CN101012463A - HDAd/F载体及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种表达RSV F蛋白的HDAd/F载体，由HDAd载体质粒和含有编码RSV F蛋白基因的HDAd穿梭质粒构建、辅助病毒辅助得到的载体，包括左、右侧末端倒置重复序列ITRs，包装信号ψ，在I－Sce I和I－Ceu I之间插入RSV F基因表达盒，该腺病毒载体需要辅助病毒为其提供全部的结构和功能蛋白，方能完成复制过程。因安全、高效、转移容量大和持续表达等特点，可作为表达RSV F等蛋白的载体用于RSV疫苗的研究来预防不同亚型的RSV感染。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种用于基因疫苗的载体及制备方法，确切地说是一种表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，RSV)(以下简称RSV)融合蛋白(fusionprotein，F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)(以下简称HDAd/F)，即HDAd/F载体及其制备方法和用途。
二、背景技术
RSV是一个世界范围内严重危害婴幼儿健康的最常见的呼吸道感染性病原体，首次感染多发生在一岁以内的婴儿，尤其是2～6个月的婴幼儿，是造成婴儿期住院的主要原因。同时RSV引起的肺炎也是老年人群住院和死亡的重要原因。至今尚无有效的预防和治疗手段。
RSV属于副粘病毒属，根据G蛋白抗原性的差异将RSV分为A、B两个亚型，基因组为单股负链RNA，编码11种蛋白，包括7种结构蛋白(SH、G、F、M、N、P、L)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、M2-1、M2-2)。其中G、F系包膜糖蛋白，为RSV中和抗原，能诱导产生中和抗体。F蛋白所诱导的中和抗体可以同时抑制A、B两个亚型的病毒感染，而G蛋白所诱导的中和抗体则具有亚型特异性。因此，无论从诊断试剂研制还是从亚单位疫苗的开发的角度，F蛋白都比G蛋白具有优势，对F蛋白结构和功能的研究对于呼吸道合胞病毒的预防、诊断和治疗都具有重要的意义。
目前正在研究的RSV疫苗有减毒活疫苗、亚单位疫苗、重组病毒疫苗和DNA疫苗等，减毒活疫苗和亚单位疫苗已进入临床实验阶段，特别是纯化的F蛋白亚单位疫苗已经在成人、大于12个月婴幼儿及有慢性肺部疾病儿童、住院的老年人和孕妇中进行了评估。但这些疫苗因安全稳定性差或效果不理想难以用于年龄较小的婴幼儿和免疫力低下的新生儿。
本发明所用的辅助病毒依赖型腺病毒载体，俗称“无肠型(gutless)”载体，仅含有腺病毒复制信号(ITRs)和包装信号(Ψ)，缺乏所有腺病毒编码基因，需要辅助病毒为其提供全部的结构和功能蛋白，方能完成复制过程，其结构如图1所示。因安全、高效、转移容量大和持续表达等特点，现主要用于基因治疗的研究，HDAd作为疫苗的研究起步较晚，2004年底在Gene Therapy杂志发表了第一篇通过肌肉注射途径诱导系统免疫的研究论文，与E1区缺失的非复制型腺病毒载体(First-Generation Adenovirus Vector，FGAd)相比，HDAd具有更强的诱导机体产生针对转基因CTLs及抗体应答的能力。
本发明所称的辅助病毒是缺失E1区的第一代5型腺病毒，含有5型腺病毒所有的结构和功能蛋白，其特点在于它的包装信号(Ψ)两端各插入一个loxP位点，感染293Cre4细胞后，通过Cre重组酶介导的顺式剪切作用，辅助病毒的包装信号(Ψ)被剪切，不能完成包装过程，但是可以为HDAd/F载体的复制提供所有的结构和功能蛋白，完成HDAd/F的复制过程，其结构如图2所示。
本发明所用的pCDNA3.1(+)/F重组质粒由本实验室等构建(参见袁媛，何金生，张梅等.人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定.免疫学杂志，2006，22(3)：330-333)
本发明所使用的pSC9A、pSC11、pSC15B由石长信博士构建(参见Shi CX，Graham FL andHitt MM.A convenient plasmid system for construction of helper-dependent adenoviralvectors and its application for analysis of the breast-cancer-specific mammaglobinpromoter.J Gene Med，2006.8(4)：442-451.)
三、发明内容
本发明针对现有疫苗存在的缺点和不足，提供一种以HDAd载体来表达RSV F蛋白(以下简称F蛋白)的HDAd/F载体，旨在制备成各种剂型的RSV基因工程疫苗，从而预防RSV的感染，减少发病率和死亡率。所要解决的技术问题是将F蛋白克隆到HDAd载体质粒中，然后制备HDAd/F载体。
本发明所称的表达RSV F蛋白的HDAd/HRSV F载体(即HDAd/F载体)，由HDAd载体质粒和含有编码RSV F蛋白基因的HDAd穿梭质粒构建、辅助病毒辅助得到的载体，其特征在于包括左、右侧的末端倒置重复序列ITRs，包装信号Ψ，在I-Sce I和I-Ceu I之间插入F基因表达盒，该表达盒的基因转录启动子为巨细胞病毒CMV立即早期启动子，基因转录的加尾信号为SV-40病毒多聚腺苷化的加尾信号PA。
本发明所称的HDAd/F载体的制备方法，其特征在于它按下述步骤进行：
a)用Mlu I和Xba I分别双酶切pCDNA3.1(+)/F和pSC11，回收目的片段以后，将含有CMV启动子的F基因与线性化的pSC11进行连接，得到插入有F基因的pSC11/F重组穿梭质粒。
b)Nhe I和Pme I酶切pSC11/F，T4 DNA polymerase、T4 DNA Ligase分别进行末端补平及连接，去除Pme I酶切位点，获得质粒pSC11/F Nhe I-Pme I。
c)用I-Sce I和I-Ceu I酶切pSC11/F Nhe I-Pme I和pSC15B，切胶回收目的片段，再与线性化的pSC15B进行连接，获得重组质粒pSC15B/F。
d)用Pme I酶切消化pSC15B/F，获得HDAd/F DNA分子，经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞，16h后感染辅助病毒，约24～72h后，收获HDAd/F载体粗提液，随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限，同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。
e)大量制备HDAd/F，CsCl不连续密度梯度及等密度梯度两次超速离心纯化，利用分子生物学技术体外鉴定HDAd/F表达情况。
本发明的技术方案采用基因工程方法制备的HDAd/F载体的用途，就在于本HDAd/F载体在制备预防RSV感染疫苗中的应用，它针对了RSV的生物学与免疫学特点，即RSV通过呼吸道感染，呼吸道的局部粘膜免疫起主要的保护作用，而HDAd具有粘膜感染的特点，可以刺激局部粘膜产生粘膜免疫和系统免疫，从而保护机体免受RSV的危害。
本HDAd/F载体可与医学上许可的赋型剂制成滴鼻剂、喷雾剂、注射剂或者口服剂。
由于采取了上述技术方案，使本发明技术与已有的技术相比具有如下优点及效果：
1)安全性。HDAd感染细胞后，不具备复制能力，不能合成或表达任何腺病毒结构和功能蛋白，也不存在回复复制型腺病毒(replication competent adenovirus，RCA)的可能性，因此应用于免疫力低下的新生儿时，其安全性较E1区缺失的FGAd进一步提高。同时，FGAd低水平表达腺病毒基因，可造成对转导细胞的直接毒性作用及对病毒载体和转导细胞的免疫清除作用，并导致炎性损伤、转基因表达短暂和病毒载体难以重复应用。研究显示HDAd可较好避免上述情况发生，克服腺病毒载体存在的病毒性问题、有利于重复应用。
2)高效黏膜基因转染系统。HDAd与FGAd具有相同的细胞嗜性，通过对呼吸道上皮细胞的高效感染，可方便的将转基因携带到细胞内进行表达，从而克服裸DNA疫苗难以进入细胞内及不能直接用于黏膜免疫的缺点。通过滴鼻途径进行接种，与RSV的自然感染途径相同，适于预防通过呼吸道感染的RSV，痛苦小，便于早期应用。
3)长期、持续表达转基因，刺激机体针对RSV中和抗原产生较强的免疫应答。HDAd缺失了所有腺病毒编码序列，不能在感染细胞内合成(denovo)腺病毒的结构和功能蛋白，可避免机体产生抗腺病毒免疫应答，尤其是CTLs介导的腺病毒特异性的细胞免疫应答，克服机体对病毒载体的免疫清除作用，使HDAd在细胞内可长期存在。与FGAd相比，HDAd表达HRSV中和抗原的时间将显著延长，能持续表达一个月甚至两年以上。
4)产生增强的Th1型免疫应答，避免因RSV疫苗引起的疾病增强作用。证据表明与FGAd相比，HDAd可诱导机体免疫系统产生更强的由CTLs介导的细胞免疫应答。
5)HDAd可转移的转基因容量高达37kb，能发展为同时表达RSV多种抗原或不同病毒抗原的新型多价疫苗载体。研究表明，大多数RSV蛋白像中和抗原G和F蛋白一样，作为免疫原均可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答。多种靶抗原同时刺激机体免疫系统，将有助于诱导机体产生强大、特异和平衡的免疫应答。
6)该病毒载体活性高，易保存，经细胞培养纯化后的HDAd/F载体即为疫苗本身，制作的方法简单，成本低，可与医学上许可的赋型剂制成滴鼻剂、喷雾剂、注射剂或者口服剂，方便易感人群使用。
四、附图说明：
图1辅助病毒依赖型腺病毒载体结构示意图：
腺病毒复制信号ITRs，包装信号Ψ，非腺病毒DNA序列stuffer DNA；
图2辅助病毒结构示意图：
腺病毒复制信号ITRs，包装信号Ψ，可被Cre重组酶剪切的loxP位点，ΔE1代表E1区缺失。
图3制备HDAd/F的Cre/loxP系统示意图
先用Pme I酶切消化的pSC15B/F重组质粒转染293Cre4细胞，随后以辅助病毒进行感染，其中辅助病毒的包装信号镶嵌于loxP位点之间。通过Cre重组酶介导的顺式剪切作用，辅助病毒的包装信号被剪切，不能完成包装过程，但可为HDAd/F载体的复制提供所有必需的反式作用因子，完成HDAd/F载体的包装过程。ΔΨ代表包装信号被剪切。
图4 pSC11/F酶切鉴定结果
1：DL2000 marker；2：EcoR V酶切pSC11/F；3：DL15000 marker；
图5 pSC11/F Nhe I-Pme I酶切鉴定结果
1：DL15000 marker；2：Pme I和Xba I酶切pSC11/F Nhe I-Pme I；3：Pme I和Xba I酶切pSC11/F；
图6 pSC15B/F酶切鉴定结果
1：BamH I 2：EcoR I 3：EcoR V 4：Hind III 5：Pst I 6：GeneRulermarkerTM10kb marker；
图7 RT-PCR鉴定F蛋白的转录结果
1：PCR扩增细胞总RNA(阴性对照)；2：RT-PCR结果；3：DL2000 marker；
图8 Western blotting鉴定F蛋白表达结果
1：蛋白marker；2：RSV感染HEp-2细胞(阳性对照)；3：HDAd/F重组体感染293细胞；4：293细胞(阴性对照)。
五、具体的实施方式
1.2.1 HDAd重组质粒pSC15B/F的构建
用Mlu I和Xba I分别酶切pCDNA3.1(+)/F和pSC11，回收目的片段，将含有CMV启动子的F基因与线性化的pSC11进行连接、转化、挑菌和摇菌，然后小提质粒用EcoR V进行鉴定，获得的重组穿梭质粒命名为pSC11/F。
Nhe I和Pme I酶切pSC11/F，T4 DNA polymerase、T4 DNA Ligase分别进行末端补平及连接，去除Pme I酶切位点，获得的重组质粒命名为pSC11/F Nhe I-Pme I。
用I-Sce I和I-Ceu I酶切pSC11/F Nhe I-Pme I和pSC15B，切胶回收目的片段，进行连接、转化、挑菌和摇菌。小提质粒分别用BamH I、EcoR I、EcoR V、Hind III和Pst I进行酶切鉴定，并将重组质粒取名为pSC15B/F。
1.2.2 HDAd/F载体的获得
取pSC15B/F重组质粒，Pme I酶切消化，待293Cre4细胞丰度达到90％时，进行转染。转染后第二天，弃掉培养液，加入含2％FCS的DMEM维持液。取辅助病毒，按moi 5.0 pfu/细胞感染293Cre4细胞，置37℃ CO2培养箱继续培养。约24～72h后，细胞完全病变、脱落，收集脱落后的细胞及上清，转移至15ml离心管中，2000rpm，离心5min。弃部分上清，保留约4ml，用吸管重悬沉淀，-80℃冰箱，冻存30min，37℃水浴融化，获得P0代HDAd/F载体粗提液，取1ml接种至形成单层、含2％FCS DMEM维持液的293Cre4细胞中，同时按moi 2.0pfu/细胞加入辅助病毒，37℃、CO2培养箱继续培养至细胞病变。约48h后，细胞完全病变、脱落，按上法处理293Cre4细胞，重复6轮获得P6代HDAd/F粗提液。
同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体(Pme I线性化pSC9A)作为平行对照监测载体复制过程。
1.2.3 HDAd/载体大量制备及纯化
用30个150×20mm培养皿培养293Cre4细胞，待细胞丰度约为90％时，取HDAd/F和辅助病毒共感染293Cre4细胞，约48-72h后，收获细胞及培养液。CsCl不连续密度梯度及等密度梯度法两次超速离心纯化HDAd/F载体，样品在4℃、10mM Tris-HCl(pH8.0)中透析24h，期间换液三次，紫外分光光度计测定OD260值并计算HDAd/F载体颗粒浓度，其余放-80℃保存备用。
1.2.4 RT-PCR鉴定
HDAd/F载体感染293细胞72小时，弃去病毒维持液，提取细胞的总RNA，于-80℃保存备用。
根据已克隆鉴定的F基因序列合成一对引物：上游引物(nt1-nt19)5’ATGGAGTTGCCAATCCTCA 3’，下游引物(nt741-nt721)5’TACAGG TGTAGTTACACCTG 3’。以细胞的总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明书进行操作，PCR反应条件：94℃预变性3min；93℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。于1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。同时用总RNA为模板，直接PCR扩增作为阴性对照，结果见图7。
1.2.5 Western blotting鉴定
纯化的HDAd/F载体感染293细胞后48h，收获细胞，用预冷的PBS清洗3次，然后弃去上清，加入150μl的细胞振荡混匀，反复冻融3次，14000r/min、30min，取上清，进行SDS-PAGE电泳，转膜后用RSV多抗进行Western blotting分析，用ECL检测试剂盒检测，暗室内用X线片曝光并显影和定影。以正常培养的293细胞为阴性对照，RSV感染的HEp-2细胞作为阳性对照，结果见图8。
Claims (3)
1、一种表达RSV F蛋白的HDAd/F载体，由HDAd载体质粒和含有编码RSV F蛋白基因的HDAd穿梭质粒构建、辅助病毒辅助得到的载体，其特征在于包括左、右侧的末端倒置重复序列ITRs，包装信号Ψ，在I-Sce I和I-Ceu I之间插入F基因表达盒，该表达盒的基因转录启动子为巨细胞病毒CMV立即早期启动子，基因转录的加尾信号为SV-40病毒多聚腺苷化的加尾信号PA。
2、如权利要求1所述HDAd/F载体的制备方法，其特征在于它按下述步骤进行：
a)用Mlu I和Xba I分别双酶切pCDNA3.1(+)/F和pSC11，回收目的片段以后，将含有CMV启动子的F基因与线性化的pSC11进行连接，得到插入有F基因的pSC11/F重组质粒，
b)Nhe I和Pme I酶切pSC11/F，T4 DNA polymerase、T4 DNA Ligase分别进行末端补平及连接，去除Pme I酶切位点，获得质粒pSC11/F Nhe I-Pme I，
c)用I-Sce I和I-Ceu I酶切pSC11/F Nhe I-Pme I和pSC15B，切胶回收目的片段，再与线性化的pSC15B进行连接，获得重组质粒pSC15B/F，
d)用Pme I酶切消化pSC15B/F，获得HDAd/F DNA分子，经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞，16h后感染辅助病毒，约24～72h后，收获HDAd/F载体粗提液，随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至获得P6代HDAd/F。
3、如权利要求1所述的HDAd/F载体的用途，其特征在于HDAd/F载体在制备预防RSV感染疫苗中的应用。
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Cited By (3)
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| CN102517330A (zh) * | 2011-12-12 | 2012-06-27 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种腺病毒载体及其在制备hcv细胞和小鼠模型中的应用 |
| CN105431169A (zh) * | 2012-03-22 | 2016-03-23 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 抗rsv疫苗 |
| CN114729383A (zh) * | 2019-07-02 | 2022-07-08 | 弗莱德哈钦森癌症研究中心 | 重组ad35载体及相关基因疗法改进 |
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2007
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