CN116640736A - 重组人4型腺病毒载体的SARS-CoV-2疫苗候选株的构建及其应用 - Google Patents
重组人4型腺病毒载体的SARS-CoV-2疫苗候选株的构建及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了重组人4型腺病毒载体的SARS‑CoV‑2疫苗候选株的构建及其应用。本发明提供了一种重组人4型腺病毒，其基因组为将含有荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因、RBD蛋白的编码基因的表达盒替换野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段得到的核酸，且该重组腺病毒表达荧光蛋白、IRES调控序列和RBD蛋白；本研究成功构建了针对RBD蛋白的疫苗候选株，通过细胞毒性和western blot的体外评价，发现其细胞毒性较低且能很好的表达RBD蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种重组人4型腺病毒载体的SARS-CoV-2疫苗候选株的构建及其应用。
背景技术
针对新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus2,SARS-CoV-2)接种疫苗可以达到增强免疫、预防感染和降低重症比例等效果，快速开发安全有效的疫苗是控制疫情最有力的措施。
目前针对SARS-CoV-2的疫苗主要有灭活疫苗、蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗和病毒载体疫苗。病毒载体的使用始于1972年，病毒载体通过对病毒基因组DNA或RNA改造而来。常用的包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等载体。其中腺病毒是第一个用于体内递送基因的病毒载体，已经应用于艾滋病毒、结核病、疟疾和埃博拉病毒疫苗。腺病毒载体具有宿主范围广、无插入致突变性、病毒产毒滴度高、外源基因容量大、转导效率高、可诱导强烈而持久的细胞和体液免疫反应，使其成为新发传染病疫苗开发的高效平台，腺病毒载体是迄今为止为SARS-CoV-2疫苗开发中使用最多和最先进的病毒载体。针对SARS-CoV-2的腺病毒载体疫苗对接种人群起到高水平的免疫保护效果，例如基于黑猩猩腺病毒载体的ChAdOx1 nCoV-19(阿斯利康/英国牛津大学)；以HAd26作为主要载体，HAd5作为辅助载体的Sputnik V(俄罗斯Gamaleya研究所)；基于HAd26载体的Ad26.COV2-S(Janssen/Johnson&Johnson，欧洲)和基于HAd5载体的Ad5-nCOV(康希诺生物，中国)。
SARS-CoV-2S蛋白由1273个氨基酸组成，是一种同源三聚体，被高度糖基化，属于I型膜蛋白家族，并锚定在病毒膜中，在病毒粒子表面形成独特的“冠状”结构。每个单体由膜远端S1和膜近端S2两个亚基组成。S1亚基含有N末端结构域(N-terminal domain，NTD)和受体结合域(receptor-binding domain，RBD)。S2包括一个内部膜融合肽、两个七肽重复序列(HR1和HR2)、一个膜近端外部区域和一个跨膜结构域(TM)。S蛋白介导受体结合和膜融合，人体内许多有效的中和抗体可以靶向S蛋白，在病毒进入过程中的多个阶段抑制病毒感染。同时，S蛋白也是T细胞作用标靶。S蛋白结构域的RBD直接参与了宿主受体的识别且S蛋白许多关键抗原表位都存在于RBD上。RBD是干扰病毒受体结合的中和抗体的主要靶点，RBD区域的氨基酸变异会导致病毒的种属嗜性和感染特性的变化。S蛋白和RBD蛋白可以作为诱导人体高水平细胞免疫和体液免疫的理想免疫原，目前SARS-CoV-2疫苗大多是基于这两种蛋白设计和开发。
目前，腺病毒载体中应用最广泛的是5型腺病毒载体，但人群普遍面临预存免疫问题，以中国为例，国内成年人80％以上对Ad5存在Ad5抗体，预存免疫会延缓免疫应答时间并降低应答峰值。
发明内容
本发明的目的是提供重组人4型腺病毒载体的SARS-CoV-2疫苗候选株的构建及其应用。
第一方面，本发明提供了一种重组人4型腺病毒，其基因组为将含有荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因和RBD蛋白的编码基因的表达盒替换野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段得到的核酸，且该重组腺病毒表达荧光蛋白和RBD蛋白；
所述RBD蛋白来源于SARS-CoV-2的原始株。
上述所述重组人4型腺病毒中，所述野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段的核苷酸序列为AY594253.1(03-FEB-2005)第27890-29435位。
上述野生人4型腺病毒基因组的核苷酸序列为AY594253.1(03-FEB-2005)。
上述所述重组人4型腺病毒中，所述含有荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因和RBD蛋白的编码基因的表达盒包括荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因、RBD蛋白的编码基因、以及驱动所述荧光蛋白和所述RBD蛋白表达的启动子。
上述所述重组人4型腺病毒中，所述荧光蛋白为EGFP蛋白；
所述驱动荧光蛋白和RBD蛋白表达的启动子为CMV启动子；
进一步地，所述含有荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因、RBD蛋白的编码基因的表达盒的核苷酸序列为序列1第506-3310位。
上述中，所述荧光蛋白为EGFP蛋白，为如下任一种：
(a1)序列表中序列1第2042-2758位编码的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述IRES调控序列为如下b1-b3任一种：
(b1)序列表中序列1第1439-2013位编码；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)与(b1)-(b2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述RBD蛋白为如下c1-c3任一种：
(c1)序列表中序列1第757-1428位编码的蛋白质；
(c2)在(c1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(c3)与(c1)-(c2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述重组人4型腺病毒的方法，包括如下步骤：
1)制备带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD和带有E3同源臂的ccdB-Kan片段；
所述带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD包括EGFP蛋白编码基因、IRES调控序列的编码基因、RBD蛋白的编码基因以及驱动EGFP蛋白和RBD蛋白表达的启动子；
2)将所述带有E3同源臂的ccdB-Kan片段和质粒pBRAd4共同导入具有Red同源重组功能的宿主菌突变体中同源重组，提取质粒，得到具有筛选功能的中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan；
所述中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan为将带有E3同源臂的ccdB-Kan片段替换质粒pBRAd4中所述野生人4型腺病毒基因组的E3区部分片段(AY594253.1，03-FEB-2005中第27890-29435位)得到的载体；
所述质粒pBRAd4含有所述野生人4型腺病毒基因组；
3)将所述带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD和所述具有筛选功能的中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan共同导入具有Red同源重组功能的宿主菌中同源重组，提取质粒，得到重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD；
4)将所述重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD转入腺病毒包装细胞中包装，得到重组人4型腺病毒。
上文中，所述带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD的核苷酸序列为序列1；
所述带有E3同源臂的ccdB-Kan片段的核苷酸序列为序列2；
所述野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段的核苷酸序列为AY594253.1的第27890-29435位。
上文中，所述具有Red同源重组功能的宿主菌突变体体为GB08Red gyrA462突变株；
所述具有Red同源重组功能的宿主菌具体为GB08Red细胞；
上文中，所述腺病毒包装细胞为HEK-293T细胞。
第三方面，本发明提供了由第二方面所述方法制备的重组人4型腺病毒；
或，本发明还提供了第一方面中所述重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD。
第四方面，本发明提供了第一方面或第三方面所述重组人4型腺病毒在制备具有如下任一功能的产品中的应用：
1)制备预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病产品；
2)制备新型冠状病毒抗体产品；
3)制备中和新型冠状病毒产品；
4)制备新型冠状病毒疫苗。
第五方面，本发明提供了第一方面中所述重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD在制备具有如下任一功能的产品中的应用：
1)制备预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病产品；
2)制备新型冠状病毒抗体产品；
3)制备中和新型冠状病毒产品；
4)制备新型冠状病毒疫苗。
第六方面，本发明提供了一种产品，其包括第一方面或第三方面中所述重组人4型腺病毒或所述重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD；
所述产品具有如下任一功能：
1)预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病；
2)产生新型冠状病毒抗体；
3)中和新型冠状病毒。
由于野生人4型腺病毒基因组长度为35990bp，很难找到合适的酶切位点来对其进行基因工程改造，本研究选用ccdB反向筛选系统结合Red/ET同源重组技术构建了表达EGFP和RBD的复制型重组人4型腺病毒载体。实验结果表明，在经过构建表达盒、构建E3区插入ccdB-Kan的中间筛选质粒和将表达盒插入腺病毒载体E3区三个步骤后，成功构建出重组人4型腺病毒表达载体，能够在非回补Ad4 E1区的辅助细胞系HEK-293T中包装出病毒、在荧光倒置显微镜下观察到表达、稳定传代并最终达到较高的病毒滴度。在此基础上插入RBD蛋白基因的重组人4型腺病毒载体，亦能够在未回补Ad4 E1区的HEK-293T细胞中成功包装出病毒，表达绿色荧光用于示踪，侵染细胞后会在体外细胞中表达SARS-CoV-2抗原RBD蛋白并分泌到细胞外。感染重组腺病毒载体的细胞存活数量比感染野生型腺病毒的多，说明表达RBD蛋白的重组人4型腺病毒显示出较低的细胞毒性。成功表达SARS-CoV-2抗原蛋白说明基于本研究构建的腺病毒载体平台可以在短时间内完成疫苗制作，高效表达抗原蛋白并引发特异性抗体。
本发明的实验证明，利用IRES介导双基因共表达原理、抗性正向筛选结合ccdB向筛选策略和Red/ET同源重组技术构建出E3区插入EGFP-IRES-RBD片段的重组人4型腺病毒载体，转染HEK-293T细胞进行病毒包装。通过显微镜下荧光和CPE的观察表明重组腺病毒疫苗候选株建成功，能快速包装出病毒，在细胞中高效表达EGFP荧光并稳定传代扩增。本研究成功构建了针对RBD蛋白的疫苗候选株，通过细胞毒性和western blot的体外评价，发现其细胞毒性较低且能很好的表达RBD蛋白。通过小鼠免疫和ELISA法检测，发现其能使小鼠产生RBD特异性抗体。显示出相比Ad4 wt较低细胞毒性，能在体外细胞中很好的表达抗原蛋白RBD且能诱导小鼠产生针对RBD的特异性抗体，为SARS-CoV-2疫情防治提供保障，同时为控制其他重大突发、变异性强的传染病疫情提供技术参考。
本发明具有如下优点：
1、本发明在CMV启动子控制启动的表达框中利用IRES调控序列连接上游EGFP并启动下游RBD基因的表达，达到利用同一启动子表达双基因的效果。EGFP和RBD表达现象证明了在多顺反子表达载体中，IRES可作为多基因连接的有效方式并允许多个基因在同一启动子的控制下转录为同一条mRNA并独立共表达。观察两种荧光蛋白表达的强度和密度可知，IRES介导共表达的双基因在表达效果方面几乎无差异。
2、本发明两轮同源重组结合筛选实现外源基因插入目标基因组(如腺病毒基因组)中：第一步在目标基因组相应位置利用Red/ET同源重组插入反向筛选基因ccdB和正向筛选基因Kan(抗性基因)，此步在GB08Red gyrA462突变株中进行；第二步利用Red/ET同源重组将ccdB-Kan基因在原位置替换为外源基因，此步在正常株中进行，未重组成功(含有ccdB基因)的会导致正常株死亡。
3、本研究拟构建针对RBD蛋白的基于复制型重组人4型腺病毒载体SARS-CoV-2疫苗，对野生人4型腺病毒基因组质粒的E3区进行片段替换，E3区的改变不影响病毒复制，但可以降低腺病毒免疫逃逸，减少对人体细胞的毒性。
腺病毒载体可作为体内表达外源抗原基因的有力工具，且有广泛的复制型和复制缺陷型的载体可选择。复制型载体仅E3区域被完全或部分删除，因此与复制缺陷型相比，克隆容量较低，但复制型腺病毒载体独特的优势在于其能够模仿天然腺病毒感染，有效甚至更强烈的诱导体液和细胞免疫，相比复制缺陷型腺病毒载体具有“剂量节约”的优点。本研究探索构建的复制型重组人4型腺病毒载体，有望规避人体预存免疫问题，提高抗原呈递效率和接种对象的免疫应答水平。
附图说明
图1为PBM16A-E3up-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down载体的构建及鉴定；A)PBM16A-E3up-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down构建过程；B)PBM16A-E3up-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down质粒图谱；C)RBD基因扩增鉴定。
图2为pBRAd4-E3-ccdBKan载体的构建及鉴定；A)pBRAd4-E3-ccdBKan构建过程；B)pBRAd4-E3-ccdBKan质粒图谱；C)E3-F、E3-R引物鉴定ccdB基因插入。
图3为pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD载体的构建及鉴定；A)
pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD构建过程；B)pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD质粒图谱；C)鉴定重组腺病毒载体质粒。
图4为明场(Bright Filed)下和绿色荧光(EGFP)下不同时间下病毒包装情况。
图5为明场(Bright Filed)下和绿色荧光(EGFP)下P2、P4、P6病毒传代图。
图6为以MOI＝1加入Ad4wt和rAd4病毒后的细胞存活率。
图7为western blot检测Hexon蛋白表达。
图8为western blot检测RBD蛋白表达。
图9为一免14天后通过ELISA法检测针对RBD蛋白的特异性抗体。
图10为二免7天后通过ELISA法检测针对RBD蛋白的特异性抗体。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中质粒pBRAd4按照如下方法制备：
1、在100-200ul野生人4型腺病毒的病毒液中加入等体积的Buffer B(100mMTris，150mM NaCl，12.5mMEDTA，pH7.4，余量为水)，得到混合液；在混合液中加入1/50体积的蛋白酶K贮存液，50℃消化30min以上；再加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀，4℃，12000rpm，10min。重复步骤3一次。取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀，4℃，12000rpm，10min。取上清，加入1/10体积3M NaAc和2.5倍体积预冷无水乙醇，-20℃沉淀1-2hr，或者过夜。4℃，12000rpm，20min，弃上清。加入1ml75％乙醇，洗涤，4℃，12000rpm，10min，弃上清。65度金属浴5min。加适量ddH2O于管底，轻弹管底，溶解DNA，得到野生人4型腺病毒的基因组DNA(核苷酸序列为AY594253.1，03-FEB-2005)。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用4VRU和4VRD组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4VRU：5’-CCCAAGCTT CCTCGCTCTGGTGGCTAATGC-3’；
4VRD：
4VRU中，单下划线为HindIII识别序列。
4VRD中，单下划线为SphI识别序列，双下划线为AsiSI识别序列，粗体为与病毒基因组中对应的序列。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶HindIII和SphI进行双酶切，回收酶切产物。
4、取质粒pBR322(J01749.1，30-SEP-2008)，用限制性内切酶HindIII和SphI进行双酶切，回收载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
6、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用4VLU和4VLD组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4VLU：
4VLD：5’-CCCAAGCTT CGTGGATCCCATCACATTTTGACG-3’。
4VLU中，单下划线为EcoRI识别序列，双下划线为AsiSI识别序列，粗体为与病毒基因组中对应的序列。
4VLD中，单下划线为HindIII识别序列，粗体为与病毒基因组中对应的序列。
7、取步骤6得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，回收酶切产物。
8、取步骤5得到的重组质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，回收载体骨架。
9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到重组质粒，将其命名为质粒pBRAd4，其含有野生人4型腺病毒基因组(AY594253.1，03-FEB-2005)和2个AsiSI酶切识别位点。
实施例1、表达RBD的蛋白的重组人4型腺病毒的获得
一、表达EGFP和RBD的载体的构建
1、EGFP和RBD基因表达盒质粒的构建
PBM16A-E3up-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down质粒的构建过程如图1A所示。
1)构建质粒
以AdHu4-E3-LfullGFP(硕士学位论文：非洲猪瘟病毒P54蛋白重组人4型腺病毒载体的构建和拯救，单栢强，2021.4.5)为模板，通过引物MCS-F和MCS-R(MCS-F：CCTTTCGTCTTCAAGAATTCTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGT、MCS-R：CCGCAAGGAATGGTGCATGCACTACCTGAGCACCCAGTCC)克隆出321bp带有pBR322载体互搭片段的多克隆位点区(MCS)；用EcoRI和SphI双酶切pBR322载体(赛默飞，15367014)，利用无缝克隆法将上述MCS连接至pBR322载体上构成pBR322-MCS质粒。
以pCMV-GFP(供货商：Biovector Co.,LTD，货号：BiovectorPCMVGFP)为模板，通过引物fullEGFP-F和fullEGFP-R(fullEGFP-F：CGCGTTAAGATACATTGATGAGTT、fullEGFP-R：CCCATATATGGAGTTCCGCG)利用PCR克隆出1603bp的full-EGFP片段，该片段包括CMVenhancer-CMV promoter-EGFP-MCS-polyA。将该片段连接到pBM16A载体(博迈德，BM180528)，构成pBM16A-CMV-EGFP-polyA。
分别以pLVX-IRES-Puro(优宝生物，VT1464)、S in pCDNA3.1(+)(供货商：genewiz，货号：GS-200519_A001)为模板，通过引物IRES-F wf(TTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACC ) 、IRES-R wf( TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTGCCCCTCTCCCTCCC)和RBD-F wf(GCCGCGGCACCATGAGGGTGCAGCCCACC)、RBD-R wf(CGGATCCGAAGTTCACGCACTTGTTCTTCAC)使用PCR法克隆出615bp的带有互搭片段的IRES片段和716bp的带有互搭片段的RBD片段。
选取MCS区的BamHI、XhoI双酶切位点将上述构建的pBR322-MCS切开，胶回收大片段作为载体。利用无缝克隆将上述带有互搭片段的IRES片段和带有互搭片段的RBD片段同时克隆至pBR322-MCS质粒的MCS区中,得到pBR322-IRES-RBD质粒。
以上述pBR322-IRES-RBD质粒为模板，通过引物I-R-F和I-R-R(I-R-F：GGATCCGAAGTTCACGCACTTGTTCTTCA、I-R-R：AAGCTTGCCCCTCTCCCTCCC)利用PCR克隆出IRES-RBD整个片段，将PCR产物胶回收。选取BamHI和XhoI双酶切位点将pBM16A-CMV-EGFP-polyA质粒进行酶切，回收大片段作为载体。T4酶连接法将IRES-RBD整体插入pBM16A-CMV-EGFP-polyA质粒中，构成pBM16A-E3up-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down(又称为pBM16A-E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down，该质粒的结构如图1B所示)。
以含有野生人4型腺病毒基因组的质粒pBRAd4为模板，通过引物E3up-F、E3up-R和E3down-F、E3down-R(E3up-F：AACGAAACAGAGCTCCATCTC、E3up-R：TTCTTAAACCAGCAACAAAGCAC、E3down-F：ATGAAGGCACTTAGCACTTTAGTT、E3down-R：TGCTTATTGGTACTAGCAGTGG)利用PCR法克隆出500bp的E3上游同源臂E3up片段和473bp的E3下游同源臂E3down片段。
以上述构建的pBM16A-E3up-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down为模板，用fullEGFP-F(CGCGTTAAGATACATTGATGAGTT)引物和fullEGFP-R(CCCATATATGGAGTTCCGCG)引物进行扩增，克隆出2853bp的CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA片段，此片段带有E3up、E3down的长度为20bps互搭序列。
通过两次Overlapping-PCR将上述E3上游同源臂E3up片段和E3下游同源臂E3down片段分别连接在CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA片段两端得到带有E3同源臂的表达盒E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down(序列1)。
序列1中，第1-500位为E3up，第506-627位为polyA，757-1428位为RBD，1439-2013位为IRES，2042-2758位为EGFP，2803-3310位为CMV，3329-3826位为E3down。
再将带有E3同源臂的表达盒E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down(序列1)连接在pBM16A载体中，构成最终的带有E3同源臂的表达盒质粒
pBM16A-E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down。
2)鉴定
以上述制备的pBM16A-E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down质粒为模板，通过鉴定引物RBD-F和RBD-R(RBD-F：GCCGCGGCACCATGAGGGTGCAGCCCACC，RBD-R：CGGATCCGAAGTTCACGCACTTGTTCTTCAC)对插入的RBD基因进行PCR鉴定，得到PCR扩增产物。
将上述PCR扩增产物凝胶电泳鉴定结果如图1C所示，1为以pBM16A质粒为模板的扩增产物，2为以pBM16A-E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down质粒为模板的扩增产物，可以看出，得到大小为690bp的PCR扩增产物为目标片段。
将上述大小为690bp的PCR扩增产物送去测序，产物大小符合预期且比对结果显示100％一致，表明构建成功pBM16A-E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down质粒。
2、构建具有筛选功能的中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan
中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan(又称为pBRAD4-E3-ccdBKan)的构建过程如图2A所示，该质粒的结构示意图如图2B所示。
1)构建
以pBR322-amp-ccdB-rpsL(博士学位论文：基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达平台的构建与应用,李振，2019.5.21)为模板，用ccdBKan-F、ccdBKan-R引物序列(ccdBKan-F：CTTTGTTGCTGGTTTAAGAACGGTTTTATGGACAGCAAGCG、ccdBKan-R：AAAGTGCTAAGTGCCTTCATTTTGTTCAAAAAAAAGCCCGCTC)进行扩增，得到1388bpccdB-Kan片段，该片段带有E3up、E3down的长度为20bp的互搭序列。
将上述1中的E3up片段和E3down片段通过overlap PCR与ccdB-Kan片段互搭构成E3up-ccdB-Kan-E3down片段(序列2)。
序列2中，第1-500位为E3up，539-844位为ccdB，893-1687位为Kan，1849-2321位为E3down。
通过L-阿拉伯糖诱导GB08red gyrA462(博士学位论文：基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达平台的构建与应用,李振，2019.5.21)菌株使其带有同源重组功能，并用其制备电转感受态，将上述E3up-ccdB-Kan-E3down片段与含有野生人4型腺病毒基因组的质粒pBRAd4共同电转至该感受态中，利用Red/ET同源重组将该片段替换质粒pBRAd4的E3区的部分片段构建出具有筛选功能的中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan，此步通过Amp/Kan抗性进行正向筛选。
中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan为将E3up-ccdB-Kan-E3down片段(序列2)替换质粒pBRAd4中野生人4型腺病毒基因组的E3区部分片段(AY594253.1(03-FEB-2005)第27890-29435位所示)得到的载体。
2)鉴定
分别以含有野生人4型腺病毒基因组的质粒pBRAd4和pBRAd4-E3-ccdBKan质粒为模板，通过引物E3up-F和E3down-R进行PCR鉴定，应扩增出的片段大小分别为2519bp和2331bp。
PCR扩增产物进行DNA凝胶电泳鉴定，结果如图2C所示，泳道1为以含有野生人4型腺病毒基因组质粒pBRAd4为模板的PCR产物，泳道2为以构建的pBRAd4-E3-ccdBKan质粒为模板的PCR产物，可以看出，以含有野生人4型腺病毒基因组质粒pBRAd4为模板得到大小为2519bp的PCR扩增产物，以pBRAd4-E3-ccdBKan质粒为模板得到大小为2331bpPCR扩增产物。
将上述PCR产物送去测序，产物大小符合预期且比对结果显示100％一致，至此构建得到中间筛选质粒pBRAd4-E3-ccdBKan。
3、将表达盒插入质粒pBRAd4中野生人4型腺病毒基因组的E3区
图3A为pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD构建过程。
以上述1构建的pBM16A-E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down为模板，通过引物E3up-F、E3down-R利用PCR法克隆出E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down片段(序列1)。
通过L-阿拉伯糖诱导GB08Red菌株(博士学位论文：基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达平台的构建与应用,李振，2019.5.21)使其具有Red同源重组功能并制备电转感受态。将E3up-CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA-E3down片段(序列1)和上述2构建的pBRAd4-E3-ccdB-Kan筛选质粒共同电转至GB08Red电转感受态中，同源重组使CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA替换ccdB-Kan，选择电转后存活的菌落，构建最终的能表达的重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD(图3B)，此步利用Amp抗性进行正向筛选。
将上述电转后的2个单菌落1和2为模板，分别通过E3up-F、E3down-R和RBD-F和RBD-R两对引物进行PCR鉴定。
结果如图3C所示，泳道1、2为以构建的pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD质粒为模板，通过引物RBD-F、RBD-R经PCR得到的产物，泳道3、4为以构建的pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD质粒为模板，通过引物E3up-F、E3down-R经PCR得到的产物，可以看出，得到688bp和4148bp的目标片段，结果显示RBD基因已成功插入。
表达EGFP和RBD的重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD为将CMV-EGFP-IRES-RBD-polyA(序列1第506-3310位)替换pBRAd4质粒中的野生人4型腺病毒基因组的E3区部分片段(CTTTGTTGCTGGTTTAAGAA序列和ATGAAGGCACTTAGCA序列间的片段，具体为AY594253.1(03-FEB-2005)第27890-29435位所示的片段)得到的载体。
4、病毒包装及扩增
将重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD通过AsisI单酶切释放重组腺病毒基因组，通过酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀回收片段，得到线性化的重组腺病毒载体pBRAd4-E3-CMV-EGFP-IRES-RBD。
提前一天在6孔板中铺好HEK-293T细胞，使其在第二天转染时细胞密度达到80％左右，将3.5ug回收的线性化的重组腺病毒载体pBRAd4-E3-CMV-EGFP-IRES-RBD利用转染试剂Lipo3000转染至HEK-293T细胞中。
转染后，在24h、48h、72h三个时间点在荧光倒置显微镜下观察并拍照记录病毒包装情况，并在白光下观察并拍照记录病毒导致的CPE。
结果如图4所示，可以看出，随着时间的增加，绿色荧光蛋白EGFP表达量有所上升，CPE现象增多，说明该重组腺病毒表达载体可以被成功包装出病毒。该病毒命名为重组人4型腺病毒pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD。
继续培养5-7天，当在白光下观察到90％以上的细胞出现明显的CPE后，收毒：将病毒和细胞混合液在37℃和-80℃条件下反复冻融三次，每次0.5h左右。将冻融后的病毒液于4℃，1300rpm离心5min，吸取上层病毒液，弃掉下层细胞，将病毒液用0.2um滤膜过滤，此病毒液为P0代。将过滤好的病毒液于-80冷冻，备用。
P0代病毒收毒后，为了使病毒滴度上升并大量制备病毒液，将病毒在细胞中传代扩增。传代HEK-293T细胞，当细胞密度达到90％-95％时，弃掉原DMEM培养基，用PBS冲洗掉干净多余的培养基，将病毒液缓慢加入培养皿或瓶中，使其覆盖住细胞层，放置细胞培养箱中2h使病毒初步侵染细胞，吸出病毒液，用PBS冲洗一遍，加入含5％FBS的DMEM培养基，放置细胞培养箱中使病毒扩增直至90％以上的细胞出现CPE并使30％的细胞出现脱落时，收毒，重复以上步骤将病毒大量扩增。
扩增至P6代的结果如图5所示，可以看出，在扩增充分长的时间后，插入RBD基因的重组人4型腺病毒pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD至P6代都能够稳定传代、导致CPE并且在几乎所有细胞中大量表达绿色荧光蛋白EGFP。
重组人4型腺病毒pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD的基因组是将含有EGFP蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因、RBD蛋白的编码基因的表达盒(序列1第506-3310)替换野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段AY594253.1(03-FEB-2005)第27890-29435位所示；具体为CTTTGTTGCTGGTTTAAGAA序列和ATGAAGGCACTTAGCA序列间的片段)得到的核酸，且该重组腺病毒表达EGFP蛋白、IRES调控序列、RBD蛋白。
野生人4型腺病毒来源：Human adenovirus 4(货号：VR-1572，购自ATCC)
二、表达RBD的重组人4型腺病毒的评价
1、病毒细胞毒性的测定
在96孔板中铺HEK-293T细胞，分为实验组(细胞+病毒+cck-8)，对照组(细胞+cck-8)和空白组(空白)，每组铺3个复孔。观察细胞融合度达到90％左右后，用无血清DMEM培养基稀释上述一制备的重组人4型腺病毒pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD，每孔中细胞数量为105个，按照MOI＝1向每孔中加入野生人4型腺病毒(图中记作AD4wt)和上述一制备的重组人4型腺病毒pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD(图中记作rAD 4)，在加入病毒后的第24h、48h和72h向对应孔中加入cck-8液，静置2-3h后在酶标仪上测出OD值。细胞毒性用细胞生存率来表征。细胞生存率＝[A(实验组)-A(空白组)]/[A(对照组)-A(空白组)]×100％。
结果如图6所示，可以看出，细胞毒性检测结果表示重组病毒的细胞毒性较野生型有所降低，说明重组人4型腺病毒对人体细胞的伤害较野生型降低，达到一定的减毒效果。
2、western blot检测Hexon蛋白和抗原蛋白RBD表达
将上述一制备的重组人4型腺病毒pBRAd4-E3-CMV-EGFP-IRES-RBD和野生人4型腺病毒分别侵染HEK-293T细胞，提取细胞总蛋白并收取病毒上清液，分别使用Western Blot方法检测病毒衣壳蛋白Hexon。一抗选用小鼠来源的Hexon抗体(A7nH，来自武汉呼吸研究所)，稀释比例为1：4000，二抗选用山羊抗小鼠IgG(ZB-2305,中杉金桥),稀释比例为1：5000。
结果如图7所示，1为未感染病毒的阴性对照组(HEK-293T细胞)，2为感染野生人4型腺病毒的阳性对照组，3为感染重组人4型腺病毒的实验组；结果显示，未感染病毒的细胞检测不到Hexon表达，感染野生人4型腺病毒和重组人4型腺病毒的都可检测到Hexon蛋白的表达，结果确定重组人4型腺病毒可以成功包装。
进一步使用Western Blot检测抗原RBD蛋白的表达。一抗选用兔来源的RBD抗体(40591-T62，义翘神州)，稀释比例为1：2000，二抗选用山羊抗兔总IgG(ZB-2301，中杉金桥),稀释比例为1:10000。
结果如图8所示，1为重组人4型腺病毒感染的细胞，2为野生人4型腺病毒感染的细胞，3为重组人4型腺病毒感染的细胞培养基；可以看出，感染重组人4型腺病毒的细胞和培养基中都可检测到RBD蛋白的表达，而感染野生人4型腺病毒的细胞中并未检测到RBD表达，结果确定重组人4型腺病毒可以在细胞内表达RBD蛋白进而释放到细胞外。
3、小鼠免疫及RBD特异性抗体检测
将12只小鼠随机分为两组，每组6只，分别免疫PBS(图中记作PBS)和纯化后的滴度为2×108TCID50/mL的上述一制备的重组人4型腺病毒pBRAd4-E3-CMV-EGFP-IRES-RBD(图中记作AD4-RBD)，免疫方式为小鼠腹腔注射，免疫剂量为每只鼠100ul。
进行眼眶取血，采集100ul全血，4℃、8000rpm离心分离血清置-80℃保存。以杆状病毒昆虫细胞表达系统来源的RBD蛋白(名称：SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike Protein(RBD,His Tag)货号：Catalog Number:40592-V08B)作为抗原，以血清作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(ZB-2305,中杉金桥)作为二抗，通过ELISA法检测小鼠血清中RBD蛋白特异性抗体。
一免14天后取血检测，结果如图9所示，免疫PBS作为对照的小鼠血清中无RBD特异性抗体，免疫重组人4型腺病毒的小鼠血清中存在针对RBD蛋白的特异性抗体，且血清稀释1600倍后特异性抗体水平仍与对照组差异显著。
二免7天后取血检测，结果如图10所示，免疫重组人4型腺病毒的小鼠血清的抗体显著增加，效价可达1：12800。
上述结果表明，重组人4型腺病毒可以作为RBD疫苗。
Claims (10)
1.一种重组人4型腺病毒，其基因组为将含有荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因和RBD蛋白的编码基因的表达盒替换野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段得到的核酸，且该重组腺病毒表达所述荧光蛋白和所述RBD蛋白；
所述RBD蛋白来源于SARS-CoV-2的原始株。
2.根据权利要求1所述的重组人4型腺病毒，其特征在于：
所述野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段的核苷酸序列为AY594253.1的第27890-29435位。
3.根据权利要求1或2所述的重组人4型腺病毒，其特征在于：
所述含有荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因和RBD蛋白的编码基因的表达盒包括所述荧光蛋白的编码基因、所述IRES调控序列的编码基因、所述RBD蛋白的编码基因、以及驱动所述荧光蛋白和所述RBD蛋白表达的启动子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组人4型腺病毒，其特征在于：
所述荧光蛋白为EGFP蛋白；
或，所述驱动荧光蛋白和RBD蛋白表达的启动子为CMV启动子；
进一步地，所述含有荧光蛋白的编码基因、IRES调控序列的编码基因和RBD蛋白的编码基因的表达盒的核苷酸序列为序列1第506-3310位。
5.一种制备权利要求1-4任一所述重组人4型腺病毒的方法，包括如下步骤：
1)制备带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD和带有E3同源臂的ccdB-Kan片段；
所述带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD包括EGFP蛋白编码基因、IRES调控序列的编码基因、RBD蛋白的编码基因以及驱动EGFP蛋白和RBD蛋白表达的启动子；
2)将所述带有E3同源臂的ccdB-Kan片段和质粒pBRAd4共同导入具有Red同源重组功能的宿主菌突变体中同源重组，提取质粒，得到具有筛选功能的中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan；
所述中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan为将带有E3同源臂的ccdB-Kan片段替换质粒pBRAd4中所述野生人4型腺病毒基因组的E3区部分片段得到的载体；
所述质粒pBRAd4含有所述野生人4型腺病毒基因组；
3)将所述带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD和所述具有筛选功能的中间质粒pBRAd4-E3-ccdB-Kan共同导入具有Red同源重组功能的宿主菌中同源重组，提取质粒，得到重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD；
4)将所述重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD转入腺病毒包装细胞中包装，得到重组人4型腺病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述带有E3同源臂的表达盒EGFP-IRES-RBD的核苷酸序列为序列1；
所述带有E3同源臂的ccdB-Kan片段的核苷酸序列为序列2；
所述野生人4型腺病毒基因组中的E3区部分片段的核苷酸序列为AY594253.1的第27890-29435位。
7.由权利要求5或6所述方法制备的重组人4型腺病毒；
或，权利要求3中的重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD。
8.权利要求1-4任一所述的重组人4型腺病毒或权利要求7所述重组人4型腺病毒在制备具有如下任一功能的产品中的应用：
1)制备预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病产品；
2)制备新型冠状病毒抗体产品；
3)制备中和新型冠状病毒产品；
4)制备新型冠状病毒疫苗。
9.权利要求3中的所述重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD在制备具有如下任一功能的产品中的应用：
1)制备预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病产品；
2)制备新型冠状病毒抗体产品；
3)制备中和新型冠状病毒产品；
4)制备新型冠状病毒疫苗。
10.一种产品，其包括权利要1-4任一所述的重组人4型腺病毒或权利要求7所述的重组人4型腺病毒或权利要求3中的所述重组人4型腺病毒载体pBRAd4-E3-EGFP-IRES-RBD；
所述产品具有如下任一功能：
1)预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病；
2)产生新型冠状病毒抗体；
3)中和新型冠状病毒。
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