CN116785422B - 含有新型冠状病毒联合抗原的麻疹减毒疫苗及其拯救方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有新型冠状病毒联合抗原的麻疹减毒疫苗及其拯救方法。该疫苗能引发针对新冠病毒和麻疹病毒的免疫应答和保护,所述新型冠状病毒联合抗原是新冠病毒的S蛋白和N蛋白的联合抗原,其中,S蛋白是具有K986P、V987P突变的C末端截短的S蛋白;该新型冠状病毒联合抗原的编码基因被克隆在减毒麻疹疫苗病毒的P基因和M基因之间。本发明首次实现了在麻疹病毒疫苗载体上利用新冠病毒的S蛋白和N蛋白作为联合免疫抗原的疫苗新策略,可以更好地引起机体T细胞免疫;本发明的病毒拯救方法不需要额外构建辅助细胞系等即可进行拯救,简化了疫苗生产,而且具有良好的安全性和稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种含有新型冠状病毒联合抗原的活麻疹病毒载体疫苗及其拯救方法。
背景技术
疫苗是应对传染病最为有效的武器,我国现有新冠疫苗以灭活疫苗、S蛋白亚单位疫苗以及腺病毒载体疫苗为主,对于预防重症和死亡有效,但存在免疫持久性差和缺乏黏膜免疫,对预防感染效果不佳。
麻疹减毒活疫苗(MeV)是一种基于对野生病毒株进行连续传代而得到的减毒活病毒株,该疫苗已有很长的使用历史,被认为是目前最安全、最有效的人用疫苗之一。国内外使用至今的主要麻疹疫苗株有:欧洲的Sehwarz株、美国的Moraten株、俄罗斯等东欧国家的Leningrad-16(L-l6)株和我国的“沪191(Shanghai-191)”株。“沪191”是我国第一株麻疹减毒活株,在临床上反应适中,免疫性良好,可产生持久的免疫记忆反应。其作为生产母株生产的麻疹减毒活疫苗至今已在我国应用超过20亿剂,是世界上产量最大的疫苗株之一。
大量研究已经证明麻疹病毒基因组能容纳较长的外源基因,将抗原编码基因整合到重组麻疹病毒后,可实现外源基因和MeV基因组的共同表达。结合MeV能诱导机体产生长期的体液免疫、黏膜免疫以及细胞免疫应答,且具有出色的安全性,重组MeV构成了理想的疫苗平台。MMR疫苗(MeV、mumps和rubella疫苗)已经是我国儿童免疫规划接种的一个重要。
发明内容
本发明的目的是开发一种含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗,以实现接种一种疫苗产生两种保护,同时预防麻疹和新冠感染的技术效果。
为了实现上述技术目的,本发明提供了一种可快速产生含有新型冠状病病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗株的制备方法。
(一)新型冠状病毒的抗原设计
新型冠状病毒的刺突蛋白(S)具有更高的免疫原性,因此选择了包含S1结构域和S2结构域且含有跨膜结构域的SARS-CoV-2的S蛋白作为MV病毒载体表达的抗原之一。为了改善其表达水平,本发明对天然S蛋白的序列进行了人源密码子优化,并在S2结构域中增加两个脯氨酸突变(K986P、V987P)以保持S蛋白融合前构象(preS)的稳定性。同时,为了增加在重组麻疹病毒感染的细胞中S蛋白的细胞膜表面表达,本发明从S蛋白细胞质尾部(CT)中删除了11个C末端氨基酸(aa 1263-1273)以生成截断体。所得S蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示,密码子优化后的基因序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
除修饰过的S蛋白外,本发明还采用了新型冠状病毒的核衣壳蛋白(N)同时作为重组疫苗的免疫抗原。N蛋白是冠状病毒最丰富的结构蛋白,其可能在通过诱导机体产生N特异性T细胞来控制感染向远端部分进一步扩散等方面起关键作用。本发明对天然N序列进行了密码子优化,同时利用P2A序列完成在细胞中对S蛋白与N蛋白的切割,P2A是来源于猪捷申病毒(Porcine teschovirus)的短肽,通常被称为“自我剪切”肽,能使一条转录产物产生多种蛋白。除了P2A外,常见的“自我剪切”肽还有T2A、E2A、F2A等。S蛋白和N蛋白的联合免疫可能为在近端和远端器官提供保护。其中,新型冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示,密码子优化后的基因序列如序列表中SEQ ID No:4所示。P2A的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:5所示,其多核苷酸编码序列如序列表中SEQ ID No:6所示。
(二)免疫抗原在重组麻疹病毒基因组中插入位置的选择
本发明使用的麻疹病毒基因组负链RNA序列衍生于中国本土的减毒麻疹病毒疫苗株-沪191(Shanghai-191)。由于麻疹病毒基因组的表达特点是从3'端到5'端各个基因的转录翻译水平依次递减,为了保证设计抗原的高表达水平以及降低对麻疹基因组的影响,因此选择在麻疹病毒的P基因与M基因之间构建额外转录单元,同时调整外源基因片段的核苷酸数量以保证重组麻疹基因组的总核苷酸数遵循其基因组特有的“六规则”,重组麻疹病毒基因组结构如图2所示。
(三)含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒株的拯救方案
为了能快速拯救出含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹病毒,本发明选择了同时将多种质粒进行共转细胞的方式进行病毒拯救,与之前的麻疹病毒拯救方案略有不同,本发明使用的全长麻疹病毒质粒载体为南京金斯瑞生物科技公司提供的pCC1-Brick,该质粒载体有利于保持长片段基因或者有毒基因的稳定性,为提高麻疹病毒辅助蛋白核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、RNA聚合酶(L)的表达水平,本发明对麻疹病毒N、P、L天然基因序列进行了人源密码子优化,密码子优化后的麻疹病毒N、P、L基因序列分别如序列表中SEQ ID No:7、8和9所示。本发明使用的其他辅助质粒(T7polymerase)及转染选择的细胞系(293T、Vero-CCL81)均为常规使用质粒和细胞系。以上拯救方案的改动有利于对不熟悉麻疹病毒反向遗传学的实验人员提高病毒拯救效率并节约时间成本。
本发明将通过检查重组病毒导致合胞体的形成、抗原蛋白的表达检测、重组病毒的生长动力学水平等几个方面来验证含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹病毒的成功拯救,步骤如下:
1)质粒构建:将密码子优化的麻疹病毒N、P、L序列构建到含有T7启动子(T7promoter)的质粒载体中;
2)病毒拯救:将步骤1)构建好的质粒与含有全长麻疹病毒基因组及外源基因的质粒和T7聚合酶(T7 polymerase)表达质粒进行混合,通过脂质体共转到易于转染的细胞中,质粒转染质量比例约为T7 pol∶rMeV-S-N∶N∶P∶L=(1~3)∶(3~5)∶(1~1.5)∶(1~1.5)∶(0.5~1),其中T7 pol代表T7聚合酶表达质粒,rMeV-S-N代表含有新型冠状病毒S和N蛋白的重组麻疹病毒全长克隆质粒,N、P、L分别代表含有密码子优化的麻疹病毒N、P、L序列的表达质粒;
3)合胞体的观察:成功拯救病毒时,可在光学显微镜下可观察到重组麻疹病毒感染导致的合胞体现象;
4)病毒收集:对上述拯救得到的病毒上清和细胞混合悬液进行速冻速融三个循环来收集病毒;
5)外源蛋白的表达验证:取重组病毒以MOI=1来感染细胞,感染48h后收集细胞对其进行Western Blot验证;
6)重组病毒的生长动力学研究:以MOI=0.01感染细胞,在不同时间点收集病毒以探究外源基因片段对麻疹病毒生长动力学的影响。
基于上述研究,本发明提供了如下技术方案:
一种含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗,其能引发针对新型冠状病毒和麻疹病毒二者的免疫应答和保护,其中,所述新型冠状病毒联合抗原是新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白的联合抗原,所述新型冠状病毒的S蛋白是具有K986P、V987P突变的C末端截短的S蛋白,其氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No:1所示;该新型冠状病毒联合抗原的编码基因被克隆在减毒麻疹疫苗病毒的P基因和M基因之间。
上述含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗中,优选的,所述新型冠状病毒的S蛋白的编码基因经过密码子优化,如序列表中SEQ ID No:2所示;新型冠状病毒N蛋白的编码基因也经过密码子优化,如序列表中SEQ ID No:4所示;所述新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白之间的连接肽为自我剪切肽,选自P2A短肽、T2A短肽、E2A短肽、F2A短肽等。
上述含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗中,所述减毒麻疹疫苗病毒优先选择衍生自减毒麻疹病毒疫苗株“沪191”。
本发明还提供了一种重组麻疹疫苗病毒载体,其包含编码新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白的联合抗原的核苷酸序列,插在减毒麻疹疫苗病毒的P基因和M基因之间,其中,所述新型冠状病毒的S蛋白是具有K986P、V987P突变的C末端截短的S蛋白,其氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No:1所示;S蛋白和N蛋白之间通过自我剪切肽连接。
如前所述,优选的,编码所述新型冠状病毒的S蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo:2所示;编码所述新型冠状病毒的N蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:4所示;连接所述新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白的自我剪切肽是P2A,其编码序列如序列表中SEQID No:6所示。
包含上述重组麻疹疫苗病毒载体的宿主细胞也在本发明的保护范围内。
本发明还提供了上述含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗的制备方法,包括以下步骤:
(1)将所述新型冠状病毒联合抗原的编码基因插入到减毒麻疹疫苗病毒的P基因和M基因之间,构建含有新型冠状病毒的S和N蛋白编码基因的重组麻疹病毒的全长克隆质粒,简称rMeV-S-N;
(2)将密码子优化的麻疹病毒N、P、L序列分别构建到含有T7启动子的质粒载体中,得到三个辅助质粒N、P和L;
(3)将步骤(1)和(2)构建的质粒和T7聚合酶表达质粒进行混合,通过脂质体共转染细胞;
(4)培养共转染细胞,收集病毒。
上述步骤(2)中,所述密码子优化的麻疹病毒的N、P、L序列分别如序列表中SEQIDNo:7、8和9所示。
上述步骤(3)中,质粒转染质粒比例约为T7 pol∶rMeV-S-N∶N∶P∶L=(1~3)∶(3~5)∶(1~1.5)∶(1~1.5)∶(0.5~1),其中T7 pol代表表达T7聚合酶的质粒,rMeV-S-N代表含有新型冠状病毒的S和N蛋白编码基因的重组麻疹病毒的全长克隆质粒,N、P、L分别代表步骤2)构建的辅助质粒N、P、L。
本发明主要优势在于:
1)本发明首次实现了在麻疹病毒疫苗载体上利用新冠病毒的S蛋白和N蛋白作为联合免疫抗原的疫苗新策略,相比以往的单独使用新冠S蛋白作为抗原的相关疫苗,除了具有S蛋白疫苗的优点外,本发明额外增加的N蛋白上具有新冠病毒的关键T细胞表位,可以更好地引起机体T细胞免疫;
2)本发明所使用的麻疹病毒拯救方法与国内其他的有所不同,不需要额外构建辅助细胞系等即可进行拯救,所使用的材料比较普遍,能简化疫苗生产;
3)本发明所使用的减毒麻疹病毒载体是一种在国内普遍并长期使用的疫苗株,具有良好的安全性和稳定性。
附图说明
图1是本发明构建的质粒pCC1-rMeV-S-N的结构示意图。
图2是本发明新型冠状病毒的S和N蛋白在麻疹病毒基因组中的插入位置示意图。
图3是本发明拯救的重组麻疹病毒在光学显微镜下的鉴定结果。
图4是本发明拯救的重组麻疹病毒的Western Blot鉴定结果。
图5是本发明拯救的重组麻疹病毒的生长动力学曲线。
具体实施方式
下面结合附图,通过实施例对本发明的含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗构建过程进行详细说明,并通过实验验证其拯救成果。
一、含有新冠病毒S和N的重组麻疹病毒全长克隆及辅助质粒的构建
1)含有新冠病毒S和N的重组麻疹重组病毒的全长克隆质粒pCC1-rMeV-S-N委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成,其中包含了密码子优化过的S基因序列、N基因序列以及P2A切割序列,质粒pCC1-rMeV-S-N结构如图1所示,返回质粒冻干粉,辅助质粒pCAGGS-T7 polymerase购于adagene,辅助质粒pT7-CFE-N、pT7-CFE-P、pT7-CFE-L所使用的质粒载体pT7-CFE-Chis购于Thermo。
2)辅助质粒pT7-CFE-N、pT7-CFE-P、pT7-CFE-L的构建
将MV的N、P、L三个基因编码区序列进行密码子优化并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成获得冻干质粒pCMV14-MeV-N、pCMV14-MeV-P和pCMV14-MeV-L,然后分别以pCMV14-MeV-N、pCMV14-MeV-P、pCMV14-MeV-L和pT7-CFE-Chis为模板,利用引物N F和N R、PF和P R、L F和L R扩增获得片段N、P、L,用引物ZT F和N/P/L R扩增获得线性载体pT7-CFE,之后利用同源重组酶将各个片段分别与载体pT7-CFE连接,并转化感受态细胞DH5α,得到的菌液单克隆通过北京睿博兴科生物技术有限公司测序确定连接质粒序列符合预期。表1为辅助质粒克隆相关引物信息(序列表中SEQ ID No:10至17)。
表1
二、含有新冠病毒S蛋白和N蛋白的重组麻疹病毒的拯救
1)利用去内毒素的质粒提取试剂盒提取全长克隆质粒和辅助质粒备用。
2)将293T细胞接种于细胞六孔板中过夜培养,第二天选择70%-80%汇合度的细胞孔进行转染,具体过程如下:将模板质粒pCC1-MeV-EGFP/pCC1-rMeV-S-N、辅助质粒pT7-CFE-N、pT7-CFE-P、pT7-CFE-L、pCAGGS-T7 polymerase按照LipofectaminTM3000转染试剂的说明书与转染试剂混合于250μL的opt-MEM中,常温孵育15min,其中P3000按照与总质粒质量体积比1∶2的体积使用,Lipo3000按照与总质粒质量体积比1∶1的体积使用。将上述混合物加入六孔板中,37℃培养4-6h,之后将细胞孔中培养基更换成含有2%胎牛血清、1%双抗的DMEM,37℃继续培养2d,收集细胞并将细胞悬液加到已经过夜培养的单层Vero细胞中,继续在37℃培养,直至在光学显微镜下观察到细胞融合病变,即证明拯救成功。拯救结果见图3,阴性对照为Vero-CCL81细胞,在0h~72h无细胞融合病变,以rMeV-EGFP为阳性对照,在48h时rMeV-EGFP出现细胞融合病变,而rMeV-S-N在72h左右出现细胞融合病变,初步证明rMeV-S-N拯救成功。
三、含有新冠病毒联合抗原的重组麻疹病毒的外源蛋白表达水平验证
1)于6孔板中接种3×105/孔Vero细胞并过夜培养,第二天分别用rMeV-EGFP、rMeV-S-N以MOI=1感染细胞,其中常温孵育1h,孵育结束后更换成含有2%FBS和1%双抗的DMEM继续在37℃培养箱培养48h,之后收集细胞,PBS清洗3遍,细胞沉淀存于-80℃
保存。
2)提前准备新冠病毒S蛋白和N蛋白转染好的细胞样品,同时取一份rMeV-S-N病毒感染过的细胞样品,每份样品加入80μL RIPA细胞裂解液,冰上裂解30min,12000rpm离心30min,收集上清,利用Western Blot检测各个样品中SARS-CoV-2的S蛋白、SARS-CoV-2的N蛋白、MeV的N蛋白以及细胞对照actin,其中检测S蛋白所用的一抗为anti-SARSS2结构域的抗体,结果如图4所示,与单独表达SARS-CoV-2的S和N的质粒样品相比,rMeV-S-N能同时表达SARS-CoV-2的S和N蛋白,图4中180kDa左右的条带为S蛋白,100kDa以下的条带为S2蛋白,该样品同时检测到了rMeV N蛋白的表达,证明重组麻疹病毒rMeV-S-N表达联合抗原S和N的策略可行。
四、含有新冠病毒S蛋白和N蛋白的重组麻疹病毒的生长动力学测定
1)为了验证SARS-CoV-2的S和N基因的插入对麻疹病毒的复制能力的影响,本发明对重组病毒rMeV-EGFP和rMeV-S-N进行了生长动力学曲线测定。在6孔板中接种2.13×105/
孔细胞过夜培养,第二天将rMeV-EGFP和rMeV-S-N分别以MOI=0.01接种细胞,常温吸附1h后将培养基换成含有2%FBS、1%双抗的DMEM,分别于24h、48h、72h、96h、120h收集细胞和细胞上清进行病毒滴度测定,并绘制病毒的生长曲线以分析插入片段对麻疹病毒复制能力的影响。结果见图5,rMeV-EGFP和rMeV-S-N的多步生长曲线相比有差异,rMeV-S-N的滴度低于rMeV-EGFP。该趋势符合麻疹病毒作为重组疫苗载体的基本规律,即外源基因的片段越长,其插入位置越靠近vRNA3’端,对重组麻疹病毒的滴度影响就越大。以上数据充分证明本发明方法成功拯救rMeV-S-N。
最后需要注意的是,公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明,但是本领域的技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内,各种替换和修改都是可能的。因此,本发明不应局限于实施例所公开的内容,本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。
Claims (9)
1.一种含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗,其能引发针对新型冠状病毒和麻疹病毒二者的免疫应答和保护,其中,所述新型冠状病毒联合抗原是新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白的联合抗原,所述新型冠状病毒的S蛋白是具有K986P、V987P突变的C末端截短的S蛋白,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示;所述新型冠状病毒的N蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示;S蛋白和N蛋白之间通过自我剪切肽连接;该新型冠状病毒联合抗原的编码基因被克隆在减毒麻疹疫苗病毒的P基因和M基因之间,所述减毒麻疹疫苗病毒衍生自减毒麻疹病毒疫苗株“沪191”。
2.如权利要求1所述的含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗,其特征在于,所述自我剪切肽选自P2A短肽、T2A短肽、E2A短肽、F2A短肽。
3.如权利要求2所述的含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗,其特征在于,所述P2A短肽的多核苷酸编码序列如序列表中SEQ ID No:6所示。
4.一种重组麻疹疫苗病毒载体,其包含编码新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白的联合抗原的核苷酸序列,插在减毒麻疹疫苗病毒的P基因和M基因之间,其中,所述新型冠状病毒的S蛋白是具有K986P、V987P突变的C末端截短的S蛋白,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示;所述新型冠状病毒的N蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示;S蛋白和N蛋白之间通过自我剪切肽连接;所述减毒麻疹疫苗病毒衍生自减毒麻疹病毒疫苗株“沪191”。
5.如权利要求4所述的重组麻疹疫苗病毒载体,其特征在于,编码所述新型冠状病毒的S蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示;编码所述新型冠状病毒的N蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:4所示。
6.如权利要求4所述的重组麻疹疫苗病毒载体,其特征在于,连接所述新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白的自我剪切肽是P2A,其编码序列如序列表中SEQ ID No:6所示。
7.包含权利要求4~6任一所述的重组麻疹疫苗病毒载体的宿主细胞。
8.权利要求1~3任一所述的含有新型冠状病毒联合抗原的重组麻疹减毒疫苗的制备方法,包括以下步骤:
1)将所述新型冠状病毒联合抗原的编码基因插入到减毒麻疹疫苗病毒的P基因和M基因之间,构建含有新型冠状病毒的S和N蛋白编码基因的重组麻疹病毒的全长克隆质粒,简称rMeV-S-N;
2)将密码子优化的麻疹病毒N、P、L序列分别构建到含有T7启动子的质粒载体中,得到分别通过T7启动子启动表达N、P和L的三个质粒,其中,所述密码子优化的麻疹病毒N、P、L序列分别如序列表中SEQ ID No:7、8和9所示;
3)将步骤1)和2)构建的质粒和T7聚合酶表达质粒进行混合,通过脂质体共转染细胞;
4)培养共转染细胞,收集病毒。
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,步骤3)中质粒转染质量比例为T7 pol∶rMeV-S-N∶N∶P∶L=(1~3)∶(3~5)∶(1~1.5)∶(1~1.5)∶(0.5~1),其中T7 pol代表表达T7聚合酶的质粒,rMeV-S-N代表含有新型冠状病毒的S和N蛋白编码基因的重组麻疹病毒的全长克隆质粒,N、P、L分别代表步骤2)构建的通过T7启动子启动表达N、P、L的质粒。
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