JP2023513913A - 麻疹ベクターを用いたｃｏｖｉｄ－１９免疫原性組成物及びワクチン - Google Patents

麻疹ベクターを用いたｃｏｖｉｄ－１９免疫原性組成物及びワクチン Download PDF

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Abstract

本発明は、コロナウイルスに対する免疫の分野に関する。この点において、本発明は、コロナウイルスに対する免疫応答を開始させるコロナウイルス由来のベクターに載せた抗原を提供する。したがって本発明は、コロナウイルス抗原を発現する生きた弱毒化組換え麻疹ウイルスである活性成分、及びSARS-CoV-2株に対する免疫、特に防御免疫、有利にはコロナウイルスの様々な株に対する広域スペクトルの防御免疫を惹起することにおけるその使用に関する。

Description

本発明は、コロナウイルスに対する免疫の分野に関する。
コロナウイルスは、大きいゲノム(26から32kb)を有するエンベロープに包まれたプラスセンス一本鎖RNAウイルスである。4つの属(アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ)が記載されており、それらのなかでもベータコロナウイルスは更に、4つの系統(A、B、C及びD)に細分されている。コロナウイルスに関して同定された宿主のなかでも特に、特定された鳥類及びヒトを含む哺乳類は、例年流行する株又はパンデミック的な大発生を引き起こしかねない株のいずれかに感染することが示されている。ヒトコロナウイルスとしては、例年の株であるHCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、並びに2003年に単離されたSARS-CoV(重症急性呼吸器症候群コロナウイルス)、又は2012年に単離され、今なお流行しているMERS-CoV(中東呼吸器症候群コロナウイルス)等のパンデミック株が挙げられる。SARS-CoV及びMERS-CoVは、それぞれベータコロナウイルス系統B及び系統Cに属する。これらのコロナウイルスは、空気中に浮遊して伝染し、ヒトからヒトに伝染することが示されている。
これらの公知の株のほかにも、2019-nCoVと名付けられた新しいコロナウイルス株(又は更に最近名付けられた重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2))が、現在中国で人に感染するものとして2019年に同定されており、これは世界中に蔓延しつつあり、結果として、多数の感染したヒト宿主で重症疾患又は死亡に至る。この高度に病原性の株は、保有動物からヒト集団に侵入し、コロナウイルスパンデミックに関する大きな懸念を生じさせるヒトからヒトへの伝染による症例死亡率を含む高い症例死亡率に関与することがすでに証明されている。2020年1月30日に、この大発生は、世界保健機関(WHO)によって国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態(Public Health Emergency of International Concern)と宣言され、次いで2020年3月11日にパンデミックとして特徴付けられた。WHOはまた、この新しいコロナウイルス疾患をCOVID-19と命名した。
WO04/000876 米国特許第8,586,364号
Escriouら、Virology、2014 Stephen F. Altschulら(1997).「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981)「Identification of common molecular subsequences.」J. Mol. Biol. 147:195～197 Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970)「A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.」J. Mol. Biol. 48:443～453 Cattaneo Rら、Cell. 1989 Mar 10;56(5):759～64 Horikami S.M. and Moyer S.A. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1995) 191、35～50) Combredet C.ら(Journal of Virology、Nov 2003、p11546～11554) Neumann G.ら(Journal of General Virology (2002) 83、2635～2662) Combredetら、J Virol、2003 Reedら、Am. J. Hyg.、1938 adenovirus 5 expressing the human ACE2 receptor of SARS-CoV-2、 Kuら、2021 Reuterら、PLoS ONE、2012、7(3)、e33989、1～8
これまで世界でほぼ1億人がSARS-CoV-2パンデミックの影響を受け、200万人より多くがCOVID-19で死亡した。パンデミックは、かつてない世界規模の社会的及び経済的な崩壊をもたらした、世界的に「楽観的にみた場合の損失」が3.3兆ドルと見積もられ、最悪の場合のシナリオでは82兆ドルの損失と見積もられた(The GDP Risk; 2020)。現在、欧州と北半球で、ウイルスは第2波において爆発的に広がりつつあるが、疾患を防止するか又は治癒させるための具体的な処置は示されていない。公衆衛生上の処置を強化することと共に、有効なワクチンが、COVID-19前の正常な状態に戻すために必要である。したがって、SARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導するための、潜在的には、SARS-CoV-2に対する保護、又は場合によってはより広範なコロナウイルス株、例えば、流行性又はパンデミック株に対する保護を提供するためのワクチン候補を提案する必要がある。
この発明は、これらの及び他の必要性を満たす。
本発明は、コロナウイルスに対する免疫応答を開始させるコロナウイルス由来のベクターに載せた抗原を提供する。したがって本発明は、コロナウイルス抗原を発現する生きた弱毒化組換え麻疹ウイルスである活性成分、及び2019-nCoV(SARS-CoV-2)株に対する免疫、特に防御免疫、有利にはコロナウイルスの様々な株に対する広域スペクトルの防御免疫を惹起することにおけるその使用に関する。本発明はまた、SARS-CoV-2の天然抗原由来のポリペプチドであって、効率的な免疫原を設計する、特にコロナウイルス感染に対するワクチン候補を設計するための有用な特性を有するポリペプチドにも関する。本発明はまた、SARS-CoV-2の天然抗原をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2の天然抗原由来のポリペプチド、特に、組換え麻疹ウイルスによる発現のために、若しくは生産細胞からの回収の改善のために適合させたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。
本発明はまた、SARS-CoV-2の抗原から得られたポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスを調製するための手段、及びそのようにして得られた組換え麻疹ウイルスも対象とする。
本発明はまた、SARS-CoV-2の抗原から得られたポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスを含む免疫原性組成物にも関する。本発明はまた、動物宿主、特に哺乳類宿主、特にヒト宿主において、SARS-CoV-2に対する、任意選択で、他のコロナウイルスに対する、又は感染によって引き起こされる疾患に対する防御免疫応答を惹起するための、このような免疫原性組成物の使用にも関する。本発明はまた、SARS-CoV-2による感染に対する、任意選択で他のコロナウイルスに対する、又は感染によって引き起こされる疾患に対する、それを必要とする宿主の処置、特に予防的処置のための方法にも関する。
特に、第1の態様において、本発明は、麻疹ウイルス(MV)の弱毒化株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び(a)SARS-CoV-2の配列番号3のスパイク(S)タンパク質、又は(b)配列番号11のS1ポリペプチド、配列番号13のS2ポリペプチド、配列番号7のSectoポリペプチド及び配列番号16のトリSectoポリペプチドからなる群から選択される、(a)における全長Sタンパク質の免疫原性断片、又は(c)1～10アミノ酸が挿入、置換、又は欠失によって改変されている(a)若しくは(b)のバリアントをコードする第1の異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する。一部の実施態様において、(c)におけるバリアントは、(i)発現された全長Sタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する突然変異、及び/又は(ii)Sタンパク質のフューリン切断部位を不活性化する突然変異、及び/又は(iii)小胞体回復シグナル(EERS)を不活性化する突然変異、及び/又は(iv)Sタンパク質のS1ドメインに位置する受容体結合ドメイン(RBD)を閉じたコンフォメーションに維持する突然変異を含むポリペプチドをコードし、第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置された追加の転写単位(ATU)(ATU2)に、又はMVのH遺伝子の下流に配置されたATU(ATU3)に置かれている。一部の実施態様において、発現された全長Sタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する突然変異は、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2つのプロリン残基の置換による突然変異(K986P及びV987P)、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の817、892、899、942、986位及び987位における6つのプロリン残基の置換による突然変異(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P及びV987P)であり、及び/又はSタンパク質のフューリン切断部位を不活性化する突然変異は、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682、683位及び685位におけるS1/S2フューリン切断部位で生じる3つのアミノ酸残基の置換による突然変異(R682G、R683S及びR685G)であるか、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質の675位におけるアミノ酸と685位におけるアミノ酸との間のS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失による突然変異であり、ループは、配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARからなり、及び/又はEERSを不活性化する突然変異は、配列番号3のアミノ酸配列の1269位及び1271位における2つのアラニン残基の置換による突然変異であり、及び/又はSタンパク質のS1ドメインに位置するRBDを閉じたコンフォメーションに維持する突然変異は、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の383位及び985位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(S383C及びD985C)、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の413位及び987位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(G413C及びP987C)であり;及び/又は(c)におけるバリアントは、配列番号3のアミノ酸配列の69位及び70位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の144位及び145位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の501位におけるチロシン残基の置換による突然変異(N501Y)、配列番号3のアミノ酸配列の570位におけるアスパラギン酸残基の置換による突然変異(A570D)、配列番号3のアミノ酸配列の681位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(P681H)、配列番号3のアミノ酸配列の716位におけるイソロイシン残基の置換による突然変異(T716I)、配列番号3のアミノ酸配列の982位におけるアラニン残基の置換による突然変異(S982A)、配列番号3のアミノ酸配列の1118位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(D1118H)、配列番号3のアミノ酸配列の484位におけるリシン残基の置換による突然変異(E484K)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるアスパラギン残基の置換による突然変異(K417N)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるスレオニン残基の置換による突然変異(K417T)及び配列番号3のアミノ酸配列の614位におけるグリシン残基の置換による突然変異(D614G)からなる群から選択される突然変異を含むポリペプチドをコードする。
第1の態様の一部の実施態様において、核酸構築物は、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド又はNポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、マトリックス(M)ポリペプチド又はMポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、Eポリペプチド又はEポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、8aポリペプチド又は8aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、7aポリペプチド又は7aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、3Aポリペプチド又は3aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、及びそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドを更に含み;第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている。
第1の態様の一部の実施態様において、第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号5、7、9、15、17、19、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62及び65からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
第1の態様の一部の実施態様において、第2の異種ポリヌクレオチドは、配列番号22のNポリペプチド、配列番号24のMポリペプチド又はそのエンドドメイン、配列番号23のEポリペプチド、配列番号25のORF8ポリペプチド、配列番号27のORF7aポリペプチド、及び配列番号26のORF3aポリペプチドの少なくとも1つをコードする。
第1の態様の一部の実施態様において、第1の異種ポリヌクレオチドは、
i.Sポリペプチドをコードする配列番号1又は2又は36、
ii.S1ポリペプチドをコードする配列番号10、
iii.S2ポリペプチドをコードする配列番号12、
iv.stab-Sポリペプチド(S2P)をコードする配列番号4、
v.Sectoポリペプチドをコードする配列番号6、
vi.stab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号8、
vii.stab-S2ポリペプチドをコードする配列番号14、
viii.トリSectoポリペプチドをコードする配列番号16、
ix.tristab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号18、
x.S3Fポリペプチドをコードする配列番号42、
xi.S2P3Fポリペプチドをコードする配列番号44、
xii.S2PΔFポリペプチドをコードする配列番号46、
xiii.S2PΔF2Aポリペプチドをコードする配列番号48、
xiv.T4-S2P3Fポリペプチド(tristab-Secto-3F)をコードする配列番号51、
xv.S6Pポリペプチドをコードする配列番号53、
xvi.S6P3Fポリペプチドをコードする配列番号55、
xvii.S6PΔFポリペプチドをコードする配列番号57、
xviii.SCCPPポリペプチドをコードする配列番号59、
xix.SCC6Pポリペプチドをコードする配列番号61、
xx.SMVopt2Pポリペプチドをコードする配列番号63、
xxi.SMVoptΔFポリペプチドをコードする配列番号64、及び
xxii.SMVopt2PΔFポリペプチドをコードする配列番号66
からなる群から選択されるオープンリーディングフレームを有する。
第1の態様の一部の実施態様において、核酸構築物は、5'末端から3'末端に、以下のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド:
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)請求項1～3、4及び6のいずれか一項で定義された第1の異種ポリヌクレオチド;
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むcDNA構築物であり、
ポリヌクレオチドは、核酸構築物内に作動可能に連結されており、ウイルス複製及び転写調節エレメント、例えばMVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある。
第1の態様の一部の実施形態において、核酸構築物は、(a)弱毒化MV株の、特にSchwarz株又はMoraten株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに隣接して、核酸構築物の5'末端に、GGGモチーフ、続いてハンマーヘッド型リボザイム配列、及び(b)全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接して、組換えMV-CoV核酸分子の3'末端に、リボザイムのヌクレオチド配列、特にデルタ型肝炎ウイルスリボザイム(δ)の配列を更に含む。
第2の異種ポリヌクレオチドを有する第1の態様の一部の実施形態において、第2の異種ポリヌクレオチドは、SARS-CoV-2のNポリペプチドをコードし、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドをクローニングするのに使用されるATUと異なる位置のATU中にクローニングされる。
第1の態様の一部の実施形態において、(i)第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号36、配列番号63、配列番号64及び配列番号66からなる群から選択される配列を含み、ATU2内に置かれているか、又は(ii)第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号2、配列番号4、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59及び配列番号61からなる群から選択される配列を含み、ATU3内に置かれている。
第1の態様の一部の実施形態において、(i)第1の異種ポリヌクレオチドは、ATU3内に置かれており、第2の異種ポリヌクレオチドは、ATU2内に置かれているか、又は(ii)第1の異種ポリヌクレオチドは、ATU2内に置かれており、第2の異種ポリヌクレオチドは、ATU3内に置かれている。
第1の態様の一部の実施形態において、麻疹ウイルスは、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、CAM-70株、TD97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株である。
第2の態様において、本発明は、(1)麻疹ウイルス(MV)の弱毒化株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び(2)配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列中に挿入、置換、又は欠失を含むSARS-CoV-2のSタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチド又はその免疫原性断片を含む核酸構築物であって、挿入、置換、又は欠失は、Sタンパク質又はその免疫原性断片の細胞表面発現を増加させ、第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置された追加の転写単位(ATU)(ATU2)に、又はMVのH遺伝子の3'に配置されたATU(ATU3)に置かれている、核酸構築物を提供する。一部の実施形態において、Sタンパク質又はその免疫原性断片は、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列中に置換を含む。一部の実施形態において、Sタンパク質又はその免疫原性断片は、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列の全部又は一部の欠失を含む。一部の実施形態において、コードされたSタンパク質又はその免疫原性断片は、発現されたSタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する1つ又は複数の追加の置換を更に含む。一部の実施形態において、コードされたSタンパク質又はその免疫原性断片は、配列番号3のアミノ酸配列のK986及びV987位に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換K986P及びV987Pを更に含む。一部の実施形態において、コードされたSタンパク質又はその免疫原性断片は、二重ドメインSタンパク質である。一部の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、ATU2に置かれている。一部の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、(a)配列番号76の融合前安定化SF-2P-dERポリペプチド、若しくは986位及び987位で変更されていない、配列番号76と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(b)配列番号82の融合前安定化SF-2P-2aポリペプチド、若しくは986位、987位、1269位、及び1271位で変更されていない、配列番号82と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアントをコードする。一部の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、(a)配列番号76の融合前安定化SF-2P-dERポリペプチド;又は(b)配列番号82の融合前安定化SF-2P-2aポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、SF-2P-dERポリペプチドをコードする配列番号75、又はSF-2P-2aポリペプチドをコードする配列番号81を含む。一部の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、SF-2P-dERポリペプチドをコードする配列番号75を含む。
第2の態様の一部の実施形態において、核酸構築物は、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド又はNポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;マトリックス(M)ポリペプチド又はMポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;Eポリペプチド又はEポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;8aポリペプチド又は8aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;7aポリペプチド又は7aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;3Aポリペプチド又は3ポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;及びそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドを更に含み、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている。
第2の態様の一部の実施形態において、核酸構築物は、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド;マトリックス(M)ポリペプチド;Eポリペプチド;8aポリペプチド;7aポリペプチド;3Aポリペプチド;及びそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドを更に含み、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている。一部の実施形態において、第2の異種ポリヌクレオチドは、Nポリペプチドをコードし、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている。
第2の態様の一部の実施形態において、第2の異種ポリヌクレオチドは、配列番号22のNポリペプチド、配列番号24のMポリペプチド又はそのエンドドメイン、配列番号23のEポリペプチド、配列番号25のORF8ポリペプチド、配列番号27のORF7aポリペプチド及び/又は配列番号26のORF3aポリペプチドの少なくとも1つをコードし、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている。
第2の態様の一部の実施形態において、第2の異種タンパク質は、MVのN遺伝子上流であるATU(ATU1)内であるか、MVのP遺伝子とM遺伝子との間のATU(ATU2)内であるか、又はMVのH遺伝子とL遺伝子との間のATU(ATU3)内である。
第2の態様の一部の実施形態において、核酸構築物は、5'から3'に、以下のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド:
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)第1の異種ポリヌクレオチド;
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を更に含み、
ポリヌクレオチドは、核酸構築物内に作動可能に連結されており、MVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある。
第2の態様の一部の実施形態において、核酸構築物は、
(a)弱毒化MV株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに隣接して、核酸構築物の5'末端に、GGGモチーフ、続いてハンマーヘッド型リボザイム配列;及び
(b)弱毒化MV株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接して、核酸構築物の3'末端に、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム(δ)のヌクレオチド配列
を更に含む。
第2の態様の一部の実施形態において、麻疹ウイルスは、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、CAM-70株、TD97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株、及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株である。一部の実施形態において、核酸構築物は、Schwarz株である麻疹ウイルスを更に含む。
本発明の第1及び第2の態様の核酸の構築は、本発明のさらなる態様に取り込むことができる。
第3の態様において、本発明は、本発明の核酸構築物を含む、組換え麻疹ウイルス(MV)のレスキューのためのトランスファーベクターを提供する。一部の実施形態において、トランスファーベクターは、
i.配列番号1又は2又は36(構築物S)、
ii.配列番号4(構築物stab-S)、
iii.配列番号6(構築物Secto)、
iv.配列番号8(構築物stab-Secto)、
v.配列番号10(構築物S1)、
vi.配列番号12(構築物S2)、
vii.配列番号14(構築物stab-S2)、
viii.配列番号16(構築物トリSecto)、
ix.配列番号18(構築物tristab-Secto)、
x.配列番号42(構築物S3F)、
xi.配列番号44(構築物S2P3F)、
xii.配列番号46(構築物S2PΔF)、
xiii.配列番号48(構築物S2PΔF2A)、
xiv.配列番号21又は37(構築物N)、
xv.配列番号51(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
xvi.配列番号53(構築物S6P)、
xvii.配列番号55(構築物S6P3F)、
xviii.配列番号57(構築物S6PΔF)、
xix.配列番号59(構築物SCCPP)、
xx.配列番号61(構築物SCC6P)、
xxi.配列番号63(構築物SMVopt2P)、
xxii.配列番号64(構築物SMVoptΔF)、及び
xxiii.配列番号66(構築物SMVopt2PΔF)
からなる群から選択されるSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする配列を含む。
第4の態様において、本発明は、本発明の核酸構築物を含むプラスミドベクターであって、配列番号29(pTM2-MVSchw-gfpであり、pTM-MVSchw2-GFPbis又はpTM-MVSchwarz-ATU2とも称される)又は配列番号38(pTM3-MVSchw-gfpであり、pTM-MVSchw3-GFP又はpTM-MVSchwarz-ATU3とも称される)である、プラスミドベクターを提供する。
第5の態様において、本発明は、本発明の核酸構築物を含む組換え麻疹ウイルスを提供する。一部の実施形態において、組換え麻疹ウイルスは、Schwarz株の組換え麻疹ウイルスである。一部の実施形態において、組換え麻疹ウイルスは、そのゲノム中に、それに作動可能に連結した発現カセットを含み、発現カセットは、本発明による核酸構築物を含む。一部の実施形態において、組換え麻疹ウイルスは、SARS-CoV-2株のN、M、E、ORF7a、ORF8及びORF3a、又はその免疫原性断片から選択される少なくとも1つのポリペプチドを更に発現する。
第6の態様において、本発明は、本発明の組換え麻疹ウイルスを含む免疫原性組成物及びワクチンを提供する。一部の実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、対象においてSARS-CoV-2ウイルスに対する免疫応答を誘導することにおける使用のためである。一部の実施形態において、免疫原性組成物及びワクチンは、(i)有効量の本発明の組換え麻疹ウイルス、及び(ii)医薬的に許容されるビヒクルを含み、組成物又はワクチンは、単回の免疫化の後、動物宿主においてSARS-CoV-2のポリペプチドに対する中和体液性応答及び/又は細胞応答を惹起する。一部の実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、それを必要とする宿主においてSARS-CoV-2に対する防御的な体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を惹起することにおける使用のためである。
第7の態様において、本発明は、本発明の組換え麻疹ウイルスをレスキューするための方法を提供する。本方法は、
(a)T7 RNAポリメラーゼ並びに麻疹ウイルスN及びPタンパク質を安定して発現するヘルパー細胞に、(i)本発明による核酸構築物、又は本発明による核酸構築物を含むプラスミドベクター、及び(ii)MVLポリメラーゼをコードするベクターをコトランスフェクトする工程;
(b)トランスフェクトされたヘルパー細胞を、組換え麻疹ウイルスの生産に好適な条件で維持する工程;
(c)組換え麻疹ウイルスの伝播を可能にする細胞を、それらを工程(b)のトランスフェクトされたヘルパー細胞と共培養することによって感染させる工程;
(d)組換え麻疹ウイルスを回収する工程
を含んでいてもよい。
第8の態様において、本発明は、
i.配列番号1又は2又は36(構築物S);
ii.配列番号4(構築物stab-S);
iii.配列番号6(構築物Secto);
iv.配列番号8(構築物stab-Secto);
v.配列番号10(構築物S1)、
vi.配列番号12(構築物S2)、
vii.配列番号14(構築物stab-S2)、
viii.配列番号16(構築物トリSecto)、
ix.配列番号18(構築物tristab-Secto)、
x.配列番号42(構築物S3F)、
xi.配列番号44(構築物S2P3F)、
xii.配列番号46(構築物S2PΔF)、
xiii.配列番号48(構築物S2PΔF2A)、
xiv.配列番号21又は37(構築物N)、
xv.配列番号51(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
xvi.配列番号53(構築物S6P)、
xvii.配列番号55(構築物S6P3F)、
xviii.配列番号57(構築物S6PΔF)、
xix.配列番号59(構築物SCCPP)、
xx.配列番号61(構築物SCC6P)、
xxi.配列番号63(構築物SMVopt2P)、
xxii.配列番号64(構築物SMVoptΔF)、
xxiii.配列番号66(構築物SMVopt2PΔF)、
xxiv.配列番号75(構築物SF-2P-dER)、及び
xxv.配列番号81(構築物SF-2P-2a)
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
第9の態様において、本発明は、
i.配列番号3(構築物S);
ii.配列番号5(構築物stab-S);
iii.配列番号7(構築物Secto);
iv.配列番号9(構築物stab-Secto);
v.配列番号11(構築物S1)、
vi.配列番号13(構築物S2)、
vii.配列番号15(構築物stab-S2)、
viii.配列番号17(構築物トリSecto)、
ix.配列番号19(構築物tristab-Secto)、
x.配列番号43(構築物S3F)、
xi.配列番号45(構築物S2P3F)、
xii.配列番号47(構築物S2PΔF)、
xiii.配列番号49(構築物S2PΔF2A)、
xiv.配列番号22(構築物N)、
xv.配列番号52(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
xvi.配列番号54(構築物S6P)、
xvii.配列番号56(構築物S6P3F)、
xviii.配列番号58(構築物S6PΔF)、
xix.配列番号60(構築物SCCPP)、
xx.配列番号62(構築物SCC6P)、
xxi.配列番号65(構築物SMVoptΔF)、
xxii.配列番号76(構築物SF-2P-dER)、及び
xxiii.配列番号82(構築物SF-2P-2a)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
第10の態様において、本発明は、本発明のトランスファーベクターによって発現された組換えタンパク質を提供する。組換えタンパク質は、in vitro又はin vivoで発現させてもよい。一部の実施形態において、組換えタンパク質は、精製のためのアミノ酸タグを更に含む。
第11の態様において、本発明は、SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル中の抗原に対する抗体の存在の検出のための、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26、27、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62、65、76及び82のいずれか1つの配列を有する抗原のin vitroにおける使用であって、ポリペプチドを生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する、使用を提供する。
12番目の態様において、本発明は、生物学的サンプルを、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26、27、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62、65、76、及び82のいずれか1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその免疫原性断片と接触させる工程、及び生物学的サンプル中に存在する抗体と、ポリペプチドとの抗体-抗原複合体の形成を検出する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、生物学的サンプルは、SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から得られる。
第13の態様において、本発明は、対象(例えばヒト宿主)においてSARS-CoV-2による感染を処置又は防止するための方法であって、本発明による免疫原性組成物又はワクチンを対象に投与することを含む方法を提供する。対象(例えばヒト宿主)においてSARS-CoV-2に対する防御免疫応答を誘導するための方法であって、本発明による免疫原性組成物又はワクチンを対象に投与する工程を含む方法も提供される。感染を処置又は防止する、又は免疫応答を誘導する方法の一部の実施形態において、本方法は、免疫原性組成物又はワクチンの第1の投与、及び免疫原性組成物又はワクチンの第2の投与を含む。一部の実施形態において、第2の投与は、第1の投与後の1ヶ月から2ヶ月の間に実行される。
プラスミドpKP-MVSchw(17858bp)の制限マップである。 SARS-CoV-2スパイクタンパク質の一次構造及び突然変異の位置の模式図である。スパイクタンパク質は、フューリン切断部位によって分離される2つのサブドメインS1及びS2からなる。S2ドメインでは、ヘプタッド反復配列1(HR1)、中央ヘリックス(CH)、コネクタドメイン(CD)、ヘプタッド反復配列2(HR2)、膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質尾部(CT)が示される。記載される突然変異の位置は、矢印で示される。全長タンパク質を安定させるフューリン切断部位の突然変異(3F:R682G+R683S+R685G)又は欠失(DetaF:6756QTQTNSPRRAR-685);突然変異(2P: K986P+V987P)は融合前の形態のタンパク質をロックする;細胞表面発現を潜在的に増強する小胞体回収シグナルの突然変異(K1269A+H1271A)。 図3A ～3Bは、組換えMVベクターのSARS-CoV-2スパイク構築物の模式図である。3A。Sタンパク質及び改変位置の簡略模式図。3B/3C。SARS-CoV-2スパイクの合成配列をMVベクターのATU3(3B)又はATU2(3C)位置にクローニングした。ATU3の全ての構築物は、全長膜結合Sタンパク質の完全ヒトコドン最適化配列(配列番号2)に基づく。ATU2の全ての構築物は、麻疹最適化配列(MVopt、配列番号36)に基づく。異なる構築物におけるSタンパク質の改変が示され、対応する救済されたウイルスの名称が示される。MVタンパク質は、以下の通りに表される: N(核タンパク質)、P(リンタンパク質)、M(マトリックス)、F(融合タンパク質)、H(血球凝集素)、L(大タンパク質)、T7 RNAポリメラーゼプロモーター(T7)、T7 RNAポリメラーゼターミネーター(T7t)、ハンマーヘッドリボザイム(hh)、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム(hδh)。 図4A～4Bは、細胞溶解物におけるウエスタンブロットによるSARS-CoV-2 Sの検出を示す図である。Vero細胞は、0.05のMOIでA) MV-ATU3-S又はB) MV-AUT3-S2P、MV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF若しくはMV-ATU3-S2PΔF2A又は親のMV Schwarz株(MVSchw)に感染させたか、又は感染させなかった(NI)。全細胞抽出物は感染から39時間後に調製し、NuPAGE 4～12%ビス-トリスゲルでの電気泳動によって分離し、PVDF膜に転写し、抗-SARS-CoV-1スパイクポリクローナルウサギ抗体(Escriouら、Virology、2014)、AlexaFluor 680コンジュゲート抗ウサギ抗体及び近赤外線画像化で検出した。ローディング対照として、抗MV核タンパク質ポリクローナルウサギ抗体(Covalab)を使用して麻疹のNタンパク質を検出した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質、S1及びS2サブドメイン並びに麻疹Nタンパク質、並びに分子量マーカー(kDa)の位置を示す。 図5A及び5Bは、様々な組換えMVの比較的融合誘導特性を示す図である。Vero細胞は、0.05のMOIでA) MV-ATU3-S、又はB) MV-AUT3-S2P、MV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF若しくはMV-ATU3-S2PΔF2A、又は親のMV Schwarz株(MVSchw)に感染させた。細胞単層を感染の39時間後に観察し、融合細胞の領域をマークした。 図6A及び6Bは、SARS-CoV-2スパイクを発現する組換えMVによる初回及び追加免疫化の後のIFNAR-KOマウスにおける麻疹(A)及びSARS-CoV-2 S(B)への抗体応答を示す図である。マウスは、親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S(S)、MV-AUT3-S2P(S2P)、MV-ATU3-S2P3F(S2P3F)、MV-ATU3-S2PΔF(S2PΔF)又はMV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)で免疫化した。抗体応答は、初回(グラフの左部分)又は追加免疫(グラフの右部分)の後に収集した血清において、麻疹特異的ELISA(A)及びSARS-CoV-2スパイク特異的ELISA(B)によって測定した。バーは、中央値を示す。抗MV ELISAにおける検出限界(点線)は、50 ELISA単位であった。抗S ELISAの検出限界は、追加免疫の後に収集した血清では200 ELISA単位であり、全ての他の分析では50 ELISA単位であった。2つ以上の独立した実験の代表的な結果が示される。 図7A及び7Bは、SARS-CoV-2スパイクを発現する組換えMVによる初回及び追加免疫化の後のIFNAR-KOマウスにおけるSARS-CoV-2微量中和力価を示す図である。A。マウスは、親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S(S)、MV-AUT3-S2P(S2P)、MV-ATU3-S2P3F(S2P3F)、MV-ATU3-S2PΔF(S2PΔF)又はMV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)で免疫化した。中和力価は初回(グラフの左部分)又は初回/追加(グラフの右部分)免疫化の後の微量中和アッセイによって測定し、細胞変性効果によって評価された50%のSARS-CoV-2感染性の中和をもたらした血清希釈の逆数で表した。バーは、中央値を示す。検出限界は、20の力価であった。検出不能な中和活性を有する試料には、検出限界の半分に等しい10の値を割り当てた。2つ以上の独立した実験の代表的な結果が示される。B。微量中和アッセイにおけるNational Institute of Biological Standards and Controls (NIBSC)により提供された研究試薬20/118(4つの回復期のヒト血清、20/120、122、124、126及び対照ヒト血清128を含むパネル)及び20/130の調査は、結果の他のアッセイとの比較を可能にした。研究試薬は、MV-ATU3- S2PΔFによる第2の免疫化の後に得られた血清のプール(S2PΔF-IS2プール)と一緒に、中和アッセイで異なる日に4回測定した。同じSARS-CoV-2株の2つの異なる保存株(C2及びC3.4)を使用した。アッセイで使用した逆滴定されたSARS-CoV-2 TCID50が示される。NIBSCにより提供された結果が比較のために掲載され、細胞変性効果(CPE)又はプラークアッセイ(PRNT50)によって評価されたウイルス感染性の50%の阻害をもたらした血清希釈の逆数で表される。 追加免疫化の後の免疫化されたマウスにおけるMV及びS特異的IFN-γT細胞を示す図である。マウスは、MV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)又は親のMV Schwarz(MVSchw)により3週間隔で2回免疫化した。Sタンパク質(S1、S2)にわたるペプチドプール又は2つの特異的麻疹ペプチドのプールで刺激した脾細胞における合計したIFN-γELISpot応答(スポット形成単位、SPU)が示される。バーは、中央値を示す。 図9A～9Cは、SARS-CoV-2スパイクを発現する組換えMVで免疫化したマウスにおけるMV及びS特異的CD4+及びCD8+ T細胞応答を示す図である。マウスは、MV-ATU3-S(S)、MV-AUT3-S2P(S2P)、MV-ATU3-S2P3F(S2P3F)、MV-ATU3-S2PΔF(S2PΔF)、MV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)又は親のMV Schwarz (Schw)で免疫化した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1又はS2ドメインにわたるペプチドプールに応答してTh1特有サイトカインIFN-γ及びTNF-α又はTh2特有サイトカインIL-5及びIL-13を生成する脾臓のCD4+ T細胞(A)又はCD8+ T細胞(B)の頻度が累積的に示される(S1及びS2プールへの応答の合計)。MV(2つのH-2bクラスI制限麻疹ペプチドのプール)へのINF-γ/TNF-α又はIL-5/IL-13 CD8+ T細胞の応答をパネルCに示す。 図10A～10Dは、MV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスにおけるMV及びS特異的二重及び単一サイトカイン陽性CD4+及びCD8+ T細胞応答を示す図である。マウスは、MV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)又は親のMV Schwarz(MVSchw)により免疫化した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1又はS2ドメインにわたるペプチドプールに応答してTh1特有サイトカインIFN-γ及びTNF-α又はTh2特有サイトカインIL-5及びIL-13を生成する脾臓のCD4+ T細胞(A)又はCD8+ T細胞(C)(それぞれ二重陽性細胞)の頻度が累積的に示される(S1及びS2プールへの応答の合計)。更に、2つのH-2bクラスI制限麻疹ペプチドのプールを、MV主鎖へのT細胞応答を調査するために使用した。TNF-α生成CD4+ T細胞を除いて、MV-ATU3-S2PΔF2A又はMVSchw対照で免疫化したマウスでは、Sペプチドプールに応答した単一のサイトカイン生成CD4+ T細胞(B)又はCD8+ T細胞(D)の頻度は、有意に異ならなかった(ns)。統計分析は、マン-ホイットニー検定(**p≦0.005、*p≦0.05)を使用して実行した。 図11A～11Dは、SARS-CoV-2を発現する組換えMVによる初回及び追加免疫化の後のIFNAR-KOマウスにおけるIgG1及びIgG2a応答を示す図である。マウスは、親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S(S)、MV-AUT3-S2P(S2P)、MV-ATU3-S2P3F(S2P3F)、MV-ATU3-S2PΔF(S2PΔF)又はMV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)で免疫化した。A。ELISAによって測定したSARS-CoV-2スパイクに対するアイソタイプ特異的(IgG1及びIgG2a)抗体応答。バーは、中央値を示す。検出限界は、50ELISA単位であった。B。各構築物/免疫原のために計算したIgG2aのIgG1に対する比。C。wt 129/SvマウスをHEK293細胞で発現されるミョウバンアジュバント加用三量体化スパイクエクトドメイン(T4S2P3F-8H)で免疫化することによって、対照実験を実行した。 図12A～12Bは、初回及び追加免疫化の後(A)又は単一の免疫化の後(B)のSARS-CoV-2による抗原投与に対するマウスの防御を示す図である。A。マウスは、親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S(S)、MV-AUT3-S2P(S2P)、MV-ATU3-S2PΔF(S2PΔF)又はMV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)で4週間隔で2回免疫化した。血液試料は第2の免疫化の20日後にとり、それぞれの中和力価を決定した(μNT)。マウスは、追加免疫の25日後にAd5:hACE2を注入し、4日後にSARS-CoV-2で抗原投与した。B。マウスは、親のMV Schwarz株(Schw)又はMV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)により1回免疫化した。血液試料は免疫化の165日後にとり、μNT力価を決定した。マウスは173日目にAd5:hACE2 25を注入し、4日後に抗原投与した。両方の実験で、抗原投与の4日後に肺を採取した。肺ウイルス量を、ゲノム当量(GEQ)でのRNAレベル又はプラーク形成単位(PFU)での感染性力価について肺ごとに決定した。微量中和力価、GEQ及び感染性ウイルスにおける差の統計的有意性は、ダンの未補正事後分析によるノンパラメトリッククラスカル-ワリスの検定(A)又はマン-ホイットニー検定(B)を使用して調査した。*p<0.05、**p<0.005、***p<0.0005、****p<0.0001。分析は、GraphPad Prism 8を使用して実行した。 図13A～13Bは、ATU2及びATU3構築物の細胞溶解物におけるウエスタンブロットによるSARS-CoV-2 Sの検出を示す図である。Vero細胞は、(A)親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S(S)の4つの異なるクローン(1～4)、又はMV-ATU2-SMVopt(SMVopt)の6つの異なるクローン(1～6)、及び(B)親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU2- SMVopt(SMVopt)の1つの代表的なクローン、MV-ATU3- S2P(S2P)、MV-ATU3- S2P3F(S2P3F)、MV-ATU3-S2PΔF(S2PΔF)又はMV-ATU2-SMVopt2P(SMVopt2P)の2つの異なるクローン(1、2)、MV-ATU2-SMVoptΔF(SMVoptΔF)、MV-ATU2-SMVopt2PΔF(SMVopt2PΔF)によりMOI=1で感染させた。タンパク質細胞抽出物は感染から24時間後に調製し、NuPAGE 4～12%ビス-トリスゲルでの電気泳動によって分離し、PVDF膜に転写し、抗-SARS-CoV-2スパイクポリクローナルウサギ抗体、AlexaFluor 680コンジュゲート抗ウサギ抗体及び近赤外線画像化で調べた。ローディング対照として、抗MV核タンパク質ポリクローナルウサギ抗体(Covalab)を使用して麻疹のNタンパク質を検出した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質、S1及びS2サブドメイン、並びに麻疹Nタンパク質、並びに分子量マーカー(kDa)の位置を示す。 図14A～14Cは、ATU2又はATU3におけるSARS-CoV-2スパイクを発現する組換えMVによる免疫化の後のIFNAR-KOマウスにおける、麻疹(A)及びSARS-CoV-2 S(B)及び微量中和力価(C)への抗体応答を示す図である。マウスは、親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S(S)又はMV-ATU2-SMVopt(SMVopt)により免疫化した。初回又は追加免疫の後に収集した血清中の抗体応答は、麻疹特異的ELISA(A)及びSARS-CoV-2スパイク特異的ELISA(B)によって測定し、中和抗体は微量中和アッセイ(C)によって測定した。バーは、中央値を示す。定量化の下限は点線によって示した。 6P安定化SARS-CoV-2スパイクを発現する組換えMV Schwarzのin vitro及びin vivo評価を示す図である。Vero細胞は、1のMOIでMV-ATU3-S、MV-AUT3-S2P、MV-ATU3-S2PΔF又はMV-AUT3-S6P (2つのウイルスクローン)、又は親のMV Schwarz株(MVSchw)に感染させたか、又は感染させなかった(NI)。全細胞抽出物は感染から24時間後に調製し、NuPAGE 4～12%ビス-トリスゲルでの電気泳動によって分離し、PVDF膜に転写し、抗SARS-CoV-2スパイクポリクローナルウサギ抗体、AlexaFluor 680コンジュゲート抗ウサギ抗体及び近赤外線画像化で検出した(A、上パネル)。ローディング対照として、抗MV核タンパク質ポリクローナルウサギ抗体(Covalab)を使用してMV Nタンパク質を調べた(A、下パネル)。SARS-CoV-2スパイクタンパク質、S1及びS2サブドメイン、並びに麻疹Nタンパク質、並びに分子量マーカー(kDa)の位置を示す。IFNAR-KOマウスは、親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S2P(S2P)、MV-AUT3-S2PΔF(S2PΔF)又はMV-ATU3-S6P(S6P)で4週間隔で2回免疫化した。初回又は追加免疫の3週後に収集した血清において、抗体応答を、麻疹特異的ELISA(B)、SARS-CoV-2スパイク特異的ELISA(C)及びSARS-CoV-2微量中和アッセイ(μNT、D)によって測定した。マウスは追加免疫化の24日後にAd5::hACE2を注入し、4日後に抗原投与した。抗原投与の4日後に肺を採取した。肺ウイルス量は、肺あたりのRNAレベル(GEQ)として決定した(E)。バーは、中央値を示す。定量化の下限は点線によって示す。GEQ力価における差の統計的有意性は、ダンの未補正事後分析によるクラスカル-ワリスの検定を使用して調査した。**p<0.005、***p<0.0005。分析は、GraphPad Prism 8を使用して実行した。 S及び組換えMVによってコードされる様々な突然変異Sタンパク質の融合特性の比較分析を示す図である。HEK-293T-GFP10細胞は、S(wt-S)、S2P(S-2P)、S3F(S-3F)、S2P3F(S-2P&3F)又はS2PΔF(S-2P&ΔF)の一時的発現を可能にするプラスミドでトランスフェクトさせ、Buchrieserら(2020)でSのために記載されるアッセイにより、2つの細胞亜集団の間で融合が起こる場合にGFP活性の再構成を可能にするhACE2発現プラスミドでトランスフェクトさせたHEK-293T-GFP11細胞と共培養した。陰性(neg、モックでトランスフェクトさせる)及び陽性(pos、高レベルでSを発現するプラスミドでトランスフェクトさせる)対照が含まれた。トランスフェクションの18時間後に細胞シートの画像を記録した。融合のパーセンテージは細胞面積あたりのGFP面積として評価し、グラフの下の画像にプロットした。 初回だけの免疫化の後のSARS-CoV-2による抗原投与に対するマウスの防御を示す図である。マウスは、親のMV Schwarz株(Schw)、MV-ATU3-S2P(S2P)又はMV-ATU3-S2PΔF2A(S2PΔF2A)により1回免疫化した。免疫化の3週後に血液試料をとり、抗体応答を、麻疹特異的ELISA(A)、SARS-CoV-2スパイク特異的ELISA(B)及びSARS-CoV-2微量中和アッセイ(μNT、C)によって測定した。マウスは免疫化の4週後にAd5:hACE2を注入し、4日後に抗原投与した。抗原投与の4日後に肺を採取した。肺ウイルス量は、肺あたりのRNAレベル(GEQ)又は感染性力価(PFU)として決定した。バーは、中央値を示す。定量化の下限は点線によって示す。微量中和力価、GEQ及び感染性ウイルスにおける差の統計的有意性は、ダンの未補正事後分析によるクラスカル-ワリスの検定を使用して調査した。*p<0.05、**p<0.005、***p<0.0005。分析は、GraphPad Prism 8を使用して実行した。 SARS-CoV-2スパイクエクトドメイン構築物の効率的な分泌及びホモトリマーへのアセンブリのための最適化を示す図である。(A)。Twin-strep-タグ(Strepタグ)が続くSer-Gly-Gly連結リンカーを通してそのC末端でfoldon(T4又はGCN4)に融合するSの全長エクトドメインに対応する、スパイクの分泌され、三量体化された形態(トリ-Secto)の模式図。シグナルペプチド、サブドメインS1及びS2、フューリン切断部位、融合ペプチド、ヘプタッド反復配列(HR) 1及び2、並びにコネクタドメイン(CD)の位置が示される。テキストに記載される突然変異の位置は、模式図の下に矢印で示される。構築物は、突然変異及びfoldonの組合せによって命名した:一例として、T4-S2P3Fは2P及び3F突然変異をT4フィブリチンfoldonと組み合わせた。全長タンパク質を安定させるフューリン切断部位の突然変異(3F:R682G+R683S+R685G)又は欠失(DetaF: 6756QTQTNSPRRAR-685);突然変異(2P: K986P+V987P)は融合前の形態のタンパク質をロックする;三量体化foldon:T4又はGCN4。 (B)。HEK 293T細胞は、示したpCI-Spike_ectomainプラスミドDNA(パネルの右部分、分泌されたエクトドメインのfoldon T4又はGCN4が示される)で、又は対照として、スパイク全長バリアント(パネルの左部分、全長膜固着(mb)スパイク)をコードするpCI-S2P、pCI-S2PΔF及びpCI-S3FプラスミドDNAで、一時的にトランスフェクトさせた。トランスフェクションから48時間後に上清を収集し、NuPAGE 4～12%ビス-トリスゲルでの電気泳動によって分離し、PVDF膜に転写し、抗SARS-CoV-2スパイクポリクローナルウサギ抗体、AlexaFluor 680コンジュゲート抗ウサギ抗体及び近赤外線画像化で検出した。分子量マーカー(kDa)の位置が示される。 (C)。T4-S2P3F、GCN4-S2P3F及びT4-S2Pポリペプチドは、Superdex200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。溶出プロファイルは、280nm(mAU)の吸光度によって記録した。 MV-ATU3-T4-S2P3F感染細胞の上清中のSARS-CoV-2スパイクエクトドメインの検出を示す図である。Vero細胞は、0.05のMOIでMV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-Secto、MV-ATU3-T4-S2P3F(4つのウイルスクローン)、又は親のMV Schwarz株(MVSchw)に感染させたか、又は感染させなかった(NI)。上清(上パネル)を収集し、全細胞抽出物(中央パネル)を感染から39時間後に調製し、NuPAGE 4～12%ビス-トリスゲルでの電気泳動によって分離し、PVDF膜に転写し、抗SARS-CoV-2スパイクポリクローナルウサギ抗体、AlexaFluor 680コンジュゲート抗ウサギ抗体及び近赤外線画像化で検出した。全細胞抽出物のローディング対照として、抗MV核タンパク質ポリクローナルウサギ抗体(Covalab)を使用してMV Nタンパク質を調べた(下パネル)。SARS-CoV-2スパイクタンパク質/エクトドメイン、S1及びS2サブドメイン、並びに麻疹Nタンパク質、並びに分子量マーカー(kDa)の位置を示す。 ATU2-N及びATU2-NMVoptウイルスに感染させた細胞からの溶解物におけるSARS-CoV-2 Nの発現レベルを示す図である。Vero細胞は、1のMOIでMV-ATU2-N (4つのウイルスクローン)、MV-ATU2-NMVopt(4つのウイルスクローン)、又は親のMV Schwarz株(MVSchw)に感染させたか、又は感染させなかった(NI)。全細胞抽出物を感染から24時間後に調製し、NuPAGE 4～12%ビス-トリスゲルでの電気泳動によって分離し、PVDF膜に転写し、抗SARS-CoV-2核タンパク質ポリクローナルウサギ抗体、AlexaFluor 680コンジュゲート抗ウサギ抗体及び近赤外線画像化で検出した(上パネル)。ローディング対照として、抗MV核タンパク質ポリクローナルウサギ抗体(Covalab)を使用してMV Nタンパク質を調べた(下パネル)。SARS-CoV-2核タンパク質、及び麻疹Nタンパク質、並びに分子量マーカー(kDa)の位置を示す。 SARS-CoV-2の天然Sタンパク質の模式図である。天然Sタンパク質は、長さが1273アミノ酸(aa)である。このタンパク質は、フューリン切断部位(F)での切断によって生成される2つのサブユニット、S1及びS2を含有する。S1は、シグナルペプチド(SP)、N末端ドメイン(NTD)及び受容体結合性ドメイン(RBD)を含有する。S2は融合ペプチド(FP)、ヘプタッド反復配列1(HR1)及び2(HR2)、膜貫通ドメイン(TM)並びに細胞質尾部(CT)を含有する。2Pは、2つの突然変異したプロリン、K986P及びV987Pを示す。文字KLHYTは、CT中の配列番号149の小胞体回収シグナル(ERRS)モチーフKxHxxを示す。dERは、CTからのC末端の11アミノ酸の欠失を有する構築物を示す。 図22A～22Dは、S遺伝子構築物の模式図及びS発現rMVの特徴付けを示す図である。a. 注目すべきドメインを有するSARS-CoV-2の天然のS遺伝子を、MVベクターにクローニングしたS遺伝子構築物と比較して示す。2P及びdER改変も示す。全てのS構築物は、pTM-MVSchwarz(MV Schwarz)、MVベクタープラスミドの第2(ATU2)又は第3(ATU3)の追加の転写単位にクローニングした。MVゲノムは、核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、V及びCアクセサリータンパク質、マトリックス(M)、融合(F)、血球凝集素(H)及びポリメラーゼ(L)遺伝子を含む。プラスミドエレメントは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター(T7)、ハンマーヘッドリボザイム(hh)、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム(∂)及びT7 RNAポリメラーゼターミネーター(T7t)を含む。b. 0.1のMOIでVero細胞を感染させるために使用したrMV構築物の増殖動態。細胞内ウイルス力価は、TCID50/mlで示す。c. 2P突然変異の有る無しでATU2又はATU3からSF-dER又はS2-dERを発現するrMVに感染させたVero細胞の細胞溶解物における、SARS-CoV-2 Sタンパク質のウエスタンブロット分析。d. 感染の24時間後に示したrMVに感染させたVero細胞の免疫蛍光染色。透過処理した又は透過処理しなかった細胞を、S、MV N及び核のために染色した。 図23A～23Fは、プライム-ブーストワクチン接種による体液性応答の誘導を示す図である。a. 0及び28日目に示したrMVの1×105 TCID50により腹腔内に免疫化したIFNAR-/-マウス(空のMV対照ではn=6又はn=4)の相同的プライム-ブースト。血清を免疫化の28及び42日後に収集し、(b)MV抗原又は(c)S-SARS-CoV-2 Sへの特異的抗体応答について調査した。データは逆数のエンドポイント希釈力価を示し、各データポイントは個々の動物を表す。d. 50%プラーク低減中和試験(PRNT50)力価で表される、SARS-CoV-2ウイルスへの中和抗体応答。e. 第1の免疫化の4週後のマウスにおけるIgGサブクラスのS特異的抗体応答。f. IgG2a/IgG1又はTh1/Th2応答の比。データは幾何平均で表され、線及びエラーバーは幾何学的SDを示している。統計的有意性は多重比較のために調整した二元配置ANOVAによって決定した。アスタリスク(*)は、マン-ホイットニーU検定で決定した有意な平均差(**p<0.01及び****p<0.001)を示す。 図23A～24Dは、rMVワクチン接種によるS特異的細胞性応答の誘導を示す図である。a. 示したrMVの1×105 TCID50により腹腔内に免疫化したIFNAR-/-マウス(空のMV対照ではn=12又はn=3)の免疫化。免疫化の7日後に、IFNγのためのELISPOTを新たに抽出した脾細胞で実行した。データは、(b)MV Schwarz又は(c)CD8+若しくはCD4+ T細胞に特異的なSARS-CoV-2 Sペプチドプールで刺激した後に検出された、1×106脾細胞あたりのIFNγ分泌細胞又はスポット形成細胞(SFC)で示される。d. CD4+又はCD8+ペプチドによって刺激されたIFNγ分泌細胞のMV Schwarzによって刺激されたものに対する比。各データポイントは個々のマウスを表す。アスタリスク(*)は、マン-ホイットニーU検定で決定した有意な平均差(*p<0.05;**p<0.01及び****p<0.001)を示す。 図25A及び25Bは、T細胞のサイトカイン発現プロファイルを示す図である。示したrMVの1×105 TCID50により腹腔内(i.p.)に免疫化したIFNAR-/-マウス(空のMV対照ではn=12又はn=3)及び脾細胞を、S特異的ペプチドプールで刺激した。S特異的な(a)CD8+及び(b)CD4+ T細胞を、細胞内IFNγ、TNFα及びIL-5のために染色した。アスタリスク(*)は、マン-ホイットニーU検定で決定した有意な平均差(*p<0.05;**p<0.01及び****p<0.001)を示す。 図26A～26Fは、中和抗体及び免疫防御の持続性を示す図である。a. IFNAR-/-マウス(n=6)のための免疫化及び抗原投与スケジュール。0及び28日目に相同的プライムブーストで動物を腹腔内に免疫化した。52、72及び110日目に血清を収集した。動物は、1.5×105PFUのマウス適合SARS-CoV-2ウイルス(MACo3)の鼻腔内接種によって、110日目に抗原投与した。血清は、(b)MV及び(c)SARS-CoV-2 Sに対する特異抗体のレベルについて調査した。d. 50%プラーク低減中和試験(PRNT50)力価で表される、SARS-CoV-2ウイルスへの中和抗体応答。e. コピー数/肺で計算した、抗原投与動物のホモジナイズされた肺におけるRT-qPCRによって検出されたSARS-CoV-2ウイルスRNAのコピー数。f. PFU/肺で表した、免疫化動物のホモジナイズされた肺から回収された感染性ウイルス粒子の力価。データは幾何平均で表され、線及びエラーバーは幾何学的SDを示している。統計的有意性は多重比較のために調整した二元配置ANOVAによって決定した。アスタリスク(*)は有意な平均差(*p<0.05;**p<0.01及び****p<0.001)を示す。 図27A～27Gは、単一の免疫化の後の免疫応答及び防御を示す図である。a. IFNAR-/-マウス(n=6)のための免疫化及び抗原投与スケジュール。動物は、0日目に腹腔内に免疫化した。24及び48日目に血清を収集した。動物は、1.5×105PFUのマウス適合SARS-CoV-2ウイルス(MACo3)の鼻腔内接種によって、48日目に抗原投与した。血清は、(b)MV及び(c)S-SARS-CoV-2タンパク質に対する特異抗体のレベルについて調査した。d. 50%プラーク低減中和試験(PRNT50)力価で表される、SARS-CoV-2ウイルスへの中和抗体応答。e. コピー数/肺で計算した、抗原投与動物のホモジナイズされた肺におけるRT-qPCRによって検出されたSARS-CoV-2ウイルスRNAのコピー数。f. PFU/肺で表した、免疫化動物のホモジナイズされた肺から回収された感染性ウイルス粒子の力価。データは幾何平均で表され、線及びエラーバーは幾何学的SDを示している。抗体応答(上パネル)の統計的有意性は多重比較のために調整した二元配置ANOVAによって決定した。残りのデータ(下パネル)は、マン-ホイットニーU検定によって分析した。アスタリスク(*)は有意な平均差(*p<0.05;**p<0.01及び****p<0.001)を示す。 トランスフェクトされたHEK293T細胞の表面でのSARS-CoV-2 S抗原の発現を示す図である。全長S又はS2サブユニット抗原をコードするpcDNA発現ベクターでトランスフェクトした細胞は、抗S抗体と続くAlexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ウサギIgGによる間接免疫蛍光法のために染色した。ゲーティング(上の点プロット)によって死細胞を排除するために、ヨウ化プロピジウムを使用した。ヒストグラムは、全長S(左ヒストグラム)又はS2サブユニットタンパク質(右ヒストグラム)の表面発現を示す。天然コンフォメーションのS抗原(明灰色)、融合前安定化S(暗灰色)、モックトランスフェクション対照細胞(黒色のヒストグラム)及び対応する平均蛍光強度(MFI)を示す。 トランスフェクトされたVero細胞におけるSタンパク質媒介シンシチウム形成を示す図である。SARS-CoV-2 Sタンパク質をコードするpcDNA発現ベクターでトランスフェクトさせたVero細胞の画像を、トランスフェクションの24時間後に取得した。上の画像は、天然コンフォメーションのS抗原をコードするプラスミドでトランスフェクトさせたVero細胞を示し、下の画像は融合前安定化S抗原でトランスフェクトさせた細胞及び非トランスフェクション対照Vero細胞を表す。灰色の線は、シンシチウムの境界を描写する。天然SFは、インタクトなCTを有する天然コンフォメーション全長Sタンパク質を示す。 組換えMVワクチンに感染させたVero細胞における細胞内Sタンパク質発現の免疫蛍光分析を示す図である。Vero細胞は、SARS-CoV-2 Sタンパク質を発現するrMV又は空のMV Schwarzに感染させた。感染の24時間後に、ウサギ抗S抗体と続くCy3コンジュゲートヤギ抗ウサギIgGを使用して、Sタンパク質が、サポニンで透過処理した細胞で検出された。マウスモノクローナル抗N抗体と続くAlexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗マウスIgGを使用して、MV Nタンパク質を可視化した。核は、DAPIで染色した。画像は、蛍光顕微鏡を使用して取得した。 組換えMVワクチンに感染させたVero細胞におけるSタンパク質の表面発現の免疫蛍光分析を示す図である。Vero細胞は、SARS-CoV-2 Sタンパク質を発現するrMV又は空のMV Schwarzに感染させた。感染の24時間後に、ウサギ抗S抗体と続くCy3コンジュゲートヤギ抗ウサギIgGを使用して、Sタンパク質が、透過処理をしなかった細胞の表面で検出された。マウスモノクローナル抗N抗体と続くAlexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗マウスIgGを使用して、MV Nタンパク質を可視化した。核は、DAPIで染色した。画像は、蛍光顕微鏡を使用して取得した。 連続継代からの組換えMVワクチンに感染させたVero細胞におけるSタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す図である。SFdER又はSF-2P-dER抗原を発現するMV ATU2ワクチンをP1からP10までVero細胞で連続的に継代させ、P1、P5及びP10細胞溶解物のイムノブロッティングによってSタンパク質発現を決定した。空のMVに感染させたVero細胞が並行して検査され、陰性対照の役目を果たした。 図33A～33Cは、MV-ATU2-SF-2P-dER又は空のMVの1×105 TCID50により腹腔内(i.p.)に免疫化したIFNAR-/-マウス(対照の空のMV群ではn=5又はn=3)において調査した、T細胞のサイトカイン発現プロファイルを示す図である。脾細胞は、S特異的CD4又はCD8ペプチドで刺激した(Table 6A(表10)及びTable 6B(表11))。S特異的な(aCD8+及び(b)CD4+ T細胞を、細胞内IFNγ、TNFα、IL-5及びIL13のために染色した。c. S特異的CD4+記憶T細胞は、細胞内IL-5及びIL13のために染色した。アスタリスク(*)は、多重比較検定によるクラスカル-ワリスANOVAで決定した有意な平均差(*p<0.05)を示す。 図34A～34Cは、用量依存性相同的プライム-ブースト免疫化を示す図である。0及び28日目に示したrMVワクチン候補の1×105 TCID50又は1×104 TCID50により、IFNAR-/-マウス(空のMV対照ではn=6又はn=4)を腹腔内に免疫化した。血清を免疫化の28及び50日後に収集し、(a)MV抗原又は(b)SARS-CoV-2 Sタンパク質への特異的抗体応答について調査した。データは逆数のエンドポイント希釈力価を示し、各データポイントは個々の動物を表す。c. 50%プラーク低減中和試験(PRNT50)力価で表される、SARS-CoV-2ウイルスへの中和抗体応答。データは幾何平均で表され、線及びエラーバーは幾何学的SDを示している。統計的有意性は多重比較のために調整した二元配置ANOVAによって決定した。アスタリスク(*)は、有意な平均差(*p<0.05、**p<0.01及び****p<0.001)を示す。 SARS-CoV-2のSタンパク質を発現するpCDNAによるトランスフェクトされたHEK293T細胞のFACS分析を示す図である。全長S又はS2サブユニット抗原をコードするpcDNA発現ベクターでトランスフェクトした細胞は、抗S抗体と続くAlexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ウサギIgGによる間接免疫蛍光法のために染色した。ゲーティング(上の点プロット)によって死細胞を排除するために、ヨウ化プロピジウムを使用した。ヒストグラムは、全長S(左ヒストグラム)又はS2サブユニットタンパク質(右ヒストグラム)の表面発現を示す。天然コンフォメーションのS抗原(明灰色)、融合前安定化S(暗灰色)、モックトランスフェクション対照細胞(黒色のヒストグラム)及び対応する平均蛍光強度(MFI)を示す。
詳細な説明
定義
本明細書で使用される場合、冠詞「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、冠詞の文法上の目的語が1つ、又は1つより多く(すなわち、少なくとも1つ)であることを指す。一例として、「1つのエレメント(an element)」は、1つのエレメント又は1つより多くのエレメントを意味する。更に、用語「含む(including)」、加えて「含む(include)」、「含む(includes)」、及び「含まれる(included)」等の他の形態の使用は、非限定的である。
定量的な用語における用語「約」は、本明細書で使用される場合、それが修飾する値のプラス又はマイナス10%を指す(分子又はヌクレオチドの数のように値が更に割り切れない場合、最も近い整数に切り上げる)。
本明細書で開示される全ての範囲は、列挙された端点を含み、独立して組み合わせることができる(例えば、「50mg～500mg」の範囲は、端点の50mg及び500mg、並びに全ての中間の値を含む)。
用語「含む」は、本明細書で使用される場合、実施形態「からなる」及び「から本質的になる」を含み得る。用語「含む(comprise(s))」、「含む(include(s))」、「有する(having)」、「有する(has)」、「含有する(contain(s))」、及びそれらの変化形は、本明細書で使用される場合、指定された成分/工程の存在が必須であり、他の成分/工程の存在が許容されるオープンエンドな移行句、用語、又は言葉になることが意図される。しかしながら、このような記載は、任意の許容できる担体又は流体と共に、指定された構成要素又は化合物の存在のみ許容され、他の構成要素又は化合物は除外される、列挙された構成要素「からなる」及び「から本質的になる」組成物又は工程をその範囲内に包含すると解釈されるべきである。
用語「上流」及び「下流」は、本明細書において、核酸配列の、それより長い核酸配列内における、より長い核酸配列のRNA転写の方向(5'から3')での相対的な位置を指すものとして使用される。用語「上流」は、より長い核酸配列の5'末端により近い(RNA転写の前の)核酸配列を指す。用語「下流」は、より長い核酸配列の3'末端により近い(RNA転写の後の)核酸配列を指す。
用語「抗原性ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの由来となるウイルスに対する免疫応答を誘導することが可能なポリペプチドを指す。
ポリペプチドの「免疫原性断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの由来となるウイルスに対する免疫応答を誘導することが可能なポリペプチド断片を指す。免疫原性断片の非限定的な例としては、SARS-CoV-2のSectoポリペプチド、SARS-CoV-2のstab-Sectoポリペプチド、SARS-CoV-2のS1ポリペプチド、SARS-CoV-2のS2ポリペプチド、SARS-CoV-2のトリSectoポリペプチド、SARS-CoV-2のtristab-Sectoポリペプチド、及び小胞体の保持に関与するドメインにおいて突然変異したSが挙げられる。
本発明の目的のために、ウイルス株SARS-CoV-2は、特にGenbankでMN908947配列として開示されたそのヌクレオチド配列(野生型配列)に対する参照によって記載されるものとし、このヌクレオチド配列は、2020年1月20日からNBCBIより公的に入手可能であり、その日付以降MN908947.3としてアップデートされている。
テキスト、図面及び配列表にわたり、表現「コロナウイルス2019-nCoV」、「2019-nCoV」、「nCoV」又は「SARS-CoV-2」は、交換可能である。
表現「ポリペプチド」又は「コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチド」は、アミノ酸残基の連結により生じる分子を定義する。
細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異を有するS-タンパク質又は二重ドメインSタンパク質の「増加した細胞表面発現」は、本明細書で使用される場合、ヒト胎児腎臓細胞(HEK)293T(ATCC CRL-3216)に発現構築物をトランスフェクトして、対応する突然変異していないタンパク質と共にトランスフェクトした対照HEK293T細胞と並行して突然変異したタンパク質を発現させること、及び免疫アッセイを使用して細胞表面発現を測定することによって測定される。細胞表面発現は、追加の挿入、置換、又は欠失による突然変異、例えばSタンパク質を融合前の形態に維持する追加の突然変異、例えば2P突然変異によって更に増加させることができる。例示的なアッセイは実施例に記載され、アッセイからの特定の結果は、図28及び図35に提示される。
表現「dER」は、本明細書において定義されるように、Sタンパク質の、特に配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質の細胞質尾部からの11のC末端アミノ酸残基(aa1263～1273)の欠失による突然変異を指す。細胞質尾部からのドメインの欠失は、このポリペプチド断片を発現する組換えMVで感染させた細胞においてSのポリペプチド断片の表面発現を増加させる。
用語「2P」は、本明細書において定義されるように、2つのアミノ酸残基の突然変異であって、すなわち、Sタンパク質を融合前の形態に維持する、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2つのプロリン残基の置換による突然変異(K986P+V987P)を指し、この突然変異は、S2ドメインに生じ、例えば7回反復1(heptad repeat 1;HR1)と中央へリックス(CH)との間に生じる。
用語「2A」又は「2a」は、本明細書において定義されるように、細胞表面発現を増加させる可能性がある、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列における小胞体回復シグナルの2つのアミノ酸残基の突然変異(K1269A+H1271A)を指す。
語句「二重ドメインSタンパク質」は、本明細書で使用される場合、S1及びS2ドメインの両方を含むコロナウイルススパイク(S)タンパク質を指す。二重ドメインSタンパク質は、突然変異(置換、欠失、及び/又は付加)を含んでいてもよいが、S1又はS2ドメインの全体は失われない。
表現「コードする」は、本明細書で使用される場合、選択された細胞又は細胞株への生成物発現のために転写され、必要に応じて翻訳される核酸分子の能力を定義する。したがって、核酸構築物は、コード配列の転写を制御する調節エレメント、特にプロモーター、並びに転写のための終結配列、並びに場合によってはエンハンサー及び他のシス作用性エレメントを含んでいてもよい。これらの調節エレメントは、CoVに対して、特にSARS-CoV-2ポリヌクレオチド配列に対して異種であってもよい。
表現「作動可能に連結した」又は「作動可能に連結した」は、特に細胞若しくは細胞株において、特に、本発明の組換え感染性MV粒子の生産又は増幅のためのレスキュー系の一部として使用される細胞若しくは細胞株において、又は宿主細胞、特に哺乳類若しくはヒト細胞において、異なるポリヌクレオチド及び核酸構築物が効率的に転写され、場合により翻訳されるように、本発明の核酸構築物の異なるポリヌクレオチド間に存在する機能的な連結を指す。
用語「レプリコン」は、本明細書で使用される場合、DNA又はRNA複製(すなわち自己複製)の自律的な単位として機能するあらゆる遺伝学的エレメント(例えば、プラスミド、染色体、ウイルスRNA)を指す。レプリコンは、ウイルスゲノムを起源とするものでもよく、1つ又は複数の構造タンパク質が欠失しているか又は野生型ウイルスゲノムにとって外来の遺伝子で置き換えられたウイルスゲノム複製のための、ウイルスの非構造遺伝子を含有していてもよい。
用語「組換え」は、本明細書で使用される場合、細胞に、少なくとも1つのポリヌクレオチドを、例えばベクターの形態で導入することを意味し、ポリヌクレオチドは、細胞ゲノム(例えば上記で定義された)に組み込まれるか(全体的又は部分的に)、又は組み込まれない。
用語「トランスファー(移行)」は、本明細書で使用される場合、異なるタイプの細胞上に、特に、異なるタイプの細胞の単分子層上に組換え細胞をプレーティングすることを指す。これらの後者の細胞は、感染性MV-CoV粒子の複製と生産の両方、すなわち、それぞれ細胞内部での感染性ウイルスの形成、及び場合によっては細胞の外部へのこれらの感染性ウイルスの放出を維持する能力を有する。このトランスファーは、本発明の組換え細胞と、前の文で定義した通りのコンピテント細胞との共培養をもたらす。上記のトランスファーは、組換え細胞が、十分効率的なウイルス産生培養物ではない場合、すなわちこれらの組換え細胞から感染性MV-CoV粒子を効率的に回収できない場合、追加の工程、すなわち任意選択の工程であり得る。
本明細書で使用される場合、語句「有効量」は、本明細書で開示されるワクチン組成物の用量又は量への言及において、後続の攻撃中に、感染因子、例えばコロナウイルスの感染の可能性又は重症度を有意に低下させる抗体及び/又は細胞性免疫応答を惹起するのに必要な用量を指す。一部の実施形態において、有効量は、ワクチン組成物のための添付文書に列挙される用量である。
用語「ブースター」は、本明細書で使用される場合、予防的組成物、例えばワクチンに言及される場合、本発明の開示免疫原性組成物、又は別の予防的又は治療的な化合物の追加の投与を指す。
用語「ウイルス様粒子」(VLP)は、本明細書で使用される場合、この開示の核酸構築物によってコードされた、麻疹ウイルス構造タンパク質及び少なくとも1つのSARS-CoV-2 Sポリペプチド又はその免疫原性断片を含むが、核酸構築物を含まない構造を指す。本発明のVLPは、非感染性であり、複製能はない。
用語「関連する(associated)」又は「関連して(in association)」は、本明細書で使用される場合、固有の組成物における、2つ又はそれより多くの列挙されたエレメント、例えば組換え感染性複製MV-CoV粒子及びCoVタンパク質及び/又はVLPを含有するCoVが存在することを指す。関連するエレメントは、物理的に別々の実体であり得る。
用語「同一性」は、当業界で公知のように、配列を比較することによって決定した場合の、2つ又はそれより多くのポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列間の関係を指す。当業界において、同一性はまた、2つ又はそれより多くのアミノ酸残基又は核酸残基の列間の一致数によって決定した場合の、2つの配列間の配列の関連の程度も意味する。同一性は、2つ又はそれより多くの配列のうち短い方と、特定の数学モデル又はコンピュータープログラム(例えば、「アルゴリズム」)によって割り当てられたギャップアライメント(存在する場合)との間の同一な一致のパーセントを測定する。関連するペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算できる。用語「%の同一性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列に適用される場合、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセントの同一性を達成した後に第2の配列のアミノ酸配列又は核酸配列中の残基と同一な候補アミノ酸又は核酸配列中の残基(アミノ酸残基又は核酸残基)のパーセンテージと定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは当業界において周知である。同一性は、パーセント同一性の計算に依存するが、計算に導入されるギャップ及びペナルティーによって値が異なる場合がある。一般的に、特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載される、当業者公知の配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定した場合、その特定の参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%であるが100%未満の配列同一性を有する。このようなアライメントのためのツールとしては、BLASTパッケージのツール(Stephen F. Altschulら(1997).「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」、Nucleic Acids Res. 25:3389～3402)が挙げられる。別の一般的なローカルアライメント技術は、スミス-ウォーターマンのアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman、M.S. (1981)「Identification of common molecular subsequences.」J. Mol． Biol. 147:195～197)に基づく。一般的な動的プログラミングに基づくグローバルアライメント技術は、ニードルマン-ブンシュのアルゴリズム(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970)「A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.」J. Mol. Biol. 48:443～453)である。つい最近になって、ニードルマン-ブンシュアルゴリズム等の他の最適グローバルアライメント方法より速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生産すると評判の、高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm;FOGSAA)が開発された。他のツールは、本明細書に、具体的には以下の「同一性」の定義で記載される。
用語「相同性」は、本明細書で使用される場合、ポリマー性分子間の全体的な関連、例えば核酸分子(例えばDNA分子)間の、及び/又はポリペプチド分子間の全体的な関連を指す。一致する残基のアライメントによって決定された類似性又は同一性の閾値レベルを共有するポリマー性分子(例えば核酸分子(例えばDNA分子)及び/又はポリペプチド分子)は、相同であると呼ばれる。相同性は、分子間の関係を述べる定性的な用語であり、定量的な類似性又は同一性に基づいていてもよい。類似性又は同一性は、2つの比較される配列間の配列の一致の程度を定義する定量的な用語である。一部の実施形態において、ポリマー性分子は、それらの配列が、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるか又は類似している場合、互いに「相同」である。用語「相同な」は必然的に、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列)間の比較を指す。2つのポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが、少なくとも20アミノ酸の少なくとも1つのストレッチにわたり、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は更には99%である場合、それらの配列は相同であるとみなされる。一部の実施形態において、相同なポリヌクレオチド配列は、少なくとも4～5の固有の特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。長さが60未満のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも4～5の固有の特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。2つのタンパク質配列が、少なくとも20アミノ酸の少なくとも1つのストレッチにわたり、少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%同一である場合、それらの配列は相同であるとみなされる。
相同性は、比較された配列が進化中に共通の起源から分岐したことを含意する。用語「ホモログ」は、共通する祖先の配列からの系統的に、第2のアミノ酸配列又は核酸配列に関連する第1のアミノ酸配列又は核酸配列(例えば、遺伝子(DNA又はRNA)又はタンパク質配列)を指す。用語「ホモログ」は、分種化事象によって分離した遺伝子及び/又はタンパク質の間の関係、又は遺伝学的重複事象によって分離した遺伝子及び/又はタンパク質の間の関係に適用され得る。「オーソログ」は、分種化によって共通の祖先の遺伝子(又はタンパク質)から進化した異なる種における遺伝子(又はタンパク質)である。典型的には、オーソログは、進化中、同じ機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子(又はタンパク質)である。オーソログは、進化中、同じ機能を保持するが、それに対してパラログは、新しい機能が元の機能に関するものであっても、新しい機能を発達させる。
用語「バリアント」は、本明細書で使用される場合、そのアミノ酸配列又は核酸配列が天然配列又は参照配列と比べて異なる分子である。配列バリアントは、天然配列又は参照配列と比較して、配列内の特定の位置に、置換、欠失、挿入、又は前述のもののいずれか2つ若しくは3つの組合せを有し得る。通常は、バリアントは、天然配列又は参照配列に対して少なくとも50%の同一性を有する。一部の実施形態において、バリアントは、天然配列又は参照配列と、少なくとも80%の同一性、又は少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を共有する。
用語「6P」は、本明細書において定義されるように、6つのアミノ酸残基の突然変異であって、すなわち、Sタンパク質を融合前の形態に維持する、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の、817、892、899、942、986位及び987位における6つのプロリン残基の置換による突然変異(F817P+A892P+A899P+A942P+K986P+V987P)を指し、前記突然変異は、S2ドメインに存在する(Hsiehら、2020)。K986P及びV987P突然変異は、7回反復1(HR1)と中央へリックス(CH)との間に存在し、F817P、A892P及びA899Pは、融合ペプチド(FP)とHR1との間の接続領域に存在し、A942P突然変異は、HR1に存在する。
用語「CC」は、本明細書において定義されるように、受容体結合ドメイン(RBD)を閉じたコンフォメーションに維持する、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の383位及び985位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(S383C及びD985C)又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の413位及び987位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(G413C及びP987C)を指す(McCallumら、2020)。
用語「フォルドン」は、本明細書において定義されるように、Sタンパク質のエクトドメインの三量体化を促進し、可溶性三量体形態での、すなわちSタンパク質の可溶性三量体化形態でのその発現を可能にする人工三量体化ドメイン、特にT4フォルドン(すなわちバクテリオファージT4のフィブリチンの三量体化ドメイン)を指す。例えば、T4フォルドンは、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号51及び配列番号52の配列において使用されている。フォルドンの別の例は、酵母GCN4トランス活性化因子の三量体化ドメインから誘導されるGCN4フォルドンである。
用語「3F」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682位、683位及び685位における、S1/S2フューリン切断部位で生じる3つのアミノ酸残基の置換による突然変異:R682G+R683S+R685Gを指す。
用語「ΔF」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質の675位におけるアミノ酸と685位におけるアミノ酸との間のS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失、すなわち配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARの欠失を指す。
「SARS-CoV-2のS3Fポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドであって、S1/S2フューリン切断部位が、例えば配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682位、683位及び685位における3つのアミノ酸残基の突然変異(R682G+R683S+R685G)によって不活性化されているものを指す。
「SARS-CoV-2のS2P3Fポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2P突然変異(K986P+V987P)、及び例えば配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682位、683位及び685位における3つのアミノ酸残基の突然変異(R682G+R683S+R685G)による、S1/S2フューリン切断部位の不活性化を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを指す。
「SARS-CoV-2のS2PΔFポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2P突然変異(K986P+V987P)、及びS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失、すなわち配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の675位から685位の間の配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARの欠失を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを対象とする。S2PΔF SARS-CoV-2のポリペプチドにおいて、2P突然変異は、配列番号47の975位及び976位に存在する(K975P+V976P)。
「SARS-CoV-2のS2PΔF2Aポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2P突然変異(K986P+V987P)、及びS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失、すなわち配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の675位から685位の間の配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARの欠失を有し、ERRシグナルの不活性化、例えば配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の1269位及び1271位における2つのアミノ酸残基の突然変異(K1269A+H1271A)によるERRシグナルの不活性化を有する、安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを対象とする。SARS-CoV-2のS2PΔF2Aポリペプチドにおいて、2P突然変異は、配列番号49の975位及び976位(K975P+V976P)に存在し、ERRシグナルの不活性化は、例えば配列番号49のアミノ酸配列の1258位及び1260位(K1258A+H1260A)における2つのアミノ酸残基の突然変異によって生じる。
「SARS-CoV-2のT4-S2P3Fポリペプチド」(tristab-Secto-3Fとも称される)は、本明細書において定義されるように、2P及び3F突然変異を有するSタンパク質の可溶性三量体化形態を含むポリペプチド、特に、T4フォルドン三量体化ドメイン、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2P突然変異(K986P+V987P)、及びS1/S2フューリン切断部位の不活性化、例えば配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682位、683位及び685位における3つのアミノ酸残基の突然変異(R682G+R683S+R685G)による不活性化を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを指す。
SARS-CoV-2の「S6Pポリペプチド」又はSARS-CoV-2の「SMVopt6Pポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の817位、892位、899位、942位、986位及び987位における6P突然変異(F817P+A892P+A899P+A942P+K986P+V987P)を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを指す。
SARS-CoV-2の「S6P3Fポリペプチド」又はSARS-CoV-2の「SMVopt6P3Fポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の817位、892位、899位、942位、986位及び987位における6P突然変異(F817P+A892P+A899P+A942P+K986P+V987P)、及びS1/S2フューリン切断部位の不活性化、例えば配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682位、683位及び685位における3つのアミノ酸残基の突然変異(R682G+R683S+R685G)による不活性化を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを指す。
SARS-CoV-2の「S6PΔFポリペプチド」又はSARS-CoV-2の「SMVopt6PΔFポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の817位、892位、899位、942位、986位及び987位における6P突然変異(F817P+A892P+A899P+A942P+K986P+V987P)、及びS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失、すなわち配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の675位から685位の間の配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARの欠失を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを指す。S6PΔF SARS-CoV-2のポリペプチドにおいて、6P突然変異は、配列番号58の806位、881位、888位、931位、975位及び976位に存在する。
SARS-CoV-2の「SCCPPポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2P突然変異(K986P+V987P)、及び配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の383位及び985位におけるCC突然変異(S383C及びD985C)を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを指す。
SARS-CoV-2の「SCC6Pポリペプチド」は、本明細書において定義されるように、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の817位、892位、899位、942位、986位及び987位における6P突然変異(F817P+A892P+A899P+A942P+K986P+V987P)、及び配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の383位及び985位におけるCC突然変異(S383C及びD985C)を有する安定化されたSタンパク質を含むポリペプチドを指す。
語句「全長Sタンパク質」は、本明細書で使用される場合、S1及びS2ドメインの両方を含むコロナウイルススパイク(S)タンパク質を指す。全長Sタンパク質は、突然変異(置換、欠失、及び/又は付加)を含んでいてもよいが、S1又はS2ドメインの全体は失われない。全長Sタンパク質は、S1ドメインとS2ドメインとの間に、フューリン切断部位、又は突然変異したフューリン切断部位を含んでいてもよい。
コロナウイルスの生物学
SARS-CoV-2は、コロナウイルス科及びβ-コロナウイルス属に属する、エンベロープに包まれた一本鎖プラスセンスRNAウイルスである(Zhou、2020)。SARS-CoV-2の全ゲノムシーケンシングは、SARS-CoV-1との79.6%のヌクレオチド配列類似性を有することを解明した(Wu、2020)。SARS-CoV-2のゲノムは、4つの構造タンパク質:スパイクタンパク質(S)、エンベロープタンパク質(E)、膜タンパク質(M)、及びヌクレオカプシド(N)をコードする。Sタンパク質は、ビリオンの表面上に位置する三量体クラスI融合タンパク質であり、宿主細胞へのウイルスの付着及び侵入において中心的な役割を果たす。ウイルス感染のために、宿主プロテアーゼによるS1及びS2サブユニットへのSタンパク質の切断(Jaimes、2020)は必須である。S1サブユニットは、ウイルスがその侵入受容体であるアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合することを可能にする受容体結合ドメイン(RBD)を含有する(Zhou、2020;Hoffmann、2020)。受容体とのドッキング後、S1サブユニットは、放出され、S2サブユニットは、その融合ペプチドを露出させて、膜融合及びウイルス侵入を媒介する(Du、2020)。
コロナウイルスは、宿主細胞の細胞質中で複製する。RNAゲノムの5'末端は、キャップされた構造を有し、3'末端は、ポリA尾部を含有する。ウイルスのエンベロープは、その表面に、スピクラ(spicules)(又はスパイクタンパク質)と呼ばれるペプロマー構造を含む。
ゲノムは、その5'末端からその3'末端に、以下のオープンリーディングフレーム又はORF:転写-複製複合体のタンパク質に対応するORF1a及びORF1b、並びに構造タンパク質S、E、M及びNに対応するORF-S、ORF-E、ORF-M及びORF-Nを含む。これはまた、ORF-SとORF-Eとの間に存在し、後者とオーバーラップする領域、ORF-MとORF-Nとの間に存在する領域、及びORF-N中に含まれる領域によってコードされた未知の機能のタンパク質に対応するORFも含む。
Sタンパク質は、ウイルスエンベロープの表面から出現するスピクラ又はスパイクの形態で存在する膜糖タンパク質(200～220kDa)である。これは、宿主細胞の受容体へのウイルスの付着及びウイルスエンベロープの細胞膜への融合の誘導に関与する。Sタンパク質は、機能的に2つの下位領域S1及びS2に分けることができ、S1は、宿主細胞上のウイルス受容体への結合に関与するSタンパク質の頭部を形成し、S2は、軸(stalk)構造を形成する。Sタンパク質は、中和抗体によって標的化される主要なエピトープを含有し、したがってヒトコロナウイルスに対するワクチンを開発するための主要な抗原とみなされる(Du、2020;Escriou、2014;Liniger、2008;Bodmer、2018;Zhu、2020)。RBDを標的化する抗体は、宿主細胞上の受容体へのウイルスの結合をブロックし、侵入を防止することによってウイルスを中和することができる。加えて、SARS-CoVのS2サブユニットにおける第2の7回領域(HR2)を模擬する合成ペプチド及びそのような合成ペプチドを標的化する抗体は、恐らく膜融合に必要なコンフォメーション変化を妨げることによって、強い中和活性を有することが観察されている(Bosh、2004;Keng、2005;Lip、2006;Zhang、2004;Zhong、2005)。したがって、SARS-CoV-2ワクチンを開発する努力は、Sタンパク質に対する応答を惹起することに焦点を当ててきた。
小さいエンベロープタンパク質(E)は、sM(小さい膜)とも称され、これは、約10kDaの非グリコシル化膜貫通タンパク質であり、ビリオン中に最も少量で存在するタンパク質である。これは、小胞体(ER)及びゴルジ装置における中間区画のレベルで存在するコロナウイルス出芽プロセスに関与する。
Mタンパク質又はマトリックスタンパク質(25～30kDa)は、M/E相互作用によってウイルス粒子に統合されるより豊富な膜糖タンパク質であり、それに対して粒子へのSの取り込みは、S/M相互作用によって指示される。これは、コロナウイルスのウイルス成熟のため、及びウイルス粒子がアセンブルされる部位の決定のために重要であると考えられる。
コロナウイルス構造タンパク質間で最も保存されているNタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質(45～50kDa)は、ゲノムRNAをキャプシドで包むこと、次いでそのビリオンへの取り込みを指示することに必要である。このタンパク質は恐らく、RNAの複製にも関与する。
宿主細胞が感染すると、ウイルスゲノムの5'領域に存在するリーディングフレーム(ORF)は、ポリタンパク質に翻訳され、これはウイルスプロテアーゼによって切断され、次いで数種の非構造タンパク質、例えばRNA依存性RNAポリメラーゼ(Rep)及びATPアーゼヘリカーゼ(Hel)を放出する。これらの2つのタンパク質は、ウイルスゲノムの複製、及びウイルスタンパク質の合成で使用される転写物の生成に関与する。これらのサブゲノムmRNAが生産されるメカニズムは、完全に理解されているわけではないが、近年の事実は、各遺伝子の5'末端における転写の調節のための配列が、サブゲノムmRNAの不連続転写を調節するシグナルの代表であることを示す。
ウイルス膜のタンパク質(S、E及びMタンパク質)は中間区画に挿入され、それに対して複製されたRNA(+鎖)は、N(ヌクレオカプシド)タンパク質と共にアセンブルされる。次いでこのタンパク質-RNA複合体は、小胞体の膜に含有されるMタンパク質と組み合わされ、ヌクレオカプシド複合体が小胞体に出芽したときにウイルス粒子が形成される。次いでウイルスはゴルジ複合体をわたって移動し、最終的に例えばエキソサイトーシスによって細胞から離れる。ウイルスの宿主細胞への付着部位は、Sタンパク質のレベルである。
組換え麻疹ウイルス
既存の、又は新生の、場合によってはパンデミックのコロナウイルスに対するワクチン、特に子供(特に若い子供又は乳児)若しくは成人集団又はその両方に使用できるワクチンを開発する目的で、本発明者らは、麻疹ウイルスベクターによる選択された抗原(又はその好適な部分)由来のポリペプチドの発現に基づく戦略を設計した。この場合、特に、麻疹ウイルス(MV又はMeV)は、生きた弱毒化麻疹ウイルスから選択され、例えばワクチン麻疹ウイルスである。特定の実施形態において、生きた弱毒化した麻疹ウイルスは、Schwarz株である。
本発明は、宿主の免疫系にスパイク由来の抗原等のコロナウイルス抗原又はそれに由来するポリペプチドを提供するための新しいアプローチを提唱し、特に、コロナウイルス、特にSARS-CoV-2株によって引き起こされる疾患に対する保護、特に予防的な保護を付与するために、特に哺乳類宿主、特にヒト宿主において免疫応答を惹起するために、このようなポリペプチド又は抗原を発現させるための麻疹ウイルスベクターの使用を提供する。コロナウイルスの免疫原性ポリペプチドのベクターとして麻疹ウイルスを使用するこのアプローチはまた、宿主において免疫応答の品質を改善するために、ベクター特性からの、特にベクターの免疫特性の利益も得ている。したがって本発明者らは、コロナウイルス感染、特にSARS-CoV-2感染に起因する疾患に対して有効であり長続きすると予想される、哺乳類、特にヒト個体において免疫応答を惹起することが可能な、生きた組換え感染性弱毒化麻疹ウイルス、例えばSchwarz株を使用して得られた組換え麻疹ウイルスを提供する。
したがって本発明は、コロナウイルス免疫原又はコロナウイルス抗原のエピトープを発現させるためのベクターとしての麻疹ウイルスの使用に関する。一部の実施形態において、前記免疫原又はエピトープは、コロナウイルスのS、E、N、ORF3a、ORF8、ORF7a及びMタンパク質等の上記で一般的に記載した通りの、又はSARS-CoV-2株に関して具体的に記載した通りの、及び本発明の説明で例示した通りのSARS-CoV-2の野生型抗原由来のポリペプチドを包含するか又はそれらに由来する。
組換え麻疹ウイルス粒子は、野生型SARS-CoV-2抗原、哺乳類宿主において免疫応答を惹起するのに十分なエピトープを含むその断片、又は突然変異若しくはトランケーションした抗原を発現することができ、天然の抗原のアミノ酸残基又は領域の欠失の結果生じる突然変異若しくはトランケーション又は断片は、抗原の免疫原性特性を保存し、免疫原性組成物におけるそれらの生産又はそれらの使用を可能にする。したがって、突然変異した抗原又は抗原の断片は、細胞において安定性の改善をもたらすことができ、及び/又は抗原の可溶化した形態の回収及び/又は抗原の多量体の形態、特にそれらの三量体(例えばスパイク由来の抗原のための)を可能にする。本明細書で開示されるポリペプチドは特に、CoVに由来し、特にSARS-CoV-2に由来し、天然タンパク質と同一であり得る構造タンパク質であるか、又は代替として、突然変異、特に標的化された点突然変異によって、例えば、置換(特に保存的アミノ酸残基による)によって、又はアミノ酸残基の付加によって、又は翻訳後の二次修飾(グリコシル化を含む)によって、又は参照の天然タンパク質と比べて短くしたサイズを有する断片を生じる天然タンパク質の部分の欠失等によってそれらから得ることができる構造タンパク質である。断片は、それらが宿主、特に哺乳類宿主、特にヒト宿主において免疫応答を惹起するのに好適な、好ましくは、CoV、特にSARS-CoV-2に対する保護を可能にする応答を惹起するのに好適な天然タンパク質のエピトープを有する程度に、本発明の範囲内に包含される。エピトープは、特に、タンパク質が投与された、又はそれが本発明の感染性の複製能のある粒子の投与後に発現される宿主における抗体の生産の活性化を介して体液性免疫応答を惹起することに関与するB細胞エピトープのタイプのものである。エピトープは、代替として、細胞媒介性免疫応答(CMI応答)の惹起に関与するT細胞エピトープのタイプのものであってもよい。断片は、CoVの、特にSARS-CoV-2の天然タンパク質のアミノ酸配列サイズの50%より多く、好ましくは少なくとも90%又は95%を表すサイズを有していてもよい。代替として、断片は、天然タンパク質のエピトープを内包する少なくとも10アミノ酸残基を有する短いポリペプチドであってもよい。断片はまた、この点に
おいて、本明細書において定義されるポリエピトープも含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、可溶性部分において抗原を含有するか又はそれからなるか、及び/又は点突然変異している(例えば天然の抗原のアミノ酸残基において1%、2%又は5%未満の置換を有する)天然の抗原の断片である。突然変異は、細胞におけるその安定性を改善するように設計することができる。ポリペプチド(例えばSポリペプチド)は、特にコロナウイルスの天然の又は改変された抗原の三量体又は三量体化形態として発現させることができる。言葉「ポリペプチド」及び「抗原」は、本明細書で提供される定義に従って、本発明による「コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチド」を定義するのに同義的に使用される。したがってポリペプチドのアミノ酸配列は、CoVの天然の成熟又は前駆タンパク質であるポリペプチド等の、CoV、特にSARS-CoV-2の株の抗原中のカウンターパートと同一であるか、又はその免疫原性断片又はそのバリアントを定義するための挿入、置換、又は欠失によって改変されているかのいずれかである。
特に、天然に存在するCoVポリペプチドに、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する断片又はバリアント。アミノ酸配列同一性は、本明細書において定義されるように決定することができる。本発明のCoVタンパク質の断片又は突然変異体は、本明細書において例示された特定のアミノ酸配列に対して定義してもよい。
本発明の第1の態様において、組換え麻疹ウイルスによる発現のための異種ポリペプチドは、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の糖タンパク質Sから誘導される:それらは、Sポリペプチド、例えば、そのグリコシル化された、又はグリコシル化されていない形態のものであってもよいし、又はそれらは、その断片、例えば免疫原性断片S1及び/若しくはS2又はそれらより短いその断片、例えば機能性ドメインを含む、すなわちウイルスの生活環に影響を与えるドメインを欠失しているか又はそれにおいて改変されている全長Sポリペプチドのより短い断片等であってもよい。本発明によれば、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のSポリペプチドの断片は、組換えウイルス粒子の状況において、免疫応答を惹起するのに好適なエピトープを含む。本発明によるSの特定の断片又はSの突然変異した断片若しくはSの突然変異した抗原は、以下に列挙した、特に、以下に開示されるヌクレオチド配列によってコードされた、若しくは本明細書に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド:SARS-CoV-2のSポリペプチド、stab-S SARS-CoV-2のポリペプチド(SARS-CoV-2のS2Pポリペプチドとも称される)、SARS-CoV-2のSectoポリペプチド、SARS-CoV-2のstab-Sectoポリペプチド、SARS-CoV-2のS1ポリペプチド、SARS-CoV-2のS2ポリペプチド、SARS-CoV-2のトリSectoポリペプチド、SARS-CoV-2のtristab-Sectoポリペプチド、S3F SARS-CoV-2のポリペプチド、S2P3F SARS-CoV-2のポリペプチド、S2PΔF SARS-CoV-2のポリペプチド、SARS-CoV-2のS2PΔF2Aポリペプチド、SARS-CoV-2のT4-S2P3F(tristab-Secto-3F)ポリペプチド、S6P SARS-CoV-2のポリペプチド、S6P3F SARS-CoV-2のポリペプチド、S6PΔF SARS-CoV-2のポリペプチド、SCCPP SARS-CoV-2のポリペプチド、SCC6P SARS-CoV-2のポリペプチド、SMVopt2P SARS-CoV-2のポリペプチド、SMVoptΔF SARS-CoV-2のポリペプチド、SMVopt2PΔF SARS-CoV-2のポリペプチドであり、好ましくは、S、stab-S(S2Pとも称される)、S3F、S2P3F、S2PΔF及びSARS-CoV-2のS2PΔF2Aポリペプチドからなる群から選択される。断片は、野生型配列から得てもよいし、又は野生型配列と比べて突然変異及び/又は欠失があってもよい。本発明による好ましいSの断片又はSの突然変異した断片は、SARS-CoV-2のSポリペプチド、stab-S SARS-CoV-2のポリペプチド(SARS-CoV-2のS2Pポリペプチドとも称される)、S3F SARS-CoV-2のポリペプチド、S2P3F SARS-CoV-2のポリペプチド、S2PΔF SARS-CoV-2のポリペプチド、SARS-CoV-2のS2PΔF2Aポリペプチド、SARS-CoV-2のT4-S2P3F(tristab-Secto-3F)ポリペプチド、S6P SARS-CoV-2のポリペプチド、S6P3F SARS-CoV-2のポリペプチド、S6PΔF SARS-CoV-2のポリペプチド、SCCPP SARS-CoV-2のポリペプチド、SCC6P SARS-CoV-2のポリペプチド、SMVopt2P SARS-CoV-2のポリペプチド、SMVoptΔF SARS-CoV-2のポリペプチド及びSMVopt2PΔF SARS-CoV-2のポリペプチドからなる群から選択される。本発明によるより好ましいSの断片又はSの突然変異した断片若しくはSの突然変異した抗原は、S2P3F SARS-CoV-2のポリペプチド、S2PΔF SARS-CoV-2のポリペプチド、SARS-CoV-2のS2PΔF2Aポリペプチド、好ましくはS2PΔF SARS-CoV-2のポリペプチド、より好ましくはSARS-CoV-2のS2PΔF2Aポリペプチドからなる群から選択される。
好ましくは、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸突然変異、すなわちアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失は、
- 発現されたタンパク質をその融合前の状態に維持するために(2P突然変異)、及び/又は
- S1/S2切断を防ぐために(3F突然変異を介するか又は取り囲むループのΔF欠失を介するかのいずれかでのフューリン切断部位の不活性化)、及び/又は
- 小胞体回復シグナル(ERRS)を不活性化するために(以下で定義される2A突然変異)、及び/又は
- Sタンパク質のS1ドメインに位置する受容体結合ドメイン(RBD)を閉じたコンフォメーションに(すなわち下がった(down)位置に、又は閉鎖された状態に)維持するために、
CoV、特にコロナウイルスSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列に導入される。
本発明の別の態様において、組換え麻疹ウイルスによる発現のための異種ポリペプチドは、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の以下の抗原、E、N、ORF3a、ORF8、ORF7a又はMタンパク質の1つ、特にNタンパク質から誘導される。
したがって本発明は、
(1)麻疹ウイルス(MV)の全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(2)コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチド、特に、上記で開示されたものを含む、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にコロナウイルスSARS-CoV-2の、少なくともスパイク(S)ポリペプチド、若しくはその免疫原性断片、又は特にSポリペプチドのバリアント若しくはその断片をコードする前記第1のポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
第1の異種ポリヌクレオチドは、組換えMV-CoV、特にMV-CoVS核酸分子が提供されるように、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加の転写単位(ATU)内に置かれている(作動可能にクローニングされている)、核酸構築物に関する。
本発明の好ましい実施形態において、核酸構築物は、
(1)麻疹ウイルス(MV)の全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(2)(a)配列番号3のSARS-CoV-2の全長スパイク(S)タンパク質、又は(b)配列番号11のS1ポリペプチド、配列番号13のS2ポリペプチド、配列番号7のSectoポリペプチド及び配列番号16のトリSectoポリペプチドからなる群から選択される、(a)における全長Sタンパク質の免疫原性断片、又は
(c)1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失、特に10未満、又は5未満のアミノ酸残基の置換、挿入、及び/又は欠失を有する(a)若しくは(b)のバリアント
をコードする第1の異種ポリヌクレオチド
を含み、好ましくは、
(i)発現された全長Sタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する突然変異、特に、S2ドメインで生じるアミノ酸残基の置換による突然変異、好ましくはS2ドメインで生じる少なくとも2つのプロリン残基の置換による突然変異、及び/又は
(ii)Sタンパク質のフューリン切断部位を不活性化する突然変異、特に、S1/S2フューリン切断部位で生じるアミノ酸残基の挿入、置換又は欠失による突然変異、及び/又は
(iii)小胞体回復シグナル(EERS)を不活性化する突然変異、及び/又は
(iv)Sタンパク質のS1ドメインに位置する受容体結合ドメイン(RBD)を閉じたコンフォメーションに維持する突然変異
を含む突然変異した抗原
を含み、
第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置された追加の転写単位(ATU)(ATU2)に、又はMVのH遺伝子の下流に配置されたATU(ATU3)に置かれている。
本発明の特定の実施形態において、核酸構築物において:
(i)発現された全長Sタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する突然変異は、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2つのプロリン残基の置換による突然変異(K986P及びV987P)であるか、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の817、892、899、942、986位及び987位における6つのプロリン残基の置換による突然変異(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P及びV987P)であり、及び/又は
(ii)Sタンパク質のフューリン切断部位を不活性化する突然変異は、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682、683位及び685位におけるS1/S2フューリン切断部位で生じる3つのアミノ酸残基の置換による突然変異(R682G、R683S及びR685G)であるか、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質の675位におけるアミノ酸と685位におけるアミノ酸との間のS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失による突然変異であり、ループは、配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARからなり、及び/又は
(iii)EERSを不活性化する突然変異は、配列番号3のアミノ酸配列の1269位及び1271位における2つのアラニン残基の置換による突然変異であり、及び/又は
(iv)Sタンパク質のS1ドメインに位置するRBDを閉じたコンフォメーションに維持する突然変異は、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の383位及び985位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(S383C及びD985C)であるか、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の413位及び987位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(G413C及びP987C)であり;及び/又は
(v)(c)におけるバリアントは、配列番号3のアミノ酸配列の69位及び70位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の144位及び145位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の501位におけるチロシン残基の置換による突然変異(N501Y)、配列番号3のアミノ酸配列の570位におけるアスパラギン酸残基の置換による突然変異(A570D)、配列番号3のアミノ酸配列の681位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(P681H)、配列番号3のアミノ酸配列の716位におけるイソロイシン残基の置換による突然変異(T716I)、配列番号3のアミノ酸配列の982位におけるアラニン残基の置換による突然変異(S982A)、配列番号3のアミノ酸配列の1118位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(D1118H)、配列番号3のアミノ酸配列の484位におけるリシン残基の置換による突然変異(E484K)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるアスパラギン残基の置換による突然変異(K417N)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるスレオニン残基の置換による突然変異(K417T)及び配列番号3のアミノ酸配列の614位におけるグリシン残基の置換による突然変異(D614G)からなる群から選択される突然変異、特に、配列番号3のアミノ酸配列の501位におけるチロシン残基の置換による突然変異(N501Y)、配列番号3のアミノ酸配列の484位におけるリシン残基の置換による突然変異(E484K)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるアスパラギン残基の置換による突然変異(K417N)及び配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるスレオニン残基の置換による突然変異(K417T)からなる群から選択される突然変異を含むポリペプチドをコードする。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドは、配列番号3のSARS-CoV-2の全長Sタンパク質である。
一部の実施形態において、全長Sタンパク質の免疫原性断片又は抗原性断片は、配列番号11のS1ポリペプチド、配列番号13のS2ポリペプチド、配列番号7のSectoポリペプチド及び配列番号16のトリSectoポリペプチドからなる群から選択される。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、発現された全長Sタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する1つ又は複数の追加の置換を更に含む。一部の実施形態において、全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K986P及びV987P、又は配列番号3のアミノ酸突然変異F817P、A892P、A899P、A942P、K986P及びV987Pを更に含む。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、Sタンパク質のフューリン切断部位を不活性化する1つ又は複数の追加の置換を更に含む。一部の実施形態において、全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異R682G、R683S及びR685G、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質の675位におけるアミノ酸と685位におけるアミノ酸との間のS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失を更に含み、ループは、配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARからなる。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、EERSを不活性化する1つ又は複数の追加の置換を更に含む。一部の実施形態において、全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の1269位及び1271位における2つのアラニン残基の置換を更に含む。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、Sタンパク質のS1ドメインに位置するRBDを閉じたコンフォメーションに維持する1つ又は複数の追加の置換を更に含む。一部の実施形態において、全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異S383C及びD985Cを更に含む。一部の実施形態において、全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異G413C及びP987Cを更に含む。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の69位及び70位におけるアミノ酸残基の欠失を更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の144位及び145位におけるアミノ酸残基の欠失を更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異N501Yを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異A570Dを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異P681Hを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異T716Iを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異S982Aを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異D1118Hを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異E484Kを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K417Nを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K417Tを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの全長Sタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異D614Gを更に含む。
一部の実施形態において、全長Sタンパク質の、又は免疫原性断片若しくは抗原性断片の突然変異した抗原は、(a)配列番号52のTA-S2P3Fポリペプチド、若しくは682位、683位、685位、986位及び987位で変更されていない、配列番号52と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(b)配列番号54のS6Pポリペプチド、若しくは817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、配列番号54と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(c)配列番号56のS6P3Fポリペプチド、若しくは682位、683位、685位、817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、配列番号56と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(d)配列番号58のS6PΔFポリペプチド、若しくは806位、881位、888位、931位、975位及び976位で変更されていない、配列番号58と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(e)配列番号60のSCCPPポリペプチド、若しくは383位、985位、986位及び987位で変更されていない、配列番号60と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(f)配列番号62のSCC6Pポリペプチド、若しくは383位、817位、892位、899位、942位、985位、986位及び987位で変更されていない、配列番号62と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(g)配列番号5のSMVopt2Pポリペプチド、若しくは986位及び987位で変更されていない、配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(h)配列番号65のSMVoptΔFポリペプチド、若しくは配列番号65と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(i)配列番号47のSMVopt2PΔFポリペプチド、若しくは975位及び976位で変更されていない、配列番号47と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(j)SMVopt6Pポリペプチド、若しくは817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、SMVopt6Pポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(k)SMVopt6PΔFポリペプチド、若しくは806位、881位、888位、931位、975位及び976位で変更されていない、SMVopt6PΔFポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(l)SMVopt6P3Fポリペプチド、若しくは682位、683位、685位、817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、SMVopt6P3Fポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアントである。一部の実施形態において、突然変異した抗原は、(a)配列番号52のTA-S2P3Fポリペプチド;又は(b)配列番号54のS6Pポリペプチド、又は(c)配列番号56のS6P3Fポリペプチド、又は(d)配列番号58のS6PΔFポリペプチド、又は(e)配列番号60のSCCPPポリペプチド、又は(f)配列番号62のSCC6Pポリペプチド、又は(g)配列番号5のSMVopt2Pポリペプチド、又は(h)配列番号65のSMVoptΔFポリペプチド、又は(i)配列番号47のSMVopt2PΔFポリペプチドである。
一部の実施形態において、核酸構築物は、配列番号2の完全に最適化された遺伝子Sの代わりに配列番号36の麻疹最適化遺伝子SMVoptを使用して設計することができる。
特定の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置されたATU2に、又はMVのH遺伝子の下流に配置されたATU3中に置かれている。好ましくは、第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのH遺伝子の下流に配置されたATU3中に置かれている。
本発明による核酸構築物は、特に、一緒に作動可能に連結した異なる起源の様々なポリヌクレオチドの組換えによって得られるか又は得ることができる、精製されたDNA分子である。これはまた、麻疹ウイルス(MV)の全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードする分子のcDNAと称する結果として、cDNAでもあるし、cDNAと同義的に称される。
表現「作動可能に連結した(operatively linked)」又は「作動可能に連結した(operably linked)」は、異なるポリヌクレオチド及び核酸構築物は、特に細胞若しくは細胞株において、特に本発明の組換え感染性MV粒子の生産又は増幅のためのレスキュー系の一部として使用される細胞若しくは細胞株において、又は宿主細胞において、特に哺乳類において、又はヒト細胞において、効率的に転写され、場合により翻訳されるように、本発明の核酸構築物の異なるポリヌクレオチド間に存在する機能的な連結を指す。
本発明の別の態様において、追加の組換え麻疹ウイルスによる発現のための異種ポリペプチドは、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の糖タンパク質Sから誘導される:それらは、Sポリペプチド、例えば、そのグリコシル化された、又はグリコシル化されていない形態のものであってもよいし、又はそれらは、その断片、例えば免疫原性断片S1及び/若しくはS2又はそれらより短いその断片、例えば機能性ドメインを含む、すなわちウイルスの生活環に影響を与えるドメインを欠失しているか又はそれにおいて改変されている全長Sポリペプチドのより短い断片等であってもよい。本発明によれば、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のSポリペプチドの断片は、組換えウイルス粒子の状況において、免疫応答を惹起するのに好適なエピトープを含む。本発明によるSの特定の断片又はSの突然変異した断片若しくはSの突然変異した抗原は、以下に列挙した、特に、以下に開示されるヌクレオチド配列によってコードされた、若しくは本明細書に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである:SARS-CoV-2のSポリペプチド(配列番号3)、stab-S SARS-CoV-2のポリペプチド(SARS-CoV-2のS2Pポリペプチドとも称される)(配列番号5)、SARS-CoV-2のSectoポリペプチド(配列番号7)、SARS-CoV-2のstab-Sectoポリペプチド(配列番号9)、SARS-CoV-2のS1ポリペプチド(配列番号11)、SARS-CoV-2のS2ポリペプチド(配列番号13)、SARS-CoV-2のトリSectoポリペプチド(配列番号17)、SARS-CoV-2のtristab-Sectoポリペプチド(配列番号19)、又は小胞体の保持に関与するドメインにおいて突然変異したS。一部の実施形態において、小胞体の保持に関与するドメインにおいて突然変異したSは、好ましくは、SARS-CoV-2のS(配列番号3)又はstab-S(S2Pとも称される)(配列番号5)ポリペプチドであるか、又はそれらから誘導される。断片は、野生型配列から得てもよいし、又は野生型配列と比べて突然変異及び/又は欠失があってもよい。
本発明による好ましいSの断片又はSの突然変異した断片は、SARS-CoV-2のSポリペプチド(配列番号3)、stab-S SARS-CoV-2のポリペプチド(SARS-CoV-2のS2Pポリペプチドとも称される)(配列番号5)からなる群から選択される。
好ましくは、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸突然変異、すなわちアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失は、
- 発現されたタンパク質をその融合前の状態に維持するために(P2突然変異)、及び/又は
- 小胞体回復シグナル(ERRS)を不活性化するために(2A突然変異又は配列番号149のKXHXXモチーフの欠失)、及び/又は
- 細胞内保持の活動、特にゴルジと小胞体(ER)区画との間のサイクリングを含む保持の活動を防ぐために、
CoV、特にSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列に導入される。
特定の実施形態において、Sタンパク質の細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異は、少なくともERにおけるポリペプチドの回復を損なわせ、この場合、挿入、置換、又は欠失による突然変異は、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列中で行われ、配列番号149のKXHXXモチーフを包含するERRSシグナルのアミノ酸残基の全部又は一部の挿入、置換、又は欠失による突然変異を包含する。この特定のドメインにおける突然変異は、得られたポリペプチドの、細胞の原形質膜への輸送を可能にする。
特定の実施形態において、Sタンパク質の細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異は、少なくとも、二重ドメインSタンパク質の細胞表面発現を増加させ、この場合、挿入、置換、又は欠失による突然変異は、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントすることができる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列中で行われ、配列番号149のKXHXXモチーフを包含するERRSシグナルのアミノ酸残基の全部又は一部の挿入、置換、又は欠失による突然変異を包含する。この特定のドメインにおける突然変異は、得られたポリペプチドの、細胞の原形質膜への輸送を可能にする。特定の実施形態において、細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異を有する二重ドメインSタンパク質の細胞表面発現は、野生型全長Sタンパク質の細胞表面発現と比較して、少なくとも約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約100%増加する。特定の実施形態において、細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異を有する二重ドメインSタンパク質の細胞表面発現は、野生型全長Sタンパク質の細胞表面発現と比較して、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%増加する。特定の実施形態において、細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異を有する二重ドメインSタンパク質の細胞表面発現は、約1%～約100%、約5%～約100%、約10%～約100%、約15%～約100%、約20%～約100%、約25%～約100%、約30%～約100%、約35%～約100%、約40%～約100%、約45%～約100%、約50%～約100%、約55%～約100%、約60%～約100%、約65%～約100%、約70%～約100%、約75%～約100%、約80%～約100%、約85%～約100%、約90%～約100%、又は約95%～約100%増加する。特定の実施形態において、細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異を有する二重ドメインSタンパク質の細胞表面発現は、1%～100%、5%～100%、10%～100%、15%～100%、20%～100%、25%～100%、30%～100%、35%～100%、40%～100%、45%～100%、50%～100%、55%～100%、60%～100%、65%～100%、70%～100%、75%～100%、80%～100%、85%～100%、90%～100%、又は95%～100%増加する。
本発明の別の態様において、組換え麻疹ウイルスは、以下のコロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の抗原、E(配列番号23)、N(配列番号22)、ORF3a(配列番号26)、ORF8(配列番号25)、ORF7a(配列番号27)又はM(配列番号24)タンパク質のうちの1つ、特にN(配列番号22)タンパク質由来の抗原性ポリペプチドである、第2の異種ポリペプチドを発現することができる。
したがって本発明は、
(1)麻疹ウイルス(MV)の弱毒化株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(2)コロナウイルス(CoV)の、特にコロナウイルスSARS-CoV-2の、少なくとも1つのポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、特に、前記第1のポリヌクレオチドは、少なくとも、特に上記で開示されたものを含む、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にコロナウイルスSARS-CoV-2の、スパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードする、異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
第1の異種ポリヌクレオチドは、組換えMV-CoV、特にMV-CoVS核酸分子が提供されるように、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加の転写単位(ATU)内に置かれている、核酸構築物に関する。
本発明の好ましい実施形態において、核酸構築物は、
(1)麻疹ウイルス(MV)の弱毒化株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(2)第1の異種ポリヌクレオチドであって、
(a)二重ドメインSタンパク質SARS-CoV-2のポリペプチドであって、:
- 二重ドメインSタンパク質の細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異であって、挿入、置換、又は欠失による突然変異は、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列中にあり、配列番号149のKXHXXモチーフを包含するERRSシグナルのアミノ酸残基の全部又は一部の挿入、置換、又は欠失による突然変異を包含し、前記挿入、置換、又は欠失による突然変異は、少なくとも、小胞体(ER)におけるポリペプチドの回復を損なわせ、特に、SARS-CoV-2の二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位のアミノ酸残基の全部又は一部の挿入、置換、又は欠失による突然変異を含み、ただし、配列番号3のアミノ酸配列の1269位～1273位の配列番号150のKLHYTモチーフの少なくとも2つのアミノ酸残基が置換によって突然変異しているか、又は配列番号3のアミノ酸配列の1269位～1273位の配列番号150のKLHYTモチーフが欠失している、突然変異及び
- 任意選択で、発現された二重ドメインSタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する置換による追加の突然変異
を含む、ポリペプチド、又は
(b)1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、(a)の二重ドメインSタンパク質の免疫原性断片又はその突然変異した抗原
をコードする、異種ポリヌクレオチド
を含み、
第1の異種ポリヌクレオチドは、MV(ATU2)のP遺伝子とM遺伝子との間に配置された追加の転写単位に、又はMV(ATU3)のH遺伝子の下流に配置された追加の転写単位に、好ましくはATU2に置かれている。
本発明の特定の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の69位及び70位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の144位及び145位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の501位におけるチロシン残基の置換による突然変異(N501Y)、配列番号3のアミノ酸配列の570位におけるアスパラギン酸残基の置換による突然変異(A570D)、配列番号3のアミノ酸配列の681位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(P681H)、配列番号3のアミノ酸配列の716位におけるイソロイシン残基の置換による突然変異(T716I)、配列番号3のアミノ酸配列の982位におけるアラニン残基の置換による突然変異(S982A)、配列番号3のアミノ酸配列の1118位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(D1118H)、配列番号3のアミノ酸配列の484位におけるリシン残基の置換による突然変異(E484K)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるアスパラギン残基の置換による突然変異(K417N)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるスレオニン残基の置換による突然変異(K417T)及び配列番号3のアミノ酸配列の614位におけるグリシン残基の置換による突然変異(D614G)からなる群から選択される突然変異、特に、配列番号3のアミノ酸配列の501位におけるチロシン残基の置換による突然変異(N501Y)、配列番号3のアミノ酸配列の484位におけるリシン残基の置換による突然変異(E484K)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるアスパラギン残基の置換による突然変異(K417N)及び配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるスレオニン残基の置換による突然変異(K417T)からなる群から選択される突然変異を更に含む。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の69位及び70位におけるアミノ酸残基の欠失を更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の144位及び145位におけるアミノ酸残基の欠失を更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異N501Yを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異A570Dを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異P681Hを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異T716Iを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異S982Aを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異D1118Hを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異E484Kを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K417Nを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K417Tを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異D614Gを更に含む。
Sタンパク質の細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異の特定の実施形態において、配列番号149のKXHXXモチーフを包含するERRSシグナルの全てのアミノ酸残基は、置換されているか又は欠失している。
Sタンパク質の細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異の他の特定の実施形態において、配列番号149のKXHXXモチーフを包含するERRSシグナルのアミノ酸残基の一部は、置換されているか又は欠失している。
本発明の特定の実施形態において、Sタンパク質の細胞質尾部における挿入、置換、又は欠失による突然変異は、配列番号149のKXHXXモチーフを包含するERRSシグナルのアミノ酸残基の全部又は一部の挿入、置換、又は欠失による突然変異、及び1、2、3、4、5又は6アミノ酸残基の挿入、置換、又は欠失による突然変異を包含し、これらの突然変異は、配列番号3のアミノ酸配列1263位～1273位とアライメントすることができるSタンパク質の11アミノ酸残基の配列で生じる。
好ましくは、第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号3のアミノ酸配列の1269位及び1271位における2つのアラニン残基の置換、又は配列番号3のアミノ酸配列の1269位～1273位のアミノ酸残基の欠失、又は配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位のアミノ酸残基の欠失による突然変異を含む、SARS-CoV-2の二重ドメインSタンパク質をコードする。
より一層好ましくは、第1の異種ポリヌクレオチドは、(a)配列番号3のアミノ酸配列の986位及び987位における2つのプロリン残基の置換による突然変異、及びその11のC末端アミノ酸残基である配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位の欠失を含む、SARS-CoV-2の融合前安定化SF-2P-dERポリペプチド、又は(b)配列番号3のアミノ酸配列の986位及び987位における2つのプロリン残基の置換による突然変異、及び配列番号3のアミノ酸配列の1269位及び1271位における2つのアラニン残基の置換による突然変異を含む、SARS-CoV-2の融合前安定化SF-2P-2aポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置されたATU2に、又はMVのH遺伝子の下流に配置されたATU3に置かれている。好ましくは、第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置されたATU2に置かれている。本発明による核酸構築物は、一緒に作動可能に連結した異なる起源の様々なポリヌクレオチドの組換えによって得られるか又は得ることができる、精製されたDNA分子である。核酸構築物は、麻疹ウイルス(MV)の全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子を含んでいてもよい。
本発明の特定の実施形態において、核酸構築物は、コロナウイルスの、特にコロナウイルスSARS-CoV-2の、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、少なくとも1つのポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチド、その免疫原性断片(野生型又は突然変異した断片を含む)、又はその突然変異した抗原を更に含み、ポリペプチドは、第1の異種ポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも1つのポリペプチド、又は第1の異種ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと異なり、特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド、マトリックス(M)、Eポリペプチド、ORF8ポリペプチド、ORF7aポリペプチド及びORF3aポリペプチド、又はその免疫原性断片又はその突然変異した断片若しくはその突然変異した抗原からなる群から選択され、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドの位置と異なる位置のATU内に置かれている。
本発明の特定の実施形態において、核酸構築物は、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、少なくとも1つのポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチド、その免疫原性断片若しくはその抗原性断片(野生型又は突然変異した断片を含む)、又はその突然変異した抗原を更に含み、ポリペプチドは、第1の異種ポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも1つのポリペプチドと異なり、特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド、マトリックス(M)、Eポリペプチド、ORF8ポリペプチド、ORF7aポリペプチド及びORF3aポリペプチド、又はその免疫原性断片、若しくはその突然変異した断片、若しくはその突然変異した抗原からなる群から選択され、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に、特にMVのN遺伝子の上流の追加の転写単位(ATU1)内に、又は特にATU2内に、又は特にATU3内に置かれている。
第2の異種ポリヌクレオチドをクローニングするためのATUは、第1の異種ポリヌクレオチドをクローニングするのに使用されるATUと異なる位置に置かれており、特に、ATU1中のMVのN遺伝子の上流に、又は特にATU2におけるMVのP遺伝子とM遺伝子との間の位置のATU内に、又は特にATU3におけるMVのH遺伝子下流の位置のATU内に置かれている。
更なる態様において、本発明は、
(1)麻疹ウイルス(MV)の全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(2)コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドであって、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド、マトリックス(M)、Eポリペプチド、ORF8ポリペプチド、ORF7aポリペプチド及びORF3aポリペプチド、又はその免疫原性若しくは抗原性断片、若しくはその突然変異した断片、若しくはその突然変異した抗原からなる群から選択される、異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
第2の異種ポリヌクレオチドは、ATU内に置かれている、核酸構築物に関する。
本発明のために使用される追加の転写単位(ATU)配列、特にATU1、ATU2、ATU3は、異種ポリヌクレオチドをMVのcDNAにクローニングするために使用される、MVのcDNAにおける配列である。ATU配列は、導入遺伝子のMV依存性発現に必要なシス作用性配列、例えば先行する遺伝子のプロモーター、ポリヌクレオチドによって代表される挿入物、例えば、コロナウイルスの少なくとも1つのポリペプチドをコードする、特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特に、SARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードする、又は特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド、マトリックス(M)、Eポリペプチド、ORF8ポリペプチド、ORF7aポリペプチド若しくはORF3aポリペプチド、又はその免疫原性断片、若しくはその突然変異した断片、若しくはその突然変異した抗原をコードする、第1又は第2のポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドの挿入のための多重クローニング部位のカセットを含む。遺伝子の遺伝子間配列(転写を促進する遺伝子開始(GS)及び挿入物(異種ポリヌクレオチド)の転写を停止させるMVのP遺伝子の遺伝子終結(GE)を含む)に加えて、ATUは、異種ポリヌクレオチドの挿入のためのポリリンカー配列を含む。ATU配列は、本発明の構築物で例示される。
ATUは、本発明を行うために使用される場合、有利には、MVのアンチゲノムの全長(+)RNA鎖をコードするcDNA分子のN末端配列内に配置され、特に、N遺伝子から上流に(ATU1)、又はこのウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に(ATU2)、又はH遺伝子とL遺伝子との間に(ATU3)配置される。MVのウイルスRNAの転写は、5'から3'末端への勾配に従うことが観察されている。したがって、cDNAのコード配列の5'末端に挿入されたATUは、cDNAのコード配列の3'末端の近くに挿入されたATUより多くの、ATU内の異種DNA配列の発現を可能にすると予想される。例示的なATUは、少なくとも1つのポリペプチド、例えばコロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又はそれが含有する1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失)を有するその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、したがって、MVのcDNA分子のいずれかの遺伝子間領域に、特にATUに挿入されていてもよい。本発明の特定の構築物は、実施例で例示されるものである。
本発明の好ましい実施形態において、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、少なくともCoVの、特にSARS-CoV-2の、スパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、MV cDNA分子のP遺伝子とM遺伝子との間の遺伝子間領域(ATU2)、又はMV cDNA分子のH遺伝子とL遺伝子との間(ATU3)、好ましくはATU3中に挿入される。
本発明の特定の実施形態において、構築物は、MVの全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNAにおいて、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチド、特にスパイク(S)E、N、ORF3a、ORF8、ORF7a又はMポリペプチド(例えば、Genbank MN908947.3に開示された配列を有するSポリペプチド、又は天然S抗原由来の、特にSの断片又は改変されたSの断片として本明細書において例示されたポリペプチドのいずれか)、又は本明細書で開示されるその免疫原性断片(突然変異した断片を含む)、又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有するその突然変異した抗原をコードするポリヌクレオチドをクローニングすることによって調製される。
代替として、本発明の核酸構築物は、核酸断片の合成又は例えばPCRによるテンプレートからの重合の工程を使用して調製してもよい。
本発明の核酸構築物及び本発明のMV-CoVは、コロナウイルスのS、E、N、ORF3a、ORF8、ORF7a又はMタンパク質からなる群から選択されるか、又はSARS-CoV-2株に関して具体的に記載された少なくとも1つのポリペプチド、特にコロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有するその免疫原性断片をコードするか又はそれらを発現する。
好ましい実施形態によれば、本発明はまた、宿主、特にヒト宿主において、MV-CoVのキメラ感染性粒子の表面における、コロナウイルスのS、E、N、ORF3a、ORF8、ORF7a若しくはMタンパク質からなる群から選択されるか、若しくはSARS-CoV-2株に関して具体的に記載された少なくとも1つのポリペプチド、特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片の効率的な発現を可能にするためのポリヌクレオチドの改変及び最適化にも関する。
この実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列の最適化は、内部TATAボックス、カイ部位及びリボソーム進入部位;ATリッチ又はGCリッチな配列ストレッチ;AUリッチな配列エレメント(ARE)、阻害性配列エレメント(INS)、及びシス作用性リプレッサー(CRS)配列エレメント;反復配列及びRNA二次構造;潜在スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに分岐点を含む核酸分子のシス活性ドメインを回避するように操作してもよい。
最適化されたポリヌクレオチドはまた、特定の細胞型における発現のためにコドン最適化されてもよい。この最適化は、発現されたタンパク質に影響を与えずに、細胞におけるキメラ感染性粒子生産の効率を増加させることを可能にする。
本発明の特定の実施形態において、少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、ヒトにおける使用のためにコドン最適化されている。
少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、若しくはその免疫原性断片、又はSポリペプチドのバリアント、若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドの最適化は、元のアミノ酸残基に対するコドンから翻訳されたアミノ酸残基の同一性に影響を与えずに、コドンにおけるゆらぎ位置の改変によって実行することができる。
最適化はまた、転写物の編集をもたらすことができる麻疹ウイルスから特定の配列を除去するためにも実行される。麻疹ウイルス転写の編集は、特に、麻疹ウイルスのP遺伝子によってコードされた転写物において行われる。この編集は、P転写物内の特定の部位における余分なG残基の挿入によってなされ、Pタンパク質と比較してトランケーションされた新しいタンパク質を生じる。単一のG残基のみの付加は、固有なカルボキシル末端を含有するVタンパク質の発現を生じる(Cattaneo Rら、Cell. 1989 Mar 10 ;56(5) :759～64)。
本発明の特定の実施形態において、麻疹転写物編集配列は、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドからの変更をもたらした。以下の麻疹転写物編集配列が突然変異されていてもよい:AAAGGG、AAAAGG、GGGAAA、GGGGAA、TTAAA、AAAA、加えてそれらの相補配列:TTCCCC、TTTCCC、CCTTTT、CCCCTT、TTTAA、TTTT。例えば、AAAGGGは、AAAGGCに突然変異されてもよいし、AAAAGGは、AGAAGG又はTAAAGG又はGAAAGGに突然変異されてもよいし、GGGAAAは、GCGAAAに突然変異されてもよい。
本発明の特定の実施形態において、特定のペプチド/タンパク質/抗原、加えて本発明のこれらのペプチド/タンパク質/抗原のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの天然及びコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号1～49、51～66及び73～82として開示された配列から選択される。これらの配列の多くに関する追加の情報に関して、以下の表1及び3を参照されたい。
コドン最適化遺伝子は、不十分に転写/翻訳された遺伝子の高レベルの発現を促進することと、高く安定な抗原発現を有する麻疹ベースのワクチン候補を回収することの両方において有用である。しかしながら、それらは、それらの設計及び最終的なコドン(最終的な宿主ゲノムにおいて最もよく使用されるコドン)及びヌクレオチド(高いGC/AT比率)組成と本質的に関連する大きな欠点がある。したがって、コドン最適化遺伝子は、ほとんどの場合、高度に転写された場合、翻訳及び翻訳後の細胞機構の飽和並びに発現されたタンパク質の品質及び細胞それ自体(ER及びゴルジストレス)への関連する結果をもたらす高レベルの翻訳を促進する。それらの天然に高いGC/組成(通常、55～60%より高い)は、MVゲノムのGC組成がより一層低いために(47.4%)安定な組換えMVベクターの操作にとっても最適とは程遠い。したがって本発明者らは、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、以下のフィーチャを用いてMVプラットホームのために最適化された遺伝子を操作することを決定した。具体的には以下の通りである:
- 両方の鎖における、MV編集の非存在(AnGn、n≧3)-及びコア遺伝子末端(A4CKT)様配列、
- 適用可能であれば、内部TATAボックス、カイ部位及びリボソーム進入部位の除去(翻訳効率のため)、
- 適用可能であれば、ATリッチ又はGCリッチな配列ストレッチ、RNA不安定モチーフ、反復配列及びRNA二次構造の除去(転写効率、mRNA安定性のため、更には翻訳効率のためにも)、及び/又は
- バランスのとれたコドン組成、適用可能であれば、まれなコドン及び最も頻度の高いコドンの高い使用量を回避すること(翻訳機構の飽和を起こさない、翻訳の効率、精度及び速度のため)、
- 44～50%の標的GC組成(MVゲノムのGC組成に調整するため)。
加えて、高等な真核生物における潜在スプライスドナー及びアクセプター部位の除去のための基準が追加された。これは、MVプラットホームにとって重要ではないが、哺乳類細胞における一過性トランスフェクションによる合成遺伝子発現のモニターを可能にする。
BsiWI及びBssHII制限酵素部位を、それぞれ設計されたヌクレオチド配列の5'及び3'末端に付加し、得られたcDNAが、MVゲノムのヌクレオチドの数が6の倍数でなければならないと規定する「6の法則(rule of six)」に準拠するように、適切なスペーサー配列を挿入した。
得られたcDNAをS_MV最適化合成遺伝子と名付けた。N_MV最適化合成遺伝子は、それぞれ配列番号36及び配列番号37として本明細書に開示される。
本発明の特定の実施形態において、トランスファーベクタープラスミドは、以下の表1で記述されるように、配列番号34の最適化された配列(pKM-ATU2-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2))又は配列番号35の最適化された配列(pKM-ATU3-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2))を有する。
本発明の特定の実施形態において、トランスファーベクタープラスミドは、配列番号144(pTM2-SF-dER_SARS-CoV-2)、配列番号145(pTM2-S2-dER_SARS-CoV-2)、配列番号146(pTM2-SF-2P-dER_SARS-CoV-2)、配列番号147(pTM2-S2-2P-dER_SARS-CoV-2)及び配列番号148(pTM2-SF-2P-2a_SARS-CoV-2)からなる群から選択される最適化された配列を有し、好ましくは、配列番号146(pTM2-SF-2P-dER_SARS-CoV-2)又は配列番号148(pTM2-SF-2P-2a_SARS-CoV-2)の配列を有し、より一層好ましくは、配列番号146の配列(pTM2-SF-2P-dER_SARS-CoV-2)を有する。
本発明の特定の実施形態において、トランスファーベクタープラスミド内への本明細書で定義される核酸構築物の挿入は、突然変異、特にサイレント突然変異をもたらすことができる。
本発明の特定の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号3の野生型Sポリペプチド、又はその断片をコードする。その断片としては、Sポリペプチドの配列番号11のS1ドメイン又は配列番号13のS2ドメイン、好ましくは、配列番号3の野生型Sポリペプチド、又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸残基の置換又は挿入及び/又は欠失、特に10未満、又は5未満のアミノ酸残基の置換を有するその突然変異した抗原を挙げることができる。置換は、安定性を改善するように設計することができる。
本発明の特定の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号3の野生型Sポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードする。その免疫原性断片としては、Sポリペプチドの、好ましくは配列番号3の野生型Sポリペプチドの配列番号11のS1ドメイン若しくは配列番号13のS2ドメイン、又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸残基の置換又は挿入及び/又は欠失、特に10未満、又は5未満のアミノ酸残基の置換を有するその突然変異した抗原、特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸残基の置換、特に10未満、又は5未満のアミノ酸残基の置換を有する突然変異した抗原、及び本明細書で開示される細胞質尾部において最大11アミノ酸残基の欠失を有する突然変異した抗原を挙げることができる。置換は特に、安定性を改善するように設計することができる。欠失は、細胞におけるポリペプチドの表面発現を改善するように設計することができる。特定の実施形態によれば、第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号5、7、9、15、17及び19からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号5のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする。好ましい実施形態によれば、第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号76のSF-2P-dERポリペプチド、又は配列番号82のSF-2P-2aポリペプチド、好ましくは配列番号76のSF-2P-dERポリペプチド、又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸残基の置換又は挿入及び/又は欠失、特に10未満、又は5未満のアミノ酸残基の置換又は付加及び/又は欠失を有するその突然変異した抗原をコードする。
特定の実施形態によれば、第1の異種ポリヌクレオチドは、配列番号5、7、9、15、17、19、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62及び65、特に配列番号5、43、45、47及び49、好ましくは配列番号43、45、47及び49、より好ましくは配列番号45、47及び49、より一層好ましくは配列番号47又は配列番号49、より一層好ましくは配列番号49からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する突然変異した抗原をコードする。
本発明の特定の実施形態において、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の単一のポリペプチドは、核酸構築物によってコードされ、ポリペプチドは、本明細書に記載されるSポリペプチド又はその部分若しくは断片である。
本発明の核酸構築物の特定の実施形態において、第2の異種ポリヌクレオチドは、(i)配列番号22のNポリペプチド、その免疫原性断片、又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸残基の置換又は挿入及び/又は欠失、特に10未満、又は5未満のアミノ酸残基の置換又は付加又は欠失を有するNポリペプチドの突然変異した抗原、及び/又は(ii)配列番号24のMポリペプチド又はそのエンドドメイン、(iii)配列番号23のEポリペプチド、(iv)配列番号25のORF8ポリペプチド、(v)配列番号27のORF7aポリペプチド、及び/又は(vi)コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の配列番号26のORF3aポリペプチド、その免疫原性断片若しくはその抗原性断片、又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸残基の置換又は挿入及び/又は欠失、特に10未満、又は5未満のアミノ酸残基の置換又は付加及び/又は欠失を有するその突然変異した抗原をコードする。本発明の好ましい実施形態において、Nポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、配列番号20、21又は37の配列、好ましくは配列番号21又は配列番号37の配列を有する。
本発明の好ましい実施形態において、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、Sポリペプチド、S1ポリペプチド又はS2ポリペプチド、その免疫原性断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、野生型遺伝子のオープンリーディングフレームを含むか若しくはそれらからなり、又は哺乳類細胞及び/又はショウジョウバエ細胞における発現のためのコドン最適化オープンリーディングフレーム(coORF)を有し、特に、異種ポリヌクレオチドは、以下の配列:
- Sポリペプチドをコードする配列番号1又は2又は36、好ましくは配列番号2又は、
- S1ポリペプチドをコードする配列番号10又は、
- S2ポリペプチドをコードする配列番号12又は、
- stab-Sポリペプチド(S2Pポリペプチドとも称される)をコードする配列番号4又は、
- Sectoポリペプチドをコードする配列番号6又は、
- stab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号8又は、
- stab-S2ポリペプチドをコードする配列番号14又は、
- トリSectoポリペプチドをコードする配列番号16又は、
- tristab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号18又は
- S3Fポリペプチドをコードする配列番号42又は、
- S2P3Fポリペプチドをコードする配列番号44又は、
- S2PΔFポリペプチドをコードする配列番号46又は、
- S2PΔF2Aポリペプチドをコードする配列番号48又は、
- T4-S2P3Fポリペプチド(tristab-Secto-3Fとも称される)をコードする配列番号51又は、
- S6Pポリペプチドをコードする配列番号53又は、
- S6P3Fポリペプチドをコードする配列番号55又は、
- S6PΔFポリペプチドをコードする配列番号57又は、
- SCCPPポリペプチドをコードする配列番号59又は、
- SCC6Pポリペプチドをコードする配列番号61又は、
- SMVopt2Pポリペプチドをコードする配列番号63又は、
- SMVoptΔFポリペプチドをコードする配列番号64又は、
- SMVopt2PΔFポリペプチドをコードする配列番号66
のうち1つを含み、好ましくは、異種ポリヌクレオチドは、配列番号2、配列番号4、配列番号42、配列番号44、配列番号46及び配列番号48からなる群から選択される配列を含み、より好ましくは、異種ポリヌクレオチドは、S2PΔF2Aポリペプチドをコードする配列番号48の配列を含む。
本発明の特定の実施形態において、核酸構築物は、5'末端から3'末端に、ORFをコードする以下のポリヌクレオチド:
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のSポリペプチド、その免疫原性断片をコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、第1の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された、特にATU2又はATU3、好ましくはATU3に挿入された追加の転写単位(ATU)内に置かれている、第1の異種ポリヌクレオチド;
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むcDNA構築物であり、
ポリヌクレオチドは、核酸構築物内に作動可能に連結されており、ウイルス複製及び転写調節エレメント、例えばMVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、加えて、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある。
本発明の好ましい実施形態において、核酸構築物は、5'末端から3'末端に、以下のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド:
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)上記で定義された第1の異種ポリヌクレオチド;
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むcDNA構築物であり、
ポリヌクレオチドは、核酸構築物内に作動可能に連結されており、ウイルス複製及び転写調節エレメント、例えばMVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある。本発明の核酸構築物のより好ましい実施形態において、(i)第1の異種ポリヌクレオチドは、麻疹ウイルス最適化ヌクレオチド配列、特に配列番号36、配列番号63、配列番号64及び配列番号66からなる群から選択される配列を含み、ATU2内に置かれているか、又は(ii)第1の異種ポリヌクレオチドは、コドン最適化ヌクレオチド配列、特に配列番号2、配列番号4、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59及び配列番号61からなる群から選択される配列を含み、ATU3内に置かれている。
本発明の核酸構築物のより好ましい実施形態において、(i)第1の異種ポリヌクレオチドは、ATU3内に置かれており、第2の異種ポリヌクレオチド、特にNポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドは、ATU2内に置かれているか、又は(ii)第1の異種ポリヌクレオチドは、ATU2内に置かれており、第2の異種ポリヌクレオチド、特にNポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドは、ATU3内に置かれている。
別の実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチドは、第2の異種ポリヌクレオチドで置き換えられている。
本発明の別の態様において、核酸構築物は、1つのみの異種ポリヌクレオチド、例えばいわゆる本明細書で定義されるATU2又はATU3内に置かれている第2の異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、この第2の異種ポリヌクレオチドは、Nポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、このNポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドは、配列番号20、21又は37の配列、好ましくは配列番号21又は配列番号37の配列を有する。この核酸構築物は、別の異種ポリヌクレオチド、例えばいわゆる本明細書で定義される第1の異種ポリヌクレオチドを更に含んでいてもよい。全ての本明細書で開示される定義及び実施形態は、この本発明の他の態様に適用され、全ての段落は、一緒に合わせることができる。
本発明の好ましい実施形態において、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、Sポリペプチド、S1ポリペプチド又はS2ポリペプチド、その免疫原性断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、野生型遺伝子のオープンリーディングフレームを含むか又はそれらからなり、又は哺乳類細胞及び/又はショウジョウバエ細胞における発現のためのコドン最適化オープンリーディングフレーム(coORF)を有し、特に、異種ポリヌクレオチドは、以下の配列:
- Sポリペプチドをコードする配列番号1又は2又は36、好ましくは配列番号2又は、
- S1ポリペプチドをコードする配列番号10又は、
- S2ポリペプチドをコードする配列番号12又は、
- stab-Sポリペプチド(S2Pポリペプチドとも称される)をコードする配列番号4又は、
- Sectoポリペプチドをコードする配列番号6又は、
- stab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号8又は、
- stab-S2ポリペプチドをコードする配列番号14又は、
- トリSectoポリペプチドをコードする配列番号16又は、
- tristab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号18
のうちの1つを含み、好ましくは、異種ポリヌクレオチドは、配列番号2又は配列番号4の配列を含む。
本発明のより一層好ましい実施形態において、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SF-2P-dERポリペプチド又はSF-2P-2aポリペプチド、その免疫原性断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞及び/又はショウジョウバエ細胞における発現のためのコドン最適化オープンリーディングフレーム(coORF)のオープンリーディングフレームを有し、特に、異種ポリヌクレオチドは、以下の配列:
i.SF-2P-dERポリペプチドをコードする配列番号75又は、
ii.SF-2P-2aポリペプチドをコードする配列番号81
のうちの1つを含み、
好ましくは、異種ポリヌクレオチドは、SF-2P-dERポリペプチドをコードする配列番号75の配列を含む。
本発明の特定の実施形態において、核酸構築物は、5'末端から3'末端に、以下のORFをコードするためのポリヌクレオチド:
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のSポリペプチド、その免疫原性断片をコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に、特にATU2又はATU3、好ましくはATU2に挿入された追加の転写単位(ATU)内に置かれている、第1の異種ポリヌクレオチド;
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むcDNA構築物であり、
ポリヌクレオチドは、核酸構築物内に作動可能に連結されており、ウイルス複製及び転写調節エレメント、例えばMVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、加えて、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある。
本発明の好ましい実施形態において、核酸構築物は、5'末端から3'末端に、以下のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド:
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)SARS-CoV-2の、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、本発明による第1の異種ポリヌクレオチド、特にSF-2P-dER又はSF-2P-2aポリペプチド、その免疫原性断片をコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、ATU2又はATU3内に、好ましくはATU2内に置かれている、第1の異種ポリヌクレオチド;
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むcDNA構築物であり、
ポリヌクレオチドは、核酸構築物内に作動可能に連結されており、ウイルス複製及び転写調節エレメント、例えばMVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、加えて、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある。
別の実施形態において、第1の核酸構築物は、第2の核酸構築物で置き換えられている。
表現「Nタンパク質」、「Pタンパク質」、「Mタンパク質」、「Fタンパク質」、「Hタンパク質」及び「Lタンパク質」はそれぞれ、MVの、核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、マトリックスタンパク質(M)、融合タンパク質(F)、ヘマグルチニンタンパク質(H)及びRNAポリメラーゼ高分子量タンパク質(L)を指す。Fields, Virology (Knipe & Howley、2001)。
本発明の構築物において、MV配列に関して、本明細書で開示されるポリヌクレオチド配列は、組換えゲノムのレプリコン中に留まると予想される付加されたポリヌクレオチド配列と共に、MVゲノムが、効率的なレスキューを可能にするために正確に実行するための逆遺伝学のために長さにおいて正確な6の倍数のヌクレオチド数である要件を特色とする「6の法則」に準拠する。
本発明の特定の実施形態において、MVアンチゲノムをコードするcDNAの第1のヌクレオチドと、MVアンチゲノムをコードするcDNAの最後のヌクレオチドとの間の組換えMV-CoV核酸分子の配列は、6ヌクレオチドの倍数である。
したがって「6の法則」はまた、この本発明に従って調製された、コロナウイルス抗原をコードする配列を含む構築物にも適用される。
「6の法則」は、MV(+)鎖RNAゲノムを表す核酸又はそれを含む核酸構築物に存在するヌクレオチドの総数が6の倍数であるという事実で示される。「6の法則」は、当業界において、MVゲノムRNAの効率的な又は最適化された複製を可能にするMVのゲノムにおけるヌクレオチド総数に関する要件として認められている。6の法則を満たす核酸構築物を定義する本発明の実施形態において、この法則は、個々に又は集合的に解釈して、全長MV(+)鎖RNAゲノム及び全ての挿入された配列をコードするcDNAを特定する核酸構築物に適用される。
特に、本発明の核酸構築物が、少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドと組み換えられている場合、MVの全長の感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子と共に6の倍数であるヌクレオチド数からなる場合、その核酸構築物は、MVゲノムの6の法則に準拠する。特定の実施形態において、6の法則は、MVの全長の感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNAに適用され、更に、cDNAにクローニングされ、少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、CoVの、特にSARS-CoV-2の、スパイク(S)ポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドに適用される。代替として、6の法則との準拠は、組換え麻疹ウイルスのレスキューのために使用される細胞における構築物全体又は構築物から得られた転写物を考慮して決定することができる。
MVのゲノムの構成並びにその複製及び転写方法は、先行技術で詳細に確認されており、特に、ウイルスのSchwarzワクチン接種株に関して、Horikami S.M.及びMoyer S.A. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1995) 191、35～50)又はCombredet C.ら(Journal of Virology、Nov 2003、p11546～11554)で開示され、又は広く考慮されるマイナスセンスRNAウイルスに関して、Neumann G.ら(Journal of General Virology (2002) 83、2635～2662)で開示されている。
本発明の好ましい実施形態において、麻疹ウイルスは、弱毒化ウイルス株である。
麻疹ウイルスの「弱毒化株」は、宿主に投与されたときに免疫原性及び場合によってはアジュバント活性を維持しながら、すなわち、免疫優性T及びB細胞エピトープ及び場合によってはT細胞共刺激タンパク質又はサイトカインIL-12の誘導等のアジュバント活性を保存しながら、非病原性であるか又は同じ宿主中で親株より低い毒性の株と定義される。
したがってMVの弱毒化株は、選択された細胞で連続的に継代され、場合によっては、他の細胞に適合させて、病原性への逆突然変異も宿主染色体への組込みも許容しないと予想される安定なゲノムを内包するワクチン株調製に好適なシード株を生産する株を指す。特定の「弱毒化株」として、ワクチンに承認された株は、実験室及び臨床データの徹底的な検討の後に、それがFDA(米国食品医薬品局)によって規定される基準を満たす場合、すなわちそれが安全性、効能、品質及び再現性の基準を満たす場合、本発明に好適な弱毒化株である(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)。
本発明を実行するために、特に核酸構築物のMV cDNAを得るために使用できる特定の弱毒化株は、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株及びMoraten株であり、より好ましくはSchwarz株である。全てのこれらの株は、先行技術において記載されており、それらの入手は、特に商業的なワクチンとして提供される。本発明の特定の実施形態において、MV-CoV分子の組換えDNA又はcDNAは、異種発現制御配列の制御下に配置される。このようなDNA/cDNAの発現のための制御の挿入は、このDNA/cDNAの発現が、その天然の制御配列を用いてDNA/cDNAの完全な転写が可能ではない細胞型において求められる場合、好都合である。
本発明の特定の実施形態において、異種発現制御配列は、T7プロモーター及びT7ターミネーター配列を含む。これらの配列はそれぞれ、MVの全長のアンチゲノム(+)RNA鎖のためのコード配列の5'及び3'に配置され、このコード配列周辺の隣接する配列を形成する。したがって、特定の実施形態において、本発明の核酸構築物は、これらの追加の制御配列を含む。
本発明の特定の実施形態において、異種ポリヌクレオチドと組み換えられた麻疹ウイルスのアンチゲノムRNAをコードする組換え核酸分子又は核酸構築物は、本明細書において定義されており、これらは更に改変され、すなわち追加のヌクレオチド配列又はモチーフを含む。
好ましい実施形態において、本発明による異種ポリヌクレオチドと組み換えられた麻疹ウイルスのアンチゲノムRNAをコードする核酸構築物又は組換え核酸分子は、(a)弱毒化MVワクチン株の、特にSchwarz株又はMoraten株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに隣接して、核酸構築物の5'末端に、GGGモチーフ、続いてハンマーヘッド型リボザイム配列を更に含み、(b)全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接して、組換えMV-CoV核酸分子の3'末端に、リボザイムのヌクレオチド配列、特にデルタ型肝炎ウイルスリボザイム(δ)の配列も含む。したがって有利には、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム(δ)は、全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接して、3'末端に提供される。
上記のコード配列の第1のヌクレオチドに隣接して5'末端に設置されたGGGモチーフは、cDNAコード配列の転写効率を改善する。麻疹ウイルス粒子の適したアセンブリは、GGGモチーフが付加される場合、リボザイムがcDNAのコード配列の5'末端、GGGモチーフから3'にも付加され、それによってMVの全長のアンチゲノム(+)RNA鎖の第1のコード化ヌクレオチドでの転写物の切断を可能にするように、本発明の核酸構築物のアンチゲノム(+)RNAをコードするcDNAが6の法則に準拠することを必要とする。
本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸構築物を調製するために、先行技術で開示されたMVの全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNA分子の調製は、公知の方法によって達成される。cDNAは特に、それがプラスミド等のベクターに挿入される場合、ゲノムベクターを提供する。
本発明の核酸構築物の調製に好適な特定のcDNA分子は、MVのSchwarz株を使用して得られたものである。したがって、本発明の範囲内で使用される麻疹ウイルスのアンチゲノムをコードするcDNAは、WO2004/000876で開示された通りに得てもよいし、又はCollection Nationale de Culture de Microorganismes(CNCM)、28 rue du Dr Roux、75724 Paris Cedex 15、Franceのパスツール研究所によって、2002年6月12日にI-2889号で寄託されたプラスミドpTM-MVSchwから得てもよく、その配列は、参照により本明細書に組み入れられるWO2004/000876に開示される。プラスミドpTM-MVSchwは、Bluescriptプラスミドから得られたものであり、これは、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの制御下に置かれたSchwarz株の全長麻疹ウイルス(+)RNA鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。プラスミドpTM-MVSchwは、18967ヌクレオチド及び配列番号28の配列を有する。他のMV株からのcDNA分子(麻疹ウイルスのcDNA又は便宜上MV cDNAとも称される)も同様に、本明細書に記載されるもの等の弱毒化MVのウイルス粒子から精製された核酸から開始して得ることができる。
本発明の範囲内で使用される麻疹ウイルスのアンチゲノムをコードするcDNAはまた、Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM)、28 rue du Dr Roux、75724 Paris Cedex 15、Franceのパスツール研究所によって、2002年6月12日に番号I-2890で寄託されたプラスミドpTM2-MVSchw-gfpからも得ることができる。これは、19795ヌクレオチド及び配列番号29として表される配列を有する。このプラスミドは、欠失している可能性があるeGFPマーカーをコードする配列を含有する。
上記で述べたpTM-MVSchwプラスミドはまた、ATU1又はATU2又はATU3、好ましくはATU3の挿入のための公知の位置に挿入された1つ又は複数のATUを使用して、麻疹ウイルスのアンチゲノムをコードするcDNAに、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2株の抗原由来のポリペプチド(特に本明細書で開示されるS抗原由来のポリペプチド)をコードする異種ポリヌクレオチドをクローニングすることによって本発明の核酸構築物の調製のために使用されることもある。
特定の実施形態において、本発明の核酸構築物は、配列番号34又は配列番号35の配列において1位～20152位に配置された組換えMV-CoV核酸分子を含むか又はそれらからなる。この構築物は、それぞれ麻疹ウイルスアンチゲノムをコードするcDNAに挿入されたATU2又はATU3のいずれかに配置されたSARS-CoV-2のSポリペプチドをコードする。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されるS抗原の断片の配列等の、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に、stab-S(S2Pとも称される)、Secto、stab-Secto、S1、S2、stab-S2、トリSecto、tristab-Secto、S3F、S2P3F、S2PΔF、S2PΔF2Aポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列、特に、それぞれ配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46若しくは48、好ましくは配列番号4、42、44、46若しくは48、より好ましくは配列番号44、46若しくは48、より一層好ましくは配列番号46若しくは配列番号48、より一層好ましくは配列番号48として開示された配列のポリヌクレオチド、又は配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、43、45、47若しくは49、それぞれ、好ましくは配列番号5、43、45、47若しくは49、より好ましくは配列番号45、47若しくは49、より一層好ましくは配列番号47若しくは配列番号49、より一層好ましくは配列番号49のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによって、Sタンパク質をコードする配列を置き換えることによって上記から得られた核酸構築物に関する。このような実施形態において、配列番号34の配列中の置き換えられるポリヌクレオチド領域は、3538位～7362位であり、配列番号35の配列中の置き換えられるポリヌクレオチド領域は、9340位～13164位である。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されるS抗原の断片の配列等の、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に、stab-S(S2Pとも称される)、Secto、stab-Secto、S1、S2、stab-S2、トリSecto、tristab-Secto、SF-2P-dER若しくはSF-2P-2aポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列、特に、それぞれ配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、75若しくは81、好ましくは配列番号4、75若しくは81、より好ましくは配列番号75若しくは81、より一層好ましくは配列番号75として開示された配列のポリヌクレオチド、又はそれぞれ配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、76若しくは82のアミノ酸配列、好ましくは配列番号5、76若しくは82、より好ましくは配列番号76若しくは82、より一層好ましくは配列番号76をコードするポリヌクレオチドによって、Sタンパク質をコードする配列を置き換えることによって上記から得られた核酸構築物に関する。このような実施形態において、配列番号34の配列中の置き換えられるポリヌクレオチド領域は、3538位～7362位であり、配列番号35の配列中の置き換えられるポリヌクレオチド領域は、9340位～13164位である。
別の実施形態において、本発明は、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、Genbank MN908947.3において開示された配列を使用して得ることができる、又は本明細書で開示されるヌクレオチド配列を有していてもよい、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のN、E、M、ORF3a、ORF7a、ORF8ポリペプチド、又はその抗原性若しくは免疫原性断片をコードする配列によって、Sタンパク質をコードする配列を置き換えることによって上記から得られた核酸構築物に関する。
本発明の好ましい実施形態において、核酸構築物は、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のNポリペプチド、又はその免疫原性断片をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含む組換えMV-CoV核酸分子を含むか又はそれらからなり、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドをクローニングするのに使用されるATUと異なる位置のATU中にクローニングされる。
特定の実施形態において、このような核酸構築物は、発現ベクター又はトランスファーベクターに、例えばプラスミドに挿入され、特にクローニングされる。好適なプラスミドの例は、Combredetら(2003)又はWO04/00876から公知のpTMプラスミドであるか、又は本明細書で開示されるpKMプラスミドである。
本明細書に記載されるいずれの核酸構築物も好適であり、複製能のある組換え感染性麻疹ウイルス-コロナウイルス(MV-CoV)の調製が意図され、したがって核酸構築物は、(i)MV-CoVの生産のための結果として麻疹ウイルスの、特にSchwarz株のcDNA分子を含むトランスファーゲノムベクターへの挿入のために、及び1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチド、又はその免疫原性断片、特に、スパイク(S)ポリペプチド又は本明細書で開示されるその免疫原性断片の産出のために使用されるか、又は(ii)このようなトランスファーベクター、特にプラスミドベクターである。
核酸構築物はまた、ウイルス様粒子(VLP)、特にCoV VLPの生産のために使用されることもある。
一例として、pTM-MVSchwプラスミド又はpTM2-MVSchwプラスミドは、少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又は別の抗原、例えばN、M、E、ORF7a、ORF3a若しくはORF8、又はその免疫原性断片の発現に必要なCoVポリヌクレオチドの挿入によってトランスファーベクターを調製するのに好適である。代替として、このようなトランスファーベクターは、pKP-MVSchw-ATU1(eGFP)、pKP-MVSchw-ATU2(eGFP)、pKP-MVSchw-ATU3(eGFP)等の実施例において詳細に説明されるpKMベクターであってもよく、eGFPのヌクレオチド配列は、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチド、又は別の抗原、例えばN、M、E、ORF7a、ORF3a若しくはORF8、又はその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドで置き換えられている。本明細書に開示される配列は、当業者が、プラスミドに含有される挿入物の位置へのアクセスを設計することを可能にし、特に実施例における開示を使用して挿入物置換をなすことを可能にする。
CNCMにおけるそれらの寄託への参照により本明細書において引用される全てのプラスミドは、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris Cedex 15(France)に寄託されている。
核酸構築物の特定の態様によれば、本発明は、本発明による核酸構築物を含む、組換え麻疹ウイルス(MV)のレスキューに好適な、トランスファーベクター、特にプラスミドベクター、特に、配列番号28のプラスミド(pTM-MVSchwarz)、配列番号29のプラスミド(pTM2-MVSchw-gfp、これは、pTM-MVSchw2-GFPbis又はpTM-MVSchwarz-ATU2-CNCM I-3034とも称され、2003年5月26日に寄託され、GFPbisコード配列が挿入されている)、配列番号38のプラスミド(pTM3-MVSchw-gfp、これは、pTM-MVSchw3-GFP又はpTM-MVSchwarz-ATU3-CNCM I-3037とも称され、2003年5月26日に寄託され、GFPコード配列が挿入されている)、配列番号30のプラスミド(pKP-MVSchwarz)、配列番号31のプラスミド(pKP-MVSchwarz-ATU1)、配列番号32のプラスミド(pKP-MVSchwarz-ATU2)及び配列番号33のプラスミド(pKP-MVSchwarz-ATU3)からなる群から選択されるトランスファーベクターに関し、トランスファーベクターは、(i)アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加の転写単位(ATU)内に置かれている、少なくとも、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のスパイクポリペプチド、若しくはその免疫原性断片をコードする第1の異種DNAポリヌクレオチド、又は(ii)コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の別のポリペプチド、例えばコロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のN、E、M、ORF3a、ORF7a、ORF8ポリペプチドの配列、例えばGenbank MN908947.3で開示された配列由来の、若しくは本明細書で開示される配列に対応する配列をコードする第2の異種ポリヌクレオチドと組み換えられている。
核酸構築物の好ましい態様によれば、本発明は、本発明による核酸構築物を含む、組換え麻疹ウイルス(MV)のレスキューに好適な、トランスファーベクター、特にプラスミドベクター、特に、配列番号32のプラスミド(pKP-MVSchwarz-ATU2)及び配列番号33のプラスミド(pKP-MVSchwarz-ATU3)からなる群から選択されるトランスファーベクターに関し、トランスファーベクターは、ATU2又はATU3内に置かれている、請求項1、2、4及び6のいずれか一項で定義されたSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする第1の異種DNAポリヌクレオチドと組み換えられている。
特定の実施形態において、トランスファーベクターは、プラスミド、特に組換えDNA MV-CoV配列と組み換えられた上記のプラスミドの1つであり、SARS-CoV-2のポリペプチドをコードする配列は、
- 配列番号1又は2又は36(構築物S);
- 配列番号4(構築物stab-S、構築物S2Pとも称される);
- 配列番号6(構築物Secto);
- 配列番号8(構築物stab-Secto);
- 配列番号10(構築物S1)、
- 配列番号12(構築物S2)、
- 配列番号14(構築物stab-S2)、
- 配列番号16(構築物トリSecto)、
- 配列番号18(構築物tristab-Secto)、
- 配列番号42(構築物S3F)、
- 配列番号44(構築物S2P3F)、
- 配列番号46(構築物S2PΔF)、
- 配列番号48(構築物S2PΔF2A)、
- 配列番号21又は37(構築物N)、
- 配列番号51(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
- 配列番号53(構築物S6P)、
- 配列番号55(構築物S6P3F)、
- 配列番号57(構築物S6PΔF)、
- 配列番号59(構築物SCCPP)、
- 配列番号61(構築物SCC6P)、
- 配列番号63(構築物SMVopt2P)、
- 配列番号64(構築物SMVoptΔF)、及び
- 配列番号66(構築物SMVopt2PΔF)
からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、トランスファーベクターは、プラスミド、特に組換えDNA MV-CoV配列と組み換えられた上記のプラスミドの1つであり、SARS-CoV-2のポリペプチドをコードする配列は、
- 配列番号2(構築物S);
- 配列番号4(構築物stab-S、構築物S2Pとも称される);
- 配列番号42(構築物S3F)、
- 配列番号44(構築物S2P3F)、
- 配列番号46(構築物S2PΔF)、及び
- 配列番号48(構築物S2PΔF2A)
からなる群から選択される。
より好ましい実施形態において、トランスファーベクターは、プラスミド、特に組換えDNA MV-CoV配列と組み換えられた上記のプラスミドの1つであり、SARS-CoV-2のポリペプチドをコードする配列は、配列番号48の(構築物S2PΔF2A)である。eGFPをコードする配列がプラスミドの中に存在する場合、それは、有利には、ATUに挿入される上記で定義された群において選択される配列によって置換されている。
特定の実施形態において、トランスファーベクターは、
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5493で寄託されたpKP-MVSchwarz(又はpKM-Schwarz)、
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5494で寄託されたpKM-ATU2(eGFP)、
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5495で寄託されたpKM-ATU3(eGFP)
から選択されるプラスミドから誘導され、特にeGFPコード配列を置き換えるためにATUに挿入された、好ましくはATU3に挿入された、特に、配列番号1、2若しくは36の配列、好ましくは配列番号2の配列、又は配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48の、21若しくは37の配列、特に配列番号4、42、44、46、48の配列、好ましくは配列番号44、46若しくは48の配列、好ましくは配列番号46若しくは配列番号48の配列、より一層好ましくは配列番号48の配列を有するポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドを含むこれらのプラスミドのうちの1つである。
又は、以下:
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5496で寄託されたpKM-ATU2-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5497で寄託されたpKM-ATU3-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、
- 2020年7月1日に番号CNCM I-5532で寄託されたpKM-ATU3-S2PΔF_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、
- 2020年7月1日に番号CNCM I-5533で寄託されたpKM-ATU3-S2PΔF2A_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、
- 2020年7月1日に番号CNCM I-5534で寄託されたpKM-ATU3-S2P3F_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、
- 2020年7月1日に番号CNCM I-5535で寄託されたpKM-ATU3-S3F_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、及び
- 2020年7月7日に番号CNCM I-5536で寄託されたpKM-ATU3-stab-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)(pKM-ATU3-S2P_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)とも称される)
からなる群から選択されるプラスミドのうちの1つであり、
好ましくは、pKM-ATU3-S2P3F_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、pKM-ATU3-S2PΔF_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)及びpKM-ATU3-S2PΔF2A_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)からなる群から選択されるプラスミドであり、より好ましくは、2020年7月1日に番号CNCM I-5533で寄託されたプラスミドpKM-ATU3-S2PΔF2A_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)である。
核酸構築物の好ましい態様によれば、本発明は、本発明による核酸構築物を含む、組換え麻疹ウイルス(MV)のレスキューに好適な、トランスファーベクター、特にプラスミドベクター、特に、配列番号29のプラスミド(pTM2-MVSchw-gfp、これは、pTM-MVSchw2-GFPbis又はpTM-MVSchwarz-ATU2とも称される)又は配列番号38のプラスミド(pTM3-MVSchw-gfp、これは、pTM-MVSchw3-GFP又はpTM-MVSchwarz-ATU3とも称される)からなるトランスファーベクターに関し、トランスファーベクターは、SARS-CoV-2のSF-2P-dERポリペプチド又はSF-2P-2aポリペプチドをコードする第1の異種DNAポリヌクレオチドと組み換えられているか、又はATU2又はATU3内に、好ましくはATU2内に置かれた1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有するその免疫原性断片からなる。
特定の実施形態において、トランスファーベクターは、プラスミド、特に組換えDNA MV-CoV配列と組み換えられた上記のプラスミドの1つであり、SARS-CoV-2のポリペプチドをコードする配列は、
- 配列番号1又は2又は36(構築物S);
- 配列番号4(構築物stab-S、これは、構築物S2Pとも称される);
- 配列番号6(構築物Secto);
- 配列番号8(構築物stab-Secto);
- 配列番号10(構築物S1)、
- 配列番号12(構築物S2)、
- 配列番号14(構築物stab-S2)、
- 配列番号16(構築物トリSecto)、
- 配列番号18(構築物tristab-Secto)、及び
- 配列番号21又は37(構築物N)
からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、トランスファーベクターは、プラスミド、特に組換えDNA MV-CoV配列と組み換えられた上記のプラスミドの1つであり、SARS-CoV-2のポリペプチドをコードする配列は、
- 配列番号2(構築物S);及び
- 配列番号4(構築物stab-S、これは、構築物S2Pとも称される)
からなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、トランスファーベクターは、MV-CoVの組換えDNAと組み換えられたプラスミドであり、SARS-CoV-2のSF-2P-dERポリペプチドをコードする配列は、配列番号75であり、SARS-CoV-2のSF-2P-2aポリペプチドをコードする配列は、配列番号81であり、好ましくはSARS-CoV-2のSF-2P-dERポリペプチドをコードする配列は、配列番号75である。eGFPをコードする配列がプラスミドの中に存在する場合、それは、有利には、ATUに挿入される上記で定義された群において選択される配列によって置換されている。
特定の実施形態において、トランスファーベクターは、
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5493で寄託されたpKP-MVSchwarz(又はpKM-Schwarz)、
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5494で寄託されたpKM-ATU2(eGFP)、
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5495で寄託されたpKM-ATU3(eGFP)
から選択されるプラスミドから誘導され、特にeGFPコード配列を置き換えるためにATUに挿入された、好ましくはATU3に挿入された、特に、配列番号1、2又は36の配列、好ましくは配列番号2の配列、又は配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、21若しくは37の配列、特に配列番号4の配列を有するポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドを含むこれらのプラスミドのうちの1つである。
又は、以下からなる群から選択されるプラスミドのうちの1つである:
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5496で寄託されたpKM-ATU2-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)
- 2020年2月12日に番号CNCM I-5497で寄託されたpKM-ATU3-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)、及び
- 2020年7月7日に番号CNCM I-5536で寄託されたpKM-ATU3-stab-S_2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)(pKM-ATU3-S2P_2019-nCoVとも称される(すなわちSARS-CoV-2))。
他の特定の実施形態において、トランスファーベクターは、配列番号144のpTM2-SF-dER_SARS-CoV-2、配列番号145のpTM2-S2-dER_SARS-CoV-2、配列番号146のpTM2-SF-2P-dER_SARS-CoV-2、配列番号147のpTM2-S2-2P-dER_SARS-CoV-2及び配列番号148のpTM2-SF-2P-2a_SARS-CoV-2からなる群から選択されるプラスミドのうちの1つであり、好ましくは、配列番号146のpTM2-SF-2P-dER_SARS-CoV-2又は配列番号148のpTM2-SF-2P-2a_SARS-CoV-2であり、より一層好ましくは、配列番号146のpTM2-SF-2P-dER_SARS-CoV-2である。
本発明はまた、ウイルスMV-CoV粒子のレスキューに好適な細胞を形質転換するための、特にこのような細胞にそれぞれ本発明の核酸構築物を内包するプラスミド又はウイルスベクターをトランスフェクト又は形質導入するための前記トランスファーベクターの使用にも関し、細胞は、複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子における本発明の核酸構築物に対応するウイルスの組換えゲノムの適切な複製、転写及びカプシド化に必要なMVタンパク質を発現するそれらの能力に関して選択される。
好ましい実施形態において、本発明は、本発明による核酸構築物又は本発明によるトランスファープラスミドベクターをトランスフェクトした、又は本発明による組換え麻疹ウイルスで感染させた、ヘルパー細胞、増幅細胞又は生産細胞である宿主細胞、特に、哺乳類細胞、VERO NK細胞、CEF細胞、ヒト胎児腎臓細胞株293又はそれらに由来する株(2006年6月14日に寄託された番号I-3618でCNCM(Paris France)に寄託された、293T又は293T-T7細胞)又はMRC5細胞に関する。
したがって、特に、少なくともN及びPタンパク質に関して安定して発現されたタンパク質として、又は組換えウイルスMV-CoV粒子の転写及び複製において機能的な一時的に発現されたタンパク質として、MVのN、P及びLタンパク質(すなわち、天然のMVタンパク質、又はレプリコンとしてリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成することが可能な機能的なそれらのバリアント)を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞中に存在する。N及びPタンパク質は、細胞中で、それらのコード配列を含むプラスミドから発現させてもよいし、又は細胞のゲノムに挿入されたDNA分子から発現させてもよい。Lタンパク質は、異なるプラスミド発現させてもよい。Lタンパク質は、一時的に発現させてもよい。ヘルパー細胞は、本発明の核酸構築物由来の組換えRNAの合成を可能にするのに好適なRNAポリメラーゼを発現すること、場合によっては安定して発現されたRNAポリメラーゼとして発現することも可能である。RNAポリメラーゼは、T7ファージポリメラーゼ又はその核の形態(nlsT7)であってもよい。
本発明の実施形態において、MVのcDNAクローンは、Nタンパク質及び/又はPタンパク質及び/又はLタンパク質と同じMV株に由来する。本発明の別の実施形態において、MVのcDNAクローンは、Nタンパク質及び/又はPタンパク質及び/又はLタンパク質と異なるウイルスの株に由来する。
本発明はまた、組換え感染性麻疹ウイルス(MV)粒子の調製のための方法であって、
1)本発明の核酸構築物又はこのような核酸構築物を含有するトランスファーベクターを、ウイルス粒子アセンブリを可能にする条件下で、そのcDNAからMVのアンチゲノム(+)RNA配列の転写、複製及びカプシド化に必要なタンパク質も発現するヘルパー細胞株に移行させる工程、特にトランスフェクトする工程;及び
2)1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチドからなる、又はその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチドを発現する組換え感染性MV-CoV粒子を回収する工程
を含む方法にも関する。
本発明の特定の実施形態において、この方法は、
1)ヘルパー細胞に、本発明による核酸構築物及びトランスファーベクターをトランスフェクトする工程であって、ヘルパー細胞は、RNAポリメラーゼを発現する、並びにMVウイルスのN、P及びLタンパク質を発現するヘルパー機能を現すことが可能である、工程;
2)工程1)のトランスフェクトされたヘルパー細胞を、cDNAの起源となるMV弱毒化株の継代に好適な継代された細胞と共培養する工程;
3)1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチドからなる、又はその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチドを発現する組換え感染性MV-CoV粒子を回収する工程
を含む。
本発明の他の特定の実施形態において、組換え感染性MV-CoV粒子の生産のための方法は、
1)RNAポリメラーゼ、MVのNタンパク質及びMVのPタンパク質を安定して生産する細胞又は細胞の培養物を、本発明の核酸構築物及びMVのLタンパク質をコードする核酸を含むベクターと組み換える工程、及び
2)組換え細胞又は組換え細胞の培養物から、組換え感染性MV-CoV粒子を回収する工程
を含む。
本方法の特定の実施形態において、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチドからなる、又はその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチド、特に同じCoVタンパク質を発現するCoV VLPを発現する組換えMVが生産される。
したがって本発明は、レスキューヘルパー細胞から、又は生産細胞において回収できる複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子に関する。任意選択で、加えて、本発明により開示されたCoV抗原を発現するVLPを回収してもよい。
特定の実施形態において、本明細書で開示される様々な実施形態により、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチドからなる、又はその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチドを発現する組換えMVが生産される。
特定の実施形態において、組換えMV粒子は、本明細書で開示される様々な実施形態により、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のN、E、M、ORF7a、ORF3a、ORF8ポリペプチドからなる、又はその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチドを発現する。
特定の実施形態において、組換えMV粒子は、本明細書で開示される様々な実施形態により、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチドからなる、又はその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチドを発現し、加えて、本明細書で開示される様々な実施形態により、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のN、E、M、ORF7a、ORF3a、ORF8ポリペプチドからなる、又はその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチドを発現する。
本発明の特定の実施形態において、粒子は、本明細書で開示される全ての実施形態によるSchwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、CAM-70株、TD97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株、特にSchwarz株である麻疹ウイルスから得られる。
特定の実施形態において、組換え麻疹ウイルス、特にSchwarz株の組換え麻疹ウイルスは、そのゲノム中に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のスパイクポリペプチド、若しくはその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチド、又はコロナウイルス(CoV)の、特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SARS-CoV-2のN、E、M、ORF7a、ORF3a、ORF8ポリペプチドからなる、若しくはその免疫原性断片からなる1つのポリペプチドをコードする核酸構築物を含み、特に、そのゲノム中に、本発明のヌクレオチド構築物、特に上記で定義された本発明のトランスファーベクターのレプリコンである核酸構築物の転写物を含み、核酸構築物は、発現カセットにおいてゲノムと作動可能に連結されている。好ましい実施形態において、組換え麻疹ウイルス、特にSchwarz株の組換え麻疹ウイルスは、そのゲノム中に、本発明による核酸構築物、特に、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SF-2P-dERポリペプチド若しくはSARS-CoV-2のSF-2P-2aポリペプチド、又はその免疫原性断片、特に、配列番号75の又は配列番号81、好ましくは配列番号75のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドをコードする核酸構築物、特に、本発明のトランスファーベクターのレプリコンである核酸構築物を含み、核酸構築物は、発現カセットにおいてゲノムと作動可能に連結されている。より好ましい実施形態において、組換え麻疹ウイルス、特にSchwarz株の組換え麻疹ウイルスは、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SARS-CoV-2株のSF-2P-dERポリペプチド若しくはSF-2P-2aポリペプチド、又はその免疫原性断片を発現し、任意選択で、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SARS-CoV-2株のNポリペプチド、Mポリペプチド、Eポリペプチド、ORF7a、ORF8若しくはORF3aポリペプチド、又はその免疫原性断片の少なくとも1つを更に発現する。
より好ましい実施形態において、組換え麻疹ウイルスは、SARS-CoV-2株のNポリペプチド、Mポリペプチド、Eポリペプチド、ORF7a、ORF8又はORF3aポリペプチドの少なくとも1つを更に発現し、特に、配列番号22のNポリペプチド、その免疫原性断片若しくはその抗原性断片、又は1、2又は10未満のアミノ酸残基、特に5未満のアミノ酸残基の置換によるNポリペプチドの突然変異した抗原、及び/又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SARS-CoV-2の、配列番号24のMポリペプチド又はそのエンドドメイン、配列番号23のEポリペプチド、配列番号25のORF8ポリペプチド、配列番号27のORF7aポリペプチド、及び/又は配列番号26のORF3aポリペプチド、若しくはその免疫原性断片を更に発現する。
特定の実施形態において、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、36、37、42、44、46及び48からなる群から選択される。
特定の実施形態において、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、36及び37からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号75のポリヌクレオチド(構築物SF-2P-dER)又は配列番号81のポリヌクレオチド(構築物SF-2P-2a)、好ましくは配列番号75のポリヌクレオチド(構築物SF-2P-dER)を含む。
好ましい実施形態において、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号2、4、42、44、46及び48からなる群から選択され、好ましくは、配列番号2、4、42からなる群から選択されるか、又は配列番号44、46及び48からなる群から選択され、より一層好ましくは、配列番号44、46及び48からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号2の又は配列番号4のヌクレオチド配列である。
更により好ましい実施形態において、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号46又は配列番号48のヌクレオチド配列であり、好ましくは、配列番号48のヌクレオチド配列である。
本発明はまた、
(i)本明細書に記載される様々な実施形態による、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のN、E、M、ORF7a、ORF3a、ORF8ポリペプチドの少なくとも1つ、若しくはその免疫原性断片、又は
(ii)本明細書に記載される様々な実施形態による、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2のスパイク(S)ポリペプチドからなるポリペプチド、若しくはその免疫原性断片からなる少なくとも1つのポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスをレスキューするための方法であって、
(a)T7 RNAポリメラーゼ並びに麻疹ウイルスN及びPタンパク質を安定して発現する細胞、特に、ヘルパー細胞、特にHEK293ヘルパー細胞に、(i)本発明による核酸構築物、又は本発明による少なくとも1つのポリペプチドをコードするトランスファープラスミドベクター、及び(ii)MV Lポリメラーゼをコードするベクター、特にプラスミドをコトランスフェクトする工程、
(b)トランスフェクトされた細胞を、組換え麻疹ウイルスの生産に好適な条件で維持する工程;
(c)組換え麻疹ウイルスの伝播を可能にする細胞を、それらを工程(b)のトランスフェクトされた細胞、特にVERO細胞と共培養することによって感染させる工程;
(d)少なくとも、コロナウイルスの、特にSARS-CoV-2の、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスのポリペプチド又はその免疫原性断片を発現する組換え麻疹ウイルスを回収する工程
を含む方法にも関する。
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で定義されたSARS-CoV-2の第1の異種ポリヌクレオチドによってコードされたSARS-CoV-2のポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスをレスキューするための方法は、
(a)T7 RNAポリメラーゼ並びに麻疹ウイルスN及びPタンパク質を安定して発現する細胞、特に、ヘルパー細胞、特にHEK293ヘルパー細胞に、(i)本発明の核酸構築物、又は本発明のトランスファープラスミドベクター、及び(ii)MV Lポリメラーゼをコードするベクター、特にプラスミドをコトランスフェクトする工程;
(b)トランスフェクトされた細胞を、組換え麻疹ウイルスの生産に好適な条件で維持する工程;
(c)組換え麻疹ウイルスの伝播を可能にする細胞を、それらを工程(b)のトランスフェクトされた細胞、特にVERO細胞と共培養することによって感染させる工程;
(d)上記で定義されたSARS-CoV-2の第1の異種ポリヌクレオチドによってコードされたSARS-CoV-2のポリペプチド、及び任意選択で、SARS-CoV-2の、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、N、M若しくは3Aポリペプチド、又はその免疫原性断片、又はその突然変異した抗原の少なくとも1つを発現する組換え麻疹ウイルスを回収する工程
を含む。
本方法の好ましい実施形態によれば、組換え麻疹ウイルスは、少なくとも、小胞体(ER)におけるポリペプチドの回復を損なわせ、任意選択で、発現されたタンパク質をその融合前の状態に維持する上記で定義された突然変異したポリペプチド、特に、SF-2P-dERポリペプチド、特に配列番号76のSF-2P-dERポリペプチド、又はSF-2P-2aポリペプチド、特に配列番号82のSF-2P-2aポリペプチドを発現する。
本方法の特定の実施形態によれば、トランスファーベクタープラスミドは、配列番号34、配列番号35の配列を有するか、又はCNCMに寄託された、I-5496、I-5497及びI-5536で本明細書で開示されるベクターの1つである。
本方法の特定の実施形態によれば、トランスファーベクタープラスミドは、配列番号34、配列番号35の配列を有するか、又はCNCMに寄託された、I-5496、I-5497、I-5532、I-5533、I-5534、I-5535及びI-5536で本明細書で開示されるベクターの1つである。
前記方法の別の特定の実施形態によれば、トランスファーベクタープラスミドは、配列番号146又は配列番号148の配列、好ましくは配列番号146の配列を有する。
特定の実施形態によれば、組換えは、本発明の核酸構築物である第1のポリヌクレオチドを用いて得ることができる。組換えは、その定義、性質及び発現の安定性が本明細書に記載されているMVのRNAポリメラーゼである高分子量タンパク質(L)をコードするベクターであるポリヌクレオチドを導入することを追加で包含してもよいし、又は代替として包含してもよい。
本発明によれば、RNAポリメラーゼ、麻疹ウイルスの核タンパク質(N)及び麻疹ウイルスのポリメラーゼ補因子であるリンタンパク質(P)を安定して生産する細胞又は細胞株又は細胞の培養物は、本明細書で定義された細胞若しくは細胞株又は本明細書で定義された細胞の培養物であり、すなわち、それらが上記で定義された1つ又は複数のポリヌクレオチドの導入によって改変された程度の組換え細胞でもある。本発明の特定の実施形態において、RNAポリメラーゼ、N及びPタンパク質を安定して生産する細胞又は細胞株又は細胞の培養物は、麻疹ウイルスのLタンパク質を生産しないか、又は麻疹ウイルスのLタンパク質を安定して生産せず、例えばその一時的な発現又は生産を可能にしない。
本発明の複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子の生産は、本明細書に記載される通りに形質転換した細胞の移行を含んでいてもよい。この工程は、本発明の核酸構築物、及び任意選択で麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼ高分子量タンパク質(L)をコードする核酸を含むベクターとの本発明の組換え細胞の更なる組換えの後に導入される。
本発明の特定の実施形態において、通常、容易に組み換えられるそれらの能力に関して選択される組換え細胞は、組換え感染性MV-CoV粒子の維持及び生産における効率が不十分であるため、移行工程が必要である。この実施形態において、上記で定義される方法の工程1)の細胞又は細胞株又は細胞の培養物は、本発明による組換え細胞又は細胞株又は組換え細胞の培養である。
本発明の組換え細胞の調製に好適な細胞は、原核又は真核細胞、特に動物又は植物細胞であり、わけても特に、哺乳類細胞、例えばヒト細胞又は非ヒト哺乳類細胞又は鳥類細胞又は酵母細胞である。特定の実施形態において、細胞は、そのゲノムの組換えの前に、初代培養物又は細胞株のいずれかから単離される。本発明の細胞は、分裂細胞であってもよいし、又は非分裂細胞であってもよい。
好ましい実施形態によれば、ヘルパー細胞は、ヒト胎児腎臓細胞株293から誘導され、細胞株293は、ATCCに番号CRL-1573で寄託されている。特定の細胞株293は、国際出願WO2008/078198に開示された細胞株(すなわち、2006年6月14日に、CNCM(Paris、France)に番号I-3618で寄託されたHEK-293-T7-NP又はHEK-293T-NP MV細胞株)であり、以下の実施例で言及される。
この方法の別の態様によれば、継代に好適な細胞は、CEF細胞である。CEF細胞は、EARL Morizeau、8 rue Moulin、28190 Dangers、Franceから入手した、又は受精させたニワトリの卵の他のあらゆる生産者から入手した受精させたニワトリの卵から調製することができる。
本発明により開示される方法は、有利には、免疫原性組成物に使用できる複製能を有する感染性MV-CoV粒子の生産のために使用される。任意選択で、免疫化組成物における使用に適切なCoV抗原を発現するVLPも発現させることができる。したがって本発明は、動物宿主、特に哺乳類宿主において、特にヒトにおいて、体液性の、特に防御的な、特に中和体液性応答及び/又は細胞応答を惹起することにおける使用のための本発明の組換えMV-CoV粒子に関する。組換えMV-CoV粒子は、特に、コロナウイルス、特にSARS-CoV-2による感染に対する予防的応答を惹起することにおける使用のためである。
したがって本発明は、(i)有効量の本発明による組換え麻疹ウイルス、及び/又は本発明による組換えVLP、並びに(ii)医薬的に許容されるビヒクルを含む、免疫原性組成物、有利にはワクチン組成物であって、組成物又はワクチンは、特に単回の免疫化の後、動物宿主において、特にヒトにおいて、それが発現する、コロナウイルスのポリペプチド、特にSARS-CoV-2のポリペプチド又はその断片に対して、体液性、特に防御的な、特に中和体液性応答及び/又は細胞応答を惹起する、組成物に関する。
本発明の特定の実施形態において、組成物は、それを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に子供における、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、コロナウイルスタンパク質又はその抗原性断片若しくはその突然変異した抗原を認識する抗体の惹起による、及び/又はコロナウイルスに対する細胞性及び/又は体液性及び細胞応答の惹起による、SARS-CoV-2に対する、又はSARS-CoV-2に対する、及び更には別のコロナウイルスに対する防御的な、優先的には予防的な免疫応答の惹起において使用される。好ましくは、組成物は、アジュバントが添加されていない。
本発明はまた、それを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に子供における、CoV、特にSARS-CoV-2による感染の防止若しくは処置又はCoVによる感染の臨床転帰の防止において使用するための、(i)有効量の、本発明による組換え麻疹ウイルス、及び/又は本発明による組換えVLP、並びに(ii)医薬的に許容されるビヒクルを含む免疫原性又はワクチン組成物にも関する。特定の実施形態において、組成物は、子供、若年又は旅行者への投与のためである。
処置の方法
ヒト及び/又は他の哺乳動物におけるコロナウイルス感染、特にSARS-CoV-2ウイルス感染の防止及び/又は処置のための組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。この開示の麻疹ウイルスは、免疫応答を誘導するために、又は例えばワクチン等の治療若しくは予防剤として使用することができる。それらは、感染性疾患を防止及び/又は処置するための薬において使用することができる。例示的な態様において、本発明の開示の組換え麻疹ウイルスワクチンは、コロナウイルス、特にSARS-CoV-2ウイルスからの予防的保護を提供するために使用される。SARS-CoV-2ウイルスからの予防的保護は、本発明の開示の組換え麻疹ウイルス及び/又は免疫原性組成物の投与後に達成することができる。ワクチンは、1回、2回、3回、4回又はそれより多く投与することができる。それほど望ましくはないが、治療応答を達成するために感染した個体にワクチンを投与することも考えられる。投与量は、特定の実施形態に応じて調整することができる。
一部の実施形態において、本発明の開示の組換え麻疹ウイルス及び免疫原性組成物は、対象においてコロナウイルス感染、特にSARS-CoV-2感染を防止する方法として使用することができ、本方法は、少なくとも1種の本明細書で提供される組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物を前記対象に投与する工程を含む。一部の実施形態において、本発明の開示の組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物は、対象においてコロナウイルス感染、特にSARS-CoV-2感染を処置する方法として使用することができ、本方法は、少なくとも1種の本明細書で提供される組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態において、本発明の開示の組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物は、対象においてコロナウイルス感染、特にSARS-CoV-2感染の発生率を低減する方法として使用することができ、本方法は、少なくとも本明細書で提供される組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態において、本発明の開示の組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物は、コロナウイルスに感染した第1の対象からコロナウイルス、特にSARS-CoV-2に感染していない第2の対象への、コロナウイルス、特にSARS-CoV-2の蔓延を阻害する方法として使用することができ、本方法は、少なくとも1種の本明細書で提供される組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物を第1の対象及び前記第2の対象の少なくとも一方に投与することを含む。
本発明の態様において、対象においてコロナウイルス、特にSARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載される組換え麻疹ウイルス又は免疫原性組成物を対象に投与する工程、それによってコロナウイルス抗原性ポリペプチド又はその免疫原性断片、特に全長SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドに特異的な免疫応答を対象において誘導する工程を含む。
一部の実施形態において、全長Sタンパク質の、又は免疫原性断片若しくは抗原性断片の突然変異した抗原は、(a)配列番号52のTA-S2P3Fポリペプチド、若しくは682位、683位、685位、986位及び987位で変更されていない、配列番号52と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(b)配列番号54のS6Pポリペプチド、又は817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、配列番号54と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(c)配列番号56のS6P3Fポリペプチド、又は682位、683位、685位、817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、配列番号56と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(d)配列番号58のS6PΔFポリペプチド、又は806位、881位、888位、931位、975位及び976位で変更されていない、配列番号58と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(e)配列番号60のSCCPPポリペプチド、又は383位、985位、986位及び987位で変更されていない、配列番号60と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(f)配列番号62のSCC6Pポリペプチド、又は383位、817位、892位、899位、942位、985位、986位及び987位で変更されていない、配列番号62と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(g)配列番号5のSMVopt2Pポリペプチド、若しくは986位及び987位で変更されていない、配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(h)配列番号65のSMVoptΔFポリペプチド、又は配列番号65と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(i)配列番号47のSMVopt2PΔFポリペプチド、又は975位及び976位で変更されていない、配列番号47と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(j)SMVopt6Pポリペプチド、又は817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、SMVopt6Pポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(k)SMVopt6PΔFポリペプチド、又は806位、881位、888位、931位、975位及び976位で変更されていない、SMVopt6PΔFポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(l)SMVopt6P3Fポリペプチド、又は682位、683位、685位、817位、892位、899位、942位、986位及び987位で変更されていない、SMVopt6P3Fポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアントである。一部の実施形態において、突然変異した抗原は、(a)配列番号52のTA-S2P3Fポリペプチド;又は(b)配列番号54のS6Pポリペプチド、又は(c)配列番号56のS6P3Fポリペプチド、又は(d)配列番号58のS6PΔFポリペプチド、又は(e)配列番号60のSCCPPポリペプチド、又は(f)配列番号62のSCC6Pポリペプチド、又は(g)配列番号5のSMVopt2Pポリペプチド、又は(h)配列番号65のSMVoptΔFポリペプチド又は(i)配列番号47のSMVopt2PΔFポリペプチドである。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドは、SARS-CoV-2の二重ドメインSタンパク質である。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列中に挿入、置換、又は欠失を含み、挿入、置換、又は欠失は、二重ドメインSタンパク質の細胞表面発現を増加させる。一部の実施形態において、二重ドメインSタンパク質は、発現された二重ドメインSタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する1つ又は複数の追加の置換を更に含む。一部の実施形態において、二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K986P及びV987Pを更に含む。一部の実施形態において、二重ドメインタンパク質は、(a)配列番号76の融合前安定化SF-2P-dERポリペプチド、若しくは986位及び987位で変更されていない、配列番号76と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は(b)配列番号82の融合前安定化SF-2P-2aポリペプチド、若しくは少なくとも986位、987位、1269位、及び1271位で変更されていない、配列番号82と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアントである。一部の実施形態において、二重ドメインSタンパク質は、(a)配列番号76の融合前安定化SF-2P-dERポリペプチド;又は(b)配列番号82の融合前安定化SF-2P-2aポリペプチドである。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の69位及び70位におけるアミノ酸残基の欠失を更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の144位及び145位におけるアミノ酸残基の欠失を更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異N501Yを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異A570Dを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異P681Hを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異T716Iを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異S982Aを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異D1118Hを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異E484Kを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K417Nを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異K417Tを更に含む。一部の実施形態において、SARS-CoV-2抗原性ポリペプチドの二重ドメインSタンパク質は、配列番号3のアミノ酸突然変異D614Gを更に含む。
前述の方法の一部の実施形態において、コロナウイルス抗原性ポリペプチド又はその免疫原性断片は、ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド又はNポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;マトリックス(M)ポリペプチド又はMポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;Eポリペプチド又はEポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;8aポリペプチド又は8aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;7aポリペプチド又は7aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;3Aポリペプチド又は3ポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアントからなる群から選択されるSARS-CoV-2の少なくとも1つのポリペプチドを含むか又はそれらからなる。
予防的及び治療的組成物
予防的有効量は、臨床的に許容されるレベルでのウイルスでの感染を防止する治療有効用量である。一部の実施形態において、治療有効用量は、ワクチンのための添付文書に列挙した用量である。
例えばヒト及び他の哺乳動物における、コロナウイルス感染、特にSARS-CoV-2感染の防止、処置又は診断のための組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。コロナウイルス組成物は、予防剤又は治療剤として使用することができる。それらは、感染性疾患を防止及び/又は処置するための薬において使用することができる。一部の実施形態において、本発明の開示の組成物は、例えば、ex vivoで末梢血単核細胞(PBMC)を活性化するための、免疫エフェクター細胞のプライミングのために使用され、これは次いで、対象に注入(再注入)される。一部の実施形態において、本発明の開示による組成物は、コロナウイルス感染、特にSARS-CoV-2感染を処置するために使用することができる。
免疫原性組成物は、健康な個体に能動免疫スキームの一部として、又は潜伏期中若しくは症状の発症後の活動性感染中の感染において早期に、予防的又は治療的に投与してもよい。一部の実施形態において、細胞、組織又は対象に提供される本発明の開示の免疫原性組成物の量は、免疫予防に有効な量であり得る。
本発明の開示の免疫原性組成物は、他の予防的又は治療的化合物と共に投与してもよい。非限定的な例として、予防的又は治療的化合物は、アジュバント又はブースターであり得る。ブースター(又はブースターワクチン)は、予防的組成物の最初の投与の後に与えることができる。予防的組成物の最初の投与とブースターとの間の投与の時間は、これらに限定されないが、1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、6分間、7分間、8分間、9分間、10分間、15分間、20分間、35分間、40分間、45分間、50分間、55分間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、1日、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、10日、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、18ヶ月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年、又は99年より長くあり得る。一部の実施形態において、予防的組成物の最初の投与とブースターとの間の投与の時間は、これらに限定されないが、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、又は1年であり得る。
一部の実施形態において、この開示の免疫原性組成物は、筋肉内又は皮内投与してもよい。一部の実施形態において、免疫原性組成物は、筋肉内投与される。
この開示の免疫原性組成物は、感染の罹患率又は未だ満たされていない医療上の必要性の程度若しくはレベルに応じて、様々な設定で利用することができる。ワクチンは、それらが、商業的に入手可能な抗ウイルス物質/組成物よりかなり大きい抗体力価及び/又は細胞性免疫応答を生じる点、及びそれより早く応答を生じる点で優れた特性を有する。
この開示の組換え麻疹ウイルス及び/又はこの開示の組換えVLPを、任意選択で1種又は複数の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が本明細書で提供される。免疫原性組成物は、宿主、特にヒト宿主への投与のための好適なビヒクル、例えば医薬的に許容されるビヒクルを含んでいてもよく、宿主において免疫応答を強化するために、必ずではないがアジュバントを更に含んでいてもよい。本発明の組成物において有用な医薬的に許容されるビヒクルとしては、採用される投薬量及び濃度で患者にとって非毒性のあらゆる適合性の薬剤、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、緩衝液等、及びそれらの組合せが挙げられる。ビヒクルはまた、追加の成分、例えば安定剤、可溶化剤、張度調節物質、例えばNaCl、MgCl2、又はCaCl2等、界面活性剤、及びそれらの混合物を含有していてもよい。本発明者らは実際に、本発明の活性成分の投与が、外部のアジュバントを必要とすることなく免疫応答を惹起できることを示した。一部の実施形態において、本明細書で開示される免疫原性組成物は、アジュバントを含まない(それらは、アジュバント非含有である)。
このようなワクチン組成物は、有利には、任意選択で同じCoVタンパク質を含むVLPと共に本明細書で定義されるベクター及び構築物からレスキューされた複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子を含む有効成分(活性成分)を含む。
投与スキーム及び投薬レジメンは、選択された用量の、上述のCoVタンパク質と共に、特に同じCoVタンパク質を発現するCoV-VLPと共に、本発明による複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子の唯一の投与を必要とする場合がある。
代替として、投与スキーム及び投薬レジメンは、複数回用量の投与を必要とする場合がある。
特定の実施形態において、投与は、プライム-ブーストレジメンに従って実行される。プライミング及びブースティングは、上述のCoVタンパク質と共に、特に同じCoVタンパク質を発現するCoV-VLPと共に、複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子からなる同一な活性成分を用いて達成することができる。
代替として、プライミング及びブースティング投与は、投与工程の少なくとも1つにおいて、上述のCoVタンパク質と共に、特に同じCoVタンパク質を発現するCoV-VLPと共に、複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子、及び他の投与工程において、CoVの他の活性な免疫原、例えば上述のCoVポリペプチド又は同じCoVタンパク質を発現するCoV-VLPを含む異なる活性成分を用いて達成することができる。
本発明による複製能を有する組換え感染性MV-CoV粒子を、同じCoVタンパク質を発現するCoV-VLPと共に投与することは、免疫応答を惹起し、様々なCoV株との交差反応性を有する抗体を惹起することができる。したがって、本発明による活性成分の投与は、CoVの特定の株のコード配列を用いて調製される場合、CoVの株の群に対する免疫応答を惹起させることができる。
ヒトMVワクチンの従来知られている用量が、103～105TCID50の範囲内であることを考慮すると、投与される好適な用量の組換えMV-CoVは、0.1～10ng、特に0.2～6ngの範囲であってもよく、一部の実施形態において、0.2～2ngもの低さでもよい。
本発明の特定の実施形態によれば、本明細書において定義される免疫原性又はワクチン組成物はまた、麻疹ウイルスによる感染に対する保護のために使用されることもある。
本発明はまた、コロナウイルスのウイルス関連疾患、特にSARS-CoV-2、すなわちCOVID-19による感染に関する疾患を防止するための方法であって、本発明による組換え麻疹ウイルスの注射、特に皮下注射による哺乳類、特にヒト、特に子供の免疫化を含む方法にも関する。
本発明はまた、コロナウイルスのウイルス関連疾患、特にSARS-CoV-2、すなわちCOVID-19による感染に関する疾患を処置するための方法であって、本発明による組換え麻疹ウイルスの注射、特に皮下注射による哺乳類、特にヒト、特に子供の免疫化を含む方法にも関する。
ワクチンの投与様式
免疫原性組成物は、治療上有効な転帰をもたらすあらゆる経路によって投与することができる。それらの例としては、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、鼻腔内及び/又は皮下投与が挙げられる。本発明の開示は、免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。必要な正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式等に応じて、対象ごとに様々であると予想される。免疫原性組成物は、典型的には、投与しやすさ及び投薬量の均一性のための投薬量単位形態で製剤化される。しかしながら、ワクチン組成物の毎日の総使用量は、主治医によって確実な医療的判断の範囲内で決定できることが理解されるであろう。いずれかの特定の患者ごとの具体的な治療上有効な、予防的に有効な、又は適切なイメージングのための用量レベルは、処置されている障害及び障害の重症度;採用される具体的な化合物の活性;採用される具体的な組成物;患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事;採用される具体的な化合物の投与の時間、投与経路、及び排泄の頻度;処置の持続時間;採用される具体的な化合物と組み合わせて、又はそれと同時に使用される薬物;並びに医療分野において周知の類似の要因等の様々な要因に依存すると予想される。
本明細書に記載される免疫原性組成物は、鼻腔内、気管内、又は注射可能な剤形(例えば、静脈内、眼球内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹膜内、鼻腔内及び皮下)等の本明細書に記載される剤形に製剤化することができる。
免疫原性配合物及び使用方法
本発明の開示の一部の態様は、ワクチンが、対象において抗原特異的な免疫応答(例えば、コロナウイルス抗原性ポリペプチドに特異的な抗体の生産)を生じる有効量で製剤化されている、免疫原性組成物の配合物を提供する。「有効量」は、抗原特異的な免疫応答を生じさせるのに有効な免疫原性組成物の用量である。対象において抗原特異的な免疫応答を誘導する方法も本明細書で提供される。
一部の実施形態において、抗原特異的な免疫応答は、本明細書で提供される免疫原性組成物が投与された対象において生産された抗抗原性ポリペプチド抗体力価を測定することによって特徴付けられる。抗体力価は、対象内の抗体、例えば、特定の抗原(例えば、突然変異した全長Sタンパク質又は突然変異した二重ドメインSタンパク質)又は抗原のエピトープに特異的な抗体の量の尺度である。抗体力価は、典型的には、肯定的な結果を提供する最大希釈率の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)は、抗体力価を決定するための一般的なアッセイである。
一部の実施形態において、抗体力価は、対象が感染していたかどうかを評価するため、又は免疫化が必要かどうかを決定するために使用される。一部の実施形態において、抗体力価は、自己免疫応答の強度を決定するため、ブースター免疫化が必要かどうかを決定するため、前のワクチンが有効かどうかを決定するため、及び何らかの最近又は以前の感染を同定するために使用される。本発明の開示によれば、抗体力価は、免疫原性組成物によって対象において誘導された免疫応答の強度を決定するのに使用することができる。
本発明はまた、SARS-CoV-2のポリペプチドをコードし、天然配列と比べて改変された核酸分子にも関する。特に本発明は、表1に開示された配列のポリヌクレオチドを含むか又はそれからなる核酸分子に関する。
Figure 2023513913000001
Figure 2023513913000002
本発明はまた、表2に開示されたプラスミドにも関する。
Figure 2023513913000003
特定の態様において、本発明は、2020年2月12日に番号CNCM I-5493で寄託されたプラスミドpKP-MVSchwarz又は配列番号30の配列を有するプラスミドpKP-MVSchwに関する。このプラスミドは、あらゆるポリヌクレオチドをクローニングするためのプラスミドとして使用することができる。
別の特定の態様において、本発明は、2002年6月12日に番号CNCM I-2889で寄託された(又は配列番号28の配列を有する)プラスミドpTM-MVSchw、又は2002年6月12日に番号CNCM I-2890で寄託された(又は配列番号29の配列を有する)プラスミドpTM2-MVSchw-gfp、又は配列番号38の配列を有するプラスミドpTM3-MVSchw-gfp、好ましくは2002年6月12日に番号CNCM I-2890で寄託された(又は配列番号29の配列を有する)プラスミドpTM2-MVSchw-gfpに関する。このプラスミドは、あらゆるポリヌクレオチドをクローニングするためのプラスミドとして使用することができる。
Figure 2023513913000004
Figure 2023513913000005
Figure 2023513913000006
開示された配列は、ヌクレオチド又はアミノ酸残基に関する以下のアノテーションによって更に特徴付けられる。
nCoVのスパイク(S)ポリペプチドの天然ヌクレオチド配列(配列番号1)
Figure 2023513913000007
nCoVのスパイク(S)ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号2)
Figure 2023513913000008
nCoVのスパイク(stab-S)ポリペプチドの安定化された形態のコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号4)
Figure 2023513913000009
nCoVのスパイク(stab-S)ポリペプチドの安定化された形態(配列番号5)
Figure 2023513913000010
nCoVのスパイク(Secto)エクトドメインポリペプチドの可溶性及びモノマーの形態のコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号6)
Figure 2023513913000011
nCoVのスパイク(stab-Secto)エクトドメインポリペプチドの安定化された形態のコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号8)
Figure 2023513913000012
nCoVのスパイク(stab-Secto)エクトドメインポリペプチドの安定化された形態(配列番号9)
Figure 2023513913000013
nCoVのS1ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号10)
Figure 2023513913000014
nCoVのS2ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号12)
Figure 2023513913000015
nCoVのS2ポリペプチド(配列番号13)
Figure 2023513913000016
nCoVのS2(stab-S2)ポリペプチドの安定化された形態のコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号14)
Figure 2023513913000017
nCoVのS2ポリペプチド(stab-S2)の安定化された形態(配列番号15)
Figure 2023513913000018
nCoVのスパイク(トリSecto)ポリペプチドの可溶性及び三量体化形態のコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号16)
Figure 2023513913000019
nCoVのスパイク(トリSecto)ポリペプチドの可溶性及び三量体化形態(配列番号17)
Figure 2023513913000020
nCoVのスパイクエクトドメイン(tristab-Secto)ポリペプチドの安定化及び三量体化された形態のコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号18)
Figure 2023513913000021
nCoVのスパイクエクトドメイン(tristab-Secto)ポリペプチドの安定化及び三量体化された形態(配列番号19)
Figure 2023513913000022
CoVのNポリペプチドの天然ヌクレオチド配列(配列番号20)
Figure 2023513913000023
CoVのNポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号21)
Figure 2023513913000024
pKP-MVSchw(配列番号30)
Figure 2023513913000025
Figure 2023513913000026
Figure 2023513913000027
pKP-MVSchw-ATU1(eGFP)(配列番号31)
Figure 2023513913000028
Figure 2023513913000029
pKP-MVSchw-ATU2(eGFP)(配列番号32)
Figure 2023513913000030
Figure 2023513913000031
pKP-MVSchw-ATU3(eGFP)(配列番号33)
Figure 2023513913000032
Figure 2023513913000033
pKM-ATU2-S_2019-nCoV(最適化された配列)(配列番号34)
Figure 2023513913000034
Figure 2023513913000035
pKM-ATU3-S_2019-nCoV(最適化された配列)(配列番号35)
Figure 2023513913000036
Figure 2023513913000037
nCoVのスパイク(S)ポリペプチドのMV最適化ヌクレオチド配列(配列番号36)
Figure 2023513913000038
CoVのNポリペプチドのMV最適化ヌクレオチド配列(配列番号37)
Figure 2023513913000039
ATU1(eGFP)(配列番号39)
Figure 2023513913000040
ATU2(eGFP)(配列番号40)
Figure 2023513913000041
ATU3(eGFP)(配列番号41)
Figure 2023513913000042
nCoVのS3Fポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号42)
Figure 2023513913000043
nCoVのS2P3Fポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号44)
Figure 2023513913000044
nCoVのS2PΔFポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号46)
Figure 2023513913000045
nCoVのS2PΔF2Aポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号48)
Figure 2023513913000046
nCoVのS3Fポリペプチド(配列番号43)
Figure 2023513913000047
nCoVのS2P3Fポリペプチド(配列番号45)
Figure 2023513913000048
nCoVのS2PΔFポリペプチド(配列番号47)
Figure 2023513913000049
nCoVのS2PΔF2Aポリペプチド(配列番号49)
Figure 2023513913000050
SARS-CoV-2のT4-S2P3F(tristab-Secto-3F又はS2P3Fの可溶性三量体化形態とも称される)ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号51)
Figure 2023513913000051
S6P SARS-CoV-2のポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号53)
Figure 2023513913000052
Figure 2023513913000053
S6P3F SARS-CoV-2のポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号55)
Figure 2023513913000054
Figure 2023513913000055
S6PΔF SARS-CoV-2のポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号57)
Figure 2023513913000056
Figure 2023513913000057
SCCPP SARS-CoV-2のポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号59)
Figure 2023513913000058
SCC6P SARS-CoV-2のポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列(配列番号61)
Figure 2023513913000059
Figure 2023513913000060
SARS-CoV-2のS2Pポリペプチド(SMVopt2P)のMV最適化ヌクレオチド配列(配列番号63)
Figure 2023513913000061
SARS-CoV-2のSΔFポリペプチド(SMVoptΔF)のMV最適化ヌクレオチド配列(配列番号64)
Figure 2023513913000062
SARS-CoV-2のS2PΔFポリペプチド(SMVopt2PΔF)のMV最適化ヌクレオチド配列(配列番号66)
Figure 2023513913000063
本発明はまた、本発明による核酸構築物の、又は本発明によるトランスファープラスミドベクター、若しくは本発明による組換え麻疹ウイルスの、第1の、任意選択で第2の異種ポリヌクレオチドによってコードされている、又は本発明による宿主細胞内で生産される、Sポリペプチド又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸置換、挿入又は欠失を有するその免疫原性断片を含む組換えウイルス様粒子(VLP)にも関する。
本発明によれば、VLPは、大量に生産させ、組換え感染性MV-CoV粒子と共に発現させることができる。VLPは、CoVのVLPである。
本発明の好ましい実施形態によれば、組換えMVベクターは、このようにして設計され、生産方法は、免疫原性組成物、好ましくは防御的又はワクチン組成物における使用のための、ワクチン接種に適合させたMV株を起源とするベクターでトランスフェクト又は形質転換されたヘルパー細胞で生産されたウイルス粒子が、複製能を有する組換え感染性MVの生産及びCoV-VLPの生産を可能にするような細胞を含む。
有利には、本発明の組換え感染性MV-CoV粒子のゲノムは、複製能を有する。「複製能を有する」は、MVのN、P及びLタンパク質を発現するヘルパー細胞株に形質導入されると、新しいウイルス粒子を生産するために転写及び発現されることが可能である核酸を意味する。
MV-CoVの組換えゲノムの調製のためのMV cDNAを使用して得られた本発明の組換えウイルスの複製はまた、宿主において、特に組換えMV-CoVが投与されるヒト宿主においてin vivoで達成することもできる。
本発明はまた、本発明による核酸分子によってコードされた、コロナウイルス(CoV)の、特にSARS-CoV-2のポリペプチドにも関する。
本発明の特定の実施形態において、ポリペプチドは、
i.配列番号3(構築物S);
ii.配列番号5(構築物stab-S);
iii.配列番号7(構築物Secto);
iv.配列番号9(構築物stab-Secto);
v.配列番号11(構築物S1)、
vi.配列番号13(構築物S2)、
vii.配列番号15(構築物stab-S2)、
viii.配列番号17(構築物トリSecto)、
ix.配列番号19(構築物tristab-Secto)、
x.配列番号43(構築物S3F)、
xi.配列番号45(構築物S2P3F)、
xii.配列番号47(構築物S2PΔF)、
xiii.配列番号49(構築物S2PΔF2A)、
xiv.配列番号22(構築物N)、
xv.配列番号52(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
xvi.配列番号54(構築物S6P)、
xvii.配列番号56(構築物S6P3F)、
xviii.配列番号58(構築物S6PΔF)、
xix.配列番号60(構築物SCCPP)、及び
xx.配列番号62(構築物SCC6P)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、ポリペプチドは、配列番号5、配列番号43、配列番号45、配列番号47及び配列番号49からなる群から選択されるアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号45、配列番号47及び配列番号49からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、より一層好ましくは、配列番号47又は配列番号49のポリペプチドである。
本発明の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号76のアミノ酸配列(構築物SF-2P-dER)又は配列番号82のアミノ酸配列(構築物SF-2P-2a)を有し、好ましくは配列番号76のアミノ酸配列(構築物SF-2P-dER)を有する。
また本発明は、本発明によるトランスファーベクターによって発現された組換えタンパク質にも関する。
本発明の特定の実施形態において、組換えタンパク質は、精製のためのアミノ酸タグを更に含む。
また本発明は、本発明によるトランスファーベクターによって、in vitro又はin vivoで発現された組換えタンパク質にも関する。
本発明はまた、コロナウイルスに、特にSARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル、特に血液又は血清サンプル中における検出のための、スパイク抗原又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸置換、挿入又は欠失を有するその免疫原性断片、特に配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26、27、43、45、47又は49の、好ましくは配列番号3、5、43、45、47又は49の、より好ましくは配列番号45、47又は49の、より一層好ましくは配列番号47又は49の、より一層好ましくは配列番号49の配列を有する抗原であるSARS-CoV-2の抗原のin vitroにおける使用であって、抗原を生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する、使用にも関する。
好ましくは、SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル、特に血液又は血清サンプル中における検出のための、SARS-CoV-2の抗原のin vitroにおける使用は、上記で定義した通りのスパイク抗原又はその免疫原性断片又はその突然変異した抗原、特に、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26、27、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62又は65の配列を有する抗原、好ましくは配列番号3、5、43、45、47又は49の配列を有する抗原、より好ましくは配列番号49の抗原であり、抗原を生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する。
本発明はまた、コロナウイルスに、特にSARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル、特に血液又は血清サンプル中における検出のための、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸置換、挿入又は欠失を有するスパイク抗原又はその免疫原性断片、特に配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26又は27、好ましくは配列番号3又は5の配列を有する抗原であるSARS-CoV-2の抗原のin vitroにおける使用であって、抗原を生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する、使用にも関する。
好ましくは、SARS-CoV-2の抗原のin vitroにおける使用は、SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル、特に血液又は血清サンプル中における検出のための、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SF-2P-dER抗原若しくはSF-2P-2a抗原又はその免疫原性断片、特に、配列番号76又は配列番号82の配列を有する抗原、好ましくは配列番号76の配列を有する抗原であり、抗原は、生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する。
本発明はまた、診断又はワクチン目的のための、又は融合前の立体配置としての、スパイク抗原又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸置換、挿入又は欠失を有するその免疫原性断片、特に、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26、27、43、45、47又は49の、好ましくは配列番号3、5、43、45、47又は49の、より好ましくは配列番号45、47又は49の、より一層好ましくは配列番号47又は49、より一層好ましくは配列番号49の配列を有する抗原である、SARS-CoV-2の抗原のin vitroにおける使用にも関する。
in vitroでコロナウイルス、特にコロナウイルスSARS-CoV-2を診断するための方法であって、スパイク抗原又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸置換、挿入又は欠失を有するその免疫原性断片、特に、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26、27、43、45、47又は49の、好ましくは配列番号3、5、43、45、47又は49の、より好ましくは配列番号45、47又は49の、より一層好ましくは配列番号47又は49の、より一層好ましくは配列番号49の配列を有する抗原であるSARS-CoV-2の抗原の使用を含む。
本発明はまた、コロナウイルスに、特にSARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル、特に血液又は血清サンプル中における検出のための、スパイク抗原又は1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸置換、挿入又は欠失を有するその免疫原性断片、特に配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26又は27、好ましくは配列番号3又は5の配列を有する抗原であるSARS-CoV-2の抗原のin vitroにおける使用であって、抗原を生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する、使用にも関する。
好ましくは、SARS-CoV-2の抗原のin vitroにおける使用は、SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル、特に血液又は血清サンプル中における検出のための、1、2、3つ又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を有する、SF-2P-dER抗原若しくはSF-2P-2a抗原又はその免疫原性断片、特に、配列番号76又は配列番号82の配列を有する抗原、好ましくは配列番号76の配列を有する抗原であり、抗原を生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する。
本発明の特定の実施形態において、抗原は、コロナウイルスに、特にSARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル、特に血液又は血清サンプルと接触して配置され、抗原に対する抗体の存在が決定される。
本発明はまた、宿主、特にヒト宿主においてSARS-CoV-2による感染を処置又は防止するための方法であって、本発明による免疫原性又はワクチン組成物を宿主に投与する工程を含む方法にも関する。
本発明はまた、宿主、特にヒト宿主においてSARS-CoV-2に対する防御免疫応答を誘導するための方法であって、本発明による免疫原性又はワクチン組成物を宿主に投与する工程を含む方法にも関する。
方法の特定の実施形態において、投与は、少なくとも2回の連続した投与工程を含む。
好ましくは、第2の投与は、第1の投与の後の2週間から6ヶ月まで、特に、第1の投与の後の1又は2ヶ月に実行される。
抗原/抗原性ポリペプチド
一部の実施形態において、抗原性ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オーソログ、パラログ、断片、並びに前述のものの他の等価体、バリアント、及びアナログが挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、又は多分子複合体、例えば二量体、三量体若しくは四量体であってもよい。ポリペプチドもまた、単鎖ポリペプチド又は多重鎖ポリペプチドを含んでいてもよく、互いに会合又は連結されていてもよい。最も一般的には、多重鎖ポリペプチドにおいて、ジスルフィド連結が見出される。用語「ポリペプチド」はまた、少なくとも1つのアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。
当業者によって認識される通り、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、及び相同なタンパク質も目的のポリペプチドの範囲内であるとみなされる。例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100アミノ酸の長さを有する、又は100アミノ酸より長い、参照タンパク質のあらゆるタンパク質断片(参照ポリペプチド配列より短いがそれ以外の点では同一な、少なくとも1つのアミノ酸残基のポリペプチド配列を意味する)が本明細書で提供される。別の例において、20、30、40、50、又は100の(連続する)アミノ酸のストレッチを含み、本明細書に記載される配列のいずれかと、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一なあらゆるタンパク質を、本開示に従って利用することができる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で提供される又は本明細書で参照された配列のいずれかで示されるように、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれより多くの突然変異を含む。別の例において、本明細書に記載される配列のいずれかと、80%、90%、95%より大きい、又は100%の同一性を有する、20、30、40、50、又は100アミノ酸のストレッチを含むあらゆるタンパク質であって、タンパク質は、本明細書に記載される配列のいずれかと80%未満、75%未満、70%未満、65%～60%の同一性を有する、5、10、15、20、25、又は30アミノ酸のストレッチを有する、タンパク質を、本開示に従って利用することができる。
本発明の開示のポリペプチド又はポリヌクレオチド分子は、参照分子(例えば、参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチド)との、例えば、当業界で記載された分子(例えば、操作された若しくは設計された分子又は野生型分子)との、特定の程度の配列類似性又は同一性を有していてもよい。
本発明の他の特色及び利点は、以下に記載される実施例から明らかであり、図面でも例示されることになるが、これらはいずれも、限定を意図しない。
A.(実施例1)
1.材料及び方法
SARS-CoV-2の特異抗原配列の設計
SARS-CoV-2からの天然のスパイク及び核タンパク質抗原をコードするcDNAは、2020年1月20日にNBCBIから公開されているGenbank MN908947配列に基づいて設計した。これらの配列は、哺乳動物及びショウジョウバエの細胞での高い発現のためにコドン最適化ヌクレオチド配列を生成するために、GeneArt(ThermoFisher社)のProject Managerプラットホームを通して次に処理した。可能な場合はいつでも、非常に高い(>80%)か又は低い(<30%)GC含有量の領域は回避され、シス作用性配列モチーフ、例えば内部TATAボックス、χ部位、リボソーム侵入部位、ARE、INS及びCRS配列エレメント、並びに反復配列、RNA二次構造及びスプライス供与部及びアクセプター部位が回避された。両配列は、両方の鎖の上のMV編集(AnGn、n≧3)-及びコア遺伝子末端(A4CKT)様配列を除去するために更に編集した。BsiWI及びBssHII制限部位をヌクレオチド配列のそれぞれ5'及び3'末端に次に加えた。生じたcDNAは、MVゲノムのヌクレオチドの数は6の倍数でなければならないと規定する「6の法則」に従い、配列20AAP6IP-S-2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)-opt(2x)(配列番号2)及び20AASUIP-N-2019-nCoV(すなわちSARS-CoV-2)-opt(2X)(配列番号21)をそれぞれ有する(下を参照する)。
天然のスパイク及び核タンパク質配列は、麻疹ワクチンプラットホームのための最適化された遺伝子を生成するために、GeneArt(ThermoFisher社)のProject Managerプラットホームを通して更に処理した。コード配列は、44～50%の標的GC組成及び平衡のとれたコドン組成を有する配列を生成し、該当する場合、稀なコドン及び最頻出のコドンの高い使用を回避するために改変した。上記の完全コドン最適化配列の生成に関しては、可能な場合はいつでも、非常に高い(>80%)又は低い(<30%)GC含有量の領域は回避され、シス作用性配列モチーフ、例えば内部TATAボックス、χ部位、リボソーム侵入部位、ARE、INS及びCRS配列エレメント、並びに反復配列、RNA二次構造及びスプライス供与部及びアクセプター部位が回避された。両配列は、両方の鎖の上のMV編集(AnGn、n≧3)-及びコア遺伝子末端(A4CKT)様配列を除去するために更に編集した。BsiWI及びBssHII制限部位をヌクレオチド配列のそれぞれ5'及び3'末端に次に加えた。生じたcDNAは、MVゲノムのヌクレオチドの数は6の倍数でなければならないと規定する「6の法則」に従い、配列20AAS76C_S-2019-nCoV_mod(配列番号36)及び20AAS77C_N-2019-nCoV-HS_mod(配列番号37)をそれぞれ有する(下を参照する)。
4つの生じたcDNAは、Geneart(ThermoFisher社)施設で合成された。
プラスミドベクター構築物及びワクチン候補のレスキュー
MVSchw組換えプラスミド構築物は、新規のpKP-MVSchw-ATU1(eGFP)、-ATU2及び-ATU3プラスミドベクター(略名: pKM1、pKM2、pKM3)に由来した。これらのベクターは、それぞれ元のpTM-MVSchw-ATU1、-ATU2及び-ATU3プラスミドベクターから構築された(国際公開第04/000876号及びCombredetら、J Virol、2003)。pKM及びpTMプラスミドベクター系列は、Schwarz MVワクチン株の抗ゲノムに対応する同一の感染性cDNA、並びに外来のオープンリーディングフレームのN遺伝子の上流(ATU1)、P及びM遺伝子の間(ATU2)、並びにH及びL遺伝子の間(ATU3)への挿入のための、特異なBsiWI及びBssHII制限部位を含有する更なる転写単位を有する。
まず、元のpTM2-eGFPプラスミド(2つのNot1部位の間に位置する17038bp)の全体のT7レスキューカセットを市販のpENTR2最小プラスミド(ThermoFisher社)の合目的改変版に移すことによって、pKM2-eGFPを得た。次に、pKM、pKM3-eGFP及びpKM1-eGFPをpKM2-eGFPから逐次的に導いた。新規pKM、pKM1-、pKM2-及びpKM3-eGFPベクターは、対応する麻疹ウイルス及びpTMプラスミドベクター系列で観察されたものに類似した効率を有するベクターをレスキューするそれらの能力について検証した。新規pKM1、pKM2及びpKM3プラスミドベクターからレスキューされたウイルスが、元のpTM1、pTM2及びpTM3ベクターからレスキューされたウイルスとそれぞれ同じゲノム配列を有することを強調することは注目に値する。
pKMプラスミド系列は、元のpTMプラスミド系列よりはるかに高いクローニング効率、安定性及びDNA収率を有する、単一、二重及び三重組換えベクターに様々なウイルス抗原を挿入するために使用するのに好適であり、したがって、麻疹ワクチンプラットホームのための最も有益なレスキューツールである。
上記のSARS-CoV-2核タンパク質及びスパイク抗原をコードするcDNAはBsiWI/BssHII消化pKM2及びpKM3ベクターに挿入し、生じたpKM-nCoVプラスミドは、前述の通り(Combredetら、J Virol、2003)ヘルパー細胞をベースとした系を使用して単一の組換えMV-nCoVワクチン候補をレスキューするために使用される。
プラスミドpKM2-nCoV_NP及びpKM3-nCoV_Spike構築物(全長-S、stab-S、Secto、S1、トリ-Secto、tristab-Secto)のいずれかがSalI制限酵素で消化され、ライゲーションされて一連の二重組換えpKM-nCoV-N&Sプラスミドを生成する。或いは、N及びS ATUカセットをP及びM遺伝子の間(MVゲノムの3位)又はH及びL遺伝子の間(MVゲノムの6位)に縦列で挿入することによって、二重組換えプラスミドが得られる。生じたpKM-nCoV-N&Sプラスミドは、前記のように二重組換えMV-nCoV-N&Sワクチン候補をレスキューするために使用される。
ワクチン候補の細胞内特徴付け
国際公開第04/000876号に開示されるように、単一及び二重組換えワクチン候補はVero-NK細胞で増幅される。全てのウイルス保存株は0.1のMOIで感染後に生成され、-80℃で保存され、Vero-NK細胞単層でのエンドポイント制限希釈アッセイによって滴定される。感染性力価は、Reed及びMunschの方法(Reedら、Am. J. Hyg.、1938)により50%組織培養感染性用量(TCID50)で決定される。
ワクチン候補は、本質的にMV-SARSワクチン候補について記載される通りに(Escriouら、Virology、2014)特徴付けられる:
- ワクチン候補及び親のMVSchwの増殖曲線は、0.1のMOIで感染させたVero-NK細胞で決定される、
- SARS-CoV-2抗原の発現レベルは、VeroNK感染細胞で実行される間接的免疫蛍光アッセイ(IFA)並びに感染細胞から調製される溶解物でのウエスタンブロットによって、利用可能な抗SARS交差反応性のマウス及びウサギ抗体並びに抗SARS-CoV-2抗体で評価される、
- ワクチン候補のゲノム安定性は、VeroNK細胞での連続継代及びレスキューされ、継代されたウイルス保存株の完全ゲノムNGSシークエンシングによって調査される。
SARS-CoV-2 Sタンパク質を発現する組換えMV Schwarzウイルスの生成
感染性MV cDNAを有するプラスミドにおけるSARS-CoV-2 Sタンパク質のクローニング
プラスミドpKM-MVSchwは、Schwarz MVワクチン株の抗ゲノムに対応する感染性MV cDNAを含有する。それは、以前に記載されたpTM-MVSchw(Combredetら、J Virol、2003)に由来した。両方のプラスミドは、Schwarz MVワクチン株のレスキューを許す。2020年の初めの循環ウイルスからの全長膜結合天然SARS-CoV2スパイク糖タンパク質をコードする最適化されたcDNA(公開されている)を、化学合成した(GeneArt/ThermoFisher社、Germany)。完全配列は、MVゲノムに加えられるヌクレオチドの数は6の倍数でなければならないと規定する「6の法則」に従い、両末端にBsiWI及びBssHII制限部位を含有する。スパイクヌクレオチド配列は、MVベクターからの転写(限定されずに特に潜在性のシグナルの除去、及びRNA一次配列の最適化)のために、及びヒト細胞における翻訳(限定されずに特にコドン最適化及びRNA二次構造)のために最適化された。このcDNAは、Schwarz MVゲノムの血球凝集素とポリメラーゼ遺伝子の間に追加の転写単位を含有するBsiWI/BssHII消化pKM-MVSchw-ATU3に挿入した。生じたプラスミドは、pKM-ATU3-S_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)と命名した。
このプラスミドから開始して、いくつかの突然変異をスパイクアミノ酸配列に導入した(図2)。アミノ酸配列は、発現されるタンパク質をその融合前の状態(2P突然変異)でロックするように、S1/S2切断を阻止するように(3F突然変異を介するか又は包含するループのΔF欠失を介するかのいずれかでのフューリン切断部位の不活性化)、及び小胞体回収シグナルを不活性化するように(2A突然変異)逐次的に改変した。生じたプラスミドは: pKM-ATU3-S_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)、pKM-ATU3-stab S_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)(2P突然変異)、pKM-ATU3-S2P3F_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)、pKM-ATU3-S2PΔF_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)、pKM-ATU3-S2PΔF2A_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)と命名した。図3に示す構築物に加えて、2P突然変異のないpKM-ATU3-S3F_2019-nCOVを生成した。
他の構築物は、ATU2部位に類似のコード配列を生成するように設計した。まず、最適化されたSARS-CoV2スパイクcDNAを、Schwarz MVゲノムのリンタンパク質とマトリックス遺伝子の間に追加の転写単位を含有するBsiWI/BssHII消化pKM-MVSchw-ATU2に挿入することによって、配列番号34のpKM-ATU2-S_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)を生成した。
更に、導入遺伝子のヌクレオチド組成及び発現レベルを微調整し、組換え麻疹ウイルスの増強された適応度及び安定性を促進しようとして、麻疹最適化配列(配列番号36)を使用してpKM-ATU2-SMVoptを生成した。例えばATU3の場合に類似した挿入を生成するために、このプラスミドから開始して、2P突然変異、フューリン切断部位の欠失(ΔF)及び2つの突然変異/欠失の組合せ(2PΔF)をスパイクアミノ酸コード配列に導入した(図3C)。生じたプラスミドは:pKM-ATU2-SMVopt、pKM-ATU2-S2PMVopt、pKM-ATU2-SΔFMVopt及びpKM-ATU2-S2PΔFMVoptと命名した。
HEK 293-T7-NP細胞の播種
ヘルパー細胞系HEK 293-T7-NP(米国特許第8,586,364号)を新たに解凍し、伝播させた。90%集密度に到達した後、細胞を採取し、10% FBS含有DMEMに再懸濁させた。6ウェルプレートに、ウェルあたり2mLの細胞懸濁液を播種し、37℃及び5% CO2で一晩インキュベートした。
配列番号35のプラスミドpKM-ATU3-S_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)、配列番号34のpKM-ATU2-S_2019-nCOV(すなわちSARS-CoV-2)、pKM-ATU2-SMVopt又は誘導体及び熱ショックによるトランスフェクション
50～70%集密度で、培地を新鮮な2mL DMEM+10% FCSに交換し、プレートを37℃及び5% CO2で4時間インキュベートした。pKMプラスミド及び麻疹SchwarzポリメラーゼをコードするpEMC-Laプラスミドの同時トランスフェクションを、前述の通り(Combredetら、J Virol、2003)リン酸カルシウムで実行した。トランスフェクション混合物を培地に滴下した。トランスフェクション混合物を均等に分配するためにプレートを静かに振盪させ、37℃及び5% CO2で一晩インキュベートした。
トランスフェクション培地を、2mLの新鮮なDMEM+10% FCSで注意深く置き換えた。トランスフェクトさせた細胞は37℃で3時間インキュベートし、その後43.5℃及び5% CO2で3時間の熱ショックが続いた。
その後、細胞層の集密まで、37℃で2日間インキュベーションを継続した。
HEK及びVERO細胞の共培養
共培養の1日前に、48ウェルプラークは、DMEM+5% FCSに2×104細胞/0.25mLの濃度でVero細胞を播種した。トランスフェクションの3日後、すなわち共培養の0日目に、トランスフェクトさせたHEK細胞を2mLの培地(プレートの各ウェルに含有される)に静かに再懸濁させ、24mLまで希釈し、0.25mL/ウェルでVero細胞に加えた(共培養)。混合のために共培養プレートを静かに振盪させ、37℃及び5% CO2でインキュベートした。共培養の3日目から、CPE及びシンシチウム形成について細胞を毎日観察した。
シンシチウム(レスキューしたウイルス)の採取
CPE又はシンシチウムの単一の病巣を示す共培養プレートのウェルをPBSで洗い、トリプシン処理(200μlのトリプシン/EDTA)によって採取した。48ウェルプラークでの共培養と一緒に、これはレスキューされたウイルスのクローン性を確実にした。37℃で2～5分のインキュベーションの後、DMEM+5% FCSの2.5mLの最終量の6ウェルプレートのうちの単一のウェルに細胞を移した。異なるプラスミドでトランスフェクトさせた細胞からの単一のシンシチウムを含有する複数のウェルを採取し、新規の6ウェルプレートに移した。6ウェルプレートは、37℃及び5% CO2でインキュベートし、CPE又はシンシチウム形成について毎日観察した。
レスキューされたウイルスは、以下のように命名した:
Figure 2023513913000064
レスキューされたウイルスの増大
シンシチウム/CPEが細胞単層の30～50%に到達したとき、レスキューされたウイルスクローンを更に増大させた。これらのウェルの細胞単層をトリプシン処理によって採取し、集密まで増殖させて37℃及び5% CO2でインキュベートしたT75フラスコを起源とする2～3×106のトリプシン処理Vero細胞と一緒に、75cm2のフラスコに移した。
増大させたレスキューされたウイルスの採取
ウイルス増大の1～2日後に、シンシチウム/CPEはレスキューされたウイルスクローンの各々に感染させたVero細胞単層の70～90%に到達した。細胞単層は凍結/解凍によって1.5mLの上清に溶解し、清澄化のために4℃及び2000gで5分間遠心分離した。生じた上清は継代0(P0)と指定され、等分されて-80℃で保存された。挿入断片の抗原発現及び配列は、レスキューされた各クローンのP0のためにウエスタンブロット(図4及び図13)及びサンガーシークエンシングによってそれぞれ検査した。優れた抗原発現及び検証された挿入断片配列を有するクローンが、更なる伝播のために選択された。
細胞培養でのウイルスクローンの伝播
レスキューされた組換えMVクローンのP0種を解凍した。ウイルス伝播は、T150フラスコ中のDMEM+5% FCSで培養し、0.05の多重性(M.O.I)で感染させ、37℃+5% CO2でインキュベートしたVero細胞で実行した。感染の2～3日後、シンシチウム/CPEがVero細胞単層の80～95%に到達したとき、2.5mLの上清中に削り取られた細胞単層の凍結/解凍サイクルによってウイルスを採取した。細胞片は、4℃及び2000gで5分間の遠心分離によって除去した(継代1、P1)。挿入断片の抗原発現及び配列は、選択された各クローンのP1のために検査した。レスキューされたウイルスの更なる継代及び遺伝子安定性の評価のために、これらの工程が繰り返される。
MV及びSARS-CoV-2 Sに特異的であるELISAアッセイ
免疫化されたマウスにおけるMV及びSARS-CoV-2特異的抗体の誘導は、以前に記載された(Escriouら、2014)ように間接ELISAによって評価した。マイクロタイタープレートは、HEK 293T細胞で発現される精製された麻疹抗原(Jena Bioscience社)又は組換え三量化SARS-CoV-2スパイクエクトドメインでそれぞれコーティングし、マウス血清の系列希釈とインキュベートした。結合した抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Southern Biotech社)及びTMB(KPL)に結合させたマウス特異的抗IgG(ガンマ鎖特異的)二次抗体で明らかにされた。ELISA IgG力価は、0.5の吸光度を与える個々の血清の最高希釈の逆数として計算した。
SARS-CoV-2微量中和アッセイ
DMEM+1%BSA+10mMトリシン中の熱不活性化マウス血清試料の2倍又は3倍の系列希釈をSARS-CoV-2の20 TCID50と37℃で2時間インキュベートし、96ウェルマイクロタイタープレート中のDMEM+5% FCSに平板培養したFRhK-4細胞の集密未満の単層に加えた。各血清希釈を4反復で試験し、細胞変性効果(CPE)エンドポイントを37℃+5% CO2で接種の5日後まで読み取った。中和抗体価は、4つのウェルのうちの少なくとも2つでCPEを阻止した血清の最高希釈の逆数として、Reed及びMuenchの方法(Reed及びMuench、1938)により決定した。
MV及びSARS-CoV-2 ELISPOTアッセイ
免疫化又は対照マウスから脾細胞を採取し、単細胞懸濁液を調製し、MV及びSARS-CoV-2特異的IFN-γ産生T細胞の頻度を標準のELISPOTアッセイで定量化した。簡潔には、96ウェル多重スクリーニングPVDFプレート(Millipore社)を、PBS中の5μg/mlのラット抗マウスIFN-γ抗体(AN18、Becton-Dickinson社)でコーティングした。プレートを洗浄し、完全RPMI培地(10% FCS、10mM Hepes、5×10-5Mβ-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを加えたRPMI 1640)で2時間ブロックした。次に、免疫化及び対照マウスからの脾細胞の様々な数(一般的に4×105、2×105及び1×105)を、適当なペプチド(1～10μM)及びIL2(10U/ml)の有る無しで3反復で平板培養した。細胞は、37℃で20時間インキュベートし、多大な洗浄の後、基質としてビオチン化ラット抗マウスIFNγ抗体(R46A2、Becton-Dickinson社)、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン(Becton-Dickinson社)及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT/BCIP、Sigma社)との連続インキュベーションによってスポットが明らかにされた。スポットは、自動化ImmunoSpot(登録商標)アナライザー及び付随するBiospot 7.0ソフトウェア(CTL)を使用して数えた。各マウスについて、陰性対照ペプチド及び特異的ペプチドの存在下で生成されたスポットの数の間の差を計算することによって、ペプチド特異的IFNγ産生細胞の数を決定した。結果は、106の脾細胞あたりのスポット形成細胞(SFC)の数で表した。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する応答を決定するために、T細胞を10μMの全体濃度で10アミノ酸重複部分(ミモトープ)を有する15量体ペプチドを含有するS1及びS2ドメインにわたるペプチドプールでそれぞれ刺激した。これらのプールは、135及び118ペプチドをそれぞれ含有した。
麻疹H22-30(配列番号67のRIVINREHL)及びH446-454(配列番号68のSNHNNVYWL)ペプチド及びNP366(SCOT)ペプチド(配列番号69のASNENMDTM)をEurogentecによって合成し、それぞれ陽性及び陰性対照ペプチドとして各々1μMの濃度で使用した。
細胞内サイトカイン染色
ワクチン接種又は対照マウスからの脾細胞を採取し、単細胞懸濁液を調製した。100万個の脾細胞を、Glutamax(ThermoFisher社)、10% FBS、1%ペニシリンストレプトマイシン、10IU/ml IL-2(Miltenyi Biotec社)、100ng/ml IL-7(Miltenyi Biotec社)を有するIMDMで培養した。ペプチドあたり2μg/ml(5% DMSOで再構成された)の最終濃度のペプチドプールにより細胞を37℃で6時間刺激した。最後の4時間は、BD GolgiPlug及びBD GolgiStop(BD Biosciences社)を加えた。陽性対照のために、細胞は50ng/ml PMA(Sigma Aldrich社)及び1g/mlイオノマイシン(Sigma Aldrich社)で刺激し、陰性対照のために、DMSOを有する培地を使用した。細胞は、マウスFc受容体ブロック(抗マウス2.4G2)及び固定可能な生存能力色素eFluor506(eBioscience社)とインキュベートして死細胞を排除した。細胞は、α-CD45 BUV395(BD Pharmingen社 # 564279)、α-CD19 AF700(eBioscience社 # 56-0193-80)、α-CD11b AF700(eBioscience社 # 56-0112-82)、α-CD11c AF700(eBioscience社 # 56-0114-82)、α-CD3e BV650(BD Pharmingen社 # 564378)、α-CD4 eFluor 450(eBioscience社 # 48-0041-80)、α- CD8a PerCp Cy5.5(BD Pharmingen社 # 5511622)、α-CD44 BV786(BD Pharmingen社 # 563736)、α-CD62L APC-Cy7(BioLegend社 # 104427)で染色した。固定及び透過処理(BD Cytofix/Cytoperm、BD Biosciences社)に続いて、細胞をα-TNFαFITC(eBioscience社 # 11-7321-81)、α-IFNγPECy7(BD Pharmingen社 # 55764)、α-IL-5 PE(eBioscience社 # 12-70
52-82)、α-IL-13 eFluor 660(eBioscience社 # 50-7133-82)で細胞内染色した。細胞はFortessa(BD Biosciences社)を使用してフローサイトメトリーによって取得し、データはFlowJo v10.7ソフトウェアで分析した。
SARS-CoV-2によるIFNAR-KOマウスの抗原投与
麻疹ワクチンを許容する129/Svバックグラウンドにおける6～9週齢IFNα/βR-/-マウス(IFNAR-KO)の群を、105 TCID50の組換えMVSchw/SARS-CoV-2-S又は親のMVSchwで腹腔内(i.p.)注射した。ブースター注射は、その後4週間投与した。血清試料は、指示された時点で収集した。ヒトACE2受容体の発現を誘導するために、免疫化マウスをケタミン/キシラジン溶液(それぞれ50mg/kg及び10mg/kg)で軽く麻酔をかけ、30μL PBS中の6.0×108 ICUのAd5-hACE2(adenovirus 5 expressing the human ACE2 receptor of SARS-CoV-2、 Kuら、2021)を鼻腔内投与した。4日後、マウスを前記のように麻酔をかけ、30μLのPBS中の2×104 TCID50(組織培養感染性用量50%)のFrance/IDF0372/2020 SARS-CoV2株で鼻腔内接種した。感染マウスは、頚部脱臼によってSARS-CoV-2抗原投与の4日後に安楽死させた。各肺葉の半分を無菌的に取り出し、PBS中で激しく洗い、2サイクルのホモジナイゼーションの間氷上でインキュベートすることにより4m/sで20秒間の2回の連続したパルス投与による、FastPrep(登録商標)-24ホモジナイザー及び6.35mm直径の酸化ジルコニウムセラミック磨砕球(MP Biomedical社)を含有するLysing MatrixM管を使用した750μLの氷冷PBS中での磨砕まで、氷上に保った。ホモジネートは4℃で2000gの10分間の遠心分離によって透明にし、使い捨てのアリコートの形で-80℃に保った。
肺におけるSARS-CoV-2ゲノムRNA量は、製造業者の手順に従ってQIAampウイルスRNA Miniキット(Qiagen社)を使用してウイルスRNAを70μLの肺ホモジネートから抽出することによって決定した。肺ホモジネート中の推定上の非粒子状ウイルスRNAを除去するために、70μLの試料を、QIAampウイルスRNA MiniキットのAVL緩衝液による不活性化の前に37℃で30分間、100UのRNaseI(Ambion社)で処理した。ウイルス量(ゲノム当量(GEQ)/肺で表される)は、本質的にCormanら(Euro Surveill. 2020)によって記載される通りに、SuperScript(商標)IIIプラチナ一段階定量的RT-PCR系(Invitrogen社)並びにTable 7(表6)に掲載されるSARS-CoV-2エンベロープ(E)遺伝子を標的にしたプライマー及びプローブ(Eurofins社)を使用した、逆転写及びリアルタイムTaqMan(登録商標)PCRに従って決定した。プラスミドpCI/SARS-CoV Eに由来するin vitro転写RNAは、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA生成系(Promega社)を使用して合成し、次に、フェノール/クロロホルム抽出及びエタノールによる2回の連続した沈殿によって精製した。RNA濃度を光学密度測定によって決定し、次にRNAを100μg/mLのtRNAキャリヤーを含有する無RNアーゼ水で109ゲノム当量/μLに希釈し、使い捨てのアリコートの形で-80℃で保存した。RNA品質は、Agilent 2100 bioanalyzer_Eukaryote Total RNA NanoシリーズIIで調整した。このin vitro転写RNAの系列希釈は、10μg/mLのtRNAキャリヤーを含有する無RNアーゼ水で調製し、各アッセイで標準曲線を確立するために使用した。熱サイクル条件は以下の通りだった: (i) 55℃で10分間の逆転写、(ii) 95℃で3分間の酵素不活性化、(iii) 95℃で15秒間、58℃で30秒間の変性/増幅を45サイクル。生成物は、ABI 7500 FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)で分析した。
Figure 2023513913000065
肺ホモジネート中の感染性SARS-CoV-2の力価は、12ウェルプレートに播種したVero-E6細胞で決定した。2反復のウェルの中の細胞を、10mMトリシン及び1mg/mL BSAを含有するDMEM培地中で肺ホモジネートの各5倍の系列希釈に感染させた。5% CO2雰囲気下の37℃で1時間のインキュベーションの後、ウイルス接種原を取り除き、1μg/mLトリプシン及び1.2%アビセルRC581(FMC Biopolymer社)を含有する培地に細胞を置き、次に、37℃で72時間更にインキュベートした。細胞シートを次にホルムアルデヒドで固定し、0.1%クリスタルバイオレットで染色し、プラークを数えた。感染性ウイルスの力価は、プラーク形成単位(PFU)/肺で表した。
2.結果及び考察
細胞培養における組換えMVのレスキュー及び特徴付け
増殖特性
ATU3からSARS-CoV-2 Sを発現する組換えMVを、首尾よくレスキューした。MV-ATU3-SはVero NK細胞で伝播させたところ、107組織培養感染用量50(TCID50)より上の高い力価まで増殖した。遺伝子安定性はATUのサンガーシークエンシング、及びトランスフェクション後に回収された独立したウイルスクローンの全長ゲノムのNGSシークエンシングによって確認した。効率的なS発現は、代表的なクローンのために図4Aに示すように、MV-ATU3-Sの各クローンに感染させた細胞で実証された。時間経過実験では、MV-ATU3-Sウイルスは48時間後にピーク力価に到達し、その後約1対数力価低下したが、これは48及び72時間の間で安定したウイルス力価を示したMV-Schwと対照的であった。細胞の感染の結果、麻疹ウイルスは、ウイルス融合(F)及び結合(H)糖タンパク質と宿主細胞形質膜の間の相互作用の結果として多核細胞(シンシチウム、図5)の形成を一般的に誘導する。最終的に、最初のシンシチウムは次第に相互に融合し、広い面積の又は融合した細胞をもたらす。MV-ATU3-Sに感染した細胞では、感染の後の時間にそのような大きなシンシチウムの数の増加が観察された(図5)。MV-ATU3-Sのこの融合誘導表現型は、感染の後の早期から観察され(示されない)、融合領域のより大きな拡張は感染から48時間後のウイルス力価のピークと一致した。この時点で、大きなシンシチウムは崩壊し、感染細胞単層は大規模な細胞変性効果(CPE)を示し、したがって、MV-Schwと比較してMV-ATU3-Sのウイルス複製に影響を与えた。融合誘導表現型は、MV-ATU3-Sに感染した細胞では、細胞表面で発現される天然のスパイクは、それが近隣細胞の上のACE2受容体と相互作用して細胞融合を促進することができるという点で機能的であることを示唆した。ワクチン候補を生成するために、MV-ATU3-Sで観察されたもの等の増強された融合誘導表現型は、それが麻疹ベクターウイルスのトロピズムを変更するかもしれないので潜在的な安全性リスクとみなされた。したがって、融合誘導特性が低減又は消滅したスパイクタンパク質バリアントが、スパイクを「2P」突然変異(K986P+V987P)を介してその融合前状態で安定させること、又は多塩基切断部位の「3F」突然変異(R682G+R683S+R685G)若しくは包含するQ675-R685ループの「ΔF」欠失を介してS1/S2ジャンクションでの切断を阻止することに基づいて、2つの相補的アプローチを通して設計された(図2)。前記の改変及びその組合せを有するバリアントスパイクタンパク質を発現する改変されたスパイク遺伝子を生成し、最初に、スプリットGFP系を持つ細胞に基づくアッセイで(Buchrieserら、2020)、hACE2発現の存在下で一時的トランスフェクションの後に細胞融合を促進するそれらの能力について評価した。データは、「2P」突然変異を単独で、多塩基S1/S2フューリン切断部位の「3F」突然変異を単独で、又は「2P」及び「3F」の組合せ、又は「2P」及びフューリン切断部位「F」の欠失の組合せを持つスパイクタンパク質が(図2)、天然のスパイクと対照的にhACE2発現HEK 293T細胞の融合を誘導しなかったことを示した(図16)。
これらの結果が示唆するように、「2P」突然変異を導入することによってSタンパク質をその融合前状態でロックすること(図2)は、そのような安定化スパイクバリアントを発現する任意の組換え麻疹ベクターウイルスの融合誘導表現型の増強を消滅させた。組換えMV-ATU3-S2P、MV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2Aは実際首尾よくレスキューされ、全てが107 TCID50より上の高い力価まで増殖した。MV-AUT3-S2P、MV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2AによるVero NK細胞の感染は、親のMV Schwarzによる感染と類似のシンシチウム形成をもたらし(図5)、天然のSを発現するMV-ATU3-Sと比較して増強された融合活性の不在を確認した。2P安定化突然変異を持つ全ての4つの構築物の遺伝子安定性は、細胞培養において5継代の後にATUのサンガーシークエンシング及び全長ウイルスゲノムのNGSシークエンシングによって確認された。
ATU2からの天然のSARS-CoV-2 Sを発現する組換えMVクローンは、親の麻疹Schwarzよりはるかに低い力価まで増殖したか、又は、レスキュー(P0)の直後若しくは以降の継代1(P1)の後に、スパイク導入遺伝子において高力価増殖を回復したナンセンス補償突然変異を発生させた。これは、完全コドン最適化S遺伝子が、位置ATU2に挿入されるときに不安定なMVベクターを生成することを示す。これの可能な説明は、MV複製によって生成される遺伝子発現の勾配に関して、下流のATU3位置よりも上流のATU2位置から推進されるS発現レベルの増加に関連付けることができる(Plumet、2005)。したがって、ATU2位置(図3C)に挿入された麻疹最適化ヌクレオチド配列から天然及びバリアントのスパイクタンパク質を発現する麻疹ベクター構築物を生成した。これらの構築物、MV-ATU2-SMVopt、MV-ATU2-SMVopt2P、MV-ATU2-SMVoptΔF、MV-ATU2-SMVopt2PΔFは、107 TCID50より上の高い力価まで増殖した。挿入断片の正しい配列はATUのサンガーシークエンシングによって確認され、麻疹最適化S遺伝子は、位置ATU2に挿入されたとき、安定したMVベクターを顕著に生成することを示している。
抗原発現
組換えMV感染Vero細胞でのスパイク発現は、SARS-CoV-1(Escriouら、Virology、2014)又はSARS-CoV-2の組換えSタンパク質に対して生成されたポリクローナルウサギ抗血清を使用したウエスタンブロット分析によって確認された。図4に示すように、主要なバンドは、180kDaの予想された見かけの分子量で全ての試料で検出され、全長Sタンパク質の発現を示す。100及び80kDaの見かけの分子量をそれぞれ有するマイナーなバンドが、MV-ATU3-S及びMV-ATU3-S2Pに感染した細胞から調製された溶解物で検出され、SがそのS1及びS2ドメインに部分的に切断されたことを実証する。突然変異(MV-ATU3-S2P3F)又は小さい包含ループの欠失(MV-ATU3-S2PΔF、MV-ATU3-S2PΔF2A)によるフューリン切断部位の不活性化は、予想通り切断を消滅させた(図4B)。更に、スパイクポリペプチドの発現は、透過処理をしなかったシンシチウムの間接免疫蛍光法(IFA)によって容易に検出され、天然の及び突然変異したSのいずれも表面に効率的に輸送されたことを示す(図5B)。
ATU2への麻疹最適化ヌクレオチド配列(配列番号36)の挿入は、ATU3への完全コドン最適化ヌクレオチド配列の挿入に類似の発現レベルをもたらした(図13A)。ATU3での完全コドン最適化ヌクレオチド配列から発現されたスパイクタンパク質と同じく、ATU2で発現されたSMVopt2Pタンパク質はS1及びS2に部分的に切断されたが、MV-ATU2-SMVoptΔF及びMV-ATU2-SMVopt2PΔFによって発現されたフューリン部位欠失スパイクタンパク質は切断されなかった(図13B)。
免疫原性
COVID-19ワクチンの免疫原性は、129sv 1型インターフェロン受容体(インターフェロン-α/β受容体、IFNAR)欠損マウス、麻疹ベクターを用いたワクチンの調査のために好適な小動物モデル、で評価した。全ての実験は、Institut Pasteur、ParisのOffice of Laboratory Animal Careによって承認され、そのガイドラインに従って実行された。IFNAR KOマウスは、Institut Pasteur動物施設において特定病原体未感染条件下で収容された。6匹の6～10週齢IFNAR KOマウスの群を、1×105 TCID50のワクチン候補の3～4週間隔で2回の腹腔内注射で免疫化したか、一度だけ免疫化した。対照として、空のMVベクターMV-Schwarz(1×105 TCID50)を注射した一群のマウスが、各試験に含まれた。マウス血清は、第1及び第2の注射の18～21日後に収集した。
体液性応答
体液性応答を調査するために、SARS-CoV-2及びMV特異的抗体応答を間接ELISAによってマウスごとに評価した。SARS-CoV-2スパイクを発現する異なる組換え麻疹ウイルスで免疫化したマウスは、麻疹特異的ELISAによって決定されたように初回免疫化の後に麻疹ウイルスに血清変換した(図6A)。抗麻疹応答は、全ての試験したMV構築物及び親のMV-Schwarzで類似し、組換えウイルスによる異種Sタンパク質の発現がin vivoにおけるそれらの複製を変更せず、それらの麻疹特異的免疫原性も改変しなかったことを示唆する。一部のマウスは初回免疫化に応答しなかったか又は不十分に応答したが、追加免疫化の後には応答した。追加免疫の後、マウスでの以前の研究から予想される通り、抗MV抗体レベルは約10倍増加した。
抗麻疹抗体で応答した、MV-ATU3-S、MV-ATU3-S2P、MV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化した全てのマウスは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のエクトドメインに特異的なELISAによって測定したとき、初回免疫の後に104の範囲で高力価のスパイク特異的抗体でも応答した(図6B)。追加免疫の後、抗S抗体レベルは、抗MV抗体で見られたように約10倍増加した。対照的に、空のMV-Schwarzで免疫化した対照マウスは全て陰性であった。統計的に有意でないが、不活性化フューリン切断部位を有する構築物(MV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2A)によって惹起された、MV-AUT3-S及びMV-ATU3-S2Pによって惹起されたものと比較してより高い抗S抗体レベルのわずかな傾向があった。
微量中和アッセイを使用して、抗-SARS-CoV-2中和抗体が検出された。SARS-CoV-2 Sを発現する全ての組換えMVは、1回の免疫化の後に中和抗体を惹起した(図7)。図7に示すように、及び更なる実験(データ示さず)で繰り返されたように、以下の構築物:MV-ATU3-S<MV-ATU3-S2P<MV-ATU3-S2P3F<MV-ATU3-S2PΔF/MV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスにおいて初回免疫の後に中和力価が増加する傾向があった。追加免疫の後、中和力価は少なくとも10倍増加した。不活性化フューリン切断部位を有するSARS-CoV-2 Sを発現する全ての組換えMVは、追加免疫の後に類似の中和抗体レベルを、並びにMV-ATU3-S及びMV-ATU3-S2Pより高いレベルを惹起する。MV-ATU3-S2P及びMV-ATU3-S2P3Fの追加免疫の後の中和力価の間の差は、統計的に有意である(マン-ホイットニー検定でp=0.0216)。これは、プラーク低減中和試験90(PRNT90)によって確認された。
2020年3月18日のInternational Coalition of Medicinal Regulatory Agencies(ICMRA)の推奨に基づき、SARS-CoV-1ワクチン候補により動物モデルで観察された潜在的疾患増大のリスクを軽減するために、Th1応答の誘導を確実にすることが重要である。IgGアイソタイプ分析は、継続中のCD4+ヘルパーT細胞応答を1型(Th1)又は2型(Th2)応答にゆがめることの第1の指標を得ることを可能にするので、IgG2aのIgG1抗体価に対する比を、アイソタイプ特異的抗S ELISAによって測定した。図11A及び11Bに示すように、この分析は、MV-ATU3-S、MV-ATU3-S2P、MV-ATU3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2Aが全てTh1応答の指標となるIgG1レベルより高いIgG2aを誘導することを明らかにした。wt 129/Svマウスをミョウバンアジュバント加用三量体化スパイクエクトドメインで免疫化することによって、対照実験を実行した。初回及び追加免疫の後、これらのマウスはIgG2a抗体価よりはるかに高いIgG1を有し(図11C及び図11D)、ミョウバンアジュバント加用SARS-CoV-1スパイクエクトドメインによる免疫化の後に我々が以前に観察したように、誘導された免疫応答が大部分Th2型であったことを示す(Escriou、2014)。
抗MV ELISA、抗S ELISA及びSARS-CoV-2微量中和によって調査したMV-ATU3-S及びMV-ATU2-SMVoptの免疫原性の比較は、第1又は第2の免疫化の後に2つの麻疹ベクターウイルスによって惹起された抗体応答において差を示さなかった(図14)。
T細胞応答
ヘルパーT細胞応答並びに細胞傷害性T細胞応答のタイプを直接調べるために、脾臓T細胞応答を分析した。Sタンパク質特異的T細胞応答は、追加免疫化の19～25日後に脾細胞で測定した。T細胞は、10アミノ酸重複を有する15量体ペプチドを含有する、スパイクタンパク質のS1及びS2ドメインの全長にそれぞれわたるペプチドプールで刺激した。対照として、麻疹特異的応答を、CD8+ T細胞に特異的な2つの麻疹ペプチドのプールを使用して調査した(Reuterら、PLoS ONE、2012、7(3)、e33989、1～8)。
IFN-γ産生T細胞はMV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスでELISpotによって数え上げ、Sタンパク質にわたるペプチドに対する細胞性応答を実証した(図8)。麻疹ベクター主鎖への細胞性応答も確認した(図8)。
CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞によるサイトカイン産生は、フローサイトメトリーによって分析した細胞内サイトカイン染色によって特徴付けた。マウスは、MV-ATU3-S、MV-AUT3-S2P、MV-AUT3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF、MV-ATU3-S2PΔF2Aで、又は親のMV Schwarz株で免疫化した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する組換えMVで免疫化した全てのマウスでは、脾細胞の細胞内サイトカイン染色は、全体のSタンパク質にわたるS1及びS2ペプチドプールに応答したIFN-γ及びTNF-α二重陽性CD8+及びCD4+ T細胞を検出した。これは、これらのT細胞の機能的状態を示し、S特異的Th1型応答がワクチン候補によって誘導されたことを確認した(図9、パネルA及びB)。更に、麻疹ベクター主鎖へのCD8+ T細胞応答は、組換え候補並びに親のMVSchwを受けたマウスでIFN-γ及びTNF-α二重陽性CD8+ T細胞を実証することによって確認された(図9、パネルA及びC)。対照的に、Th2応答に特有の、IL-5及びIL-13を発現するS特異的T細胞のわずかな分画だけが、組換え候補のいずれかを受けたマウスで検出された(図9、パネルA及びB)。
更に詳細にT細胞応答を特徴付けるために、Sペプチドプールに応答して単一のサイトカインを産生するT細胞(図10、パネルB及びD)を、二重サイトカイン陽性T細胞に加えてMV-ATU3-S2PΔF2A及び親のMV Schwarzで免疫化したマウスで調査した(図10、パネルA及びC、図9にも同じ結果が含まれる)。MV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスではMVSchw対照で免疫化したマウスより高い頻度で、TNF-α産生CD4+ T細胞だけが存在した(図10、パネルB)。全ての他のCD4+及びCD8+単一サイトカイン産生T細胞は、MV-ATU3-S2PΔF2A及びMWSchw免疫化マウスにおいて類似の頻度で見出され(図9、パネルB及びD)、これらの応答がスパイクタンパク質に特異的でないことを示した。
総合すると、これらの結果は、Sタンパク質のエピトープを標的にする機能的Th1型T細胞応答は、MV-ATU3-S、MV-AUT3-S2P、MV-AUT3-S2P3F、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2Aを含む、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する組換えMVによる免疫化によって誘導されることを示した。この応答は、IFN-γ及びTNF-α産生CD8+ T細胞、並びにIFN-γ及びTNF-α産生CD4+ T細胞の支配的な誘導によって特徴付けられる。
SARS-CoV-2抗原投与に対する防御
SARS-CoV-2による実験的な抗原投与感染に対する防御を誘導する麻疹ベクター構築物の可能性を調査するために、発明者は、SARS-CoV-2によるその後の感染を可能にするために、IFNAR-KOマウスの肺におけるヒトACE2受容体の一時的発現のモデルを使用した(Kuら、2021)。
初回及び追加免疫化の後の防御を調査するために、マウスを、MV-ATU3-S、MV-AUT3-S2P、MV-ATU3-S2PΔF、MV-ATU3-S2PΔF2A、又は対照として親のMV Schwarz株で免疫化した。第2の免疫化の25日後にマウスはAD5:hACE2を注入し、4日後に、2×104pfuのSARS-CoV-2を鼻腔内接種した。肺におけるSARS-CoV-2ウイルスの存在は、ゲノム当量(GEQ) RNAレベルを測定するRT-qPCRによって、並びにVero細胞中の感染性ウイルスの定量化によって調査した。図12のパネルAに示すように、全ての麻疹ベクター構築物は、MVSchw親ウイルスと比較して肺におけるウイルス量を有意に低減した。GEQは、MV-ATU3-S、MV-ATU3-S2Pによって概ね1.5log、並びにMV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2Aによって2.5log低減された。更に、感染性ウイルスは、MV-ATU3-S及びMV-ATU3-S2Pで免疫化した群の中の各々1匹のマウスにおいて、特に免疫化に不十分に応答し、非常に低い中和抗体価を有したマウスにおいて低い残留力価で検出されただけで、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスのいずれでも検出されなかった。全体として、これらの結果は、組換えMVによるワクチン接種が動物の肺でウイルス量を有意に低減すること、特に感染性ウイルスの存在が阻止されることを示した。注目すべきことに、防御の効率は中和抗体レベルの誘導について観察された階層に従い、MV-ATU3-S2PΔF及びMV-ATU3-S2PΔFはMV-ATU3-S及びMV-ATU3-S2Pより優れた防御を付与した。
顕著なことには、GEQ(p=0.0149)及びPFU(p=0.0253)のレベルによって調査したとき、抗原投与の9日前にとられた血液試料中の中和抗体価のレベルは、個々のマウス(免疫原が何であれ)における防御の効率と逆相関した。これは、血液中の中和抗体レベルが感染後のSARS-CoV-2複製の低減に直接的又は間接的に寄与することを示唆する。
初回及び追加免疫化の後の有望な結果に基づいて、初回免疫だけの後の防御を、MV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスで調査した。この実験は、初回だけの免疫化から165日後まで抗体応答の寿命を調査するようにも設計された。初回免疫から約6ヶ月後に測定した微量中和力価(図12、パネルB、uNT)は高く、103の範囲内であったが、それでもこのベクターによる追加免疫化の後に到達したレベルより約10倍低かった(図12、パネルA、uNT)。抗原投与及びウイルス量の分析を前記のように実行した。2logのGEQ/肺の有意な低減が観察された(図12、パネルB)。感染性のSARS-CoV-2ウイルスは、MV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化した6匹のマウスのうちの1匹の肺から非常に低い力価で回収されただけであり、MV-ATU3-S2PΔF2Aによる初回免疫化だけの後の強力な防御を実証した。
初回免疫だけの後の防御は、MV-ATU3-S2Pで免疫化したマウス及び対照として空のベクターMV-Schwarzで免疫化したマウスとの比較で、MV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスでも調査された。この実験は、初回免疫化のわずか4週後の短期防御を調査するように設計された。
図6Bで表される実験で既に示されているように、ELISAによって測定したとき、MV-ATU3-S2P及びMV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化した全てのマウスは104の範囲内の高力価の麻疹特異的及びスパイク特異的抗体で応答した(図17、パネルA)。2P安定化Sを有するMV-ATU3-S2Pによって惹起されたもの[2.1±0.2log10(NT力価)]と比較して、不活性化フューリン切断部位を有するMV-ATU3-S2PΔF2A構築物によって有意により高い中和抗体レベル(p=0.0087、マン-ホイットニー)が惹起された[2.6±0.1log10(NT力価)]。
SARS-CoV-2による抗原投与からの防御は、前記のように調査された。図17のパネルBに示すように、両方の麻疹ベクター構築物による免疫化は、MVSchw親ウイルスと比較して肺におけるウイルス量を有意に低減した。GEQ RNAレベルは、MV-ATU3-S2Pによって概ね0.8log、及びMV-ATU3-S2PΔF2Aによって1.3log低減された。更に、感染性ウイルスは、マウスがMV-ATU3-S2Pで免疫化した6匹の半分で、特に最も低い中和抗体価を有したマウスにおいて低い残留力価で検出されただけだった。MV-ATU3-S2PΔF2Aで免疫化したマウスでは、感染性ウイルスは検出されなかった。
全体として、この実験は、組換えMVによるワクチン接種が、初回免疫化から4週後と早期に動物の肺でウイルス量を有意に低減したことを示した。それは、防御の効率が中和抗体レベルの誘導について観察された階層に従うことも確認し、すなわち、MV-ATU3-S2PΔF2Aは初回免疫後にMV-ATU3-S2Pより優れた防御を付与する。
SARS-CoV-2 S6P、6P3F及び6PΔFタンパク質を発現する組換えMV Schwarzウイルスの増強された免疫原性及び防御能力。
スパイクタンパク質を更に安定させる努力の中で、「6P」突然変異(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P)を上記の「3F」突然変異(R682G+R683S+R685G)又は「ΔF」欠失(配列番号50のQ675-R685ループ)と組み合わせることによって、スパイクタンパク質バリアントを設計した(図2)。前記の改変及びその組合せを有するバリアントスパイクタンパク質をコードする改変されたスパイク遺伝子を生成し、pKM-MVSchw-ATU3ベクターに挿入した。生じたpKM3-S6Pプラスミドは、前述のヘルパー細胞をベースとした系を使用して単一の組換えMV-ATU3-S6Pワクチン候補を首尾よくレスキューするために使用した。MV-ATU3-S6PウイルスクローンはVero NK細胞で伝播させたところ、107 TCID50/mLより上の高い力価まで増殖し、ATUのサンガーシークエンシングによって遺伝子的に安定していることが確認された。MV-ATU3-S6PによるVero NK細胞の感染は、親のMV Schwarzによる感染と類似したシンシチウム形成をもたらし(示さず)、天然のSを発現するMV-ATU3-Sで観察された増強された融合活性の不在を示し、したがって、S6Pの融合前状態での効率的ロッキングを確認する。S発現はMV-ATU3-S6Pの各クローンに感染した細胞で実証され、S1及びS2ドメインへの部分的切断を示した(図15A)。注目すべきことに、MV-ATU3-S、MV-ATU3-2P及びMV-ATU3-S6Pに感染した細胞で類似の発現レベルが観察された。このことは、S6Pの分泌された未切断のエクトドメインについてHsiehら(Science、2020)によって観察された、HEK293T細胞における一時的発現の後のS2Pのそれの発現レベルと比較して実質的により高い発現レベルと対照的である。MV-ATU3-S6P発現レベルが2Pのそれの範囲内に留まるという事実は、S2P及びS6Pの固有の免疫原性の比較評価を許す。感染Vero NK細胞におけるS6P抗原の未切断の全長形態(S6P3F、S6PΔF)の発現を実証するために、MV-ATU3-S6P3F及びMV-ATU3-S6PΔFはレスキューされて、基本的に前記のように特徴付けられる。
ELISAによって測定したとき、MV-ATU3-S6Pで免疫化したほとんどのマウスは、初回免疫の後に104の範囲内の高い力価の麻疹特異的及びスパイク特異的抗体で応答した(図15、パネルB及びC)。SARS-CoV-2中和力価は、102の範囲内であった(図15、パネルD)。初回免疫後の麻疹応答体マウスの間で、以下の構築物で免疫化したマウスにおいてSARS-CoV-2特異的ELISA及び中和力価の増加傾向があった: MV-ATU3-S2P[3.8±0.1log10(ELISA力価); 1.5±0.2log10(NT力価)]<MV-ATU3-S6P[4.1±0.1log10(ELISA力価); 2.1±0.2log10(NT力価)]<MV-ATU3-S2PΔF[4.6±0.3log10(ELISA力価); 2.5±0.3log10(NT力価)]。MV-ATU3-S2P及びMV-ATU3-S6Pの初回免疫の後の中和力価の間の差は、統計的に有意である(マン-ホイットニー検定でp=0.0079)。
抗MV抗体について観察される通り、及び麻疹プラットホームによりベクターに載せたほとんどのスパイクバリアントについて上で既に記載される通り、追加免疫の後、抗S抗体レベルは約10倍増加した。統計的に有意でないが、MV-ATU3-S6P[3.9±0.1log10(NT力価)]は、追加免疫の後にMV-ATU3-S2P[3.5±0.3log10(NT力価)]よりわずかに高い中和抗体レベル及びMV-ATU3-S2PΔF(4.1±0.2log10(NT力価))より低いレベルを惹起した。
抗原投与及び肺ウイルス量の分析は、前記の通り追加免疫化の4週後に実行した。図15のパネルEに示すように、全ての麻疹ベクター構築物は、MVSchw親ウイルスと比較して肺におけるウイルス量を有意に低減した。GEQ RNAレベルは、MV-ATU3-S2Pによって概ね1.7log、並びにMV-ATU3-S6P及びMV-ATU3-S2PΔF2Aによって2.2log低減された。注目すべきことに、防御の効率は中和抗体レベルの誘導について観察された傾向に従い、MV-ATU3-S2PΔFはMV-ATU3-S2P及びMV-ATU3-S6Pよりわずかに優れた防御を付与した。
これらの実験から、S6Pは中和抗体の誘導に関してS2P抗原より優れた成績を上げたと我々は結論づける。両抗原は麻疹ベクターから類似したレベルで発現されるという事実を考慮すると、これは、S6PがS2Pより効率的に融合前状態でロックされること、及び/又はより高い安定性を有することを示唆する。「3F」突然変異及び「ΔF」欠失は中和抗体の誘導のために「2P」突然変異と相乗的に作用するという事実を考慮すると、このことは「6P」突然変異の場合にも当てはまること、並びにMV-ATU3-S6P3F及びMV-ATU3-S6PΔFは防御的中和抗体の誘導のためにMV-ATU3-S6Pより、並びにそれぞれMV-ATU3-S2P3F及びMV-ATU3-S2PΔFよりも優れた成績を上げることを我々は予期する。
閉じたコンフォメーションで安定化されるSARS-CoV-2スパイクバリアントを発現する組換えMV Schwarzの免疫原性及び防御能力。
SARS-CoV-2に対して防御的抗体応答を誘導する代わりのアプローチとして、発明者は単一/二重プロリン置換によってそれらの融合前状態でロックされ、追加のジスルフィド結合によって閉じたコンフォメーションで共有結合的に安定化される、全長SARS-CoV-2スパイクバリアントを設計した。これらには、限定されずに、上記の「2P」又は「6P」突然変異の組合せ、及び二重S383C/D985C「CC」突然変異(SCCPP及びSCC6P)が含まれる。この「CC」突然変異はMcCallumら、Hendersonら及びXiongら(2020)によって独立して報告され、スパイクエクトドメインを、RBDが下がったコンフォメーションにあるその閉鎖されたコンフォメーションで効率的に安定化させることが示された。或いは、発明者は任意の融合前安定化突然変異を二重G413C/P987C「CC2」突然変異と組み合わせることができ、これはXiongらによってスパイクをその閉じたコンフォメーションで安定させることも示された。発明者はジスルフィド結合の唯一の追加によって共有結合的に安定化されるSARS-CoV-2スパイクバリアントに頼ることもでき、そのような二重システイン突然変異は単独でスパイクを閉鎖的融合前コンフォメーションで安定化させることができると仮定する。
注目すべきことに、フューリン切断部位は上記のSCCPP及びSCC6P構築物において不活性化されず、RBD閉鎖状態はこれらの構築物中の切断部位のアクセスを制限することができ、したがって、それをフューリン媒介タンパク質分解に耐性にすると発明者は予期する。或いは、スパイクタンパク質を更に安定化させる努力の中で、「SCCPP」又は「SCC6P」突然変異を上で特徴付けた「3F」突然変異又は「ΔF」欠失と組み合わせることによって、スパイクタンパク質バリアントを設計することができる。
前記の改変及びその組合せを有するバリアントスパイクタンパク質をコードする改変されたスパイク遺伝子を生成し、pKM-MVSchw-ATU3ベクターに挿入する。対応するワクチン候補をレスキューし、基本的に前記のように特徴付けることができる。これらのMV構築物は未切断の全長スパイクを、RBDが下がったコンフォメーションにありほとんど遮断されているその閉じたコンフォメーションで発現することができる。発現される閉鎖的スパイクは、SARS-CoV-2のACE-2受容体に対して大きく低減された結合親和性を有することができ、このことは、麻疹プラットホームによるベクターに載せる場合の主要な利点である。その理由は、発明者がMV-ATU3-Sについて観察し、潜在的な安全性リスクとみなした融合誘導表現型の増加をそれが阻止するからである。
これらのワクチン候補の免疫原性及び防御能力は、IFNAR-KOマウスで評価することができる。「閉鎖的」スパイクを発現するMV構築物は、天然タンパク質(S2P等)に対して生成されるものから異なる免疫応答を誘導することができ、より低いレベルの中和RBD特異的抗体はACE-2結合を阻止し、より高いレベルの抗体は下がった位置のRBDに結合する。発明者は、これらの代わりの抗体がSARS-CoV-2バリアントに対して増強された及び/又はより広い防御を提供することを予想する。
SARS-CoV-2スパイクの分泌形態を発現する組換えMV Schwarzの免疫原性及び防御能力。
SARS-CoV-2に対して防御応答を誘導し、全長スパイクを発現するMV候補について発明者が観察した融合誘導表現型の増加を回避する代わりのアプローチとして、発明者は、Sの可溶性及び分泌形態としてスパイクエクトドメインを発現するMV候補を評価した。
完全コドン最適化スパイク遺伝子からいくつかの構築物を工学操作し、一時的発現分析のために先ずそれらの一部をC末端のTwin-Strep-タグとpCIプラスミド(Promega社)にクローニングした。これらの構築物は図18Aに図式化され、以下のものが含まれる:
- その全長エクトドメイン(Secto: M1-K1211)に対応する可溶性でおそらく単量体の形態のスパイク、その設計は我々がMVプラットホームで首尾よく発現させたSARS Sol防御的免疫原に類似している(Escriouら、2014)。
- 開始メチオニンからプロリン681へのSエクトドメインの可溶性で単量体のS1領域(M1-P681)、これは予測されたRRARフューリン切断部位の直前に先行する。
- Ser-Gly-Gly連結リンカーを通してGCN4又はT4フィブリチンfoldonに融合するその全長エクトドメインに対応する可溶性で三量体の形態のスパイク(トリ-Secto)。
- 二重K986P及びV987P「2P」突然変異(tristab-Secto)、「3F」突然変異(R682G+R683S+R685G)及び/又は「ΔF」欠失(配列番号50のQ675-R685ループ)を持つ、トリ-Sectoの安定化バリアント。
HEK 293T細胞は、pCI-Spike_ectomainプラスミドDNAのセット、又は対照としてスパイクの全長バリアントをコードするpCI-S2P、pCI-S2PΔF及びpCI-S3FプラスミドDNAで一時的にトランスフェクトした。上清はトランスフェクションの48時間後に収集し、スパイクエクトドメイン分泌は抗StrepTagモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析によって比較した。(三量化)エクトドメインの可溶形態だけが上清で検出され、膜貫通C末端のサイトゾルドメインがトランケーションされるときの効率的な分泌を示した(図18B)。S1/S2切断部位が「3F」突然変異又は「ΔF」欠失で不活性化されたとき、及びT4 foldonではなくGCN4 foldonが使用されたとき、上清中のより高いレベルのスパイクが検出された。全細胞抽出物中の発現レベルは全ての構築物で同じ範囲内にあった(示されず)ので、これは、未切断のGCN4三量体化エクトドメインの培地におけるより効率的な分泌又は増加した安定性を示唆する。
T4S2P3F、GCN4-S2P3F及びT4S2Pポリペプチドは、StrepTactinカラムでの親和性クロマトグラフィーによって一時的にトランスフェクトしたExpi293F細胞の上清から精製し、Superdex200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した(図18C)。溶出プロファイルは280nm(mAU)の吸光度によって記録され、T4-S2P3Fがホモトリマーで排他的に構成されることを示したが、GCN4-S2P3F及びT4-S2Pは二量体及び二量体/単量体のかなりの割合をそれぞれ含有した。
全体として、これらの結果は、T4 foldonを「2P」突然変異及びS1/S2切断部位の不活性化と組み合わせたときに、最も効率的な分泌及びホモトリマーフォールディングが得られることを示す。
概念実証として、天然のスパイクエクトドメイン(Secto)及び三量体化エクトドメインバリアント(上記の一時的発現系で試験した)の最も成績の良いT4-S2P3F構築物をコードする完全コドン最適化cDNAを、BsiWI/BssHII消化pKM-MVSchw-ATU3に挿入した。対応するMV-ATU3-Secto及びMV-ATU3-T4-S2P3Fワクチン候補は、前記のようにヘルパー細胞をベースとした系を使用して効率的にレスキューされた。独立したウイルスクローンはVero NK細胞で伝播させたところ、107 TCID50/mLより上の高い力価まで増殖した。挿入断片の正しい配列はATUのサンガーシークエンシングによって確認され、Sの分泌形態をコードするcDNAの麻疹ベクターへの挿入が、遺伝子的に安定したMV組換えをもたらすことを示した。MV-ATU3-Secto及びMV-ATU3-T4-S2P3FによるVero NK細胞の感染は、親のMV Schwarzによる感染と類似したシンシチウム形成をもたらし(図示せず)、優れた適応度及び予想通りこれらのウイルスの増強された融合誘導活性の不在を示した。
組換えMV感染Vero細胞でのスパイクエクトドメインの発現及び分泌は、SARS-CoV-2の組換えSタンパク質に対して生成されたポリクローナルウサギ抗血清を使用したウエスタンブロット分析によって確認された(未発表)。予想通り、全長S2P3Fタンパク質は細胞溶解物で検出されただけだった(図19、中央パネル)。対照的に、Secto及びT4-S2P3Fは感染の39時間後に感染Vero細胞の溶解物及び上清の両方で明らかに検出され(図19、上及び中央のパネル)、効率的な分泌を示した。一貫して、細胞培地に分泌されたSecto及びT4-S2P3Fタンパク質は、細胞溶解物の中で観察されたそれらの対応物より高い見かけ分子量で移動し、分泌前にERからゴルジへの移動の後に成熟を経たこれらの糖タンパク質と一致していた。注目すべきことに、T4-S2P3Fは感染細胞の溶解物及び上清中にSectoより著しく高いレベルで存在し、このことは、T4 foldon媒介三量体化を「2P」突然変異及びS1/S2切断部位の不活性化と組み合わせたときのSエクトドメインのより正確なフォールディング及び/又は安定性の増加を確認する。
MV-ATU3-T4-S2P3Fの免疫原性は、全長構築物について記載される通り、中和抗体応答並びにCD4+及びCD8+ T細胞応答の誘導に関してIFNAR-KOマウスで調査することができる。Th1に偏った応答の誘導、及び分泌されたT4-S2P3F対膜固着S2P3Fによって誘導される応答の微調整の評価を確認することができる。防御の効率は、Ad5:Ace2による鼻腔内導入及びSARS-CoV-2による抗原投与の後の肺ウイルス量を定量化することによって調査することができる。
単独での又はSARS-CoV-2スパイクと組み合わせた、SARS-CoV-2核タンパク質を発現する組換えMV Schwarzの免疫原性及び防御能力。
pKM2-nCoV_NP又はpKM-ATU2-Nと略されるプラスミドpKM-ATU2-N_2019-nCoV(2019-nCoV=SARS-CoV-2)は、「Plasmid vector constructs and vaccine candidate rescue」と題されたセクションに記載されており、完全コドン最適化SARS-CoV2核タンパク質(N) cDNA(配列番号21)を、MV Schwarzゲノムのリンタンパク質とマトリックス遺伝子の間に追加の転写単位を含有するBsiWI/BssHII消化pKM-MVSchw-ATU2に挿入することによって生成された。導入遺伝子のヌクレオチド組成及び発現レベルを微調整し、組換え麻疹ウイルスの増強された適応度及び安定性を促進する努力の中で、麻疹最適化配列(配列番号37)を使用してpKM-ATU2-NMVoptを同様に生成した。
前記のようにヘルパー細胞をベースとした系を使用して、単一の組換えMV-ATU2-N及びMV-ATU2-NMVoptワクチン候補を首尾よくレスキューするために、pKM-ATU2-N及びpKM-ATU2-NMVoptプラスミドを使用した。独立したウイルスクローンはVero NK細胞で伝播させたところ、107 TCID50/mLより上の高い力価まで増殖した。挿入断片の正しい配列は、ATUのサンガーシークエンシングによって確認され、ATU2位に挿入された完全コドン最適化及び麻疹最適化されたSARS-CoV-2 N遺伝子は、安定したMVベクターの生成を注目すべきことに可能にすることを示した。MV-ATU2-N及びMV-ATU2-NMVoptによるVero NK細胞の感染は、親のMV Schwarzによる感染と類似のシンシチウム形成をもたらし(示されず)、これらのウイルスの優れた適応度を示した。
組換えMVに感染したVero細胞でのSARS-CoV-2核タンパク質の発現は、SARS-CoV-2 Nタンパク質に対して生成されたポリクローナルウサギ抗血清を使用したウエスタンブロット分析によって確認された(未発表)。図20に示すように、飽和検出レベルに近い非常に高い強度の主要なバンドが、45kDaの予想された見かけ分子量で全ての試料で検出され、全長Nタンパク質の発現を示した。主要なバンドの強度は、MV-ATU2-NよりMV-ATU2-NMVoptで強力だった。MV-ATU2-NMVoptでは、おそらくマイナーな分解断片に対応するより低い分子量の他のバンドも観察された。全体として、これは、SARS-CoV-2核タンパク質が麻疹ベクターのATU2に挿入された完全コドン最適化及び麻疹最適化遺伝子から効率的に発現されること、並びに完全コドン最適化遺伝子が核タンパク質のより高い発現をおそらく引き起こしたことを示した。
MV-ATU3-N及びMV-ATU3-NMVoptの免疫原性は、MV-S構築物について記載される通りCD4+及びCD8+ T細胞応答の誘導をモニタリングすることによってIFNAR-KOマウスで調査することができる。IFN-γ産生T細胞は、Nタンパク質にわたるペプチドプールによる刺激の後にELISpotによって数え上げることができる。CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞によるサイトカイン産生は、フローサイトメトリーによって分析される細胞内サイトカイン染色によって特徴付けることができ、Th1に偏った応答の誘導を発明者が確認することを可能にする。防御の効率は、Ad5:Ace2による鼻腔内導入及びSARS-CoV-2による抗原投与の後の肺ウイルス量を定量化することによって調査することができる。
プラスミドpKM-ATU2-N及びpKM3-スパイク構築物のいずれか、特にS6P及び誘導されたバリアント(S6P3F、S6PΔF及びSCC6P)は、SalI制限酵素で消化してライゲーションさせ、完全コドン最適化SARS-CoV N及びS遺伝子を持つ一連の二重組換えpKM-N&Sプラスミドを生成することができる。麻疹最適化SARS-CoV N及びS遺伝子で、類似のpKM-NMVopt&SMVoptプラスミドを構築することができる。これらのプラスミドは、二重組換えMV-N&Sワクチン候補をレスキューするために使用することができ、これらは前記のようにin vitroで比較して特徴付けることができる。単一の組換え構築物について記載される通り、免疫原性はN及びSペプチドプールを標的にするCD4+及びCD8+ T細胞応答、並びに中和抗体の誘導に関してIFNAR-KOマウスで調査することができる。臨床試験はSARS-CoV-2感染からの回復における体液性及び細胞媒介性の免疫の防御的役割を示唆しているので(Del Valle、2020)、二重組換えMV-N&Sワクチン候補がSARS-CoV-2による鼻腔内抗原投与に対してそれらの単一の組換え親候補より優れた防御を提供するかどうかについて調査することができる。
B.(実施例2)
1.材料及び方法
細胞及びウイルス
ヒト胚性腎細胞(HEK)293T(ATCC CRL-3216)、HEK293T7-NPヘルパー細胞(MV-N及びMV-P遺伝子を安定して発現する)、アフリカミドリザル腎細胞(Vero)及びVero C1008クローンE6(ATCC CRL-1586)を、5%(Vero細胞の場合)又は10%(HEK293T細胞の場合)の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)(Corning社)、100単位/mlのペニシリン-ストレプトマイシン及び100μg/mlのストレプトマイシンを補ったダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)(Thermo Fisher社)の中で37℃、5% CO2で維持した。SARS-CoV-2 BetaCoV/France/IDF0372/2020株は、Institut Pasteur(Paris、France)によって抱えられたNational Reference Centre for Respiratory Virusesによって供給された。株BetaCoV/France/IDF0372/2020が単離されたヒト試料は、Bichat Hospital、Paris、France、からのX. Lescure博士及びY. Yazdanpanah教授によって提供された。マウス適合SARS-CoV-2(MACo-3)は、他の場所で記載されている。
改変されたSARS-CoV-2 Sタンパク質構築物を発現するpTM-MVSchwarzの構築
Zhouら(Zhou、2020)によって公開された配列に基づくSARS-CoV-2スパイク(S)遺伝子は、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化した。pCDNA 5.1へのクローニングのためにそのC末端の11アミノ酸が欠失した(SF-dER)(図21)全長S(SF)を生成するために、制限部位BsiWI及びBssHIIをそれぞれS 5'及び3'末端に導入するプライマーを使用してヌクレオチド1～3799を増幅した。S2構築物を生成するために、フューリン切断部位の直ぐ隣の天然のSシグナルペプチド及びS2のC末端にBsmBI制限部位及び4ヌクレオチド重複部分を有する逆PCRのために、プライマーを設計した(Table 5A-5C(表7～9))。S2領域、pCDNA主鎖及びSシグナルペプチドを含む増幅生成物をBsmBI(NEB)で消化し、自己ライゲーションさせてS2-dERを生成した。Sのコンフォメーションを融合前の状態に維持するために、2つの突然変異をHR1、K986P及びV987Pのヒンジに導入した(2P突然変異) (図21)。突然変異を導入するプライマーは、突然変異させた重複ヌクレオチド及びBsmBI部位で設計した(Tables 5A-5C(表7～9))。SF-dER及びS2-dER構築物を増幅、消化し、自己ライゲーションさせて融合前に安定化させたSF-2P-dER及びS2-2P-dER構築物を作製した。pCDNAバックグラウンドのS構築物を、FugeneHDを使用してVero細胞にトランスフェクトさせた。トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションの24及び48時間後に融合誘導表現型について観察した。
全てのS遺伝子は、MV Schwarzワクチン株の抗ゲノムに対応する感染性MV cDNAをコードするpTM-MVSchwarzにその後クローニングした。全ての挿入された遺伝子は、ヌクレオチドの総数が6の倍数であるように終止コドンで改変された(Calain、1993)。
ウイルスのレスキュー、伝播及び滴定
以前に記載された通り(Combredet、2003)、ヘルパー細胞をベースとした系を使用して、組換えMVウイルスのレスキューを実行した。簡潔には、ヘルパーHEK293T7-NP細胞を5μgのpTM-MVSchwarzをベースとしたSARS-CoV-2 Sプラスミド及び0.02μgのpEMC-La、MVポリメラーゼ(L)遺伝子を発現するプラスミドで個々にトランスフェクトした(Duprex、2002)。37℃で一晩のインキュベーションの後、トランスフェクション培地を新鮮なDMEM培地と交換した。ヒートショックを42℃で加え3時間おいた後に、トランスフェクトされた細胞を37℃インキュベーターに戻した。2日後に、トランスフェクトされた細胞をVero細胞の単層を播種した100mmシャーレに移した。共培養の2～3日後に出現したシンシチウムを単独で選び出し、6ウェルプレートに播種したVero細胞に移した。感染細胞をトリプシン処理し、75cm2及び次に150cm2のフラスコの中で5% FBS含有DMEMで増大させた。80%～90%被覆率にシンシチウムが到達したとき(又は、最大細胞変性効果(CPE)が観察されたとき、通常感染から36～48時間以内)、細胞を削り取って少量のOptiMEM(Thermo Fisher社)に入れた。細胞は単回の凍結融解サイクルによって溶解し、細胞溶解物は低速の遠心分離によって透明にした。感染性上清を次に収集し、-80℃で保存した。rMVの力価は、7500細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、5% FBS含有DMEM中のウイルスの系列10倍希釈溶液で感染させたVero細胞で決定した。7日間のインキュベーションの後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、Karber方法(Karber、1931)を使用してTCID50値を計算した。SARS-CoV-2及びMACo3の力価は、類似のプラークアッセイにおいてVero-E6で調査した。プラーク数は、感染の3日後に読み取った。
rMVのウイルス増殖動態は、6ウェルプレートの中のVero細胞の単層で試験した。細胞は、0.1のMOIでrMVに感染させた。rMV構築物あたり、1枚のプレートを使用した。感染から様々な時点で、感染細胞を削り取って1mlのOptiMEMに入れ、凍結融解によって溶解し、遠心分離によって透明にし、前記のように滴定した。
S発現の安定性を調査するために、凍結融解サイクルによって生成した細胞溶解物を使用してVero細胞を10継代繰り返し感染させた。継代1(P1)、P5及びP10ウイルスを使用して、6ウェルプレートの中のVeroを2反復で感染させ、RT-PCR及びウエスタンブロッティングをそれぞれ使用してS mRNA及びタンパク質レベルについて調査した。
RT-PCR
rMV構築物からのS発現を検証するために、RNeasy Miniキット(Qiagen社)を使用して感染Vero細胞から全RNAを抽出した。cDNA合成及びPCR工程は、製造業者の指示に従ってRNA LA PCRキット(Takara Bio社)をATU2及びATU3を標的にするプライマー(Table 5A-5B(表7～8))と使用して実行した。RT-PCR生成物は、Table 5C(表9)に示すプライマーを使用したサンガーシークエンシング(Eurofins Genomics)によって検証した。
ウエスタンブロット分析
6ウェルプレートの中のVero細胞を、0.1のMOIで様々なrMVに感染させた。感染の36～48時間後(80%シンシチウム)、感染細胞をRIPA溶解緩衝液(Thermo Fisher社)に溶解した。試料を短時間遠心分離し、NuPAGE-pre-cast4～12%勾配ゲルをNuPAGE-MOPs流動緩衝液(Invitrogen社)と使用したSDS-PAGEにかけた。ニトロセルロース膜(GE Healthcare社)への移動及び0.1%Tween、5%ミルクを含有するトリス緩衝食塩水(TBS)緩衝液によるブロッキングの後、保存された1124aa～1140aaエピトープ(ABIN199984、Antibody Online社、1:2000希釈)を認識するウサギポリクローナル抗SARS- CoV S抗体で、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートブタ抗ウサギIgG抗体(P0399、Dako社、1:3000希釈)で膜をその後調べた。バンドは、Super Signal West pico Plus化学発光性HRP基質(Thermo Fisher社)を使用して可視化した。ローディング対照のために、膜を5% NaOHで5分間剥脱し、その後ブロックした。その後膜をマウスモノクローナル抗MV-N抗体(ab9397、Abcam社、1:20000希釈)で、続いてHRPコンジュゲート抗マウスIgG(NA931V、GE Healthcare社、1:10000希釈)で再び調べた。
免疫蛍光アッセイ
Vero細胞は、0.1のMOIで様々なrMVに感染させた。感染の24～36時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、2%ヤギ血清で一晩ブロックし、次に0.1%サポニンA(Sigma社)で処理したか又はしなかった。固定した細胞は次に一次抗体としてマウスモノクローナル抗SARS-CoV S抗体(ab273433、Abcam社、1:300希釈)で調べた。Alexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(A-11008、Thermo Fisher社)を、二次抗体として使用した。抗-MV-Nと続くCy3コンジュゲートヤギ抗ウサギ(A10520、Jackson Immuno Research社、1:1000希釈)による染色を、同じ感染細胞でMVを検出するのに使用した。核は、DAPIで染色した。20×対物レンズを備えた倒立ライカDM IRB蛍光顕微鏡を使用して、画像を収集した。
フローサイトメトリー
JetPrimeトランスフェクションキット(PolyPlus社)を製造業者の使用説明書に従って使用して、HEK293T細胞をトランスフェクトするために、融合前安定化又は天然コンフォメーションの全長S及びS2サブユニット抗原をコードするpcDNA5.1発現ベクターを使用した。トランスフェクションの48時間後、10μg/mlのS2を標的にしたウサギポリクローナル抗S抗体(ABIN199984)と、続くAlexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(A-11008)による間接免疫蛍光法のために細胞を染色した。ゲーティングによって死細胞を排除するために、ヨウ化プロピジウムを使用した。染色された細胞をAttune NxTフローサイトメーター(Invitrogen社)で取得し、データはFlowJo v10.7ソフトウェア(FlowJo LLC社)を使用して分析した。
マウス免疫化及び抗原投与
全ての実験はInstitut PasteurのOffice of Laboratory Animal Careによって承認され、そのガイドラインによって実行された。I型IFN受容体が欠損した6～8週齢マウス(IFNAR-/-)の群を、105 TCID50 rMV、すなわちATU2若しくはATU3のSF-2P-dER若しくはS2-2P-dER、又は対照の空のMV Schwarzで腹腔内注射した。体液性応答を試験するために、2回の免疫化を4週間隔で投与した。血清は、第1の免疫化の前(-1日目)並びにその後第2の免疫化の前(28日目)及び後(42日目)に収集した。全ての血清試料を、56℃で30分間、熱不活性化した。防御を調査するために、1回又は2回の免疫化を受けたマウスに、1.5×105PFUのマウス適合SARS-CoV-2ウイルス(MACo3)の鼻腔内接種で抗原投与した。抗原投与の3日後に、マウスを屠殺し、肺試料を収集した。肺の中のMACo3ウイルスの存在は、ウイルスの増殖、感染性ウイルス粒子のPFU、を決定し、製造業者のプロトコール(E3006)に従ってLuna Universal Pr-be一段階RT-qPCRキットを使用してvRNAを測定することによって検出された。使用したプライマー及びプローブは、WHOウェブサイト(プロトコル、Institut Pasteur、2020)に記載されるnCoV_IP4パネル(Table 5A-5C(表7～9))に対応する。
Figure 2023513913000066
Figure 2023513913000067
Figure 2023513913000068
ELISA
Edmonston株由来MV抗原(Jena Bioscience)又はR683A及びR685A突然変異を有するアミノ酸残基16～1213を包含する組換えSタンパク質(ABIN6952426、Antibodies Online)を、1×リン酸緩衝食塩水(PBS)中に1μg/mlでNUNC MAXISORP 96ウェルイムノプレート(Thermo Fisher)の上にコーティングした。コーティングしたプレートを4℃で一晩インキュベートし、洗浄緩衝液(PBS、0.05% Tween)で3回洗浄し、更にブロッキング緩衝液(PBS、0.05% Tween、5%ミルク)により37℃で1時間ブロックした。免疫化マウスからの血清試料は、結合緩衝液(PBS、0.05% Tween、2.5%ミルク)で連続希釈し、37℃で1時間プレートの上でインキュベートした。洗浄工程の後、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson Immuno Research、115-035-146、1:5000希釈)を37℃で加え1時間おいた。抗体結合をTMB基質(Eurobio)の追加によって検出し、反応を100μlの30% H2SO4で停止した。光学密度は、EnSpire 2300 Multilabelプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して450及び620nm波長で記録した。各個々の血清試料のエンドポイント力価は、陰性対照血清の吸光度の2倍を与えた最後の希釈の逆数として計算した。HRPコンジュゲートアイソタイプ特異的(IgG1又はIgG2a)ヤギ抗マウス抗体(AB97240及びAB97245、Abcam社、1:5000)を使用して、抗体応答のアイソタイプ決定を実行した。
プラーク低減中和試験
熱不活性化血清試料の二倍系列希釈を、FBSなしのDMEM培地中の50PFUのSARS-CoV-2ウイルスと37℃で1時間インキュベートし、24ウェルプレートに播種したVero E6細胞の単層に加えた。ウイルスは、37℃で2時間吸着させた。上清を除去し、1mlのプラークアッセイオーバレイ培地(5% FBS及び1.5%カルボキシメチルセルロースを補ったDMEM)を細胞にオーバレイした。プレートは、5% CO2の37℃で3日間インキュベートした。ウイルスを不活性化し、細胞を固定し、20%エタノール及び10%ホルムアルデヒド(全てSigma社から)を含有する30%クリスタルバイオレット溶液で染色した。SARS-CoV-2プラークを50%低減した希釈(PRNT50)で、血清中和力価を数えた。
ELISPOT
免疫化マウスからの脾細胞を単離し、Hybri-Max赤血球溶解緩衝液(Sigma社)を使用して赤血球を溶解した。脾細胞は、特異的刺激の後にIFN-γを分泌するそれらの能力について試験した。マルチスクリーンHA 96ウェルプレート(Millipore社)を、1ウェルあたり100μlのPBS中の10μg/mlの抗マウスIFN-γ(551216、BD Biosciences社)で、4℃で一晩コーティングし、その後洗浄し、200μlの完全MEM-α(10% FBS、1×非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、10mM HEPES、1%ペニシリン-ストレプトマイシン及び50μMβ-メルカプトエタノールを補ったMEM-α(Thermo Fisher社))により37℃で2時間ブロックした。培地は、各ウェルに3反復で1×105の脾細胞及び100μlの刺激剤を10U/mlのマウスIL-2(Roche社)を補った完全MEM-α中に含有する100μlの細胞懸濁液と交換した。使用した刺激剤は、陽性対照のための2.5μg/mlコンカナバリンA(Sigma Aldrich社)、陰性対照のための完全MEM-α、1のMOIのMV Schwarzウイルス、又は1ペプチドにつき2μg/mlのSARS-CoV-2 Sペプチドプール(Table 6A-6B(表10～11))であった。37℃、5% CO2で40時間のインキュベーションの後、プレートをPBSで1回、次に洗浄緩衝液(PBS、0.05% Tween)で3回洗浄した。洗浄緩衝液中の1μg/mlのビオチン化抗マウスIFN-γ抗体(554410、BD Biosciences社)を加え、プレートは室温で120分間インキュベートした。大量の洗浄後、100μlのストレプトアビジン-アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート(Roche社)を1:1000の希釈で加え、プレートを室温で1時間更にインキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で2回洗浄し、続いてTweenなしのPBS緩衝液で洗浄した。スポットをBCIP/NBT(Sigma社)で発現させ、CTL ImmunoSpot(登録商標)ELISPOTリーダーで数えた。
Figure 2023513913000069
Figure 2023513913000070
細胞内サイトカイン染色
ワクチン接種をしたマウスの脾細胞を前述の通りに抽出した。1ウェルあたりマウスにつき200万の脾細胞を200μLの完全MEM-α培地(Thermo Fisher)の中でインキュベートした。製造業者の使用説明書に従ってBD Golgi Stop(554724、BD Biosciences社)を培地に加えた。1ペプチドにつき2μg/mlの最終濃度でSARS-CoV-2 Sタンパク質の予測されたCD4及びCD8 T細胞エピトープ(Table 6A-6B(表10～11))をカバーするペプチドプールで、脾細胞を刺激した。PMA/イオノマイシン細胞刺激カクテル(eBioscience社)を陽性対照のための刺激として使用し、培地だけを陰性対照のために使用した。脾細胞は、37℃で4時間刺激した。刺激した細胞はマウスBD Fc Block(553141、BD Biosciences)とインキュベートし、ゲーティングによって死細胞を排除するためにLive/Dead Fixable Aqua Viability Dye(Thermo Fisher)で染色した。その後、細胞はInvitrogen社からのCD3e PE(クローン145-2C11、12-0031-83、eBioscience社)、CD4 PerCP-eFluor710(クローンRM4-5、46-0042-82)及びCD8 Alexa Fluor 488(クローン53-6.7、53-0081-82)抗体で染色した。BD固定/透過処理キット(BD Biosciences社)で細胞を固定、透過処理し、IFN-γAPC/Fire750(クローンXMG1.2、505860、BioLegend社)、TNF-αBV421(クローンMP6-XT22、563387、BD Horizon社)及びIL-5 APC(クローンTRFK5、505860、BD Biosciences社)抗体で染色した。Attune NxTフローサイトメーター(Invitrogen社)で試料を取得し、データはFlowJo v10.7ソフトウェア(FlowJo LLC社)を使用して分析した。
統計情報
統計分析は、GraphPad Prism v.8.0.2を使用して実行した。p<0.05ならば、結果は有意とみなした。全てのグラフの線は幾何平均を表し、エラーバーは幾何学的SDを示している。抗体応答、ELISA及びPRNT50の統計分析は、多重比較のために調整した二元配置ANOVAを使用して実行した。2群の間の差を比較するために、両側ノンパラメトリックマン-ホイットニーのU検定を適用した。
2.結果
SARS-CoV-2 S抗原の設計
SARS-CoV-1 Sを発現するMVによる発明者からの以前の研究(Escriou、2014)に基づき、並びにSARS-CoV及びSARS-CoV-2 Sタンパク質は高度な類似性を共有する(Chan、2020)ので、MVベクターによって発現させる主な抗原としてSARS-CoV-2の全長Sタンパク質を選択した。発明者は、その発現及び免疫原性を向上させるために、天然のS配列にいくつかの改変を導入した(図21)。第1に、ヒト細胞でのその発現を増加させるために、RNA配列をコドン最適化した。第2に、2P構築物のサブセットを生成するために、発明者はSタンパク質をその融合前コンフォメーションで安定させ、その発現及び免疫原性を増加させるための証明された戦略に従って、S2領域で2つのアミノ酸をプロリンで置換した、K986P及びV987P (Kirchdoerfer、2018; Pallesen、2017; Wrapp、2020)。第3に、MV感染細胞でSタンパク質の表面発現を増加させるために、発明者は、dER構築物を生成するためにS細胞質尾部からC末端の11アミノ酸(aa 1263～1273)を欠失させた。コロナウイルスSタンパク質の細胞質尾部は、1つ又は2つの異なる保持シグナルを含有する:配列番号149のKxHxx又はKKxxモチーフを含む小胞体回収シグナル(ERRS)及びチロシン依存性局在シグナルYxxφ(Ujiker、2016)。ERRSを有するSタンパク質はコートマー複合体I(COPI)へ動員され、ゴルジからERに逆行的に再循環される。したがって、ERとゴルジの間のSタンパク質の反復サイクルはSタンパク質の細胞内保持につながるが、ERRSがない突然変異体Sタンパク質は原形質膜に輸送される(McBride、2007; Ujike、2015)。同様に、Yxxφモチーフを有するアルファコロナウイルスのSタンパク質はERで保持され、Sタンパク質のほとんどは細胞表面へ輸送されない(Schwegmann-Wessels、2004)。したがって、発明者は細胞質尾部から全ての可能性がある保持シグナルが欠失したそれらのSARS-CoV-2 S抗原を設計した。
SARS-CoV-1及びSARS-CoV-2臨床分離株を標的にした広範囲ワクチンを生成する可能性を調査するために、発明者は、S2サブユニット抗原も設計した(図22a)。SARS-CoV-2のS2サブユニットはSARS様CoVの間で高度に保存され、コウモリのSARS様CoV(SL-CoV ZXC21及びZC45)及びヒトSARS-CoV-1のそれらと99%同一性を共有する(Chan、2020)。したがって、発明者はその天然の三量体及び融合前安定化の形態のS2サブユニット抗原を設計し、Sタンパク質のシグナルペプチドは抗原が細胞表面を標的にするようにN末端に挿入した。
全体として、発明者は、4つの異なるSARS-CoV-2 S構築物(図22a)を設計した:1)天然コンフォメーション全長S三量体(SF-dER);2)融合前安定化全長S(SF-2P-dER);3)天然コンフォメーション三量体S2サブユニット(S2-dER);及び4)融合前安定化S2サブユニット(S2-2P-dER)。
SARS-CoV-2 S抗原の発現プロファイル
全長S及びS2配列は先ずpCDNAにクローニングし、HEK293T細胞にトランスフェクトさせて、表面染色と続くフローサイトメトリーとによって発現を検証し、表面タンパク質局在を調査した。融合前安定化S構築物は、トランスフェクトされた細胞の表面により強く局在化することが観察された(図28)。Sタンパク質の機能は、ACE-2を発現するVero細胞に同じpCDNAベクターをトランスフェクトさせることによって分析した。Sタンパク質がACE-2受容体に結合すると、融合タンパク質の活性化は細胞の間での大きなシンシチウムの形成を通して観察することができる。天然のSタンパク質(インタクトなCTを有する全長S)を発現するVero細胞は、かなりのシンシチウム形成を示し(図29)、機能的Sタンパク質は細胞表面で発現されたことを示す。注目すべきことに、SdER突然変異体は天然のSFと比較して増加した融合を誘導し、ERRSを欠失させたときに予想されるSタンパク質の表面発現の増加を確認した。興味深いことに、S2サブユニットだけの発現は、Vero細胞で超過融合表現型をもたらした。これは、融合ペプチドをS2'部位で切断して遊離させるプロテアーゼによる、非受容体媒介膜融合の誘発を示唆する。逆に、2P安定化SF-2P-dER及びS2-2P-dERは、両方ともシンシチウム形成を誘導せず、それらの融合活性が2P突然変異によって抑止されたことを示す。
SARS-CoV-2 S及びS2タンパク質を発現するrMVの生成
4つの抗原性構築物は、追加の転写単位(ATU)でpTM-MVSchwarzプラスミドに個々にクローニングし、ATU2はMVゲノムのP及びM遺伝子の間に位置し、ATU3はHとL遺伝子の間に位置していた(Combredet、2003)(図22a)。MV遺伝子の低下する発現勾配のために、ATU2でのクローニングは抗原の高レベルの発現を可能にするが、ATU3でのクローニングはより低い発現レベルをもたらす(Plumet、2005)。ATU3からのより低い発現は、有毒であるか発現するのが困難である抗原をコードするrMVのレスキューを促進するトレードオフである。
Sタンパク質を発現する全てのrMVはリバースジェネティクスによって首尾よくレスキューされ、Vero細胞でrMVを伝播させた。rMVはわずかに遅い増殖動態を示したが、最終ウイルス収量は高く、親のMV Schwarz(約107 TCID50/ml)のそれと同一だった(図22b)。S抗原の発現は、ウエスタンブロッティング(WB)及び免疫蛍光染色(IF)によって感染Vero細胞で検出された(図22c、d及び図30及び図31)。予想通り、ATU3と比較してATU2ベクターから、はるかにより高い抗原発現が観察された(図22c)。
組換えウイルスベクターをワクチンとして使用する場合、構築物の遺伝子安定性は、それが複数の製造工程の後にワクチンの有効性を保証するので大きな懸念である。Vero細胞での連続継代の後のrMVのそのような分析は、ATU2から天然のSを発現するMV-ATU2-SF-dERが不安定であり、継代5までにS発現が失われることを明らかにした(図32)。対照的に、その2P対応物は、継代10まで安定して効率的に発現された。したがって、発明者は天然のSを発現するワクチン候補を廃棄し、融合前安定化SF-2P及びS2-2P構築物を発現するものを更なる免疫原性研究のために選択した。
マウスにおけるSARS-CoV-2中和抗体の誘導
発明者は、MV感染に感受性のIFNAR-/-マウスにおいて、選択されたrMVワクチン候補の免疫原性を調査した(Mura、2018)。0及び30日目にrMV候補の1×105のTCID50での1、2回の腹腔内投与によって動物を免疫化した(図23a)。対照ワクチン接種のために、空のMV Schwarzを使用した。マウス血清は、初回免疫の4週後及び追加免疫の12日後に収集した。S-及びMV特異的IgG抗体の存在は、SARS-CoV-2 S組換えタンパク質及び天然のMV抗原をそれぞれ使用した間接ELISAによって調査した。
全ての動物は同等の力価での初回免疫の後に全ての群で高いMV特異的IgG抗体を生成し(約104～105のIgG力価)、全ての動物での効率的なワクチン取り込みを示した(図23b)。追加免疫化は全ての群でMV特異的抗体価を増加させ、全ての動物が良好なプライム-ブーストワクチン接種を受けたことを示した。SARS-CoV-2 Sに対する特異的IgG抗体は、免疫化マウスの100%で検出された。興味深いことに、ATU2からSF-2P-dER又はS2-2P-dER抗原を発現するrMVは、特に追加免疫後にATU3ベクターより高いレベルの抗S抗体を惹起した(図23c)。免疫前血清及び空のMVを受けた対照動物からの血清は、抗S抗体に関して陰性のままだった(データ示さず)。
発明者は次にプラーク低減中和試験(PRNT)をVero E6単層のSARS-CoV-2ウイルス感染と使用して、SARS-CoV-2中和抗体(NAb)の存在を調査した。初回免疫の後、SARS-CoV-2 NAbはATU3構築物で免疫化された1匹のマウスだけ以外の、ATU2から発現されるSF-2P-dERで免疫化された全てのマウスで見出された(図23d)。第2の免疫化の後、NAb力価は両方の群で増加し、ATU2群はATU3群と比較して10倍より高いNAb力価を示した。高レベルの抗S抗体にもかかわらず、S2候補で免疫化された動物でNAbは検出されなかった(図23c)。
IgGアイソタイプスイッチングは、Th1及びTh2応答の間接的な指標の役割を果たすことができるので(Finkelman、1990)、発明者は、免疫化マウスの血清においてS特異的IgG1及びIgG2aアイソタイプ力価を決定した(図23f、g)。発明者からの以前の結果に類似して(Escriou、2014)、rMV候補はIgG1より有意に高いIgG2a抗体価を惹起し、支配的なTh1型免疫応答を反映した(図23f、g)。Th1及びTh2サイトカイン生成を形作る上で活性化T細胞は重要な役割を演ずるので、発明者はMV免疫化マウスにおいてS特異的T細胞応答を更に詳細に分析した。
S特異的T細胞応答の誘導
IFN-γELISPOTアッセイを使用して、免疫化によって惹起された細胞性免疫応答を先ず調査した。IFNAR-/-マウスの群は、初回免疫化の1週間後に屠殺した(図24a)。S特異的応答を評価するために、129sv IFNAR-/-マウスのMHC-I H-2Kb/H-2Db及びMHC-II I-Abハプロタイプに一致する、SARS-CoV-2 Sタンパク質の予測されたCD8+及びCD4+ T細胞エピトープをカバーする合成ペプチドのプールで脾細胞をex vivoで刺激した(Table 6A(表10)及びTable 6B(表11))。MVベクター特異的T細胞応答を検出するために、脾細胞を空のMVウイルスでも刺激した。
SARS-CoV-2 S及びMVへの高レベルのT細胞応答は、初回ワクチン接種後の早期に惹起された(図24)。MV-ATU2-SF-2P-dERでワクチン接種をしたマウスからの脾細胞は、MHCクラスI制限Sペプチドプールによる刺激の後に著しく高いIFN-γ分泌レベルを与え、106の脾細胞あたりおよそ2,500のスポット形成細胞(SFC)を与えた。概ね400SFC/106脾細胞のMHCクラスII制限Sペプチドによる刺激の後、より低いIFN-γ応答が観察された(図24b、c)。これらのマウスの脾細胞は比較的低いベクター特異的IFN-γ応答(約990SFC/106脾細胞)も示し、バランスのとれたS対MVベクター応答比を示した(図24d)。同じワクチンのATU3対応物は、より多くのベクター特異的IFN-γ分泌細胞(約1,320SFC/106脾細胞)を生成する傾向があったが、同時に、MHCクラスII制限Sペプチドによる刺激の後のS特異的IFN-γ分泌細胞の生成においては効率が劣っていた(約130SFC/106脾細胞)。MHCクラスI制限Sペプチドによる刺激の後のIFN-γ応答は、そのATU2対応物のそれらと有意に異ならなかったが(約1,980SFC/106脾細胞)、S対MVベクター応答比はMV-ATU2-SF-2P-dERで有意により高かった(図24b)。
対照的に、Sペプチドプールのいずれかによる刺激の後には、S2のみの構築物によって惹起されたS特異的IFN-γ応答は低かった(図24c、d)。これらの動物ではS対MVベクター応答比も非常に低いままであり、S2タンパク質サブユニットだけによる免疫化は強力な防御的細胞性免疫応答を誘導するのに十分でないかもしれないことを示唆した(図24e、f)。MV-ATU3-S2-2P-dER及び空のMVは、S特異的IFN-γ応答を誘導することができなかった。
発明者は、細胞内サイトカイン染色(ICS)の後、フローサイトメトリー分析によってS特異的CD4+及びCD8+ T細胞を次に試験した。S特異的IFN-γ+及びTNF-α+応答がCD8+ T細胞で観察されたが、CD4+ T細胞はSペプチドプール刺激への応答が劣っていた(図25a、b)。ELISPOT結果に類似して、ATU2又はATU3から発現されたSF-2P-dERは、著しく高くて同等のパーセンテージのS特異的IFN-γ+及びTNF-α+ CD8+ T細胞を誘導したが、ATU2から発現されたS2タンパク質の免疫原性は10分の1であった。MV-ATU3-S2-2P-dER及び空のMVは、S特異的IFN-γ又はTNF-α産生T細胞を誘導することができなかった。IL-5分泌細胞(Th2に偏った応答の指標)は、免疫化群のいずれでも検出されなかった。MV-ATU2-SF-2P-dERで免疫化されたマウスにおけるT細胞応答の追加の詳細な分析は、高レベルのS特異的IFN-γ+及びTNF-α+産生CD8+ T細胞、並びに二重陽性IFN-γ+/TNF-α+産生CD8+ T細胞によるCD8コンパートメントの強力な刺激を確認した。CD4+又はCD8+ T細胞で、並びにCD4+/CD44+/CD62L-記憶T細胞では、IL-5もIL-13も検出されず、S特異的記憶T細胞もTh1指向であることを確認した(図33)。
まとめると、これらの結果はMV-ATU2-SF-2P-dERがSARS-CoV-2 S抗原に対してMV-ATU3-SF-2P-dERより有意に高いレベルで頑強なTh1作動T細胞免疫応答を誘導することを実証する。S2候補は、NAbレベルで以前に観察されたように、はるかにより低い細胞性応答を惹起し、S2だけではこれらのマウスにおいて効率的な免疫応答を誘導するのに十分でないことを示した。したがって、発明者は更なる分析からS2候補を排除した。
中和抗体の持続性及び鼻腔内抗原投与からの防御
発明者はMV-ATU2-SF-2P-dER又はMV-ATU3-SF-2P-dERで2回免疫化したマウスにおいて抗S抗体の持続性をモニタリングした(図26a)。MV応答において通常観察されるように(図26b)、追加免疫から最高3ヶ月間、ATU2及びATU3候補の両方においてS特異的IgG力価は高いレベル(105～106の限界希釈力価)で持続し、安定していた(図26c)。しかし、ATU2構築物による免疫化は、実験の持続期間にわたって有意により高いレベルのS特異的IgG及びNAb力価(103～104の限界希釈力価)をもたらした(図26d)。
これらの応答がSARS-CoV-2感染からの防御を付与するかどうか決定するために、免疫化マウスに1.5×105PFUのMACo3、マウス適合SARS-CoV-2ウイルスを鼻腔内に抗原投与した。抗原投与の3日後にマウスを屠殺し、ウイルスの存在を肺ホモジネートにおいて検査した。SARS-CoV-2 RNAは、RdRP遺伝子特異的プライマー(プロトコル、Institut Pasteur、2020)を使用したRT-qPCRによって測定し(Table 5A-5C(表7～9))、感染性ウイルスのレベルをVero E6細胞で滴定した。SARS-CoV-2ウイルスRNAは、抗原投与後の全ての免疫化マウスの肺で検出され、空のMV対照群と比較してATU2群は平均2log10の低減を示し、ATU3群は1log10の低減を示した(図26e)。しかし、ATU2群及びATU3群の1匹以外の全ての肺で感染性ウイルスは検出されなかった(図26f)。これらの結果は、ウイルス複製は低レベルで発生したが、接種した子孫ウイルスの感染性が効率的に中和されたことを実証する。
単回免疫化の後の鼻腔内抗原投与からの部分的防御
発明者は、単回免疫化がIFNAR-/-マウスをMACo3ウイルスによる抗原投与から保護することができるかどうか次に決定した(図27a)。免疫化動物は免疫化から28及び48日目に、抗原投与の前に免疫応答について検査した。全ての動物は、MV及びS特異的抗体を示した(図27b、c)。S抗原並びにSARS-CoV-2 NAbへのTh1関連のIgG応答は、抗原投与の前に存在していたが、2回の免疫化の後より低いレベルであった(図27d、e)。マウスは次に鼻腔内に抗原投与し、抗原投与の3日後に肺試料を収集した。試験及び対照群の間にウイルスRNAレベルの差は観察されなかったが(図27f)、MV-ATU2-SF-2P-dERで免疫化した動物の半分は肺における感染性ウイルスに陰性であって(図27g)、単回投与の後でさえも部分的防御を示していた。対照的に、MV-ATU3-SF-2P-dERで免疫化した動物は、単回投与の後に防御されなかった。しかしプライム/ブーストの後、両方の構築物は防御的であることが見出された(図26)。
3.考察
ここで、発明者は、SARS-CoV-2 Sタンパク質を標的にしたMVをベースとしたCOVID-19ワクチン候補の開発及び試験を報告した。他のワクチンプラットホームに類似して、全長融合前安定化Sは最も免疫原性であり、最強の体液性及び細胞性応答を惹起した。それらのリード候補MV-ATU2-SF-2P-dERは、SARS-CoV-2への高レベルの中和抗体及び強力なTh1指向T細胞応答を惹起した。プライム-ブースト免疫化は、マウス適合SARS-CoV-2ウイルスによる鼻腔内抗原投与からの防御を与えた。更に、NAb力価は免疫化から数ヶ月間持続した-そのような持続性の免疫は複製型ベクターワクチンの特質である(Amanna、2007)。ウイルス量及びウイルス拡散の制御及び低減に必須である(Rydyznski、2020)T細胞応答は、単回免疫化の7日後に誘導された。注目すべきことに、SARS-CoV-1及びMERS-CoVワクチン研究について以前に報告されている通り(Roberts、2010; Luo、2018;Qin、2006; Niu、2018; Zhang、2016)、Th1応答の優勢は、これらのワクチン候補がワクチン誘導疾患増強による免疫病理を誘導しそうにないことを示唆した。更に、単回免疫化の後、それらのリード候補MV-ATU2-SF-2P-dERは、少なくとも50%のCOVID-19ワクチンの一次有効性のためのWHO勧告(Considerations for evaluation of COVID19、WHO、2020)による十分な免疫防御も提供した。これは、それらのリードワクチン候補がSARS-CoV-2の感染及び疾患から防御することができることを示唆する。
広範囲ワクチンを生成する可能性を探るために、発明者は、SARS-CoV-1及びSARS-CoV-2ウイルスの間で高度に保存されているS2サブユニットだけを発現するワクチン候補も試験した。S2サブユニットは免疫優勢及び中和エピトープを持つことが示されている(Zhang、2004;He、2004; Wang、2020)。この報告書では、MV状況でのS2は高いS特異的抗体価を誘導したが、これらの抗体はSARS-CoV-2ウイルスを中和できなかった。細胞性応答に関して、S2はS特異的CD4+も、CD8+もIL-5+ T細胞応答も誘導しなかった。これらの観察は、S2サブユニットだけでは免疫防御を誘導するのに不十分であることを示唆した。非中和抗体の高い力価を考慮すると、SARS-CoV-2感染への免疫応答におけるそれらの役割を特徴付けること、及びそれらが免疫病理に寄与することができるかどうか調査することは興味深いだろう。
発明者の結果は、ATU2対ATU3から標的抗原を発現するrMVワクチンの免疫原性において、興味深い差も与えた。S抗原はATU2からより高いレベルで発現され、これはより高い体液性及び細胞性の応答と相関した。ATU2候補の免疫化用量を1×104のTCID50に低減しても、1×105のTCID50のATU3ワクチンより高いNAb力価をなお誘導した(図34)。更に、MVベクターへのT細胞応答もATU2構築物でより低かった。これらの観察は、より高い抗原発現がin vivoでウイルス複製を低減することができ、ベクター自体へのより低い細胞性応答をもたらすことを示唆した。MVワクチンはベクターへの既存の免疫にもかかわらず有効であることが示されているが、抗原及びベクターの免疫原性におけるこのより望ましい平衡は、ATU2構築物のより大きなワクチン有効性にたぶん寄与する。それにもかかわらず、将来のワクチンのためのrMVビヒクルとして、不安定であるか、有毒であるか、さもなければ発現させるのが困難である抗原を発現させるために、ATU3概念はなお有益である。
［参考文献］
Figure 2023513913000071
Figure 2023513913000072
Figure 2023513913000073
Figure 2023513913000074
Figure 2023513913000075

Claims (63)

  1. (1)麻疹ウイルス(MV)の弱毒化株の全長のアンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
    (2)(a)配列番号3のSARS-CoV-2のスパイク(S)タンパク質、又は
    (b)配列番号11のS1ポリペプチド、配列番号13のS2ポリペプチド、配列番号7のSectoポリペプチド及び配列番号16のトリSectoポリペプチドからなる群から選択される、(a)における全長Sタンパク質の免疫原性断片、又は
    (c)1～10アミノ酸が挿入、置換、又は欠失によって改変されている(a)若しくは(b)のバリアント
    をコードする第1の異種ポリヌクレオチド
    を含む核酸構築物。
  2. (c)におけるバリアントが、
    (i)発現された全長Sタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する突然変異、及び/又は
    (ii)Sタンパク質のフューリン切断部位を不活性化する突然変異、及び/又は
    (iii)小胞体回復シグナル(EERS)を不活性化する突然変異、及び/又は
    (iv)Sタンパク質のS1ドメインに位置する受容体結合ドメイン(RBD)を閉じたコンフォメーションに維持する突然変異
    を含むポリペプチドをコードし、
    第1の異種ポリヌクレオチドが、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置された追加の転写単位(ATU)(ATU2)に、又はMVのH遺伝子の下流に配置されたATU(ATU3)に置かれている、請求項1に記載の核酸構築物。
  3. (i)発現された全長Sタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する突然変異が、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の986位及び987位における2つのプロリン残基の置換による突然変異(K986P及びV987P)、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の817位、892位、899位、942位、986位及び987位における6つのプロリン残基の置換による突然変異(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P及びV987P)であり、及び/又は
    (ii)Sタンパク質のフューリン切断部位を不活性化する突然変異が、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の682位、683位及び685位におけるS1/S2フューリン切断部位で生じる3つのアミノ酸残基の置換による突然変異(R682G、R683S及びR685G)であるか、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質の675位におけるアミノ酸と685位におけるアミノ酸との間のS1/S2フューリン切断部位を取り囲むループの欠失による突然変異であり、ループは、配列番号50のアミノ酸配列QTQTNSPRRARからなり、及び/又は
    (iii)EERSを不活性化する突然変異が、配列番号3のアミノ酸配列の1269位及び1271位における2つのアラニン残基の置換による突然変異であり、及び/又は
    (iv)閉じたコンフォメーションに、Sタンパク質のS1ドメインに位置するRBDを維持する突然変異が、配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の383位及び985位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(S383C及びD985C)であるか、又は配列番号3のSARS-CoV-2のSタンパク質のアミノ酸配列の413位及び987位における2つのシステイン残基の置換による突然変異(G413C及びP987C)であり;及び/又は
    (v)(c)におけるバリアントが、配列番号3のアミノ酸配列の69位及び70位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の144位及び145位におけるアミノ酸残基の欠失、配列番号3のアミノ酸配列の501位におけるチロシン残基の置換による突然変異(N501Y)、配列番号3のアミノ酸配列の570位におけるアスパラギン酸残基の置換による突然変異(A570D)、配列番号3のアミノ酸配列の681位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(P681H)、配列番号3のアミノ酸配列の716位におけるイソロイシン残基の置換による突然変異(T716I)、配列番号3のアミノ酸配列の982位におけるアラニン残基の置換による突然変異(S982A)、配列番号3のアミノ酸配列の1118位におけるヒスチジン残基の置換による突然変異(D1118H)、配列番号3のアミノ酸配列の484位におけるリシン残基の置換による突然変異(E484K)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるアスパラギン残基の置換による突然変異(K417N)、配列番号3のアミノ酸配列の417位におけるスレオニン残基の置換による突然変異(K417T)、及び配列番号3のアミノ酸配列の614位におけるグリシン残基の置換による突然変異(D614G)からなる群から選択される突然変異を含むポリペプチドをコードする、請求項2に記載の核酸構築物。
  4. ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド又はNポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、マトリックス(M)ポリペプチド又はMポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、Eポリペプチド又はEポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、8aポリペプチド又は8aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、7aポリペプチド又は7aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、3Aポリペプチド又は3aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、及びそれらの免疫原性断片からなる群から選択される少なくとも1つのSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドを更に含み、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  5. 第1の異種ポリヌクレオチドが、配列番号5、7、9、15、17、19、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62及び65からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  6. 第2の異種ポリヌクレオチドが、配列番号22のNポリペプチド、配列番号24のMポリペプチド又はそのエンドドメイン、配列番号23のEポリペプチド、配列番号25のORF8ポリペプチド、配列番号27のORF7aポリペプチド、及び配列番号26のORF3aポリペプチドのうちの少なくとも1つをコードする、請求項4に記載の核酸構築物。
  7. 第1の異種ポリヌクレオチドが、
    i. Sポリペプチドをコードする配列番号1又は2又は36、
    ii. S1ポリペプチドをコードする配列番号10、
    iii. S2ポリペプチドをコードする配列番号12、
    iv. stab-Sポリペプチド(S2P)をコードする配列番号4、
    v. Sectoポリペプチドをコードする配列番号6、
    vi. stab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号8、
    vii. stab-S2ポリペプチドをコードする配列番号14、
    viii. トリSectoポリペプチドをコードする配列番号16、
    ix. tristab-Sectoポリペプチドをコードする配列番号18、
    x. S3Fポリペプチドをコードする配列番号42、
    xi. S2P3Fポリペプチドをコードする配列番号44、
    xii. S2PΔFポリペプチドをコードする配列番号46、
    xiii. S2PΔF2Aポリペプチドをコードする配列番号48、
    xiv. T4-S2P3Fポリペプチド(tristab-Secto-3F)をコードする配列番号51、
    xv. S6Pポリペプチドをコードする配列番号53、
    xvi. S6P3Fポリペプチドをコードする配列番号55、
    xvii. S6PΔFポリペプチドをコードする配列番号57、
    xviii. SCCPPポリペプチドをコードする配列番号59、
    xix. SCC6Pポリペプチドをコードする配列番号61、
    xx. SMVopt2Pポリペプチドをコードする配列番号63、
    xxi. SMVoptΔFポリペプチドをコードする配列番号64、及び
    xxii. SMVopt2PΔFポリペプチドをコードする配列番号66
    からなる群から選択されるオープンリーディングフレームを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  8. 5'から3'末端に、以下のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド:
    (a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (c)請求項1から3、4及び6のいずれか一項に規定の第1の異種ポリヌクレオチド;
    (d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を含むcDNA構築物であって、
    ポリヌクレオチドが、核酸構築物内に作動可能に連結されており、ウイルス複製及び転写調節エレメント、例えばMVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある、請求項1から7のいずれか一項に記載のcDNA構築物。
  9. (a)弱毒化MV株の、特にSchwarz株又はMoraten株の全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに隣接して、核酸構築物の5'末端に、GGGモチーフ、続いてハンマーヘッド型リボザイム配列、及び
    (b)全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接して、組換えMV-CoV核酸分子の3'末端に、リボザイムのヌクレオチド配列、特にデルタ型肝炎ウイルスリボザイム(δ)の配列
    を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  10. 第2の異種ポリヌクレオチドが、SARS-CoV-2のNポリペプチドをコードし、第2の異種ポリヌクレオチドは、第1の異種ポリヌクレオチドをクローニングするのに使用されるATUと異なる位置のATU中にクローニングされる、請求項4から9のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  11. (i)第1の異種ポリヌクレオチドが、配列番号36、配列番号63、配列番号64及び配列番号66からなる群から選択される配列を含み、ATU2内に置かれているか、又は
    (ii)第1の異種ポリヌクレオチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59及び配列番号61からなる群から選択される配列を含み、ATU3内に置かれている、請求項1から10のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  12. (i)第1の異種ポリヌクレオチドが、ATU3内に置かれており、第2の異種ポリヌクレオチドは、ATU2内に置かれているか、又は
    (ii)第1の異種ポリヌクレオチドが、ATU2内に置かれており、第2の異種ポリヌクレオチドは、ATU3内に置かれている、請求項4から10のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  13. 麻疹ウイルスが、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、CAM-70株、TD97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株である、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  14. 請求項1から13のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、組換え麻疹ウイルス(MV)のレスキューのためのトランスファーベクター。
  15. i.配列番号1又は2又は36(構築物S)、
    ii.配列番号4(構築物stab-S)、
    iii.配列番号6(構築物Secto)、
    iv.配列番号8(構築物stab-Secto)、
    v.配列番号10(構築物S1)、
    vi.配列番号12(構築物S2)、
    vii.配列番号14(構築物stab-S2)、
    viii.配列番号16(構築物トリSecto)、
    ix.配列番号18(構築物tristab-Secto)、
    x.配列番号42(構築物S3F)、
    xi.配列番号44(構築物S2P3F)、
    xii.配列番号46(構築物S2PΔF)、
    xiii.配列番号48(構築物S2PΔF2A)、
    xiv.配列番号21又は37(構築物N)、
    xv.配列番号51(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
    xvi.配列番号53(構築物S6P)、
    xvii.配列番号55(構築物S6P3F)、
    xviii.配列番号57(構築物S6PΔF)、
    xix.配列番号59(構築物SCCPP)、
    xx.配列番号61(構築物SCC6P)、
    xxi.配列番号63(構築物SMVopt2P)、
    xxii.配列番号64(構築物SMVoptΔF)、及び
    xxiii.配列番号66(構築物SMVopt2PΔF)
    からなる群から選択されるSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする配列を含むトランスファーベクター。
  16. Schwarz株の組換え麻疹ウイルスであって、そのゲノム中に、それに作動可能に連結された発現カセットを含み、発現カセットは、請求項1から13のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、組換え麻疹ウイルス。
  17. SARS-CoV-2株のN、M、E、ORF7a、ORF8及びORF3a、並びにそれらの免疫原性断片から選択される少なくとも1つのポリペプチドを更に発現する、請求項16に記載の組換え麻疹ウイルス。
  18. (i)有効量の請求項16又は17に記載の組換え麻疹ウイルス、及び(ii)医薬的に許容されるビヒクルを含む免疫原性組成物又はワクチンであって、単回の免疫化後に、動物宿主において、SARS-CoV-2のポリペプチドに対する中和体液性応答及び/又は細胞応答を惹起する組成物又はワクチン。
  19. それを必要とする宿主においてSARS-CoV-2に対する防御的な体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を惹起することにおける使用のための、請求項18に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  20. SARS-CoV-2の、請求項1から3、4及び6のいずれか一項に規定の第1の異種ポリヌクレオチドによってコードされたSARS-CoV-2のポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスをレスキューするための方法であって、
    (a)T7 RNAポリメラーゼ並びに麻疹ウイルスN及びPタンパク質を安定して発現するヘルパー細胞に、(i)請求項1から13のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項13又は14に規定のプラスミドベクター、及び(ii)MV Lポリメラーゼをコードするベクターをコトランスフェクトする工程;
    (b)トランスフェクトされた細胞を、組換え麻疹ウイルスの生産に好適な条件で維持する工程;
    (c)組換え麻疹ウイルスの伝播を可能にする細胞を、工程(b)のトランスフェクトされた細胞と共培養することによってそれらを感染させる工程;及び
    (d)組換え麻疹ウイルスを回収する工程
    を含む方法。
  21. i.配列番号1又は2又は36(構築物S);
    ii.配列番号4(構築物stab-S);
    iii.配列番号6(構築物Secto);
    iv.配列番号8(構築物stab-Secto);
    v.配列番号10(構築物S1)、
    vi.配列番号12(構築物S2)、
    vii.配列番号14(構築物stab-S2)、
    viii.配列番号16(構築物トリSecto)、
    ix.配列番号18(構築物tristab-Secto)、
    x.配列番号42(構築物S3F)、
    xi.配列番号44(構築物S2P3F)、
    xii.配列番号46(構築物S2PΔF)、
    xiii.配列番号48(構築物S2PΔF2A)、
    xiv.配列番号21又は37(構築物N)、
    xv.配列番号51(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
    xvi.配列番号53(構築物S6P)、
    xvii.配列番号55(構築物S6P3F)、
    xviii.配列番号57(構築物S6PΔF)、
    xix.配列番号59(構築物SCCPP)、
    xx.配列番号61(構築物SCC6P)、
    xxi.配列番号63(構築物SMVopt2P)、
    xxii.配列番号64(構築物SMVoptΔF)、及び
    xxiii.配列番号66(構築物SMVopt2PΔF)
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む核酸分子。
  22. i.配列番号3(構築物S);
    ii.配列番号5(構築物stab-S);
    iii.配列番号7(構築物Secto);
    iv.配列番号9(構築物stab-Secto);
    v.配列番号11(構築物S1)、
    vi.配列番号13(構築物S2)、
    vii.配列番号15(構築物stab-S2)、
    viii.配列番号17(構築物トリSecto)、
    ix.配列番号19(構築物tristab-Secto)、
    x.配列番号43(構築物S3F)、
    xi.配列番号45(構築物S2P3F)、
    xii.配列番号47(構築物S2PΔF)、
    xiii.配列番号49(構築物S2PΔF2A)、
    xiv.配列番号22(構築物N)、
    xv.配列番号52(構築物T4-S2P3F(tristab-Secto-3F))、
    xvi.配列番号54(構築物S6P)、
    xvii.配列番号56(構築物S6P3F)、
    xviii.配列番号58(構築物S6PΔF)、
    xix.配列番号60(構築物SCCPP)、
    xx.配列番号62(構築物SCC6P)、及び
    xxi.配列番号65(構築物SMVoptΔF)
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド 。
  23. 請求項14又は15に記載のトランスファーベクターによって発現された、精製のためのアミノ酸タグを更に含む組換えタンパク質。
  24. 請求項14又は15に記載のトランスファーベクターによって、in vitro又はin vivoで発現された組換えタンパク質。
  25. SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル中の抗原に対する抗体の存在の検出のための、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、22、23、24、25、26、27、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62及び65のいずれか1つの配列を有する抗原のin vitroにおける使用であって、ポリペプチドを生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する、使用。
  26. ヒト宿主におけるSARS-CoV-2による感染を処置又は防止するための方法であって、請求項18に記載の免疫原性組成物又はワクチンを宿主に投与する工程含む方法。
  27. 宿主においてSARS-CoV-2に対する防御免疫応答を誘導するための方法であって、請求項18に記載の免疫原性組成物又はワクチンを宿主に投与する工程を含む方法。
  28. 免疫原性組成物の第1の投与及び免疫原性組成物の第2の投与を含む、請求項26又は27に記載の方法。
  29. 第2の投与が、第1の投与後の1ヶ月から2ヶ月の間に実行される、請求項28に記載の方法。
  30. (1)麻疹ウイルス(MV)の弱毒化株の全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
    (2)配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基の配列中に、挿入、置換、又は欠失を含むSARS-CoV-2のSタンパク質又はその免疫原性断片をコードする第1の異種ポリヌクレオチド
    を含む核酸構築物であって、
    挿入、置換、又は欠失は、Sタンパク質又はその免疫原性断片の細胞表面発現を増加させ、
    第1の異種ポリヌクレオチドは、MVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置された追加の転写単位(ATU)(ATU2)、又はMVのH遺伝子の3'に配置されたATU(ATU3)に置かれている、核酸構築物。
  31. Sタンパク質又はその免疫原性断片が、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基配列に置換を含む、請求項30に記載の核酸構築物。
  32. Sタンパク質又はその免疫原性断片が、配列番号3のアミノ酸配列の1263位～1273位とアライメントされる、Sタンパク質の11アミノ酸残基配列の全部又は一部の欠失を含む、請求項30に記載の核酸構築物。
  33. コードされたSタンパク質又はその免疫原性断片が、発現されたSタンパク質をその融合前のコンフォメーションに維持する、1つ又は複数の追加の置換を更に含む、請求項30から32のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  34. コードされたSタンパク質又はその免疫原性断片が、配列番号3のアミノ酸配列のK986位及びV987位に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換K986P及びV987Pを更に含む、請求項33に記載の核酸構築物。
  35. コードされたSタンパク質又はその免疫原性断片が、二重ドメインSタンパク質である、請求項30から34のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  36. 第1の異種ポリヌクレオチドが、ATU2に置かれている、請求項30から35のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  37. 第1の異種ポリヌクレオチドが、
    (a)配列番号76の融合前安定化SF-2P-dERポリペプチド、又は986位及び987位で変更されていない、配列番号76と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;又は
    (b)配列番号82の融合前安定化SF-2P-2aポリペプチド、又は986位、987位、1269位、及び1271位において変更されていない、配列番号82と少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント
    をコードする、請求項30から36のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  38. 第1の異種ポリヌクレオチドが、
    (a)配列番号76の融合前安定化SF-2P-dERポリペプチド;又は
    (b)配列番号82の融合前安定化SF-2P-2aポリペプチド
    をコードする、請求項37に記載の核酸構築物。
  39. 第1の異種ポリヌクレオチドが、SF-2P-dERポリペプチドをコードする配列番号75、又はSF-2P-2aポリペプチドをコードする配列番号81を含む、請求項38に記載の核酸構築物。
  40. 第1の異種ポリヌクレオチドが、SF-2P-dERポリペプチドをコードする配列番号75を含む、請求項39に記載の核酸構築物。
  41. ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド又はNポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;マトリックス(M)ポリペプチド又はMポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;Eポリペプチド又はEポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;8aポリペプチド又は8aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;7aポリペプチド又は7aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント;3Aポリペプチド又は3aポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するそのバリアント、それらの免疫原性断片からなる群から選択される少なくとも1つのSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドを更に含み、第2の異種ポリヌクレオチドが、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている、請求項30から40のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  42. ヌクレオカプシド(N)ポリペプチド;マトリックス(M)ポリペプチド;Eポリペプチド;8aポリペプチド;7aポリペプチド;3Aポリペプチド;及びそれらの免疫原性断片からなる群から選択される少なくとも1つのSARS-CoV-2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドを更に含み、第2の異種ポリヌクレオチドが、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている、請求項30から40のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  43. 第2の異種ポリヌクレオチドが、Nポリペプチドをコードし、第2の異種ポリヌクレオチドが、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている、請求項42に記載の核酸構築物。
  44. 第2の異種ポリヌクレオチドが、配列番号22のNポリペプチド、配列番号24のMポリペプチド又はそのエンドドメイン、配列番号23のEポリペプチド、配列番号25のORF8ポリペプチド、配列番号27のORF7aポリペプチド及び/又は配列番号26のORF3aポリペプチドのうちの少なくとも1つをコードし、第2の異種ポリヌクレオチドが、第1の異種ポリヌクレオチドのATUと異なる位置の追加の転写単位(ATU)内に置かれている、請求項30から40のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  45. 第2の異種タンパク質が、MVのN遺伝子上流であるATU(ATU1)内であるか、MVのP遺伝子とM遺伝子の間のATU(ATU2)内であるか、又はMVのH遺伝子とL遺伝子との間のATU(ATU3)内である、請求項41から44のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  46. 5'から3'に、以下のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド:
    (a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (c)第1の異種ポリヌクレオチド;
    (d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を更に含み、
    ポリヌクレオチドは、核酸構築物内に作動可能に連結されており、MVリーダー及びトレーラー配列の制御下にあり、T7プロモーターとT7ターミネーターとのフレーム内にあり、組換えMV-CoV発現カセットが提供されるように、ベクター中にクローニングするのに好適な制限酵素部位のフレーム内にある、請求項30から45のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  47. (a)弱毒化MV株の全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに隣接して、核酸構築物の5'末端に、GGGモチーフ、続いてハンマーヘッド型リボザイム配列;及び
    (b)弱毒化MV株の全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接して、核酸構築物の3'末端に、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム(δ)のヌクレオチド配列
    を更に含む、請求項30から45のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  48. 麻疹ウイルスが、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham16株、CAM-70株、TD97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株、及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株である、請求項30から47のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  49. 麻疹ウイルスが、Schwarz株である、請求項48に記載の核酸構築物。
  50. 請求項30から49のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、配列番号29又は配列番号38であるプラスミドベクター。
  51. 請求項30から49のいずれか一項に記載の核酸構築物をそのゲノムに含む組換え麻疹ウイルス。
  52. 請求項51に記載の組換え麻疹ウイルス及び医薬的に許容されるビヒクルを含む免疫原性組成物。
  53. 対象においてSARS-CoV-2ウイルスに対する免疫応答を誘導することにおける使用のための、請求項51に記載の組換え麻疹ウイルス又は請求項52に記載の免疫原性組成物。
  54. 対象におけるSARS-CoV-2による感染を防止又は処置するための方法であって、請求項52に記載の免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む方法。
  55. 対象におけるSARS-CoV-2ウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、請求項52に記載の免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む方法。
  56. 免疫原性組成物の第1の投与及び免疫原性組成物の第2の投与を含む、請求項54又は55に記載の方法。
  57. 第2の投与が、第1の投与後の1ヶ月から2ヶ月の間に実行される、請求項56に記載の方法。
  58. 請求項51に記載の組換え麻疹ウイルスをレスキューするための方法であって、
    (a)T7 RNAポリメラーゼ並びに麻疹ウイルスN及びPタンパク質を安定して発現するヘルパー細胞に、(i)請求項30から49のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項50に記載の核酸構築物を含むプラスミドベクター、及び(ii)MV Lポリメラーゼをコードするベクターをコトランスフェクトする工程;
    (b)トランスフェクトされたヘルパー細胞を、組換え麻疹ウイルスの生産に好適な条件で維持する工程;
    (c)組換え麻疹ウイルスの伝播を可能にする細胞を、工程(b)のトランスフェクトされたヘルパー細胞と共培養することによってそれらを感染させる工程;及び
    (d)組換え麻疹ウイルスを回収する工程
    を含む方法。
  59. 配列番号75のポリヌクレオチドを含む核酸分子(構築物SF-2P-dER)又は配列番号81のポリヌクレオチドを含む核酸分子(構築物SF-2P-2a)。
  60. 配列番号76のアミノ酸配列を有するポリペプチド(構築物SF-2P-dER)又は配列番号82のアミノ酸配列を有するポリペプチド(構築物SF-2P-2a)。
  61. SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から事前に得た生物学的サンプル中の抗原に対する抗体の存在の検出のための、請求項60に記載のポリペプチドの抗原のin vitroにおける使用であって、ポリペプチドを生物学的サンプルと接触させて、抗原に対する抗体の存在を決定する、使用。
  62. 生物学的サンプルを、請求項60に記載のポリペプチドと接触させる工程、及び生物学的サンプル中に存在する抗体と、ポリペプチドとの抗体-抗原複合体の形成を検出する工程を含む方法。
  63. 生物学的サンプルが、SARS-CoV-2に感染している疑いのある個体から得られる、請求項62に記載の方法。
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