CN111549065B - 应用腺病毒转导制备能够表达人源apn转基因非人动物的方法，及所得动物的应用 - Google Patents

应用腺病毒转导制备能够表达人源apn转基因非人动物的方法，及所得动物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物模型领域，具体而言，涉及一种应用腺病毒转导制备能够表达人源APN转基因非人动物的方法，及所得动物的应用。其中该腺病毒由pShuttle‑hAPN与pAdEasy‑1重组得到的重组载体在AD293细胞中拯救得到，所述pShuttle‑hAPN为插入有所述人源APN的DNA序列的pShuttle；所述腺病毒在转导所述动物后，所述动物的呼吸道细胞表达人源APN蛋白。该方法具有快速，易于获得和制备等优点。

Description

应用腺病毒转导制备能够表达人源APN转基因非人动物的方 法，及所得动物的应用
技术领域
本发明涉及动物模型领域，具体而言，涉及一种应用腺病毒转导制备能够表达人源APN转基因非人动物的方法，及所得动物的应用。
背景技术
人冠状病毒是常见和重要的呼吸道病毒。从二十世纪六十年代至今，可以感染人类的冠状病毒共有7种，其中Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus(SARS-CoV)、Middle East Respiratory Syndrome coronavirus(MERS-CoV)是高致病性冠状病毒，SARS-CoV-2病死率低于SARS，但传播性强。229E、NL63、OC43、HKU1属于低致病性冠状病毒，感染人后症状较轻，是自限性的呼吸道疾病，约占三份之一的病毒性感冒。但在老年人、儿童、免疫缺陷患者，可引起危及生命的肺炎和支气管炎。
冠状病毒属于冠状病毒科家族，是一组有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长度在26-32kb，是迄今已知基因组最大的RNA病毒。基于整个病毒基因组序列的比较，冠状病毒分为4个属：α、β、γ和δ。229E、NL63属于α属，OC43、HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2属于β属。
229E最早发现于1966年，从普通感冒患者的呼吸道中分离得到。
病毒进入细胞依赖于刺突(Spike，S)蛋白和细胞表面受体的结合，受体分布决定了病毒的宿主范围和跨物种感染。一些冠状病毒采用细胞表面酶作为受体，比如229E使用氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)作为受体，SARS-CoV、NL63和SARS-CoV-2使用血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)作为受体，MRES-CoV使用二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)为受体。申请人团队Zhao等人前期利用腺病毒转导hDPP4小鼠的MERS-CoV的动物模型，成功研发国际首个MERS小鼠模型，表明此种方法构建动物模型快速有效。
研究表明表达hAPN的原代胚胎成纤维细胞在体外对229E易感，但是hAPN转基因小鼠在体内对229E不易感。I型和II型干扰素参与宿主抗病毒反应，两种干扰素都需要磷酸化和信号转导及转录激活蛋白1(signal transducers and activators of transcription，Stat1)的活化，由于干扰素反应受损，Stat1敲除鼠对微生物和病毒高度易感。为了克服hAPN转基因小鼠在体内对229E不易感，Caroline Lassnig等人构建了hAPN转基因、同时stat1敲除小鼠(hAPN+/+Stat1-/-)。229E对hAPN+/+或者hAPN+/+Stat1-/-原代胚胎成纤维细胞高度易感。然而，只有当229E在hAPN+/+Stat1-/-原代胚胎成纤维细胞适应后，229E才能感染hAPN+/+Stat1-/-小鼠，比较繁琐，因此限制了其应用。
发明内容
本发明涉及应用腺病毒转导制备能够表达人源APN转基因非人动物的方法，其中该腺病毒由pShuttle-hAPN与pAdEasy-1重组得到的重组载体在AD293细胞中拯救得到，所述pShuttle-hAPN为插入有所述人源APN的DNA序列的pShuttle；
所述腺病毒在转导所述动物后，所述动物的呼吸道细胞表达人源APN蛋白。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及依照如上所述的方法获得的转基因非人动物在构建人类冠状病毒229E感染疾病模型中的应用。
本发明利用pAdEasy系统将人类冠状病毒229E受体基因人源APN重组至5型腺病毒载体，在AD293细胞中拯救Ad5-APN重组腺病毒，从而将腺病毒转导非人动物，使其呼吸道特别是肺部表达人APN受体，而后进行病毒感染。该人类冠状病毒229E感染小鼠动物模型，可广泛应用于疫苗和治疗药物评估，以及致病机制研究。该方法具有快速，易于获得和制备等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中利用pAdEasy系统成功构建重组腺病毒质粒Ad5-hAPN和Ad5-Empty的酶切鉴定结果；
图2为本发明一个实施例中CsCl纯化腺病毒Ad5-hAPN和Ad5-Empty结果；
图3为本发明一个实施例中hAPN体外表达鉴定结果；
图4为本发明一个实施例中免疫组化鉴定APN在小鼠肺部表达结果；
图5为本发明一个实施例中小鼠感染后肺内229E病毒复制情况；A.小鼠感染229E后肺组织肉眼病变；B.小鼠感染229E后体重变化；C.小鼠感染229E后病毒生长曲线；本实验中的统计学差异分析采用是upaired t test，P＜0.05作为组间具有统计学显著性差异的标准，P＜0.0332(*)、P＜0.0021(**)、P＜0.0002(***)、P＜0.0001(****)。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及应用腺病毒转导制备能够表达人源APN转基因非人动物的方法，其中该腺病毒由pShuttle-hAPN与pAdEasy-1重组得到的重组载体在AD293细胞中拯救得到，所述pShuttle-hAPN为插入有所述人源APN的DNA序列的pShuttle；
所述腺病毒在转导所述动物后，所述动物的呼吸道细胞表达人源APN蛋白。
通过表达人源APN的腺病毒转导构建小鼠模型的方式，则更加快速、易于操作，转导后5天即可攻毒，在爆发新发突发呼吸道传染病时，可以快速构建小鼠模型，有利于抗病毒药物和保护性中和抗体、疫苗的应急体内验证，以及体内免疫应答和致病机制的研究。
在本发明中，术语“呼吸道”可以包括下述的三部分：
·上呼吸道：鼻、鼻道、鼻窦、喉和咽。
·气管：喉结、气管、支气管和次级支气管。
·肺：小支气管、肺泡管和肺泡。
术语“转基因”在用于本文时描述人工插入细胞特别是哺乳动物细胞的基因组中用于植入存活动物的遗传材料。对于特定国家，可能必需由这个方面专门排除某些主题，例如人的全能干细胞，受精卵等。
“转基因动物”指在其部分细胞中具有非内源(即异源)核酸序列作为染色体外元件中的非人动物，通常是哺乳动物，优选啮齿动物，再优选小鼠(Mus musculus)，且最优选B6小鼠。
质粒pAdEasy-1为缺失E1区和E3区5型野生型腺病毒(Ad5dE1/3)基因组质粒，带有氨苄青霉素抗性基因。
在一些实施方式中，所述重组载体的构建方法包括：
将pAdEasy-1与线性化的pShuttle-hAPN共转化至BJ5183感受态细胞；
其中线性化的pShuttle-hAPN为所述pShuttle-hAPN由PmeI酶切位点断开得到。
在一些实施方式中，所述pAdEasy-1与所述线性化的pShuttle-hAPN以1:(1～5)的浓度比共转化；还可以1:2、1:3、1:4的质量比共转化。
在一些实施方式中，将所述BJ5183感受态细胞培养8h～16h，随后挑选10～20个最小的单克隆接种至含Kana+的LB培养基培养≤8h。
在一些实施方式中，所述重组载体在XL-Blue感受态细胞中扩增后在AD293细胞中拯救腺病毒，将拯救得到病毒进行扩增与纯化。
在一些实施方式中，所述扩增过程采用D2培养基。
在一些实施方式中，所述拯救腺病毒的步骤包括：
将所述AD293细胞在培养容器中培养至细胞融合度50％～70％后清洗，更换为Opti-MEM培养基，待细胞适应后将细胞转染液滴加至细胞培养液中转染3.5h～4.5h；
转染结束后换液培养至出现细胞病变，收集病毒；
其中，以所述培养容器为T75培养瓶计算，每瓶细胞的转染终体系中含有：
Opti-MEM培养基8.5mL～12.5mL、线性化的所述重组载体9μg～13μg、PEI30μg～36μg。
在一些实施方式中，转染结束后换液培养所用的培养基为D10培养基。
在一些实施方式中，以所述培养容器为T75培养瓶计算，每瓶细胞的转染终体系中含有：
Opti-MEM培养基9.5mL～11.5mL、线性化的所述重组载体10μg～12μg、PEI 32μg～34μg。
腺病毒可通过多种途径施用于动物，优选为鼻腔滴注进行。
在一些实施方式中，所述鼻腔滴注的滴注量为(1～4)×108FFU/(50μl～100μl)的腺病毒。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及依照如上所述的方法获得的转基因非人动物在构建人类冠状病毒229E感染疾病模型中的应用。
人类冠状病毒229E可通过多种途径施用于动物，优选为鼻腔滴注进行。
在一些实施方式中，所述鼻腔滴注人类冠状病毒229E的浓度为(1～3)×106TCID50/mL，接种量为50μl～100μl。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1重组载体的构建
一般情况而言，当腺病毒载体容纳外源基因长度越长，重组效率越低。hAPN构建至穿梭质粒pShuttle后与骨架质粒pAdEasy-1重组，具有一定概率性，本发明对每个步骤进行优化，提高了pShuttle-hAPN与pAdEasy-1的重组效率，具体步骤如下：
1.试剂盒大提pAdEasy-1质粒
pAdEasy-1骨架质粒分子量约33kb，本发明用Macherey-Nagel公司的NucleoBondBAC100提大分子的大量提取质粒试剂盒提取pAdEasy-1，获得高质量pAdEasy-1的质粒，操作步骤见试剂盒说明书。
2.pShuttle-hAPN的构建和提取
2.1 PCR扩增hAPN基因(GenBank:NM_001150.3)
参照NEB公司的Q5 High-Fidelity 2X Master Mix试剂盒说明书进行操作，以pENTR-hAPN-flag质粒为模板，扩增hAPN基因，目的片段长度约为3000bp。
PCR扩增体系：
PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸2min。
2.2按照试剂盒说明书进行PCR产物纯化
2.3分别酶切pShuttle载体和hAPN
37℃酶切2h，分别电泳回收载体hAPN片段，并定量。
2.4连接、转化、挑选单克隆菌落鉴定
连接反应体系：载体与目的基因以摩尔比1:5连接；
16℃连接过夜，转化至Stbl3感受态细胞，次日挑选单克隆菌落进行菌液PCR鉴定。最终测序验证是否构建成功。
2.5pShuttle-hAPN提取
pShuttle载体的完整性对于有效的重组很重要，用常规柱提法试剂盒小量提取容易产生显著数量的单链缺口，导致重组失败，因此本实验采用手提法取pShuttle质粒。步骤如下：
(1)将含质粒的菌种接种于含有3mL LB培养液(Kana+)的15mL离心管中，37℃震荡培养12-16h。
(2)以10000×g离心1min，收集菌体。
(3)倒弃培养基，并反扣于吸水纸以吸尽残液。加入250μL Buffer P1/RNase A混和液，涡漩重悬细菌。
(4)往重悬液中加入250μL Buffer P2，轻轻颠倒离心管8-10次。
(5)加入350μL BufferP3，立即颠倒8-10次让溶液彻底中和。以上Buffer使用均采用天根公司质粒提取试剂盒所提供试剂。
(6)4℃，12000×g离心10min。
(7)量取上清液至新的EP管中，加入0.7倍体积异丙醇，充分混匀置于-20℃中15-30min(可以长于1h)。
(8)4℃，12000×g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴。
(9)加入500μL的75％乙醇，4℃，12000×g离心10min，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴。
(10)于室温下将EP管开盖并置于实验桌上以使残留的液体挥发至干。
(11)加适量的(通常为20μL)灭菌水(55℃预热)溶解沉淀。
3.线性化pShuttle和pShuttle-hAPN质粒
1)用PmeI酶将pShuttle-hAPN质粒线性化，反应体系如下
37℃酶切1h，酶切后进行产物纯化。
4.酶切产物纯化(乙醇沉淀法)
用乙醇沉淀法，不用柱子纯化，避免产生单链缺口。
(1)加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L，pH＝5.2)于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3mol/L；
(2)加入2.5倍体积预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15-30min(可以长于1h)；
(3)4℃，12000×g离心10min，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
(4)加入500μL的75％乙醇，12000×g离心2min，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
(5)于室温下将开盖的EP管置于通风橱中约5min以使残留的液体挥发至干；
(6)加适量的灭菌水(55℃预热)溶解DNA沉淀；
5.线性化的pShuttle-hAPN和pShuttle质粒分别与pAdEasy-1共转化至BJ5183热转感受态细胞
BJ5183热转感受态细胞的转化效率是决定重组的重要因素，因此购买高质量的BJ5183热转感受态细胞。同时还需要考虑线性化pShuttle质粒和pAdEasy-1加入比例，当重组不成功时，线性化pShuttle质粒和pAdEasy-1加入比例可进行调整，按照BJ5183感受态说明书进行转化，加入质粒比例如下：
复苏后涂Kana+平板(2-5块平板)，倒置培养过夜(16-20h)。
6.提质粒进行酶切鉴定
转化后，培养过夜，在平板上挑选10-20个最小的单克隆接种至含Kana+的LB培养基培养8h(不超过8h，防止过度重组)进行手提质粒，操作步骤参照2.5，进行手提质粒。用PacI内切酶鉴定质粒是否重组成功，pShuttle与pAdEasy-1存在两种重组方式，如果是复制起始位点Ori与右臂之间进行重组，PacI酶切质粒后产生30kb和4.5kb片段，如果是左臂和右臂之间进行重组，PacI酶切质粒后产生30kb和3kb片段，两种重组方式均正确。结果见图1，酶切验证表明重组成功。
酶切体系如下：
37℃酶切30min，跑电泳鉴定。
7.转化至XL-Blue感受态细胞进行质粒扩增
BJ5183适合重组质粒，不适合扩增质粒，将酶切鉴定发生重组的质粒转化至XL-Blue感受态细胞，挑选单克隆，提质粒，再次PacI酶切鉴定，最终测序验证是否正确重组。
实施例2重组腺病毒拯救、扩增及纯化
在AD293细胞中拯救重组腺病毒Ad5-hAPN和Ad5-Empty和进行3-4轮扩增
1.Ad5-hAPN、Ad5-Empty重组腺病毒质粒在AD293细胞中拯救腺病毒，一般需要14-20天，时间较长。
能否拯救成功，跟细胞状态、转染效率有关，此外需要有耐心等至病变。
具体步骤如下：
1)AD293细胞以3×106铺至T75培养瓶，培养20h左右，细胞密度约70％(50％-70％密度转染为佳)；
2)转染：A液:1.5mL Opti-MEM与11μg线性化质粒混匀后室温孵育5min；B液:1.5mLOpti-MEM与33μg PEI混匀后室温孵育5min；C液:A液加入B液，涡旋混匀，室温孵育15-30min。
3)孵育过程中，用12mL预热的DMEM洗细胞一次，弃掉DMEM，加入预热的7.5mLOpti-MEM，37℃孵育10min。
4)37℃孵育10min后，将孵育好的C液缓慢滴加至T75细胞中，轻柔混匀。
5)转染4h后换液，加入12mL预热的D10。
6)每隔4天补3mL D10，并观察是否有病变产生。
7)18天后可见细胞病变(一般是14-20天)，将细胞吹打下来，800g，4℃离心10min，弃大部分上清，留3mL上清重悬沉淀。
8)4轮反复冻融(-80℃/37℃)，800g，4℃离心10min，收集上清，此为P0代病毒，分装冻存于-80℃。
2.P1代腺病毒扩增
1)AD293细胞以3×106铺至T25培养瓶，培养24h左右，细胞密度约80％-90％。
2)接毒：500μL P0代病毒与500μL D2培养基1:1混匀，共1mL，弃细胞上清，接种病毒至细胞，37℃孵育1h，1h后补5mL D2，放入37℃培养箱培养。
3)每日观察病变，待90％以上的细胞发生病变，大概需要1周时间，收集细胞，800g，4℃离心10min，弃大部分上清，留1.5mL上清重悬沉淀。
4)4轮反复冻融(-80℃/37℃)，病毒释放至上清，800g，4℃离心10min，收集上清，弃沉淀，此为P1代病毒，分装冻存于-80℃。
3.P2-P4代腺病毒扩增
重组腺病毒经过P1代扩增，病毒滴度上升，需稀释病毒进行扩增培养，每扩增一轮病毒滴度提高10倍-100倍。用D2培养基10倍梯度稀释病毒，分别稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，以接毒后72h左右，90％细胞发生病变的稀释比例为最佳稀释比例(MOI约等于10)，此稀释比例接毒，产毒量较高。一直扩增到P4代，大量扩增腺病毒。
4.Ad5-hAPN和Ad5-Empty大量扩增
1)AD293细胞以1.2×107铺至150mm皿培养皿，一共培养80皿细胞，培养24h左右，细胞密度约90％。
2)提前摸好最佳稀释比例接毒(以接毒后72h左右，90％细胞发生病变的稀释比例为最佳稀释比例，MOI约等于10)，每个皿接6mL稀释好的腺病毒，37℃孵育1h，1h后补24mLD2培养基。
3)接毒后72h左右，待90％细胞发生病变，800g，4℃离心10min，收集细胞，40mLDPBS重悬细胞。
4)4轮反复冻融(-80℃/37℃)，转移至2mL离心管，12000rpm，4℃离心10min，取上清进行纯化。
5.Ad5-hAPN和和Ad5-Empty病毒纯化
1)制备CsCl不连续密度梯度：在超速离心管(Beckman ultra-ClearTMcentrifuge tubes,14×95mm)中缓慢加入5mL CsCl重液和5mL CsCl轻液。CsCl重液和轻液配方见附录。
2)将浓缩液缓慢加至CsCl轻液液面上，各管平衡后，30000rpm，4℃超速离心3h；
3)收集病毒带(约3mL)至Slide-A-LyzerTMG2透析装置(透析装置需要提前在透析液平衡2min，按照说明书使用透析装置)。
4)透析装置放入含有1L腺病毒透析液(A195/PBS/5％Sucrose)的烧杯中进行透析，烧杯放置于磁力搅拌器，4℃低速缓慢搅拌透析。透析液配方见附录，每隔2h换一次液，换2次液。
5)取出透析后的病毒液，0.22μm滤膜过滤除菌，50μL/管分装，-80℃保存。
P0代重组腺病毒在AD293细胞中经过3-4轮的扩增，病毒滴度逐渐上升，第4轮进行大量扩增，获得的细胞裂解上清用CsCl进行超速离心纯化，在CsCl重液和轻液之间可见清晰的上下2条带，下面条带是有感染性的病毒颗粒，收集下面条带，表明纯化成功(见图2)。
6.Ad5-hAPN和Ad5-Empty病毒滴度测定
采用空斑形成实验(Focus forming assay，FFA)测定腺病毒滴度，实验步骤参照Takara公司试剂盒(Adeno-XTMRapid Titer Kit)方法。
1)AD293细胞以2.5×104铺至96孔板，培养24h左右，细胞密度约95％。
2)稀释病毒：腺病毒在冰上化开，用D2培养基按十倍梯度稀释病毒，从10-1稀释至10-9，纯化好的腺病毒滴度可达到1010FFU/mL，因此可稀释至10-9。
3)孵育病毒：用真空泵弃掉细胞上清，按空白对照(D2)、10-9-10-5的顺序将病毒加入细胞孔中，每个稀释度接4-6个复孔，(一般10-5-10-1在48h后病变严重，无法数斑)，50μL/孔。放入37℃培养箱每隔15min摇板，促进感染。
4)补液：感染1h后不用弃液，直接补100μL/孔D2。
6)接毒48h后，用真空泵完全吸掉液体，然后打开盖子，在生物安全柜里边吹10min。
7)固定：无水乙醇提前放-20℃预冷，轻柔加入预冷的无水乙醇，100μL/孔，-20℃固定20min。
8)封闭：用含1％BSA的PBS洗3次，150μL/孔。
9)孵育一抗：用含1％BSA的PBS稀释一抗(5型腺病毒免疫的鼠血清)，以1:400稀释，50μL/孔，37℃孵育1h。
10)洗涤：弃一抗，用含1％BSA的PBS洗3次，150μL/孔。
11)孵育二抗：含1％BSA的PBS稀释二抗(Anti-mouse-HRP)，以1:1250稀释，50μL/孔，37℃孵育1h。
12)洗涤，弃二抗，用含1％BSA的PBS洗3次，150μL/孔。
13)DAB显色：按照说明书操作，室温，避光在摇床上反应10-20min(显色10min左右后在显微镜下观察，看到有明显的棕色斑点则终止反应，太深容易有背景，太浅看不清斑点)。
14)终止显色，弃显色液，加ddH2O洗2遍，然后充分甩干板。
15)在酶联斑点扫描仪上扫描斑点，计算病毒滴度。
采用斑点形成实验测定腺病毒滴度，病毒滴度可达到1010FFU/mL以上，结果见下表。
重组腺病毒滴度结果
7.Western-blot和流式结果表明hAPN在体外正确表达。
17Cl-1细胞分别以MOI＝20转导Ad5-hAPN和Ad5-Empty(阴性对照)，转导48h后，用Western-blot鉴定hAPN的表达，结果表明hAPN成功表达，见图3的A。用流式细胞术鉴定hAPN的定位，染色可见阳性细胞群，结果表明hAPN定位于细胞表面，见图3的B。
实施例3 229E病毒扩增与滴度测定
1. 229E病毒扩增
229E病毒来自-ATCC(VR-740)，用huh7细胞进行扩增。
1)Huh7细胞铺T75培养瓶，待细胞长至80％-90％的密度。
2)稀释病毒:冰上化毒，用D2稀释229E病毒。
3)孵育病毒：Huh7用室温的DPBS洗一遍，加入3mL稀释好的病毒，放入34℃培养箱，每隔10-15min摇一次，2h后补液，补D2至12mL。
4)每日观察病变，待70％以上的细胞发生病变，将整瓶病变细胞直接冻存于-80℃。
5)冻融一次，4℃，3500rpm，10min，取上清分装，-80℃冻存。
2. 229E病毒滴度测定(TCID50)
1)MRC-5细胞以2.5×104铺至96孔板，培养20h左右，细胞密度约95％。
2)稀释病毒：病毒在冰上化开，用D2培养基按十倍梯度稀释病毒，从10-1稀释至10-6。
3)孵育病毒：用真空泵吸掉细胞上清，按空白对照(D2)、10-6-10-1的顺序将病毒加入细胞孔中，每个稀释度接4-6个复孔，50μL/孔。放入34℃培养箱，每隔15min摇板，促进感染。
4)补液：感染1h后用真空泵吸掉病毒液，然后补200μL/孔D2。
5)第三天开始观察病变，连续观察至第7天，记录每个稀释度的病变孔数。
6)根据公式计算TCID50。
实施例4重组腺病毒和人类冠状病毒229E转导小鼠构建动物模型
1.Ad5-hAPN和Ad5-Empty转导小鼠
将小鼠移至生物安全柜内，应用异氟烷(isoflurane)麻醉小鼠。将塑料干燥器置于生物安全柜内，向塑料干燥器内加入异氟烷；将小鼠置于干燥器内进行麻醉，观察小鼠呼吸，直至达到麻醉效果。
取出麻醉好小鼠，鼻腔滴注2.5×108FFU/75μl Ad5-hAPN或Ad5-Empty。
等待小鼠从麻醉中恢复，并将其放回鼠笼。饲养5天。
Ad5-hAPN转导小鼠后，在免疫组化鉴定结果中，抗APN抗体和抗标签抗体Flag均表明APN在小鼠肺部成功表达(图4)。
Ad5-hAPN腺病毒转导小鼠肺部后，具有一定的时效性，会被小鼠免疫系统清除。本发明选择转导受体5天后攻毒，一方面腺病毒在小鼠体内引发的天然免疫反应在5天后大部分消散，有利于病毒的复制；另一方面转导5天后腺病毒受体在肺部高表达，未被免疫系统清除。
2.人类冠状病毒229E感染转导后小鼠
1)所有的小鼠都要在生物安全柜内进行感染。应用异氟烷(isoflurane)麻醉小鼠。
2)从–80℃冰箱取出229E病毒(2×106TCID50/mL)，冰面上化开。
3)取出麻醉好小鼠，鼻腔滴注75μL稀释好的病毒。
4)等待小鼠从麻醉中恢复，并将其放入新鼠笼中以降低可能的笼内污染。
5)用10％新鲜配置的有效氯消毒液灭活未用完的病毒储存液和稀释液，并高压消毒。
6)每日观察感染小鼠临床指标(呼吸抑制、弓背、无精打采、无法站立和脱水)。
Ad5-hAPN转导IFNAR KO B6小鼠5天后，滴鼻感染229E，连续收取感染后1至7天的肺组织，测定病毒滴度。小鼠在感染后第二天开始肺部出现明显病变，肺充血(图5的A)。小鼠在感染后1-3天体重逐渐下降，之后体重回升(图5的B)。229E病毒可在小鼠肺内复制(图5的C)，随着感染天数增加，病毒滴度逐渐降低，结果表明，我们已成功构建Ad5-hAPN转导的229E感染动物模型，可支持病毒在肺部复制。
附录
1.细胞培养液配方
2.CsCl轻液和重液配方
3.腺病毒透析液和储存液配方(A-195/PBS/5％Sucrose)
将上述试剂混合，在磁力搅拌器上搅拌均匀，0.22μm抽滤瓶过滤，4℃保存。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.应用腺病毒转导制备能够表达人源APN转基因非人动物的方法，其中该腺病毒由pShuttle-hAPN与pAdEasy-1重组得到的重组载体在AD293细胞中拯救得到，所述pShuttle-hAPN为插入有所述人源APN的DNA序列的pShuttle；
所述腺病毒在转导所述动物后，所述动物的呼吸道细胞表达人源APN蛋白；
所述动物是B6小鼠；
所述质粒pAdEasy-1为缺失E1区和E3区5型野生型腺病毒(Ad5dE1/3)基因组质粒，带有氨苄青霉素抗性基因；
所述腺病毒在转导所述动物的方法为经鼻腔滴注转导所述动物。
2.根据权利要求1所述的方法，所述重组载体的构建方法包括：
将pAdEasy-1与线性化的pShuttle-hAPN共转化至BJ5183感受态细胞；
其中线性化的pShuttle-hAPN为所述pShuttle-hAPN由PmeI酶切位点断开得到。
3.根据权利要求2所述的方法，所述pAdEasy-1与所述线性化的pShuttle-hAPN以1:(1～5)的质量比共转化。
4.根据权利要求2所述的方法，转化后，将所述BJ5183感受态细胞培养8h～16h，随后挑选10～20个最小的单克隆接种至含Kana+的LB培养基培养≤8h。
5.根据权利要求1所述的方法，所述重组载体在XL-Blue感受态细胞中扩增后在AD293细胞中拯救腺病毒，将拯救得到病毒进行扩增与纯化。
6.根据权利要求5所述的方法，所述拯救腺病毒的步骤包括：
将所述AD293细胞在培养容器中培养至细胞融合度50％～70％后清洗，更换为Opti-MEM培养基，待细胞适应后将细胞转染液滴加至细胞培养液中转染3.5h～4.5h；
转染结束后换液培养至出现细胞病变，收集病毒；
其中，以所述培养容器为T75培养瓶计算，每瓶细胞的转染终体系中含有：
Opti-MEM培养基8.5mL～12.5mL、线性化的所述重组载体9μg～13μg、PEI 30μg～36μg。
7.根据权利要求1所述的方法，所述鼻腔滴注的滴注量为(1～4)×108FFU/(50μl～100μl)的腺病毒。
8.依照权利要求1～7任一项所述的方法获得的转基因非人动物在构建人类冠状病毒229E感染疾病模型中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述动物同时鼻腔滴注人类冠状病毒229E。
10.根据权利要求9所述的应用，所述鼻腔滴注人类冠状病毒229E的浓度为(1～3)×106TCID50/mL，接种量为50μl～100μl。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5922576A (en) * 1998-02-27 1999-07-13 The John Hopkins University Simplified system for generating recombinant adenoviruses
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5922576A (en) * 1998-02-27 1999-07-13 The John Hopkins University Simplified system for generating recombinant adenoviruses
CN107267469A (zh) * 2017-08-22 2017-10-20 广州医科大学附属第医院 纤毛蛋白嵌合型重组人b型腺病毒及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A simplified system for generating recombinant adenoviruses;TONG-CHUAN HE et al.;《Proc. Natl. Acad. Sci.》;19980331;图1及其说明，第2510页左栏第2段 *
Aminopeptidase N expression in the endometrium could affect endometrial receptivity;Li-Jun Shui et al.;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20190625;第2.4节，第469页左栏最后一段至右栏第3行 *
Rapid generation of a mouse model for Middle East respiratory syndrome;Jincun Zhao et al.;《PNAS》;20140401;第4970页左栏第2段、第4971页左栏第1段、第4973页右栏第1段、第4974页左栏第1段 *
冠状病毒研究概述;陈乐如等;《中华卫生杀虫药械》;20200229;第18页右栏最后一段至第19页左栏第1段 *

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