CN107267469B

CN107267469B - 纤毛蛋白嵌合型重组人b型腺病毒及其制备方法

Info

Publication number: CN107267469B
Application number: CN201710725500.5A
Authority: CN
Inventors: 田新贵; 周荣; 刘甜恬; 周志超; 李潇
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2017-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2037-08-22
Also published as: CN107267469A

Abstract

本发明公开了一种纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒及其制备方法，其骨架为人B型腺病毒基因组，编码其纤毛蛋白的受体结合结构域的碱基序列为编码人C型腺病毒的相应结构域的碱基序列。本发明采用分子克隆方法将Ad5‑knob基因片段克隆置换到重组穿梭质粒，与重组人3型腺病毒基因组进行体外重组，获得knob基因片段被替换为5型的重组人3型腺病毒基因组，进而得到纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3‑FK5。其在体外可以感染小鼠原代上皮细胞、金仓鼠肺和肾原代细胞，其感染效率与Ad5相近，相比其母毒株rAd3E其感染效率要高得多，在金仓鼠细胞内有显著复制，可以用于人3型腺病毒疫苗、抗病毒药物评价的小动物模型研究。

Description

纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒及其制备方法。

背景技术

人腺病毒包括有7个组60多种型别，B组腺病毒3型、7型、14型、55型是导致急性呼吸道感染及重症肺炎的主要型别。腺病毒衣壳主要包括纤毛蛋白、五邻体基座和六邻体，一般认为六邻体是腺病毒的主要中和抗原，而纤毛蛋白是吸附细胞的受体结合蛋白，与受体结合的主要结构域位于纤毛蛋白头(knob)。

腺病毒疫苗评价、治疗药物疗效评价、致病机制研究等都需要用到合适的动物模型。小鼠是最常用的模型动物，然而已有研究表明B组腺病毒不能感染小鼠细胞，而C组腺病毒例如5型腺病毒可以感染小鼠细胞；B组腺病毒不能感染金仓鼠细胞，而C组腺病毒例如5型腺病毒可以感染金仓鼠细胞并能复制增殖，这种差异可能是纤毛蛋白的差异导致的，3型等B组腺病毒以人DSG2蛋白为受体，而C组5型腺病毒等吸附受体主要是CAR，但没有研究证实。目前缺乏B组腺病毒的感染动物模型，因此建立B组腺病毒感染的小动物模型非常有必要。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒，所述重组人B型腺病毒以人B型腺病毒基因组为骨架，编码所述重组人B型腺病毒的纤毛蛋白的受体结合结构域的碱基序列为编码人C型腺病毒的相应结构域的碱基序列。

在其中一些实施例中，所述人B型腺病毒为3型、7型、11型、14型、或55型腺病毒。

在其中一些实施例中，所述人C型腺病毒为5型腺病毒。

在其中一些实施例中，所述重组人B型腺病毒以人3型腺病毒基因组为骨架，编码所述重组人B型腺病毒的纤毛蛋白的受体结合结构域的碱基序列为编码人5型腺病毒的相应结构域的碱基序列。

在其中一些实施例中，所述人5型腺病毒的相应结构域具有如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列。

在其中一些实施例中，所述SEQ ID No:6所示的氨基酸序列是由如SEQ ID No:5所示的碱基序列所编码的。

本发明还提供了上述纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

(1)、以pBRAd△E3GFP为模板，SEQ ID No:1～2为引物进行PCR扩增，Cla I酶切PCR产物，T4连接酶自连，得到原始穿梭质粒pShuttle-Ad3F；

(2)、以腺病毒Ad5基因组作为模板，SEQ ID No:3～4为引物进行PCR扩增，获得碱基序列如SEQ ID No:5所示的Ad5-knob基因；

(3)、以原始穿梭质粒pShuttle-Ad3F为模板，SEQ ID No:7～8为引物进行PCR扩增，获得的PCR产物与步骤(2)的PCR产物体外重组，重组产物转化感受态细胞，挑选阳性克隆进行鉴定，鉴定正确者提取质粒，命名为pShuttle-Ad3-FK5；

(4)、以步骤(3)获得的pShuttle-Ad3-FK5为模板，SEQ ID No:9～10为引物进行PCR扩增，获得的PCR产物与经Rsr II和Pme I双酶切的pBRAd△E3GFP载体进行体外重组，将重组产物转化感受态细胞，挑选PCR及酶切鉴定均正确的质粒送测序，并将修饰的fiber全基因测通，获得重组质粒pAd3E-FK5；

(5)、将重组质粒pAd3E-FK5用内切酶AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装得到重组病毒，大量培养并CsCl密度梯度离心纯化，即得。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR的反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR的反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer10μl、dNTP mixture 4μl、SEQ ID No:3引物1μl、SEQ ID No:4引物1μl、模板1μl、PrimeSTARHS DNAPolymerase 0.5μl、ddH₂O加至50μl。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述体外重组反应的反应体系为：A5-knob PCR产物3.5μl、Pshuttle-Ad3F PCR产物3.5μl、5×CE Buffer 2μl、Exnase multis 1μl。

在其中一些实施例中，步骤(4)中所述体外重组反应的反应体系为：pBRAd△E3GFP-Rsr II+Pme I产物3.5μl、pShuttle-Ad3-FK5PCR产物3.5μl、5×CE Buffer 2μl、Exnase multis 1μl。

本发明是采用分子克隆方法包括PCR、体外重组等过程将Ad5-knob基因片段克隆置换到重组穿梭质粒，与重组人3型腺病毒基因组进行体外重组，获得knob基因片段被替换为5型的重组人3型腺病毒基因组，转染细胞后拯救得到纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3-FK5。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5在体外可以感染小鼠原代上皮细胞、金仓鼠肺和肾原代细胞，其感染效率与Ad5相近，相比其母毒株rAd3E其感染效率要高得多，rAd3E-FK5在金仓鼠细胞内有显著复制，可以用于人3型腺病毒疫苗评价、抗病毒药物评价、致病机制的小鼠、金仓鼠动物模型中。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。

图1为本发明实施例1中Ad5-knob置换的穿梭载体pShuttle-Ad3-FK5菌落PCR鉴定图谱，其中，M：DL15000DNAmarker；泳道1-8：pShuttle-Ad3-FK5菌落1#-8#模板PCR产物；

图2为本发明实施例1中Ad5-knob置换的重组腺病毒载体菌落PCR鉴定图谱，其中，M：DL5000DNAmarker；泳道1-8：pAd3E-FK5菌落1#-6#模板PCR产物；

图3为本发明实施例1中Ad5-knob置换的重组腺病毒载体pAd3E-FK5酶切鉴定图；M：DL15000DNAmarker；泳道1、3、5：pAd3E-FK5-1#-BamHI、-EcoRI、-EcoRV；泳道2、4、6：pAd3E-FK5-6#-BamHI、-EcoRI、-EcoRV；

图4为本发明实施例2中纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5感染小鼠肾原代细胞的结果图，其中，A：荧光视野；B：可见光视野；

图5为本发明实施例3中纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5感染金仓鼠肾原代细胞的结果图，其中，A：荧光视野；B：可见光视野；

图6为本发明实施例3中QPCR检测rAd3E-FK5在金仓鼠原代肾细胞内的复制结果图，其中rAd3E-FK5-GHK：rAd3E-FK5接种金仓鼠肾上皮细胞；rAd3E-GHK：rAd3E接种金仓鼠肾上皮细胞；rAd3E-FK5-A549：rAd3E-FK5接种人A549细胞；rAd3E-A549：rAd3E接种人A549细胞；

图7为本发明实施例3中免疫细胞化学法检测晚期基因hexon蛋白的表达，其中，A：对照金仓鼠肾原代细胞，B：rAd3E-FK5感染的金仓鼠肾原代细胞，C：rAd3E-FK5感染的小鼠肾原代细胞。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

本发明实施例中所述Ad3为HAdv3-gz01病毒株，全基因组Genbank号：DQ099432，rAd3E为HAdv3-gz01病毒基因组缺失E3区基因，表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组人3型腺病毒。

复制缺陷型Ad5病毒株(AdEASY)来源于pAdEasy-1，其GenBank号：AY370909.2；

实施例1纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5制备

本实施例所述的纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5是以发明人前期获得的骨架质粒pBRAd△E3GFP及重组人3型腺病毒rAd3E(公开的文献为Zhang Q,Su X,SetoD,Zheng BJ,Tian X,Sheng H,Li H,Wang Y,Zhou R.Construction andcharacterization of a replication-competent human adenovirus type 3-basedvector as a live-vaccine candidate and a viral delivery vector.Vaccine 2009；27(8):1145-53)为基础，用Ad5的纤毛蛋白头基因(knob，扩增自Ad5的病毒株，氨基酸序列无突变)替换掉该重组人3型腺病毒rAd3E的纤毛蛋白头基因，而获得纤毛蛋白头置换型重组腺病毒rAd3E-FK5，即纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5。

具体制备步骤如下：

(1)、扩增构建穿梭质粒

以pBRAd△E3GFP为模板，用引物对Fiber-L-RsrII(CCATCGATCGGTCCGCAGCGACAAAAAT，SEQ ID No:1)和Fiber-R-PmeI(CCATCGATGTTTAAACCACACCTCATT，SEQ ID No:2)进行PCR扩增，PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸5min。PCR反应体系：

扩增产物约8.3kb，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收，纯化后以内切酶Cla I酶切，回收后T4连接酶自连，形成原始穿梭质粒pShuttle-Ad3F。

(2)、PCR扩增Ad5纤毛蛋白头(fiberknob)基因

从培养的腺病毒Ad5保存液提取病毒基因组，取1μl病毒基因组作为模板，用Ad5knob上下游引物对Ad5_fiber knob-R(GTCATCTTCTGTAATTTATTCTTGGGCAATGTATGAAAAAG，SEQ ID No:3)；Ad5_fiberknob-F(CTCAAAAATAACACTttgtggaccacaccagctccatc，SEQ IDNo:4)进行PCR扩增，获得Ad5的knob基因，碱基序列如SEQ ID No:5所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收；PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min。PCR反应体系：

(3)、穿梭载体pShuttle-Ad3-F5构建

以原始穿梭质粒pShuttle-Ad3F为模板，用引物对C-Fiber-F(ATTACAGAAGATGACTGACAACA，SEQ ID No:7)C-Fiber-R(AGTGTTATTTTTGAGTGCAATAGAAT，SEQID No:8)进行PCR扩增，PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸5min。PCR反应体系：

产物大小约8kb，琼脂糖凝胶电泳回收，与Ad5-knob基因PCR产物体外重组，重组反应体系(3.5μlA5-knob PCR产物+3.5μl Pshuttle-Ad3F PCR产物+2μl 5×CE Buffer+1μlExnase multis)，37℃孵育30min，将重组产物转化100μl Top10化学感受态细胞，过夜培养，挑单菌落进行菌落PCR鉴定(图1)，鉴定引物Fiber-L-RsrII(SEQ ID No:1)/ADV5-fiberknob-R(SEQ ID No:3)，阳性克隆送测序公司进行测序鉴定，鉴定正确者提取质粒，命名为pShuttle-Ad3-FK5；

(4)、重组腺病毒质粒构建

以穿梭质粒pShuttle-Ad3-FK5为模板，以引物对Fiber-L(actagtatacgagctCGGTCCGCAGCGACAAAAAT，SEQ ID No:9)/Fiber-R(actgtctacttccgtGTTTAAACCACACCTCATT，SEQID No:10)进行PCR扩增，PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸5min。PCR反应体系：

pBRAd△E3GFP质粒用RsrII+PmeI双酶切，反应体系：pBRAd△E3GFP质粒3μg+RsrII1μl+PmeI 1μl+cutsmartbuffer 5μl，加ddH₂O至总体积50μl，37℃反应2hr，琼脂糖凝胶电泳回收大片段pAd3E-RsrII+PmeI。

PCR产物与双酶切后回收的pAd3E-RsrII+PmeI产物进行体外重组，组装成重组腺病毒质粒，重组反应体系(3.5μl PCR产物+3.5μl pAd3E-RsrII+PmeI产物+2μl 5×CEBuffer+1μl Exnase multis)，37℃孵育30min，将重组产物转化100μl Top10化学感受态细胞，过夜培养，挑单菌落进行菌落PCR鉴定，结果有四个克隆1#、3#、5#、6#正确(图2)，鉴定引物GFP-F(ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG,SEQ ID No:11)/Ad5-fiberknob-R(SEQ ID No:3)，阳性克隆送测序公司进行测序鉴定。PCR鉴定筛选阳性的菌落接种含Amp的LB培养基培养，质粒小抽试剂盒抽提质粒，进行酶切鉴定，结果有两个克隆1#和6#酶切图谱正确(图3)，PCR及酶切均正确的质粒送测序，将修饰的fiber全基因测通，验证基因突变是否成功及重组过程中质粒是否有碱基突变或缺少，获得重组质粒pAd3E-FK5；

(5)重组病毒拯救

将上述重组得到的质粒pAd3E-FK5用内切酶AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装得到重组病毒。重组病毒在A549细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定，表明重组病毒基因组保持稳定，没有基因缺少、重组现象，重组病毒的纤毛蛋白为嵌合型，与理论序列一致，没有碱基突变。

(6)病毒大量培养与纯化

病毒感染前1-2天，用100mm皿传代培养AD293细胞或HEp-2细胞，待生长状态良好的细胞密度达到90％左右时，弃掉培养基，加入不完全培养基，接种0.1-1ml rAd3E-FK5病毒液，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养2-4天，逐日观察细胞病变情况，当90％以上细胞病变后，吹打收集细胞和上清。将收集的细胞和上清在-80℃/37℃反复冻融三次，使细胞破粹。细胞冻融液10000rpm离心10分钟，收集上清，分装后标记，冻存于-80℃冰箱保存备用。用AD293细胞测定病毒感染滴度(TCID50)。大量培养病毒(约20-50个100mm皿)，收集细胞，反复冻融3-4次后，离心收集病毒上清，CsCl不连续密度梯度超速离心纯化病毒得到重组病毒粒子rAd3E-FK5。经过纯化的病毒粒子稀释到1×10¹²VPs/ml，测定OD260/OD280比值约1.2-1.4，内毒素检测<10EU/ml。

实施例2实施例1制备得到的重组人腺病毒rAd3E-FK5感染小鼠原代肾上皮细胞

包括以下步骤：

(1)制备小鼠原代肾上皮细胞

BALB/C小鼠腹腔注射麻醉剂，待动物麻醉后向动物身体表面喷75％酒精消毒，转置生物安全柜中，灭菌纸擦拭。从腿根部开始解剖，手术刀划开或剪刀剪开皮肤，剪刀剪开腹腔和胸腔。取肾器官，去掉器官表面的油脂等杂物，肾脏去掉表面的一层薄薄的包膜，放置于无菌平皿中，PBS洗涤两遍后转置新的细胞培养皿中。取器官一部分(直径约1cm)置5ml离心管或青霉素小瓶中，用剪刀将器官反复剪切，剪碎至约0.5mm大小。加PBS静置约2min，组织块自然沉降，去掉非组织块部分；重复清洗两次。加消化液(20％胎牛血清+青连霉素双抗+0.1％I型胶原蛋白酶+DMEM，0.22μm过滤除菌)约10ml将组织块转置于100mm细胞培养皿中，消化过夜(12-24hr)，离心收集细胞，加20％胎牛血清+青链双抗培养基，吹散打匀，置375％CO₂培养箱中培养。收集消化液处理的细胞于15ml离心管中，自然沉降5min，去非沉淀部分，沉淀加无血清培养基1000rpm离心5min，无血清培养基洗涤一遍，吹散打匀后加20％胎牛血清+双抗培养基转置100mm细胞培养皿中培养。第二天去掉未贴壁细胞，贴壁细胞用无血清培养基洗涤一次，加20％胎牛血清+双抗培养基继续培养，每天观察细胞贴壁及生长情况。

(2)rAd3E-FK5感染小鼠原代细胞

肾原代细胞培养2-3天后密度达到50％以上，常规方法1：2或1：3传代，接种24孔或48孔、96孔细胞培养板，用于接毒培养。取100TCID₅₀的rAd3E-FK5病毒及对照病毒rAd3E、rAd5E接种小鼠原代上皮细胞，培养48hr，期间观察细胞形态和绿色荧光蛋白的表达。

结果发现对照人3型腺病毒rAd3E对小鼠肾原代细胞感染能力低，而纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5的感染力高，与对照人5型腺病毒rAd5E感染力相近(图4)。

实施例3实施例1制备得到的重组人腺病毒rAd3E-FK5感染感染金仓鼠细胞

包括以下步骤：

(1)制备金仓鼠原代肾上皮细胞

金仓鼠原代肾上皮细胞制备方法与小鼠原代肾上皮细胞制备方法相同；

(2)rAd3E-FK5感染金仓鼠原代细胞

细胞培养2-3天后密度达到50％以上，常规方法1：2或1：3传代，接种24孔或48孔、96孔细胞培养板，用于接毒培养。取100TCID₅₀的rAd3E-FK5病毒及对照病毒rAd3E、rAd5E接种金仓鼠原代上皮细胞，培养48hr，期间观察细胞形态和绿色荧光蛋白的表达。

结果发现对照人3型腺病毒rAd3E对金仓鼠肾原代细胞感染能力低，而纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-FK5对金仓鼠肾原代细胞的感染力高，与对照人5型腺病毒rAd5E感染力相近(图5)。

(3)rAd3E-FK5在金仓鼠原代细胞内的复制

分别传代金仓鼠原代细胞和人肺癌上皮细胞A549，铺24孔细胞培养板，分别接种100TCID₅₀的rAd3E-FK5病毒及对照病毒rAd3E，于感染后两小时加PBS洗涤两次，培养96hr，期间分别于接种后12hr、24hr、48hr、72hr和96hr各收集一孔。冻融三次后取10ul悬液提取病毒基因组，荧光定量PCR检测病毒基因组拷贝数。

结果发现rAd3E-FK5病毒在金仓鼠原代细胞内有显著增殖，48hr较12hr病毒基因组拷贝数提高了约100倍；而rAd3E病毒在金仓鼠原代细胞内没有显著增殖，48hr较12hr病毒基因组拷贝数没有明显提高，但是在24hr到48hr和72hr病毒拷贝数有所稳定增长；感染48hr之后rAd3E-FK5病毒较rAd3E病毒在金仓鼠原代细胞内基因组拷贝数高约100倍(图6)。

(4)rAd3E-FK5在金仓鼠原代细胞内晚期基因的表达

rAd3E-FK5感染金仓鼠或BALB/C小鼠肾原代细胞，培养48hr后去除培养基，PBS洗涤两遍，免疫细胞化学法检测晚期基因的表达。固定：PBS洗两次，加含3％H₂O₂的甲醇固定细胞10min；封闭：封闭液10％羊血清/PBST孵育10min；加一抗：加封闭液稀释的抗人3型腺病毒六邻体抗体(申请人自制，田新贵，周荣，薛春燕，李潇，周志超.三种常见人呼吸道腺病毒六邻体蛋白的克隆、表达及抗原性分析.中华微生物学和免疫学杂志.2014；34(5):393-396)(1：500)，37℃孵育40min；洗涤：PBST洗涤5次，每次4min；加二抗：封闭液稀释HRP标记的羊抗鼠二抗(1：2000)，37℃孵育30min；洗涤：PBST洗涤5次，每次5min；显色：加免疫组化HRP底物TMB显色。

结果证明rAd3E-FK5感染的金仓鼠或BALB/C小鼠肾原代细胞可以检测到hexon蛋白的表达(图7)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州医科大学附属第一医院

<120> 纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒及其制备方法

<141> 2017-08-22

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ccatcgatcg gtccgcagcg acaaaaat 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

ccatcgatgt ttaaaccaca cctcatt 27

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

gtcatcttct gtaatttatt cttgggcaat gtatgaaaaa g 41

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

ctcaaaaata acactttgtg gaccacacca gctccatc 38

<210> 5

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaa agatgctaaa 60

ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg ctacagtttc agttttggct 120

gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa gtgctcatct tattataaga 180

tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg acccagaata ttggaacttt 240

agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg ctgttggatt tatgcctaac 300

ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgt cagtcaagtt 360

tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacca ttacactaaa cggtacacag 420

gaaacaggag acacaactcc aagtgcatac tctatgtcat tttcatggga ctggtctggc 480

cacaactaca ttaatgaaat atttgccaca tcctcttaca ctttttcata cattgcccaa 540

gaataa 546

<210> 6

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

Trp Thr Thr Ala Ser Asn Cys Arg Asn Ala Lys Asp Ala Lys Thr Val

1 5 10 15

Thr Lys Cys Gly Ser Ala Thr Val Ser Val Ala Val Lys Gly Ser Ala

20 25 30

Ser Gly Thr Val Ser Ala His Arg Asp Asn Gly Val Asn Asn Ser Asp

35 40 45

Tyr Trp Asn Arg Asn Gly Asp Thr Gly Thr Ala Tyr Thr Asn Ala Val

50 55 60

Gly Met Asn Ser Ala Tyr Lys Ser His Gly Lys Thr Ala Lys Ser Asn

65 70 75 80

Val Ser Val Tyr Asn Gly Asp Lys Thr Lys Val Thr Thr Thr Asn Gly

85 90 95

Thr Thr Gly Asp Thr Thr Ser Ala Tyr Ser Met Ser Ser Trp Asp Trp

100 105 110

Ser Gly His Asn Tyr Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala

115 120 125

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

attacagaag atgactgaca aca 23

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

agtgttattt ttgagtgcaa tagaat 26

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

actagtatac gagctcggtc cgcagcgaca aaaat 35

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

actgtctact tccgtgttta aaccacacct catt 34

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

atggtgagca agggcgagga g 21

Claims

1.一种纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)、以步骤(1)的原始穿梭质粒pShuttle-Ad3F为模板，SEQ ID No:7～8为引物进行PCR扩增，获得的PCR产物与步骤(2)的PCR产物体外重组反应，体外重组反应产物转化感受态细胞，挑选鉴定正确的阳性克隆提取质粒，得到pShuttle-Ad3-FK5；

(4)、以步骤(3)获得的pShuttle-Ad3-FK5为模板，SEQ ID No:9～10为引物进行PCR扩增，获得的PCR产物与经Rsr II和Pme I双酶切的pBRAd△E3GFP载体进行体外重组，将重组产物转化感受态细胞，挑选PCR及酶切鉴定均正确的质粒送测序，并将修饰的纤毛蛋白全基因测通，获得重组质粒pAd3E-FK5；

2.根据权利要求1所述的纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR的反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min。

3.根据权利要求1或者2所述的纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR的反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer 10μl、dNTP mixture 4μl、SEQ ID No:3引物1μl、SEQ ID No:4引物1μl、模板1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μl、ddH₂O加至50μl。

4.根据权利要求1所述的纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述体外重组反应的反应体系为：A5-knob PCR产物3.5μl、pShuttle-Ad3F PCR产物3.5μl、5×CE Buffer 2μl、Exnase multis 1μl。

5.根据权利要求1或者4所述的纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述体外重组反应的反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸5min。

6.根据权利要求1所述的纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述体外重组反应的反应体系为：pBRAd△E3GFP-Rsr II+Pme I产物3.5μl、pShuttle-Ad3-FK5 PCR产物3.5μl、5×CE Buffer 2μl、Exnase multis 1μl。

7.根据权利要求1或者6所述的纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述体外重组反应的反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸5min。

8.根据权利要求1所述的纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸5min。