에 대한 인간 CD46 발현에 기반한 이식된 세포의 생착. 각 기호는 개별 동물이다. 특히, 형질도입된 공여자 세포는 CD46을 발현하였지만, 수용자 C57Bl/6 마우스는 발현하지 않았다. (도 60b) 14 주차에 PBMC(혈액), 비장, 및 골수에서 CD46-양성 세포의 백분율. (도 60c) 14 주차에 PBMC, 비장 및 골수에서 GFP-양성 세포의 백분율. (도 60d) 상이한 형질도입 설정에서 LSK 및 계통-양성 세포의 백분율. 3 개의 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다. (도 60e) GFP+ 콜로니의 분석. 14 주차 마우스의 총 골수 Lin- 세포를 플레이팅하고 콜로니에서 GFP 발현을 12 일 후에 분석하였다. 각 기호는 개별 마우스에 대한 평균 GFP+ 콜로니 수이다(왼쪽 패널). 모든 콜로니의 세포를 풀링하고 유세포 분석에 의해 분석하였다(오른쪽 패널).
도 61a-61f. 2차 수용자에서 GFP 마킹 분석. HDAd-GFP-공여자 또는 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자 형질도입된 Lin- 세포를 이식한 반응자 마우스의 골수 세포를 이식 후 14 주차에 수확하고, 계통-양성 세포에 대해 고갈시키고, 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스 내로 이식하였다. (도 61a) 4 마리의 수용자 마우스에서 PBMC의 GFP-유세포 분석. 오른쪽 패널은 전형적인 분석을 나타낸다. 수직 축은 hCD46에 대한 염색을 나타내고, 수평 축은 GFP 염색을 나타낸다. (도 61b) 16 주차에 PBMC, 비장 및 골수에서 GFP-양성 세포의 백분율. (도 61c) 이식 후 16 주차에 수용자에서 계통-양성 및 -음성 세포의 GFP 흐름 분석. (도 61d) GFP+ 콜로니의 분석. 16 주차 마우스의 총 골수 Lin- 세포를 플레이팅하고 콜로니에서 GFP 발현을 12 일 후에 분석하였다. 각 기호는 개별 마우스에 대한 평균 GFP+ 콜로니 수이다(왼쪽 패널). 모든 콜로니의 세포를 풀링하고 유세포 분석에 의해 분석하였다(오른쪽 패널). (도 61e) 유세포 분석에 의해 측정된 PBMC에 대한 인간 CD46 발현에 기반한 이식된 세포의 생착. (도 61f) 상이한 형질도입 설정에서 계통-양성 및 -음성 세포의 백분율. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다.
도 62a-62f. HDAd-AAVS1-CRISPR + HDAd-GFP-공여자를 사용한 AAVS1/CD46tg 마우스의 생체내 형질도입. (도 62a) 처리 레지멘. AAVS1/hCD46tg 마우스를 동원하고 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자를 IV 주사하였다(두 바이러스의1:1 혼합물의 각 4x1010 vp 2 회). 4 주 후에, O6BG/BCNU 처리를 시작하였다. 각 주기마다, BCNU 농도를 2.5　mg/kg에서 7.5　mg/kg 및 10　mg/kg까지 증가시켰다. O6BG 농도는 3 가지 처리 모두에서 30　mg/kg이었다. 마우스를 동물이 분석을 위해 희생되고 Lin- 세포가 2차 수용자 내로 이식될 때 12 주까지 추적하였다. 그런 다음 2차 수용자를 16 주 동안 추적하였다. (도 62b) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 GFP-양성 세포의 백분율. (도 62c) 14 주차에 PBMC, 비장 및 골수에서 GFP-양성 세포의 백분율. (도 62d) 계통-양성 세포 CD3+(T-세포), CD19+(B-세포), Gr-1+(골수성 세포), 및 HSC(LSK 세포)에서 GFP+ 세포의 백분율. (도 62e) GFP+ 콜로니의 분석. 14 주차 마우스의 총 골수 Lin- 세포를 플레이팅하고 콜로니에서 GFP 발현을 12 일 후에 분석하였다. 각 기호는 개별 마우스에 대한 평균 GFP+ 콜로니 수이다(왼쪽 패널). 모든 콜로니의 세포를 풀링하고 유세포 분석에 의해 분석하였다(오른쪽 패널). (도 62f) 14 주차에 계통-양성 및 -음성 세포의 백분율.
도 63a-63e. 도 59a-59d의 2차 수용자 분석. 14 주차에, 생체내 형질도입된 AAVS1/hCD46tg 마우스의 골수 Lin- 세포를 치명적으로 조사된 C57Bl/6 수용자 내로 이식하였다. (도 63a) 6 마리의 수용자 마우스에서 PBMC의 GFP-유세포 분석. (도 63b) 혈액, 비장 및 골수의 단핵 세포에서 GFP 발현. (도 63c) 이식 후 16 주차에 수용자에서 계통-양성 및 -음성 세포의 GFP 흐름 분석. (도 63d) 유세포 분석에 의해 측정된 PBMC에 대한 인간 CD46 발현에 기반한 이식된 세포의 생착. (도 63f) 16 주차에 계통-양성 및 -음성 세포의 백분율.
도 64a-64h. HDAd-AAVS1 및 HDAd-공여자-γ-글로빈 벡터를 사용한 AAVS1/CD46 Lin- 세포의 생체외 형질도입 및 치명적으로 조사된 수용자 내로의 후속 이식. (도 64a) 공여자의 구조. 전반적인 구조는 HDAds-GFP-공여자 벡터에 대한 것과 동일하다(도 55d 참조). 상동성 영역은 새로운 HDAd-글로빈-공여자 벡터에서 더 길다(1.8　kb vs 0.8　kb). γ -글로빈 발현 카세트는 4 개의 DNAse 과민성(HS) 영역 및 γ -글로빈 프로모터를 포함하는 γ-글로빈 LCR의 4.3　kb 버전을 함유한다(Lisowski 등, Blood. 110, 4175-4178, 1996). 3' UTR(적혈구에서 mRNA 안정화를 위함)을 포함하는 전장 γ -글로빈 cDNA를 사용하였다. mgmtP140K 유전자는 보편적으로 활성인 EF1α 프로모터의 제어 하에 있다. 양방향성 SV40 폴리-아데닐화 신호를 사용하여 전사를 종결한다. LCR/β-프로모터 및 EF1α 프로모터 사이의 간섭을 피하기 위해, 1.2　kb 닭 HS4 염색질 절연체(Emery 등, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 9150-9155, 2000)를 카세트 사이에 삽입하였다. (도 64b) 처리 레지멘은 도 57a에 제시된 것과 동일하다. (도 64c) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 적혈구(RBC)에서 인간 γ-글로빈-양성 세포의 백분율. 체내 형질도입 후 16 주차에 혈액 및 골수에서 적혈구(Ter119+) 및 비-적혈구(Ter119-) 세포의 인간 γ-글로빈-양성 세포의 (도 64d) 백분율 및 (도 64e) 평균 형광 강도. * p<0.05. (도 64f) HPLC에 의해 16 주차에 RBC에서 측정된 마우스 β-주요 쇄에 대한 γ -글로빈 쇄의 백분율. (도 64g) qRT-PCR에 의해 16 주차에 RBC에서 측정된 마우스 β-주요 RNA에 대한 γ -글로빈 mRNA의 백분율. (도 64h) Lin- 세포로부터 유래된 콜로니에서 세포 당 벡터 카피 수. 각 기호는 하나의 콜로니를 나타낸다. 동물 사이의 차이는 유의하지 않다.
도 65a, 65b. HDAd-CRISPR 및 HDAd-글로빈-공여자 벡터로 형질도입된 AAVS1/CD46 Lin- 세포의 생착. (도 65a) 유세포 분석에 의해 측정된 PBMC에 대한 인간 CD46 발현에 기반한 이식된 세포의 생착. (도 65b) 16 주차에 계통-양성 PBMC(혈액), 비장, 및 골수 세포 뿐만 아니라 골수 LSK 세포에서 CD46-양성 세포의 백분율.
도 66a-66c. 도 64a-64h의 2차 수용자 분석. HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자 형질도입된 Lin- 세포가 이식된 마우스의 골수 세포를 이식 후 16 주차에 수확하고, 계통-양성 세포에 대해 고갈시키고, 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스 내로 이식하였다. (도 66a) 5 마리의 수용자 마우스에서 RBC의 γ-글로빈 유세포 분석. (도 66b) 계통-양성 PBMC에서 CD46-양성 세포의 백분율. (도 66c) 2차 수용자 내로 이식 후 16 주차에 골수 조성물.
도 67a-67h. HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자를 사용한 AAVS1/CD46tg 마우스의 생체내 형질도입. (도 67a) 처리 레지멘. (도 67b) γ-글로빈-양성 RBC의 백분율. (도 67c) 형질도입되지 않은 대조군 마우스 또는 형질도입 후 16 주차 마우스의 말초 RBC에서 γ-글로빈 발현의 백분율을 나타내는 대표적인 도트 팟(dot pot). (도 67d) 혈액 및 골수의 적혈구(Ter119+) 및 비-적혈구(Ter119-) 세포에서 γ-글로빈의 평균 형광 강도. * p<0.05. (도 67e) HPLC에 의해 16 주차에 RBC에서 측정된 마우스 β-주요 쇄에 대한 γ-글로빈 쇄의 백분율. * p<0.05. (도 67f) qRT-PCR에 의해 16 주차에 RBC에서 측정된 마우스 β-주요 RNA에 대한 γ-글로빈 mRNA의 백분율. * p<0.05. (도 67g) 4 마리의 반응자 마우스에서 Lin- 세포로부터 유래된 콜로니에서 세포 당 벡터 카피 수. 각 기호는 하나의 콜로니를 나타낸다. 동물 사이의 차이는 유의하지 않다. (도 67h) 생체내 형질도입 후 16 주차에 혈액, 비장 및 골수에서 계통-양성 세포 및 골수에서 LSK 세포의 조성물.
도 68a-68d. 도 67a-67h의 2차 수용자 분석. (도 68a) 유세포 분석에 의해 측정된 PBMC에 대한 인간 CD46 발현에 기반한 이식된 세포의 생착. (도 68b) RBC에서 γ-글로빈 발현. (도 68c) HPLC에 의해 16 주차에 2차 수용자의 RBC에서 측정된 마우스 β-주요 쇄에 대한 γ-글로빈 쇄의 백분율. (도 68d) 생체내 형질도입 후 16 주차에 혈액, 비장 및 골수에서 계통-양성 세포 조성물.
도 69a, 69b. AAVS1/CD46 유전자이식 마우스에서 AAVS1 유전자좌의 국소화 및 구조. (도 69a) 염색체 14 상의 불일치를 나타내는 TLA 데이터. AAVS1-특이적 프라이머 쌍을 사용하였다. 오른쪽 패널은 18　kb 갭이 보이는 염색체 14의 확대된 절편을 나타낸다. 갭은 추가된 인간 AAVS1 유전자좌에 상응한다. (도 69b)
도 70. 게놈 국소화를 나타내는 AAVS1 유전자좌의 상세한 구조. 음영 처리된 AAVS1 영역을 Sanger 서열분석에 의해 확인하였다. 빈 영역은 The Jackson Laboratory의 제한 분석 및 AAVS1 tg 마우스 유전적 배경 정보로부터 제하였다. CRISPR/Cas9 절단 부위는 가위로 표시된다. 반복부 #2 내지 #5는 완전한 8.2 kb 인간 AAVS1 EcoRI 단편이지만, 반복부 #1 및 #5만이 EcoRI 단편의 분획만을 함유한다. 특히, 반복부 #5는 완전한 5' 상동성 아암이 결여되어 있다. AAVS1tg 마우스에 존재하는 다중카피 AAVS1 유전자좌의 CRISPR/Cas9 절단에 따른 결과. 절단 위치에 관한 규칙은 다음과 같다: a) 반복부 #1 내지 #4에서 하나의 단일 절단: 바람직. b) 반복부 #5에서 하나의 단일 절단: 불완전한 왼쪽 상동성 아암으로 인한 선호도 감소. c) 2 개의 반대로 배향된 반복부(예를 들어 #1 및 #4)에서 2 개의 절단: 오른쪽 상동성 아암의 누락으로 인해 HDR-매개 표적화된 통합 없음. d) 동일한 방향을 직면한 2 개의 반복부(예를 들어 #1 및 #2)에서 2 개의 절단: 바람직. e) 2 개 초과의 절단의 경우, 각 측면에서 마우스 gDNA 서열에 대한 하나의 근위부만 고려: 규칙 c) 또는 d)에 따라서 적용. f) 반복부 #1 및 #5에서 절단 및 중심 영역의 결실. 또한, HDR-매개 표적화된 통합은 반복부 #2 내지 #4에서 발생하였고, CRISPR에 의한 플랭킹 반복부, 예를 들어 #1 및 #5에서 연속적 절단은 이미 통합된 이식유전자의 손실을 초래할 수 있다.
도 71a, 71b. HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자를 사용한 생체외 또는 생체내 HSC 형질도입 후 16 주차에 단리된 게놈 DNA의 서던에 의한 통합 부위 분석. (도 71a) AAVS1-특이적 프로브와의 혼성화. 상부 패널은 예상된 EcoRI 단편 크기 및 프로브의 국소화를 나타낸다. 하부 패널은 생체외 및 생체내 형질도입 설정에서 개별 마우스의 분석을 나타낸다. 더 큰 밴드는 비-표적화된 AAVS1 유전자좌 반복부를 나타낸다. (도 71b) BlpI-소화된 DNA와 GFP-특이적 프로브의 혼성화. 밴드 패턴은 다른 곳에서 논의된다.
도 72a-72c. HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자를 사용한 생체외 또는 생체내 HSC 형질도입 후 16 주차에 단리된 게놈 DNA의 역PCR(iPCR)에 의한 통합 부위 분석. (도 72a) 다이어그램은 NcoI 부위, 및 프라이머의 위치를 나타낸다(반 화살: 5' 접합부에 대한 EF1α 프라이머; 연회색: 3' 접합부에 대한 pA 프라이머). 반복부 #5에서 표적화된 통합을 위한 각 측면에서 예상된 앰플리콘 크기가 표시된다. (도 72b) 총 골수 세포에서 게놈 DNA를 사용한 iPCR 결과. 각 레인은 하나의 마우스를 나타낸다. #009, #023, #943, #944 및 #946은 생체외 HSC 형질도입 후 마우스이다. #147, #304 및 #467은 생체내 형질도입된 동물이다. (도 72c) GFP-양성 콜로니의 iPCR 분석. 14 주차 마우스의 골수 Lin- 세포를 플레이팅하고, 20 일 후에 게놈 DNA를 GFP+ 콜로니에서 단리하고 iPCR에 사용하였다. 마우스 #943 및 #946을 분석하였다. 각 레인은 하나의 콜로니를 나타낸다. 연회색 화살표: 표적화된 통합; 진회색 화살표: 표적외(off-target) 통합; 중간 회색 화살표: 통합된 전체 HDAd 바이러스 게놈.
도 73a, 73b. HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자를 사용한 생체외 또는 생체내 HSC 형질도입 후 16 주차에 단리된 게놈 DNA의 역PCR(iPCR)의 통합 부위 분석. (도 73a) 다이어그램은 NcoI 부위, 및 프라이머의 위치를 나타낸다(반 화살표. 검정색 5' 접합부에 대한 EF1α 프라이머; 회색: 3' 접합부에 대한 pA 프라이머). 반복부 #5에서 표적화된 통합을 위한 각 측면에서 예상된 앰플리콘의 크기가 제시된다. (도 73b) 총 골수 세포에서 게놈 DNA를 사용한 iPCR 결과. 각 레인은 하나의 마우스를 나타낸다. #321, #322, #856, #857, #858 및 #945는 생체외 형질도입된 마우스이다. #504, #816 #869 및 #898은 생체내 형질도입된 동물이다. 흰색 화살촉은 표적화된 통합을 나타내고; 회색, 점선 화살촉: 표적외 통합; 흰색 전체 화살표: 통합된 전체 HDAd 바이러스 게놈.
도 74a-74d. (도 74a) 생체내 HSPC 형질도입을 위한 HDAd5/35++ 벡터. HDAd-GFP/mgmt에서, 트랜스포존은 HDAd-SB 벡터에서 제공된 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제(SB100X)를 통해 통합을 위해 도립된 트랜스포존 반복부(IR) 및 frt 부위에 의해 플랭킹된다. 이식유전자 카세트는 β-글로빈 3'UTR에 연결된 PGK-프로모터 구동된 GFP 유전자 뿐만 아니라 EF1α-프로모터 구동된 mgmtP140K 카세트를 함유한다. 두 카세트는 닭 글로빈 HS4 절연체에 의해 분리된다. HSPC를 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사(5 μg/마우스/일, 4 일) 이어서 마지막 G-CSF 주사 18 시간 후 AMD3100의 s.c. 주사(5 mg/kg)에 의해 neu/CD46 유전자이식 마우스에서 동원하였다. HDAd-GFP/mgmt+HDAd-SB의 총 8x1010 개의 바이러스 입자를 AMD3100 주사 1 시간 후 i.v. 주사하였다. HDAd 주사 후 전염증성 사이토카인 방출을 방지하기 위해, 동물에게 바이러스 주사 16 시간 및 2 시간 전에 덱사메타손(10 mg/kg)을 i.p.로 제공하였다. 6 주 후, 3 차례의 O6BG/BCNU(i.p.)를 적용하여 형질도입된 HSPC가 말초 혈액 순환으로 빠져나가는 것을 활성화시켰다(30 mg/kg O6BG 및 5, 7.5, 및 10 mg/kg BCNU). 생체내 형질도입 17 주 후, 1x106 개의 MMC 세포를 유선 지방 패드 내로 이식하였다. 5 주 후, 종양 및 다른 조직을 수확하고 GFP 발현에 대해 분석하였다. (도 74b) 왼쪽 패널: 생체내 형질도입 후 상이한 시점에서 GFP-발현 PBMC의 백분율. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. 오른쪽 패널: 골수, 비장, 혈액, 및 콜라게나제/디스파제-소화된 종양에서 범-백혈구 마커 CD45에 대해 염색된 세포에서 GFP+ 세포의 백분율. (도 74c) GFP에 대한 항체 및 세포외 기질 단백질인 라미닌에 대한 항체로 염색된 종양 절편. 스케일 바는 50　μm이다. (도 74d) 혈액에서 GFP+ PBMC 및 종양에서 GFP+ 세포의 면역표현형.
도 75. MMC 세포에서 래트 Neu 발현. 세포를 Neu-특이적 단클론 항체 7.16.4 이어서 항-마우스 Ig-FITC로 염색하였다. 배양된 MMC 세포의 대표적인 공초점 현미경 이미지가 제시된다. 새로운-특이적 신호는 흰색 색조로 보인다. 스케일 바는 20　μm이다.
도 76. 면역표현형을 위한 게이팅 전략.
도 77. 골수 및 비장에서 GFP+ 세포의 면역표현형(MMC 모델). 상세한 내용은 도 74d를 참조한다.
도 78a-78f. 생체내 HSPC 형질도입 후 종양-침윤 백혈구에서 GFP 발현(TC-1 모델). (도 78a) 실험 도식. HSPC를 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사(5 mg/마우스/일, 4 일) 이어서 마지막 G-CSF 주사 18 시간 후 AMD3100의 s.c. 주사(5 mg/kg)에 의해 CD46tg 유전자이식 마우스에서 동원하였다. HDAd-GFP/mgmt+HDAd-SB의 총 8x1010 개의 바이러스 입자를 AMD3100 1 시간 후 i.v. 주사하였다. HDAd 주사 후 전염증성 사이토카인 방출을 방지하기 위해, 동물에게 바이러스 주사 16 시간 및 2 시간 전에 덱사메타손(10 mg/kg)을 i.p.로 제공하였다. 6 주 후, 3 차례의 O6BG/BCNU(i.p.)를 적용하여 형질도입된 HSPC가 말초 혈액 순환으로 빠져나가는 것을 활성화시켰다(30 mg/kg O6BG 및 5, 7.5, 및 10 mg/kg BCNU. 생체내 형질도입 17 주 후, 5x104 개의 TC-1 세포를 유선 지방 패드 내로 이식하였다. 5 주 후, 종양 및 다른 조직을 수확하고 GFP 발현에 대해 분석하였다. (도 78b) 생체내 형질도입 후 상이한 시점에서 GFP-발현 PBMC의 백분율. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. (도 78c) 골수, 비장, 혈액, 및 콜라게나제/디스파제-소화된 종양에서 범백혈구 마커 CD45에 대해 염색된 세포에서 GFP+ 세포의 백분율. (도 78d) 전체(악성 + 종양 침윤) 세포에서 GFP+ 세포 및 GFP+ 양성 백혈구의 대표적인 유세포 분석 데이터. (도 78e). 대표적인 종양 절편. 왼쪽 패널: GFP 형광. 오른쪽 패널: GFP에 대한 항체(흰색) 및 세포외 기질 단백질 라미닌(회색)으로 염색. 스케일 바는 50 mm이다. (도 78f) 종양에서 GFP+ 세포 및 혈액에서 PBMC의 면역표현형. BD Biosciences의 림프구 유세포 분석 패널 8c(CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD19) 및 골수성 패널 9c(CD45, CD11c, F4/80, MHCII, SiglecF-PecCP, Ly6C, CD11b, Ly6G)를 사용하였다.
도 79a-79c. 종양-침윤 백혈구 이외의 세포에서 억제하기 위한 miRNA 선택. (도 79a) 이식유전자 발현의 조직-특이성의 miRNA-기반 조절. miRNA는 전형적으로 천연 mRNA의 3' 비번역 영역(3' UTR)에 상주하는 miRNA 표적 부위(miR-T)로 지칭되는 표적 서열과의 염기 쌍형성을 통해 가이드 분자로서 기능한다. 이 상호작용은 mRNA 절단 또는 번역 억제를 매개하는 효과기 복합체를 모집한다. 이식유전자의 mRNA가 주어진 세포 유형에서 높은 수준으로 발현되는 miRNA에 대한 miR-T를 함유하는 경우, 이식유전자 발현은 이 세포 유형에서 방지될 것이다. 대조적으로, 특이적 miRNA를 발현하지 않는 세포 유형에서, 이식유전자가 발현될 것이다(Brown 등, Nat Med. 2006;12: 585- 591). (도 79b) MicroRNA-Seq를 5 마리의 마우스(neu/CD46tg-MMC 모델, 종양 접종 후 17 일)에서 풀링된 RNA에 대해 수행하였다. GFP+ 종양 13 개의 샘플에 대한 비장, 골수 및 혈액의 작은 RNA 서열분석에 의해 식별된 정규화된 microRNA 판독물 계수(100만 개의 맵핑된 microRNA 당 판독물 + 1)가 제시된다. miR-423을 포함하는, 종양에 존재하지 않는 MicroRNA를 유사-계수 1로 산점도의 왼쪽에 정렬한다. miR-423-5p는 블롯에 표시된다. (도 79c) MicroRNA-Seq를 5 마리의 마우스(CD46tg/TC-1 모델, 17 일)에서 풀링된 RNA에 대해 수행하였다. 상위 10 개 miRNA의 상대적 발현 수준을 종양의 수준(1로 설정)과 비교하였다.
도 80a-80c. HSPC에 대한 miR-423-5p 표적 부위 과발현의 효과. (도 80a) 벡터 구조. HDAd-GFP-miR-423은 GFP 유전자에 연결된 3'UTR에서 4 개의 miR-423-5p 표적 부위를 함유한다. (도 80b) 마우스 HSPC(M)(CD46-유전자이식 마우스의 골수로부터의 Lin- 세포) 및 인간 HSPC(Hu)(CD34+ 세포)를 HDAd-GFP 또는 HDAd-GFP-miR423으로 각각 500 또는 3000 vp/세포의 MOI에서 감염시켰다. 3 일 후, 세포 용해물을 CDKN1A에 대한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 블롯을 항-β-액틴 항체로 재프로빙하여 로딩 차이를 조정하였다. 오른쪽 패널은 b-액틴 신호에 대해 정규화된 CDKN1A 신호의 정량화를 나타낸다. 상응하는 마우스 및 인간 HDAd-GFP/mgmt 샘플의 신호를 100%로 취하였다. (도 80c) 전구체 콜로니 형성에 대한 효과. HDAd 감염 1 일 후, 마우스 Lin- 세포(35　mm 접시 당 2.5x103 개 세포) 또는 인간 CD34+ 세포(접시 당 3x103 개 세포)를 콜로니 검정을 위해 플레이팅하였다. 콜로니를 12 일 후 계수하였다. N=3. *p<0.05. 통계적 유의성을 양측 스튜던트(Student) t-검정(Microsoft Excel)에 의해 계산하였다. (이전 연구와 일치하여(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 2018;9: 390-401; Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 9: 142-152, 2018), 상대적으로 높은 MOI에서 HSPC의 감염은 HSPC의 콜로니 형성 용량을 약간 감소시켰다)
도 81. 노던 블롯에 의해 miR-423-5p 발현 검증. 골수 계통-음성 세포, 비장, 전체 혈액 세포, 및 MMC-/TC-1-종양 침윤 백혈구의 총 RNA(2　μg)를 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 블롯을 muRNA-423-5p에 특이적인 프로브 및 후속적으로 U6 RNA(로딩 대조군)에 대한 프로브와 혼성화하였다. Mir-423은 70　bp의 전구체 길이 및 23　bp의 성숙 miRNA 길이를 갖는다. miR-423-5p-특이적 신호는 혈액, 골수, 및 비장에서 보이지만, 두 종양 모델에서 종양-침윤 세포에는 없다.
도 82a, 82b. 인간에서 miRNA423-5p 발현. (도 82a) Ludwig 등, Nucleic Acids Res. 2016;44: 3865-3877에 공개된 miR-423-5p의 수준. 왼쪽에서 오른족으로, y-축 라벨은 다음을 포함한다: 지방세포, 동맥, 결장, 경막, 신장, 간, 폐, 근육, 심근, 피부, 비장, 위, 고환, 갑상선, 소장 십이지장, 소장 공장, 췌장, 신장 부신, 신피질, 신수질, 식도, 전립선, 골수, 정맥, 림프절, 흉막, 뇌하수체, 척수, 뇌시상, 뇌백질, 뇌꼬리핵, 뇌회백질, 대뇌피질 측두엽, 대뇌피질 전두엽, 대뇌피질 후두부, 및 소뇌. (도 82b) 2 명의 난소암 환자에서 플롯팅된 miRNA-Seq 데이터(풀링). CD45+ 세포를 고등급 장액성 난소의 생검으로부터 단리하였다. RNA를 종양-침윤 백혈구 및 일치하는 PBMC로부터 단리하고 LC Sciences, LLC의 miRNA-Seq에 적용하였다. miRNA-423-5p가 표시된다.
도 83a-83e. neu/MMC 모델에서 생체내 HSPC αPD-L1-γ1 면역-체크포인트 억제제 요법. (도 83a) MMC 종양 세포에서 PDL1 발현(흰색). 스케일 바는 20 μm이다. (도 83b) 요법 벡터의 전반적인 구조는 도 74a에 제시된 것과 동일하다. 벡터는 5' 단부 상의 HA 태그 및 분비 신호(LS) 및 3' 단부 상의 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3 도메인 및 myc 태그에 연결된 scFv 항-마우스 PD-L1에 대한 발현 카세트를 함유한다. miR423-5p 표적 부위를 3'UTR 내로 삽입하여 miR423-5p 조절에 의해 αPD-L1-γ1 발현을 종양-침윤 세포로 제한하였다. 벡터는 또한 mgtmP140K에 대한 발현 카세트를 함유한다. (도 83c) HDAd-GFP/mgmt 및 HDAd-αPD-L1-γ1 생체내 형질도입된 HSPC가 있는 마우스에서 MMC 세포 접종 후(0 일) 종양 부피. HDAd-αPD-L1-γ1 그룹의 마우스에게 첫번째 종양 세포 주사 후 80 일차에 1x105 개 MMC 세포의 피하 주사를 재접종하였다. 각 곡선은 개별 동물이다. (도 83d) 유세포 분석에 의한 T-세포 반응 분석. 미처리 neu-유전자이식 마우스 및 HDAd-αPD-L1-γ1-처리된 마우스(100 일)의 비장세포를 CD4, CD8, 및 세포내 IFNγ에 대해 유세포 분석에 의해 분석하거나 또는 Neu 사량체로 염색하였다. N=3. *p<0.05. (도 83e) Neu+ 및 Neucell로 자극 시 IFNγ 반응. 미처리 neu-유전자이식 마우스 및 HDAd-αPDL1-γ1-처리된 마우스(100 일)의 비장세포를 저지된 MMC 세포 (Neu+) 또는 neu유전자이식 마우스(Neu-)의 비장세포에 노출시키거나, 또는 PMA/이오노마이신("noAg")으로 처리하였다. 배양 상청액에서의 IFNγ 농도가 제시된다. N=3. * p<0.005.
도 84a-84c. αPD-L1-γ1 발현의 동역학. (도 84a) 항-HA 태그 항체를 사용한 αPD-L1-γ1 웨스턴 블롯. 3 마리의 동물을 17 일차에 희생시키고 조직을 웨스턴 블롯에 의해 αPD-L1-γ1 발현에 대해 분석하였다. αPD-L1-γ1 단백질은 완전히 환원되지 않아서, 2 개의 scFv 쇄(130　kDa)가 있는 완전한 αPD-L1-γ1 잔류물을 생성하였다(αPD-L1-γ1의 구조의 경우 오른쪽 패널 참조). β-액틴에 대한 염색은 로딩 대조군으로 사용하였다. 대표적인 샘플이 제시된다. 또한 웨스턴 블롯 신호의 정량화가 제시된다. N=5 마우스. (도 84b) 종양-침윤 백혈구, PBMC, 골수 세포 및 비장세포에서 αPD-L1-γ1 mRNA 발현. 마우스 PPIA mRNA를 내부 대조군으로 사용하였다. 결과를 2(-ΔΔCt) 방법에 따라 계산하고 상응하는 종양 샘플의 cDNA 수준을 100%로 설정하여 상대적 발현의 백분율로 제시하였다. (도 84c) 포획을 위한 재조합 마우스 PD-L1 및 검출을 위한 항-HA 항체-HRP 접합체를 사용하여 ELISA에 의해 측정된 혈청에서 분비된 αPD-L1-γ1의 수준. 각 기호는 개별 동물을 나타낸다. * p<0.05. 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-검정(Microsoft Excel)에 의해 계산하였다.
도 85a - 85f. ID8-p53-/-brca2-/- 난소암 모델에서 면역-예방 연구. (도 85a) ID8-p53-/-brca2-/- 종양의 분석. 총 2x106 개의 ID8-p53-/-brca2-/- 세포를 CD46-유전자이식 마우스에 복강내로 주사하였다. 복수/악액질이 6-8 주 후에 발생하였다. 그런 다음 종양을 제거하고 유세포 분석을 위해 디스파제/콜라게나제로 소화시켰다. 세포의 분획을 노던 블롯 분석을 위해 종양-연관 대식세포(TAM), 호중구(TAN), 및 T-세포(TIL)로 분류하였다. (도 76 참조). (도 85b) 종양-연관 백혈구의 면역표현형. (도 85c) miR-423-5p에 대한 노던 블롯. 레인 당 총 1 μg의 RNA를 로딩하였다. 상부 패널은 32P-표지된 miR-423-5p 프로브로 프로빙 후 신호를 나타낸다. 블롯을 스트립(stripped)하고 U6 RNA 특이적 프로브로 재프로빙하였다(하부 패널). Ambion의 32P-표지된 Decade 마커를 오른쪽 레인에서 실행하였다. (도 85d) 실험 체계. CD46-유전자이식 마우스를 동원하고 HDAd-αPDL1γ1miR423 + HDAd-SB, HDAd-GFP-miR423 + HDAd-SB를 주사하거나, 또는 모의-주사하였다. 4 차례의 O6BG/BCNU 생체내 선택이 주어졌다. ID8-p53-/-brca2-/- 세포를 마지막 O6BG/BCNU 처리 2 주 후 복강내로 주사하였다. 종양 세포 주사 2, 6, 및 11 주 후, αPDL1γ1 수준을 혈청에서 분석하였다. 복수 또는 이환율/악액질의 발병을 종점으로 취하였다. (도 85e) Kaplan-Meier 생존 플롯. N=7. (도 85f) ELISA에 의해 측정된 혈청 αPDL1γ1 수준. 각 기호는 개별 동물이다. * p<0.05. 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-검정(Microsoft Excel)에 의해 계산하였다
도 86a- 86d. ID8-p53-/-brca2-/- 난소암 모델에서 면역-요법 연구. (도 86a) 암 재발을 예방하기 위한 임상 설정. 생체내 HSC 형질도입은 외과적 종양 감량수술 후 또는, 수술이 옵션이 아닌 경우 화학요법과 함께 시작할 것이다. O6BG/BCNU 생체내 선택은 화학요법과 조합될 수 있다. 생체내 HSPC 형질도입/선택의 결과로서, 보강된 HSPC는 암이 재발할 때까지 휴면기에 놓여 HSPC 분화 및 효과기 유전자 발현의 활성화를 촉발할 것이다. (도 86b) 실험 체계. CD46 유전자이식 마우스에게 1x106 개의 ID8-p53-/-brca2-/- 종양 세포를 복강내로 주사하였다. 일단 종양이 확립되면, 생체내 HSPC 형질도입 및 선택을 수행하였다. miR-423-기반 발현 시스템의 활성화를 혈청 αPDL1γ1 수준에 기반하여 모니터링하였다. (도 86c) Kaplan-Meier 생존 플롯. 대조군 설정에서, HDAd-GFP-miR423을 주사하였다. N=9. (도 86d) 혈청 αPDL1γ1 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 각 기호는 개별 동물이다. *　p<0.05. 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-검정(Microsoft Excel)에 의해 계산하였다.
도 87a, 87b. 종양 성장의 역전 전에, αPD-L1-γ1의 피크에서 17 일차에 희생된 동물의 자가면역 반응. (도 87a) 처리 전 동물(왼쪽 패널)과 비교하여 처리된 동물(오른쪽 패널)에서 털 변색. (도 87b) 처리된 동물의 기관에 대한 조직학적 분석. 절편을 H&E로 염색하였다. 대표적인 영역이 제시된다. 스케일 바는 20　mm이다. 단핵 세포의 침윤에 주목한다.
도 88a-88h. MMC 종양이 있는 neu-유전자이식 마우스에서 항-PD-L1 단클론 항체 요법의 효과 및 혈구형성에 대한 생체내 HSC 형질도입의 효과. 종양이 100　mm3의 부피에 도달했을 때, 마우스에게 항-마우스 PD1-L1 단클론 항체 muDX400*(5 mg/kg i.p.)(4 일마다 4 회) 또는 이소형 대조군 항체를 복강내 주사하였다. (도 88a) 개별 마우스의 종양 부피가 제시된다. (도 88b) 항-PD-L1에 대한 더 긴 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 생존 플롯. 부피가 1000　mm3인 종양을 종점으로 취하였다. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다. (도 88c) 생체내 HSCPC 형질도입 후 2 주차에 도 85d에 제시된 hCD46-유전자이식 마우스의 혈액 세포 계수 (도 85a) 혈액학적 매개변수. RBC: 적혈구, Hb: 헤모글로빈, MCV: 평균 미립자 부피, MCH: 평균 미립자 헤모글로빈, MCHC: 평균 미립자 헤모글로빈 농도, RDW: 적혈구 분포 폭. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 세 그룹 사이의 차이는 유의하지 않았다. (도 88e) GFP+ 세포 분획의 niRNA-Seq. (도 88f) 웨스턴 블롯, qRT-PCR, 및 혈청 ELISA에 의한 αPDL1 발현의 동역학. (도 88g) miRNA-조절된 유전자 발현. (도 88h) 개시된 면역-예방적 및 암 재발 예방의 요약된 도식.
도 89a-89h. 적혈구의 GFP 발현과 관련된 데이터.
도 90a-90i. 적혈구의 인간 인자 VIII 발현과 관련된 데이터.
도 91a-91d. 혈액학적 이상은 관찰되지 않는다.
도 92a-92g. 억제제 항체에도 불구하고 A형 혈우병의 표현형 교정.
도 93a-93e. 원숭이(엠. 파시쿨라리스(M. fascicularis))의 생체내 형질도입. (도 93a) 실험 타임라인; (도 93b - 93d) 말초 혈액에서 동원된 CD34+ 세포의 GFP 마킹; (도 93e) 골수(3 일).
도 94a-94m. 조합된 생체내 HSC 형질도입 선택. mgmtP140K는 약물 내성 및 유전자-변형된 세포의 선택적 확장에 대한 메커니즘을 제공한다. (인간 O(6)-메틸구아닌-DNA-메틸트랜스퍼라제(MGMT)에 대한 P140K 돌연변이체는 벤질구아닌으로도 알려진 MGMT 억제제 O(6)-(4-브로모테닐) 구아닌(O6BG)에 대한 내성을 부여한다. (도 94a) MGMTp140k에 대한 벡터. (도 94b) 주사에 대한 타임라인 및 투여량을 나타내는 실험 설계. (도 94c) PBMC에서 GFP+ 세포의 퍼센트를 나타내는 데이터. (도 94d) 26 주차에 골수에서 GFP+ 세포의 퍼센트를 나타내는 데이터. (도 94e) Ad5/35-GFP 벡터. (도 94f) 4 일의 동원 이어서 Ad5/35 주사를 받은 돼지꼬리 원숭이를 묘사하는 실험 프로토콜. (도 94g) 동물 ID 및 G-CSF, SCF, AMD3100, 및 Ad5/35-GFP의 용량. (도 94h) AMD3100은 총 CD34+ 줄기 세포 수준을 G-CSF/SCF 단독보다 3-배 및 기준선보다 65-배 더 우수하게 증가시켰으며; 왼쪽 패널 말초 혈액에서 CD34+ 줄기 세포의 백분율을 나타내었고; 오른쪽 패널은 CD34+ 세포 계수를 나타내었다. (도 94i) AD5/35 주사 후 동원된 세포는 계통 왜곡 없이 건강한 콜로니를 형성하며; 왼쪽 패널은 Ad5/35 주사 후 0 시간에서 6 시간까지 콜로니의 빈도 및 수를 나타내는 수치 데이터를 제공하고; 오른쪽 패널은 CD34+ 세포의 형태학에 대한 육안 검사를 제공한다. (도 94j) 상단 패널은 주사 후 0 시간에서 6 시간까지 Ad5/35-GFP 세포의 유세포 분석 데이터를 제시한다. 하단 패널은 주사 후 0, 2, 및 6 시간에 Ad5/35-GFP를 함유하는 콜로니 수의 수치 데이터를 제시한다. (도 94k) 3% 초과의 말초 CD34+ 세포는 Ad5/35 주사 후 GFP를 발현한다. 상단 패널은 Ad5/35 주사 후 0 일에서 8 일까지 단핵 세포(MNC) 층에서 추출된 C34+ 세포를 도시한다. 하단 패널은 주사 후 2 및 6 시간에 평균 GFP+ 발현을 도시한다. (도 94l) 다중 방법은 동원 및 Ad5/35 주사 후 순환 세포의 성공적인 형질도입을 확인한다. 왼쪽 패널은 벡터 DNA의 Taqman 검출을 도시한다. 오른쪽 패널은 GFP 발현의 유세포 분석 데이터를 도시한다. (도 94m) 골수로 돌아가는 변형된 세포. 왼쪽 패널은 Ad5/35 주사 후 3, 7, 및 73 일차에 CD34+ 및 GFP+ 세포에서의 변화를 나타내는 유세포 분석 데이터를 도시한다. 오른쪽 패널은 Ad5/35 주사 후 기준선, 및 3, 7, 및 73 일차에 GFP+, CD34+ 세포의 퍼센트를 도시한다.
도 95. 본원에 기재된 대표적인 Ad35 헬퍼 바이러스 및 벡터의 특징. 5-점 별은 다음 텍스트를 나타낸다: -SB100x에 대한 조합(추가 및 재활성화) 및 표적화됨; -CRISPR 또는 BE에 대한 다중 sgRNA; -Cas9의 miRNA(miR187/218) 조절된 발현; 및 -Cas9의 자동-불활성화.
도 96. HDAd-TI-combo 벡터의 도식. CRISPR 시스템은 2 개의 상이한 부위(HBG 프로모터 및 적혈구 bcl11a 인핸서)를 표적화하여, 증가된 감마 재활성화를 야기한다.
도 97a-97d. (도 97a). HDAd-SB 및 HDAd-combo의 공동감염 시, Flpe가 발현되고 IR-플랭킹된 트랜스포존을 방출한 다음, SB100x 트랜스포사제에 의해 게놈 내로 통합될 것이다. 동시에, HBG1 및 bcl11a-E CRISPR이 발현되고 DNA indel을 생성하여 γ-글로빈의 재활성화를 야기할 것이다. 트랜스포존의 Flp―매개 방출 시, CRISPR 카세트는 분해되어 세포독성을 회피할 것이다. CRISPR 시스템은 2 개의 상이한 부위(HBG 프로모터 및 적혈구 bcl11a 인핸서)를 표적화하여, 증가된 γ 재활성화를 야기한다. (도 97b) 표적화 전략; (도 97c) 적혈구 특이적 BCL11A 인핸서; (도 97d) HBG 프로모터에서 BCL11A 결합 부위(서열번호: 48). HDAd-SB 및 HdAd-comb-SB의 도식은 도 102에서 찾을 수 있다.
도 98a-98n. 이중 CRISPR 벡터 및 γ-글로빈 재활성화. (도 98a) HDAd-Bcl11ae-CRISPR, HDad-HBG-CRISPR, HDAd-Dual-CRISPR, 및 HDAd-스크램블에 대한 벡터 설계. (도 98b) 이중 gRNA 벡터에 대한 HD-Ad5/35++ CRISPR 벡터. (도 98c) 인간 적혈구 전구체 세포주(HUDEP-2)의 HD-Ad5/35++ CRISPR 형질도입은 분화 전 및 후에 제시된다. 타임라인은 HUDEP-2 세포 이미지 아래에 제시된다. (도 98d) HD-AD5/35++ "Dual" gRNA 벡터는 미처리(UNTR), BCL11A, 또는 HBG 벡터와 비교하여 세포 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않는다. (도 98e) HD-AD5/35++ "Dual" gRNA 벡터는 UNTR, BCL11A, 또는 HBG 벡터와 비교하여 증식에 부정적인 영향을 미치지 않는다. (도 98f, 도 98g) 이중 벡터는 표적 유전자좌 (도 98f) Bcl11a 인핸서 및 (도 98g) HBG 프로모터에 대한 단일 gRNA 벡터로 관찰된 것과 유사한 유사한 편집 수준을 달성한다. (도 98h) HD-AD5/35++ "Dual" gRNA 벡터는 단일 gRNA 벡터로 관찰된 것과 유사한 표적 유전자좌의 편집 수준을 달성한다. (도 98i) HbF+ 세포의 상당히 더 높은 백분율은 단일 gRNA 벡터와 비교하여 HD-Ad5/35 "Dual" gRNA 벡터로 형질도입된 HUDEP-2 세포에서 유세포 분석에 의해 관찰되었다. 유세포 분석 데이터를 요약하는 막대 차트는 유세포 분석 데이터 아래에 있다. (도 98j) HPLC에 의해 측정된 전반적인 감마 글로빈 발현은 이중 표적화된 샘플에서 상당히 더 높았다. (도 98k) 단일 녹아웃(knock-out) 클론보다 이중 녹아웃 클론에서 상당히 더 높은 태아 글로빈 발현이 관찰었으며 이는 더 높은 감마 발현/세포로 이어지는 2 개의 돌연변이의 가능한 상승 효과를 암시한다. (도 98l) 도식은 말초 혈액 동원된 CD34+ 세포가 HDAd5/35++ CRISPR 벡터로 형질도입되었음을 나타낸다. CRISPR/Cas9 세포독성을 최소화하기 위해, 세포를 항-Cas9 펩티드를 발현하는 HDAd5/35++ 벡터로 후속적으로 형질도입하였다. 세포를 준치명적으로 조사된 NSG 마우스 내로 이식하고 분석하였다. (도 98m) 이식 후 10 주차에, HD-Ad5/35 "Dual" gRNA 벡터로 형질도입된 세포는 단일 gRNA 벡터로 형질도입된 세포와 유사한 생착을 나타내었다. 계통 조성물은 모든 그룹에서 유사하였다. (도 98n) 이중 gRNA 벡터에 의해 형질도입되고 편집된 CD34+ 세포는 NSG 마우스에서 효율적으로 주입되었다. 또한, 적혈구 분화 후 주입된 이중 표적화된 세포는 상대적으로 더 낮은 편집 수준에도 불구하고, 단일 표적화된 세포와 비교하여, 대조군에 대해 더 높은 수준의 감마 글로빈을 발현하였다.
도 99a-99u. 이중 편집된 정상 및 thal CD34+ 세포의 생체외 형질도입. (도 99a) 실험 설계. 정상 CD34+ 세포에 대해 15 일째에 콜로니에서 (도 99b) HBF 발현 및 (도 99c) MFI. *는 p=0.034를 나타낸다. (도 99d) 정상 CD34+ 세포에서 15 일째에 콜로니에서 HBF 발현을 설명하는 유세포 분석 데이터. 정상 CD34+ 세포에 대한 적혈구 분화(ED) 후 (도 99e) HBF 발현 및 (도 99f) MFI. *는 p=0.01을 나타낸다. 정상 CD34+ 세포에서 형질도입 후(txd) 48 시간에 (도 99g) HBG 부위에 대한 TE71 및 (도 99h) BCL11A 부위에 대한 TE71. (도 99i) EC 및 적혈구 분화에서 HBF 발현을 설명하는 유세포 분석 데이터. (도 99j-99u) Thal CD34+ 세포. (도 99j) 0 일차 세포, 형질도입되지 않은 세포 및 CRISPR-Dual으로 형질도입된 세포의 면역표현형 및 (도 99k) 11 일에 걸쳐 형질도입되지 않은 세포 및 CRISPR-Dual으로 형질도입된 세포를 비교하는 성장 곡선. 15 일째에 콜로니에서 (도 99l) HBF 발현 및 (도 99m) MFI. **는 p=0.0046을 나타낸다. (도 99n) 형질도입되지 않은 세포에 대한 CRISPR-Dual을 비교하는 적혈구 및 골수성 구획에서 HBF 발현. (도 99o) 형질도입되지 않은 세포에 대한 CRISPR-Dual A 및 B를 비교하는 적혈구 및 골수성 구획에서 HBF 발현. (도 99p) EC에서 HBF 발현 및 (도 99q) MFI. ***는 p=0.0003을 나타내고 ****는 p=0.00003을 나타낸다. (도 99r) P04 및 P18에서 HBF 발현을 설명하는 유세포 분석 데이터. (도 99s, 99t) (도 99s) p04 및 (도 99t) p18에서 HBG 부위 적혈구 분화에 대한 TE71. (도 99u) 형질도입 48 시간 후 BCL11A 부위에 대한 TE71.
도 100. γ-글로빈 유전자 추가 및 내인성 γ-글로빈 재활성화의 조합을 설명하는 그래픽 요약.
도 101. 본원에 사용되는 HDAd5/35++ 벡터. γ-글로빈 유전자 추가는 발현 카세트를 플랭킹하는 IR 및 frt 부위가 있는 트랜스포존 벡터(HDAd-combo 및 HDAd-SB-추가 참조) 및 SB100x 및 Flpe 재조합효소를 트랜스로 제공하는 제2 벡터(HDAd-SB)로 이루어진 SB100x 트랜스포사제 시스템을 통해 달성된다. 무작위 통합을 위한 트랜스포존 카세트는 인간 γ-글로빈의 적혈구 특이적 발현을 위한 미니 β-글로빈 LCR/프로모터로 이루어진다. 3'UTR은 적혈구 세포에서 mRNA 안정화를 제공한다. γ-글로빈 발현 단위는 보편적으로 활성인 PGK 프로모터로부터 mgmtP140K 발현을 위한 카세트에서 닭 글로빈 HS4 절연체에 의해 분리된다. HDAd-CRISPR 및 HDAd-combo 벡터에서 CRISPR/Cas9 카세트는 EF1α 프로모터 제어 하에 SpCas9인 HBG1/2 프로모터 내의 BCL11A 결합 부위에 특이적인 U6 촉진-구동된 sgRNA로 이루어진다. HDAd 생산자 세포에서 Cas9의 발현은 miRNA 조절 시스템에 의해 억제된다(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 2015, 1: 14057, 2015). HDAd-combo에서, CRISPR/Cas9 카세트는 트랜스포존 외부에 배치되어 Flpe/SB100x-매개 통합 시 손실될 것이다(도 102 참조).
도 102. 제어된 Cas9 발현에 대한 도식. HDAd-combo에서, Flpe 재조합효소와 frt 부위의 상호작용은 트랜스포존의 원형화를 야기하여, CRISPR 카세트를 함유하는 벡터의 선형 단편을 남긴다. SB100x/Flpe 시스템을 사용한 이전 연구는 원형화된 트랜스포존이 SB100x에 의해 숙주 게놈 내로 통합되는 동안 이들 벡터 부분이 빠르게 손실됨을 임증하였다(Yant 등, Nat Biotechnol., 20: 999-1005, 2002).
도 103a-103d. Cas9 및 γ-글로빈 발현을 분석하기 위해 HUDEP-2 세포를 사용한 시험관내 연구. (도 103a 및 103b) 웨스턴 블롯에 의한 Cas9 발현의 분석. HUDEP-2 세포를 HDAd-combo 단독으로 및 HDAd-SB와 조합하여(즉, Flpe 및 SB100x를 트랜스로 제공하는 벡터) 형질도입하였다. 시험관내 적혈구 분화를 형질도입 후 4 일에 시작하고 8 일 동안 계속하였다. (적혈구 분화는 γ-글로빈 발현을 허용한다). 오른쪽 패널: Cas9 및 β-액틴 항체를 프로브로서 사용하는 대표적인 웨스턴 블롯. 왼쪽 패널: Cas9 신호의 요약. 막대는 HDAd-SB 공동 감염이 있거나 없는 Cas9, 즉, Flpe/SB100x 메커니즘에 의한 Cas9의 감소를 비교한다. (도 103c) 유세포 분석에 의한 γ-글로빈 발현 분석. HUDEP-2 세포를 HDAd-CRISPR("cut"), HDAd-SB-add("add")+HDAd-SB, 또는 HDAd-combo("combo")+HDAd-SB로 형질도입하고 표시된 시점에 분석하였다. (도 103d) qRT-PCR에 의한 γ-글로빈 mRNA 수준. d.p.t., 형질도입 후 일. Diff, 분화. * p<0.05
도 104a-104i. CD46/β-YAC 마우스의 생체내 형질도입 후 γ-글로빈 발현 연구. (도 104a) 실험 도식. HSPC를 4 일 동안 인간 재조합 G-CSF의 피하(s.c.) 주사 이어서 AMD3100의 1 회 s.c. 주사에 의해 동원하였다. AMD3100 주사 후 30 및 60 분에, 동물에게 다음 HDAd 벡터의 1:1 혼합물을 정맥내로 주사하였다(2 회 주사, 각각 4x1010　vp): HDAd-combo+HDAd-SB, HDAd-SB-add+HDAd-SB, 및 HDAd-cut. 인간 γ-글로빈 및 MGMT에 대한 면역 반응을 피하기 위해 마우스를 다음 4 주 동안 면역억제성(IS) 약물로 처리하였다. 4 주차에, O6-BG/BCNU 처리를 시작하고 2 주마다 3 회 반복하였다. 각 주기마다, BCNU 농도를 5　mg/kg에서 7.5　mg/kg 내지 10　mg/kg까지 증가시켰다. 18 주차에 동물을 조직 샘플 분석 및 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스 내로 2차 이식을 위한 골수 Lin- 세포 수확을 위해 희생시킨 다음, 이후 16 주 동안 추적하였다. (도 104b) "combo" 및 "cut" 그룹에 대한 유세포 분석에 의한 말초 적혈구에서 γ-글로빈 발현의 검출. (도 104c) HPLC에 의해 측정된 γ-글로빈 단백질 수준. 오른쪽 패널: 인간 β-글로빈, 재활성화된 인간 Aγ, 및 추가된 γ-글로빈 쇄가 표시된 RBC 용해물(18 주)의 크로마토그램. 왼쪽 패널: HPLC 데이터의 요약. "cut", "add", 및 "combo" 벡터로 처리된 CD46/β-YAC 마우스에 대한 인간 β -글로빈에 대한 총 γ-글로빈의 백분율이 제시된다. *: p<0.05, n.s.. (도 104d) 마우스 β-주요 mRNA 발현에 대한 γ-글로빈 mRNA 발현(qRT-PCR에 의해 측정). (도 104e) CRISPR/Cas9에 의한 퍼센트 표적 부위 절단. 생체내 "cut" 및 "combo" 형질도입된 마우스로부터 18 주차에 수확된 PBMC 및 골수 MNC로부터의 게놈 DNA를 T7EI 검정에 적용하였다. 도 105의 데이터에 대한 요약이 제시된다. * p<0.05). (도 104f) "add" 및 "combo" 벡터로 형질도입 후 18 주차에 골수 HSPC에서 측정된 통합 벡터 카피 수. 그룹 사이의 차이는 유의하지 않다. (도 104g) "combo" 벡터 처리된 마우스의 개별 CFU에서 VCN의 스펙트럼. 골수 Lin- 세포를 전구체 검정을 위해 플레이팅하고 VCN을 qPCR에 의해 개별 콜로니에서 측정하였다. 4 마리의 상이한 마우스의 데이터가 제시된다. (도 104h) HPLC에 의한 인간 γ/인간 β 글로빈 단백질. (도 104i) 마우스 β-주요 mRNA 발현에 대한 인간 γ-글로빈 mRNA 발현의 백분율.
도 105a, 105b. 표시된 인간 β- 및 γ-글로빈 피크가 있는 RBC 용해물의 크로마토그램. (도 105a) 상부 패널은 처리 전 β-YAC 마우스를 나타낸다. 중간 패널은 HDAd-CRISPR("cut") 형질도입 후 18 주를 제시한다. 왼쪽 패널은 Gγ 및 Aγ 둘 다의 재활성화를 나타낸다. 하부 패널은 HDAd-CRISPR("cut") 형질도입 후 18 주를 나타낸다. (도 105b) 피크는 마지막 하단 패널에 표지되어 있다. 각 크로마토그램은 개별 동물이다. 인간 β-글로빈은 감소하고 γ-글로빈은 증가함에 유의한다(역 글로빈 스위치).
도 106. "cut" 및 "combo" 벡터로 형질도입 후 16 주차에 혈액, 비장, 및 골수의 MNC에 대한 T7EI 검정 데이터. 특이적 CRISPR/Cas9 절단 단편(255 및 110　bp)은 화살표로 표시된다. 밴드 신호 정량화에 기반한 절단 백분율은 각 레인 아래에 제시된다.
도 107a-107f. CD46/β-YAC 형질도입된 마우스로부터 Lin- 세포의 2차 수용자 분석. (도 107a) 표시된 시점에서 인간 γ-글로빈 발현 말초 혈액 RBC의 백분율. 모든 마우스는 이식후 4 주부터 시작하여 면역억제를 받았다. (도 107b) 이식 후 16 주차에 인간 β-글로빈에 대한 γ-글로빈 단백질의 수준. (도 107c 및 107d) 마우스 β주요-글로빈 및 인간 β-글로빈에 대한 γ-글로빈 단백질의 수준. (도 107e) 형질도입되지 않은 대조군 마우스와 비교하여 "combo" 벡터로 형질도입 후 16 주차에 혈액, 비장, 및 골수의 MNC에서 계통-양성 세포 조성물. 도 107f. γ-글로빈 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 측정된 HDAd-comb 그룹의 총 백혈구에서 세포 당 벡터 카피 수.
도 108a-108d. SCD에 대한 모델로서 삼중 유전자이식 CD46/Townes 마우스의 생성 및 특성화. (도 108a) CD46/Townes 마우스의 번식. Townes 마우스(hα/hα::βS/βS)를 3 차례에 걸쳐 CD46 유전자이식 마우스와 번식시켰다. CD46, HbS 및 HBA에 대해 동형접합성인 동물을 생체내 형질도입 연구에 사용하였다. (도 108b) 부동변형적혈구증가증, 다염적혈구증가증(검정색 화살표), 겸상 및 단편화 세포(별표가 있는 검정색 화살표)를 포함하는 인간 질환의 전형적인 특징이 있는 CD46/Townes 마우스의 말초 혈액 도말 스케일 바는 15　μm이다. (도 108c) 모체 "건강한" CD46-유전자이식 마우스와 비교하여 CD46/Townes 마우스의 말초 혈액의 혈액학적 분석. Ret: 망상적혈구; RBC: 적혈구, Hb: 헤모글로빈; HCT: 적혈구용적률; WBC: 백혈구. 모든 차이는 유의하다(p<0.05). (도 108d) CD46/Townes 마우스에서 비장비대. CD46tg 및 CD46/Townes 마우스에서 비장 대 체중의 비율이 제시된다. N=3.
도 109a-109f. CD46/Townes 마우스의 생체내 HSPC 형질도입 후 γ-글로빈 발현. 마우스를 동원하고, HDAd-combo+HDAd-SB를 주사하고, 도 104에 대해 기재된 바와 같이 O6BG/BCNU로 처리하였다. (도 109a) 유세포 분석에 의해 측정된 말초 RBC에서 γ-글로빈 마킹. 빈 사각형은 미처리 CD46/Townes 마우스의 RBC에서 마킹을 나타낸다. 수직 화살표는 생체내 선택 주기를 나타낸다. (도 109b) HPLC에 의해 13 주차에 측정된 RBC에서 γ-글로빈 수준. 왼쪽 패널: 개별 마우스에서 인간 α-글로빈 및 βs-글로빈 쇄에 대한 총 γ-글로빈 수준의 요약. 빈 사각형은 미처리 CD46/Townes 마우스에서 RBC의 수준을 나타낸다. 오른쪽 패널: 처리 전(상부 패널) 및 HDAd-combo+HDAd-SB로 생체내 HSPC 형질도입 후 13 주차에 CD46/Townes 마우스의 대표적인 크로마토그램. 인간 β-, βs, 재활성화된 Aγ, 및 추가된 γ-글로빈에 대한 피크가 표시된다. (도 109c) HPLC에 기반한 재활성화된 Aγ의 백분율. (도 109d) 개별 마우스에서 인간 α-글로빈 및 βs-글로빈 mRNA에 대한 총 γ-글로빈 mRNA의 백분율. (도 109e) HDAd-combo로 형질도입 후 163 주차에 골수 HSPC에서 측정된 통합 벡터 카피 수. (도 109f) HDAd-combo의 주사 후 13 주차에 CD46/Townes 마우스의 HBG1/2 표적 부위 절단 총 골수 핵 세포, Lin- 세포, PBMC, 및 비장세포. 특이적 CRISPR/Cas9 절단 단편(255 및 110　bp)은 화살표로 표시된다. 밴드 신호 정량화에 기반한 절단 백분율은 각 레인 아래에 제시된다.
도 110a, 110b. 형질도입된 CD46/Townes 마우스의 Lin- 세포로 이식된 2차 수용자의 분석. (도 110a) 인간 γ-글로빈 발현 말초 혈액 RBC의 백분율. (도 110b) 이식 후 16 주차에 인간 α- 및 βS 글로빈에 대한 γ-글로빈 단백질의 수준.
도 111a-111c. 혈액에서 표현형 교정. (도 111a) 브릴리언트 크레실 블루에 의한 망상적혈구에 대해 염색된 혈액 도말. 이 염료는 핵 및 세포질 구획의 잔류물을 염색한다. (정량화는 도 109c, 막대의 첫번째 그룹에서 발견될 수 있다). 스케일 바는 20　μm이다. (도 111b) HDAd-combo 유전자 요법 후 적혈구의 정상적혈구 형태학을 나타내는 혈액 도말. (도 111c) 말초 혈액의 혈액학적 분석. "CD46" 및 "combo 후 13 주차 CD46/Townes" 사이의 차이는 유의하지 않다.
도 112a-112c. 비장 및 간에서 표현형 교정. (도 112a) 조직 조직학. 상부 패널: 비장에서 철분 침착. Perl의 프러시안 블루 염색에 의해 비장 절편에서 헤모시데린을 검출하였다. 스케일 바는 20　μm이다. 중간 및 하부 패널: 비장 및 간 절편에서 헤마톡실린/에오신 염색에 의한 골수외 혈구형성. 간에서 적혈구모세포 및 CD46/Townes 마우스의 비장에서 거핵구의 클러스터는 흰색 화살표로 표시된다. 스케일 바는 20　μm이다. 대표적인 이미지가 제시된다. (도 112b) 처리된 CD46/Townes 마우스에서 보상 혈구형성의 측정가능한 특성인 비장 크기는 모체 CD46 마우스와 비교가능하다. (도 112c) 도 112a의 간 절편 이미지의 4-배 더 큰 배율. 처리 전에 CD46/Townes 마우스의 간 동양혈관에 포획된 겸상 RBC(왼쪽 패널) 및 처리 후에 간 동양혈관에서 겸상 적혈구의 부재(오른쪽 패널).
도 113. Ad5/35 헬퍼 바이러스 게놈의 왼쪽 단부. 진회색으로 음영 처리된 서열은 천연 Ad5 서열에 상응하며, 즉, 음영 처리되지 않거나 또는 연회색으로 강조된 서열은 인공적으로 도입되었다. 연회색으로 강조된 서열은 (나란히 반복된) loxP 서열의 2 개 카피이다. "cre 재조합효소" 단백질의 존재 하에, 2 개의 loxP 서열 사이의 뉴클레오티드 서열이 결실된다(loxP의 하나의 카피만 남아 있음). loxP 부위 사이의 Ad5 서열은 아데노바이러스 DNA를 (생산자 세포의 핵에서) 캡시드 내로 패키징하는 데 필수적이기 때문에, 이 결실은 패키징할 수 없는 헬퍼 아데노바이러스 게놈 DNA를 초래한다. 결과적으로, 결실 과정의 효율은 패키징된 헬퍼 게놈 DNA의 수준(원치않은 헬퍼 바이러스 "오염")에 직접 영향을 미친다. 상기 관점에서, Ad5 이외의 아데노바이러스 혈청형에 대해 동일한 체계를 번역하기 위해, 다음을 달성하는 것이 바람직하다: 1. loxP 서열 삽입에 의해 플랭킹되고 cre 재조합효소의 존재 하에 결실될 수 있도록 패키징에 필수적인 서열을 식별한다. 이러한 서열의 식별은 서열에서 유사성이 거의 없는 경우 간단하지 않다. 2. 천연 DNA 서열에서 loxP 서열의 삽입이 헬퍼 바이러스의 증식 및 패키징에 최소 영향을 미칠 위치를 결정한다(cre 재조합효소의 부재 하에). 3. 헬퍼-의존적 아데노바이러스의 생산 동안(즉, 116 세포주와 같은 cre 재조합효소 - 발현 세포주에서) 헬퍼 바이러스 패키징을 최소로 유지하고 패키징 서열의 효율적인 결실을 허용하기 위해 loxP 서열 사이의 간격을 결정한다.
도 114. Ad5 및 Ad35 패키징 신호의 정렬(서열번호: 49 및 50). Ad5의 왼쪽 단부 서열과 Ad35의 정렬은 패키징 신호를 식별하는 데 도움을 준다. 패키징(AI 내지 AV)에 중요한 Ad5 서열의 모티프는 상자에 있다(Schmid 등, J Virol., 71(5):3375-4, 1997의 도 1b 참조). loxP 삽입 부위의 위치는 검정색 화살표로 표시된다. 삽입은 AI 내지 AIV를 플랭킹하고 AV를 방해하는 것으로 보인다. Schmid 등에 표시된 바와 같은 추가적인 패키징 신호 AVI 및 AVII은 이 벡터의 E1 결실의 일부로서 Ad5 헬퍼 바이러스에서 결실되었음에 유의한다.
도 115. pAd35GLN-5E4의 도식. 이는 재조합 기술을 사용하여 벡터화된 Ad35 게놈(ATCC의 Holden 균주)에서 유래된 1세대(E1/E3-결실) Ad35 벡터이다(PMID: 28538186). 그런 다음 이 벡터 플라스미드를 사용하여 loxP 부위를 삽입하였다.
도 116. 플라스미드 패키징 신호에 대한 정보. 패키징 부위(PS)1 LoxP 삽입 부위는 뉴클레오티드 178 및 344 뒤에 있다. 이는 AI 내지 AIV를 제거하여야 한다. AVI 및 AVII을 포함하는 나머지 패키징 신호(344 이후)는 결실되었다(E1 결실(345 내지 3113)의 일부). PS2 LoxP 삽입 부위는 뉴클레오티드 178 및 481 뒤에 있다. 추가적으로, 뉴클레오티드 179 내지 365는 결실되어, AI 내지 AV는 존재하지 않는다. 나머지 패키징 모티프 AVI 및 AVII은 HDAd 생산 동안 cre 재조합효소에 의해 제거가능하다. E1 결실은 482에서 3113까지이다. PS3 LoxP 삽입 부위는 뉴클레오티드 154 및 481 뒤에 있다. 3 개의 조작된 벡터가 구제될 수 있다. 재배열된 loxP 부위가 있는 바이러스 게놈의 백분율은 PS1, PS2, 및 PS3에 대해 각각 50, 20, 및 60%였다. lox P 부위가 바이러스 복제 및 유전자 발현에 중대하게 영향을 미칠 때 재배열이 발생한다. 재배열된 loxP 부위가 있는 벡터는 패키징될 수 있고 HDAd prep을 오염시킬 것이다. 서열번호: 286, 51, 및 52는 각각 PS1, PS2, 및 PS3으로 도해된 벡터를 예시한다.
도 117. 현재 HDAd5/35 플랫폼과 비교한 차세대 HDAd35 플랫폼. 두 벡터는 CMV-GFP 카세트를 함유한다. Ad35 벡터는 면역원성 Ad5 캡시드 단백질을 함유하지 않는다. 시험관내에서 CD34+ 세포의 비슷한 형질도입 효율을 나타낸다. 가교 연구는 시험관내에서 CD34+ 세포의 비슷한 형질도입 효율을 나타낸다. G-CSF 동원된 공여자의 말초 CD34+ 세포인 인간 HSC를 HDAd35(Ad35 헬퍼 P-2로 생성) 또는 Ad5 캡시드와 Ad35의 섬유를 함유하는 키메라 벡터로 500, 1000, 2000 vp/세포의 MOI에서 형질도입하였다. GFP-양성 세포의 백분율을 3 개의 독립적인 실험에서 바이러스 추가 후 48 시간에 측정하였다. 특히, HDAd35로 감염은 헬퍼 바이러스 오염으로 인해 48 시간에 세포변형 효과를 촉발하였다.
도 118. PS2 헬퍼 벡터를 원숭이 연구에 초점을 맞춰 새로 만들었다. 다음으로부터 학습된 조치가 이어진다: E1 영역의 결실, Loxp에 의해 플랭킹된 돌연변이체 패키징 신호, 돌연변이체 패키징 서열, E3 영역의 결실(27435→30540), Ad5E4orf6으로 대체, copGFP 카세트를 플랭킹하는 스터퍼 DNA의 삽입, 및 놉에 돌연변이를 도입하여 Ad35K++ 제조.
도 119. 돌연변이된 패키징 신호 서열이 제공된다. 잔기 1 내지 137은 Ad35 ITR이다. 굵은 글씨는 SwaI 부위이고, Loxp 부위는 이탤릭체이고, 돌연변이된 패키징 신호는 밑줄로 표시된다.
도 120a, 120b. 다양한 헬퍼 벡터 및 패키징 신호 변이체의 개략적 도면. 구현예에서, E3 영역(27388 → 30402)은 결실되고 CMV - eGFP 카세트는 E3 결실, Ad35K++ 내에 위치하고, eGFP는 copGFP 대신에 사용된다. (도 120a)에 제시된 패키징 신호 변이체를 함유하는 4 개의 헬퍼 벡터 모두 구제될 수 있다. loxP 부위는 증폭이 보다 효율적일 수 있을 때 재배열되었다. 추가적인 패키징 신호 변이체는 도 120b에 예시되어 있다.
도 121. HDAd-combo 벡터의 묘사.
도 122. 실험 프로토콜.
도 123. +58 적혈구 bcl11a 인핸서 영역 내에서 GATAA 모티프를 편집하기 위한 벡터. 벡터 구조는 상부 패널에 제시되어 있다. 두 벡터는 GATAA 모티프를 표적화한다. 하부 패널은 HDAd-C-BE 벡터에 의해 매개된 염기 변화를 나타낸다. (서열번호: 65-68)
도 124a-124c. 인간 CD34+ 세포에 대한 벡터 분석. (도 124a) 세포를 2000　vp/세포의 MOI에서 감염시키고 1 일 후에 18 일 동안 적혈구 분화에 적용하였다. (도 124b) 상이한 시점에서 T7E1A 검정에 의한 표적 부위 절단을 위해 세포 분취액을 분석하였다. 왼쪽 막대: HDAd-wtCRISPR, 오른쪽 막대: HDAd-C-BE. (도 124c) 적혈구 분화의 종료에 γ-글로빈+ 세포의 백분율.
도 125. HDAd-wtCRISPR 및 HDAd-C-BE 형질도입된 CD34+ 세포의 생착. 형질도입의 MOI는 2000 vp/세포였다. 생착은 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 CD45+ 세포의 백분율에 기반하여 측정하였다.
도 126. 염기 편집기 HDAd 벡터. sgRNA는 HBG1/2에서 적혈구 bcl11a 인핸서(상부 패널) 또는 BCL11a 단백질 결합 부위를 표적화한다. 중간 패널은 적혈구 전구체 세포주 HUDEP-2의 적혈구 분화 당일에 염기 전환율 %을 나타낸다. 오른쪽 패널은 γ-글로빈 재활성화 수준을 나타낸다. (서열번호: 67, 65, 및 71)
도 127a, 127b. (도 127a) 전형적인 겸상-유사 적혈구를 사용한 혈액 도말. (도 127b) 적혈구 매개변수.
도 128a-128c. (도 128a) 생체내 선택 없이 Townes/CD46 마우스의 생체내 형질도입. (도 128b) RBC에서 γ-글로빈 재활성화. (도 128c) 처리 전 및 처리 8 주차에 혈액 도말의 망상적혈구 염색.
도 129a-129d. 동원된 원숭이에서 생체내 HSC 형질도입. G-CSF, SCF, 및 AMD3100으로 동원 후, 2 마리의 수컷 원숭이에게 정맥내 주사에 의해 HDAd-GFP(1x1012vp/kg)를 제공하였다. HDAd 주사 전에, 동물을 덱사메타손을 전처리하여 가능한 사이토카인 방출을 차단하였다. (도 129a) 표시된 시점으로부터 정제된 말초 혈액 CD34+ 세포를 배양하고 유세포 분석에 의해 GFP 발현에 대해 분석하였다. 배양물에서 4 일에 걸쳐 GFP를 발현하는 세포의 평균 퍼센트가 제시된다 (도 129b) HDAd-GFP 주사 전(0 시간) 또는 후(6 시간) GFP를 발현하는 정제된 CD34+ 세포의 대표적인 흐름도. (도 129c) 콜로니 형성 검정을 말초 혈액 또는 총 PBMC로부터 정제된 CD34+ 세포로 개시하였다. 배양물에서 14 일 후, 개별 콜로니를 선별하고 PCR에 의해 GFP DNA의 존재에 대해 분석하였다. (도 129d) 골수 CD34+ 세포에서 GFP 발현의 분석. 대표적인 블롯이 제시된다. 이 연구에서, HDAd-GFP만을 주사하고 따라서 단기간 GFP 발현만을 측정하였다.
도 130. 가이드 서열의 스크리닝. HUDEP-2 세포를 표 14에 나열된 염기 편집기로 형질감염시켰다. γ-글로빈 발현을 형질감염 후 4 일차(4dpt) 및 시험관내 적혈구 분화 후 6 일차(Diff 6d)에 측정하였다. HBG1/2 프로모터에서 TGACCA 모티프를 표적화하는 CRISPR/Cas9 벡터를 양성 대조군(pos ctrl)으로 사용하였다. CBE 표적화 CCR5 코딩 영역을 음성 대조군(sgNeg)으로 포함하였다. 제시된 데이터(평균 ± SD)는 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 131a, 131b. 상이한 버전의 사이티딘 염기 편집기의 비교. (도 131a) 293 세포(HEK293)를 WTCas9 또는 BE 벡터 + pSP-BE4-sgBCL11Ae1(3 + 1　μg)로 형질감염시키고 bcl11a 인핸서 표적 부위 절단 부위는 T7E1 검정에 의해 형질감염 4 일 후에 분석하였다. (도 131b) 동일한 연구를 적혈구백혈병 세포주(K562) WTCas9 또는 BE 벡터 + pSP-BE4-sgBCL11Ae1(2 + 0.66　μg)에서 수행하였다.
도 132a-132c. HDAd5/35++_BE 벡터의 설계 및 구제. (도 132a) 사이티딘 염기 편집기(CBE) 벡터 설계. 구제가능하지만 낮은 수율. (도 132b) 아데닌 염기 편집기(ABE) 벡터 설계의 첫번째 버전. 구제가능하지 않음. (도 132c) 반복성을 감소시키기 위한 ABE 코돈 최적화. TadA(tRNA 아데노신 데아미나제 효소)의 코돈 최적화를 나타내는 서열 비교를 포함한다(서열번호: 260 및 261)
도 133a-133h. HDAd5/35++_BE 벡터의 구축 및 검증. (도 133a) HDAd_ABE 벡터 다이어그램. 2 개의 frt-IR에 의해 플랭킹된 4.2 kb MGMT/GFP 카세트는 HDAd_SB 벡터와 공동-전달될 때 통합된 발현을 허용한다. 8.0 kb 염기 편집기 구성요소를 일시적 발현을 위해 트랜스포존 외부에 설계하였다. 2 개의 TadAN 반복부는 반복 서열을 감소시키기 위해 코돈 최적화되었다(*는 촉매 반복부를 나타낸다). microRNA 반응성 요소(miR)를 3' 인간 β-글로빈 UTR에 포매시켜 116 세포에서 ABE 발현을 특이적으로 하향조절함으로서 생산자 세포에 대한 독성을 최소화하였다. PGK, 인간 PGK 프로모터. bGHpA, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열. SV40pA, 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 신호. ITR, 도립된 말단 반복부. Ψ, 패키징 신호. (도 133b) 생성된 바이러스 벡터의 정보. 나열된 수율은 하나의 3L 스피너로부터 기인한다. (도 133c) HUDEP-2 세포에서 바이러스 벡터의 검증. 세포를 표시된 MOI(vp/세포)에서 다양한 벡터로 형질도입하였다. γ-글로빈 발현을 형질감염 후 4 일차(4dpt) 및 시험관내 적혈구 분화 후 6 일차(Diff 6d)에 측정하였다. CCR5 코딩 영역을 표적화하는 CBE 벡터를 음성 대조군(sgNeg)으로 포함하였다. 제시된 데이터(평균 ± SD)는 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다. (도 133d) HDAd_sgHBG#2에 의한 표적 염기 전환. 표적화 염기를 포함하는 HBG1 또는 HBG2 게놈 분절을 증폭시키고 Sanger 서열분석에 적용하였다. 데이터를 EditR 1.0.9에 의해 분석하였다. 화살표는 표적화 염기를 나타낸다. 전환율 %은 크로마토그램 아래에 제시되었다. (도 133e) 분화 후 6 일차에 HPLC에 의해 측정된 α- 또는 β-글로빈에 대한 γ-글로빈 발현의 %. MOI=1000. 제시된 데이터(평균 ± SD)는 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다. 도 133f-133h) HDAd_sgHBG#2로 형질도입된 HUDEP-2 세포로부터 유래된 대표적인 클론(#3). 단일대립유전자성 -116A→G 염기 전환이 HBG1 프로모터에서 검출되었으며(도 133f), 이는 유세포 분석에 의한 100% γ-글로빈+ 세포를 초래하였다(도 133g). γ-글로빈 단백질 수준은 HPLC에 의해 측정하였다(도 133h).
도 134a-134c. 도 133을 뒷받침하는 데이터. (도 134a) 도 133d의 보충. 표시된 바이러스로 처리된 HUDEP-2 세포에서 표적 염기 전환. (도 134b) 대표적인 단일 세포 HUDEP-2 클론. 도 133f의 보충. 화살표가 있는 B는 이중대립유전자성 편집을 나타내고 M 및 화살표는 단일대립유전자성 편집을 나타낸다. (도 134c) 상응하는 단일 세포 HUDEP-2 클론에서 γ-글로빈 발현은 상기 제시된다. 도 133g의 보충.
도 135a-135i. 생체내 형질도입 및 선택 후 βYAC 마우스에서 γ-글로빈의 재활성화. (도 135a) 실험 절차. β-YAC/CD46 마우스(n=9)를 G-CSF/AMD3100에 의해 동원하고 HDAd_sgHBG#2 + HDAd_SB로 생체내 형질도입하였다. O6BG/BCNU에 의한 4 차례의 선택을 형질도입 후 각각 4, 6, 8 및 10 주차에 수행하였다. 마우스를 16 주차에 안락사시켰다. 계통- 세포를 단리하고 치명적으로 조사된 C57BL/6 마우스에 IV 주사하였다. 2차 이식된 마우스를 이후 16 주 동안 추적하였다. (도 135b) 형질도입 후 상이한 시점에서 PBMC의 GFP 마킹. 각 점은 1 마리의 동물을 나타낸다. (도 135c) PBMC에서 GFP 발현의 대표적인 점 플롯. (도 135d) 유세포 분석에 의해 측정된 혈액 세포에서 γ-글로빈 발현. (도 135e) 혈액 세포에서 γ-글로빈 발현의 대표적인 점 플롯. (도 135f) 1차 마우스의 종료점에서 혈액 및 골수의 Ter-119+ 및 Ter-119- 세포에서 유세포 분석에 의한 γ-글로빈 발현. (도 135g) HPLC에 의해 측정된 적혈구 용해물에서 γ-글로빈 단백질 수준. 제시된 데이터는 마우스 α- 또는 β-글로빈 또는 인간 β-글로빈에 대한 백분율이다. (도 135h) RT-PCR에 의해 측정된 mRNA 수준에서 γ-글로빈 발현. 제시된 데이터는 마우스 HBA 또는 HBB, 또는 인간 HBB mRNA에 대한 배수 변화이다. (도 135i) 총 골수 세포에서 벡터 카피 수(세포 당 카피). MGMT에 대한 프라이머를 사용하였다.
도 136. 도 135h에 제시된 대표적인 데이터의 HPLC 플롯.
도 137a-137g. 표적 염기 전환. (도 137a) sgHBG#2 가이드 서열. 넘버링은 5' 단부에서 시작하였다. 주황색 배경으로 강조된 것은 보고된 BCL11A 결합 부위인 TGACCA 모티프이다. 모티프에서 2 개의 아데닌(A5 및 A8)은 2 개의 화살표로 표시하였다. (도 137b) 표적 염기 전환 백분율. HBG1 및 HBG2 프로모터 영역에서 두 A5 및 A8이 제시되었다. 각 점은 1 마리의 동물을 나타낸다(n=9). (도 137c) 마우스 #1108의 HBG1 및 HBG2 영역에서 표적 염기 전환을 나타내는 대표적인 크로마토그램. (도 137d) γ-글로빈 발현에 대한 평균 염기 전환 사이의 상관관계. 각 동물에서 평균 염기 전환 백분율은 HBG1 및 HBG2 프로모터 영역의 A5 및 A8에서 평균 수준이었다. 각 점은 1 마리의 동물을 나타낸다(n=9). (도 137e) A5 및 A8에서 염기 전환 비교. 각 점은 1 마리의 동물을 나타낸다(n=9). (도 137f) 표적화된 아데닌 뉴클레오티드에서 전환 백분율을 나타내는 차트. (도 137g) 특정 마우스에서 표적화 염기 전환을 나타내는 크로마토그램(서열번호: 250).
도 138a-138d. 안전성 프로파일. (도 138a) 형질도입 후 16 주차에 혈액 샘플을 사용한 HEMAVET®에 의한 혈액학 분석. 제시된 데이터는 HDAd_sgHBG#2로 형질도입된 9 마리의 마우스 및 3 마리의 형질도입되지 않은 대조군 마우스를 나타내는 평균 ± SD이다. (도 138b) 16 주차에 혈액 샘플의 망상적혈구 백분율. 샘플을 브릴리언트 크레실 블루로 염색하였다. 제시된 데이터는 HDAd_sgHBG#2로 형질도입된 4 마리의 마우스 및 3 마리의 형질도입되지 않은 대조군 마우스를 나타내는 평균 ± SD이다. (도 138c) 1차 마우스의 종료점에서 골수 MNC의 세포 조성물. 형질도입되지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 각 점은 1 마리의 동물을 나타낸다. (도 138d) 브릴리언트 크레실 블루로 염색한 대표적인 망상적혈구.
도 139a-139c. 2차 이식. (도 139a) 유세포 분석을 사용하여 PBMC에서 인간 CD46 발현에 의해 측정된 생착. (도 139b) PBMC에서 GFP 발현. (도 139c) γ 유세포 분석에 의해 검출된 말초 혈액 세포에서 γ-글로빈 발현.
도 140a, 140b. 유전자간 결실의 검출. (도 140a) 유전자간 4.9　k 결실의 검출은 이전에 기재되었다(Li 등, Blood, 131(26): 2915, 2018). 총 골수 MNC로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. HBG1 및 HBG2 프로모터에서 2 개의 CRISPR 절단 부위에 걸쳐 있는 9.9 kb 게놈 영역을 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성물에서 추가 5.0 kb 밴드는 4.9　k 결실의 발생을 나타낸다. 결실 백분율을 4.9　kb 결실의 비로 정의된 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성된 표준 곡선 공식에 따라 계산하였다. HBG1/2 프로모터를 표적화하는 CRISPR 벡터로 형질도입된 생체내 마우스로부터 유래된 샘플을 비교에 사용하였다. 각 레인은 1 마리의 동물을 나타낸다. (도 140b) 도 140a에서 결실 백분율의 요약. 각 점은 1 마리의 동물을 나타낸다.
도 141. BE vs CRISPR/Cas9의 세포독성. CRISPR/Cas9를 사용한 현재 게놈-편집 기술에 대한 주요 관심사는 이중-가닥 DNA 파괴(DSB)를 도입하여, 원치않은 큰 단편 결실 및 p53-의존적 DNA 손상 반응을 야기함으로써 숙주 세포에 해로울 수 있다는 점이다. 염기 편집기는 표적화된 게놈 유전자좌에서 정확한 뉴클레오티드 돌연변이를 설치할 수 있고 DSB를 피하는 이점이 있다. 이 연구는 HSC의 주요한 기능적 특징, 즉 준치명적으로 조사된 NSG 마우스에서 생착이 BE에 의해 영향을 받지 않지만 CRISPR/Cas9 발현 벡터로 인간 CD34+ 세포의 형질도입 후 극적으로 감소됨을 나타낸다.
도 142. BE4-sgBCL11AE1에 의해 매개된 예상된 편집. BCL11A 유전자좌의 편집을 나타내는 도식. GATAA 모티프(서열번호: 65) 및 염기 편집 후 방해된 GATAA 모티프(서열번호: 67)가 제시된다.
도 143. 표적에 대한 최적 위치. 표적화를 위한 예시적인 위치를 강조하는 핵산 서열의 도식. 도면은 표적 C가 프로토스페이서 내의 위치 4 내지 8에 있을 때 부분적으로 C에서 T로의 편집을 나타낸다.
도 144는 염기 편집기를 암호화하는 벡터의 도식이다.
도 145. 바이러스 gDNA의 다이어그램. 단일 인접한 작제물을 나타내지만 제시의 용이성을 위해서만 2 개의 절편으로 나눠진 바이러스 gDNA(HBG2-miR, 아데닌 편집기)의 도식.
도 146. TadA 서열. 2 개의 'TadA +32aa'의 DNA 서열(서열번호: 367 및 268)을 포함하는, TadA 및 TadA*의 서열(서열번호: 265 및 266)의 개략도.
도 147. 염기 편집. 야생형(서열번호: 269) 및 편집된 서열(서열번호: 269)의 개략도.
도 148. 염기 편집. HDAd5/35++_BE4-sgBCL11Ae1-FI-mgmtGFP(041318-1) 바이러스에 의한 염기 편집과 관련한 개략도 및 2 개의 겔.
도 149. γ-글로빈+ 세포의 퍼센트. 표시된 MOI에서 γ-글로빈+ 세포의 백분율을 나타내는 그래프.
도 150. 염기 편집에 의한 HbF의 재활성화. 벡터 및 관련 정보의 목록.
도 151. 벡터 및 관련 정보의 목록, 및 염기 편집기의 다양한 MOI에서 퍼센트 HbF+ 세포를 나타내는 그래프.
도 152. γ-글로빈 발현(HUDEP-2), 2차 시험. HUDEP-2 세포에서 2차 시험의 % HbF+를 나타내는 그래프.
도 153. γ-글로빈 발현(HUDEP-2), 단일 세포 유래 클론. 다양한 단일 세포 유래 클론에서 % HbF+를 나타내는 그래프.
도 154a-154s. 개별 단일 세포 유래 클론을 나타내는 데이터. 도 154a-154s는 각각 단일 세포 클론을 나타내는 데이터를 포함한다. (서열번호: 271, 250, 252)
도 155. 293FT 세포에서의 테스트. 293FT 세포에서 염기 편집기의 사용 결과를 나타내는 2 개의 겔.
도 156a-156d. 편집된 염기(293FT 세포)를 확인하기 위한 Sanger 서열분석. 도 156a-156d는 각각 sanger 서열분석 결과를 나타내는 크로마토그램(들)을 포함한다. (서열번호: 269, 275-278)
도 157. HUDEP-2 세포에서의 테스트. 형질감염 4 일 후 HUDEP-2 세포에서 염기 편집기의 사용 결과를 나타내는 2 개의 겔.
도 158. γ-글로빈 발현(HUDEP-2). γ-글로빈의 발현을 나타내는 그래프.
도 159a-159d. 편집된 염기(HUDEP-2 세포)를 확인하기 위한 Sanger 서열분석. 도 159a-159d는 각각 이용가능한 경우 Sanger 서열분석 결과를 나타내는 크로마토그램(들)을 포함한다. (서열번호: 269, 275-278)
도 160. (Maxi 제조 하에) HDAd 바이러스 생산을 위한 선택된 작제물. (Maxi 제조 하에) HDAd 바이러스 생산을 위한 특정 작제물의 구축된 벡터 표시 선택 목록.
도 161. huCD45+ 세포의 생착을 나타내는 차트.
도 162. HUDEP-2 세포의 일시적 형질감염(T7EI에 의해 절단). HUDEP-2 세포의 일시적 형질감염(T7EI에 의해 절단) 결과를 나타내는 겔.
도 163. 이중 염기 편집 벡터 적용. 이중 염기 편집 벡터 구현예(서열번호: 279)의 개략도.
도 164. SB100x 트랜스포사제에 의한 인간 γ-글로빈/mgmt. 유전자 추가 및 HBG 프로모터에서 적혈구 bcl11a 인핸서 및 BCL11A 결합 부위를 표적화하는 CRISPR를 사용한 레서스 γ-글로빈 재활성화를 나타내는 HDad5/35++ combo 벡터의 벡터 도식.
도 165. HDAd-sgAAVS1-rm(no Cas9) 벡터 및 HDAd-Comb2를 나타내는 벡터 도식. 이 벡터의 특성은 1.8k 상동성 아암(HA), PBMC에서 형질도입을 추적하기 위한 GFP, HA 외부의 CRISPR 카세트, 및 HBG 프로모터 표적화이다.
도 166. LCR β-글로빈 프로모터 구동된 외인성 γ-글로빈 및 γ-글로빈 프로모터의 억제인자 결합 영역의 CRISPR/Cas9-매개 파괴를 통한 내인성 γ-글로빈의 재활성화를 사용하여 γ-글로빈을 발현하는 HDAd-rh-combo의 벡터 도식.
본 개시내용은 무엇보다도, 조혈 줄기 세포의 생체내 유전자 편집을 위해 CD46을 표적화하는 Ad5/35 및 Ad35 벡터와 같은 재조합 아데노바이러스 벡터를 기재한다. Ad35 벡터는 CD46 결합을 증가시키는 놉 단백질 돌연변이, 유전자의 발현을 조절하는 miRNA 제어 시스템, 내인성 유전자 발현을 활성화시키는 CRISPR 구성요소, 양성 선택 마커, 미니- 또는 긴-형태의 β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR) 조절 서열, 트랜스포사제/재조합효소 시스템, 및/또는 조건화-없는 생체내 유전자 요법을 촉진하는 다수의 다른 유리한 진보를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 개시된 다양한 다른 서열을 포함할 수 있다.
유전자 요법에 대한 많은 도구의 개발에도 불구하고, 벡터 및/또는 치료적으로 유용한 페이로드의 설계는 당 분야에서 중요한 과제로 남아있다. 유전자 요법 페이로드는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터에 의해 전달될 수 있다. 예시적인 비-바이러스 벡터는 양이온성 지질, 지질 나노 에멀젼, 고체 지질 나노입자, 펩티드, 및 중합체-기반 전달 시스템을 포함한다. 바이러스 벡터는 AAV, 단순 포진, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 랍도바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 폭스바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스 벡터, 및 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있으며, 각각은 다양한 별개의 특성을 갖는다. 아데노바이러스 중에는, 또한 50 개 초과의 혈청형이 있다. 또한 단백질, 조절 핵산, CRISPR/Cas9 시스템, 염기 편집 시스템, 트랜스포존 시스템, 및 상동 재조합 시스템을 암호화하는 페이로드를 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산 서열의 발현 및/또는 변형을 위한 치료적 페이로드가 존재한다. 본원에 제공된 유전자 요법을 위한 방법 및 조성물은 제한 없이 아데노바이러스 벡터 및/또는 다양한 치료적 페이로드의 활용에서 다양한 과제를 해결한다.
본 명세서의 개시내용은 특정 맥락(예를 들어, 아데노바이러스 벡터 또는 게놈 맥락, 예를 들어, Ad5, Ad5/35, 또는 Ad35 맥락)에 있을 수 있지만, 각 구성요소는 임의의 이러한 맥락과 상관없이 추가로 개시되고 이와 같이 이러한 맥락과 상관없이 청구될 수 있다. 예시적인 개시내용은 본 개시내용의 서열 및 페이로드 작제물을 포함하며, 당업자는 임의의 특정 벡터, 혈청형, 또는 다른 맥락에 제한되지 않는 일반적인 연관성을 가질 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시내용의 측면은 이제 다음과 같이 추가로 상세하게 기재된다: (I) 유전자 요법 벡터; (II) 표적 세포 집단; (III) 투여량, 제형, 및 투여; (IV) 적용; (V) 예시적인 구현예; (VI) 실험적 실시예; 및 (VII) 마무리 단락.
I. 유전자 요법 벡터
아데노바이러스(또는, 상호교환가능하게, "아데노바이러스") 벡터 및 게놈은 (a) 발현 작제물의 패키징을 지원하고 (b) 코딩 서열을 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 그러한 작제물을 지칭한다. 아데노바이러스 게놈은 선형 이중-가닥 DNA 분자일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 아데노바이러스 게놈과 같은 선형 게놈은 예를 들어, 바이러스 생산 목적을 위해 원형 플라스미드에 존재할 수 있다.
천연 아데노바이러스 게놈은 혈청형에 따라 26　kb 내지 45　kb 길이 범위이다.
아데노바이러스 벡터는 프리마제-독립적 DNA 합성을 촉진하고 숙주 게놈 내로의 통합을 용이하게 하는 자기-프라이머로서 작용하는 도립된 말단 반복부(ITR)에 의해 양 말단 상에 플랭킹된 아데노바이러스 DNA를 포함한다. 아데노바이러스 게놈은 또한 적절한 바이러스 전사체 패키징을 용이하게 하고 게놈의 왼쪽 아암 상에 위치하는 패키징 서열을 함유한다. 바이러스 전사체는 초기 전사 단위, E1, E2, E3, 및 E4 및 Ad 비리온의 구조적 구성요소를 암호화하는 후기 전사 단위를 포함하는 여러 단백질을 암호화한다(Lee 등, Genes Dis., 4(2):43-63, 2017).
아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈을 포함한다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 아데노바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스의 유전적으로 조작된 형태를 포함한다. 당업자는 본 출원 전반에 걸쳐 아데노바이러스 벡터의 개시내용이 이의 아데노바이러스 게놈의 개시내용을 포함하고, 아데노바이러스 게놈의 개시내용이 개시된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 아데노바이러스 벡터의 개시내용을 포함함을 이해할 것이다.
아데노바이러스는 큰 20면체 형상의 비-외피보유 바이러스이다. 바이러스 캡시드는 섬유, 펜톤, 및 헥손 기반 단백질을 포함하는 3 가지 유형의 단백질을 포함한다. 헥손은 대부분 바이러스 캡시드로 구성되어, 20 개의 삼각형 면을 형성한다. 펜톤 염기는 캡시드의 12 개 꼭지점에 위치하고 섬유(또한 놉형 섬유로 지칭됨)은 각 펜톤 염기로부터 돌출된다. 펜톤 및 섬유인 이들 단백질은 캡시드가 숙주 세포에 부착하는 것을 용이하게 하기 때문에 수용체 결합 및 내재화에 특히 중요한 것이다(Lee 등, Genes Dis., 4(2):43-63, 2017).
Ad35 섬유는 섬유 단백질 삼량체이며, 각 섬유 단백질은 오량체성 펜톤 염기와 상호작용하는 N-말단 꼬리, 숙주 세포 수용체에 대한 부착 부위로서 기능하는 C-말단 구형의 놉 도메인(섬유 놉), 및 꼬리 및 놉 도메인을 연결하는 중심 샤프트(shaft) 도메인을 포함한다(샤프트). 삼량체성 섬유의 꼬리 도메인은 5-배 축에서 오량체성 펜톤 염기에 부착된다. 다양한 구현예에서, Ad35 섬유 놉은 표준 야생형 Ad35 섬유 단백질의 아미노산 123 내지 320을 포함한다. 다양한 구현예에서, Ad35 섬유 놉은 표준 야생형 Ad35 섬유 단백질의 아미노산 123 내지 320의 상응하는 단편과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성) 서열 동일성을 갖는 적어도 60 개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 198 개의 아미노산)을 포함한다. 다양한 구현예에서, 섬유 놉은 표준 야생형 Ad35 섬유 단백질을 포함하는 참조 섬유 놉, 섬유 단백질, 섬유 또는 벡터와 비교하여, 섬유 단백질, 섬유, 또는 벡터에 CD46과의 증가된 친화도에 대해 조작되고/되거나, CD46과의 증가된 친화도를 부여하도록 조작되며, 임의적으로 여기서 증가는 적어도 1.1-배, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20-배의 증가이다. 중심 샤프트 도메인은 5.5 개의 β-반복부로 구성되며, 각각은 β-턴으로 연결된 2 개의 역평행 β-가닥을 코딩하는 15-20 개의 아미노산을 함유한다. β-반복부는 연결되어 매우 강성이고 안정한 3 개의 서로 엮인 나선형 가닥의 연장된 구조를 형성한다.
아데노바이러스는 중간 크기의 게놈, 조작 용이성, 높은 역가, 넓은 표적-세포 범위 및 높은 감염성으로 인해 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양 단부는 100-200 개의 염기쌍 ITR을 함유하며, 이는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소이다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제 개시에 의해 구분되는 상이한 전사 단위를 함유한다. E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 몇몇 세포 유전자의 전사 조절을 담당하는 단백질을 암호화한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질의 합성을 초래한다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단(shut-off)에 수반된다. 대부분의 바이러스 캡시드 단백질를 포함하는 후기 유전자 산물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 비롯된 단일 1차 전사체의 상당한 처리 후에만 발현된다. MLP는 감염의 후기 단계 동안 특히 효율적이고, 이 프로모터로부터 비롯된 모든 mRNA는 번역에 선호되는 mNRA를 초래하는 5'-삼부 리더(TPL) 서열을 보유한다.
I(A). 유전자 요법 벡터 혈청형
아데노바이러스 중에는, 또한 50 개 초과의 혈청형이 있다. 아데노바이러스 5형은 다량의 생화학적 및 유전적 정보가 알려져 있고, 역사적으로 아데노바이러스를 벡터로서 이용하는 대부분의 구축물에 사용된 인간 아데노바이러스이다. Ad5는 유전자 요법 연구에서 광범위하게 사용되었다.
그러나, 대부분의 인간은 Ad5 캡시드 단백질에 대해 지시된 중화 혈청 항체를 가지며, 이는 HDAd5/35 벡터, 즉, Ad5 캡시드 단백질 및 키메라 Ad35 섬유를 함유하는 벡터와 같은 Ad5 캡시드를 포함하는 아데노바이러스 벡터로 생체내 형질도입을 차단할 수 있다. Ad5 캡시드 단백질에 대해 지시된 중화 혈청 항체의 존재는 Ad5 캡시드를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 치료적 가치를 무시화하지 않는 반면, Ad5 캡시드를 포함하지 않는 아데노바이러스 벡터는 임상적으로 유의한 면역원성 반응의 일반적인 위험이 특히 Ad5 캡시드 단백질에 대해 지시된 중화 혈청 항체가 있는 대상체에서 감소될 것이라는 점에서 추가적인 이익을 제공할 것이다.
Ad35는 57 개의 알려진 인간 혈청형 중 가장 희귀한 것 중 하나이며, 혈청 유병률이 7% 미만이고 Ad5와의 교차 반응성이 없다. Ad35는 부분적으로 Ad35 섬유 놉의 T-세포 활성화의 약화로 인해 Ad5보다 면역원성이 적다. 또한, 정맥내(iv) 주사 후, 인간 CD46 유전자이식(hCD46tg) 마우스 및 비-인간 영장류에서 간을 포함하는 조직의 최소 형질도입만이 있다(PCR에 의해서만 검출가능). 1세대 Ad35 벡터는 백신접종 목적을 위해 임상적으로 사용되었다.
I(A)(i). Ad35 유전자 요법 벡터
대표적인 천연 Ad35 아데노바이러스의 완전한 게놈은 알려져 있고 공개적으로 이용가능하다(예를 들어, Gao 등, 2003 Gene Ther. 10(23): 1941-9; Reddy 등 2003 Virology 311(2): 384-393; GenBank 수탁 번호 AX049983 참조). Ad5 게놈은 35,935 bp이고 G + C 함량이 55.2%인 반면, Ad35 게놈은 34,794 bp 이고 G + C 함량이 48.9%이다. Ad35의 게놈은 도립된 말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, Ad35 ITRS는 137 bp를 포함하며(예를 들어, GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 1-137 또는 4-140을 포함하는 5' Ad35 및 GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 34658-34794를 포함하는 3' ITR), Ad5(103 bp)보다 더 길다. 다양한 구현예에서, Ad35 5' ITR은 GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 1-200의 상응하는 단편과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 적어도 80 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 80, 90, 100, 110, 120, 또는 130 개 뉴클레오티드의 하한 및 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 개 뉴클레오티드의 상한, 예를 들어, 137 개의 뉴클레오티드를 갖는 다수의 뉴클레오티드)를 포함하고 Ad35 3' ITR은 GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 34595-34794의 상응하는 단편과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 적어도 80 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 80, 90, 100, 110, 120, 또는 130 개 뉴클레오티드의 하한 및 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 개 뉴클레오티드의 상한, 예를 들어, 137 개의 뉴클레오티드를 갖는 다수의 뉴클레오티드)를 포함한다. 다양한 구현예에서, ITR은 Ad35 캡슐화 및/또는 복제 중 하나 또는 둘 다에 충분하다. 다양한 구현예에서, Ad35 벡터에 대한 Ad35 ITR 서열은 첫번째 8 bp가 CATCATCA보다 CTATCTAT라는 점에서 상이하다(Wunderlich, J. Gen Viro. 95: 1574-1584, 2014).
다양한 구현예에서, 아데노바이러스 게놈의 패키징은 ITR에 인접한 바이러스 게놈의 5' 단부에 위치한 시스-작용 패키징 서열 도메인에 의해 매개되고, 패키징은 왼쪽에서 오른쪽으로 극성 방식으로 발생한다. Ad35의 패키징 서열은 5 내지 7 개의 추정 "A" 반복부가 있는 게놈의 왼쪽 단부에 위치한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용은 Ad35 패키징 서열을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 벡터 또는 게놈을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용은 재조합효소 부위에 의해 플랭킹된 패키징 서열을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 벡터 또는 게놈을 포함한다. 다양한 구현예에서, Ad35 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 138-481 또는 Ad35 벡터 또는 게놈의 패키징에 충분하거나 또는 필요한 이의 단편을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다(예를 들어, 재조합효소 부위가 있는 서열의 플랭킹 및 재조합효소 부위의 재조합에 의한 절제는 패키징을 위한 벡터 또는 게놈 결핍을 예를 들어, 패키징 서열을 포함하는 참조와 비교하여 적어도 10%, 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40$, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%로 만들도록 하며, 임의적으로 여기서 참조는 재조합효소 부위에 의해 플랭킹된 패키징 서열을 포함한다). 다양한 구현예에서, Ad35 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 137-481의 상응하는 단편과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 적어도 80 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 또는 300 개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 개 뉴클레오티드의 하한 및 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 또는 300 개 뉴클레오티드의 상한을 갖는 다수의 뉴클레오티드)를 포함한다.
다양한 구현예에서, Ad35 헬퍼 벡터는 패키징 서열에 플랭크하도록 삽입된 재조합효소 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 재조합효소 부위는 뉴클레오티드 130 내지 뉴클레오티드 400 사이에서 선택된 위치(예를 들어, 뉴클레오티드 138 내지 180, 138 내지 200, 138 내지 220, 138 내지 240, 138 내지 260, 138 내지 280, 138 내지 300, 138 내지 320, 138 내지 340, 138 내지 360, 138 내지 366, 138 내지 380, 또는 138 내지 400 사이)에 바로 인접하여(예를 들어, 앞에 또는 뒤에) 삽입되고 제2 재조합효소 부위는 뉴클레오티드 300 내지 뉴클레오티드 550 사이에서 선택된 위치(예를 들어, 뉴클레오티드 344 내지 360, 344 내지 380, 344 내지 400, 344 내지 420, 344 내지 440, 344 내지 460, 344 내지 480, 344 내지 481, 344 내지 500, 344 내지 520, 344 내지 540, 또는 344 내지 550 사이)에 바로 인접하여(예를 들어, 앞에 또는 뒤에) 삽입된다. 당업자는 용어 패키징 서열이 반드시 주어진 벡터 또는 게놈에 존재하는 패키징 요소를 모두 포함하지 않음을 이해할 것이다. 예를 들어, 헬퍼 게놈은 패키징 서열에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부를 포함할 수 있으며, 여기서 플랭킹된 패키징 서열은 헬퍼 게놈에 존재하는 패키징 요소를 모두 포함하지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 헬퍼 게놈의 1 또는 2 개의 재조합효소 지시 반복부는 더 큰 패키징 서열 내에 위치하여, 예를 들어 더 큰 패키징 서열이 1 또는 2 개의 재조합효소 지시 반복부의 도입에 의해 인접하지 않게 되도록 한다. 다양한 구현예에서, 헬퍼 게놈의 재조합효소 지시 반복부는 재조합효소 지시 반복부의 재조합에 의한 플랭킹된 패키징 서열의 절제가 헬퍼 게놈의 패키징 및/또는 헬퍼 게놈이 패키징되는 능력을 감소시키거나 또는 제거하도록(보다 일반적으로 방해하도록) 패키징 서열의 단편에 플랭킹한다. 예로서, 재조합효소 지시 반복부(DR)는 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않기 위해 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내에 위치한다. 다양한 구현예에서, DR은 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않기 위해, Ad35 게놈의 5' 단부로부터 550 개 뉴클레오티드보다 더 가깝게, 예를 들면 540, 530, 520, 510, 500, 495,490, 480, 470, 450, 440, 400, 380, 360 개 뉴클레오티드 이내에, 또는 Ad35 게놈의 5' 단부의 360 개 뉴클레오티드 이내보다 더 가깝게 위치한다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 Ad35 5' ITR, Ad35 패키징 서열, 및 Ad35 3' ITR을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 벡터 또는 게놈을 포함한다, 특정 구현예에서, Ad35 5' ITR, Ad35 패키징 서열, 및 Ad35 3' ITR은 표준 Ad35 게놈으로부터 유래되고/되거나, 이에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 재조합 Ad35 공여자 벡터 또는 게놈의 유일한 단편(예를 들어, 50 개 초과 또는 100 개 초과의 염기쌍에 대한 유일한 단편)이다.
Ad35 초기 영역은 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, 및 E4를 포함한다. Ad35 중간 영역은 pIX 및 IVa2를 포함한다. Ad35의 후기 전사 단위는 16.9 맵 단위에 위치한 주요 후기 프로모터(MLP)로부터 전사된다. Ad35에서 후기 mRNA는 이러한 mRNA에 의해 사용되는 poly(A) 신호에 따라 5 개의 mRNA 패밀리(L1-L5)로 나눌 수 있다. MLP 공통 개시인자 요소, 및 스플라스 공여자 및 스플라이스 수용체 부위 서열을 기반으로, 삼부 리더(TPL)의 길이는 204 개 뉴클레오티드인 것으로 예측되었다. MLP에 인접한 TPL의 첫번째 리더는 45 개의 뉴클레오티드 길이이다. DNA 폴리머라제의 코딩 영역 내에 위치한 두번째 리더는 72 개의 뉴클레오티드 길이이다. 세번째 리더는 E2B 영역의 전구체 말단 단백질(pTP)의 코딩 영역 내에 놓여 있고 87 개의 뉴클레오티드 길이이다. Ad5는 2 개의 바이러스-연관(VA) RNA 유전자를 함유하지만, 하나의 바이러스-연관 RNA 유전자만이 Ad35의 게놈에서 발생한다. 이 VA RNA 유전자는 52/55K L1 단백질을 코딩하는 유전자 및 pTP 사이에 위치한다.
특정 구현예에서, Ad35++ 벡터는 돌연변이체 Ad35 섬유 놉이 있는 키메라 벡터(예를 들어, 돌연변이체 Ad35 섬유 놉이 있는 재조합 Ad35 벡터 또는 돌연변이체 Ad35 섬유 놉이 있는 Ad5/35 벡터)이다. 특정 구현예에서, Ad35++ 게놈은 돌연변이체 Ad35 섬유 놉을 암호화하는 게놈(예를 들어, 돌연변이체 Ad35 섬유 놉을 암호화하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈 또는 돌연변이체 Ad35 섬유 놉을 암호화하는 Ad5/35 헬퍼 게놈)이다. 다양한 구현예에서, Ad35++ 돌연변이체 섬유 놉은 CD46에 대한 친화도가, 예를 들어, 25-배 증가하도록 돌연변이된 Ad35 섬유 놉이며, 예를 들어, Ad35++ 돌연변이체 섬유 놉은 예를 들어, 더 낮은 감염 다중도(MOI)에서 세포 형질도입 효율을 증가시키도록 한다(Li and Lieber, FEBS Letters, 593(24): 3623-3648, 2019).
다양한 구현예에서, Ad35++ 돌연변이체 섬유 놉은 Ile192Val, Asp207Gly(또는 특정 Ad35 서열에서 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 다양한 구현예에서, Ad35++ 돌연변이체 섬유 놉은 다음 돌연변이 각각을 포함한다: Ile192Val, Asp207Gly(또는 특정 Ad35 서열에서 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His. 다양한 구현예에서, Ad35 섬유의 아미노산 넘버링은 GenBank 수탁 AP_000601 또는 이에 상응하는 아미노산 서열에 따르며, 예를 들어, 여기서 위치 207은 Glu 또는 Asp이다. 다양한 구현예에서, Ad35 섬유는 GenBank 수탁 AP_000601에 따른 아미노산 서열을 갖는다. Ad35++ 섬유 놉 돌연변이에 대한 추가의 상세한 내용은 Wang 2008 J. Virol. 82(21): 10567-10579에 기재되어 있으며, 섬유 놉과 관련하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
I(A)(ii). Ad5/35 유전자 요법 벡터
본 개시내용의 Ad5/35 벡터는 Ad5 캡시드 폴리뉴클레오티드 및 Ad35 섬유 놉을 포함하는 키메라 섬유 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 포함하며, 키메라 섬유 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 또한 Ad35 섬유 샤프트(예를 들어, Ad35 섬유 아미노산 44-323과 조합된 Ad5 섬유 아미노산 1-44)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 섬유는 Ad35++ 돌연변이체 섬유 놉을 포함한다. 본 개시내용의 다양한 Ad5/35 벡터에서, 섬유 놉 도메인 및 샤프트를 제외한 모든 단백질은 혈청형 5로부터 유래된 반면, 섬유 놉 도메인 및 샤프트는 혈청형 35로부터 유래되었고, CD46에 대한 친화도가 증가된 돌연변이는 Ad35 섬유 놉 내로 도입되었다(WO 2010/120541 A2 참조). 추가적으로, 다양한 구현예에서, Ad5/35 벡터의 ITR 및 패키징 서열은 Ad5로부터 유래된다. (예시적인 놉 돌연변이에 대해 표 1; 및 HDAd35 벡터 생산의 일반적인 도식에 대해 도 95 참조.)
표 1: CD46에 대한 결합이 증가된 돌연변이된 Ad35 놉
Figure pct00003
I(B). 헬퍼-의존적 Ad35 및 Ad5/35 벡터
일반적으로, 천연 아데노바이러스 벡터에서 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터로의 경로는 3 가지 세대를 포함한다. 1세대 아데노바이러스 벡터는 유전자 E1 및 E3을 제거하도록 조작된다. 이들 유전자 없이, 아데노바이러스 벡터는 자체적으로 복제할 수 없지만 HEK293 세포와 같은 E1-발현 포유류 세포주에서 생성될 수 있다. 1세대 변형만으로, 아데노바이러스 벡터 클로닝 용량은 제한되고, 벡터에 대한 숙주 면역 반응은 효과적인 페이로드 발현에 문제가 될 수 있다. 2세대 아데노바이러스 벡터는 E1/E3 제거 이외에도, 비-구조적 유전자 E2 및 E4를 제거하도록 조작되어, 용량 증가 및 면역원성 감소를 초래한다. 3세대 아데노바이러스 벡터(또한 무기력한, 고용량 아데노바이러스 벡터, 또는 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터(HdAd)로도 지칭됨)는 모든 바이러스 코딩 서열을 제거하고, 게놈의 ITR 및 게놈 또는 이의 기능적 단편의 패키징 서열만을 유지하도록 추가로 조작된다. 이들 게놈은 바이러스 생산에 필요한 단백질을 암호화하지 않기 때문에, 헬퍼-의존적이다: 헬퍼-의존적 게놈은 바이러스 단백질을 트랜스로 제공하는 핵산 서열을 포함하는 세포에 존재하는 경우에만 벡터 내로 패키징될 수 있다. 이들 헬퍼-의존적 벡터는 또한 여전히 더 큰 용량 및 추가로 감소된 면역원성을 특징으로 한다. 각 바이러스 게놈의 서열은 적어도 각 혈청형에 대해 구별되기 때문에, 주어진 혈청형에 대한 헬퍼-의존적 바이러스 게놈, 및/또는 헬퍼 게놈을 생성하는 데 필요한 적절한 변형은 다른 혈청형과 관련한 이용가능한 정보로부터 예측될 수 없다.
모든 바이러스 코딩 서열이 결여되도록 조작된 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터(HDAd)는 광범위한 세포 유형을 효율적으로 형질도입할 수 있고, 무시할 수 있는 만성 독성으로 장기간 이식유전자 발현을 매개할 수 있다. 바이러스 코딩 서열을 결실시키고 게놈 복제(ITR) 및 캡슐화(Ψ)에 필요한 시스-작용 요소만을 남겨둠으로써, Ad 벡터에 대한 세포 면역 반응은 감소된다. HDAd 벡터는 최대 37　kb의 큰 클로닝 용량을 가져, 큰 페이로드의 전달을 허용한다. 이들 페이로드는 이식유전자 발현을 향상시키고, 연장하고, 조절하도록 큰 치료 유전자 또는 심지어 다중 이식유전자 및 큰 조절 구성요소를 포함할 수 있다. 다른 아데노바이러스 벡터와 마찬가지로, 전형적인 HDAd 게놈은 일반적으로 에피솜으로 남아있고 숙주 게놈과 통합하지 않는다(Rosewell 등, J Genet Syndr Gene Ther. Suppl 5:001, 2011, doi: 10.4172/2157-7412.s5-001).
일부 HDAd 벡터 시스템에서, 하나의 바이러스 게놈(헬퍼 게놈)은 복제에 필요한 단백질을 모두 암호화하지만 패키징 서열에 조건부 결함이 있어서, 비리온 내로 패키징될 가능성이 적다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편의 식별 및 다른 아데노바이러스 혈청형과 관련하여 기존 지식에서 확인될 수 없는 헬퍼 벡터의 증식을 무효화하지 않는 방식으로 대상체 게놈의 변형을 필요로 할 수 있다, 개별 공여자 바이러스 게놈은 바이러스 ITR, 페이로드(예를 들어, 치료적 페이로드), 및 기능적 패키징 서열(예를 들어, 정상 야생형 패키징 서열, 또는 이의 기능적 단편)을 포함하여(예를 들어, 유일하게 포함하여), 이 공여자 바이러스 게놈이 HDAd 바이러스 벡터 내로 선택적으로 패키징되고 생산자 세포로부터 단리되게 한다. HDAd 공여자 벡터는 물리적 수단에 의해 헬퍼 벡터로부터 추가로 정제될 수 있다. 일반적으로, HDAd 바이러스 벡터 및 HDAd 바이러스 벡터 제형에서 헬퍼 벡터 및/또는 헬퍼 게놈의 일부 오염이 발생할 수 있고 허용될 수 있다.
일부 HDAd 벡터 시스템에서, 헬퍼 게놈은 Cre/loxP 시스템을 활용한다. 이러한 특정 HDAd 벡터 시스템에서, HDAd 공여자 게놈은 게놈 복제에 필요한 아데노바이러스 ITR, 및 게놈을 캡시드 내로 캡슐화하는 데 필요한 패키징 서열 또는 이의 기능적 단편인 Ψ를 포함하는 비코딩 아데노바이러스 DNA의 500 bp를 포함한다. 또한 HDAd 공여자 벡터 게놈은 총 길이가 27.7 kb 내지 37 kb일 때 가장 효율적으로 패키징될 수 있음이 관찰되었으며, 예를 들어, 치료적 페이로드 및/또는 "스터퍼" 서열로 구성될 수 있다. HDAd 공여자 게놈은 Cre 재조합효소를 발현하는 293 세포(HEK293)와 같은 세포로 전달될 수 있으며, 임의적으로 여기서 HDAd 공여자 게놈은 비-바이러스 벡터 형태, 예컨대 박테리아 플라스미드 형태로 세포에 전달된다(예를 들어, 여기서 HDAd 공여자 게놈은 박테리아 플라스미드(pHDAd)로 구축되고 제한 효소 소화로 유리된다). 동일한 세포는 헬퍼 게놈으로 형질도입될 수 있으며, 이는 Cre 재조합효소를 발현하는 293 세포의 감염 후, 패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편이 loxP 부위 사이의 Cre-매개 부위-특이적 재조합에 의해 헬퍼 게놈으로부터 절제되도록 loxP 부위에 의해 플랭킹된 패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편을 보유하는 E1-결실된 Ad 벡터를 포함한다. 따라서, HDAd 공여자 게놈은 Cre를 발현하는 293 세포(HEK293) 내로 형질감염될 수 있고 패키징 서열(Ψ) 또는 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)에 의해 플랭킹된 이의 기능적 단편을 보유하는 헬퍼 게놈으로 형질도입되어 Ψ의 상응하는 재조합효소에 의해 매개된 절제(예를 들어, Cre-매개 절제)가 헬퍼 바이러스 게놈을 패키징할 수 없게 만들지만, 여전히 HDAd의 증식을 위해 필요한 트랜스-작용 인자를 모두 제공할 수 있도록 한다. 패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편의 절제 후, 헬퍼 게놈은 패키징할 수 없지만 여전히 DNA 복제를 겪을 수 있고 따라서 HDAd 공여자 게놈의 복제 및 캡슐화를 트랜스-보완할 수 있다. 일부 구현예에서, 293 세포(HEK293)에 존재하는 헬퍼 및 HDAd 공여자 게놈 사이의 상동 재조합의 결과로서 복제 적격 Ad(RCA; E1+)의 생성을 방지하기 위해 "스터퍼" 서열은 E3 영역 내로 삽입되어 임의의 E1+　재조합체를 패키징하기에 너무 크게 만들 수 있다. 유사한 HDAd 생산 시스템은 FLP(예를 들어, FLPe)/frt 부위-특이적 재조합을 사용하여 개발되었으며, 여기서 헬퍼 게놈의 패키징 서열에 플랭킹 하는 frt 부위 사이의 FLP-매개 재조합은 FLP를 발현하는 293 세포(HEK293)에서 헬퍼 게놈의 캡슐화에 대해 선택한다. 헬퍼 벡터에 대해 선택하기 위한 대안적인 전략이 개발되었다. Ad35 헬퍼 바이러스는 전형적으로 E1 발현 산물이 생산자 세포주의 게놈으로부터 상보적 발현에 의해 공급될 수 있을 때, E1에서와 같은 것들을 제외한 모든 바이러스 유전자를 포함한다.
HDAd5/35 공여자 벡터, 공여자 게놈, 헬퍼 벡터 및 헬퍼 게놈은 본원에 제공되고 본 개시내용의 다양한 방법에 사용되는 조성물의 예시이다. HDAd5/35 벡터 또는 게놈은 Ad35 섬유 놉 및 Ad5 샤프트가 있는 헬퍼-의존적 키메라 Ad5/35 벡터 또는 게놈이다. HDAd5/35++ 벡터 또는 게놈은 돌연변이체 Ad35 섬유 놉이 있는 헬퍼-의존적 키메라 Ad5/35 벡터 또는 게놈이다. 벡터는 CD46에 대한 친화도가 예를 들어, 25-배 증가하도록 돌연변이되고 더 낮은 감염 다중도(MOI)에서 세포 형질도입 효율을 증가시킨다(Li & Lieber, FEBS Letters, 593(24): 3623-3648, 2019). Ad5/35 헬퍼 벡터는 조건부로 발현된(예를 들어, frt-부위 또는 loxP-부위 플랭킹된) 패키징 서열을 포함하고 공여자 게놈이 패키징될 수 있는 Ad5/35 비리온의 생산을 위해 필요한 트랜스-작용 인자를 모두 암호화하는 헬퍼 게놈을 포함하는 벡터이다.
HDAd35 공여자 벡터, 공여자 게놈, 헬퍼 벡터 및 헬퍼 게놈은 또한 본원에 제공되고 본 개시내용의 다양한 방법에 사용되는 조성물의 예시이다. HDAd35 벡터 또는 게놈은 헬퍼-의존적 Ad35 벡터 또는 게놈이다. HDAd35++ 벡터 또는 게놈은 CD46에 대한 친화도를 향상시키고 세포 형질도입 효율을 증가시키는 돌연변이체 Ad35 섬유 놉이 있는 헬퍼-의존적 Ad35 벡터 또는 게놈이다. Ad35 헬퍼 벡터는 조건부로 발현된(예를 들어, frt-부위 또는 loxP-부위 플랭킹된) 패키징 서열을 포함하고 공여자 게놈이 패키징될 수 있는 Ad35 비리온의 생산을 위해 필요한 트랜스-작용 인자를 모두 암호화하는 헬퍼 게놈을 포함하는 벡터이다. 본 개시내용은 HDAd35 공여자 게놈 및 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 세포를 포함하는 HDAd35 공여자 벡터 생산 시스템을 추가로 포함한다. 이러한 특정 세포에서, 헬퍼 게놈에 의해 암호화되고 발현되는 바이러스 단백질은 HDAd35 공여자 게놈이 패키징되는 HDAd35 공여자 벡터의 생산에 활용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 HDAd35 공여자 게놈 및 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 세포를 배양함으로써 HDAd35 공여자 벡터를 생산하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서 세포는 Ad35 헬퍼 벡터의 패키징 서열에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부에 상응하는 재죠합효소를 암호화하고 발현한다. 일부 구현예에서, Ad35 헬퍼 게놈의 플랭킹된 패키징 서열은 절제되었다.
일부 구현예에서 Ad35 헬퍼 게놈은 모든 Ad35 코딩 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서 Ad35 헬퍼 게놈은 E1 영역의 하나 이상의 코딩 서열 및/또는 E3 코딩 서열 및/또는 E4 코딩 서열을 제외한 모든 Ad35 코딩 서열을 암호화하고/하거나 발현한다. 다양한 구현예에서, Ad35 E1 유전자를 암호화하고/하거나 발현하지 않는 헬퍼 게놈은 Ad35 E4 유전자를 암호화하고/하거나 발현하지 않으며, 임의적으로 여기서 Ad35 헬퍼 게놈은 Ad5 E4orf6 코딩 서열을 포함하도록 추가로 조작된다. 다양한 구현예에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, HDAd 35 공여자 벡터의 생산을 위한 조성물 및 방법의 세포는 Ad5 E1 발현 산물을 발현하는 세포일 수 있다. 다양한 구현예에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, HDAd 35 공여자 벡터의 생산을 위한 조성물 및 방법의 세포는 293 T 세포(HEK293)일 수 있다.
헬퍼는 야생형 또는 증식-적격 Ad5 벡터 또는 Ad35 벡터와 같은 야생형 또는 유사한 증식-적격 벡터로부터 조작될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 헬퍼 벡터의 조작에 사용될 수 있는 한 가지 전략은 E1 유전자 발현의 결실 또는 다른 기능적 파괴이다. 아데노바이러스 게놈의 5' 부분에 위치한 E1 영역은 초기 및 후기 유전자의 야생형 발현에 필요한 단백질을 암호화한다. E1 결실은 E1에 의해 제어된 특정 바이러스 유저자의 발현을 감소시키거나 또는 제거하고, E1-결실된 헬퍼 바이러스는 복제-결핍이다. 따라서, E1-결핍 헬퍼 바이러스는 E1을 발현하는 세포주를 사용하여 증식될 수 있다. 예를 들어, E1-결핍 Ad35 헬퍼 벡터가 Ad5 E4orf6을 암호화도록 조작되는 경우, 헬퍼 벡터는 Ad5 E1을 발현하는 세포주에서 증식될 수 있고, E1-결핍 Ad35 헬퍼 벡터가 Ad5 E4orf6을 암호화하는 경우, 헬퍼 벡터는 Ad5 E1을 발현하는 세포주에서 증식될 수 있다. HDAd35 벡터 생산을 위한 하나의 예시적인 세포 유형에서, HEK293 세포는 Ad5 E4 단백질 ORF6과 복합체를 형성하는 것으로 알려진 Ad5 E1b55k를 발현한다. 표 2는 Ad35 게놈에 의해 암호화된 발현 산물의 예시적인 요약을 제공한다(Gao, Gene Ther. 10:1941-1949, 2003 참조).
표 2. Ad35 게놈의 예측된 번역 특징.
Figure pct00004
Figure pct00005
본 개시내용은 무엇보다도, 예를 들어, 2 개의 Ad35 ITR이 페이로드에 플랭킹되는 Ad35 ITR(예를 들어, 5' Ad35 ITR 및 3' ITR)을 포함하는 HDAd35 공여자 벡터 및 게놈을 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, Ad35 패키징 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 HDAd35 공여자 벡터 및 게놈을 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, E1 또는 이의 단편이 결실된(예를 들어, E1 결실이 GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 481-3112 또는 본원에 제공된 또 다른 Ad35 벡터 서열의 상응하는 위치의 결실을 포함하는 경우) HDAd35 공여자 벡터 및 게놈을 포함한다. 본 개시내용은 무엇보다도, E3 또는 이의 단편이 결실된(예를 들어, E3 결실이 GenBank 수탁 번호 AX049983의 뉴클레오티드 27609 내지 30402 또는 27435-30542 또는 본원에 제공된 또 다른 Ad35 벡터 서열의 상응하는 위치의 결실을 포함하는 경우) HDAd35 벡터 및 게놈을 포함한다.
본 개시내용은 무엇보다도, 패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편에 플랭킹하는 2 개의 재조합 부위 요소를 포함하는 Ad35 헬퍼 벡터 및 게놈을 포함하며, 각각의 재조합 부위 요소는 재조합 부위를 포함하며, 여기서 2 개의 재조합 부위는 동일한 재조합효소에 대한 부위이다. 상기 언급된 바와 같이, Ad35 헬퍼 벡터의 구축은 다른 벡터와 관련하여 기존 지식으로부터 예측가능하게 조작될 수 없다. 이에 반해, Ad35의 관련 서열은 예를 들어, Ad5의 상응하는 서열과 매우 상이하다(예를 들어, Ad35 및 Ad5의 5' 600 내지 620 개의 뉴클레오티드 비교). 더욱이, 패키징 서열은 혈청형-특이적이다. Ad35 패키징 서열은 적어도 Ad5 패키징 단일 서열 AI, AII, AIII, AIV, 및 AV에 상응하는 서열을 포함한다. 따라서, Ad35 헬퍼 벡터의 생산은 다음을 포함하여 여러 예측할 수 없는 결정을 필요로 한다: (1) 서열 유사성이 제한적인 경우 간단하지 않은, 재조합효소 부위 요소를 대상체 게놈 내로 삽입함으로써 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)에 의해 플랭킹되는 Ad35 패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편의 식별; (2) 예측될 수 없는, (패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편이 절제되지 않은 조건 하에) 헬퍼 벡터의 증식을 무효화하지 않는 재조합효소 부위 요소 삽입의 식별; 및/또는 (3) (예를 들어, 116 세포주와 같은 cre 재조합효소-발현 세포주에서) HDAd35 공여자 벡터의 생산 동안 헬퍼 바이러스 패키징을 감소시키면서 패키징 서열 또는 기능적으로 기여하는(예를 들어, 기능적으로 필요한) 이의 단편의 효율적인 결실을 허용하는 재조합 부위 요소 사이의 간격 식별.
본 개시내용은 (1) 적어도 플랭킹된 서열의 절제를 야기하는 loxP 부위의 재조합이 벡터의 증식을 예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%로 감소(예를 들어, 벡터의 증식을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%의 하한, 및 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상한을 갖는 백분율로 감소)시킨다는 점에서 Ad35 패키징 서열의 기능적으로 기여하거나 또는 기능적으로 필요한 단편에 플랭킹하는 loxP 부위를 포함하는 복수의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터 및 게놈을 포함하며, 임의적으로 여기서 퍼센트 증식은 비슷한 조건 하에 완전한 벡터(재조합효소 부위-플랭킹된 서열이 절제되지 않음) 또는 야생형 Ad35 벡터와 비교하여 절제된 벡터(절제된 재조합효소 부위-플랭킹된 서열)의 증식에 의해 생산된 바이러스 입자의 수로 측정된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 178 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 437 뒤에 삽입된다. loxP-플랭킹된 서열의 절제는 패키징 서열 서열 AI 내지 AIV를 제거한다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 345-3113의 결실은 E1 유전자 뿐만 아니라 패키징 단일 서열 AVI 및 AVII을 제거한다. 따라서, 플랭킹된 패키징 서열 또는 이의 단편은 위치 179-344에 상응한다. 이 설명에 따른 벡터는 증식되는 것으로 나타났다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 178 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 481 뒤에 삽입되며, 여기서 뉴클레오티드 179-365는 결실된다(패키징 서열 서열 AI 내지 AV를 제거하여, 나머지 서열 AVI 및 AVII이 재조합효소 부위 요소에 의해 플랭킹된 핵산 서열에 있도록 한다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 482-3113의 결실은 E1 유전자를 제거한다. 따라서, 플랭킹된 패키징 서열 또는 이의 단편은 위치 366-481에 상응한다. 이 설명에 따른 벡터는 증식되는 것으로 나타났다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 154 다음에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 481 다음에 삽입된다, 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 482-3113의 결실은 E1 유전자를 제거한다. 따라서, 플랭킹된 패키징 서열 또는 이의 단편은 위치 155-481에 상응한다. 이 설명에 따른 벡터는 증식되는 것으로 나타났다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 158 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 480 뒤에 삽입된다. 이 설명에 따른 벡터는 증식되는 것으로 나타났다. 이러한 특정 구현예에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오티드 27388-30402는 결실된다. 특정 구현예에서, 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 158 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 446 뒤에 삽입된다. 이 설명에 따른 벡터는 증식되는 것으로 나타났다. 이러한 특정 구현예에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오티드 27388-30402는 결실된다. 특정 구현예에서, 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 179 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 480 뒤에 삽입된다. 이 설명에 따른 벡터는 증식되는 것으로 나타났다. 이러한 특정 구현예에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오티드 27388-30402는 결실된다. 특정 구현예에서, 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 206 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 480 뒤에 삽입된다. 이 설명에 따른 벡터는 증식되는 것으로 나타났다. 이러한 특정 구현예에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오티드 27,388-30,402는 결실된다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27,607-30,409 또는 27,609-30,402는 결실된다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27,240-27,608은 결실되지 않는다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 139 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 158 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 179 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 201 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 158 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 481 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 179 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 384 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 179 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 481 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 206 뒤에 삽입되고 재조합효소 부위 요소(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오티드 481 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 27609-30402는 결실된다.
추가적인 임의적 조작 고려사항은 원심분리, 예를 들어, CsCl 초원심분리에 의해 HDAd35 공여자 벡터로부터 헬퍼 벡터의 분리를 허용하는 크기를 갖는 헬퍼 게놈의 조작일 수 있다. 이 결과를 달성하기 위한 한 가지 방식은 헬퍼 게놈의 크기를 34,794 bp의 야생형 길이를 갖는 전형적인 Ad35 게놈과 비교하여 증가시키는 것이다. 특히, 아데노바이러스 게놈은 야생형 길이의 적어도 104%까지 조작함으로써 증가될 수 있다. 본 개시내용의 특정 헬퍼 벡터는 Ad35 E1 영역 및 E4 영역을 포함하고, E3 영역이 결실되고, 페이로드 및/또는 스터퍼 서열을 수용할 수 있다.
Ad35 헬퍼 벡터는 Ad35 공여자 벡터의 생산에 사용될 수 있다. HDAd35++ 벡터의 생산은 HDAd 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드 및 구조적 및 비-구조적　바이러스 단백질을 제공하는 패키징-결함 헬퍼 바이러스의 공동-형질감염을 포함할 수 있다. 헬퍼 바이러스 게놈은 Ad35 공여자 벡터의 증식을 구제할 수 있고 Ad35 공여자 벡터는 예를 들어, 대규모로 생산되고 단리될 수 있다. 다양한 프로토콜이 당업계, 예를 들어, Palmer 등, 2009 Gene Therapy Protocols. Methods in Molecular Biology, Volume 433. Humana Press; Totowa, NJ: 2009. pp. 33-53에 알려져 있다.
본 개시내용은 GFP를 암호화하는 페이로드 코딩 서열을 발현하는 접촉된 세포의 퍼센트로 측정된 바와 같이, 본 개시내용의 HDAd35 공여자 벡터가 인간 CD34+ 세포의 형질도입에서 HDAd5/35 공여자 벡터과 비슷하게 수행함을 입증하는 예시적인 데이터를 포함한다. 결과는 접촉된 세포 당 500 내지 2000 개의 벡터 입자 범위의 다중 MOI에서 확인되었다. 예시적인 실험은 예시적인 데이터를 생성하는 데 사용된 HDAd35 공여자 벡터를 사용하여 수행하였으며 loxP 부위가 플랭킹된 뉴클레오티드 366-481에 플랭킹된 상기 개시된 바와 같은 Ad35 헬퍼 벡터를 사용하여 생성하였다(예를 들어, 도 117 참조).
다양한 예시적인 공여자 벡터가 본원에 제공된다. 본 개시내용은 비제한적인 예로서 표 3-6에 제시된 바와 같은 HDAd35 공여자 게놈을 제공한다.
표 3: 서열번호: 304에 따른 예시적인 HDAd35 공여자 벡터.
Figure pct00006
표 4: 서열번호: 305에 따른 예시적인 HDAd35 공여자 벡터
Figure pct00007
표 5: 서열번호: 288에 따른 예시적인 HDAd35 공여자 벡터.
Figure pct00008
표 6: 서열번호: 289에 따른 예시적인 지지 벡터.
Figure pct00009
표 7: 서열번호: 286에 따른 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터
Figure pct00010
표 8: 서열번호: 51에 따른 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터.
Figure pct00011
표 9: 서열번호: 52에 따른 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터.
Figure pct00012
I(C). 유전자 요법 벡터 페이로드
본 개시내용의 Ad35 및 Ad5/35 공여자 벡터 및 게놈은 하나 이상의 발현 산물을 암호화하는 하나 이상의 코딩 서열, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열, 하나 이상의 스터퍼 서열 등 중 임의의 것을 포함할 수 있는 다양한 핵산 페이로드를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 페이로드는 숙주 세포 또는 시스템에서 치료 효과와 같은 원하는 결과, 예를 들어, 치료 관심 단백질의 발현 또는 치료 관심의 서열 변형을 생성하기 위한 유전자 편집 시스템, 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 염기 편집 시스템의 발현을 달성하기 위해 조작된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자는 코딩 서열 뿐만 아니라 조절 영역 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결 영역, 유전자좌 제어 영역(LCR), 종결 및 폴리아데닐화 신호 요소, 스플라이싱 신호 요소 등을 포함할 수 있다. 용어는 대안적인 스플라이스 부위를 초래하는 변이체와 함께, mRNA 전사체로부터 스플라이싱된 모든 인트론 및 다른 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 서열은 또한 특이적 유기체 또는 세포 유형에 코돈 선호도를 제공하도록 도입될 수 있는 참조 서열 또는 서열들의 축퇴성 코돈을 포함할 수 있다.
페이로드는 단일 유전자 또는 다중 유전자를 포함할 수 있다. 페이로드는 단일 조절 서열 또는 복수의 조절 서열을 포함할 수 있다. 페이로드는 단일 코딩 서열 또는 복수의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 페이로드는 코딩 서열의 개별 발현 산물이 함께 예를 들어, 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA의 경우에서와 같이, 또는 독립적으로, 예를 들어 직접적으로 또는 간접적으로 결합하지 않는 2 개의 개별 단백질로서 기능하는 복수의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 복수의 코딩 서열은 예를 들어 협력하여 기능할 수 있으며, 여기서 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA는 숙주 세포 또는 시스템에 내인성인 코딩 서열의 발현 증가를 야기하고 페이로드는 내인성 코딩 서열에 의해 암호화된 단백질의 것에 상응하는 적어도 하나의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 추가로 암호화하고 발현한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 표준 야생형 Ad35 게놈에 의해 암호화되지 않은 본원에 제공된 임의의 페이로드-암호화된 발현 산물은 본원에서 이종 발현 산물로 지칭될 수 있다.
I(C)(i). 페이로드 발현 산물
본 개시내용의 아데노바이러스 공여자 벡터 또는 아데노바이러스 공여자 게놈의 페이로드는 다양한 발현 산물 중 임의의 것을 암호화하는 하나 이상의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 발현 산물은 참조 수준과 비교하여 생물학적으로 활성인 단백질의 낮은 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료를 위한 대체 요법 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질을 포함한다. 예시적인 발현 산물은 CRISPR/Cas 및 염기 편집기 시스템을 포함한다. 예시적인 발현 산물은 항체, CAR, 및 TCR를 포함한다. 예시적인 발현 산물은 작은 RNA를 포함한다. 다양한 구현예에서, 예를 들어, 의도된 또는 표적 효과가 CRISPR 시스템 또는 염기 편집기 시스템에 의한 숙주 세포 게놈의 편집을 포함하는 특정 경우에, 공여자 벡터 페이로드의 전부 또는 일부의 숙주 세포 게놈 내로의 통합은 의도된 또는 표적 효과를 생성하도록 공여자 벡터 또는 게놈의 표적 세포에 전달하기 위해 요구되지 않는다. 다양한 구현예에서, 예를 들어, 페이로드-암호화된 발현 산물의 발현이 형질도입된 표적 세포의 자손 세포에서 바람직한 경우, 공여자 벡터 페이로드의 전부 또는 일부의 통합은 의도된 또는 표적 효과를 생성하도록 공여자 벡터 또는 게놈의 표적 세포에 전달하기 위해 요구되거나 또는 바람직하다. 다양한 구현예에서, 페이로드는 예를 들어, 재조합 또는 전위에 의해 숙주 세포 게놈 내로 통합을 위해 조작된 핵산 서열("통합 요소")을 포함할 수 있다.
하나 이상의 치료 단백질을 암호화하는 유전자 서열은 관련 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 이들 서열 중 임의의 것을 암호화하는 유전자 서열은 또한 서열을 암호화하는 유전자 서열을 상이한 서열을 암호화하는 또 다른 유전자 서열로 대체하고 용이한 절제를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 단부에서 하나 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 서열을 암호화하는 유전자 서열은 포유류 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
치료 유전자 및/또는 유전자 산물의 특정 예는 γ-글로빈, 인자 VIII, γC, JAK3, IL7RA, RAG1, RAG2, DCLRE1C, PRKDC, LIG4, NHEJ1, CD3D, CD3E, CD3Z, CD3G, PTPRC, ZAP70, LCK, AK2, ADA, PNP, WHN, CHD7, ORAI1, STIM1, CORO1A, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, RMRP, DKC1, TERT, TINF2, DCLRE1B, 및 SLC46A1; FancA, FancB, FancC, FancD1(BRCA2), FancD2, FancE, FancF, FancG, FancI, FancJ(BRIP1), FancL, FancM, FancN(PALB2), FancO(RAD51C), FancP(SLX4), FancQ(ERCC4), FancR(RAD51), FancS(BRCA1), FancT(UBE2T), FancU(XRCC2), FancV(MAD2L2), 및 FancW(RFWD3)를 포함하는 FANC 패밀리 유전자; 가용성 CD40; CTLA; Fas L; CD4, CD5, CD7, CD52 등에 대한 항체; IL1, IL2, IL6에 대한 항체; 자가반응성 T 세포 상에 특이적으로 존재하는 TCR에 대한 항체; IL4; IL10; IL12; IL13; IL1Ra, sIL1RI, sIL1RII; sTNFRI; sTNFRII; TNF에 대한 항체; P53, PTPN22, 및 DRB1*1501/DQB1*0602; 글로빈 패밀리 유전자; WAS; phox; 디스트로핀; 피루베이트 키나제; CLN3; ABCD1; 아릴술파타제 A; SFTPB; SFTPC; NLX2.1; ABCA3; GATA1; 리보솜 단백질 유전자; TERT; TERC; DKC1; TINF2; CFTR; LRRK2; PARK2; PARK7; PINK1; SNCA; PSEN1; PSEN2; APP; SOD1; TDP43; FUS; 유비퀼린 2; C9ORF72 및 본원에 기재된 다른 치료 유전자를 포함한다.
치료 유전자는 적혈구 및 응혈과 관련된 질환에 대한 치료적으로 효과적인 반응을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 질환은 지중해빈혈과 같은 혈색소병증, 또는 겸상적혈구병/특성이다. 치료 유전자는 예를 들어, 헤모글로빈의 생산을 유도하거나 또는 증가시키거나; β-글로빈, γ-글로빈, 또는 α-글로빈의 생산을 유도하거나 또는 증가시키거나; 또는 신체에서 세포에 대한 산소의 이용가능성을 증가시키는 유전자일 수 있다. 치료 유전자는 예를 들어, HBB 또는 CYB5R3일 수 있다. 예시적인 효과적인 치료는 예를 들어, 혈액 세포 계수를 증가시키거나, 혈액 세포 기능을 개선하거나, 또는 환자에서 세포의 산소화를 증가시킬 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 질환은 혈우병이다. 치료 유전자는 예를 들어, 응고/응혈 인자 VIII 또는 응고/응혈 인자 IX의 생산을 증가시키거나, 응고 인자 VIII 또는 응고 인자 IX의 정상 버전의 생산을 야기하는 유전자, 응고/응혈 인자 VIII 또는 응고/응혈 인자 IX에 대한 항체의 생산을 감소시키는 유전자, 또는 혈전의 적절한 형성을 야기하는 유전자일 수 있다. 예시적인 치료 유전자는 F8 및 F9를 포함한다. 예시적인 효과적인 치료는 예를 들어, 응고/응혈 인자 VIII 및 IX의 생산을 증가시키거나 또는 유도하거나; 응고/응혈 인자 VIII 및 IX의 기능화를 개선하거나, 또는 대상체에서 응혈 시간을 감소시킬 수 있다.
본 개시내용의 다양한 구현예에서, 공여자 벡터는 글로빈 유전자를 암호화하며, 여기서 글로빈 유전자에 의해 암호화된 글로빈 단백질은 γ-글로빈, β-글로빈, 및/또는 α-글로빈으로부터 선택된다. 본 개시내용의 글로빈 유전자는 예를 들어, 글로빈 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터와 같은 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, γ-글로빈, β-글로빈, 및/또는 α-글로빈 각각은 태아 및/또는 성인 헤모글로빈의 구성요소이며 따라서 본원에 개시된 다양한 벡터에 유용하다.
다양한 구현예에서, 글로빈 단백질의 발현을 증가시키는 것은 (i) 특정 서열을 갖는 글로빈 단백질의 세포 또는 시스템에서 양, 농도, 또는 발현(예를 들어, 암호화하는 핵산의 전사 또는 번역)의 증가; (ii) 서로에 대한 단백질의 서열과 관련없이 특정 유형의 글로빈 단백질의 세포 또는 시스템에서(예를 들어, 암호화하는 핵산의 전사 또는 번역) 양, 농도, 또는 발현(예를 들어, 당업자에 의해 또는 본 명세서에 제시된 바와 같은 γ-글로빈(또는 대안적으로 β-글로빈 또는 α-글로빈)으로 식별될 모든 단백질의 총량)의 증가; 및/또는 (iii) 이종 글로빈 단백질, 예를 들어, 유전자 요법 전에 숙주 세포에 의해 암호화되지 않은 글로빈 단백질의 세포 또는 시스템에서 발현 중 하나 이상 중 임의의 것을 지칭할 수 있다.
다음 참고문헌은 기능적 글로빈 유전자의 특정 예시적인 서열을 설명한다. 참고문헌 1-4는 α-형 글로빈 서열에 관한 것이고 참고문헌 4-12는 β-형 글로빈 서열(β 및 γ 글로빈 서열)에 관한 것이며, 이의 서열은 본원에 참조로 포함된다: (1) GenBank 수탁 번호 Z84721 (Mar. 19, 1997); (2) GenBank 수탁 번호 NM_000517 (Oct. 31, 2000); (3) Hardison 등, J. Mol. Biol. (1991) 222(2):233-249; (4) A Syllabus of Human Hemoglobin Variants (1996), by Titus 등, published by The Sickle Cell Anemia Foundation in Augusta, Ga. (available online at globin.cse.psu.edu); (5) GenBank 수탁 번호 J00179 (Aug. 26, 1993); (6) Tagle 등, Genomics (1992) 13(3):741-760; (7) Grovsfeld 등, Cell (1987) 51(6):975-985; (8) Li 등, Blood (1999) 93(7):2208-2216; (9) Gorman 등, J. Biol. Chem. (2000) 275(46):35914-35919; (10) Slightom 등, Cell (1980) 21(3):627-638; (11) Fritsch 등, Cell (1980) 19(4): 959-972; (12) Marotta 등, J. Biol. Chem. (1977) 252(14):5040-5053. 글로빈을 암호화하는 유전자의 추가적인 코딩 및 비-코딩 영역에 대해 예를 들어, Marotta 등, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 19, 165-175, 1976, Lawn 등, Cell 21 (3), 647-651, 1980, 및 Sadelain 등, PNAS.; 92:6728-6732, 1995를 참조한다.
헤모글로빈 서브유닛 β의 예시적인 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 수탁 번호 P68871에 제공된다. β-글로빈에 대한 예시적인 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 수탁 번호 NP_000509에 제공된다.
치료 유전자 및/또는 유전자 산물 이외에도, 이식유전자는 또한 체크포인트 억제제 시약, 하나 이상의 암 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체 분자, 및/또는 하나 이상의 암 항원에 특이적인 T-세포 수용체와 같은 치료 분자를 암호화할 수 있다.
또 다른 예로서, 치료 유전자는 리소좀 축적 장애에 대한 치료적으로 효과적인 반응을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 리소좀 축적 장애는 뮤코다당류축적증(MPS), I형; MPS II 또는 헌터 증후군; MPS III 또는 산필리포 증후군; MPS IV 또는 모르키오 증후군; MPS V; MPS VI 또는 마로토-라미 증후군; MPS VII 또는 슬라이 증후군; α-만노사이드축적증; β-만노사이드축적증; GSDI로도 알려져 있는 글리코겐 축적 질환 I형, 폰 기르케병, 또는 테이 삭스; 폼페병; 고세병; 파브리병이다. 치료 유전자는 예를 들어 효소의 생산을 암호화하거나 또는 유도하거나, 또는 달리 리소좀에서 뮤코다당류의 분해를 야기하는 유전자일 수 있다. 예시적인 치료 유전자는 IDUA 또는 이두로니다제, IDS, GNS, HGSNAT, SGSH, NAGLU, GUSB, GALNS, GLB1, ARSB, 및 HYAL1을 포함한다. 리소좀 축적 질환에 대한 예시적인 효과적인 유전적 요법은 예를 들어, 리소좀에서 다양한 물질의 분해를 담당하는 효소의 생산을 암호화 또는 유도하고; 머리(대두증), 간, 비장, 혀, 또는 성대를 포함하는 다양한 기관에서 부종을 감소, 제거, 방지, 또는 지연시키고; 뇌의 체액을 감소시키고; 심장 판막 이상을 감소시키고; 좁아진 기도를 방지 또는 연장시키고 감염 및 수면 무호흡과 같은 관련 상부 호흡기 병태를 예방하고; 뉴런의 파괴, 및/또는 연관 증상을 감소, 제거, 예방, 또는 지연시킬 수 있다.
또 다른 예로서, 치료 유전자는 과증식성 질환에 대한 치료적으로 효과적인 반응을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 과증식성 질환은 암이다. 치료 유전자는 예를 들어, 종양 억제인자 유전자, 세포자멸사를 유도하는 유전자, 효소를 암호화하는 유전자, 항체를 암호화하는 유전자, 또는 호르몬을 암호화하는 유전자일 수 있다. 예시적인 치료 유전자 및 유전자 산물은 (본원의 다른 곳에 나열된 것들 이외에도) 101F6, 123F2(RASSF1), 53BP2, abl, ABLI, ADP, aFGF, APC, ApoAI, ApoAIV, ApoE, ATM, BAI-1, BDNF, 베타*(BLU), bFGF, BLC1, BLC6, BRCA1, BRCA2, CBFA1, CBL, C-CAM, CNTF, COX-1, CSFIR, CTS-1, 사이토신 데아미나제, DBCCR-1, DCC, Dp, DPC-4, E1A, E2F, EBRB2, erb, ERBA, ERBB, ETS1, ETS2, ETV6, Fab, FCC, FGF, FGR, FHIT, fms, FOX, FUS1, FYN, G-CSF, GDAIF, 유전자 21(NPRL2), 유전자 26(CACNA2D2), GM-CSF, GMF, gsp, HCR, HIC-1, HRAS, hst, IGF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, ING1, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, IRF-1, JUN, KRAS, LUCA-1(HYAL1), LUCA-2(HYAL2), LYN, MADH4, MADR2, MCC, mda7, MDM2, MEN-I, MEN-II, MLL, MMAC1, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, neu, NF-1, NF-2, NGF, NOEY1, NOEY2, NRAS, NT3, NT5, OVCA1, p16, p21, p27, p57, p73, p300, PGS, PIM1, PL6, PML, PTEN, raf, Rap1A, ras, Rb, RB1, RET, rks-3, ScFv, scFV ras, SEM A3, SRC, TALI, TCL3, TFPI, 트롬보스폰딘, 티미딘 키나제, TNF, TP53, trk, T-VEC, VEGF, VHL, WT1, WT-1, YES, 및 zac1을 포함한다. 예시적인 효과적인 유전적 요법은 종양을 억제 또는 제거하거나, 암 세포 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 지연 또는 제거하거나, 종양에 의해 야기된 증상을 완화할 수 있다.
또 다른 예로서, 치료 유전자는 감염성 질환에 대한 치료적으로 효과적인 반응을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다. 치료 유전자는 예를 들어, 면역 세포가 HIV 감염에 대해 내성을 갖도록 하거나, 또는 면역 세포가 면역 재구축을 통해 바이러스를 효과적으로 중화할 수 있게 하는 유전자, 면역 세포에 의해 발현된 단백질을 암호화하는 유전자의 다형성, 환자에서 발현되지 않는 감염과 싸우는 데 유리한 유전자, 감염원, 수용체 또는 공수용체를 암호화하는 유전자; 수용체 또는 공수용체에 대한 리간드를 암호화하는 유전자; 특정 전사 인자의 작용을 차단하는 리보자임, 안티센스 RNA, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 유인 RNA를 암호화하는 유전자; 우성 음성 바이러스 단백질, 세포내 항체, 인트라킨 및 자살 유전자를 암호화하는 유전자를 포함하는 바이러스 복제에 필수적인 바이러스 및 세포 유전자일 수 있다. 예시적인 치료 유전자 및 유전자 산물은 α2β1; αvβ3; αvβ5; αvβ63; BOB/GPR15; Bonzo/STRL-33/TYMSTR; CCR2; CCR3; CCR5; CCR8; CD4; CD46; CD55; CXCR4; 아미노펩티다제-N; HHV-7; ICAM; ICAM-1; PRR2/HveB; HveA; α-디스트로글리칸; LDLR/α2MR/LRP; PVR; PRR1/HveC; 및 라미닌 수용체를 포함한다. 예를 들어, HIV의 치료를 위한 치료 유효량은 HIV에 대한 대상체의 면역력을 증가시키거나, AIDS 또는 HIV와 연관된 증상을 개선시키거나, 또는 HIV에 대한 대상체에서 선천적 또는 적응 면역 반응을 유도할 수 있다. HIV에 대한 면역 반응은 항체 생산을 포함하고 AIDS 예방 및/또는 대상체의 AIDS 또는 HIV 감염 증상 개선을 초래하거나, 또는 HIV 감염성 및/또는 병독성을 감소 또는 제거할 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 벡터 또는 게놈, 예를 들어, Ad35 헬퍼 벡터 또는 Ad35 헬퍼 게놈은 예를 들어, CRISPR/Cas의 정상 활성을 억제하는 파지로부터 유래된 항-CRISPR (Acr) 단백질을 암호화하고/하거나 발현한다.
I(C)(i)(a). 결합 도메인, 항체, CAR, 및 TCR 페이로드 발현 산물
본 개시내용은 다양한 결합 도메인을 포함한다. 항체는 결합 도메인의 일 예이며 세포 마커에 특이적으로 결합하는 전체 항체 또는 항체의 결합 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 및 단일 쇄(sc) 형태 및 이의 단편(예를 들어, scFv)을 포함한다. 항체 또는 항원 결합 단편은 다클론 항체, 단클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 비-인간 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디(mini body), 및 선형 항체의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이의 기능적 단편은 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 낙타과 유래 나노바디(nanobody)의 가변 도메인(VHH) 등과 같은 단일-도메인 항체를 포함한다.
일부 경우에, scFv는 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, Bird 등, Science 242:423-426, 1988; 및 Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988 참조). ScFv 분자는 유연한 폴리펩티드 링커를 사용하여 항체의 VL 및 VH 영역을 함께 연결함으로써 생성될 수 있다. 짧은 폴리펩티드 링커가 이용되는 경우(예를 들어, 5-10 개의 아미노산) 쇄간 접힘이 방지된다. 쇄간 접힘은 또한 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 2 개의 가변 영역을 함께 가져오는 데 필요하다. 링커 방향 및 크기의 예는 예를 들어, Hollinger 등 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, US 2005/0100543, US 2005/0175606, US 2007/0014794, WO2006/020258, 및 WO2007/024715를 참조한다.
scFv는 VL 및 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개, 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, scFv의 VL 및 VH를 연결하는 데 사용되는 링커 서열은 5 내지 35 개의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, VL-VH 링커는 5 내지 35 개, 10 내지 30 개의 아미노산 또는 15 내지 25 개의 아미노산을 포함한다. 링커 길이의 변경은 활성을 유지하거나 또는 향상시켜, 활성 연구에서 우수한 효능을 일으킬 수 있다.
일부 구현예에서, scFv의 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커 서열은 (GlyxSery)n의 1 내지 10 개의 반복부와 같은 글리신 및 세린 반복부의 세트를 포함하며, 여기서 x 및 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이며, 단, x 및 y는 둘 다 0이 아니고 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이고) 여기서 연결된 VH-VL 영역은 기능적 면역글로불린-유사 결합 도메인(예를 들어, scFv, scTCR)을 형성한다. 특정 예는 (Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly2Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly4Ser)1, (Gly3Ser)1, 또는 (Gly2Ser)1을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3이다. 상기 scTCR에 대한 참조를 통해 나타낸 바와 같이, 이러한 링커는 또한 T 세포 수용체 Vα/β 및 Cα/β 쇄(예를 들어, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ)에 연결하는 데 사용될 수 있다.
추가적인 예는 scFv-기반 그라바바디(grababody) 및 가용성 VH 도메인 항체를 포함한다. 이들 항체는 중쇄 가변 영역만을 사용하여 결합 영역을 형성한다. 예를 들어, Jespers 등, Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo 등, Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral 등, Nature Med. 12:580, 2006; 및 Barthelemy 등, J. Biol. Chem. 283:3639, 2008 참조.
일부 경우에, 결합 도메인이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, 항원 결합 도메인이 인간 항체, 인간화 항체, 또는 이의 단편 또는 조작된 형태를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 인간 기원의 항체 또는 인간화 항체는 인간에서 면역원성이 낮거나 또는 전혀 없고 비-인간 항체와 비교하여 더 적은 수의 비-면역원성 에피토프를 갖는다. 항체 및 이의 조작된 단편은 일반적으로 인간 대상체에서 감소된 수준의 항원성을 갖거나 또는 전혀 없도록 선택될 것이다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 인간화 항체 또는 이의 조작된 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-인간 항체는 인간화되며, 여기서 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 또는 이의 단편에서 자연적으로 생성된 항체에 대한 유사성을 증가시키도록 변형된다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되며, 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 본원에 제공된 바와 같이, 인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간 면역글로불린 분자 및 프레임워크 영역으로부터 하나 이상의 CDR을 포함하며 여기서 프레임워크를 포함하는 아미노산 잔기는 인간 생식계열로부터 완전히 또는 대부분 유래된다. 일 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다. 인간화 항체는 CDR-이식(예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 239,400; WO 91/09967; 및 US 5,225,539, US 5,530,101, 및 US 5,585,089 참조), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(예를 들어, EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka 등, 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; 및 Roguska 등, PNAS, 91:969-973, 1994 참조), 쇄 셔플링(shuffling)(예를 들어, US. 5,565,332 참조), 및 예를 들어, US 2005/0042664, US 2005/0048617, US 6,407,213, US 5,766,886, WO 9317105, Tan 등, J. Immunol., 169:1119-25, 2002, Caldas 등, Protein Eng., 13(5):353-60, 2000, Morea 등, Methods, 20(3):267-79, 2000, Baca 등, J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84, 1997, Roguska 등, Protein Eng., 9(10):895-904, 1996, Couto 등, Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s, 1995, Couto 등, Cancer Res., 55(8):1717-22, 1995, Sandhu, Gene, 150(2):409-10, 1994, 및 Pedersen 등, J. Mol. Biol., 235(3):959-73, 1994에 개시된 기술을 포함하여, 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 CDR 공여자 항체로부터 상응하는 잔기로 치환되어 세포 마커 결합을 변경, 예를 들어 개선시킬 것이다. 이들 프레임워크 치환은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 세포 마커 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 식별하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용 모델링 및 특정 위치에서 특이한 프레임워크 잔기를 식별하기 위한 서열 비교에 의해 식별된다. (예를 들어, US 5,585,089; 및 Riechmann 등, Nature, 332:323, 1988 참조).
특정 세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 및 다른 결합 도메인은 단클론 항체를 수득하는 방법, 파지 디스플레이 방법, 인간 또는 인간화 항체를 생성하는 방법, 또는 당업자에게 알려진 바와 같이 항체를 생성하도록 조작된 유전자이식 동물 또는 식물을 사용하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, US 6,291,161 및 US 6,291,158 참조). 부분적 또는 완전 합성 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 이용가능하며 세포 마커에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인은 관심 세포 마커에 특이적으로 결합하는 Fab 단편에 대한 Fab 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 식별될 수 있다(Hoet 등, Nat. Biotechnol. 23:344, 2005 참조). 인간 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 또한 이용가능하다. 추가적으로, 편리한 시스템(예를 들어, 마우스, HuMAb mouse®(GenPharm Int'l. Inc., 캘리포니아주 마운틴뷰 소재), TC mouse®(Kirin Pharma Co. Ltd., 일본 도쿄 소재), KM-mouse®(Medarex, Inc., 뉴저지주 프린스턴 소재), 라마, 닭, 래트, 햄스터, 토끼 등)에서 관심 세포 마커를 면역원으로 사용한 하이브리도마 개발을 위한 전통적인 전략을 사용하여 결합 도메인을 개발할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 특정 암 세포 유형에 의해 우선적으로 발현되는 세포 마커에 특이적으로 결합하고 비특이적 구성요소 또는 관련되지 않은 표적과 교차 반응하지 않는다. 일단 식별되면, 항체의 아미노산 서열 및 항체를 암호화하는 유전자 서열은 단리되고/되거나 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 치료 유전자는 Fab 또는 scFv와 같은 항체 또는 항체의 결합 단편을 암호화할 수 있다. 발현될 수 있는 예시적인 항체(scFv 포함)는 WO2014/164553A1, US2017/0283504, US 7,083,785, US 10,189,906, US 10,174,095, WO2005102387, US2011/0206701A1, WO2014/179759A1, US2018/0037651A1, US2018/0118822A1, WO2008/047242A2, WO1996/016990A1, WO200/5103083A2, 및 WO1999/062526A2에 기재된 제공된 것들을 포함한다. 결합 도메인과 관련하여 상기 기재된 항체, 뿐만 아니라 아테졸리주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 세툭시맙, 섬투주맙, 팔레투주맙, 겜투주맙, OKT3, 오레고보맙, 프로믹시맙, 펨브롤리주맙, 및 트라스투주맙이 또한 사용될 수 있다.
면역 체크포인트 억제제가 또한 사용될 수 있다. 면역 체크포인트 억제제는 면역 억제 체크포인트 단백질의 기능을 억제하는 화합물을 지칭한다. 억제는 기능 감소 및 완전 차단을 포함한다. 바람직한 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 다수의 면역 체크포인트 억제제가 알려져 있으며 이러한 알려진 면역 체크포인트 단백질 억제제의 유사성에서, 대안적인 면역 체크포인트 억제제가 (가까운) 미래에 개발될 수 있다. 면역 체크포인트 억제제는 펩티드, 항체, 핵산 분자 및 소분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 대상체에서 CD8+ T 세포의 증식, 이동, 지속 및/또는 세포독성 활성 및 특히 대상체의 CD8+ T 세포의 종양-침윤을 향상시킨다. 또 다른 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 실시예 4에 개시된 바와 같은 체크포인트 억제제를 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 αPD-L1γ1 항체(대안적으로 αPD-L1γ1로 지칭됨)를 포함한다. αPD-L1γ1은 Engeland 등 Mol Ther 22(11):1949-1959, 2014에 추가로 기재되며, 특히 항-PD-L1 항체, 이를 암호화하는 핵산, 및 이의 용도와 관련하여그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
PD-1 및 PD-L1 항체의 예는 US 7,488,802; US 7,943,743; US 8,008,449; US 8,168,757; US 8,217,149, WO03042402, WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400, 및 WO2011161699에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, PD-1 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 특정한 다른 구현예에서 PD-1 차단제는 항-PD-1 항체 및 유사한 결합 단백질 예컨대 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 의해 PD-1에 결합하고 이의 활성화를 차단하는 완전 인간 IgG4 항체인 니볼루맙(MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538); PD-1에 대한 인간화 단클론 IgG4 항체인 람브롤리주맙(MK-3475 또는 SCH 900475); PD-1에 결합하는 인간화 항체인 CT-011; B7-DC의 융합 단백질인 AMP-224; 항체 Fc 부분; PD-L1(B7-H1) 차단을 위한 BMS-936559(MDX-1105-01)를 포함한다.
다른 면역-체크포인트 억제제는 가용성 Ig 융합 단백질인 IMP321과 같은 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 억제제를 포함한다(Brignone 등, 2007, J. Immunol. 179:4202-4211). 다른 면역-체크포인트 억제제는 B7-H3 및 B7-H4 억제제와 같은 B7 억제제를 포함한다. 특히, 항-B7-H3 항체 MGA271(Loo 등, 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834). 또한 TIM3(T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3) 억제제가 포함된다(Fourcade 등, J. Exp. Med. 207:2175-86, 2010 및 Sakuishi 등, J. Exp. Med. 207:2187-94, 2010). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "TIM-3"은 당업계에서 일반적인 의미를 가지며 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-함유 분자 3을 지칭한다. TIM-3의 천연 리간드는 갈렉틴 9(Ga19)이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "TIM-3 억제제"는 TIM-3의 기능을 억제할 수 있는 화합물, 물질 또는 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 억제제는 TIM-3의 발현 또는 활성을 억제하고/하거나, TIM-3 신호전달 경로를 조절 또는 차단하고/하거나 갈렉틴-9에 대한 TIM-3의 결합을 차단할 수 있다. TIM-3에 대한 특이성을 갖는 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며 전형적으로 WO2011/155607, WO2013/006490 및 WO2010/117057에 기재된 것들이다.
추가적인 특정 면역 체크포인트 억제제는 아테졸리주맙, BMS-936559, 이필리무맙, MEDI0680, MEDI4736, MSB0010718C, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 및 트레멜리무맙을 포함한다. 또한 WO 1998/42752; WO 2000/37504; WO 2001/014424; WO 2004/035607; US 2005/0201994; US 2002/0039581; US 2002/086014; US 5,811,097; US 5,855,887; US 5,977,318; US 6,051,227; US 6,984,720; US 6,682,736; US 6,207,156; US 6,682,736; US 7,109,003; US 7,132,281; EP1212422B1; Hurwitz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071 (1998); Camacho 등, J. Clin. Oncology, 22(145): Abstract No. 2505, 2004(항체 CP-675206); 및 Mokyr 등, Cancer Res, 58:5301-5304, 1998 참조.
본 개시내용은 CD4, CD5, CD7, CD52 등에 결합하는 항체 및 다른 결합 도메인; 항체; IL1, IL2, IL6에 대한 항체; 자가반응성 T 세포 상에 특이적으로 존재하는 TCR에 대한 항체; IL4; IL10; IL12; IL13; IL1Ra; sIL1RI; sIL1RII; TNF에 대한 항체; ABCA3; ABCD1; ADA; AK2; APP; 아르기나제; 아릴술파타제 A; A1AT; CD3D; CD3E; CD3G; CD3Z; CFTR; CHD7; 키메라 항원 수용체(CAR); CIITA; CLN3; 보체 인자, CORO1A; CTLA; C1 억제제; C9ORF72; DCLRE1B; DCLRE1C; 유인 수용체; DKC1; DRB1*1501/DQB1*0602; 디스트로핀; 효소; 인자 VIII, FANC 패밀리 유전자(FancA, FancB, FancC, FancD1(BRCA2), FancD2, FancE, FancF, FancG, FancI, FancJ(BRIP1), FancL, FancM, FancN(PALB2), FancO(RAD51C), FancP(SLX4), FancQ(ERCC4), FancR(RAD51), FancS(BRCA1), FancT(UBE2T), FancU(XRCC2), FancV(MAD2L2), 및 FancW(RFWD3)); Fas L; FUS; GATA1; 글로빈 패밀리 유전자(즉, γ-글로빈); F8; 글루타미나제; HBA1; HBA2; HBB; IL7RA; JAK3; LCK; LIG4; LRRK2; NHEJ1; NLX2.1; 중화 항체; ORAI1; PARK2; PARK7; phox; PINK1; PNP; PRKDC; PSEN1; PSEN2; PTPN22; PTPRC; P53; 피루베이트 키나제; RAG1; RAG2; RFXANK; RFXAP; RFX5; RMRP; 리보솜 단백질 유전자; SFTPB; SFTPC; SOD1; 가용성 CD40; STIM1; sTNFRI; sTNFRII; SLC46A1; SNCA; TDP43; TERT; TERC; TINF2; 유비퀼린 2; WAS; WHN; ZAP70; γC; 및 본원에 기재된 다른 치료 유전자를 추가로 포함한다.
결합 도메인의 대안적인 공급원은 다음을 포함한다: 랜덤 펩티드 라이브러리를 암호화하는 서열 또는 scTCR과 같은 대안적인 비-항체 스캐폴드의 루프 영역에서 다양한 조작된 아미노산을 암호화하는 서열(예를 들어, Lake 등, Int. Immunol. 11:745, 1999; Maynard 등, J. Immunol. Methods 306:51, 2005; US 8,361,794 참조), 피브리노겐 도메인(예를 들어, Weisel 등, Science 230:1388, 1985 참조), 쿠니츠(Kunitz) 도메인(예를 들어, US 6,423,498 참조), 설계된 안키린 반복 단백질(DARPins; Binz 등, J. Mol. Biol. 332:489, 2003 및 Binz 등, Nat. Biotechnol. 22:575, 2004), 피브로넥틴 결합 도메인(아드넥틴 또는 모노바디(monobody); Richards 등, J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker 등, Protein Eng. Des. Selec. 18:435, 2005 and Hackel 등, J. Mol. Biol. 381:1238-1252, 2008), 시스테인-노트(knot) 미니단백질(Vita 등, 1995, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin 등, 2002, Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 및 Huang 등, Structure 13:755, 2005), 테트라트리코펩티드 반복 도메인(Main 등, Structure 11:497, 2003 및 Cortajarena 등, ACS Chem. Biol. 3:161, 2008), 류신-풍부 반복 도메인(Stumpp 등, J. Mol. Biol. 332:471, 2003), 리포칼린 도메인(예를 들어, WO 2006/095164, Beste 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 및 Schonfeld 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009 참조), V-유사 도메인(예를 들어, US 2007/0065431 참조), C-형 렉틴 도메인(Zelensky and Gready, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992 및 Sato 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), 항원 결합 도메인이 있는 mAb2 또는 Fc-영역(Fcab™(F-Star Biotechnology, 영국 캠브리지 소재; 예를 들어, WO 2007/098934 및 WO 2006/072620 참조), 아르마딜로 반복 단백질(예를 들어, Madhurantakam 등, Protein Sci. 21: 1015, 2012; WO 2009/040338 참조), 아필린(Ebersbach 등, J. Mol. Biol. 372: 172, 2007), 아피바디(affibody), 아비버, 노틴(knottin), 피노머(fynomer), 아트리머(atrimer), 세포독성 T-림프구 연관 단백질-4(Weidle 등, Cancer Gen. Proteo. 10:155, 2013), 또는 기타(Nord 등, Protein Eng. 8:601, 1995; Nord 등, Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord 등, Euro. J. Biochem. 268:4269, 2001; Binz 등, Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005; Boersma and Pluckthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 2011).
펩티드 압타머는 단백질 스캐폴드의 양쪽 단부에 부착된 펩티드 루프(세포 마커에 특이적)를 포함한다. 이 이중 구조적 제약은 펩티드 압타머의 결합 친화도를 항체와 비슷한 수준으로 증가시킨다. 가변 루프 길이는 전형적으로 8 내지 20 개의 아미노산이고 스캐폴드는 안정되고, 가용성이고, 작고, 무독성인 임의의 단백질일 수 있다. 펩티드 압타머 선택은 효모 2-하이브리드 시스템(예를 들어, Gal4 효모-2-하이브리드 시스템), 또는 LexA 상호작용 트랩 시스템과 같은 상이한 시스템을 사용하여 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 세포 마커 CD33에 결합한다. 특정 구현예에서, CD33에 결합하는 결합 도메인은 겜투주맙, 아클리주맙, 또는 HuM195 중 하나로부터 유래된다. 특정 구현예에서 CD33 결합 도메인은 서열번호: 91을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호: 92를 포함하는 CDRL2 서열, 및 서열번호: 93을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호: 94를 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 95를 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 96을 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 결합 도메인이다.
특정 구현예에서, CD33 결합 도메인은 서열번호: 97을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호: 98을 포함하는 CDRL2 서열, 및 서열번호: 99를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호: 100을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 101을 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 102를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 scFv이다. CD33에 결합하는 결합 도메인에 관한 더 많은 정보를 위해, 미국 특허 번호 제8759494호를 참조한다.
특정 구현예에서, 인간 CD33에 결합하는 서열은 서열 서열번호: 103을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열 서열번호: 104를 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 CD33에 결합하는 서열은 서열 서열번호: 103을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열 서열번호: 106을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 전장 CD33(CD33FL)에 결합한다. 특정 구현예에서, CD33FL에 결합하는 결합 도메인은 5D12, 8F5, 1H7, 린투주맙, 또는 겜투주맙 중 적어도 하나로부터 유래된다. 특정 구현예에서, CD33FL 결합 도메인은 인간 또는 인간화이며, 서열번호: 107을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호: 108을 포함하는 CDRL2 서열, 서열번호: 109를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄), 서열번호: 110을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 111을 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 112를 포함하는 CDRH3 서열을 포함한다. CD33FL에 결합하는 결합 도메인에 관한 더 많은 정보를 위해, PCT/US17/42264을 참조한다.
특정 구현예에서, 인간 CD33FL에 결합하는 결합 도메인은 서열 서열번호: 113을 포함하는 가변 경쇄 영역), 및 서열 서열번호: 114를 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 세포 마커 CD33델타E2(CD33ΔE2)에 결합한다. 특정 구현예에서, CD33ΔE2에 결합하는 결합 도메인은 12B12, 4H10, 11D5, 13E11, 11D11, 또는 1H7 중 적어도 하나로부터 유래된다. 특정 구현예에서, CD33ΔE2 결합 도메인은 인간 또는 인간화이며 서열번호: 115를 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호: 116을 포함하는 CDRL2 서열, 서열번호: 117을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 서열번호: 118을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 11을 포함하는 CDRH2 서열), 및 서열번호: 120을 포함하는 CDRH3 서열을 포함한다. CD33ΔE2에 결합하는 결합 도메인에 관한 더 많은 정보를 위해, PCT/US17/42264를 참조한다.
특정 구현예에서, 인간 CD33ΔE2에 결합하는 서열은 서열 서열번호: 121을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열 서열번호: 122를 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 세포 마커 Her2에 결합한다. 특정 구현예에서, HER2에 결합하는 결합 도메인은 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin))으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 서열번호: 12를 포함하는 CDRL1 서열), 서열번호: 124를 포함하는 CDRL2 서열, 및 서열번호: 125를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호: 126을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 127을 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 128을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 세포 마커 PD-L1에 결합한다. 특정 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 도메인은 펨브롤리주맙 또는 FAZ053(Novartis) 중 적어도 하나로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 서열번호: 129를 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호: 130을 포함하는 CDRL2 서열, 및 서열번호: 131을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호: 132를 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 133을 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 134를 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다.
PD-L1에 대한 예시적인 결합 도메인은 아벨루맙 또는 아테졸리주맙을 포함하거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 아벨루맙의 가변 중쇄는 서열번호: 135를 포함한다. 특정 구현예에서, 아벨루맙의 가변 중쇄는 서열번호: 136을 포함한다.
특정 구현예에서, 아벨루맙의 CDR 영역은 서열번호: 137을 포함하는 CDRH1; 서열번호: 138을 포함하는 CDRH2; 서열번호: 139를 포함하는 CDRH3; 서열번호: 140을 포함하는 CDRL1; 서열번호: 141을 포함하는 CDRL2; 및 서열번호: 142를 포함하는 CDRL3을 포함한다. 특정 구현예에서, 아테졸리주맙의 가변 중쇄는 서열번호: 143을 포함한다. 특정 구현예에서, 아테졸리주맙의 가변 경쇄는 서열번호: 144를 포함한다.
특정 구현예에서, 아테졸리주맙의 CDR 영역은 서열번호: 145를 포함하는 CDRH; 서열번호: 146을 포함하는 CDRH2; 서열번호: 147을 포함하는 CDRH3; 서열번호: 148을 포함하는 CDRL1; 서열번호: 149를 포함하는 CDRL2; 및 서열번호: 150을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 세포 마커 PSMA에 결합한다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 서열번호: 151을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호: 152를 포함하는 CDRL2 서열, 서열번호: 153을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 서열번호: 154를 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 155를 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 156을 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 세포 마커 MUC16에 결합한다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 인간 또는 인간화이며 서열번호: 157을 포함하는 CDRL1 서열, GAS를 포함하는 CDRL2 서열, 서열번호: 158을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 인간 또는 인간화이며 서열번호: 159를 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 160을 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 161을 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 세포 마커 FOLR에 결합한다. 특정 구현예에서, FOLR에 결합하는 결합 도메인은 팔레투주맙으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 서열번호: 162를 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호: 163을 포함하는 CDRL2 서열, 및 서열번호: 164를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호: 165를 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호: 166을 포함하는 CDRH2 서열, 및 서열번호: 167을 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다.
메소텔린에 대한 예시적인 결합 도메인은 아마툭시맙을 포함하거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 아마툭시맙의 가변 중쇄는 서열번호: 168을 포함한다. 특정 구현예에서, 아마툭시맙의 가변 경쇄는 서열번호: 169를 포함한다.
특정 구현예에서, 아마툭시맙의 CDR 영역은 서열번호: 170을 포함하는 CDRH1 서열; 서열번호: 171을 포함하는 CDRH2 서열; 서열번호: 172를 포함하는 CDRH3 서열; 서열번호: 173을 포함하는 CDRL1 서열;(서열번호: 174를 포함하는 CDRL2 서열; 및 서열번호: 175를 포함하는 CDRL3 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 Vα/β 및 Cα/β 쇄(예를 들어, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ)를 포함하거나 또는 관심 세포 마커에 특이적인 Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ 쌍(예를 들어, 펩티드-MHC 복합체)을 포함하는 sc T 세포 수용체(scTCR)이다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 알려지거나 또는 식별된 TCR Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하며, 여기서 각 CDR은 표적화된 세포 마커에 특이적으로 결합하는 TCR 또는 이의 단편 또는 유도체로부터 0 개의 변화 또는 최대 1, 2, 또는 3 개의 변화를 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 알려지거나 또는 식별된 TCR(예를 들어, 고-친화도 TCR)의 Vα, Vβ, Cα, 및/또는 Cβ로부터 유래되거나 또는 이에 기반한 Vα, Vβ, Cα, 및/또는 Cβ 영역을 포함하고 알려지거나 또는 식별된 TCR의 Vα, Vβ, Cα, 및/또는 Cβ와 비교할 때, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 상기 언급된 변화의 조합을 포함한다. 삽입, 결실 또는 치환은 Vα, Vβ, Cα, 및/또는 Cβ 영역의 아미노- 또는 카르복시-말단 또는 양쪽 단부를 포함하여 이러한 영역의 어디든 있을 수 있으며, 단, 각 CDR은 0 개의 변화 또는 최대 1, 2, 또는 3 개의 변화를 포함하고 변형된 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ 영역을 함유하는 표적 결합 도메인이 제공되면 여전히 야생형과 유사한 친화도 및 작용으로 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 경쇄 가변 영역(VL) 또는 중쇄 가변 영역(VH), 또는 둘 다의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나 또는 이를 포함하며, 여기서 각 CDR은 관심 세포 마커에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 이의 단편 또는 유도체로부터 0 개의 변화 또는 최대 1, 2, 또는 3 개의 변화를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 결합 도메인에서 VL 영역은 알려진 단클론 항체의 VL로부터 유래되거나 또는 이를 기반으로 하고 알려진 단클론 항체의 VL과 비교할 때, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 또는 상기-언급된 변화의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은 VL 영역의 아미노- 또는 카르복시-말단 또는 둘 다의 단부를 포함하여 이 영역의 어디든 있을 수 있으며, 단, 각 CDR은 0 개의 변화 또는 최대 1, 2, 또는 3 개의 변화를 포함하고 변형된 VL 영역을 함유하는 결합 도메인이 제공되면 여전히 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 결합 도메인 VH 영역은 알려진 단클론 항체의 VH로부터 유래되거나 또는 이를 기반으로 할 수 있고 알려진 단클론 항체의 VH와 비교할 때, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 상기-언급된 변화의 조합을 함유할 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환은 VH 영역의 아미노- 또는 카르복시-말단 또는 둘 다의 단부를 포함하여 이 영역의 어디든 있을 수 있으며, 단, 각 CDR은 0 개의 변화 또는 최대 1, 2, 또는 3 개의 변화를 포함하고 변형된 VH 영역을 함유하는 결합 도메인이 제공되면 여전히 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 Kabat 등 (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(Kabat 넘버링 체계); Al-Lazikani 등, J Mol Biol 273: 927-948, 1997(Chothia 넘버링 체계); Maccallum 등, J Mol Biol 262: 732-745, 1996(Contact 넘버링 체계); Martin 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 9268-9272, 1989(AbM 넘버링 체계); Lefranc 등, Dev Comp Immunol 27(1): 55-77, 2003(IMGT 넘버링 체계); 및 Honegger and Pluckthun, J Mol Biol 309(3): 657-670, 2001("Aho" 넘버링 체계)에 의해 기재된 것들을 포함하여 다수의 잘 알려진 체계 중 임의의 것을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별을 위해 사용되는 체계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 체계는 구조적 정렬에 기반한 반면, Chothia 체계는 구조적 정보에 기반한다. Kabat 및 Chothia 체계 둘 다에 대한 넘버링은 가장 통상적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하며, 삽입은 삽입 문자, 예를 들어, "30a"로 수용되고 결실은 일부 항체에서 보인다. 두 체계는 상이한 위치에서 특정 삽입 및 결실("indel")을 배치하여, 차등 넘버링을 초래한다. Contact 체계는 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하고 Chothia 넘버링 체계에 대한 많은 측면에서 유사하다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체 CDR 서열은 Kabat 넘버링에 따른다.
전립선암과 연관된 특정 세포 마커는 PSMA, WT1, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 및 SV40 T를 포함한다. 유방암과 연관된 특정 세포 마커는 HER2 및 ERBB2를 포함한다. 난소암과 연관된 특정 세포 마커는 L1-CAM, MUC16의 세포외 도메인(MUC-CD), 폴레이트 결합 단백질(폴레이트 수용체), Lewis Y, 메소텔린, 및 WT-1을 포함한다. 췌장암과 연관된 특정 세포 마커는 메소텔린, CEA 및 CD24를 포함한다. 다발성 골수종과 연관된 특정 세포 마커는 BCMA, GPRC5D, CD38, 및 CS-1을 포함한다. 백혈병 및/또는 림프종과 연관된 특정 마커는 CLL-1, CD123, CD33, 및 PD-L1을 포함한다.
또한 예를 들면 감염원 항원에 대한 결합에 의해 감염성 질환 제제에 특이적인 결합 도메인이 고려된다. 이들은 예를 들면 바이러스-감염된 세포에 의해 발현되는 바이러스 항원 또는 다른 바이러스 마커를 포함한다. 예시적인 바이러스는 아데노바이러스, 아레나바이러스, 부냐바이러스, 코로나바이러스, 플라비바이러스, 한타바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스, 파필로마바이러스, 파라믹소바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 오르토믹소바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 로타바이러스, 스폰지형 바이러스 또는 토가바이러스를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 바이러스 항원 마커는 CMV, 감기 바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr), 독감 바이러스, A형, B형, 및 C형 간염 바이러스, 단순 포진, HIV, 인플루엔자, 일본 뇌염, 홍역, 소아마비, 광견병, 호흡기 세포융합체, 풍진, 천연두, 수두 대상포진 또는 웨스트 나일(West Nile) 바이러스에 의해 발현되는 펩티드를 포함한다.
추가의 특정 예로서, 사이토메갈로바이러스 항원은 외피 당단백질 B 및 CMV pp65를 포함하고; 엡스타인-바 항원은 EBV EBNAI, EBV P18, 및 EBV P23을 포함하고; 간염 항원은 HBV의 S, M, 및 L 단백질, HBV의 프리-S 항원, HBCAG DELTA, HBV HBE, C형 간염 바이러스 RNA, HCV NS3 및 HCV NS4를 포함하고; 단순 포진 바이러스 항원은 급초기 단백질 및 당단백질 D를 포함하고; HIV 항원은 gag, pol, 및 env 유전자의 유전자 산물 예컨대 HIV gp32, HIV gp41, HIV gp120, HIV gp160, HIV P17/24, HIV P24, HIV P55 GAG, HIV P66 POL, HIV TAT, HIV GP36, Nef 단백질 및 역전사효소를 포함하고; 인플루엔자 항원은 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함하고; 일본 뇌염 바이러스 항원은 단백질 E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A 및 80% E를 포함하고; 홍역 항원은 홍역 바이러스 융합 단백질을 포함하고; 광견병 항원은 광견병 당단백질 및 광견병 핵단백질을 포함하고; 호흡기 세포융합 바이러스 항원은 RSV 융합 단백질 및 M2 단백질을 포함하고; 로타바이러스 항원은 VP7sc를 포함하고; 풍진 항원은 단백질 E1 및 E2를 포함하고; 수두 대상포진 바이러스 항원은 gpI 및 gpII를 포함한다.
추가적인 특정 예시적인 바이러스 항원 서열은 다음을 포함한다: Nef(66-97)(서열번호: 176), Nef(116-145)(서열번호: 177), Gag p17(17-35)(서열번호: 178), Gag p17-p24(253-284)(서열번호: 179), 및 Pol 325-355(RT 158-188)(서열번호: 180). 바이러스 항원의 추가적인 예에 대하여 Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991) 참조.
암 세포와 같은 원치않은 세포 유형을 표적화하고 사멸하기 위해 면역계의 T 세포를 유전적으로 조작하는 데 상당한 진전이 이루어졌다. 많은 이들 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 작제물을 발현하도록 유전적으로 조작되었다. CAR은 암 세포를 인식하고 사멸시키기 위해 T 세포를 유전적으로 변형시키는 여러 별개의 하위구성요소를 포함하는 단백질이다. 하위구성요소는 적어도 세포외 구성요소 및 세포내 구성요소를 포함한다.
세포외 구성요소는 원치않은 세포의 표면 상에 우선적으로 존재하는 마커에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인이 이러한 마커에 결합할 때, 세포내 구성요소는 결합된 암 세포를 파괴하도록 T 세포를 지시한다. 결합 도메인은 전형적으로 단클론 항체(mAb)로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편(scFv)이지만, 이는 항체-유사 항원 결합 부위를 포함하는 다른 형식을 기반으로 할 수 있다.
세포내 구성요소는 효과기 도메인의 포함을 기반으로 활성화 신호를 제공한다. 1세대 CAR은 CD3ζ의 세포질 영역을 효과기 도메인으로 활용하였다. 2세대 CAR은 분화 클러스터 28(CD28) 또는 4-1BB(CD137)와 조합하여 CD3ζ을 활용한 반면, 3세대 CAR은 세포내 효과기 도메인 내에서 CD28 및 401BB와 조합하여 CD3ζ를 활용하였다.
CAR은 일반적으로 또한 분자 내에서 다양한 목적을 위해 사용되는 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 예를 들어, 막관통 도메인은 CAR의 세포외 구성요소를 세포내 구성요소에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 결합 도메인에 막-근위에 있는 스페이서 영역으로 종종 지칭되는 유연한 링커 서열은 결합 도메인 및 세포 막 사이의 추가적인 거리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이는 막에 대한 근접성을 기반으로 결합에 대한 입체 장애를 감소시키는 데 유익할 수 있다. 이 목적을 위해 사용되는 통상적인 스페이서 영역은 IgG4 링커이다. 표적화된 세포 마커에 따라, 더 조밀한 스페이서 또는 더 긴 스페이서가 사용될 수 있다. 다른 잠재적인 CAR 하위구성요소는 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재된다. CAR의 구성요소는 이제 다음과 같이 추가로 상세하게 기재된다: (a) 결합 도메인; (b) 세포내 신호전달 구성요소; (c) 링커; (d) 막관통 도메인; (e) 접합부 아미노산; 및 (f) 태그 카세트를 포함하는 제어 특징.
(a) 결합 도메인. 결합 도메인은 세포 마커에 결합하여 복합체를 형성하는 물질을 포함하며, 본원에 개시된 모든 결합 도메인 및 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 결합 도메인의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 세포 마커의 유형 및 수에 따라 달라질 수 있다. 결합 도메인의 예는 세포 마커 리간드, 수용체 리간드, 항체, 펩티드, 펩티드 압타머, 수용체(예를 들어, T 세포 수용체), 또는 이의 조합 및 조작된 단편 또는 형식을 포함한다.
(b) 세포내 신호전달 구성요소. CAR의 세포내 또는 달리 세포질 신호전달 구성요소는 CAR이 발현되는 세포의 활성화를 담당한다. 따라서 용어 "세포내 신호전달 구성요소" 또는 "세포내 구성요소"는 활성화 신호를 형질도입하기에 충분한 세포내 도메인의 임의의 부분을 포함하는 것을 의미한다. 발현된 CAR의 세포내 구성요소는 효과기 도메인을 포함한다. 효과기 도메인은 적절한 신호를 수신할 때 세포에서 생물학적 또는 생리학적 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 융합 단백질 또는 수용체의 세포내 부분이다. 특정 구현예에서, 효과기 도메인은 결합될 때 신호를 수신하는 단백질 또는 단백질 복합체의 일부이거나, 또는 효과기 도메인로부터 신호를 촉발하는 표적 분자에 직접적으로 결합된다. 효과기 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)와 같은 하나 이상의 신호전달 도메인 또는 모티프를 함유할 때 세포 반응을 직접적으로 촉진할 수 있다. 다른 구현예에서, 효과기 도메인은 공동-자극 도메인과 같이, 세포 반응을 직접적으로 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 회합함으로써 세포 반응을 간접적으로 촉진할 것이다.
효과기 도메인은 암 세포에 의해 발현되는 세포 마커에 결합 시 변형된 세포의 적어도 하나의 기능의 활성화를 제공할 수 있다. 변형된 세포의 활성화는 분화, 증식 및/또는 활성화 또는 다른 효과기 기능 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 효과기 도메인은 T 세포 수용체 및 공동-수용체 또는 공동-자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있는 공동-자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성요소를 포함할 수 있다.
효과기 도메인은 1, 2, 3 개 또는 그 이상의 수용체 신호전달 도메인, 세포내 신호전달 구성요소(예를 들어, 세포질 신호전달 서열), 공동-자극 도메인, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예시적인 효과기 도메인은 4-1BB(CD137), CARD11, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD27, CD28, CD79A, CD79B, DAP10, FcRα, FcRβ(FcεR1b), FcRγ, Fyn, HVEM(LIGHTR), ICOS, LAG3, LAT, Lck, LRP, NKG2D, NOTCH1, pTα, PTCH2, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, TCRα, TCRβ, TRIM, Wnt, Zap70, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 신호전달 및 자극 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 예시적인 효과기 도메인은 CD86, FcγRIIa, DAP12, CD30, CD40, PD-1, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, GADS, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, 또는 NKp46으로부터 선택된 신호전달 및 공동-자극 도메인을 포함한다.
자극 방식으로 작용하는 세포내 신호전달 구성요소 서열은 iTAM을 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 포함하는 iTAM의 예는 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD66d, CD79a, CD79b, 및 공통 FcRγ(FCER1G), FcγRlla, FcRβ(Fcε Rib), DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것들을 포함한다. 특정 구현예에서,CD3ζ의 변이체는 적어도 하나, 2, 3 개, 또는 모든 ITAM 영역을 보유한다.
특정 구현예에서, 효과기 도메인은 세포질 신호전달 단백질과 회합하는 세포질 부분을 포함하며, 여기서 세포질 신호전달 단백질은 림프구 수용체 또는 이의 신호전달 도메인, 복수의 ITAM을 포함하는 단백질, 공동-자극 도메인, 또는 이의 임의의 조합이다.
세포내 신호전달 구성요소의 추가적인 예는 CD3ζ 쇄의 세포질 서열, 및/또는 결합 도메인 관여 후 신호 형질도입을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공동-수용체를 포함한다.
공동-자극 도메인은 세포 마커 결합에 대한 효율적인 림프구 반응에 필요할 수 있는 활성화가 있는 도메인이다. 일부 분자는 세포내 신호전달 구성요소 또는 공동-자극 도메인으로 상호교환가능하다. 공동 자극 도메인의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 예를 들어, CD27 공동-자극은 시험관내에서 인간 CART 세포의 확장, 효과기 기능, 및 생존을 향상시키고 생체내에서 인간 T 세포 지속 및 항암 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다(Song 등 Blood. 2012; 119(3):696-706). 이러한 공동-자극 도메인 분자의 추가의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDllc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, 및 CD19a를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 구성요소의 아미노산 서열은 CD3ζ의 변이체 및 4-1BB 세포내 신호전달 구성요소의 일부를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 구성요소는 (i) CD3ζ의 신호전달 도메인의 전부 또는 일부, (ii) 4-1BB의 신호전달 도메인의 전부 또는 일부, 또는 (iii) CD3ζ 및 4-1BB의 신호전달 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다.
세포내 구성요소는 또한 Wnt 신호전달 경로(예를 들어, LRP, Ryk, 또는 ROR2), NOTCH 신호전달 경로(예를 들어, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, 또는 NOTCH4), Hedgehog 신호전달 경로(예를 들어, PTCH 또는 SMO), 수용체 티로신 키나제(RTK)(예를 들어, 표피 성장 인자(EGF) 수용체 패밀리, 섬유모세포 성장 인자(FGF) 수용체 패밀리, 간세포 성장 인자(HGF) 수용체 패밀리, 인슐린 수용체(IR) 패밀리, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 수용체 패밀리, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 패밀리, 트로포마이신 수용체 키나제(Trk) 수용체 패밀리, 에프린(Eph) 수용체 패밀리, AXL 수용체 패밀리, 백혈구 티로신 키나제(LTK) 수용체 패밀리, 면역글로불린-유사 및 EGF-유사 도메인 1을 함유하는 티로신 키나제(TIE) 수용체 패밀리, 수용체 티로신 키나제-유사 고아(ROR) 수용체 패밀리, 디스코이딘 도메인(DDR) 수용체 패밀리, 형질감염 동안 재배열된(RET) 수용체 패밀리, 티로신-단백질 키나제-유사(PTK7) 수용체 패밀리, 수용체 관련된 티로신 키나제(RYK) 수용체 패밀리, 또는 근육 특이적 키나제(MuSK) 수용체 패밀리); G-단백질-커플링된 수용체, GPCR(Frizzled 또는 Smoothened); 세린/트레오닌 키나제 수용체(BMPR 또는 TGFR); 또는 사이토카인 수용체(IL1R, IL2R, IL7R, 또는 IL15R)의 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
(c) 링커. 본원에 사용된 바와 같이, 링커는 분자의 2 개의 다른 하위 구성요소를 연결하는 역할을 하는 CAR 분자의 임의의 부분일 수 있다. 일부 링커는 다른 구성요소를 연결하는 것 이외의 목적을 제공하지 않는 반면 많은 링커는 추가적인 목적을 제공한다. scFv의 항체 유래된 결합 도메인의 VL 및 VH를 연결하는 맥락에서 링커는 상기 기재되어 있다. 링커는 또한 스페이서 영역, 및 접합부 아미노산을 포함할 수 있다.
스페이서 영역은 다른 연결된 구성요소로부터 적절한 거리 및/또는 유연성을 생성하는 데 사용되는 링커 영역의 한 유형이다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역의 길이는 원치않은 세포 인식 및 파괴를 최적화하기 위해 원치않은 세포에 대한 개별 세포 마커를 맞춤화할 수 있다. 스페이서는 스페이서의 부재와 비교하여, 항원 결합 후 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역 길이는 세포 마커 에피토프의 위치, 에피토프에 대한 결합 도메인의 친화도, 및/또는 세포 마커 인식에 반응하여 시험관내 및/또는 생체내에서 증식하는 분자를 발현하는 변형된 세포의 능력을 기반으로 선택될 수 있다. 스페이서 영역은 또한 변형된 세포에서 높은 발현 수준을 허용할 수 있다.
예시적인 스페이서는 10 내지 250 개의 아미노산, 10 내지 200 개의 아미노산, 10 내지 150 개의 아미노산, 10 내지 100 개의 아미노산, 10 내지 50 개의 아미노산, 또는 10 내지 25 개의 아미노산을 갖는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 12 개의 아미노산, 20 개의 아미노산, 21 개의 아미노산, 26 개의 아미노산, 27 개의 아미노산, 45 개의 아미노산, 또는 50 개의 아미노산이다.
특정 구현예에서, 스페이서 영역은 IgG1, IgG2, lgG3, lgG4 또는 IgD 단독으로부터 힌지 영역 서열의 전부 또는 일부 또는 CH2 영역의 전부 또는 일부; CH3 영역의 전부 또는 일부; 또는 CH2 영역의 전부 또는 일부 및 CH3 영역의 전부 또는 일부와 조합하여 포함하는 군으로부터 선택된다.
예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 아미노산 서열 서열번호: 181의 IgG4 링커를 포함한다. 힌지 영역은 의도되지 않은 파트너와의 이량체화와 같은 바람직하지 않은 구조적 상호작용을 피하기 위해 변형될 수 있다.
특정 구현예에서, 스페이서 영역은 II형 C-렉틴 도메인간(줄기) 영역 또는 분화 클러스터(CD) 분자 줄기 영역인 힌지 영역을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "야생형 면역글로불린 힌지 영역"은 CH1 및 CH2 도메인 사이에 개재되어 연결하거나(IgG, IgA, 및 IgD의 경우) 또는 항체의 중쇄에서 발견되는 CH1 및 CH3 도메인 사이에 개재되어 연결하는(IgE 및 IgM의 경우) 자연 발생 상부 및 중간 힌지 아미노산을 지칭한다.
II형 C-렉틴 또는 CD 분자의 "줄기 영역"은 C-형 렉틴-유사 도메인(CTLD; 예를 들어, 자연 살해자 세포 수용체의 CTLD와 유사) 및 소수성 부분(막관통 도메인) 사이에 위치한 II형 C-렉틴 또는 CD 분자의 세포외 도메인 부분을 지칭한다. 예를 들어, 인간 CD94의 세포외 도메인(GenBank 수탁 번호 AAC50291.1)은 아미노산 잔기 34-179에 상응하지만, CTLD는 아미노산 잔기 61-176에 상응하여, 인간 CD94 분자의 줄기 영역은 소수성 부분(막관통 도메인) 및 CTLD 사이에 위치한 아미노산 잔기 34-60을 포함한다(Boyington 등, Immunity 10:15, 1999 참조; 다른 줄기 영역의 설명을 위해, 또한 Beavil 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:153, 1992; 및 Figdor 등, Nat. Rev. Immunol. 2:11, 2002 참조). 이러한 II형 C-렉틴 또는 CD 분자는 또한 줄기 영역 및 막관통 영역 또는 CTLD 사이에 접합부 아미노산(하기 기재됨)을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 233 개의 아미노산 인간 NKG2A 단백질(GenBank 수탁 번호 P26715.1)은 아미노산 71-93 범위의 소수성 부분(막관통 도메인) 및 아미노산 94-233 범위의 세포외 도메인을 갖는다. CTLD는 아미노산 119-231을 포함하고 줄기 영역은 아미노산 99-116을 포함하며, 이는 추가적인 접합부 아미노산에 의해 플랭킹될 수 있다. 다른 II형 C-렉틴 또는 CD 분자, 뿐만 아니라 이의 세포외 리간드-결합 도메인, 줄기 영역, 및 CTLD는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, GenBank 수탁 번호 NP 001993.2; AAH07037.1; NP 001773.1; AAL65234.1; CAA04925.1 참조; 각각 인간 CD23, CD69, CD72, NKG2A, 및 NKG2D의 서열 및 이의 설명에 대한 것).
예시적인 스페이서는 또한 Hudecek 등 (Clin. Cancer Res., 19:3153, 2013) 또는 WO2014/031687에 기재된 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 아미노산 서열 서열번호: 182의 CD28 링커일 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호: 183이다. 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호: 184이다.
특정 구현예에서, 긴 스페이서는 119 개 초과의 아미노산(예를 들어, 229 개의 아미노산)이고, 중간 스페이서는 13-119 개의 아미노산이고, 짧은 스페이서는 12 개 이하의 아미노산이다. 중간 스페이서 영역의 예는 IgG4 힌지 영역 서열 및 CH3 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 긴 스페이서의 예는 IgG4 힌지 영역 서열, CH2 영역, 및 CH3 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 짧은 스페이서 서열이 바람직하다.
스페이서 영역에 관한 추가의 설명으로서, 융합 단백질의 세포외 구성요소는 임의적으로 예를 들어, 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 결합 도메인이 숙주 세포(예를 들어, T 세포) 표면으로부터 멀리 떨어져 위치할 수 있는 세포외, 비-신호전달 스페이서 또는 링커 영역을 포함한다(Patel 등, Gene Therapy 6: 412-419 (1999)). 나타낸 바와 같이, 융합 결합 단백질의 세포외 스페이서 영역은 일반적으로 소수성 부분 또는 막관통 도메인 및 세포외 결합 도메인 사이에 위치하고, 스페이서 영역 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 또는 항원-결합 도메인 크기 및 친화도를 기반으로 항원 인식(예를 들어, 종양 인식)을 최대화하도록 달라질 수 있다(예를 들어, Guest 등, J. Immunother. 28:203-11, 2005; WO　2014/031687 참조). 특정 구현예에서, 스페이서 영역은 면역글로불린 힌지 영역을 포함한다. 면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 면역글로불린 힌지 영역이다. 면역글로불린 힌지 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 힌지 영역일 수 있다. IgG 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 힌지 영역일 수 있다. 예시적인 변경된 IgG4 힌지 영역은 PCT 공개 번호 WO　2014/031687에 기재되어 있다. 본원에 기재된 융합 결합 단백질에 사용되는 힌지 영역의 다른 예는 야생형 또는 이의 변이체일 수 있는 CD8α, CD4, CD28 및 CD7과 같은 1형 막 단백질의 세포외 영역에 존재하는 힌지 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포외 스페이서 영역은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다(예를 들어, WO　2014/031687 참조). Fc 도메인 또는 이의 부분은 (예를 들어, 항체 효과기 기능을 감소시키기 위해) 변경된 야생형일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포외 구성요소는 결합 도메인 및 소수성 부분 사이에 배치된 면역글로불린 힌지 영역, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 구성요소는 IgG1 힌지 영역, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인을 포함한다. 추가의 구현예에서, IgG1 CH2 도메인은 (i) N297Q 돌연변이, (ii) 첫번째 6 개 아미노산(APEFLG)의 APPVA로의 치환, 또는 (i) 및 (ii) 둘 다를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 힌지 영역, Fc 도메인 또는 이의 부분, 또는 둘 다는 인간이다.
(d) 막관통 도메인. 나타낸 바와 같이, CAR 분자 내의 막관통 도메인은 종종 세포 막을 통해 세포외 구성요소 및 세포내 구성요소를 연결하는 역할을 한다. 막관통 도메인은 변형된 세포의 막에서 발현된 분자를 고정시킬 수 있다.
막관통 도메인은 천연 및/또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연일 때, 막관통 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질으로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 적어도 T-세포 수용체, CD28, CD27, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 α, β 또는 ζ 쇄의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 적어도 예를 들어, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD 11a, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, 또는 NKG2C의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 Ig(면역글로불린) 힌지(예를 들어, IgG4 힌지, IgD 힌지), GS 링커(예를 들어, 본원에 기재된 GS 링커), KIR2DS2 힌지 또는 CD8a 힌지를 포함하는 다양한 인간 힌지가 또한 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 막관통 도메인은 세포 막에서 열역학적으로 안정되고, 일반적으로 15 내지 30 개의 아미노산 길이 범위인 3차원 구조를 갖는다. 막관통 도메인의 구조는 α 나선, β 베럴, β 시트, β 나선, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가적인 아미노산, 예를 들어, CAR의 세포외 영역 내에서 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 세포외 영역의 최대 15 개 아미노산) 및/또는 CAR의 세포내 영역 내에서 하나 이상의 추가적인 야미노산(예를 들어, 세포내 구성요소의 최대 15 개 아미노산)을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 막관통 도메인은 신호전달 도메인, 공동-자극 도메인 또는 힌지 도메인이 유래된 것과 동일한 단백질로부터 유래된다. 또 다른 측면에서, 막관통 도메인은 CAR의 임의의 다른 도메인이 유래된 것과 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 의도되지 않은 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 또는 변형될 수 있다. 일 측면에서, 막관통 도메인은 CAR-발현 세포의 세포 표면 상에서 또 다른 CAR과 동종이량체화할 수 있다. 상이한 측면에서, 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CAR-발현 세포에 존재하는 천연 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하기 위해 변형되거나 또는 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인의 아미노산 서열을 포함한다.
(e) 접합부 아미노산. 접합부 아미노산은 스페이서에 의해 제공되는 거리가 필요하지 않고/하거나 원치 않을 때 CAR 도메인의 서열을 연결하는 데 사용될 수 있는 링커일 수 있다. 접합부 아미노산 공동-자극 세포내 신호전달 구성요소를 연결하는 데 사용될 수 있는 짧은 아미노산 서열이다. 특정 구현예에서, 접합부 아미노산은 9 개 이하의 아미노산이다.
접합부 아미노산은 링커를 형성하는 짧은 올리고- 또는 단백질 링커, 바람직하게는 2 내지 9 개의 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 개의 아미노산) 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 글리신-세린 이중항이 적합한 접합부 아미노산 링커로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글리신이 적합한 접합부 아미노산으로 사용될 수 있다.
(f) 태그 카세트, 형질도입 마커, 및 자살 스위치를 포함하는 제어 특징. 특정 구현예에서, CAR 작제물은 하나 이상의 태그 카세트, 형질도입 마커, 및/또는 자살 스위치를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 마커 및/또는 자살 스위치는 동일한 작제물 내에 있지만 세포 표면 상에서 별개의 분자로 발현된다. 태그 카세트 및 형질도입 마커는 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 유전적으로 변형된 세포를 활성화, 이의 증식 촉진, 검출, 이에 대한 강화, 단리, 추적, 고갈 및/또는 제거에 사용될 수 있다. "태그 카세트"는 결합 특성이 태그된 단백질 및/또는 태그된 단백질을 발현하는 세포를 활성화, 이의 증식 촉진, 검출, 이에 대한 강화, 단리, 추적, 고갈 및/또는 제거에 사용될 수 있는 경우 동족 결합 분자(예를 들어, 리간드, 항체, 또는 다른 결합 파트너)가 특이적으로 결합할 수 있는 CAR에 부착되거나, 융합되거나, 또는 이의 일부인 고유한 합성 펩티드 서열을 지칭한다. 형질도입 마커는 동일한 목적을 제공할 수 있지만 자연 발생 분자로부터 유래되고 종종 나머지 CAR 분자로부터 형질도입 마커를 분리하는 스킵 요소를 사용하여 발현된다.
동족 결합 분자에 결합하는 태그 카세트는 예를 들어, His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모듈린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Myc 태그, Softag 1, Softag 3, 및 V5 태그를 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 Myc 태그를 포함한다.
본원에 개시된 태그 카세트 서열에 특이적으로 결합하는 접합체 결합 분자는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, His 태그 항체는 Life Technologies, Pierce Antibodies, 및 GenScript를 포함하는 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. Flag 태그 항체는 Pierce Antibodies, GenScript, 및 Sigma-Aldrich를 포함하는 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. Xpress 태그 항체는 Pierce Antibodies, Life Technologies 및 GenScript를 포함하는 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. Avi 태그 항체는 Pierce Antibodies, IsBio, 및 Genecopoeia를 포함하는 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. 칼모듈린 태그 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Abcam, 및 Pierce Antibodies를 포함하는 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. HA 태그 항체는 Pierce Antibodies, Cell Signal 및 Abcam을 포함하는 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. Myc 태그 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Abcam, 및 Cell Signal을 포함하는 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다.
형질도입 마커는 절두된 CD19(tCD19; Budde 등, Blood 122: 1660, 2013 참조); 절두된 인간 EGFR(tEGFR; Wang 등, Blood 118: 1255, 2011 참조); 인간 CD34의 세포외 도메인; 및/또는 CD34의 표적 에피토프와 조합하는 RQR8(Fehse 등, Mol. Therapy 1(5 Pt 1); 448-456, 2000 참조) 및 CD20 항원(Philip 등, Blood 124: 1277-1278, 2014 참조) 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, iCaspase9 작제물(iCasp9)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자살 스위치로서 CAR 뉴클레오티드 작제물 내로 삽입될 수 있다.
제어 특징은 CAR의 다중 카피에 존재할 수 있거나 또는 스키핑 요소를 사용하여 별개의 분자로서 표현될 수 있다. 예를 들어, CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 태그 카세트를 가질 수 있고/있거나 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 형질도입 마커가 또한 발현될 수 있다. 예를 들어, 구현예는 2 개의 Myc 태그 카세트, 또는 His 태그 및 HA 태그 카세트, 또는 HA 태그 및 Softag 1 태그 카세트, 또는 Myc 태그 및 SBP 태그 카세트가 있는 CAR 작제물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 후 다량체화될 CAR은 상이한 태그 카세트를 포함한다. 특정 구현예에서, 형질도입 마커는 tEFGR을 포함한다. 예시적인 형질도입 마커 및 동족 쌍은 US 13/463,247에 기재되어 있다.
CAR에서 적어도 하나의 제어 특징을 포함하는 한 가지 이점은 대상체에게 투여된 CAR 발현 세포가 태그 카세트에 대한 동족 결합 분자를 사용하여 고갈될 수 있다는 점이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 태그 카세트에 특이적인 항체를 사용하거나, 제어 특징에 특이적인 동족 결합 분자를 사용하거나, 또는 CAR을 발현하고 제어 특징에 대한 특이성을 갖는 제2 변형된 세포를 사용함으로써 CAR을 발현하는 변형된 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 변형된 세포의 제거는 제어 특징에 특이적인 고갈제를 사용하여 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 분자를 발현하는 변형된 세포는 제어 특징에 대한 특이성으로 결합하는 항체(예를 들어, 항-Tag 항체)를 사용하거나, 또는 제어 특징에 특이적으로 결합하는 다른 동족 결합에 의해 생체내에서 검출 또는 추적될 수 있으며, 제어 특징에 대한 결합 파트너는 형광 염료, 방사선-추적자, 산화철 나노입자 또는 X-선, CT-스캔, MRI-스캔, PET-스캔, 초음파, 유세포 분석, 근적외선 이미징 시스템, 또는 다른 이미징 양식에 의한 검출을 위해 당업계에 알려진 다른 이미징제에 접합된다(예를 들어, Yu, 등, Theranostics 2:3, 2012 참조).
따라서, CAR이 있는 적어도 하나의 제어 특징을 나타내는 변형된 세포는 예를 들어, 태그 카세트가 없는 변형된 세포와 비교하여 더 용이하게 식별, 단리, 분류, 증식 유도, 추적, 및/또는 제거될 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 유용한 예시적인 CAR 및 CAR 아키텍처는 WO2012/138475A1, US 9,624,306B2, US9266960B2, US2017/017477, EP2694549B1, US2017/0283504, US2017/0281766, US20170283500, US2018/0086846, US2010/0105136, US2010/0105136, WO2012/079000, WO2008045437, WO2016/139487A1, 및 WO2014/039523에 의해 제공된 것들을 포함한다.
TCR은 자연 발생 T 세포 수용체를 지칭한다. HSC는 선택된 TCR을 발현하도록 생체내에서 변형될 수 있다. CAR/TCR 하이브리드는 TCR의 요소 및 CAR의 요소를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, CAR/TCR 하이브리드는 TCR 결합 도메인이 자연적으로 회합되지 않는 효과기 도메인과 함께 자연 발생 TCR 결합 도메인을 가질 수 있다. CAR/TCR 하이브리드는 돌연변이된 TCR 결합 도메인 및 ITAM 신호전달 도메인을 가질 수 있다. CAR/TCR 하이브리드는 삽입된 비-자연 발생 스페이서 영역 또는 막관통 도메인과 함께 자연 발생 TCR을 가질 수 있다.
특정 CAR/TCR 하이브리드는 매사추세츠주 케임브리지 소재의 TCR2 Therapeutics의 TRuC®(T 세포 수용체 융합 작제물) 하이브리드를 포함한다. 예로서, TCR 융합 단백질의 생산은 국제 특허 공개 WO 2018/026953 및 WO 2018/067993, 및 출원 공개 US 2017/0166622에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, CAR/TCR 하이브리드는 "T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"를 포함한다. TFP는 일반적으로 i) 표적 세포 상의 표면 항원에 결합할 수 있고 ii) 전형적으로 T-세포의 표면 내에 또는 표면 상에 공동-위치할 때, 온전한 TCR 복합체의 다른 폴리펩티드 구성요소와 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 다양한 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, TFP는 암 항원(예를 들어, CD19, ROR1)에 결합하는 항체 단편을 포함하며 여기서 항체 단편의 서열은 TCR 서브유닛 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 서열과 인접하고 이와 동일한 판독 프레임 내에 있다. TFP는 기능적 TCR 복합체를 형성하기 위해 하나 이상의 내인성(또는 대안적으로, 하나 이상의 외인성, 또는 내인성 및 외인성의 조합) TCR 서브유닛과 회합할 수 있다.
I(C)(i)(b). 유전자 편집 시스템 및 구성요소
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 페이로드는 유전자 편집 시스템의 적어도 하나의 구성요소, 또는 모든 구성요소를 암호화한다. 본 개시내용의 유전자 편집 시스템은 CRISPR 시스템 및 염기 편집 시스템을 포함한다. 광범위하게, 유전자 편집 시스템은 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 염기 편집 효소로부터 선택된 유전자 편집 효소 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 복수의 구성요소를 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 유전자 편집 시스템은 (i) CRISPR 시스템의 경우, CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제인 CRISPR 효소 및 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA), 또는 (ii) 염기 편집 시스템의 경우, 염기 편집 효소 및 적어도 하나의 gRNA를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 자기-불활성화 유전자 편집 시스템이 본 개시내용의 벡터에 존재하고 벡터의 일부, 예를 들어, 통합 요소의 숙주 세포 게놈 내로의 절제 및/또는 통합 시 비-기능적으로 만드는 유전자 편집 시스템을 포함한다는 것을 포함한다. 다양한 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 통합 요소의 절제 및/또는 통합 요소의 숙주 세포 게놈 내로의 통합 후 유전자 편집 시스템의 적어도 하나의 구성요소를 암호화하는 벡터 서열의 분해에 의해 비-기능적으로 만든다.
본 개시내용은 다양한 구현예에서, CRISPR 효소 또는 염기 편집 효소가 PGK 프로모터와 작동가능하게 연결된 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 개시내용은 PGK가 공여자 벡터 생산을 위한 HEK293 세포와 같은 생산자 세포에서 더 약한 프로모터이지만(즉, 예를 들어, 생산자 세포의 Ef1α 프로모터와 비교하여 및/또는 HSC의 PGK 프로모터와 비교하여, 코딩 서열 발현의 상대적으로 낮거나 또는 감소된 수준을 구동) HSC에서 효율적인 이식유전자 발현을 구동하는(즉, 예를 들어, HSC의 Ef1α 프로모터와 비교하여 및/또는 HEK293 세포와 같은 생산자 세포의 PGK 프로모터와 비교하여, 코딩 서열 발현의 상대적으로 높거나 또는 증가된 수준을 구동) 실험적 발견을 포함한다.
다양한 구현예에서, CRISPR 효소 또는 염기 편집 효소를 포함하는 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산 서열은 예를 들어, TadA 및/또는 Tad*의 발현으로부터, 예를 들어, 생산자 세포(들)에서 유전자 편집 시스템 발현(예를 들어, 염기 편집 시스템 발현)의 잠재적인 유해 효과를 피하거나 또는 감소시키기 위해, HEK293 세포와 같은 생산자 세포에서 효소의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는 microRNA 표적 부위를 포함한다. 다양한 구현예에서, miR 서열은 예를 들어, Saydaminova 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 1: 14057, 2015; Li 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9: 390-401, 2018에 기재된 바와 같이, HDAd35 공여자 벡터 생산 동안 생산자 세포에서 염기 편집 또는 CRISPR 효소 발현을 억제하는 서열일 수 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
따라서, 의심의 여지를 피하기 위해, 본 개시내용은 유전자 편집 시스템을 암호화하는 핵산 서열이 (i) 임의적으로 핵산 서열이 본원에 개시된 바와 같은 변형된 TadA 및/또는 TadA*를 포함하는 경우, CRISPR 효소 또는 염기 편집 효소를 암호화하는 핵산 서열; (ii) CRISPR 효소 또는 염기 편집 효소 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터; 및 (iii) HEK293 세포와 같은 생산자 세포에서 효소의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는 microRNA 표적 부위의 전부 또는 임의의 것을 포함할 수 있는 구현예를 포함한다. 본 개시내용은 이러한 특징(i, ii, 및 iii)이 효과적인 유전자 요법에 개별적으로 및 상승적 조합으로 기여할 수 있음을 포함한다.
I(C)(i)(b)(1). CRISPR 페이로드 발현 산물
CRISPR(클러스터링된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문 반복부)/Cas(CRISPR-연관 단백질) 뉴클레아제 시스템은 박테리아 시스템에 기반한 유전적 조작에 사용되는 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이는 부분적으로 많은 박테리아 및 고세균의 적응 면역 반응에 기반한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아를 침입하는 경우, 침입자의 DAN 분절은 박테리아의 "면역" 반응에 의해 CRISPR RNA(crRNA)로 전환된다. 그런 다음 crRNA는 부분적 상보성 영역을 통해, tracrRNA라 불리는 또 다른 유형의 RNA와 회합하여 "프로토스페이서"라 불리는 표적 DNA의 crRNA에 상동인 영역에 Cas 뉴클레아제를 가이드한다. Cas 뉴클레아제는 crRNA 전사체 내에 함유된 20-뉴클레오티드 상보적 가닥 서열에 의해 명시된 부위에서 이중-가닥 파괴 시 뭉툭한 단부를 생성하도록 DNA를 절단한다. 일부 경우에, Cas 뉴클레아제는 부위-특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA를 둘 다 필요로 한다.
가이드 RNA(gRNA)는 표적화 요소의 일 예이다. 가장 간단한 형태에서, gRNA는 상보성에 기반한 게놈 내의 부위를 표적화하는 서열(예를 들어, crRNA)을 제공한다. 그러나, 하기 예시된 바와 같이, gRNA는 또한 추가적인 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, gRNA는 표적화 서열(예를 들어, crRNA) 및 표적화 서열을 절단 요소에 연결하는 구성요소를 포함할 수 있다. 이 연결 구성요소는 tracrRNA일 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 기재된 바와 같이, crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 gRNA는 단일 gRNA(sgRNA)로 지칭되는 단일 분자로 표현될 수 있다. gRNA는 또한 다른 메커니즘을 통해 예컨대 나노입자를 통해 또는 이중 또는 다중-목적 분자의 발현 또는 구축을 통해 절단 요소에 연결될 수 있다. 당업자는 예를 들어, 본 개시내용의 아데노바이러스 공여자 벡터 또는 게놈의 숙주 세포에서 선택된 핵산 서열 교정 또는 변형을 생성하기 위한 gRNA 또는 다른 표적화 요소가 예를 들어, 이용가능한 서열 정보를 기반으로 용이하게 설계 및 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 표적화 요소(예를 들어, gRNA)는 새롭거나 또는 향상된 특징(예를 들어, 개선된 안정성)이 있는 핵산을 제공하기 위해, 하나 이상의 변형(예를 들어, 염기 변형, 백본 변형)을 포함할 수 있다. 변형된 백본은 백본에서 인 원자를 유지하는 것들 및 백본에서 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함할 수 있다. 인 원자를 함유하는 적합한 변형된 백본은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스페이트 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트, 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 포스포로디아미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스포네이트, 및 정상 3'-5' 연결, 2'-5' 연결된 유사체, 및 도립된 극성이 있는 것을 갖는 보라노포스페이트를 포함할 수 있으며 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결은 3'에서 3'으로, 5'에서 5'으로 또는 2'에서 2'으로 연결이다. 도립된 극성을 갖는 적합한 표적화 요소는 3'-대부분 뉴클레오티드간 연결에서 단일 3'에서 3'으로 연결(즉, 핵염기가 누락되거나 또는 이 대신에 하이드록실 기를 갖는 단일 도립된 뉴클레오티드 잔기)를 포함할 수 있다. 다양한 염(예를 들어, 염화칼륨 또는 염화나트륨), 혼합 염, 및 유리 산 형태가 또한 포함될 수 있다.
표적화 요소는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오시드간 연결, 특히 --CH2-NH-O-CH2-, --CH2-N(CH3)-O-CH2-(즉, 메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본), --CH2-O-N(CH3)-CH2-, --CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 --O--N(CH3)-CH2-CH2-(여기서 천연 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결은 --O--P(=O)(OH)-O-CH2-로 표현됨)를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 표적화 요소는 모르폴리노 백본 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적화 요소는 리보스 고리 대신에 6-원 모르폴리노 고리를 포함할 수 있다. 이러한 구현예 중 일부에서, 포스포로디아미데이트 또는 다른 비-포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결을 대체한다.
특정 구현예에서, 표적화 요소는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 폴리뉴클레오티드는 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬로부터 선택된 당 치환기를 포함할 수 있으며, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. O((CH2)nO) mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON((CH2)nCH3)2가 특히 적합하며, 여기서 n 및 m은 1 내지 10이다.
절단 요소의 예는 뉴클레아제를 포함한다. CRISPR-Cas 유전자좌는 50 개 초과의 유전자 패밀리를 갖고 엄격하게 보편적인 유전자가 없으며, 이는 유전자좌 아키텍처의 빠른 진화 및 극도의 다양성을 나타낸다. 예시적인 Cas 뉴클레아제는 Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csnl 및 Csxl2로도 알려짐), CaslO, Cpfl, C2c3, C2c2 및 C2clCsyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Cpfl, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, 및 Csf4를 포함한다.
3가지 주요 유형의 Cas 뉴클레아제(I형, II형, 및 III형), 및 5 개의 I형, 3 개의 II형, 및 2 개의 III형 단백질을 포함하는 10 개의 하위유형이 있다(예를 들어, Hochstrasser and Doudna, Trends Biochem Sci, 2015:40(l):58-66) 참조. II형 Cas 뉴클레아제는 Casl, Cas2, Csn2, 및 Cas9를 포함한다. 이들 Cas 뉴클레아제는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 야생형 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 참조 서열 번호 NP 269215에 제시되어 있고, 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 야생형 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 참조 서열 번호 WP_011681470에 제시되어 있다.
특정 구현예에서, Cas9는 RNA-가이드된 이중-가닥 DNA-결합 뉴클레아제 단백질 또는 닉카제 단백질을 지칭한다. 야생형 Cas9 뉴클레아제는 상이한 DNA 가닥을 절단하는 2 개의 기능적 도메인, 예를 들어, RuvC 및 HNH를 갖는다. Cas9는 두 기능적 도메인이 활성일 때 게놈 DNA(표적 DNA)에서 이중 가닥 파괴를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 효소는 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 필리프 액터(Filif actor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 마이코플라스마(Mycoplasma), 박테로이데스(Bacteroides), 플라비볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 스페로케타(Sphaerochaeta), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 네이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파르비바쿨룸(Parvibaculum), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 니트라티프락터(Nitratifractor), 및 캄필로박터(Campylobacter)와 같은 박테리아로부터 유래된 Cas9 단백질의 하나 이상의 촉매적 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9는 융합 단백질이며, 예를 들어 2 개의 촉매적 도메인은 상이한 박테리아 종으로부터 유래된다.
이전에 나타낸 바와 같이, CRISPR/Cas 시스템은 특정 경우에, crRNA 및 tracrRNA가 단일 gRNA(sgRNA)라고 불리는 하나의 분자 내로 조합될 수 있도록 조작되었다. 이 조작된 접근법에서, sgRNA는 Cas가 임의의 원하는 서열을 표적화하도록 가이드한다(예를 들어, Jinek 등, Science 337:816-821, 2012; Jinek 등, eLife 2:e00471, 2013; Segal, eLife 2:e00563, 2013 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 세포의 게놈에서 원하는 표적에서 이중 가닥 파괴를 생성하고, 세포의 내인성 메커니즘을 활용하여 HDR, 또는 NHEJ에 의해 유도된 파괴를 복구하도록 조작될 수 있다. 본원에 기재된 특정 구현예는 정의된 통합 부위에서 HDR을 촉진하기 위해 상동성 아암을 활용한다.
Cas9 뉴클레아제의 유용한 변이체는 RuvC" 또는 HNH" 효소 또는 닉카제와 같은 단일 불활성 촉매적 도메인을 포함한다. Cas9 닉카제는 활성 하나의 기능적 도메인만을 가지며, 일부 구현예에서, 표적 DNA의 한쪽 가닥만을 절단하여, 단일 가닥 파괴 또는 닉을 생성한다. 일부 구현예에서, 적어도 D10A 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cas9 뉴클레아제는 Cas9 닉카제이다. 다른 구현예에서, 적어도 H840A 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Cas9 뉴클레아제는 Cas9 닉카제이다. Cas9 닉카제에 존재하는 돌연변이의 다른 예는 N854A 및 N863 A를 포함한다. 이중 가닥 파괴는 반대 DNA 가닥을 표적화하는 적어도 2 개의 DNA-표적화 RNA가 사용되는 경우 Cas9 닉카제를 사용하여 도입된다. 이중 닉 유도된 이중 가닥 파괴는 HDR 또는 NHEJ에 의해 복구된다. 이 유전자 편집 전략은 일반적으로 HDR을 선호하고 표적외 DNA 부위에서 indel 돌연변이의 빈도를 감소시킨다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제 또는 닉카제는 표적 세포 또는 표적 유기체에 대해 코돈-최적화된다.
특정 구현예는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)　Cas9(SaCas9)를 활용할 수 있다. 특정 구현예는 다음 위치 중 하나 이상에서 돌연변이가 있는 SaCas9를 활용할 수 있다: E782, N968, 및/또는 R1015. 특정 구현예는 다음 위치 중 하나 이상에서 돌연변이가 있는 SaCas9를 활용할 수 있다: E735, E782, K929, N968, A1021, K1044 및/또는 R1015. 일부 구현예에서, 변이체 SaCas9 단백질은 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다: R1015Q, R1015H, E782K, N968K, E735K, K929R, A1021T, 및/또는 K1044N. 일부 구현예에서, 변이체 SaCas9 단백질은 D10A, D556A, H557A, N580A, 예를 들어, D10A/H557A 및/또는 D10A/D556A/H557A/N580A에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 SaCas9 단백질은 E735, E782, K929, N968, R1015, A1021, 및/또는 K1044로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SaCas9 변이체는 다음 돌연변이 세트 중 하나를 포함할 수 있다: E782K/N968K/R1015H(KKH 변이체); E782K/K929R/R1015H(KRH 변이체); 또는 E782K/K929R/N968K/R1015H(KRKH 변이체).
Cpf1에 의해 예시된 클래스 II, V형 CRISPR-Cas 클래스는 Zetsche 등 (2015) Cell 163(3): 759-771에서 식별되었다. Cpf1 뉴클레아제는 특히 프로토스페이서-인접 모티프 또는 PAM으로 알려진 짧은 3 개의 염기 쌍 인식 서열(TTN)에 의해 표적 부위 선택에 추가의 유연성을 제공할 수 있다. Cpf1의 절단 부위는 PAM 서열로부터 적어도 18 bp 떨어져 있다. 더욱이, 끈적한 단부가 있는 엇갈린 DSB는 방향-특이적 공여자 주형 삽입을 허용하며, 이는 비-분할 세포에 유리하다.
특정 구현예는 조작된 Cpf1을 활용할 수 있다. 예를 들어, US 2018/0030425는 표적 특이성이 변경되고 개선된 라크노스피라세 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 및 악시다미노코쿠스 종(Acidaminococcus sp.) BV3L6으로부터 조작된 Cpf1 뉴클레아제를 기재한다. 특정 변이체는 예를 들어, 다음 위치 중 하나 이상에서 돌연변이(즉, 천연 아미노산을 상이한 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글리신, 또는 세린으로 대체)가 있는 아미노산 19-1246을 적어도 포함하는 라크노스피라세 박테리움 ND2006을 포함한다: S202, N274, N278, K290, K367, K532, K609, K915, Q962, K963, K966, K1002, 및/또는 S1003. 특정 Cpf1 변이체는 또한 다음 위치 중 하나 이상에서 돌연변이(즉, 천연 아미노산을 상이한 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글리신, 또는 세린(천연 아미노산이 세린인 경우 제외)으로 대체)가 있는 악시다미노코쿠스 종 BV3L6 Cpf1(AsCpf1)을 포함한다: N178, S186, N278, N282, R301, T315, S376, N515, K523, K524, K603, K965, Q1013, Q1014, 및/또는 K1054.
다른 Cpf1 변이체는 Zetsche 등 (2015) Cell 163: 759-771에 개시된 Cpf1 폴리펩티드 뿐만 아니라 U.S. 2016/0208243에 개시된 Cpf1 폴리펩티드의 Cpf1 상동체 및 오솔로그(ortholog)를 포함한다. 다른 조작된 Cpf1 변이체는 당업자에게 알려져 있고 본 개시내용의 범위 내에 포함된다(예를 들어, WO/2017/184768 참조).
CRISPR-Cas 시스템 및 이의 구성요소에 관한 추가적인 정보는 다음에 기재되어 있다: US 8697359, US 8771945, US 8795965, US 8865406, US 8871445, US 8889356, US 8889418, US 8895308, US 8906616, US 8932814, US 8945839, US 8993233 및 US 8999641 및 이와 관련된 출원; 및 WO2014/018423, WO2014/093595, WO2014/093622, WO2014/093635, WO2014/093655, WO2014/093661, WO2014/093694, WO2014/093701, WO2014/093709, WO2014/093712, WO2014/093718, WO2014/145599, WO2014/204723, WO2014/204724, WO2014/204725, WO2014/204726, WO2014/204727, WO2014/204728, WO2014/204729, WO2015/065964, WO2015/089351, WO2015/089354, WO2015/089364, WO2015/089419, WO2015/089427, WO2015/089462, WO2015/089465, WO2015/089473 및 WO2015/089486, WO2016/205711, WO2017/106657, WO2017/127807 및 이와 관련된 출원.
일부 구현예에서 CRISPR 시스템은 예를 들어, γ-글로빈의 발현을 증가시키기 위해 γ-글로빈을 암호화하는 핵산 서열을 변형시키도록 조작된다. 헤모글로빈의 주요 태아 형태인 헤모글로빈 F(HbF)는 γ-글로빈 폴리펩티드 서브유닛과 α-글로빈 폴리펩티드 서브유닛의 쌍형성에 의해 형성된다. 인간 태아 γ -글로빈 유전자(HBG1 및 HBG2; 진화적 복제에 의해 생성된 2 개의 고도로 상동성인 유전자)는 정상적으로 출생 시 침묵하는 반면, 성인 β-글로빈 유전자 발현(HBB 및 HBD)의 발현은 증가한다. 일생에 걸쳐 태아 γ-글로빈의 지속적인 발현을 야기하거나 또는 허용하는 돌연변이는 β-글로빈 결핍의 표현형을 개선할 수 있다. 따라서, 태아 γ-글로빈 유전자의 재활성화는 특히 β-글로빈 결핍이 있는 대상체에서 치료적으로 유익할 수 있다. γ-글로빈의 발현을 증가시키는 다양한 돌연변이는 당업계에 알려져 있고 본원에 개시되어 있다(예를 들어, Wienert, Trends in Genetics 34(12): 927-940, 2018을 참조하며, γ-글로빈의 발현을 증가시키는 돌연변이와 관련하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 이러한 특정 돌연변이는 HBG1 프로모터 또는 HBG2 프로모터에서 발견된다.
일부 구현예에서, 벡터 또는 게놈은 페이로드가 통합 요소를 포함하는 CRISPR 시스템을 포함하고 CRISPR 시스템의 적어도 하나의 구성요소는 페이로드에 존재하지만 통합 요소의 외부(예를 들어, 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹된 전위성 통합 요소를 포함하는 페이로드 단편의 외부 또는 상동 통합을 위한 상동성 아암을 포함하는 페이로드 단편의 외부)에 있다. 페이로드가 전위성 통합 요소를 포함하는 특정한 특정 구현예에서, 전위성 통합 요소가 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹된 경우, CRISPR 효소 및/또는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 gRNA 중 하나 이상은 전위성 통합 요소의 외부 위치에서 (즉, 내부에 존재하지 않는) 페이로드에 존재한다(즉, 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹된 핵산 서열에 존재하지 않음). 페이로드가 전위성 통합 요소를 포함하는 특정한 특정 구현예에서, 전위성 통합 요소가 상동성 아암에 의해 플랭킹된 경우, CRISPR 효소 및/또는 CRISPR 편집 시스템의 하나 이상의 gRNA 중 하나 이상은 통합 요소의 위부 위치에서 (즉, 내부에 존재하지 않는) 페이로드에 존재한다(즉, 상동성 아암에 의해 플랭킹된 핵산 서열에 존재하지 않음). 이러한 시스템에서, CRISPR 시스템의 발현 및/또는 활성은 일시적이며, 전위성 통합 요소의 전위의 경우 벡터를 파괴하고 전위성 통합 요소의 외부에 위치한 CRISPR 시스템 구성요소 중 하나 이상의 발현을 감소 또는 종결시킬 수 있다. (예를 들어, 전위 또는 상동 재조합에 의한) 통합 요소의 통합은 CRISPR 시스템의 발현 및/또는 활성을 불활성화할 수 있기 때문에 CRISPR 시스템을 포함하는 이러한 벡터는 때때로 "자기-불활성화" CRISPR 시스템 또는 벡터로 지칭될 수 있다. 다양한 구현예에서, 자기-불활성화 CRISPR 시스템은 조합 페이로드에 존재한다.
본 발명자들은 자기-불활성화 CRISPR 시스템 페이로드를 포함하는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, HDAd 아데노바이러스 벡터)가 예를 들어, 다른 CRISPR 시스템 페이로드와 비교하여 유전자 요법(예를 들어, 생체내 유전자 요법)에서 절단 빈도 증가 및/또는 형질도입 및/또는 편집된 표적 세포의 생존 증가(예를 들어, 형질도입 HSPC의 생존 증가)를 초래함을 관찰하였으며, 여기서 CRISPR 시스템은 통합 요소 내에 완전히 있거나 또는 CRISPR 시스템은 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않지만 발현은 벡터 파괴에 의해 불활성화되지 않는다. CRISPR 시스템의 자기-불활성화는 CRISPR 효소 및/또는 gRNA의 발현을 단축시키고, 편집된 세포의 생존을 증가시키고, 장기간 재증식하는 세포의 백분율을 증가시킨다, 일 예를 제공하기 위해, HBG1 및/또는 HGB2의 재활성화를 위한 자기-불활성화 CRISPR 시스템을 포함하고 γ-글로빈의 발현을 위한 핵산 서열을 추가로 포함하는 조합 페이로드를 포함하는 HDAd 벡터를 사용한 유전자 요법은 비-불활성화 CRISPR 시스템 또는 γ-글로빈 단독의 발현을 위한 핵산 서열을 포함하는 HDAd 벡터가 형질도입 수행 후 RBC에서 상당히 더 높은 γ-글로빈을 생성하였다.
본원에는 예를 들어, 자기-불활성화 CRISPR 시스템을 포함하는 공여자 벡터가 통합 요소의 전위를 위한 트랜스포사제를 암호화하는 지지 벡터 또는 게놈과 조합하여 인간 대상체에게 투여되는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 다양한 경우에 공여자 벡터가 지지 벡터의 투여 전에 투여되는 것을 포함하며, 여기서 공여자 벡터의 투여 및 지지 벡터의 투여 사이의 시간 기간은 CRISPR 시스템의 지속기간 및/또는 활성 수준을 조절하는 수단을 제공한다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 예를 들어, 공여자 벡터의 투여 후 일정 기간에 대상체에게 투여될 수 있으며 여기서 일정 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72, 96, 또는 128 시간이다(예를 들어, 여기서 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72 시간의 하한 및 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 96, 또는 128 시간의 상한을 갖는다).
일부 구현예에서, CRISPR 시스템 구성요소를 암호화하는(예를 들어, CRISPR 효소를 암호화하는) 핵산 서열은 CRISPR 발현 및/또는 활성의 microRNA 조절을 위한 microRNA 표적 부위를 포함하도록 조작된다.
I(C)(i)(b)(2). 염기 편집기 페이로드 발현 산물
본 개시내용은 무엇보다도, 염기 편집제 및 이를 암호화하는 핵산을 포함하며, 임의적으로 여기서 염기 편집제 또는 이를 암호화하는 핵산은 아데노바이러스 벡터 또는 게놈과 같은 벡터 또는 게놈에 존재한다. 염기 편집 시스템은 염기 편집 효소 및/또는 적어도 하나의 gRNA를 이의 구성요소로서 포함할 수 있다. 특정한 특정 구현예에서, 본 개시내용의 염기 편집제 및/또는 염기 편집 시스템은 Ad35 또는 Ad5/35 아데노바이러스 벡터에 존재한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용의 염기 편집제 및 이를 암호화하는 핵산 서열이 임의의 맥락 또는 형태, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터가 아닌 벡터, 예를 들어, 플라스미드로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 암호화 염기 편집 시스템은 전형적으로 많은 제한된 용량의 벡터 시스템에 포함하기에 너무 크지만, 아데노바이러스 벡터의 큰 용량은 본 개시내용의 아데노바이러스 벡터 및 게놈에 이러한 서열의 포함을 허용한다. 실제로, 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 아데노바이러스 벡터는 염기 편집 시스템을 암호화하고 하나 이상의 추가적인 코딩 서열을 추가로 암호화하는 페이로드를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 염기 편집기를 암호화하는 페이로드를 사용한 유전자 요법을 위한 본원에 개시된 바와 같은 아데노바이러스 벡터 및 게놈의 추가적인 이점은 Ad35 게놈과 같은 아데노바이러스 게놈이 숙주 세포 게놈 내로 자연적으로 통합되지 않아, 염기 편집 시스템의 일시적 발현을 용이하게 한다는 점이며, 예를 들어, 면역원성 및/또는 유전독성을 피하는 것이 바람직할 수 있다.
염기 편집은 게놈 DNA 또는 세포 RNA 내의 염기 또는 염기 쌍을 상이한 염기 또는 염기 쌍으로 전환함으로써 핵산 서열의 선택적 변형을 지칭한다(Rees & Liu, Nature Reviews Genetics, 19:770-788, 2018). DNA 염기 편집기에는 다음과 같은 2 가지 일반적인 클래스가 있다: (i) 구아닌-사이토신 염기 쌍을 티민-아데닌 염기 쌍으로 전환하는 사이토신 염기 편집기(CBE), 및 (ii) 아데닌-티민 염기 쌍을 구아닌 사이토신 염기 쌍으로 전환하는 아데닌 염기 편집기(ABE). 특정 구현예에서, CRISPR 시스템의 구성요소는 다른 효소 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편과 조합하여 예를 들어, 돌연변이된 핵산에서 하나 이상의 이중-가닥 파괴를 만들거나, 야기하기나, 또는 생성하지 않고 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA에 점 돌연변이와 같은 돌연변이를 직접적으로 설치하거나, 야기하거나, 또는 생성한다. 구성요소의 이러한 특정 조합은 염기 편집기로 알려져 있다.
DNA 염기 편집기는 핵염기 데아미나제 효소에 융합된 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제 및, 일부 경우에 DNA 글리코실라제 억제제를 포함할 수 있다. RNA 염기 편집기는 RNA를 변형시키는 염기를 구성요소로 사용하여 유사한 변화를 달성한다.
DNA에서 표적 유전자좌에 결합 시, 가이드 RNA 및 표적 DNA 가닥 사이에 염기 쌍형성은 단일-가닥 DNA의 작은 분절의 대체로 이어진다. 이 단일-가닥 DNA 버블 내의 DNA 염기는 데아미나제 효소에 의해 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 진핵생물 세포에서의 효율을 개선하기 위해, 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제는 또한 비-편집된 DNA 가닥에서 닉을 생성하여, 세포가 편집된 가닥을 주형으로 사용하여 비-편집된 가닥을 복구하도록 유도한다.
CBE의 경우, CRISPR-기반 편집기는 사이토신 데아미나제를 Cas 닉카제, 예를 들어, Cas9 닉카제(nCas9)와 연결함으로써 생성될 수 있다. 일 예를 피하기 위해, nCas9는 단일 가닥을 절단함으로써 표적 DNA에 닉을 생성하여, 이중-가닥 파괴를 필요로 하는 방법과 비교하여 해로운 indel 형성 가능성을 감소시킬 수 있다. DNA와 결합 후, CBE는 표적 사이토신(C)을 우라실(U) 염기로 탈아미노화한다. 이후에 생성된 U-G 쌍은 원래 C-G 쌍을 T-A로 전환하거나 또는 우라실 글리코실라제에 의해 매개된 염기 절제 복구에 의해 원래 C-G로 역전시키는 세포 불일치 복구 기구에 의해 복구된다. 다양한 구현예에서, 우라실 글리코실라제 억제제(UGI), 예를 들어, 페이로드에 존재하는 UGI의 발현은 2차 결과의 발생을 감소시키고 T-A 염기 쌍 형성의 생성을 증가시킨다.
아데노신 염기 편집기(ABE)의 경우, 아데닌 염기 편집을 위해 DNA 상에서 작용할 수 있는 예시적인 아데노신 데아미나제는 DNA를 기질로서 수용하는 돌연변이체 TadA 아데노신 데아미나제(TadA*)를 포함한다. 이. 콜라이(E. coli) TadA는 전형적으로 동종이량체로서 작용하여 전달 RNA(tRNA)에서 아데노신을 탈아미노화한다. TadA* 데아미나제는 표적 'A'에서 'I'(이노신)으로의 전환을 촉매하며, 이는 세포 폴리머라제에 의해 'G'로 처리된다. 후속적으로, 원래 게놈 A-T 염기 쌍은 G-C 쌍으로 전환될 수 있다. 세포의 이노신 절제 복구는 우라실 절제만큼 활성이 아니므로, ABE는 CBE에서 UGI와 같은 임의의 추가적인 억제제 단백질을 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 전형적인 ABE는 염기 편집 동안 구조적 역할을 할 수 있는 야생형 이. 콜라이 tRNA-특이적 아데노신 데아미나제(TadA) 단량체, 데옥시아데노신 탈아미노화를 촉매하는 TadA* 돌연변이체 TadA 단량체, 및 Cas9(D10A)와 같은 Cas 닉카제를 포함하는 3 개의 구성요소를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, TadA 및 TadA* 사이에 위치한 링커가 있고, 특정 구현예에서 TadA* 및 Cas 닉카제 사이에 위치한 링커가 있다. 다양한 구현예에서, 하나 또는 두 링커는 적어도 6 개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개의 아미노산(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15 개, 아미노산의 하한 및 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개 아미노산의 상한을 가짐)을 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 또는 두 링커는 32 개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 또는 두 링커는 (SGGS)2-XTEN-(SGGS)2에 따른 서열, 또는 당업자에게 달리 알려진 서열을 갖는다.
염기 편집기는 하나의 염기 또는 염기 쌍을 또 다른 것으로 직접적으로 전환할 수 있으며, 삽입 및 결실(indel)과 같은 과도한 원치않은 편집 부산물을 생성하지 않고 비-분할 세포에서 점 돌연변이의 효율적인 설치를 가능하게 한다. 예를 들어, 염기 편집기는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만의 indel을 생성할 수 있다.
DNA 염기 편집기는 이러한 점 돌연변이를 이중 가닥 파괴를 생성하지 않고 비-분할 세포에 삽입할 수 있다. 이중 가닥 파괴의 결여로 인해, 염기 편집기는 삽입 및 결실(indel)과 같은 과도한 원치않은 편집 부산물을 초래하지 않는다. 예를 들어, 염기 편집기는 이중 가닥 파괴에 의존하는 기술과 비교하여 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만의 indel을 생성할 수 있다.
대부분의 염기-편집 시스템의 구성요소는 (1) 표적화된 DNA 결합 단백질, (2) 핵염기 데아미나제 효소, 및 (3) DNA 글리코실라제 억제제를 포함한다.
CRISPR 시스템의 임의의 뉴클레아제는 기능상실되고 염기 편집 시스템 내에서 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 뉴클레아제는 Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csnl 및 Csxl2로도 알려짐), CaslO, Cpfl, C2c3, C2c2 및 C2clCsyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Cpfl, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 및 이의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예는 뉴클레아제-불활성 Cas9(dCas9)를 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제로서 활용한다. 그러나, CRISPR 시스템의 임의의 뉴클레아제(이 중 많은 것이 상기 기재됨)는 기능상실되고 염기 편집 시스템 내에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 고충실도의 Cas9 도메인이 선택되며 여기서 Cas9 도메인은 야생형 Cas9 도메인과 비교하여, Cas9 도메인 및 DNA의 당-포스페이트 백본 사이에 감소된 정전기적 상호작용을 나타낸다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인(예를 들어, 야생형 Cas9 도메인)은 Cas9 도메인 및 DNA의 당-포스페이트 백본 사이의 회합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 고충실도의 Cas9 도메인은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 고충실도의 Cas9 도메인은 Kleinstiver, 등, Nature 529, 490-495, 2016; 및 Slaymaker 등, Science 351, 84-88, 2015에 기재되었다.
다른 유전자-편집 시스템의 뉴클레아제가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 염기-편집 시스템은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)(Urnov 등, Nat Rev Genet., 11(9):636-46, 2010) 및 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)(Joung 등, Nat Rev Mol Cell Biol. 14(1):49-55, 2013)를 활용할 수 있다. DNA-결합 뉴클레아제에 관한 추가적인 정보를 위해, US2018/0312825A1을 참조한다.
특정 구현예에서, 핵염기 데아미나제 효소는 사이티딘 데아미나제 도메인 또는 아데닌 데아미나제 도메인을 포함한다.
특정 구현예는 사이티딘 데아미나제 도메인을 핵염기 데아미나제 효소로서 활용한다. 특정 구현예는 아데닌 데아미나제 도메인을 핵염기 데아미나제 효소로서 활용한다. 추가로, 특정 구현예는 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)를 글리코실라제 억제제로서 활용한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, dCas9 또는 Cas9 닉카제는 사이티딘 데아미나제 도메인에 융합될 수 있다. 사이티딘 데아미나제 도메인에 융합된 dCas9 또는 Cas9 닉카제는 하나 이상의 UGI 도메인에 융합될 수 있다. 하나 초과의 UGI 도메인이 있는 염기 편집기는 indel을 덜 생성하고 표적 핵산을 더 효율적으로 탈아미노화할 수 있다.
특정 구현예에서, 데아미나제 도메인(사이티딘 및/또는 아데닌)은 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제의 N-말단에 융합된다. 이는 Cas9의 N-말단에 융합된 사이티딘 데아미나제 도메인이 다른 구성과 비교하여 염기-편집 효율이 개선될 수 있기 때문이다. 이러한 구현예에서, 글리코실라제 억제제(예를 들어, UGI 도메인)는 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제의 C-말단에 융합될 수 있다. 다중 글리코실라제 억제제가 사용될 때, 각각은 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제의 C-말단에 융합될 수 있다.
특정 구현예에서, 사이티딘 데아미나제 도메인을 활용하는 CBE는 우라실을 생성하기 위해 사이토신의 외환식 아민을 탈아미노화함으로써 구아닌-사이토신 염기 쌍을 티민-아데닌 염기 쌍으로 전환한다. 사이토신 데아미나제 효소의 예는 APOBEC1, APOBEC3A, APOBEC3G, CDA1, 및 AID를 포함한다. APOBEC1은 특히 단일 가닥 (ss)DNA를 기질로서 수용하지만 이중 가닥 (ds)DNA 상에서 작용할 수 없다.
대부분의 염기-편집 시스템은 또한 의도된 염기 편집을 달리 복구할 수 있는 천연 DNA 복구 메커니즘을 중단시키는 역할을 하는 DNA 글리코실라제 억제제를 포함한다. 특정 구현예에서, DNA 글리코실라제 억제제는 Wang 등(Gene 99, 31-37, 1991)에 기재된 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 단백질 (UGI)과 같은 우라실 글리코실라제 억제제를 포함한다.
염기 편집기의 구성요소는 직접적으로(예를 들어, 직접 공유 결합에 의해) 또는 링커를 통해 융합될 수 있다. 예를 들어, 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제는 링커를 통해 데아미나제 효소 및/또는 글리코실라제 억제제에 융합될 수 있다. 다중 글리코실라제 억제제는 또한 링커를 통해 융합될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 링커는 임의의 펩티드 또는 이의 부분을 연결하는 데 사용될 수 있다.
예시적인 링커는 중합체성 링커(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르); 아미노산 링커; 탄소-질소 결합 아미드 링커; 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커; 단량체성, 이량체성, 또는 중합체성 아미노알칸산 링커; 아미노알칸산(예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, β-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산) 링커; 단량체성, 이량체성, 또는 중합체성 아미노헥산산(Ahx) 링커; 탄소환형 모이어티(예를 들어, 사이클로펜탄, 사이클로헥산) 링커; 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티 링커; 및 페닐 고리 링커를 포함한다.
링커는 또한 펩티드에서 링커까지 친핵체(예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하는 기능화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체가 링커의 일부로 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클(Michael) 수용체, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
특정 구현예에서, 링커는 4-100 개의 아미노산 범위의 길이이다. 특정 구현예에서, 링커는 4 개의 아미노산, 9 개의 아미노산, 14 개의 아미노산, 16 개의 아미노산, 32 개의 아미노산, 또는 100 개의 아미노산이다.
표적화된 DNA 결합 단백질을 사이티딘 데아미나제 효소 및 DNA 글리코실라제 억제제(예를 들어, UGI)와 연결함으로써 형성된 수많은 염기-편집(BE) 시스템이 기재되었다. 이러한 복합체는 예를 들어, BE1([APOBEC1-16 아미노산(aa) 링커-Sp dCas9(D10A, H840A)] Komer 등, Nature, 533, 420-424, 2016), BE2([APOBEC1-16aa 링커-Sp dCas9(D10A, H840A)-4aa 링커-UGI] 상기 Komer 등, 2016), BE3([APOBEC1-16aa 링커-Sp nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] 상기 Komer 등,), HF-BE3([APOBEC1-16aa 링커-HF nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] Rees 등, Nat. Comm un. 8, 15790, 2017), BE4, BE4max([APOBEC1-32aa 링커-Sp nCas9(D10A)-9aa 링커-UGI-9aa 링커-UGI] Koblan 등, Nat. Biotechnol 10.1038/nbt.4172, 2018; Komer 등, Sci. Adv., 3, eaao4774, 2017), BE4-GAM([Gam-16aa 링커-APOBEC1-32aa 링커-Sp nCas9(D10A)-9aa 링커-UGI-9aa 링커-UGI] 상기 Komer 등, 2017), YE1-BE3([APOBEC1(W90Y, R126E)-16aa 링커-Sp nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] Kim 등, Nat. Biotechnol. 35, 475-480, 2017), EE-BE3([APOBEC1(R126E, R132E)-16aa 링커-Sp nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] 상기 Kim 등, 2017), YE2-BE3([APOBEC1(W90Y, R132E)-16aa 링커-Sp nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] 상기 Kim 등, 2017), YEE-BE3([APOBEC1(W90Y, R126E, R132E)-16aa 링커-Sp nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] 상기 Kim 등, 2017), VQR-BE3([APOBEC1-16aa 링커-Sp VQR nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] 상기 Kim 등, 2017), VRER-BE3([APOBEC1-16aa 링커-Sp VRER nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] Kim 등, Nat. Biotechnol. 35, 475-480, 2017), Sa-BE3([APOBEC1-16aa 링커-Sa nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] 상기 Kim 등, 2017), SA-BE4([APOBEC1-32aa 링커-Sa nCas9(D10A)-9aa 링커-UGI-9aa 링커-UGI] 상기 Komer 등, 2017), SaBE4-Gam([Gam-16aa 링커-APOBEC1-32aa 링커-Sa nCas9(D10A)-9aa 링커-UGI-9aa 링커-UGI] 상기 Komer 등, 2017), SaKKH-BE3([APOBEC1-16aa 링커-Sa KKH nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] 상기 Kim 등, 2017), Cas12a-BE([APOBEC1-16aa 링커-dCas12a-14aa 링커-UGI], Li 등, Nat. Biotechnol. 36, 324-327, 2018), 표적-AID([Sp nCas9(D10A)-100aa 링커-CDA1-9aa 링커-UGI] Nishida 등, Science, 353, 10.1126/science.aaf8729, 2016), 표적-AID-NG([Sp nCas9(D10A)-NG-100aa 링커-CDA1-9aa 링커-UGI] Nishimasu 등, Science, 361(6408): 1259-1262, 2018), xBE3([APOBEC1-16aa 링커-xCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] Hu 등, Nature, 556, 57-63, 2018), eA3A-BE3([APOBEC3A(N37G)-16aa 링커-Sp nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] Gerkhe 등, Nat. Biotechnol., 10.1038/nbt.4199, 2018), A3A-BE3([hAPOBEC3A-16aa 링커-Sp nCas9(D10A)-4aa 링커-UGI] Wang 등, Nat. Biotechnol. 10.1038/nbt.4198, 2018), 및 BE-PLUS([10X GCN4-Sp nCas9(D10A) / ScFv-rAPOBEC1-UGI] Jiang 등, Cell. Res, 10.1038/s41422-018-0052-4, 2018)를 포함한다. 아데닌 데아미나제 염기 편집기를 포함하는 BE 복합체의 추가적인 예를 위해, Rees & Liu Nat. Rev Genet. 19(12): 770-788, 2018 참조.
염기 편집기에 관한 추가적인 정보를 위해, US2018/0312825A1, WO2018/165629A, Urnov 등, Nat Rev Genet. 11(9):636-46, 2010; Joung 등, Nat Rev Mol Cell Biol. 14(1):49-55, 2013; Charpentier 등, Nature.; 495(7439):50-1, 2013; Seo & Kim, Nature Medicine, 24,　1493-1495, 2018, 및 Rees & Liu, Nature Reviews Genetics, 19, 770-78, 2018을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함되고 염기 편집기에 대해 특이적이다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서 사용될 수 있는 특정 염기 편집기 작제물은 Zafra 등, Nat Biotech, 36(9):888-893, 2018, 및 Koblan 등, Nat Biotech 36(9):843-846, 2018에 기재되어 있으며, 이들 각각은 염기 편집기 작제물과 특이적으로 관련하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서 염기 편집기 시스템은 예를 들어, γ-글로빈의 발현을 증가시키기 위해 γ-글로빈을 암호화하는 핵산 서열을 변형시키도록 조작된다. 헤모글로빈의 주요 태아 형태인 헤모글로빈 F(HbF)는 γ-글로빈 폴리펩티드와 α-글로빈 폴리펩티드의 쌍형성에 의해 형성된다. 인간 태아 γ -글로빈 유전자(HBG1 및 HBG2; 진화적 복제에 의해 생성된 2 개의 고도로 상동성인 유전자)는 정상적으로 출생 시 침묵하는 반면, 성인 β-글로빈 유전자 발현(HBB 및 HBD)의 발현은 증가하다. 일생에 걸쳐 태아 γ-글로빈의 발현을 야기하거나 또는 허용하는 돌연변이는 β-글로빈 결칩의 표현형을 개선할 수 있다. 따라서, 태아 γ-글로빈 유전자의 재활성화는 특히 β-글로빈 결핍이 있는 대상체에서 치료적으로 유익할 수 있다. γ-글로빈의 발현을 증가시키는 다양한 돌연변이는 당업계에 알려져 있고 본원에 개시되어 있다(예를 들어, Wienert Trends in Genetics 34(12): 927-940, 2018을 참조하며, γ-글로빈의 발현을 증가시키는 돌연변이와 관련하여 이의 전문이 본원에 참조로 포함되고). 이러한 특정 돌연변이는 HBG1 프로모터 또는 HBG2 프로모터에서 발견된다.
일부 구현예에서, 벡터 또는 게놈은 페이로드가 통합 요소를 포함하고 염기 편집 시스템의 적어도 하나의 구성요소가 페이로드에 존재하지만 통합 요소의 외부(예를 들어, 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹된 전위성 통합 요소를 포함하는 페이로드 단편의 외부 또는 상동 통합을 위한 상동성 아암을 포함하는 페이로드 단편의 외부)에 존재하는 염기 편집 시스템을 포함한다. 페이로드가 전위성 통합 요소를 포함하는 특정한 특정 구현예에서, 전위성 통합 요소가 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹된 경우, 염기 편집 효소 및/또는 염기 편집 시스템의 하나 이상의 gRNA 중 하나 이상은 전위성 통합 요소의 외부의 위치(즉, 내부에 존재하지 않음)에서 페이로드에 존재한다(즉, 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹된 핵산 서열에 존재하지 않음). 페이로드가 전위성 통합 요소를 포함하는 특정한 특정 구현예에서, 전위성 통합 요소가 상동성 아암에 의해 플랭킹된 경우, 염기 편집 효소 및/또는 염기 편집 시스템의 하나 이상의 gRNA 중 하나 이상은 통합 요소의 외부 위치(즉, 내부에 존재하지 않음)에서 페이로드에 존재한다(즉, 상동성 아암에 의해 플랭킹된 핵산 서열에 존재하지 않음). 이러한 시스템에서, 염기 편집 시스템의 발현 및/또는 활성은 일시적이며, 전위성 통합 요소의 해당 전위에서 벡터를 파괴하고 전위성 통합 요소의 외부에 위치한 염기 편집 시스템 구성요소 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 또는 종결시킬 수 있다. (예를 들어, 전위 또는 상동 재조합에 의한) 통합 요소의 통합은 염기 편집 시스템의 발현 및/또는 활성을 불활성화할 수 있기 때문에 염기 편집 시스템을 포함하는 이러한 벡터는 때때로 "자기-불활성화" 염기 편집 시스템 또는 벡터로 지칭될 수 있다. 다양한 구현예에서, 자기-불활성화 염기 편집 시스템은 조합 페이로드에 존재한다.
본 개시내용은 자기-불활성화 염기 편집 시스템 페이로드를 포함하는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, HDAd 아데노바이러스 벡터)가 다른 염기 편집 시스템 페이로드와 비교하여 예를 들어, 유전자 요법(예를 들어, 생체내 유전자 요법)에서 증가된 절단 빈도 및/또는 형질도입 및/또는 편집된 표적 세포의 증가된 생존(예를 들어, 형질도입 HSPC의 증가된 생존)을 생성할 수 있음을 포함하며, 여기서 염기 편집 시스템은 통합 요소 내에 완전히 있거나 또는 염기 편집 시스템은 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않지만 발현은 벡터 파괴에 의해 불활성화되지 않는다. 염기 편집 시스템의 자기-불활성화는 염기 편집기 효소 및/또는 gRNA의 발현을 단축시키고, 편집된 세포의 생존을 증가시키고, 장기간 재증식하는 세포의 백분율을 증가시킨다, 예를 들어, HBG1 및/또는 HBG2의 재활성화를 위한 자기-불활성화 염기 편집 시스템을 포함하고 γ-글로빈의 발현을 위한 핵산 서열을 추가로 포함하는 조합 페이로드를 포함하는 HDAd 벡터를 사용한 유전자 요법은 비-불활성화 염기 편집 시스템 또는 γ-글로빈 단독의 발현을 위한 핵산 서열을 포함하는 해당 HDAd 벡터를 형질도입한 후 RBC에서 상당히 더 높은 γ-글로빈을 생성할 수 있다.
본원에는 자기-불활성화 염기 편집 시스템을 포함하는 공여자 벡터를 예를 들어, 통합 요소의 전위를 위한 트랜스포사제를 암호화하는 지지 벡터 또는 게놈과 조합하여 인간 대상체에게 투여하는 방법이 추가로 제공된다. 본 개시내용은 다양한 경우에 공여자 벡터가 지지 벡터의 투여 전에 투여되는 것을 포함하며, 여기서 공여자 벡터의 투여 및 지지 벡터의 투여 사이의 시간 기간은 염기 편집 시스템의 지속기간 및/또는 활성 수준을 조절하는 수단을 제공한다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 예를 들어, 공여자 벡터의 투여 후 일정 기간에 대상체에게 투여될 수 있으며 여기서 일정 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72, 96, 또는 128 시간이다(예를 들어, 여기서 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72 시간의 하한 및 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 96, 또는 128 시간의 상한을 갖는다).
일부 구현예에서, 염기 편집 시스템 구성요소를 암호화하는(예를 들어, 염기 편집 효소를 암호화하는) 핵산 서열은 염기 편집기 발현 및/또는 활성의 microRNA 조절을 위한 microRNA 표적 부위를 포함하도록 조작된다.
본 개시내용은 ABE 시스템의 활용 시 문제를 추가로 인식하고 해결하였다. 본 개시내용은 염기 편집기 TadA 및 TadA* 서열의 반복성 및/또는 서열 유사성이 예를 들어, 생체내 유전자 요법을 위해 암호화된 염기 편집 시스템의 발현 및/또는 활성에 대한 이러한 벡터의 효능을 감소시키는 상동 재조합을 초래하 수 있다는 인식을 포함한다. 본 발명자들이 아는 한, 본 개시내용은 예를 들어, 생체내 유전자 요법에서 관찰된 바와 같이 이 문제의 최초 인식을 나타낸다. 문제를 해결하기 위해, TadA 및/또는 TadA*를 변형시켜 유사한 서열 사이에 감소된 상동성을 달성하였다. 다양한 구현예에서, TadA 및 TadA*를 암호화하는 핵산 서열의 5 개의 상응하는 코돈은 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖도록 조작되며, 임의적으로 여기서 조작은 TadA 또는 TadA* 뉴클레오티드 서열에서 초기 코돈 서열을 관련 시스템, 예를 들어, 인간에서 코돈 용법에 따라 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈 서열로 대체하는 것을 포함한다. 다양한 구현예에서, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개의 코돈은 TadA 및 TadA*를 각각 암호화하는 핵산 서열 사이에서 상이하도록 조작된다. 예시적인 조작된 서열은 도 132c에 제시되어 있다.
다양한 구현예에서, ABE는 다음 TadA 및 TadA* 서열에 대해 적어도 하나의 서열 변형을 포함하는 TadA 및 TadA* 서열을 포함하며, 이는 예를 들어, ABE를 암호화하는 서열에서 링커에 의해 직접적으로 융합되거나 또는 분리될 수 있다. 다양한 구현예에서 TadA 서열은 하기 TadA 서열과 적어도 80% 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)을 갖는 서열이며 본원에 제공된 임의의 또는 모든 TadA 변형을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서 TadA* 서열은 하기 TadA* 서열과 적어도 80% 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)을 갖는 서열이며 본원에 제공된 임의의 또는 모든 TadA* 변형을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서 본 개시내용의 TadA 및/또는 TadA* 서열은 32 개의 아미노산 링커와 같은 링커를 포함하거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 하기 제공된 TadA 및/또는 TadA* 서열을 포함하는 것들을 포함하는 다양한 서열 및 구현예에서, 서열은 32 개의 아미노산 링커를 암호화하는 96 개의 뉴클레오티드의 3' 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서 TadA 서열은 하기 TadA 서열의 뉴클레오티드 1-498(96 개의 3' 뉴클레오티드 제외)과 적어도 80% 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)을 갖는 서열이며 본원에 제공된 임의의 또는 모든 상응하는 TadA 변형을 포함할 수 있다. 또한 따라서, 다양한 구현예에서 TadA* 서열은 하기 TadA* 서열의 뉴클레오티드 1-498(96 개의 3' 뉴클레오티드 제외)와 적어도 80% 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)을 갖는 서열이며 본원에 제공된 임의의 또는 모든 상응하는 TadA* 변형을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, ABE의 TadA 및/또는 TadA*의 서열은 TadA 및 TadA* 사이(또는 예를 들어, 뉴클레오티드 1 내지 579 또는 1 내지 498을 포함하는 이의 정렬된 부분)의 퍼센트 동일성을 80% 미만(예를 들어, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 또는 40% 미만, 또는 60% 내지 80%, 65% 내지 80%, 70%, 내지 80%, 75% 내지 80%, 60% 내지 75%, 65% 내지 75%, 70% 내지 75%, 60% 내지 70%, 또는 65% 내지 70%인 퍼센트 동일성)으로 감소시키도록 조작된다. 다른 것에 의해 생성된 pCMV-ABEmax 플라스미드(Addgene #112095)에서, 81.6%의 동일성을 갖는 2 개의 594　bp TadA+32aa 반복부 사이에 109　bp 불일치가 있다. 다양한 본 구현예에서 TadA 및/또는 TadA* 변형을 위한 부위는 하기 서열에서 밑줄로 표시되고 하기 표에 기재된 것들을 포함한다. 다양한 구현예에서, TadA* 서열은 TadA* 변형 표(표 11)에 제시된 것들에 상응하는 하나 이상, 또는 모든 변형을 포함한다. 다양한 구현예에서, TadA 서열은 TadA 변형 표(표 10)에 제시된 하나 이상, 또는 모든 변형을 포함하고 TadA* 서열은 TadA* 변형 표(표 11)에 제시된 것들에 상응하는 하나 이상, 또는 모든 변형을 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, TadA 서열은 TadA 변형 표(표 10; 서열번호: 280 참조)에 제시된 것들에 상응하는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 변형(예를 들어, 1 내지 5, 5 내지 10, 5 내지 20, 5 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 25, 15 내지 20, 15 내지 25, 또는 20 내지 25 개의 변형)을 포함하고 TadA* 서열은 TadA* 변형 표(표 11; 서열번호: 281 참조)에 제시된 것들에 상응하는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 개의 변형(예를 들어, 1 내지 5, 5 내지 10, 5 내지 16, 또는 10 내지 16 개의 변형)을 포함한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 감소된-동일성 TadA 및 TadA* 서열은 생체내 및 생체외 유전적 조작을 포함하나 이에 제한되지 않는 유전적 조작 분야에서 일반적인 유용성을 갖는다. 감소된 동일성을 갖도록 조작된 TadA 및 TadA* 서열은 또한 예를 들어, 생체내 유전자 요법을 위해 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 페이로드), 예를 들어, Ad35, Ad35++, HDAd35, 또는 HDAd35++ 공여자 벡터 또는 공여자 게놈과 같은 아데노바이러스 벡터 또는 게놈에 포함된다.
표 10: TadA 변형 표
Figure pct00013
표 11: TadA* 변형 표
Figure pct00014
당업자는 TadA 서열 및 TadA* 서열을 포함하는 ABE에 존재하는 TadA 변형 표 및/또는 TadA* 변형 표의 것들에 상응하는 다수의 변형이 적어도 TadA 및 TadA* 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 감소가 임의의 특정 변형을 필요로 하지 않지만 오히려 TadA 및 TadA* 서열 사이의 동일성의 전반적인 변화를 필요로 하는 식별된 문제에 대한 해결책인 한, 선택된 특정 변형의 고려 없이 유의할 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 따라서, 본 개시내용은 예시적인 변형을 제공하지만, 임의의 특정 변형의 포함 또는 제외는 본원에 제시된 해결책에 중요하지 않다. 따라서 본 개시내용은 TadA 및 TadA* 변형 표에 제시된 하나 이상의 변형을 포함하고 80% 미만(예를 들어, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 또는 40% 미만)인 TadA 및 TadA* 사이(또는 예를 들어, 뉴클레오티드 1 내지 579를 포함하는 이의 정렬된 부분)의 퍼센트 동일성을 갖는 TadA 및 TadA*의 감소된-동일성 서열을 포함한다.
의심의 여지를 피하기 위해, 제공된 서열은 하기 TadA 및 TadA* 서열의 상응하는 뉴클레오티드 위치에 대한 비교에 의해 본원에 제공된 임의의 TadA 또는 TadA* 서열 변형을 포함하거나 또는 포함하지 않는 것으로 식별될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 임의의 TadA 또는 TadA* 서열 변형의 존재 또는 부재의 결정은 임의의 제공된 서열의 기원 또는 이력에 의존하지 않고 서열 그 자체로부터 단독으로 결정될 수 있다.
당업자는 본 개시내용의 ABE 시스템, 뿐만 아니라 이의 TadA 및 TadA* 서열이 본 명세서에 제시된 본 맥락 또는 임의의 다른 맥락으로 제한되지 않는, 예를 들어, 특정 벡터, 혈청형, 또는 다른 맥락에서 사용하는 것으로 제한되지 않는 일반적인 유용성의 기여를 나타냄을 이해할 것이다. 실제로, 본 개시내용의 서열은 염기 편집 구성요소를 암호화하거나 또는 포함할 수 있는 임의의 실험 시스템에서 생체내, 시험관내, 또는 생체외에서 사용될 수 있다. 서열은 다양한 분자 생물학 적용에서 도구로서 유용하다.
I(C)(i)(c). 작은 RNA 페이로드 발현 산물
작은 RNA는 유전자 발현을 조절하는 데 있어서 역할을 하는 짧은 비-코딩 RNA 분자이다. 특정 구현예에서, 작은 RNA는 200 개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구현예에서, 작은 RNA는 100 개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구현예에서, 작은 RNA는 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20 개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구현예에서, 작은 RNA는 20 개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 다양한 구현예에서 작은 RNA는 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30 개 뉴클레오티드의 하한 및 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 또는 100 개 뉴클레오티드의 상한을 갖는 길이를 갖는다. 작은 RNA는 microRNA(miRNA, Piwi-상호작용 RNA(piRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA), tRNA-유래 작은 RNA(tsRNA) 작은 rDNA-유래 RNA(srRNA), 및 작은 핵 RNA를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 작은 RNA의 추가적인 클래스는 계속 발견되고 있다.
특정 구현예에서, 표적 mRNA에 상동성이거나 또는 간섭 RNA가 혼성화할 수 있는 간섭 RNA 분자는 RNA 간섭(RNAi)으로 지칭되는 과정인 표적 mRNA 분자의 분해 또는 표적 mRNA의 감소된 번역을 야기할 수 있다(Carthew, Curr. Opin. Cell. Biol. 13: 244-248, 2001). RNAi는 외래 RNA(예를 들어, 바이러스 RNA)를 제거하기 위해 자연적으로 세포에서 발생한다. 일부 경우에, 천연 RNAi는 분해 메커니즘을 다른 유사한 RNA 서열로 지시하는 유리 이중 가닥 RNA(dsRNA)로부터 절단된 단편을 통해 진행된다. 대안적으로, RNAi는 예를 들어, 표적 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 제조될 수 있다. 예시적인 RNAi 분자는 작은 헤어핀 RNA(shRNA, 또한 짧은 헤어핀 RNA로도 지칭됨) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다.
본 개시내용을 제한하지 않고, 이론에 의해 얽매이지 않고, 자연 및/또는 일부 구현예에서 RNA 간섭은 전형적으로 2-단계 과정이다. 첫번째 단계인 개시 단계에서, 유입 dsRNA는 아마도 dsRNA-특이적 리보뉴클레아제의 리보뉴클레아제(RNase) III 패밀리의 구성원인 Dicer의 작용에 의해 21-23 개 뉴클레오티드(nt) siRNA로 소화되며, 이는 ATP-의존적 방식으로 (직접적으로 또는 이식유전자 또는 바이러스를 통해 도입된) dsRNA를 처리한다(절단한다). 성공적인 절단 사건은 RNA를 19-21 개 염기 쌍(bp) 이중체(siRNA)로 분해하며, 각각은 2-뉴클레오티드 3' 돌출부를 갖는다(Hutvagner & Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232, 2002; Bernstein, Nature 409:363-366, 2001).
두번째 단계인 효과기 단계에서, siRNA 이중체는 뉴클레아제 복합체에 결합되어 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)를 형성한다. RISC의 활성화를 위해 siRNA 이중체의 ATP-의존적 풀림이 요구된다. 그런 다음 활성 RISC는 염기 쌍형성 상호작용에 의해 상동 전사체를 표적화하고 전형적으로 mRNA를 siRNA의 3' 말단으로부터 12 개의 뉴클레오티드 단편으로 절단한다(Hutvagner & Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232, 2002; Hammond 등, Nat. Rev. Gen. 2:110-119, 2001; Sharp, Genes. Dev. 15:485-490, 2001). 연구는 각 RISC가 단일 siRNA 및 RNase를 함유함을 나타낸다(Hutvagner & Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232, 2002).
RNAi의 현저한 효력으로 인해, RNAi 경로 내에서 증폭 단계가 제안되었다. 증폭은 더 많은 siRNA를 생성하는 유입 dsRNA의 카피에 의해, 또는 형성된 siRNA의 복제에 의해 발생할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 증폭은 RISC의 다중 전환 사건에 의해 실행될 수 있다(Hutvagner & Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232, 2002; Hammond 등, Nat. Rev. Gen. 2:110-119, 2001; Sharp, Genes. Dev. 15:485-490, 2001). 또한 RNAi는 Tuschl(Chem. Biochem. 2: 239-245, 2001); Cullen(Nat. Immunol. 3:597-599, 2002); 및 Brantl(Biochem. Biophys. Act. 1575:15-25, 2002)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 함께 사용하기에 적합한 RNAi 분자의 합성은 다음과 같이 수행될 수 있다. 첫째로, mRNA 서열은 표적화된 이식유전자의 시작 코돈의 하류에서 스캐닝될 수 있다. 각 AA 및 3' 인접 19 개 뉴클레오티드의 발생은 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 기록된다. 특정 구현예에서, siRNA 표적 부위는 비번역된 영역(UTR)이 조절 단백질 결합 부위에 더 풍부할 때, 오픈 리딩 프레임으로부터 선택될 수 있다. UTR-결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체는 siRNA 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 방해할 수 있다(Tuschl, Chem. Biochem. 2: 239-245, 2001). 비번역된 영역에서 지시된 siRNA는 또한 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)에 대해 입증된 바와 같이, 효과적일 수 있음이 이해될 것이며, 여기서5' UTR에서 지시된 siRNA는 세포 GAPDH mRNA에서 90% 감소를 매개하고 단백질 수준을 완전히 폐지하였다. 둘째로, 잠재적인 표적 부위는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)(NCBI) 서버에서 이용가능한 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 소프트웨어와 같은 임의의 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여 적절한 게놈 데이터베이스와 비교될 수 있다. 다른 코딩 서열과 상당한 상동성을 나타내는 추정 표적 부위가 필터링될 수 있다.
적격한 표적 서열이 siRNA 합성을 위한 주형으로 선택될 수 있다. 선택된 서열은 G/C 함량이 55% 초과인 것과 비교하여 유전자 침묵을 매개하는 데 더 효과적인 것으로 제시되었을 때 G/C 함량이 낮은 것들을 포함할 수 있다. 여러 표적 부위가 평가를 위한 표적 유전자의 길이에 따라 선택될 수 있다. 선택된 siRNA의 더 나은 평가를 위해, 음성 대조군이 사용될 수 있다. 음성 대조군 siRNA는 siRNA와 동일한 뉴클레오티드 조성물을 포함할 수 있지만 게놈에 대한 상동성이 상당히 결여되어 있다. 따라서, 다른 유전자와 임의의 상당한 상동성을 나타내지 않으면, siRNA의 스크램블된 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
센스 가닥은 선택된 부분의 서열을 기반으로 설계될 수 있다. 안티센스 가닥은 일상적으로 센스 가닥과 동일한 길이이며 상보적 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 가닥은 정렬되거나 또는 어닐링될 때 완전히 상보적이고 말단이 뭉툭해진다. 다른 구현예에서, 가닥은 1-, 2- 또는 3-뉴클레오티드 돌출부가 생성되도록, 즉, 센스 가닥의 3' 단부가 안티센스 가닥의 5' 단부보다 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드를 추가로 확장하고/하거나 안티센스 가닥의 3' 단부가 센스 가닥의 5' 단부보다 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드를 추가로 확장하도록 정렬 또는 어닐링된다. 돌출부는 표적 유전자 서열(또는 이의 보체)에 상응하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 돌출부는 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시티민(dT), 또는 뉴클레오티드 유사체, 또는 다른 적합한 비-뉴클레오티드 물질을 포함할 수 있다.
안티센스 가닥의 RISC로의 진입을 용이하게 하기 위해(따라서 표적 절단 및 침묵의 효율을 증가시키거나 또는 개선하기 위해), 센스 가닥의 5' 단부 및 안티센스 가닥의 3' 단부 사이의 염기 쌍 강도는 변경, 예를 들어, 줄어들거나 또는 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 염기 쌍 강도는 제1 또는 안티센스 가닥의 3' 단부 및 제2 또는 센스 가닥의 5' 단부 사이 보다 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 단부 및 제2 또는 센스 가닥의 3' 단부 사이의 더 적은 G:C 염기 쌍으로 인해 더 적다. 특정 구현예에서, 염기 쌍 강도는 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 단부 및 제2 또는 센스 가닥의 3' 단부 사이의 적어도 하나의 불일치된 염기 쌍으로 인해 더 적다. 바람직하게는, 불일치된 염기 쌍은 G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C 및 U:U를 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 염기 쌍 강도는 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 단부 및 제2 또는 센스 가닥의 3' 단부 사이의 적어도 하나의 워블(wobble) 염기 쌍, 예를 들어, G:U로 인해 더 적다. 또 다른 구현예에서, 염기 쌍 강도는 드문 뉴클레오티드, 예를 들어, 이노신(I)을 포함하는 적어도 하나의 염기 쌍으로 인해 더 적다. 특정 구현예에서, 염기 쌍은 I:A, I:U 및 I:C를 포함하는 군으로부터 선택된다. 또한 또 다른 구현예에서, 염기 쌍 강도는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 염기 쌍으로 인해 더 적다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 예를 들어, 2-아미노-G, 2-아미노-A, 2,6-디아미노-G, 및 2,6-디아미노-A로부터 선택된다.
ShRNA는 헤어핀 루프 구조를 갖는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 영역에서 하나의 가닥의 3' 단부 및 이중-가닥 영역에서 다른 가닥의 5' 단부를 연결하는 루프 분절을 갖는다. 이중-가닥 영역은 표적 서열에 혼성화가능한 제1 서열, 예컨대 이식유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 제1 서열에 상보적인 제2 서열로부터 형성되며, 따라서 제1 및 제2 서열은 연결 서열이 단부를 연결하여 헤어핀 루프 구조를 형성하는 이중 가닥 영역을 형성한다. 제1 서열은 이식유전자를 암호화는 폴리뉴클레오티드의 임의의 부분에 혼성화가능할 수 있다. shRNA의 이중 가닥 줄기 도메인은 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함할 수 있다.
shRNA의 전사는 폴리머라제 III(Pol III) 프로모터에서 개시되어 4-5-티민 전사 종결 부위의 위치 2에서 종결되는 것으로 생각된다. 발현 시, shRNA는 3' UU-돌출부가 있는 줄기-루프 구조로 접히는 것으로 생각되며; 후속적으로, 이러한 shRNA의 단부가 처리되어, shRNA를 21-23 개 뉴클레오티드의 siRNA-유사 분자로 전환시킨다(Brummelkamp 등, Science. 296(5567):550-553, 2002; Lee 등, Nature Biotechnol. 20(5):500-505, 2002; Miyagishi & Taira, Nature Biotechnol. 20(5):497-500, 2002; Paddison 등, Genes & Dev. 16(8): 948-958, 2002; Paul 등, Nature Biotechnol. 20(5):505-508, 2002; Sui, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(6):5515-5520, 2002; Yu 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(9):6047-6052, 2002).
shRNA의 줄기-루프 구조는 임의적인 뉴클레오티드 돌출부, 예컨대 2-bp 돌출부, 예를 들어, 3' UU 돌출부를 가질 수 있다. 변경이 있을 수 있지만, 줄기는 전형적으로 15 내지 49, 15 내지 35, 19 내지 35, 21 내지 31 bp, 또는 21 내지 29 bp 범위이고, 루프는 4 내지 30 bp, 예를 들어, 4 내지 23 bp 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, shRNA 서열은 45-65 bp; 50-60 bp; 또는 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 또는 59 bp를 포함한다. 특정 구현예에서, shRNA 서열은 52 또는 55 bp를 포함한다. 특정 구현예에서 siRNA는 15-25 bp를 갖는다. 특정 구현예에서 siRNA는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 bp를 갖는다. 특정 구현예에서 siRNA는 19 bp를 갖는다. 그러나, 당업자는 16 개 미만의 뉴클레오티드 또는 24 개 초과의 뉴클레오티드 길이를 갖는 siRNA가 또한 RNAi를 매개하는 기능을 할 수 있음을 이해할 것이다. 더 긴 RNAi 제제는 바람직하지 않을 수 있는 특정 포유류 세포에서 인터페론 또는 단백질 키나제 R(PKR) 반응을 도출하는 것으로 입증되었다. 바람직하게는 RNAi 제제는 PKR 반응을 도출하지 않는다(즉, 충분히 짧은 길이의 것이다). 그러나, 더 긴 RNAi 제제는 예를 들어, PKR 반응이 대체 수단에 의해 하향조절되거나 또는 약화되는 상황에서 유용할 수 있다.
작은 RNA가 또한 유전자 발현을 활성화하는 데 사용될 수 있다.
I(C)(i)(d). 조합 페이로드
본 개시내용은 복수의 발현 산물을 암호화하는 페이로드를 포함하는 아데노바이러스 벡터 및 게놈을 포함한다. 복수의 발현 산물을 암호화하는 페이로드는 조합 페이로드로 지칭될 수 있다. 다양한 구현예에서, 조합 페이로드는 제1 발현 산물을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 제2 발현 산물을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 발현 산물 각각은 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 단백질(예를 들어, 치료 단백질, 예를 들어, 대체 효소), 결합 도메인, 항체, CAR, TCR, CRISPR 시스템, 염기 편집기 시스템, 작은 RNA, 및/또는 선택가능한 마커 중 임의의 것으로부터 독립적으로 선택될 수 있다, 예시적인 조합 페이로드가 본원에 개시되어 있다.
당업자는 코딩 서열이 본원에 제공되거나 또는 달리 당업계에 알려진 다양한 프로모터 및/또는 다른 조절 서열 중 임의의 것과의 작동가능한 연결에 의해 제어되고/되거나 발현될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자가 인식하고, 본 개시내용에 예시된 바와 같이, 벡터에서 코딩 서열을 제어 및/또는 발현하는 데 이용가능한 서열은 당업계에 알려져 있고 본원에 제공된 것들을 포함한다. 다양한 특정 예에서, 본 개시내용의 페이로드에 존재하는 코딩 서열은 임의적으로 프로모터, 인핸서, 종결 영역, 절연체, 미니-LCR, 종결 신호, 폴리아데닐화 신호, 스플라이싱 신호 등으로부터 선택된 하나 이상의 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 조합 페이로드는 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 CRISPR 시스템의 하나 이상, 또는 모든 구성요소를 암호화하며, 임의적으로 여기서 적어도 하나의 gRNA는 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 gRNA, 및 임의적으로 CRISPR 시스템의 부분이 아닌 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, CRISPR 시스템의 gRNA는 HBG1 프로모터의 핵산 서열을 표적화하는 gRNA, HBG2 프로모터의 핵산 서열을 표적화하는 gRNA, 및/또는 적혈구 인핸서 bcl11a의 핵산 서열을 표적화하는 gRNA 중 하나 이상, 또는 전부를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, (i) HBG1 프로모터-표적화된 gRNA는 HBG1 프로모터에서 BCL11A 억제인자 단백질 결합 부위의 불활성화에 의해 HBG1 프로모터에 작동가능하게 연결된 γ-글로빈 코딩 서열의 발현을 증가시키도록 설계되고/되거나, (ii) HBG2 프로모터-표적화된 gRNA는 HBG2 프로모터에서 BCL11A 억제인자 단백질 결합의 불활성화에 의해 HBG2 프로모터에 작동가능하게 연결된 γ-글로빈 코딩 서열의 발현을 증가시키도록 설계되고/되거나, (iii) bcl11a-표적화된 gRNA는 bcl11a 인핸서에 작동가능하게 연결된 γ-글로빈 코딩 서열의 발현을 증가시키도록 설계되며, 여기서 적혈구 bcl11a 인핸서의 변형 및/또는 불활성화는 적혈구 세포에서 감소된 BCL11A 억제인자 단백질 발현을 초래한다. 다양한 구현예에서, CRISPR 시스템을 포함하는 조합 페이로드는 치료 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 치료 단백질은 γ-글로빈 및 β-글로빈 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 β-글로빈 프로모터 및/또는 β-글로빈 LCR과 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 조합 페이로드는 염기 편집 효소 및 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 염기 편집기 시스템 중 하나 이상, 또는 모든 구성요소를 암호화하며, 임의적으로 여기서 적어도 하나의 gRNA는 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 gRNA, 및 임의적으로 염기 편집기 시스템의 부분이 아닌 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 염기 편집기 시스템의 gRNA는 HBG1 프로모터의 핵산 서열을 표적화하는 gRNA, HBG2 프로모터의 핵산 서열을 표적화하는 gRNA, 및/또는 적혈구 인핸서 bcl11a의 핵산 서열을 표적화하는 gRNA 중 하나 이상, 또는 전부를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, (i) HBG1 프로모터-표적화된 gRNA는 HBG1 프로모터에서 BCL11A 억제인자 단백질 결합 부위의 불활성화에 의해 HBG1 프로모터에 작동가능하게 연결된 γ-글로빈 코딩 서열의 발현을 증가시키도록 설계되고/되거나, (ii) HBG2 프로모터-표적화된 gRNA는 HBG2 프로모터에서 BCL11A 억제인자 단백질 결합 부위의 불활성화에 의해 HBG2 프로모터에 작동가능하게 연결된 γ-글로빈 코딩 서열의 발현을 증가시키도록 설계되고/되거나, (iii) bcl11a-표적화된 gRNA는 bcl11a 인핸서에 작동가능하게 연결된 γ-글로빈 코딩 서열의 발현을 증가시키도록 설계되며, 여기서 적혈구 bcl11a 인핸서의 변형 및/또는 불활성화는 적혈구 세포에서 감소된 BCL11A 억제인자 단백질 발현을 초래한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기 시스템을 포함하는 조합 페이로드는 치료 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 치료 단백질은 γ-글로빈 및 β-글로빈 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 β-글로빈 프로모터 및/또는 β-글로빈 LCR과 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 조합 페이로드는 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 조합 페이로드는 제1 항체를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 제2 항체를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체(예를 들어, 제1 및/또는 제2 항체)는 scFv이다. 일부 구현예에서 항체는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체이다.
다양한 구현예에서, 조합 페이로드의 페이로드 핵산 서열에 의해 암호화된 적어도 하나의 발현 산물은 선택가능한 마커이다. 다양한 구현예에서, 선택가능한 마커는 MGMTP140K이다.
예시적인 Ad35 페이로드 및 시스템은 다음을 포함한다:
(i) 다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 SB100x에 의한 전위를 위해 트랜스포사제 도립 반복부에 의해 플랭킹된 통합 요소를 포함하고, 트랜스포사제 도립 반복부는 FLPe와 같은 FLP 재조합효소에 의한 재조합을 위해 frt 지시 반복부에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, 통합 요소는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) β-글로빈 미니-LCR, (b) γ-글로빈 코딩 서열이 3'UTR(예를 들어, γ-글로빈 3'UTR)과 작동가능하게 연결된 인간 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 β-글로빈 프로모터를 포함하며, 여기서 β-글로빈 미니-LCR이 또한 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결되는 유전자 (c) cHS4 절연체 서열, 및 (d) MGMTP140K 코딩 서열, 2A 자기-절단 펩티드, GFP 형광 마커 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터와 같은 프로모터를 포함하는 유전자를 포함하며, 임의적으로 여기서 (a)-(d) 중 임의의 것은 Ad35 페이로드의 2 개의 가닥 중 어느 한 가닥 상에서 5'에서 3' 방향으로 암호화될 수 있다.
다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 통합 요소의 외부 및 재조합효소 부위의 외부에, CRISPR 시스템을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, CRISPR 시스템을 암호화하는 핵산 서열은 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) 제1 gRNA가 bcl11a 인핸서를 표적화하는 제1 gRNA-암호화 서열과 작동가능하게 연결된 제1 U6 프로모터를 포함하는 제1 gRNA 유전자, (b) 제2 gRNA가 HBG 프로모터를 표적화하는 제2 gRNA-암호화 서열과 작동가능하게 연결된 제2 U6 프로모터를 포함하는 제2 gRNA 유전자, 및 (c) CRISPR/Cas9 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터와 같은 프로모터를 포함하는 CRISPR 효소 유전자를 포함하며, 여기서 CRISPR/Cas9 코딩 서열은 3'UTR/miR 서열 및 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된다. 다양한 구현예에서, CRISPR 시스템은 HBG 프로모터의 적혈구 bcl11a 인핸서 및 BCL11A 결합 부위를 표적화하며, 각각은 γ-글로빈 활성화 또는 재활성화를 야기하는 데 기여한다. 본원에 개시된 바와 같이, CRISPR 시스템은 전위에 의한 공여자 벡터의 절단이 비-통합된 공여자 벡터 핵산의 분해를 초래한다는 점에서 자기-불활성화될 수 있다. 다양한 구현예에서, miR 서열은 HDAd35 공여자 벡터 생산 동안 생산자 세포에서 Cas9 발현을 억제하는 서열일 수 있다(예를 들어, Saydaminova 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 1: 14057, 2015; Li 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9: 390-401, 2018 참조).
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 Ad35 시스템은 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 지지 벡터는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) FLPe 재조합효소 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터를 포함하는 재조합 유전자, 및 (b) SB100x 트랜스포사제 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터를 포함하는 트랜스포사제 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서 Ad35 페이로드는 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재한다. 다양한 구현예에서 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재하는 Ad35 페이로드는 Ad35 ITR에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터 게놈은 Ad35 공여자 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 공여자 벡터는 Ad35 ++ 벡터이다.
다양한 구현예에서 지지 게놈은 Ad35 ITR을 포함한다. 다양한 구현예에서, 지지 게놈은 Ad35 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 Ad35 ++ 벡터이다.
다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터는 헬퍼 의존적 공여자 벡터(HDAd35)이다. 이러한 특정 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 HDAd35 공여자 벡터 또는 게놈, 및 Ad35 헬퍼 벡터 또는 게놈을 포함할 수 있고, 다양한 구현예에서 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
특정 예시적인 구현예는 도 164에 예시되어 있다.
(ii) 다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 표적 세포 게놈과 적어도 80% 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%< 또는 100% 동일성)을 갖는, 상동성 아암(예를 들어, 1.8 kb 상동성 아암)에 의해 플랭킹된 통합 요소를 포함한다. 다양한 구현예에서, 통합 요소는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) HS1, HS2, HS3, 및 HS4를 포함하나, HS5를 포함하지 않는 β-글로빈 미니-LCR, (b) γ-글로빈 3'UTR과 작동가능하게 연결된 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 β-글로빈 프로모터를 포함하며, 여기서 β-글로빈 미니-LCR이 또한 γ-글로빈 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 유전자 (c) cHS4 절연체 서열, 및 (d) 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 MGMTP140K 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터를 포함하는 유전자를 포함하며, 임의적으로 여기서 (a)-(d) 중 임의의 것은 Ad35 페이로드의 2 개의 가닥 중 어느 한 가닥 상에서 5'에서 3' 방향으로 암호화될 수 있다.
다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 통합 요소의 외부 및 재조합효소 부위의 외부에, CRISPR 시스템을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, CRISPR 시스템을 암호화하는 핵산 서열은 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) sgRNA가 HBG2 프로모터를 표적화하는 sgRNA-암호화 서열과 작동가능하게 연결된 U6 프로모터를 포함하는 sgRNA 유전자, 및 (b) miR 부위, β-글로빈 3'UTR 서열, 및 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 spCas9 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터를 포함하는 CRISPR 효소 유전자를 포함한다. 다양한 구현예에서, CRISPR 시스템은 HBG 프로모터의 BCL11A 결합 부위를 표적화하고 γ-글로빈 활성화 또는 재활성화를 야기할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, CRISPR 시스템은 AAVS1 CRISPR에 의한 공여자 벡터의 절단이 비-통합된 공여자 벡터 핵산의 분해를 초래한다는 점에서 자기-불활성화될 수 있다. 다양한 구현예에서, miR 서열은 HDAd35 공여자 벡터 생산 동안 생산자 세포에서 Cas9 발현을 억제하는 서열일 수 있다(예를 들어, Saydaminova 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 1: 14057, 2015; Li 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9: 390-401, 2018 참조).
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 Ad35 시스템은 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 지지 벡터는 임의적으로 5'에서 3'으로, sgAAVS1-rm 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 U6 프로모터를 포함한다.
다양한 구현예에서 Ad35 페이로드는 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재한다. 다양한 구현예에서 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재하는 Ad35 페이로드는 Ad35 ITR에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터 게놈은 Ad35 공여자 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 공여자 벡터는 Ad35 ++ 벡터이다.
다양한 구현예에서 지지 게놈은 Ad35 ITR을 포함한다. 다양한 구현예에서, 지지 게놈은 Ad35 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 Ad35 ++ 벡터이다.
다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터는 헬퍼 의존적 공여자 벡터(HDAd35)이다. 이러한 특정 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 HDAd35 공여자 벡터 또는 게놈, 및 Ad35 헬퍼 벡터 또는 게놈을 포함할 수 있고, 다양한 구현예에서 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
특정 예시적인 구현예는 도 165에 예시되어 있다.
(iii) 다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 SB100x에 의한 전위를 위해 트랜스포사제 도립 반복부에 의해 플랭킹된 통합 요소를 포함하고, 트랜스포사제 도립 반복부는 FLPe와 같은 FLP 재조합효소에 의한 재조합을 위해 frt 지시 반복부에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, 통합 요소는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) β-글로빈 미니-LCR, (b) γ-글로빈 코딩 서열이 3'UTR(예를 들어, γ-글로빈 3'UTR)과 작동가능하게 연결된 레서스 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 β-글로빈 프로모터를 포함하며, 여기서, β-글로빈 미니-LCR이 또한 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결되는 유전자 (c) cHS4 절연체 서열, 및 (d) 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 MGMTP140K 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터를 포함하는 유전자를 포함하며, 임의적으로 여기서 (a)-(d) 중 임의의 것은 Ad35 페이로드의 2 개의 가닥 중 어느 한 가닥 상에서 5'에서 3' 방향으로 암호화될 수 있다.
다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 통합 요소의 외부 및 재조합효소 부위의 외부에, CRISPR 시스템을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, CRISPR 시스템을 암호화하는 핵산 서열은 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) gRNA가 HBG 프로모터를 포함하는 gRNA-암호화 서열과 작동가능하게 연결된 U6 프로모터를 포함하는 gRNA 유전자, 및 (b) 3'UTR/miR 서열 및 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 CRISPR/Cas9 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터를 포함하는 CRISPR 효소 유전자를 포함한다. 다양한 구현예에서, CRISPR 시스템은 HBG 프로모터의 BCL11A 결합 부위를 표적화하여, γ-글로빈 활성화 또는 재활성화를 초래할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, CRISPR 시스템은 전위에 의한 공여자 벡터의 절단이 비-통합된 공여자 벡터 핵산의 분해를 초래한다는 점에서 자기-불활성화될 수 있다. 다양한 구현예에서, miR 서열은 HDAd35 공여자 벡터 생산 동안 생산자 세포에서 Cas9 발현을 억제하는 서열일 수 있다(예를 들어, Saydaminova 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 1: 14057, 2015; Li 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9: 390-401, 2018 참조).
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 Ad35 시스템은 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 지지 벡터는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) FLPe 재조합효소 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터를 포함하는 재조합 유전자, 및 (b) SB100x 트랜스포사제 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터를 포함하는 트랜스포사제 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서 Ad35 페이로드는 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재한다. 다양한 구현예에서 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재하는 Ad35 페이로드는 A3d5 ITR에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터 게놈은 Ad35 공여자 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 공여자 벡터는 Ad35 ++ 벡터이다.
다양한 구현예에서 지지 게놈은 Ad35 ITR을 포함한다. 다양한 구현예에서, 지지 게놈은 Ad35 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 Ad35 ++ 벡터이다.
다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터는 헬퍼 의존적 공여자 벡터(HDAd35)이다. 이러한 특정 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 HDAd35 공여자 벡터 또는 게놈, 및 Ad35 헬퍼 벡터 또는 게놈을 포함할 수 있고, 다양한 구현예에서 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
특정 예시적인 구현예는 도 166에 예시되어 있다.
(iv) 다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 SB100x에 의한 전위를 위해 트랜스포사제 도립 반복부에 의해 플랭킹된 통합 요소를 포함하고, 트랜스포사제 도립 반복부는 FLPe와 같은 FLP 재조합효소에 의한 재조합을 위해 frt 지시 반복부에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, 통합 요소는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) β-글로빈 미니-LCR, (b) γ-글로빈 코딩 서열이 3'UTR(예를 들어, γ-글로빈 3'UTR)과 작동가능하게 연결된 인간 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 β-글로빈 프로모터를 포함하며, 여기서 β-글로빈 미니-LCR이 또한 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결되는 유전자 (c) cHS4 절연체 서열, 및 (d) MGMTP140K 코딩 서열, 2A 자기-절단 펩티드, GFP 형광 마커 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터와 같은 프로모터를 포함하는 유전자를 포함하며, 임의적으로 여기서 (a)-(d) 중 임의의 것은 Ad35 페이로드의 2 개의 가닥 중 어느 한 가닥 상에서 5'에서 3' 방향으로 암호화될 수 있다.
다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 통합 요소의 외부 및 재조합효소 부위의 외부에, 염기 편집 시스템을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, 염기 편집 시스템을 암호화하는 핵산 서열은 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) 제1 gRNA가 bcl11a 인핸서를 표적화하는 제1 gRNA-암호화 서열과 작동가능하게 연결된 제1 U6 프로모터를 포함하는 제1 gRNA 유전자, (b) 제2 gRNA가 HBG 프로모터를 표적화하는 제2 gRNA-암호화 서열과 작동가능하게 연결된 제2 U6 프로모터를 포함하는 제2 gRNA 유전자, 및 (c) 3'UTR/miR 서열 및 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 염기 편집 효소 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터와 같은 프로모터를 포함하는 염기 편집 효소 유전자를 포함한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집 시스템은 HBG 프로모터의 적혈구 bcl11a 인핸서 및 BCL11A 결합 부위를 표적화하며, 각각은 γ-글로빈 활성화 또는 재활성화를 야기하는 데 기여한다. 본원에 개시된 바와 같이, 염기 편집 시스템은 전위에 의한 공여자 벡터의 절단이 비-통합된 공여자 벡터 핵산의 분해를 초래한다는 점에서 자기-불활성화될 수 있다. 다양한 구현예에서, miR 서열은 HDAd35 공여자 벡터 생산 동안 생산자 세포에서 Cas9 발현을 억제하는 서열일 수 있다(예를 들어, Saydaminova 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 1: 14057, 2015; Li 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9: 390-401, 2018 참조).
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 Ad35 시스템은 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 지지 벡터는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) FLPe 재조합효소 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터를 포함하는 재조합 유전자, 및 (b) SB100x 트랜스포사제 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터를 포함하는 트랜스포사제 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서 Ad35 페이로드는 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재한다. 다양한 구현예에서 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재하는 Ad35 페이로드는 Ad35 ITR에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터 게놈은 Ad35 공여자 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 공여자 벡터는 Ad35 ++ 벡터이다.
다양한 구현예에서 지지 게놈은 Ad35 ITR을 포함한다. 다양한 구현예에서, 지지 게놈은 Ad35 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 Ad35　++ 벡터이다.
다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터는 헬퍼 의존적 공여자 벡터(HDAd35)이다. 이러한 특정 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 HDAd35 공여자 벡터 또는 게놈, 및 Ad35 헬퍼 벡터 또는 게놈을 포함할 수 있고, 다양한 구현예에서 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
(v) 다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 SB100x에 의한 전위를 위해 트랜스포사제 도립 반복부에 의해 플랭킹된 통합 요소를 포함하고, 트랜스포사제 도립 반복부는 FLPe와 같은 FLP 재조합효소에 의한 재조합을 위해 frt 지시 반복부에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, 통합 요소는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) β-글로빈 미니-LCR, (b) γ-글로빈 코딩 서열이 3'UTR(예를 들어, γ-글로빈 3'UTR)과 작동가능하게 연결된 레서스 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 β-글로빈 프로모터를 포함하며, 여기서 β-글로빈 미니-LCR이 또한 γ-글로빈 코딩 서열과 작동가능하게 연결되는 유전자 (c) cHS4 절연체 서열, 및 (d) 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 MGMTP140K 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터를 포함하는 유전자를 포함하며, 임의적으로 여기서 (a)-(d) 중 임의의 것은 Ad35 페이로드의 2 개의 가닥 중 어느 한 가닥 상에서 5'에서 3' 방향으로 암호화될 수 있다.
다양한 구현예에서, Ad35 페이로드는 통합 요소의 외부 및 재조합효소 부위의 외부에, 염기 편집 시스템을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, 염기 편집 시스템을 암호화하는 핵산 서열은 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) gRNA가 HBG 프로모터를 표적화하는 gRNA-암호화 서열과 작동가능하게 연결된 U6 프로모터를 포함하는 gRNA 유전자, 및 (b) 3'UTR/miR 서열 및 폴리아데닐화 신호와 작동가능하게 연결된 염기 편집 효소 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터를 포함하는 염기 편집 효소 유전자를 포함한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집 시스템은 HBG 프로모터의 BCL11A 결합 부위를 표적화하며, 이는 γ-글로빈 활성화 또는 재활성화를 초래할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 염기 편집 시스템은 전위에 의한 공여자 벡터의 절단이 비-통합된 공여자 벡터 핵산의 분해를 초래한다는 점에서 자기-불활성화될 수 있다. 다양한 구현예에서, miR 서열은 HDAd35 공여자 벡터 생산 동안 생산자 세포에서 Cas9 발현을 억제하는 서열일 수 있다(예를 들어, Saydaminova 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 1: 14057, 2015; Li 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9: 390-401, 2018 참조).
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 Ad35 시스템은 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 지지 벡터는 임의적으로 5'에서 3'으로, (a) FLPe 재조합효소 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터를 포함하는 재조합 유전자, 및 (b) SB100x 트랜스포사제 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 PGK 프로모터를 포함하는 트랜스포사제 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서 Ad35 페이로드는 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재한다. 다양한 구현예에서 Ad35 공여자 벡터 게놈에 존재하는 Ad35 페이로드는 Ad35 ITR에 의해 플랭킹된다. 다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터 게놈은 Ad35 공여자 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 공여자 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
다양한 구현예에서 지지 게놈은 Ad35 ITR을 포함한다. 다양한 구현예에서, 지지 게놈은 Ad35 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터는 헬퍼 의존적 공여자 벡터(HDAd35)이다. 이러한 특정 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 HDAd35 공여자 벡터 또는 게놈, 및 Ad35 헬퍼 벡터 또는 게놈을 포함할 수 있고, 다양한 구현예에서 Ad35 지지 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
I(C)(ii). 페이로드 조절 서열
I(C)(ii)(a). 프로모터 조절 서열
프로모터는　일반적으로 전사를 개시하기 전에 RNA 폴리머라제가 결합하는 관련 코딩 서열의 상류(5')에 있는 비-코딩 게놈 DNA 서열일 수 있다. 이 결합은 전사가 특이적 전사 개시 부위에서 개시하도록 RNA 폴리머라제를 정렬한다. 　프로모터의 뉴클레오티드 서열은　 효소의 속성 및 이에 부착되는 다른 관련 단백질 인자 및 RNA 합성률을 결정한다. RNA는 RNA 서열을 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열 내로 번역하기 위한 주형으로서 역할을 하는 메신저 RNA(mRNA)를 생성하도록 처리된다. 5' 비-번역된 리더 서열은 mRNA의 개시 및 번역에서 역할을 할 수 있는 코딩 서열의 상류에 있는 mRNA 영역이다. 3' 전사 종결/폴리아데닐화 신호는 RNA 합성의 종결 및 3' 단부에 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드의 첨가를 야기하도록 식물 세포에서 기능하는 코딩 영역의 하류에 있는 비-번역된 영역이다.
프로모터는 일반적인 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 및/또는 세포질에 특이적인 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 강한 프로모터, 약한 프로모터, 구성적 발현 프로모터, 및/또는 유도성(조건부) 프로모터를 포함할 수 있다. 유도성 프로모터는 특정 조건, 신호, 또는 세포 사건에 반응하여 발현을 지시하거나 또는 제어한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터로부터 전사를 실행하기 위해 특정 리간드, 소분자, 전사 인자, 호르몬, 또는 호르몬 단백질을 필요로 하는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터의 특정 예는 AFP(α-태아단백질) 프로모터, 아밀라제 1C 프로모터, 아쿠아포린-5(AP5) 프로모터, αl -항트립신 프로모터, β-act 프로모터, β-글로빈 프로모터, β-Kin 프로모터, B29 프로모터, CCKAR 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, CEA 프로모터, c-erbB2 프로모터, COX-2 프로모터, CXCR4 프로모터, 데스민 프로모터, E2F-1 프로모터, 인간 신장 인자 lα 프로모터(EFlα), CMV(사이토메갈로바이러스 바이러스) 프로모터, minCMV 프로모터, SV40(시미안 바이러스 40) 급초기 프로모터, EGR1 프로모터, eIF4A1 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, FerH 프로모터, FerL 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GAPDH 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, GRP78 프로모터, GRP94 프로모터, HE4 프로모터, hGR1/1 프로모터, hNIS 프로모터, Hsp68 프로모터, Hsp68 최소 프로모터(proHSP68), HSP70 프로모터, HSV-1 바이러스 TK 유전자 프로모터, hTERT 프로모터, ICAM-2 프로모터, 칼리크레인 프로모터, LP 프로모터, 주요 후기 프로모터(MLP), Mb 프로모터, Rho 프로모터, MT(메탈로티오네인) 프로모터, MUC1 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, PGK(포스포 글리세레이트 키나제) 프로모터, PGK-1 프로모터, 폴리머라제 III(Pol III) 프로모터, PSA 프로모터, ROSA 프로모터, SP-B 프로모터, 서비빈 프로모터, SYN1 프로모터, SYT8 유전자 프로모터, TRP1 프로모터, Tyr 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, WASP 프로모터, 및 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴-말단 반복부(LTR) 프로모터를 포함한다
프로모터는 천연 프로모터 또는 복합 프로모터로서 수득될 수 있다. 천연 프로모터, 또는 최소 프로모터는 주어진 유전자의 5' 영역으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로모터를 지칭한다. 천연 프로모터는 코어 프로모터 및 이의 천연 5'UTR을 포함한다. 특정 구현예에서, 5'UTR은 인트론을 포함한다. 복합 프로모터는 상이한 기원의 프로모터 요소를 조합하거나 또는 원위 인핸서를 동일하거나 또는 상이한 기원의 최소 프로모터와 조합함으로써 유도된 프로모터를 지칭한다.
특정 구현예에서, SV40 프로모터는 서열번호: 80에 제시된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, dESV40 프로모터(인핸서 영역의 결실이 있는 SV40 프로모터)는 서열번호: 81에 제시된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 텔로머라제 촉매적 서브유닛(hTERT) 프로모터는 서열번호: 82에 제시된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 슈미츠-루핀(Schmidt-Ruppin) A 균주로부터 유래된 RSV 프로모터는 서열번호: 83에 제시된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, hNIS 프로모터는 서열번호: 84에 제시된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 글루코코르티코이드 수용체 1A(hGR 1/Ap/e) 프로모터는 서열번호: 85에 제시된 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 프로모터는 야생형　프로모터　서열 및 야생형 프로모터에 비해 특정 위치에서 임의적인 변화(삽입, 점 돌연변이 또는 결실 포함)가 있는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 20 개 뉴클레오티드 스트레치 당 1 개 변화, 20 개 뉴클레오티드 스트레치 당 2 개 변화, 20 개 뉴클레오티드 스트레치 당 3 개 변화, 20 개 뉴클레오티드 스트레치 당 4 개 변화, 또는 20 개 뉴클레오티드 스트레치 당 5 개 변화를 가짐으로써 자연 발생 프로모터로부터 달라진다. 특정 구현예에서, 천연 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 염기에서 변경될 것이다. 프로모터는　 다른 바이러스 서열이 있거나 없이, LTR 서열의 50 개 뉴클레오티드 내지 100, 200, 250 또는 350 개 뉴클레오티드를 포함하는 길이로 달라질 수 있다.
일부 프로모터는 조직 또는 세포에 특이적이고 일부 프로모터는 조직 또는 세포에 비-특이적이다. 포유류 세포의 각 유전자는 고유한 프로모터가 있고 일부 프로모터는 특정 세포 유형에서만 활성화될 수 있다. 비-특이적 프로모터, 또는 유비쿼터스 프로모터는 광범위한 세포, 조직 및 세포 주기에서 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 전사 개시를 보조한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 비-특이적 프로모터이다. 특정 구현예에서, 비-특이적 프로모터는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터, 포유류 신장 인자 1α(EF1α) 프로모터, β-act 프로모터, EGR1 프로모터, eIF4A1 프로모터, FerH 프로모터, FerL 프로모터, GAPDH 프로모터, GRP78 프로모터, GRP94 프로모터, HSP70 프로모터, β-Kin 프로모터, PGK-1 프로모터, ROSA 프로모터, 및/또는 유비퀴틴 B 프로모터를 포함한다.
특이적 프로모터는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 세포 특이적 발현을 보조한다. 특정 구현예에서, 특이적 프로모터는 B 세포, 단핵구 세포, 백혈구, 대식세포, 췌장 선포 세포, 내피 세포, 성상세포, 및/또는 임의의 다른 세포 유형 또는 세포 주기에서 활성이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 특이적 프로모터이다. 특정 구현예에서, SYT8 유전자 프로모터는 인간 섬에서 유전자 발현을 조절한다(Xu, 등, Nat Struct Mol Biol., 2011, 18: 372-378). 특정 구현예에서, 칼리크레인 프로모터 췌관 세포 특이적 타액선에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 아밀라제 1C 프로모터는 선포 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 아쿠아포린-5(AP5) 프로모터는 선포 세포에서 유전자 발현을 조절한다(Zheng and Baum, Methods Mol Biol., 434: 205-219, 2008). 특정 구현예에서, B29 프로모터는 B 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, CD14 프로모터는 단핵구 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, CD43 프로모터는 백혈구 및 혈소판에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, CD45 프로모터는 조혈세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, CD68 프로모터는 대식세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 데스민 프로모터는 근육 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 엘라스타제-1 프로모터는 췌장 선포 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 엔도글린 프로모터는 내피 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 피브로넥틴 프로모터는 분화 세포 또는 치유 조직에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, Flt-1 프로모터는 내피 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, GFAP 프로모터는 성상세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, GPIIb 프로모터는 거핵구에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, ICAM-2 프로모터는 내피 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, Mb 프로모터는 근육에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, NphsI 프로모터는 족세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, OG-2 프로모터는 골모세포, 치아모세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, SP-B 프로모터는 폐 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, SYN1 프로모터는 뉴런에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, WASP 프로모터는 조혈 세포에서 유전자 발현을 조절한다.
특정 구현예에서, 프로모터는 종양-특이적 프로모터이다. 특정 구현예에서, AFP 프로모터는 간세포 암종에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, CCKAR 프로모터는 췌장암에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, CEA 프로모터는 상피암에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, c-erbB2 프로모터는 유방암 및 췌장암에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, COX-2 프로모터는 종양에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, CXCR4 프로모터는 종양에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, E2F-1 프로모터는 종양에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, HE4 프로모터는 종양에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, LP 프로모터는 종양에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, MUC1 프로모터는 암종 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, PSA 프로모터는 전립선 및 전립선암에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 서비븐 프로모터는 종양에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, TRP1 프로모터는 멜라닌세포 및 흑색종에서 유전자 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, Tyr 프로모터는 멜라닌세포 및 흑색종에서 유전자 발현을 조절한다.
I(C)(ii)(b). LCR 조절 서열
유전자좌 제어 영역은 염색질 부위에서 조직-특이적 및 카피 수-의존적 방식으로 연결된 유전자의 발현을 생리학적 수준으로 향상시키는 능력에 의해 작동적으로 정의된다. Li 등, Blood, 2002, 100(9): 3077-3086.
β-글로빈 LCR은 적어도 여러 측면에서 적어도 일부 LCR의 예시이다. 예를 들어, 많은 다른 LCR과 마찬가지로, β-글로빈 LCR은 작동가능하게 연결된 유전자 또는 이식유전자의 발현을 향상시키고(예를 들어, 전사 증가, 번역 증가, 및/또는 세포 또는 조직 특이성 증가) LCR의 발현 효과를 매개하기 위해 당업자에 의해 이해되는 DNAse 과민성(HS) 영역을 포함한다. 또한, 많은 다른 LCR과 마찬가지로, β-글로빈 LCR은 예를 들어, β-글로빈 LCR HS 영역(HS1-HS5)의 전부를 포함하거나 또는 β-글로빈 LCR HS 영역(예를 들어, HS1-HS4)의 하위세트를 포함하는 β-글로빈 LCR 서열을 포함하는 핵산에서 활용될 수 있다는 점에서 전체적으로 또는 부분적으로 활용될 수 있다.
염색체 11 상의 호모 사피엔스(Homo sapiens) β-글로빈 영역에 대한 예시적인 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 NG_000007로 제공된다. β-글로빈 긴 LCR은 일부 경우에, 유전자좌의 첫번째(배아) 글로빈 유전자에 대해 6 내지 22 kb 5'에 위치한 서열이거나 또는 이를 포함할 수 있다. β-글로빈 긴 LCR은 5 개의 DNAse I 과민성 부위인 5'HS 1 내지 5를 포함할 수 있다. Li 등, Blood, 2002, 100(9): 3077-3086. NG_000007은 유전자좌 제어 영역 내에서 DNAse I 과민성 부위 HS1, HS2, HS3, 및 HS4를 설명하는 제한 부위의 위치(예를 들어, HS2의 SnaBI 및 BstXI 제한 부위, HS3의 HindIII 및 BamHI 제한 부위, 및 HS4의 BamHI 및 BanII 제한 부위)를 제공하고, 특히 과민성 부위 위치와 관련하여 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. HS1의 서열 및 위치는 예를 들어, Pasceri 등, Ann NY Acad. Sci. 850:377-381, 1998; Pasceri 등, Blood. 92:653-663, 1998; 및 Milot 등, Cell. 87:105-114, 1996에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, HS2 영역은 유전자좌 제어 영역의 위치 16,671에서 17,058까지 확장된다. HS2의 SnaBI 및 BstXI 제한 부위는 각각 위치 17,093 및 16,240에 위치한다. HS3 영역은 유전자좌 제어 영역의 위치 12,459에서 13,097까지 확장된다. HS3의 BamHI 및 HindIII 제한 부위는 각각 위치 12,065 및 13,360에 위치한다. HS4 영역은 유전자좌 제어 영역의 위치 9,048에서 9,713까지 확장된다. HS4의 BamHI 및 BanII 제한 부위는 각각 위치 8,496 및 9,576에 위치한다.
본원에 개시된 특정 구현예는 β-글로빈 LCR의 미니-부분을 활용한다. 미니-부분은 LCR이 β-글로빈 LCR의 5 개 절편을 모두 포함하지 않는 한, HS1, HS2, HS3, HS4, 및/또는 HS5와 같은 5 개 미만의 HS 영역을 모두 포함한다. 본 개시내용의 실시예 1에서 활용되는 4.3 kb HS1-HS4 LCR은 미니-LCR의 일 예를 제공한다. 다른 미니-LCR은 예를 들어, HS1, HS2, 및 HS3; HS2, HS3, 및 HS4; HS3, HS4, 및 HS5; HS1, HS3, 및 HS5; HS1, HS2, 및 HS5; 및 HS1, HS4, 및 HS5를 포함할 수 있다. 미니-LCR의 추가적인 예에 대해, Sadelain 등, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 92: 6728-6732, 1995; 및 Lebouich 등, EMBO J. 13: 3065-3076, 1994를 참조한다. 특정 구현예는 β-글로빈 프로모터와 조합하여 미니-β-글로빈 LCR을 활용할 수 있다. 특정 구현예에서, 이 조합은 5.9 kb LCR-프로모터 조합을 산출한다. LCR과 관련하여, "미니" 및 "마이크로"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 개시된 특정 구현예는 유전자좌 제어 영역(LCR)의 긴 부분을 활용한다. 긴 β-글로빈 LCR은 HS1, HS2, HS3, HS4, 및 HS5를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 긴 LCR은 β-글로빈 LCR의 HS1, HS2, HS3, HS4, 및 HS5를 포함하는 21.5　kb 서열을 포함한다. 긴 β-글로빈 LCR은 β-글로빈 프로모터와 커플링되어 높은 단백질 발현 수준을 구동할 수 있다.
특정 구현예는 GRCh38에 열거된 바와 같이 인간 염색체 11(서열번호: 185)의 긴 β-글로빈 LCR 위치 5292319-5270789(21,531 bp)를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 긴 LCR은 18 kb, 18.5 kb, 19 kb, 19.5 kb, 20 kb, 20.5 kb, 21 kb, 21.5 kb, 또는 21.531 kb보다 더 크거나 또는 동일한 총 길이를 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 긴 LCR은 서열번호: 185의 길이의 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%보다 더 크거나 또는 동일한 총 길이를 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 긴 LCR은 서열번호: 185의 적어도 18 kb, 18.5 kb, 19 kb, 19.5 kb, 20 kb, 20.5 kb, 21 kb, 또는 21.5 kb를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 다양한 구현예 중 임의의 것에서, 긴 LCR은 서열번호: 185의 상응하는 인접한 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 다양한 구현예 중 임의의 것에서, 긴 LCR은 HS1, HS2, HS3, HS4, 및 HS5를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, Ad35 벡터 시스템은 예를 들어, 인간 염색체 11의 위치 5228631-5227023(1609 bp) 또는 β-글로빈 프로모터로서 GRCh38에 열거된 바와 같은 5228631-5227018(1614 bp)(서열번호: 186)을 포함하는 전위성 이식유전자 삽입물을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, β-글로빈 프로모터는 예를 들어, 1.0 kb, 1.1. kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 또는 1.609 kb보다 더 크거나 또는 동일한 총 길이를 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, β-글로빈 프로모터는 서열번호: 186의 적어도 1.0 kb, 1.1. kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 또는 1.609 kb를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 전위성 이식유전자 삽입물은 인간 염색체 11의 위치 5228631-5227023(1609 bp)을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, β-글로빈 프로모터는 예를 들어, 엡실론(HBE1), G-감마(HBG2), A-감마(HBG1), 델타(HBD), 및 베타(HBB) 글로빈 유전자 및/또는 헤모글로빈 β 유전자좌에 존재하는 하나 이상의 유전자(11:5,225,463-5,227,070, 보체) 중 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는, β-글로빈 LCR에 의해 발현이 조절되는 유전자의 상류, 예를 들어, 이의 첫번째 코딩 뉴클레오티드의 바로 상류에 있는 핵산 서열의 100　bp, 200　bp, 300　bp, 400　bp, 500　bp, 1　kb, 1.5　kb, 2　kb, 2.5　kb, 3　kb, 4　kb, 또는 5　kb보다 더 크거나 또는 동일한 총 길이를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, β-글로빈 프로모터는 예를 들어, 염색체 11 NC_000011.10 위치 5227021의 상류, 예를 들어, 바로 상류에 있는 핵산 서열의 100　bp, 200　bp, 300　bp, 400　bp, 500　bp, 1　kb, 1.5　kb, 2　kb, 2.5　kb, 3　kb, 4　kb, 또는 5　kb보다 더 크거나 또는 동일한 총 길이를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, β-글로빈 프로모터는 서열번호: 186의 길이의 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%보다 더 크거나 또는 동일한 총 길이를 가질 수 있다. 본원에 제공된 다양한 구현예 중 임의의 것에서, β-글로빈 프로모터는 서열번호: 186의 상응하는 인접합 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 핵산이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 긴 β-글로빈 LCR과 같은 β-글로빈 LCR은 적혈구에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 야기한다. 다양한 구현예에서, 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 또한 본원에 제시되거나 또는 달리 당업계에 알려진 바와 같은 β-글로빈 프로모터와 작동가능하게 연결된다.
면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR은 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 향상시키는(예를 들어, 전사 증가, 번역 증가, 및/또는 세포 또는 조직 특이성 증가) 예시적인 LCR이다. 코딩 서열의 발현은 완전한 면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR 서열을 포함하고/하거나 이의 발현-조절 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR에 작동가능하게 연결될 때 향상될 수 있다. 면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR은 면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR의 발현-향상 효과의 적어도 일부를 매개하기 위해 당업자에 의해 이해되는 DNAse 과민성 부위(HS)를 포함한다. 면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR은 인핸서-유전자좌 제어 영역(LCR)으로서 기능하는 면역글로불린 중쇄(IgH) 유전자좌의 3'Cα 영역에서 4 개의 DNase I-과민성 부위(HS1, HS2, HS3, 및 HS4)를 포함한다. 따라서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR은 HS1-HS4를 모두 포함하는 완전한 면역글로불린 중쇄 유전자좌 B 세포 LCR일 수 있거나, 또는 과민성 부위 HS1-HS4의 하위세트를 포함하는 이의 발현-조절 단편일 수 있다. 이러한 HS 부위는 IgH C 유전자의 10-30　kb에 대해 맵핑되고 일시적 형질감염 검정에서 림프계 세포-특이적 및 발달적으로 조절된 인핸서 요소를 유발할 수 있다. 이 핵산 서열은 버킷(Burkitt) 림프종 및 형질세포종 세포주에서 c-myc 유전자에 연결될 때 유사한 발현 패턴을 지시할 수 있는 것으로 관찰되었다. 버킷 림프종 및 형질세포종에서, B-세포 LCR에 의한 c-myc의 제어는 c-myc 유전자가 IgH 서열과 병치되게 하여, 비정상적인 c-myc 전사를 초래하는 특징적 염색체 전위로 인해 발생한다. B 세포 LCR의 추가적인 설명은 예를 들어, Madisen 등, Mol Cell Biol. 18(11):6281-92, 1998; Giannini 등, J. Immunol. 150:1772-1780, 1993; Madisen & Groudine, Genes Dev. 8:2212-2226, 1994; 및 Michaelson 등, Nucleic Acids Res. 23:975-981, 1995에서 찾을 수 있다.
발현 작제물은 mRNA 전사체, 예를 들어, 절연체, 및/또는 polyA 꼬리의 안정성을 향상시키는 특징을 추가적으로 포함할 수 있다.
I(C)(ii)(c). Micro RNA 부위 조절 서열
다양한 구현예에서, microRNA(또는 miRNA) 제어 시스템은 유전자의 발현이 microRNA 부위(예를 들어, microRNA가 상호작용할 수 있는 핵산 서열)의 존재에 의해 조절되는 방법 또는 조성물을 지칭할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용은 발현 산물의 발현이 상응하는 miRNA의 존재, 수준, 활성, 및/또는 이와의 접촉에 의해 제어되도록 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열이 miRNA 표적 부위에 작동가능하게 연결된 페이로드를 포함하는 Ad35 공여자 벡터를 포함한다. 다양한 구현예에서, miRNA 부위는 miR423-5, miR423-5p, miR42-2, miR181c, miR125a, miR15a, miR187, 및/또는 miR218 중 임의의 것으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 부위이다. 의심의 여지를 피하기 위해 본 개시내용은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 miRNA 부위와 작동가능하게 연결된 핵산 서열이 예를 들어, 본원에 제공된 하나 이상의 발현 산물 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열일 수 있음을 고려한다.
특정 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 유전자가 HSPC 예를 들어, 종양 침윤 HSPC와 같은 표적 세포에서 광범위하게 발현되도록 유전자의 발현을 조절하였다. 일부 구현예에서, 관심 단백질 또는 핵산(예를 들어, 항암제 예컨대 CAR, TCR, 항체, 및/또는 체크포인트 억제제, 예를 들어, 체크포인트 억제제인 αPD-L1 항체(예를 들어, αPD-L1γ1 항체))을 암호화하는 핵산(예를 들어, 치료 유전자)은 microRNA 부위, 복수의 동일한 microRNA 부위, 또는 복수의 별개의 microRNA 부위를 포함하거나, 이와 회합되거나, 또는 이와 작동가능하게 연결된다. 당업자는 관심 유전자를 암호화하는 서열을 갖는 핵산 또는 이의 부분과 microRNA 부위를 회합하는 수단 및 기술에 친숙할 것이지만, 특정 비-제한적인 예가 본원에 제공된다. 예를 들어, 관심 유전자(예를 들어, αPD-L1γ1 항체를 암호화하는 서열)는 관심 유전자의 발현이 종양-침윤 백혈구 세포가 아닌 세포에서 발현을 억제하지만, 종양-침윤 백혈구에서 발현을 억제하지 않는 하나 이상의 microRNA 부위의 존재에 의해 조절되도록 핵산에 존재할 수 있다. 특정한 특정 예에서, 관심 유전자(예를 들어, αPD-L1γ1 항체를 암호화하는 서열)는 관심 유전자의 발현이 종양-침윤 백혈구 세포가 아닌 세포에서 발현을 억제하지만, 종양-침윤 백혈구에서 발현을 억제하지 않는 하나 이상의 miR423-5p microRNA 부위의 존재에 의해 조절되도록 핵산에 존재할 수 있다. 다양한 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 하나 이상의 microRNA 부위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 microRNA 부위를 포함하거나, 또는 관심 단백질 또는 핵산의 발현이 이에 의해 조절되는 핵산을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 하나 이상의 miR423-5p microRNA 부위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 miR423-5p microRNA 부위를 포함하거나, 또는 관심 단백질 또는 핵산의 발현이 이에 의해 조절되는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 특정 구현예에서, microRNA 제어 시스템은 αPD-L1γ1 항체를 암호화하고, 하나 이상의 miR423-5p microRNA 부위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 miR423-5p microRNA 부위, 예를 들어, miR423-5p microRNA 부위를 포함하거나, 또는 αPD-L1γ1 항체의 발현이 이에 의해 조절되는 핵산을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, microRNA 부위는 HDAd35 공여자 벡터 생산 동안 생산자 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열, 예를 들어, CRISPR 효소, 염기 편집 효소, 또는 gRNA를 암호화하는 코딩 서열의 발현을 억제하는 서열일 수 있다(예를 들어, Saydaminova 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 1: 14057, 2015; Li 등, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9: 390-401, 2018 참조).
I(C)(iii). 선택 서열
특정 구현예에서 벡터는 선택 카세트를 포함하는 선택 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 선택 카세트는 프로모터, 선택제에 내성을 추가하거나 또는 부여하는 cDNA, 및 이 독립적인 전사 요소의 전사를 중지시킬 수 있는 poly A 서열을 포함한다.
선택 카세트는 (a) 항생제 또는 다른 독소에 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양소, 예를 들어, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급하는 하나 이상의 단백질을 암호화할 수 있다. 임의의 수의 선택　시스템을 사용하여 형질도입된 세포주를 회수할 수 있다. 특정 구현예에서, 양성 선택 카세트는 네오마이신, 하이그로마이신, 암피실린, 퓨로마이신, 플레오마이신, 제오마이신, 블라스티시딘, 비오마이신에 대한 내성 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 양성 선택 카세트는 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공하는 DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 유전자, O6BG/BCNU에 대한 내성을 담당하는 MGMTP140K 유전자, HAT 선택 배지에 존재하는 특이적 염기(아미노프테린, 하이포크산틴, 티미딘)의 형질전환을 담당하는 HPRT(하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자 및 일부 약물에 관한 해독을 위한 다른 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 선택제는 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 플레오마이신, 제오마이신, 블라스티시딘, 비오마이신, 암피실린, O6BG/BCNU, 메토트렉세이트, 테트라사이클린, 아미노프테린, 하이포크산틴, 티미딘 키나제, DHFR, Gln 합성효소, 또는 ADA를 포함한다.
특정 구현예에서, 음성 선택 카세트는 배양 배지에 존재하는 기질을 유전자를 발현하는 세포에 대한 독성 물질로 형질전환하기 위한 유전자를 포함한다. 이러한 분자는 간시클로비르 또는 FIAU의 존재에 민감한 헤르페스 바이러스(HSV TK)의 키나제 티미딘 유전자인 디프테리아 독소(DTA)의 해독 유전자(Yagi 등, Anal Biochem. 214(1):77-86, 1993; Yanagawa 등, Transgenic Res. 8(3):215-221, 1999)를 포함한다. HPRT 유전자는 또한 6-티오구아닌(6TG)을 배지에 첨가함으로써 음성 선택으로 사용될 수 있고. 모든 양성 및 음성 선택의 경우, poly A 전사 종결 서열은 상이한 기원으로부터 유래되며, 가장 고전적인 것은 SV40 poly A, 또는 진핵생물 유전자 poly A(소 성장 호르몬, 토끼 β-글로빈 등)으로부터 유래되고 있다.
특정 구현예에서, 선택 카세트는 Olszko 등 (Gene Therapy 22: 591-595, 2015)에 기재된 바와 같은 MGMTP140K를 포함한다. 특정 요소에서, 선택제는 O6BG/BCNU를 포함한다.
인간 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(hAGT)를 암호화하는 약물 내성 유전자 MGMT는 니트로소우레아 및 테모졸로미드(TMZ)와 같은 알킬화제의 세포독성 효과에 내성을 부여하는 DNA 복구 단백질이다. 6-벤질구아닌(6-BG)은 니트로소우레아 독성을 강화하는 AGT의 억제제이며 이 제제의 세포독성 효과를 강화하기 위해 TMZ와 함께 공동 투여된다. AGT의 변이체를 암호화하는 MGMT의 여러 돌연변이체 형태 6-BG에 의한 불활성화에 고도로 내성이지만 DNA 손상을 복구하는 능력은 유지한다(Maze 등, J. Pharmacol. Exp. Ther. 290: 1467-1474, 1999). MGMTP140K-기반 약물 내성 유전자 요법은 마우스, 개, 레서스 원숭이, 및 인간 세포, 구체적으로 조혈 세포에 화학보호를 부여하는 것으로 제시되었다(Zielske 등, J. Clin. Invest. 112: 1561-1570, 2003; Pollok 등, Hum. Gene Ther. 14: 1703-1714, 2003; Gerull 등, Hum. Gene Ther. 18: 451-456, 2007; Neff 등, Blood 105: 997-1002, 2005; Larochelle 등, J. Clin. Invest. 119: 1952-1963, 2009; Sawai 등, Mol. Ther. 3: 78-87, 2001).
특정 구현예에서, 생체내 선택 카세트와의 조합은 유전자-보정된 세포의 선택적 이점 없이 질환에 대한 주요한 구성요소일 것이다. 예를 들어, SCID 및 일부 다른 면역결핍 및 FA에서, 보정된 세포는 이점이 있으며 치료 유전자를 "약간의" HSPC로 형질도입하는 것만이 치료 효능에 충분하다. 세포가 경쟁적 이점을 입증하지 않는 혈색소병증(즉, 겸상적혈구병 및 지중해빈혈)과 같은 다른 질환의 경우, 유전자 보정된 세포의 생체내 선택은 MGMTP140K와 같은 생체내 선택 카세트와의 조합과 같이, 약간의 형질도입된 HSPC를 선택하여, 유전자 교정된 세포에서 증가를 허용하고 치료 효능을 달성하기 위함이다. 이 접근법은 또한 HSPC가 생체외 유전적 변형보다는 생체내 HIV에 내성을 가짐으로써 HIV에 적용될 수 있다.
I(C)(iv). 스터퍼 서열
특정 구현예에서, 벡터는 스터퍼 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 스터퍼 서열은　 게놈을 야생형 길이에 가까운 크기로 만들기 위해 추가될 수 있다. 스터퍼는　 길이를 확장하기 위해 의도된 기능적으로 불활성인 서열을 정의하기 위해 의도된 당업계에서 일반적으로 인식되는 용어이다
스터퍼 서열은 벡터의 효율적인 패키징 및 안정성을 달성하기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 스터퍼 서열은 게놈 크기를 야생형 바이러스 게놈 크기의 70% 내지 110%로 만드는 데 사용된다.
스터퍼　서열은　바람직하게는 포유류 기원의 임의의 DNA일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서,　스터퍼　서열은 포유류 기원의 비-코딩 서열, 예를 들어 인트론 단편이다.
스터퍼 서열은 벡터의 크기를 미리 결정된 크기로 유지하는 데 사용될 때, 임의의 비-코딩 코딩 서열 또는 게놈을 분할 또는 비분할 세포에서 안정하게 유지하는 서열일 수 있다. 이들　서열은　다른 바이러스 게놈(예를 들어 엡스타인 바 바이러스) 또는 유기체(예를 들어 효모)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 이들 서열은　 센트로미어 및/또는 텔로미어의 기능적 부분일 수 있다.
I(C)(v). 페이로드 통합 및 지지 벡터
유전자 요법은 종종 원하는 핵산 페이로드를 표적 세포의 게놈 내로 통합하는 데 필요하다. 다양한 시스템은 페이로드를 숙주 또는 표적 세포 게놈 내로 통합하기 위해 다양한 시스템이 설계 및/또는 사용될 수 있다. 이러한 다양한 시스템은 특정 페이로드 서열 특징 및 지지 벡터 및 지지 게놈(지지 게놈) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
페이로드를 숙주 세포 게놈 내로 통합하는 아데노바이러스 벡터를 조작하는 한 가지 수단은 통합 바이러스 하이브리드 벡터을 생성하는 것이었다. 통합 바이러스 하이브리드 벡터는 표적 세포를 효율적으로 형질도입하는 벡터의 유전적 요소를 벡터 페이로드를 안정하게 통합하는 벡터의 유전적 요소와 조합한다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터와 조합하여 사용하기 위한 관심 통합 요소는 박테리오파지 인터그라제 PHiC31, 레트로트랜스포존, 레트로바이러스(예를 들어, LTR-매개 또는 레트로바이러스 통합-매개), 아연-핑거 뉴클레아제, DNA-결합 도메인-레트로바이러스 인터그라제 융합 단백질, AAV(예를 들어, AAV-ITR 또는 AAV-Rep 단백질-매개), 및 잠자는 미녀(SB) 트랜스포사제의 것들이 포함된다.
본원에 기재된 Ad35 벡터는 임의적으로 트랜스포사제 및 트랜스포존을 포함하는 전위성 요소를 포함할 수 있다. 트랜스포사제는 레트로트랜스포존 또는 레트로바이러스 기원의 인터그라제, 뿐만 아니라 전위 가능한 기능적 핵산-단백질 복합체의 구성요소이고 전위를 매개하는 효소를 포함할 수 있다. 전위 반응은 트랜스포존 및 트랜스포사제 또는 인터그라제 효소를 포함한다. 특정 구현예에서, 통합 효율, 통합될 수 있는 DNA 서열 크기, 및 게놈 내로 통합될 수 있는 DNA 서열의 카피 수는 이러한 전위성 요소를 사용함으로써 개선될 수 있다. 트랜스포존은 DNA의 더 큰 분절의 상류 및 하류에 있는 말단 반복부 서열을 갖는 짧은 핵산 서열을 포함한다. 트랜스포사제는 말단 반복부 서열에 결합하고 트랜스포존을 게놈의 또 다른 부분으로 이동시키는 것을 촉매화한다.
인간을 포함하는 척추동물의 게놈 내로 핵산의 삽입을 용이하게 하는 다수의 트랜스포사제가 당업계에 기재되었다. 이러한 트랜스포사제의 예는 잠자는 미녀("SB", 예를 들어, 연어과 어류의 게놈으로부터 유래); 피기백(piggyBac)(예를 들어, 인식목 세포 및/또는 마이오티스 루시푸구스(Myotis lucifugus)로부터 유래); 마리너(Mariner)(예를 들어, 드로소필라(Drosophila)로부터 유래); 개구리 왕자(frog prince)(예를 들어, 라나 피피엔스(Rana pipiens))로부터 유래; Tol1; Tol2(예를 들어, 송사리 어류로부터 유래); TcBuster(예를 들어, 붉은 밀가루갑충 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum)으로부터 유래), Helraiser, Himar1, Passport, Minos, Ac/Ds, PIF, Harbinger, Harbinger3-DR, HSmar1, 및 spinON을 포함한다.
피기백(PB) 트랜스포사제는 예를 들어, Fraser 등, Insect Mol. Biol., 1996, 5, 141-51; Mitra 등, EMBO J., 2008, 27, 1097-1109; Ding 등, Cell, 2005, 122, 473-83; 및 미국 특허 번호 6,218,185; 6,551,825; 6,962,810; 7,105,343; 및 7,932,088에 기재된 조밀한 기능적 트랜스포사제 단백질이다. 과활성 피기백 트랜스포사제는 US 10,131,885에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, PB 트랜스포사제는 서열번호: 291(GenBank ABS12111.1)에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 개구리 왕자 트랜스포사제는 서열번호: 292(GenBank: AAP49009.1)에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다. 또한 US2005/0241007을 참조한다.
특정 구현예에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호: 293(GenBank: ABF20545.1)에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, Tol2 트랜스포사제는 서열번호: 294(GenBank: BAA87039.1)에 제시된 서열을 갖는다.
DNA 트랜스포존에 대한 추가적인 정보는 예를 들면, Munoz-Lopez & Garcia Perez, Curr Genomics, 11(2):115-128, 2010에서 찾을 수 있다.
잠자는 미녀는 Ivics 등 Cell 91, 501-510, 1997; Izsvak 등, J. Mol. Biol., 302(1):93-102, 2000; Geurts 등, Molecular Therapy, 8(1): 108-117, 2003; Mates 등 Nature Genetics 41:753-761, 2009; 및 미국 특허 번호 6,489,458; 7,148,203; 및 7,160,682; 미국 공개 번호 2011/117072; 2004/077572; 및 2006/252140에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀 트랜스포사제 효소는 서열 서열번호: 73을 갖는다. 특정 구현예에서, 과활성 잠자는 미녀(SB100x) 트랜스포사제 효소는 서열 서열번호: 74를 갖는다.
SB 트랜스포사제의 활성을 증가시키기 위해 체계적인 돌연변이생성 연구가 수행되었다. 예를 들어, Yant 등은 알라닌에 대한 SB 트랜스포사제의 N-말단 95 AA의 체계적인 교환을 수행하였다(Mol. Cell Biol. 24: 9239-9247, 2004). 이들 치환 중 10 개는 참조로서 SB10과 비교하여 200-400% 사이의 과활성을 야기하였다. Baus 등(Mol. Therapy 12: 1148-1156, 2005)에 기재된 SB16은 SB10과 비교하여 16-배 활성 증가를 갖는 것으로 보고되었다. 추가적인 과활성 SB 변이체는 Zayed 등 (Molecular Therapy 9(2):292-304, 2004) 및 US 9,840,696에 기재되어 있다.
SB 트랜스포존은 전위하기 위해 원형화될 필요가 있다(Yant 등, Nature Biotechnology, 20: 999-1005, 2002). 또한, 1.9 내지 7.2 kb의 트랜스포존의 경우, 트랜스포존 및 전위 빈도의 길이 사이에 역 선형 관계가 있다. 다시 말해서, SB 트랜스포사제는 더 작은 트랜스포존과 비교하여 더 큰 트랜스포존의 전달을 덜 효율적으로 매개한다(Geurts 등, Mol Ther., 8(1):108-17, 2003).
SB 트랜스포사제는 SB ITR 사이에 위치한 핵산 트랜스포존 페이로드를 전위시킨다. 다양한 SB ITR이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, SB ITR은 트랜스포사제에 대한 인식 신호로서 역할을 하는 32 bp 길이의 불완전한 지시 반복부를 포함하는 230 bp 서열이다. pT, pT2, pT3, pT2B, 및 pT4로 알려진 SB ITR을 포함하는 조작된 SB ITR이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, pT4 ITR은 예를 들어, SB100x 트랜스포사제에 의한 전위를 위해, 예를 들어, 본 개시내용의 트랜스포존 페이로드를 플랭킹하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR(도립 반복부)/DR(지시 반복부) 및 염색체 서열을 암호화하는 서열은 서열번호: 4를 포함한다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR/DR 및 염색체 서열을 암호화하는 서열은 서열번호: 5를 포함한다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR/DR 암호화 서열은 서열번호: 295를 포함한다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR/DR 및 염색체 서열을 암호화하는 서열은 서열번호: 296을 포함한다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR/DR 및 염색체 서열을 암호화하는 서열은 서열번호: 297을 포함한다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR/DR을 암호화하는 서열은 서열번호: 298을 포함한다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR/DR 및 염색체 서열을 암호화하는 서열은 서열번호: 299를 포함한다. 특정 구현예에서, 잠자는 미녀의 IR/DR을 암호화하는 서열은 서열번호: 300을 포함한다.
다양한 구현예에서, Ad35 공여자 벡터 또는 게놈은 β-글로빈 발현 산물 또는 γ-글로빈 발현 산물을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 통합 요소를 플랭킹하는 SB100x 트랜스포존 도립 반복부를 포함하는 페이로드를 포함한다.
다양한 구현예에서, 아데노바이러스 전위 시스템은 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹된 통합 요소를 포함하는 Ad35 공여자 벡터 또는 게놈을 포함하고, 아데노바이러스 지지 벡터 또는 지지 게놈을 추가로 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 지지 벡터는 (i) 아데노바이러스 캡시드; 및 (ii) 통합 요소를 플랭킹하는 도립 반복부에 상응하는 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 지지 게놈을 포함한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 지지 벡터 또는 지지 게놈의 적어도 하나의 기능은 표적 세포에 투여된 공여자 벡터에 존재하는 통합 요소의 전위를 위한 트랜스포사제를 표적 세포에 암호화, 발현, 및/또는 전달할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, Ad35 공여자 벡터 또는 게놈은 β-글로빈 발현 산물 또는 γ-글로빈 발현 산물을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 통합 요소를 플랭킹하는 SB100x 트랜스포존 도립 반복부를 포함하고, 지지 벡터 또는 지지 게놈은 SB100x 트랜스포사제를 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 통합 요소가 트랜스포존 도립 반복부에 의해 플랭킹되고 트랜스포존 도립 반복부가 재조합효소 지시 반복부에 의해 플랭킹되는 경우 통합 요소는 재조합효소 지시 반복부에 의해 플랭킹된다. 이러한 특정 구현예에서, 지지 벡터 또는 지지 게놈의 적어도 하나의 기능은 표적 세포에 투여된 공여자 벡터에 존재하는 재조합효소 부위의 재조합을 위한 재조합효소를 표적 세포로 암호화, 발현, 및/또는 전달하는 것일 수 있다. 다양한 구현예에서, 지지 벡터 또는 지지 게놈은 표적 세포에 투여된 공여자 벡터에 존재하는 재조합효소의 부위의 재조합을 위해 재조합효소를 표적 세포로 암호화, 발현, 및/또는 전달할 수 있고 또한 표적 세포에 투여된 공여자 벡터에 존재하는 통합 요소의 전위를 위해 트랜스포사제를 표적 세포로 암호화, 발현, 및/또는 전달한다.
본원에 개시된 특정 구현예는 또한 부위-특이적 재조합효소 시스템을 사용한다. 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 치료 유전자 이외에도, 트랜스포사제-인식된 도립 반복부를 포함하는 트랜스포존은 또한 적어도 하나의 재조합효소-인식된 부위를 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용은 또한 다음을 투여하는 것을 포함하는 치료 유전자를 게놈 내로 통합하는 방법을 제공한다: (a) (i) 트랜스포사제에 의해 인식된 도립 반복 서열 및 (ii) 재조합효소-인식 부위에 의해 플랭킹된 치료 유전자를 포함하는 트랜스포존; 및 b) 플라스미드, 에피솜, 또는 이식유전자로부터 치료 유전자를 절제하고 치료 유전자를 게놈 내로 통합하는 역할을 하는 트랜스포사제 및 재조합효소. 일부 구현예에서, (b)의 단백질(들)은 단백질(들)을 암호화하는 핵산으로 투여된다. 일부 구현예에서, (b)의 단백질(들)을 암호화하는 트랜스포존 및 핵산은 별개의 벡터 상에 존재한다. 일부 구현예에서, (b)의 단백질(들)을 암호화하는 트랜스포존 및 핵산은 동일한 벡터 상에 존재한다. 동일한 벡터 상에 존재할 때, (b)의 단백질(들)을 암호화하는 벡터의 부분은 (a)의 트랜스포존을 보유하는 부분의 외부에 위치한다. 다시 말해서, 트랜스포사제 및/또는 재조합효소 암호화 영역은 도립 반복부 및/또는 재조합효소-인식 부위에 의해 플랭킹된 영역 외부에 위치한다. 전술된 방법에서, 트랜스포사제 단백질은 표적 세포 게놈 내로 삽입되는 핵산과 같은 삽입된 핵산을 플랭킹하는 도립 반복부를 인식한다. 재조합효소 및 재조합효소-인식된 부위의 사용은 게놈 내로 추가로 통합될 수 있는 트랜스포존의 크기를 증가시킬 수 있다.
재조합효소 시스템의 예는 Flp/Frt 시스템, Cre/loxP 시스템, Dre/rox 시스템, Vika/vox 시스템, 및 PhiC31 시스템을 포함한다.
Flp/Frt DNA 재조합효소 시스템은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 단리되었다. Flp/Frt 시스템은 Frt 인식 부위에서 DNA-재조합을 촉매화하는 재조합효소 Flp(플리파제)를 포함한다. 특정 구현예에서, Flp(플리파제)는 서열 서열번호: 75를 포함하고 FRT 인식 부위는 서열번호: 76을 포함한다.
Flp 단백질의 변이체는 서열번호: 77(GenBank: ABD57356.1) 및 서열번호: 78(GenBank: ANW61888.1)을 포함한다.
Cre/loxP 시스템은 예를 들어, EP 02200009B1에 기재되어 있다. Cre는 박테리오파지 P1로부터 단리된 부위-특이적 DNA 재조합효소이다. 특정 구현예에서, Cre는 서열 서열번호: 79를 포함한다.
Cre 단백질의 인식 부위는 loxP 부위(서열번호: 80)인 34 개 염기 쌍의 뉴클레이다. Cre는 13 개 염기 쌍 도립 반복부에 결합하고 스페이서 영역 내에서 가닥 절단 및 재결찰을 촉매화함으로써 34 bp loxP DNA 서열을 재조합한다. 스페이서 영역에서 Cre에 의해 만들어진 엇갈린 DNA 절단은 6 개의 염기 쌍에 의해 분리되어 동일한 중첩 영역을 갖는 재조합 부위로만 재조합을 보장하도록 상동성 센서로서 작용하는 중첩 영역을 제공한다. 또한 사용될 수 있는 lox 인식 부위의 변이체는 lox2272(서열번호: 81); lox511(서열번호: 82); lox66(서열번호: 83); lox71(서열번호: 84); loxM2(서열번호: 85); 및 lox5171(서열번호: 86)을 포함한다.
VCre/VloxP 재조합효소 시스템은 비브리오 플라스미드 p0908로부터 단리되었다. 특정 구현예에서, 이 시스템의 VCre 재조합효소는 서열번호: 87을 포함하고 VloxP 인식 부위는 서열번호: 88을 포함한다.
sCre/SloxP 시스템은 WO 2010/143606에 기재되어 있다. Dre/rox 시스템은 US 7,422,889 및 US 7,915,037B2에 기재되어 있다. 일반적으로 서열 서열번호: 89 및 rox 인식 부위(서열번호: 90)를 갖는 엔테로박테리아(Enterobacteria) 파지 D6으로부터 단리된 Dre 재조합효소를 포함한다.
Vika/vox 시스템은 미국 특허 번호 10,253,332에 기재되어 있다. 추가적으로, PhiC31 재조합효소는 AttB/AttP 결합 부위를 인식한다.
트랜스포존(도립 반복부 및/또는 재조합효소 인식 부위 포함)을 포함하는 벡터 핵산의 양, 및 많은 구현예에서 트랜스포사제 및/또는 재조합효소를 암호화하는 벡터 핵산의 양은 트랜스포존 핵산의 원하는 절제 및 삽입을 표적 세포 게놈 내로 제공하기에 충분한 세포 내로 도입된다. 이와 같이, 도입된 벡터 핵산의 양은 트랜스포사제 활성 및/또는 재조합효소 활성의 충분한 양 및 표적 세포 게놈 내로 삽입되는 것이 바람직한 트랜스포존의 충분한 카피 수를 제공하여야 한다. 특정 구현예는 트랜스포존 대 트랜스포사제/재조합효소를 1:1; 1:2; 또는 1:3 비로 포함한다.
대상 방법은 핵산의 표적 세포 게놈 내로의 안정된 통합을 초래한다. 안정된 통합이란 핵산이 일시적 기간을 초과하여 표적 세포 게놈에 존재하고 염색체 유전적 물질의 일부를 통과시켜 표적 세포의 자손에게 주는 것을 의미한다.
본 개시내용의 실시예 2는 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제가 32.4 kb 트랜스포존을 HSPC의 게놈 내로 통합하는 데 사용될 수 있다는 놀라운 결과를 기재한다. 이러한 구현예는 도 23에 도시된 바와 같이 Flp/Frt 시스템과 조합하여 SBX100의 사용을 포함한다.
이전에 나타낸 바와 같이, 특정 구현예는 상동성 아암을 활용하여 상동성 지시된 복구를 활용하는 유전적 작제물의 표적화된 삽입을 용이하게 한다. 상동성 아암은 절단 부위 및 상동성을 보유하는 게놈 서열 사이의 HDR을 지지하기 위해, 예를 들어, 절단 부위의 50 개 미만의 염기 이내 , 예를 들어, 30 개 염기 이내, 15 개 염기 이내, 10 개 염기 이내, 5 개 염기 이내, 또는 절단 부위를 바로 플랭킹하는, 절단 부위에서 게놈 서열에 충분한 상동성, 예를 들어 절단 부위를 플랭킹하는 뉴클레오티드 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 상동성을 갖는 임의의 길이일 수 있다. 상동성 아암은 일반적으로 게놈 서열, 예를 들어, 이중 가닥 파괴(DSB)가 발생하는 게놈 영역과 동일하다. 그러나, 나타낸 바와 같이, 절대적인 동일성은 필요하지 않다.
특정 구현예는 상동성-지시된 복구 주형 및 표적화된 게놈 서열 사이에 25, 50, 100, 또는 200 개 뉴클레오티드(nt), 또는 200 nt 초과의 서열 상동성(또는 10 내지 200 개 뉴클레오티드 사이, 또는 그 이상의 임의의 정수 값)을 갖는 상동성 아암을 활용할 수 있다. 특정 구현예에서, 상동성 아암은 40 - 1000 nt 길이이다. 특정 구현예에서, 상동성 아암 500-2500 개 염기 쌍, 700 - 2000 개 염기 쌍, 또는 800 -1800 개 염기 쌍. 특정 구현예에서, 상동성 아암은 적어도 800 개의 염기 쌍 또는 적어도 850 개의 염기 쌍을 포함한다. 상동성 아암의 길이는 또한 대칭적 또는 비대칭적일 수 있다.
특정 구현예는 표적 게놈의 상응하는 단편과 서열 동일성 또는 상동성을 갖는, 적어도 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 1,800, 2,000, 2,500, 또는 3,000 개 뉴클레오티드 또는 그 이상을 각각 포함하는 제1 및/또는 제2 상동성 아암을 활용할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 상동성 아암은 각각 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 또는 1,800 개 뉴클레오티드의 하한 및 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 1,800, 2,000, 2,500, 또는 3,000 개 뉴클레오티드의 상한을 갖는 표적 게놈의 상응하는 단편과 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 다수의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 상동성 아암은 각각 40 내지 1,000 개의 뉴클레오티드, 500 내지 2,500 개의 뉴클레오티드, 700 내지 2,000 개의 뉴클레오티드, 또는 800 내지 1800 개의 뉴클레오티드이거나, 또는 적어도 800 개 뉴클레오티드 또는 적어도 850 개 뉴클레오티드 길이를 갖는 표적 게놈의 상응하는 단편과 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 다수의 뉴클레오티드를 포함한다. 제1 및 제2 상동성 아암은 동일한, 유사한, 또는 상이한 길이를 가질 수 있다.
상동성 아암에 관한 추가적인 정보를 위해, Richardson 등, Nat Biotechnol. 34(3):339-44, 2016 참조.
특정 구현예에서, 유전적 작제물(예를 들어, 세포 내에서 치료 산물의 발현을 야기하는 유전자)은 게놈 안전 항구 내로 정확하게 삽입된다. 게놈 안전 항구 부위는 숙주 세포에 대한 부작용 없이 새롭게 통합된 DNA의 예측가능한 발현을 수용할 수 있는 게놈의 유전자내 또는 유전자외 영역이다. 유용한 안전 항구는 암호화된 단백질의 원하는 수준을 산출하기에 충분한 이식유전자 발현을 허용하여야 한다. 게놈 안전 항구 부위는 또한 세포 기능을 변경시키지 않아야 한다. 게놈 안전 항구 부위를 식별하는 방법은 Sadelain 등, Nature Reviews 12:51-58, 2012; 및 Papapetrou 등, Nat Biotechnol. 29(1):73-8, 2011에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 게놈 안전 항구 부위는 다음 기준 중 하나 이상(1, 2, 3, 4, 또는 5 개)를 충족한다: (i) 임의의 유전자의 5' 단부로부터 적어도 50 kb의 거리, (ii) 임의의 암-관련된 유전자로부터 적어도 300 kb의 거리, (iii) (천연 또는 조작된 뉴클레아제를 사용한 DNA 절단에 의해 측정된) 개방/접근가능한 염색질 구조 내, (iv) 유전자 전사 단위 외부의 위치 및 (v) 게놈의 초보존된 영역(UCR), microRNA 또는 긴 비-코딩 RNA 외부의 위치.
특정 구현예에서, 게놈 안전 항구의 기준을 충족하기 위해, 염색질 부위는 알려진 암유전자로부터 150 kb 초과로 멀리 떨어져 있어야 하고, 알려진 전사 시작 부위로부터 30 kb 초과로 멀리 떨어져 있어야 하고; 코딩 mRNA와 중첩되지 않아야 한다. 특정 구현예에서, 게놈 안전 항구의 기준을 충족하기 위해, 염색질 부위는 알려진 암유전자로부터 200　kb 초과로 멀리 떨어져 있어야 하고, 알려진 전사 시작 부위로부터 40　kb 초과로 멀리 떨어져 있어야 하고; 코딩 mRNA와 중첩되지 않아야 한다. 특정 구현예에서, 게놈 안전 항구의 기준을 충족하기 위해, 염색질 부위는 알려진 암유전자로부터 300　kb 초과로 멀리 떨어져 있어야 하고, 알려진 전사 시작 부위로부터 50　kb 초과로 멀리 떨어져 있어야 하고; 코딩 mRNA와 중첩되지 않아야 한다. 특정 구현예에서, 게놈 안전 항구는 전술한 기준을 충족하고(알려진 전사 시작 부위로부터 150　kb 초과, 200　kb 초과 또는 300　kb 초과로 멀리 떨어져 있고; 코딩 mRNA와 중첩되지 않고, 코딩 mRNA와 중첩하지 않고 알려진 전사 시작 부위로부터 40　kb 초과, 또는 50　kb 초과로 멀리 떨어져 있음) 추가적으로 관련 발견의 신속한 임상 번역을 허용하기 위해 관련 동물 모델의 동물 및 인간 게놈 사이에 100% 상동이다.
특정 구현예에서, 게놈 안전 항구는 본원에 기재된 기준을 충족하고 또한 유전자좌가 주변 유전적 물질에 영향을 미치지 않음을 추가로 입증하는 렌티바이러스 통합의 정방향:역방향의 1:1 비를 입증한다.
특정 게놈 안전 항구 부위는 CCR5, HPRT, AAVS1, Rosa 및 알부민을 포함한다. 또한, 적절한 게놈 안전 항구 통합 부위에 대한 추가적인 정보 및 옵션에 대해 예를 들어, 미국 특허 번호 7,951,925 및 8,110,379; 미국 공개 번호 2008/0159996; 2010/00218264; 2012/0017290; 2011/0265198; 2013/0137104; 2013/0122591; 2013/0177983 및 2013/0177960 참조.
당업계에 알려진 다양한 기술은 게놈 안전 항구와 같은 특이적 게놈 유전자좌에서 통합 요소의 통합을 지시하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 AAV-매개 유전자 표적화, 뿐만 아니라 부위-특이적 엔도뉴클레아제(아연-핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 효과기(TALE) 뉴클레아제), 및 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 DNA 이중 가닥 파괴의 도입에 의해 향상된 상동 재조합은 게놈 안전 항구와 같은 미리 결정된 게놈 유전자좌에서 외래 DNA의 표적화된 삽입을 매개할 수 있는 모든 도구이다. 면역억제 레지멘은 예를 들어, 미국 가출원 번호 제63/009,218호에 기재되어 있으며, 이는 특히 면역억제 레지멘과 관련하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 게놈 안전 항구와 같은 특이적 게놈 유전자좌에서 통합 요소의 통합은 표적 게놈의 CRISPR 효소-매개 절단을 사용한 상동성-지시된 통합을 포함할 수 있다. CRISPR 효소(예를 들어, Cas9)는 가이드 RNA(gRNA)에 의해 명시된 부위에서 이중 가닥 DNA를 절단한다. 이중 가닥 파괴는 공여자 주형(예컨대 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암을 포함하는 Ad35 페이로드 통합 요소)이 존재할 때 상동성-지시된 복구(HDR)에 의해 복구될 수 있다. 이러한 다양한 방법에서, 통합 요소는 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암(예를 들어, 500-3,000 bp)을 절단된 표적 게놈 내로 삽입하기 위해 포함한다는 점에서 "복구 주형"이다. CRISPR-매개 유전자 삽입은 DNA 주형의 자발적인 재조합과 비교하여 몇 배 더 효율적일 수 있으며, 이는 CRISPR-매개 유전자 삽입이 게놈 편집을 위한 효과적인 도구일 수 있음을 입증한다. 핵산 서열을 명시된 게놈 유전자좌 내로 상동성-지시 통합을 위한 예시적인 방법은 당업계, 예를 들어, Richardson 등 (Nat Biotechnol. 34(3):339-44, 2016)에 알려져 있다.
다양한 구현예에서, 표적 세포 게놈의 게놈 안전 항구에서 삽입을 위한 통합 요소를 포함하는 아데노바이러스 공여자 벡터는 최대 15　kb의 길이를 갖는 핵산 서열의 통합을 유발할 수 있다. 다양한 구현예에서, 게놈 안전 항구에서 표적 세포 게놈 내로의 통합을 위한 통합 요소는 예를 들어, 길이가 1　kb, 2　kb, 3　kb, 4　kb, 또는 5　kb의 하한 및 10　kb, 11　kb, 12　kb, 13　kb, 14　kb, 또는 15　kb의 상한을 갖는 적어도 1　kb, 2　kb, 3　kb, 4　kb, 5　kb, 6　kb, 7　kb, 8　kb, 9　kb, 10　kb, 11　kb, 12　kb, 13　kb, 14　kb, 또는 15　kb의 길이를 가질 수 있다.
II. 표적 세포 집단
다양한 구현예에서, 본 개시내용의 Ad35 공여자 벡터 및 게놈은 본원에 개시된 HSC, T 세포, B 세포, 및 종양 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 유형의 표적 세포를 형질도입할 수 있다.
II(A). HSC
특정 구현예에서, 벡터-표적화된 세포 유형은 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함한다. HSC는 CD46을 결합함으로써 생체내 유전적 변형을 위해 표적화된다. 나타낸 바와 같이, 본 개시내용 내에서, HSC는 CD46을 결합함으로써 생체내 유전적 변형을 위해 표적화된다. 벡터는 CD46 결합의 특이성 및/또는 강도를 증가시키기 위해 본원에 개시된 돌연변이를 포함할 수 있다. HSC는 또한 다음 마커 프로파일에 의해 식별될 수 있다: CD34+, Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+(HSC1) 및 CD34+CD38-CD45RA-CD90- CD49f+(HSC2). 인간 HSC1은 다음 프로파일에 의해 식별될 수 있다: CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+ 또는 CD34+/CD45RA-/CD90+ 및 마우스 LT-HSC는 Lin-Sca1+ckit+CD150+CD48-Flt3-CD34-에 의해 식별될 수 있다(여기서 Lin은 CD3, Cd4, CD8, CD11b, CD11c, NK1.1, Gr1, 및 TER119를 포함하는 성숙 세포의 임의의 마커의 발현 부재를 나타낸다). 특정 구현예에서, HSC는 CD164+ 프로파일에 의해 식별된다. 특정 구현예에서, HSC는 CD34+/CD164+ 프로파일에 의해 식별된다. HSC 마커 프로파일에 관한 추가적인 정보를 위해, WO2017/218948 참조.
II(B). T 세포
T-세포의 여러 상이한 하위세트가 발견되었으며, 각각은 별개의 기능이 있다. 예를 들어, 대부분의 T-세포는 여러 단백질의 복합체로서 존재하는 T-세포 수용체(TCR)가 있다. 실제 T-세포 수용체는 독립적인 T-세포 수용체 알파 및 베타(TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생성되고 α- 및 β-TCR 쇄라고 불리는 2 개의 개별 펩티드 쇄로 구성된다.
γδ T-세포는 표면 상에 별개의 T-세포 수용체(TCR)를 보유하는 T-세포의 작은 하위세트를 나타낸다. γδ T-세포에서, TCR은 하나의 γ-쇄 및 하나의 δ-쇄로 구성된다. 이 T-세포 그룹은 αβ T-세포보다 훨씬 덜 일반적이다(총 T-세포의 2%).
CD3은 모든 성숙 T 세포 상에서 발현된다. 활성화된 T-세포는 4-1BB (CD137), CD69, 및 CD25를 발현한다. CD5 및 트랜스페린 수용체는 또한 T-세포 상에서 발현된다.
T-세포는 추가로 헬퍼 세포(CD4+ T-세포) 및 세포독성 T-세포(CTL, CD8+ T-세포)로 분류될 수 있으며, 이는 세포용해성 T-세포를 포함한다. T 헬퍼 세포는 다른 기능 중에서 B 세포의 형질 세포로의 성숙 및 세포독성 T-세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 보조한다. 이들 세포는 또한 CD4+ T-세포로 알려져 있는데 표면 상에서 CD4 단백질을 발현하기 때문이다. 헬퍼 T-세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에서 발현된 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원과 함께 제시될 때 활성화되게 된다. 일단 활성화되면, 이들은 빠르게 분할되어 활성 면역 반응에서 조절하거나 또는 보조하는 사이토카인이라 불리는 작은 단백질을 분비한다.
세포독성 T-세포는 바이러스로 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. 이들 세포는 또한 CD8+ T-세포로 알려져 있는데 표면 상에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문이다. 이들 세포는 신체의 거의 모든 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 클래스 I과 회합된 항원에 대한 결합에 의해 표적을 인식한다.
특정 구현예에서, CAR은 세포독성 T-세포에서 발현되도록 유전적으로 변형된다.
본원에 사용된 바와 같은 "중추 기억" T-세포(또는 "TCM")는 이의 표면 상에서 CD62L 또는 CCR7 및 CD45RO를 발현하고, 미처리 세포와 비교하여 CD45RA를 발현하지 않거나 또는 이의 발현이 감소된 항원 경험 CTL을 지칭한다. 특정 구현예에서, 중추 기억 세포는 CD62L, CCR7, CD25, CD127, CD45RO, 및 CD95의 발현에 대해 양성이고, 미처리 세포와 비교하여 CD45RA의 발현이 감소된다.
본원에 사용된 바와 같은 "효과기 기억" T-세포(또는 "TEM")는 중추 기억 세포와 비교하여 이의 표면 상에서 CD62L을 발현하지 않거나 또는 이의 발현이 감소되고 미처리 세포와 비교하여 CD45RA를 발현하지 않거나 또는 이의 발현이 감소된 항원 경험 T-세포를 지칭한다. 특정 구현예에서, 효과기 기억 세포는 미처리 세포 또는 중추 기억 세포와 비교하여 CD62L 및 CCR7의 발현에 대해 음성이고, CD28 및 CD45RA의 가변 발현을 갖는다. 효과기 T-세포는 기억 또는 미처리 T-세포와 비교하여 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다.
본원에 사용된 바와 같은 "미처리" T-세포는 중추 또는 효과기 기억 세포와 비교하여 CD62L 및 CD45RA를 발현하고 CD45RO를 발현하지 않는 비-항원 경험 T 세포를 지칭한다. 특정 구현예에서, 미처리 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, 및 CD45RA를 포함하는 미처리 T-세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 한다.
II(C). B 세포
B 세포는 체액 반응의 매개체이며 항원에 특이적인 항체의 생산 및 방출을 담당한다. 여러 유형의 B 세포가 존재하며 이는 핵심 마커를 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 미성숙 B 세포는 CD19, CD20, CD34, CD38, 및 CD45R을 발현하고, 이들이 성숙함에 따라 핵심 발현된 마커는 CD19 및 IgM이다.
II(D). 종양
특정 구현예에서, 벡터는 종양을 표적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 종양은 종양 세포 상에 존재하지만 건강한 세포 상에서는 존재하지 않는 수용체를 표적화함으로써 표적화된다. 종양은 αv 인테그린에 결합함으로써 생체내 유전적 변형을 위해 표적화될 수 있다. αv 인테그린은 혈관신생에 중요한 역할을 한다. αvβ3 및 αvβ5 인테그린은 정상 내피 세포에서 부재하거나 또는 낮은 수준으로 발현되지만 종양의 혈관신생 혈관계에서 유도된다(Brooks 등, Cell, 79: 1157-1164, 1994; Hammes 등, Nature Med, 2: 529-533, 1996). 아미노펩티다제 N/CD13은 최근에 NGR 모티프에 대한 혈관신생 수용체로서 식별되었다(Burg 등, Cancer Res, 59:2869-74, 1999). 아미노펩티다제 N/CD13은 암의 혈관신생 혈관 및 다른 혈관신생 조직에서 강하게 발현된다.
특정 구현예에서, 벡터는 암 세포 항원 에피토프를 표적화함으로써 종양을 표적화할 수 있다. 암 세포 항원은 암 세포 또는 종양에 의해 발현된다.
특정 구현예에서, 암 세포 항원 에피토프는 암 세포에 의해 우선적으로 발현된다. "우선적으로 발현된"은 암 세포 항원이 다른 세포 유형과 비교하여 암 세포에 대한 더 높은 수준으로 발견됨을 의미한다. 일부 경우에, 암 항원 에피토프는 표적화된 암 세포 유형에 의해서만 발현된다. 다른 경우에, 암 항원은 비-표적화된 세포보다 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 더 많은 표적화된 암 세포 유형 상에서 발현된다.
특정 구현예에서, 암 세포 항원은 암성 및 건강한 조직 상에서 상당히 발현된다. 특정 구현예에서, 상당히 발현된은 이중특이적 항체의 사용이 표적내/암외 독성에 기반한 개발 동안 중단되었음을 의미한다. 특정 구현예에서, 상당히 발현된은 이중특이적 항체의 사용이 표적내/암외 독성에 기반한 잠재적인 부정적인 부작용에 관한 경고를 필요로 함을 의미한다. 일 예로서, 세툭시맙은 피부에서 EGFR 발현으로 인한 것으로 생각되는 여러 피부 발진과 연관된 항-EGFR 항체이다. 또 다른 예는 항-HER2 (ERBB2) 항체인 허셉틴(트라스투주맙)이다. 허셉틴은 심장에서 표적 발현으로 인한 심장독성과 연관되어 있다. 더욱이, CAR-T 세포로 Her2를 표적화하는 것은 폐에서 표적내, 암외 발현으로 인해 환자에게 치명적이었다.
표 12는 특정 암 유형에서 공동 발현될 가능성이 높은 암 항원의 예를 제공한다.
표 12
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보다 특정 예에서, 암 세포 항원은 다음을 포함한다: 메소텔린, MUC16, FOLR, PD-L1, ROR1, 글리피칸-2(GPC2), 디시알로강글리오시드(GD2), HER2, EGFR, EGFRvIII, CEA, CD56, CLL-1, CD19, CD20, CD123, CD30, CD33(전장), CD33(델타E2 변이체), CD33(C-말단 절두됨), BCMA, IGFR, MUC1, VEGFR, PSMA, PSCA, IL13Ra2, FAP, EpCAM, CD44, CD133, Tro-2, CD200, FLT3, GCC, 및 WT1. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 표적화된 항원은 신호 펩티드가 결여될 수 있다.
신경 세포 접착 분자 1(NCAM1)로도 알려져 있는 CD56은 세포-세포 및 세포-기질 접착에 수반되는 I형 막 당단백질이다. 이의 세포외 도메인은 N-말단에서 5 개의 IgG-유사 도메인 및 막-근위 영역에서 2 개의 피브로넥틴 III형 도메인을 갖는다.
디시알로강글리오시드 GalAc베타1-4(NeuAc알파2-8NeuAc알파2-3)Gal베타1-4Glc베타1- 1Cer(GD2)은 신경모세포종을 포함하는 다양한 종양에서 발현된다. 디시알로강글리오시드 항원 GD2는 시알산 및 지질 잔기에 의해 플랭킹된 올리고당류의 백본을 포함한다. 예를 들어, Cheresh (Surv. Synth. Pathol. Res. 4:97, 1987) 및 US 5,653,977 참조.
EGFR의 종양 특이적 돌연변이체인 EGFR 변이체 III(EGFRvIII)은 종종 야생형 EGFR 유전자 증폭과 연관된 게놈 재배열의 생성물이다. EGFRvIII은 엑손 2-7의 인프레임 결실에 의해 형성되어, 접합부에서 글리신 치환에 따른 267 개 아미노산의 결실로 이어진다. 절두된 수용체는 리간드에 결합하는 능력을 상실하지만 구성적 키나제 활성을 획득한다. 흥미롭게도, EGFRvIII은 동일한 종양 세포에서 전장 야생형 EGFR과 함께 빈번하게 공동 발현된다. 더욱이, EGFRvIII 발현 세포는 증가된 증식, 침입, 혈관신생 및 세포자멸사에 대한 내성을 나타낸다.
EGFRvIII은 다형성 교모세포종(GBM)에서 가장 흔히 발견된다. GBM의 25-35%는 이 절두된 수용체를 보유하는 것으로 추정된다. 더욱이, 이의 발현은 종종 보다 공격적인 표현형 및 나쁜 예후를 반영한다. GBM 이외에도, EGFRvIII의 발현은 또한 비-소세포 폐암, 두경부암, 유방암, 난소암 및 전립선암과 같은 다른 고형 종양에서 보고되었다. 대조적으로, EGFRvIII은 건강한 조직에서 발현되지 않는다.
특정 구현예에서, 표적화된 암 항원 에피토프는 표적화된 암 세포 또는 종양에 의한 높은 발현 또는 표적화된 암 세포 또는 종양에 의한 낮은 발현을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 높은 발현 및 낮은 발현은 유세포 분석 또는 형광-활성화 세포-분류(FACS)를 사용하여 결정될 수 있다. 유세포 분석의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "hi", "lo", "+" 및 "-"는 음성 또는 다른 집단에 대한 신호 강도를 지칭한다. 특정 구현예에서, 양성 발현(+)은 마커가 유세포 분석을 사용하여 세포 상에서 검출가능함을 의미한다. 특정 구현예에서, 음성 발현(-)은 마커가 유세포 분석을 사용하여 검출가능하지 않음을 의미한다. 특정 구현예에서, "hi"는 관심 마커의 양성 발현이 형광(예를 들어 FACS 사용)에 의해 측정될 때 발현에 대해 또한 양성인 다른 세포보다 더 밝음을 의미한다. 이러한 구현예에서, 당업자는 밝기가 검출 임계값을 기반으로 함을 인식한다. 일반적으로, 당업자는 먼저 음성 대조군 튜브를 분석하고, FSC 및 SSC에 의해 관심 집단 주위에 게이트(비트맵)를 설정하고 원하는 방출 파장에서 형광에 대한 광전자 증배관 전압 및 이득을 조정하여, 세포의 97%가 음성 대조군이 있는 형광 마커에 대해 염색되지 않은 것으로 보이도록 할 것이다. 일단 이러한 매개변수가 확립되면, 염색된 세포를 분석하고, 염색되지 않은 형광 세포 집단과 비교하여 형광을 기록하였다. 특정 구현예, 및 대표적인 전형적인 FACS 플롯에서, hi는 맨 오른쪽(x 라인) 또는 가장 높은 상단 라인(오른쪽 또는 왼쪽 상단)을 의미하는 반면 lo는 왼쪽 하단 사분면 내 또는 오른쪽 및 왼쪽 사분면 사이의 중간을 의미한다(그러나 음성 집단에 비해 이동됨). 특정 구현예에서, "hi"는 +의 20-배 초과, +의 30-배 초과, +의 40-배 초과, +의 50-배 초과, +의 60-배 초과, +의 70-배 초과, +의 80-배 초과, +의 90-배 초과, +의 100-배 초과, 또는 + 세포에 비해 검출가능한 형광의 증가 이상을 지칭한다. 반대로, "lo"는 "hi"로 정의된 것들의 상호간의 집단을 지칭할 수 있다.
II(E). 다른 표적
HSC, T 세포, B 세포, 및 종양(또는 암 세포) 외에도, 벡터는 박테리아 및 진균에 대한 다른 항원을 표적화할 수 있다.
박테리아를 표적화하는 항원은 예를 들어, 탄저병, 그람-음성균, 클라미디아, 디프테리아, 헬리코박터 파일로리, 결핵균, 백일해 독소, 폐렴구균, 리케차, 포도상구균, 연쇄상구균 및 파상풍으로부터 유래될 수 있다.
박테리아 항원 마커의 특정 예로서, 탄저병 항원은 탄저병 보호 항원을 포함하고; 그람-음성균 항원은 지질다당류를 포함하고; 디프테리아 항원은 디프테리아 독소를 포함하고; 결핵균 항원은 마이콜산, 열 충격 단백질 65(HSP65), 30 kDa 주요 분비 단백질 및 항원 85A를 포함하고; 백일해 독소 항원은 헤마글루티닌, 페르탁틴, FIM2, FIM3 및 아데닐레이트 사이클라제를 포함하고; 폐렴쌍구균 항원은 페렴구균용혈소 및 폐렴쌍구균 캡슐 다당류를 포함하고; 리케차 항원은 rompA를 포함하고; 연쇄상구균 항원은 M 단백질을 포함하고; 파상풍 항원은 파상풍 독소를 포함한다.
진균을 표적화하는 항원은 예를 들어, 칸디다, 콕시디오데스, 크립토코쿠스, 히스토플라스마, 리슈마니어, 말라리아원충, 원생동물, 기생체, 주혈흡충속, 백선, 톡소플라스마, 및 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터 유래될 수 있다.
진균 항원의 특정 예로서, 콕시디오데스 항원은 소구체 항원을 포함하고; 크립토코쿠스 항원은 캡슐 다당류를 포함하고; 히스토플라스마 항원은 열 충격 단백질 60(HSP60)을 포함하고; 리슈마니어 항원은 gp63 및 지질포스포글리칸을 포함하고; 열대열원충 항원은 낭충 표면 항원, 종충 표면 항원, 포자소체 항원, 생식모세포/배우자 표면 항원, 원생동물 및 혈액-단계 항원 pf 155/RESA를 포함하는 다른 기생체 항원을 포함하고; 주혈흡충속 항원은 글루타티온-S-트랜스퍼라제 및 파라마이오신을 포함하고; 백선 진균 항원은 백선균을 포함하고; 톡소플라스마 항원은 SAG-1 및 p30을 포함하고; 트리파노소마 크루지 항원은 75-77 kDa 항원 및 56 kDa 항원을 포함한다.
III. 투여량, 제형, 및 투여
벡터는 세포 또는 동물, 예를 들어, 인간에게 투여하기 위해 약제학적으로 허용되도록 제형화될 수 있다. 벡터는 시험관내, 생체외, 또는 생체내 투여될 수 있다. 본원에 기재된 Ad35 바이러스 벡터 벡터들은 대상체에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 제형은 치료 유전자("활성 성분") 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 연관된 Ad35 바이러스 벡터를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이, 벡터는 당업계에 알려진 임의의 형태일 수 있다. 이러한 형태는 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예를 들어, 주사가능 및 주입가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포솜 및 좌제를 포함한다.
임의의 특정 형태의 선택 또는 사용은 부분적으로 의도된 투여 방식 및 치료 적용에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 전신 또는 국소 전달을 위해 의도된 조성물을 함유하는 조성물은 주사가능 또는 주입가능 용액의 형태일 수 있다. 따라서, 벡터는 비경구 방식(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사)에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비경구 투여는 일반적으로 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 정맥내, 비강내, 안내, 폐, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 폐내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 대뇌내, 두개내, 경동맥내 및 수조내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비경구 투여 경로는 예를 들어, 주사에 의한 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 또는 경피 투여일 수 있다. 투여는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사에 의한 전신 또는 국소 투여일 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 고농도에서 안정된 저장에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능 용액은 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 본원에 기재된 조성물을 필요한 양으로 혼입한 후, 필터 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 본원에 기재된 조성물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 본원에 기재된 조성물의 분말 및 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가적인 바람직한 성분(하기 참조)를 산출하는 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들어, 모노스테아레이트 염, 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 야기될 수 있다.
벡터는 멸균 용액 또는 물 중 현탁액 또는 또 다른 약제학적으로 허용되는 액체를 포함하는 주사가능 제형 형태로 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 치료 분자를 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 매질, 예컨대 멸균수 및 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 향미 부형제, 희석제, 비히클, 보존제, 결합제와 적절하게 조합한 후, 일반적으로 허용되는 약제학적 관행에 필요한 단위 용량 형태로 혼합함으로써 제형화될 수 있다. 약제학적 제제에 포함되는 벡터의 양은 지정된 범위 내에서 적합한 용량이 제공되도록 한다. 유성 액체의 비제한적인 예는 참깨유 및 대두유를 포함하고, 가용화 제제로서 벤질 벤조에이트 또는 벤질 알코올과 조합될 수 있다. 포함될 수 있는 다른 항목은 포스페이트 완충제, 또는 나트륨 아세테이트 완충제와 같은 완충제, 프로카인 하이드로클로라이드와 같은 진정제, 젠질 알코올 또는 페놀과 같은 안정화제, 및 산화방지제이다. 제형화된 주사는 적합한 앰플에 패키징될 수 있다.
다양한 구현예에서, 피하 투여는 주사기, 미리 충전된 주사기, 자동 주사기(예를 들어, 일회용 또는 재사용가능), 펜 주사기, 패치 주사기, 착용가능한 주사기, 피하 주입 세트가 장착된 보행용 주사기 주입 펌프와 같은 장치, 또는 피하 주사를 위한 다른 장치에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 국소 투여 방식에 의해 대상체에게 치료적으로 전달될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "국소 투여" 또는 "국소 전달"은 혈관계를 통해 의도된 표적 조직 또는 부위에 벡터 또는 벡터를 수송하는 것에 의존하지 않는 전달을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 조성물 또는 제제의 주사 또는 이식 또는 조성물 또는 제제를 함유하는 장치의 주사 또는 이식에 의해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 조직 또는 부위 부근에 국소 투여 후, 조성물 또는 제제, 또는 이의 하나 이상의 구성요소는 투여 부위가 아닌 의도된 표적 조직 또는 부위로 확산될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 단위 투여 형태로 존재하며, 단위 투여 형태는 자기-투여에 적합할 수 있다. 이러한 단위 투여 형태는 용기, 전형적으로, 예를 들어, 바이알, 카트리지, 미리 충전된 주사기 또는 일회용 펜 내에 제공될 수 있다. US 6,302,855에 기재된 투약기 장치와 같은 투약기는 또한 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 주사 시스템과 함께 사용될 수 있다.
주사에 적합한 벡터 제형의 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액을 포함할 수 있다. 제형은 멸균될 수 있고 주사기의 안팎으로 적절한 흐름을 허용하기 위해 유체여야 한다. 제형은 또한 제조 및 저장 조건 하에 안정될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물 및 염수 또는 완충 수용액을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 바람직하게는, 등장성 제제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨이 제형에 사용될 수 있다.
게다가, 당업자는 또한 추가적인 전달 방법이 전기천공법, 초음파영동법, 골내 주사 방법을 통하거나 또는 유전자 총을 사용하는 것임을 고려할 수 있다. 벡터는 또한 마이크로칩, 나노-칩 또는 나노입자에 이식될 수 있다.
본원에 기재된 벡터의 적합한 용량은 예를 들어, 치료될 대상체의 연령, 성별, 및 체중, 치료될 병태 또는 질환, 및 사용되는 특정 벡터를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량에 영향을 미치는 다른 인자는 예를 들어, 병태 또는 질환의 유형 또는 중증도를 포함한다. 다른 인자는 예를 들어, 대상체에게 동시에 또는 이전에 영향을 미치는 다른 의학적 장애, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 유전적 소인, 식습관, 투여 시간, 배출률, 약물 조합, 및 대상체에게 투여되는 임의의 다른 추가적인 치료제를 포함할 수 있다. 벡터 투여의 적합한 수단은 치료될 병태 또는 질환에 기반하고 대상체의 연령 및 병태에 따라 선택될 수 있다. 투여 용량 및 방법은 환자의 체중, 연령, 병태 등에 따라 달라질 수 있고, 당업자에 의해 필요에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대한 특이적 투여량 및 치료 레지멘은 의사의 판단에 따라 조정될 수 있다.
벡터 용액은 치료 유효량의 본원에 기재된 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 유효량은 부분적으로, 투여되는 조성물의 효과, 또는 하나 초과의 제제의 사용되는 경우 조성물 및 하나 이상의 추가적인 활성 제제의 조합 효과에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 치료 유효량은 조성물의 임의의 독소 또는 유해 효과가 치료적으로 유익한 효과를 능가하는 더 큰 양일 수 있다.
다양한 경우에, 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 생리학적으로 호환가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 산 부가 염 또는 염기 부가 염을 포함할 수 있다.
예시적인 일반적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 임의의 및 모든 흡수 지연제, 산화방지제, 결합제, 완충제, 증강제 또는 충전제, 킬레이트화제, 코팅제, 붕해제, 분산 매질, 겔, 등장성제, 윤활제, 보존제, 염, 용매 또는 공용매, 안정화제, 계면활성제, 및/또는 전달 비히클을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 조성물, 예를 들어, 주사용 멸균 제형은 주사용 증류수를 비히클로 사용하여 통상적인 약제학적 관행에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 생리 식염수 또는 글루코스 및 다른 보충물 예컨대 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화나트륨을 함유하는 등장성 용액은 임의적으로 적합한 가용화제, 예를 들어, 에탄올과 같은 알코올 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알코올, 및 폴리소르베이트 80™, HCO-50 등과 같은 비이온성 계면활성제와 조합하여, 주사용 수용액으로 사용될 수 있다.
예시적인 산화방지제는 아스코르브산, 메티오닌, 및 비타민 E를 포함한다.
예시적인 완충제는 시트레이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 푸마레이트 완충제, 글루코네이트 완충제, 옥살레이트 완충제, 락테이트 완충제, 아세테이트 완충제, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제, 및/또는 트리메틸아민 염을 포함한다.
예시적인 킬레이트화제는 EDTA이다.
예시적인 등장성제는 3가 또는 그 이상의 당을 포함하는 다가 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨, 또는 만니톨을 포함한다.
예시적인 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥사놀, 및 3-펜타놀을 포함한다.
안정화제는 증강제부터 활성 성분을 가용화하거나 또는 변성 또는 용기 벽에 부착을 방지하는 데 도움이 되는 첨가제까지 다양한 기능을 할 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알코올; 아미노산, 예컨대 알라닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 및 트레오닌; 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤, 및 사이클리톨, 예컨대 이노시톨; PEG; 아미노산 중합체; 황-함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤, 및 나트륨 티오술페이트; 저분자량 폴리펩티드(즉, 10 개 미만의 잔기); 단백질 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류 예컨대 크실로스, 만노스, 프럭토스 및 글루코스; 이당류 예컨대 락토스, 말토스 및 수크로스; 삼당류 예컨대 라피노스, 및 다당류 예컨대 덱스트란을 포함할 수 있다. 안정화제는 전형적으로 치료 중량을 기준으로 0.1 내지 10,000 중량부의 범위로 존재한다.
본원에 개시된 제형은 예를 들어, 주사에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위해, 제형은 수용액으로, 예컨대 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수를 포함하는 완충액, 또는 이스코브의 변형된 듀벨코 배지(IMDM)와 같은 배양 배지에서 제형화될 수 있다. 수용액은 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제형은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 무발열원수로 구성하기 위한 동결건조 및/또는 분말 형태일 수 있다.
본원에 개시된 임의의 제형은 유리하게는 투여 이익을 능가하는 상당히 유해하거나, 알레르기성이거나, 또는 다른 불리한 반응을 생성하지 않는 것들을 포함하는 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체 및 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 기재되어 있다. 더욱이, 제형은 US FDA 생물학적 표준 사무국(Office of Biological Standards) 및/또는 다른 관련한 외국 규제 기관에서 요구하는 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성, 및 순도 표준을 충족시키도록 제조될 수 있다.
특정 구현예에서, 제형은 제형의 적어도 0.1% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 1% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 10% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 20% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 30% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 40% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 50% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 60% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 70% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 80% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 90% w/v 또는 w/w; 제형의 적어도 95% w/v 또는 w/w; 또는 제형의 적어도 99% w/v 또는 w/w의 활성 성분을 포함한다.
특정 대상체에게 투여되는 Ad35 바이러스 벡터 및, 특정 구현예에서, Ad35 바이러스 벡터 및 동원 인자의 실제 용량 및 양 및 일치하는 동원 절차 및 일정은 예를 들어, 표적; 체중; 병태 유형; 병태 중증도; 알려진 경우 예정된 관련 사건; 이전 또는 동시 치료 개입; 대상체의 특발성; 및 투여 경로를 포함하는 물리적 및 생리학적 인자와 같은 매개변수를 고려하여 의사, 수의사, 또는 연구자에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 및 생체내 검정은 임의적으로 최적의 투여량 범위를 식별하는 것을 돕기 위해 이용될 수 있다.
치료 유전자와 연관된 Ad35 벡터의 치료 유효량은 예를 들어, 1 x 107 내지 50 x 108 감염 단위(IU) 또는 5 x 107 내지 20 x 108 IU 범위의 용량을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 용량은 5 x 107 IU, 6 x 107 IU, 7 x 107 IU, 8 x 107 IU, 9　x 107 IU, 1 x 108 IU, 2 x 108 IU, 3 x 108 IU, 4 x 108 IU, 5 x 108 IU, 6 x 108 IU, 7 x 108 IU, 8 x 108 IU, 9 x 108 IU, 10 x 108 IU, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 유전자와 연관된 Ad35 벡터의 치료 유효량은 4 x 108 IU를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료 유전자와 연관된 Ad35 벡터의 치료 유효량은 피하로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 유전자와 연관된 Ad35 벡터의 치료 유효량은 하나 이상의 동원 인자와 함께 투여 후 투여될 수 있다.
본 개시내용의 다양한 구현예에서, 생체내 유전자 요법은 적어도 하나의 바이러스 유전자 요법 벡터를 적어도 하나의 면역 억제 레지멘과 조합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 지지 벡터인 제2 벡터와 조합된 지지된 바이러스 유전자 요법 벡터인 제1 벡터와 같은 하나 초과의 벡터 종을 포함하는 생체내 유전자 요법에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 단일 제형 또는 투여 형태 또는 2 개의 별개의 제형 또는 투여 형태로 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 벡터는 동시에 또는 상이한 시간에, 예를 들어, 동일한 1 시간 기간 동안 또는 중첩하지 않는 1 시간 기간 동안 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 벡터는 동시에 또는 상이한 시간에, 예를 들어, 동일한 날 또는 상이한 날에 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 벡터는 예를 들어, 투여량이 총 바이러스 입자 수 또는 대상체의 킬로그램 당 바이러스 입자의 수로 측정되는 경우 동일한 투여량 또는 상이한 투여량으로 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 벡터는 미리 정의된 비율로 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 비율은 2:1 내지 1:2 범위 내, 예를 들어, 1:1이다.
다양한 구현예에서, 벡터는 하루에 단일 총 용량으로 대상체에게 투여된다. 다양한 구현예에서 벡터는 함께 총 용량을 구축하는 2, 3, 4, 또는 그 이상의 단위 용량으로 투여된다. 다양한 구현예에서, 벡터의 1 단위 용량은 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 또는 그 이상의 연속 일 각각에 하루에 대상체에게 투여된다. 다양한 구현예에서, 벡터의 2 단위 용량은 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 또는 그 이상의 연속 일 각각에 하루에 대상체에게 투여된다. 따라서, 다양한 구현예에서, 일일 용량은 하루에 걸쳐 대상체가 받는 벡터의 용량을 지칭할 수 있다. 다양한 구현예에서, 용어 일은 첫번째 달력 날짜의 자정부터 다음 달력 날짜의 자정까지 24 시간 기간과 같은 24 시 기간을 지칭한다.
다양한 구현예에서, 바이러스 유전자 요법 벡터 또는 지지 벡터와 같은 벡터의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량, 또는 바이러스 유전자 요법 벡터 및 지지 벡터의 총 조합 용량은 킬로그램 당 적어도 1E8, 5E8, 1E9, 5E9, 1E10, 5E10, 1E11, 5E11, 1E12, 5E12, 1E13, 5E13, 1E14, 또는 1E15 바이러스 입자(vp/kg)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 바이러스 유전자 요법 벡터 또는 지지 벡터와 같은 벡터의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량, 또는 바이러스 유전자 요법 벡터 및 지지 벡터의 총 조합 용량은 1E8, 5E8, 1E9, 5E9, 1E10, 5E10, 1E11, 5E11, 1E12, 5E12, 1E13, 5E13, 1E14, 또는 1E15 vp/kg으로부터 선택된 하한 및 1E8, 5E8, 1E9, 5E9, 1E10, 5E10, 1E11, 5E11, 1E12, 5E12, 1E13, 5E13, 1E14, 또는 1E15 vp/kg으로부터 선택된 상한을 갖는 범위 내에 속할 수 있다.
다양한 구현예에서, 바이러스 유전자 요법 벡터는 적어도 1E10, 5E10, 1E11, 5E11, 1E12, 5E12, 1E13, 5E13, 1E14, 또는 1E15 vp/kg의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량으로 투여되고 지지 벡터는 적어도 1E8, 5E8, 1E9, 5E9, 1E10, 5E10, 1E11, 및 5E11 vp/kg의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량으로 투여되며, 임의적으로 여기서 바이러스 유전자 요법 벡터의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량은 1E10, 5E10, 1E11, 5E11, 1E12, 및 5E12, vp/kg으로부터 선택된 하한 및 1E11, 5E11, 1E12, 5E12, 1E13, 5E13, 1E14, 및 1E15 vp/kg으로부터 선택된 상한을 갖는 범위 내에 있고/있거나, 지지 벡터의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량은 1E8, 5E8, 1E9, 5E9, 1E10, 및 5E10 vp/kg으로부터 선택된 하한 및 1E9, 5E9, 1E10, 5E10, 1E11, 및 5E11 vp/kg으로부터 선택된 상한을 갖는 범위 내에 있다.
다양한 구현예에서, 지지 벡터는 적어도 1E10, 5E10, 1E11, 5E11, 1E12, 5E12, 1E13, 5E13, 1E14, 또는 1E15 vp/kg의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량으로 투여되고 지지된 바이러스 유전자 요법 벡터는 적어도 1E8, 5E8, 1E9, 5E9, 1E10, 5E10, 1E11, 및 5E11 vp/kg의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량으로 투여되며, 임의적으로 여기서 지지 벡터의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량은 1E10, 5E10, 1E11, 5E11, 1E12, 및 5E12, vp/kg으로부터 선택된 하한 및 1E11, 5E11, 1E12, 5E12, 1E13, 5E13, 1E14, 및 1E15 vp/kg으로부터 선택된 상한을 갖는 범위 내에 있고/있거나, 지지된 바이러스 유전자 요법 벡터의 단위 용량, 일일 용량, 또는 총 용량은 1E8, 5E8, 1E9, 5E9, 1E10, 및 5E10 vp/kg으로부터 선택된 하한 및 1E9, 5E9, 1E10, 5E10, 1E11, 및 5E11 vp/kg으로부터 선택된 상한을 갖는 범위 내에 있다. 다양한 구현예에서, 지지된 바이러스 유전자 요법 벡터 및 지지 벡터는 미리 정의된 비율로 투여된다. 다양한 구현예에서, 비율은 2:1 내지 1:2 범위 내, 예를 들어, 1:1이다.
IV. 적용
본원에 제공된 방법 및 조성물은 적어도 부분적으로 생체내 유전자 요법에 사용하기 위해 개시된다. 그러나, 의심의 여지를 피하기 위해, 본 개시내용은 세포 및/또는 조직의 생체외 조작, 뿐만 아니라 연구 목적을 위한 세포 및/또는 조직의 조작을 포함하는 시험관내 사용을 위해 본원에 제공된 조성물 및 방법의 사용을 명시적으로 포함한다. 유전자 요법은 외인성 DNA를 숙주 세포(예컨대 표적 세포) 및/또는 핵산(예컨대 표적 핵산, 예컨대 표적 게놈, 예를 들어, 표적 세포의 게놈) 내로 도입하는 방법에서 본 개시내용의 벡터, 게놈, 또는 시스템의 사용을 포함한다. 본 개시내용은 당업자가 본원에 제공된 다양한 방법 및 조성물이 일반적으로 핵산 페이로드를 대상체, 예를 들어, 숙주 또는 표적 세포 내로 도입하도록 적용가능함을 이해하는 생체내, 시험관내, 및 생체외 요법과 관련한 조성물 및 방법의 설명 및 예시를 포함한다. 이러한 조성물 및 방법은 예를 들어, 유전자 요법에서 일반적으로 유용하기 때문에, 일반적으로 유전자 요법 및 본원에 제공된 것들을 포함하는 특히 다양한 특정 조건에서 모두 도구로서 유용하다.
IV(A). 생체내 유전자 요법
바이러스 벡터를 환자에게 직접 전달하는 것을 포함하는 생체내 유전자 요법을 사용한 치료가 탐구되었다. 생체내 유전자 요법은 임의의 유전자독성 조건화(또는 유전자독성 조건화가 덜 요구될 수 있거나) 또는 생체외 세포 처리를 필요로 하지 않을 수 있기 때문에 매력적인 접근법이며 따라서 백신의 전달을 위해 이미 전 세계적으로 수행되는 것과 유사한 주사를 통해 요법이 투여될 수 있으므로, 개발도상국을 포함하여 전세계적으로 많은 기관에서 채택될 수 있다. 다양한 구현예에서 본 개시내용의 아데노바이러스 벡터를 사용한 생체내 유전자 요법 방법은 (i) 표적 세포 동원, (ii) 면역억제, (iii) 본원에 제공된 벡터, 게놈, 시스템 또는 제형의 투여, 및/또는 (iv) 형질도입된 세포 및/또는 아데노바이러스 벡터 또는 게놈의 페이로드의 통합요소를 통합한 세포의 선택 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 아데노바이러스 벡터 제형은 대상체(인간, 수의학 동물(개, 고양이, 파충류, 조류 등), 가축(말, 소, 염소, 돼지, 닭 등), 및 연구 동물(원숭이, 래트, 마우스, 어류 등)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 대상체를 치료하는 것은 치료 유효량의 본 개시내용의 하나 이상의 벡터, 게놈, 또는 시스템을 전달하는 것을 포함한다. 치료 유효량은 유효량, 예방적 치료, 및/또는 치료적 치료를 제공하는 것을 포함한다.
IV(A)i. HSC의 동원
본원에 기재된 벡터는 동원 인자와 함께 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터 제형은 HSPC 동원과 협력하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스 공여자 벡터의 투여는 하나 이상의 동원 인자의 투여와 동시에 발생한다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스 공여자 벡터의 투여는 하나 이상의 동원 인자의 투여 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스 공여자 벡터의 투여는 첫번째 하나 이상의 동원 인자의 투여 후에 수행되고 두번째 하나 이상의 동원 인자의 투여와 동시에 발생한다. HSPC 동원을 위한 제제는 예를 들어, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), AMD3100, SCF, S-CSF, CXCR4 길항제, CXCR2 작용제, 및 Gro-베타(GRO-β)를 포함한다. 다양한 구현예에서, CXCR4 길항제는 AMD3100이고/이거나 CXCR2 작용제는 GRO-β이다.
G-CSF는 HSPC 동원에서의 기능이 과립구 확장의 촉진 및 접착 분자의 프로테아제-의존적 및 독립적 감쇠 및 SDF-1/CXCR4 축의 파괴 둘 다를 포함할 수 있는 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 당업자에게 알려진 임의의 상업적으로 이용가능한 형태의 G-CSF, 예를 들어, 필그라스팀(Filgrastim)(Neupogen®, Amgen Inc., 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재) 및 PEGy길화 필그라스팀(페그필그라스팀(Pegfilgrastim), NEULASTA®, Amgen Inc., 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재)이 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제형에 사용될 수 있다.
GM-CSF는 사이토카인으로 기능하며 대식세포, T 세포, 비만 세포, 자연 살해 세포, 내피 세포, 및 섬유모세포에 의해 자연적으로 분비되는 콜로니-자극 인자 2(CSF2)로도 알려진 단량체성 당단백질이다. 특정 구현예에서, 당업자에게 알려진 임의의 상업적으로 이용가능한 형태의 GM-CSF, 예를 들어, 사르그라모스팀(Sargramostim)(Leukine, Bayer Healthcare Pharmaceuticals, 워싱턴주 시애틀 소재) 및 몰그라모스팀(molgramostim)(Schering-Plough, 뉴저지주 케닐워스 소재)은 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제형에 사용될 수 있다.
비사이클람 클래스의 합성 유기 분자인 AMD3100(MOZOBIL™, PLERIXAFOR™; Sanofi-Aventis, 프랑스 파리 소재)은 케모카인 수용체 길항제이며 CXCR4에 대한 SDF-1 결합을 가역적으로 억제하여, HSPC 동원을 촉진한다. AMD3100은 골수종 및 림프종 환자에서 HSPC 동원을 위해 G-CSF와 조합하여 사용되도록 승인되었다. AMD3100의 구조는 하기와 같다:
Figure pct00016
KIT 리간드, KL, 또는 강철 인자로도 알려져 있는 SCF는 c-kit 수용체(CD117)에 결합하는 사이토카인이다. SCF는 막관통 단백질 및 가용성 단백질 둘 다에 존재할 수 있다. 이 사이토카인은 조혈, 정자생성, 및 멜라닌생성에서 중요한 역할을 한다. 특정 구현예에서, 당업자에게 알려진 임의의 상업적으로 이용가능한 형태의 SCF, 예를 들어, 재조합 인간 SCF(안세스팀(Ancestim), STEMGEN®, Amgen Inc., 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재)는 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제형에 사용될 수 있다.
집중적인 골수억제 치료에 사용되는 화학요법은 또한 화학요법-유도된 무형성증에 따른 보상 호중구 생성의 결과로 HSPC를 말초 혈액으로 동원한다. 특정 구현예에서, HSPC의 동원을 위해 사용될 수 있는 화학치료제는 사이클로포스파미드, 에토포시드, 이포스파미드, 시스플라틴, 및 사이타라빈을 포함한다.
세포 동원을 위해 사용될 수 있는 추가적인 제제는 다음을 포함한다: CXCL12/CXCR4 조절인자(예를 들어, CXCR4 길항제: POL6326(Polyphor, 스위스 알슈빌 소재), CXCR4를 가역적으로 억제하는 합성 환형 펩티드; BKT-140(4F-벤조일-TN14003; Biokine Therapeutics, 이스라엘 레호보트 소재); TG-0054(Taigen Biotechnology, 태국 타이베이 소재); SDF-1에 결합하여, CXCR4)에 대한 결합을 억제하는 CXCL12 중화제 NOX-A12(NOXXON Pharma, 독일 베를린 소재); 스핑고신-1-포스페이트(S1P) 작용제(예를 들어, SEW2871, Juarez 등 Blood 119: 707-716, 2012); 혈관 세포 접착 분자-1(VCAM) 또는 매우 후기 항원 4(VLA-4) 억제제(예를 들어, VLA-4의 α4 서브유닛에 대한 재조합 인간화 단클론 항체인 나탈리주맙(Zohren 등 Blood 111: 3893-3895, 2008); VLA-4의 소분자 억제제인 BIO5192(Ramirez 등 Blood 114: 1340-1343, 2009)); 파라갑상선 호르몬(Brunner 등 Exp Hematol. 36: 1157-1166, 2008); 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉, Ghobadi 등 ASH Annual Meeting Abstracts. p. 583, 2012); CXCR2 수용체에 대한 결합에 의해 호중구의 화학주성 및 활성화를 자극하는 CXC 케모카인 패밀리의 구성원인 Groβ(예를 들어, SB-251353, King 등 Blood 97: 1534-1542, 2001); 저산소증 유도성 인자(HIF)의 안정화(예를 들어, FG-4497, Forristal 등 ASH Annual Meeting Abstracts. p. 216, 2012); α4β1 및 α4β7 인테그린 억제제(α4β1/7)인 피라테그라스트(Kim 등 Blood 128: 2457-2461, 2016); α4β7 인테그린에 대한 인간화 단클론 항체인 베돌리주맙(Vedolizumab)(Rosario 등 Clin Drug Investig 36: 913-923, 2016); 및 인테그린 α9β1/α4β1을 표적화하는 BOP(N-(벤젠술포닐)-L-프롤릴-L-O-(1-피롤리디닐카르보닐) 티로신)(Cao 등 Nat Commun 7: 11007, 2016). HSPC 동원을 위해 사용될 수 있는 추가적인 제제는 예를 들어, Richter R 등 Transfus Med Hemother 44:151-164, 2017, Bendall & Bradstock, Cytokine & Growth Factor Reviews 25: 355-367, 2014, WO 2003043651, WO 2005017160, WO 2011069336, US 5,637,323, US 7,288,521, US 9,782,429, US 2002/0142462, 및 US 2010/02268에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, G-CSF의 치료 유효량은 0.1 μg/kg 내지 100 μg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, G-CSF의 치료 유효량은 0.5 μg/kg 내지 50 μg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, G-CSF의 치료 유효량은 0.5　μg/kg, 1 μg/kg, 2 μg/kg, 3 μg/kg, 4 μg/kg, 5 μg/kg, 6 μg/kg, 7 μg/kg, 8 μg/kg, 9 μg/kg, 10 μg/kg, 11　μg/kg, 12 μg/kg, 13 μg/kg, 14 μg/kg, 15 μg/kg, 16 μg/kg, 17 μg/kg, 18 μg/kg, 19　μg/kg, 20 μg/kg, 또는 그 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, G-CSF의 치료 유효량은 5 μg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, G-CSF는 피하로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, G-CSF는 1 일, 2 일 연속, 3 일 연속, 4　일 연속, 5 일 연속, 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, G-CSF는 4 일 연속 동안 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, G-CSF는 5　일 연속 동안 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 제제로서, G-CSF는 Ad35 전달 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 일 전에 시작하여, 매일 피하로 10 μg/kg의 용량으로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, G-CSF는 단일 제제로서 투여된 후 또 다른 동원 인자와 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, G-CSF는 단일 제제로 투여된 후 AMD3100과 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 프로토콜은 G-CSF가 1 일, 2 일, 3 일, 및 4 일 및 5 일에 투여될 수 있는 경우 5 일 치료를 포함하며, G-CSF 및 AMD3100은 Ad35 투여 6 내지 8 시간 전에 투여된다.
투여될 GM-CSF의 치료 유효량은 예를 들어, 0.1 내지 50 μg/kg 또는 0.5 내지 30 μg/kg 범위의 용량을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, GM-CSF가 투여될 수 있는 용량은 0.5 μg/kg, 1 μg/kg, 2 μg/kg, 3 μg/kg, 4　μg/kg, 5　μg/kg, 6 μg/kg, 7　μg/kg, 8 μg/kg, 9 μg/kg, 10 μg/kg, 11 μg/kg, 12 μg/kg, 13 μg/kg, 14　μg/kg, 15　μg/kg, 16 μg/kg, 17　μg/kg, 18 μg/kg, 19 μg/kg, 20 μg/kg, 또는 그 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, GM-CSF는 1 일, 2 일 연속, 3　일 연속, 4 일 연속, 5 일 연속, 또는 그 이상 동안 피하로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, GM-CSF는 피하로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, GM-CSF는 Ad35 전달 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 일 전에 시작하여 매일 피하로 10 μg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, GM-CSF는 단일 제제로서 투여된 후 또 다른 동원 인자와 통시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, GM-CSF는 단일 제제로서 투여된 후 AMD3100과 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 프로토콜은 GM-CSF가 1 일, 2 일, 3 일, 및 4 일 및 5 일에 투여될 수 있는 경우 5 일 치료를 포함하며, GM-CSF 및 AMD3100은 Ad35 투여 6 내지 8 시간 전에 투여된다. 사르그라모스팀에 대한 투약 레지멘은 200 μg/m2, 210 μg/m2, 220 μg/m2, 230 μg/m2, 240 μg/m2, 250 μg/m2, 260 μg/m2, 270　μg/m2, 280 μg/m2, 290 μg/m2, 300 μg/m2, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 사르그라모스팀은 1 일, 2 일 연속, 3 일 연속, 4 일 연속, 5　일 연속, 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 사르그라모스팀은 피하로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 사르그라모스팀에 대한 투약 레지멘은 250 μg/m2/일 정맥내 또는 피하를 포함할 수 있고 표적화된 세포 양이 말초 혈액에서 도달할 때까지 계속될 수 있거나 또는 5 일 동안 계속될 수 있다. 특정 구현예에서, 사르그라모스팀은 단일 제제로서 투여된 후 또 다른 동원 인자와 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 사르그라모스팀은 단일 제제로서 투여된 후 AMD3100과 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 프로토콜은 사르그라모스팀이 1 일, 2 일, 3 일, 및 4 일 및 5 일에 투여될 수 있는 경우 5 일 치료를 포험마며, 사르그라모스팀 및 AMD3100은 Ad35 투여 6 내지 8 시간 전에 투여된다.
특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 0.1　mg/kg 내지 100 mg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 0.5　mg/kg 내지 50 mg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16　mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19　mg/kg, 20 mg/kg, 또는 그 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 4 mg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 5 mg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 10 μg/kg 내지 500 μg/kg 또는 50 μg/kg 내지 400 μg/kg을 포함한다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 100 μg/kg, 150 μg/kg, 200 μg/kg, 250 μg/kg, 300 μg/kg, 350 μg/kg, 또는 그 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, AMD3100은 피하로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, AMD3100은 Ad35 전달 6 내지 11 시간 전에 160-240 μg/kg으로 피하로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 또 다른 동원 인자의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 또 다른 동원 인자의 투여 후에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, AMD3100의 치료 유효량은 G-CSF의 투여 후에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 프로토콜은 G-CSF가 1 일, 2 일, 3 일, 및 4 일 및 5 일에 투여되는 경우 5-일 치료를 포함하며, G-CSF 및 AMD3100은 Ad35 주사 6 내지 8 시간 전에 투여된다.
투여될 SCF의 치료 유효량은 예를 들어, 0.1 내지 100 μg/kg/일 또는 0.5 내지 50 μg/kg/일 범위의 용량을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, SCF가 투여될 수 있는 용량은 0.5 μg/kg/일, 1 μg/kg/일, 2 μg/kg/일, 3　μg/kg/일, 4 μg/kg/일, 5 μg/kg/일, 6 μg/kg/일, 7 μg/kg/일, 8 μg/kg/일, 9 μg/kg/일, 10　μg/kg/일, 11　μg/kg/일, 12　μg/kg/일, 13 μg/kg/일, 14 μg/kg/일, 15 μg/kg/일, 16　μg/kg/일, 17　μg/kg/일, 18 μg/kg/일, 19 μg/kg/일, 20 μg/kg/일, 21 μg/kg/일, 22　μg/kg/일, 23　μg/kg/일, 24 μg/kg/일, 25 μg/kg/일, 26 μg/kg/일, 27 μg/kg/일, 28　μg/kg/일, 29　μg/kg/일, 30 μg/kg/일, 또는 그 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, SCF는 1　일, 2 일 연속, 3 일 연속, 4　일 연속, 5　일 연속, 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, SCF는 피하로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, SCF는 20 μg/kg/일로 피하로 주사될 수 있다. 특정 구현예에서, SCF는 단일 제제로서 투여된 후 또 다른 동원 인자와 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, SCF는 단일 제제로서 투여된 후 AMD3100과 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 프로토콜은 SCF가 1 일, 2 일, 3 일, 4 일 및 5 일에 투여될 수 있는 경우 5 일 치료를 포함하며, SCF 및 AMD3100은 Ad35 투여 6 내지 8 시간 전에 투여된다.
특정 구현예에서, 성장 인자 GM-CSF 및 G-CSF는 골수 틈새에서 HSPC를 말초 순환 혈액에 동원하여 혈액에서 순환하는 HSPC의 분획을 증가시키기 위해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 동원은 G-CSF/필그라스팀(Amgen) 및/또는 AMD3100(Sigma)의 투여로 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 동원은 GM-CSF/사르그라모스팀(Amgen) 및/또는 AMD3100(Sigma)의 투여로 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 동원은 SCF/안세스팀(Ancestim)(Amgen) 및/또는 AMD3100(Sigma)의 투여로 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, G-CSF/필그라스팀의 투여는 AMD3100의 투여에 선행한다. 특정 구현예에서, G-CSF/필그라스팀의 투여는 AMD3100의 투여와 동시에 발생한다. 특정 구현예에서, G-CSF/필그라스팀의 투여는 AMD3100의 투여에 선행한 후, G-CSF/필그라스팀 및 AMD3100이 동시 투여된다. US 20140193376은 S1P 수용체 1(S1PR1) 조절인자 제제와 함께 CXCR4 길항제를 활용하는 동원 프로토콜을 기재한다. US 20110044997은 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR) 작용제와 함께 CXCR4 길항제를 활용하는 동원 프로토콜을 기재한다.
Ad35 바이러스 벡터는 HSPC 동원과 협력하여 투여될 수 있는 벡터의 예이다. 특정 구현예에서, Ad35 바이러스 벡터의 투여는 하나 이상의 동원 인자의 투여와 동시에 발생한다. 특정 구현예에서, Ad35 바이러스 벡터의 투여는 하나 이상의 동원 인자의 투여 후에 수행된다. 특정 구현예에서, Ad35 바이러스 벡터의 투여는 첫번째 하나 이상의 동원 인자의 투여 후에 수행되고 두번째 하나 이상의 동원 인자의 투여와 동시에 발생한다.
특정 구현예에서, CD19 면역독소 또는 5-FU와 같은 HSC 강화제는 HSPC를 강화하기 위해 투여될 수 있다. CD19 면역독소는 골수 세포의 30%를 차지하는 모든 CD19 계통 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 고갈은 골수로부터 빠져나가는 것을 부추긴다. HSPC가 증식하도록 강제함으로써(5-FU의 CD19 면역독소를 통해서든, 이는 분화를 자극하고 골수로부터 빠져나가고 말초 혈액 세포에서 이식유전자 마킹을 증가시킨다.
치료 유효량은 주사, 주입, 관류에 의한 것과 같은 임의의 적절한 투여 경로를 통해, 보다 특히 골수, 정맥내, 피내, 동맥내, 결절내, 림프내, 복강내 주사, 주입, 또는 관류 중 하나 이상에 의한 투여에 의해 투여될 수 있다).
IV(A)ii. 면역억제 레지멘
Ad35 바이러스 벡터는 하나 이상의 스테로이드, IL-1 수용체 길항제, 및/또는 IL-6 수용체 길항제 투여를 포함할 수 있는, 하나 이상의 면역억제제 또는 면역억제 레지멘의 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 프로토콜은 치료의 잠재적인 부작용을 완화할 수 있다.
IL-1 수용체 길항제는 알려져 있고 ADC-1001(Alligator Bioscience), FX-201(Flexion Therapeutics), Bioasis Technologies로부터 이용가능한 융합 단백질인 GQ-303(Genequine Biotherapeutics GmbH), HL-2351(Handok, Inc.), MBIL-1RA(ProteoThera, Inc.), Anakinra(Pivor Pharmaceuticals), 인간 면역글로빈 G 또는 글로불린 S(GC Pharma)를 포함한다. IL-6 수용체 길항제는 또한 당업계에 알려져 있고 토실리주맙, BCD-089(Biocad), HS-628(Zhejiang Hisun Pharm), 및 APX-007(Apexigen)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 면역 억제 레지멘은 또한 적어도 하나의 바이러스 유전자 요법 벡터를 받는 대상체에게 투여되며, 여기서 면역 억제 레지멘은 (i) 대상체에게 제1 용량의 바이러스 유전자 요법 벡터를 투여하기 1 일 이상 전; (ii) 제1 용량의 바이러스 유전자 요법 벡터의 투여와 동일한 날; (iii) 하나 이상의 제2 또는 다른 후속 용량의 바이러스 유전자 요법 벡터의 투여와 동일한 날; 및/또는 (iv) 대상체에게 제1 용량의 바이러스 유전자 요법 벡터의 투여 및 제2 또는 다른 후속 용량의 바이러스 유전자 요법 벡터의 임의의 하나 이상, 또는 전부의 투여 사이에 개입하는 임의의 하나 이상, 또는 모든 일에 대상체에게 적어도 하나의 면역 억제제 투여를 포함한다.
면역억제 레지멘은 예를 들어, 미국 가출원 번호 제63/009,218호에 추가로 기재되어 있으며, 이는 특히 면역억제 레지멘과 관련하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
IV(A)iii. 선택
특정 구현예에서, 사용 방법은 교정된 세포가 비-교정된 세포에 비해 선택적 이점을 갖는 병태의 치료를 포함한다. Ad35 바이러스 벡터는 HSPC 동원과 협력하고 생체내 선택 카세트(들)와 상응하는 선택제의 투여 전에 투여될 수 있는 벡터의 예이다. 특정 구현예는 본원에 기재된 Ad35 벡터 및 MGMTP140K 카세트를 포함하는 Ad35의 경우 BCNU 또는 벤질구아닌 및 테모졸로미드 및/또는 항-CD33 카세트를 포함하는 Ad35 벡터의 경우 CD33-표적화 분자의 투여와 동원(예를 들어, 본원에 기재된 동원 프로토콜)을 조합한다.
특정 구현예에서, 생체내 Ad35-매개 유전자 전달(동원이 있거나 또는 없이)은 생체내 선택 마커와 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 생체내 선택 마커는 Olszko 등, Gene Therapy 22: 591-595, 2015에 기재된 바와 같은 MGMTP140K를 포함할 수 있다.
인간 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(hAGT)를 암호화하는 약물 내성 유전자 MGMT는 니트로소우레아 및 테모졸로미드(TMZ)와 같은 알킬화제의 세포독성 효과에 내성을 부여하는 DNA 복구 단백질이다. 6-벤질구아닌(6-BG)은 니트로소우레아 독성을 강화하는 AGT의 억제제이며 이 제제의 세포독성 효과를 강화하기 위해 TMZ와 공동 투여된다. AGT의 변이체를 암호화하는 MGMT의 여러 돌연변이체 형태는 6-BG에 의한 불활성화에 고도로 내성이지만, DNA 손상을 복구하는 능력을 유지한다(Maze 등 J. Pharmacol. Exp. Ther. 290: 1467-1474, 1999). MGMTP140K-기반 약물 내성 유전자 요법은 마우스, 개, 레서스 원숭이, 및 인간 세포, 구체적으로 조혈 세포에 화학보호를 부여하는 것으로 나타났다(Zielske 등 J. Clin. Invest. 112: 1561-1570, 2003; Pollok 등 Hum. Gene Ther. 14: 1703-1714, 2003; Gerull 등 Hum. Gene Ther. 18: 451-456, 2007; Neff 등 Blood 105: 997-1002, 2005; Larochelle 등 Clin. Invest. 119: 1952-1963, 2009; Sawai 등 Mol. Ther. 3: 78-87, 2001).
특정 구현예에서, 생체내 선택 마커와의 조합은 유전자-교정된 세포의 선택적 이점 없이 질환에 대한 주요한 구성요소가 될 것이다. 예를 들어, SCID 및 일부 다른 면역결핍 및 FA에서, 교정된 세포는 이점을 가지며 치료 유전자를 "약간의" HSPC 내로 형질도입하는 것만으로도 치료 효능에 충분하다. 세포가 경쟁적 이점을 입증하 않는 혈색소병증(즉, 겸상적혈구병 및 지중해빈혈)과 같은 다른 질환의 경우, MGMTP140K와 같은 생체내 선택 마커와 조합하는 것과 같은 유전자 교정된 세포의 생체내 선택은 약간의 형질도입된 HSPC를 선택하여, 유전자 교정된 세포에서의 증가를 허용하고 치료 효능을 달성하기 위함이다. 이 접근법은 또한 HSPC가 생체외 유전적 변형보다는 생체내에서 HIV에 내성을 가짐으로써 HIV에 적용될 수 있다.
추가적인 접근법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 유전적으로 변형된 치료 세포에서 CD33 발현을 선택적으로 감소시키는 동시에 치료 유전자를 제공하기 위해 세포를 유전적으로 변형시키는 시스템 및 방법을 활용할 수 있다. 이 방식에서, 유전적으로 변형된 치료 세포는 환자가 받을 수 있는 동시 또는 후속 항-CD33 요법에 의해 해를 입지 않을 것이다. 그러나, 환자에서 기존 CD33-발현 세포 및/또는 유전적 변형이 결여된 투여된 세포는 보호되지 않아, 교정되지 않은 세포에 비해 유전자-교정된 세포에 대한 양성 선택을 초래할 것이다.
특정 구현예에서, 이 접근법은 단일 세포내 전달 비히클에서 치료 유전자 및 CD33 차단 분자를 연결함으로써 달성된다. 특정 구현예에서, 단일 세포내 전달 비히클은 Ad35 바이러스 벡터이다.
특정 구현예에서, CD33 차단 분자는 공통 Ad35 바이러스 벡터 내에 포함됨으로써 치료 유전자와 조합된 shRNA 또는 siRNA CD33 차단 분자이다. 특정 구현예에서, CD33 차단 분자는 서열번호: 187을 포함하는 shRNA 서열 또는 서열번호: 188을 포함하는 서열이다.
CD33-표적화 치료는 항-CD33 항체, 항-CD33 면역독소, 항-CD33 항체-약물 접합체, 항-CD33 항체-방사성 동위원소 접합체, 항-CD33 이중특이적 항체, 항-CD33 BiTE® 항체, 항-CD33 삼중특이적 항체, 및/또는 항-CD33 CAR을 포함한다.
IV(B). 시험관내 및 생체외 유전자 요법
시험관내 유전자 요법은 외인성 DNA를 숙주 세포(예컨대 표적 세포) 및/또는 핵산(예컨대 표적 핵산, 예컨대 표적 게놈) 내로 도입하는 방법에서 본 개시내용의 벡터, 게놈, 또는 시스템의 사용을 포함하며, 여기서 숙주 세포 또는 핵산은 다세포 유기체(예를 들어, 실험실)에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 표적 세포 또는 핵산은 다세포 유기체, 예컨대 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 인간, 또는 비-인간 영장류)로부터 유래된다. 다세포 유기체로부터 유래된 세포의 시험관내 조작은 생체외 조작으로 지칭될 수 있고, 생체외 요법에 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 제1 다세포 유기체로부터 유래된 표적 세포 또는 핵산을 변형시키기 위해 활용된 다음 조작된 표적 세포 또는 핵산은 예를 들어, 입양 세포 요법의 방법으로 제2 다세포 유기체, 예컨대 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 인간, 또는 비-인간 영장류)에게 투여된다. 일부 경우에, 제1 및 제2 유기체는 동일한 단일 대상 유기체이다. 물질이 유래된 대상체에게 시험관내 조작된 물질을 되돌리는 것은 자가 요법일 수 있다. 일부 경우에, 제1 및 제2 유기체는 상이한 유기체(예를 들어, 동일한 종의 2 개의 유기체, 예를 들어, 동일한 종의 2 마리의 마우스, 2 마리의 래트, 2 명의 인간, 또는 2 마리의 비-인간 영장류)이다. 제1 대상체로부터 유래된 조작된 물질을 제2 상이한 대상체로 전달하는 것은 동종이계 요법일 수 있다.
생체외 세포 요법은 환자 또는 정상 공여자로부터 줄기, 전구체 또는 분화된 세포의 단리, 유전적 조작이 있거나 또는 없이 생체외에서 단리된 세포의 확장 및 주입된 세포 및/또는 이의 자손의 일시적 또는 안정된 이식을 달성하기 위해 대상체에게 세포의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 생체외 접근법은 예를 들어, 유전성, 감염성 또는 신생물성 질환을 치료하거나, 조직을 재생하거나 또는 치료제를 질환 부위에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 생체외 요법에서 대상체를 유전자 전달 벡터에 직접 노출시키기 않고, 형질도입의 표적 세포는 임의의 유전적 조작 전 또는 후에, 효능 및 안전성을 개선하기 위해 선택, 확장, 및/또는, 분화될 수 있다.
생체외 요법은 조혈 줄기 세포(HSC) 이식(HCT)을 포함한다. 자가 HSC 유전자 요법은 혈액 및 면역계의 여러 단일유전자성 질환 뿐만 아니라 저장 장애에 대한 치료 옵션을 나타내고, 이는 선택된 질환 상태에 대한 1차 치료 옵션이 될 수 있다. 또 다른 확립된 세포 및 유전자 요법 적용은 악성종양, 감염 및 자가면역 질환에 대해 사용하기 위한 면역 효과기 및 조절 세포의 힘을 활용하기 위해, 유전적 조작이 있거나 또는 없이 항원 특이성을 재지시하거나 또는 안정성 프로파일을 증가시키는 생체외 확장된 T 세포를 이용하는 입양 면역요법이다. 일부 경우에 유전적 조작에 수반되는 다양한 다른 유형의 체세포 줄기 세포는 표피 및 윤부 줄기 세포, 신경 줄기/전구체 세포(NSPC), 심장 줄기 세포 및 다능성 간질 세포(MSC)를 포함하는 치료 적용에 대한 가능성을 나타내고 있다.
생체외 요법의 적용은 기능장애 세포 계통을 재구축하는 것을 포함한다. 결함성이거나 또는 부재하는 세포 계통을 특징으로 하는 선천적 질환의 경우, 계통은 정상 공여자 또는 결핍을 교정하기 위해 생체외 유전자 전달에 적용된 자가 세포로부터 유래된 기능적 전구체 세포에 의해 재생될 수 있다. 예는 SCID에 의해 제공되며, 여기서 여러 유전자 중 임의의 하나에서 결핍은 성숙 림프 세포의 발달을 차단한다. 숙주에서 다양한 계통의 공여자-유래 기능적 조혈 세포의 생성을 허용할 수 있는 조작되지 않은 정상 공여자 HSC의 이식은 SCID, 뿐만 아니라 혈액 및 면역계에 영향을 미치는 많은 다른 질환에 대한 치료 옵션을 나타낸다. 이식된 조혈 줄기/전구체 세포(HSPC)에서 결핍성 유전자의 기능적 카피를 대체하는 것을 포함할 수 있고, HCT와 유사하게, 기능적 자손의 꾸준한 공급을 제공할 수 있는 자가 HSC 유전자 요법은 이식편대숙주병(GvHD)의 위험 감소, 이식 거부의 위험 감소, 및 이식후 면역억제에 대한 필요성 감소를 포함하는 여러 이점을 가질 수 있다.
생체외 요법의 적용은 치료 유전자 투여량 증가를 포함한다. 일부 적용에서, HSC 유전자 요법은 동종이계 HCT의 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 치료 유전자 투여량은 이식된 세포에서 정상 수준 이상으로 조작될 수 있다.
생체외 요법의 적용은 신규 기능을 도입하고 유전자 요법을 표적화하는 것을 포함한다. 생체외 유전자 요법은 고용향 항종양 화학요법 레지멘의 투여를 허용하는 약물 내성을 확립하거나 또는 HIV와 같은 바이러스, 또는 RNA-기반 제제(예를 들어, 리보자임, RNA 유인, 안티센스 RNA, RNA 압타머 및 작은 간섭 RNA) 및 단백질-기반 제제(예를 들어, 병원체의 게놈을 표적화하는 우성-음성 돌연변이체 바이러스 단백질, 융합 억제제 및 조작된 뉴클레아제)를 발현함으로써 다른 병원체로 사전 확립된 감염에 대한 내성을 확립하는 것과 같이, HSC 또는 이의 자손에게 신규 기능을 부여할 수 있다.
생체외 요법의 적용은 면역 반응을 향상시키는 것을 포함한다. 신생물 질환에서, T 세포와 같은 동종이계 적응 면역 세포 유형은 암 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있다. 불행히도, 동종반응성 림프구에 의한 건강한 조직의 인식은 또한 해로운 GvHD를 초래할 수 있다. 공여자 림프구에서 자살 유전자의 전달은 독성을 길들이면서 항-종양 잠재력을 활용할 수 있게 한다. 자가 설정에서, 형질전환 또는 감염된 세포에 대해 지시된 특이성이 있는 림프구는 환자의 조직으로부터 단리되고 생체외에서 선택적으로 확장될 수 있다 대안적으로, 이들은 형질전환 또는 감염된 세포를 접할 때 세포의 반응을 촉발하는 합성 또는 키메라 항원 수용체에 대한 유전자의 전달에 의해 생성될 수 있다. 이러한 접근법은 종양 또는 감염에 대한 기본적인 숙주 반응을 강화하거나, 또는 이를 새롭게 유도할 수 있다.
IV(C). 유전자 요법에 의해 치료가능한 병태
적어도 부분적으로 본 개시내용의 아데노바이러스 벡터는 숙주 및/또는 표적 세포의 변형을 위해 생체내, 시험관내, 또는 생체외에서 사용될 수 있고, 추가로 아데노바이러스 벡터는 매우 다양한 발현 산물을 암호화하는 페이로드를 포함할 수 있기 때문에, 본원에 제공되는 다양한 기술은 광범위한 적용가능성을 갖고 매우 다양한 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음이 본 명세서로부터 분명할 것이다. 본 개시내용의 아데노바이러스 벡터, 게놈, 또는 시스템의 투여에 의해 치료가능한 병태의 예는 혈색소병증, 면역결핍, 점 돌연변이 병태, 암, 단백질 결핍, 감염성 질환, 및 염증성 병태를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 게놈, 시스템 및 제형은 대상체(인간, 수의학 동물(개, 고양이, 파충류, 조류 등), 가축(말, 소, 염소, 돼지, 닭 등), 및 연구 동물(원숭이, 래트, 마우스, 어류 등)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 대상체를 치료하는 것은 치료 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 치료 유효량은 유효량, 예방적 치료, 및/또는 치료적 치료를 제공하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 제형은 혈액 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 제형은 혈우병, 중증 β-지중해빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈(DBA), 발작성 야간 헤모글로빈뇨증(PNH), 순수 적혈구 무형성증(PRCA), 불응성 빈혈,　중증 재생불량성 빈혈, 및/또는 백혈병, 림프종, 및 골수종과 같은 혈액암을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
혈색소병증은 불균형 결과를 초래하는 전 세계적인 건강 부담을 나타낸다. 헤모글로빈 단백질 또는 글로빈 유전자 발현에서의 결함은 혈색소병증이라 불리는 질환을 초래할 수 있다. 혈색소병증은 전 세계적으로 가장 흔한 유전 질환 중 하나이다.
매년, 전 세계적으로 110만 명의 신생아가 혈색소병증에 대한 위험이 있으며, 헤모글로빈(Hb) 유전적 변이에 의해 부여된 말라리아 감염에 대한 자연적 내성으로 인해, 말라리아 열대열원충이 만연한 지리학적 영역에서 매 1,000 명마다 신생아 중 25명 정도로 영향을 미친다. 선진국에서, 환자는 만성 수혈로부터 철분 과부하의 위험이 있다. 후진 지역에서, 생존은 상당히 더 낮다. 예를 들어, 아프리카에서, 유아기 사망률은 모든 어린이에서 16%인 것과 비교하여 혈색소병증 환자에서 40%이다.
글로빈 유전자에서 돌연변이는 겸상적혈구병(SCD) 및 헤모글로빈 C, D, 및 E 질환에서과 같이 비정상적인 형태의 헤모그로빈을 생성하거나, 또는 α 또는 β 폴리펩티드의 생산을 감소시키고 따라서 세포에서 글로빈 쇄의 불균형을 초래할 수 있다. 이러한 후자의 병태는 글로빈 쇄가 손상되는 정도에 따라 α- 또는 β-지중해빈혈이라고 불린다. 전 세계 인구의 5%는 단연코 가장 흔한(담체의 40%) b-글로빈(HBB) 유전자(글루타메이트에서 발린으로 전환; 역사적으로 E6V, 동시에 E7V)에서 겸상 세포 돌연변이가 있는 상당한 헤모글로빈 변이체를 가지고 있다. 헤모글로빈 장애의 높은 유병률 및 중증도는 일생동안 환자 관리에 비용이 들기 때문에, 이환된 환자의 삶 뿐만 아니라 건강-관리 시스템에 영향을 미치는 실질적인 부담을 나타낸다.
2 개의 알파(α) 및 2 개의 감마(γ) 쇄를 포함하는 태아(HbF), 및 2 개의 α 및 2 개의 베타(β) 쇄를 포함하는 성체(HbA)의 2 가지 형태의 헤모글로빈이 있다. HbF에서 HbA로의 자연적 전환은 출생 직후 발생하고 마스터 조절인자인 bcl11a를 포함하는 인자에 의해 γ 글로빈 유전자의 전사 억제에 의해 조절된다. 비판적으로, 다양한 임상 관찰은 겸상적혈구병 및 β-지중해빈혈과 같은 β-혈색소병증의 중증도가 HbF의 생산 증가에 의해 개선됨을 입증한다.
특정 구현예에서, 치료적으로 효과적인 치료는 HbF의 발현을 유도 또는 증가시키고/시키거나, 헤모글로빈의 생산을 유도 또는 증가시키고/시키거나 β-글로빈의 생산을 유도 또는 증가시킨다. 특정 구현예에서, 치료적으로 효과적인 치료는 혈액 세포 기능을 개선하고/하거나, 세포의 산소화를 증가시킨다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 β-글로빈 긴 LCR, β-글로빈 프로모터, 및 혈액 장애의 치료를 위한 단백질 또는 제제를 암호화하는 코딩 핵산 서열을 포함하는 본 개시내용의 아데노바이러스 공여자 벡터를 사용한 혈액 장애의 치료를 포함한다. 다양한 구현예에서, 혈액 장애는 지중해빈혈이고 단백질은 β-글로빈 또는 γ-글로빈 단백질, 또는 달리 부분적으로 또는 완전히 β-글로빈 또는 γ-글기능적으로 대체하는 단백질이다. 다양한 구현예에서, 혈액 장애는 혈우병이고 단백질은 ET3 또는 달리 부분적으로 또는 완전히 인자 VIII을 기능적으로 대체하는 단백질이다. 다양한 구현예에서, 혈액 장애는 겸상 세포 빈혈과 같은 점 돌연변이 질환이고, 제제는 유전자 편집 단백질이다.
ET3은 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다: 서열번호 301. 다양한 구현예에서, 인자 VIII 대체 단백질은 서열번호: 301에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
β-글로빈은 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다: 서열번호 302. 다양한 구현예에서, β-글로빈 대체 단백질은 서열번호: 302에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
γ-글로빈은 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다: 서열번호 303. 다양한 구현예에서, γ-글로빈 대체 단백질은 서열번호: 303에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
80 개 초과의 1차 면역 결핍 질환이 세계보건기구에 의해 인식되고 있다. 이러한 질환은 일부 경우에, 신체가 감염에 대한 임의의 또는 충분한 항체를 생산할 수 없는 면역계의 본질적인 결함을 특징으로 한다. 다른 경우에, 감염에 싸우는 세포 방어가 적절하게 작동하지 않는다. 전형적으로, 1차 면역 결핍은 선천적 장애이다.
이차성, 또는 후천성 면역 결핍은 선천적 유전 이상의 결과가 아니라, 오히려 면역계가 면역계 외부에 있는 요인에 의해 손상된 개인에서 발생한다. 예는 외상, 바이러스, 화학요법, 독소, 및 오염을 포함한다. 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)은 T 림프구의 고갈이 신체를 감염에 싸울 수 없게 만드는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 바이러스에 의해 유발된 2차 면역 결핍 장애의 예이다.
X-결합 중증 복합 면역결핍(SCID-X1)은 공통 감마 쇄 유전자(γC)의 돌연변이에 의해 유발된 세포성 및 체액성 면역 고갈 둘 다이며, 이는 T 및 자연 살해(NK) 림프구의 부재 및 비기능적 B 림프구의 존재를 초래한다. SCID-X1은 면역계가 예를 들어, 골수 이식(BMT) 또는 유전자 요법을 통해 재구축되지 않는 한 생후 첫 2년 내에 치명적이다.
대부분의 개인은 BMT 또는 비-자가 유전자 요법에 대해 일치된 공여자가 부족하기 때문에, 성숙 T 세포가 고갈된 동일단배체의 모체 골수가 종종 사용되지만; 합병증은 이식편대숙주병(GVHD), 적절한 항체를 생성하지 못해 장기간 면역글로불린 대체 필요, 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC)의 주입 실패로 인한 T 세포의 후기 손실, 만성 혹, 및 림프구 조절장애를 포함한다.
판코니 빈혈(FA)은 골수 부전으로 이어지는 선천적 혈액 장애이다. 이는 부분적으로 DNA-복구 메커니즘 결핍을 특징으로 한다. FA 환자의 적어도 20%는 급성 골수성 백혈병과 같은 암, 및 피부, 간, 위장관, 및 부인과계의 암으로 발전한다. 피부 및 위장관 종양은 일반적으로 편평세포 암종이다. 암으로 발전하는 환자의 평균 연령은 백혈병의 경우 15 세, 간 종양의 경우 16 세, 및 다른 종양의 경우 23 세이다.
치료 유전자는 특정 구현예에서, 선천적인 병태에 대해 치료적으로 효과적인 반응을 제공하도록 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 병태는 그레이브스병, 류마티스 관절염, 악성 빈혈, 다발성 경화증(MS), 염증성 장 질환, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 아데노신 데아미나제 결핍증(ADA-SCID) 또는 중증 복합 면역결핍증(SCID), 비스코트-알드리치 증후군(WAS), 만성 육아종증(CGD), 판코니 빈혈(FA), 바텐병, 부신백질이영양증(ALD) 또는 이염백질이영양증(MLD), 근이영양증, 폐포단백질증(PAP), 피루베이트 키나제 결핍, 슈바크만-다이아몬드-블랙판 빈혈, 선천성 이각화증, 낭포성 섬유증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 또는 근위축성 측색 경화증(루게릭병)일 수 있다. 특정 구현예에서, 병태에 따라, 치료 유전자는 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 기능이 중단된 유전자일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 제형은 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 제형은 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수형성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수형성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 호지킨 림프종, 청소년 골수단핵구 백혈병, 다발성 골수종, 골수이형성, 및/또는 비-호지킨 림프종을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
치료될 수 있는 추가의 예시적인 암은 성상세포종, 비정형 기형 간상소체 종양, 뇌 및 중추신경계(CNS) 암, 유방암, 암육종, 연골육종, 척색종, 맥락총 암종, 맥락총 유두종, 연조직의 투명 세포 육종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 뇌실막세포종, 상피양 육종, 생식선외 생식 세포 종양, 신장외 횡문양 종양, 유잉 육종, 위장관 간질 종양, 교모세포종, HBV-유도된 간세포 암종, 두경부암, 신장암, 폐암, 악성 간상소체 종양, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발성 골수종, 신경교 종양, 달리 명시되지 않은(NOS) 육종, 핍지교성상세포종, 희소돌기아교세포종, 골육종, 난소암, 난소 투명 세포 선암종, 난소 자궁내막 선암종, 난소 장액성 선암종, 췌장암, 췌장관 선암종, 췌장 내분비성 종양, 송과체모세포종, 전립선암, 신세포 암종, 신수질 암종, 횡문근육종, 육종, 신경집종, 피부 편평세포 암종, 및 줄기 세포암을 포함한다. 다양한 특정 구현예에서, 암은 난소암이다. 다양한 특정 구현예에서 암은 유방암이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 제형은 점 돌연변이 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 제형은 겸상적혈구병, 낭포성 섬유증, 테이삭스병, 및/또는 페닐케톤뇨증을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 트랜스포존 페이로드는 핵산 병변의 교정 편집을 위한 CRISPR-Cas를 암호화한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 트랜스포존 페이로드는 핵산 병변의 교정 편집을 위한 염기 편집기를 암호화한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 제형은 특정 효소 결핍을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 제형은 헐러 증후군, 선택적 IgA 결핍, 고 IgM, IgG 하위클래스 결핍, 니만-픽병, 테이삭스병, 고세병, 파브리병, 크라베병, 포도당혈증, 단풍시럽뇨병, 페닐케톤뇨증, 글리코겐 축적 질환, 프리드라이히 운동실조, 젤웨거 증후군, 부신백질이영양증, 보체 장애, 및/또는 뮤코다당증을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
치료 유효량은 면역 및 다른 혈액 세포 및/또는 소교 세포에 기능을 제공할 수 있거나 또는 대안적으로 치료된 병태에 따라 림프구 활성화를 억제하고/하거나, 림프구에서 세포자멸사를 유도하고/하거나, 림프구의 다양한 하위세트를 제거하고/하거나, T 세포 활성화를 억제하고/하거나, 자가반응성 T 세포를 제거 또는 억제하고/하거나, Th-2 또는 Th-1 림프구 활성을 억제하고/하거나, IL-1 또는 TNF를 길항하고/하거나, 염증을 감소시키고/시키거나, 자극제에 대한 선택적 내성을 유도하고/하거나, 면역-매개 병태를 감소 또는 제거하고/하거나; 면역-매개 병태의 증상을 감소 또는 제거할 수 있다. 치료 유효량은 또한 기능적 DNA 복구 메커니즘; 계면활성제 단백질 발현; 텔로미어 유지; 리소좀 기능; 지질 또는 아밀로이드와 같은 다른 단백질의 분해를 제공하고/하거나; 리보솜 기능을 허용하고/하거나; 달리 다른 백혈구 유형의 대식세포와 같이 발달하지 않을 성숙 혈액 세포 계통의 발달을 허용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 매개된 면역 반응을 회복시킬 수 있다. T-세포 매개된 면역 반응의 회복은 흉선 배출 회복 및/또는 정상 T 림프구 발달 회복을 포함할 수 있다
특정 구현예에서, 흉선 배출 회복은 말초 혈액에서 CD45RA를 발현하는 CD3+ T 세포의 빈도를 대조군 집단에서 유래된 참조 수준과 비슷한 수준으로 회복시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 흉선 배출 회복은 106 개의 성숙 T 세포 당 T 세포 수용체 절제 원(TREC)의 수를 대조군 집단에서 유래된 참조 수준과 비슷한 수준으로 회복시키는 것을 포함할 수 있다. 106 개의 성숙 T 세포 당 TREC의 수는 Kennedy 등, Vet Immunol Immunopathol 142: 36-48, 2011에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 정상 T 림프구 발달 회복은 CD4+ 세포: CD8+ 세포의 비를 2로 회복시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 정상 T 림프구 발달 회복은 순환 T-림프구에서 αβ TCR의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 순환 T-림프구에서 αβ TCR의 존재는 예를 들어, TCR의 α 및/또는 β 쇄에 결합하는 항체를 사용한 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, 정상 T 림프구 발달 회복은 다양한 TCR 레퍼토리의 존재를 대조군 집단에서 유래된 참조 수준과 비슷한 수준으로 검출하는 것을 포함한다. TCR 다양성은 TCRβ 유전자의 가변 영역의 유전적 재배열을 분석하는 TCRVβ 스펙트럼유형화(spectratyping)에 의해 평가될 수 있다. 강력하고 정상적인 스펙트럼유형 프로파일은 TCRVβ 분절의 17 개 패밀리에 걸쳐 크기가 부여된 단편의 가우스(Gaussian) 분포를 특징으로 할 수 있다. 특정 구현예에서, 정상 T 림프구 발달 회복은 T-세포 특이적 신호전달 경로의 회복을 포함한다. T-세포 특이적 신호전달 경로의 회복은 T 세포 미토겐 파이토헤마글루티닌(PHA)에 노출 후 림프구 증식에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 정상 T 림프구 발달 회복은 백혈구 계수, 호중구 세포 계수, 단핵구 세포 계수, 림프구 세포 계수, 및/또는 혈소판 세포 계수를 대조군 집단에서 유래된 참조 수준과 비슷한 수준으로 회복시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 림프구 재구축의 동역학 및/또는 클론 다양성을 개선할 수 있다. 특정 구현예에서, 림프구 재구축의 동역학 개선은 순환 T 림프구의 수를 대조군 집단에서 유래된 참조 수준의 범위 내로 증가시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 림프구 재구축의 동역학 개선은 절대 CD3+ 림프구 계수를 대조군 집단에서 유래된 참조 수준의 범위 내로 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 이의 범위는 주어진 매개변수에 대해 정상(즉, 면역 손상되지 않은) 대상체에서 관찰되거나 또는 이에 의해 나타난 값의 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 림프구 재구축의 동역학 개선은 본원에 기재된 요법이 투여되지 않은 이를 필요로 하는 대상체와 비교하여 정상 림프구 계수에 도달하는 데 필요한 시간을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 림프구 재구축의 동역학 개선은 본원에 기재된 요법이 투여되지 않은 이를 필요로 하는 대상체와 비교하여 유전자 교정된 림프구의 빈도를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 림프구 재구축의 동역학 개선은 본원에 기재된 유전자 요법이 투여되지 않은 이를 필요로 하는 대상체와 비교하여 대상체에서 유전자 교정된 림프구의 클론 레퍼토리의 다양성을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 유전자 교정된 림프구의 클론 레퍼토리의 다양성 증가는 레트로바이러스 통합 부위(RIS) 분석에 의해 측정된 바와 같은 고유한 (RIS) 클론의 수를 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 골수 기능을 회복시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 골수 기능 회복은 본원에 기재된 요법이 투여되지 않은 이를 필요로 하는 대상체와 비교하여 유전자 교정된 세포로 골수 재증식을 개선하는 것을 포함할 수 있다. 유전자 교정된 세포로 골수 재증식을 개선하는 것은 유전자 교정된 세포의 백분율을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 백혈구 및 골수 유래 세포로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 유전자 교정된 세포의 백분율은 정량적 실시간 PCR 및 유세포 분석으로부터 선택된 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역화에 대한 1차 및 2차 항체 반응을 정규화할 수 있다. 면역화에 대한 1차 및 2차 항체 반응의 정규화는 항원에 대한 클래스 전환 및 기억 반응에서 기능하는 B-세포 및/또는 T-세포 사이토카인 신호전달 프로그램의 회복을 포함할 수 있다. 면역화에 대한 1차 및 2차 항체 반응의 정규화는 박테리오파지 면역화 검정에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, B-세포 및/또는 T-세포 사이토카인 신호전달 프로그램의 회복은 T-세포 의존적 신생항원 박테리오파지 ΨX174로 면역화 후 검정될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역화에 대한 1차 및 2차 항체 반응의 정규화는 이를 필요로 하는 대상체에서 IgA, IgM, 및/또는 IgG의 수준을 대조군 집단에서 유래된 참조 수준과 비슷한 수준으로 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역화에 대한 1차 및 2차 항체 반응의 정규화는 이를 필요로 하는 대상체에서 IgA, IgM, 및/또는 IgG의 수준을 본원에 기재된 유전자 요법이 투여되지 않은 이를 필요로 하는 대상체보다 더 큰 수준으로 증가시키는 것을 포함할 수 있다. IgA, IgM, 및/또는 IgG의 수준은 예를 들어, 면역글로불린 테스트에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 테스트는 항체 결합 IgG, IgA, IgM, 카파 경쇄, 람다 경쇄, 및/또는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 테스트는 혈청 단백질 전기영동법, 면역전기영동법, 방사성 면역확산, 혼탁법 및 비탁법을 포함한다. 상업적으로 이용가능한 면역글로불린 테스트 키트는 MININEPH™(Binding Site, 영국 버밍엄 소재), 및 Dako(덴마크 소재) 및 Dade Behring(독일 마르부르크 소재)의 면역글로불린 테스트 시스템을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 수준을 측정하는 데 사용될 수 있는 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 뇌척수액 샘플, 및 소변 샘플을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 SCID-X1을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 SCID(예를 들어, JAK 3 키나제 결핍 SCID, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP) 결핍 SCID, 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍 SCID, MHC 클래스 II 결핍 또는 재조합효소 활성화 유전자(RAG) 결핍 SCID)를 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 효능은 림프구 재구축, 클론 다양성 및 흉선형성 개선, 감염 감소, 및/또는 환자 결과 개선을 통해 관찰될 수 있다. 치료 효능은 또한 체중 증가 및 성장, 위장관 기능 개선(예를 들어, 설사 감소), 상부 호흡기 증상 감소, 구강(칸디다증)의 진균 감염 감소, 폐렴 발병률 및 중증도 감소, 수막염 및 혈류 감염 감소, 및 귀 감염 감소 중 하나 이상을 통해 관찰될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법으로 SCIDX-1을 치료하는 것은 γC-의존적 신호전달 경로에 대한 기능성 회복을 포함한다. γC-의존적 신호전달 경로의 기능성은 각각 IL-21 및/또는 IL-2로 시험관내 자극 후 효과기 분자 STAT3 및/또는 STAT5의 티로신 인산화를 측정함으로써 검정될 수 있다. STAT3 및/또는 STAT5의 티로신 인산화는 세포내 항체 염색에 의해 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 FA를 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 효능은 림프구 재구축, 클론 다양성 및 흉선형성 개선, 감염 감소, 및/또는 환자 결과 개선을 통해 관찰될 수 있다. 치료 효능은 또한 체중 증가 및 성장, 위장관 기능 개선(예를 들어, 설사 감소), 상부 호흡기 증상 감소, 구강(칸디다증)의 진균 감염 감소, 폐렴 발병률 및 중증도 감소, 수막염 및 혈류 감염 감소, 및 귀 감염 감소 중 하나 이상을 통해 관찰될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법으로 FA를 치료하는 것은 미토마이신 C(MMC)에 대한 골수 유래 세포의 내성을 증가시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, MMC에 대한 골수 유래 세포의 내성은 메틸셀룰로스 및 MMC에서 세포 생존 검정에 의해 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 저감마글로불린혈증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 저감마글로불린혈증은 B-림프구 결여에 의해 유발되고 혈액에서 낮은 수준의 항체를 특징으로 한다. 저감마글로불린혈증은 백혈병-관련 면역 기능장애 및 요법-관련 면역억제 둘 다의 결과로 만성 림프구성 백혈병(CLL), 다발성 골수종(MM), 비-호지킨 림프종(NHL) 및 다른 관련 악성종양 환자에서 발생할 수 있다. 이러한 혈액학적 악성종양에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증 환자, 및 HSPC 이식 후 환자는 박테리아 감염에 취약하다. 체액성 면역력의 결핍은 특히 캡슐화된 미생물에 의해 이러한 환자에서 감염-관련된 이환율 및 사망률 위험 증가에 주로 기인한다. 예를 들어, 폐렴연쇄구균, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 및 스타필로코쿠스 아우레우스, 뿐만 아니라 레지오넬라 및 노카르디아 종(Nocardia spp.)은 CLL 환자에서 폐렴을 유발하는 빈번한 박테리아 병원체이다. 폐포자충(Pneumocystis carinii), 진균, 바이러스, 및 마이코박테리아와 같은 기회 감염이 또한 관찰되었다. 이러한 환자에서 감염의 수 및 중증도는 면역 글로불린의 투여에 의해 상당히 감소될 수 있다(Griffiths 등 Blood 73: 366-368, 1989; Chapel 등 Lancet 343: 1059-1063, 1994).
특정 구현예에서, 제형은 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수형성 백혈병(AML), 부신백질이영양증, 병인불명 골수성 화생, 무거핵구성/선천성 혈소판감소증, 모세혈관 확장성운동실조, 중증성 β-지중해빈혈, 만성 육아종증, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수형성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구 백혈병, 공통 가변성 면역 결핍증(CVID), 보체 장애, 선천성 무감마글로불린혈증, 다이아몬드 블랙판 증후군, 미만성 거대 B-세포 림프종, 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 여포성 림프종, 호지킨 림프종, 헐러 증후군, 초 IgM, IgG 하위클래스 결핍증, 청소년 골수단핵구 백혈병, 이염백질이영양증, 뮤코다당증, 다발성 골수종, 골수이형성, 비-호지킨 림프종, 발작성 야간 헤모글로빈뇨증(PNH), 항체 결핍된 1차 면역결핍증, 순수 적혈구 무형성증, 불응성 빈혈, 슈와크만-다이아몬드-블랙판(Shwachman-Diamond-Blackfan) 빈혈(DBA), 선택적 IgA 결핍증, 중증 재생불량성 빈혈, 겸상적혈구병, 특이적 항체 결핍증, 비스코트-올드리치 증후군, 및/또는 X-결합 무감마글로불린혈증(XLA)을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
치료될 수 있는 추가의 예시적인 암은 성상세포종, 비정형 기형 간상소체 종양, 뇌 및 중추신경계(CNS) 암, 유방암, 암육종, 연골육종, 척색종, 맥락총 암종, 맥락총 유두종, 연조직의 투명 세포 육종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 뇌실막세포종, 상피양 육종, 생식선외 생식 세포 종양, 신장외 횡문양 종양, 유잉 육종, 위장관 간질 종양, 교모세포종, HBV-유도된 간세포 암종, 두경부암, 신장암, 폐암, 악성 간상소체 종양, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발성 골수종, 신경교 종양, 달리 명시되지 않은(NOS) 육종, 핍지교성상세포종, 희소돌기아교세포종, 골육종, 난소암, 난소 투명 세포 선암종, 난소 자궁내막 선암종, 난소 장액성 선암종, 췌장암, 췌장관 선암종, 췌장 내분비성 종양, 송과체모세포종, 전립선암, 신세포 암종, 신수질 암종, 횡문근육종, 육종, 신경집종, 피부 편평세포 암종, 및 줄기 세포암을 포함한다. 다양한 특정 구현예에서, 암은 난소암이다. 다양한 특정 구현예에서 암은 유방암이다.
암의 맥락에서, 치료 유효량은 종양 세포 수를 감소시키고/시키거나, 전이 수를 감소시키고/시키거나, 종양 부피를 감소시키고/시키거나, 기대 수명을 증가시키고/시키거나, 암 세포의 세포자멸사를 유도하고/하거나, 암 세포 사멸을 유도하고/하거나, 암 세포에서 화학- 또는 방사성민감성을 유도하고/하거나, 암 세포 근처의 혈관형성을 억제하고/하거나, 암 세포 증식을 억제하고/하거나, 종양 성장을 억제하고/하거나, 전이를 예방하고/하거나, 대상체의 수명을 연장하고/하거나, 암-연관 통증을 감소시키고/시키거나, 전이 수를 감소시키고/시키거나, 치료 후 암의 재발 또는 재출현을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예는 외상, 바이러스, 화학요법, 독소, 및 오염에 의해 유발된 면역 결핍과 같은 이차성, 또는 후천성 면역 결핍의 치료를 포함한다. 이전에 나타낸 바와 같이, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)은 T 림프구의 고갈이 신체를 감염에 싸울 수 없게 만드는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 바이러스에 의해 유발된 2차 면역 결핍 장애의 예이다. 따라서, 또 다른 예로서, 유전자는 감염성 질환에 대한 치료적으로 효과적인 반응을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다. 치료 유전자는 예를 들어, 면역 세포가 HIV 감염에 대한 내성을 갖도록 하거나, 또는 면역 세포가 면역 재구축을 통해 바이러스를 효과적으로 중화할 수 있는 유전자, 면역 세포에 의해 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자의 다형성, 환자에서 발현되지 않는 감염과 싸우는 데 유리한 유전자, 감염성 제제, 수용체 또는 공수용체를 암호화하는 유전자; 수용체 또는 공수용체에 대한 리간드를 암호화하는 유전자; 특정 전사 인자의 작용을 차단하기 위해 리보자임, 안티센스 RNA, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 유인 RNA를 암호화하는 유전자; 우성 음성 바이러스 단백질, 세포내 항체, 인트라킨 및 자살 유전자를 암호화하는 유전자를 포함하는 바이러스 복제에 필수적인 바이러스 및 세포 유전자일 수 있다. 예시적인 치료 유전자 및 유전자 산물은 α2β1; αvβ3; αvβ5; αvβ63; BOB/GPR15; Bonzo/STRL-33/TYMSTR; CCR2; CCR3; CCR5; CCR8; CD4; CD46; CD55; CXCR4; 아미노펩티다제-N; HHV-7; ICAM; ICAM-1; PRR2/HveB; HveA; α-디스트로글리칸; LDLR/α2MR/LRP; PVR; PRR1/HveC; 및 라미닌 수용체를 포함한다. HIV의 치료를 위한 치료 유효량은 예를 들어, HIV에 대한 대상체의 면역력을 증가시키거나, AIDS 또는 HIV와 연관된 증상을 개선하거나, 또는 HIV에 대한 대상체의 선천적 또는 적응 면역 반응을 유도할 수 있다. HIV에 대한 면역 반응은 항체 생산 및 AIDS의 예방의 초래 및/또는 대상체의 AIDS 또는 HIV 감염 증상 개선, 또는 HIV 감염성 및/또는 병독성의 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.
특정 구현예, 제형은 암 재발을 예방 또는 지연시키거나 또는 고위험 생식 계열 돌연변이의 보균자에서 암 발병을 예방 또는 지연시키기 위해 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 제형은 더 높은 치료 용량의 테모졸로미드(TMZ) 및 벤질구아닌 또는 BCNU를 받기 위해 대상체에게 투여된다. 강한 골수억제성 표적외 효과로 인해, 유효량의 TMZ 및 벤질구아닌을 종양에 전달하는 것은 과제로 남아있다. 환자는 현재 급성 골수성 백혈병(AML), 식도암, 두경부암, 고등급 신경교종, 골수이형성 증후군, 비-소세포 폐암, NSCLC; 불응성 AML, 소세포 폐암, 역형성 성상세포종, 뇌 종양, 유방암(예를 들어, 전이성), 결장직장암(예를 들어, 전이성), 미만성 내재성 뇌간 신경교종, 유잉 육종, 다형성 교모세포종(GBM), 악성 뇌교종, 흑색종, 전이성 악성 흑색종, 재발성 악성 흑색종, 비인두암, 전이성 유방암, 및 소아암과 연관된 치료를 위해 TMZ 및 벤질구아닌을 받을 수 있다.
MGMT 발현 종양이 있는 환자는 MGMTP140K 생체내 선택 카세트와 조합된 활성 성분(예컨대 CAR, TCR, 또는 체크포인트 억제제)과 함께 Ad35 바이러스 벡터의 투여로부터 이익을 얻을 것이다. 생체외 접근법은 이 접근법의 적용가능성을 제시하였다. 특정 구현예에서, TMZ 및 벤질구아닌 또는 BCNU의 치료량은 종양 부담 또는 부피를 감소시키기 위해 투여된다.
특정 구현예에서, 치료 유효량은 면역 및 다른 혈액 세포에 기능을 제공하고/하거나, 면역-매개 병태를 감소 또는 제거하고/하거나; 면역-매개 병태의 증상을 감소 또는 제거할 수 있다.
본원에 기재된 벡터, 동원 인자, 제형, 및 사용 방법에서, 단백질 및/또는 핵산 서열의 변이체가 또한 사용될 수 있다. 변이체는 본원에 기재되거나 또는 개시된 단백질 및 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 80% 서열 동일성, 85% 서열, 90% 서열 동일성, 95% 서열 동일성, 96% 서열 동일성, 97% 서열 동일성, 98% 서열 동일성, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며 여기서 변이체는 실질적으로 유사하거나 또는 개선된 생물학적 기능을 나타낸다.
본원에 기재된 생체내 유전자 요법 및/또는 HSPC 동원과 연관된 매개변수에 대해 수득된 값은 대조군 집단에서 유래된 참조 수준과 비교될 수 있고, 이 비교는 본원에 기재된 생체내 유전자 요법이 유전자 요법이 투여된 이를 필요로 하는 대상체에 효과적인지를 나타낼 수 있다. 생체내 유전자 요법 및/또는 HSPC 동원과 연관된 매개변수는 예를 들어 다음을 포함할 수 있다: 총 백혈구, 호중구, 단핵구, 림프구, 및/또는 혈소판의 수; 정상 림프구 계수에 도달하는 데 필요한 시간; 퍼센트 CD3+CD45RA+ T 세포; 106 개 세포 당 TREC의 수; CD4+인 세포의 퍼센트; CD8+인 세포의 퍼센트; CD4/CD8의 비; CD3+ T 세포에서 TCRαβ+ 세포의 퍼센트; TCR의 다양성; 유전자 교정된 림프구의 빈도; 유전자 교정된 림프구의 클론 레퍼토리의 다양성; 고유한 RIS 클론의 수; 박테리오파지 주사에 대한 1차 및 2차 항체 반응; 박테리오파지 불활성화 비; 유전자 교정된 세포의 백분율; 면역글로불린 IgA, IgM, 및/또는 IgG의 수준; 미토마이신 C에 대한 골수 유래 세포의 내성; 메틸셀룰로스 및 미토마이신 C에서 살아있는 세포의 퍼센트; γC-의존적 신호전달 경로의 기능성; 및 세포의 IL-21/미토겐 자극에 의한 STAT3의 인산화 퍼센트. 참조 수준은 대조군 집단의 하나 이상의 관련 데이터세트로부터 수득될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "데이터세트"는 원하는 조건 하에 샘플(샘플 집단)의 평가로 인한 수치 값 세트이다. 데이터세트의 값은 예를 들어, 샘플로부터 측정치를 실험적으로 수득하고 이러한 측정으로부터 데이터세트를 구축함으로써 수득될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 수준은 예를 들어, 개별 데이터포인트의 집합; 예를 들어, 평균, 중앙값, 평균의 중앙값 등으로부터 의미있는 집합적 참조 수준에 도달하기 위해 당업계에서 유용하고 알려진 임의의 수학적 또는 통계적 공식을 기반으로 할 수 있다. 대안적으로, 참조 수준 또는 참조 수준을 생성하기 위한 데이터세트는 실험실과 같은 서비스 제공자로부터, 또는 데이터베이스 또는 데이터베이스가 저장된 서버로부터 수득될 수 있다.
데이터세트로부터의 참조 수준은 대조군 집단에서 유래된 이전 측정치로부터 유래될 수 있다. "대조군 집단"은 유사한 명시된 특성의 대상체 또는 샘플의 임의의 그룹화이다. 그룹화는 예를 들어, 임상 매개변수, 임상 평가, 치료 레지멘, 질환 상태, 병태의 중증도 등에 따를 수 있다. 특정 구현예에서, 그룹화는 연령 범위(예를 들어, 0-2 세) 및 면역손상되지 않은 상태에 기반한다. 특정 구현예에서, 정상 대조군 집단은 테스트 대상체에 연령이 일치하고 면역손상되지 않은 개체를 포함한다. 특정 구현예에서, 연령 일치는 상황에 따라 임상적으로 관련되므로, 예를 들어, 0-6 개월; 0-1 년; 0-2 년; 0-3 년; 10-15 년을 포함한다).
특정 구현예에서, 본원에 기재된 생체내 유전자 요법 및/또는 HSPC 동원과 연관된 특정 매개변수의 값에 대한 관련 참조 수준은 본원에 개시된 생체내 유전자 요법이 유전자 요법이 투여된 이를 필요로 하는 대상체에 대해 치료적으로 효과적인지를 결정하기 위해 대조군 집단에서 생체내 유전자 요법 및/또는 HSPC 동원과 연관된 특정한 상응하는 매개변수의 값을 기반으로 수득된다.
특정 구현예에서, 대조군 집단은 건강하고 면역 결핍이 없는 집단을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 대조군 집단은 면역 결핍이 있고 치료 유효량의 (i) 치료 유전자와 연관된 Ad35 바이러스 벡터를 포함하는 제형; 및 (ii) 동원 인자가 투여되지 않은 집단을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 대조군 집단은 면역 결핍이 있고 치료 유전자와 연관된 Ad35 바이러스 벡터를 포함하고 동원 인자를 포함하지 않는 제형이 치료 유효량으로 투여된 집단을 포함할 수 있다. 예로서, 관련 참조 수준은 대조군 대상체에서 생체내 유전자 요법 및/또는 HSPC 동원과 연관된 특정 매개변수의 값일 수 있다.
특정 구현예에서, 결론은 샘플 값이 참조 수준과 통계적으로 유의하게 상이하거나 또는 통계적으로 유의하게 상이하지 않은지 여부에 기반하여 도출된다. 측정치는 차이가 우연에만 기반하여 발생할 것으로 예측될 수준 내에 있는 경우 통계적으로 유의하게 상이하지 않다. 대조적으로, 통계적으로 유의한 차이 또는 증가는 우연으로만 발생할 것으로 예상된 것보다 더 큰 것이다. 통계적 유의성 또는 이의 결여는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법 중 임의의 것에 의해 결정될 수 있다. 통계적 유의성에 대해 통상적으로 사용되는 측정치의 예는 p-값이다. p-값은 특정 데이터포인트와 동등한 주어진 결과를 수득할 확률을 나타내며, 여기서 데이터포인트는 무작위 우연 단독의 결과이다. 결과는 종종 0.05 보다 작거나 또는 동일한 p-값에서 (무작위 우연이 아니라) 유의한 것으로 간주된다. 특정 구현예에서, 샘플 값은 샘플 값 및 참조 수준이 통계적으로 유의하게 상이하지 않은 경우 정상 대조군 집단에서 유래된 참조 수준과 "비슷하"다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 생체내 유전자 요법 및/또는 HSPC 동원과 관련된 매개변수 및/또는 다른 데이터세트 구성요소에 대해 수득된 값은 선택된 매개변수를 사용한 분석 과정에 적용될 수 있다. 분석 과정의 매개변수는 본원에 개시된 것들 또는 본원에 기재된 지침을 사용하여 유래된 것들일 수 있다. 결과를 생성하는 데 사용되는 분석 과정은 샘플 분류에 유용한 결과를 제공할 수 있는 임의의 유형의 과정, 예를 들어, 수득된 값과 참조 수준의 비교, 선형 알고리즘, 이차 알고리즘, 결정 트리 알고리즘, 또는 투표 알고리즘일 수 있다. 분석 과정은 샘플이 주어진 클래스에 속할 확률을 결정하기 위한 임계값을 설정할 수 있다. 확률은 바람직하게는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상이다.
본원에 기재된 Ad35 벡터는 하기 예시적인 구현예 및 실시예에 기재된 Ad5/Ad35++ 벡터 대신에 활용될 수 있다.
하기 예시적인 구현예 및 실시예(들)는 개시내용의 특정 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 많은 변화가 본원에 개시된 특이적 구현예로 이루어질 수 있고 개시내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 여전히 비슷하거나 또는 유사한 결과를 수득할 수 있음을 본 개시내용에 비추어 인식하여야 한다.
V. 예시적인 구현예
예시적인 구현예의 첫번째 세트는 하기를 포함할 수 있다:
1. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 벡터 생산 시스템: 다음을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈: Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR), 및 다음을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈: 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열.
2. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 벡터: Ad35 섬유 샤프트; Ad35 섬유 놉; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR)를 포함하는 Ad35 게놈.
3. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 게놈: Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR).
4. 하기를 포함하는, 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 벡터: 다음을 포함하는 핵산 서열: 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열, 여기서 게놈은 Ad35 바이러스 구조적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 것; 및 Ad35 섬유 샤프트 및/또는 Ad35 섬유 놉.
5. 하기를 포함하는, 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 게놈: 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열, 여기서 Ad35 공여자 게놈은 야생형 Ad35 게놈에 의해 암호화된 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 것.
6. 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 벡터를 생산하는 방법으로, 상기 방법은 세포의 배양물로부터 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR)를 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈, 및 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈을 포함하는 것인, 방법.
7. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 생산 시스템: 다음을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈: Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR), 및 다음을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 게놈:5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열.
8. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 벡터: Ad35 섬유 샤프트; Ad35 섬유 놉; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR)를 포함하는 Ad35 게놈.
9. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 게놈: Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR).
10. 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 벡터를 생산하는 방법으로, 상기 방법은 세포의 배양물로부터 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열; Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR)를 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈, 및 5' Ad35 ITR; 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 게놈을 포함하는 것인, 방법.
11. 구현예 1-4 또는 6-10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Ad35 섬유 놉이 야생형 Ad35 섬유 놉을 포함하거나, 또는 Ad35 섬유 놉이 조작된 Ad35 섬유 놉을 포함하며, 여기서 조작된 섬유 놉은 CD46에 대한 섬유 놉의 친화도를 증가시키는 돌연변이를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
12. 구현예 11에 있어서, 상기 돌연변이가 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His로부터 선택된 돌연변이를 포함하거나; 또는 돌연변이 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His 각각을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
13. 구현예 1, 4-7, 또는 10-12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 이종 발현 산물이 조절 서열과 작동가능하게 연결된 치료 발현 산물을 포함하며, 임의적으로 여기서 치료 발현 산물은 (a) β-글로빈 단백질 또는 γ-글로빈 단백질; (b) 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄로, 임의적으로 여기서 항체는 항-CD33 항체를 포함하는 것; (c) 제1 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄 및 제2 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄로, 임의적으로 여기서 항체는 항-CD33 항체를 포함하는 것; (d) CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA(gRNA)로, 임의적으로 여기서 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 cpf1을 포함하는 것; (e) 염기 편집기 및/또는 gRNA로, 임의적으로 여기서 염기 편집기는 사이토신 염기 편집기(CBE) 또는 아데닌 염기 편집기(ABE)를 포함하며, 임의적으로 여기서 염기 편집기는 기능상실된 Cas9 및 기능상실된 cpf1로부터 선택된 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제를 포함하는 것; (f) 바이러스 감염을 차단하거나 또는 감소시키는 응고 인자 또는 단백질로, 임의적으로 여기서 치료 발현 산물은 인자 VII 대체 단백질 또는 인자 VIII 대체 단백질을 포함하는 것; (g) 체크포인트 억제제; (h) 키메라 항원 수용체 또는 조작된 T 세포 수용체; 또는 (i) γC, JAK3, IL7RA, RAG1, RAG2, DCLRE1C, PRKDC, LIG4, NHEJ1, CD3D, CD3E, CD3Z, CD3G, PTPRC, ZAP70, LCK, AK2, ADA, PNP, WHN, CHD7, ORAI1, STIM1, CORO1A, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, RMRP, DKC1, TERT, TINF2, DCLRE1B, SLC46A1, FancA, FancB, FancC, FancD1, FancD2, FancE, FancF, FancG, FancI, FancJ, FancL, FancM, FancN, FancO, FancP, FancQ, FancR, FancS, FancT, FancU, FancV, FancW, 가용성 CD40, CTLA, Fas L, PD-L1에 대한 항체, CD4에 대한 항체, CD5에 대한 항체, CD7에 대한 항체, CD52에 대한 항체, IL-1에 대한 항체, IL-2에 대한 항체, IL-4에 대한 항체, IL-6에 대한 항체, IL-10에 대한 항체, TNF에 대한 항체, 자가반응성 T 세포 상에 특이적으로 존재하는 TCR에 대한 항체, 글로빈 패밀리 유전자, WAS, phox, 디스트로핀, 피루베이트 키나제, CLN3, ABCD1, 아릴술파타제 A, SFTPB, SFTPC, NLX2.1, ABCA3, GATA1, 리보솜 단백질 유전자, TERT, TERC, DKC1, TINF2, CFTR, LRRK2, PARK2, PARK7, PINK1, SNCA, PSEN1, PSEN2, APP, SOD1, TDP43, FUS, 유비퀼린 2, 및/또는 C9ORF72로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로, 임의적으로 여기서 단백질은 FancA 단백질을 포함하는 것을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
14. 구현예 13(d) 또는 13(e)에 있어서, 상기 gRNA가 HBG1, HBG2, 및/또는 적혈구 인핸서 bcl11a의 표적 핵산 서열에 결합하며, 임의적으로 여기서 gRNA는 γ-글로빈의 발현을 증가시키도록 조작되거나; 또는 상기 gRNA가 CD33의 일부를 암호화하는 표적 핵산 서열에 결합하며, 임의적으로 여기서 CD33은 인간 CD33을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
15. 구현예 13에 있어서, 상기 치료 발현 산물이 β-글로빈 단백질 또는 γ-글로빈 단백질; 및 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템; 및 다음 중 1, 2, 또는 3 개를 포함하며: HBG1의 표적 핵산에 결합하는 gRNA; HBG2의 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA; 및/또는 Bcl11a의 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA, 임의적으로 여기서 gRNA는 γ-글로빈의 발현을 증가시키도록 조작되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
16. 구현예 13에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 프로모터를 포함하며, 임의적으로 여기서 프로모터는 β-글로빈 프로모터를 포함하며, 임의적으로 여기서 β-글로빈 프로모터는 약 1.6 kb의 길이를 갖고/갖거나 염색체 11의 위치 5228631-5227023에 따른 핵산을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
17. 구현예 13에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 유전자좌 제어 영역(LCR)을 포함하며, 임의적으로 여기서 LCR은 β-글로빈 LCR을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법
18. 구현예 13에 있어서, 상기 β-글로빈 LCR이
HS1, HS2, HS3, 및 HS4를 포함하거나 또는 이로 이루어진 β-글로빈 LCR DNAse I 과민성 부위(HS)를 포함하며, 임의적으로 여기서 β-글로빈 LCR은 약 4.3 kb의 길이를 갖거나;
HS1, HS2, HS3, HS4, 및 HS5를 포함하는 β-글로빈 LCR DNAse I HS를 포함하며, 임의적으로 여기서 β-글로빈 LCR은 약 21.5 kb의 길이를 갖거나; 또는
상기 β-글로빈 LCR이 염색체 11의 위치 5292319-5270789에 따른 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
19. 구현예 13 또는 14에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 3'HS1을 포함하며, 임의적으로 여기서 3'HS1은 염색체 11의 위치 5206867-5203839에 따른 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
20. 구현예 13-19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 miRNA 결합 부위를 포함하며, 임의적으로 여기서 miRNA 결합 부위는 관심 종에 의해 자연적으로 발현되는 miRNA에 대한 결합 부위를 포함하고/하거나; miRNA는 혈액 및 종양 미세환경 또는 표적 조직에서 차등 점유 프로파일을 입증하며, 임의적으로 여기서 점유 프로파일은 종양 미세환경 또는 표적 조직에서보다 혈액에서 더 높은 것이고/이거나; miRNA 결합 부위는 miR423-5, miR423-5p, miR42-2, miR181c, miR125a, 또는 miR15a 결합 부위를 포함하고/하거나; miRNA 결합 부위는 miR187 또는 miR218 결합 부위를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
21. 구현예 1, 4-7, 또는 10-21 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산이 통합 요소를 추가로 포함하는 페이로드의 일부이며, 임의적으로 여기서 통합 요소는 발현 산물을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 통합 요소가 상동 재조합에 의해 표적 게놈 내로 통합을 위해 조작되고, 상기 통합 요소가 표적 게놈의 인접하게 연결된 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹되며, 임의적으로 여기서 상동성 아암은 0.8 내지 1.8　kb인 것이고/이거나; 상동성 아암은 염색체 안전 항구 유전자좌에 플랭킹하는 표적 게놈의 핵산 서열에 상동성이며, 임의적으로 여기서 안전 항구 유전자좌는 AAVS1, CCR5, HPRT, 또는 Rosa로부터 선택되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
23. 구현예 21에 있어서, 상기 통합 요소가 전위에 의해 표적 게놈 내로 통합을 위해 조작되고, 상기 통합 요소가 트랜스포존 도립 반복부(IR)에 의해 플랭킹되며, 임의적으로 여기서 트랜스포존 IR은 재조합효소 DR에 의해 플랭킹되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 트랜스포존 IR이 잠자는 미녀(SB) IR이며, 임의적으로 여기서 SB IR은 pT4 IR이거나; 또는 트랜스포존 IR이 피기백, 마리너, 개구리 왕자, Tol2, TcBuster, 또는 spinON IR인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
25. 구현예 21-24 중 어느 한 구현예에 있어서, 트랜스포존 IR에 의해 플랭킹된 통합 요소의 전위를 매개하는 트랜스포사제를 암호화하는 핵산을 포함하며, 임의적으로 여기서 트랜스포사제를 암호화하는 핵산은 지지 벡터 또는 지지 벡터 게놈으로 구성되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
26. 구현예 25에 있어서, 상기 트랜스포사제가 잠자는 미녀, 피기백, 마리너, 개구리 왕자, Tol2, TcBuster, 또는 spinON 트랜스포사제를 포함하며, 임의적으로 여기서 트랜스포사제는 잠자는 미녀 100x(SB100x) 트랜스포사제인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
27. 구현예 25 또는 26에 있어서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 핵산이 PGK 프로모터와 작동가능하게 연결되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
28. 구현예 1-3 또는 6-27 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹되고/되거나 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내에 있고 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않는 재조합효소 DR이 FRT, loxP, rox, vox, AttB, 또는 AttP 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
29. 구현예 28에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부의 절제를 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산이 헬퍼 게놈을 포함하는 세포의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
30. 구현예 23-29 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 트랜스포존 IR에 플랭킹하는 재조합효소 DR이 FRT, loxP, rox, vox, AttB, 또는 AttP 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
31. 구현예 21-28 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 통합 요소를 포함하는 핵산의 절제를 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산이 지지 벡터 또는 지지 벡터 게놈으로 구성되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
32. 구현예 29 또는 31에 있어서, 상기 재조합효소가 Flp, Cre, Dre, Vika, 또는 PhiC31 재조합효소를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
33. 구현예 32에 있어서, 상기 재조합효소를 암호화하는 핵산이 EF1α 프로모터와 작동가능하게 연결되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
34. 구현예 21-33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 페이로드가 이종 발현 산물을 포함하는 통합요소를 포함하며, 여기서 이종 발현 산물은 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 긴 LCR과 작동가능하게 연결된 β-글로빈을 포함하고,
여기서 통합 요소는 SB IR에 의해 플랭킹되며, 여기서 SB IR은 재조합효소 DR에 의해 플랭킹되며, 임의적으로 여기서 재조합효소 DR은 FRT 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
35. 구현예 21-34 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 페이로드가 통합 요소, 및 발현 산물을 암호화하고, 통합 요소로 구성되지 않고, 표적 게놈 내로 통합 효소의 통합에 의해 기능적이지 않게 만들도록 위치하는 조건부로 발현되는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
36. 구현예 35에 있어서, 상기 조건부로 발현되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 발현 산물이 CRISPR 시스템 구성요소 또는 염기 편집기 시스템 구성요소를 포함하며, 임의적으로 여기서 구성요소는 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 염기 편집기 효소, 또는 gRNA를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
37. 구현예 21-36 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 페이로드가 선택 카세트를 포함하며, 임의적으로 여기서 선택 카세트는 통합 요소로 구성되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
38. 구현예 37에 있어서, 상기 선택 카세트가 mgmtP140K를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 상기 선택 카세트가 항-CD33 shRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
39. 구현예 1-3 또는 6-38 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 재조합효소 DR에 의해 플랭킹된 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부가 GenBank 수탁 번호 AX049983에 따른 Ad35 서열의 뉴클레오티드 138-481에 상응하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
40. 구현예 1-3 또는 6-38 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 재조합효소 DR에 의해 플랭킹된 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부가 GenBank 수탁 번호 AX049983에 따른 Ad35 서열의 뉴클레오티드 179-344; 뉴클레오티드 366-481; 뉴클레오티드 155-481; 뉴클레오티드 159-480; 뉴클레오티드 159-446; 뉴클레오티드 180-480; 뉴클레오티드 207-480; 뉴클레오티드 140-446; 뉴클레오티드 159-446; 뉴클레오티드 180-446; 뉴클레오티드 202-446; 뉴클레오티드 159-481; 뉴클레오티드 180-384; 뉴클레오티드 180-481; 또는 뉴클레오티드 207-481에 상응하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
41. 구현예 1-3 또는 6-40 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 재조합효소 DR이 LoxP 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
42. 구현예 2, 3, 8, 또는 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Ad35 헬퍼 게놈이 293 T 세포에서 증폭을 위해 Ad5 E4orf6을 포함하는 것인, 헬퍼 벡터 또는 헬퍼 게놈.
43. 구현예 2, 3, 8, 또는 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 헬퍼 게놈이 서열번호: 51-65 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 또는 생성하는 것인, 헬퍼 벡터 또는 헬퍼 게놈.
44. 구현예 2-5, 8, 또는 9 중 어느 한 구현예의 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 공여자 벡터, 또는 공여자 게놈을 포함하는 세포로, 임의적으로 여기서 세포는 HEK293 세포인, 세포.
45. 구현예 1, 4, 6, 7, 10, 13-27 또는 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 공여자 게놈을 포함하는 세포로, 임의적으로 여기서 세포는 적혈구이고, 임의적으로 여기서 세포는 조혈 줄기 세포, T-세포, B-세포, 또는 골수성 세포이고, 임의적으로 여기서 세포는 발현 산물을 분비하는 것인, 세포.
46. 구현예 6 또는 10-41 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 HEK293 세포인, 방법.
47. 세포를 변형시키는 방법으로, 상기 방법은 구현예 5 또는 11-27 중 어느 한 구현예에 따른 Ad35 공여자 벡터와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
48. 대상체의 세포를 변형시키는 방법으로, 상기 방법은 구현예 5 또는 11-27 중 어느 한 구현예에 따른 Ad35 공여자 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 방법은 대상체로부터 세포의 단리를 포함하지 않는 것인, 방법.
49. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로, 구현예 5 또는 11-27 중 어느 한 구현예에 따른 Ad35 공여자 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 투여는 정맥내 투여인, 방법.
50. 구현예 49에 있어서, 상기 방법이 동원제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 동원제는 과립구-콜로니 자극 인자, GM-CSF, S-CSF, CXCR4 길항제, 및 CXCR2 작용제 중 하나 이상을 포함하며, 임의적으로 여기서 CXCR4 길항제는 AMD3100을 포함하고/하거나 여기서 CXCR2 작용제는 GRO-β를 포함하는 것인, 방법.
51. 구현예 49 또는 50에 있어서, 상기 Ad35 공여자 벡터가 선택 카세트를 포함하며, 임의적으로 여기서 방법은 대상체에게 선택제를 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 선택 카세트는 mgmtP140K를 암호화하고 선택제는 O6BG/BCNU를 포함하는 것인, 방법.
52. 구현예 49-51 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 면역 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 면역 억제 레지멘은 스테로이드, IL-6 수용체 길항제, 및/또는 IL-1R 수용체 길항제를 포함하며, 임의적으로 여기서 스테로이드는 글루코코르티코이드 또는 덱사메타손을 포함하는 것인, 방법.
53. 구현예 49-52 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Ad35 공여자 벡터가 통합 요소를 포함하고 방법이 CD46을 발현하는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 조혈 줄기 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 및/또는 적혈구 Ter119+ 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%에서 이의 통합 요소의 카피의 통합 및/또는 발현을 유발하는 것인, 방법.
54. 구현예 49-53 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 통합 요소의 적어도 1 개의 카피를 포함하는 표적 세포 게놈에서 통합 요소의 평균 적어도 2 개의 카피 또는 적어도 2.5 개의 카피의 통합을 유발하는 것인, 방법.
55. 구현예 49-54 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 참조 수준의 적어도 약 20% 또는 참조 수준의 적어도 약 25%인 수준에서 페이로드에 의해 암호화된 발현 산물 또는 이의 통합 요소의 발현을 유발하며, 임의적으로 여기서 참조는 대상체 또는 참조 집단에서 내인성 참조 단백질의 발현인, 방법.
56. 구현예 49-55 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 혈색소병증, 혈소판 장애, 빈혈, 면역 결핍 응고 인자 결핍, 판코니 빈혈, 알파-1 항트립신 결핍, 겸상 세포 빈혈, 지중해빈혈, 중간형 지중해빈혈, A형 혈우병, B형 혈우병, 폰빌레브란트병, 인자 V 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 X 결핍, 인자 XI 결핍, 인자 XII 결핍, 인자 XIII 결핍, 베르나르-술리에 증후군, 그레이 혈소판 증후군, 또는 뮤코다당류축적증을 포함하는 것인, 방법.
57. 구현예 49-56 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고 있는 대상체이고 상기 방법이 암을 치료, 예방, 또는 지연시키거나, 또는 암 재발을 지연시키며,
임의적으로 여기서 대상체는 암의 발달과 연관된 하나 이상의 생식 계열 돌연변이의 보균자이며, 임의적으로 여기서 암은 역형성 성상세포종, 유방암, 난소암, 결장직장암, 미만성 내재성 뇌간 신경교종, 유잉 육종, 다형성 교모세포종, 악성 뇌교종, 흑색종, 전이성 악성 흑색종, 비인두암, 또는 소아암을 포함하며, 임의적으로 여기서 대상체는 O6BG, TMZ(테모졸로미드), 및/또는 BCNU(카르무스틴)를 받거나 또는 투여받는 것인, 방법.
58. 구현예 49-57 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 중간형 지중해빈혈을 포함하며, 임의적으로 여기서 벡터 또는 게놈은 내인성 γ-글로빈의 발현을 증가 또는 재활성화하는 발현 산물(들)로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물을 암호화하는 핵산을 포함하며, 임의적으로 여기서 내인성 γ-글로빈의 발현을 증가 또는 재활성화하는 발현 산물(들)은 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 염기 편집기 및 HBG1의 핵산 서열에 결합하고 표적 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 코딩 서열로부터 발현을 증가시키도록 조작된 gRNA; HBG2의 핵산 서열에 결합하고 표적 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 코딩 서열로부터 발현을 증가시키도록 조작된 gRNA; 및 적혈구 인핸서 bcl11a의 핵산 서열에 결합하고 BCL11A의 발현을 감소시키도록 조작된 gRNA; γ-글로빈; 및 β-글로빈 중 하나 이상을 포함하며, 임의적으로 여기서 방법은 중간형 지중해빈혈의 증상을 감소시키고/시키거나 중간형 지중해빈혈을 치료하고/하거나 HbF를 증가시키는 것인, 방법.
예시적인 구현예의 두번째 세트는 하기를 포함할 수 있다:
1. 조혈 줄기 세포의 생체내 유전자 편집을 위한 CD46을 표적화하는 재조합 혈청형 35 아데노바이러스(Ad35) 벡터.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 벡터의 섬유 놉 단백질이 CD46 결합을 증가시키는 돌연변이를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
3. 구현예 2에 있어서, 상기 섬유 놉 단백질 돌연변이가 Asn217Asp, Thr254Pro, Ile256Leu, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Thr245Ala, Thr226Ala, Ile192Val, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
4. 구현예 2에 있어서, 상기 섬유 놉 단백질 돌연변이가 Asn217Asp, Thr254Pro, Ile256Leu, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Thr245Ala, Thr226Ala, Ile192Val, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
5. 구현예 2에 있어서, 상기 섬유 놉 단백질 돌연변이가 Asn217Asp, Thr254Pro, Ile256Leu, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Thr245Ala, Thr226Ala, Ile192Val, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His로 이루어지는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
6. 구현예 1에 있어서, 생체내 암호화된 유전자의 발현을 조절하는 miRNA 제어 시스템을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
7. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 제어 시스템이 혈액 및 종양 미세환경 또는 표적 조직에서 차등 점유 프로파일을 갖는 miRNA 표적 부위로 이루어지는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
8. 구현예 7에 있어서, 상기 점유 프로파일이 종양 미세환경 또는 표적 조직에서보다 혈액에서 더 높은 것인, 재조합 Ad35 벡터.
9. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 표적 부위가 miR423-5, miR423-5p, miR42-2, miR181c, miR125a, 및/또는 miR15a를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
10. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 표적 부위가 Cas9의 발현을 제어하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
11. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 표적 부위가 miR187, 및/또는 miR218을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
12. 구현예 1에 있어서, DNA 파괴를 매개하고/하거나 내인성 유전자 발현을 활성화시키기 위해 CRISPR 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 CRISPR 구성요소가 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
14. 구현예 13에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Cas9 또는 cpf1을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
15. 구현예 12에 있어서, 상기 CRISPR 구성요소가 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
16. 구현예 15에 있어서, 상기 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제가 기능상실된 Cas9 또는 기능상실된 cpf1을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
17. 구현예 15에 있어서, 상기 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제가 가이드 RNA 및 사이티딘 또는 아데닌 데아미나제 또는 트랜스아미나제에 융합되는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
18. 구현예 13에 있어서, 상기 가이드 RNA가 HBG1 프로모터, HBG2 프로모터, 및/또는 bcl11a 인핸서에 결합하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
19. 구현예 1에 있어서, 양성 선택 마커를 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
20. 구현예 19에 있어서, 상기 양성 선택 마커가 항-CD33 shRNA 카세트 및/또는 MGMTP140K 카세트를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
21. 구현예 1에 있어서, 상동성 아암을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 상동성 아암이 0.8 내지 1.8kb인, 재조합 Ad35 벡터.
23. 구현예 21에 있어서, 상기 상동성 아암이 염색체 안전 항구 유전자좌에 특이적인 것인, 재조합 Ad35 벡터.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 염색체 안전 항구 유전자좌가 AAVS1, CCR5, HPRT, 또는 Rosa로부터 선택되는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
25. 구현예 1에 있어서, 트랜스포사제에 의해 인식되는 도립 반복 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
26. 구현예 1에 있어서, 트랜스포사제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
27. 구현예 26에 있어서, 상기 트랜스포사제가 잠자는 미녀, 피기백, 마리너, 개구리 왕자, Tol2, TcBuster, 및 spinON을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
28. 구현예 26에 있어서, 상기 트랜스포사제가 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제 또는 과활성 피기백 트랜스포사제를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
29. 구현예 28에 있어서, 상기 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제가 SB100X를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
30. 구현예 26에 있어서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 PGK 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
31. 구현예 1에 있어서, 재조합효소 인식 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 재조합효소 인식 서열이 Frt, lox, rox, vox, AttB, 또는 AttP를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
33. 구현예 1에 있어서, 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
34. 구현예 33에 있어서, 상기 재조합효소가 Flp, Cre, Dre, Vika, 또는 PhiC31을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
35. 구현예 33에 있어서, 상기 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 EF1α 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
36. 구현예 1-35 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료 카세트를 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 치료 카세트가 치료 유전자를 포함하거나 또는 γC, JAK3, IL7RA, RAG1, RAG2, DCLRE1C, PRKDC, LIG4, NHEJ1, CD3D, CD3E, CD3Z, CD3G, PTPRC, ZAP70, LCK, AK2, ADA, PNP, WHN, CHD7, ORAI1, STIM1, CORO1A, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, RMRP, DKC1, TERT, TINF2, DCLRE1B, SLC46A1, FancA, FancB, FancC, FancD1(BRCA2), FancD2, FancE, FancF, FancG, FancI, FancJ(BRIP1), FancL, FancM, FancN(PALB2), FancO(RAD51C), FancP(SLX4), FancQ(ERCC4), FancR(RAD51), FancS(BRCA1), FancT(UBE2T), FancU(XRCC2), FancV(MAD2L2), FancW(RFWD3), 가용성 CD40, CTLA, Fas L, PD-L1에 대한 항체, CD4에 대한 항체, CD5에 대한 항체, CD7에 대한 항체, CD52에 대한 항체, IL-1에 대한 항체, IL-2에 대한 항체, IL-4에 대한 항체, IL-6에 대한 항체, IL-10에 대한 항체, TNF에 대한 항체, 자가반응성 T 세포 상에 특이적으로 존재하는 TCR에 대한 항체, 글로빈 패밀리 유전자, WAS, phox, 디스트로핀, 피루베이트 키나제, CLN3, ABCD1, 아릴술파타제 A, SFTPB, SFTPC, NLX2.1, ABCA3, GATA1, 리보솜 단백질 유전자, TERT, TERC, DKC1, TINF2, CFTR, LRRK2, PARK2, PARK7, PINK1, SNCA, PSEN1, PSEN2, APP, SOD1, TDP43, FUS, 유비퀼린 2, 및/또는 C9ORF72로부터 선택된 치료 유전자 산물을 암호화하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
38. 구현예 36에 있어서, 상기 치료 카세트가 공통 감마(γ) 쇄, FancA, γ-글로빈, 및/또는 FVIII을 포함하거나 또는 암호화하는 치료 유전자를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
39. 구현예 36에 있어서, 상기 치료 카세트가 키메라 항원 수용체, 조작된 T 세포 수용체, 및/또는 치료 항체를 암호화하는 치료 유전자를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
40. 구현예 38에 있어서, 상기 치료 유전자가 β-글로빈 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
41. 구현예 38에 있어서, 상기 치료 유전자가 HS1, HS2, HS3, 및 HS4로 이루어진 DNAse I 과민성 부위(HS)를 포함하는 β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR)의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
42. 구현예 41에 있어서, 상기 β-글로빈 LCR가 대략 4.3 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
43. 구현예 41에 있어서, 상기 치료 유전자가 추가로 β-글로빈 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
44. 구현예 43에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 대략 1.6 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
45. 구현예 44에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 염색체 11의 위치 5228631-5227023의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
46. 구현예 38에 있어서, 상기 치료 유전자가 HS1, HS2, HS3, HS4, 및 HS5를 포함하는 β-글로빈 긴 LCR의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
47. 구현예 46에 있어서, 상기 β-글로빈 긴 LCR이 대략 21.5 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
48. 구현예 47에 있어서, 상기 β-글로빈 긴 LCR이 염색체 11의 위치 5292319-5270789의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
49. 구현예 46에 있어서, 상기 치료 유전자가 추가로 β-글로빈 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
50. 구현예 49에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 대략 1.6 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
51. 구현예 50에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 염색체 11의 위치 5228631-5227023의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
52. 구현예 46에 있어서, 3'HS1을 추가로 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
53. 구현예 52에 있어서, 상기 3'HS1이 염색체 11의 위치 5206867-5203839의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
54. 구현예 1에 있어서, 적어도 30 kb 트랜스포존을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
55. 구현예 1에 있어서, 32.4 kb 트랜스포존을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
56. 구현예 1에 있어서, 헬퍼 바이러스를 사용하여 생성되는, 재조합 Ad35 벡터.
57. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 293 T 세포에서 증폭을 위해 Ad5 E4orf6을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
58. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 Ad35 신호전달 서열 및 패키징 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
59. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 바이러스 제조 동안 CRISPR 구성요소의 발현을 방지하기 위해 항-CRISPR(acr) 발현 카세트를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
60. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 벡터가 서열번호: 51-64의 서열을 포함하거나 또는 생성하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
61. 치료 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 적혈구.
62. 구현예 61에 있어서, 상기 치료 단백질이 바이러스 감염을 차단 또는 감소시키는 응고 인자 또는 단백질을 포함하는, 적혈구.
63. 구현예 61에 있어서, 상기 적혈구가 치료 단백질을 분비하는 것인, 적혈구.
64. 적혈구 bcl11a-인핸서 및 HBG 프로모터 영역을 동시에 표적화함으로써 HbF 재활성화를 증가시키기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
65. γ-글로빈 유전자 추가 및 내인성 γ-글로빈 유전자 재활성화의 조합을 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
66. 생체내 CRISPR 게놈 조작을 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
67. 치료 유전자를 제공하기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
68. (i) 혈색소병증, (ii) 판코니 빈혈, (iii) 임의적으로 A형 혈우병, B형 혈우병, 또는 폰빌레브란트병으로부터 선택된 응고 인자 결핍, (iv) 혈소판 장애, (v) 빈혈, (vi) 알파-1 항트립신 결핍, 또는 (v) 면역 결핍을 치료하기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
69. 지중해빈혈을 치료하기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
70. 암을 치료하거나, 암 재발을 예방 또는 지연시키거나 또는 고위험 생식 계열 돌연변이의 보균자에서 암 발병을 예방 또는 지연시키기 위한 것이며, 임의적으로 여기서 암은 유방암 또는 난소암인, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
71. CRISPR/Cas9의 자기-불활성화를 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
72. 자기-방출 카세트를 갖는 HDAd를 공여자 벡터로서 사용하여 표적화된 통합을 위한, 구현예 1-3 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
73. 구현예 64 - 72 중 어느 한 구현예에 있어서, 동원을 포함하는, 용도.
74. 구현예 49에 있어서, 상기 동원이 Gro-베타, GM-CSF, S-CSF, 및/또는 AMD3100의 투여를 포함하는, 용도.
75. 구현예 64 - 72 중 어느 한 구현예에 있어서, 스테로이드, IL-6 수용체 길항제, 및/또는 IL-1R 수용체 길항제를 Ad35 벡터 및/또는 적혈구를 받는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 용도.
76. 구현예 75에 있어서, 상기 스테로이드가 글루코코르티코이드를 포함하는 것인, 용도.
77. 구현예 75에 있어서, 상기 스테로이드가 덱사메타손을 포함하는 것인, 용도.
78. 구현예 64-72 중 어느 한 구현예에 있어서, O6BG 및 TMZ(테모졸로미드) 또는 BCNU(카르무스틴)를 Ad35 벡터 및/또는 적혈구를 받는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 용도.
79. 구현예 78에 있어서, 상기 대상체가 역형성 성상세포종, 유방암, 결장직장암, 미만성 내재성 뇌간 신경교종, 유잉 육종, 다형성 교모세포종(GBM), 악성 뇌교종, 흑색종, 전이성 악성 흑색종, 비인두암, 또는 소아암에 대한 치료로서 O6BG 및 TMZ 또는 BCNU를 받는 것인, 용도.
예시적인 구현예의 세번째 세트는 하기를 포함할 수 있다:
1. 조혈 줄기 세포의 생체내 유전자 편집을 위한 CD46을 표적화하는 재조합 혈청형 35 아데노바이러스(Ad35) 벡터.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 벡터의 섬유 놉 단백질이 CD46 결합을 증가시키는 돌연변이를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
3. 구현예 2에 있어서, 상기 섬유 놉 단백질 돌연변이가 Asn217Asp, Thr254Pro, Ile256Leu, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Thr245Ala, Thr226Ala, Ile192Val, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
4. 구현예 2에 있어서, 상기 섬유 놉 단백질 돌연변이가 Asn217Asp, Thr254Pro, Ile256Leu, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Thr245Ala, Thr226Ala, Ile192Val, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
5. 구현예 2에 있어서, 상기 섬유 놉 단백질 돌연변이가 Asn217Asp, Thr254Pro, Ile256Leu, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Thr245Ala, Thr226Ala, Ile192Val, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His로 이루어지는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
6. 구현예 1에 있어서, 생체내에서 암호화된 유전자의 발현을 조절하는 miRNA 제어 시스템을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
7. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 제어 시스템이 혈액 및 종양 미세환경 또는 표적 조직에서 차등 점유 프로파일을 갖는 miRNA 표적 부위로 이루어지는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
8. 구현예 7에 있어서, 상기 점유 프로파일이 종양 미세환경 또는 표적 조직에서 보다 혈액에서 더 높은 것인, 재조합 Ad35 벡터.
9. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 표적 부위가 miR423-5, miR423-5p, miR42-2, miR181c, miR125a, 및/또는 miR15a를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
10. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 표적 부위가 Cas9의 발현을 제어하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
11. 구현예 6에 있어서, 상기 miRNA 표적 부위가 miR187, 및/또는 miR218을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
12. 구현예 1에 있어서, DNA 파괴를 매개하고/하거나 내인성 유전자 발현을 활성화하기 위해 CRISPR 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 CRISPR 구성요소가 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
14. 구현예 13에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Cas9 또는 cpf1을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
15. 구현예 12에 있어서, 상기 CRISPR 구성요소가 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
16. 구현예 15에 있어서, 상기 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제가 기능상실된 Cas9 또는 기능상실된 cpf1을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
17. 구현예 15에 있어서, 상기 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제가 가이드 RNA 및 사이티딘 또는 아데닌 데아미나제 또는 트랜스아미나제에 융합되는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
18. 구현예 13에 있어서, 상기 가이드 RNA가 HBG1, HBG2, 및/또는 Bc11a에 결합하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
19. 구현예 1에 있어서, 양성 선택 마커를 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
20. 구현예 19에 있어서, 상기 양성 선택 마커가 항-CD33 shRNA 카세트 및/또는 MGMTP140k 카세트를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
21. 구현예 1에 있어서, 상동성 아암을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 상동성 아암이 0.8 내지 1.8　kb인, 재조합 Ad35 벡터.
23. 구현예 21에 있어서, 상기 상동성 아암이 염색체 안전 항구 유전자좌에 특이적인 것인, 재조합 Ad35 벡터.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 염색체 안전 항구 유전자좌가 AAVS1, CCR5, HPRT, 또는 Rosa로부터 선택되는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
25. 구현예 1에 있어서, 트랜스포사제에 의해 인식되는 도립 반복 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
26. 구현예 1에 있어서, 트랜스포사제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
27. 구현예 26에 있어서, 상기 트랜스포사제가 잠자는 미녀, 피기백, 마리너, 개구리 왕자, Tol2, TcBuster, 및 spinON을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
28. 구현예 26에 있어서, 상기 트랜스포사제가 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제 또는 과활성 피기백 트랜스포사제를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
29. 구현예 28에 있어서, 상기 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제가 SB100X를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
30. 구현예 26에 있어서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 PGK 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
31. 구현예 1에 있어서, 재조합효소 인식 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 재조합효소 인식 서열이 Frt, lox, rox, vox, AttB, 또는 AttP를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
33. 구현예 1에 있어서, 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
34. 구현예 33에 있어서, 상기 재조합효소가 Flp, Cre, Dre, Vika, 또는 PhiC31을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
35. 구현예 33에 있어서, 상기 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 EF1α 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
36. 구현예 1-35 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료 카세트를 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 치료 카세트가 치료 유전자를 포함하거나 또는 γC, JAK3, IL7RA, RAG1, RAG2, DCLRE1C, PRKDC, LIG4, NHEJ1, CD3D, CD3E, CD3Z, CD3G, PTPRC, ZAP70, LCK, AK2, ADA, PNP, WHN, CHD7, ORAI1, STIM1, CORO1A, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, RMRP, DKC1, TERT, TINF2, DCLRE1B, SLC46A1, FancA, FancB, FancC, FancD1(BRCA2), FancD2, FancE, FancF, FancG, FancI, FancJ(BRIP1), FancL, FancM, FancN(PALB2), FancO(RAD51C), FancP(SLX4), FancQ(ERCC4), FancR(RAD51), FancS(BRCA1), FancT(UBE2T), FancU(XRCC2), FancV(MAD2L2), FancW(RFWD3), 가용성 CD40, CTLA, Fas L, PD-L1에 대한 항체, CD4에 대한 항체, CD5에 대한 항체, CD7에 대한 항체, CD52에 대한 항체, IL-1에 대한 항체, IL-2에 대한 항체, IL-4에 대한 항체, IL-6에 대한 항체, IL-10에 대한 항체, TNF에 대한 항체, 자가반응성 T 세포 상에 특이적으로 존재하는 TCR에 대한 항체, 글로빈 패밀리 유전자, WAS, phox, 디스트로핀, 피루베이트 키나제, CLN3, ABCD1, 아릴술파타제 A, SFTPB, SFTPC, NLX2.1, ABCA3, GATA1, 리보솜 단백질 유전자, TERT, TERC, DKC1, TINF2, CFTR, LRRK2, PARK2, PARK7, PINK1, SNCA, PSEN1, PSEN2, APP, SOD1, TDP43, FUS, 유비퀼린 2, 및/또는 C9ORF72로부터 선택된 치료 유전자 산물을 암호화하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
38. 구현예 36에 있어서, 상기 치료 카세트가 공통 감마(γ) 쇄, FancA, γ-글로빈, 및/또는 FVIII을 포함하거나 또는 암호화하는 치료 유전자를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
39. 구현예 36에 있어서, 상기 치료 카세트가 키메라 항원 수용체, 조작된 T 세포 수용체, 및/또는 치료 항체를 암호화하는 치료 유전자를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
40. 구현예 38에 있어서, 상기 치료 유전자가 β-글로빈 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
41. 구현예 38에 있어서, 상기 치료 유전자가 HS1, HS2, HS3, 및 HS4로 이루어진 DNAse I 과민성 부위(HS)를 포함하는 β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR)의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
42. 구현예 41에 있어서, 상기 β-글로빈 LCR이 대략 4.3 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
43. 구현예 41에 있어서, 상기 치료 유전자가 추가로 β-글로빈 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
44. 구현예 43에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 대략 1.6 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
45. 구현예 44에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 염색체 11의 위치 5228631-5227023의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
46. 구현예 38에 있어서, 상기 치료 유전자가 HS1, HS2, HS3, HS4, 및 HS5를 포함하는 β-글로빈 긴 LCR의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
47. 구현예 46에 있어서, 상기 β-글로빈 긴 LCR이 대략 21.5 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
48. 구현예 47에 있어서, 상기 β-글로빈 긴 LCR이 염색체 11의 위치 5292319-5270789의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
49. 구현예 46에 있어서, 상기 치료 유전자가 추가로 β-글로빈 프로모터의 전사 제어 하에 있는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
50. 구현예 49에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 대략 1.6 kb인, 재조합 Ad35 벡터.
51. 구현예 50에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 염색체 11의 위치 5228631-5227023의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
52. 구현예 46에 있어서, 3'HS1을 추가로 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
53. 구현예 52에 있어서, 상기 3'HS1이 염색체 11의 위치 5206867-5203839의 서열을 갖는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
54. 구현예 1에 있어서, 적어도 30 kb 트랜스포존을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
55. 구현예 1에 있어서, 32.4 kb 트랜스포존을 포함하는, 재조합 Ad35 벡터.
56. 구현예 1에 있어서, 헬퍼 바이러스를 사용하여 생성되는, 재조합 Ad35 벡터.
57. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 293 T 세포에서 증폭을 위해 Ad5 E4orf6을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
58. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 Ad35 신호전달 서열 및 패키징 신호를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
59. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스가 바이러스 제조 동안 CRISPR 구성요소의 발현을 방지하기 위해 항-CRISPR(acr) 발현 카세트를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
60. 구현예 56에 있어서, 상기 헬퍼 벡터가 서열번호: 51-65 중 임의의 하나의 서열을 포함하거나 또는 생성하는 것인, 재조합 Ad35 벡터.
61. 치료 단백질을 발현하기 위해 유전적으로 변형된 적혈구.
62. 구현예 61에 있어서, 상기 치료 단백질이 바이러스 감염을 차단 또는 감소시키는 응고 인자 또는 단백질을 포함하는 것인, 적혈구.
63. 구현예 61에 있어서, 상기 적혈구가 치료 단백질을 분비하는 것인, 적혈구.
64. 적혈구 bcl11a-인핸서 및 HBG 프로모터 영역을 동시에 표적화함으로써 HbF 재활성화를 증가시키기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
65. γ-글로빈 유전자 추가 및 내인성 γ-글로빈 유전자 재활성화의 조합을 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
66. 생체내 CRISPR 게놈 조작을 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
67. 치료 유전자를 제공하기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
68. (i) 혈색소병증, (ii) 판코니 빈혈, (iii) 임의적으로 A형 혈우병, B형 혈우병, 또는 폰빌레브란트병으로부터 선택된 응고 인자 결핍, (iv) 혈소판 장애, (v) 빈혈, (vi) 알파-1 항트립신 결핍, 또는 (v) 면역 결핍을 치료하기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
69. 지중해빈혈을 치료하기 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
70. 암을 치료하거나, 암 재발을 예방 또는 지연시키거나 또는 고위험 생식 계열 돌연변이의 보균자에서 암 발병을 예방 또는 지연시키기 위한 것이며, 임의적으로 여기서 암은 유방암 또는 난소암인, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
71. CRISPR/Cas9의 자기-불활성화를 위한, 구현예 1-63 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
72. 자기-방출 카세트가 있는 HDAd를 공여자 벡터로서 사용하여 표적화된 통합을 위한, 구현예 1-3 중 어느 한 구현예의 재조합 Ad35 벡터 또는 적혈구의 용도.
73. 구현예 64 - 72 중 어느 한 구현예에 있어서, 동원을 포함하는, 용도.
74. 구현예 49에 있어서, 상기 동원이 Gro-베타, GM-CSF, S-CSF, 및/또는 AMD3100의 투여를 포함하는 것인, 용도.
75. 구현예 64 - 72 중 어느 한 구현예에 있어서, 스테로이드, IL-6 수용체 길항제, 및/또는 IL-1R 수용체 길항제를 Ad35 벡터 및/또는 적혈구를 받는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 용도.
76. 구현예 75에 있어서, 상기 스테로이드가 글루코코르티코이드를 포함하는 것인, 용도.
77. 구현예 75에 있어서, 상기 스테로이드가 덱사메타손을 포함하는 것인, 용도.
78. 구현예 64 - 72 중 어느 한 구현예에 있어서, O6BG 및 TMZ(테모졸로미드) 또는 BCNU(카르무스틴)를 Ad35 벡터 및/또는 적혈구를 받는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 용도.
79. 구현예 78에 있어서, 상기 대상체가 역형성 성상세포종, 유방암, 결장직장암, 미만성 내재성 뇌간 신경교종, 유잉 육종, 다형성 교모세포종(GBM), 악성 뇌교종, 흑색종, 전이성 악성 흑색종, 비인두암, 또는 소아암에 대한 치료로서 O6BG 및 TMZ 또는 BCNU를 받는 것인, 용도.
VI. 실험 실시예
실시예 1. 생체내 조혈 줄기 세포 유전자 요법은 뮤린 중간형 지중해빈혈을 개선시킨다.
이 실시예는 "건강한" 인간 CD46-유전자이식(CD46tg) 마우스에서 인간 γ-글로빈 유전자를 발현하는 통합 HDAd5/35++ 벡터를 이용하는 생체내 HSPC 유전자 요법 접근법을 예시하며; 개념 증명으로서, 이 접근법은 중간형 지중해빈혈에 대한 마우스 모델(CD46+/+/Hbbth-3 마우스)에서 예시된다. 이는 지중해빈혈에 대한 전통적인 렌티바이러스 벡터 생체외 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 이 실시예에 함유된 정보 중 적어도 일부는 Wang 등, (J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019; e-pub November 13, 2018)에 공개되었다.
지중해빈혈은 전 세계적으로 인간에서 가장 흔한 선천적 질환 중 하나이며(Weatherall, Ann N Y Acad Sci. 1202:17-23, 2010), β-글로빈 쇄 합성이 없거나(β0/β0) 또는 결핍된다(β+/β+). 60,000 명의 어린이가 매년 주요 β-지중해빈혈을 가지고 태어난다. 치료가 없으면, 주요 지중해빈혈이 있는 어린이는 생후 10 년 내지 20 년 내에 사망한다. 헤모글로빈 사량체 형성을 위한 충분한 β-글로빈 쇄 합성이 없으면, 과도한 α-글로빈 쇄는 침전되고 골수에서 후기 적혈구모세포의 조기 사멸을 유발하거나 또는 순환 적혈구의 반감기를 감소시키는 내포물을 형성하여, β-지중해빈혈의 주요 혈액학적 특징인 비효과적인 적혈구생성 및 적혈구 사멸을 일으킨다. 생성된 빈혈은 조혈 구획의 확장을 자극하여, 적혈구 과형성 및 골수외 조혈을 생성한다.
주요 β-지중해빈혈에 대한 주요 치료 양식은 적혈구(RBC)의 평생 수혈 및 과잉 철분을 제거하기 위한 킬레이트화를 사용한 지지적 치유; 또는 동종이계 조혈 줄기/전구체 세포(HSPC)의 이식을 사용한 치유적 치료로 이루어진다. 잘 일치하는 공여자가 없거나 또는 동종이계 HSPC 이식을 겪을 위험이 있는 환자의 경우, 렌티바이러스 벡터 야생형 β-글로빈 또는 태아 γ-글로빈 유전자 요법은 동종이계 이식의 면역학적 위험을 우회하는 치유 가능성이 있다. SIN-렌티바이러스 글로빈 벡터를 사용하여 마이크로-LCR 카세트를 혼입하는 HSPC 유전자 요법은 동물 모델 및 시험관내 환자 세포에서 β-지중해빈혈 및 겸상적혈구병(SCD) 표현형을 구제하였다(Pstaha 등, Curr Gene Ther. 17(5):364-378, 2017). 이에 기반하여, 지중해빈혈 및 SCD에 대한 다수의 임상 시험이 현재 유럽, 아시아, 및 미국에서 진행중이다(Pstaha 등, Curr Gene Ther. 17(5):364-378, 2017, Cavazanna-Calvo 등, Nature. 467(7313):318-322, 2010, Ferarri 등, Hematology/Oncology Clinics of North America: Gene Therapy. 31(5), Thompson 등, N Engl J Med. 378(16):1479-1493, 2018). 지금까지 이들 시험 데이터는 β+ 유전자형이 있는 대부분의 환자에 대한 장기간 수혈 독립성을 입증하지만, β0/β0 지중해빈혈의 치유는 여전히 과제로 남아있다.
고무적인 임상 결과에도 불구하고, 현재 지중해빈혈 유전자 요법 프로토콜은 복잡하며, 백혈구분리반출술, 시험관내 배양, β- 또는 γ-글로빈 발현 카세트를 보유하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입, 및 완전한 골수절제술로 조건화된 환자에게 재이식에 의한 공여자/환자로부터 HSPC의 수집을 수반한다. 기술적 복잡성 이외에도, 이 접근법의 다른 단점은 (a) 조혈 줄기 세포(HSC)의 다능성 및 이의 생착 가능성에 영향을 미칠 수 있는 다중 사이토카인의 존재 하에 배양의 필요성; (b) 혈색소병증 환자와 같이 만성 비악성 질환 및 기존 기관 손상이 있는 환자에서 골수절제술이 상당한 조혈 및 비조혈, 조기 또는 후기 독성과 연관된 중요한 위험 인자를 나타낼 때, 골수절제 레지멘에 대한 요건; 및 (c) 접근법에 대한 비용을 포함한다. 지중해빈혈이 자원 부족 국가에 만연하다는 사실은 더 간단하고 더 값싼 요법 접근법을 요구한다.
백혈구분리반출술, 골수절제술, 및 HSPC 이식 없이 생체내 HSPC 유전자 전달을 위한 최소로 침습적이고 용이하게 번역가능한 접근법이 개발되었다(Richter 등, Blood. 2016;128(18):2206-2217, Richter 등, Hematol Oncol Clin North Am. 31(5):771-785, 2017, Ren 등, Blood. 128(18):2194-219, 2016). 이는 골수에서 말초 혈류 내로 HSPC를 동원하기 위한 G-CSF/AMD3100의 주사 및 통합 헬퍼-의존적 아데노바이러스(HDAd5/35++) 벡터 시스템의 정맥내 주사를 수반한다. HDAd5/35++ 벡터는 원시 HSC 상에서 발현되는 수용체인 인간 CD46을 표적화한다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-2217, 2016). HDAd5/35++에서, 섬유 놉 도메인 및 샤프트를 제외한 모든 단백질은 혈청형 5로부터 유래되고; 섬유 놉 도메인 및 샤프트는 혈청형 35로부터 유래되고; CD46에 대한 친화도를 증가시키는 돌연변이는 Ad35 섬유 놉 및 ITR 내로 도입되고(WO　2010/0120541 참조) 패키징 신호는 Ad5로부터 유래된다. HdAd35++에서, 모든 단백질은 혈청형 35로부터 유래되고; CD46에 대한 친화도를 증가시키는 돌연변이는 섬유 놉 및 ITR 내로 도입되고 패키징 신호는 Ad35로부터 유래된다.
이식유전자 통합은 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제(SB100X)에 의해 무작위 패턴으로 달성된다(Mates 등, Nat Genet. 41(6):753-761, 2009). GFP를 리포터 유전자로 사용하는 마우스 모델에서, HSPC가 주변부에서 골수로 되돌아가 다시 형질도입되어, 생체내-형질도입된 마우스 및 2차 수용자에서 장기간 리포터를 지속하고 안정되게 발현함을 입증하였다(Richter 등, Blood. 2016;128(18):2206-2217).
지중해빈혈을 표현형적으로 교정하기 위해 필요한 높은 수준의 이식유전자 마킹을 고려하면, 생체내 HSPC 형질도입 접근법은 MGMTP140K 발현 카세트를 HDAd5/35++ 벡터 내로 삽입함으로서 최적화되었다. 이는 저용량의 메틸화제, 예를 들어, O6-벤질구아닌(O6BG) 및 비스-클로로에틸니트로소우레아(BCNU) 또는 테모졸로미드로 유전자-교정된 전구체의 생체내 선택을 허용한다(Beard 등, J Clin Invest. 120(7):2345-2354, 2010, Larochelle 등, J Clin Invest. 119(7):1952-1963, 2009, Trobridge 등, PLoS One. 7(9):e45173, 2012). 이전에 조합된 생체내 형질도입/선택 접근법은 안전하고 2차 수용체에서 유지되는 수준인 말초 혈액 세포의 최대 80%에서 안정된 GFP 발현을 초래하였음이 제시되었으며, 이는 자기-재생, 다중계통, 장기간 재증식 HSC의 안정된 형질도입을 나타낸다(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 8:52-64, 2018).
본원에서는 "건강한" 인간 CD46-유전자이식(CD46tg) 마우스 및, 개념 증명으로서, 중간형 지중해빈혈에 대한 마우스 모델(CD46+/+/Hbbth-3 마우스)에서 인간 γ-글로빈 유전자를 발현하는 통합 HDAd5/35++ 벡터를 사용하여 생체내 HSPC 유전자 요법 접근법을 테스트하였다.
재료 및 방법 . 시약.　 하기 시약을 사용하였다: G-CSF(Neupogen, Amgen), AMD3100(Sigma-Aldrich), 플레릭사포르(Mozobil, Genzyme Corp.), O6-BG 및 BCNU(Sigma-Aldrich), 마이코페놀레이트 모페틸(CellCept Intravenous, Genentech), 라파마이신(Rapamune/Sirolimus, Pfizer), 및 메틸프레드니솔론 (Pfizer).
HDAd 벡터.　 트랜스포존 벡터 HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 SB100X-발현 인간 배아 신장-293 세포-유래 116 세포의 생성(Palmer 등, Gene Therapy Protocols. Volume 1: Production and In vivo Applications of Gene Transfer Vectors (Methods in Molecular Biology):33-53, 2009)은 이전에 기재되었다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 9:142-152, 2018). 헬퍼 바이러스 오염 수준은 0.05% 미만인 것으로 밝혀졌다. 역가는 6 x 1012 내지 12 x 1012 vp/ml였다. 이 연구에 사용되는 모든 HDAd 벡터는 Ad5 섬유 꼬리, Ad35 섬유 샤프트, 및 친화도-향상된 Ad35++ 섬유 놉으로 구성된 키메라 섬유를 함유한다(Wang 등, J Virol. 82(21):10567-10579, 2008). 모든 HDAd 제제는 1010　vp에서 1 개 미만 카피의 야생형 바이러스를 가졌다(다른 곳에 기재된 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 측정됨; Haeussler 등, PLoS One. 6(8):e23160, 2011).
인간 γ-글로빈 발현을 검출하는 세포내 유세포 분석.　 FIX 및 PERM 세포 투과화 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 제조업체의 프로토콜에 따랐다. 간단히 말해서, 1 Х 106 개 세포를 100 μl FACS 완충액(1% FCS가 보충된 PBS)에 재현탁하고, 100　μl 시약 A(고정 배지)를 첨가하고 실온에서 2-3 분 동안 배양한 다음, 미리 냉각된 절대 메탄올 1 ml를 첨가하고, 혼합하고, 10 분 동안 암실에서 얼음 위에서 배양하였다. 그런 다음 샘플을 FACS 완충액으로 세척하고 100　μl 시약 B(투과 배지) 및 1　μg γ-글로빈 항체(Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 sc-21756 PE)에 재현탁하고, 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 분석하였다. 적혈구 및 γ-글로빈 이중 염색을 위해, 세포를 먼저 APC 항-마우스 Ter119 항체(Ter119-APC, BioLegend, 카탈로그 116212)로 염색한 다음, 세척하고 상기 기재된 바와 같은 고정 배지로 고정하였다.
글로빈 HPLC.　 개별 글로빈 쇄 수준을 SPD-10AV 다이오드 어레이 검출기 및 LC-10AT 바이너리 펌프가 장착된 Shimadzu Prominence 기기(Shimadzu)에서 정량화하였다. 물/아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산의 38%-60% 구배 혼합물을 Vydac C4 역상 칼럼(Hichrom)을 사용하여 1 ml/분의 속도로 적용하였다.
실시간 역전사 PCR.　 총 RNA를 제조업체의 페놀-클로로포름 추출 방법에 따라 TRIzol™ 시약(Thermo Fisher Scientific, Cat. # 15596026)을 사용하여 50-100　μl 혈액으로부터 추출하였다. QuantiTect 역전사 키트(Qiagen, Cat. # 205311) 및 Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Thermo Fisher Scientific, Cat.# 4367659)를 사용하였다. 실시간 정량적 PCR을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 수행하였다. 다음 프라이머 쌍을 이 작업에 사용하였다: 마우스 RPL10 정방향(서열번호: 189), 및 역방향(서열번호: 190); 인간 γ-글로빈 정방향(서열번호: 191), 및 역방향(서열번호: 192); 마우스 β-주요 글로빈 정방향(서열번호: 193), 및 역방향(서열번호: 194).
자기 세포 분류.　 계통-수임 세포의 고갈을 위해, 마우스 계통 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec, Cat. # 130-090-858)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 1차 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 골수로부터의 Ter119+ 세포 또는 2차 C57BL/6 수용자의 조혈 조직으로부터의 CD46+ 세포의 선택을 위해, 인간 항-CD46-PE 1차 항체(Miltenyi Biotec, 카탈로그 130-104-508)로 염색한 후 마우스 항-Ter119 마이크로비드(Miltenyi Biotec, 카탈로그 130-049-901) 또는 항-PE 마이크로비드(Miltenyi Biotec, 카탈로그 130-048-801)를 각각 사용하였다.
동물 연구.　 인간 CD46 게놈 유전자좌(CD46tg)에 대해 동형접합성이고 인간에서와 유사한 수준 및 패턴으로 CD46 발현을 제공하는 C57BL/6-기반 유전자이식 마우스는 이전에 기재되었다(Kemper 등, Clin Exp Immunol. 2001;124(2):180-189). CD46tg 마우스는 Roberto Cattaneo, Mayo Clinic(미국 미네소타주 로체스터 소재)에서 제공받았다. HDAd5/35++ 벡터에 의한 감염에 취약한 지중해빈혈 마우스 모델은 암컷 CD46tg 마우스와 수컷 Hbbth-3 마우스(The Jackson Laboratory)를 교배하고 F1과 CD46tg 마우스를 역교배하여, CD46+/+/Hbbth-3 마우스를 생성함으로써 수득하였다. 6 내지 10 주령의 암컷 CD46tg 및 CD46+/+/Hbbth-3 암컷을 생체내 형질도입/선택 연구에 사용하였다. 6 내지 10 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 2차 수용자로서 사용하였다.
CD46tg 마우스의 동원 및 생체내 형질도입.　 HSPC를 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사(하루에 마우스 당 5　μg, 4 일) 이어서 5 일째에 AMD3100의 s.c. 주사(5　mg/kg)에 의해 마우스에 동원하였다. 또한, 동물은 바이러스 주사 16 시간 및 2 시간 전에 덱사메타손(10　mg/kg)을 i.p.로 투여받았다. AMD3100 후 30 및 60 분에, 동물에게 HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB를 주사 당 4 x 1010　vp의 용량으로 안와하정맥총을 통해 i.v. 주사하였다(총 2 회 주사, 30 분 간격). 4 주 후, 마우스에게 O6-BG(15 mg/kg, i.p.)를 2 회, 30 분 간격으로 주사하였다. O6-BG의 두번째 주사 1 시간 후, 마우스에게 BCNU(5 mg/kg, i.p.)를 주사하였다. BCNU 용량을 두번째 및 세번째 주기에 각각 7.5 및 10 mg/kg으로 증가시켰다.
CD46+/+/ Hbbth-3 마우스의 동원 및 생체내 형질도입.　 이들 연구에서, 이전에 지중해빈혈 마우스 모델에 대해 기재된 바와 같이(Psatha 등, Hum Gene Ther Methods. 25(6):317-327, 2014), G-CSF 250　μg/kg i.p.(1-6 일) 및 플레릭사포르 5　mg/kg i.p.(이전에 AMD3100; Mozobil, Genzyme Corp.)(5-7 일)를 사용한 7-일 동원 접근법을 적용하였다. 생체내 형질도입을 상기와 같이 수행하였다. 처리 후, 조합된 면역억제를 투여하였다. 17 주차에, 마우스를 O6BG(30　mg/kg, i.p.)를 사용한 4 주기의 생체내 선택에 적용하고 BCNU 용량(5, 7.5, 10, 10 mg/kg)을 용량 사이에 2-주 간격으로 증가시켰다. 면역억제는 마지막 O6-BG/BCNU 용량 후 2 주에 재개하였다.
면역억제.　 마이코페놀레이트 모페틸(20 mg/kg/d), 라파마이신(0.2 mg/kg/d), 및 메틸프레드니솔론(20 mg/kg/d)의 1 일 i.p. 주사를 수행하였다.
2차 골수 이식.　 수용자는 Jackson Laboratory의 6-8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스였다. 이식 당일에, 수용자 마우스를 10 Gy로 조사하였다. 생체내-형질도입된 CD46tg 마우스로부터의 골수 세포를 무균상태로 단리하고, 계통-고갈된 세포를 자기 세포 분류(MACS)를 사용하여 단리하였다. 조사 4 시간 후, 세포를 마우스 당 1 x 106 개 세포로 i.v. 주사하였다. CD46+/+/Hbbth-3 마우스 연구에서, 생체내-형질도입된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스로부터의 2Х106 개의 전체 골수 세포를 3 개의 일일 용량 또는 치명적인 TBI(1,000 cGy)로 나눠진 100　mg/kg i.p. 부술판(Busilvex, Pierre Fabre)으로 조건화된 골수하제거된 2차 C57BL/6 수용자에 이식하였다. 20 주차에, 2차 수용자를 희생시키고, 혈액, 골수, 및 비장의 CD46+ 세포를 MACS에 의해 단리하거나, 또는 마우스를 상기 기재된 바와 같이 동원 및 생체내 형질도입에 적용하였다. 모든 2차 수용자는 4 주차에 시작하여 면역억제를 받았다.
조직 분석.　 2.5 μm 두께의 비장 및 간 조직 절편을 적어도 24 시간 동안 4% 포름알데하이드에 고정시키고, 탈수화하고, 파라핀에 포매하였다. H&E 염색을 골수외 혈구형성의 조직학적 평가에 사용하였다. 헤모시데린을 Perl의 프러시안 블루(Prussian blue) 염색에 의해 조직 절편에서 검출하였다. 간단히 말해서, 조직 절편을 증류수 증 동일한 부피(2%)의 페로시안화칼륨 및 염산의 혼합물로 처리한 다음 뉴트럴 레드(neutral red)로 대조염색하였다. 비장 크기를 비장 중량(mg) 대 체중(g)의 비로 평가하였다.
혈액 분석 및 골수 사이토스핀.　 혈액 샘플을 EDTA-코팅된 튜브에 수집하고, HemaVet 950FS(Drew Scientific) 또는 ProCyteDx(IDEXX) 기계에서 분석을 수행하였다. 말초 혈액 도말을 준비하고 각각 5 및 15 분 동안 May-Grunwald/Giemsa(Merck)로 염색하였다. 골수 세포의 현탁액을 사이토스핀 장치를 사용하여 슬라이드에서 원심분리하고 May-Grunwald/Giemsa로 염색하였다.
통계. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 다중 그룹의 비교를 위해, 다중 비교를 위한 본페로니 사후-테스트와 함께 일원 및 이원 ANOVA를 사용하였다. 1 개의 그룹화 변수에 대한 그룹 간 차이를 독립표본 양측 스튜던트 t 검정에 의해 결정하였다. 비모수 분석을 위해, Kruskal-Wallis 검정을 사용하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 버전 6.01(GraphPad Software Inc.)을 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P 값이 유의한 것으로 간주되었다; *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.0002, ***P ≤ 0.00003.
동물 연구 승인.　 모든 실험은 통제 기관 심의 위원회 및 IACUC의 승인에 따라 수행되었다.
결과 . CD46tg 마우스에서 후속 생체내 선택과 함께 생체내 HSPC 형질도입은 대부분의 말초 RBC에서 안정된 γ-글로빈 발현을 초래한다. 치료용 HDAd5/35++ 벡터는 적혈구에서 효율적인 발현을 위한 5-kb "마이크로" β-글로빈 LCR/β-프로모터의 제어 하에 인간 γ-글로빈 유전자 뿐만 아니라 MGMTP140K 발현 카세트를 함유한다(도 2a, HDAd-γ-글로빈/mgmt). CD46tg 마우스는 인간과 유사한 패턴 및 수준에서 HDAd5/35++ 수용체 CD46을 발현하는 인간 CD46 유전자좌에 대해 동형접합성이고 따라서 생체내 HSPC 형질도입 연구를 위한 모델이다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-2217, 2016, Kemper 등, Clin Exp Immunol. 124(2):180-189, 2001). "건강한" CD46tg 마우스에서 이러한 연구의 목표는 마우스 세포 상에서 인간 γ-글로빈의 수준, 동역학, 및 분포 및 접근법의 안전성을 분석하는 것이었다. 동물을 G-CSF/AMD3100으로 동원한 다음 HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 SB100X-발현 HDAd-SB 벡터를 정맥내로 주사하였다. 3 주기의 O6BG/BCNU 처리는 벡터 주사 후 4 주에 시작하였고, 마우스를 벡터 주사 후 18 주까지 추적하였다(도 2b). 먼저, RBC에서 인간 γ-글로빈 발현을 분석하였다(도 2c). 생체내 선택 시작 전(형질도입 후 4 주) 수준은 배경보다 단지 미미하게 높았다. γ-글로빈+ 세포의 백분율은 두번째 차례의 선택 후 증가하기 시작하여 세번째 차례 후 80% 초과의 수준에 도달하였다. γ-글로빈-발현 세포의 백분율은 말초 혈액 및 골수에서 비적혈구 Ter119- 세포에 비해 적혈구 Ter119+ 세포에서 7- 내지 10-배 더 높았다(도 2d). HPLC를 사용하여 성체 마우스 α- 및 β-글로빈 쇄와 비교하여 γ-글로빈 단백질의 수준을 측정하였다(도 2e 및 도 3; https://doi.org/10.1172/JCI122836DS1의 보충 자료). 18 주차에, 이들 수준은 성체 마우스 α-글로빈 및 β-주요 글로빈의 10%-15% 및 마우스 β-소수 글로빈의 25%에 도달하였다. 이를 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)에 의해 mRNA 수준에서 확인하였으며, 여기서 인간 γ-글로빈 mRNA는 마우스 β-주요 mRNA의 13%였다(도 2f). 원시 장기간 재증식 HSC가 형질도입되었는지 추가로 입증하기 위해, 생체내-형질도입된/선택된 마우스로부터의 계통-고갈된(Lin-) 골수 세포를 조사된 C57BL/6 마우스에 이식하였다. 말초 혈액, 골수, 및 비장에서 분석된 생착 수준은 95% 초과였고 20 주의 관찰 기간에 걸쳐 안정되었다(도 4a, 4b). 인간 γ-글로빈 수준(마우스 α-글로빈과 비교)은 ("1차") 생체내-형질도입된 마우스(형질도입 후 18 주차에 분석) 및 이식 후 14 및 20 주차에 분석된 2차 수용자에서 유사하였다(도 4c).
생체내 HSPC 형질도입/선택 접근법은 SB100X-매개 무작위 이식유전자 통합 패턴을 바꾸지 않고 조혈을 변경하지 않는다.　 하이브리드 트랜스포존/SB100X HDAd5/35++ 시스템을 사용한 생체내 형질도입은 HSPC에서 무작위 이식유전자 통합을 초래하였음이 이전에 제시되었다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-2217, 2016). 생체내 선택에서 O6BG/BCNU의 효과를 평가하기 위해, 골수 Lin- 세포에서 이식유전자 통합을 연구 종료 시, 즉, 2차 수용자에서 20 주차에 분석하였다. 선형 증폭-매개 PCR(LAM-PCR) 이어서 심층 서열분석은 마우스 게놈에서 통합 부위의 무작위 분포 패턴을 나타내었다(도 5a). 5 마리 마우스의 풀링된 데이터는 엑손으로 2.23% 통합, 인트론으로 31.58%, 유전자간 영역으로 65.17%, 및 비번역 영역으로 1.04%를 입증하였다(도 5b). 통합의 무작위성 수준은 전체 마우스 게놈의 임의의 주어진 창에서 우선적인 통합 없이 99%였다(도 5c). 이는 생체내 선택 및 2차 수용자에서 세포의 추가 확장이 우세한 통합 부위의 출현을 초래하지 않았음을 나타낸다(도 5d). qPCR을 사용하여 형질도입 및 비-형질도입된 세포를 둘 다 함유하는 집단에서 골수 세포 당 평균 2 개의 γ-글로빈 cDNA 카피를 측정하였다. 그런 다음 통합된 이식유전자 카피 수를 단일-세포 수준에서 정량화하였다. 이를 위해, 18 주차 마우스로부터의 골수 Lin- 세포를 메틸셀룰로스에 플레이팅하고, 개별 전구체 콜로니를 단리하고, 게놈 DNA에 대해 qPCR을 수행하였다. 이식유전자-양성 콜로니에서(n　= 113), 콜로니의 86.7%는 2 또는 3 개의 통합된 카피를 가졌다(도 5e 및 도 6). 4 개의 카피를 콜로니의 6.2%에서, 8 개의 카피를 1.78%에서 발견하였다. 콜로니의 0.88%는 13, 10, 7, 6, 또는 5 개의 통합 벡터 카피를 가졌다.
연구 종료 시(18 주) 혈액 세포 계수의 변경은 밝견되지 않았다(도 7a). RBC 매개변수의 분석은 이상을 나타내지 않았다(도 7a-7c). 골수에서 Lin+ 분획의 조성물은 처리 전 마우스 및 처리 후(18 주) 마우스에서 유사하였다(도 7d). Lin-Sca1+cKit+　(LSK) HSPC(도 7d, 마지막 레인) 및 전구체 콜로니-형성 세포(도 7e)의 수준은 또한 두 그룹에서 비슷하였다.
인간 CD46을 발현하고 인간 중간형 지중해빈혈과 유사한 CD46+/+/Hbbth-3 마우스 모델의 생성.　 HDAd5/35++ 벡터는 감염을 위해 인간 CD46을 필요로 한다. 생체내 HSPC 형질도입 연구를 위한 지중해빈혈 마우스 모델을 개발하기 위해, CD46tg(CD46+/+) 마우스를 마우스 Hbb-β1 및 -β2 유전자 결실에 대해 이형접합성인 Hbbth-3 마우스와 교배하였다(Yang 등, Proc Natl Acad Sci USA. 92(25):11608-11612, 1995). (동형접합성 상태는 자궁내 또는 출생후 초기에 치명적이다.) Hbbth-3 마우스는 인간 중간형 지중해빈혈과 유사한 생존가능한 형태의 지중해빈혈을 나타낸다. F1　하이브리드 마우스를 CD46+/+　마우스와 역교배하여 CD46+/+/Hbbth-3 마우스를 생성하였다(도 8). 이들 마우스는 지중해빈혈 표현형을 나타내었다. 모체 CD46tg 마우스와 비교하여, CD46+/+/Hbbth-3 마우스는 상당히 감소된 RBC 수(7.1 ± 0.1 vs. 8.63 ± 0.29 M/μl); 더 낮은 헤모글로빈(9.7 ± 0.18 vs. 13.9 ± 0.63 g/dl), 적혈구용적률(30.7% ± 0.46% vs. 41.7% ± 1.48%), 평균 미립자 헤모글로빈(13.9 ± 0.14 vs. 16.1 ± 0.23 g/dl), 및 평균 미립자 부피(43.03 ± 0.22 vs. 48.35 ± 0.9 fl)를 가졌고; RBC 분포 폭(42.9% ± 0.29% vs. 25.3% ± 0.79%)이 증가하였으며; 명백한 망상적혈구증가증(42.4% ± 1.43% vs. 11.8% ± 3.7%)을 나타내었다(도 9a). 혈액 도말에서 적혈구 형태는 Hbbth-3 마우스 혈액 도말의 형태와 유사하고 CD46tg 마우스의 정상적혈구 외형과 뚜렷하게 대조적인 혈색소 감소증, 다양한 크기 및 모양(부동변형적혈구증가증), 및 세포 단편화를 특징으로 하였다(도 9b). 마찬가지로, CD46+/+/Hbbth-3 마우스로부터의 간 및 비장의 조직학적 분석은 적혈구 전구체 또는 거핵구의 클러스터를 함유하는 골수외 혈구형성의 병소를 보인 반면(도 9c, 하단 왼쪽 및 하단 중간 패널), Perl의 염색은 모체 CD46tg 마우스로부터의 조직 절편에서 골수외 혈구형성 및 철분 축적이 부재하거나 또는 제한된 것(도 9c, 상단 패널)과 대조적으로 뚜렷한 실질 철분 침착을 입증하였다(도 9c, 하단 오른쪽 패널). CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 이러한 특성은 인간 질환을 요약하고 후속 실험을 위한 이러한 모델의 타당성을 뒷받침한다. 특히, CD46+/+/Hbbth-3 모델에서 지중해빈혈 표현형은 또한 총 WBC의 상승된 수에 의해 나타낸 바와 같이, 적혈구 계통 이외의 계통에서 정량적 차이를 특징으로 하였다(도 10).
HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB를 사용한 HSPC 생체내 형질도입 이어서 CD46+/+/Hbbth-3 마우스에서 생체내 선택은 γ-글로빈의 높고 안정된 장기간 발현을 초래한다.　 생체내 형질도입 접근법이 CD46+/+/Hbbth-3 지중해빈혈 마우스 모델의 특징적인 질환의 매개변수를 개선할 수 있는지를 결정하였다. Hbbth-3 마우스에서 이전에 검증된 변형된 G-CSF/AMD3100 동원 체계(Psatha 등, Hum Gene Ther Methods. 2014;25(6):317-327)는 마지막 플레릭사포르(AMD3100) 주사 1 시간 후(도 11), 즉, HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB가 정맥내로 주사된 시점에 말초 혈액에서 LSK 세포의 높은 수를 산출하였다. 마우스는 인간 γ-글로빈 및 MGMT 단백질에 대한 반응을 피하기 위해 면역억제를 받았다(도 12). 생체외 렌티바이러스 벡터 유전자 요법 후, 유전적으로 교정된 적혈구모세포가 생존 이점이 있고 Hbbth-3 마우스에서 생체내 선택을 겪는다는 보고를 고려하면(Miccio 등, Proc Natl Acad Sci USA 105(30):10547-10552, 2008), 초기에 O6BG/BCNU 처리 없이 연구를 수행하도록 계획하였다. 평균 γ-글로빈+　RBC 백분율은 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 생체내 형질도입 후 8 주차에 31.19% ± 2.7%에 도달하였지만 16 주차에 13.14% ± 0.4%로 감소하였다. 이 시점에, 마우스를 2 개 그룹으로 나누었다. 마우스의 절반을 혈액 및 골수 분석(그룹 1: 생체내 선택 없음) 및 2차 수용자에 대한 공여자로서 사용한 반면, O6BG/BCNU 생체내 선택을 수반하는 다른 그룹(그룹 2: 생체내 선택 있음)으로 연구를 계속하였다(도 12 참조). 16 주차에, 그룹 1은 말초 RBC의 13%에서 γ-글로빈 발현을 나타내었다(도 13a, 13b). 이 수준의 γ-글로빈 마킹은 말초 혈액 망상적혈구의 백분율에서 상당한 감소를 초래하였다(도 13c, 마지막 레인). 그러나, RBC 형태학 및 골수외 혈구형성을 포함하는 다른 RBC 매개변수를 개선하기에 충분하지 않았다(도 13c, 13d). 1차 γ-글로빈 마킹 수준은 이식 전에 부술판으로 골수 조건화된 2차 C57BL/6 수용자에서 20 주에 걸쳐 유지되었다(도 13e, 13f). 이는 장기간-재증식 HSPC가 형질도입되었음을 나타낸다.
그룹 2에서, 4 주기의 생체내 선택은 29 주차에 평균 76%에 도달하는 γ-글로빈+　RBC 백분율에서 6-배 증가를 초래하였다(도 14a). γ-글로빈 발현은 Ter119- 세포와 비교하여 유세포 분석에 의한 게이팅 또는 면역자기적으로 단리된 Ter119+　적혈구 세포에서 γ-글로빈 발현에 의한 분석에 의해 나타낸 바와 같이 적혈구-특이적이었다(도 14b, 도 14c). 다른 연구와 일치하여(Miccio 등, Proc Natl Acad Sci USA. 105(30):10547-10552, 2008, Zhao 등, Blood. 113(23):5747-5756, 2009), 선택은 골수(또는 비장)을 빠져나가고 핵을 손실하기 전에 (핵형성 및 증식 적혈구) 전구체의 수준에서 발생하였다. 이는 생체내 선택 전에 비해 선택 후 우세하게 발생한 골수 및 비장에서 γ-글로빈+Ter119+ 세포의 증가에 반영된다 (도 14d). 그러나, (제핵 RBC가 우세한) 말초 혈액의 Ter119+ 세포에서 γ-글로빈+　마킹의 전반적인 증가(도 14b)는 아마도 지중해빈혈 배경에 의해 제공된 "천연" 생체내 선택의 부가적인 효과에 기인할 것이다. HPLC에 의해 측정된 RBC에서 마우스 α-글로빈에 대한 인간 γ-글로빈의 비는 14 주차에 거의 검출불가능한 수준에서 29 주차에 10%로 증가하였다(도 14e 및 15; 기준선(도 15b), 16 주차(도 15c) 및 29 주차(도 15d, 및 CD46tg 대조군(도 15a)에서 CD46+/+/Hbbth-3 마우스 참조). 유사하게, 처리된 마우스의 혈액 세포에서 γ-글로빈 mRNA의 수준은 증가하여, 29 주차에 마우스 β-글로빈 mRNA의 10% 인간 γ-글로빈 mRNA로 번역하였다(도 14f). 생체내 형질도입 후 29 주차에 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스에서 세포 당 1.5 개의 γ-글로빈 유전자 카피가 측정되었다(도 16).
생체내 형질도입/선택 후 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 지중해빈혈 표현형의 역전.　 마지막 용량의 O6BG/BCNU 처리 6 주 후, CD46+/+/Hbbth-3 마우스를 희생시키고, 분석을 위해 조혈 조직을 수확하였다. 생체내 형질도입 후 29 주차에 혈액학적 매개변수는 기준선에 걸쳐 상당히 개선되었고(도 17a)(RBC: 8.53 ± 0.16 vs. 7.1 ± 0.13 M/μl,　P　= 0.01; 헤모글로빈: 11.27 ± 0.39 vs. 9.7 ± 0.18 g/dl,　P　= 0.05; 적혈구용적률: 41.37% ± 0.81% vs. 30.7% ± 0.46%,　P　= 0.00001; 평균 미립자 부피: 48.63 ± 0.36 vs. 43.5 ± 0.38 fl,　P　= 0.003; RBC 분포 폭: 39.5% ± 0.8% vs. 43% ± 0.3 %,　P　= 0.006; 망상적혈구: 31.13% ± 3.17% vs. 42.4% ± 1.43%,　P　= 0.05), 특이적 적혈구 지수(적혈구용적률 [HCT], RBC, 평균 미립자 부피)에 대해, 수준은 대조군 CD46tg 대응물과 구별하기 어려웠으며, 이는 거의 완전한 표현형 교정을 시사한다. 혈액 도말의 망상적혈구 염색은 γ-글로빈+　RBC의 가장 높은 백분율을 갖는 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스에서 망상적혈구의 인상적인 3-배 감소를 입증하였다(도 17b). 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 말초 혈액 도말에서 지중해빈혈 표현형의 역전을 나타내는 저변색성이고, 고도로 단편화되고 부동변형적혈구증가적인 기준선 RBC를 크기가 덜 변이되고 거의 정색성이고 잘 형상화된 RBC로 대체하였다(도 17c, 상단 패널). 대조군 및 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 사이토스핀에서 전적혈구모세포 및 호염기성 적혈구모세포의 유병률에 의해 나타낸 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 골수에서 적혈구 계통 성숙의 차단과 대조적으로, 성숙 적혈구모세포가 우세하였고 다염성 및 정염성 적혈구모세포에 의해 나타내었다(도 17c, 중간 패널). 극심한 실질 혈철소증이 미처리 CD46+/+/Hbbth-3 마우스에서 관찰된 반면, CD46tg 및 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스에서 제한된 철분 축적만이 검출될 수 있었다(도 17c, 하단 패널). 따라서, 보상 혈구형성의 측정가능한 특징인 비장 크기는 처리된 동물에서 현저하게 감소하였다(도 17d, 17e).
조합된 생체내 형질도입/선택 접근법이 원시 HSC의 유전적 변형을 초래하였는지를 결정하기 위해, 29 주차(형질도입 후)에 수확된 처리된 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 골수 세포를 준치사량의 부술판 처리 또는 치명적 전신 조사(TBI) 후 C57BL/6 2차 수용자에 이식하였다(도 18a, 18b). 예상된 바와 같이, TBI를 받은 마우스에서 생착률은 부술판-처리된 동물에서보다 더 높았지만, 생착 수준으로 조정된 발현 수준은 γ-글로빈+　RBC의 상당히 상이한 빈도를 나타내지 않았다. 이식-유래된 (CD46+) 적혈구의 75% 초과가 2차 이식 후 20 주차에 γ-글로빈+였고 정상 수용자 배경(여기서 HDAd-γ-글로빈/HDAd-SB-형질도입된 CD46+/+/Hbbth-3 HSPC는 선택적 이점이 없음)에서 골수하절제 부술판 조건에 의해 생성된 경쟁 조건 하에 29 주차에 1차 처리된 마우스에서 발견된 것과 유사한 마킹률을 갖는다(도 18c, 18d)는 사실은 접근법이 장기간 재증식 HSC의 유전적 교정을 초래한다는 결론을 추가로 뒷받침한다. 더욱이, 동원 및 생체내 형질도입에 제출된 이식 후 20 주차에 2차, 부술판-조건화된 C57BL/6 수용자는 γ-글로빈-발현 세포의 현저한 강화 및 발현/MFI에서 상당한 증가를 입증하였다(도 18e).
HDAd-γ-글로빈/mgmt 및 HDAd-SB를 사용한 생체내 HSPC 형질도입 이어서 O6-BG/BCNU 생체내 선택의 안정성.　 마우스 연구에서, 절차는 잘 용인되었다. 명백한 혈액학적 이상은 관찰되지 않앗다. 희생 시, 마지막 O6-GB/BCNU 용량 후 6 주에, 모든 혈액학적 값은 정상 범위 내에 있었지만, 총 WBC 계수는 생체내 선택 전 수준과 비교하여 더 낮았으며, 이는 WBC, 특히 림프구에 대한 약물 치료의 세포감소 효과를 시사한다(도 19a, 19b). 이 효과는 또한 미처리 또는 선택전 대응물과 비교하여 골수에서 CD3+, CD19+, 및 Gr-1+ 세포의 감소된 빈도를 반영하였다(도 19c). 특히, 최하점(25-27 주; 마지막 O6BG/BCNU 주사 후 2-4 주)에서 조차도, WBC 및 혈소판은 결코 무형성증 수준(즉, 호중구 1,000/μl 미만, 혈소판 20,000/μl 미만)에 도달하지 않았고, WBC는 30 주까지(마지막 O6BG/BCNU 주사 후 7 주) 회복되기 시작하였다. 이는 CD46tg 모델에서, WBC 및 림프구 계수가 마지막 O6BG/BCNU 주사 후 10 주에 전처리 수준으로 되돌아갔다는 관찰과 함께(도 7a), 생체내 선택 약물의 세포감소 효과가 경미하고 일시적임을 시시한다. 중요하게는, LSK 및 Ter119+ 세포의 백분율에서 골수 세포 조성, 뿐만 아니라 골수 세포의 콜로니-형성 가능성은 HSPC의 생체내 형질도입/선택에 의해 영향을 받지 않았다(도 19c, 19d).
논의 . 혈색소병증의 생체외 HSPC 유전자 요법에서 명백한 임상 진행에도 불구하고, 임상적으로 관련된 HSPC 생착률에 도달하기 위한 골수절제 조건화에 대한 필요성은 주요 한계이다. 또한, 기술적 복잡성은 소수의 전문화 및/또는 공인된 센터에서만 이러한 치료의 이행을 허용한다. 개발된 생체내 HSPC 유전자 요법 접근법은 골수절제술 및 HSPC 세포 이식을 필요로 하지 않고 따라서 지중해빈혈에 대한 HSPC 유전자 요법을 더 안전하고 더 접근가능하게 만든다. 접근법의 핵심 아이디어는 골수로부터 HSPC를 동원하는 것이고, 주변부에서 많은 수로 순환하는 동안, 정맥내로 주사된 HSPC-향성 HDAd5/35++ 유전자 전달 벡터 시스템으로 형질도입한다. HDAd5/35++ 벡터 시스템의 신규 특징은 (a) 정맥내 주사 후 비조혈조직의 감염을 피하면서 원시 HSC의 효율적인 형질도입을 허용하는 CD46-친화도-향상된 섬유, (b) 세포 인자와 무관하게 기능하고 유전자에 대한 선호도 없이 무작위 이식유전자 통합을 매개하는 SB100X 트랜스포사제-기반 통합 시스템, 및 (c) 저용량 O6BG/BCNU의 단기간 처리에 의해 형질도입된 원시 HSC의 풀에 영향을 미치지 않고 자손 세포의 선택적 생존 및 확장을 매개하는 MGMTP140K 발현 카세트를 포함한다(Wang 등, Mol Ther Methods. Clin Dev. 8:52-64, 2018). 현재 사용되는 SIN-렌티바이러스(SIN-LV) 벡터로부터 HDAd5/35++ 벡터를 구별하는 추가적인 특징은 이 연구에서 마이크로-LCR/β-프로모터-구동된 γ-글로빈 유전자 및 11.8 kb 크기의 EF1A 프로모터-구동된　MGMT P140K 유전자를 혼입하는 데 사용된 큰(30 kb) 삽입 용량을 포함한다. 또한, HDAd5/35++ 벡터의 생산은 대규모 플라스미드 형질감염을 필요로 하지 않고 스피너 배양 리터 당 3 x 1012　개 초과의 감염성 입자를 산출한다. 특히, 혈색소병증에 대한 임상 연구에 사용되는 SIN-LV 벡터의 수율은 적어도 2 자릿수 이하이다.
생체내 접근법의 효능.　 HSPC의 1% 미만의 안정된 형질도입이 상당한 임상적 이익을 제공하는 다른 유전적 질환의 HSPC 유전자 요법과 대조적으로(즉, X-관련 SCID, Cavazzana-Calvo 등, Science. 288(5466):669-672, 2000; ADA-SCID, Gaspar 등, Sci Transl Med. 3(97):97ra80. 2011; 또는 비스코트-알드리치 증후군, Aiuti 등, Science. 341(6148):1233151, 2013), 환자에서 혈색소병증의 표현형 교정은 적어도 20% 교정된 적혈구 전구체를 필요로 한다(Persons 등, Blood. 97(10):3275-3282, 2001, Andreani 등, Blood.; 87(8):3494-3499, 1996, Negre 등, Blood. 117(20):5321-5331, 2011). 혈색소병증에 대한 뮤린 모델에서, 총 α-글로빈 mRNA의 15%에서 γ-글로빈 발현이 요법에 충분하였다(Persons 등, Blood. 2001;97(10):3275-3282, McColl 등, Blood Med. 7:263-274, 2016, Pestina 등, Mol Ther. 17(2):245-252, 2009). 이 연구에서, 생체내 형질도입/선택 후, 골수 적혈구모세포의 60% 초과가 생체내 형질도입된 CD46tg 및 CD46+/+/Hbbth-3 모델에서 γ-글로빈을 발현하였다(도 2c 및 14a). 이는 40%-97% 순환 γ-글로빈-발현 RBC로 번역되었다(도 2d 및 14b). 중요하게도 또한, 두 동물 모델에서, RBC에서 지속된 γ-글로빈 마킹이 2차 수용자에서 입증되었으며, 이는 원시, 장기간 재증식 HSC가 벡터 시스템에 의해 초기에 형질도입되었음을 시사한다.
qPCR 연구는 압도적인 대부분의 골수 세포에서 세포 당 2 내지 3 개의 통합된 이식유전자 카피를 검출하였다. 이전 연구와 일치하여(Zhao 등, Blood. 113(23):5747-5756, 2009, Zielske 등, Mol Ther. 9(6):923-931, 2004), 생체내 선택이 높은 카피 수 클론에 대해 선택되었다는 것은 밝혀지지 않았다. 게놈-와이드 통합 부위 분석을 고려하여, 1,000 개의 원래 형질도입된 HSC를 예상하였다. 마우스가 10,000 내지 20,000 개의 HSC를 갖는다는 것을 고려하면(Abkowitz 등, Blood. 100(7):2665-2667, 2002; Chen 등, Blood. 107(9):3764-3771, 2006), 벡터 시스템이 HSC의 5%-10%를 표적화하였음을 의미할 것이며, 이는 생체내 선택 후 조혈의 다클론 재구축 및 장기간 치료 효과를 위한 견고한 기초가 될 것이다.
중간형 지중해빈혈 모델에서, 거의 완전한 표현형 교정이 달성되었다. 핵심 혈액학적 매개변수(HCT, RBC, 평균 미립자 부피)는 "건강한"(모체 CD46tg) 마우스의 대응물과 구별할 수 없었다. RBC 지수의 교정 정도 및 형태는 개별 마우스에서 γ-글로빈-발현 세포의 수준과 상관관계가 있었다. 말초 RBC 및 적혈구 골수 전구체 세포는 형태학 및 성숙 과정 둘 다에서 건강한 마우스와 유사하였다. 골수외 조혈 및 실질 철분 침착은 퇴화되었고, 비장 크기는 상당히 감소하였다. CD46+/+/Hbbth-3 모델에서 지중해빈혈 표현형은 또한 백혈구증가증/림프구증가증을 특징으로 하였다(도 10). (백혈구증가증/림프구증가증은 또한 종종 비장 절제된 지중해빈혈/겸상적혈구병 환자 또는 기능적 질환 연관 무비증 환자에 존재한다; Brousse 등, Br J Haematol. 166(2):165-176, 2014). 흥미롭게도, CD46++/Hbbth-3 마우스의 WBC 계수는 생체내 형질도입 후 29 주차에 "건강한" CD46tg 마우스의 수준으로 되돌아갔다(도 19a). 이 효과는 접근법에 의한 지중해빈혈 표현형의 역전이 적혈구 구획을 넘어 확장되어, WBC의 정상화, 및 대부분의 경우 전반적인 비장 기능을 초래함을 시사한다.
특히, CD46tg 마우스에서의 연구와 대조적으로, 지중해빈혈 배경의 맥락 및 O6BG/BCNU 처리의 부재 하에, γ-글로빈+　RBC의 13%는 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 말초 혈액에서 순환하였고, 이 수준은 2차 수용자에서 장기간 유지하였다. 이는 γ-글로빈 유전자 발현이 주요 지중해빈혈의 마우스 모델에서 생체외 렌티벡터 HSPC 유전자 요법으로 보고된 것과 유사한 지중해빈혈식 유전적으로 변형된 적혈구 전구체에 생존 이점을 부여하였음을 나타낸다(Micco 등, Proc Natl Acad Sci USA. 105(30):10547-10552, 2008). 그러나, 지중해빈혈 마우스 모델에서 표현형 교정은 O6BG/BCNU 처리를 필요로 하였다. 이는 낮은 글로빈 마킹으로 인해 필요한 경우, 유도성 생체내 선택 시스템이 쉬운 약리학적 개입에 의한 치료 효능의 구제를 허용함을 시사한다.
뮤린 지중해빈혈 모델에서 추가로 γ-글로빈의 수준을 증가시키기 위해, 하기 가능성이 고려될 수 있다: (a) HDAd-SB 대 HDAd-γ-글로빈/mgmt 벡터의 비를 세포 당 통합된 이식유전자 카피의 수를 증가시키기 위해 1:1에서 1:3으로 바꿀 수 있다(Zhang 등, PLoS One. 8(10):e75344, 2013). (b) 또한 이식유전자 통합 위치 효과를 최소화하기 위해 β-글로빈 LCR의 26.1-kb 버전을 사용하여 γ-글로빈 발현을 구동하도록 계획하였다(Wang 등, J Virol. 79(17):10999-11013, 2005). (c) SB100X-기반 γ-글로빈 유전자 추가 시스템 이외에도, HDAd5/35++ 벡터는 γ-글로빈 억제인자 영역을 파괴하고 내인성 γ-글로빈 유전자를 재활성화기 위해 CRISPR/Cas9를 수용할 수 있다(Li 등, Blood. 131(26):2915-2928, 2018).
동원 및 발현으로부터 시간의 관계를 평가하기 위해, HDAd-mgmt/GFP 벡터 + HDAd-SB 벡터를 G-CSF 및 AMD3100으로 동원 후 hCD46tg 마우스에 투여하였다. 혈청 항-HDAd 항체를 도 20a 및 20e에 제시된 바와 같이 측정하였다. GFP를 4 일 또는 4 주 및 동원 후 4 일에 측정하였다(도 20b("B") 및 20c("C")). 동원 및 HDAd 주사의 두번째 차례(첫번째 차례 후 4 주; 도 20d). 결과는 도 20f에 제시된다. 동원의 두번째 차례(도 20d; "D")는 바이러스에 대한 중화 혈청 항체의 발달로 인해 말초 혈액 세포의 형질도입을 초래하지 않았다. 그러나, 2차 이식 수용자에서 생체내 형질도입 연구에서 나타낸 바와 같이(도 18e), 항-HDAd 항체의 발달이 약제학적으로 차단될 수 있는 경우, 두번째 처리는 γ-글로빈+　RBC 및 γ-글로빈 발현 수준/MFI의 백분율을 둘 다 증가시킬 수 있다.
생체내 HSPC 형질도입/선택 접근법의 안전성.　 이 접근법은 골수절제술/조건화 및 연관된 독성에 대한 필요성을 폐지하는 반면, 간단한 정맥내 및 피하 물질/벡터 주사에 의해 조건화되지 않은 숙주에서 HSPC를 효과적으로 표적화한다. 중요하게는, 절차는 이 연구에 수반되는 모든 동물에서 잘 용인되었다.
G-CSF/AMD3100(플레릭사포르)에 기반한 HSPC 동원과 관련하여, 접근법은 안전하고 효과적인 것으로 임상적으로 입증되었고 주요 지중해빈혈에 대한 모든 진행중인 실험에서 백혈구분리반출술에 의한 HSPC 동원 및 수집에 정기적으로 사용된다(Psatha 등, Curr Gene Ther. 17(5):364-378, 2017, Karponi 등, Blood. 126(5):616-619, 2015). 이 연구에 사용되는 동원 레지멘에 대한 대안으로서, 다른 접근법은 HSPC의 보다 효율적인 동원을 달성하기 위해 작은 합성 분자에 의한 CXCR4의 연속 차단을 수반할 수 있다(Karpova 등, Blood. 129(21):2939-2949, 2017).
HDAd5/35++ 벡터의 정맥내 주사는 주사 후 3 일차에 CD46tg 마우스에서 동원된 HSPC 및 PBMC 이외의 조직에서 이식유전자 발현을 초래하지 않는다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-2217, 2016). 이는 1세대 CD46-표적화 Ad5/35 및 Ad5/11 벡터가 정맥내로 주사된 개코원숭이에서 초기 연구와 일치하였다(Ni 등, Blood. 128(18):2206-2217, 2016). 이 향성에 대한 잠재적인 설명은 CD46 수용체 밀도 및 접근가능성이 비조혈 조직에서 충분히 높지 않아 효율적인 바이러스 형질도입을 허용하지 않는다는 점이다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-2217, 2016; Ong 등, Exp Hematol. 34(6):713-720, 2006). 여기서, 세포 당 통합된 이식유전자 카피 수는 트랜스포존 벡터를 사용하여 생체내 형질도입/선택 후 18 주차에 상이한 조직에서 측정되었다(도 21a). 카피 수에 대한 효율은 도 21b 및 21c에 제시된다. 다양한 조직에서 세포 당 통합된 트랜스포존 카피가 제시된다(도 21d). 골수, PBMC, 및 비장에서 카피 수는 2.5였다. 통합된 이식유전자를 또한 간, 폐, 및 장의 게놈 DNA에서 검출하였다. GFP 벡터 시스템을 사용한 이전 연구는 이들 기관에서의 신호가 침윤 혈액 세포 및/또는 거주 대식세포로부터 기원함을 나타내었다(Richter 등, Blood. 2016;128(18):2206-2217).
HDAd 벡터(뿐만 아니라 다른 바이러스 벡터)의 정맥내 주사는 전염증성 사이토카인의 방출과 연관되지만(Atasheva 등, Curr Opin Virol. 21:109-113, 2016,　Grieg 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 3:16079, 2016), 바이러스 주사(Seregin 등, Mol Ther. 17(4):685-696, 2009) 또는 벡터 용량 분획화(Illingworth 등, Mol Ther Oncolytics. 5:62-74, 2017) 전 날에 글루코코르티코이드를 사용한 전처리에 의해 효율적으로 차단될 수 있다. 정맥내로 주사된 종양용해성 아데노바이러스의 우수한 안전성 프로파일은 CD46-표적화 종양용해성 아데노바이러스를 사용한 시험을 포함하여 수십 개의 임상 시험에서 문서화되었다(Garcia-Carbonero 등, J Immunother Cancer. 5(1):71, 2017).
생체내 선택의 안전성 및 O6BG/BCNU-자극된 증식이 장기간 정지된 HSPC의 저장소를 고갈시킬 수 있다는 우려와 관련하여, 대형-동물 모델을 사용한 연구는 HSPC 소진 또는 우성 클론의 출현 없이 장기간 다중계통 선택에 대한 증거를 제공하였다(Beard 등, J Clin Invest. 120(7):2345-2354, 2010,　Neff 등, J Clin Invest. 112(10):1581-1588, 2003). 이러한 모델에서, 조혈 및 골수외 독성 프로파일은 허용가능하였다. 본 연구 및 이전 마우스 연구에서(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 8:52-64, 2018, Li 등, Blood. 131(26):2915-2928, 2018), 생체내 선택은 골수억제 없이 잘 용인되었다. O6BG/BCNU 처리 시 골수 HSPC의 빈도에서 변화는 관찰되지 않았다. WBC, 구체적으로 림프구 계수에서 경미한 감소는 일시적이었다. 생체내 선택된 HSPC의 생존을 초래하는 DNA 복구 과정의 억제제인 O6BG, 및 알킬화제인 BCNU를 사용한 저용량 처리의 3 내지 4 주기는 이론적으로 돌연변이 및 종양형성을 촉발할 수 있다. 이 위험에 대한 논쟁은 이러한 치료를 받았지만 발암 징후를 시사하지 않은 원숭이 및 개의 장기간 추적 연구이다(Beard 등, J Clin Invest. 120(7):2345-2354, 2010, Radke 등, Sci Transl Med. 9(414):eaan1145, 2017, Beard 등, Blood. 113(21):5094-5103, 2009). HSPC에서 이 위험을 평가하려는 시도에서, 시험관내 연구를 MGMTP140K-발현 HDAd 벡터로 형질도입된 CD34+ 세포를 사용하여 수행하고 MGMTP140K 발현에 의해 보호되지 않는 세포의 98%가 사멸된 용량으로 O6BG/BCNU 처리에 적용하였다(도 22a-22c). 약물 노출 후 14 일차에, 미처리 CD34+ 세포 및 처리 생존된 세포의 Illumina 전체 엑솜 서열분석을 분석하였으며, 결과는 하기 표에 제시되어 있다. 약물 처리 생존된 CD34+ 세포 vs 미처리 CD34+ 세포의 전체 엑솜 서열분석. 샘플 서열을 호모 사피엔스 참조 게놈(UCSC hg19)과 비교하였다.
샘플 #1: 미처리 CD34 + 세포
Figure pct00017
샘플 #2: 선택된 CD34 + 세포
Figure pct00018
아미노산 치환이 단백질 기능에 영향을 미치는지를 예측하는 필터로서 Tolerant의 Sorting Intolerant(SIFT; uswest.ensemble.org에서 온라인 이용가능)를 사용하여, 처리된 샘플에서 47,858,908 개의 서열분석된 염기 쌍 당 126 개의 새로운 돌연변이(염기 쌍 당 2.63　x 10-6 개의 돌연변이)를 식별하였다. 필터로서 ClinVar을 사용하여, 잠재적인 병리학적 효과가 있는 6 개의 돌연변이가 발견되었다. 표 11은 염색체 고유 돌연변이가 발견된 것을 요약한다:
표 13
Figure pct00019
O6BG/BCNU 처리가 돌연변이를 유발한다는 발견은 예상되지 못했지만; 엑솜 서열분석 데이터 결과는 불분명하다. 기능 상실 돌연변이체는 인간 집단에서 흔하다. Exome Aggregation Consortium에 의한 최근 분석은 기능 상실 돌연변이가 있는 3,230 개의 유전자를 식별하였으며, 이들 변이체 중 72%는 현재 확립된 인간 질환 표현형이 없다(Lek 등, Nature. 536(7616):285-291, 2016).
SB100X 트랜스포사제 및 Flpe 재조합효소 유전자를 보유하는 HDAd-SB 벡터는 통합되지 않고 세포 분열 동안 손실된다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 9:142-152, 2018). 이전에 공개된 데이터와 일치하여(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 9:142-152, 2018), 통합 또는 에피솜 HDAd-SB 벡터는 골수 Lin-세포에서 연구 종료 시 qPCR에 의해 검출가능하지 않았다. SB100X 트랜스포사제는 유전자 내로 또는 근처에 통합에 대한 선호도 없이 무작위 이식유전자 통합을 매개한다(Richter 등,　Blood. 128(18):2206-2217, 2016, Zhang 등, PLoS One. 8(10):e75344, 2013). 이 무작위 패턴은 우세한 통합 부위/클론의 출현 없이 생체내 선택 후 유지된다. 이론적으로, 무작위 통합은 활성 유전자 내로 우선적 통합 보다 상대적으로 더 안전하며, 이는 렌티바이러스 또는 AAV 벡터 형질도입 동안 발생한다(Deyle 등, Curr Opin Mol Ther. 11(4):442-447, 2009, Bartholomae 등, Mol Ther. 19(4):703-710, 2011, Schroder 등, Cell. 110(4):521-529, 2002). 특히, β-지중해빈혈에 대한 SIN-LV-기반 임상 시험에서, HMGA2　원종양형성 유전자의 인트론 내로 통합은 1 명의 환자에서 양성 클론 우성을 촉발하였다(Cavazzana-Calvo 등, Nature. 467(7313):318-322, 2010).
SB100X-매개 무작위 이식유전자 통합 및 돌연변이성 선택 약물을 사용한 치료의 조합 효과로부터 잠재적인 종양 형성의 위험을 감소시키기 위해, 벡터 시스템을 제1 위험 인자를 제거하도록 설계하였다. 이는 염색체 안전 항구 부위 내로 표적화된 γ-글로빈 통합을 매개하고 마우스에서 RBC의 70% 초과에서 안정된 γ-글로빈 마킹을 초래하였다(Li 등, 21st Annual American Society of Gene and Cell Therapy Meeting. Abstract 972).
이 접근법의 안전성은 비인간 영장류의 장기간 연구에서 처음으로 명확하게 입증될 수 있다. 이 맥락에서 원숭이 및 개코원숭이 골수 CD34+ 세포는 인간 CD34+ 세포만큼 Ad5/35 벡터에 의해 효율적으로 형질도입됨에 주목할만하고(Tuve 등, J Virol. 80(24):12109-12120, 2006), 원숭이에서 GFP를 발현하는 통합 HDAd5/35++ 벡터에 의해 동원된 CD34+ 세포의 직접 생체내 도입을 입증하였다(Harworth 등, 21st Annual American Society of Gene and Cell Therapy Meeting. Abstract 995).
접근법의 임상 번역에 대하여.　 HDAd5/35++ 벡터의 생산은 일상적으로 스피너 배양물 리터 당 5 x 1012 개의 바이러스 입자(vp)를 산출한다. Flexion의 FX201 벡터에 대한 cGMP-등급 HDAd 생산이 확립된다. 정맥내로 주사된 바이러스에 대한 선천적 면역 반응의 약리학적 제어를 위한 프로토콜은 마우스보다 인간에 대해 더 개발되었고 현재 정맥내로 주사된 고용량 rAAV 벡터를 사용한 임상 시험에서 실행되고 있다. 그러나, 대부분의 인간은 Ad5 캡시드 단백질에 대해 지시된 중화 혈청 항체를 가지며, HDAd5/35 벡터, 즉, Ad5 캡시드 단백질 및 키메라 Ad35 섬유를 함유하는 벡터로 생체내 형질도입을 차단할 것이다. 본 개시내용에 기재된 대안은 Ad35로부터 유래된 벡터를 포함한다. Ad35는 혈청 유병률이 7% 미만이고 Ad5와의 교차 반응성이 없는 57 개의 알려진 인간 혈청형 중 가장 희귀한 것 중 하나이다(Vogels 등, J Virol. 77(15):8263-8271, 2003, Abbink 등, J Virol. 81(9):4654-4663, 2007, Kostense 등, AIDS. 18(8):1213-1216, 2004, Flomenberg 등, J Infect Dis. 155(6):1127-1134, 1987, Barouch 등, Vaccine. 29(32):5203-5209, 2011). Ad35는 Ad5보다 면역원성이 적으며(Johnson 등, J Immunol. 188(12):6109-6118, 2012), 이는 부분적으로 Ad35 섬유 놉에 의한 T 세포 활성화의 감쇠에 기인한다(Adams 등, J Gen Virol. 93(pt 6):1339-1344, 2012. Adams 등, Proc Natl Acad Sci USA 108(18):7499-7504, 2011, Shoji 등, PLoS One. 7(1):e30302, 2012). 정맥내 주사 후, 인간 CD46-유전자이식 마우스(Sakurai 등, Gene Ther. 13(14):1118-1126, 2006, Sakurai 등, Mol Ther. 16(4):726-733, 2008) 및 비인간 영장류(Sakurai 등, Mol Ther. 16(4):726-733, 2008)에서 간을 포함하는 조직의 최소 형질도입만이 있다(PCR에 의해서만 검출가능). 1세대 Ad35 벡터는 백신접종 목적을 위해 임상적으로 사용되었다(Baden 등, Ann Intern Med. 164(5):313-322, 2016,　Kazmin 등, Proc Natl Acad Sci USA 114(9):2425-2430, 2017). 인간에서 향후 연구를 위해, 벡터는 생체내 HSPC 유전자 요법을 위해 HDAd35++에 기반하여 생성될 것이다.
요약하면, 이는 지중해빈혈에 대한 전통적인 렌티바이러스 벡터 생체외 유전자 요법에 대한 대안을 제공하며, 이는 요법을 단순화하고, 주요 지중해빈혈이 풍토성이고 HSPC 이식이 실행가능하지 않는 자원 부족 지역에 접근가능하게 만들 수 있다.
실시예 2. 29　kb β-글로빈 유전자좌 제어 영역을 사용한 뮤린 지중해빈혈의 생체내 조혈 줄기 세포 유전자 요법
실시예 1은 생체내 변형된 HSPC에서 γ-글로빈 유전자 발현을 구동하는 능력의 상당한 진전을 기재한다. 또한 γ-글로빈 발현 수준을 추가로 증가시키기 위해, β-글로빈 LCR의 더 긴 버전(예를 들어, 26.1 kb)을 사용하여 γ-글로빈 발현을 구동시킬 수 있음을 언급한다. 이 실시예는 추적 분석 결과를 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 조혈 줄기/전구체 세포(HSPC) 동원 이어서 통합 헬퍼-의존성 아데노바이러스 HDAd5/35++ 벡터의 정맥내 주사는 형질도입된 HSPC의 생체내 선택 후 마우스 모델에서 장기간 재증식 세포의 효율적인 형질도입 및 질환 개선을 초래하였다. HDAd5/35++ 주사와 연관된 급성 선천적 독성은 이 접근법을 임상 번역을 위해 실현가능하게 만드는 적절한 예방에 의해 제어된다. 이는 기술적으로 중요 지중해빈혈 또는 겸상적혈구병의 유전자 요법에 대한 간단한 생체내 HSPC 형질도입 접근법으로 사용될 수 있다. 이러한 질환의 치유는 높은 발현 수준의 치료 단백질(γ- 또는 β-글로빈)을 필요로 하며, 이는 더 큰 조절 요소를 수용하는 것을 허용하지 않는 게놈 크기 제한으로 인해 렌티바이러스 벡터로 달성하기 어렵다. 이 실시예는 HDAd5/35++ 벡터의 35　kb 삽입 용량을 활용하여 총 길이가 29　kb인 β-글로빈 유전자좌의 전사 조절 영역이 HSPC 내로 효율적으로 전달될 수 있음을 입증한다. 생체내 HSPC 형질도입은 적혈구 세포에서 안정된 γ-글로빈 수준을 초래하여 뮤린 중간형 지중해빈혈의 완전한 치유를 부여하였다. 특히, 이는 최소 생체내 HSPC 선택 레지멘으로 달성되었다. 이 연구는 큰 조절 영역을 혼입하는 HDAd5/35++ 벡터가 높은 수준의 이식유전자 발현을 필요로 하는 질환의 유전자 요법에서 과제를 해결할 수 있음을 입증한다.
도입 . 주요 지중해빈혈 및 겸상 세포 빈혈과 같은 혈색소병증의 유전자 요법이 성공하기 위해, 전달된 유전자는 바람직하게는 통합 및 전사 침묵의 위치 효과 없이, 적혈구 세포에서 높은 수준으로 발현된다. β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR)은 이러한 용도에 유익한 것으로 생각된다. 유전자 요법 적용의 경우, HS1 내지 HS5를 함유하는 β-글로빈 LCR은 유전자이식 마우스에서 시스-연결된 유전자에 대해 높은 수준의 발현을 부여하는 것으로 제시되었다(Grosveld 등, Cell 51: 975-985, 1987). 그러나, 이 버전의 LCR은 렌티바이러스 벡터에서 사용하기에 너무 크고(삽입 용량 8 kb), 따라서 절두된 "미니" 또는 "마이크로" LCR 버전이 개발되었다. 예를 들어, 지중해빈혈 환자에서 진행중인 임상 시험에서 2.7 kb 미니-LCR(HS2-HS4 포함) 및 266 bp β-글로빈 프로모터을 함유하는 렌티바이러스가 사용되고 있다(Negre 등, Curr Gene Ther 15:64-81, 2015). 실시예 1에서, CD46 유전자이식 마우스 또는 CD46/Hbbth3 지중해빈혈 마우스에서 γ-글로빈의 발현을 위한 HS1 내지 HS4 및 β-글로빈 프로모터를 함유하는 5.9 kb β-글로빈 LCR 버전이 이용되었다(Wang 등, J Clin Invest 129:598-615, 2019). 생체내 HSPC 형질도입/선택 접근법을 사용하여, 말초 혈액 적혈구의 거의 100%에서 γ-글로빈 마킹이 달성된 반면, γ-글로빈의 발현 수준은 세포 당 2-3 개 카피의 평균 통합 벡터 카피 수(VCN)를 갖는 성체 마우스 α-글로빈 수준의 10-15%였다.
β0/β0 지중해빈혈 또는 겸상 세포 빈혈의 완전한 치유를 위해, 일반적으로 적혈구 세포에서 20%의 치료 글로빈(γ- 또는 β-글로빈) 발현 수준이 필요하다고 생각된다(Fitzhugh 등, Blood 130:1946-1948, 2017). 이 수준에 도달하는 한 가지 방식은 HSPC 형질도입을 개선하거나 또는 벡터 용량을 증가시킴으로써 VCN을 증가시키는 것이다. 그러나, 이러한 접근법은 역사적으로 적어도 부분적으로 활용된 벡터 시스템의 무작위 통합 패턴으로 인해, 독성 위험을 증가시키는 다른 맥락에서 관찰되었다. 이 실시예에서, 더 강한 전사 요소, 즉 더 긴 LCR 버전은 CD46-유전자이식 마우스의 생체내 HSPC 형질도입 후 RBC에서 γ-글로빈 발현을 증가시키기 위해 활용되었다.
백혈구분리반출술, 골수절제술, 및 HSPC 이식을 필요로 하지 않는 신규 생체내 HSPC 형질도입 접근법이 제공된다(Richter 등, Blood, 128:2206-2217, 2016). 접근법은 생체내 HSPC 형질도입에 적합한 새로운 백터 플랫폼, 즉 헬퍼-의존적, 캡시드-변형된 아데노바이러스 벡터(HDAd5/35++)를 수반한다. 이러한 벡터의 특징은 i.v. 주사 후 비-조혈 조직의 감염을 피하면서 원시 HSC의 효율적인 형질도입을 허용하는 CD46-친화도 향상된 섬유 및 최대 30　kb의 삽입 용량을 포함한다. 제한된 접근가능성으로 인해, 골수에 위치한 HSPC는 벡터가 골수 세포 상에 존재하는 수용체를 표적화하는 경우에도, HDAd5/35++ 벡터를 포함하는 정맥내로 주사된 벡터에 의해 형질도입되지 않을 수 있다(Ni 등, Hum Gene Ther, 16: 664-677, 2005 및 Ni 등, Cancer Gene Ther, 13:1072-1081, 2006). 과립구-콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 CXCR4 길항제 AMD3100(MOZOBILTM, PLERIXATM)의 조합은 동물 모델 및 인간에서 원시 전구체 세포를 효율적으로 동원하는 것으로 제시되었다(Fruehauf 등, Cytotherapy, 11: 992-1001, 2009 및 Yannaki 등, Hum Gene Ther, 24: 852-860, 2013). G-CSF/AMD3100을 사용하여 골수에서 말초 혈류로 HSPC를 동원한 후 HDAd5/35++ 벡터를 정맥내 주사하였다. 이는 이전에 인간 CD46 유전자이식 마우스(Richter 등, Blood, 128: 2206-2217, 2016; Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 9: 390-401, 2018; Li 등, Blood, 131: 2915-2928. 2018; Wang 등, J Clin Invest, 129: 598-615. 2019; Wang 등, Blood Adv, 3: 2883-2894, 2019; 및 Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 8: 52-64, 2018), 인간화 마우스(Richter 등, Blood, 128: 2206-2217, 2016) 및 레서스 원숭이(Harworth 등, ASCGT 21th Annual meeting, 2018, DOI: 10.1016/j.ymthe.2018.05.001)에서 제시되었다. 주변부에서 되돌아가 형질도입된 HSPC는 장기간 지속되는 골수로 되돌아간다. 증식 이점 없이, 생체내 형질도입된 HSPC는 골수를 효율적으로 빠져나가지 않고 하류 분화에 기여한다. O6BG/BCNU를 사용한 동물의 단기간 처리는 mgmt P140K 유전자-변형된 HSPC에 대한 증식 자극을 제공하고 이후에 말초 혈액 세포의 80% 초과에서 안정된 이식유전자 발현을 제공한다(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 8: 52-64, 2018).
HD-Ad5/35++ 게놈은 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않고 세포 분열 시 손실된다. 유전자 요법 목적 및 장기간 생체내 형질도입된 HSPC를 추적하기 위해, HD-Ad5/35++ 벡터를 이식유전자 통합을 허용하도록 변형시켰다. 이는 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제 시스템(SB100)을 통합함으로써 수행되었다(Zhang 등, PLoS One, 8: e75344, 2013; Hausl 등, Mol Ther, 18: 1896-1906, 2010; 및 Yant 등, Nat Biotechnol, 20: 999-1005, 2002). 제2 벡터로부터 트랜스로 공동 발현된 트랜스포사제는 이식유전자 카세트에 플랭킹하는 특이적 DNA 서열(도립 반복부; "IR")을 인식하고 염색체 DNA의 TA 디뉴클레오티드 내로의 통합을 촉발한다. 레트로바이러스 통합과 달리, SB100x-매개 통합은 표적화된 유전자의 전사 상태에 의존하지 않는다(Yant 등, Mol Cell Biol, 25: 2085-2094, 2005). 여러 연구는 SB100x-매개 이식유전자 통합이 무작위적이고 원종양형성 유전자의 활성화와 연관되지 않음을 입증하였다(Richter 등, Blood, 128: 2206-2217, 2016; Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 8: 52-64, 2018; Zhang 등, PLoS One, 8: e75344, 2013; Hausl 등, Mol Ther, 18: 1896-1906, 2010; 및 Yant 등, Nat Biotechnol, 20: 999-1005, 2002). SB100x-기반 통합 시스템의 이점은 세포의 효율적인 상동 DNA 복구 기구에 의존하지 않는다는 점이다. 후자는 DNA 복구 및 재조합효소의 낮은 활성을 나타내는 HSPC에서 중요하다(Beerman 등, Cell Stem Cell, 15: 37-50, 2014). CD46-유전자이식 마우스(Richter 등, Blood, 128: 2206-2217, 2016; Wang 등, J Clin Invest, 129: 598-615. 2019; Li 등, Mol Ther, 27: 2195-2212, 2019; Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 9: 142-152, 2018; 및 Wang 등, J Virol, 79: 10999-11013, 2005) 및 인간 CD34+ 세포(Li 등, Mol Ther, 27: 2195-2212, 2019)에서 HDAd35++-트랜스포존 벡터 및 SB100x/Flpe 발현 벡터를 사용한 생체내 HSC 공동-감염은 유전자에 대한 선호도 없이 세포 당 2 개 이식유전자 카피의 무작위 이식유전자 통합을 초래하였음이 입증되었다.
인간 게놈은 일반적으로 루프 형성을 통해 조절 영역(즉, 전사 인자 결합 부위) 사이에 긴 범위 상호작용을 갖는 3-D 구조로 조직화된다. 이러한 상호작용의 대부분은 위상적으로 연관된 도메인(TAD)의 맥락에서 발생한다. TAD는 인핸서가 전사를 제어하기 위해 다른 조절 영역과 상호작용하는 염색체 조직화의 기능적 단위로 간주된다. TAD/LCR 경계 절연은 인핸서 및 프로모터의 검색 공간을 제한하고 원치않은 조절 접촉이 형성되는 것을 방지하는 것으로 생각된다. 이러한 도메인의 양 측면에서 경계는 상이한 포유류 세포 유형 사이에 그리고 심지어 종에 걸쳐 보존된다.
현재 사용되는 렌티바이러스 및 rAAV 유전자 전달 벡터는 작은 인핸서/프로모터만을 수용하여, 종종 이식유전자 발현의 차선적 수준 및 조직 특이성, 이식유전자 침묵, 및 벡터 통합 부위 주위의 조절 영역과의 의도하지 않은 상호작용을 초래할 수 있다. 최악의 경우에 대한 시나리오에서, 후자는 원종양형성 유전자의 활성화로 이어질 수 있다.
유전자 요법의 안전성 및 효능을 증가시키기 위해, TAD는 유전자 추가 전략에 사용되어야 한다. TAD의 중간 크기는 880 kb이다. 고처리량 염색체 형태 캡처 (3C) 검정 및 후속 4C, 5C 및 Hi-C 프로토콜 뿐만 아니라 섬유-Seq 검정의 추가 발전에 따라, 조절 게놈의 심문은 빠른 속도로 진행될 것이고, 유전자 요법 목적을 위해, 중요한 코어 요소만을 함유하는 TAD를 전달할 수 있다. β-글로빈 유전자좌 제어 영역(LCR)은 TAD의 정의 하에 속한다.
캡시드-변형된 HDAd5/35++ 벡터는 생체내 HSPC 유전자 요법에 사용되었다(Li & Lieber, FEBS Lett. 593(24):3623-48, 2019; Richter 등, Blood. 128(18):2206-17, 2016). 접근법은 골수에서 HSPC의 동원을 수반하고, 주변부에서 많은 수로 순환하는 동안, HDAd5/35++ 벡터가 정맥내로 주사된다. 이러한 벡터는 원시 HSPC에서 발현되는 수용체인 CD46을 표적화한다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-17, 2016). 형질도입된 HSPC는 장기간 지속되는 경우 골수로 되돌아간다. 무작위 통합은 활성-향상된 잠자는 미녀 트랜스포사제(SB100x)에 의해 매개된다(Boehme 등, Mol Ther Nucleic Acids. 5(7):e337, 2016). 표적화된 통합은 상동성 의존적 DNA 복구를 통해 달성될 수 있다(Li 등, Mol Ther. 27(12):2195-212, 2019). 이 접근법은 뮤린 중간형 지중해빈혈의 개선(Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019), 뮤린 혈우병의 교정(Wang 등, Blood Adv. 3(19):2883-94, 2019), 및 자연암의 회귀(Li 등, Cancer Res. 80(3):549-560, 2019)를 초래하였다. 비-인간 영장류에서의 첫번째 데이터는 생체내 HSPC 유전자 요법 접근법이 정맥내 HDAd5/35++ 주사 후 선천적 면역 반응을 억제하기 위해 글루코코르티코이드, IL6- 및 IL1β-수용체 길항제 전처리와 조합될 때 안전함을 나타낸다(Li 등, 23rd Annual ASGCT meeting. 2020; abstract #546). HDAd5/35++ 벡터의 정맥내 주사는 주사 후 3 일차에 CD46tg 마우스에서 동원된 HSPC 및 PBMC 이외의 조직에서 이식유전자 발현을 초래하지 않았다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-17, 2016; Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019). 이는 최근에 비-인간 영장류에서 확인되었다. 이 향성에 대한 잠재적인 설명은 CD46 수용체 밀도 및 접근가능성이 효율적인 바이러스 형질도입을 허용하기에 비-조혈조직에서 충분히 높지 않다는 것이다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-17, 2016; Ni 등, Hum Gene Ther. 16(6):664-77, 2005).
HDAd5/35++ 벡터를 사용한 이전 연구에서, 4.3　kb HS1-HS4 미니-LCR(β-글로빈 유전자좌 제어 영역)은 생체내 HSPC 형질도입 후 인간 γ-글로빈 발현을 구동하기 위해 0.66　kb β-글로빈 프로모터와 조합하여 사용되었다(Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019; Ong 등, Exp Hematol. 34(6):713-20, 2006). Hbbth3/CD46+/+ 지중해빈혈 마우스에서, 안정된(8 개월 이상) γ-글로빈 마킹은 말초 혈액 적혈구의 거의 100% 및 거의 완전한 표현형 교정에서 달성되었다(Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019). 그러나, γ-글로빈 발현 수준은 세포 당 2 개 카피의 평균 통합 벡터 카피 수(VCN)를 갖는 성체 마우스 α-글로빈의 단지 10-15%였으며, 따라서 주요 지중해빈혈 또는 SCD에 대한 접근법의 임상 번역을 특히 어렵게 만든다. 여기서, HDAd5/35++ 벡터의 큰 용량은 γ-글로빈 발현 카세트를 포함하는 β-글로빈 TAD 코어 요소를 29　kb 길이로 통합하여 완전한 표현형 교정을 달성함으로써 활용되었다.
이 맥락에서, 또 다른 의도는 SB100x 시스템이 32.4　kb 트랜스포존의 효율적인 통합을 매개할 수 있음을 입증하는 것이었다. 플라스미드-기반 SB 시스템을 사용한 연구로부터 SB 통합 활성은 트랜스포존의 길이와 음의 상관관계가 있는 것으로 생각되었다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 9:142-52, 2018; Karsi 등, Mar Biotechnol (NY). 3(3):241-5, 2001). 이를 고려하면, Kay 및 Ehrhardt 그룹에 의해 개발된 첫번째 SB-기반 HDAd 벡터는 상대적으로 작은(4　kb-6　kb) 트랜스포존을 보유하였다(Turchiano 등, PLoS One. 9(11):e112712, 2014; Yant 등, Nat Biotechnol. 20(10):999-1005, 2002).
최근에, HDAd5/35++ 벡터를 사용하여, 생체외 또는 생체내 HSPC 형질도입 후 HSPC에서 10.8　kb(Wang 등, Blood Adv. 3(19):2883-94, 2019) 및 11.8　kb(Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019; Ong 등, Exp Hematol. 34(6):713-20, 2006) 트랜스포존의 효율적인 SB100x-매개 통합을 입증하였다. 이 실시예는 HDAd5/35++-기반 SB100x 벡터 시스템이 32.4　kb 트랜스포존을 통합할 수 있다는 증거를 제공한다.
전반적으로, 정상 및 지중해빈혈 마우스에서 이러한 생체내 연구 뿐만 아니라 인간 CD34+ 세포에 대한 시험관내 연구는 HDAd5/35++ 벡터를 함유하는 기재된 긴-LCR이 혈색소병증의 치료를 위한 효율적인 도구일 수 있음을 나타낸다.
재료 및 방법 .
구성요소 위치: HS5→HS1 (21.5kb): Chr11, 5292319→5270789; β-프로모터: chr11, 5228631→5227023; 및 3'HS1: Chr11, 5206867→5203839.
HDAd 벡터: HDAd-SB 및 HDAd-짧은-LCR 벡터의 생성은 이전에 기재되었다(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016; Ong 등, Exp Hematol 34(6):713-20, 2006). HDAd-긴-LCR 벡터의 생성을 위해, 상응하는 셔틀 플라스미드는 코스미드 벡터 pWE15를 기반으로 하였다(Stratagene, 캘리포니아주 라호이아 소재). pWE.Ad5-SB-mgmt는 Ad5 5'ITR(뉴클레오티드 1 내지 436) 및 3'ITR(뉴클레오티드 35741 내지 35938), pBS-μLCR-γ-글로빈-mgmt로부터 유래된 구 인간 EF1α 프로모터-mgmtP140K-SV40pA-cHS4 카세트(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019), SB100x-특이적 IR/DR 부위 및 FRT 부위를 함유한다. pAd.LCR-β-GFP(21.5-kb 인간 β-글로빈 LCR 함유)에서의 GFP-BGHpA 단편(Hudecek 등, Crit Rev Biochem Mol Biol 52(4):355-380, 2017)은 인간 γ-글로빈 유전자 및 이의 3'UTR 영역에 의해 대체되었다(Chr 11:5,247,139 →5,249,804)(pAd-긴-LCR-β-γ-글로빈). 플라스미드 pAd-긴-LCR-β-γ-글로빈은 21.5-kb 인간 β-글로빈 LCR 및 3.0-kb 인간 β-글로빈 3'HS1을 함유한다. LCR-β-γ-글로빈-3'HS1을 함유하는 28.9-kb 단편은 EF1α-mgmt-SV40pA-cHS4의 카세트의 하류를 pWE.Ad5-SB-mgmt 내로 삽입하였다(pWE.Ad5-SB-긴-LCR-γ-글로빈/mgmt). 완전한 긴-LCR-γ-글로빈/mgmt 카세트는 SB100x-특이적 IR/DR 부위 및 FRT 부위에 의해 플랭킹되었다. 생성된 플라스미드를 Gigapack III Plus Packaging Extract(Stratagene, 캘리포니아주 라호이아 소재)를 사용하여 파지 내로 패킹하고 증식시켰다. HD-Ad-긴-LCR-γ-글로빈/mgmt 바이러스를 생성하기 위해, 바이러스 게놈을 116 세포에서 구제를 위한 플라스미드로부터 I-CeuI 소화에 의해 방출하였다. 단일 아미노산 변이가 있는 인간 집단에서 HBG1 유전자에 대한 2 개의 알려진 변이체가 있다(76-이소류신 또는 76-트레오닌). 빈도가 유럽인의 13%에서 동아시아인의 73%까지의 범위인 76-Ile HBG1 변이체가 사용되었다.
HDAd 바이러스를 생성하기 위해, 바이러스 게놈을 Ad5/35++-Acr 헬퍼 바이러스가 있는 116 세포에서 구제하기 위해 FseI 소화에 의해 방출하였다(Palmer 등, Mol Ther 8: 846-852, 2003). 이 헬퍼 바이러스는 Ad5 섬유 꼬리, Ad35 섬유 샤프트, 및 친화도-향상된 Ad35++ 섬유 놉으로 구성된 키메라 섬유를 함유하는 Ad5/35++ 헬퍼 벡터인 AdNG163-5/35++의 유도체이다(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016). SpCas9 활성을 억제하는 것으로 최근에 제시된 인간 코돈-최적화된 AcrIIA4-T2A-AcrIIA2 서열을 합성하고(Yang 등, Proc Natl Acad Sci USA. 92(25):11608-12, 1995) 셔틀 플라스미드 pBS-CMV-pA(pBS-CMV-Acr-pA)로 클로닝하였다. 이후에, 2.0-kb CMV-Acr-pA 카세트를 pBS-CMV-Acr-pA로부터 증폭시키고 In-Fusion HD 클로닝 키트(Takara)에 의해 pNG163-2-5/35++의 SwaI 부위 내로 삽입하였다(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016). 그런 다음 바이러스 게놈을 PacI 소화에 의해 방출하고 Ad5/35++-Acr 헬퍼 바이러스를 구제하고 293 세포(HEK293)에서 증식시켰다. HDAd-SB의 생성은 이전에 기재되었다(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016). 헬퍼 바이러스 오염 수준은 0.05% 미만이었다. 모든 제제는 박테리아 내독소가 없었다.
CD34 + 세포 배양: G-CSF-동원된 성체 공여자로부터의 CD34+ 세포를 동결된 스톡으로부터 회수하고 10% 열-불활성화 FCS, 1% BSA 0.1 mmol/l 2-머캅토에탄올, 4 mmol/l 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신, Flt3 리간드(Flt3L, 25 ng/ml), 인터류킨 3(10 ng/ml), 트롬보포이에틴(TPO)(2 ng/ml), 및 줄기 세포 인자(SCF)(25 ng/ml)가 보충된 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(IMDM)에서 밤새 배양하였다. 유세포 분석은 세포의 98% 초과가 CD34+였음을 입증하였다. 사이토카인 및 성장 인자는 Peprotech(뉴저지주 로키 힐 소재)로부터 수득하였다. CD34+ 세포를 낮은 부착 12 웰 플레이트에서 바이러스로 형질도입하였다.
적혈구 시험관내 분화: 인간 HSPC의 적혈구 세포 내로의 분화를 Douay 등에 기재된 프로토콜에 기반하여 수행하였다(Methods Mol Biol 482: 127-140, 2009). 간단히 말해서, 단계 1에서, 104 개 세포/ml 밀도의 세포를 5% 인간 혈장, 2 IU/ml 헤파린, 10　μg/ml 인슐린, 330 μg/ml 트랜스페린, 1　μM 하이드로코르티손, 100　ng/ml SCF, 5 ng/ml IL-3, 3 U/ml 에리트로포이에틴(Epo), 글루타민, 및 Pen-Strep이 보충된 IMDM에서 7 일 동안 배양하였다. 단계 2에서, 1x105 개 세포/ml 밀도의 세포를 5% 인간 혈장, 2　IU/ml 헤파린, 10 μg/ml 인슐린, 330 μg/ml 트랜스페린, 100 ng/ml SCF, 3 U/ml Epo, 글루타민, 및 Pen/Strep이 보충된 IMDM에서 3 일 동안 배양하였다. 단계 3에서, 1x106 개 세포/ml 세포 밀도의 세포를 5% 인간 혈장, 2 IU/ml 헤파린, 10 μg/ml 인슐린, 330 μg/ml 트랜스페린, 3 U/ml Epo, 글루타민, 및 Pen/Strep이 보충된 IMDM에서 12 일 동안 배양하였다.
형질도입된 CD34+ 세포의 시험관내 선택: 형질도입된 CD34+ 세포를 시험관내 분화 프로토콜의 단계 1 에서 5 일째에 O6BG/BCNU로 선택하였다. 간단히 말해서, CD34+ 세포를 50 μM O6BG와 1 시간 동안 배양한 다음 35 μM BCNU와 추가 2 시간 동안 배양한 다음, 세포를 2 회 세척하고 새로운 단계 1 배지에 재현탁하였다.
Lin - 세포 배양: 계통 음성 세포를 Miltenyi Biotech(독일 베르기슈글라트바흐 소재)의 계통 세포 고갈 키트를 사용하여 MACS에 의해 총 마우스 골수 세포로부터 단리하였다. Lin- 세포를 10% FCS, 10% BSA, Pen-Strep, 글루타민, 10 ng/ml 인간 TPO, 20 ng/ml 마우스 SCF 및 20 ng/ml 인간 Flt-3L이 보충된 IMDM에서 배양하였다.
글로빈 HPLC: 개별 글로빈 쇄 수준을 SPD-10AV 다이오드 어레이 검출기 및 LC-10AT 바이너리 펌프가 장착된 Shimadzu Prominence 기기(Shimadzu, 일본 쿄토 소재)에서 정량화하였다. 물/아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산의 40%-60% 구배 혼합물을 Vydac C4 역상 칼럼(Hichrom, 영국 소재)을 사용하여 1 mL/분의 속도로 적용하였다.　
유세포 분석: 세포를 1　% FCS가 보충된 PBS에 1x106 개 세포/100　μL로 재현탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 FcR 차단 시약(Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 오번 소재)과 함께 배양하였다. 다음으로 염색 항체 용액을 106 개 세포 당 100 μL에 첨가하고 암실에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 FACS 완충액(PBS, 1%　FBS)에서 1 회 세척하였다. 염색 단계를 2차 염색 용액으로 반복하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 분석하였다. 파편을 전방 산란 영역 및 측방 산란 영역 게이트를 사용하여 제외하였다. 그런 다음 단일 세포를 전방 산란 높이 및 전방 산란 폭 게이트를 사용하여 게이팅하였다. 그런 다음 유세포 분석 데이터를 FlowJo(버전 10.0.8, FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. LSK 세포의 흐름 분석을 위해, 세포를 비오틴-접합된 계통 검출 칵테일(cat #: 130-092-613; Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 c-Kit(cat #:12-1171-83) 및 Sca-1(cat #: 25-5981-82)에 대한 항체 뿐만 아니라 APC-접합된 스트렙타비딘으로 염색하였다. eBioscience(캘리포니아주 샌디에이고 소재)로부터의 다른 항체는 항-마우스 LY-6A/E(Sca-1)-PE-Cyanine7(클론 D7), 항-마우스 CD117(c-Kit)-PE(클론 2B8), 항-마우스 CD3-APC(클론 17A2; cat #:17-0032-82), 항-마우스 CD19-PE-Cyanine7(클론 eBio1D3; cat #: 25-0193-82), 및 항-마우스 Ly-66 (Gr-1)-PE(클론 RB6-8C5; cat #: 12-5931-82)을 포함하였다. 항-마우스 Ter-119-APC(클론: Ter-119; cat #: 116211)는 Biolegend(캘리포니아주 샌디에이고 소재)로부터 수득하였다.
인간 γ-글로빈 발현을 검출하는 세포내 유세포 분석: FIX & PERMTM(Nordic Immunological Laboratories, 네덜란드 수스테렌 소재) 세포 투과화 키트(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따랐다. 간단히 말해서, 1x106 개 세포를 100　μl FACS 완충액(1%　FCS가 보충된 PBS)에 재현탁하고, 100　μl의 시약 A(고정 배지)를 첨가하고 실온에서 2-3 분 동안 배양한 다음, 1　ml 사전-냉각된 절대 메탄올을 첨가하고, 혼합하고 10 분 동안 암실에서 얼음 위에서 배양하였다. 그런 다음 샘플을 FACS 완충액으로 세척하고 100　μl 시약 B(투과 배지) 및 0.3　μg 헤모글로빈 γ 항체(Santa Cruz Biotechnology, 텍사스주 댈러스 소재, cat# sc-21756 PE)에 재현탁하고, 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 분석하였다. 유세포 분석 게이팅 전략은 도 46에 제시되어 있다.
실시간 역전사 PCR: 총 RNA를 제조업체의 페놀-클로로포름 추출 방법에 따라 TRIzolTM 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 50-100 μl 혈액으로부터 추출하였다. Quantitect 역전사 키트(Qiagen) 및 power SYBRTM green PCR 마스터 믹스(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 실시간 정량적 PCR을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(AB Applied Biosystems)에서 수행하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: 마우스 RPL10(하우스키핑) 정방향(서열번호: 189), 및 역방향(서열번호: 190); 인간 γ-글로빈 정방향(서열번호: 191), 및 역방향(서열번호: 192); 마우스 β-주요 글로빈 정방향(서열번호: 193), 및 역방향(서열번호: 194), 마우스 α 글로빈 정방향(서열번호: 212), 및 역방향(서열번호: 213).
벡터 카피 수의 측정: 골수 세포로부터의 총 DNA를 Quick-DNA 미니프렙 키트(Zymo Research)를 사용하여 추출하였다. HDAd-짧은 LCR-γ-글로빈/mgmt 바이러스로부터 추출된 바이러스 DNA를 연속으로 희석하고 표준 곡선에 사용하였다. qPCR을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 power SYBR Green PCR 마스터 믹스를 사용하여 삼중으로 수행하였다. 9.6 ng DNA(9600 pg/6 pg/세포 = 1600 개 세포)를 10 μL 반응에 사용하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: 인간 γ-글로빈 정방향(서열번호: 195), 및 역방향(서열번호: 196).
통합 부위 분석. 절차를 설명하기 위해, 도 27을 참조한다. 도 28d에 대한 무작위화 데이터를 포아송(Poisson) 회귀 삽입 모델(PRIM)을 사용하여 생성하여 마우스 참조 게놈(mm9)에서 각 염색체의 길이에 따라 중첩하지 않는 20 킬로염기 창에 대한 예상된 삽입률을 계산하였다. PRIM 알고리즘은 각 창 내에서 TA 디뉴클레오티드의 수, 창이 잔류하는 염색체, 및 고유 삽입의 총 수에 기반하여 통계 모델을 생성하였다. 각 창에 대해, 예상된 삽입 수를 계산하고 관찰된 삽입 수와 비교하여 p-값을 생성하였다. 그런 다음 본페로니-교정(Bonferroni-correction)을 적용하여 삽입된 트랜스포존의 검출을 위한 강화를 나타내는 창을 식별하였다. 그런 다음 TA를 함유하는 참조 게놈으로부터의 무작위 서열을 생성하고, Bowtie2를 사용하여 맵핑하고 실제 통합 데이터에 대해 플롯팅하였다. 계산 및 플롯은 R에서 ggplot2를 사용하여 수행하였다. 도면은 HOMER 및 ChIPseeker를 사용하여 그렸다.
통합 부위 분석(역PCR). 총 골수 세포의 접합부를 변형되어 다른 곳에서 기재된 바와 같은 역PCR에 의해 분석하였다(Hudecek 등, Crit Rev Biochem Mol Biol 52(4):355-80, 2017). 간단히 말해서, 골수 세포로부터의 게놈 DNA를 제조업체의 지침에 따라 Quick-DNA 미니프렙 키트(Zymo Research)에 의해 단리하였다. 5 - 10 μg의 DNA를 SacI로 소화시키고 분자내 반응을 촉진하는 조건 하에 재결찰시켰다. 결찰 혼합물을 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제한 다음 KOD Hot Start DNA 폴리머라제를 사용하여 중첩 PCR(각 30 주기)에 사용하였다. 다음 프라이머를 사용하였다: EF1α p1 정방향(서열번호: 197) 및 역방향(서열번호: 198); EF1α p2 정방향(서열번호: 199) 및 역방향(서열번호: 200); 3'HS1 p1 정방향(서열번호: 201) 및 역방향(서열번호: 202); 및 3'HS1 p2 정방향(서열번호: 203) 및 역방향(서열번호: 204). 서열번호: 197-204에서, 밑줄 표시된 염기를 하류 클로닝에 사용한다. PCR 앰플리콘을 겔 정제하고, 클로닝하고, 서열분석하고, 정렬시켜 통합 부위를 식별하였다.
RNA-seq 분석을 Omega Bioservices(조지아주 노르크로스 소재)에 의해 수행하였다. 데이터를 OnRamp BioInformatics, Inc.(캘리포니아주 샌디에이고 소재)에 의해 개발된 HyperScale 아키텍처를 사용하여 Rosalind(rosalind.onramp.bio/에서 온라인 이용가능)에 의해 분석하였다. 판독물을 cutadapt를 사용하여 트리밍하였다. 품질 점수를 FastQC를 사용하여 평가하였다. 개별 샘플 판독물을 HTseq4를 사용하여 정량화하고 DESeq2 R 라이브러리를 사용하여 상대 Log 발현(RLE)을 통해 정규화하였다. DEseq2를 또한 사용하여 배수 변화 및 p-값을 계산하고 임의의 공변량 교정을 수행하였다. 차등적으로 발현된 유전자의 최종 히트맵을 위한 유전자의 클러스터링을 fpc R 라이브러리를 사용한 PAM(분할적 군집 분석) 방법을 사용하여 수행하였다. Interpro9, NCBI10, MSigDB11,12, REACTOME13, WikiPathways를 포함하는 여러 데이터베이스 소스를 강화 분석을 위해 참조하였다. 강화는 실험과 관련된 배경 유전자 세트와 관련하여 계산하였다.
p-값에 대한 log-스케일 배수 변화를 플롯팅하는 맞춤형 Python 스크립트로 볼케이노 플롯(volcano plot)을 생성하였다.
동물:
연구 승인: 동물을 수반하는 모든 실험은 워싱턴 대학(University of Washington)에 의해 제시된 기관 지침에 따라 수행하였다. 워싱턴 대학은 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회(AALAC) 공인 연구 기관이며 이 대학에서 수행된 모든 살아있는 동물 작업은 실험실 동물 복지국(OLAW) 공중 보건 보증(PHS) 정책, USDA 동물 복지법 및 규정, 실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 정책을 따른다. 연구는 워싱턴 대학 IACUC(프로토콜 번호 3108-01)에 의해 승인되었다.
생체외 및 생체내 HSPC 형질도입 연구를 완전한 인간 CD46 유전자좌를 함유하는 C57Bl/6-기반 유전자이식 마우스 모델(hCD46tg)로 수행하였다. 이러한 마우스는 인간과 유사한 패턴 및 수준에서 hCD46을 발현한다(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 8:52-64, 2018).
Hbb th3 /CD46+/+ 마우스의 교배 및 스크리닝: 3 차례의 역교배 후, C46에 대한 Hbbth3 마우스 동형접합성을 gDNA에 대한 PCR(CD46F-5'(서열번호: 205) 및 CD46R 프라이머(서열번호: 206) 사용) 뿐만 아니라 CD46 MFI 측정을 허용하는 유세포 분석에 의해 확인하였다. Hbbth3/CD46+/+ 마우스의 지중해빈혈 표현형을 하기 기재된 바와 같이,
Figure pct00020
염색 후 말초 혈액 도말에 의해 평가하였다.
골수 Lin - 세포 이식: 수용자는 6 - 8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스였다. 이식 당일에, 수용자 마우스를 1000 Rad로 조사하였다. 조사 4 시간 후 1x106 개 Lin- 세포를 꼬리 혈관을 통해 정맥내로 주사하였다. 이 프로토콜을 생체외 형질도입 Lin- 세포의 이식 및 2차 수용자로의 이식을 위해 사용하였다.
HSPC 동원 및 생체내 형질도입: 이 절차는 이전에 Richter, 등, (2016) Blood 128: 2206-2217에 기재되었다. HSPC를 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사(5 μg/마우스/일, 4 일)(Amgen 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재) 이어서 5 일째에 AMD3100(5 mg/kg)의 s.c. 주사(Sigma-Aldrich)에 의해 마우스에서 동원하였다. 또한, 동물은 바이러스 주사 16 시간 및 2 시간 전에 덱사메타손(10 mg/kg)을 i.p.로 받았다. AMD3100 후 30 및 60 분에, 동물에게 HDAd 벡터를 주사 당 각 바이러스에 대해 4x1010 vp의 용량으로 안와하정맥총을 통해 정맥내로 주사하였다. 4 주 후, O6BG/BCNU의 생체내 선택을 시작하였다.
2차 골수 이식: 수용자는 Jackson Laboratory로부터 수득한 6 - 8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스였다. 이식 당일에, 수용자 마우스를 1000 Rad로 조사하였다. 생체내 형질도입된 CD46tg 마우스로부터의 골수 세포를 무균상태로 단리하고 계통-고갈된 세포를 MACS를 사용하여 단리하였다. 조사 4 시간 후 세포를 마우스 당 1x106 개 세포로 정맥내로 주사하였다. 20 주차에, 2차 수용자를 희생시키고 혈액, 골수 및 비장으로부터 CD46+ 세포를 MACS에 의해 단리하거나 또는 상기 기재된 바와 같이, 동원 및 생체내 형질도입에 적용하였다. 모든 2차 수용자는 4 주차에 시작하여 면역억제를 받았다.
혈액학적 분석: 혈액 샘플을 EDTA-코팅된 튜브에 수집하고, 분석을 HemaVet 950FS(Drew Scientific)에서 수행하였다.
조직 분석: 2.5 μm 두께의 비장 및 간 조직 절편을 적어도 24 시간 동안 4% 포름알데하이드에 고정시키고, 탈수하고 파라핀에 포매하였다. 골수외 혈구형성의 조직학적 평가를 위해 헤마톡실린-에오신 염색을 사용하였다. 헤모시데린은 Perl의 프러시안 블루 염색에 의해 조직 절편에서 검출되었다. 간단히 말해서, 조직 절편을 증류수 중 동일한 부피(2%)의 페로시안화칼륨 및 염산의 혼합물로 처리한 다음 뉴트럴 레드로 대조염색하였다. 세포외 혈구형성 및 혈철소증을 정량화하기 위해, 적어도 3 마리 동물로부터의 5 개의 상이한 조직 절편에서 10 개의 무작위 영역을 마우스 그룹에 대해 맹검이 된 조사자들에 의해 평가하였다. 비장 크기를 비장 중량(mg)/체중(g)의 비로 평가하였다.
혈액 분석 및 골수 사이토스핀: 혈액 샘플을 EDTA-코팅된 튜브에 수집하고 분석을 HemaVet 950FS(Drew Scientific, 코네티컷주 워터베리 소재)에서 수행하였다. 말초 혈액 도말 및 골수 세포 사이토스핀을 각각 5 및 15 분 동안
Figure pct00021
/Giemsa(Merck, 독일 다름슈타트 소재)로 염색하였다. 망상적혈구를 브릴리언트 크레실 블루로 염색하였다. 혈액 도말 시 망상적혈구를 계수한 조사자들은 샘플 그룹 할당에 대해 맹검이었다. 슬라이드에는 동물 번호만이 표시되었다(동물 당 5 개 슬라이드, 5 개의 무작위 1　cm2 절편).
통계적 분석 : 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 제시된다. 다중 그룹의 비교를 위해, 다중 비교를 위한 본페로니 사후-테스트와 함께 일원 및 이원 분산 분석(ANOVA)을 이용하였다. 하나의 그룹화 변수에 대한 그룹 간의 차이는 독립표본 양측 스튜던트 t 검정에 의해 결정하였다. 비모수 분석을 위해 Kruskal-Wallis 검정을 사용하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 버전 6.01(GraphPad Software Inc., 캘리포니아주 라호이아 소재)을 사용하여 수행하였다. *p≤0.05, ** p≤00.0001. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다.
결과 .
정맥내로 주사된 HDAd5/35++ 벡터를 사용한 생체내 형질도입 연구를 위한 모델로서, 완전한 인간 CD46 유전자좌를 함유하고 따라서 인간과 유사한 패턴 및 수준에서 hCD46을 발현하는 유전자이식 마우스를 사용하였다(hCD46tg 마우스) (Kemper, 등, (2001) Clin Exp Immunol 124: 180-189).
긴 β-글로빈 LCR을 함유하는 HDAd5/35++ 벡터. 실시예 1에 기재된 연구에서, 1.6 kb β-글로빈 프로모터에 연결된 4.3 kb 미니 LCR(HS1 내지 HS4의 코어 요소 포함(Lisowski 등, Blood 110: 4175-4178, 2007))의 제어 하에 γ-글로빈을 발현하는 HDAd5/35++ 벡터(도 23, "HDAd-짧은-LCR")(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019)를 사용하였다(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019; Li, 등, () Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018). 본 실시예에서, γ-글로빈 유전자 발현을 최대화하기 위해 하기 요소를 함유하는 HDAd5/35++ 벡터를 구축하였다: i) 전장 HS5 내지 HS1 영역을 포함하는 21.5 kb LCR, ii) 1.6 kb β-글로빈 프로모터, iii) γ-글로빈 mRNA를 안정화하기 위한 β-글로빈 3'UTR, 및 iv) 3' HS1 영역. 벡터는 HDAd-긴-LCR(도 23, "HDAd-긴-LCR")로 명명하였다. 통합을 매개하기 위해, LCR-벡터를 SB100x/Flpe 발현 HDAd 벡터(도 23, "HDAd-SB")와 조합하여 사용한다. 트랜스포존 벡터(HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR)는 Flpe 재조합효소의 존재 하에 이식유전자 카세트의 원형화를 허용하는 SB100x 트랜스포사제 및 frt 부위에 의해 인식된 도립된/지시 반복(IR/DR) 모티프를 함유한다. HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR은 둘 다 또한 보편적으로 활성인 EF1α 프로모터의 제어 하에 돌연변이체 O6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(mgmtP140K)에 대한 유전자를 보유하여 저용량 O6BG/BCNU 처리에 의해 안정하게 형질도입된 세포의 선택을 허용하였다(Hausl 등, B. Mol Ther 18(11):1896-906, 2010; Neff 등, J Clin Invest 112(10):1581-8, 2003).
생체외 HSPC 형질도입/이식 연구. 인간에서, CD46은 모든 유핵 세포에서 발현되지만, 마우스에서 상응하는 오솔로그는 고환에서만 존재한다. 정맥내로 주사된 HDAd5/35++ 벡터를 사용한 생체내 형질도입 연구를 위한 모델로서, 완전한 인간 CD46 유전자좌를 함유하고 따라서 인간과 유사한 패턴 및 수준에서 hCD46을 발현하는 유전자이식 마우스를 사용하였다(CD46tg 마우스)(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev 8:52-64, 2018). 연역적으로, SB100x가 32.4　kb 트랜스포존의 통합을 매개할 수 있는지가 알려져 있지 않았기 때문에, HSPC 형질도입 효능이 제어될 수 있는 설정으로 생체외 HSPC 형질도입 연구를 수행하였다. HSPC에 대해 강화된 세포 분획인 CD46tg 마우스 골수 계통-음성(Lin-) 세포를 HDAd-긴-LCR + HDAd-SB로 생체외 형질도입하였다(도 24a). 그런 다음 생체외 형질도입된 세포를 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스에 이식하였다. 4 주차에 생착률은 CD46-양성 PBMC를 기반으로 95% 초과였다. 이식 1 개월 후, 마우스를 4 차례의 O6BG/BCNU 처리에 적용하여 통합된 γ-글로빈/mgmt 이식유전자를 갖는 전구체를 선택적으로 확장하였다(도 24a). 생체내 선택의 각 차례마다, γ-글로빈-양성 말초 적혈구(RBC)의 백분율을 증가시켜, 연구 종료 시 95% 초과에 도달하였다(도 24b). 20 주차에, 동물을 희생시키고 골수 단핵 세포(MNC)를 분석하였다. qPCR에 의해 측정된 평균 VCN은 세포 당 2.8 개의 카피였다. γ-글로빈 발현은 유세포 분석에 의해 적혈구 Ter119+ 세포의 85.46(+/-5.9)% 및 비-적혈구(Ter119-) 골수 MNC의 14.54(+/-2.3)%에서 검출되었다(도 24c).
γ-글로빈 발현이 SB100x 통합된 이식유전자로부터 유래되었음을 입증하기 위해, 이식 후 20 주차에 수확된 골수 단핵 세포(MNC)로부터의 게놈 DNA에서 역PCR(iPCR) 분석을 수행하였다. iPCR 프로토콜은 게놈 DNA의 SacI로의 소화, 재결찰/원형화 단계, 중첩 PCR 및 벡터/염색체 접합부의 서열분석을 수반한다(도 24d). (도 24e)는 3 가지 대표적인 PCR 생성물 및 염색체 4, 15, 및 X 상에서 통합 부위의 국소화를 나타낸다. 생성물의 서열분석은 벡터 IR/DR-염색체 접합부에서 TA 디-뉴클레오티드를 포함하는 SB100x 매개 통합에 전형적인 벡터/염색체 접합부를 입증하였다(도 24f). 요약하면, 생체외 HSPC 형질도입 연구에서, 긴 글로빈 LCR은 SB100x 통합된 트랜스포존으로부터 기원하는 높은 수준의 γ-글로빈 발현을 부여하였다.
짧은 LCR vs 긴 LCR를 함유하는 HDAd5/35++ 벡터를 사용한 CD46b 유전자이식 마우스에서 생체내 HSPC 형질도입. HDAd-긴-LCR 및 미니LCR을 함유하는 실시예 1에서 이전에 사용된 벡터(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019; Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018)(본원에서 "HDAd-짧은-LCR"로 지칭됨)를 나란히(side-by-side) 비교하였다 (도 23). CD46-유전자이식 마우스를 G-CSF/AMD3100으로 동원하고 정맥내로 벡터를 주사하고, 5 주 후, 생체내 선택에 적용하였다(도 25a). γ-글로빈-양성 적혈구(RBC)의 백분율은 각 차례의 생체내 선택으로 증가하여 20 주차에 두 백터에 대해 95% 초과에 도달하였다(도 25b). 20 주 샘플로부터의 RBC 용해물에 대해 수행된 HPLC는 벡터 사이의 γ-글로빈/성체 마우스 α-글로빈의 백분율에서 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 25c). 이는 또한 mRNA 수준에서 반영되었다(도 25d).
qPCR에 의해 20 주차에 측정된 골수 단핵 세포(MNC)에서 벡터 카피 수는 세포 당 2.5 개 카피였고(도 25e) 벡터 사이에 유의한 차이는 없었다. 이는 "긴" 32.4 kb 트랜스포존의 통합이 "짧은" 11.8 kb 트랜스포존의 통합만큼 효율적이었음을 나타낸다. 벡터를 사용한 생체내 HSPC 형질도입 후 32.4　kb 트랜스포존의 SB100x-매개 통합은 대부분의 적혈구 세포에서 γ-글로빈 발현에도 불구하고 혈액학적 이상(20 주)을 유발하지 않았다(도 26b). 세포 골수의 조성물(도 26c) 및 골수 Lin- 세포의 콜로니 형성-가능성(도 26d)은 그룹 사이에 유의하지 않았다.
장기간 재증식 HSPC에서 발생된 생체내 형질도입 및 SB100x-매개 통합을 입증하기 위한 2차 이식에서, 세포 골수의 조성물(도 26c) 및 골수 Lin- 세포의 콜로니 형성-가능성(도 26d)은 그룹 사이에 유의하지 않았다. 이식된 골수 Lin- 세포를 hCD46 이식유전자 없이 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스로의 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 수확하였다). 2차 수용자에서 다중-계통 재구축을 구동하는 이식된 세포의 능력을 16 주 기간에 걸쳐 평가하였다. "1차" 생체내 HSPC 형질도입된 마우스에서와 같이, 골수의 세포 조성물 또는 말초 혈액에서 혈액학적 매개변수에 대한 높은 수준의 글로빈 발현 효과는 관찰되지 않았다.
또한 20 주차에 수확된 골수 Lin- 세포를 사용하여 게놈-와이드 통합 부위 분석을 수행하였다. 이 검정에서, 선형 증폭-매개 PCR(LAM-PCR) 전략은 통합 접합부의 서열분석이 이어진다(도 27). 마우스 게놈에 걸친 통합 부위의 분포는 도 28a에 제시되어 있다. 통합된 이식유전자 카세트를 정확하게 처리하였고, 식별된 IR/DR 염색체 접합부는 TA 디뉴클레오티드를 함유하였다(도 28b). 대부분의 통합은 유전자간 및 인트론 영역 내에 각각 83% 및 17% 빈도로 있었다(도 28c). 통합은 전체 마우스 게놈의 임의의 주어진 창에서 우선적인 통합 없이 무작위였다(도 28d). 원종양형성 유전자 내에서 또는 근처에서 통합은 발견되지 않았다. 이 SB100x-매개 통합 패턴은 이전 연구와 일치한다(Richter 등, Blood 128(18):2206-17, 2016; Neff 등, J Clin Invest 112(10):1581-8, 2003; Kemper 등, Clin Exp Immunol. 124(2):180-9, 2001; Zhang 등, PLoS One 8(10):e75344, 2013; Yant 등, Nat Biotechnol 20(10):999-1005, 2002).
2차 수용자의 분석. 생체내 형질도입이 장기간 재증식 HSPC에서 발생하였음을 입증하기 위해, 생체내 HSPC 형질도입 후 20 주차에 수확된 골수 Lin- 세포를 HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR과 함께 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스(hCD46 이식유전자 없이)에 이식하였다. 2차 수용자에서 다중-계통 재구축을 구동하는 이식된 세포의 능력을 16 주 기간에 걸쳐 평가하였다. PBMC에서 CD46 발현에 기반한 생착률은 95%였고 안정적으로 유지되었다(도 29a). 유세포 분석에 의해 측정된 RBC의 γ-글로빈 마킹은 90 내지 95% 범위에 있었고 안정되었다(도 29b). γ-글로빈+ RBC의 백분율에서 두 벡터 사이에 유의한 차이는 없었다. 평균 통합 벡터 카피 수는 또한 장기간 재증식 세포에서 두 트랜스포존의 통합이 동일하게 효율적이었음을 나타내는 2 개의 벡터 사이에 유의하게 상이하지 않았다(도 29c). 흥미롭게도, 마우스 성체 글로빈 쇄에 대한 γ-글로빈의 백분율은 HDAd-긴-LCR 벡터가 마우스 α-글로빈의 20-25%에 도달하는 경우 시간 경과에 따라 증가하였다(도 29d 및 29e). 대조적으로, HDAd-짧은-LCR 형질도입된 골수 세포의 2차 수용자에서 γ-글로빈/마우스 α-글로빈의 백분율은 증가하지 않았다. γ-글로빈 발현 적혈구 세포의 백분율은 HDAd-긴-LCR에 대해 상당히 더 높았다(도 29f). 더 높은 γ-글로빈 발현 수준을 부여하는 것 외에도, 긴 LCR은 또한 비-적혈구 분획(Ter119-)에 비해 적혈구(Ter119+) 분획에서 γ-글로빈 발현 골수 세포의 상당히 더 높은 백분율에 의해 제시된 바와 같이 더 엄격한 적혈구-특이적 발현을 제공하였다(도 27h). 골수 MNC에서 세포 당 벡터 수 카피는 생체내 HSPC 형질도입 후 16 주차에 수확된 경우 HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR 사이에서 통계적으로 유의하지 않았다(도 27i). "1차" 생체내 HSPC 형질도입된 마우스에서와 같이, 골수의 세포 조성 또는 말초 혈액에서 혈액학적 매개변수에 대한 높은 수준의 글로빈 발현 효과는 관찰되지 않았다(도 30a - 30d).
인간 CD34+ 형질도입, 시험관내 선택, 및 적혈구 분화 후 2 개 백터의 비교.
마우스 적혈구 세포와 같은 이종 시스템에서 인간 β-글로빈 LCR의 분획은 LCR 내에 결합하는 전사 인자의 보존 결여로 인해 차선일 수 있다. 따라서 인간 세포에서 시험관내 연구를 수행하였다(도 31a). GCSF-동원된 건강한 공여자로부터 수득된 인간 CD34+ 세포를 4000 vp/세포의 총 MOI, 즉, 대부분의 CD34+ 세포의 형질도입을 부여하는 MOI에서 HDAd-긴-LCR + HDAd-SB 또는 HDAd-짧은-LCR + HDAd-SB로 형질도입하였다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 390-401, 2018). 그런 다음 형질도입된 세포를 통합된 이식유전자를 갖는 세포에 대해 적혈구 분화(ED) 및 O6BG/BCNU 선택에 적용하였다. 18 일에 걸쳐 형질도입된 세포의 확장 동안, 대부분의 에피솜 벡터는 손실된다. ED 종료 시, 유세포 분석에 의한 HDAd-긴-LCR + HDAd-SB 설정에 대해 상당히 더 높은 백분율의 γ-글로빈+ 유핵 세포(즉, 핵을 상실한 망상적혈구)가 발견되었다(도 31b). HPLC 분석은 또한 HDAd-긴-LCR + HDAd-SB-형질도입된 세포에서 상당히 더 높은 γ-글로빈 쇄 수준을 입증하였다(도 31c).
중간형 지중해빈혈 γ-글로빈 수준의 마우스 모델에서 HDAd-짧은-LCR vs HDAd-긴-LCR 생체내 HSPC 형질도입 연구 . 이러한 연구를 위해(4 차례 초과) (CD46+/+) 마우스를 마우스 Hbb-베타1 및 -베타2 유전자 결실에 대해 이형접합성인 Hbbth3 마우스와 교배하였다(Yoshida 등, Sci Rep 7:43613, 2017). 생성된 Hbbth3/CD46+/+ 마우스는 중간형 지중해빈혈에 대한 전형적인 표현형을 갖는다(Wang 등, J Clin Invest, 129: 598-615. 2019). Hbbth3/CD46+/+ 마우스를 동원하고, 정맥내로 HDAd-긴-LCR 및 HDAd-짧은-LCR 벡터 시스템을 주사하고, 4 주 후에 생체내 선택에 적용하였다(도 32a 및 32e). 중요하게는, 말초 적혈구의 γ-글로빈 마킹은 생체내 선택의 두번째 주기 후 이미 평균 40%에 도달하였고, 세번째 주기 후에 10 마리 마우스 중 9 마리에서 90% 초과에 도달하였고, HDAd-긴-LCR로 생체내 형질도입 후 12 주 차에 모든 마우스에서 거의 100%를 유지하였다(도 32b 및 32f). 대조적으로, HDAd-짧은-LCR로 형질도입된 마우스의 경우, 7 마리 마우스 중 2 마리의 RBC에서 100% γ-글로빈 마킹에 도달하기 위해 4 회 생체내 선택 주기가 필요하였고 100% 마킹은 형질도입후 16 주차에만 달성되었다. 100% 마킹률에서, 성체 마우스 α-글로빈 쇄보다 인간 γ-글로빈의 백분율(HPLC에 의해 측정)은 두 벡터에 대해 시간 경과에 따라 증가하여(대부분 질환 배경으로 인해) HDAd-긴-LCR 및 HDAd-짧은-LCR로 생체내 형질도입 후 16 주차까지 각각 평균 22%(max: 35%) 및 11%(max: 19%)에 도달하였다(도 32g 및 32h; 21 주 데이터의 경우 도 32c 및 32d). CD46tg 마우스에서 관찰된 것과 유사하게, 골수 단핵 세포의 분석은 두 벡터에 대해 비슷한 VCN을 나타내었고 HDAd-긴-LCR에 대한 적혈구 세포에서 더 높은 글로빈 발현 수준을 나타내었다(도 33). 요약하면, 이들 데이터는 i) 100% 마킹에 도달하기 위해 덜 강력한 생체내 선택을 필요로 하고 ii) RBC에서 γ-글로빈 수준을 달성함으로써 HDAd-짧은-LCR보다 HDAd-긴-LCR의 우수성이 이론적으로 SCD 및 주요 지중해빈혈 환자에서 치유력이 있어야 함을 입증한다.
혈액학적 매개변수의 교정. 표현형 교정은 상이한 시점에서 제시된다. 처리 전 및 긴 LCR로 처리 후 10 주차에 C57BL6 및 Townes SCA 마우스의 정규화된 적혈구 형태를 비교하는 현미경 사진(도 34) 및 처리 전 Townes 마우스, 및 긴 LCR로 처리 후 10 주차에 Townes 마우스에 대해 정규화된 적혈구생성(망상적혈구 계수)을 나타내는 현미경 사진이 제시된다(도 35). 14 주차에, Giemsa 염색 및 May-Grunwald 염색으로 염색된 혈액 세포 형태가 제시된다(도 36a). 처리 후 16 주차에, 마우스를 희생시켰다. 처리된 Hbbth3/CD46+/+ 마우스의 말초 혈액 도말에서 지중해빈형 표현형의 역전을 나타내는, 저변색성의 고도로 단편화된 부동변형적혈구증가적 기준선 RBC를 거의 정색성의 잘 형성된 RBC로 대체하였다(도 37a, 왼쪽 패널, 21 주 데이터의 경우 도 36b 참조). 말초 혈액에서 망상적혈구의 수준은 정상 CD46tg 마우스와 비슷하였다(도 37a, 오른쪽 패널, 또한 도 39 참조). 21 주에 대해 유사한 데이터는 도 36b의 오른쪽 패널에서 찾을 수 있다. 대조군 및 처리된 Hbbth3/CD46+/+ 마우스로부터의 사이토스핀에서, 호염기성 적혈구모세포의 유병률에 의해 나타낸 Hbbth3/CD46+/+ 마우스의 골수에서 적혈구 계통 성숙의 차단과 대조적으로, 골수 사이토스핀에서, 성숙 다염성 및 정염성 적혈구모세포가 우세하였다(도 37b, 21 주 데이터의 경우 도 36c 참조). 긴 LCR, 짧은 LCR, 및 대조군 CD46tg 벡터로 형질도입된 마우스의 정규화된 적혈구 매개변수가 제시된다(도 38). 생체내 형질도입 후 16 주차에 혈액학적 매개변수는 두 벡터에 대한 전처리 매개변수와 비교하여 유의하게 개선되었다(도 38, 39a). 백혈구, 적혈구, MCHC, MCV, 및 RDW-CV의 경우 이들은 CD46tg 대조군과 구별할 수 없었다(도 39a). 그러나, HDAd-짧은-LCR보다 HDAd-긴-LCR 벡터로 처리된 동물에 유리한 상당한 차이가 있으며, 구체적으로, 말초 혈액에서 망상적혈구의 백분율은 미처리, HDAd-짧은-LCR, 및 HDAd-긴-LCR-처리 Hbbth3/CD46+/+ 마우스에 대해 각각 40.9 vs 26.8 vs 9.2%였다(도 38). 또한, 헤모글로빈 수준 및 적혈구용적률은 HDAd-긴-LCR-처리 그룹에서 더 높았다.
골수외 조혈 및 혈철소증의 교정 . 보상 혈구형성의 측정가능한 특성인 비장 크기는 두 벡터로 처리된 동물에서 정상으로 감소되었고, 이에 의해 HDAd-긴-LCR 및 HDAd-짧은-LCR 사이에 유의한 차이는 없었다(도 40a). Hbbth3/CD46+/+ 마우스와 대조적으로, 골수외 적혈구생성의 병소는 HDAd-긴-LCR로 처리 후 비장 및 간 절편에서 관찰되지 않았고 제한된 골수외 적혈구생성만이 HDAd-짧은-LCR-처리된 마우스에서 검출되었다(도 40b). 비장 및 간에서 강렬한 혈철소증은 미처리 Hbbth3/CD46+/+ 마우스에서 우세하였다(도 41, 두번째 패널. 조직의 Perl 염색 후 신호는 CD46tg(도 41, 첫번째 패널( 및 HDAd-긴-LCR 처리된 Hbbth3/CD46+/+ 마우스(도 41, 세번째 패널)에 대해 비교적 낮았던 반면, 비장 조직 cm2 당 2.7(+/-0.8)-배 더 많은 청색 스팟이 HDAd-긴-LCR-처리된 동물보다 HDAd-짧은-LCR에 대해 계수되었다(N=5).
요약하면, HDAd-긴-LCR-처리된 동물에서 망상적혈구, 혈액 매개변수, 세포외 조혈 및 혈철소증은 대조군 CD46tg 마우스와 상당히 상이하지 않았으며, 이는 완전한 표현형 교정을 나타낸다. 또한, HDAd-긴-LCR은 여러 표현형 매개변수에서 지중해빈혈 마우스를 치유하는 데 있어서 HDAd-짧은-LCR보다 우수한 것으로 입증되었으며, 긴-LCR에서 발현된 더 높은 γ-글로빈 수준에 기인할 가능성이 더 높다.
인간 CD34+ 형질도입 및 적혈구 분화 후 2 개 벡터의 비교. 마우스에서 데이터를 통합하기 위해, 인간 세포에서 시험관내 연구를 수행하였다(도 31a). GCSF-동원된 건강한 공여자에서 수득된 인간 CD34+ 세포를 4000 vp/세포의 총 MOI, 즉, 대부분의 CD34+ 세포의 형질도입을 부여하는 MOI에서 HDAd-긴-LCR + HDAd-SB 또는 HDAd-짧은-LCR + HDAd-SB로 형질도입하였다(Yang 등, Proc Natl Acad Sci USA. 92(25):11608-12, 1995). 그런 다음 형질도입된 세포를 통합된 이식유전자를 갖는 세포에 대해 적혈구 분화(ED) 및 O6BG/BCNU 선택에 적용하였다. 18 일에 걸쳐 형질도입된 세포의 확장 동안, 대부분의 에피솜 벡터가 손실된다.
골수를 Hbbth3/CD46tg 마우스의 생체내 HSC 형질도입 후 21 주차에 수확하였다. (도 42a) 골수 MNC에서 세포 당 벡터 카피 수. 두 그룹 사이의 차이는 유의하지 않았지만 더 큰 샘플 크기로 분석하는 경우 유의하게 될 수 있다. (도 42b, 42c) γ-글로빈 발현의 적혈구 특이성. (도 42b) γ-글로빈 발현 적혈구(Ter119+) 및 비-적혈구(Ter119-) 세포의 백분율. *p<0.05. 통계적 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
아데노바이러스 공여자 벡터의 투여 전 CD46tg 및 CD46+/+/Hbbth-3 마우스의 간 및 비장 절편에서 헤마톡실린/에오신 염색에 의한 골수외 혈구형성(도 43). 철분 침착은 Perl 염색에 의해 비장에서 헤모시데린의 세포질 청색 색소로 제시된다.
ED 종료 시, γ-글로빈+ 제핵 세포(즉, 핵이 손실된 망상적혈구)의 상당히 더 높은 백분율이 유세포 분석에 의해 발견되었고(도 31b) 또한 HDAd-짧은-LCR보다 HDAd-긴-LCR 설정에서 HPLC에 의해 상당히 더 높은 γ-글로빈 쇄 수준이 발견되었다(도 31c). 18 일차에 측정된 벡터 카피 수는 두 벡터에 대해 2개였다(도 31d).
요약하면, 마우스를 사용한 생체외 및 생체내 HSPC 형질도입 연구 뿐만 아니라 인간 HSPC를 사용한 시험관내 연구는 혈색소병증의 유전자 요법에 대한 HDAd-긴-LCR의 연관성을 뒷받침한다.
논의 . 이 실시예는 백혈구분리반출술, 골수절제술 및 HSPC 이식을 필요로 하지 않는 생체내 HSPC 유전자 요법 접근법의 임상 개발과 관려된 작업을 기재한다(Richter 등, Blood. 128(18):2206-17, 2016). 이는 특히 고령의 환자 및 동반이환 환자에서 혈색소병증의 생체외 HSPC 유전자 요법에 대한 광범위한 적용에 중요한 장애물이다. 이 접근법의 안전성 및 효능은 여러 뮤린 질환 모델(Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019; Wang 등, Blood Adv. 3(19):2883-94, 2019; Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 9:390-401, 2018) 및, 최근에 비-인간 영장류(Li 등, 23rd Annual ASGCT meeting. 2020; abstract #546)에서 입증되었다. 두 종에서, 정맥내 HDAd5/35++ 주사와 연관된 주요 문제, 즉 급성 선천적 면역 반응은 전염증성 사이토카인을 차단하는 예방적 레지멘에 의해 해결되었다.
생체외 HSPC 유전자 요법 설정에서 주요 지중해빈혈 및 SCD 환자에서 치유적 γ- 또는 β-글로빈 발현 수준에 도달하는 것은 여전히 과제이다. 이는 HSPC 형질도입 과정을 최적화하거나 또는 감염 다중도를 증가시킴으로써 통합된 이식유전자 카피의 수를 증가시키는 접근법을 필요로 한다. 그러나, VCN을 증가시키는 것은 유전독성을 유도하는 위험이 있다. 다른 시도는 글로빈 발현 카세트를 추가로 최적화하는 데 초점을 맞춘다(Li 등, Cancer Res. 80(3):549-60, 2020). 높은-페이로드 용량 HDAd 벡터를 사용하면, 렌티- 및 rAAV 벡터에 대해 설정된 게놈 크기 제한을 넘어설 기회가 있다. 본 연구는 γ-글로빈의 치유적 수준이 총 길이가 29　kb인 β-글로빈 LCR/프로모터 요소를 수용하는 통합 HDAd5/35++ 벡터를 사용한 생체내 HSPC 유전자 요법에 의해 RBC에서 달성될 수 있음을 입증한다.
지중해빈혈 마우스에서, RBC에서 100% γ-글로빈 마킹은 HDAd-짧은-LCR 처리된 동물과 비교하여 HDAd-긴-LCR로 처리된 마우스의 초기 및 더 적은 주기의 O6BG/BCNU 생체내 선택로 달성되었다. 이는 접근법의 임상 번역에 중요하다. O6BG/BCNU 생체내 선택 시스템은 γ-글로빈 양성 RBC 백분율의 제어 증가를 허용하지만, 또한 일시적 백혈구감소증 및 GI-관의 부작용을 유발한다(Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019). HDAd-긴-LCR을 사용한 덜 강렬한 생체내 선택의 요건에 대한 잠재적 설명은 긴 LCR이 O6BG/BCNU에 대한 내성을 제공하는 mgmtP140K 유전자의 발현을 구동하는 EF1α 프로모터의 침묵을 방지한다는 것일 수 있다. 이 가설은 골수 MNC에서 mgmt mRNA 수준(VCN으로 정규화됨)이 HDAd-긴-LCR에 대해 상당히 더 높았다는 관찰에 의해 뒷받침된다(도 48).
이 연구는 HDAd-긴-LCR을 사용한 생체내 접근법의 치료 측면에 집중하였지만, 미래에 해결해야 할 다수의 기계적 문제가 남아 있다. 이러한 개방 질문 중 하나는 긴 LCR이 떨어져 있는 이웃 유전자의 전사활성화를 방지하는지 여부이다. 또한, mRNA 수준에서도 반영되는 HDAd-긴-LCR의 더 높은 γ-글로빈 발현 수준이 더 활성인 전사 개시 또는 통합 벡터 카피의 더 적은 침묵, 또는 둘 다에 기인하는지 여부는 완전히 명확하지 않다. HDAd-긴-LCR-처리된 Hbbth3/CD46 마우스에서, 2차 수용자에서 CD46tg 모델에서도 볼 수 있는 현상인 마우스 성체 글로빈 쇄에 대한 γ-글로빈의 백분율이 시간 경과에 따라 증가하였다는 관찰은 구체적으로 장기간 재증식 세포에서 침묵이 시간 경과에 따라 발생하였고 긴-LCR이 이에 대해 보호되었음을 나타낼 수 있다. 통합 벡터 카피 당 더 높은 mgmtP140K mRNA 수준(도 48)은 또한 긴-LCR이 침묵으로부터 보호한다는 가설을 뒷받침한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 추가 연구는 형질도입된 CD34+ 세포 클론에 초점을 맞추고 LAM-PCR/NGS(통합 부위), 염색체 형태 캡처 기술, 및 RNA-Seq를 사용한 게놈-와이드 분석을 포함할 것이다. 이러한 연구에 대한 전제조건은 SB100x 트랜스포사제-매개 이식유전자 통합 및 생체내 선택 과정이 원치않은 게놈 변경/재배열을 촉발하지 않는다는 것이다. 이를 평가하기 위한 시도에서, RNA-Seq를 시험관내에서 SB100x-매개 통합 및 O6BG/BCNU 선택 후 mgtm/GFP 이식유전자를 안정하게 발현하는 인간 CD34+ 세포 상에서 수행하였다(도 47a). 단지 176 개 유전자의 약간 변경된 발현은 우선적으로 히스톤 유전자를 발견하였다(도 47b). 이는 SB100x가 중요한 유전독성을 발휘하지 않음을 나타내며, 또한 통합 부위 분석에서 클론 우성의 부재 및 장기간 연구에서 혈액학적 부작용의 부재에 의해 뒷받침된다.
HDAd5/35++-기반 SB100x 시스템을 사용한 생체내 HSPC 형질도입/선택 후 16 내지 23 주차에 골수 MNC에서 분석된 통합된 이식유전자의 카피 수는 13.8(Wang 등, J Clin Invest. 129(2):598-615, 2019) 내지 32.4　kb 범위의 트랜스포존에 대해 세포 당 2 개 카피였다. 촉매적으로 프라이밍된 트랜스포존/트랜스포사제 복합체를 형성하기 위해, 트랜스포존의 2 개 단부는 트랜스포사제 분자에 의해 물리적으로 매우 가깝게 함께 유지되어야 한다(Uchida 등, Nat Commun. 10(1):4479, 2019). 이러한 제한은 frt 측면을 HDAd 벡터로 통합함으로써 해결되었고 공동 발현된 Flpe 재조합효소에 의해 인식되어 트랜스포존의 원형화로 이어진다(Turchiano 등, PLoS One. 9(11):e112712, 2014). 여기에 보고된 데이터는 이 과정이 HDAd5/35++ 벡터에 의해 운반되는 트랜스포존의 크기에 크게 의존하지 않고 통합을 이룰 수 있음을 시사한다.
이 연구는 확장된 TAD/LCR 코어 요소를 사용하는 것인 치료 이식유전자의 발현 수준을 증가시킴을 입증한다. β-글로빈 LCR은 수십 년 동안 연구되었지만, 다른 유전자/클러스터에 대한 TAD 코어 요소는 덜 특성화되었다. TAD의 중앙 크기는 880 kb이다. 고처리량 염색체 형태 캡처(3C) 검정 및 후속 4C, 5C 및 Hi-C 프로토콜 뿐만 아니라 섬유-Seq 검정의 추가 발전에 따라, 조절 게놈의 심문은 빠른 속도로 진행될 것이고, 유전자 요법 목적을 위해, 중요한 코어 요소만을 함유하는 TAD를 전달할 수 있다(Liu 등, BMC Genomics. 20(1):217, 2019).
요약하면, 현재 실시예는 마우스에서 HSPC의 생체내 형질도입을 위해 HDAd5/35++ 벡터의 맥락에서 더 큰 조절 요소를 이용하는 것이 주요 지중해빈혈 및 겸상 세포 빈혈에 대해 치유적인 것으로 생각된 유전자 발현 임계값을 충족하는 γ-글로빈 수준을 부여하는 벡터를 산출하였음을 나타낸다.
인간 β-글로빈 유전자 클러스터는 염색체 11에 있고
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100 kb에 걸쳐 있다. β-글로빈 유전자좌는 활성 염색질 hub(ACH)라고 불리는, 시스-조절 요소 및 활성 β-글로빈 유전자로 구성된 적혈구-특이적 공간 구조를 형성하는 것으로 제안되었다(Tolhius 등, Mol Cell, 10:1453-1465, 2002). 코어 ACH는 발달적으로 보존되고 글로빈 LCR이라고 불리는 상류 5' DNAse 과민성 영역 1 내지 5, 및 하류 3'HS1 뿐만 아니라 적혈구-특이적 트랜스작용화 인자로 이루어진다(Kim 등, Mol Cell Biol., 27:4551-65, 2007). 유전자 요법 적용을 위해, HS1 내지 HS5를 함유하는 23　kb β-글로빈 LCR 및 3　kb 3'HS1 영역은 유전자이식 마우스에서 시스-연결된 유전자에에 대한 높은 수준의 적혈구-특이적 위치 독립적 발현을 부여하였음에 유의한다(Grosveld, Cell, 51:975-985, 1987). 이 LCR의 제어 하에 이식유전자를 전달하는 도구는 30+ kb HDAd 벡터와 함께 이용가능하다.
많은 유전적 질환의 교정은 치료 유전자의 높은 수준 및 조직-제한된 발현을 필요로 하며, 이는 LCR을 이용함으로써 달성될 수 있다(Li 등, Blood 100: 3077-3086, 2002). β-주요 지중해빈혈 및 겸상 세포 빈혈의 치유를 위해, HSPC에서 약 20% 유전자 마킹 및 적혈구 세포에서 20% 치료-글로빈 쇄(β- 또는 γ-글로빈) 생산이 필요한 것으로 생각된다(Fitzhugh 등, Blood 130: 1946-1948, 2017). 크기 제한으로 인해, β-글로빈 LCR의 절두된 형태만이 유전자 발현 수준을 교정하기 위한 요건을 충족하기 어렵게 만드는 렌티바이러스 벡터에서 사용될 수 있다(Uchida, 등, Nat Commun 10: 4479, 2019). 렌티바이러스-매개 HSPC 형질도입 후 발현 수준을 증가시키는 전략은 벡터 용량 및 따라서 통합된 이식유전자 카피 수를 증가시키는 것이다. 그러나 이 접근법은 유전독성 및 종양 형성의 위험을 향상시킨다. 다른 시도는 글로빈 발현 카세트를 추가로 최적화하는 것에 초점을 맞춘다(Uchida, 등, (2019) Nat Commun 10: 4479). 삽입 용량이 30 kb인 HDAd 벡터는 후자 개념을 개발하기 위한 이상적인 도구이다. 이 실시예에서, 29 kb γ-글로빈 발현 카세트를 보유하는 HDAd5/35++ 벡터를 생성하고 CD46-유전자이식 마우스에서 시험관내 및 생체내 HSPC 형질도입 후 테스트하였다.
HDAd 벡터 시스템에서, γ-글로빈 카세트의 통합은 SB100x 트랜스포사제에 의해 매개된다. SB/트랜스포존 시스템을 사용한 비-바이러스 유전자 전달은 CD19 CAR T-세포 요법(Kebriaei 등, J Clin Invest 126: 3363-3376, 2016), 연령 관련 황반 변성(Hudecek 등, Crit Rev Biochem Mol Biol 52: 355-380, 2017; Thumann 등, Mol Ther Nucleic Acids 6: 302-314, 2017), 및 알츠하이머병(Eyjolfsdottir 등, Alzheimers Res Ther 8: 30, 2016)에 대해 임상적으로 사용되고 있다. HD-Ad 매개된 SB 유전자 전달은 Kay 및 Ehrhardt 그룹에 의해 개척되었다. 이들의 연구에서, 트랜스포존은 4 kb-6 kb로 상대적으로 작았다(Hausl 등, Mol Ther 18: 1896-1906, 2010; Yant 등, Nat Biotechnol 20: 999-1005, 2002). 현재 실시예는 SB100x가 비슷한 VCN(세포 당 2-3 개 카피)에 기반하여 11.8　kb 트랜스포존과 비슷한 효능으로 32.4 kb 트랜스포존을 통합할 수 있음을 처음으로 입증한다. 그 자체로 이 발견은 SB-매개 통합의 효능이 SB 트랜스포존의 크기와 역으로 상관관계가 있다는 관찰과 모순된다(Karsi 등, Mar Biotechnol (NY) 3: 241-245, 2001). 시스템은 크기 제한으로부터 해제된 것으로 보인다. 먼저, 촉매적으로 프라이밍된 트랜스포존/트랜스포사제 복합체를 형성하기 위해, 트랜스포존의 2개의 단부는 트랜스포사제 분자에 의해 물리적으로 매우 가깝게 함께 유지되어야 한다(Hudecek 등, Crit Rev Biochem Mol Biol 52: 355-380, 2017). 이 제한은 frt 측면을 HDAd 벡터로 통합함으로써 해결되었고 공동 발현된 Flpe 재조합효소에 의해 인식되어 트랜스포존의 원형화로 이어진다(Yant 등, Nat Biotechnol 20: 999-1005, 2002). 큰 작제물의 전위를 제한하는 두번째 메커니즘은 자동-통합, 즉, 트랜스포존 내부의 TA 디뉴클레오티드로의 통합이라 불리는 자살 전위 메커니즘이다(Wang 등, PLoS Genet 10: e1004103, 2014). HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR 사이의 VCN에서 보이지 않는 차이는 생체내 선택과 관련될 수 있으며, 특정 수준의 mgmtP140K 발현에 따라, 즉, 임계값 VCN에 도달된 세포의 경우 HSPC 및 전구체에 대해 풍부화된다.
강력한 O6BG/BCNU 생체내 선택 시스템으로 인해, 말초 혈액 적혈구의 거의 100%는 γ-글로빈을 함유하였다. 이 생체내 선택 접근법은 골수에서 세포 조성물에 영향을 미치지 않는 반면, 백혈구감소증을 초래한다. 따라서 세포독성 약물 BCNU를 수반하지 않는 대안적인 접근법에 대한 노력이 집중되고 있다. 특히, 뮤린 지중해빈혈 모델에서의 연구에 의해 뒷받침되는 바와 같이(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019), 유전자-교정된 HSPC가 교정되지 않은 세포보다 증식 이점이 있을 것이기 때문에 약제학적 생체내 선택은 혈색소병증 환자에서 필요하지 않을 수 있다(Perumbeti 등, Blood 114: 1174-1185, 2009).
1차 동물 및 2차 수용자에서 HDAd-짧은-LCR 및 HDAd-긴-LCR에 대한 비슷한 VCN을 고려하면, RBC 및 골수 적혈구 전구체에서 γ-글로빈 수준(HPLC 및 qRT-PCR에 의해 측정됨)은 긴 LCR을 함유하는 벡터에 대해 상당히 더 높았다. 흥미롭게도, 2 개 벡터 사이의 차이는 2차 수용자에서 더 명백하였다. 이는 형질도입된 장기간 재증식 HSPC로부터 유래된 RBC가 더 높은 γ-글로빈 수준을 갖는다는 것을 암시한다. 또한, HDAd-긴-LCR은 더 강한 적혈구 특이성을 나타내었다. 이러한 효과는 LCR의 염색질 개방 능력으로 인해(Li 등, Blood 100: 3077-3086, 2002) 전사 인자에 대한 더 나은 접근을 초래하는 HDAd-긴 LCR에서 추가적인 LCR 요소, 및/또는 γ-글로빈 유전자의 전사 증가를 초래하는 추가적인 전사 인자의 결합에 기여할 수 있다. LCR의 또 다른 특징은 주목할만하며, 즉, 자율적인 조절 단위로 작용할 수 있는 능력이며, 무작위 통합 후 이웃 유전자의 적은 전사활성화를 암시한다. 이 맥락에서 보다 완전한 LCR 버전을 사용하여 접근법에 대한 잠재적인 유전독성을 감소시킨다.
실시예 3. 내인성 태아 글로빈의 CRISPR-촉발된 재활성화 및 SB100x 트랜스포사제-매개 γ-글로빈 유전자 추가의 조합을 사용한 생체내 HSC 유전자 요법은 마우스 모델에서 겸상적혈구병을 치유한다.
태아 글로빈의 유전적 지속성을 갖는 환자 및, 보다 최근에, 유전자 요법 환자에서, 겸상적혈구병(SCD)의 표현형 교정 정도는 태아 γ-글로빈의 발현 수준과 상관관계가 있다. HDAd5/35++ 벡터를 사용한 생체내 조혈 줄기 세포/전구체(HSPC) 형질도입 후, SB100x 트랜스포사제-매개 γ-글로빈 유전자 추가는 성체 마우스 글로빈의 10-15% γ-글로빈을 달성하여, 중간형 지중해빈혈 마우스 모델에서 유의하지만 불완전한 표현형 교정을 초래하는 것으로 최근에 보고되었다. 또한 CRISPR/Cas9에 의해 γ-글로빈 프로모터 내에서 γ-글로빈 억제인자 결합 부위의 게놈 편집은 내인성 γ-글로빈의 효율적인 재활성화를 초래하는 것으로 제시되었다. 이 실시예는 이러한 2 가지 메커니즘을 조합하여 생체내 HSPC 형질도입 후 γ-글로빈의 치유적 수준을 수득한다.
두 모듈을 함유하는 HDAd5/35++ 아데노바이러스 벡터(HDAd-combo)를 생성하고 "건강한" CD46/β-YAC 마우스 및 SCD 마우스 모델(CD46/Townes)에서 시험관내 및 생체내 HSPC 형질도입 후 테스트하였으며, 여기서 뮤린 α- 및 β-글로빈 유전자를 인간 α-글로빈 및 인간 겸상 βS /태아 γ-글로빈 유전자로 대체하였다. 본 HDAd-combo는 표적 부위 절단 완료 후 Cas9 발현을 감소시키는 자기-활성화 메커니즘을 함유하였다. 이는 생체내에서 상당히 더 높은 절단 빈도를 초래하였으며, 더 나은 생존 CRISPR/Cas9-편집된 HSPC 때문일 가능성이 크다. 중요하게는, γ-글로빈 추가 또는 CRISPR/Cas9 재활성화 단위 단독을 함유하는 HDAd 벡터와 비교하여, HDAd-combo로 형질도입 후 상당히 더 높은 γ-글로빈이 RBC에서 발견되었다. combo 벡터로 CD46/Townes 마우스의 생체내 HSC 형질도입 후 13 주차에, 적혈구에서 γ-글로빈 수준의 수준은 성인 인간 α- 및 βS-쇄 수준의 30%였다. 이는 SCD의 완전한 표현형 교정을 초래하였다.
도입:
SCD 유전자 요법: 겸상적혈구병 및 β-지중해빈혈은 전 세계적으로 가장 흔한 단일유전자성 장애이며, 매년 317,000 명의 영향을 받은 신생아가 태어난다. SCD는 b-글로빈 유전자의 첫번째 엑손(βs 대립유전자) 상의 단일 돌연변이에 의해 유발되어, 결함이 있는 헤모글로빈 사량체의 형성을 초래하여, 낮은 산소 농도에서 중합되어, 적혈구 파괴로 이어진다. SCD는 실질적 이환율, 낮은 삶의 질, 및 기대 수명 단축과 연관된다. SCD의 임상 과정은 태아 γ-글로빈 유전자가 HPFH 특성이 있는 환자에서 볼 수 있는 바와 같이 고도로 발현될 때 개선된다(Conley 등, Blood 21: 261-281, 1963; Stamatoyannopoulos 등, Blood 46: 683-692, 1975). SCD에서, γ-글로빈은 Hb 사량체에 혼입을 위해 겸상 β-글로빈과 경쟁하고 겸상 헤모글로빈(HbS) 중합을 억제함으로써 강력한 겸상 방지 기능을 발휘한다. HbF 수준을 증가시키는 약리학적 치료는 모든 환자에서 동일하게 효과적이지 않다. β-혈색소병증에 대한 유전자 요법의 개발은 일치하는 공여자의 제한된 이용가능성 및 가장 어린 환자에게 HSPC 이식 적용의 좁은 창에 의해 정당화되었다. 현재 SCD 유전자 요법 접근법은 HSPC의 수집, 이들의 시험관내 배양, 온전한 β-글로빈, 겸상 방지 β-글로빈 또는, 태아 γ-글로빈 발현 카세트를 보유하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입, 및 골수-조건화된 환자로 재이식을 수반한다. γ-글로빈 유전자 추가 렌티바이러스 벡터를 사용한 I 상 유전자 요법 시험이 유망하지만, 모든 SCD 증상의 장기간 치유는 아직 달성되지 않았다(Demirci 등, Hum Mol Genet., 2020. doi: 10.1093/hmg/ddaa088). 질환의 치유를 위해, RBC에서 γ-글로빈 수준은 성인 α-글로빈의 적어도 20%이어야 하고, 최적으로, βS 수준은 감소되어야 한다. 이는 전장 글로빈 LCR 또는 다중-양식 게놈 편집 카세트의 사용을 방지하는 삽입 크기 제한으로 인해, 렌티-바이러스 벡터로 달성하기 어렵다(Uchida 등, Nat Commun 10: 4479, 2019).
생체내 HSPC 유전자 요법 - γ-글로빈 유전자 추가: 생체외 HSPC 유전자 요법의 주요 위험은 이식 관련된 이환율이다(Anurathapan 등, Biol Blood Marrow Transplant 20: 2066-2071, 2014; Lucarelli 등, Blood Rev 16: 81-85, 2002; Storb 등, Hematology Am Soc Hematol Educ Program: 372-397, 2003). 또한, 렌티바이러스 벡터의 사용은 이식유전자 발현이 침묵되거나 또는 염색체 원종양형성 유전자가 활성화되는 위험이 있다. 중요하게는, 접근법은 복잡하고, 값이 비싸며, 따라서 SCD가 만연한 제한된 자원을 가진 나라에서 수행하기 어렵다. 간단한 생체내 HSPC 유전자 요법 접근법이 개발되었다. 이는 HSPC를 골수에서 말초 혈류로 동원하기 위한 GCSF/AMD3100의 피하 주사 및 통합 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터 시스템인 HDAd5/35++ 벡터의 정맥내 주사를 수반한다. 이들 벡터는 30+kb의 삽입 용량을 가지며 원시 HSPC 상에서 발현되는 수용체인 CD46을 표적화한다(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016). 정맥내 HDAd5/35++ 주사와 연관된 선천적 독성은 마우스 및 비-인간 영장류에서 글루코코르티코이드, IL6- 및 IL1β-수용체 길항제 전처리에 의해 제어될 수 있다(Li 등, 23rd Annual ASGCT meeting. 2020; abstract #546) 무작위 이식유전자 통합은 활성-향상된 잠자는 미녀 트랜스포사제(SB100x)에 의해 매개된다(Boehme 등, Mol Ther Nucleic Acids 5: e337, 2016). 이 시스템에서, 이식유전자 카세트는 SB100x 트랜스포사제에 의해 인식되는 도립 반복부(IR), 및 Flp 재조합효소의 존재 하에 이식유전자 카세트의 원형화를 허용하는 frt 부위에 의해 플랭킹된다. 제2 벡터인 HDAd-SB는 Flp 재조합효소 및 SB100x를 트랜스로 공급하여 GFP 카세트의 게놈 DNA의 TA 디뉴클레오티드로의 통합을 매개한다(Mates 등, Nat Genet 41: 753-761, 2009). HDAd5/35++ 벡터를 사용한 이전 연구에서, 4.3　kb HS1-HS4 미니-LCR(β-글로빈 유전자좌 제어 영역)을 0.66　kb β-글로빈 프로모터와 조합하여 사용하여 생체내 HSPC 형질도입 후 인간 γ-글로빈 발현을 구동하였다(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019; Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018). Hbbth3/CD46+/+ 지중해빈혈 마우스에서, 안정된(8 개월 초과) γ-글로빈 마킹은 말초 혈액 적혈구의 거의 100% 및 거의 완전한 표현형 교정에서 달성되었다(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019). 그러나, γ-글로빈 발현 수준은 세포 당 2 개 카피의 평균 통합 벡터 카피 수(VCN)를 갖는 성체 마우스 α-글로빈 수준의 단지 10-15%였으며, 따라서 특히 과제인 SCD에 대한 접근법의 임상 번역을 제공한다.
생체내 HSPC 유전자 요법 - 내인성 γ-글로빈의 재활성화: 양성 유전적 상태인 태아 헤모글로빈(HPFH)의 유전적 지속성에서, 돌연변이는 γ에서 β로의 글로빈 전환을 약화시켜, 일생에 걸쳐 높은 태아 글로빈(HbF) 수준을 유발하여 이러한 장애의 임상적 징후를 완화시킨다(Forget, Ann N Y Acad Sci 850: 38-44, 1998). β-글로빈 유전자좌 내에서 큰 결실을 생성하거나(Sankaran, Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2011: 459-465, 2011), 또는 HBG 프로모터에 돌연변이를 도입함으로써 HPFH 돌연변이를 다시 일으키려 시도하는 초기 연구는 적혈구 세포에서 HbF의 수준을 증가시킬 수 있다(Wienert 등, Nat Commun 6: 7085, 2015; Traxler 등, Nat Med 22: 987-990, 2016; Lin 등, Blood 130: 284, 2017). 태아 글로빈 억제인자로서 BCL11A의 발견으로, 이러한 시도는 HBG 프로모터 내에서 BCL11A 결합 부위의 표적화된 파괴(Masuda 등, Science 351: 285-289, 2016) 또는 CRISPR/Cas9 또는, 최근에, 염기 편집기(Zeng 등, Nat Med 26: 535-541, 2020)에 의해 BCL11A 발현을 감소시키는 적혈구 bcl11a 인핸서의 파괴(Wu 등, Nat Med 25: 776-783, 2019)를 수반하는 데 더욱 집중하게 되었다. HBG1/HBG2 프로모터 표적화된 CRISPR/Cas9를 이용하여 인간 β-글로빈 유전자좌-유전자이식(β-YAC) 마우스에서 γ-글로빈을 재활성화하였다(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018). 생체내 HSPC 형질도입 후, HSPC의 2차 이식 후 유지된 성체 마우스의 적혈구에서 인간 β-에서 γ-글로빈 발현으로의 명백한 전환을 초래하는 효율적인 표적 부위 파괴를 입증하였다. 장기간 추적 연구에서, 혈액학적 이상은 검출되지 않았으며, 이는 HBG 프로모터 편집이 조혈에 부정적으로 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
HDAd5/35++ 벡터로부터 CRISPR/Cas9의 발현은 줄기 세포 기능 및 형질도입된 HSPC, 구체적으로 인간 HSPC의 생존을 손상시킬 수 있는 있음이 이전에 보고되었다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 390-401, 2018). 따라서, CRISPR/Cas9 발현을 단축하기 위한 접근법이 개발되었다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 390-401, 2018; Li 등, Mol Ther 27: 2195-2212, 2019).
여기서, 목표는 β-YAC 마우스 뿐만 아니라 Tim Townes에 의해 개발된 겸상적혈구병의 마우스 모델(hα/hα::βS/βS)에서 SB100x-매개 γ-글로빈 유전자 추가 및 γ-글로빈의 재활성화를 조합함으로써 생체내 HSPC 형질도입 후 γ-글로빈의 치유적 수준을 달성하는 것이었다(Wu 등, Blood 108: 1183-1188, 2006). 이 모델에서, 뮤린 α-글로빈 유전자를 인간 α-글로빈으로 대체하였고 뮤린 성체 β-글로빈 유전자를 함께 연결된 인간 겸상 βS 및 태아 γ-글로빈 유전자로 대체하였다. 이 모델은 겸상적혈구병의 주요 표현형 특징을 나타낸다.
재료 및 방법
시약: G-CSF(Neupogen™)(Amgen 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재) 및 AMD3100(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재)을 사용하였다. O6-BG 및 BCNU는 Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스 소재)로부터 수득하였다.
HDAd 벡터: HDAd-CRISPR("cut"), HDAd-SB-추가("add") 및 HDAd-SB는 이전에 기재되었다(Li 등, Blood 131(26):2915-2928, 2018; Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019). pHCA-combo의 클로닝은 3 단계를 수반하였다. 단계 1) HBG1/2 프로모터 영역에서 BCL11A 결합 부위를 표적화하는 sgHBG#2(서열번호: 258)를 합성하고, 어닐링하고 pSPgRNA(Addgene, 매사추세츠주 케임브리지 소재)의 BbsI 부위에 삽입하여, pSP-sgHBG#2를 생성하였다. pSP-sgHBG#2에서 0.4　kb U6-sgHBG#2 단편을 증폭시키고 pBST-sgAAVS1-miR의 BamHI 부위로 클로닝하여(Li 등, Mol Ther 27: 2195-2212, 2019), pBST-sgHBG#2-miR을 수득하였다. 단계 2) 1.5　kb PGK-mgmt-bGHpolyA 단편을 gBlock(IDT, 뉴저지주 뉴어크 소재)으로 합성하고 ClaI-소화된 pBS-LCR-글로빈-mgmt와 결찰시켜(Li 등, Mol Ther 27: 2195-2212, 2019), pBS-LCR-글로빈-PGK-mgmt를 수득하였다. 다음으로, pBS-Frt-IR 영역을 함유하는 4.8　kb 서열을 pBS-FRT-IR-Ef1α-mgmt로부터 증폭시키고(Li 등, Cancer Res 80: 549-560, 2020) EcoRV-KpnI 소화된 pBS-LCR-글로빈-PGK-mgmt와 결찰시켜, pBS-Frt-IR-LCR-글로빈-PGK-mgmt를 야기하였다. 이 단계에서 나중 주입 클로닝을 위한 15 bp 상동성 아암 (HA)을 함유하는 프라이머(Takara, 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)를 사용하였다. 2 개의 Frt-IR 구성요소에 플랭킹하는 2 개의 15 bp HA는 PacI 소화 시 노출되어 하기 기재된 변형된 pHCA 작제물을 사용한 재조합을 용이하게 할 수 있다. 단계 3) pHCAS1S-MCS의 5.3　kb XbaI 단편(Li 등, Mol Ther 27: 2195-2212, 2019)을 XbaI 제한에 의해 검출하고 재결찰시켜, pHCAS1S1-MCS를 생성하였다. U6 프로모터에서 시작하여 SV40 polyA 신호 서열까지 7.6　kb CRISPR 카세트를 pBST-sgHBG#2-miR로부터 증폭시키고 pHCAS1S1-MCS의 NheI 부위에 클로닝하여, pHCAS1S1-MCS-sgHBG#2를 형성하였다. 마지막으로, pBS-Frt-IR-LCR-글로빈-PGK-mgmt에서 12.0　kb HA-플랭킹된 글로빈/mgmt 카세트를 PacI 처리에 의해 방출시키고 PacI-소화된 pHCAS1S1-MCS-sgHBG#2와 재조합하여, pHCA-combo를 초래하였다. 최종 작제물을 여러 제한 효소(HindIII, EcoRI 및 PmeI)에 의해 스크리닝하고 이식유전자를 함유하는 전체 영역을 서열분석함으로써 확인하였다.
HDAd5/35++ 벡터의 생산을 위해, 상응하는 플라스미드를 PmeI로 선형화하고 Ad5 섬유 꼬리, Ad35 섬유 샤프트, 및 친화도-향상된 Ad35++ 섬유 놉으로 구성된 키메라 섬유를 함유하는 Ad5/35++ 헬퍼 벡터인 AdNG163-5/35++(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016)를 사용하여 116 세포를 구제하였다(Palmer & Ng, Mol Ther 8: 846-852, 2003). HD-Ad5/35++ 벡터를 다른 곳에 상세하게 기재된 바와 같이 116 세포에서 증폭시켰다(Palmer & Ng, Mol Ther 8: 846-852, 2003). 헬퍼 바이러스 오염 수준은 0.05% 미만인 것으로 밝혀졌다. 역가는 2-5x1012 vp/ml였다.
본 실시예의 벡터는 도 101에 예시되어 있고, (i) 트랜스포존에 존재하는 γ-글로빈 이식유전자를 암호화하는 핵산("add") 및 (ii) 트랜스포존에 존재하지 않는, 내인성 γ-글로빈의 발현을 증가시키기 위해 HBG1/2을 표적화하는 CRISPR/Cas9 시스템을 암호화하는 핵산("CRISPR")을 둘 다 포함하는 HDAd 조합 아데노바이러스 벡터를 포함한다(둘은 함께 "조합"을 형성한다). 이중 벡터와 관련한 추가 개시내용에 대해, 또한 도 96, 102, 97a-97d, 98a-98n, 99a-99u를 참조한다).
구체적으로, 도 96은 CRISPR 시스템이 2 개의 상이한 부위(HBG 프로모터 및 적혈구 bcl11a 인핸서)를 표적화하여, 증가된 감마 재활성화로 이어지는 HDAd-TI-combo 벡터의 개략도를 나타낸다. 도 102는 HDAd-combo에서 Flpe 재조합효소와 frt 부위의 상호작용이 어떻게 트랜스포존의 원형화로 이어져, CRISPR 카세트를 함유하는 벡터의 선형 단편을 남기는지를 나타낸다. SB100x/Flpe 시스템을 사용한 이전 연구는 원형화된 트랜스포존이 SB100x에 의해 숙주 게놈 내로 통합되는 동안 이러한 벡터 부분이 빠르게 손실된다는 것을 입증하였다(Yant 등, Nat Biotechnol., 20: 999-1005, 2002). 도 97a는 HDAd-SB 및 HDAd-combo의 공동 감염시, Flpe이 어떻게 발현되고 IR-플랭킹된 트랜스포존을 방출한 다음, SB100x 트랜스포사제에 의해 게놈 내로 통합될 것인지를 나타낸다. 동시에, HBG1 및 bcl11a-E CRISPR은 발현되고 DNA indel을 생성하여 γ-글로빈의 재활성화로 이어질 것이다. 트랜스포존의 Flp-매개 방출 시, CRISPR 카세트는 분해되어, 세포독성을 피할 것이다. CRISPR 시스템은 2 개의 상이한 부위(HBG 프로모터 및 적혈구 bcl11a 인핸서)를 표적화하여, γ 재활성화 증가로 이어진다. 표적화 전략(도 97b), 적혈구 특이적 BCL11A 인핸서(도 97c), 및 HBG 프로모터서의 BCL11A 결합 부위(도 97d)가 또한 제시된다.
이중 CRISPR 벡터 및 γ-글로빈 재활성화는 도 98a-98n에 제시된다. HDAd-Bcl11ae-CRISPR, HDad-HBG-CRISPR, HDAd-Dual-CRISPR, HDAd-스크램블(도 98a) 및 이중 gRNA 벡터에 대한 HD-Ad5/35++ CRISPR 벡터(도 98b)에 대한 벡터 설계가 제시된다. 인간 적혈구 전구체 세포주(HUDEP-2)의 HD-Ad5/35++ CRISPR 형질도입은 도 98c에서 분화 전 및 후로 제시된다. HD-AD5/35++ "Dual" gRNA 벡터는 미처리(UNTR), BCL11A, 또는 HBG 벡터와 비교하여 세포 생존력(도 98d) 또는 증식(도 98e)에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 이중 벡터는 표적 유전자좌(도 98f) Bcl11a 인핸서 및 (도 98g) HBG 프로모터에 대한 단일 gRNA 벡터로 관찰된 것들과 유사한 유사한 편집 수준을 달성한다. 또한, HD-AD5/35++ "Dual" gRNA 벡터는 단일 gRNA 벡터로 관찰된 것들과 유사한 표적 유전자좌의 편집 수준을 달성한다(도 98h). HbF+ 세포의 상당히 더 높은 백분율은 단일 gRNA 벡터와 비교하여 HD-Ad5/35 "Dual" gRNA 벡터로 형질도입된 HUDEP-2 세포에서 유세포 분석에 의해 관찰되었다(도 98i). HPLC에 의해 측정된 전반적인 감마 글로빈 발현은 이중 표적화된 샘플에서 상당히 더 높았다(도 98j). 단일 녹아웃 클론보다 이중 녹아웃 클론에서 상당히 더 큰 태아 글로빈 발현이 관찰되었으며 2 개 돌연변이의 가능한 상승적 효과를 암시하며, 더 높은 감마 발현/세포로 이어진다(도 98k). 도 98l은 말초 혈액 동원된 CD34+ 세포가 HDAd5/35++ CRISPR 벡터로 형질도입되었음을 나타낸다. CRISPR/Cas9 세포독성을 최소화하기 위해, 이어서 세포를 항-Cas9 펩티드를 발현하는 HDAd5/35++ 벡터로 후속적으로 형질도입하였다. 세포를 준-치명적으로 조사된 NSG 마우스 내에 이식하고 분석하였다. 이식 후 10 주차에, HD-Ad5/35 "Dual" gRNA 벡터로 형질도입된 세포는 단일 gRNA 벡터로 형질도입된 세포와 유사한 생착을 나타내었다. 계통 조성은 모든 그룹에서 유사하였다(도 98m). 이중 gRNA 벡터에 의해 형질도입되고 편집된 CD34+ 세포는 NSG 마우스에 효율적으로 주입되었다(도 98n). 또한, 적혈구 분화 후 주입된 이중 표적화된 세포는 상대적으로 더 낮은 편집 수준에도 불구하고, 단일 표적화된 세포와 비교하여, 대조군에 대해 더 높은 수준의 감마 글로빈을 발현하였다(도 9n).
이중 편집된 정상 및 thal CD34+ 세포의 생체외 형질도입에 대한 실험 설계는 도 99a에 제시된다. 정상 CD34+ 세포에 대해 15 일째에 콜로니에서 HBF 발현(도 99b), MFI(도 99c), 및 HBF 발현을 설명하는 유세포 분석 데이터(도 99d)가 제시된다. 정상 CD34+ 세포에 대해 적혈구 분화(ED) 후 HBF 발현(도 99e) 및 MFI(도 99f)가 제시된다. HBG 부위에 대한 TE71(도 99g) 및 BCL11A 부위에 대한 TE71(도 99h)은 정상 CD34+ 세포에서 형질도입(txd) 후 48 시간에 제시된다. EC에서 HBF 발현 및 적혈구 분화를 설명하는 유세포 분석 데이터는 도 99i에서 찾을 수 있다. 도 99j-99u는 Thal CD34+ 세포에서의 결과를 제시한다. 0 일차에 세포의 면역표현형, 형질도입되지 않은 세포 및 CRISPR-Dual로 형질도입된 세포(도 99j) 및 11 일에 걸쳐 형질도입되지 않은 세포 및 CRISPR-Dual로 형질도입된 세포를 비교하는 성장 곡선(도 99k). HBF 발현(도 99l) 및 MFI(도 99m)는 15 일째에 콜로니에서 제시된다. EC에서의 HBF 발현(도 99p), MFI(도 99q), 및 HBF 발현 및 P04 및 P18을 설명하는 유세포 분석 데이터(도 99r)가 또한 제시된다. p04(도 99s) 및 p18(도 99t)에서 HBG 부위 적혈구 분화에 대한 TE71이 제시되는 반면 도 99u는 형질도입 48 시간 후 BCL11A 부위에 대한 TE71을 제시한다.
HUDEP-2 세포/적혈구 분화: HUDEP-2 세포(Kurita 등, PLoS One 8: e59890, 2013)를 100 ng/ml SCF, 3 IU/ml EPO, 10-6 M 덱사메타손 및 1　μg/ml 독시사이클린(DOX)이 보충된 StemSpan SFEM 배지(STEMCELL Technologies)에서 배양하였다. 적혈구 분화를 5% 인간 AB 혈청, 100 ng/ml SCF, 3 IU/ml EPO, 10　μg/ml 인슐린, 330　μg/ml 트랜스페린, 2 U/ml 헤파린 및 1 μg/ml DOX를 함유하는 IMDM 배지에서 6 일 동안 유도하였다.
콜로니-형성 단위(CFU) 검정: 계통 마이너스(Lin-) 세포를 제조업체의 지침에 따라 마우스 계통 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 골수 MNC에서 계통-수임 세포의 고갈에 의해 단리하였다. CFU 검정을 제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 완전 배지와 함께 ColonyGEL(Reachbio, 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 수행하였다. 콜로니를 플레이팅 10 일 후 점수매겼다.
T7EI 불일치 뉴클레아제 검정: 게놈 DNA를 제공된 프로토콜에 따라 PureLink Genomic DNA 미니 키트(Life Technologies, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 단리하였다(Miller 등, Nat Biotechnol 25: 778-785, 2007). HBG1/2 프로모터의 표적화된 부위를 포함하는 게놈 분절을 다음 PCR 프라이머에 의해 증폭시켰다: HBG1/2 정방향(서열번호: 270), 역방향(서열번호: 271). PCR 생성물을 혼성화하고 37℃에서 20 분 동안 2.5 단위의 T7EI(NEB)로 처리하였다. 소화된 PCR 생성물을 10% TBE PAGE(Bio-Rad)로 분해하고 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 100 bp DNA 래더(New England Biolabs)를 사용하였다. 밴드 강도를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 절단율 % = (1-sqrt(모체 밴드/(모체 밴드 + 절단된 밴드)) x 100%.
유세포 분석: 세포를 1　% FCS가 보충된 PBS에 1x106 개 세포/100　μL로 재현탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 FcR 차단 시약(Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 오번 소재)과 함께 배양하였다. 다음으로 염색 항체 용액을 106 개 세포 당 100　μL로 첨가하고 암실에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 FACS 완충액(PBS, 1%　FBS)에서 1 회 세척하였다. 2차 염색을 위해 염색 단계를 2차 염색 용액으로 반복하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 분석하였다. 파편을 전방 산란 영역 및 측방 산란 영역 게이트를 사용하여 제외하였다. 그런 다음 단일 세포를 전방 산란 높이 및 전방 산란 폭 게이트를 사용하여 게이팅하였다. 그런 다음 유세포 분석 데이터를 FlowJo(버전 10.0.8, FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. LSK 세포의 흐름 분석을 위해, 세포를 비오틴-접합된 계통 검출 칵테일(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)(cat #: 130-092-613) 및 c-Kit(cat #:12-1171-83) 및 Sca-1(cat #: 25-5981-82)에 대한 항체 뿐만 아니라 APC-접합된 스트렙타비딘으로 염색하였다. eBioscience(캘리포니아주 샌디에이고 소재)의 다른 항체는 항-마우스 LY-6A/E(Sca-1)-PE-Cyanine7(클론 D7), 항-마우스 CD117(c-Kit)-PE(클론 2B8), 항-마우스 CD3-APC(클론 17A2)(cat #:17-0032-82), 항-마우스 CD19-PE-Cyanine7(클론 eBio1D3)(cat #: 25-0193-82), 및 항-마우스 Ly-66(Gr-1)-PE(클론 RB6-8C5)(cat #: 12-5931-82을 포함하였다. 항-마우스 Ter-119-APC(클론: Ter-119)(cat #: 116211)는 Biolegend(캘리포니아주 샌디에이고 소재)로부터 수득하였다.
인간 γ-글로빈 발현을 검출하는 세포내 유세포 분석: FIX & PERMTM 세포 투과화 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따랐다. 간단히 말해서, 1x106 개의 세포를 100　μl FACS 완충액(1%　FCS가 보충된 PBS)에 재현탁하고, 100　μl의 시약 A(고정 배지)를 첨가하고 실온에서 2-3 분 동안 배양한 다음, 1　ml 미리 냉각된 절대 메탄올을 첨가하고, 혼합하고 10 분 동안 암실에서 얼음 위에서 배양하였다. 그런 다음 샘플을 FACS 완충액으로 세척하고 100　μl 시약 B(투과 배지) 및 1　μg 헤모글로빈 γ 항체(Santa Cruz Biotechnology, cat# sc-21756 PE)에 재현탁하고, 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 분석하였다.
글로빈 HPLC: 개별 글로빈 쇄 수준을 SPD-10AV 다이오드 어레이 검출기 및 LC-10AT 바이너리 펌프가 장착된 Shimadzu Prominence 기기에서 정량화하였다(Shimadzu, 일본 쿄토 소재). 폴리펩티드에 대한 Vydac 214TP™ C4 역상 칼럼(214TP54 Column, C4, 300 Å, 5 μm, 4.6 mm i.d. x 250 mm)(Hichrom, 영국 소재)을 사용하였다. 물/아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산의 40%-60% 구배 혼합물을 1　mL/분의 속도로 적용하였다.　
벡터 카피 수의 측정: 세포 당 아데노바이러스 게놈 카피의 절대 정량화를 위해, 게놈 DNA를 제공된 프로토콜에 따라 PureLink Genomic DNA 미니 키트(Life Technologies)를 사용하여 세포로부터 단리하고, power SYBRTM green PCR 마스터 믹스(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행된 qPCR에 대한 주형으로 사용하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: 인간 γ-글로빈 정방향(서열번호: 195), 및 역방향(서열번호: 196); mgmt 정방향(서열번호: 220), 및 역방향(서열번호: 221).
실시간 역전사 PCR: 총 RNA를 5x10^6 개의 분화된 HUDEP-2 세포 또는 100　μl 혈액으로부터 제조업체의 페놀-클로로포름 추출 방법에 따라 TRIzolTM 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 추출하였다. Quantitect 역전사 키트(Qiagen) 및 power SYBRTM green PCR 마스터 믹스(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 실시간 정량적 PCR을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(AB Applied Biosystems)에서 수행하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: 마우스 RPL10(하우스키핑) 정방향(서열번호: 189), 및 역방향(서열번호: 190); 인간 γ-글로빈 정방향(서열번호: 191), 및 역방향(서열번호: 192); 인간 β-글로빈 정방향(서열번호: 216), 및 역방향(서열번호: 217); 마우스 β-주요 글로빈 정방향(서열번호: 193), 및 역방향(서열번호: 194), 마우스 α 글로빈 정방향(서열번호: 212), 및 역방향(서열번호: 213).
Cas9 웨스턴 블롯: 3x106 개의 HUDEP-2 세포를 형질도입 후 다양한 시점에서 수확하고, PBS로 2 회 세척하고, 5% β-머캅토에탄올이 함유된 Laemmli 완충액으로 용해시켰다. 샘플을 95℃에서 5 분 동안 끓이고 13,000　g에서 10 분 동안 원심분리에 의해 정화시켰다. 10　μL의 용해물을 4-15% 프리캐스트 단백질 겔(Bio-Rad)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 블롯의 Cas9 단백질을 항-Cas9-HRP(클론 7A9-3A3)에 의해 프로빙하였다(Cell Signaling Technology, 매사추세츠주 댄버스 소재). Pierce™ ECL Plus 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Fisher Scientific)로 처리 후 X-선 필름 상에서 화학발광 검출을 수행하였다. Cas9 검출 후, 블롯을 스트립하고 내부 대조군을 위해 Sigma-Aldrich의 항-β-액틴 항체(클론 AC-74)에 의해 다시 프로빙하였다.
동물: 동물을 수반하는 모든 실험은 워싱턴 대학에 의해 제시된 기관 지침에 따라 수행하였다. 워싱턴 대학은 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회(AALAC) 공인 연구 기관이며 이 대학에서 수행된 모든 살아있는 동물 작업은 실험실 동물 복지국(OLAW) 공중 보건 보증(PHS) 정책, USDA 동물 복지법 및 규정, 실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 정책을 따른다. 연구는 워싱턴 대학 IACUC(프로토콜 번호 3108-01)에 의해 승인되었다. 인간 CD46 게놈 유전자좌를 함유하고 인간과 유사한 수준 및 패턴에서 CD46 발현을 제공하는 C57Bl/6 기반 유전자이식 마우스(hCD46+/+ 마우스)는 초기에 기재되었다(Kemper 등, Clin Exp Immunol 124: 180-189, 2001). 야생형 248 kb β-글로빈 유전자좌 효모 인공 염색체(β-YAC)를 보유하는 유전자이식 마우스를 사용하였다(Peterson 등, Ann N Y Acad Sci 850: 28-37, 1998). β-YAC 마우스를 인간 CD46+/+ 마우스와 교배시켜 생체내 HSPC 형질도입 연구를 위한 β-YAC+/-/CD46+/+ 마우스를 수득하였다. 다음 프라이머를 마우스의 유전형 분석에 사용하였다: CD46 정방향(서열번호: 233), 및 역방향(서열번호: 234); β-YAC(γ-글로빈 프로모터) 정방향(서열번호: 242), 및 역방향(서열번호: 243).
겸상적혈구병 마우스 모델: Townes 수컷 마우스(Hbb tm2(HBG1,HBB*)Tow 또는 hα/hα::βS/βS)를 Jackson Laboratory(JAX 스톡 #013071)로부터 수득하고 인간 CD46 유전자이식 암컷 마우스와 교배시켰다. 도 109a에 제시된 바와 같이, 3 차례의 교배 후, CD46, HbS 및 HBA에 대해 동형접합성인 마우스를 수득하고 실험에 사용하였다. 다음 프라이머를 유전형 분석에 사용하였다: HBB 프라이머(서열번호: 246, 251, 및 70), 및 HBA 프라이머(서열번호: 272-274); 및 상기 제시된 바와 같은 CD46 프라이머(서열번호: 233 및 234). PCR 결과는 공급처에 의해 제공된 프로토콜에 따라 해석하였다.
HSPC 동원 및 생체내 형질도입: HSPC를 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사(5　μg/마우스/일, 4 일) 이어서 5 일째에 AMD3100의 s.c. 주사(5　mg/kg)에 의해 마우스에 동원하였다. 또한, 동물은 바이러스 주사 16 시간 및 2 시간 전에 덱사메타손(10 mg/kg)을 i.p.로 받았다. AMD3100 후 30 및 60 분에, 동물에게 주사 당 4x1010 개 바이러스 입자(vp)의 용량으로 안와하정맥총을 통해 바이러스 벡터를 정맥내로 주사하였다.
생체내 선택: 선택은 형질도입 후 1 주차(Townes 모델) 또는 4 주차(β-YAC 모델)에 시작하였다. 마우스에게 O6-BG(15　mg/kg, IP)를 2 회, 30 분 간격으로 주사하였다. O6-BG의 두번째 주사 1 시간 후에, 마우스에게 5　mg/kg 카르무스틴(BCNU)을 주사하였다(IP). 1 차례의 선택 후 2 및 4 주차에, 각각 7.5 및 10　mg/kg의 BCNU 용량으로 2 차례 이상 수행하였다.
면역억제: 마이코페놀레이트 모페틸(CellCept Intravenous)은 Genentech(오리건주 힐즈버러 소재)에서 수득하였다. 라파마이신(Rapamune/Sirolimus) 및 메틸프레드니솔론은 Pfizer(뉴욕주 뉴욕 소재)에서 수득하였다. 마이코페놀레이트 모페틸(20　mg/kg/일), 라파마이신(0.2　mg/kg/일), 메틸프레드니솔론(20　mg/kg/일)의 일일 복강내 주사를 수행하였다.
2차 골수 이식: 수용자는 Jackson Laboratory에서 수득한 6 - 8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스였다. 이식 당일에, 수용자 마우스를 1000 Rad로 조사하였다. 생체내 형질도입된 CD46tg 마우스로부터 골수 세포를 단리된 무균상태로 단리하고 계통-고갈된 세포를 상기 기재된 바와 같이 MACS를 사용하여 단리하였다. 조사 6 시간 후 세포를 마우스 당 1x106 개 세포로 정맥내로 주사하였다. 2차 수용자는 종료점 분석을 위해 이식 후 16 주 동안 유지하였다. 모든 2차 수용자는 4 주차에 시작하여 면역억제를 받았다.
조직 분석: 2.5 μm 두께의 비장 및 간 조직 절편을 적어도 24 시간 동안 4% 포름알데하이드에 고정시키고, 탈수하고 파라핀에 포매하였다. 헤마톡실린-에오신 염색은 골수외 혈구형성의 조직학적 평가를 위해 사용하였다. 헤모시데린을 Perl의 프러시안 블루 염색에 의해 조직 절편에서 검출하였다. 간단히 말해서, 조직 절편을 증류수 중 동일한 부피(2%)의 페로시안화칼륨 및 염산의 혼합물로 처리한 다음 뉴트럴 레드로 대조염색하였다. 비장 크기를 비장 중량(mg)/체중(g)의 비로 평가하였다.
혈액 분석: 혈액 샘플을 EDTA-코팅된 튜브에 수집하고 HemaVet 950FS(Drew Scientific, 코네티컷주 워터베리 소재)에서 분석을 수행하였다. 말초 혈액 도말을 각각 5 및 15 분 동안
Figure pct00023
(Merck, 독일 다름슈타트 소재)로 염색하였다. 망상적혈구를 브릴리언트 크레실 블루로 염색하였다. 혈액 도말에 대한 망상적혈구를 계수한 조사자들은 샘플 그룹 할당에 대해 맹검이었다. 동물 번호만이 슬라이드에 보였다. (동물 당 5 개 슬라이드, 5 개의 무작위 1 cm2 절편)
통계적 분석 : 다중 그룹의 비교를 위해, 다중 비교를 위한 본페로니 사후-테스트와 함께 일원 및 이원 분산 분석(ANOVA)를 이용하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 버전 6.01(GraphPad Software Inc., 캘리포니아주 라호이아 소재)을 사용하여 수행하였다.
결과 및 논의
γ-글로빈 유전자 추가를 위한 HDAd-combo 벡터 및 γ-글로빈 재-활성화를 위한 자기-불활성화 CRISPR/Cas9: HDAd5/35++ 벡터의 30　kb 삽입 용량은 2 개의 치료 카세트를 1 개의 벡터로 통합하기 위해 활용되었다(도 100, 상부 패널, "HDAd-combo"): i) 인간 γ-글로빈 발현을 구동하기 위해 β-글로빈 프로모터와 조합된 HS1-HS4 미니-LCR로 이루어진 SB100x에 의한 γ-글로빈 유전자 추가용 카세트(Wang 등, J Clin Invest 129: 598-615, 2019). 이 카세트는 저용량 O6BG/BCNU 처리에 의해 안정하게 형질도입된 세포의 선택을 허용하는 보편적으로 활성인 PGK 프로모터의 제어 하에 돌연변이체 O6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(mgmtP140K)에 대한 유전자에 연결된다(Neff 등, J Clin Invest 112: 1581-1588, 2003; Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev 8: 52-64, 2018). ii) IR/frt 플랭킹된 트랜스포존 외부에 위치한 CRISPR/Cas9 발현 카세트인, γ-글로빈/mgmtP140K 트랜스포존 카세트는 frt 부위 및 IR에 의해 플랭킹된다. 이 모듈은 HBG1/2 프로모터 내에서 BCL11A 결합 부위를 표적화하는 U6-프로모터 구동된 sgRNA 및 EF1α 프로모터의 제어 하에 SpCas9로 이루어진다. HDAd combo 및 HDAd-SB의 공동 감염 및 SB100x 및 Flpe 재조합효소의 발현은 IR-플랭킹된 γ-글로빈/mgmtP140K 카세트의 통합을 매개하고 동시에 벡터를 파괴하고 CRISPR/Cas9 발현을 중지시킬 것이다(도 101). CRISPR/Cas9의 이러한 단축된 발현은 게놈- 편집된 세포의 생존 및 장기간 재증식 세포의 백분율을 증가시켜야 한다. 비교를 위해, HDAd5/35++ 벡터는 2 개의 상이한 모듈, HDAd-CRISPR("cut") 및 HDAd-SB-추가("add")를 별도로 함유하는 연구에 포함되었다(도 100, 중간 패널-"HDAd-cut" 및 "HDAd-SB-add").
HUDEP-2 세포에서 벡터 검증: 가설은 BCL11A 및 대부분의 β-글로빈 및, 낮은 수준의 γ-글로빈만을 발현하는 불멸성 인간 조혈 줄기 및 전구체 세포-유래 적혈구 전구체 세포주인 인간 제대혈 혈액-유래 적혈구 전구체(HUDEP-2) 세포에서 처음으로 테스트되었다(Kurita 등, PLoS One 8: e59890, 2013). HUDEP-2 세포는 γ-글로빈 재활성화 연구에 광범위하게 사용되었다(Canver 등, Nature 527: 192-197, 2015). HUDEP-2 세포를 대부분의 세포를 혈질도입하는 MOI에서 HDAd-combo +/- HDAd-SB로 감염시키고 4 일 후, 세포를 초기에 기재된 바와 같이 적혈구 분화 배지에서 8 일 동안 추가로 확장시켰다(Li 등, Mol Ther 27: 2195-2212, 2019). Cas9 웨스턴 블롯 신호는 세포가 분화/확장에 적용되면 급격하게 감소하였으며, 에피솜 HDAd-combo 벡터 카피의 손실로 인할 가능성이 크다(도 103a). HDAd-combo 벡터를 사용하여 제어된 Cas9 발현에 대한 개략도는 도 102에 제시된다. 그러나 Cas9는 12 일의 연구 기간 동안 검출가능하였다. HDAd-SB와의 공동 감염은 Cas9 발현을 35%(Diff d3) 내지 50%(Diff d8)로 감소시켰으며(도 103b), 이는 도 101에 기재된 자기-불활성화 메커니즘의 효과를 나타낸다. 유세포 분석에 의한 γ-글로빈 마킹의 분석(도 103C)은 γ-글로빈 유전자 추가 및 재활성화 모듈의 부가 효과를 시사하였다.
CD46/β-YAC 마우스에서 생체내 HSPC 형질도입. HBG1/2 프로모터를 표적화하는 HDAd5/35++ 벡터를 사용한 생체내 HSPC 형질도입 후 인간 γ-글로빈 재활성화 CD46/β-YAC 마우스가 이전에 입증되었다(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018). 여기서, 유사한 프로토콜에 따라 새로운 HDAd-combo 벡터를 평가하였다. CD46/ β -YAC 마우스를 G-CSF/AMD3100으로 동원하고, "cut", "add" 및 "combo" 벡터를 정맥내로 주사하고, 4 주 후, 3 차례의 생체내 선택에 적용하였다(도 104a). γ-글로빈-양성 RBC의 백분율은 각 차례의 생체내 선택과 함께 증가하였으며 O6BG/BCNU 주사의 마지막 차례 2 주 후 "combo" 벡터에 대해 95% 초과에 도달하였다(도 104b). "cut" 벡터로의 재활성화는 덜 효율적이고(60%) 동물 사이에 더 가변적이었다. 18 주차에, RBC 용해물을 글로빈 쇄에 대해 HPLC에 의해 분석하였다. 크로마토그램은 인간 β-글로빈, 재활성화된 인간 Gγ/Aγ (HBG1/2) 및 추가된 76-Ile G 변이체에 대한 별개의 피크를 나타낸다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018)(도 104c 왼쪽 패널, 도 105). 특히, Gγ 및 Aγ의 동시 재활성화는 "cut" 벡터로 처리된 마우스의 작은 분획에서만 보였다(도 105). "cut" 및 "combo" 벡터-처리된 마우스의 대부분은 재활성화된 Aγ만을 나타내었으며, HBG1 및 HBG2 프로모터 둘 다에서 CRISPR/Cas9의 동시 절단 결과로서 HBG2 유전자의 결실에 기인할 가능성이 크다(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018). 도 104c(오른쪽 패널)는 인간 β-글로빈에 대한 γ-글로빈 단백질 수준을 나타낸다. "cut", "add", 및 "combo" 벡터 각각에 대해 평균, 7 %, 11% 및 17% γ-글로빈 단백질이 검출되었다. mRNA 수준에서 유사한 패턴이 보였다(도 104d). "cut" 및 "add" 벡터 사이의 차이는 유의하지 않았지만, "combo" 벡터에 대한 γ-글로빈 수준은 상당히 더 높았다. PBMC 및 골수 MNC에서 18 주차에 측정된 HBG 프로모터 표적 부위의 CRISPR/Cas9-매개 절단의 백분율은 "cut" 벡터와 비교하여 "combo" 벡터에 대해 상당히 더 높았다(도 104e, 도 106). 이는 CRISPR/Cas9 발현 감소로 이어지는 메커니즘, 및, 잠재적으로, 생체내 선택에 의해 확장된 CRISPR-편집된 HSPC의 더 나은 생존으로 인할 가능성이 더 크다. 골수 MNC에서 벡터 카피 수는 "combo" 벡터에 대한 γ-글로빈 수준 증가가 더 나은 형질도입 및 벡터 통합 때문이었다는 점을 제외하고, "add" 및 "combo" 벡터와 비슷하였다(도 104f). 상이한 마우스의 개별 전구체 콜로니에서 분석할 때, VCN은 세포 당 1 내지 6 개 카피 범위였다(도 104g). γ-글로빈 유전자 추가 및 CRISPR 절단-매개 γ-글로빈 재활성화가 장기간 재증식 HSC에서 발생하였음을 입증하기 위해, 골수 Lin- 세포를 이식하고, "cut" 및 "combo" 벡터를 갖는 β-YAC/CD46 마우스의 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스로의 생체내 HSPC 형질도입 후 18 주차에 수확하였다. 2차 수용자에서 다중-계통 재구축을 구동하는 이식된 세포의 능력을 16 주의 기간에 걸쳐 평가하였다. PBMC에서 CD46 발현에 기반한 생착률은 95%였고 안정하게 유지되었다. 유세포 분석에 의해 측정된 RBC의 γ-글로빈 마킹이 또한 "cut" 및 "combo" 벡터 각각에 대해 16 주차에 70% 및 95% 범위에서 안정하였다(도 107a). HPLC(도 107b) 또는 qRT-PCR(도 107c)에 의해 측정된 γ-글로빈 발현 수준(마우스 β-주요 기준)은 1차 마우스와 비슷하였다. 도 107b는 이식 후 16 주차에 인간 β-글로빈에 대한 γ-글로빈 단백질의 수준을 나타낸다. 도 107c 및 107d는 마우스 β주요-글로빈 및 인간 β-글로빈에 대한 γ-글로빈 단백질의 수준을 나타낸다.
혈액, 비장, 및 골수의 세포 조성물에 대한 HSPC의 유전적 조작 또는 적혈구 세포로부터의 γ-글로빈 발현에 대한 효과는 관찰되지 않았다. 도 107e 형질도입되지 않은 대조군 마우스(채워지지 않은 기호)와 비교하여 "combo" 벡터(채워진 기호)로 형질도입 후 16 주차에 혈액, 비장, 및 골수의 MNC에서 계통-양성 세포 조성. 도 107f는 혈액, 비장, 및 골수에서 세포 당 트랜스포존의 통합된 카피 수를 나타낸다.
SCD(Townes) 마우스에서 생체내 HSPC 형질도입 연구. 이 모델에서, 뮤린 α-글로빈 유전자를 인간 α-글로빈으로 대체하고 뮤린 성체 β-글로빈 유전자를 함께 연결된 인간 겸상 βS 및 태아 γ-글로빈 유전자로 대체하였다. β-글로빈 유전자(HBG1)는 CRISPR/Cas9에 의해 절단된 BCL11A 표적 부위를 함유하는 1400 bp의 5' 플랭킹 서열을 함유한다. 이는 β -글로빈 유전자의 재활성화로 이어져야 한다. Townes 모델의 게놈은 또 다른 SCD 마우스 모델인 Berkeley 모델(Hba0/0　Hbb0/0　Tg(Hu-miniLCRα1GγAγδβS)보다 더 잘 특성화되며, 이는 인간 글로빈 이식유전자의 2 개 초과의 카피를 갖는 것으로 보인다(Paszty 등, Science 278: 876-878, 1997).
HDAd5/35++ HSPC 유전자 요법에 적합한 Townes 모델을 만들기 위해, Townes 마우스를 인간 CD46 유전자이식 마우스와 교배하였다. 3 차례의 역교배 후, 인간 CD46 및 2 개의 인간(α, βS/γ) 글로빈 유전자에 동형접합성인 마우스를 실험에 사용하였다(도 108a). 삼중 동형접합성 CD46/Townes 마우스는 겸상-유사 적혈구(도 108b), 중증 빈혈, 말초 혈액에서 40% 망상적혈구 뿐만 아니라 백혈구증가증 및 혈소판증가증을 나타내었다(도 108c). 후자는 조혈 장애가 적혈구 계통을 넘어 확장됨을 나타낸다. 또 다른 특징적 특성은 골수외 조혈의 결과로서 비장비대였다(도 108d).
CD46/Townes 마우스를 GCSF/AMD3100으로 동원하고 HDAd-combo+HDAd-SB 벡터를 정맥내로 주사하였다. O6BG/BCNU로의 생체내 선택을 형질도입 1 주 후에 시작하고 BCNU 용량을 증가시키면서(5→7.5→10　mg/kg) 4 및 6 주차에 반복하였다. 기준선에서, 평균 5%의 RBC는 낮은 MFI로 γ-글로빈 양성이었으며, 이는 CD46/Townes 마우스에서 태아 글로빈의 불완전한 억제를 나타낸다. 3 차례의 생체내 선택 후, -글로빈-양성 RBC의 백분율은 증가하고 연구 종료까지(생체내 형질도입 후 13 주) 95% 초과에 도달하였다(도 109a). RBC 용해물의 HPLC 분석은 인간 α-글로빈 또는 βS-글로빈의 30%인 γ-글로빈 수준을 나타내었다(도 109b 왼쪽 패널). 추가된 γ-글로빈 및 재활성화된 Aγ에 대한 피크는 명확하게 보였다(도 109b 오른쪽 패널). CD46/β-YAC 모델에서 볼 수 있는 바와 같이, 재활성화된 γ-글로빈은 총 γ-글로빈 수준에 대해 추가된 γ-글로빈보다 적게 기여하였다(도 109c). 유세포 분석에 의해 검출된 기준선 γ-글로빈의 낮은 수준은 HPLC의 검출 한계 미만이었다. RBC에서 글로빈 mRNA의 분석은 HPLC인 단백질 수준에서 보인 값을 반영하였다(도 109d). HDAd-combo 생체내 HSC 유전자 요법 후 γ-글로빈 수준은 "건강한" CD46/β-YAC 마우스에서보다 SCD CD46/Townes 모델에서 더 높았다.
2 가지 의도된 게놈 변형을 13 주의 골수 샘플에서 검출하였다. 세포 당 평균 2.5 개의 통합된 γ-글로빈 유전자가 발견되었다(도 109e). T7EI 검정에 의해 측정된 표적 부위 절단 효율은 총 골수 MNC, Lin- 세포, PBMC, 및 비장세포에서 25-30% 범위로 비슷하였다(도 109f). CD46/Townes HSPC의 안정된 유전적 변형을 나타내기 위해, 생체내 형질도입 후 13 주차에 수확된 Lin- 세포를 2차 치명적으로 조사된 C57Bl/6 수용자에 이식하였다. RBC에서 γ-글로빈 마킹은 성인 인간 글로빈의 30% 수준에서(도 110b) 16 주에 걸쳐 안정되었다(도 110a.
마우스 모델에서 SCD의 표현형 교정: combo 벡터로 생체내 HSPC 형질도입 후 13 주차에, 겸상적혈구병의 표현형 특징을 CD46/Townes 마우스에서 분석하였다. 말초 혈액 도말에 대해 계수된 망상적혈구의 평균 백분율은 모체("건강한") CD46 유전자이식 마우스, 처리 전 CD46/Townes 마우스, 및 처리 후 13 주차의 CD46/Townes 마우스 각각에 대해 5, 39, 및 5%였다(도 111a 및 111c). 처리된 마우스에서, 혈색소감소증, 광범위하게 다양한 크기/형상(겸상 세포) 및 세포 단편화(도 108b 참조)를 특징으로 하는 CD46/Townes 마우스의 혈액 도말에서 적혈구 형태는 CD46 마우스에서 보이는 정상적혈구 적혈구 모양으로 되돌아갔다(도 111b). RBC, WBC, 및 혈소판 계수 뿐만 아니라 적혈구 특징(예를 들어 헤모글로빈 및 적혈구용적률)을 포함하는 혈액학적 매개변수는 CD46 및 처리된 CD46/Townes 마우스에서 유사하였다(도 111c). 마찬가지로, 처리된 CD46/Townes 마우스의 간 및 비장의 조직학적 분석은 실질 철분 침착 및 골수외 혈구형성의 부재를 포함하는 정규화를 나타내었다(도 112a). 처리된 CD46/Townes 마우스에서 보상 혈구형성의 측정가능한 특징인 비장 크기는 모체 CD46 마우스와 비슷하였다(도 112b).
전반적으로, 이들 데이터는 CD46/Townes 마우스에서 겸상적혈구병의 완전한 치유를 나타낸다. 이는 SB100x 트랜스포사제-매개 γ-글로빈 유전자 추가(주요 기여) 및 내인성 γ-글로빈의 CRISPR/Cas9-촉발된 재활성화의 조합에 의해 달성된 높은 γ-글로빈 수준(20% 초과)과 직접적으로 관련된다고 가정된다. 또한, 이러한 결과는 Flpe/SB100x에 의한 Cas9 발현 감소가 HDAd-combo 게놈으로부터 CRISPR/Cas9 발현 카세트의 절제를 매개하여, CRISPR-편집된 HSPCS의 안전성 및 백분율 증가로 이어짐을 입증한다. 이 시스템이 추가 개선은 예를 들어 SCD 돌연변이를 HDAd-combo 벡터 내로 교정하는 Prime Editor를 포함함으로써, RBC에서 βS의 양을 감소시키는 접근법을 포함할 수 있다.
실시예 4. Ad35 벡터 생산
이 실시예는 Ad35 벡터 생산 및 CD34+ 세포의 형질도입에 대한 효능 입증을 기재한다. 상이한 구조를 갖는(상이한 LoxP 배치 포함) 3 개의 예시적인 Ad35 벡터를 생산하였다.
대표적인 Ad5/35 헬퍼 바이러스 게놈의 왼쪽 단부는 도 113에 제시된다. 진회색으로 음영처리된 서열은 천연 Ad5 서열에 상응하며, 즉, 음영처리되지 않거나 또는 연회색으로 강조된 서열은 인위적으도 도입되었다. 연회색으로 강조된 서열은 (연속 반복되는) loxP 서열의 2개 카피이다. "cre 재조합효소" 단백질의 존재 하에, 2 개의 loxP 서열 사이의 뉴클레오티드 서열이 결실된다(loxP의 1 개 카피만 남겨둠). loxP 부위 사이의 Ad5 서열은 아데노바이러스 DNA를 (생산자 세포의 핵 내의) 캡시드로 패키징하는 데 필수적이기 때문에, 이 결실은 패키징에 대한 헬퍼 아데노바이러스 게놈 DNA가 결핍되게 만든다. 결과적으로, 결실 과정의 효율은 패키징된 헬퍼 게놈 DNA(원치않은 헬퍼 바이러스 "오염")의 수준에 직접 영향을 미친다. 상기 관점에서, Ad5 이외의 아데노바이러스 혈청형에 대한 동일한 체계로 번역하기 위해, 하기를 달성하는 것이 바람직하다: 1. loxP 서열 삽입에 의해 플랭킹되고 cre 재조합효소의 존재 하에 결실될 수 있도록 패키징에 필수적인 서열을 식별한다. 이러한 서열의 식별은 서열에 유사성이 거의 없는 경우 간단하지 않다. 2. 천연 DNA 서열에서 loxP 서열의 삽입이 (cre 재조합효소의 부재 하에) 헬퍼 바이러스의 증식 및 패키징에 최소 영향을 미칠 수 있는지를 결정한다. 3. 헬퍼-의존적 아데노바이러스의 생산 동안(즉, 116 세포주와 같은 세포주를 발현하는 cre 재조합효소에서) 패키징 서열의 효율적인 결실을 허용하고 헬퍼 바이러스 패키징을 최소로 유지하는 loxP 서열 사이의 간격을 결정한다.
도 114는 대표적인 Ad5 및 Ad35 패키징 신호(서열번호: 49 및 50)의 정렬을 나타낸다. Ad5의 왼쪽 단부 서열과 Ad35의 정렬은 패키징 신호를 식별하는 데 도움이 된다. 패키징에 중요한 Ad5 서열의 모티프(AI 내지 AV)는 선으로 표시된다(또한 Schmid 등, J Virol., 71(5):3375-4, 1997의 도 1b 참조). 예시적인 loxP 삽입 부위의 위치는 검정색 화살표로 표시된다. 이러한 삽입은 AI 내지 AIV에 플랭킹하고 AV를 파괴한다. Schmid 등에 표시된 바와 같은 추가적인 패키징 신호 AVI 및 AVII은 이 벡터의 E1 결실의 일부로서 Ad5 헬퍼 바이러스에서 결실되었다.
도 115는 Ad35 벡터 pAd35GLN-5E4의 개략도이다. 이는 재조합 기술(PMID: 28538186)을 사용하여 벡터화된 Ad35 게놈(ATCC의 Holden 균주)으로부터 유래된 1세대(E1/E3-결실) Ad35 벡터이다. 그런 다음 이 벡터 플라스미드를 사용하여 loxP 부위를 삽입하였다.
패키징 부위(PS)1 LoxP 삽입 부위는 뉴클레오티드 178 및 344 뒤에 있으며; 이 Ad35 벡터는 서열번호: 286에 예시되어 있다. 이 LoxP 배치는 AI 내지 AIV를 제거하는 것으로 예상된다. AVI 및 AVII을 포함하는 나머지 패키징 신호(344 이후)는 결실되었다(위치 345 내지 3113에서 E1 결실의 일부로서). PS2 LoxP 삽입 부위는 뉴클레오티드 178 및 481 뒤에 있으며; 이 Ad35 벡터는 서열번호: 51에 예시되어 있다. 추가적으로, 뉴클레오티드 179 내지 365는 결실되어, AI 내지 AV가 존재하지 않는다. 나머지 패키징 모티프 AVI 및 AVII은 HDAd 생산 동안 cre 재조합효소에 의해 제거가능하다. E1 결실은 482에서 3113까지이다. PS3 LoxP 삽입 부위는 뉴클레오티드 154 및 481 뒤에 있으며; 이 Ad35 벡터는 서열번호: 52에 예시되어 있다. 이들 3 개 벡터의 패키징 신호 구조는 도 116에 제공된다.
3 개의 조작된 벡터는 구제될 수 있다. 재배열된 loxP 부위를 갖는 바이러스 게놈의 백분율은 PS1, PS2, 및 PS3 각각에 대해 50, 20, 및 60%였다. 재배열은 lox P 부위가 바이러스 복제 및 유전자 발현에 중요하게 영향을 미칠 때 발생한다.
현재 HDAd5/35 플랫폼과 비교하여 이 HDAd35 플랫폼은 도 117에 예시된다. 두 벡터는 CMV-GFP 카세트를 함유한다. Ad35 벡터는 면역원성 Ad5 캡시드 단백질을 함유하지 않는다. 이들 2 개의 벡터는 시험관내에서 CD34+ 세포의 비슷한 형질도입 효율을 나타내었다. 가교 연구는 시험관내에서 CD34+ 세포의 비슷한 형질도입 효율을 나타낸다. G-CSF 동원된 공여자로부터의 말초 CD34+ 세포인 인간 HSC를 HDAd35(Ad35 헬퍼 P-2로 생산) 또는 Ad35으로부터의 섬유가 있는 Ad5 캡시드를 함유하는 키메라 벡터로 MOI 500, 1000, 2000 vp/세포에서 형질도입하였다. GFP-양성 세포의 백분율을 3 개의 독립적인 실험에서 바이러스 첨가 48 시간 후에 측정하였다.
PS2 헬퍼 벡터는 원숭이 연구에 사용하기 위해 다시 제조하였다(도 118에 예시된 바와 같음). 이 버전을 만들기 위해 취해진 조치는 다음과 같다: E1 영역 결실, Loxp에 의해 플랭킹된 돌연변이체 패키징 신호, 돌연변이체 패키징 서열, E3 영역 결실(27435→30540), Ad5E4orf6으로 대체, 스터퍼 DNA 플랭킹 copGFP 카세트 삽입, 및 Ad35K++를 만들기 위해 놉에 돌연변이 도입.
도 119는 돌연변이된 패키징 신호 서열을 나타낸다. 잔기 1 내지 137은 Ad35 ITR이다. 굵은 글씨 글자는 SwaI 부위이고, Loxp 부위는 이탤릭체로 표시되고, 돌연변이된 패키징 신호는 밑줄로 표시된다. 명확성을 위해, 이들 서열은 도 119에 개별적으로 제시된다.
4 개의 Ad35 헬퍼 벡터 패키징 신호 변이체를 만들었다(도 120a). E3 영역(27388 → 30402)을 결실시키고 CMV - eGFP 카세트를 E3 결실, Ad35K++ 내에 위치시키고, eGFP를 copGFP 대신에 사용하였다. 이들 4 개의 패키징 신호 변이체에서 LoxP 부위는 예시된 위치에 있다(도 120a). 4 개의 헬퍼 벡터 모두를 구제할 수 있다.
도 120b는 명시된 LoxP 부위가 있는 8 개의 추가적인 패키징 신호 변이체를 나타내는 개략도이다.
특정 추가적인 헬퍼 벡터 및 패키징 신호 변이체에서, E3 결실의 단축(27609→30402)과 같은 변화가 도 120a의 헬퍼 벡터에서 이루어졌다.
실시예 5. HDAd5/35++ 벡터를 사용한 생체외 및 생체내 조혈 줄기 세포 형질도입 후 AAVS1 유전자이식 마우스에서 표적화된 통합 및 높은 수준의 이식유전자 발현.
이 실시예에 함유된 정보의 적어도 일부는 Li 등(Mol Ther., 27(12): 2195-2212, 2019; e-pub August 19, 2019)에 공개되었다.
환자에서 현재 조혈 줄기 세포 유전자 요법은 유전자 전달을 위해 렌티바이러스 벡터를 사용한다(Nadini, EMBO Mol Med, 11, 2019; Wang 등, Genome Res, 17, 1186-1194, 2007). 렌티바이러스 벡터는 활성적으로 전사되는 유전자에 대한 강한 편향으로 인간 게놈에서 효율적으로 통합된다. 이러한 반-무작위 통합 패턴은 암-관련 유전자를 포함하는 이웃 유전자의 발현을 교란시킬 위험을 수반한다. 따라서 이 분야에서의 주요 목표는 미리 선택된 부위에 이식유전자 통합을 표적화하는 것이다. 인간 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 다수의 "안전 항구"가 제안되었다(예를 들어 AAVS1 및 CCR5)(Papapetrou 등, Nat Biotechnol, 29, 73-78, 2011). 안전 항구 부위에 대한 기준 중에는 다음이 있다: (i) 임의의 유전자의 5' 단부로부터 50 kb 초과의 거리, (ii) 암-관련 유전자로부터 300 kb 초과의 거리, (iii) 임의의 microRNA로부터 300 kb 초과의 거리, (iv) 유전자 전사 단위 외부, 및 (v) 초보존된 영역의 외부. 염색체 19에서 AAVS1 유전자좌는 AAVS1 부위 내에서 특이적 모티프(RBS)를 인식하는 바이러스-암호화된 단백질 Rep 78에 의해 매개되는 통합을 위해 야생형 AAV에 의해 사용된다(Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158, 97-129, 1992, Huser 등, PLoS Pathog, 6, e1000985, 2010). 일부 AAV 혈청형에 대한 검출가능한 항체에 의해 입증되지만, 임의의 식별가능한 병리 없이 인간 집단의 많은 비율이 AAV에 직면하였기 때문에, AAVS1로의 통합은 안전할 수 있는 것으로 결론내렸다(Henckaerts 등, Future Virol, 5, 555-574, 2010). 또한, 이 유전자좌는 CD34+ 및 iPS 세포에서 개방 염색질 형태를 유지하는 DNAse I 과민성 부위 및 절연체를 함유한다(van Rensburg 등, Gene Ther, 20, 201-214, 2013, Lombardo 등, Nat Methods, 8, 861-869, 2011, Ogata 등, J Virol, 77, 9000-9007, 2003). 이는 게놈 편집 도구의 더 나은 접근을 허용하고 다른 한편으로는 높은 수준의 이식유전자 발현을 뒷받침한다(van Rensburg 등, Gene Ther, 20, 201-214, 2013, Voigt 등, J Mol Med, 86, 1205-1219, 2008).
표적화된 이식유전자 통합은 상동성-지시된 복구(HDR)를 통해 달성될 수 있다(Lombardo 등, Nat Med, 20, 1101-1103, 2014). 조작된 부위-특이적　뉴클레아제에 의한 절단 후, DNA 이중 가닥 파괴는 전형적으로 가변 삽입 또는 결실(indel), 또는 HDR로 이어지는 오류가 발생하기 쉬운 DNA 복구 경로인 비-상동 말단 연결(NHEJ)을 통해 해결되며, 이는 상동 공여자 주형을 카피함으로써 DNA를 복구한다. 파괴 부위 주위의 게놈 서열에 상동 DNA에 의해 플랭킹된 외인성 DNA의 전달은 부위-특이적 방식으로 외인성 서열의 혼입으로 이어질 수 있다.
표적화된 통합을 달성하기 위한 현재 접근법은 엔도뉴클레아제-암호화된 mRNA 및 공여자 플라스미드 DNA(Blair 등, J Vis Exp, e53583, 2016, Dreyer 등, Biomaterials, 69, 191-200, 2015; Kuhn 등, Sci Rep, 7, 15195 2017; Li 등, Mol Med Rep, 15, 1313-1318, 2017), 통합-결핍 렌티바이러스 벡터(IDLV)(Lombardo 등, Nat Med, 20, 1101-1103, 2014; Rio 등, EMBO Mol Med, 6, 835-848, 2014) 또는 rAAV6 벡터(De Ravin 등, Nat Biotechnol, 34:424-429, 2016, Hung 등, Mol Ther, 26, 46-467, 2018; Johnson 등, Sci Rep, 8:12144, 2018)를 사용하여 시험관내에서 HSC의 전기전공법에 기반한다. 헬퍼-의존적 아데노바이러스(HDAd5/35++) 벡터는 설계자 인터그라제(Li 등, Blood, 1431, 2915-2928, 2018, Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 1, 14057, 2015) 및, 이 연구에서 공여자 주형을 전달하기 위해 개발되었다. HDAd5/35++ 벡터는 원시 HSC 상에서 발현되는 수용체인 인간 CD46을 표적화한다(Richter 등, Blood, 128, 2206-2217, 2016). 게놈을 비-분할 세포의 핵 내로 효율적으로 전달하는 HDAd5/35++ 벡터의 능력은 효율적인 표적화된 통합에 대한 전제 조건인 다량의 공여자 DNA를 허용한다. HDAd5/35++ 및 HDAd35 벡터는 최대 30　bp의 외래 DNA를 전달할 수 있기 때문에, 이들은 주어진 표적 부위에 상동인 공여자 서열의 긴 스트레치를 수용할 수 있다. 이는 상동 재조합에 의해 표적화된 유전자의 효능을 증가시켜야 하며, 상동성 영역의 길이와 직접적으로 상관관계가 있다(Balamotis 등, Virology, 324, 229-237, 2004, Ohbayashi 등, Proc Natl Acad Sci USA, 102, 13628-13633, 2005, Suzuki 등, Proc Natl Acad Sci USA, 105, 13781-13786, 2008). 이러한 벡터는 고수율로 생성하기 쉽고 강한 HSC 향성을 갖기 때문에, 이들은 생체내 HSC 형질도입에 이용되었다(Richter 등, Blood, 128, 2206-2217, 2016). 접근법의 핵심 아이디어는 G-CSF/AMD3100을 사용하여 골수로부터 HSC를 동원하고, 주변부에서 많은 수로 순환하는 동안, 정맥내로 주사된 HDAd5/35++ 벡터로 형질도입하는 것이다. 형질도입된 세포는 장기간 지속되는 경우 골수로 되돌아간다. 접근법의 안전성 및 효능은 이전에 내인성 태아 글로빈의 CRISPR/Cas9-매개 재활성화(Li 등, Blood, 1431, 2915-2928, 2018) 또는 효율적인 무작위 일시적 통합을 매개하는 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제(SB100x)를 사용한 태아 글로빈 유전자 추가(Wang 등, J Clin Invest, 129, 598-615, 2019)에 의해 혈색소병증에 대한 CD46 유전자이식 마우스 모델에서 입증되었다. SB100x-매개 이식유전자 통합은 이론적으로 렌티바이러스 벡터의 준-무작위 통합보다 더 안전하지만, 여전히 이식유전자 침묵, 이웃 유전자에 대한 원치않은 효과, 및 게놈 재배열과 관련한 우려를 일으킨다. 따라서 이 연구의 목표는 AAVS1 내로 표적화된 통합을 위한 HDAd5/35++ -기반 생체내 HSC 형질도입 접근법을 변형하는 것이었다.
인간 AAVS1 유전자좌에 대해 상동인 서열은 설치류에 부재한다(Samulski 등, EMBO J, 10, 3941-3950, 1991). 2 개의 유전자이식 설치류 모델이 이전에 보고되었으며, 이는 래트 또는 마우스 게놈(X-염색체)에서 AAVS1 유전자좌의 3.5-kb 단편(래트에서 머리에서 꼬리까지 7 개 카피)을 함유한다(Rizzuto 등, J Virol, 73, 2517-2526, 1999). 연구는 AAVS1의 개방 염색질 구조가 유전자이식 마우스에서 유지됨을 나타내었다(Young 등, J Virol, 74, 3953-3966, 2000). Jackson Laboratories는 AAVS1 유전자이식 마우스를 배포한다(Bakowska 등, Gene Ther, 10, 1691-1702, 2003). Jackson Labs의 웹사이트는 이러한 마우스가 단일 게놈 부위에 삽입된 8.2　kb 인간 AAVS1 유전자좌 단편의 5 개 카피를 함유함을 언급한다. HDAd5/35++ 벡터를 사용한 형질도입에 적합한 AAVS1 유전자이식 마우스를 만들기 위해, 인간 CD46 유전자좌에 대해 유전자이식된 마우스를 교배하였다(Kemper 등, Clin Exp Immunol, 124, 180-189, 2001). 모든 동물 연구는 AAVS1/CD46+/+ 마우스로 수행하였다.
재료 및 방법.
세포 : G-CSF-동원된 성체 공여자로부터 CD34 + 세포를 수득하였다. 세포를 동결 스톡에서 회수하고 페니실린/스트렙토마이신, Flt3 리간드(Flt3L, 25　ng/ml), 인터류킨 3(10 ng/ml), 트롬보포이에틴(TPO)(2 ng/ml), 및 줄기 세포 인자(SCF)(25　ng/ml)를 함유하는 StemSpan H3000(STEMCELL Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재)에서 밤새 배양하였다. 세포를 2000 vp/세포의 MOI에서 HDAd 벡터로 형질도입하고 나타낸 바와 같이 분석하였다. HUDEP-2 세포 . HUDEP-2 세포(Kurita 등, PLoS One, 8, e59890, 2013)를 또한 수득하였다. HUDEP-2 세포를 이전에 기재된 바와 같이 SCF, EPO, 독시사이클린 및 덱사메타손의 존재 하에 배양하였다(Canver 등, Nature, 527, 192-197, 2015). 세포를 500-1000 vp/세포의 MOI에서 HDAd 벡터로 형질도입하고 나타낸 바와 같이 분석하였다.
HDAd5/35++ 벡터: HDAd-SB, HDAd-IR-GFP/mgmt, 및 HDAd-IR-γ-글로빈/mgmt는 이전에 기재되었다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 9, 142-152, 2018, Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 8, 52-64, 2018). HDAd-CRISPR 벡터의 클로닝을 위해, 인간 AAVS1 유전자좌를 표적화하는 sgRNA(서열번호: 207)(Mali 등, Science, 339, 823-826, 2013)를 합성하고, 어닐링하고, pSPgRNA(Addgene, 매사추세츠주 케임브리지 소재)의 BbsI 부위로 삽입하여, pSP-sgAAVS1을 생성하였다. pLentiCRISPRv2(Addgene)로부터 증폭된 Cas9 코딩 서열, pSP-sgAAVS1의 BamHI 소화에 의해 방출된 U6sgAAVS1 단편, 및 이전에 기재된 microRNA 표적화 영역(miR-183/218)(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 1, 14057, 2015)을 pBS-T-EF1α의 EcoRV-NotI, BamHI 및 NotI 부위에 순차적으로 클로닝하여(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 1, 14057, 2015), pBST-sgAAVS1-miR을 형성하였다. 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 수득하기 위해, U6 프로모터에서 시작하여 SV40 polyA 신호 서열까지의 8 kb 카세트를 pBST-sgAAVS1-miR로부터 증폭하고 Gibson 어셈블리(New England Biolabs)에 의해 NheI-XmaI 소화된 pHCA와 결찰시켜(Sandig 등, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 1002-1007, 2000), 상응하는 pHCA-sgAAVS1-miR 플라스미드를 생성하였다.
HDAd-GFP-공여자 벡터의 구축을 위해, AAVS1 CRISPR 절단 부위에 바로 플랭킹하는 2 개의 0.8　kb 상동성 아암(HA)을 gBlock(IDT, 캘리포니아주 산호세 소재)으로 합성하였다. PAM 서열이 있는 1 개의 23　bp sgAAVS1은 각각 5'HA의 상류 및 3'HA의 하류에 포함되어, 공여자 카세트의 방출을 매개하였다. EF1α-mgmt-2A-GFP-pA 단편을 GenScript(중국 난징 소재)에 의해 합성하고, 중첩 PCR에 의해 2 개의 5'HA와 결찰시켜, sgAAVS1-5'HA-Ef1α-mgmt-2A-GFP-pA-3'HA-sgAAVS1을 형성한 후 pHCA의 XmaI 부위에 삽입시켜(Sandig 등, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 1002-1007, 2000), GFP 공여자 벡터 pHCA-AAVS1-GFP-mgmt를 생성하였다.
HDAd-글로빈-공여자 벡터의 클로닝은 3 단계를 수반하였다. 단계 1) 11.8　kb LCR-글로빈-mgmt 카세트를 EcoRV-KpnI 소화에 의해 pHM5-FR-IR-LCR-글로빈-mgmt로부터 방출하고(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 9, 142-152, 2018) pBS-Z로부터 증폭된 2.8　kb 플라스미드 백본과 결찰시켜(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 1, 14057, 2015), pBS-LCR-글로빈-mgmt를 생성하였다. AAVS1 CRISPR 절단 부위에 바로 인접한 2 개의 1.8　kb HA를 PAM 서열이 있는 23　bp sgAAVS1을 함유하는 프라이머를 사용하여 AAVS1-tg 마우스의 골수 세포로부터 단리된 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 5' 및 3' 측면 HA를 pBS-LCR-글로빈-mgmt의 EcoRV 및 KpnI 부위에 각각 순차적으로 삽입하여, pBS-AAVS1-글로빈-mgmt를 생성하였다. 단계 2) pHCA의 nt1588-12121 영역을 EcoRI 소화에 의해 결실시키고 자기-결찰시켜, pHCAS1을 생성하였다. pHCAS1에서의 원래 PacI 부위를 2 개의 어닐링된 올리고 서열을 삽입하여 파괴하였다. 새로운 PacI 클로닝 부위를 BstBI 부위에 생성하여, pHCAS1-MCS를 수득하였다. 이 클로닝 부위는 2 개의 15　bp 상동 영역이 PacI 소화 시 노출되는 방식으로 설계하였다. pHCAS1-MCS의 크기를 1.5　kb NheI 단편을 제거함으로써 추가로 감소시켜, pHCAS1S-MCS를 생성하였다. 단계 3) 상기 2 개 단계로부터의 2 개의 최종 작제물을 PacI 소화한 후, 생성물을 Gibson 어셈블리에 의해 재조합하여, 글로빈 공여자 벡터 pHCA-AAVS1-글로빈-mgmt를 생성하였다.
HDAd5/35++ 벡터의 생산을 위해, 상응하는 플라스미드를 PmeI로 선형화하고 다른 곳에 상세히 기재된 바와 같이(Palmer 등, Mol Ther, 8, 846-852, 2003) Ad5/35++-Acr 헬퍼 벡터(Li 등, 2018. Blood, 1431, 2915-2928)가 있는 116 세포에서 구제하였다(Palmer 등, Mol Ther, 8, 846-852, 2003). 헬퍼 바이러스 오염 수준은 0.05% 미만인 것으로 밝혀졌다. 역가는 6-12x1012 vp/ml였다. 이 연구에 사용되는 모든 HDAd 벡터는 Ad5 섬유 꼬리, Ad35 섬유 샤프트, 및 친화도-향상된 Ad35++ 섬유 놉으로 구성된 키메라 섬유를 함유한다(Wang 등, J Virol, 82, 10567-10579, 2008).
불일치 민감성 뉴클레아제 검정 T7E1 검정 . 게놈 DNA를 이전에 기재된 바와 같이 단리하였다(Miller 등, Nat Biotechnol, 25, 778-785, 2007). AAVS1 표적 부위를 포함하는 게놈 분절을 다음 프라이머를 사용하여 KOD Hot Start DNA 폴리머라제(MilliporeSigma, 매사추세츠주 버링턴 소재)에 의해 증폭시켰다: AAVS1 정방향(서열번호: 208); 역방향(서열번호: 209). PCR 생성물을 혼성화하고 37℃에서 20 분 동안 2.5 단위의 T7EI(NEB)로 처리하였다. 소화된 PCR 생성물을 6% TBE PAGE(Bio-Rad)에 의해 분해하고 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 밴드 강도를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 절단율 % = (1-sqrt(모체 밴드/(모체 밴드 + 절단된 밴드)))x100%
차세대 서열분석: 삽입/결실(indel)의 심층 서열분석을 위해, 예측된 AAVS1 절단 부위 주위의 250-bp 영역을 증폭시키고 Illumina 시스템을 사용하여 생성물을 서열분석하였다. 게놈 DNA를 이전에 기재된 바와 같이 단리하였다(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 1, 14057, 2015). AAVS1 표적 부위를 수반하는 249 bp 게놈 영역을 다음 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: AAVS1 정방향(서열번호: 210); 역방향(서열번호: 211). AMPure XP Beads(Beckman Coulter, 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 사용하여 앰플리콘을 세정한 후, Klenow 단편을 사용하여 dA-테일링을 수행하였다. Illumina-호환성 어댑터를 T4 리가제(New England Biolabs)에 의해 생성물과 결찰시켰다. 고유한 바코드 서열을 PCR에 의해 도입하여 동일한 서열분석 수행 시 다중 샘플을 서열분석하였다. 각 단계는 AMPure XP Beads를 사용한 정제로 이어졌다. 최종 라이브러리를 Qubit(Invitrogen)에 의해 정량화하고 Agilent 2100 Bioanalyzer에서 테스트하여 앰플리콘의 평균 크기를 결정하였다. 앰플리콘을 동일한 몰 농도로 풀링하고 Illumina MiSeq 시스템에서 심층 서열분석하였다. 앰플리콘 당 105 개의 판독물을 생성하여 돌연변이 유형을 적절하게 조사하였다. 서열분석 데이터를 Cas-Analyzer 온라인 툴(available at rgenome.net/cas-analyzer/#!에서 이용가능)을 사용하여 AAVS1 참조 서열에 대해 정렬하였다(Park 등, Bioinformatics, 33, 286-288, 2017, NGS 데이터 분석을 위한 자바스크립트-기반 구현.
유세포 분석: 세포를 FACS 완충액(1　% 열-불활성화 FBS가 보충된 PBS)에 1x106 개 세포/100　μL로 재현탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 FcR 차단 시약(Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 오번 소재)과 함께 배양하였다. 다음으로 염색 항체 용액을 106 개 세포 당 100　μL로 첨가하고 암실에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 FACS 완충액에서 1 회 세척하였다. 2차 염색을 위해 염색 단계를 2차 염색 용액으로 반복하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 분석하였다. 파편을 전방 산란 영역 및 측방 산란 영역 게이트를 사용하여 제외하였다. 그런 다음 단일 세포를 전방 산란 높이 및 전방 산란 폭 게이트를 사용하여 게이팅하였다. 그런 다음 유세포 분석 데이터를 FlowJo(버전 10.0.8, FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. LSK 세포의 흐름 분석을 위해, 세포를 비오틴-접합된 계통 검출 칵테일(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 c-Kit 및 Sca-1에 대한 항체 뿐만 아니라 APC-접합된 스트렙타비딘으로 염색하였다. eBioscience (캘리포니아주 샌디에이고 소재)로부터의 다른 항체는 항-마우스 LY-6A/E(Sca-1)-PE-Cyanine7(클론 D7), 항-마우스 CD117(c-Kit)-PE(클론 2B8), 항-마우스 CD3-APC(클론 17A2), 항-마우스 CD19-PE-Cyanine7(클론 eBio1D3), 및 항-마우스 Ly-66(Gr-1)-PE(클론 RB6-8C5)을 포함하였다. Miltenyi Biotec으로부터의 다른 항체는 항-인간 CD46-APC(클론: REA312)를 포함하였다. 항-마우스 Ter-119-APC(클론: Ter-119)는 BioLegend(캘리포니아주 샌디에이고 소재)로부터 수득하였다.
인간 γ-글로빈의 세포내 염색을 Santa Cruz의 PE-접합된 항-인간 γ-글로빈 항체(클론 51.7)를 사용하여 수행하였다. Invitrogen의 Fix & Perm 세포 투과화 키트를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
실시간 역전사 PCR : 총 RNA를 TRIzolTM 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조업체의 페놀-클로로포름 추출 방법에 따라 50-100　μL 혈액에서 추출한 다음, Qiagen의 Quantitect 역전사 키트를 사용하여 역전사시켜 cDNA를 생성하였다. 키트에 제공된 gDNA 제거 시약으로 RNA 샘플을 처리하여 잠재적인 게놈 DNA 오염을 제거하였다. 비교 실시간 PCR을 Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하고 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 실행하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: 마우스 RPL10(하우스키핑) 정방향(서열번호: 189), 및 역방향(서열번호: 190); 인간 γ-글로빈 정방향(서열번호: 214), 및 역방향(서열번호: 215); 마우스 β-주요 글로빈 정방향(서열번호: 193), 및 역방향(서열번호: 217).
글로빈 HPLC : 개별 글로빈 쇄 수준을 SPD-10AV 다이오드 어레이 검출기 및 LC-10AT 바이너리 펌프가 장착된 Shimadzu Prominence 기기(Shimadzu, 일본 쿄토 소재)에서 정량화하였다. 물/아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산의 38%-58% 구배 혼합물을 Vydac C4 역상 칼럼(Hichrom, 영국 소재)을 사용하여 1 mL/분의 속도로 적용하였다.　
콜로니 형성 단위 검정 . 2500 개의 Lin- 세포를 ColonyGEL 1202 마우스 완전 배지(ReachBio, 워싱턴주 시애틀 소재)에 삼중으로 플레이팅하고 5　% CO2 및 최대 습도에서 37℃에서 12 일 동안 배양하였다. 콜로니를 Leica MS 5 해부 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 열거하였다. HDAd-GFP-공여자-형질도입된 마우스로부터 유래된 콜로니의 경우, GFP 양성 콜로니로 계수하고, 선별하고 분석하였다.
벡터 카피 수의 측정 : 골수 세포 또는 단일 콜로니의 총 DNA를 PureLink Genomic DNA 미니 키트(Invitrogen)에 의해 추출하였다. HDAd-GFP-공여자 또는 HDAd-글로빈-공여자로부터 추출된 바이러스 DNA를 연속으로 희석하고 표준 곡선으로 사용하였다. qPCR을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 power SYBR Green PCR 마스터 믹스를 사용하여 이중으로 수행하였다. 5 ng DNA를 10 μL 반응에 사용하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: GFP 정방향(서열번호: 218), 및 역방향(서열번호: 219); 및 mgmt 정방향(서열번호: 220), 및 역방향(서열번호: 221). 인간 γ-글로빈 프라이머는 실시간 역전사 PCR 단락에 기재되었다.
AAVS1 유전자이식 마우스에서 AAVS1 유전자좌의 국소화 . TLA 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다(de Vree 등, Nat Biotechnol, 32, 1019-1025, 2014). 간단히 말해서, 총 골수 세포로부터의 포름알데하이드 가교된 DNA를 NlaIII으로 소화시켰다. 결찰 및 역가교 후, DNA를 정제하였다. 이 생성물을 NspI로 추가로 소화시키고 결찰시켜 2　kb의 원형 키메라 DNA를 수득하였다. 키메라 DNA를 AAVS1 특이적 TLA 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 정방향(서열번호: 222), 및 역방향(서열번호: 223). PCR 증폭된 생성물로부터의 TLA 라이브러리를 Illumina Nextera XT NGS 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하였다. 쌍형성 단부 서열분석을 NovaSeq에서 수행하였다. TLA 프로토콜은 DNA의 재셔플링으로 이어지며, 따라서 판독물을 다음 설정을 사용한 스플릿-판독 인지 정렬기 BWA(Li 등, Bioinformatics, 26, 589-595, 2010)를 사용하여 정렬하였다: 이전에 제안된 바와 같은 bwasw -b 7(github.com/Cergentis/Cergentis_common에서 온라인 참조)(Vain-Hom 등, 2017. Nucleic Acids Res, 45, e62). 이러한 정렬된 bam 파일을 deepTool을 사용하여 RPKM 정규화된 bigwig 파일로 변환하였다(Ramirez 등, Nucleic Acids Res, 42, W187-191, 2014). 게놈 와이드 분포를 WashU 에피게놈 브라우저를 사용하여 시각화하였다(Zhou 등, Nat Methods, 8, 989-990, 2011).
서던 블롯. 마우스 골수의 게놈 DNA를 EcoRI 또는 Blp1로 소화시키고 Prime-It RmT 무작위 프라이머 표지화 키트(Agilent Technologies)를 사용하여 32P로 표지된 AAVS1- 또는 GFP-특이적 프로브와 함께 서던 블롯에 적용하였다. 비-혼입된 32P dCTP를 MicroSpin G25 칼럼(GE Healthcare)을 통해 원심분리에 의해 제거하였다. 혼성화를 PerfectHyb Plus 혼성화 완충액(Sigma)에서 수행하였다. 블롯을 Amersham Hybond-XL 필름(GE Healthcare)에 노출시켰다.
역PCR: 총 골수 세포, 단일 콜로니, HUDEP-2 세포 혼합물 또는 클론에서의 접합부를 변형이 있는 다른 곳에 기재된 바와 같은 역PCR에 의해 분석하였다(Wang 등, J Virol, 79, 10999-11013, 2005). 간단히 말해서, 게놈 DNA를 진탕하면서 밤새 55℃에서 게놈 DNA 용해 완충액(100 mM Tris-Cl(pH 8.0), 50 mM EDTA, 1%(w/v) SDS, 및 400　μg/mL 프로테이나제 K)과 배양한 후, 페놀-클로로포름에 노출시키고, 이소프로판올로 침전시키고, 70% 에탄올로 세척하여 단리하였다. DNA 샘플을 10 mM Tris/HCL 완충액(pH 8.5)에 용해시켰다. 5　μg의 DNA를 5 시간 동안 37℃에서 50　μL 반응물 중 30 U NcoI로 소화시켰다. 열-불활성화 및 정리 후, 소화된 DNA를 분자내 결찰을 위해 밤새 16℃에서 500　μL 반응 완충액 중 2.5　μL T4 리가제(New England Biolabs, M0202L)로 처리하였다. 열-불활성화 및 정리 후, 재결찰된 생성물을 KOD Hot Start DNA 폴리머라제를 사용하여 역PCR에 사용하였다. 다음 프라이머를 사용하였다: EF1α 정방향(서열번호: 224), 및 역방향(서열번호: 225); pA 정방향(서열번호: 226), 및 역방향(서열번호: 227); HS4 정방향(서열번호: 228); 및 역방향(서열번호: 229). Ef1α 및 pA 프라이머 쌍은 GFP 공여자 벡터-처리된 샘플의 5' 및 3' 접합부를 각각 분석하기 위해 사용하였다. HS4 및 EF1α 프라이머 쌍은 글로빈 공여자 벡터-처리된 샘플의 5' 및 3' 접합부를 각각 분석하기 위해 사용하였다. PCR 앰플리콘을 겔 정제하고, 클로닝하고, 서열분석하고, 정렬하여 통합 부위를 식별하였다.
In-Out PCR: 게놈 DNA를 역PCR 섹션에 기재된 바와 같이 추출하였다. 5 ng 게놈 DNA를 25 μl의 반응물에서 KOD Hot Start DNA 폴리머라제에 의한 In-Out PCR용 주형으로 직접 사용하였다. 다음 PCR 프로그램을 사용하였다: 94℃ 2 분; 98℃ 10 초, 66℃ 30 초 및 68℃ 1.5 분으로 5 회 주기; 98℃ 10 초, 63℃ 30 초 및 68℃ 1.5 분으로 5 회 주기; 98℃ 10 초, 60℃ 30 초 및 68℃ 1.5 분으로 15 회 주기; 68℃ 5　분. 사용된 프라이머는 In-Out P1(서열번호: 230), In-Out P2(서열번호: 231), 및 In-Out P3(서열번호: 232)이다. 생성물을 1% 아가로스 겔에 용해하였다. 1 개의 단일 1.6 kb 밴드는 이중대립유전자성 표적화된 통합을 나타내고; 1 개의 1.6 kb 및 1 개의 2.0 kb 밴드는 단일대립유전자성 표적화된 통합을 나타내고; 1 개의 단일 2.0 kb 밴드는 잠재적인 표적외 통합을 나타낸다.
표적외 절단 부위의 인 실리코 예측 : 인간 또는 마우스 게놈에서 AAVS1 가이드 서열의 표적외 부위를 sanger.ac.uk/htgt/wge/find_off_targets_by_seq에서 이용가능한 온라인 툴을 사용하여 예측하였다.
동물 연구: 모든 실험은 통제 기관 심의 위원회 및 IACUC의 승인을 받아 수행하였다. 마우스를 특이적 무병원체 시설에서 수용하였다. AAVS1 유전자이식 마우스(C3; B6-Tg(AAVS1)A1Xob/J)(The Jackson Laboratory)는 Bakowska 등(Gene Ther, 10, 1691-1702, 2003)에 기재된 바와 같이 마우스의 동결보존된 배아로부터 회수하였다. 마우스는 인간 AAVS1 유전자좌에 대해 반접합성이다. AAVS1 유전자이식 마우스를 인간 CD46+/+ 마우스와 교배시켜 생체외 연구를 위한 AAVS1+/-/CD46+/- 마우스 및 생체내 HSC 형질도입 연구를 위한 AAVS1+/-/CD46+/+ 마우스를 수득하였다. 다음 프라이머를 CD46 마우스의 유전형 분석에 사용하였다: 정방향(서열번호: 233), 및 역방향(서열번호: 234). CD46에 동형접합성 또는 이형접합성인 마우스는 유세포 분석에 의해 검출된 PBMC에 대한 CD46 발현의 상이한 강도에 의해 식별하였다. AAVS1 이식유전자의 유전형 분석은 Jackson Labs의 권고된 프로토콜에 따라 PCR에 의해 수행하였다.
골수 Lin - 세포 이식: 수용자는 6 - 8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스였다. 이식 당일에, 수용자 마우스를 1000 Rad로 조사하였다. 조사 4 시간 후 1x106 개의 Lin- 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. 이 프로토콜은 생체외 형질도입 Lin- 세포의 이식 및 2차 수용자로의 이식에 사용되었다.
HSC 동원 및 생체내 형질도입 : 이 절차는 이전에 기재되었다(Richter 등, Blood, 128, 2206-2217, 2016). 간단히 말해서, HSC를 인간 재조합 G-CSF의 s.c. 주사(5　μg/마우스/일, 4 일)(Amgen 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재) 이어서 5 일째에 AMD3100의 s.c. 주사(5　mg/kg)(Sigma-Aldrich)에 의해 마우스에 동원하였다. 또한, 동물은 바이러스 주사 16 시간 및 2 시간 전에 덱사메타손(10 mg/kg)을 i.p.로 받았다. AMD3100 후 30 및 60 분에, 동물에게 주사 당 각 바이러스에 대해 4x1010 vp의 용량으로 안와하정맥총을 통해 HDAd-CRISPR 및 HDAd-GFP-공여자 또는 HDAd-글로빈-공여자를 정맥내로 주사하였다. 4 주 후, 마우스에게 O6-BG(15　mg/kg, IP)를 2 회, 30 분 간격으로 주사하였다. O6-BG의 두번째 주사 1 시간 후, 마우스에게 BCNU(5　mg/kg, IP)를 주사하였다. BCNU 용량을 두번째 주기에 10　mg/kg로 증가시켰다. BCNU 및 O6-BG는 둘 다 Sigma-Aldrich로부터 수득하였다.
통계적 분석: 다중 그룹의 비교를 위해, 다중 비교를 위한 본페로니 사후-테스트와 함께 일원 및 이원 분산 분석(ANOVA)을 이용하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 버전 6.01(GraphPad Software Inc., 캘리포니아주 라호이아 소재)을 사용하여 수행하였다.
결과
HDAd-CRISPR 및 HDAd-공여자 벡터의 설계 . CRISPR/Cas9를 발현하는 HDAd5/35++ 벡터를 생성하였다. 벡터는 AAVS1 유전자좌 내에서 ds DNA 파괴를 생성할 수 있다(도 55a). 이전 연구는 이 유전자좌로의 부위-특이적 통합이 1차 인간 세포에서 부작용 없이 강력한 이식유전자 발현을 허용하였음을 입증하였다(Lombadro 등, Nat Methods, 8, 861-869, 2011). 상응하는 HDAd-CRISPR 벡터의 활성을 테스트하기 위해, HSC에 대해 강화된 세포 분획인 인간 CD34+ 세포를 형질도입하였다. 42%의 빈도로 감염 후 3 일차에 AAVS1 부위-특이적 절단은 불일치 민감성 뉴클레아제 검정 T7E1 검정에 의해 입증되었다(도 55b). HDAd-CRISPR 삽입/결실(indel)의 심층 서열분석을 위해, 예측된 AAVS1 절단 부위 주위의 250-bp 영역에서 PCR 증폭을 수행하고 Illumina 시스템을 사용하여 생성물을 서열분석하였다(도 55c). indel의 80%는 1 내지 20 bp 범위의 결실이었고 10%만이 1 내지 2　bp 마이크로-삽입이었다.
HDAd5/35++ 벡터를 공여자 벡터로 사용하였다. 첫번째 HDAd-공여자 벡터는 CRISPR/Cas9 표적 부위에 바로 인접한 영역에 상동인 0.8 kb 길이 영역에 의해 양측에 플랭킹된 GFP 및 mgmtP140K에 대한 발현 카세트를 함유하였다(도 55d). 선형 이중-가닥 아데노바이러스 게놈은 바이러스가 세포에 진입하여 핵으로 전위될 때 생성된 "말단 단백질 - TP"와 공유적으로 연결된다(Shenk, Fields Virology, 2:2111-2148, 1996). 이는 TP가 헬퍼 바이러스 유래인 HDAd5/35++ 게놈의 경우와 동일하다. 공여자에서 유리 DNA 단부의 부재는 HDR을 크게 감소시키는 것으로 생각된다(Cristea 등, Biotechnol Bioeng, 110, 871-880, 2013). AAVS1 CRISPR에 대한 sgRNA 표적 부위는 공여자 이식유전자 카세트를 플랭킹하는 공여자 벡터 내로 혼입되었다(도 55d). 따라서 HDAd-CRISPR 및 HDAd-GFP-공여자의 공동 감염은 염색체 AAVS1 표적 부위에서 dsDNA 파괴를 동시에 생성하고 핵 내부에서 유입 HDAd-공여자 게놈으로부터 공여자 카세트를 방출하여야 한다. 1000 및 2000　vp/세포의 총 MOI에서 감염 후 2 일차에 CD34+ 세포에서 각각 13.2 및 18.1%의 효능을 갖는 공동 감염된 HDAd-GFP-공여자 벡터로부터 공여자 카세트의 IA HDAd-CRISPR-매개 방출이 입증되었다(도 55e). 이 발견은 또한 CRISPR/Cas9가 이중-가닥 선형 아데노바이러스 DNA를 절단할 수 있으며, 항-바이러스 요법에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
시험관내 표적화된 통합. 먼저, HDAd-CRISPR + HDAd-공여자 벡터 시스템을 무작위 통합을 매개하는 SB100x 벡터 시스템과 직접 비교하여 시험관내에서 표적화된 통합에 대해 테스트하였다(도 56a). 인간 적혈구 전구체 세포인 HUDEP-2 세포를 사용하였다. 이 세포주는 이배체이며 단일 콜로니 확장을 허용하여 통합 부위 분석을 용이하게 하는 것을 특징으로 한다. HUDEP-2 세포의 형질도입 후 2 일차에 수행된 GFP 유세포 분석은 유사한 형질도입률을 나타내는 SB100x-매개 및 표적화된 통합 시스템에 대한 GFP-양성 세포의 유사한 백분율을 입증하였다(도 56b, 상부 패널). 2 일차에 GFP 발현은 HDAd-GFP-공여자 단독으로의 형질도입이 유사한 GFP 마킹을 초래할 수 있기 때문에 에피솜 게놈으로부터 유래할 가능성이 있다. 21 일 동안 형질도입된 세포를 배양한 후, 세포 증식으로 인해, 에피솜 게놈은 HDAd-GFP-공여자 단독 설정에서 GFP 발현의 부재를 나타낼 때 사라졌다. 21 일차에, 세포의 4.52% 및 1.82%가 각각 SB100x-매개 및 표적화된 통합 시스템에 대해 GFP-양성이었다(도 56b, 하부 패널). 이는 SB100x 시스템이 더 높은 안정된 형질도입률을 부여함을 시사한다. 그러나, 평균 형광 강도(MFI)에 의해 반영되는 GFP 발현 수준은 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자로 형질도입된 세포에서 21 일차에 세포 집단(도 56c) 및 단일 클론 수준(도 56d) 둘 다에서 더 높았다. 벡터 통합 분석은 단일 클론에서 수행하였다. 이식유전자 카세트에 플랭킹하는 긴 상동성 영역으로 인해, 벡터 통합 부위 분석에 통상적으로 사용되는 도구(예를 들어 LAM-PCR)를 이용하는 것은 가능하지 않았다. 벡터-세포 DNA 접합부의 존재를 입증하기 위해, 4　kb 단편으로 게놈 DNA의 엔토뉴클레아제 절단, 이의 원형화, 및 이식유전자 특이적 프라이머를 사용한 후속 PCR을 수반하는 역PCR(iPCR) 방법을 사용하였다(Wang 등, J Virol, 79, 10999-11013, 2005). 결과는 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자 형질도입된 HUDEP-2 세포로부터 유래된 모든 테스트된 36 개 콜로니가 AAVS1 부위로 통합된 이식유전자를 가짐을 나타내었다(도 57a). 이는 표적화된 통합이 있는 클론에서 균질한 높은 수준의 이식유전자 발현과 일치한다. AAVS1 및 이식유전자 특이적 프라이머를 사용한 In-/out-PCR은 36 개 콜로니 중 3개에서의 통합이 두 대립유전자에서 발생하였고; 36 개 중 31 개가 단일대립유전자성 통합을 가졌고, 2 개가 분명히 연쇄체 통합체를 가짐을 입증하였다(도 57b). 대조적으로, 특이적 유전자좌의 우선적 표적화가 없는 SB100x-매개 무작위 통합(Wang 등, 2019. J Clin Invest, 129, 598-615, Boehme 등, Mol Ther Nucleic Acids, 5, e337, 2016)은 다양한 유전자 침묵 수준을 초래하였다(도 56e). 유사한 수준의 벡터 카피 수를 SB100x 및 표적화된 통합을 갖는 클론에서 검출하였다(도 56f).
요약하면, 시험관내 연구는 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자 시스템이 고효율로 표적화된 통합을 부여하고 SB100x 매개 시스템보다 더 높은 GFP 발현 수준을 초래하였음을 제시하였다. 안정된 통합의 효능은 표적화된 시스템에 대해 40% 더 낮았다.
HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자를 사용한 AAVS1/CD46 HSC의 생체외 형질도입 및 치명적으로 조사된 수용자 내로 후속 이식 . 다음으로, 표적화된 통합 시스템을 AAVS1/CD46tg 마우스의 HSC에서 테스트하였다. HSC에 대해 강화된 골수 세포 분획인 계통-음성(Lin-) 세포의 생체외 형질도입 후 표적 부위 절단 빈도는 1000　vp/세포의 MOI에서 HDAd-CRISPR 벡터로 형질도입 후 25%였다(도 58a). 0% 및 50% 절단에서 삽입/결실의 백분율은 도 58b에 제시된다. 예시적인 서열은 도 58c에 제시된다. HDAd-CRISPR 단독, HDAd-GFP-공여자 단독, 및 둘 다의 조합으로 생체외에서 형질도입된 AAVS1/CD46 Lin- 세포를 치명적으로 조사된 C57Bl/6 마우스로 이식한 다음, 16 주 동안 추적하였다(도 59a). PBMC에 대한 인간 CD46 발현에 기반하여 이식된 세포의 생착을 표시된 시점에서 CD46+ PBMC의 퍼센트에 의해 측정하였다. 형질도입된 공여자 세포는 CD46을 발현한 반면(도 60b), 수용자 C57Bl/6 마우스는 발현하지 않았다. PBMC(혈액), 비장, 및 뼈에서 CD46+ 세포의 백분율은 도 60c 및 60d에 제시된다. GFP 마커의 발현을 또한 콜로니 및 풀링된 콜로니 세포에서 분석하였다.
공여자 세포 생착률은 모든 3 가지 설정에 대해 비슷하였으며(도 60) 이는 HDAd-CRISPR 및 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자 벡터에 의해 HSC에 도입된 게놈 변형이 HSC 생물학, 특히 치명적으로 조사된 수용자의 다중계통 재증식에 해로운 효과를 미치지 않았음을 시사한다. 최대 100%에 도달하는 GFP 마킹률은 이식유전자가 안정하게 발현된 HSC/전구체의 3 차례의 O6BG/BCNU 선택 후 PBMC에서 보였다(도 59b, 59c). 선택 전(이식 4 주 후)에, GFP+ PBMC의 백분율은 1.1%였으며, 이는 표적화된 통합이 드문 사건임을 나타낸다. GFP+ PBMC는 HDAd-GFP-공여자 단독으로 형질도입된 Lin- 세포로 이식된 마우스에서 평균 0.2% 미만이었다. 이는 안정된 이식유전자 발현을 달성하기 위해 CRISPR/Cas9-매개 dsDNA 파괴의 필요성에 관해 시사한다. 이식 후 16 주차에 분석된 마우스는 골수, 비장, 및 PBMC에서 분석된 모든 계통에서 GFP 마킹을 제시하였다(도 59d). GFP 마킹률은 2차 이식 수용자에서 16 주 동안 유지되었으며, 이는 원시 HSC가 혈액, 비장, 및 골수를 포함하여(도 61b, 61c), 콜로니 및 풀링된 콜로니 세포에 대해 제시된 바와 같이(도 61d), HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자 벡터 시스템으로 유전적으로 변형됨(도 61a)을 입증한다. 인간 CD46+ 세포의 퍼센트 및 혈액, 비장, 및 골수에서의 백분율은 도 61e 및 61f에 추가로 제시된다.
HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자를 사용한 AAVS1/CD46tg 마우스의 생체내 HSC 형질도입. AAVS1/CD46-유전자이식 마우스의 생체내 HSC 형질도입을 위해, HSC를 G-CSF/AMD3100의 피하 주사에 의해 골수에서 말초 혈류로 동원하고 정맥내로 전달된 HDAd-CRISPR + HDAd-GFP-공여자 벡터에 의해 생체내에서 형질도입하였다(도 62a). 3 주기의 O6BG/BCNU로 생체내 선택 후, 마우스의 60%는 개별 동물에서 35 내지 95% GFP+ PBMC 범위의 PBMC에서 GFP 발현을 나타내었다(도 62b). 생체내 형질도입 후 16 주차에, 혈액, 비장 및 골수의 단핵 세포에서 유사한 마킹을 보였다(도 62c). 혈액, 비장 및 골수의 CD3+, CD19+, 및 Gr-1+ 계통 세포에서 GFP 마킹을 보였다(도 62d). "반응자"의 골수에서, LSK 세포의 50% 초과(HSC에 대해 강화된 분획)는 GFP-양성이었다(도 62d, 마지막 그룹). 이는 또한 전구체 콜로니를 형성하는 능력인 HSC에 대한 기능적 검정에 의해 반영되었다(도 62e). 또한, 원시의 장기간 재증식 HSC의 형질도입은 2차 수용자에서 제시되었다(표시된 시험에서 GFP+ PBMC의 백분율(도 63a), 혈액, 비장, 및 골수에서 GFP+ 세포의 백분율(도 63b, 63c); 인간 CD46+ 세포의 백분율(도 63d), 및 혈액, 비장, 및 골수에서의 백분율(도 63e) 참조). 생체내 HSC 형질도입/선택 절차는 골수 세포 조성물 및 조혈에 부정적인 영향을 미치지 않았다(도 62f).
HDAd-CRISPR 및 HDAd-글로빈-공여자 벡터의 생체외 및 생체내 HSC 형질도입. HDAd-GFP-공여자 벡터를 사용한 연구는 대부분의 동물에서 안정된 HSC 형질도입을 시사하지만, 더 높은 비율의 반응자가 바람직할 것이다. 이는 HDR-매개 통합의 효능을 증가시킬 필요가 있으며, 상동성 아암의 길이를 증가시킴으로써 달성될 수 있다(Balamotis 등, Virology, 324, 229-237, 2004, Ohbayashi 등, Proc Natl Acad Sci USA, 102, 13628-13633, 2005, Suzuki 등, Proc Natl Acad Sci USA, 105, 13781-13786, 2008). CRISPR/Cas9 절단 부위 주위의 AAVS1 게놈 서열에 상동인 1.8　kb 영역을 갖는 새로운 HDAd-공여자 벡터를 생성하였다(도 64a). 혈색소병증의 유전자 요법에서 적용하기 위해, 미니 γ-글로빈 LCR의 제어 하에 인간 γ-글로빈 유전자(HBG1)를 사용하였다. HDAd-글로빈-공여자 벡터를 생체외 및 생체내 HSC 형질도입 프로토콜 둘 다에서 테스트하였다. 생체외 형질도입 설정에서(도 64b), 모든 마우스가 말초 적혈구(RBC)의 80%에서 γ-글로빈을 발현하는 마우스에 반응하였음을 관찰하였다(도 64c). 혈액 및 골수에서 γ-글로빈-양성 적혈구(Ter119+) 세포의 백분율은 비-적혈구(Ter119-) 세포의 백분율보다 상당히 더 높았다(도 64d). γ-글로빈 MFI에 대한 경우도 동일하였다(도 64e). 이는 미니-LCR이 적혈구 세포에서 우선적 발현을 부여함을 시사한다. 16 주차에, γ-글로빈 수준은 HPLC에 의해 측정된 성체 마우스 γ-글로빈 수준의 20.52(+/-5.66)%(도 64f) 및 qRT-PCR에 의해 22.33(+/-6.21)%(도 64g)였다. SB100x-시스템을 사용한 동일한 레지멘 하에 수행된 이전 연구에서, γ-글로빈 발현 수준은 HPLC에 의해 15.74(+/-2.69)% 및 qRT-PCR에 의해 15.40(+/-9.21)%였다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 9, 142-152, 2018). 이는 γ-글로빈 발현 수준이 SB100x 시스템과 비교하여 표적화된 통합 시스템에 대해 더 높음을 의미한다. 사실, 표적화된 통합 시스템의 경우, β0/β0 지중해빈혈 또는 겸상적혈구병 환자에 대해 성인 글로빈의 20% γ-글로빈으로 생각되는 치유 수준 범위에 있을 것이다(Wang 등,. J Clin Invest, 129, 598-615, 2019). 이전 연구와 일치하게(Wang 등,. J Clin Invest, 129, 598-615, 2019), 16 주차에 게놈 당 2 개의 통합 벡터 카피를 단일 Lin- 세포-유래 콜로니에서 평균으로 측정하였다(도 64h). Lin- 세포의 생체외 HSC 형질도입은 치명적으로 조사된 수용자에서 다중계통 생착 및 완전한 조혈 재구축에 대한 능력에 영향을 미치지 않았다(표시된 시점에서 인간 CD46+ 세포의 백분율(도 65a), 혈액, 비장, 및 골수에서의 백분율(도 65b) 참조). 2차 HSC 이식 수용자의 분석은 HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자 벡터로 생체외 형질도입 이어서 생체내 선택이 장기간 재증식할 수 있는 HSC의 풀에 영향을 미치지 않았음을 나타내었다(RBC에서 인간 γ-글로빈+ 세포의 백분율(도 66a), 인간 CD46+ 세포의 백분율(도 66b), 및 혈액 및 골수에서의 백분율(도 66c) 참조).
HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자 벡터를 사용한 생체내 HSC 형질도입 연구에서(도 67a), 생체내 선택 후, 5 마리 마우스 중 4 마리가 개별 마우스에서 40 내지 97% γ-글로빈+ RBC 범위로 RBC에서 안정된 γ-글로빈 발현을 나타내었다(도 67b). γ-글로빈 발현은 적혈구 세포에서 우선적으로 밝혀졌다(도 67c, 67d). RBC에서 γ-글로빈 발현 수준은 성체 마우스 γ-글로빈 수준에 대해 HPLC에 의해 23.97(+/-7.22)%(도 67e, 67h) 및 qRT-PCR에 의해 24.53(+/-7.34)%(도 67f)였다. 세포 당 벡터 카피 수는 개별 마우스에서 1.5 내지 2.5 개 범위였다(도 67g). 동일한 생체내 HSC 형질도입/선택 설정에서, SB100x 기반 γ-글로빈 벡터를 사용하여, 게놈 당 평균 2 개의 통합 벡터 카피를 갖는 γ-글로빈 수준은 HPLC에 의해 10.5(+/-3.1)% 및 qRT-PCR에 의해 12.17(+/-3.38)%였다(Wang 등, J Clin Invest, 129, 598-615, 2019). 치명적으로 조사된 수용자 내로 HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자를 사용한 생체내 형질도입 후 16 주차에 수확된 골수 Lin- 세포의 이식은 성체 β-글로빈의 평균 24% γ- 수준으로 16 주에 걸쳐 RBC에서 100% 생착 및 안정된 γ-글로빈 발현을 나타내었다(표시된 시점의 PBMC에서 인간 CD46+ 세포의 백분율(도 68a); 표시된 시점의 말초 혈액에서 γ-글로빈+ 세포의 백분율(도 68b); 마우스 β-주요 단백질의 백분율로서 인간 γ-글로빈(도 68c); 및 혈액, 비장, 및 골수에서 백분율(도 68d) 참조).
요약하면, HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자를 사용한 HSC 형질도입 연구는 SB100x-기반 시스템을 사용한 이전 연구에서 달성된 것보다 상당히 더 큰 수준으로 안정된 γ-글로빈 발현을 초래하였다.
AAVS 유전자이식 마우스에서 AAVS1 유전자좌의 국소화 . 통합 부위 분석을 위한 역PCR(iPCR)은 AAVS1/CD46-유전자이식 마우스의 게놈에서 AAVS1 유전자좌 국소화에 대한 지식이 필요하다. 이를 결정하기 위해, 물리적으로 근위 서열의 가교를 수반하는 표적화된 유전자좌 증폭(TLA)/PCR 기술을 사용하였다(de Vree 등, Nat Biotechnol, 32, 1019-1025 2014; 재료 및 방법 참조). 그런 다음 AAVS1/CD46-tg 마우스의 골수 세포에서 수득된 TLA 데이터를 참조 마우스 게놈과 정렬하였다(도 69). TLA 결과는 위치 (Chr14:110443871-110461834)에서 염색체 14에 통합됨을 나타낸다(도 55b). 이 정보를 사용하여, 프라이머를 사용하여 유전자좌를 서열분석하였다(도 70). 왼쪽에서 오른쪽으로 및 오른쪽에서 왼쪽으로 향하는 AAVS1 유전자좌의 반복이 발견되었다. 두 말단 반복부(# 1 및 #5)를 각각 4.5 및 2.8　kb 길이로 절두하였다. 반복부 #5는 완전한 5' 상동성 영역이 결여되었다. 이러한 표적 부위 무리가 통합 부위 분석을 복잡하게 만들었다. HDAd-CRISPR + HDAd-공여자 시스템에 의한 통합에 대한 이론적 결과의 일부는 도 70에 요약되어 있다.
HDAd-CRISPR+HDAd-공여자를 사용한 생체외 및 생체내 HSC 형질도입 후 염색체 통합. 먼저 게놈 서던 블롯을 16 주차에 수확된 골수 세포의 DNA에서 수행하였다. EcoRI-소화된 게놈 DNA와 AAVS1 특이적 프로브의 혼성화는 모든 분석된 마우스에서 AAVS1 유전자좌의 하나(또는 그 이상)의 반복부 내로 공여자 카세트의 통합을 나타내는 3.9　kb-특이적 밴드를 나타내었다(도 71a). Blp1-소화된 DNA와 GFP 프로브의 혼성화는 전장 반복부 #2-4로의 통합을 나타내는 10 마리 마우스 중 5 마리에서 5.8 kb 신호를 초래하였다(도 71b). 5 및 6 kb 신호는 반복부 #1 및 5 각각으로의 통합 결과일 수 있다. 10 마리 마우스 중 2 마리는 여러 AAVS1 모티프 반복부 내로의 통합을 갖는 것으로 나타났다. 이식유전자/염색체 접합부의 존재를 입증하기 위해, iPCR을 마우스의 게놈 DNA에서 수행하였다(도 72a, 72b). 분석된 8 마리 마우스 중 6 마리는 AAVS1 부위로의 HDR-매개 통합과 일치하는 PCR 생성물을 나타내었다(도 72b). 이들 마우스 중 여러 마리는 염색체 5 상의 CRISPR/Cas9 표적외 부위 중 하나로의 통합을 초래하는 추가적인 밴드를 가졌다(도 72b). 접합부로서 ITR을 수반하는 전장 HDAd 게놈의 통합에서 유래된 밴드가 또한 발견되었다. 흥미롭게도, 이러한 통합된 전장 HDAd 게놈은 CRISPR AAVS1 표적 부위를 함유하는 염색체인 염색체 14 상에 있었다(도 72b). 골수 세포의 풀에서 유래된 이러한 결과를 복잡하지 않게 하려는 시도에서, d GFP+ 골수 Lin- 세포를 플레이팅하여 단일 세포에서 유래된 전구체 콜로니를 생성하였다(도 72c). AAVS1로의 HDR-통합에 특이적인 1 개의 밴드만 있는 마우스(예를 들어 마우스 #943)의 콜로니에 대한 분석은 모든 콜로니에서 균일한 신호를 나타낸 반면, 추가적인 표적외 통합을 갖는 마우스(예를 들어 #946)의 콜로니는 키메라 패턴을 나타내었으며: 10 개 콜로니 중 9 개는 표적내 통합만을 가졌고, 1 개 콜로니는 표적내 및 표적외 통합을 둘 다 함유하며, 이는 게놈 당 통합된 이식유전자의 평균 수가 2이기 때문에 가능하다. HDAd-CRISPR 및 HDAd-글로빈-공여자 벡터를 사용한 생체외 및 생체내 형질도입 연구에서 골수 세포의 통합 부위 분석은 유사한 결과를 보였다(도 73a 및 73b는 표적내 통합(도 73a) 및 표적내 및/또는 표적외 통합을 갖는 샘플(도 73b)을 나타낸다). HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자를 사용한 생체외 HSC 형질도입 설정에서, HDAd-GFP-공여자 벡터를 사용한 생체내 HSC 형질도입 연구와 비교하여 표적화된 통합을 갖는 동물의 더 높은 비율이 발견되었다. 이는 더 긴 상동성 영역에 기반한 더 높은 HDR 효능 때문일 수 있다.
전반적으로 이러한 통합 연구는 AAVS1 유전자좌로 표적화된 통합의 높은 빈도를 나타낸다. 통합 분율은 CRISPR 표적외 부위 및 아마도 표적 부위에 함유된 염색체 상의 CRISPR-촉발된 큰 결실을 수반하는 영역으로 발생하였다.
논의. 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터는 감마-레트로바이러스 벡터와 대조적으로 임상 HSC 유전자 요법 시험에서 삽입 부위-연관 악성 클론 확장과 연관되지 않았다. 그러나, 이 위험은 비-인간 영장류에서 최근 연구에 나타낸 바와 같이 완전히 제외될 수는 없었다(Espinoza 등, Mol Ther, 6, 1074-1086, 2019). 이론적으로, SB100x에 의해 매개되는 무작위 통합 패턴 및 활성화 유전자 및 프로모터 내로 통합을 위한 선호도 결여는 더 안전해야 하지만 유전독성에 관한 우려가 남아있다. 따라서, 관련 분야의 주요 노력은 AAVS1 부위과 같은 미리 선택된 부위로 표적화된 이식 유전자 통합을 목표로 한다. 인간 HSC에서 아연 핑거 뉴클레아제 mRNA 및 AAV6-매개 공여자 주형 전달은 AAVS1 유전자좌로 50% 초과의 표적화된 통합을 초래하였다(De Ravin 등, Nat Biotechnol, 34, 424-429, 2016).　 공여자 주형을 전달하기 위해 AAVS1-특이적 CRISPR/Cas9 RNP 및 AAV6을 이용하는 다른 연구에서, 부위-특이적 통합의 빈도는 25%였다(Johnson 등, 2018. Sci Rep, 8, 12144).　 CCR5로의 표적화된 통합에 대해 유사한 비율이 달성되었다(Hung 등, Mol Ther, 26, 456-467, 2018).
AAVS1로의 표적화된 통합을 위한 이 접근법은 다수의 새로운 측면이 있다. (i)　 공여자 주형을 전달하기 위한 헬퍼-의존적, 캡시드-변형된 HDAd벡터의 사용. 상응하는 게놈은 두 단부 상에서 바이러스 TP 단백질에 공유적으로 연결된 이중가닥 선형 DNA이다. 단일-가닥 AAV6 공여자 벡터와 대조적으로, 이중-가닥 선형 아데노바이러스 DNA는 HDR에 대한 최적의 주형이 아닌 것으로 생각된다. 이러한 잠재적인 단점을 보완하기 위해, AAVS1 CRISPR/Cas9 절단 부위를 HDAd-공여자 벡터 내로 혼입하여 유리 "재조합원성" DNA 단부를 생성하였다. (ii) HDAd벡터의 삽입 용량은 30　kb이기 때문에 rAAV6 또는 IDLV 벡터의 패키징 용량을 초과하는 상동성 아암을 혼입하는 것이 가능하였다. 이전 연구(Balamotis 등, Virology, 324, 29-237, 2004, Ohbayashi 등, Proc Natl Acad Sci USA, 102, 13628-13633, 2005, 및 Suzuki 등, Proc Natl Acad Sci USA, 105, 13781-13786, 2008) 및 0.8 및 1.8　kb 상동성 영역을 갖는 HDAd-공여자 벡터의 비교는 상동성을 증가시키는 것이 높은 수준의 이식유전자 발현을 갖는 반응자 마우스의 수 뿐만 아니라 표적화된 통합을 갖는 마우스의 분율을 개선시켰음을 시사한다. (iii) 큰 HDAd5/35++ 삽입 용량은 또한 mgmtP140K-기반 생체내 선택 카세트를 공여자 주형에 포함하는 것을 허용하여, 저용량 O6BG/BCNU를 사용한 단기간 치료에 의해 형질도입된 원시 HSC의 풀에 영향을 미치지 않으면서 자손 세포의 선택적 생존 및 확장을 매개한다(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev, 8, 52-64, 2018). HDR의 낮은 효능 및 결과적으로 HSC에서 표적화된 통합을 고려하면(Genovese 등, Nature, 510, 235-240, 2014), 생체내 HSC 선택은 말초 혈액 세포에서 높은 이식유전자 마킹 수준을 달성하는 데 중요한 것으로 보인다. (iv) 마지막으로, 고수율 HDAd5/35++ 벡터 생산의 용이성 및 원시 HSC에 대한 향성으로 인해, 이들은 동원된 동물에 정맥내 주사를 통한 생체내 HSC 형질도입에 사용될 수 있다. 따라서, 표적화된 이식유전자 통합으로 혈색소병증의 생체내 HSC 유전자 요법의 원리 증명을 수행하는 것이 가능하였다.
안정된 이식유전자(GFP 또는 γ-글로빈) 발현을 달성하기 위해, HDAd-공여자 및 HDAd-CRISPR의 공동 감염이 필수적이었으며, 이는 CRISPR-매개 게놈 DNA 파괴 및, 가장 가능성 있게는 HDAd-공여자 벡터에서 공여자 주형의 방출이 통합을 크게 자극하였음을 시사한다. HDAd-공여자 + HDAd-CRISPR을 사용한 생체내 형질도입 후 HSC로 이식유전자 통합을 위한 지표는 생체내 선택 완료 후 안정된 높은 수준의 이식유전자 발현을 나타낸 마우스의 분율(즉 "반응자")이었다. HDAd-GFP-공여자 + HDAd-CRISPR의 경우 16 개 중 6 개(37.5%) 및 HDAd-글로빈-공여자 + HDAd-CRISPR의 경우 5 개 중 4 개(80%)였다. 특히, 표적화된 통합 빈도가 높은 "반응자" 비율은 생체외 형질도입 설정에서 두 벡터에 대해 100%였다. 이는 표적화된 생체내 HSC 형질도입 접근법에 대한 제한 인자가 HSC 감염의 효능임을 나타낸다. 초기 감염 단계는 이론적으로 최적화된 HSC 동원 레지멘(Psatha 등, Hum Gene Ther Methods, 25, 317-327, 2014) 및 하루 간격으로 2 차례의 HDAd 주사에 의해 개선될 수 있다.
이러한 데이터는 벡터 시스템이 생체외 및 생체내 형질도입 설정에서 HSC의 표적화된 통합을 달성하기 위한 효율적인 도구임을 나타낸다. 이는 대부분 HDAd-공여자 벡터를 비-분할 세포의 핵으로 전달하는 높은 효능, 벡터 백본에서 공여자 카세트를 방출하는 능력, 및 큰 상동성 영역을 혼입하는 HDAd 벡터의 용량 때문일 수 있다.
이 연구에서 중요한 발견은 표적화된 통합 시스템이 시험관내, 생체외, 및 생체내 형질도입 설정에서 SB100x-기반 시스템보다 더 높은 이식유전자 발현 수준을 부여하였다는 점이었다. 이는 특히 성인 글로빈 수준의 20%를 초과하는 수준에서 γ-글로빈을 필요로 하는 혈색소병증(β0/β0 지중해빈혈 및 겸상적혈구병)의 유전자 요법과 관련된다. HDAd-CRISPR + HDAd-글로빈-공여자를 사용하여 생체외 또는 생체내 형질도입된 "반응자" 마우스에서, 이러한 이론적으로 치유 수준이 달성되었다. 이는 SB100x 트랜스포사제 시스템이 γ-글로빈 유전자 추가를 위해 활용된 지중해빈혈 마우스 모델의 이전 연구에 비해 중요한 개선이다(Wang 등, J Clin Invest, 129, 598-615, 2019). 이식유전자 발현에 대한 에피게놈 효과는 HSC(Wang 등, Genome Res, 17, 1186-1194, 2007, Huser 등, PLoS Pathog, 6, e1000985, 2010, van Rensburg 등, Gene Ther, 20, 201-214, 2013) 및 AAVS1 유전자이식 마우스에서 개방 염색질 구성을 유지하는 것으로 알려진 AAVS1 유전자좌로의 통합 후 덜 명백할 수 있다. 한편으로, 무작위 SB100x-매개 통합은 침묵을 겪는 영역으로 이식유전자를 배치하는 것을 제외할 수 없다.
통합 부위 분석은 HUDEP-2 세포의 시험관내 형질도입 후 거의 100% 표적화된 통합 효능을 시사한다. 생체외 및 생체내 HSC 형질도입 연구에서, 게놈 골수 DNA에 대한 서던 블롯 및 iPCR은 둘 다 골수 HSC에서 효율적인 표적화된 통합을 나타내었다. 예를 들어, 통합 접합부의 iPCR은 마우스의 75%에서 표적화된 통합을 입증하였으며, 이러한 마우스 중 대부분은 표적외 통합이 없었다. 이는 단일 CFU에서 유래된 콜로니의 분석에 의해 추가로 확인되었다. 낮은 빈도에서, 통합은 또한 인 실리코 예측된 CRISPR Cas9 표적외 부위 중 2 개에서 발견되었다. 또한, AAVS1 유전자좌를 보유하는 염색체인 염색체 14에서 통합된 전장 HDAd-공여자 게놈이 발견되었다. HDAd ITR은 DNA 파괴가 일어나기 쉽고 이는 DNA 파괴가 발생하는 게놈 부위로 비효율적인 통합을 초래할 수 있음이 이전에 밝혀졌다(Wang 등, J Virol, 79, 10999-11013, 2005, Wang 등, J Virol, 80, 11699-11709, 2006). 표적 부위 주위의 CRISPR/Cas9-유도된 원치않은 큰 결실/전좌(7-8 kb)에 대한 최근 연구를 고려하면(Kosicki 등, Nat Biotechnol, 36, 765-771, 2018), 표적 부위에서 멀리 떨어진 CRISPR-Cas9 DNA 파괴가 완전한 HDAd 게놈의 통합에 연루될 수 있음이 가능하다. 전반적으로, 큰 결실/전좌에 대한 보고서는 CRISPR/Cas9의 안정성에 문제를 제기한다. 반면에, 동물에서 CRISPR/Cas9-매개 생식계열 편집과 연관된 발달 효과는 지금까지 보고되지 않았기 때문에, 이러한 해로운 염색체 변화가 있는 세포가 발달 동안 선택될 가능성이 있다. 이 가설에 대한 뒷받침은 CRISPR Cas9-편집된 HSC가 이식되었고 HBG1/2 영역에서 9　kb 결실이 시간 경과에 따라 PBMC에서 사라졌다는 최근 NHP 연구에서 기인한다(Humbert 등, 23rd Annual Meeting of the ASGCT, abstract # 974, 2019).
이들 연구로부터, AAVS1tg 마우스 모델은 다중 AAVS1 표적 유전자좌의 존재로 인해 CRISPR/Cas9를 수반하는 표적화된 통합 연구에 차선이라는 결론을 내릴 수 있으며, 이 중 일부는 HDAd-공여자 벡터가 있는 상동성 영역을 손실하는 정도로 절두되다. 절두된 AAVS1 유전자좌의 존재는 또한 재배열이 이전에 보고된 바와 같이 AAVS1 유전자이식 마우스에서 발생할 수 있음을 시사한다(Linden 등, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 7966-7972, 1996).
실시예 6. 면역 체크포인트 억제제를 사용한 예방적 생체내 조혈 줄기 세포 유전자 요법은 동계 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 역전시킨다.
이 실시예에 함유된 정보 중 적어도 일부는 Li 등(Cancer Res. 80(3):549-560, 2020; 2019년 11월 14일 온라인 공개됨)에 공개되었다.
암-연관 생식계열 돌연변이에 대한 집단-와이드 테스트는 난소 및 유방 암종의 1/5 초과가 선천적 위험과 연관되어 있음을 규명하였다. 난관난소절개술 및/또는 유방절제술은 현재 고위험 돌연변이가 있는 여성에게 제공되는 유일한 효과적인 옵션이다. 목표는 선천적 돌연변이의 보균자에 대한 면역-예방을 제공하는 오래 지속되는 접근법을 개발하는 것이다. 이 접근법은 초기 단계에서, 종양이 골수에서 조혈 줄기/전구체 세포(HSPC)를 모집하고 종양-촉진 세포로 분화한다는 사실을 활용한다. 생체내에서 HSPC를 유전적으로 변형하기 위해 기술적으로 간단한 기술이 개발되었다. 기술은 HSPC 동원 및 통합 HDAd5/35++ 벡터의 정맥내 주사를 수반한다. GFP-발현 벡터로의 생체내 HSPC 형질도입 및 후속 동계 종양 세포 이식은 종양 침윤 백혈구에서 80% 초과의 GFP-마킹을 나타내었다. 이식유전자의 발현을 제어하기 위해, HSPC가 종양에 의해 모집되고 분화되는 경우에만 활성화되는 miRNA 조절 시스템이 개발되었다. 면역 체크포인트 억제제 αPD-L1-γ1을 효과기 유전자로 사용하여 접근법을 테스트하였다. 이식된 마우스 유선 암종(MMC) 종양이 있는 생체내 HSPC-형질도입된 마우스에서, 초기 종양 성장 후, 종양은 퇴행하고 관찰 기간 내내 재발하지 않았다. 퇴행은 T-세포 매개되었다. 항-PD-L1 단클론 항체를 사용한 "통상적인" 치료는 유의한 항-종양 효과가 없었으며, 이는 αPD-L1-γ1의 조기 자기-활성화 발현이 MMC 종양에서 면역억제성 환경을 극복할 수 있음을 나타낸다. 접근법의 효능 및 안전성은 예방적 및 치료적 설정 둘 다에서 전형적인 생식 계열 돌연변이가 있는 난소암 모델(ID8 p53-/- brca2-/-)에서 추가로 검증되었다.
재료 및 방법 .
HDAd5/35++ 벡터: HDAd-SB는 Richter 등, Blood. 128: 2206-2217, 2016에 기재되어 있다. 마우스 αPD-L1-γ1 이식유전자는 Engeland 등, Mol Ther. 22: 1949-1959, 2014)에 기재되어 있고; 116 세포에서 HDAd5/35++ 벡터의 생산은 Palmer 등, Methods in Molecular Biology, 33-53, 2009에 기재되어 있다. 헬퍼 바이러스 오염 수준은 0.05% 미만인 것으로 밝혀졌다. 역가는 6-12x1012 vp/ml였다. 이 연구에 사용된 모든 HDAd 벡터는 Ad5 섬유 꼬리, Ad35 섬유 샤프트, 및 친화도-향상된 Ad35++ 섬유 놉으로 구성된 키메라 섬유를 함유한다(Wang 등, J Virol. 82: 10567-10579, 2008). 모든 HDAd 제제는 다른 곳에 기재된 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 측정된 1010 vp에서 1 개 미만의 카피 야생형 바이러스를 가졌다(Haussler 등, PLoS One. 6: e23160, 2011).
HDAd-GFP/mgmt 및 HDAd-αPD-L1γ 1 miR423 벡터의 구축. 단계 1: PGK 프로모터, β-글로빈 3' UTR 및 BGH polyA 단편을 pHCA-HBG-CRISPR/mgmt로부터 PCR 증폭시킨 후(Li 등, Blood. 2018;131: 2915-2928), Gibson 어셈블리(New England Biolabs)에 의해 pBS-Z-Ef1α의 BstBI 부위로 삽입하여(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 1: 14057, 2015), pBS-PGK-3'UTR을 생성하였다. GFP 코딩 서열을 pHM5-frt-IR-EF1α-mgmt-2a-GFP로부터 PCR 증폭시키고(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 8: 52-64, 2018) EcoRI 선형화 pBS-PGK-3'UTR과 결찰시켜, pBS-PGK-GFP를 생성하였다. 단계 2: Ef1α-mgmtP140K-SV40pA-cHS4 절연체 카세트를 pHM5-T/μLCR-γ-글로빈-mgmt-FRT2로부터 증폭시키고(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018) PacI-소화된 pHM5-T/μLCR-γ-글로빈-mgmt-FRT2와 결찰시켜, pHM5-FRT-IR-Ef1α-mgmt를 형성하였다. cHS4의 3' 측면에서 BsrGI 부위를 하류 사용을 위해 프라이머에 의해 도입하였다. pHM5-FRT-IR-Ef1α-mgmt의 박테리아 플라스미드 백본을 나중 주입 클로닝을 위한 15 bp 상동성 아암(HA)을 함유하는 프라이머(Takara, 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)를 사용하여 pBS-Z-Ef1α로부터 백본으로 전환하여, pBS-FRT-IR-Ef1α-mgmt를 생성하였다. 2 개의 Frt-IR 구성요소에 플랭킹하는 2 개의 15 bp HA는 PacI 소화 시 노출되어 하기 기재된 변형된 pHCA 작제물과의 재조합을 용이하게 할 수 있다. 그런 다음, PGK-GFP-3'UTR-BGHpA 단편을 단계 1의 pBS-PGK-GFP에서 pBS-FRT-IR-Ef1α-mgmt의 BsrGI 부위로 이동시켜, pBS-FRT-IR-GFP/mgmt를 생성하였다. 단계 3: pHCA에서 원래 PacI 부위를 2 개의 어닐링된 올리고 서열을 삽입하여 파괴시켰다. 2 개의 HA와 함께 새로운 PacI 부위를 BstBI 부위에서 생성하였다. 마지막으로, pBS-FRT-IR-GFP/mgmt 및 변형된 pHCA 둘 다의 PacI 소화 후, 생성물을 주입 클로닝에 의해 재조합하여, 후속 바이러스 구제에 사용된 pHCA-FRT-IR-GFP/mgmt를 생성하였다. HDAd-αPD-L1γ1은 GFP 코딩 서열 대신에, 항-PD-L1-γ1 이식유전자가 단계 1 에서 pBS-PGK-3'UTR의 EcoRI에 삽입된 것을 제외하고, 이 실시예에서 다른 곳에 기재된 HDAd-GFP/mgmt와 유사하게 구축하였다. microRNA 조절된 유전자 발현을 위해, 합성된 4 개의 miR423 올리고(정방향(서열번호: 24); 역방향(서열번호: 25))를 어닐링하고 pBS-PGK-3'UTR의 AvrII-XhoI 부위에 삽입하여, pBS-PGK-miR423-3'UTR을 생성한 다음, 항-PD-L1-γ1 삽입에 사용하였다.
HDAd-GFP-423은 4 개의 miR423 표적 부위를 HDAd-GFP/mgmt의 3'UTR에 삽입함으로써 유사한 방식으로 구축하였다.
유세포 분석: 세포를 1　% FCS가 보충된 PBS에 1x106 개 세포/100　μL로 재현탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 FcR 차단 시약(Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 오번 소재)과 함께 배양하였다. 다음으로 염색 항체 용액을 106 개 세포 당 100　μL로 첨가하고 암실에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 FACS 완충액(PBS, 1% FBS)에서 1 회 세척하였다. 2차 염색을 위해 염색 단계를 2차 염색 용액으로 반복하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 분석하였다. 파편은 전방 산란 영역 및 측방 산란 영역 게이트를 사용하여 제외하였다. 그런 다음 단일 세포를 전방 산란 높이 및 전방 산란 폭 게이트를 사용하여 게이팅하였다. 그런 다음 유세포 분석 데이터를 FlowJo(버전 10.0.8, FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. 일치된 이소형-대조군을 모든 실험에 포함하였다.
면역표현형에 대한 유세포 분석: 림프구 유세포 분석 패널 8c(CD45-APC/Cy7, 클론 30-F11, cat# 103116; CD3-APC, 클론 17A2, cat# 100236; CD4-PE/Cy7, 클론 GK1.5, cat# 100422; CD8a-PE, 클론 53-6.7, cat# 100708; CD25-BV421, 클론 PC61, cat# 102043; CD19-BV510, 클론 6D5, cat# 115546; 이들 항체는 모두 BioLegend에서 수득함) 및 골수성 패널 9c(CD45-APC/Cy7, 클론 30-F11, BioLegend, cat# 103116; CD11c-APC, 클론 N418, BioLegend, cat# 117310; F4/80-PE, 클론 C1:A3-1, Cedarlane, cat# CL8940PE; MHCII-BV510, 클론 M5/114.15.2, BioLegend, cat# 107635; Siglec F-PerCP, 클론 1RNM44N, eBioscience, cat# 46-1702-82; Ly6C-BV421, 클론 AL-21, BD Biosciences, cat# 562727; CD11b-PE/Cy7, 클론 M1/70, eBioscience, cat# 25-0112-82; Ly6G-BV605, 클론 1A8, BioLegend, cat# 127639)를 사용하였다. 게이팅 전략은 도 76에 제시된다. LSK(계통- /Sca-1+/c-Kit+) 세포는 Richter 등, Blood. 2016;128: 2206-2217에서 이전에 특성화되었다. 다음 항체를 또한 사용하였다: 비오틴-접합된 계통 검출 칵테일(Miltenyi Biotec, 샌디에이고 소재, cat# 130-092-613); 항-마우스 LY-6A/E(Sca-1)-PE-Cyanine7(클론 D7, eBioscience, 샌디에이고 소재, cat# 25-5981-82); 항-마우스 CD117(c-Kit)-PE(클론 2B8, eBioscience, 샌디에이고 소재, cat# 12-1171-83); 항-마우스 CD3-APC(클론 17A2, Invitrogen, 매사추세츠주 월섬 소재, cat# 17-0032-82); 항-마우스 CD19-PE-Cyanine7(클론 eBio1D3, eBioscience, 샌디에이고 소재, cat# 25-0193-82); 항-마우스 Ly-6G(Gr-1)-PE(클론 RB6-8C5, eBioscience, 캘리포니아주 샌디에이고 소재, cat #12-5931-82); 항-인간 CD46-APC(클론 E4.3, BD Pharmingen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재, cat# 564253).
IFNγ-유세포 분석: 50 mL 팔콘 튜브에 부착된 70 μm 세포 여과기를 통해 새로 수확된 비장을 통과시켜 비장세포를 단리하였다. 300 x g에서 10 분 동안 원심분리 후, 세포를 1 mL 1 x BD Pharm Lyse™ 용해 용액(BD Pharmingen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재, cat# 555899)에 재현탁하고 30 초 동안 배양함으로써 적혈구를 제거하였다. 20 mL RPMI-1640 배지를 첨가하여 용해 반응을 중지시켰다. 원심분리 및 10% 열-불활성화 FBS, 100 단위/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지에 재현탁 후, 수득된 비장세포를 5% CO2를 함유하는 가습 인큐베이터의 96-웰 조직 배양 플레이트에 5 x 106 개 세포/ml(200 μl/웰)로 배양하였다. 1 x 세포 자극 칵테일 및 단백질 수송 억제제(eBioscience, 샌디에이고 소재, cat# 00-4975-93)가 세포 내에서 IFN-γ 생산의 유도 및 축적을 위해 배양 배지에 존재하였다. 12 시간 동안 자극 후, 세포를 수집하고, 먼저 상기 기재된 바와 같이 세포 표면 마커로 염색한 다음, 제조업체의 지침에 따라 IFN-γ (BioLegend, 캘리포니아주 샌디에이고 소재, cat# 505842)에 대한 세포내 염색에 적용하였다.
Neu-사량체 유세포 분석: PE-표지된 H-2Dq/RNEU420-429(H-2D(q)PDSLRDLSVF)(서열번호: 290) 사량체를 국립 알레르기 및 전염병 질환 연구소 MHC 사량체 코어 시설(조지아주 애틀랜타 소재)에서 수득하고, 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
유세포 분석, FACS, 및 웨스턴 블롯을 위한 종양-침윤 백혈구의 단리: 종양 부피가 500 mm3에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 종양을 수확하고, 절단하고 부드럽게 혼합하면서 37℃에서 30 분 동안 5 mL의 RPMI 1640에서 300 U/mL 콜라게나제 I(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재, cat# C0130) 및 1 mg/mL 디스파제 II(Sigma-Aldrich, cat# 4942078001)로 소화시켰다. 소화 후, 2000 U/mL DNase I(Sigma-Aldrich, cat# 260913)을 첨가하여 방출된 DNA를 제거함으로서 점도를 감소시켰다. 소화된 조직을 주사기 플런저를 사용하여 70 μm 세포 여과기를 통해 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이후에, 종양 침윤 백혈구를 마우스 CD45(TIL) 마이크로비드(Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 오번 소재, cat# 130-110-618)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로부터 정제하였다.
면역형광 연구: 종양 슬라이드를 아세톤/메탄올로 고정시키고(10 분) PBS로 2 회 세척하였다. 슬라이드를 5% 블롯팅 등급 우유(Bio-Rad, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)를 함유하는 PBS를 사용하여 실온에서 20 분 동안 차단한 후 PBS 중 1 차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 2 회 세척하고 2차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양한 후 PBS로 3 회 세척하였다. 슬라이드를 PBS로 2 회 세척하고, 형광용 장착 배지(Vector Laboratories 캘리포니아주 벌링게임 소재)로 장착한 다음 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 항-라미닌 다클론(1차) 항체(1:200; #Z0097; Dako, 캘리포니아주 카핀테리아 소재) 및 염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor568(2차) 항체(1:200; Molecular Probes, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 라미닌을 검출하였다.
마우스 조직의 면역조직화학: 조직을 10% 포르말린에 고정시키고 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 처리하였다. 모든 샘플은 2 명의 숙련된 병리학자에 의해 맹검 방식으로 전형적인 염증 징후에 대해 검사하였다.
T-세포 검정: MMC 세포(Neu-양성) 및 동계 neu/CD46-유전자이식 마우스(Neu-음성)의 비장세포를 20 분 동안 50 mg/m의 최종 농도에서 미토마이신 C로 처리한 다음, 광범위하게 세척하였다. 테스트 동물(HDAd-αPD-L1-γ1 처리) 및 미처리 대조군 동물(미처리)의 비장 세포를 미토마이신 C 처리된 세포와 1:1로 혼합하고 10 U/ml IL-2의 존재 하에 1 일 동안 배양하였다. 대조군 비장세포를 또한 PMA/이오노마이신으로 처리하였다. 상청액의 IFNγ 농도를 IFNγ ELISA(InVitrogen, cat# 88-7214-22)에 의해 측정하였다
MicroRNA 어레이 분석은 UW Functional Genomics, Proteomics & Metabolomics Facility Core using Affymetrix miRNA 4.0 어레이에 의해 수행하였다
실시간 PCR: 총 RNA를 제조업체의 지침에 따라 TRIzoI™(Invitrogen)을 사용하여 종양 침윤 백혈구, PBMC, 비장세포 및 골수 세포로부터 추출한 다음, 역전사시켜 Qiagen의 QuantiTect 역전사 키트(cat# 205311)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 키트에 제공된 gDNA 제거 시약을 사용하여 잠재적인 게놈 DNA 오염을 제거하였다. Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 비교 실시간 PCR을 수행하였다. 다음 프라이머를 사용하였다: 항-마우스 PDL1 정방향(서열번호: 238), 및 역방향(서열번호: 239); 마우스 PPIA 정방향(서열번호: 240), 및 역방향(서열번호: 241); 마우스 RPL10 정방향(서열번호: 189), 및 역방향(서열번호: 190).
마우스 PPIA를 내부 대조군으로 사용하였다. 두번째 내부 대조군 마우스 RPL10이 또한 포함되었고 유사한 결과를 관찰하였다. 결과는 2(-ΔΔCt) 방법에 따라 계산하고 상응하는 종양 샘플의 cDNA 수준을 100%로 설정하여, 상대적 발현의 백분율로 표시하였다.
계통-고갈된(Lin - ) 골수 세포의 단리: 계통-수임 세포의 고갈을 위해, 마우스 계통 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
콜로니 형성 단위 검정. 총 2500 개의 Lin- 세포를 ColonyGEL 1202 마우스 완전 배지(ReachBio, 워싱턴주 시애틀 소재)에 삼중으로 플레이팅하고 5　% CO2 및 최대 습도에서 37　℃에서 12 일 동안 배양하였다. 콜로니를 Leica MS 5 해부 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 열거하였다.
세포: 마우스 유선 암종(MMC) 세포를 neu/CD46-tg 마우스의 자발적 종양으로부터 확립하였다. MMC 세포 입증을 Neu-특이적 단클론 항체 7.16.4를 사용하여 면역형광에 의해 수행하였다(Knutson 등, Cancer Res. 2004;64: 1146-1151). TC-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, 버지니아주 머내서스 소재)으로부터 수득하였다. TC-1 세포는 HPV-16 E6 및 E7 단백질을 안정하게 발현하는 불멸성 뮤린 상피 세포이다. C57Bl/6-유래 난소암 ID8 p53-/- brca2-/- 세포는 이전에 기재되었다. Walton 등, Cancer Res. 2016;76: 6118-6129. 이 세포주는 ID8 세포에서 p53 및 brca2의 CRISPR/Cas9 녹아웃에 의해 생성하였다. MMC 및 TC-1 세포를 10% 소태아 혈청, 1 mmol/l 나트륨 피루베이트, 10 mmol/1 HEPES, 2 mmol/l L-글루타민, 100 단위/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지하였다. ID8 p53-/- brca2-/- 세포를 4% 소태아 혈청, 100 μg/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 ITS(5 μg/mL 인슐린, 5 μg/mL 트랜스페린, 및 5 ng/mL 나트륨 셀레나이트)가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 마이코플라즈마의 부재를 abm(캐나다 리치먼드(BC) 소재)의 PCR 마이코플라즈마 검출 키트를 사용하여 확인하였다. 증폭을 위해 동결보존된 세포를 해동시키고 4 회 계대하였다.
난소암 생검은 환자를 식별하는 데 도움이 되는 임의의 기밀 정보 없이 대서양 난소암 연구 컨소시엄(POCRC) 시료 보관소에 의해 제공되었다(Fred Hutchinson Cancer Research Center IRB 프로토콜 # 6289). 생검의 종양 조직을 4　mm 조각으로 절개하고 Strauss 등 (PLoS One. 6: e16186, 2011)에 이전에 기재된 바와 같이 콜라게나제/디스파제(Roche)와 함께 37℃에서 2 시간 동안 소화시켰다. 백혈구는 인간 CD45 마이크로비드(Miltenyi Biotech, cat #130-045-801)를 사용하여 자기 활성화된 세포 분류에 의해 단리하였다. 2 개의 고등급 장액성 난소암 생검의 종양-연관 백혈구를 풀링하고 RNA를 LC Sciences, LLC(텟사스주 휴스턴 소재)에 의해 일치하는 PBMC RNA와 비교하여 miRNA-Seq에 의해 분석하였다.
MicroRNA 분석: miRNA-Seq: 작은 RNA 서열분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Valdmanis 등, Nat Med. 2016;22: 557-562.). RNA를 miRNeasy 미니 키트(Qiagen Cat# 1071023)를 사용하여 추출하였다. 샘플 당 1 μg의 RNA를 ATP의 부재 하에 T4 RNA 리가제 1(New England Biosciences cat# M0204)을 사용하여 3' 보편적인 miRNA 클로닝 링커(New England Biosciences cat# S1315)에 결찰시켰다. 결찰된 샘플을 15% 우레아-폴리아크릴아미드 겔 상에서 실행하였다. 작은 RNA에 상응하는 단편(17-28　nt)을 겔로부터 절단하고, 다시 T4 RNA 리가제 1을 사용하여 5' 바코드에 결찰시켰다. 그런 다음 바코드화 샘플을 다중화하고 Illumina MiSeq 기계에서 서열분석하여 Precision Medicine의 UW Center에서 50　bp 단일-단부 판독물을 수득하였다. 바코드 및 어댑터를 서열에서 프리밍한 후 Bowtie 버전 0.12.7을 사용하여 miRBase 상의 마우스 microRNA에 정렬하여, 2 개의 불일치를 허용하였다(Langmead 등, Genome Biol. 10: R25, 2009).
작은 RNA에 대한 노던 블롯. 이 프로토콜은 Valdmanis 등, Nat Med. 2016;22: 557-562에 기재되어 있다. 다음 32P-γ-ATP 표지된 프로브를 사용하였다: miRNA의 경우 423-5p(서열번호: 235); U6의 경우 snRNA(서열번호: 236). 방사성 RNA 분자량 마커는 Ambion으로부터 수득하였다.
웨스턴 블롯: 조직 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 블롯을 닭 항-HA-태그-HRP(Abcam, ab1190)와 함께 배양하였다. X-선 필름 상에서 화학발광 검출을 Pierce™ ECL Plus 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Fisher Scientific, cat# 34029)로 처리 후 수행하였다.
αPD-L1-γ 1 ELISA: 재조합 마우스 PD-L1 단백질(Sino Biological Inc, cat # 50010-M08H)을 2 μg/ml로 사용하여 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 테스트 동물의 혈청을 1:10 희석으로 첨가하고 닭 항-HA-태그-HRP(Abcam, ab1190)를 사용하여 αPD-L1-γ 1 을 측정하였다.
동물 : 동물을 수반하는 모든 실험은 통제 기관 심의 위원회 및 IACUC의 승인을 받아 수행되었다.
hCD46-유전자이식 마우스 : 인간 CD46 게놈 유전자좌를 함유하고 인간과 유사한 수준 및 패턴으로 CD46을 발현하는 C57Bl/6 기반 유전자이식은 Kemper 등 (Clin Exp Immunol. 124: 180-189, 2001)에 기재되어 있다. 이들은 C57Bl/6 유래 TC-1 세포를 사용한 이식 연구에 사용되었다. Neu 유전자이식 마우스: Neu-tg 마우스(균주명: FVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul)는 Jackson Laboratory(메인주 바 하버 소재)에서 수득하였다. 이러한 마우스는 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터(게놈 당 1 개의 이식유전자 카피)의 제어 하에 돌연변이되지 않은 비활성화된 래트 neu를 보유한다. 생체내 형질도입 연구를 위해, CD46tg 및 neu-tg 마우스를 교배하여 CD46+/+/neu+ 마우스를 수득하였다.
생체내 HSPC 형질도입/선택 : 도 74a 참조.
CD8 세포 고갈 : CD8-T 세포를 200　μg 래트 항-마우스 CD8 IgG(169.4; ATCC)의 복강내 주사를 사용하여 고갈시켰다. 주사를 3 일마다 반복하여 고갈을 유지하였다.
통계 : 생체내 데이터의 통계적 유의성을 Kaplan-Meier 생존 곡선 및 로그-순위 테스트(GraphPad Prism Version 4)에 의해 분석하였다. 시험관내 데이터의 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-검정(Microsoft Excel)에 의해 계산하였다. 0.05 초과의 P 값은 통계적으로 유의하지 않은 것(n.s.)으로 간주된다.
결과 및 논의 .
50 세 이전에 유방암 진단 또는 모든 연령에서 난소암 진단을 받은 적어도 한 명의 직계 가족이 있는 여성은 이제 유전자 검사에 적용된다. 표적화된 포획 및 대량 병렬 게놈 서열분석을 사용하여, 생식 계열 돌연변이를 검출하고 암 발병 위험을 예측하는 일련의 다중 유전자 검사를 확립하였다. 이러한 검사 플랫폼 중에는 BROCA가 있다(Walsh 등, Proc Natl Acad Sci USA. 108: 18032-18037, 2011, Shirts 등, Genet Med. 18: 974-981, 2016). BROCA를 사용하여, 난소 및 유방 암종의 1/5 초과가 선천적 위험과 연관되어 있음을 규명하였다(Tung 등, Cancer. 121: 25-33, 2015). 문제는 고위험 보균자의 예방을 위한 현재 옵션이 지속적으로 개선되는 유전적 진단에 뒤쳐진다는 것이다. 불임, 심혈관 질환, 골다공증, 갱년기 증상, 및 심리적 효과를 포함하는 예방적 난관난소절개술 및 유방절제술의 부작용은 여성의 일생에 걸쳐 예상된다. CA125 및 HE4와 같은 혈청 마커의 사용은 난소암 사망률의 상당한 감소를 나타내지 않았다(Jacobs 등, Lancet. 387: 945-95, 2016). Her2/neu, HIF1α, 또는 MUC1과 같은 종양-연관 항원에 대한 예방적 백신은 모든 종양 세포 상에서 이들 항원의 존재에 의존하고, 항원-손실 돌연변이체의 발달에 의해 애를 먹고 있다(Knutson 등, Cancer Res. 64:1146-1151, 2004).
목표는 종양 재발에 대한 위험이 높은 환자, 및 궁극적으로, 암에 걸리기 쉬운 선천적 돌연변이의 보균자에서 암의 면역-예방을 허용하는 오래 지속되고 기술적으로 간단한 접근법을 개발하는 것이다. 종양 진행 동안, 악성 세포는 HSPC를 활성화하고 동원하는 다수의 특이적 케모카인을 분비하여 혈액 순환에 들어가고 종양-지지 세포로 분화하는 경우 종양으로 국소화하게 한다(Hanahan 등, Cell. 144: 646-674, 2011, Mantovani 등, Trends Immunol. 23: 549- 555, 2002). HSPC-유래 골수성 및 림프성 세포는 예를 들어 장액성 관 상피내 암종(STIC)에서 암 발병 초기 단계에 존재한다(Okla 등, Front Immunol. 10: 691, 2019; Colvin, Front Oncol. 4: 137, 2014; Baert 등, Front Immunol. 10: 1273, 2019). Sarkar 등, Genes Dev. 31: 1109-1121, 2017. 이 접근법은 조혈 줄기 세포의 유전적 변형에 기반한다. 이들 세포는 자기 재생할 수 있기 때문에, 1-회 개입은 평생 치료 효과가 있어야 한다. 백혈구분리반출술, 골수절제술 및 이식 없이 HSPC로의 생체내 유전자 전달을 가능하게 만드는 최소로 침습성이고 비용-효율적인 기술이 개발되었다(Richter 등, Blood. 128: 2206-2217, 2016, Wang 등, J Clin Invest. 129: 598-615, 2019). 이 접근법의 핵심 아이디어는 G-CSF/AMD3100을 사용하여 골수에서 HSPC를 동원하고, 주변부에서 많은 수로 순환하는 동안, 정맥내로 주사된 HSPC-향성 헬퍼-의존적 아데노바이러스 HDAd5/35++ 유전자 전달 벡터 시스템으로 형질도입하는 것이다. 이들 벡터는 원시 조혈 줄기 세포 상에서 발현되는 수용체인 CD46을 사용한다. 형질도입된 세포는 장기간 지속되는 경우 골수로 돌아간다. 이 연구에서 사용된 HDAd5/35++ 벡터 시스템의 새로운 특징은 다음을 포함한다: (i) i.v. 주사(간 포함) 후 비-조혈 조직의 감염을 피하면서 원시 HSPC의 효율적인 형질도입을 허용하는 CD46-친화도 향상된 섬유, (ii) 세포 당 1 내지 2 개의 통합 벡터 카피가 있는 유전자에 대한 선호도 없이 세포 요인과 무관하게 기능하고 무작위 이식유전자 통합을 매개하는 SB100X 트랜스포사제-기반 통합 시스템(도 74a), 및 (iii) 저용량 O6BG/BCNU를 사용한 단기간 치료에 의해 형질도입된 원시 HSPC의 풀에 영향을 미치지 않으면서 자손 세포의 선택적 생존 및 확장을 매개하는 MGMTP140K 발현 카세트(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 8: 52-64, 2018). 혈색소병증에 대한 마우스 모델에서 생체내 HSPC 유전자 요법 방법의 효능 및 안전성이 최근에 입증되었다(Wang 등, J Clin Invest. 129: 598-615, 2019, Li 등, Blood. 131: 2915-2928, 2018). 여기서, 이 접근법은 암 성장을 예방하는 데 사용된다.
생체내 HSPC 형질도입 후 종양-침윤 백혈구에서 GFP 발현. 동계 종양이 있는 2 개의 인간 CD46 유전자이식 마우스 모델을 이용하였다. (CD46은 HDAd5/35++ 벡터를 사용한 HSPC 형질도입이 필요하다). 첫번째 모델은 유방 조직에서 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터로부터의 래트 neu를 과발현하는 인간 CD46/래트 neu-유전자이식 마우스를 포함하였다. Neu-tg 마우스는 Treg에 의존하고 유방암 환자에서 관찰된 것과 유사한 Neu에 대한 활성 면역 허용을 발달시킨다(Knuston 등, J Immunol. 177: 84-91, 2006). 마우스 유선 암종 세포(MMC)는 자발적 neu/CD46-유전자이식 마우스 종양으로부터 유래된 Neu-양성 유방암 세포주이다(도 75). HSPC를 neu/CD46 tg 마우스에 동원하고 통합 GFP-발현 HDAd5/35++ 벡터(도 74a)를 주사하였다. 이전 연구와 유사하게(Wang 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 8: 52-64, 2018), O6BG/BCNU를 사용한 3 차례의 저용량 처리는 PBMC의 80%에서 안정된 GFP 발현을 초래하였다(도 74). 생체내 HSPC 형질도입 후 17 주차에, 동계 MMC 세포를 유선 지방 패드에 이식하고 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 700　mm의 부피에 도달했을 때(Palmer 등, Methods in Molecular Biology, 2009:33-53), 동물을 희생시키고 GFP 발현을 분석하였다. 골수 세포, 비장세포, PBMC, 및 종양-침윤 백혈구의 80%는 GFP를 발현하였다(도 74b). 종양에서, GFP+ 세포는 종양 기질에서 우세하게 발견되었다(도 74c). 면역표현형은 GFP+ 종양-침윤 세포가 림프구(우세하게는 Treg), 호중구, DC/MDSC, 및 대식세포임을 나타내었다(도 74d, 76). 이 패턴은 말초 혈액(도 74d), 골수 및 비장(도 77)에서 GFP+ 세포와 상이하였으며, 이는 종양이 HSPC를 전문화된 전종양 세포로 활성적으로 분화시킴을 나타낸다. 종양에 대한 생체내 형질도입된 HSPC의 효율적인 모집은 CD46tg 마우스 및 HPV16 E6/E7-양성 마우스 폐암 세포주인 TC-1 세포로 이루어진 두번째 모델에서 추가로 확인되었다(도 78a-78c).
종양-침윤 백혈구에서 miRNA-조절된 이식유전자 발현 . 도 74b 및 도 78c는 GFP(보편적으로 활성인 EF1α 프로모터의 제어 하에)가 종양-침윤 백혈구 뿐만 아니라 골수, 비장, PBMC, 및 상주 대식세포를 포함하는 다른 조직에서도 발현됨을 예시한다. 자가-면역 반응을 최소화하기 위해, 요법 접근법은 치료 이식유전자가 (i) 종양에서 우선적으로 발현되고, (ii) 종양이 발달하기 시작할 때만 자동적으로 활성화되고, (iii) 종양이 사라질 때 중단되는 것을 필요로 한다. 이러한 요건은 miRNA 조절을 통해 충족될 수 있다. 조혈 동안, miRNA 프로파일은 분화 단계 및 세포 계통에 따라 변한다(Chen 등, Science. 2004;303: 83-86). 종양-연관 골수성 세포는 별개의 mRNA 및 miRNA 발현 프로파일을 갖는다(Thorsson 등, Immunity. 48: 812-830 e814, 2018). 마지막으로, 인간의 상이한 종양 유형에서 발견된 골수성 및 림프성 세포에서 miRNA의 보존 정도가 높다 (Thorsson 등, Immunity. 48: 812-830 e814, 2018). 이식유전자 발현의 miRNA 조절 원리는 도 79a에 제시된다. 생체내 HSPC-형질도입된 마우스 모델을 사용하여, 골수, 비장, PBMC, 및 종양으로부터의 GFP+/CD45+ 세포를 분류하고(도 74b, 78c) 이들의 miRNA 발현 프로파일을 분석하였다. 목표는 골수, 혈액 및 비장 세포에서 높은 수준으로 발현되지만, 종양-연관 백혈구에 부재하는 miRNA를 찾는 것이었다. 총 RNA(5 마리의 마우스로부터 풀링됨)를 차세대 miRNA 서열분석에 적용하였다(도 79b, 79c). 상기 기준을 충족하는 일련의 miRNA를 식별하였다. neu/CD46tg-MMC(도 79b) 및 CD46tg-TC-1 모델(도 79c) 둘 다에서 목록의 상위에 있는 miRNA인 miR423-5p에 초점을 맞췄다. miR-423-5p는 인간 및 마우스 사이에 보존되어 있고 따라서 클리닉에 대한 접근법의 추가 개발에 사용될 수 있다. MMC 및 TC-1 종양이 있는 생체내 형질도입된 마우스로부터의 GFP+ 분획에서 miRNA-423-5p의 발현 프로파일을 microRNA 어레이(제시되지 않음) 및 노던 블롯 분석(도 81)에 의해 검증하였다.
miR-423-5p 조절이 또한 인간에서 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, 일련의 인간 조직에 걸쳐 microRNA를 평가한 공개된 데이터세트에서 miR-423-5p의 수준을 조사하였다. Ludwig 등, Nucleic Acids Res. 2016;44: 3865-3877. miR-423-5p는 발현된 microRNA의 상위 20%에 있고 골수 및 비장을 포함하는 조직에 걸쳐 균일하게 분포하는 것으로 밝혀졌다(도 82a). 일치하는 PBMC 및 종양 생검을 2 명의 고등급 장액성 난소암 환자로부터 수득하였다. miRNA-Seq를 일치하는 PBMC로부터의 RNA에 비해 종양-침윤(CD45+) 백혈구로부터의 RNA에서 수행하였다(도 82b). 이 분석은 PBMC에서 miR423-5p의 높은 발현 수준 및 종양-침윤 백혈구에서 낮은 발현 수준을 확인하였다. 이러한 데이터는 마우스에서 관찰된 결과가 인간 연구로 번역될 강한 잠재력을 가짐을 입증한다.
HSPC에 대한 HDAd-매개 miR-423 표적 부위 발현의 효과. miRNA-423-5p는 모든 정상 조직에서 발현되고 따라서 유전자 발현의 조절에 수반될 가능성이 가장 높다. "mirtarbase"에서 miR-423-5p에 대한 표적 mRNA의 검색은 사이클린-의존적 키나제 억제제 1A(CDKN1A) mRNA를 1차 표적으로 식별하였다(mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/detail.php?mirtid= MIRT000589#target에서 온라인으로 이용가능). 다른 표적 mRNA는 전사 신장 인자 A 유사 1(TCEAL1), bcl2 유사 11(bcl2L11), 및 증식-연관 2G4(PA2G4)를 포함한다. HDAd 벡터로부터 추가된 miR-423-5p 표적 부위의 발현이 CDKN1A의 발현에 영향을 미치는지를 평가하기 위해, GFP 함유 mRNA에 연결된 표적 부위가 있거나 없는 2 개의 HDAd-GFP 벡터를 구축하였다(도 80a). 마우스 및 인간 HSPC, 즉, miR-423-5p 발현 수준이 높은 세포 유형을 대부분의 세포의 형질도입을 초래할 MOI에서 감염시키고(Li 등, Mol Ther. 27(12):2195-2212, 2019) 3 일 후 웨스턴 블롯에 의해 CDKN1A 단백질 수준을 분석하였다(도 80b). 두 세포 유형에서 2 개의 HDAd 벡터 사이의 유의한 차이는 발견되지 않았다. 또한, miR-423-5p 표적 부위 과발현의 해로운 효과가 전구체 콜로니 검정에서 관찰되지 않았다(도 80c). 본원의 다른 곳에 요약된 바와 같이, miR423-5p 표적 부위를 함유하는 요법 벡터를 사용한 생체내 HSPC 형질도입은 조혈에서 이상을 유발하지 않았다. 종합하면, 이는 개시된 miR-423-5p-기반 조절 시스템이 HSPC에서 안전함을 시사한다.
면역-예방 연구. 유전성 유방암 및 난소암에서, 유전적 변이체는 DNA 복구 메커니즘을 방해하여 더 높은 돌연변이 부담 및 신생항원 존재를 초래한다. 이는 종종 비정상적인 카피 수 및 낮은 면역원성을 특징으로 하는 비-유전성 유방암 및 난소암보다 종양을 면역요법으로 더 잘 처리할 수 있게 만든다(Thorsson 등, Immunity. 2018;48: 812-830 e814). 여기서, 체크포인트 억제제 αPD-L1-γ1은 면역치료 이식유전자로서 선택되었다. 이전에, 바이러스 유전자 전달 후 종양내 αPD-L1-γ1 발현은 종양 성장 감쇠를 초래하는 것으로 제시되었다(Engeland 등, Mol Ther. 22: 1949-1959, 2014, Reul 등, Front Oncol. 9: 52, 2019). MMC 세포 배양에서, 강한 PD-L1 발현이 관찰되었으며(도 83a), 이는 MMC 종양을 αPD-L1-γ1 요법에 민감하게 만들어야 한다. miR423-5p 표적 부위의 4 개의 카피를 αPD-L1-γ1 유전자에 연결된 글로빈 3' UTR로 통합하였다(도 83b). 실험 체계는 도 74a에 제시된 것과 동일하였다. 대조군 HDAd-GFP/mgmt 벡터로 생체내 형질도입된 마우스에서, 이식된 MMC 종양은 빠르게 성장하여 종양 세포 이식 후 35 일에 종료점 부피에 도달하였다(도 83c, 왼쪽 패널). αPD-L1-γ1 모델에서, 초기 종양 성장 후, 7 개 종양 중 6 개가 퇴행되고 관찰 기간(100 일) 내에 재발하지 않았다. 처리된 마우스는 첫번째 주사 후 11 주 차에 주어진 또 다른 접종된 MMC 세포를 거부하였다. 항-CD8 mAb 주사에 의한 CD8 세포의 고갈은 치료 효과를 무효화하였다. 항-종양 T-세포 반응을 관찰 기간의 종료 시(100 일) 측정하였다. 유세포 분석에 의한 비장 세포 분석은 상당히 더 높은 백분율의 인터페론-γ (IFNγ)-생산 CD4 및 CD8 세포 뿐만 아니라 Neu-사량체로 양성으로 염색된 더 높은 빈도의 CD8 세포를 나타내었다(도 83d). HDAd-αPD-L1-γ1-처리된 동물로부터의 비장세포는 (Neu-양성) MMC 세포로 자극 시, Neu-음성 세포와 비교하여 30-배 더 큰 IFNγ 분비를 나타내었다(도 83e). 예상된 바와 같이, 미처리 CD46/neu-tg 마우스는 Neu-특이적 T-세포를 보유하였지만, 종양에서 면역억제성 T-세포의 존재로 인해 종양 성장을 제어할 수 없었다(Knutson 등, J Immunol. 2006;177: 84-91).
MMC/neu-유전자이식 마우스 모델에서 αPD-L1-γ 1 발현의 동역학 및 특이성. HDAd-αPDL1γ1miR423-처리된 동물의 별개의 그룹에서, 종양이 줄어들기 시작하기 전에 이식 후 17 일차에 수확하였다. 이들 종양(300-400　mm3)에서, 웨스턴 블롯 분석 8에 의해 PBMC, 골수, 및 비장에서보다 종양에서 10-배 더 높은 수준의 αPD-L1-γ1을 관찰하였다(도 84a). 종양-침윤 백혈구에서 αPD-L1-γ 1 mRNA의 우선적 발현을 qRT-PCR에 의해 확인하였다(도 84b). 이 발현 패턴은 miR-423-조절이 종양-침윤 골수성 및 림프성 세포 이외의 HSPC 자손에서 αPD-L1-γ 1 발현을 억제하였음을 시사하였다. 혈청 αPD-L1-γ 1 은 MMC 세포 주사 후 검출가능하게 되고 종양이 사라지면 감소하였으며, 이는 αPD-L1-γ 1 발현의 기능적 자기조절을 나타내며(도 84b), 즉 이식유전자 발현은 HSPG가 종양-연관 백혈구로 분화된 후에만 시작됨을 나타낸다. MMC 세포 주사 후 2 주부터 시작하여, 털 변색 및 조직의 염증성 침윤에 의해 반영된 자가-면역 반응이 관찰되었다(도 87, 도 87a에서는 마우스를 나타내고 도 87b에서는 신장, 간, 및 폐에서의 샘플을 나타냄). 중요하게는, 종양이 사라지고 4 주 후 희생된 동물에서, 모든 기관의 조직학은 정상으로 돌아왔다. 이러한 관찰은 αPD-L1-γ 1 이 발현되고 혈류로 방출되는 한, 일시적 자가-면역 반응(neu-발현 조직/세포 유형에 대한 것일 가능성이 가장 큼)이 발생할 수 있음을 나타낸다. 특히, miR-423-5p 표적 부위가 없는 HDAd αPD-L1-γ 1 벡터를 사용한 연구는 마지막 O6BG/BCNU 처리 2 주 후 처리된 동물에서 발생하는 20% 초과의 체중 손실로 인해 종료하였다. 이는 조절된 αPD-L1-γ 1 발현에 대한 필요성을 강조한다. 관찰된 자가-면역 반응은 αPD-L1-γ 1 을 종양에 물리적으로 테더링하거나 또는 세포내 면역조절 효과기(예를 들어, 종양-촉진 백혈구를 종양-사멸 세포로 재분극화하는 miRNA)를 사용함으로써 최소화될 수 있다. 추가로, 벡터는 또한 항체(Erbitux)-의존적 세포독성에 의해 형질도입된 모든 세포의 파괴를 허용하는 절두된 EGFR 수용체를 함유할 수 있다(Wang 등, Blood. 2011;118: 1255-1263).
생체내 HSPC αPD-L1-γ 1 유전자 요법 접근법의 효능은 neu-tg/MMC 모델에서, 다른 면역요법 접근법이 종양 재발을 예방하지 못했다는 점을 고려하면 주목할만하다(Knutson 등, Cancer Res. 64:1146-1151, 2004, Burgents 등, J Immunother. 33: 482-491, 2010). 이 맥락에서, 항-마우스 PD-L1 단클론 항체의 4 차례의 복강내 주사는 종양 성장에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 88a, 88b). 이러한 데이터는 종양 발달 동안 초기에(HSPC 자손 세포가 종양을 침투하자마자) αPD-L1-γ 1 1의 종양내 발현이 억제인자 및 효과기 면역 세포 사이의 균형을 종양 제거 쪽으로 기울일 수 있음을 나타낸다.
p53 및 brca2 돌연변이가 있는 난소암 모델에서 면역예방 및 요법 연구. C57Bl/6 유래된 뮤린 난소암 ID8 세포는 전형적인 암-연관 생식 계열 돌연변이(brca1, brca2, p53, Nf1, Rb1, Pten...)를 함유하지 않고 복강내 주사 후 종양을 잘 형성하지 않는다. Walton 등, Cancer Res. 76: 6118-6129, 2016. 종양-억제인자 유전자의 CRISPR/Cas9 녹아웃에 의해 생성된 더 새롭게 개선된 ID8-유래 모델에서, 이러한 결핍을 해결한다. Walton 등, Cancer Res. 2016;76: 6118-6129; Walton 등, Sci Rep. 2017;7: 16827. 이러한 모델 중에는 ID8-p53-/--brca2-/- 세포가 있다. 2x106 개의 ID8-p53-/--brca2-/- 세포를 CD46-유전자이식 마우스로 복강내 주사하면 6-8 주 내에 종양 성장 및 복수의 발병(또는 사망)을 초래하였다(도 84c 및 85a). 복강내 종양은 장간막을 따라 광범위하게 퍼져 다른 장기(비장, 간, 림프절)을 침습하였다. 복강내 ID8-p53-/--brca2-/- 종양에서 종양-침윤 백혈구의 면역표현형은 Treg 뿐만 아니라 면역억제성 DC/MDSC 및 TAM의 의 명백한 존재를 나타내었다(도 85b). 종양 침윤 T-세포(TIL), 대식세포(TAM), 및 호중구(TAN)를 복막의 ID8 p53-/- brca2-/- 종양으로부터 단리하고 miRNA-423-5p 수준을 노던 블롯으로 분석하였다. MMC 및 TC-1 모델에서 관찰된 바와 같이, miR-423-5p는 골수 단핵 세포에서 발현되지만 TIL, TAN, 및 TAM)을 포함하는 종양-침윤 백혈구에서 검출가능하지 않았으며, 이는 모든 3 가지 세포 유형이 종양에 의해 특이적으로 재프로그램화되었음을 나타낸다(도 85c).
먼저, ID8-Trp53-/--brca2-/- 모델을 예방적 설정에 사용하였다(도 85d). HDAd-αPDL1γ1miR423 + HDAd-SB 또는 HAd-GFP-miR423 + HDAd-SB(대조군)를 사용한 HSPC 생체내 형질도입/선택 후, ID8-p53-/-brca2-/- 세포를 복강내로 주사하고 혈청 αPDL1γ1 수준 및 이환율 및 복수의 발병을 모니터링하였다. 모든 대조군 마우스는 생체내 형질도입 후 70 일에 종료점에 도달하였지만, 모니터링 기간이 종료될 때(종양 세포 접종 후 11 주) HDAd-αPDL1γ1miR423 + HDAd-SB 처리된 동물의 100%가 생존하였다(도 85e). 6 주차(세포 주사 후)에 상승된 혈청 αPDL1γ1 수준은 종양이 성장하였고 혈청 αPDL1γ1 발현이 활성화되었음을 시사한다(도 85f). 11 주차에, 혈청 αPDL1γ1은 배경 수준으로 돌아갔으며 이는 종양이 제거되었음을 나타낸다. 이 연구에서, 자가-면역 반응의 징후(예를 들어, 털 변색)는 관찰되지 않았으며, 종양 및 정상 조직 사이에 공유되는 항원(예를 들어, Neu)의 부재 때문일 가능성이 가장 크다. 기재된 접근법의 안전성을 평가하는 맥락에서, 또한 HDAd-αPDL1γ1miR423을 사용한 생체내 HSPC 형질도입이 조혈에서 이상을 유발하지 않았음을 제시하였다(도 88c, 88d). 동계 종양 세포가 이식된 마우스에서, PBMC에서 GFP 양성 세포의 백분율을 표시된 시점에서 측정하고, GFP 양성 세포를 miRNAseq에 대해 수확하였다(도 88e). 결과는 관심 발현 패턴을 갖는 miRNA를 식별하였다(도 58e). 종양(TIL), PBMC, 골수, 및 비장에서 PDL1에 대한 웨스턴 블롯은 도 88f에서 mRNA에 대한 발현으로 제시되고 정량화된다. 종양 이식 전 및 이식 후 표시된 시점에서 혈청 αPDLA ELISA OD450이 또한 도 88f에 제시된다. 개략도는 도 88g 및 88h에 제시된다.
예방 접근법은 종양-발달의 극초기 단계에서 자동으로 시작한다는 이점을 갖지만, 고위험 돌연변이를 보유하는 건강한 여성에서 즉시 적용하는 것은 임상 번역에서 규제 장애물에 직면할 가능성이 있을 것이다. 따라서, 보다 현실적인 목표는 이 접근법을 사용하여 1차 요법 후 암 재발을 예방하는 것이다. 이 경우에, 생체내 HSPC 선택은 환자의 화학요법 치료에 직접적으로 포함될 수 있다. 도 86a는 임상 설정에서, 생체내 HSC 형질도입이 어떻게 외과적 종양 감량수술 후 시작하거나, 또는, 수술이 옵션이 아닌 경우 화학요법과 함께 시작함을 나타낸다. O6BG/BCNU 생체내 선택은 화학요법과 조합될 수 있다. 생체내 HSPC 형질도입/선택의 결과로서, 무장된 HSPC는 암이 재발할 때까지 휴면기에 놓여 HSPC 분화 및 효과기 유전자 발현의 활성화를 촉발할 것이다. 이 설정은 또한 종양-특이적 신생-항원 및 종양의 면역-표현형이 외과적 생검의 분석으로부터 알려질 것이라는 이점을 가지며, 이는 적절한 면역요법 효과기 유전자를 선택하게 할 수 있다. 한편으로, "완전히 발달한" 암 특징을 갖는 암의 재발을 예방하는 것(Hanahan 등, Cell. 2011;144: 646-674)은 발달 초기 단계에서 종양을 표적화하는 것보다 더 어렵다.
이러한 "치료적" 설정을 시뮬레이션하기 위해, CD46-유전자이식 마우스에게 먼저 ID8-Trp53-/--brca2-/- 세포를 주사한 후 2 주 후에 생체내 HSPC 형질도입/선택을 하였다(도 86b). 대조군 설정의 모든 마우스(HDAd-GFP-miR423 + HDAd-SB 형질도입된 HSPC)는 종양 세포 주사 후 12 주에 종료점에 도달하였지만, αPDL1-γ1 발현 벡터로 처리된 모든 마우스는 15 주차에 건강하였다(도 86c). 예방 연구에서와 같이, 11 주차에 상승된 혈청 αPDL1-γ1 수준은 종양이 초기에 성장하지만 자기-조절된 αPDL1-γ1 메커니즘이 활성화되면 사라졌음을 시사한다(도 86d). 이러한 데이터는 기재된 접근법이 수술/1차 화학요법 후 암 재발을 예방할 수 있음을 나타낸다.
TC-1(마우스 폐암) 종양(도 78a-81), MMC(마우스 유방암) 종양(도 79a-79c 및 81), 및 ID8-p53-/-/brca2-/-(마우스 난소암 종양)(도 85c)에 존재하는 종양-침윤 백혈구에 대한 mRNA 프로파일링/노던 블롯 분석을 수행하였다. miR423-5p가 검출불가능하지만, 정상 조혈 구획에서 높은 수준으로 존재하는 3 가지 종양 유형 모두에서 발견되었다. 인간 난소암 생검으로부터의 데이터와 함께(도 82a, 82b), 이는 miR423-5p-기반 시스템이 효과기 유전자 발현의 조절을 위해 종에 걸쳐 상이한 종양 유형에 광범위하게 사용될 수 있음을 나타내다.
현재 암 발병의 고위험과 연관된 생식 계열 돌연변이가 있는 여성에게 제공되는 제한된 예방적 옵션, 및 집단-와이드 스크리닝으로 인해 이러한 보균자 수의 증가를 고려하면, 이 생체내 HSPC 유전자 요법 접근법은 주요 의학적 문제를 해결하는 유망한 접근법이다.
실시예 7. 분비된 치료 단백질의 고수준 생산을 위한 공장으로서 적혈구 세포를 사용한 생체내 HSC 유전자 요법.
이 실시예는 생체내 HSC 형질도입/선택 후 적혈구 세포에서 비-적혈구 단백질의 발현 및 성숙 적혈구에서 발현된 단백질의 저장을 나타낸다. 이 시스템을 사용하여 단일 정맥내 개입 후 장기간 치료 교정을 제공할 수 있다. 이 실시예에 함유된 정보의 적어도 일부는 Wang 등 (Blood Adv 3(19): 2883-2894, 2019; e-pub October 4, 2019)에 공개되었다.
인간 성인에서 초 당 240 만개의 새로운 적혈구가 생성된다. 인체 세포의 거의 1/4는 적혈구이다(Pierige 등, Adv Drug Deliv Rev. 60(2):286-295, 2008). 적혈구생성 과정에서 HSC는 공통 골수성 전구체 및 전적혈구모세포를 통해 정염성 적혈구모세포(Wright의 염색에 기반)로 분화한다. 이 단계에서, 핵은 배출되고, 세포는 골수에서 빠져나와 망상적혈구로서 순환계로 들어간다. 성인에서 순환하는 적혈구의 0.5% 내지 2.5%(1x105/μl) 및 유아의 2% 내지 6%가 망상적혈구이다. 망상적혈구는 여전히 mRNA로부터 헤모글로빈을 생성할 수 있다. 1 내지 2 일 후, 이들은 궁극적으로 모든 세포기관을 손실하고 성숙 적혈구가 되며, 더이상 단백질 생합성을 할 수 없다. 열성적인 적혈구 전구체에서 적혈구까지 분화는 7 일이 걸린다. 적혈구의 수명은 120 일이다. 오래되고 죽어가는 적혈구는 비장의 식세포 시스템에 의해 제거된다.
HSC가 열성적인 적혈구 세포로 분화되면, 대량의 α 및 β 글로빈 쇄가 생성된 다음 이후에 적혈구에서 사량체성 헤모글로빈으로 저장된다. 건강한 개인은 혈액 100 ml 당 12 내지 20 그램의 헤모글로빈을 가지며 적혈구 중량의 95%는 헤모글로빈이다(세포 당 270x106 개의 Hb 분자). 이러한 효율적인 생합성에 대한 기초는 높은 수준의 전사 및 효율적으로 번역되는 안정된 mRNA를 허용하는 강한 적혈구 특이적 유전자좌 제어 영역(LCR)이다.
적혈구생성의 엄청난 속도 및 효능 및 헤모글로빈 생산의 강력한 기구를 사용하여 적혈구 전구체 세포로부터 비-적혈구 분비된 단백질을 생산하였다(전적혈구모세포에서 망상적혈구까지의 분화 단계 포함). 이식유전자는 미니-β-글로빈 LCR의 제어 하에 있고 mRNA 안정화를 위해 β-글로빈 유전자의 5'UTR 영역을 함유하였다. 치료 단백질의 장기간 평생 생산을 허용하기 위해, 유전자 전달 벡터는 원시 HSC를 표적화하였다. 생체내 HSC 형질도입 접근법은 골수에서 말초 혈류로의 HSC의 G-CSF/AMD3100-촉발된 동원 및 통합 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터 시스템의 정맥내 주사를 수반한다. 이식유전자 통합은 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제(SB100x)를 사용하여 (무작위 패턴으로) 달성되지만, 특정 구현예에서, 상동성 지시된 복구를 통해 달성될 수 있다.
적혈구 세포가 혈액 순환으로 분비되는 치료 단백질의 높은 수준의 생산에 사용될 수 있다는 증거 또는 원리로서, 본원에서는 응고 인자 VIII의 생체공학적 형태에 초점을 맞췄다. 연구 결과는 A형 혈우병 치료와 관련이 있다. 최근에, 임상 발전은 B형 혈우병에 대한 간-지시된 인자 IX 유전자 전달을 위한 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)-기반 유전자 요법을 사용하여 이루어졌다(High 등, Methods Mol Biol. 2011;807:429-457). 전임상 연구는 또한 동물 모델에서 FVIII 발현 rAAV 벡터로 A형 혈우병을 치료하는 실현가능성을 입증하였다(Brown 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 1:14036, 2014, Callan 등, PLoS One. 11(3):e0151800, 2016, Greig 등, Hum Gene Ther. 28(5):392-402, 2017). 그러나, 간-지시된 rAAV A형 혈우병 유전자 요법의 광범위한 적용은 여러 장애물에 직면할 수 있다: (i) 간세포에서 rAAV 게놈의 대부분의 에피솜 속성 및 구체적으로 어린이에서 세포 분열로 인한 이들의 손실. (ii) rAAV 벡터 생산에 대한 고비용, (iii) 유전자 침묵 또는 유전독성을 방지하기 위해 종종 요구되는 큰 전사적 조절 요소를 수용할 수 없는 rAAV의 제한된 패키징 용량(Grieger 등, J Virol. 79(15):9933-9944, 2005, Chandler 등, J Clin Invest. 125(2):870-880, 2015), 및 (iv) 구체적으로 바이러스 간염과 같은 기저 간 질환이 있는 환자, 또는 혈우병 환자의 많은 분율을 차지하는 간세포가 활성적으로 분열하는 어린이에서(Nault 등, Mol Cell Oncol. 3(2):e1095271, 2016, Nault 등, Nat Genet. 47(10):1187-1193, 2015), 원종양형성 유전자 부근의 잠재적인 rAAV 통합(Russell 등, Nat Genet. 2015;47(10):1187-1193)으로 인한 종양 형성 위험 증가.
HDAd 벡터를 사용하여 적혈구 세포로부터 FVIII을 발현하는 접근법은 이러한 문제를 해결한다. 이 연구는 미니 LCR의 제어 하에 GFP를 리포터 유전자로 사용하여 생체내 HSC 형질도입/선택 후 적혈구 세포에서 비-적혈구 단백질의 발현 및 성숙 적혈구에서 GFP의 저장을 달성할 가능성이 있음을 나타낸다(도 89a-89h 참조). 그런 다음 "건강한" hCD46 유전자이식 마우스에서 접근법이 항-FVIII 혈장 항체의 존재에도 불구하고 A형 혈우병 마우스 모델에서 생리학적 수준의 FVIII의 생체공학적 형태 및 표현형 교정을 초래함을 입증하였다.
제안된 접근법은 단일 정맥내 개입 후 평생 치료 교정을 제공할 수 있다. 적혈구로의 분화 시 유전자 변형된 HSC의 거대한 증폭 및 이러한 세포의 고효율 단백질 합성 기구는 치유적 수준에서 FVIII 생산에 대한 기초를 생성한다. 또한, HSC의 유일한 분획의 유전적 변형은 이식유전자 산물에 대한 내성을 초래할 수 있다. 생체내 유전자를 HSC로 전달하기 위해 새로 개발된 이러한 접근법은 골수절제술 및 HSC 이식을 필요로 하지 않는다. 이는 골수에서 말초 혈류로 HSC를 동원하기 위한 G-CSF/AMD3100의 주사 및 통합 헬퍼-의존적 아데노바이러스(HDAd) 벡터 시스템의 정맥내 주사를 수반한다(도 90b). HDAd5/35++ 및 HDAd35 벡터는 원시 HSC 상에서 발현되는 수용체인 CD46을 표적화한다. 이식유전자 통합은 과활성 잠자는 미녀 트랜스포사제(SB100x)를 사용하여 (무작위 패턴으로) 달성된다(도 90a). CD46-유전자이식 마우스에서 생체내 HSC 형질도입/선택 후, 생체공학적 인간 인자 VIII 버전(ET3)의 과생리적 혈청 농도 및 활성이 입증되었다(도 90c-90i; 91a-91d; 92a-92g). ET3 유전자는 ET3 발현을 적혈구로 제한하는 미니 β-글로빈 LCR의 제어 하에 있었다. 적혈구 세포로부터 고수준 ET3 생산에도 불구하고, 조혈에 대한 효과는 관찰되지 않았다. 억제 항-ET3 항체의 초기 개발 후, 처리된 마우스의 50%에서 크게 감소된 혈청 항체 수준은 흉선에서 낮은 수준의 ET3 발현 및 내성 발달로 인할 가능성이 가장 크다. CD46-tg/A형 혈우병 마우스로부터 HSC의 생체외 및 생체내 형질도입 및 치명적으로 조사된 A형 혈우병 마우스로의 후속 이식 후, 표현형 교정은 생리학적 인자 VIII 혈청 활성, 정상 aPTT, 및 꼬리 절단 후 정상적인 출혈 시간에 기반하여 달성되었다.
논의. FVIII 이외에도, 다른 분비된 단백질에 대한 이 접근법의 적용은 예를 들어 다음에 사용될 수 있다: (i) 다른 응고 인자, 구체적으로 FXI, FVII(Binny 등, Blood. 119(4):957-966, 2012), 폰빌레브란트 인자(VWF)(De Meyer 등, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28(9):1621-1626, 2008), 뿐만 아니라 희귀 응혈 인자(즉, 인자 I, II, V, X, XI, 또는 XIII); (ii) 폼페병(산 α-글루코시다제), 고세병(글루코레세브로시다제), 파브리병(α-갈락토시다제 A), 및 I형 점액다당류증(α-L-이두로니다제)과 같은 현재 리소좀 축적 질환에 대한 효소 대체 요법(ERT)에 사용되는 효소(교차-교정 메커니즘의 이점을 취함)(Penati 등, J Inherit Metab Dis. 40(4):543-554, 2017); (iii) 면역결핍 예를 들어, SCID-ADA(Cicalese 등, Mol. Ther. 26(3):917-931 2018)(아데노신 데아미나제); (iv) 심혈관 질환, 예를 들어, 가족성 아포지질단백질 E　결핍 및 아테롬성동맥경화증(ApoE)(Wacker 등, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38(1):206-217, 2018); (v) 바이러스 유인 수용체의 발현에 의한 바이러스 감염(예를 들어 HIV의 경우 - 가용성 CD4(Falkenhagen 등, Mol Ther Nucleic Acids. 9:132-144, 2017), 또는 HIV(Kuhlmann 등, Mol Ther. 27(1):164-177, 2019), 만성 HCV(Quadeer 등, Nat Commun. 10(1):2073, 2019), 또는 HBV(Kuciinskaite-Kodze 등, Virus es. 211:209-221, 2016) 감염에 대한 광범위한 중화 항체(bNAb); 및 (vi) 암(예를 들어 단클론 항체(예를 들어 트라스투주맙(Zafir-Laviee 등, J Control Release. 291:80-89, 2018) 또는 체크포인트 억제제(예를 들어 aPDL1(Engeland 등, Mol Ther. 22(11):1949-1959, 2014))의 제어된 발현).
실시예 8. 생체내 HSC 형질도입 후 비-인간 영장류에서 SB100x-매개 유전자 추가 및 내인성 γ-글로빈의 BE-매개 재활성화 둘 다의 검증.
이 실시예는 SB100x-매개 유전자 추가 및 내인성 γ-글로빈의 BE-매개 재활성화가 둘 다 생체내 HSC 형질도입 후 비-인간 영장류에서 효과적임을 검증하는 연구를 기재한다.
유전자 전달 벡터 : 유전자 전달 벡터인 HDAd-combo가 사용될 것이다: 벡터는 다음 이식유전자의 SB100x 트랜스포사제-매개 무작위 게놈 통합을 함유한다: i) 적혈구에서 효율적인 발현을 위한 미니-LCR의 제어 하에 레서스 γ-글로빈 유전자, ii) O6BG/BCNU로 형질도입된 세포의 생체내 선택을 위한 보편적으로 활성인 EF1a 프로모터의 제어 하에 레서스 mgmtP140K, iii) 말초 혈액 T-세포 형질도입 및 벡터 생물분포 연구의 분석을 위한 보편적으로 활성인 EF1a 프로모터의 제어 하에 GFP. 이는 HBG 프로모터에서 BCL11a 억제인자 단백질 결합 부위의 불활성화 및 적혈구 bcl11a 인핸서의 동시 불활성화(이는 적혈구 세포에서 BCL11a 억제인자 단백질 발현 감소를 초래함)를 통해 내인성 γ-글로빈의 재활성화를 위한 아데닌 염기 편집기를 추가로 포함할 것이다. 또한, 염기 편집기 발현 카세트는 iCas-BE의 일시적 발현만을 초래하는 트랜스포존의 Flp 재조합효소 매개된 절제 시 제거될 것이다. 마지막으로, SB100x 트랜스포사제 및 Flp 재조합효소를 함유하는 벡터는 통합되지 않고 HSC 세포 증식 동안 손실될 것이다(도 121).
치료 프로토콜: 이전에 테스트된 HSC 동원 및 O6BG/BCNU 생체내 선택 프로토콜을 사용하여 3 마리의 히말라야 원숭이(Macaca mulatta)로 6-개월 연구가 수행될 것이다(도 122). 프로토콜은 1 마리의 동물을 테스트하는 것으로 시작될 것이다. 연구는 8 주(마지막 생체내 선택 주기의 종료)에 심각한 합병증이 발생하지 않으면 나머지 2 마리 동물에서 반복할 것이다.
동원: 피하로 주어진 GCSF 및 SCF은 5 일 동안 아침에 제공될 것이다(각각 50　μg/kg). 피하로 주어진 GCSF/SCF + AMD3100은 마지막 2 일 동안 오후에 생길 것이다(5　mg/kg).
전처리: 4　mg/kg으로 투여된 덱사메타손은 HDAd5/35++ 주사 16 전에 정맥내로 주어질 것이다. 20　mg/kg으로 투여된 메틸프레드니솔론 및 4　mg/kg으로 투여된 덱사메타손은 정맥내로 주어질 것이지만, 100 mg으로 투여된 아나킨라는 HDAd5/35++ 주사 30 분 전에 피하로 주어질 것이다.
HDAd 주사: 2 차례의 HDAd 주사는 정맥내로 1) -1 일에 저용량(2 mL/분으로 20 mL의 포스페이트 완충된 염수 중 3x1011 vp/kg)로 주어질 것이고, 2) 2 개의 완전 용량(2 mL/분으로 20 mL의 포스페이트 완충된 염수 중 1x1012 vp/kg)은 0 일차에 30 분 간격으로 주어질 것이다.
일시적 면역억제: 면역억제는 O6BG/BCNU의 첫번째 용량(4 주)까지 1 일에 시작하고, 필요한 경우, O6BG/BCNU의 마지막 용량 후 2 주간 계속될 것이다. 면역억제는 0.2　mg/kg/일의 라파마이신, 30 mg/kg/일의 마이코페놀레이트 모페틸, 및 0.25 mg/kg/일의 타크롤리무스를 포함하며, 모두 음식을 통해 경구로 매일 제공될 것이다.
O 6 BG/BCNU를 사용한 생체내 선택: O6BG: 동물은 적어도 30 분에 걸쳐 정맥내로 주입되는 200　mL의 염수 중 120 mg/m2 O6BG를 받을 것이다. BCNU는 O6BG 주입을 시작하고 60 분 후에 투여될 것이다. 그런 다음 동물은 BCNU 투여 6 내지 8 시간 후 적어도 30 분에 걸쳐 정맥내로 200　mL의 염수 중 또 다른 용량의 O6BG를 받을 것이다. 첫번째 처리는 HDAd 주사 4 주 후에 주어지고; 두번째 및 세번째 처리는 γ-글로빈 마킹 및 혈액학에 따라 2 주 간격(임의적)으로 주어질 것이다.
수집할 데이터: 혈액 샘플은 도 122에 나타낸 바와 같이 수집될 것이다. 매일 신체 관찰 및 매주 체중 측정이 수행될 것이다.
혈액 샘플: 2 시간 및 6 시간 혈액 샘플을 위해, 다음 검정이 수행될 것이다: CD34+에서 GFP+ 세포의 백분율 및 CD38-/Cd45RA에서 GFP+ 세포의 퍼센트, CD90+ 세포가 정량화되고, 콜로니 형성 단위 검정을 사용하여 %GFP+ 콜로니의 퍼센트, SDF1-a로의 이동, 및 CXCR4 및/또는 VLA-4의 발현율을 평가할 것이다(예를 들어, 도 93b-93e). 모든 다른 샘플의 경우, 혈액 세포 계수, 화학, c-반응성 단백질, 및 전염증성 사이토카인이 측정될 것이다. γ-글로빈 발현은 유세포 분석(적혈구/비-적혈구 세포)을 통해 측정되는 반면, HPLC 및 qRT-PCR은 사용하여 추가된 γ-글로빈에 대한 재활성화된 γ-글로빈 수준을 측정할 것이다. 사이토스핀은 γ-글로빈 면역형광을 평가하는 데 사용될 것이다. 벡터 카피 수 및 Cas9, SB100x, 및 Flpe mRNA 수준이 측정될 것이다. 백혈구(CD4+, CD8+, CD25, CD45RO, CD45RA, CCR-7, CD62L, FOXP3, 인테그린 αeβ7)에서 GFP 발현이 측정될 것이다.
골수 샘플: 골수 샘플은 4 일째에 수집한 다음 매월 수집될 것이다(도 122 참조). 골수 샘플의 계통 조성물은 유세포 분석에 의해 평가될 것이다. CD34+ 세포의 벡터 카피 수가 또한 측정될 것이다. γ-글로빈은 Ter119+/Ter119- 마커로 분류함으로써 유세포 분석을 사용하여 평가될 것이다. HPLC 및 qRT-PCR을 사용하여 추가된 γ-글로빈에 대한 재활성화된 γ-글로빈 수준이 측정될 것이다. 이러한 분석 외에도, 부검 시, 전체 게놈 서열분석을 CD34+ 세포에서 수행하여 SB100-매개 통합 및 염기 편집기 표적외 효과를 식별할 것이다. RNA 서열분석을 또한 CD34+ 세포에서 수행하여 처리 전 및 처리 후 사이의 mRNA 및 miRNA 프로파일을 비교할 것이다.
부검으로 수득한 조직(생식계열 조직 및 정액 포함): 일상적인 조직학이 수행될 것이고, 벡터 카피 수가 주요 조직 그룹에서 측정될 것이다. γ-글로빈 및 GFP 면역형광이 조직 절편에서 평가될 것이다.
결과: 이 실험은 SB100x-매개 유전자 추가 및 내인성 γ-글로빈의 BE-매개 재활성화 둘 다가 생체내 HSC 형질도입 후 비-인간 영장류에서 효과적임을 검증할 것이다. 벡터는 SCA 환자에서 치유적일 수 있는 적혈구에서 γ-글로빈 발현 수준을 달성함이 입증될 것이다(즉 80% 초과의 γ-글로빈+ RBC 및 성체 레서스 글로빈의 20% 초과의 γ-글로빈 수준). 또한 장기간 혈액학적 부작용의 부재 및 원치않은 게놈 재배열의 부재 및 HSC 전사체의 변화를 입증할 것이다. 마지막으로, 정맥내로 주사된 HDAd5/35++ 벡터가 기억 T-세포를 형질도입함을 입증할 것이다.
실시예 9. 내인성 γ-글로빈 빈 발현의 재-활성화를 위한 염기 편집기를 발현하는 HDAd5/35++ 벡터를 사용한 인간 및 레서스 원숭이 HSC 형질도입.
사이티딘 또는 아데닌 데아미나제 또는 트랜스아미나제에 융합된 불활성 Cas9는 태아 글로빈을 재활성화하는 도구로서 역할을 할 수 있다. 사이티딘 염기 편집기를 발현하는 HDAd 벡터(HDAd-C-BE)를 적혈구 bcl11a 인핸서를 표적화하고 중요한 GATA 결합 모티프를 파괴하는 HDAd-CRISPR/Cas9 벡터와 비교하였다(도 123). 동일한 영역에 대해 야생형 CRISPR을 발현하는 HDAd 벡터를 구축하였다. 두 벡터를 HDAd 형질도입 후, 18 일에 걸쳐 적혈구 분화에 적용된 인간 CD34+ 세포에서 테스트하였다(도 124a). HDAd-wtCRISPR 형질도입된 세포의 경우, 편집된 표적 부위의 백분율의 점진적인 감소가 관찰되었으며, CRISPR-관련된 세포독성 때문일 가능성이 가장 크다(도 124b). 게놈 편집의 효능은 HDAd-C-BE 벡터의 경우 더 낮았지만, 편집률은 안정되게 유지되어, γ-글로빈의 비슷한 재활성화를 초래하였다(도 124c). 이식 후, HDAd-C-BE 형질도입된 CD34+ 세포의 생착은 형질도입되지 않은 대조군 세포만큼 효율적이었다(도 125). 요약하면, 이러한 데이터는 염기-편집기 벡터가 잠재적으로 wtCRISPR-발현 벡터보다 HSC에서 게놈 편집을 위한 더 나은 도구임을 나타낸다. 보다 최근에, HBG1/2 프로모터에서 3 개의 상이한 영역에 대해 아데닌 편집기를 발현하는 HDAd 벡터 시리즈가 개발되었다. γ-글로빈 재활성화는 염기 편집기 벡터로 여러 억제인자 수준을 동시에 표적화함으로서 실질적으로 증가될 수 있을 것으로 예상된다. 이 목표를 향해 적혈구 bcl11a 인핸서(도 126, 상부 패널) 또는 HBG1/2의 BCL11a 단백질 결합 부위(도 126, 하부 패널)를 표적화하는 염기 편집기를 발현하는 HDAd 벡터를 테스트하였다. 시험관내 연구에서 γ-글로빈 재활성화는 두 벡터에 대해 각각 9 및 53%였다.
SCA 마우스 모델(Townes 모델)의 데이터: B6;129-Hbbtm2(HBG1,HBB*)Tow/Hbbtm3(HBG1,HBB)Tow　Hbatm1(HBA)Tow/J; hα/hα::βA/βS, hα/hα::-383 γ-βA/-1400 γ-βS.
마우스는 인간 α-글로빈, γ-글로빈(프로모터를 함유하는 -383 및 -1400 영역 포함), 상응하는 마우스 유전자 대신에 β87-SCA 글로빈을 함유하고 말초 혈액에서 망상적혈구의 40%, 낮은 적혈구용적률, 낮은 헤모글로빈 수준, 및 백혈구증가증(도 127b)을 갖는 심각한 SCA 표현형(도 127a)을 나타낸다. 이러한 마우스를 CD46에 대한 동형접합성 및 3 개의 글로빈 유전자 치환을 달성하도록 번식시켰다(CD46/Townes 마우스). 이전에 개발된 HDAd-HBG-CRISPR 벡터가 CD46/Townes 마우스의 생체내 HSC 형질도입 후 γ-글로빈을 활성화시키는지 여부를 결정하기 위해 테스트하였다(도 128a). O6BG/BCNU 선택 없이, RBC의 γ-글로빈 마킹은 60%에 도달하였으며, 이는 Townes 마우스의 적혈구생성의 기능적 결핍이 게놈-편집된 HSC/ 적혈구 전구체 세포에 대한 강한 증식 자극을 제공함을 나타낸다(도 128b). HDAd-HBG-CRISPR 벡터의 치료 효과는 크게 개선된 적혈구 표현형 및 말초 망상적혈구의 5-배 감소를 반영하였다(도 128c). 이는 이 모델(및 잠재적으로 SCA 환자)의 치유가 O6BG/BCNU 생체내 HSC 선택에 대한 필요성 없이 달성될 수 있음을 나타낸다.
비-인간 영장류(NHP)에서 생체내 HSC 유전자 전달: 이들 데이터는 G-CSF, SCF, 및 AMD3100으로 동원 후 HDAd-GFP 주사를 받은 2 마리의 NHP(돼지꼬리 원숭이(Macaca nemestrina))로부터 수득된다(도 129a; 도 93a; 도 94e-94g). 말초 혈액 샘플을 벡터 주사 직전, 및 벡터 주사 2 및 6 시간 후에 수집하였다. 단리된 CD34+ 세포를 생체외에서 배양하고 콜로니 형성 검정에 플레이팅하였다. 벡터 투여 후 단리된 CD34+ 세포의 평균 3%는 GFP+였으며(도 129b; 도 93b, 93c; 도 94h), 이는 말초 혈액에서 동원된 CD34+ 세포가 HDAd5/35++ 벡터의 단일 정맥내 투여에 의해 형질도입될 수 있음을 시사한다. 이러한 CD34+ 세포가 콜로니-형성 가능성을 유지하는지를 테스트하기 위해, 콜로니 검정을 수행하고, PCR을 통해 GFP 이식유전자를 보유하는 콜로니의 백분율을 결정하였다. 주사 후 시점으로부터 CD34+ 세포에서 유래된 콜로니의 최대 55%가 벡터에 의해 형질도입되었다(도 129c; 도 93d; 또한 도 94i-94m 참조). 마지막으로, 말초 동원 후 골수 구획으로 되돌아가는 생체내 벡터-표적화된 세포의 능력을 테스트하기 위해, 골수 흡인물을 벡터 투여 3 일 후 동물 중 하나로부터 수집하였다. 골수-상주 CD34+ 세포의 3.7% 또는 2.9%는 GFP+였고, 생체내 전달 전 vs 전달 후 수집된 세포에서 콜로니 형성 가능성의 주목할만한 차이는 관찰되지 않았다(도 129d; 도 93e). 이러한 비-인간 영장류 연구(마우스에서보다 10배 더 낮은 벡터 용량으로 수행됨)는 기재된 생체내 전달 접근법이 검증된 전임상 모델에서 실행가능하고 안전함을 입증한다.
실시예 10. 염기 편집기를 사용한 생체내 HSC 유전자 요법은 β-YAC 마우스에서 태아 γ-글로빈의 효율적인 재활성화를 허용한다
이 실시예는 생체내에서 HDAd5/35++ 벡터에 의해 전달된 염기 편집기가 예를 들어, 혈색소병증의 치료를 위해 정확한 게놈 조작을 위한 유용하고 효과적인 전략임을 입증한다.
염기 편집기는 표적화된 게놈 유전자좌에서 정확한 뉴클레오티드 돌연변이를 설치할 수 있고 이중-가닥 DNA 파괴를 피하는 이점을 제시하다. 여기서, 중요한 모티프는 HDAd5/35++ 벡터를 통해 전달된 염기 편집기로 γ-글로빈 재활성화 조절을 표적화하였다. 최적화된 설계를 통해, HBG1/2 프로모터에서 BCL11A 인핸서를 표적화하거나 또는 자연 발생 태아 헤모글로빈의 유전적 지속성(HPFH) 돌연변이를 재생성하는 사이티딘 및 아데닌 염기 편집기(CBE 및 ABE)의 패널은 성공적으로 구제되었다. HUDEP-2 세포에서, 5 개의 테스트된 벡터는 모두 표적 염기 전환을 효율적으로 설치하고 실질적인 γ-글로빈 재활성화로 이어졌다. HBG1/2 프로모터에서 -113A에서 G로의 HPFH 돌연변이에 특이적인 ABE 벡터 HDAd-ABE-sgHBG#2를 사용함으로써 상당한 γ-글로빈 단백질 생산(β-글로빈에 비해 23%)이 관찰되었다. 따라서 이 벡터가 하류 동물 연구에 선택되었다. 248　kb의 인간 β-글로빈 유전자좌를 보유하는 마우스(β-YAC 마우스)를 사용하여 글로빈 전환을 정확하게 반영하였다. FRT 및 트랜스포존 부위에 의해 플랭킹된 EF1α-MGMTP140K 발현 카세트는 형질도입된 세포의 생체내 선택을 허용하는 벡터에 포함되었다. HDAd-ABE-HBG#2 + HDAd-SB로의 생체내 형질도입 및 저용량의 화학선택 후, 말초 적혈구에서 평균 40% 초과의 HbF-양성 세포가 측정되었다. 이는 인간 β-글로빈에 비해 γ-글로빈 생산의 21%에 상응하였다. 총 골수 세포에서 -113 A에서 G로의 전환은 평균 20%였다. 형질도입되지 않은 마우스와 비교하여, 처리 후 혈액학적 매개변수, 적혈구생성 및 골수 세포 조성물에서 변경은 관찰되지 않았으며, 이는 접근법의 우수한 안전성 프로파일을 입증한다. 상위 점수의 잠재적인 표적외 게놈 부위에서 검출가능한 편집은 발견되지 않았다. 골수 계통 마이너스 세포를 형질도입 후 16 주차에 1차 마우스로부터 단리하고 치명적으로 조사된 C57BL/6J 마우스에 주입하였다. HbF-양성 세포의 백분율은 16 주에 걸쳐 2차 수용자에서 유지되었으며, 이는 게놈 편집이 장기간 재증식 마우스 HSC에서 발생하였음을 나타낸다. 관찰은 HDAd5/35++ 벡터에 의해 전달된 염기 편집기가 혈색소병증의 치료를 위한 정확한 생체내 게놈 조작을 위한 유망한 전략을 나타냄을 입증한다.
CRISPR/Cas9와 같은 뉴클레아제에 기반한 게놈 조작 전략은 임상 평가 단계에 들어가는 다중 유전자 요법 연구와 함께 주목할만한 발전을 달성하였다. CRISPR/Cas9-매개 유전자 편집은 고전적인 비-상동 말단 결합(NHEJ)을 포함하는 내인성 복구 메커니즘을 촉발하는 이중-가닥 DNA 파괴(DSB)에 의존한다. 공여자 DNA 주형의 존재 하에, 상동성-지시된 복구(HDR)는 전형적으로 더 낮은 빈도로 발생할 수 있다. 최신 연구는 혈액 장애에 대한 유전적 요법에 중요한 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC)에서 관심 유전자의 매우 효율적인 파괴를 입증하였다(Martin 등, Cell Stem Cell 24: 821-828.e825, 2019; Wu 등, Nature Medicine 25: 776-783, 2019). 그러나, 연구는 뉴클레아제-유도된 DSB가 원치않은 큰 단편 결실 및 p53-의존적 DNA 손상 반응을 생성함으로써(Haapaniemi 등, Nature Medicine, 24(7):927-903, 2018; Ihry 등, Nature Medicine, 24(7):939-946, 2018; Kosicki 등, Nature Biotechnology 36: 765, 2018) 숙주 세포에 대한 부작용을 유발할 수 있음을 보고하였다(Haapaniemi 등, Nature Medicine, 24(7):927-903, 2018; Ihry 등, Nature Medicine, 24(7):939-946, 2018; Kosicki 등, Nature Biotechnology 36: 765, 2018).
염기 편집기(BE)는 DSB를 생성하지 않으면서 표적화된 게놈 유전자좌에서 정확한 뉴클레오티드 치환을 설치할 수 있다. 이들은 핵염기 데아미나제 효소 및, 일부 경우에, DNA 글리코실라제 억제제에 융합된, DSB를 만들 수 없는 Cas9 닉카제(nCas9)와 같은 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제를 포함한다. 현재, 2 가지 주요 범주인 사이티딘 염기 편집기(CBE) 및 아데닌 염기 편집기(ABE)가 있으며, 이는 nCas9와 커플링된 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 지시된 좁은 표적가능한 창(일반적으로 약 5 개 염기 쌍)에서 각각 C > T 및 A > G 전이를 전환시킨다(Gaudelli 등, Nature 551: 464-471, 2017; Komor 등, Nature 533: 420-424, 2016; Nishida 등, Science 353, 2016). CBE 및 ABE 사이의 핵심 차이는 CBE가 사이티딘 데아미나제(예를 들어, APOBEC1)를 함유하고 ABE가 실험실에서 진화된 TadA 데옥시아데노신 데아미나제를 사용하는 데아미나제 영역에 위치한다. 다중 그룹은 다양한 진핵생물 세포에서 효율적인 염기 편집을 보고하였다(Zhang 등, Genome Biology 20: 101, 2019; Chadwick 등, Arterioscler Thromb Vasc Biol 37: 1741-1747, 2017; Zeng 등, Nature Medicine 26: 535-541, 2020; Lim 등, Mol Ther, 82(4):1177-1189, 2020; Gao 등, Nature 553: 217-221, 2018). 인간에서 알려진 모든 병원성 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 60%는 현재 BE에 의해 잠재적으로 역전될 수 있는 것으로 예측된다(Rees 등, Nature Reviews Genetics 19: 770-788, 2018).
β-혈색소병증은 주로 β-지중해빈혈 및 겸상적혈구병(SCD)를 포함하는 정상 β글로빈 생산이 부재하거나 또는 겹핍된 유전 질환의 통상적인 그룹이다. 특이적 유전적 결함에 따라, β-지중해빈혈 및 SCD 환자는 다양한 중증도의 질환 징후를 나타낸다. 신생아 스크리닝 및 치료 예방으로 SCD 어린이의 사망률이 크게 감소하였지만, 대부분의 β-주요 지중해빈혈(β0) 및 SCD 환자는 평생 급성 및 만성 합병증으로 고통을 받는다(Ware 등, Lancet 390: 311-323, 2017; Higgs 등, Lancet 379: 373-383, 2012). 그러나, 대부분의 임신 단계 동안 우세하고 일반적으로 출생 직후 침묵하는 태아 헤모글로빈(HbF) 수준이 높은 일부 성인 환자에서, 질환 증상은 현저하게 경미하다. 이러한 태아 헤모글로빈의 유전적 지속성(HPFH) 현상은 HbF의 강한 보호 효과를 입증하고 β-글로빈 장애 환자에 대한 유전적 요법 전략으로서 γ-글로빈의 재활성화에 대한 우수한 근거를 제공한다.
다수의 HPFH 돌연변이가 보고되었다(Orkin & Bauer, Annual Review of Medicine 70: 257-271, 2019 및 Wienert 등, Trends in Genetics: TIG 34: 927-940, 2018에 의해 검토됨). HBG1/2 프로모터에서 약 -150, -175 및 -200 부위에 위치한 HPFH SNP의 3 가지 주요한 클러스터가 있다. 이들 부위에서 HPFH 돌연변이의 도입은 HbF 억제인자(예를 들어, BCL11A 및 ZBTB7A)의 결합 부위를 파괴하거나 또는 활성인자(예를 들어, TAL1 및 KLF1)의 기능 획득 결합 부위를 생성하여, 억제된 HbF 발현으로 이어질 수 있다(Traxler 등, Nature Medicine 22: 987-990, 2016; Martyn 등, Nature Genetics 50: 498-503, 2018). HbF 재활성화는 또한 주요한 HbF 억제인자인 BCL11A과 같은 HbF 조절인자의 발현을 조절함으로써 달성될 수 있다(Sankaran 등, Science 322: 1839-1842, 2008). 직접 BCL11A 녹아웃은 발달적으로 필수적인 역할로 인해 옵션이 아니었지만, 적혈구-특이적 인핸서의 편집에 의한 BCL11A의 부분적 하향조절은 동물 생존력을 유지하면서 효율적인 HbF 유도를 허용한다(Wu 등, Nature Medicine 25: 776-783, 2019; Canver 등, Nature 527: 192-197, 2015). BE:sgRNA 리보뉴클레오단백질(RNP) 전기천공법을 사용하여, 최근 연구는 +58 BCL11A 인핸서의 중요한 모티프를 염기 편집기로 파괴하는 것이 환자-유래된 CD34+ HSPC에서 치료적 HbF 유도로 이어짐을 입증하였다.
생체내 HSC 형질도입에 의한 단순화된 유전자 요법 접근법이 최근에 규명되었다. HSC 향성을 위한 키메라 섬유, 가장 통상적으로 사용되는 이식유전자를 수용하기 위한 32 kb 초과의 페이로드 등을 포함하는 다양한 유리한 특성으로 인해 헬프-의존적 HDAd5/35++ 벡터가 사용되었다. 이 연구에서, 최적화된 설계를 사용하여 BCL11A 인핸서 또는 HBG1/2 프로모터를 표적화하는 BE 벡터의 패널을 성공적으로 생성하였다. 유전자이식 마우스 모델에서, HDAD-ABE 벡터를 사용한 생체내 HSC 염기 편집은 HPFH 돌연변이를 재생성하고 효율적인 HbF 유도로 이어짐이 여기에 제시된다.
재료 및 방법 .
생체내 형질도입 및 선택을 위한 시약: G-CSF(Neupogen™)(Amgen, 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재), AMD3100(MilliporeSigma, 매사추세츠주 버링턴 소재) 및 덱사메타손 나트륨 포스페이트(Fresenius Kabi USA, 일리노이주 레이크 주리치 소재)를 사용하였다. O6-벤질구아닌(O6-BG) 및 카르무스틴(BCNU)은 MilliporeSigma로부터 수득하였다.
HDAd 벡터 생성: 하버드의 David R. Liu 실험실에서 개발된 염기 편집 시스템을 사용하였다(Koblan 등, Nature Biotechnology 36: 843-846, 2018). pCMV_AncBE4max 및 pCMV_ABEmax 플라스미드는 Addegene(매사추세츠주 워터타운 소재)으로부터 구입하였다. Addgene으로부터 구입한 다음 플라스미드를 또한 사용하였다: 도 131a 및 131b의 BE4, ABE7.10, pLenti-BE3RA-PGK-Puro 및 pLenti-FNLS-PGK-Puro 및 BE3RA(Zafra 등, Nature Biotechnology 36: 888-893, 2018). 하기 기재된 올리고 및 gBlock은 Integrated DNA Technologies(IDT)(아이오와주 코랄빌 소재)에 의해 합성하고 표 14에 나열하였다.
표 14: 염기 편집기를 위한 가이드 서열.
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CBE 및 ABE 작제물의 첫번째 버전: 클로닝은 3 단계를 수반하였다. 단계 1) BE4에서 BsmBI 부위는 EagI-NaeI 단편을 gBlock #1로 교체함으로써 파괴하였다. pCMV_AncBE4max에서 BsmBI 부위는 BsmBI-NarI 단편을 gBlock #2로 교체함으로써 파괴하였다. BsmBI sgRNA 클로닝 부위가 있는 pBST-CRISPR이라는 벡터는 주입을 사용하여(Takara, 캘리포니아주 마운틴뷰 소재) 다음 4 개의 단편을 조합함으로써 생성되었다: #3FR을 사용하여 LentiCRISPRv2(Addgene)로부터 증폭된 2.3　kb U6-충전제-gRNA 스캐폴드 단편, 각각 #4FR 및 #5FR을 사용하여 pBST-sgBCL11Ae1로부터 증폭된 1.4　k　b 및 1.0　kb 단편(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018), 및 BsaI-BamHI 소화에 의해 방출된 pBST-sgBCL11Ae1의 9.6　kb 단편. 중간 플라스미드 pBS-U6-Ef1α는 주입을 사용하여 다음 3 개의 단편을 연결함으로써 구성되었다: 각각 프라이머 #6FR 및 #7FR을 사용하여 pBST-CRISPR로부터 증폭된 3.6　kb U6-충전제-스캐폴드-Eflα 서열 및 2.9 kb 벡터 백본, 및 BseRI 클로닝 부위를 함유하는 0.5 kb gBlock(#8). 이 중간체를 BseRI로 소화시키고 EagI-PmeI 처리 후 BE4-ΔBsmBI의 5.5 kb 단편과 재조합하여, pBS-BE4를 생성하였다. 6.6 kb pBS 백본-U6-충전제-gRNA 스캐폴드-Eflα 서열을 #9FR을 사용하여 pBS-BE4로부터 PCR 증폭시킨 후, NotI-AgeI-소화된 pCMV-ABEmax 및 pCMV_AncBE4max-ΔBsmBI를 주입하여, 각각 pBS-AncBE4max 및 pBS-ABEmax를 생성하였다. 다음으로, sgRNA 올리고를 합성하고, 어닐링하고 pBS-BE4, pBS-AncBE4max 및 pBS-ABEmax의 BsmBI 부위로 삽입하여, pBS-ABEmax-sgHBG#2와 같은 일체형 염기 편집 구성요소를 같는 셔터 플라스미드를 생성하였다. 단계 2) PacI 클로닝 부위가 있는 21.0　kb pHCAS3-MCS 벡터를, 스터퍼 DNA를 EcoRI 제한에 의해 줄이고 1.8　kb EcoRI 단편과 재결찰시키는 것을 제외하고 이전에 기재된 것과 유사하게 생성하였다(Li 등, Cancer Res 80: 549-560, 2020). 2.2　kb PGK-MGMTP140K-2A-GFP-bGHpolyA 서열을 #10FR에 의해 pHCA-이중-MGMT-GFP로부터 증폭시키고(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018) PacI-소화된 pHM5-FRT-IR-Ef1α-GFP와 재조합하여(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016), pHM5-FI-PGK-MGMT-GFP를 생성하였다. 이후에, I-CeuI 및 PI-SceI 부위 사이의 단편을 #11FR에 의해 이 작제물로부터 pHCAS3-MCS의 PshAI 부위로 옮기고 주입 클로닝하여, pHCAS3-FI-PGK-MGMT-GFP-MCS를 형성하였다. 단계 3) 단계 1의 셔틀 플라스미드 및 단계 2에서 생성된 벡터를 PacI로 처리하고 재조합하여 pHCA-ABEmax-sgHBG#2-FI-MGMT-GFP와 같은 최종 작제물을 생성하였다. 상이한 sgRNA 서열을 갖는 최종 pHCA 작제물은, 상이한 sgRNA가 단계 1에서 사용되었다는 것을 제외하고 유사하게 생성되었다.
ABE 작제물의 두번째 버전: ABE 작제물의 두번째 버전은 프로모터, 대안적인 코돈 용법 및 miRNA-조절된 유전자 발현에서 첫번째 버전과 상이하다. 클로닝은 또한 3 단계를 수반하였다. 단계 1) miR183/218 표적 서열이 있는 1.5　kb 3' β-글로빈 UTR을 프라이머 #12FR을 사용하여 pBST-sgHBG1-miR로부터 증폭시킨 후(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018), pBS-ABEmax-sgHBG#2의 NotI-HpaI 부위에 삽입하여, pBS-ABEmax-sgHBG#2-miR을 생성하였다. ABE 작제물의 두번째 버전에 대한 셔틀 플라스미드, 예를 들어, pBS-ABEopti-sgHBG#2-miR은 주입 클로닝에 의해 AscI-EcoRV-소화된 pBS-ABEmax-sgHBG#2-miR과 다음 4 개의 단편을 연결함으로서 수득하였다: #13FR을 사용하여 pHM5-FI-PGK-MGMT-GFP로부터 증폭된 인간 PGK 프로모터, 서열 반복성을 감소시키는 대안적인 코돈 용법을 갖는 2 개의 TadA 유전자를 함유하는 2 개의 gBlock(#14 및 #15), 및 #16FR을 사용하여 pBS-ABEmax-sgHBG#2로부터 증폭된 1.9　kb 서열. 단계 2) pHM-FRT-IR-Ef1α-MGMT(P140K)-2A-GFP-pA의 PshAI-NotI 부위 사이의 SV40 polyA 서열을 bGH polyA 서열(gBlock #17)로 대체하여, pHM-FI-Ef1α-MGMT(P140K)-GFP-bGHpA를 수득하였다. 그런 다음, I-CeuI 및 PI-SceI 부위 사이의 전체 4.9　kb 트랜스포존을 #11FR을 사용하여 pHCAS3-MCS의 PshAI 부위로 전달하여, pHCAS3-FI-Ef1α-MGMT-GFP-MCS를 생성하였다. 단계 3) 단계 1 및 2로부터의 생성된 작제물을 PacI 처리 후 주입 클로닝에 의해 조합하여, pHCA-ABEopti-sgHBG#2-FI-MGMT-GFP를 생성하였다. 상이한 sgRNA 서열을 갖는 최종 pHCA 작제물을 유사하게 생성하였다.
Phusion Hot Start II 고충실도 DNA 폴리머라제를 클로닝에 수반되는 모든 PCR 증폭에 사용하였다. 최종 작제물을 여러 제한 효소(HindIII, EcoRI 및 PmeI)에 의해 스크리닝하고 이식유전자를 함유하는 전체 영역을 서열분석함으로써 확인하였다.
HDAd5/35++ 벡터의 생산을 위해, 상응하는 플라스미드를 PmeI로 선형화하고 Ad5 섬유 꼬리, Ad35 섬유 샤프트, 및 친화도-향상된 Ad35++ 섬유 놉으로 구성된 키메라 섬유를 함유하는 Ad5/35++ 헬퍼 벡터(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016)인 AdNG163-5/35++로 116 세포에서 구제하였다(Palmer & Ng, Mol Ther 8: 846-852, 2003). HD-Ad5/35++ 벡터를 다른 곳에 상세히 기재된 바와 같이 116 세포에서 증폭시켰다(Palmer & Ng, Mol Ther 8: 846-852, 2003). 헬퍼 바이러스 오염 수준은 0.05% 미만인 것으로 밝혀졌다. 역가는 2-5x1012 개 바이러스 입자(vp)/mL였다.
세포주의 형질감염: 293FT(Thermo Fisher Scientific) 및 K562 세포를 판매처의 지침에 따라 배양하였다. 6-웰 플레이트에 미리 시딩된 293FT 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 3000(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 4　μg 플라스미드(3　μg 염기 편집기 또는 CRISPR/Cas9 + 1　μg pSP-sgBCL11AE(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 390-401, 2018))로 형질감염시켰다. K562 세포를 공급자의 프로토콜에 따라 뉴클레오펙션(카탈로그 # V4XC-2024)(Lonza, 스위스 바젤 소재)을 사용하여 2.66　μg 플라스미드(2　μg 염기 편집기 또는 CRISPR/Cas9 + 0.6　μg pSP-sgBCL11AE)로 형질감염시켰다. 게놈 DNA을 분석을 위해 형질감염 후 4 일째에 단리하였다.
HUDEP-2 세포 및 적혈구 분화: HUDEP-2 세포(Kurita 등, PloS One 8: e59890, 2013)를 100 ng/mL SCF, 3 IU/mL EPO, 10-6 M 덱사메타손 및 1　μg/mL 독시사이클린(DOX)이 공급된 StemSpan SFEM 배지(STEMCELL Technologies)에서 배양하였다. 적혈구 분화를 5% 인간 AB 혈청, 100 ng/mL SCF, 3 IU/mL EPO, 10 μg/mL 인슐린, 330 μg/mL 트랜스페린, 2 U/mL 헤파린 및 1　μg/mL DOX를 함유하는 IMDM에서 6 일 동안 유도하였다.
콜로니-형성 단위(CFU) 검정: 계통 마이너스(Lin-) 세포를 제조업체의 지침에 따라 마우스 계통 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 사용하여 골수 MNC에서 게통-수임 세포의 고갈에 의해 단리하였다. CFU 검정을 제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 완전 배지와 함께 ColonyGEL(Reachbio, 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 수행하였다. 콜로니를 플레이팅 후 10 일에 점수매겼다.
T7EI 불일치 뉴클레아제 검정: 게놈 DNA를 제공된 프로토콜에 따라 PureLink Genomic DNA 미니 키트(Life Technologies, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 단리하였다(Miller 등, Nat Biotechnol 25: 778-785, 2007). 적혈구 BCL11A 인핸서의 표적 부위를 포함하는 게놈 분절을 PCR 프라이머에 의해 증폭시켰다: BCL11A 정방향(서열번호: 247) 및 역방향(서열번호: 263). PCR 생성물을 혼성화하고 2.5 단위의 T7EI(New England Biolabs)로 37℃에서 30 분 동안 처리하였다. 소화된 PCR 생성물을 10% TBE PAGE(Bio-Rad)로 분해하고 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 100　bp DNA 래더(New England Biolabs)를 사용하였다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 절단율% = (1-sqrt(모체 밴드/(모체 밴드 + 절단된 밴드)) * 100%.
유세포 분석: 세포를 FACS 완충액(PBS, 1%　FBS) 중 1x106 개 세포/100　μL로 재현탁하고 FcR 차단 시약(Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 오번 소재)과 함께 얼음 위에서 10 분 동안 배양하였다. 다음으로 염색 항체 용액을 106 개 세포 당 100 μL로 첨가하고 암실에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 FACS 완충액에서 1 회 세척하였다. 2차 염색을 위해 염색 단계를 2차 염색 용액으로 반복하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 분석하였다. 파편을 전방 산란 영역 및 측방 산란 영역 게이트를 사용하여 제외하였다. 그런 다음 단일 세포를 전방 산란 높이 및 전방 산란 폭 게이트를 사용하여 게이팅하였다. 그런 다음 유세포 분석 데이터를 FlowJo(버전 10.0.8, FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. LSK 세포의 분석을 위해, 세포를 비오틴-접합된 계통 검출 칵테일(카탈로그 # 130-092-613)(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에이고 소재), c-Kit(클론 2B8, 카탈로그 # 12-1171-83) 및 Sca-1(클론 D7, 카탈로그 # 25-5981-82)에 대한 항체로 염색한 후, APC-접합된 스트렙타비딘(카탈로그 # 17-4317-82)(eBioscience, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)으로 2차 염색하였다. eBioscience로부터의 다른 항체는 항-마우스 CD3-APC(클론 17A2)(카탈로그 # 17-0032-82), 항-마우스 CD19-PE-Cyanine7(클론 eBio1D3)(카탈로그 # 25-0193-82), 및 항-마우스 Ly-66(Gr-1)-PE(클론 RB6-8C5)(카탈로그 # 12-5931-82를 포함하였다. 항-마우스 Ter-119-APC(클론 Ter-119)(카탈로그 # 116211)는 Biolegend(캘리포니아주 샌디에이고 소재)로부터 수득하였다.
인간 γ-글로빈 발현을 검출하는 세포내 유세포 분석: FIX & PERMTM 세포 투과화 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따랐다. 간단히 말해서, 5x106 개의 HUDEP-2 세포를 100　μL FACS 완충액에 재현탁하였다. 100　μL의 시약 A(고정 배지)를 첨가하고 실온에서 2-3 분 동안 배양하였다. 그런 다음 1　mL 미리 냉각된 절대 메탄올을 첨가하고 10 분 동안 암실에서 얼음 위에서 배양하였다. 그런 다음 샘플을 FACS 완충액으로 세척하고, 0.6　μg 헤모글로빈 γ 항체(클론 51-7, 카탈로그 # sc-21756 PE)(Santa Cruz Biotechnology, 텍사스주 댈러스 소재)를 함유하는 100　μL 시약 B(투과 배지)에 재현탁하고, 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고 분석하였다.
글로빈 HPLC: 개별 글로빈 쇄 수준을 SPD-10AV 다이오드 어레이 검출기 및 LC-10AT 바이너리 펌프가 장착된 Shimadzu Prominence 기기(Shimadzu, 일본 쿄토 소재)로 정량화하였다. 폴리펩티드용 Vydac 214TP™ C4 역상 칼럼(214TP54 Column, C4, 300 Å, 5 μm, 4.6 mm i.d. x 250 mm)(Hichrom, 영국 소재)을 사용하였다. 물/아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산의 40%-60% 구배 혼합물을 1 mL/분의 속도로 적용하였다.　
벡터 카피 수의 측정: 세포 당 아데노바이러스 게놈 카피의 절대 정량화를 위해, 게놈 DNA를 제공된 프로토콜에 따라 PureLink Genomic DNA 미니 키트(Life Technologies)를 사용하여 세포로부터 단리하고, power SYBRTM green PCR 마스터 믹스(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행된 qPCR에 대한 주형으로 사용하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: MGMT 정방향(서열번호: 220), 및 역방향(서열번호: 221).
실시간 역전사 PCR: 총 RNA를 TRIzolTM 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 5x106 개의 분화된 HUDEP-2 세포 또는 100　μL 혈액으로부터 추출한 후 페놀-클로로포름으로 추출하였다. QuantiTect 역전사 키트(Qiagen) 및 power SYBRTM green PCR 마스터 믹스(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 실시간 정량적 PCR을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(AB Applied Biosystems)에서 수행하였다. 다음 프라이머 쌍을 사용하였다: 마우스 RPL10(하우스키핑) 정방향(서열번호: 189), 및 역방향(서열번호: 190); 인간 γ-글로빈 정방향(서열번호: 191), 및 역방향(서열번호: 192); 인간 β-글로빈 정방향(서열번호: 216), 및 역방향(서열번호: 217); 마우스 β-주요 글로빈 정방향(서열번호: 193), 및 역방향(서열번호: 194), 마우스 α 글로빈 정방향(서열번호: 212), 및 역방향(서열번호: 213).
염기 편집의 검출: 게놈 DNA를 상기 기재된 바와 같이 단리하였다. BCL11A 인핸서 및 HBG1/2 프로모터의 표적 부위를 포함하는 게놈 분절을 다음 프라이머를 사용하여 KOD Hot Start DNA 폴리머라제(MilliporeSigma)로 증폭시켰다: HBG1 정방향(서열번호: 31), 역방향(서열번호: 33); HBG2 정방향(서열번호: 69), 역방향(서열번호: 72); 및 상기 제시된 BCL11A 프라이머. 앰플리콘을 NucleoSpin Gel & PCR 정리 키트(Takara)를 사용하여 정제하고 다음 프라이머로 서열분석하였다: HBG1-seq(서열번호: 105); HBG2-seq(서열번호: 237); 및 BCL11A-seq(서열번호: 247). 염기 편집 수준을 EditR 1.0.9를 사용하여 Sanger 서열분석 결과로부터 정량화하였다(Kluesner 등, CRISPR J 1: 239-250, 2018).
동물 연구: 동물을 수반하는 모든 실험은 워싱턴 대학에 의해 제시된 기관 지침에 따라 수행하였다. 워싱턴 대학은 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회(AALAC) 공인 연구 기관이며 이 대학에서 수행된 모든 살아있는 동물 작업은 실험실 동물 복지국(OLAW) 공중 보건 보증(PHS) 정책, USDA 동물 복지법 및 규정, 실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 정책을 따른다. 연구는 워싱턴 대학 IACUC(프로토콜 번호 3108-01)에 의해 승인되었다. 인간 CD46 게놈 유전자좌를 함유하고 인간과 유사한 수준 및 패턴으로 CD46 발현을 제공하는 C57BL/6J 기반 유전자이식 마우스(hCD46+/+ 마우스)는 이전에 기재되었다(Kemper 등, Clin Exp Immunol 124: 180-189, 2001). 야생형 248 kb β-글로빈 유전자좌 효모 인공 염색체(β-YAC)를 보유하는 유전자 이식 마우스를 사용하였다(Peterson 등, Ann N Y Acad Sci 850: 28-37, 1998). β-YAC 마우스를 인간 CD46+/+ 마우스와 교배하여 생체내 HSPC 형질도입 연구를 위한 β-YAC+/-/CD46+/+ 마우스를 수득하였다. 다음 프라이머를 마우스의 유전형 분석에 사용하였다: CD46 정방향(서열번호: 233) 및 역방향(서열번호: 234); β-YAC(γ-글로빈 프로모터) 정방향(서열번호: 242) 및 역방향(서열번호: 243).
HSPC 동원 및 생체내 형질도입: HSPC를 인간 재조합 G-CSF의 피하(SC) 주사(5　μg/마우스/일, 4 일) 이어서 5 일째에 AMD3100의 SC 주사(5　mg/kg)에 의해 마우스에 동원하였다. 또한, 동물은 바이러스 주사 16 시간 및 2 시간 전에 덱사메타손(10 mg/kg, IP)을 받았다. AMD3100 후 30 및 60 분에, 동물에게 2 개 용량의 바이러스(4x1010 vp/용량 x 2 회 용량)를 안와하정맥총을 통해 바이러스 벡터로 정맥내로 주사하였다. 염기 편집 및 SB 바이러스를 1:1 비로 공동 전달하였다.
생체내 선택: 선택을 형질도입 후 1 주차(Townes 모델) 또는 4 주차(β-YAC 모델)에 시작하였다. 마우스에게 O6-BG(15　mg/kg, IP)를 2 회, 30 분 간격으로 주사하였다. O6-BG의 두번째 주사 1 시간 후, 마우스에게 5　mg/kg BCNU를 주사하였다(IP). 선택의 첫번째 차례 후 2 및 4 주차에, 2 차례 이상을 각각 7.5 및 10　mg/kg의 BCNU 용량으로 수행하였다.
2차 골수 이식: 수용자는 Jackson Laboratory로부터 수득된 6 - 8 주령의 암컷 C57BL/6J 마우스였다. 이식 당일에, 수용자 마우스를 1000 Rad로 조사하였다. 생체내 형질도입된 CD46tg 마우스로부터 골수 세포를 무균상태로 단리하고 계통-고갈된 세포를 상기 기재된 바와 같이 MACS를 사용하여 단리하였다. 조사 6 시간 후 세포를 마우스 당 1x106 개의 세포로 정맥내로 주사하였다. 2차 수용자를 종료점 분석을 위해 이식 후 16 주 동안 유지하였다.
조직 분석: 2.5 μm 두께의 비장 및 간 조직 절편을 4% 포름알데하이드에 적어도 24 시간 고정시키고, 탈수하고 파라핀에 포매하였다. 헤마톡실린-에오신으로 염색을 골수외 혈구형성의 조직학적 평가를 위해 사용하였다. 헤모시데린을 Perl의 프러시안 블루 염색에 의해 조직 절편에서 검출하였다. 간단히 말해서, 조직 절편을 증류수 중 동일한 부피(2%)의 페로시안화칼륨 및 염산의 혼합물로 처리한 다음 뉴트럴 레드로 대조염색하였다.
혈액 분석: 혈액 샘플을 EDTA-코팅된 튜브에 수집하고 분석을 HemaVet 950FS(Drew Scientific, 코네티컷주 워터베리 소재)에서 수행하였다. 말초 혈액 도말을
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(Merck, 독일 다름슈타트 소재)로 각각 5 및 15 분 동안 염색하였다. 망상적혈구를 브릴리언트 크레실 블루로 염색하였다. 혈액 도말에 대한 망상적혈구를 계수한 조사자들은 샘플 그룹 할당에 대해 맹검이었다. 슬라이드에는 동물 번호만이 보였다(동물 당 5 개 슬라이드, 5 개의 무작위 1　cm2 절편).
통계적 분석 : 다중 그룹의 비교를 위해, 다중 비교를 위한 본페로니 사후-테스트와 함께 일원 및 이원 분산 분석(ANOVA)을 이용하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 버전 6.01(GraphPad Software Inc., 캘리포니아주 라호이아 소재)을 사용하여 수행하였다.
결과 . 염기 편집기 및 가이드 RNA의 선택. BE4(Komo 등, Science Advances 3: eaao4774, 2017), AncBE4max(Koblan 등, Nature Biotechnology 36: 843-846, 2018), BE3RA 및 FNLS(Zafra 등, Nature Biotechnology 36: 888-893, 2018)를 포함하는 사이티딘 염기 편집기(CBE)의 다중 버전의 편집 활성을 비교하였다. 염기 편집기(BE)를 보편적인 EF1α 프로모터에 의해 서브클로닝하고 구동시켰다. +58 BCL11A 인핸서 영역에서 GATAA 모티프를 표적화하는 인간 U6 프로모터 하에 가이드 RNA를 발현하는 두번째 플라스미드(Canver 등, Nature 527: 192-197, 2015)를 공동 형질감염에 사용하였다. BE3RA는 293FT 세포에서 더 높은 편집을 나타내었지만(도 131a), AncBE4max 시스템은 절단 검정에 의해 측정된 K562 적혈구 세포에서 가장 높은 활성을 입증하였다(도 131b). 따라서, AncBE4max를 하류 연구에 사용하였다. 아데닌 염기 편집기(ABE)의 경우, David Liu 그룹에 의해 개발된 ABEmax 시스템을 사용하고 AncBE4max에 대한 것과 유사한 접근법을 사용하여 최적화하였다(Koblan 등, Nature Biotechnology 36: 843-846, 2018). 또한 xCas9(3.7)-BE4 및 xCas9(3.7)-ABE(7.10) 편집기를 광범위한 PAM 호환성으로 인해 가이드 서열 스크리닝에 사용하였다(Hu 등, Nature 556: 57-63, 2018).
염기 편집기의 최적의 표적가능한 창은 5' 단부 첫번째 염기를 위치 1로서 계수하는 프로토스페이서의 위치 4-8이다. 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열의 패널을 +58 BCL11A 인핸서에서 GATAA 모티프(sgBCL#1 내지 #6)에 특이적이거나 또는 HBG1/2 프로모터에서 다양한 자연 발행 태아 헤모글로빈의 유전적 지속성(HPFH) 돌연변이(sgHBG#1 내지 #6)를 재생성하도록 설계하였다. 서열 및 이의 특이적 표적 모티프/염기는 표 14에 제시되었다. 가이드 서열을 γ-글로빈 발현을 재활성화하는 효능에 대해 적혈구 전구체 세포주 HUDEP-2 세포(Kurita 등, PloS One 8: e59890, 2013)에서 테스트하였다. 세포를 형질감염 후 4 일차에 적혈구 분화에 넣었다. 모든 12 개의 sgRNA 서열은 CCR5 발현을 표적화하지만 헤모글로빈-관련 유전자는 표적화하지 않는 음성 CBE 대조군과 비교하여 상당한 γ-글로빈 발현을 야기하였다(도 130). sgHBG#2는 분화 후 6 일차에 41% HbF+ 세포를 초래하였다. HBG 프로모터에서 BCL11A 결합 부위를 표적화하는 이전에 기재된 CRISPR 벡터를 양성 대조군으로 사용하고 HbF+ 세포의 84%를 생성하였다(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018). 따라서, sgBCL#1(CBE), sgHBG#1(CBE), sgHBG#2(ABE) 및 sgHBG#4(ABE)를 활성 뿐만 아니라 표적 부위의 다양성을 고려하여 바이러스 벡터 전달을 위해 선택하였다. 음성 대조군 벡터 sgNeg(CBE) 및 sgHBG#1 및 sgBCL#1을 둘 다 함유하는 벡터(Dual, CBE)를 또한 구축하였다.
BE를 발현하는 헬프-의존적 아데노바이러스 벡터(HDAd)의 생성. 다음으로, 목표는 효율적인 생체내 BE 전달을 위한 바이러스 벡터를 생성하는 것이었다. 필요한 조절 요소를 함유하는 8　kb 초과 크기의 염기 편집기로 인해, 하나의 렌티바이러스 벡터(LV) 또는 아데노 연관 벡터(AAV)에 맞추기가 어렵다. 조혈 줄기 세포(HSC)의 효율적인 형질도입을 위해 HDAd5/35++라고 불리는 변형된 섬유를 갖는 HDAd 벡터를 개발하였다(Li 등, Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018). HDAd 벡터는 36　kb 패키징 용량을 수용하여, BE 구성요소를 위한 충분한 공간을 제공할 수 있다. 첫번째 시도에서, BE 효소(CBE의 경우 rAPOBEC1-nCas9-2xUGI 또는 ABE의 경우 2xTadA-nCas9)를 EF1α 프로모터 하에 배치하였다. 인간 U6 프로모터에 의해 구동된 sgRNA를 포함하는 전체 BE 구성요소를 HDAd 벡터 플라스미드 pHCA에 클로닝하였다. FRT 및 트랜스포존 부위에 의해 플랭킹된 MGMT/GFP 카세트를 또한 벡터로 클로닝하여 O6BG/BCNU 처리에 의해 형질도입된 세포의 선택을 용이하게 하였다(도 132a 및 132b). 특히, BE 구성요소를 트랜스포존의 외부에 배치하였다. 이 설계는 i) MGMT/GFP의 통합된 발현을 유지하면서 BE의 일시적 발현을 허용하고; ii) 잠자는 미녀 트랜스포사제를 발현하는 또 다른 벡터(HDAd-SB)와 공동 감염 시 편집 효소의 보다 빠른 분해를 허용한다(벡터 설계의 특정 측면의 추가 논의 및/또는 추가적인 예시를 위해, 실시예 3을 또한 참조한다). 3-리터 스피너 당 수율은 상대적으로 낮았지만(평균 1x1012 개의 바이러스 입자 또는 vp), 4 개의 CBE 벡터를 모두 구제하였다. 이는 뉴클레아제 발현을 조절하는 메커니즘 없이 구제가능하지 않은 HDAd-CRISPR 벡터와 대조적이다(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev 1: 14057, 2015). 결과는 DSB-무함유 BE 시스템이 CRISPR/Cas9보다 HDAd 생산자 세포에 독성이 적을 수 있음을 시사하였다. ABE 벡터의 경우, 바이러스가 재배열된 것으로 보였고 CsCl 구배를 사용한 초원심분리 후 별개의 HDAd 밴드는 관찰되지 않았다. ABE 및 CBE 벡터 사이의 주요 차이는 데아미나제 영역이므로, ABE 벡터에서 2 개의 TadA-32aa 반복부는 원인 요소였을 가능성이 있었다. 따라서, ABE 벡터의 첫번째 버전에 대해 다음 변형이 이루어졌다: i) 2 개의 TadA-32aa 반복부 사이의 서열 반복성은 대안적인 코돈 용법에 의해 추가로 감소되었다(도 132c); ii) PGK 프로모터를 사용하여 BE 효소를 구동하였다. HSC에서 구성하는 동안(Li 등, Cancer Res 80: 549-560, 2020), PGK 프로모터는 116 생산자 세포에서 Ef1α보다 더 낮은 유전자 발현을 구동하여(Qin 등, PloS One 5: e10611, 2010), 잠재적인 TadA-연관 부작용을 제거한다; iii) miR183/218-기반 유전자 조절 시스템을 활용하여 BE 발현을 추가로 제어하였다(Saydaminova 등, Mol Ther Methods Clin Dev 1: 14057, 2015)(도 133a). 최적화된 설계의 이러한 두번째 버전의 작제물은 정상 수율 범위 내에 있는 3.3x1012 vp/스피너의 평균 수율로 2 개의 HDAd-ABE 바이러스를 성공적으로 구제하였다(도 133b).
다음으로 HDAd 벡터를 HUDEP-2 세포에서 조사하였다. 테스트된 5 개의 벡터는 모두 표적 염기 전환을 효율적으로 설치하고 실질적인 γ-글로빈 재활성화로 이어졌다(도 133 및 도 134). 일시적 형질감염에 의한 스크리닝 데이터와 일치하게, HDAd-ABE-sgHBG#2 벡터는 최고 수준의 HbF+ 세포를 유도하였다(MOI 1000 vp/세포에서 71%). 흥미롭게도, sgBCL#1 및 sgHBG#1 단독은 각각 17% 및 39% HbF+ 세포를 매개하였지만, sgBCL#1 및 sgHBG#1을 동시에 발현하는 이중 표적화 벡터는 sgHBG#2의 수준과 비슷한 수준에서 HbF 유도를 생성하였으며(도 133c), 이는 상승 효과를 나타낸다. 음성 대조군 벡터에 대해 유의한 HbF 유도는 측정되지 않았다. HPLC에 의해 측정된 γ-글로빈 단백질 수준은 유세포 분석 데이터와 일치하였다. 인간 β-글로빈에 비해 인간 γ-글로빈의 23%가 sgHBG#2로 형질도입 후 관찰되었으며, 이는 상당한 전환을 입증한다(도 133e 및 133h). MOI 1000에서, 4 개의 sgRNA에 대한 염기 전환 빈도는 25 - 51% 범위 내에 있었다(도 133d 및 도 134a). sgHBG#2의 경우, 위치 5 및 8에서 각각 40% 및 34% A > G 전환이 검출되었다(도 133d). A8에서 G로의 전환은 -113A > G HPFH 돌연변이를 시뮬레이션하였다(표 14)(Martyn 등, Blood 133(8):852-856, 2019). HBG1 및 HBG2 사이에 상당한 편집 차이는 발견되지 않았다. 단일 세포 유래 클론에서, A5 및 A8 부위에서 단일대립유전자성 편집은 HbF-양성 세포의 100%를 부여하였으며(도 133f 및 133g), 이는 HbF 억제를 조절하는 데 있어서 이들 부위의 중요한 역할을 확인하였다. sgHBG#1 및 sgHBG#4로부터 유래된 클론에서 유사한 결과가 제시되었다. sgBCL#1로 형질도입된 클론에서, BCL11A 인핸서의 GATAA 모티프에서 이중대립유전자성 G > A 돌연변이는 15% HbF-발현 세포를 야기하였다(도 134b 및 134c). 종합하여, 이들 데이터는 BCL11A 인핸서 또는 HBG1/2 프로모터에서 중요한 부위에 특이적인 HDAd-BE 벡터가 HbF 발현을 효율적으로 재활성화할 수 있음을 입증한다.
염기 편집기를 사용한 생체내 형질도입 후 β-YAC 마우스에서 γ-글로빈의 재활성화. HDAd5/35++ 벡터를 사용한 HSC의 생체내 형질도입에 의해 단순화된 유전자 요법 접근법이 달성되었다(Richter 등, Blood 128: 2206-2217, 2016). 따라서, 이러한 신규 생체내 전략법으로 염기 편집의 효능을 조사하였다. 완전한 82　kb β-글로빈 유전자좌를 포함하는 248　kb의 인간 DNA를 함유하는 β-YAC 마우스를 사용하였다(Peterson 등, PNAS USA 90: 7593-7597, 1993). 마우스를 HDAd5/35++ 벡터로의 형질도입을 허용하도록 인간 CD46 유전자이식 마우스와 교배하였다. HDAd-ABE-sgHBG#2는 HUDEP-2 세포에서 γ-글로빈 발현을 유도하는 가장 높은 효능을 인해 선택하였다. G-CSF/플레릭사포르로 동원 후, β-YAC/CD46 마우스에게 HDAd-ABE-sgHBG#2 및 HDAd-SB 벡터를 정맥내로 주사하였다. 형질도입 4 주 후, 마우스를 4 차례의 O6BG/BCNU(O6-벤질구아닌/카르무스틴) 처리에 적용하여 통합된 MGMT-GFP 이식유전자를 갖는 전구체를 선택적으로 확장시켰다(도 135a). 선택 후, PBMC에서 GFP 마킹은 60%에 도달하였다(도 135b 및 135c). 특히, 말초 혈액 세포에서 γ-글로빈 발현은 형질도입 전 1%에서 형질도입 후 16 주차에 평균(n = 9) 43%까지 증가하였으며, 이는 상당한 γ-글로빈 재활성화를 입증한다(도 135d 및 135e). 상이한 마우스 사이에 존재하는 큰 변이는 아마도 MGMT의 더 낮은 발현을 초래할 수 있는 MGMT-2A-GFP의 바이시스트론 설계에 의해 유발되고 따라서 생체내 선택 효능에 영향을 미쳤다. γ-글로빈+ 세포는 주로 골수 샘플의 두 혈액에서 적혈구(RBC) 분획(Ter-119+)에 상주하였다(도 135f). 16 주차에 RBC 용해물에서, 인간 β-글로빈 단백질에 비해 γ-글로빈의 최대 21%가 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정되었다(도 135g 및 도 136). γ-글로빈 mRNA 발현은 HPLC 데이터와 일치하였다(도 135h). 16 주차에 총 골수 단핵 세포에서, 통합 벡터 카피 수는 세포 당 최대 2.5 개 카피였다(평균 1.4 개)(도 135I).
HBG1/2 프로모터에서 염기 편집을 분석하였다. HBG1 및 HBG2의 A5 및 A8 부위에서 A > G 전환 빈도는 평균 15-30%였다(도 137a-137c). 염기 편집 빈도는 γ-글로빈 발현 수준과 밀접하게 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(Pearson 검정, R = 0.92, p < 0.001) (도 137d). γ-글로빈 발현이 가장 높은 마우스에서, 82% 표적 염기 전환이 달성되었다(도 137b). 참고로, A5에서의 전환율%은 HBG1 및 HBG2 영역 둘 다의 A8 부위에서보다 약간 더 높은 경향이 있었지만, 통계적 차이는 발견되지 않았다(도 137b). 일부 염기 편집기는 다중 표적이 프로토스페이서에 존재할 때 진행적 편집을 나타내는 것으로 제시되었다. 그러나, A9 부위에서 편집은 발견되지 않았다(도 137a 및 137c). 이는 위치 9가 최적 편집 창 외부에 위치하기 때문이며, 이는 편집 창의 협소함을 입증할 가능성이 있었다.
요약하면, 이들 데이터는 HBG1/2 프로모터에 특이적인 염기 편집기를 사용한 생체내 형질도입 이어서 선택이 β-YAC/CD46 마우스에서 효율적인 표적 염기 전환 및 γ-글로빈 재활성화를 야기함을 입증한다.
생체내 HSC 염기 편집 후 우수한 안전성 프로파일 및 안정된 효능. 16 주차에, 동물을 안락사시키고 조직 샘플을 다중 혈액학 및 조직학 분석에 적용하였다. 백혈구(K/μL), 적혈구(M/μL), Hb(g/dL), MCV(fL), MCHC(g/dL), RDW(%) 및 혈소판(K/μL)을 포함하는 혈액학적 매개변수는 미처리 β-YAC/CD46 마우스의 것과 유사하였다(도 138a 및 138b). 브릴리언트 크레실 블루 염색에 의해 측정된 말초 혈액 내 망상적혈구의 백분율은 처리되지 않은 마우스와 비슷하였다(도 138d). 비장 및 간 절편에서 골수외 적혈구생성의 병소는 관찰되지 않았다. PBMC, 비장 및 골수 단핵 세포에서 세포 조성물은 대조군 마우스와 구별할 수 없는 것으로 입증되었다(도 138c). 게다가, 이전에 보고된 다른 유전자 요법 벡터와 비교하여(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018; Wang 등, J Clin Invest. 129(2): 598-615, 2018; Li 등, Molecular Therapy 27: 2195-2212, 2019), HDAd-ABE-sgHBG#2는 생체내 형질도입/선택 후 체중, 행동 및 외형의 명백한 변화를 유발하지 않았다.
생체내 형질도입이 장기간 재증식 HSPC에서 발생하였음을 입증하기 위해, 16 주차에 수확된 골수 계통 마이너스(Lin-) 세포를 형질도입 후 치명적으로 조사된 C57BL/6J 마우스(인간 CD46 유전자 없음)에 이식하였다. 2차 수용자에서 다중-계통 재구축을 구동하는 이식된 세포의 능력을 16 주의 기간에 걸쳐 평가하였다. PBMC에서 huCD46 발현에 기반한 생착률은 95% 초과였고 안정되게 유지하였다(도 139a). PMBC의 GFP 마킹은 1차 마우스의 것과 비슷하였다(도 139b). γ-글로빈+ RBC의 퍼센트는 평균 40%였고 안정되었다(도 139c).
이러한 관찰과 함께 생체내 HSC 염기 편집은 전반적으로 안전하였음이 입증되었다. 변형된 HSPC는 장기간 지속되었고 안정된 이식유전자 발현으로 2차 수용자 마우스를 재구축할 수 있었다.
최소 유전자간 결실 및 상위-점수 표적외 부위에서 검출가능하지 않은 편집. DSB-의존적 유전자 편집 전략의 균형은 잠재적인 게놈 큰-단편 결실이다(Kosicki 등, Nature Biotechnology 36: 765, 2018). DSB-생성 뉴클레아제에 의해 HBG1/2 프로모터를 표적화하는 경우, 이 부작용은 HBG1 및 HBG2 영역 사이의 높은 유사성으로 인해 더 유의하게 될 수 있다. 2 개 영역 중 하나에 특이적인 가이드 서열은 또한 다른 하나를 표적화할 수 있다. CRISPR/Cas9를 사용하여 HBG1/2 프로모터에서 BCL11A 결합 부위를 표적화하는 것은 4.9　kb 유전자간 결실을 야기함이 보고되었다(Traxler 등, Nature Medicine 22: 987-990, 2016; Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018). 결과적으로, 전체 HBG2 유전자가 제거된다. 따라서, 반-정량적 PCR에 의한 게놈 결실을 조사하였다(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018). 2 개의 표적화 부위에 플랭킹하는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 9.9　kb 게놈 분절을 증폭시켰다. 4.9　kb 결실의 존재는 추가로 단축된 5.0　kb PCR 앰플리콘을 생성할 것이다. 결실 백분율은 표준 곡선을 확립함으로써 5.0　kb 대 9.9　kb 앰플리콘의 비와 양의 상관관계가 있었다(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018의 도 7c 참조). 염기 편집기-처리된 마우스에서 평균 4.9　kb 결실은 1% 미만이었던 것으로 밝혀졌다(도 140). 일부 마우스에서, 거의 검출할 수 없었다. 이는 HDAd-HBG-CRISPR 벡터를 사용한 형질도입으로부터 유래된 것보다 상당히 더 낮았다(Li 등, Blood 131: 2915-2928, 2018).
다음으로, 표적외 분석을 수행하여 시스템의 충실도를 조사하였다. 인 실리코 분석은 인간 및 마우스 게놈 둘 다에서 가이드 서열에 대한 2 개 이하의 염기 쌍(bp) 불일치가 있는 잠재적인 표적외 부위가 없음을 나타내었다. 인간 및 마우스에서는 3 bp 불일치가 있는 각각 10 및 2 개의 잠재적인 표적외가 있었다. 이러한 예측된 표적에서 표적외 편집의 가능성은 모든 부위가 프로토스페이서의 PAM-근위 절반에서 적어도 1 bp 불일치를 보유하기 때문에 낮았던 것으로 추측되었다. 4　bp 불일치로 인해, 인간 및 마우스에서 각각 79 및 74 개의 잠재적 표적이 반환되었다. 연구를 마우스에서 수행한 이후, 10 개의 상위-점수의 게놈 부위(2 개는 3　bp 불일치; 7 개는 4　bp 불일치)를 표적내 염기 설치가 가장 높은 마우스로부터 증폭시키고 이어서 Sanger 서열분석하였다. 이들 부위 중 어느 것도 검출가능한 편집을 나타내지 않았다.
종합하면, 이들 데이터는 최소 유전자간 결실 및 생체내 염기 편집 시스템의 높은 충실도에 대한 증거를 제공하였다.
실시예 11. 염기 편집기 구현예에 관한 추가 설명
도 141은 혈액학 분석(도 141a) 및 골수 MNC에서 세포 비교(도 141b)를 포함하는 염기 편집기의 안전성 프로파일을 제시한다. 염기 편집기 BE4-sgBCL11AE1의 활성으로 생성될 것으로 예상되는 편집의 예는 도 142에 제시되어 있다. 도 143은 C에서 T로(상단 이미지) 또는 G에서 A로(하단 이미지) 염기 변환을 수행할 때 염기 편집 효율을 최대화하기 위한 최적의 프로토스페이서 서열 배열을 나타낸다. 도 144는 표적 C가 프로토스페이서의 위치 4 내지 8에 있을 때 C에서 T로의 편집을 위한 벡터를 나타낸다. 도 145는 단일 인접한 작제물을 나타내지만 제시의 용이성만을 위해 2 개의 섹션으로 나눠진 바이러스 gDNA(HBG2-miR, 아데닌 편집기)의 다이어그램을 나타낸다. 도 146은 TadA 및 TadA*의 서열을 나타낸다. Sanger 서열분석을 수행하여 서열의 염기 편집을 확인하였다(도 147). 도 148은 HDAd5/35++_BE4-sgBCL11Ae1-FI-mgmtGFP(041318-1) 바이러스에 의한 염기 편집을 나타내고, 도 149는 표시된 MOI에서 γ-글로빈+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 150은 염기 편집에 의한 HbF의 재활성화를 위한 사이티딘 염기 편집기 및 아데닌 염기 편집기를 나타낸다. 도 151은 예시적인 염기 편집기 및 염기 편집기의 다양한 MOI에서 퍼센트 HbF+ 세포를 나타낸다. 도 152는 HUDEP-2 세포에서 2차 시험의 % HbF+를 나타낸다. 도 153은 단일 세포 유래 클론의 결과를 나타낸다. 도 154a-154s는 개별 단일 세포 유래 클론을 나타내는 데이터를 제시한다. 또한 염기 편집기를 293FT 세포에서 테스트하였다(도 155). 도 156a-156d는 sanger 서열분석 결과를 나타낸다. 또한 염기 편집기를 HUDEP-2 세포에서 테스트하였다(도 157). γ-글로빈의 발현은 도 158에 제시되어 있다. 도 159a-159d는 이용가능한 경우 sanger 서열분석 결과를 나타낸다. 작제물은 도 160에 제시된 바와 같이 Maxi 제조를 위해 선택하였다.
예를 들어, HDAd-AAVS1-CRISPR 또는 HDAd-글로빈-BE4 염기 편집기로 편집된 huCD45+ 세포의 생착은 도 161에 제시되어 있다.
HUDEP-2 세포의 일시적 형질감염(T7EI에 의한 절단)은 도 162에 제시되어 있다.
HbF에 대한 염기 편집 작제물의 비제한적인 예는 (1) pHCA-ABEmax-sgHBG2-miR-FI-mgmtGFP; (2) pHCA-ABEmax-sgHBG4-miR-FI-mgmtGFP; 또는 (3) pHCA-ABEmax-Dual-Skip-miR-FI-mgmtGFP를 포함할 수 있다.
염기 편집기의 적어도 하나의 적용은 이중 염기 편집 벡터를 포함하며, 이 적용은 도 163에 예시되어 있다.
단일 세포 유래 클론에서, 단일대립유전자성 또는 이중대립유전자성 표적 염기 전환은 HbF-양성 세포의 100%를 부여하였다. 혼합된 HUDEP-2 세포의 HBG1/2 프로모터에서 60% -113 A에서 G로의 HPFH 돌연변이를 ABE 벡터 HDAd-ABE-HBG#2를 사용하여 관찰하였다(도 135 참조). 이 벡터는 특정 추가 동물 연구를 위해 선택되었다. 동물 연구를 248　kb의 인간 β-글로빈 유전자좌(β-YAC 마우스)를 보유하고 따라서 글로빈 전환을 정확하게 반영하는 마우스에서 수행하였다(예를 들어, 도 137 참조). FRT 및 트랜스포존 부위에 의해 플랭킹된 EF1α-mgmtP140K 발현 카세트는 형질도입된 세포의 생체내 선택을 허용하기 위해 벡터에 포함되었다(예를 들어, 도 136 참조). HDAd-ABE-HBG#2 + HDAd-SB를 사용한 생체내 형질도입 및 저용량의 O6BG/BCNU로의 선택 후, HbF-양성 세포의 평균 35%가 말초 적혈구에서 측정되었다(도 138). 8 마리 마우스 중 1 마리에서, 거의 완전한 -113 A에서 G로의 전환 및 HbF-양성 세포의 90%가 달성되었다. 혈액 세포 계수의 변이는 발견되지 않았다(도 141). 골수 샘플의 세포 조성물은 형질도입되지 않은 마우스의 것과 비슷하였으며, 이는 우수한 안전성 프로파일을 입증한다(도 141). 골수 계통 마이너스 세포를 형질도입 후 14 주차에 1차 마우스로부터 단리하고 치명적으로 조사된 C57BL/6J 마우스에 주입하였다. HbF-양성 세포의 백분율은 2차 수용자에서 16 주에 걸쳐 유지되었으며 이는 게놈 편집이 장기간 재증식 마우스 HSC에서 발생하였음을 나타낸다. 이러한 관찰은 생체내에서 HDAd5/35++ 벡터에 의해 전달된 염기 편집기가 예를 들어, 혈색소병증의 치료를 위해 정확한 게놈 조작을 위한 전략임을 입증한다.
VII. 마무리 단락
본원에 개시되고 참조된 서열의 변이체가 또한 포함된다. 아미노산 잔기가 생물학적 활성을 제거하지 않으면서 치환, 삽입, 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은 DNASTAR™(위스콘신주 매디슨 소재) 소프트웨어와 같이 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾을 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전 또는 비하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 수반한다.
펩티드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 알려져 있고 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않으면서 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않음을 인식한다(예를 들어, Watson 등, Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 참조). 자연 발생 아미노산은 일반적으로 다음과 같은 보존적 치환 패밀리로 나눠진다: 그룹 1: 알라닌(Ala), 글리신(Gly), 세린(Ser), 및 트레오닌(Thr); 그룹 2: (산성): 아스파르트산(Asp), 및 글루탐산(Glu); 그룹 3: (산성; 또한 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이의 아미드로 분류됨): 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), Asp, 및 Glu; 그룹 4: Gln 및 Asn; 그룹 5: (염기성; 또한 극성, 양으로 하전된 잔기로 분류됨): 아르기닌(Arg), 리신(Lys), 및 히스티딘(His); 그룹 6 (큰 지방족, 비극성 잔기): 이소류신(Ile), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 발린(Val) 및 시스테인(Cys); 그룹 7(비하전된 극성): 티로신(Tyr), Gly, Asn, Gln, Cys, Ser, 및 Thr; 그룹 8(큰 방향족 잔기): 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 및 Tyr; 그룹 9(비-극성): 프롤린(Pro), Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Met, 및 Trp; 그룹 11(지방족): Gly, Ala, Val, Leu, 및 Ile; 그룹 10 (작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기): Ala, Ser, Thr, Pro, 및 Gly; 및 그룹 12(황-함유): Met 및 Cys. 추가적인 정보는 Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company에서 찾을 수 있다.
이러한 변화를 만들기 위해, 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157(1), 105-32, 1982). 각 아미노산은 소수성 및 전하 특성에 기반하여 소수성 지수가 할당되었다(Kyte and Doolittle, 1982). 이들 값은 다음과 같다: Ile(+4.5); Val(+4.2); Leu(+3.8); Phe(+2.8); Cys(+2.5); Met(+1.9); Ala(+1.8); Gly(-0.4); Thr(-0.7); Ser(-0.8); Trp(-0.9); Tyr(-1.3); Pro(-1.6); His(-3.2); 글루타메이트(-3.5); Gln(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); Asn(-3.5); Lys(-3.9); 및 Arg(-4.5).
특정 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래하며, 즉, 여전히 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있음이 당업계에 알려져 있다. 이러한 변화를 만드는 데 이어서, 소수성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내의 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내의 것이 더욱 더 특히 바람직하다. 또한 유사 아미노산의 치환이 친수성에 기반하여 효과적으로 이루어질 수 있음이 당업계에서 이해된다.
미국 특허 번호 제4,554,101호에 상세히 기재된 바와 같이, 다음 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: Arg(+3.0); Lys(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); Ser(+0.3); Asn(+0.2); Gln(+0.2); Gly(0); Thr(-0.4); Pro(-0.5±1); Ala(-0.5); His(-0.5); Cys(-1.0); Met(-1.3); Val(-1.5); Leu(-1.8); Ile(-1.8); Tyr(-2.3); Phe(-2.5); Trp(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되고 여전히 생물학적으로 동등한 단백질, 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있음이 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내의 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내의 것이 더욱더 특히 바람직하다.
상기 요약된 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기반할 수 있다.
다른 곳에 나타낸 바와 같이, 유전자 서열의 변이체는 코돈 최적화된 변이체, 서열 다형성, 스플라이스 변이체, 및/또는 암호화된 생성물의 기능에 통계적으로 유의한 정도로 영향을 미치지 않는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 단백질, 핵산, 및 유전자 서열의 변이체는 또한 본원에 개시된 단백질, 핵산, 또는 유전자 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 80% 서열 동일성, 85% 서열, 90% 서열 동일성, 95% 서열 동일성, 96% 서열 동일성, 97% 서열 동일성, 98% 서열 동일성, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"% 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같은 2 개 이상의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된 바와 같은 단백질, 핵산, 또는 유전자 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성"(종종 "유사성"으로 언급됨)은 다음 문헌에 기재된 것들을 포함하여 알려진 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992). 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 테스트된 서열 사이의 최고 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 의해 성문화된다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 LASERGENE 생물정보학 컴퓨터 묶음의 Megalign 프로그램(DNASTAR, Inc., 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 또한 디폴트 매개변수(갭 패널티=10, 갭 길이 패널티=10)에 따른 Clustal 정렬 방법(Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989)을 사용하여 수행될 수 있다. 관련 프로그램은 또한 GCG 프로그램 묶음(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group(GCG), 위스콘신주 매디슨 소재); BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul, 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); DNASTAR(DNASTAR, Inc., 위스콘신주 매디슨 소재); 및 Smith-Waterman 알고리즘을 포함하는 FASTA 프로그램(Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y.을 포함한다. 본 개시내용의 맥락 내에서 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "디폴트 값"에 기반함이 이해될 것이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "디폴트 값"은 처음에 초기화될 때 소프트웨어와 함께 원래 로드되는 임의의 값 또는 매개변수의 세트를 의미할 것이다.
변이체는 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 본원에 개시된 서열에 혼성화하고 참조 서열과 동일한 기능을 제공하는 핵산 분자를 포함한다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5XSSC(750 mM NaCl, 75 mM 트리나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 7.6), 5XDenhardt의 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 μg/ml 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 42 ℃에서 밤새 배양한 후, 50℃에서 0.1XSSC에서 충전제를 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 및 신호 검출의 엄격성에서의 변화는 주로 포름아미드 농도(포름아미드의 백분율이 낮을수록 낮은 엄격도를 초래함); 염 농도, 또는 온도의 조작을 통해 달성된다. 예를 들어, 적당히 높은 엄격도 조건은 6XSSPE(20XSSPE=3M NaCl; 0.2　M NaH2PO4; 0.02　M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100 μg/ml 연어 정자 차단 DNA를 포함하는 용액에서 37℃에서 밤새 배양한 후; 1XSSPE, 0.1% SDS로 50 ℃에서 세척하는 것을 포함한다. 또한, 심지어 더 낮은 엄격도를 달성하기 위해, 엄격한 혼성화 후 수행되는 세척은 더 높은 염 농도(예를 들어 5XSSC)에서 수행될 수 있다. 상기 조건에서의 변이는 혼성화 실험에서 배경을 억제하는 데 사용되는 대체 차단 시약의 포함 및/또는 치환을 통해 달성될 수 있다. 전형적인 차단 시약은 Denhardt의 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA, 및 상업적으로 이용가능한 독점 제형을 포함한다. 특이적 차단 시약의 포함은 호환성 문제로 인해, 상기 기재된 혼성화 조건의 변형을 필요로 할 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는 (예를 들어, CAR 결합 도메인 또는 나노입자 선택된 세포 표적화 리간드의) 결합 도메인과 이의 동족 결합 분자를 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M 단위의 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 회합하지만, 관련 환경 샘플에서 임의의 다른 분자 또는 구성요소와 유의하게 회합하지 않는 것을 지칭한다. "특이적으로 결합한다"는 또한 본원에서 "결합한다"로 지칭된다. 결합 도메인은 "높은 친화도" 또는 "낮은 친화도"로 분류될 수 있다. 특정 구현예에서, "높은 친화도" 결합 도메인은 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109　M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 또는 적어도 1013 M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. 특정 구현예에서, "낮은 친화도" 결합 도메인은 최대 107 M-1, 최대 106　M-1, 최대 105　M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. 대안적으로, 친화도는 M 단위(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M)의 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로서 정의될 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 도메인은 야생형(또는 모체) 결합 도메인보다 동족 결합 분자에 더 강한 결합을 갖는 선택된 또는 조작된 결합 도메인을 지칭하는 "향상된 친화도"를 가질 수 있다. 예를 들어, 향상된 친화도는 참조 결합 도메인보다 더 높은 동족 결합 분자에 대한 Ka(평형 결합 상수) 또는 참조 결합 도메인보다 낮은 동족 결합 분자에 대한 Kd(해리 상수), 또는 참조 결합 도메인보다 낮은 동족 결합 분자에 대한 오프레이트(Koff) 때문일 수 있다. 특정 동족 결합 분자에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 검출할 뿐만 아니라 결합 친화성을 결정하기 위해, 웨스턴 블롯, ELISA, 및 BIACORE® 분석과 같은 다양한 검정이 알려져 있다(또한, 예를 들어, Scatchard, 등, 1949, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; 및 US 5,283,173, US 5,468,614, 또는 등가물 참조).
달리 표시되지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 이용할 수 있다. 이들 방법은 다음 공개물에 기재되어 있다. 예를 들어, Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989); F. M. Ausubel, 등, eds., Current Protocols in Molecular Biology, (1987); the series Methods IN Enzymology (Academic Press, Inc.); M. MacPherson, 등, PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); MacPherson 등, eds. PCR 2: Practical Approach, (1995); Harlow and Lane, eds. Antibodies, A Laboratory Manual, (1988); 및 R. I. Freshney, ed. Animal Cell Culture (1987) 참조.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 개시된 각 구현예는 특정 언급된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 따라서, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 "포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는"을 재인용하는 것으로 해석되어야 한다. 전환 용어 "포함하다" 또는 "포함한다"는 명시되지 않은 요소, 단계, 성분, 또는 구성요소를 포함하나 이에 제한되지 않고, 심지어 다량으로 포함하는 것을 허용함을 의미한다. 전환 어구 "로 이루어지는"은 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 제외한다. 전환 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 명시된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소에 대한 구현예의 범위 및 구현예에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 제한한다. 실질적 효과는 본 개시내용에 기재된 관련 실험 방법에 따라 청구된 효과를 수득하는 능력에서 통계적으로 유의한 감소를 야기할 것이다.
달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 표시되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 및 청구범위의 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 자릿수에 비추어 그리고 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다. 추가로 명확성이 요구되는 경우, 용어 "약" 및 "대략"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 언급된 수치 값 또는 범위와 함께 사용되는 경우 당업자에 의해 합리적으로 귀속되는 의미를 가지며, 즉, 언급된 값의 ±20%; 언급된 값의 ±19%; 언급된 값의 ±18%; 언급된 값의 ±17%; 언급된 값의 ±16%; 언급된 값의 ±15%; 언급된 값의 ±14%; 언급된 값의 ±13%; 언급된 값의 ±12%; 언급된 값의 ±11%; 언급된 값의 ±10%; 언급된 값의 ±9%; 언급된 값의 ±8%; 언급된 값의 ±7%; 언급된 값의 ±6%; 언급된 값의 ±5%; 언급된 값의 ±4%; 언급된 값의 ±3%; 언급된 값의 ±2%; 또는 언급된 값의 ±1%의 범위 내에서 언급된 값 또는 범위보다 다소 많거나 또는 다소 적은 것을 나타낸다.
본 발명의 넓은 의미를 제시하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차에서 반드시 비롯되는 특정 오류를 함유한다.
본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약칭 방법을 제공하는 것으로 의도된다. 본원에 달리 나타낸 바와 같이, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명맥하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것으로 의도되고 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 본원에서 발견되는 그룹의 다른 구성원 또는 다른 요소와 조합하여 언급되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 또는 그룹으로부터 삭제될 수 있는 것으로 예상된다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생할 때, 명세서는 변형된 그룹을 함유하며 따라서 첨부된 청구범위에 사용되는 모든 Markush 그룹의 서면 설명을 충족하는 것으로 간주된다.
본 발명의 특정 구현예는 본 발명을 수행하기 위해 발명자들에게 알려진 최고의 모드를 포함하여 본원에 기재된다. 물론, 이러한 기재된 구현예에 대한 변이는 전술된 설명을 읽을 때 당업자에게 명백하게 될 것이다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변이를 적절하게 이용하기를 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것보다 달리 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 여기에 첨부된 청구범위에서 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본원에 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변이에서 상기 기재된 요소의 임의의 조합은 본 발명에 포함된다.
또한, 본 명세서에 걸쳐 특허, 인쇄된 간행물, 저널 기사 및 다른 서면 텍스트에 대한 수많은 참조가 이루어졌다(본원에서 참조된 자료). 참조된 자료 각각은 개별적으로 참조된 교시를 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 참조된 자료가 시간 경과에 따라 개정되는 경우(예를 들어, 서열 데이터베이스 항목 등), 해당 참조의 내용은 참조가 본 출원에 대한 우선권 주장에서 출원 시 포함되는 날짜를 기준으로 포함된다.
마지막으로, 본원에 개시된 본 발명의 구현예는 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 제한되지 않는 예로서, 본 발명의 대안적인 구성이 본원의 교시에 따라 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제시되고 기재된 것으로 정확하게 제한되지 않는다.
본원에 제시되는 세부사항은 예로서 그리고 단지 본 발명의 바람직한 구현예의 예시적인 논의를 위한 목적이며 본 발명의 다양한 구현예의 원리 및 개념적 측면의 가장 유용하고 용이하게 이해되는 설명인 것으로 여겨지는 것을 제공하기 위해 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것보다 상세하게 본 발명의 구조적 세부사항을 나타내려는 시도 없이, 설명은 본 발명의 여러 형태가 어떻게 실제로 구현될 수 있는지를 당업자에게 명백하게 하는 도면 및/또는 실시예와 함께 기재되었다.
본 개시내용에 사용되는 정의 및 설명은 실시예에서 달리 명확하고 모호하지 않게 변형되거나 또는 의미의 적용이 임의의 구축을 무의미하거나 또는 본질적으로 무의미하게 만드는 경우 외에는 임의의 미래 구축에서 제어되는 것을 의미하고 의도된다. 용어의 구축이 무의미하거나 또는 본질적으로 무의미하게 만드는 경우에, 정의는 Webster's Dictionary, 3rd Edition 또는 Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Eds. Attwood T 등, Oxford University Press, Oxford, 2006)와 같이 당업자에게 알려진 사전에서 취해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center University of Washington <120> RECOMBINANT AD35 VECTORS AND RELATED GENE THERAPY IMPROVEMENTS <130> F053-0107PCT/19-132-WO-PCT <150> US 62/869,907 <151> 2019-07-02 <150> US 62/935,507 <151> 2019-11-14 <150> US 63/009,385 <151> 2020-04-13 <160> 325 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 end vector sequence, Sleeping Beauty IR/DR sequence, integration junction (chr15, 6805206) <400> 1 ccctgggatt ccccaaggca ggggcgagtc cttttgtatg aattactcaa atcgataact 60 agaaacttaa ttaacaacga gatcttataa tttgcatact tctgcctgct ggggactttc 120 cacaccctag ctgacacaag aatttgaaat acatccacag gtacacctcc aattgactca 180 aatgatgtca attagtctat cataatcttc taaagccatg acatcatttt aactggaatt 240 ttccaagctg tttaaaggca cagtcaactt agtgtatgta aacttctgac ccactggaat 300 tgtgatacag tgaattataa gtgaaataat ctgtctgtaa acaattgttg gaaaaatgac 360 ttgtgtcatg cacaaagtag atgtcctaac tgacttgcca aaactattgt ttgttaacaa 420 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Artificial Sequence <220> <223> LCR-F8 (Ad5, Sleeping beauty IR, HS4 to HS1, beta promoter, ET3, mgmt, EF1a promoter, and Ad5) <400> 64 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt gattcggccg aaggattaca tgagcttaga aatgtaatta 480 gcatagtgtg tggcatagtg tagataccaa ataaatatga tctctccttc tactcttgaa 540 aatgcaaaca cattcttggt ggtcctaaaa tagcctgtaa catggtttac tcagcagcat 600 ttgctattca aggcagatct gcctttagtc attggctgcg ctcctgaaca gctgtgtgaa 660 aggctaactt ttgtaaacca aatcaaaata aaatgcagca aaaatttgtc actgaaagga 720 aatcctcagt atatcctttt atgaaatgaa agatccctca tccaaactta acttttttaa 780 aagtgcgcat ttggagatat agccctttct tatgaatcct aattcaattt tggccataaa 840 cacacgttga tgttccccac cccaaagcac atagcaacaa gagtaggttc tatattgaaa 900 ataatgacaa tttaaaaaca tgtacttatt tcactgtatg tggacagtgt ctatgattgc 960 atcatgaagt gtcatataac catgtacgtg tacatgagag agagatagag agagaagtgg 1020 tagggtggtg gtggtagagg ggatggcgat agtaatcatg gtaatggtag aggtgatgga 1080 ggtggtaatg acggaggtaa gggtggtagt gatgatggtg gtggtggtaa tggtggtgga 1140 tgtggtggtg gcaattggga tggtgggatg gtggtagcca tggtgatggt ggtaatggtg 1200 ttgatttaaa gggtggtggt agtgaaggtg agggtagtgg tggtggaggt ggtggtgctg 1260 gtagcaatag tgatggtggt gatggtgttg atgagggtgt tgggatcagg gtgagttccc 1320 acagtatatt tcattcttgt tgtaccactc tgtcaacagc accactgact gggacagagg 1380 aagaaggcac actctgaatg tgttattaac agaaacctca aaacagtctg tctccttgta 1440 gtcattcaaa attatctttt tcttacctgg aaaactgaaa ctgaattacc gggaaaaaca 1500 caggagattt ttgtttgtta atatgctgcc aataaagtaa ttttatgtca aatttaacta 1560 caggaaaggg caaggcattt tctaagttcc ttagatgtca tgtggctaaa aaaaacaaaa 1620 ggatggacag cagttagata ctgtacactt agctgtttga agccatatat tcagaaagca 1680 gatgttggga gttggtgttt gaggactgat ttcctggagg tattttatat aggccaagtt 1740 cattgttcta aactctaagg gcttgacttg agggaggaaa agaggcaaga acatgtttag 1800 ttttgctgac agcatcacat gggcagccct aaggctagac aactttaggg cctgaagctt 1860 attctaggaa agaagcacct acagagtggc actgggctcc cctccactat agagatgaag 1920 tcatatgaca gtaaagggca ggcagggctg cctagggggc ccattgaaat tgcggccgca 1980 aataatgggc ccggagcaag agagagggag gcaatgacag cagagacatg cctgcgcctt 2040 gggtttgagt gcccagtggt caaatccact tccctgtggc tgatgcttgc ctttctaact 2100 ttggaattta ggggttggag atctggtgag aaggtaggag ggagatgagg aggagaaggg 2160 aaaggcagga aggaagggga gggaaaggaa aagcaaaagg ggaggaggaa ggtttccaac 2220 aaattattct atatcaactg cggaaatcaa aatttgttgc ccaaatctta gaagctcatg 2280 tccctcctcc ccagaagtct ggaatgcagc actccagggg tagcttataa cccaaatatc 2340 tatctgtaaa aagagaaaca ttgggctttc gagctgtgga ttctcagtaa aagcaagagg 2400 cctcagccta cacaggccag cccagagttt gaggaacccc aggcccacac ccacagggct 2460 ggcccctggg tctgcatact ccctagaaat gtgcacactt ctgagcctca actctgtcct 2520 ggagtctaac agcatccctc tccttcctgg ggcagttcca cctccagaaa cctgttacct 2580 tgggccttat gtcaaggaaa ctgtgggaaa gagctaggca ggaatgcaga tgaggccagc 2640 atgggctcct aaaagtttag aaataggcag tgtcatgctc ccaggtgcct gcataaacca 2700 gctgaaaaat ggagctcccc tcaccagcac tctcccttca aacagactgt gatttgcagg 2760 tcactggttt accaagccag gctacccagg caggacccag atgccaagcc cagtggtgtc 2820 ctgcaagctg agcagtgctc agttcttgca aaaaaaggtc tgtgtgaagg caaggcctct 2880 gcctggcttc tcaccccagt tgggtgtctg gaacaggaag gagcccttac tgcagaaaaa 2940 ggaggaggga gcaaagggag cgaacagctg cgtgctccat ggggaggatc cccaaagtag 3000 aaaggcgcat acacactgca gcccttgacc cagaatgctc acagctacat tacagattca 3060 ggtctcctca gtgtagtggg gctgctgatg agactgtggc atcctcaggg gtcaggacac 3120 acattttcca tcactcttct gatggcaaaa aacctctgag ccaatgccaa cctctgatca 3180 ttaaaaaaaa gtgctcacag cagtgtgtgg tttaggatca tgccctgtgt ggtttggaac 3240 acgtgcacaa ccacaccttg ttcatcacca 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accctcacca gtataaagaa ctctggccta 29940 caagtcagat gacctgagtt ttaatctcag ctttgccatt agccgtgtga acttgagaaa 30000 gtccctttcc tttttacatc tattgggatg atcatgcatt ttttgtcctt tattctgtta 30060 atatagtgtg ttacattgat tgcttttcat agactgaacc agccttgtat tccagggata 30120 aatctcactt ggtcatggtg tataatcctt tatacaaatg ttgctgggtt gagtttgcta 30180 gtattttgtt gaagattttt atgtcttgat tcataaggaa tattggtgta ccttcccctt 30240 ttatggccac agtttcccta caatgatgta gtcgaactag acaacctcca atatctttca 30300 gtattcatgt cctctgattc tgtgaaacta agaaaattaa gaaatagtga ttcataggca 30360 caaggcaggc aaaacttaga ctccttgtag aataattagg aagccaaata ttcagtgtgc 30420 ttatttctca aataacctta gtttctccag tctgccccaa ctccgaggcc tgaatatctc 30480 tagatgctta tgatggcaac taaagcctaa aagctaattc attttaaagt tcttccaaat 30540 gcatagggtt ttatttttcc agacctgggt tcagatgggg aatttgacaa acaatggaaa 30600 gggggaaaaa caacaatcta aacactgagt gacaaagtaa caaagaaata gtctagctat 30660 cagccagtca agccagcctt ggctttgcta tccaaagtag tcagtctaat tctaccacca 30720 gtttctgttc ctgtagctgt 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20 25 30 <210> 180 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pol 325-355 (RT 158-188) <400> 180 Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys 1 5 10 15 Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr 20 25 30 <210> 181 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 linker <400> 181 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 182 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 linker <400> 182 Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Residues (GGGGS) can be repeated n times, wherein n is an integer including, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or more <400> 183 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 184 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> (EAAAK) can be repeated n times, wherein n is an integer including 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or more <400> 184 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 185 <211> 21531 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 185 gatctctatc ccctcctgtt ttctctacgt tatttatatg ggtatcatca ccatcctgga 60 caacatcagg acagatatcc ctcaccaagc caatgttcct ctctatgttg gctcaaatgt 120 ccttgaactt tcctttcacc accctttcca cagtcaaaag gatattgtag tttaatgcct 180 cagagttcag cttttaagct tctgacaaat tattcttcct ctttaggttc tcctttatgg 240 aatcttctgt actgatggcc atgtccttta actactatgt agatatctgc tactacctgt 300 attatgcctc tacctttatt agcagagtta tctgtactgt tggcatgaca atcatttgtt 360 aatatgactt gcctttcctt tttctgctat tcttgatcaa atggctcctc tttcttgctc 420 ctctcatttc tcctgccttc acttggacgt gcttcacgta gtctgtgctt atgactggat 480 taaaaattga tatggactta tcctaatgtt gttcgtcata atatgggttt tatggtccat 540 tattatttcc tatgcattga tctggagaag gcttcaatcc ttttactctt tgtggaaaat 600 atctgtaaac cttctggttc actctgctat agcaatttca gtttaggcta gtaagcatga 660 ggatgcctcc ttctctgatt tttcccacag tctgttggtc acagaataac ctgagtgatt 720 actgatgaaa gagtgagaat gttattgata gtcacaatga caaaaaacaa acaactacag 780 tcaaaatgtt tctcttttta ttagtggatt atatttcctg acctatatct ggcaggactc 840 tttagagagg tagctgaagc tgctgttatg accactagag ggaagaagat acctgtggag 900 ctaatggtcc aagatggtgg agccccaagc aaggaagttg ttaaggagcc cttttgattg 960 aaggtgggtg cccccacctt acagggacag gacatctgga tactcctccc agtttctcca 1020 gtttcccttt ttcctaatat atctcctgat aaaatgtcta tactcacttc cccatttcta 1080 ataataaagc aaaggctagt tagtaagaca tcaccttgca ttttgaaaat gccatagact 1140 ttcaaaatta tttcatacat cggtctttct ttatttcaag agtccagaaa tggcaacatt 1200 acctttgatt caatgtaatg gaaagagctc tttcaagaga cagagaaaag aataatttaa 1260 tttctttccc cacacctcct tccctgtctc ttaccctatc ttccttcctt ctaccctccc 1320 catttctctc tctcatttct cagaagtata ttttgaaagg attcatagca gacagctaag 1380 gctggttttt tctaagtgaa gaagtgatat tgagaaggta gggttgcatg agccctttca 1440 gttttttagt ttatatacat ctgtattgtt agaatgtttt ataatataaa taaaattatt 1500 tctcagttat atactagcta tgtaacctgt ggatatttcc ttaagtatta caagctatac 1560 ttaactcact tggaaaactc aaataaatac ctgcttcata gttattaata aggattaagt 1620 gagataatgc ccataagatt cctattaata acagataaat acatacacac acacacacat 1680 tgaaaggatt cttactttgt gctaggaact ataataagtt cattgatgca ttatatcatt 1740 aagttctaat ttcaacacta gaaggcaggt attatctaaa tttcatactg gatacctcca 1800 aactcataaa gataattaaa ttgccttttg tcatatattt attcaaaagg gtaaactcaa 1860 actatggctt gtctaatttt atatatcacc ctactgaaca tgaccctatt gtgatatttt 1920 ataaaattat tctcaagtta ttatgaggat gttgaaagac agagaggatg gggtgctatg 1980 ccccaaatca gcctcacaat taagctaagc agctaagagt cttgcagggt agtgtaggga 2040 ccacagggtt aagggggcag tagaattata ctcccacttt agtttcattt caaacaatcc 2100 atacacacac agccctgagc acttacaaat tatactacgc tctatacttt ttgtttaaat 2160 gtataaataa gtggatgaaa gaatagatag atagatagac agatagatga tagatagaat 2220 aaatgcttgc cttcatagct gtctccctac cttgttcaaa atgttcctgt ccagaccaaa 2280 gtaccttgcc ttcacttaag taatcaattc ctaggttata ttctgatgtc aaaggaagtc 2340 aaaagatgtg aaaaacaatt tctgacccac aactcatgct ttgtagatga ctagatcaaa 2400 aaatttcagc catatcttaa cagtgagtga acaggaaatc tcctcttttc cctacatctg 2460 agatcccagc ttctaagacc ttcaattctc actcttgatg caacagacct tggaagcata 2520 caggagagct gaacttggtc aacaaaggag aaaagtttgt tggcctccaa aggcacagct 2580 caaacttttc aagccttctc taatcttaaa ggtaaacaag ggtctcattt ctttgagaac 2640 ttcagggaaa atagacaagg acttgcctgg tgcttttggt aggggagctt gcactttccc 2700 cctttctgga ggaaatattt atccccaggt agttcccttt ttgcaccagt ggttctttga 2760 agagacttcc acctgggaac agttaaacag caactacagg gccttgaact gcacactttc 2820 agtccggtcc tcacagttga aaagacctaa gcttgtgcct gatttaagcc tttttggtca 2880 taaaacattg aattctaatc tccctctcaa ccctacagtc acccatttgg tatattaaag 2940 atgtgttgtc tactgtctag tatccctcaa gtagtgtcag gaattagtca tttaaatagt 3000 ctgcaagcca ggagtggtgg ctcatgtctg taattccagc acttgagagg tagaagtggg 3060 aggactgctt gagctcaaga gtttgatatt atcctggaca acatagcaag acctcgtctc 3120 tacttaaaaa aaaaaaaaaa attagccagg catgtgatgt acacctgtag tcccagctac 3180 tcaggaggcc gaaatgggag gatcccttga gctcaggagg tcaaggctgc agtgagacat 3240 gatcttgcca ctgcactcca gcctggacag cagagtgaaa ccttgcctca cgaaacagaa 3300 tacaaaaaca aacaaacaaa aaactgctcc gcaatgcgct tccttgatgc tctaccacat 3360 aggtctgggt actttgtaca cattatctca ttgctgttca taattgttag attaattttg 3420 taatattgat attattccta gaaagctgag gcctcaagat gataactttt attttctgga 3480 cttgtaatag ctttctcttg tattcaccat gttgtaactt tcttagagta gtaacaatat 3540 aaagttattg tgagtttttg caaacacagc aaacacaacg acccatatag acattgatgt 3600 gaaattgtct attgtcaatt tatgggaaaa caagtatgta ctttttctac taagccattg 3660 aaacaggaat aacagaacaa gattgaaaga atacattttc cgaaattact tgagtattat 3720 acaaagacaa gcacgtggac ctgggaggag ggttattgtc catgactggt gtgtggagac 3780 aaatgcaggt ttataataga tgggatggca tctagcgcaa tgactttgcc atcactttta 3840 gagagctctt ggggacccca gtacacaaga ggggacgcag ggtatatgta gacatctcat 3900 tctttttctt agtgtgagaa taagaatagc catgacctga gtttatagac aatgagccct 3960 tttctctctc ccactcagca gctatgagat ggcttgccct gcctctctac taggctgact 4020 cactccaagg cccagcaatg ggcagggctc tgtcagggct ttgatagcac tatctgcaga 4080 gccagggccg agaaggggtg gactccagag actctccctc ccattcccga gcagggtttg 4140 cttatttatg catttaaatg atatatttat tttaaaagaa ataacaggag actgcccagc 4200 cctggctgtg acatggaaac tatgtagaat attttgggtt ccattttttt ttccttcttt 4260 cagttagagg aaaaggggct cactgcacat acactagaca gaaagtcagg agctttgaat 4320 ccaagcctga tcatttccat gtcatactga gaaagtcccc acccttctct gagcctcagt 4380 ttctcttttt ataagtagga gtctggagta aatgatttcc aatggctctc atttcaatac 4440 aaaatttccg tttattaaat gcatgagctt ctgttactcc aagactgaga aggaaattga 4500 acctgagact cattgactgg caagatgtcc ccagaggctc tcattcagca ataaaattct 4560 caccttcacc caggcccact gagtgtcaga tttgcatgca ctagttcacg tgtgtaaaaa 4620 ggaggatgct tctttccttt gtattctcac atacctttag gaaagaactt agcacccttc 4680 ccacacagcc atcccaataa ctcatttcag tgactcaacc cttgacttta taaaagtctt 4740 gggcagtata gagcagagat taagagtaca gatgctggag ccagaccacc tgagtgatta 4800 gtgactcagt ttctcttagt agttgtatga ctcagtttct tcatctgtaa aatggagggt 4860 tttttaatta gtttgttttt gagaaagggt ctcactctgt cacccaaatg ggagtgtagt 4920 ggcaaaatct cggctcactg caacttgcac ttcccaggct caagcggtcc tcccacctca 4980 acatcctgag tagctggaac cacaggtaca caccaccata cctcgctaat tttttgtatt 5040 tttggtagag atggggtttc acatgttaca caggatggtc tcagactccg gagctcaagc 5100 aatctgccca cctcagcctt ccaaagtgct gggattataa gcatgattac aggagtttta 5160 acaggctcat aagattgttc tgcagcccga gtgagttaat acatgcaaag agtttaaagc 5220 agtgacttat aaatgctaac tactctagaa atgtttgcta gtattttttg tttaactgca 5280 atcattcttg ctgcaggtga aaactagtgt tctgtacttt atgcccattc atctttaact 5340 gtaataataa aaataactga catttattga aggctatcag agactgtaat tagtgctttg 5400 cataattaat catatttaat actcttggat tctttcaggt agatactatt attatcccca 5460 ttttactaca gttaaaaaaa ctacctctca acttgctcaa gcatacactc tcacacacac 5520 aaacataaac tactagcaaa tagtagaatt gagatttggt cctaattatg tctttgctca 5580 ctatccaata aatatttatt gacatgtact tcttggcagt ctgtatgctg gatgctgggg 5640 atacaaagat gtttaaattt aagctccagt ctctgcttcc aaaggcctcc caggccaagt 5700 tatccattca gaaagcattt tttactcttt gcattccact gtttttccta agtgactaaa 5760 aaattacact ttattcgtct gtgtcctgct ctgggatgat agtctgactt tcctaacctg 5820 agcctaacat ccctgacatc aggaaagact acaccatgtg gagaaggggt ggtggttttg 5880 attgctgctg tcttcagtta gatggttaac tttgtgaagt tgaaaactgt ggctctctgg 5940 ttgactgtta gagttctggc acttgtcact atgcctatta tttaacaaat gcatgaatgc 6000 ttcagaatat gggaatatta tcttctggaa tagggaatca agttatatta tgtaacccag 6060 gattagaaga ttcttctgtg tgtaagaatt tcataaacat taagctgtct agcaaaagca 6120 agggcttgga aaatctgtga gctcctcacc atatagaaag cttttaaccc atcattgaat 6180 aaatccctat aggggatttc taccctgagc aaaaggctgg tcttgattaa ttcccaaact 6240 catatagctc tgagaaagtc tatgctgtta acgttttctt gtctgctacc ccatcatatg 6300 cacaacaata aatgcaggcc taggcatgac tgaaggctct ctcataattc ttggttgcat 6360 gaatcagatt atcaacagaa atgttgagac aaactatggg gaagcagggt atgaaagagc 6420 tctgaatgaa atggaaaccg caatgcttcc tgcccattca gggctccagc atgtagaaat 6480 ctggggcttt gtgaagactg gcttaaaatc agaagcccca ttggataaga gtagggaaga 6540 acctagagcc tacgctgagc aggtttcctt catgtgacag ggagcctcct gccccgaact 6600 tccagggatc ctctcttaag tgtttcctgc tggaatctcc tcacttctat ctggaaatgg 6660 tttctccaca gtccagcccc tggctagttg aaagagttac ccatgcagag gccctcctag 6720 catccagaga ctagtgctta gattcctact ttcagcgttg gacaacctgg atccacttgc 6780 ccagtgttct tccttagttc ctaccttcga ccttgatcct cctttatctt cctgaaccct 6840 gctgagatga tctatgtggg gagaatggct tctttgagaa acatcttctt cgttagtggc 6900 ctgcccctca ttcccacttt aatatccaga atcactataa gaagaatata ataagaggaa 6960 taactcttat tataggtaag ggaaaattaa gaggcatacg tgatgggatg agtaagagag 7020 gagagggaag gattaatgga cgataaaatc tactactatt tgttgagacc ttttatagtc 7080 taatcaattt tgctattgtt ttccatcctc acgctaactc cataaaaaaa cactattatt 7140 atctttattt tgccatgaca agactgagct cagaagagtc aagcatttgc ctaaggtcgg 7200 acatgtcaga ggcagtgcca gacctatgtg agactctgca gctactgctc atgggccctg 7260 tgctgcactg atgaggagga tcagatggat ggggcaatga agcaaaggaa tcattctgtg 7320 gataaaggag acagccatga agaagtctat gactgtaaat ttgggagcag gagtctctaa 7380 ggacttggat ttcaaggaat tttgactcag caaacacaag accctcacgg tgactttgcg 7440 agctggtgtg ccagatgtgt ctatcagagg ttccagggag ggtggggtgg ggtcagggct 7500 ggccaccagc tatcagggcc cagatgggtt ataggctggc aggctcagat aggtggttag 7560 gtcaggttgg tggtgctggg tggagtccat gactcccagg agccaggaga gatagaccat 7620 gagtagaggg cagacatggg aaaggtgggg gaggcacagc atagcagcat ttttcattct 7680 actactacat gggactgctc ccctataccc ccagctaggg gcaagtgcct tgactcctat 7740 gttttcagga tcatcatcta taaagtaaga gtaataattg tgtctatctc atagggttat 7800 tatgaggatc aaaggagatg cacactctct ggaccagtgg cctaacagtt caggacagag 7860 ctatgggctt cctatgtatg ggtcagtggt ctcaatgtag caggcaagtt ccagaagata 7920 gcatcaacca ctgttagaga tatactgcca gtctcagagc ctgatgttaa tttagcaatg 7980 ggctgggacc ctcctccagt agaaccttct aaccagctgc tgcagtcaaa gtcgaatgca 8040 gctggttaga ctttttttaa tgaaagctta gctttcatta aagattaagc tcctaagcag 8100 ggcacagatg aaattgtcta acagcaactt tgccatctaa aaaaatctga cttcactgga 8160 aacatggaag cccaaggttc tgaacatgag aaatttttag gaatctgcac aggagttgag 8220 agggaaacaa gatggtgaag ggactagaaa ccacatgaga gacacgagga aatagtgtag 8280 atttaggctg gaggtaaatg aaagagaagt gggaattaat acttactgaa atctttctat 8340 atgtcaggtg ccattttatg atatttaata atctcattac atatggtaat tctgtgagat 8400 atgtattatt gaacatacta taattaatac taatgataag taacacctct tgagtactta 8460 gtatatgcta gaatcaaatt taagtttatc atatgaggcc gggcacggtg gctcatatat 8520 gggattacat gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggcaattgga tcacctgagg 8580 tcaggagttc cagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc cttctctact aaaaaataca 8640 aaaaatcagc caggtgtggt ggcacgcgtc tataatccca gctactcagg aggctgaggc 8700 aggagaatca cttgaaccca ggaggtggag gttgcagtga gctaagattg caccactgca 8760 ctccagccta ggcgacagag tgagactcca tctcaaaaaa aaaaaaagaa gtttattata 8820 tgaattaact tagttttact cacaccaata ctcagaagta gattattacc tcatttattg 8880 atgaggagcc caatgtactt gtagtgtaga tcaacttatt gaaagcacaa gctaataagt 8940 agacaattag taattagaag tcagatggtc tgagctctcc tactgtctac attacatgag 9000 ctcttattaa ctggggactc gaaaatcaaa gacatgaaat aatttgtcca agcttacaga 9060 accaccaagt agtaaggcta ggatgtagac ccagttctgc tacctctgaa gacagtgttt 9120 tttccacagc aaaacacaaa ctcagatatt gtggatgcga gaaattagaa gtagatattc 9180 ctgccctgtg gcccttgctt cttactttta cttcttgtcg attggaagtt gtggtccaag 9240 ccacagttgc agaccatact tcctcaacca taattgcatt tcttcaggaa agtttgaggg 9300 agaaaaaggt aaagaaaaat ttagaaacaa cttcagaata aagagatttt ctcttgggtt 9360 acagagattg tcatatgaca aattataagc agacacttga gaaaactgaa ggcccatgcc 9420 tgcccaaatt accctttgac cccttggtca agctgcaact ttggttaaag ggagtgttta 9480 tgtgttatag tgttcattta ctcttctggt ctaacccatt ggctccgtct tcatcctgca 9540 gtgacctcag tgcctcagaa acatacatat gtttgtctag tttaagtttg tgtgaaattc 9600 taactagcgt caagaactga gggccctaaa ctatgctagg aatagtgctg tggtgctgtg 9660 ataggtacac aagaaatgag aagaaactgc agattctctg catctccctt tgccgggtct 9720 gacaacaaag tttccccaaa ttttaccaat gcaagccatt tctccatatg ctaactactt 9780 taaaatcatt tggggcttca cattgtcttt ctcatctgta aaaagaatgg aagaactcat 9840 tcctacagaa ctccctatgt cttccctgat gggctagagt tcctctttct caaaaattag 9900 ccattattgt atttccttct aagccaaagc tcagaggtct tgtattgccc agtgacatgc 9960 acactggtca aaagtaggct aagtagaagg gtactttcac aggaacagag agcaaaagag 10020 gtgggtgaat gagagggtaa gtgagaaaag acaaatgaga agttacaaca tgatggcttg 10080 ttgtctaaat atctcctagg gaattattgt gagaggtctg aatagtgttg taaaataagc 10140 tgaatctgct gccaacatta acagtcaaga aatacctccg aataactgta cctccaatta 10200 ttctttaagg tagcatgcaa ctgtaatagt tgcatgtata tatttatcat aatactgtaa 10260 cagaaaacac ttactgaata tatactgtgt ccctagttct ttacacaata aactaatctc 10320 atcctcataa ttctattagc taatacatat tatcatccta tatttcagag acttcaagaa 10380 gttaagcaac ttgctcaaga tcatctaaga agtaggtggt atttctgggc tcatttggcc 10440 cctcctaatc tctcatggca acatggctgc ctaaagtgtt gattgcctta attcatcagg 10500 gatgggctca tactcactgc agaccttaac tggcatcctc ttttcttatg tgatctgcct 10560 gaccctagta gacttatgaa atttctgatg agaaaggaga gaggagaaag gcagagctga 10620 ctgtgatgag tgatgaaggt gccttctcat ctgggtacca gtggggcctc taagactaag 10680 tcactctgtc tcactgtgtc ttagccagtt ccttacagct tgccctgatg ggagatagag 10740 aatgggtatc ctccaacaaa aaaataaatt ttcatttctc aaggtccaac ttatgttttc 10800 ttaattttta aaaaaatctt gaccattctc cactctctaa aataatccac agtgagagaa 10860 acattctttt cccccatccc ataaatacct ctattaaata tggaaaatct gggcatggtg 10920 tctcacacct gtaatcccag cactttggga ggctgaggtg ggtggactgc ttggagctca 10980 ggagttcaag accatcttgg acaacatggt gataccctgc ctctacaaaa agtacaaaaa 11040 ttagcctggc atggtggtgt gcacctgtaa tcccagctat tagggtggct gaggcaggag 11100 aattgcttga acccgggagg cggaggttgc agtgagctga gatcgtgcca ctgcactcca 11160 gcctggggga cagagcacat tataattaac tgttattttt tacttggact cttgtgggga 11220 ataagataca tgttttattc ttatttatga ttcaagcact gaaaatagtg tttagcatcc 11280 agcaggtgct tcaaaaccat ttgctgaatg attactatac tttttacaag ctcagctccc 11340 tctatccctt ccagcatcct catctctgat taaataagct tcagtttttc cttagttcct 11400 gttacatttc tgtgtgtctc cattagtgac ctcccatagt ccaagcatga gcagttctgg 11460 ccaggcccct gtcggggtca gtgccccacc cccgccttct ggttctgtgt aaccttctaa 11520 gcaaaccttc tggctcaagc acagcaatgc tgagtcatga tgagtcatgc tgaggcttag 11580 ggtgtgtgcc cagatgttct cagcctagag tgatgactcc tatctgggtc cccagcagga 11640 tgcttacagg gcagatggca aaaaaaagga gaagctgacc acctgactaa aactccacct 11700 caaacggcat cataaagaaa atggatgcct gagacagaat gtgacatatt ctagaatata 11760 ttatttcctg aatatatata tatatataca catatacgta tatatatata tatatatata 11820 tttgttgtta tcaattgcca tagaatgatt agttattgtg aatcaaatat ttatcttgca 11880 ggtggcctct atacctagaa gcggcagaat caggctttat taatacatgt gtatagattt 11940 ttaggatcta tacacatgta ttaatatgaa acaaggatat ggaagaggaa ggcatgaaaa 12000 caggaaaaga aaacaaacct tgtttgccat tttaaggcac ccctggacag ctaggtggca 12060 aaaggcctgt gctgttagag gacacatgct cacatacggg gtcagatctg acttggggtg 12120 ctactgggaa gctctcatct taaggataca tctcaggcca gtcttggtgc attaggaaga 12180 tgtaggcaac tctgatcctg agaggaaaga aacattcctc caggagagct aaaagggttc 12240 acctgtgtgg gtaactgtga aggactacaa gaggatgaaa aacaatgaca gacagacata 12300 atgcttgtgg gagaaaaaac aggaggtcaa ggggatagag aaggcttcca gaagaatggc 12360 tttgaagctg gcttctgtag gagttcacag tggcaaagat gtttcagaaa tgtgacatga 12420 cttaaggaac tatacaaaaa ggaacaaatt taaggagagg cagataaatt agttcaacag 12480 acatgcaagg aattttcaga 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<210> 202 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'HS1 p1 reverse primer <400> 202 attcgatatc aagcttaatc ccaaaaggct gatagtctc 39 <210> 203 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'HS1 p2 forward primer <400> 203 ccccctcgag gtcgacacat ctctcacttt ctcatcacca 40 <210> 204 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'HS1 p2 reverse primer <400> 204 attcgatatc aagctaagta actgggatta caggagcac 39 <210> 205 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD46F primer <400> 205 aaagggcaaa taccttaagg ggtg 24 <210> 206 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD46R primer <400> 206 agcacttcga cctaaaaata gagat 25 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 207 ggggccacta gggacaggat 20 <210> 208 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 forward primer <400> 208 atctcacagg taaaactgac gcacggagga aca 33 <210> 209 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 reverse primer <400> 209 cgggtcacct ctcactcctt tcatttgggc 30 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 forward primer <400> 210 cggttaatgt ggctctggtt 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 reverse primer <400> 211 cctctctggc tccatcgtaa 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse alpha globin forward primer <400> 212 ctggggaaga caaaagcaac 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse alpha globin reverse primer <400> 213 gccgtggctt acatcaaagt 20 <210> 214 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human g-globin forward primer <400> 214 ggggcaaggt gaatgtggaa ga 22 <210> 215 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human g-globin reverse primer <400> 215 catgatggca gaggcagagg ac 22 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-globin forward primer <400> 216 ctcatggcaa gaaagtgctc g 21 <210> 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224 aacaaaagct ggttaattaa atcggacggg ggtagtctca ag 42 <210> 225 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a reverse primer <400> 225 tattgtacca tcttaattaa aggggcgagt ccttttgtat g 41 <210> 226 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pA forward primer <400> 226 aacaaaagct ggttaattaa tcattttatg tttcaggttc aggggg 46 <210> 227 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pA reverse primer <400> 227 tattgtacca tcttaattaa atggttacaa ataaagcaat agcatcac 48 <210> 228 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS4 forward primer <400> 228 aacaaaagct ggttaattaa gtttttgtat tctgtttcgt gaggca 46 <210> 229 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS4 reverse primer <400> 229 tattgtacca tcttaattaa gcatttgcct aaggtcggac at 42 <210> 230 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-Out P1 primer <400> 230 ccacacccag acctgaccca aacc 24 <210> 231 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-Out P2 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gagcacgaga cgccaagacc ggagcagcag gcagcctgat ggatgtgctg 360 caccacccag gcatgaacca ccgggtggag atcacagagg gcatcctggc agacgagtgc 420 gccgccctgc tgagcgattt ctttagaatg aggagacagg agatcaaggc ccagaagaag 480 gcacagagct ccaccgactc tggaggctct agcggaggat cctctggaag cgagacacca 540 ggcacatccg agtccgccac accagagtct tccggcggct cctccggagg atcc 594 <210> 261 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TadAN+ +32aa <400> 261 tctgaggtgg agttttccca cgagtactgg atgagacatg ccctgaccct ggccaagagg 60 gcacgcgatg agagggaggt gcctgtggga gccgtgctgg tgctgaacaa tagagtgatc 120 ggcgagggct ggaacagagc catcggcctg cacgacccaa cagcccatgc cgaaattatg 180 gccctgagac agggcggcct ggtcatgcag aactacagac tgattgacgc caccctgtac 240 gtgacattcg agccttgcgt gatgtgcgcc ggcgccatga tccactctag gatcggccgc 300 gtggtgtttg gcgtgaggaa tgcaaaaact ggcgccgcag gctctctgat ggacgtgctg 360 cactaccccg gcatgaatca cagagtcgaa attaccgagg gaatcctggc agatgaatgt 420 gccgccctgc tgtgctattt ctttcggatg cctagacagg tgtttaatgc tcagaagaag 480 gcccagagct ccaccgatag tggcggatct agcgggggct cctctggctc tgagacccct 540 ggcacaagcg agagcgcaac acctgaaagc agcgggggca gcagcggggg gagc 594 <210> 262 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector <400> 262 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacagcc ctaggataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata 240 ctagtacgcc cgggcgtatc gatacgatat cggtccggac aggaagtgac aattttcgcg 300 cggttttagg cggatgttgt agtaaatttg ggcgtaaccg agtaagattt ggccattttc 360 gcgggaaaac tgaataagag gaagtgaaat ctgaataatt ttgtgttact catagcgcgt 420 aatggatccg cgttaaccgg cggccgcatt ctagacggaa ttcataactt cgtatagcat 480 acattatacg aagttatgct agccgaagct tgagctcgtc gagggatctg ggcgtggtta 540 agggtgggaa agaatatata aggtgggggt cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca 600 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL11A-seq reverse primer 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tatacttggc agctgtatga cctcagacaa ccagtgttac ctctctaagc 25980 ctcagtttcc tcatgcaaaa ggagggggaa taacaacaga gcccactgct tgggggtgtt 26040 gtgaggacag gatgaaaaaa caaacagaaa tccctcagta caggattcag tgcagtggac 26100 agtcttgcaa ggtctggttc agccctccac ccctaccctc accagtataa agaactctgg 26160 cctacaagtc agatgacctg agttttaatc tcagctttgc cattagccgt gtgaacttga 26220 gaaagtccct ttccttttta catctattgg gatgatcatg cattttttgt cctttattct 26280 gttaatatag tgtgttacat tgattgcttt tcatagactg aaccagcctt gtattccagg 26340 gataaatctc acttggtcat ggtgtataat cctttataca aatgttgctg ggttgagttt 26400 gctagtattt tgttgaagat ttttatgtct tgattcataa ggaatattgg tgtaccttcc 26460 ccttttatgg ccacagtttc cctacaatga tgtagtcgaa ctagacaacc tccaatatct 26520 ttcagtattc atgtcctctg attctgtgaa actaagaaaa ttaagaaata gtgattcata 26580 ggcacaaggc aggcaaaact tagactcctt gtagaataat taggaagcca aatattcagt 26640 gtgcttattt ctcaaataac cttagtttct ccagtctgcc ccaactccga ggcctgaata 26700 tctctagatg cttatgatgg caactaaagc ctaaaagcta attcatttta aagttcttcc 26760 aaatgcatag ggttttattt ttccagacct gggttcagat ggggaatttg acaaacaatg 26820 gaaaggggga aaaacaacaa tctaaacact gagtgacaaa gtaacaaaga aatagtctag 26880 ctatcagcca gtcaagccag ccttggcttt gctatccaaa gtagtcagtc taattctacc 26940 accagtttct gttcctgtag ctgtctactg cctgccaggg actctgcctt cccacccaca 27000 actaccaatg gaaggatgtg gtgaccatac cagtggctgc tgacatctcc tgccatggga 27060 agcataattg cctccagcag cctccccctt agatccatca tttttgttgc acttggcctg 27120 ggctgtactc ccggccaatg actgaacatg gtgagcatag taatgcaggc ccatttctgt 27180 gaggagcagg actcctccag taggtgactt tggctcaagg actctctatt ggcctggttg 27240 aacttttcct gaactgtgct actgtctgag actcttctta cccaatcctc tttctcgccc 27300 caattgtcac agaccacctg cattgtggtc tgagtctctc cccaccttct cttgctcttc 27360 cctgtttatc tttcacaggc atttccccca gtacattcct tgaatgtcta acccgatacg 27420 ggtgcctgac ttttggcaga cctaagcaga caaaaaggag tacttggtta cctagctctt 27480 ctttctacca caaacatcga gggaaccctt tttccctcac ccctctgcca cacccccact 27540 gccccagtga acaaccacag agagagctgt ggtataatat taggctggtg caaaagtaat 27600 tgcggttttt gccattactt ttaatggtaa aaaccgcaat tacttttgca cctacctagt 27660 atttgtgtcc ccccaaattc atatgttgaa acctaaccca caatatgatg tcattaggag 27720 gcaagacctt gaggaggtga ttagatgatg gggtggagct ctcctgaatg agattagtgc 27780 ccttataaga agaagcccaa ggaagctacc ttgactcttc catcacatga gaatgcagca 27840 agaaggcacc atctactaat caggaagaga gctctcacca gacactgaat ctgccagtgt 27900 cttgatcttg aagttcccag cctccagaac tatgcataat gcatttccat tgtctctaag 27960 ccacccagcc tatggtattt tgtcatagca gcctgaactg actaagacag tgagccacat 28020 gagaagtgcc ccaacccctc ccttaagcac ttggctcaca gatcagtggg ttcatttctg 28080 cctgagtttt attgttattc tgtagatttc ttgggctaga tatatttttc tgttattttc 28140 cttcttcacc tcagtcatga attggttgtt ttaaaaaaga caatgtaagt catggggaaa 28200 ctcctgacaa ctctactctc ctagggttcc tgataaaagg ggattcagtt gagtcctctg 28260 atggtctcta cctgccaaag tccagcagcc cttagcaaac atgctgctcg tttctgtaga 28320 gaaggtgctg gtgtcccacc atacttctct ctccctcatg aagggcttgc gacccagcaa 28380 atgggtggct tatatgggtc tgtttcaaag gaagagccag ctctgggaag aaaaacgatg 28440 agcataagca taacctacca ctgtgcctgg gaaagcagac aacttttttg atgtgtgaat 28500 atctaatgag aatggaatcc atcaattacc ttaaacttag gcacagtctt caaattcaat 28560 atatgtggga tatactttta gtcagtttgt agacgttatt tgtaataaat aatctggctt 28620 ctctaaagaa attattttaa gtgtttggtt tggtttgatt taatggtaaa attatattta 28680 gtggcagaga attatagcaa tggtgataaa ctatagagtg tcataagttc atatcttatt 28740 ctcacatttg aagctgcctg cagatgcatt caagatgcag ccagaagtca ggagactcag 28800 gctgttattt ggagctcatc attttacagc cttgctggac tcccactttc tcaggggaaa 28860 aatgtggtgt tgacccagat tagctctcca ggccctgctg agttgggcac tctgtaagct 28920 ggagggtctt ctattgtctt cacctaagtg tcaatcaaca acccaaatgg gcatggggga 28980 agagggagct gggccaatgc ccagggtgcc tggtagagag ataccttggg cactggaagg 29040 caccagcttc ccagagagaa gggggagggc catgaaaaag ttggctgtag atgccaggga 29100 cactgggact ctccagctgt gtgtttgtgt cttctgaaga cttatgtttc attcctttgg 29160 agcatgcata atcatacact gtgggatgtg ttatatagat tgcttgatag ttcaccactg 29220 taataaaata ctgtgactgg aatctgctcc cagtctgcct ttgatagcac ttgtgcaaca 29280 cacatttact gagcatttac agtgatccag gacctgtgtt gtgaaaacat tgatggacaa 29340 ggcagatggt ggagcacgtc agtgaggatt tttaacaaag gctggtaagt gctataaagg 29400 aacattgtag gacactagag aacaaagaac aggagaacct gacttaggct ggggtggggc 29460 gttggttaga ggaggctcct tggaggacat gaggtttaag ctgtgacctg aggatgaata 29520 gatgttggcc aggtgaggta ccggtatttg tcagccttac cagtaaaaaa gaaaacctat 29580 taaaaaaaaa atacacatac aaagcctcat cagccatggc ttaccagaga aagtacagcg 29640 ggcacacaaa ccacaagctc taaagtcact ctccaacctc tccacaatat atatacacaa 29700 gccctaaact gacgtaatgg gactaaagtg taaaaaatcc cgccaaaccc aacacacacc 29760 ccgaaactgc gtcaccaggg aaaagtacag tttcacttcc gcaatcccaa caagcgtcac 29820 ttcctctttc tcacggtacg tcacatccca ttaacttaca acgtcatttt cccacggccg 29880 cgccgcccct tttaaccgtt aaccccacag ccaatcacca cacggcccac actttttaaa 29940 atcacctcat ttacatattg gcaccattcc atctataagg tatattattg atgatg 29996 <210> 306 <400> 306 000 <210> 307 <400> 307 000 <210> 308 <400> 308 000 <210> 309 <400> 309 000 <210> 310 <400> 310 000 <210> 311 <400> 311 000 <210> 312 <400> 312 000 <210> 313 <400> 313 000 <210> 314 <400> 314 000 <210> 315 <400> 315 000 <210> 316 <400> 316 000 <210> 317 <400> 317 000 <210> 318 <400> 318 000 <210> 319 <400> 319 000 <210> 320 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 promoter <400> 320 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 348 <210> 321 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dESV40 promoter <400> 321 gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 60 taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 120 cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 180 gaggcctagg cttttgcaaa aagctt 206 <210> 322 <211> 463 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 322 ttggcccctc cctcgggtta ccccacagcc taggccgatt cgacctctct ccgctggggc 60 cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg cgagcggcgc gcgggcgggg aagcgcggcc 120 cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc gctgtcgggg ccaggccggg ctcccagtgg 180 attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc tccccacgtg gcggagggac tggggacccg 240 ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt 300 cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc 360 ctttaccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct 420 gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac ccccgccaga tct 463 <210> 323 <211> 648 <212> DNA <213> Schmidt-Ruppin A strain <400> 323 acgcgtcatg tttgacagct tatcatcgca gatccgtatg gtgcactctc agtacaatct 60 gctctgatgc cgcatagtta agccagtatc tgctccctgc ttgtgtgttg gaggtcgctg 120 agtagtgcgc gagcaaaatt taagctacaa caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga 180 agaatctgct tagggttagg cgttttgcgc tgcttcgcga tgtacgggcc agatattcgc 240 gtatctgagg ggactagggt gtgtttaggc gaaaagcggg gcttcggttg tacgcggtta 300 ggagtcccct caggatatag tagtttcgct tttgcatagg gagggggaaa tgtagtctta 360 tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg ccttacaagg 420 agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg tggtacgatc gtgccttatt 480 aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc actaaattcc gcattgcaga 540 gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacgcc atttgaccat tcaccacatt 600 ggtgtgcacc tccaagctgg gtaccagctg ctagcaagct tgagatct 648 <210> 324 <211> 1740 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 324 gagtagctgg gattacaggc atgtgccacc acgcctcgct aatattagta tttttcatac 60 agacaagatc tcactatgtt gctcagggta gtctcgaatt ctgggactca aatgatcctc 120 ccacttcagc ctcccaaagt gctgggatta caggcataag ccatcatgcc cggcctctga 180 cgctgtttct ttcaaccccc aggatttcag attccaccag cttatggaga agggaaccaa 240 gttcgagatg cgtgattgcc cagaaagttg gaggctgagc tgagacttga acccagagac 300 cagaacctcc agaggtcaaa gtcctcctcc tgggtccccc agagaagggc cctgagatga 360 cagctcgttg gtcctcatgg aagcgtgacc cccccagtag actttctccc acacccaacc 420 ttggtttcct catctatatg atagggacaa gccagactct acctccctgg tggtcatggt 480 ctccgcttat tcgggttcat aaccttaaag gcccctcgca ccacctcagt gagccattta 540 tgcctggcac agggccaact ctcagtgcat atctgcaaag gaaccaatga atgagtgaat 600 gaagtgacaa atgaataaag gaataaatga atgaggcact tatcatgtac caggctttcg 660 ttaccacgtc ccatttattc ctctgaggca gggtctattt tatccttgtt acagatgggg 720 aaactaaggc ccagggagga gcaaagtctt ccccaagtat gtacccactc agaacttgag 780 ctctgaatgt ctcccaccca gcttagccca agagcggggt tcagtgatgc ccacccccta 840 aggctctaga gaaagggggt aggcccacat gccagtttgg gggtggtaaa gccaggtaag 900 ttttctttat gggtcccctg aaaccctgaa agtgaacccc agtcctgcat gaaagtgagc 960 tccccatagc tcaaggtatt caagcacaat acggctttga gtgctgaagc aggctgtgca 1020 ggcttggata gtgacatgcc ctctctgagc ctcaatttcc ccacctgtca acagcagaca 1080 gtgacagctg tgatcagggg atcacagtgc atggggatgg gtgggtgcat ggggatggag 1140 gggcatttgg gagccctccc cgataccacc ccctgcagcc acccagatag cctgtcctgg 1200 cctgtctgtc ccagtccagg gctgaaaggg tgcgggtcct gcccgcccct aggtctggag 1260 gcggagtcgc ggtgacccgg gagcccaata aatctgcaac ccacaatcac gagctgctcc 1320 cgtaagcccc aaggcgacct ccagctgtca gcgctgagca cagcgcccag ggagagggac 1380 agacagccgg ctgcatggga cagcggaacc cagagtgaga ggggaggtgg caggacagac 1440 agacagcagg ggcggacgca gagacagaca gcggggacag ggaggccgac acggacatcg 1500 acagcccata gattcctaac ccagggagcc ccggcccctc tcgccgcttc ccaccccaga 1560 cggagcgggg acaggctgcc gagcatcctc ccacccgccc tccccgtcct gcctcctcgg 1620 cccctgccag cttcccccgc ttgagcacgc agggcgtccg aggacgcgct gggcctccgc 1680 acccgccctc atggaggccg tggagaccgg ggaacggccc accttcggag cctgggacta 1740 <210> 325 <211> 1075 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 325 attagagatt gtaaattggg ctctgagctt cctaccaaca aaagcacaaa ggaaaatatg 60 atcactggta ttaaaaaaaa acacctatgg tttccaaaag attaaaacaa accagcagtt 120 ttatagaagc taacactaaa atctaaagga actacgttct atggagccac ttaatatgga 180 taaacacttt gacaatattc tttcaacaac tacagtaaca agtttcttag agtccatttc 240 tttttacatc cataatgaat tgtaaatctt ttctacttct taagtaaaac atcaccactt 300 aattctggta acttttccat attaactttt tagaacaatt gcaaacgtac cataaatgat 360 tgttgtcaca gtggtaacta tttgaccctg actgttattt tgtatatagc agcttttaaa 420 ataaaaaggc aacaagtttc taggcgtaat ttccacagat cttttatgta aaacaatgac 480 atcctttgca acttctgcca tttaatctat ctcaagcaag ctctctggaa acaaatctat 540 ttgaaagatt ctattgtaat tagaaatcag ggtaactgaa tgcactagat gaaaaccttc 600 tgactggggc caatgaagtc aataaagtca aaactgctgt gaatgctcaa ctgtctgcag 660 atcagatgtc ttgggatgga atccgttctc gaggccacca tcattaatat caatttggcc 720 atgtaataca agcctcactt gttccactgt tacaaatgtg cttaaaactg agctcattta 780 caatccaaat acatatgtag gatggtaacc aaggcatcac actaatttag gtattatgtt 840 ttagggggaa caaaaggtat gttaatattt tattcatctc caaattaact ataaattgtg 900 cattcttgca tagatcctcc ttgggaatga gaaattagga aaatccagtt gttaaaatga 960 atgcctaaaa tcaaaataaa atttgttttt ctggcacctg cttgatgaca cagactaata 1020 accaatgaca aaattccctt gaacccaagt tttcatttcc tcctattgtg tggtc 1075

Claims (58)

  1. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 벡터 생산 시스템:
    다음을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈:
    Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열;
    Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및
    Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR), 및
    다음을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈:
    5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR);
    3' Ad35 ITR;
    Ad35 패키징 서열; 및
    적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열.
  2. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 벡터:
    Ad35 섬유 샤프트;
    Ad35 섬유 놉; 및
    Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR)를 포함하는 Ad35 게놈.
  3. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 게놈:
    Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열;
    Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및
    Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR).
  4. 하기를 포함하는, 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 벡터:
    다음을 포함하는 핵산 서열:
    5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR);
    3' Ad35 ITR;
    Ad35 패키징 서열; 및
    적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열로, 여기서 게놈은 Ad35 바이러스 구조적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 것인 핵산 서열; 및
    Ad35 섬유 샤프트 및/또는 Ad35 섬유 놉.
  5. 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR);
    3' Ad35 ITR;
    Ad35 패키징 서열; 및
    적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열
    을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 게놈이며, 여기서 Ad35 공여자 게놈은 야생형 Ad35 게놈에 의해 암호화된 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 것인, 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈.
  6. 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 벡터를 생산하는 방법으로, 상기 방법은 세포의 배양물로부터 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 하기를 포함하는 것인, 방법:
    다음을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈:
    Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열;
    Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및
    Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하는 재조합효소 지시 반복부(DR) 및
    다음을 포함하는 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 게놈:
    5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR);
    3' Ad35 ITR;
    Ad35 패키징 서열; 및
    적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열.
  7. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 생산 시스템:
    다음을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈:
    Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열;
    Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및
    Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR), 및
    다음을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 게놈:
    5' Ad35 ITR;
    3' Ad35 ITR;
    Ad35 패키징 서열; 및
    적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열.
  8. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 벡터:
    Ad35 섬유 샤프트;
    Ad35 섬유 놉; 및
    Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR)를 포함하는 Ad35 게놈.
  9. 하기를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 헬퍼 게놈:
    Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열;
    Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및
    Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR).
  10. 재조합 헬퍼 의존적 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 공여자 벡터를 생산하는 방법으로, 상기 방법은 세포의 배양물로부터 재조합 헬퍼 의존적 Ad35 공여자 벡터를 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 하기를 포함하는 것인, 방법:
    다음을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 게놈:
    Ad35 섬유 샤프트를 암호화하는 핵산 서열;
    Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열; 및
    Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 도립된 말단 반복부(ITR)는 방해하지 않는 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내의 재조합효소 지시 반복부(DR), 및
    다음을 포함하는 재조합 Ad35 공여자 게놈:
    5' Ad35 ITR;
    3' Ad35 ITR;
    Ad35 패키징 서열; 및
    적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열.
  11. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Ad35 섬유 놉이 야생형 Ad35 섬유 놉이거나, 또는
    상기 Ad35 섬유 놉이 조작된 Ad35 섬유 놉이며, 여기서 조작된 섬유 놉은 CD46에 대한 섬유 놉의 친화도를 증가시키는 돌연변이를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 돌연변이가
    Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His로부터 선택된 돌연변이를 포함하거나; 또는 돌연변이 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys, 및 Arg279His 각각을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  13. 제1항, 제4항 내지 제7항, 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 발현 산물이 조절 서열과 작동가능하게 연결된 치료 발현 산물을 포함하며, 임의적으로 여기서 치료 발현 산물은 하기를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법:
    (a) β-글로빈 단백질 또는 γ-글로빈 단백질;
    (b) 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄로, 임의적으로 여기서 항체는 항-CD33 항체인 것;
    (c) 제1 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄 및 제2 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄로, 임의적으로 여기서 항체는 항-CD33 항체인 것;
    (d) CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA(gRNA)로, 임의적으로 여기서 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 cpf1을 포함하는 것;
    (e) 염기 편집기 및/또는 gRNA로, 임의적으로 여기서 염기 편집기는 사이토신 염기 편집기(CBE) 또는 아데닌 염기 편집기(ABE)이며, 임의적으로 여기서 염기 편집기는 기능상실된 Cas9 및 기능상실된 cpf1로부터 선택된 촉매적으로 기능상실된 뉴클레아제를 포함하는 것;
    (f) 바이러스 감염을 차단 또는 감소시키는 응고 인자 또는 단백질로, 임의적으로 여기서 치료 발현 산물은 인자 VII 대체 단백질 또는 인자 VIII 대체 단백질을 포함하는 것;
    (g) 체크포인트 억제제;
    (h) 키메라 항원 수용체 또는 조작된 T 세포 수용체; 또는
    (i) γC, JAK3, IL7RA, RAG1, RAG2, DCLRE1C, PRKDC, LIG4, NHEJ1, CD3D, CD3E, CD3Z, CD3G, PTPRC, ZAP70, LCK, AK2, ADA, PNP, WHN, CHD7, ORAI1, STIM1, CORO1A, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, RMRP, DKC1, TERT, TINF2, DCLRE1B, SLC46A1, FancA, FancB, FancC, FancD1, FancD2, FancE, FancF, FancG, FancI, FancJ, FancL, FancM, FancN, FancO, FancP, FancQ, FancR, FancS, FancT, FancU, FancV, FancW, 가용성 CD40, CTLA, Fas L, PD-L1에 대한 항체, CD4에 대한 항체, CD5에 대한 항체, CD7에 대한 항체, CD52에 대한 항체, IL-1에 대한 항체, IL-2에 대한 항체, IL-4에 대한 항체, IL-6에 대한 항체, IL-10에 대한 항체, TNF에 대한 항체, 자가반응성 T 세포 상에 특이적으로 존재하는 TCR에 대한 항체, 글로빈 패밀리 유전자, WAS, phox, 디스트로핀, 피루베이트 키나제, CLN3, ABCD1, 아릴술파타제 A, SFTPB, SFTPC, NLX2.1, ABCA3, GATA1, 리보솜 단백질 유전자, TERT, TERC, DKC1, TINF2, CFTR, LRRK2, PARK2, PARK7, PINK1, SNCA, PSEN1, PSEN2, APP, SOD1, TDP43, FUS, 유비퀼린 2, 및/또는 C9ORF72로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로, 임의적으로 여기서 단백질은 FancA 단백질인 것.
  14. 제13항에 있어서, (d) 또는 (e)에서
    상기 gRNA가 HBG1, HBG2, 및/또는 적혈구 인핸서 bcl11a의 표적 핵산 서열에 결합하며, 임의적으로 여기서 gRNA는 γ-글로빈의 발현을 증가시키도록 조작되는 것이거나; 또는
    상기 gRNA가 CD33의 일부를 암호화하는 표적 핵산 서열에 결합하며, 임의적으로 여기서 CD33은 인간 CD33인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 치료 발현 산물이 하기를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법:
    β-글로빈 단백질 또는 γ-글로빈 단백질; 및
    CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제; 및 하기 중 1, 2, 또는 3 개를 포함하는 CRISPR 시스템:
    HBG1의 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA;
    HBG2의 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA; 및/또는
    Bcl11a의 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA로,
    임의적으로 여기서 gRNA는 γ-글로빈의 발현을 증가시키도록 조작되는 것.
  16. 제13항에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 프로모터를 포함하며, 임의적으로 여기서 프로모터는 β-글로빈 프로모터이며, 임의적으로 여기서 β-글로빈 프로모터는 약 1.6 kb 길이이고/이거나 염색체 11의 위치 5228631-5227023에 따른 핵산을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 유전자좌 제어 영역(LCR)을 포함하며, 임의적으로 여기서 LCR은 β-글로빈 LCR인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 β-글로빈 LCR이
    HS1, HS2, HS3, 및 HS4를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 β-글로빈 LCR DNAse I 과민성 부위(HS)를 포함하며, 임의적으로 여기서 β-글로빈 LCR은 약 4.3 kb의 길이를 갖는 것이거나;
    HS1, HS2, HS3, HS4, 및 HS5를 포함하는 β-글로빈 LCR DNAse I HS를 포함하며, 임의적으로 여기서 β-글로빈 LCR은 약 21.5 kb의 길이를 갖는 것이거나; 또는
    상기 β-글로빈 LCR이 염색체 11의 위치 5292319-5270789에 따른 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  19. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 3'HS1을 포함하며, 임의적으로 여기서 3'HS1은 염색체 11의 위치 5206867-5203839에 따른 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 조절 서열(들)이 miRNA 결합 부위를 포함하며, 임의적으로 여기서
    상기 miRNA 결합 부위는 관심 종에 의해 자연적으로 발현되는 miRNA에 대한 결합 부위이고/이거나;
    상기 miRNA는 혈액 및 종양 미세환경 또는 표적 조직에서 차등 점유 프로파일을 입증하며, 임의적으로 여기서 점유 프로파일은 종양 미세환경 또는 표적 조직에서보다 혈액에서 더 높은 것이고/이거나;
    상기 miRNA 결합 부위는 miR423-5, miR423-5p, miR42-2, miR181c, miR125a, 또는 miR15a 결합 부위를 포함하고/하거나;
    상기 miRNA 결합 부위는 miR187 또는 miR218 결합 부위를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  21. 제1항, 제4항 내지 제7항, 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산이 통합 요소를 추가로 포함하는 페이로드의 부분이며, 임의적으로 여기서 통합 요소는 발현 산물을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 통합 요소가 상동 재조합에 의한 표적 게놈으로의 통합을 위해 조작되고, 상기 통합 요소가 표적 게놈의 인접하게 연결된 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹되며, 임의적으로 여기서
    상동성 아암은 0.8 및 1.8　kb 사이인 것이고/이거나;
    상동성 아암은 염색체 안전 항구 유전자좌에 플랭킹되는 표적 게놈의 핵산 서열에 상동이며, 임의적으로 여기서 안전 항구 유전자좌는 AAVS1, CCR5, HPRT, 또는 Rosa로부터 선택되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 통합 요소가 전위에 의한 표적 게놈으로의 통합을 위해 조작되고, 상기 통합 요소가 트랜스포존 도립 반복부(IR)에 의해 플랭킹되며, 임의적으로 여기서 트랜스포존 IR은 재조합효소 DR에 의해 플랭킹되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 트랜스포존 IR이 잠자는 미녀(SB) IR이며, 임의적으로 여기서 SB IR은 pT4 IR이거나;
    상기 트랜스포존 IR이 피기백, 마리너, 개구리 왕자, Tol2, TcBuster, 또는 spinON IR인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 트랜스포존 IR에 의해 플랭킹되는 통합 요소의 전위를 매개하는 트랜스포사제를 암호화하는 핵산을 포함하며, 임의적으로 여기서 트랜스포사제를 암호화하는 핵산은 지지 벡터 또는 지지 벡터 게놈으로 구성되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 트랜스포사제가 잠자는 미녀, 피기백, 마리너, 개구리 왕자, Tol2, TcBuster, 또는 spinON 트랜스포사제이며, 임의적으로 여기서 트랜스포사제는 잠자는 미녀 100x(SB100x) 트랜스포사제인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 핵산이 PGK 프로모터와 작동가능하게 연결되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 공여자 게놈, 공여자 벡터, 또는 방법.
  28. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부에 플랭킹하고/하거나 Ad35 게놈의 5' 단부의 550 개 뉴클레오티드 내에 있고 Ad35 패키징 신호를 기능적으로 방해하지만 5' Ad35 ITR은 방해하지 않는 재조합효소 DR이 FRT, loxP, rox, vox, AttB, 또는 AttP 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부의 절제를 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산이 헬퍼 게놈을 포함하는 세포의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  30. 제23항에 있어서, 상기 트랜스포존 IR에 플랭킹되는 재조합효소 DR이 FRT, loxP, rox, vox, AttB, 또는 AttP 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  31. 제21항에 있어서, 상기 통합 요소를 포함하는 핵산의 절제를 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산이 지지 벡터 또는 지지 벡터 게놈으로 구성되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  32. 제29항 또는 제31항에 있어서, 상기 재조합효소가 Flp, Cre, Dre, Vika, 또는 PhiC31 재조합효소인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 재조합효소를 암호화하는 핵산이 EF1α 프로모터와 작동가능하게 연결되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  34. 제21항에 있어서,
    상기 페이로드가 이종 발현 산물을 포함하는 통합 요소를 포함하고,
    상기 이종 발현 산물이 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 긴 LCR와 작동가능하게 연결된 β-글로빈 단백질을 포함하고,
    상기 통합 요소가 SB IR에 의해 플랭킹되고,
    상기 SB IR이 재조합효소 DR에 의해 플랭킹되며, 임의적으로 여기서 재조합효소 DR은 FRT 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  35. 제21항에 있어서, 상기 페이로드가 하기를 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법:
    통합 요소, 및
    발현 산물을 암호화하고, 통합 요소로 구성되지 않고, 통합 요소의 표적 게놈으로의 통합에 의해 기능적이지 않게 만들도록 배치되는, 조건부로 발현되는 핵산 서열.
  36. 제35항에 있어서, 상기 조건부로 발현되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 발현 산물이 CRISPR 시스템 구성요소 또는 염기 편집기 시스템 구성요소를 포함하며, 임의적으로 여기서 구성요소는 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 염기 편집기 효소, 또는 gRNA인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  37. 제21항에 있어서, 상기 페이로드가 선택 카세트를 포함하며, 임의적으로 여기서 선택 카세트는 통합 요소로 구성되는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 선택 카세트가 mgmtP140K를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 상기 선택 카세트가 항-CD33 shRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  39. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 DR에 의해 플랭킹된 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부가 GenBank 수탁 번호 AX049983에 따른 Ad35 서열의 뉴클레오티드 138-481에 상응하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  40. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 DR에 의해 플랭킹된 Ad35 패키징 서열의 적어도 일부가 GenBank 수탁 번호 AX049983에 따른 Ad35 서열의 뉴클레오티드 179-344; 뉴클레오티드 366-481; 뉴클레오티드 155-481; 뉴클레오티드 159-480; 뉴클레오티드 159-446; 뉴클레오티드 180-480; 뉴클레오티드 207-480; 뉴클레오티드 140-446; 뉴클레오티드 159-446; 뉴클레오티드 180-446; 뉴클레오티드 202-446; 뉴클레오티드 159-481; 뉴클레오티드 180-384; 뉴클레오티드 180-481; 또는 뉴클레오티드 207-481에 상응하는 것인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  41. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 DR이 LoxP 부위인, 재조합 Ad35 벡터 생산 시스템, 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 또는 방법.
  42. 제2항, 제3항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ad35 헬퍼 게놈이 293 T 세포에서 증폭을 위해 Ad5 E4orf6을 포함하는 것인, 헬퍼 벡터 또는 헬퍼 게놈.
  43. 제2항, 제3항, 제8항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 게놈이 서열번호: 51-65 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 또는 생성하는 것인, 헬퍼 벡터 또는 헬퍼 게놈.
  44. 제2항 내지 제5항, 제8항, 및 제9항 중 어느 한 항의 헬퍼 벡터, 헬퍼 게놈, 공여자 벡터, 또는 공여자 게놈을 포함하는 세포로, 임의적으로 여기서 세포는 HEK293 세포인, 세포.
  45. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항, 제13항 내지 제27항 및 제44항 중 어느 한 항의 공여자 게놈을 포함하는 세포로, 임의적으로 여기서 세포는 적혈구이고, 임의적으로 여기서 세포는 조혈 줄기 세포, T-세포, B-세포, 또는 골수성 세포이고, 임의적으로 여기서 세포는 발현 산물을 분비하는 것인, 세포.
  46. 제6항 또는 제10항에 있어서, 상기 세포가 HEK293 세포인, 방법.
  47. 세포를 변형시키는 방법으로, 상기 방법은 세포를 제5항 및 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 Ad35 공여자 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  48. 대상체의 세포를 변형시키는 방법으로, 상기 방법은 제5항 및 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 Ad35 공여자 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 방법은 대상체로부터 세포의 단리를 포함하지 않는 것인, 방법.
  49. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 제5항 및 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 Ad35 공여자 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 투여는 정맥내 투여인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 방법이 동원제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 임의적으로 여기서 동원제는 과립구-콜로니 자극 인자, GM-CSF, S-CSF, CXCR4 길항제, 및 CXCR2 작용제 중 하나 이상을 포함하며, 임의적으로 여기서 CXCR4 길항제는 AMD3100이고/이거나 여기서 CXCR2 작용제는 GRO-β인, 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 Ad35 공여자 벡터가 선택 카세트를 포함하며, 임의적으로 여기서 방법은 선택제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 선택 카세트는 mgmtP140K를 암호화하고 선택제는 O6BG/BCNU인, 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 방법이 면역 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 면역 억제 레지멘은 스테로이드, IL-6 수용체 길항제, 및/또는 IL-1R 수용체 길항제를 포함하며, 임의적으로 여기서 스테로이드는 글루코코르티코이드 또는 덱사메타손을 포함하는 것인, 방법.
  53. 제49항에 있어서, 상기 Ad35 공여자 벡터가 통합 요소를 포함하고 방법이 CD46을 발현하는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 조혈 줄기 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 및/또는 적혈구 Ter119+ 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%에서 이의 통합 요소 카피의 통합 및/또는 발현을 유발하는 것인, 방법.
  54. 제49항에 있어서, 상기 방법이 통합 요소의 적어도 1 개 카피를 포함하는 표적 세포 게놈에서 통합 요소의 평균 적어도 2 개 카피 또는 적어도 2.5 개 카피의 통합을 유발하는 것인, 방법.
  55. 제49항에 있어서, 상기 방법이 페이로드 또는 이의 통합 요소에 의해 암호화된 발현 산물의 발현을 참조 수준의 적어도 약 20% 또는 참조 수준의 적어도 약 25%인 수준에서 유발하며, 임의적으로 여기서 참조는 대상체 또는 참조 집단에서 내인성 참조 단백질의 발현인, 방법.
  56. 제49항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 혈색소병증, 혈소판 장애, 빈혈, 면역 결핍 응고 인자 결핍, 판코니 빈혈, 알파-1 항트립신 결핍, 겸상 세포 빈혈, 지중해빈혈, 중간형 지중해빈혈, A형 혈우병, B형 혈우병, 폰빌레브란트병, 인자 V 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 X 결핍, 인자 XI 결핍, 인자 XII 결핍, 인자 XIII 결핍, 베르나르-술리에 증후군, 그레이 혈소판 증후군, 또는 뮤코다당류축적증인, 방법.
  57. 제49항에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고 있는 대상체이고 상기 방법이 암을 치료, 예방, 또는 지연시키거나, 또는 암 재발을 지연시키며,
    임의적으로 여기서 대상체는 암 발병과 연관된 하나 이상의 생식 계열 돌연변이의 보균자이고,
    임의적으로 여기서 암은 역형성 성상세포종, 유방암, 난소암, 결장직장암, 미만성 내재성 뇌간 신경교종, 유잉 육종, 다형성 교모세포종, 악성 뇌교종, 흑색종, 전이성 악성 흑색종, 비인두암, 또는 소아암이고,
    임의적으로 여기서 대상체에게 O6BG, TMZ(테모졸로미드), 및/또는 BCNU(카르무스틴)를 제공하거나 또는 투여하는 것인, 방법.
  58. 제49항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 중간형 지중해빈혈이며, 임의적으로 여기서 벡터 또는 게놈은 하기로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물을 암호화하는 핵산을 포함하는 것이며, 임의적으로 여기서 방법은 중간형 지중해빈혈의 증상을 감소시키고/시키거나 중간형 지중해빈혈을 치료하고/하거나 HbF를 증가시키는 것인, 방법:
    내인성 γ-글로빈의 발현을 증가시키거나 또는 재활성화하는 발현 산물(들)로, 임의적으로 여기서 내인성 γ-글로빈의 발현을 증가시키거나 또는 재활성화하는 발현 산물(들)은 CRISPR-연관 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 염기 편집기 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 것:
    HBG1의 핵산 서열에 결합하고 표적 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 코딩 서열로부터 발현을 증가시키도록 조작된 gRNA;
    HBG2의 핵산 서열에 결합하고 표적 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 코딩 서열로부터 발현을 증가시키도록 조작된 gRNA; 및
    적혈구 인핸서 bcl11a의 핵산 서열에 결합하고 BCL11A 발현을 감소시키도록 조작된 gRNA;
    γ-글로빈; 및
    β-글로빈.
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PCT/US2020/040756 WO2021003432A1 (en) 2019-07-02 2020-07-02 Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements

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KR1020227003415A KR20220038362A (ko) 2019-07-02 2020-07-02 재조합 ad35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선

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US (1) US20220257796A1 (ko)
EP (1) EP3994270A1 (ko)
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IL (1) IL289518A (ko)
MX (1) MX2021015433A (ko)
SG (1) SG11202111943UA (ko)
WO (1) WO2021003432A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022220203A1 (en) * 2021-02-11 2023-08-24 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Curing disease by transcription regulatory gene editing
CA3218362A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
WO2022236174A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Washington University In situ car-t therapies, vectors and methods therefor
GB202111195D0 (en) * 2021-08-03 2021-09-15 Cergentis B V Method for targeted sequencing
CN113755447B (zh) * 2021-09-23 2022-04-29 云舟生物科技(广州)股份有限公司 一种用于生产腺病毒的293a细胞株及其制备与应用
WO2023150393A2 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Ensoma, Inc. Inhibitor-resistant mgmt modifications and modification of mgmt-encoding nucleic acids
WO2024006319A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Ensoma, Inc. Adenoviral helper vectors
CN116751799B (zh) * 2023-06-14 2024-01-26 江南大学 一种多位点双重碱基编辑器及其应用

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1999A (en) 1841-03-12 Improvement in seed-planters
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US6291161B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertiore
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5653977A (en) 1993-09-09 1997-08-05 Uab Research Foundation Anti-idiotypic antibody that mimics the GD2 antigen
EP1489097B1 (en) 1994-01-11 2011-10-19 Dyax Corporation Inhibitors of human plasmin derived from kunitz domains and nucleic acids encoding the same
US5637323A (en) 1994-11-16 1997-06-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of mobilizing pluripotential hematopoietic stem cells with IL-7
GB9424449D0 (en) 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US6051227A (en) 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5855887A (en) 1995-07-25 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US6218185B1 (en) 1996-04-19 2001-04-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Piggybac transposon-based genetic transformation system for insects
AU745049B2 (en) 1997-03-11 2002-03-07 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
US20020142462A1 (en) 1997-11-26 2002-10-03 Ildstad Suzanne T. Methods for mobilizing hematopoietic facilitating cells and hematopoietic stem cells into the peripheral blood
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6302855B1 (en) 1998-05-20 2001-10-16 Novo Nordisk A/S Medical apparatus for use by a patient for medical self treatment of diabetes
AU770718B2 (en) 1998-06-05 2004-02-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Use of genetically engineered antibodies to CD38 to treat multiple myeloma
US7160682B2 (en) 1998-11-13 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid transfer vector for the introduction of nucleic acid into the DNA of a cell
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
CN1328571B (zh) 1998-12-23 2016-08-31 辉瑞大药厂 抗ctla-4的人单克隆抗体
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
EE05673B1 (et) 1999-08-17 2013-08-15 Biogen, Inc. BAFF-retseptor (BCMA), immunoregulatoorne agens
WO2001014424A2 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
AU2001233027A1 (en) 2000-01-27 2001-08-07 Genetics Institute, Llc Antibodies against ctla4 (cd152), conjugates comprising same, and uses thereof
US7288521B2 (en) 2000-04-06 2007-10-30 Franco Wayne P Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood
US8771663B2 (en) 2000-04-18 2014-07-08 Gentium Spa Formulation having mobilising activity
US6962810B2 (en) 2000-10-31 2005-11-08 University Of Notre Dame Du Lac Methods and compositions for transposition using minimal segments of the eukaryotic transformation vector piggyBac
US7105343B1 (en) 2000-10-31 2006-09-12 University Of Notre Dame Du Lac Methods and compositions for transposition using minimal segments of the eukaryotic transformation vector Piggybac
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
WO2003042402A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof
KR100704158B1 (ko) 2001-11-19 2007-04-05 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 다분화능 줄기세포를 조직으로부터 말초혈로 동원하는약제
AU2003231048A1 (en) 2002-04-22 2003-11-03 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
DE10224242A1 (de) 2002-05-29 2003-12-11 Max Delbrueck Centrum Frog Prince, ein Transposonvektor für den Gentransfer bei Wirbeltieren
KR101348472B1 (ko) 2002-10-17 2014-01-07 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
CN1753912B (zh) 2002-12-23 2011-11-02 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
JP5026072B2 (ja) 2003-07-01 2012-09-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 二重特異性抗体の多価キャリヤー
EP1656156A2 (en) 2003-08-13 2006-05-17 Children's Hospital Medical Center Mobilization of hematopoietic cells
ES2458636T3 (es) 2003-08-18 2014-05-06 Medimmune, Llc Humanización de anticuerpos
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
BRPI0507489A (pt) 2004-02-06 2007-07-10 Morphosys Ag anticorpos humanos de anti-cd38 e para os seus usos
US8361794B2 (en) 2004-06-29 2013-01-29 Immunocore Limited Cells expressing a modified T cell receptor
EP1786918A4 (en) 2004-07-17 2009-02-11 Imclone Systems Inc NEW BISPECIFIC ANTIBODY TETRAVALENT
US7422889B2 (en) 2004-10-29 2008-09-09 Stowers Institute For Medical Research Dre recombinase and recombinase systems employing Dre recombinase
EA018897B1 (ru) 2005-01-05 2013-11-29 Ф-Стар Биотехнологише Форшунгс- Унд Энтвиклунгсгез.М.Б.Х. Молекулы иммуноглобулина, содержащие модифицированные участки структурных петель, обладающие свойством связывания, и способ их получения
GB0504767D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Ares Trading Sa Lipocalin protein
US7932088B1 (en) 2005-04-25 2011-04-26 University Of Notre Dame Du Lac High efficiency transformation of Plasmodium falciparum by the lepidopteran transposon, piggyBac
US20060252140A1 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Yant Stephen R Development of a transposon system for site-specific DNA integration in mammalian cells
CN105315373B (zh) 2005-05-09 2018-11-09 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
KR101607288B1 (ko) 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
MY169746A (en) 2005-08-19 2019-05-14 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1829895A1 (en) 2006-03-03 2007-09-05 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Bispecific molecule binding TLR9 and CD32 and comprising a T cell epitope for treatment of allergies
EP2019839B1 (en) 2006-05-25 2011-12-07 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CN101012463A (zh) * 2007-01-19 2007-08-08 安徽医科大学 HDAd/F载体及制备方法和用途
CA2684378C (en) 2007-04-26 2016-11-29 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the ppp1r12c locus
KR101562580B1 (ko) 2007-06-18 2015-10-22 머크 샤프 앤 도메 비.브이. 사람 프로그램된 사멸 수용체 ｐｄ-1에 대한 항체
JP5726522B2 (ja) 2007-07-04 2015-06-03 マックス−デルブリュック−ツェントルム フューア モレキュラーレ メディツィン トランスポゾンシステム−スリーピングビューティーのトランスポザーゼタンパク質の機能亢進性バリアント
JP4435811B2 (ja) 2007-07-06 2010-03-24 シャープ株式会社 画像通信装置
EP2198022B1 (en) 2007-09-24 2024-03-06 University Of Zurich Designed armadillo repeat proteins
WO2009074807A2 (en) 2007-12-12 2009-06-18 Imperial Innovations Limited Methods
WO2009114335A2 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Merck & Co., Inc. Pd-1 binding proteins
US8552154B2 (en) 2008-09-26 2013-10-08 Emory University Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor
WO2010051391A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Facet Biotech Corporation Use of anti-cs1 antibodies for treatment of rare lymphomas
CA2745031C (en) 2008-12-04 2018-08-14 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
SG196798A1 (en) 2008-12-09 2014-02-13 Genentech Inc Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
EP3192811A1 (en) 2009-02-09 2017-07-19 Université d'Aix-Marseille Pd-1 antibodies and pd-l1 antibodies and uses thereof
WO2010099296A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Hyperactive piggybac transposases
US8753639B2 (en) 2009-03-31 2014-06-17 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Compositions and methods for modulating the activity of complement regulatory proteins on target cells
US8647623B2 (en) 2009-04-10 2014-02-11 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method for treatment of blood tumor using anti-TIM-3 antibody
JP5336592B2 (ja) 2009-06-08 2013-11-06 公益財団法人かずさＤｎａ研究所 新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法
DE102009045006A1 (de) 2009-09-25 2011-04-14 Technische Universität Dresden Anti-CD33 Antikörper und ihre Anwendung zum Immunotargeting bei der Behandlung von CD33-assoziierten Erkrankungen
EP2504028A4 (en) 2009-11-24 2014-04-09 Amplimmune Inc SIMULTANEOUS INHIBITION OF PD-L1 / PD-L2
CN101716167B (zh) 2009-12-08 2011-12-28 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一类饱和胺类化合物在制备外周血造血干细胞动员药物中的应用
WO2011082400A2 (en) 2010-01-04 2011-07-07 President And Fellows Of Harvard College Modulators of immunoinhibitory receptor pd-1, and methods of use thereof
WO2011139335A1 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases
US8793650B2 (en) 2010-06-11 2014-07-29 Microsoft Corporation Dynamic web application notifications including task bar overlays
CA2814155C (en) 2010-06-11 2019-10-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody
WO2011159877A2 (en) 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US8907053B2 (en) 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
NZ612512A (en) 2010-12-09 2015-03-27 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
PT3459560T (pt) 2011-04-08 2021-05-24 Us Health Recetores de antigénio quimérico variante iii de recetor de fator de crescimento antiepidérmico e utilização dos mesmos para o tratamento de cancro
US9763980B2 (en) 2011-06-16 2017-09-19 Children's Medical Center Corporation Combined chemical modification of sphingosine-1-phosphate (S1P) and CXCR4 signalling pathways for hematopoietic stem cell (HSC) mobilization and engraftment
US8841418B2 (en) 2011-07-01 2014-09-23 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to TIM3
US9150847B2 (en) 2011-09-21 2015-10-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
JP6188703B2 (ja) 2011-10-27 2017-08-30 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｈｐｒｔ遺伝子座を修飾するための方法および組成物
EP2690177B1 (en) 2012-07-24 2014-12-03 Technische Universität Dresden Protein with recombinase activity for site-specific DNA-recombination
KR20230065381A (ko) 2012-07-25 2023-05-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 유도 ｄｎａ 결합 단백질 및 게놈 교란 도구 및 이의 적용
CA3177394A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
PT2893004T (pt) 2012-09-04 2019-01-21 Cellectis Recetor de antígeno quimérico de cadeia múltipla e utilizações do mesmo
EP2914628A1 (en) 2012-11-01 2015-09-09 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin An antibody that binds cd269 (bcma) suitable for use in the treatment of plasma cell diseases such as multiple myeloma and autoimmune diseases
EP3045537A1 (en) 2012-12-12 2016-07-20 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP2931898B1 (en) 2012-12-12 2016-03-09 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EP4299741A3 (en) 2012-12-12 2024-02-28 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093635A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
KR20150131208A (ko) 2013-03-13 2015-11-24 이미지냅 인코포레이티드 Cd８에의 항원 결합 구조체들
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
BR112015027567B1 (pt) 2013-05-03 2024-02-20 Ohio State Innovation Foundation Polipeptídeo, sequência de ácido nucleico isolada, vetor, método de obtenção de célula, uso de uma célula
BR112015031611A2 (pt) 2013-06-17 2017-12-12 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para direcionamento e modelação de doenças e distúrbios de células pós-mitóticas
MX2015017313A (es) 2013-06-17 2016-11-25 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
EP3011031B1 (en) 2013-06-17 2020-09-30 The Broad Institute Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
DK3011029T3 (da) 2013-06-17 2020-03-16 Broad Inst Inc Administration, modificering og optimering af tandem-guidesystemer, fremgangsmåder og sammensætninger til sekvensmanipulering
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
EP4219699A1 (en) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
ES2765481T3 (es) 2013-12-12 2020-06-09 Broad Inst Inc Administración, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas crispr-cas y composiciones para la edición genómica
KR20160097327A (ko) 2013-12-12 2016-08-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법
BR112016013547A2 (pt) 2013-12-12 2017-10-03 Broad Inst Inc Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos
JP2017501149A (ja) 2013-12-12 2017-01-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 粒子送達構成成分を用いた障害及び疾患の標的化のためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
JP2017527256A (ja) 2013-12-12 2017-09-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ＨＢＶ及びウイルス性疾患及び障害のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
US20170037431A1 (en) * 2014-05-01 2017-02-09 University Of Washington In vivo Gene Engineering with Adenoviral Vectors
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
EP3227324A4 (en) 2014-12-05 2018-08-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies targeting g-protein coupled receptor and methods of use
GB201503742D0 (en) 2015-03-05 2015-04-22 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
SG10201914069SA (en) 2015-05-18 2020-03-30 Tcr2 Therapeutics Inc Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US20190225955A1 (en) 2015-10-23 2019-07-25 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
US20190233814A1 (en) 2015-12-18 2019-08-01 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP3405570A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 The Broad Institute, Inc. Crystal structure of crispr cpf1
AU2017240150C1 (en) 2016-04-01 2022-10-27 Kite Pharma, Inc. BCMA binding molecules and methods of use thereof
CR20210084A (es) 2016-04-01 2021-03-26 Amgen Inc Receptores quiméricos y métodos de uso de los mismos (divisional 2018-0480)
BR112018070073A2 (pt) 2016-04-01 2019-02-12 Kite Pharma, Inc. receptores de antígeno quimérico e célula t e métodos de uso
SG10202010311SA (en) 2016-04-19 2020-11-27 Broad Inst Inc Novel Crispr Enzymes and Systems
WO2017189901A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Baylor College Of Medicine Silencing transgene expression during vector production
US20190345450A1 (en) 2016-06-17 2019-11-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Strategies to assess and/or produce cell populations with predictive engraftment potential
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
CA3031414A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 The General Hospital Corporation Variants of crispr from prevotella and francisella 1 (cpf1)
AU2017306432A1 (en) 2016-08-02 2019-03-21 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
TWI695010B (zh) 2016-09-28 2020-06-01 美商凱特製藥公司 抗原結合分子類和使用彼等之方法
EP3445787B1 (en) 2016-10-07 2020-12-02 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor

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