CN113480618A

CN113480618A - 表达新冠病毒蛋白的重组麻疹病毒及其应用

Info

Publication number: CN113480618A
Application number: CN202110757388.XA
Authority: CN
Inventors: 黄耀伟; 徐令东; 陈相波; 宗明瑞; 王斌; 杨永乐; 梅小强; 覃盼; 彭蕾
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2021-10-08

Abstract

本发明涉及表达新型冠状病毒蛋白，例如S蛋白或其三聚体或其功能性片段的重组麻疹病毒，包含该重组麻疹病毒的疫苗，以及这类疫苗在用于预防或治疗新冠病毒感染中的应用。

Description

表达新冠病毒蛋白的重组麻疹病毒及其应用

优先权要求

本申请要求2020年10月16日提交的申请号为202011112686.5 的中国专利申请的优先权，其通过提述全文并入本文。

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体地，本发明涉及表达新型冠状病毒蛋白的重组麻疹病毒，包含该重组麻疹病毒的疫苗，以及这类疫苗在用于预防或治疗新冠病毒感染中的应用等。

序列表

本申请包含序列表，其通过提述并入本文。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是新型冠状病毒肺炎(COVID-19) 的病原。目前亟需针对新冠病毒有效的治疗和预防措施。

预防性疫苗接种仍然是预防病毒感染最有效的方法。目前正在研发的新型冠状病毒以灭活疫苗和腺病毒载体疫苗等为主。灭活疫苗是选用普遍流行的及免疫原性良好的毒株等进行人工培养，用化学或物理的方法将其灭活，使其丧失传染性，但仍保其留免疫原性。其优点是安全、不存在散毒的危险，便于贮存和运输，产生抗体水平高；其缺点是引起细胞介导免疫的能力较弱，免疫力产生较慢，通常在接种2周后才能获得良好的免疫力。腺病毒载体疫苗的优点是宿主范围广，对人致病性低，人体免疫后能在体内持续增殖，安全性好，不整合到人的基因组中；缺点则是存在体内预存抗体而影响免疫效果。在人体中针对Ad5型腺病毒的预存抗体对以Ad5为载体的腺病毒载体疫苗诱导的免疫反应产生抑制，有研究显示，具有Ad5腺病毒预存抗体的志愿者体内产生中和抗体的滴度相较于没有预存抗体的志愿者偏低。

麻疹病毒(MeV)属于副粘病毒毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属，为不分节段的单股负链RNA病毒，病毒颗粒呈多形态或球形，外部由囊膜包裹。国内所用的麻疹疫苗株为沪191(S191)株，沪191 株生产的麻疹疫苗稳定性良好，其临床安全性和免疫原性均良好，在我国已应用近60年，有效性和安全性已经得到明确的肯定，是中国麻疹疫苗的主要生产株。

已有研究表明麻疹病毒可作为良好的重组疫苗载体平台，开发“即插即用”技术平台(Christiane Gerke等人，Expert Review of Vaccines, 2019,Vol 18,No.4,393-403)。重组麻疹病毒载体可容纳高达6kb的外源基因插入到病毒的基因组中，具有高度通用性和适用性，能诱导机体产生持久的体液免疫、细胞免疫反应，且免疫效果不受人体中预存麻疹病毒抗体的影响。

由于新冠病毒感染的严重性，目前迫切需要能够有效预防和/或治疗新冠病毒感染的疫苗。针对这一问题，本发明开发了表达新冠病毒抗原蛋白的重组麻疹病毒用于疫苗制备。

发明内容

本发明实现了产生基于重组麻疹病毒的疫苗，该重组麻疹病毒表达新冠病毒的一种或多种抗原蛋白，在施用后能有效预防和/或治疗新冠病毒感染。

在一个方面，本发明提供了新冠病毒的S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体与天然新冠病毒S蛋白胞外区的氨基酸序列(例如如SEQ ID No:1所示)相比，包含以下突变：

(a)消除或破坏位于氨基酸序列第682至685位的Furin蛋白酶酶切位点的突变；和

(b)促进S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变。

在一些实施方案中，所述S蛋白突变体还包含促进S蛋白释放的突变。

在一些实施方案中，消除或破坏Furin蛋白酶酶切位点的突变为在氨基酸序列第682至685位的一个或多个氨基酸位置处的添加、删除、和/或取代，例如可以是R682G/R683S/R685S取代。

在一些实施方案中，所述促进S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变为K986P/V987P取代。在一些实施方案中，所述S蛋白突变体在 C末端还包含如SEQ ID No:4所示的基序。

所述S蛋白突变体可以包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID No:2具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

优选地，所述S蛋白突变体在表达后能形成包含三个S1亚基和三个S2亚基的融合前三聚体构象。在一些实施方案中，所述功能性片段为免疫原性片段，例如S1亚基或受体结合域(RBD)序列。

在一个方面，本发明提供了新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的三聚体，其中所述S蛋白突变体与天然新冠病毒S蛋白胞外区的氨基酸序列相比，包含以下突变：

(a)消除或破坏位于氨基酸序列第682至685位的Furin蛋白酶酶切位点的突变；和(b)促进S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变。

优选地，所述三聚体呈S蛋白的融合前三聚体构象，从而可以有利地用作抗原来激发受试者中的免疫应答。

在一个方面，本发明提供了一种多核苷酸序列，其编码如本文公开的任一种新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段。优选地，所述多核苷酸是经过密码子优化的。

在一个方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如本文公开的多核苷酸序列可操作地连接至编码麻疹病毒反基因组正链RNA的 cDNA序列。所述多核苷酸序列可以插入cDNA序列中，例如插入 cDNA序列的P基因与M基因之间或H基因与L基因之间。

在一个方面，本发明提供了一种重组麻疹病毒载体，其中在麻疹病毒基因组负链RNA序列中包含与编码如本文公开的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的正链RNA序列互补的负链RNA序列。

在一些实施方案中，所述麻疹病毒基因组负链RNA序列是来自或衍生自减毒麻疹病毒疫苗株的麻疹病毒的全长基因组负链RNA。例如，所述减毒麻疹病毒疫苗株选自：沪191株、Schwarz株、Moraten 株、AIK-C株和Edmonston-Zagreb株，优选为沪191株。

在一些实施方案中，新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的正链RNA序列是经过密码子优化的，特别是针对哺乳动物密码子优化的。并且优选地，在麻疹病毒基因组负链RNA序列中，包含与编码如本文公开的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的正链RNA序列互补的负链RNA序列的核苷酸数目符合麻疹病毒的6倍规则。

在一些实施方案中，互补的负链RNA序列位于麻疹病毒基因组负链RNA序列中的基因间区，例如N基因与P基因之间、P基因与M 基因之间、M基因与F基因之间、F基因与H基因之间或H基因与L 基因之间，优选地位于麻疹病毒基因组负链RNA序列中的P基因与 M基因之间或H基因与L基因之间。

在一些实施方案中，所述重组麻疹病毒载体还包含与选自以下的一种或多种调控元件的编码序列互补的负链RNA序列：转录启动子、终止序列、增强子、和其他顺式作用元件。所述调控元件与使用的麻疹病毒株可以是同源或异源的。

在一些实施方案中，如本文公开的重组麻疹病毒载体还包含外部囊膜。在一些实施方案中，所述重组麻疹病毒载体还包含在囊膜表面呈融合前三聚体构象的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的三聚体。

在一个方面，本发明提供包含一种转移质粒或抗原表达质粒，其包含如上文公开的多核苷酸序列或核酸构建体。

在一个方面，本发明提供一种用于拯救表达新冠病毒抗原蛋白的重组麻疹病毒载体的反向遗传系统，其包含：

a)如本文公开的抗原表达质粒；

b)包含麻疹病毒核衣壳蛋白编码序列的辅助质粒1；

c)包含麻疹病毒磷蛋白编码序列的辅助质粒2；和

d)包含麻疹病毒RNA聚合酶编码序列的辅助质粒3。

在一些实施方案中，所述抗原表达质粒是真核表达质粒，例如是酵母-大肠杆菌穿梭质粒。在一些实施方案中，所述抗原表达质粒和辅助质粒1-3都是包含T7启动子的质粒。例如，辅助质粒可以基于pT7 载体构建。在一些具体的实施方案中，辅助质粒1为pT7-Hu191-N，辅助质粒2为pT7-Hu191-P，和/或辅助质粒3为pT7-Hu191-L。

在一个方面，本发明提供一种制备重组麻疹病毒颗粒的方法，其包括：

a)将本文公开的抗原表达质粒和辅助质粒共转染至第一细胞系中；

b)转染后收集细胞上清液感染第二细胞系并培养；

c)收集细胞上清液并纯化，从而获得表达新冠病毒抗原蛋白的重组麻疹病毒颗粒。

在一些实施方案中，所述辅助质粒包括以下质粒：包含麻疹病毒核衣壳蛋白编码序列的辅助质粒1、包含麻疹病毒磷蛋白编码序列的辅助质粒2、和包含麻疹病毒RNA聚合酶编码序列的辅助质粒3。

在一些实施方案中，其中步骤a)中抗原表达质粒和辅助质粒1-3 加入的质量比为10：3：3：1。

在一些实施方案中，所述第一细胞系是稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系例如BHK-T7细胞系，和/或第二细胞系是Vero细胞系。

a)将如本文公开的抗原表达质粒转染至辅助细胞系中；

b)转染后收集细胞上清液感染第二细胞系并培养；

在一些实施方案中，所述辅助细胞系在基因组中包含麻疹病毒核衣壳蛋白、磷蛋白和RNA聚合酶编码序列，从而能稳定地表达麻疹病毒核衣壳蛋白、磷蛋白和RNA聚合酶。

在一个方面，本发明提供一种重组麻疹病毒颗粒，其包含在麻疹病毒包膜表面表达的新冠病毒S蛋白变体的多聚体，例如三聚体。所述重组麻疹病毒颗粒可以通过用如本文公开的任一种制备重组麻疹病毒颗粒的方法获得。

在一个方面，本发明提供宿主细胞，其经过所述抗原表达质粒和提供辅助功能和蛋白的其他多核苷酸转染获得。所述宿主细胞优选为真核细胞。所述其他多核苷酸可以编码麻疹病毒N、P、L蛋白的一种或多种。在一些实施方案中，所述其他多核苷酸包含在相应的辅助质粒中，或者由已整合到细胞基因组中。

在一些实施方案中，所述N、P、L蛋白来自相同或不同的病毒株。

在一个方面，本发明提供一种组合物，其包含如本文公开的重组麻疹病毒颗粒或宿主细胞。所述组合物可以是药物组合物或免疫原性组合物，例如疫苗组合物。

在一个方面，本发明提供如本文公开的重组麻疹病毒颗粒或组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒的疫苗中的用途。任选地，所述重组麻疹病毒颗粒或组合物还可用于同时预防麻疹病毒感染。

在一个方面，本发明提供如本文公开的重组麻疹病毒颗粒或组合物在制备预防和/或治疗受试者中新冠病毒感染引起的疾病或病况的药物中的用途。所述受试者可以是例如猴、猿、黑猩猩、猫、狗、牛、马、小鼠、大鼠、兔和人(包括成人和儿童)等，优选是人，包括成人和儿童。

本发明涉及的一些实施方案：

1.一种新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体与天然新冠病毒S蛋白胞外区的氨基酸序列相比，包含以下突变：

2.实施方案1的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体还包含促进S蛋白释放的突变。

3.实施方案1或2的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中消除或破坏Furin蛋白酶酶切位点的突变为在氨基酸序列第682至685 位的一个或多个氨基酸位置处的添加、删除、和/或取代。

4.实施方案3的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述突变为R682G/R683S/R685S取代。

5.前述实施方案中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述促进S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变为 K986P/V987P取代。

6.前述实施方案中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体在C末端还包含如SEQ ID No:4所示的基序。

7.前述实施方案中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID No:2具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

8.前述实施方案中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体在表达后能形成包含三个S1亚基和三个S2 亚基的融合前三聚体构象。

9.前述实施方案中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述功能性片段为免疫原性片段，例如受体结合域(RBD)序列。

10.一种重组麻疹病毒载体，其中在麻疹病毒基因组负链RNA序列中包含与编码实施方案1-9中任一项所述的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的正链RNA序列互补的负链RNA序列。

11.实施方案10的重组麻疹病毒载体，其中所述麻疹病毒基因组负链RNA序列是来自或衍生自减毒麻疹病毒疫苗株的麻疹病毒的全长基因组负链RNA。

12.实施方案10或11的重组麻疹病毒载体，其中所述减毒麻疹病毒疫苗株选自：沪191株、Schwarz株、Moraten株、AIK-C株和 Edmonston-Zagreb株。

13.实施方案11或12的重组麻疹病毒载体，其中所述减毒麻疹病毒疫苗株为沪191株。

14.实施方案10-13中任一项的重组麻疹病毒载体，其中编码实施方案1-9中任一项所述的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的正链RNA序列是经过密码子优化的，特别是针对哺乳动物密码子优化的。

15.实施方案10-14中任一项的重组麻疹病毒载体，其中互补的负链RNA序列的核苷酸数目符合麻疹病毒的6倍规则。

16.实施方案10-15中任一项的重组麻疹病毒载体，其中互补的负链RNA序列位于麻疹病毒基因组负链RNA序列中的基因间区，包括N基因与P基因之间、P基因与M基因之间、M基因与F基因之间、F基因与H基因之间或H基因与L基因之间。

17.实施方案16的重组麻疹病毒载体，其中互补的负链RNA序列位于麻疹病毒基因组负链RNA序列中的P基因与M基因之间或H 基因与L基因之间。

18.实施方案10-17中任一项的重组麻疹病毒载体，其还包含与选自以下的一种或多种调控元件的编码序列互补的负链RNA序列：转录启动子、终止序列、增强子、和其他顺式作用元件。

19.实施方案18的重组麻疹病毒载体，其中所述调控元件与麻疹病毒是同源或异源的。

20.实施方案10-19中任一项的重组麻疹病毒载体，其还包含外部囊膜。

21.实施方案20的重组麻疹病毒载体，其还包含在囊膜表面呈融合前三聚体构象的新冠病毒S蛋白突变体的三聚体。

22.一种多核苷酸序列，其编码实施方案1-9中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段。

23.一种核酸构建体，其包含实施方案22的多核苷酸序列可操作地连接至编码麻疹病毒反基因组正链RNA的cDNA序列。

24.实施方案23的核酸构建体，所述多核苷酸序列插入cDNA序列中，例如插入cDNA序列的P基因与M基因之间或H基因与L基因之间。

25.一种转移质粒，其包含实施方案23或24的核酸构建体。

26.一种用于拯救表达新冠病毒抗原蛋白的重组麻疹病毒载体的反向遗传系统，其包含：

a)抗原表达质粒，其包含新冠病毒抗原蛋白的编码序列可操作地连接于编码麻疹病毒反基因组正链RNA的cDNA序列中；

b)包含麻疹病毒核衣壳蛋白编码序列的辅助质粒1；

c)包含麻疹病毒磷蛋白编码序列的辅助质粒2；和

d)包含麻疹病毒RNA聚合酶编码序列的辅助质粒3。

27.实施方案26的反向遗传系统，其中所述抗原表达质粒是真核表达质粒，例如酵母-大肠杆菌穿梭质粒。

28.实施方案26或27的反向遗传系统，其中所述抗原表达质粒和辅助质粒1-3都是包含T7启动子的质粒。

29.一种制备重组麻疹病毒颗粒的方法，其包括：

a)将如实施方案26-28中任一项所述的反向遗传系统中的质粒共转染至第一细胞系中；b)转染后收集细胞上清液感染第二细胞系并培养；和c)收集细胞上清液并纯化，从而获得表达新冠病毒抗原蛋白的重组麻疹病毒颗粒。

30.实施方案29的方法，其中步骤a)中抗原表达质粒和辅助质粒 1-3加入的质量比为10：3：3：1。

31.实施方案29或30中任一项的方法，其中所述第一细胞系是稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系例如BHK-T7细胞系，和/或第二细胞系是Vero细胞系。

32.一种制备重组麻疹病毒颗粒的方法，其包括：

a)将如实施方案26-38中任一项所述的反向遗传系统中的抗原表达质粒转染至辅助细胞系中；

b)转染后收集细胞上清液感染第二细胞系并培养；和

33.实施方案32的方法，其中所述辅助细胞系在基因组中包含麻疹病毒核衣壳蛋白、磷蛋白和RNA聚合酶编码序列，从而稳定地表达麻疹病毒核衣壳蛋白、磷蛋白和RNA聚合酶。

34.一种重组麻疹病毒颗粒，其通过用实施方案26-33中任一项的方法获得。

35.一种重组麻疹病毒颗粒，其包含在麻疹病毒囊膜表面表达的新冠病毒S蛋白或其功能性片段或多聚体。

36.实施方案35的重组麻疹病毒颗粒，其包含在囊膜表面呈融合前三聚体构象的新冠病毒S蛋白的三聚体。

37.实施方案35或36的重组麻疹病毒颗粒，其中所述S蛋白与天然新冠病毒S蛋白胞外区的氨基酸序列相比，包含以下突变：

38.一种宿主细胞，其通过用实施方案23或24的核酸构建体或者实施方案25的转移质粒转染获得。

39.一种组合物，其包含实施方案34-37中任一项的重组麻疹病毒颗粒，以及任选地药学上可接受的运载体。

40.实施方案39的组合物，其为疫苗组合物。

41.实施方案34-37中任一项的重组麻疹病毒颗粒或实施方案 39-40中任一项的组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒的疫苗中的用途。

42.实施方案34-37中任一项的重组麻疹病毒颗粒或实施方案 39-40中任一项的组合物在制备预防和/或治疗受试者中新冠病毒感染引起的疾病或病况的药物中的用途。

43.实施方案42的用途，其中所述受试者是人，包括成人和儿童。

44.实施方案1-9中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的三聚体。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和用途和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。

附图说明

图1为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒感染性克隆质粒pYES2-rMeV-SC2-ST的构建示意图。

图2为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒分段扩增示意图。

图3为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒分段扩增结果检测图。

图4为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒感染性克隆质粒pYES2-rMeV-SC2-ST琼脂糖凝胶电泳验证结果图。

图5为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒拯救检测的致细胞病变效应(CPE)结果图，箭头处指示出现细胞合胞体病变。

图6为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒拯救检测的RT-PCR检测结果图。

图7为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒拯救检测的间接免疫荧光法检测结果图。

图8为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒传至第20 代(p20)间接免疫荧光法检测结果图。

图9为用非变性胶检测重组麻疹病毒感染Vero细胞后新冠病毒S 蛋白三聚体的表达。

图10为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒在Vero 细胞中一步生长曲线测定结果图。

图11为通过荧光酶活性测定的多克隆抗体对假病毒感染的中和效果结果图。

图12A-C为比较仓鼠中接种重组麻疹病毒后产生的SARS-CoV2-S 抗体滴度的差异的分析图。其中圆圈代表rMeV-GFP(n＝5)，方框代表rMeV-SC2-RBD(n＝5)，上三角代表rMeV-SC2-S(n＝5)，下三角代表rMeV-SC2-ST(n＝5)，每个柱高代表5个小鼠中的均值。

发明详述

本发明涉及新冠病毒抗原蛋白变体、以麻疹病毒作为载体重组表达新冠病毒抗原蛋白变体、产生的重组麻疹病毒颗粒、包含此类重组麻疹病毒颗粒的组合物，特别是疫苗组合物，以及其在预防和/或治疗新冠病毒感染中的用途。具体地，本发明人基于现有的减毒麻疹病毒株的基因组序列，通过DNA重组克隆入编码新冠病毒一种或多种抗原蛋白(例如S蛋白或其功能性片段或其多聚体)的多核苷酸序列，从而构建携带源自新冠病毒的一种或多种异源多核苷酸的麻疹病毒表达载体(即重组麻疹病毒载体)，以用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的疫苗。

新型冠状病毒SARS-Cov-2

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具包膜、基因组为单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒直径约80～120nm，基因组5’端具有甲基化的帽状结构， 3’端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。

新型冠状病毒SARS-Cov-2(也称为2019-nCoV，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余 6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、 SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。

与其他冠状病毒一样，SARS-Cov-2病毒颗粒是球形的且具有在其表面呈刺突状的S蛋白(又称为刺突蛋白，Spike glycoprotein)。这些刺突粘附到人细胞上，引起允许病毒膜与细胞膜融合的结构变化，然后病毒基因可以进入宿主细胞进行复制，产生更多的病毒。

因此，S蛋白是新冠病毒的主要抗原，负责病毒与受体结合，具有良好的免疫原性。天然S蛋白包含跨膜区和胞内区以及在囊膜表面的胞外区，胞外区有两个亚基：S1和S2，其中S1亚基中包含受体结合位点 (RBD)以介导S1亚基与受体(例如血管紧张素转化酶2(ACE2)受体)结合，S2亚基促进膜融合，从而有助于病毒进入细胞。除了S蛋白以外，新冠病毒还有另外三种主要的结构蛋白：核衣壳蛋白(N蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)。

包括新冠病毒在内的所有冠状病毒的S蛋白在病毒表面均呈现三聚体结构，即由三个S1亚基和三个S2亚基构成。天然的S蛋白三聚体有两种不同的构象：融合前的结构存在于成熟的病毒体上，呈丁香状，三个S1头位于三聚化S2茎的顶部；融合后结构为膜融合状态，呈哑铃状，三个S2亚基重排，形成一个六个螺旋束的结构。来自不同冠状病毒属的S2的结构在融合前和融合后状态均相似，但来自不同属的S1亚基在结构上存在差异，并且识别多种宿主细胞受体。S蛋白三聚体形式是其天然形态，如果阻断S蛋白与受体的结合，新冠病毒将无法入侵细胞。

不同属的冠状病毒的S蛋白存在明显差异，结合不同的糖受体和蛋白受体。新冠病毒S蛋白与非典型肺炎病毒SARS-CoV-1S蛋白的氨基酸同一性为76.3％，与其他冠状病毒(如MERS-CoV等)差异性更大。 S蛋白是疫苗、治疗性抗体和诊断方法研究的关键目标。

S抗原蛋白和融合前S三聚体蛋白

如本文中使用的，术语“抗原蛋白”与“抗原”可互换使用，指的是源自新冠病毒的蛋白，通常为结构蛋白，其可与天然蛋白相同或可由天然蛋白经突变衍生，包括取代(特别通过保守氨基酸残基)、删除或添加氨基酸或翻译后二次修饰，或其功能性片段或多聚体。本发明涵盖具有适于在宿主特别是人宿主中引发免疫应答的天然蛋白的表位的功能性片段，所述免疫应答能够预防或治疗新冠病毒感染或相关疾病。

因此，本文中的表述“S蛋白”或“S抗原蛋白”涵盖全长S蛋白以及全长S蛋白中的胞外区，不仅涵盖天然S蛋白的胞外区，还涵盖经突变衍生的S蛋白胞外区的变体、其功能性片段或其多聚体。例如，天然S蛋白不限于新冠病毒的S蛋白的胞外区(例如如SEQ IDNo:1所示)，而可以是来自其他冠状病毒的S蛋白的胞外区；功能性片段包括但不限于S1亚基、S2亚基或者S1亚基中包含的RBD位点；多聚体优选是三聚体。

如本文所用，“功能性片段”是指多肽分子(例如S蛋白胞外区) 的一部分，其含有多肽全长的至少80％、90％、95％或更多，且保留了全长多肽的免疫原性。即，在本发明中所述的S蛋白的功能性片段也能够成功组装到麻疹病毒载体中，且也能够在受试者中产生针对新冠病毒的免疫力。在一些实施方案中，功能性片段是免疫原性片段。在一些实施方案中，所述功能性片段是S蛋白的RBD片段，其序列如SEQ ID No: 3所示。

在新冠病毒S蛋白中，S1亚基和S2亚基的连接处存在Furin蛋白酶酶切位点(如SEQ ID No:1所示的S蛋白第682-685位氨基酸，RRAS)，在通过RBD结合易感细胞表面后，细胞膜表面Furin蛋白酶剪切该酶切位点，使得S蛋白的S1结构域解离脱落，剩下的S2结构域负责病毒膜与细胞膜的膜融合作用，即为融合后构象。在本发明中，表述“融合前三聚体构象”是指包含三个S1亚基和三个S2亚基的三聚体构象，其中S1亚基未被切割。

在一些方面，本发明提供一种新冠病毒S蛋白变体，所述变体相比于野生型新冠病毒S蛋白序列，消除或破坏了位于S1亚基与S2亚基连接处的Furin蛋白酶酶切位点。

在一些实施方案中，相比于天然新冠病毒S蛋白序列，所述新冠病毒S蛋白变体包含对该酶切位点处或附近的氨基酸的突变以消除或破坏该酶切位点，所述突变包括添加、删除、和取代中的一种或多种，优选为取代，例如保守性取代。在一些具体的实施方案中，相比于如SEQ ID No:1所示的天然新冠病毒S蛋白序列，在变体中第682、683、和/或 685位氨基酸发生突变，优选为R682G/R683S/R685S取代，即RRAR 突变为GSAS。

在一些进一步的实施方案中，所述新冠病毒S蛋白变体还包含使S 蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变。所述突变可选自添加、删除、和取代中的一种或多种。在一些具体的实施方案中，所述突变为 K986P/V987P取代，取代后的两个脯氨酸之间将形成分子间共价键以稳定S蛋白融合前的三聚体构象。如本领域中技术人员所理解的，所述突变也可以是取代为其他氨基酸，只要也能实现S蛋白融合前三聚体构象稳定化并且不干扰S蛋白的正常折叠。

进一步地，相比于天然新冠病毒S蛋白序列，所述新冠病毒S蛋白变体还包含位于C末端的基序序列。可以出于多种目的加入基序序列，例如维持S蛋白三聚体构象和更好地促进S蛋白的释放等。在一些实施方案中，所述基序序列包含或组成为SEQ ID No:4。如本领域技术人员理解的，所述基序序列不限于如SEQ ID No:4所示的序列，其可以是另外的序列，只要能提供期望的功能。

在一些具体的实施方案中，本文公开的新冠病毒S蛋白变体的氨基酸序列包含或组成为SEQ ID No:2。

在一些另外的实施方案中，本发明还提供以下新冠病毒S蛋白变体，其包含与SEQID No:2具有至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。本发明涵盖将这些新冠病毒 S蛋白变体或其功能性片段用于构建重组麻疹病毒载体。

在本发明中，序列比对、确定序列同一性百分比和对应序列位置可以根据本领域中已知的一些软件进行，例如BLAST程序、CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)、MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)或MUSCLE(Multiple Sequence Alignment)，以这些网站指示的缺省参数来探查(例如比对)获得的序列。如本文使用的，当关于比对氨基酸序列的特定对使用时，术语“同一性”或“百分比同一性”指氨基酸序列同一性百分比，其通过计数在比对中的相同匹配数目，并且将这样的相同匹配数目除以比对序列的长度来获得。

例如，可以通过Needleman-Wunsch总体比对和评分算法 (Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453)计算同一性，如通过作为EMBOSS软件包的部分分配的“Needle”程序执行的 (Rice，P.等人(2000)EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite，Trends in Genetics 16(6):276-277，在其他资源中，可在embnet.org/resource/emboss和emboss.sourceforge.net处从 EMBnet获得的版本6.3.1)，使用默认缺口罚分和评分矩阵(用于蛋白质的EBLOSUM62和用于DNA的EDNAFULL)。

另外的数学算法是本领域中已知的并且可以用于比较两个序列。可以用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索的蛋白质查询)执行 BLAST蛋白质搜索，以获得与S蛋白同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述利用。可替代地，PSI-Blast可以用于执行迭代搜索，其检测分子之间的遥远关系(参见Altschul等人，同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast 程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过检查手动执行。

关于与参考序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”在比对中与残基配对的参考序列中的位置。“位置”由数目指示，该数目基于其相对于N末端的位置依次鉴定参考序列中的每个氨基酸。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，一般而言，如通过从N末端简单计数确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与参考序列中其对应位置的数目相同。例如，在其中比对的测试序列中存在缺失的情况下，在缺失位点处没有氨基酸对应于参考序列中的位置。当比对的参考序列中存在插入时，该插入将不对应于参考序列中的任何氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可以存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段。

在本发明中，通过破坏Furin蛋白酶酶切位点以防止S1亚基被剪切，保留了S1亚基且因此保持S蛋白融合前构象，形成包含三个S1亚基和三个S2亚基的S蛋白三聚体。如本发明验证的，保持S蛋白融合前构象有利于免疫后中和抗体的产生，在重组麻疹病毒中表达S蛋白三聚体可以诱导产生更强、更有针对性的免疫反应，进而起到更好的保护效果。

重组麻疹病毒载体

麻疹病毒(MeV)属于副粘病毒病毒科麻疹病毒属，是一种具有不分节段的单股负链RNA基因组(长度约16kb)的包膜病毒。由于其基因组是负链RNA基因组，在体内或体外均不翻译，不具有感染性。麻疹病毒RNA基因组编码6种结构蛋白：核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和依赖RNA的 RNA聚合酶大蛋白(L)，以及2种非结构性蛋白V和C(调节病毒复制以及宿主先天性免疫应答)。在本文中，麻疹病毒的核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素蛋白和RNA聚合酶大蛋白也可称为“N 蛋白”、“P蛋白”、“M蛋白”、“F蛋白”、“H蛋白”和“L蛋白”。这些成分在现有技术中已经鉴定，并特别公开于Fields,Virology(Knipe& Howley,2001)中。蛋白H、F和M构成病毒的包膜并且负责病毒附接、膜融合和病毒进入。麻疹病毒基因组中可以插入外源遗传材料的大片段，可以长达6kb甚至更长。

麻疹疫苗是迄今为止开发的最安全、最稳定且有效的人类疫苗之一，目前国外使用的减毒的活MV疫苗毒株有例如Schwarz株、Moraten 株和Edmonston-Zagreb株，这几种减毒疫苗株几乎都通过在非人细胞中多次传代而获得。在中国广泛使用的麻疹病毒株是沪191株(Hu191)，它是中国第一株麻疹减毒活株，反应适中，免疫性良好，且具有较好的免疫持久性。麻疹病毒的“减毒株”定义为在相同宿主中无毒或比母株低毒的毒株，施用于宿主时保留免疫原性以及可能的佐剂性。

在一些方面，本发明提供了重组麻疹病毒载体，其中在麻疹病毒基因组负链RNA序列中包含与编码新冠病毒抗原蛋白的正链RNA序列互补的负链RNA序列。在一些实施方案中，所述麻疹病毒基因组RNA负链是来自或衍生自减毒MV疫苗株的麻疹病毒的全长基因组负链RNA。

如本文所用，术语“重组麻疹病毒载体”、“重组麻疹病毒”或“重组麻疹病毒颗粒”可以互换使用，其意指麻疹病毒囊膜包裹的基因组负链RNA中含有异源多核苷酸，例如来自其他病毒的异源多核苷酸。在本发明中，与初始麻疹病毒(例如沪191株中包含的麻疹病毒)相比，重组麻疹病毒在其RNA基因组中包含来自新冠病毒的异源多核苷酸，例如新冠病毒抗原蛋白编码序列互补的负链RNA序列。

如本文所用，术语“负链RNA”，例如麻疹病毒基因组的负链RNA，是指不能作为mRNA起作用，必须先合成互补链(正链RNA)作为 mRNA，再进行蛋白质翻译的RNA。相应地，其互补序列称为正链RNA 序列。麻疹病毒基因组负链RNA对应的正链RNA又称为反基因组正链RNA。

在一些实施方案中，与编码至少一种新冠病毒抗原蛋白的正链RNA 序列互补的负链RNA序列和麻疹病毒基因组负链RNA序列可操作地连接，特别时插入到该基因组负链RNA序列中。优选地，编码至少一种新冠病毒抗原蛋白的负链RNA序列是经过密码子优化的，特别是针对哺乳动物密码子优化的，以提供在哺乳动物中更高的蛋白表达。在一些优选的实施方案中，互补的负链RNA序列的核苷酸数目符合麻疹病毒的6倍规则。

如本领域已知的，麻疹病毒的“6倍规则”是指来自麻疹病毒负链 RNA基因组的负链RNA序列和/或插入的异源多核苷酸中存在的核苷酸数目是6的倍数。“6倍规则”已被本领域认为是麻疹病毒基因组中有关核苷酸总数的要求，其使得MV基因组RNA有效或优化复制。

在一些实施方案中，所述麻疹病毒基因组负链RNA序列是来自或衍生自减毒麻疹病毒疫苗株的麻疹病毒的全长基因组负链RNA。所述减毒麻疹病毒疫苗株可以选自：沪191株、Schwarz株、Moraten株、 AIK-C株和Edmonston-Zagreb株。所有这些毒株均已在现有技术中记载并可获得，特别是用作商业化疫苗。优选地，所述减毒麻疹病毒疫苗株为沪191株，即其基因组与沪191株完全相同。

麻疹病毒的减毒株指在选取的细胞上经系列传代并且可能地，适应于其他细胞以产生适于制备疫苗株的种子毒株的毒株，其具有不允许回复到病原性也不整合入宿主染色体的稳定基因组。作为具体的“减毒株”，经确证的用于疫苗的毒株是适于本发明的减毒株，其满足FDA(美国食品和药物管理局)限定的规则，即经过对实验室和临床数据严格的审阅后，其满足安全性、效力、质量和重复性规则 (www.fda.gov/cber/vaccine/ vacappr.htm)。

在一些实施方案中，与编码新冠病毒抗原蛋白的正链RNA序列互补的负链RNA序列可操作地连接于麻疹病毒基因组负链RNA序列，例如插入基因间隔区域中。例如，可以位于N和P基因之间、P和M基因之间、M和F基因之间、F和H基因之间或者H和L基因之间。在一些实施方案中，当几种不同的多核苷酸存在于重组麻疹病毒载体中时，这些对应于新冠病毒抗原蛋白的多核苷酸的每一个可以插入麻疹病毒载体的不同位点中，例如一个多核苷酸位于P和M基因之间，另一个多核苷酸位于H和L基因之间。在一些优选的实施方案中，与编码至少一种新冠病毒抗原蛋白的正链RNA互补的负链RNA序列插入麻疹病毒载体的P和M基因之间的基因间区域中。

在一些实施方案中，本文公开的重组麻疹病毒载体包含对应于以下基因转录单元的负链RNA序列，从3’到5’(对应于正链RNA的5’到3’) 依次包含：编码MV的N蛋白的多核苷酸，编码MV的P蛋白的多核苷酸，编码至少一种新冠病毒抗原蛋白(例如S蛋白或其功能性片段) 的多核苷酸，编码MV的M蛋白的多核苷酸，编码MV的F蛋白的多核苷酸，编码MV的H蛋白的多核苷酸，和编码MV的L蛋白的多核苷酸。

在一些另外的实施方案中，本文公开的重组麻疹病毒载体包含对应以下于基因转录单元的负链RNA序列，从3’到5’(对应于正链RNA 的5’到3’)依次包含：编码MV的N蛋白的多核苷酸，编码MV的P 蛋白的多核苷酸，编码MV的M蛋白的多核苷酸，编码MV的F蛋白的多核苷酸，编码MV的H蛋白的多核苷酸，编码至少一种新冠病毒抗原蛋白(例如S蛋白或其功能性片段)的多核苷酸，和编码MV的L 蛋白的多核苷酸。

优选地，所述多核苷酸可操作地连接到麻疹病毒cDNA中编码MV 的P蛋白与编码MV的M蛋白的多核苷酸之间，并且受病毒复制和转录调控序列例如MV前导序列和尾随序列控制。

在某些情况下，该重组麻疹病毒载体可以另外包含用于控制表达的多个元件对应的负链RNA序列，所述元件包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、内含子、kozak序列、polyA序列、选择元件和报道基因。这些调控元件可以是与麻疹病毒编码序列同源或异源的。

在一些实施方案中，所述新冠病毒抗原蛋白是新冠病毒的天然S蛋白单体。在一些实施方案中，所述新冠病毒抗原蛋白是如本文公开的新冠病毒S蛋白变体或其功能性片段或其多聚体，特别是S蛋白变体的三聚体。优选地，产生的重组麻疹病毒载体包含如本文公开的新冠病毒S 蛋白突变体或其功能性片段的三聚体，其在囊膜表面表达，呈融合前三聚体构象。本发明还涵盖用于重组麻疹病毒的新冠病毒抗原蛋白还可以是除S蛋白以外的其他蛋白，例如E蛋白、M蛋白、N蛋白。

编码S蛋白的多核苷酸和包含该多核苷酸的核酸构建体

在一些方面，本发明还提供编码如本文公开的S蛋白、其功能性片段的多核苷酸。

优选地，编码S蛋白、其功能性片段或其多聚体的多核苷酸序列是经过密码子优化的，例如针对哺乳动物中表达进行过密码子优化的。如本文所用，术语“密码子优化的”是指为在特定细胞类型中表达而经密码子优化，特别是可以为人密码子使用而修饰。该优化使得重组感染性颗粒在细胞中的产生效率增加，而不影响表达的蛋白。如上文提到的，该多核苷酸的核苷酸数目优选也符合麻疹病毒的6倍规则。

在一些实施方案中，本发明涵盖包含以下的多核苷酸：

a)编码SEQ ID NO：2所示的S蛋白的核酸序列；

b)如SEQ ID NO：5所示的核酸序列；或

c)在高严格条件下与a)或b)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

具体地，所述多核苷酸可以包含如SEQ ID No:5所示的序列或由其组成。

在一些方面，本发明还提供核酸构建体，其包含如上文所述的多核苷酸序列可操作地连接至编码麻疹病毒反基因组正链RNA的cDNA序列。所述麻疹病毒反基因组正链RNA是指与麻疹病毒基因组负链RNA 互补的正链RNA序列。所述多核苷酸序列可以插入cDNA序列中，例如插入ATU(额外转录单元)中，麻疹病毒的ATU是本领域技术人员已知的。所述多核苷酸序列优选地定位于cDNA分子的N末端序列中，并且尤其定位于例如插入cDNA序列的P基因与M基因之间或H基因与L基因之间。

如本文所用，术语“可操作地连接”在本发明中指核酸构建体或载体中的不同多核苷酸之间存在的功能性连接，由此所述不同的多核苷酸和核酸构建体有效转录，并且在适当的情况下翻译，特别是在细胞或细胞系中，尤其是在用作拯救系统的一部分产生本发明的重组感染性麻疹病毒颗粒的细胞或细胞系或宿主细胞中。

所述多核苷酸可以位于同源或异源表达控制序列的控制下。在一些实施方案中，所述核酸构建体中除了S蛋白编码序列之外，还包含表达控制序列，例如转录启动子和终止序列以及可能的增强子和其他顺式作用元件，这些调控元件可以是与麻疹病毒编码序列同源或异源的。备选地，所述多核苷酸中不包含另外的表达控制序列，而是使用麻疹病毒自身的调控元件驱动S蛋白表达。

可以通过将编码一种或多种新冠病毒抗原蛋白的多核苷酸克隆到编码麻疹病毒全长反基因组正链RNA的cDNA分子中来制备所述核酸构建体。例如，可以使用核酸片段合成或通过由模板聚合(包括通过 PCR)的步骤来制备该核酸构建体。

在一些实施方案中，将麻疹病毒基因组序列与新冠病毒融合前S蛋白编码序列以及质粒分为几个片段转染到酵母菌中，通过同源重组得到包含新冠病毒融合前S蛋白基因的麻疹病毒全长cDNA克隆质粒。由此，如本文公开的核酸构建体包含在所得麻疹病毒全长cDNA克隆质粒中。该质粒在本文中又称为抗原表达质粒，其可以是酵母-大肠杆菌穿梭质粒。在一些实施方案中，该质粒是基于pYES2质粒构建的。

包含抗原表达质粒的反向遗传系统

反向遗传是通过定点突变某基因，研究其表型来确定该基因的功能的遗传学研究方法。在研究病毒时，反向遗传可通过DNA重组在细胞培养中表达和操作含有特定突变的病毒，从而评估突变对于病毒复制和转录、病原性、病毒-宿主相互作用、抑制宿主细胞应答和宿主范围或传播性等的影响(参见例如Ginés

-Pérez等人，Viruses.2018Nov；10(11):597)。已经有各种反向遗传方法用于恢复各种病毒家族的重组病毒，包括正链RNA病毒例如管状病毒、小核糖核酸病毒、黄病毒；负链RNA病毒例如流感病毒和沙粒病毒等。反向遗传还已经用于开发基于病毒减毒形式的疫苗和产生携带报告基因以追踪病毒感染的重组病毒。由于反向遗传的众多优点，例如快速生产和突变病毒(包括重排列)，它是病毒学和疫苗制造的有效工具。

在一些方面，本发明提供了用于拯救表达新型冠状病毒抗原蛋白的重组麻疹病毒载体疫苗株的反向遗传系统。在一些实施方案中，所述抗原蛋白是融合前S蛋白突变体三聚体。

在一些实施方案中，该反向遗传系统包含如上文所述的抗原表达质粒，其中包含编码新冠病毒抗原蛋白，例如S蛋白突变体的多核苷酸；和辅助质粒或辅助细胞系。具体地，所述辅助质粒可以为分别包含麻疹病毒N、P和L基因的三种辅助质粒，所述辅助质粒可以使用载体pT7 构建，例如所述辅助质粒可以分别为pT7-Hu191-N、pT7-Hu191-P和pT7-Hu191-L，其中辅助质粒pT7-Hu191-N含有麻疹病毒的核衣壳蛋白编码基因，辅助质粒pT7-Hu191-P含有麻疹病毒的磷蛋白编码基因，辅助质粒pT7-Hu191-L含有麻疹病毒RNA聚合酶编码基因。备选地，可以不使用辅助质粒而采用辅助细胞系，所述辅助细胞系经过在细胞中导入麻疹病毒的核衣壳蛋白N、磷蛋白P以及RNA聚合酶L的编码序列而获得，能够稳定地表达这些蛋白，在用抗原表达质粒转染后即能组装出重组麻疹病毒颗粒。优选地，所述辅助细胞也能表达RNA聚合酶，例如T7噬菌体聚合酶。关于辅助细胞的例子，可参见Radecke F等人 (1995)Rescue of measles viruses from clonedDNA.EMBO J 14(23):5773–5784中提到的293-3-46细胞系。

在一些实施方案中，通过将如上文所述的抗原表达质粒和辅助质粒共转染到细胞中来制备重组麻疹病毒颗粒。

在一些另外的实施方案中，采用稳定表达麻疹病毒N蛋白、P蛋白和L蛋白的辅助细胞系，通过用如上文所述的抗原表达质粒转染该辅助细胞来制备重组麻疹病毒颗粒。

进一步地，本发明提供了使用此类反向遗传系统来产生重组麻疹病毒颗粒的方法，包括以下步骤：

a)将抗原表达质粒和辅助质粒共转染至第一细胞系中；

b)转染后收集细胞上清混合物感染第二细胞系，收集培养后获得的表达新冠病毒抗原蛋白的重组麻疹病毒。

在一些实施方案中，抗原表达质粒和各辅助质粒加入的质量比为 FL：N：P：L＝10：3：3：1，其中FL代表抗原表达质粒，N、P、L 分别代表表达N、P、L蛋白的辅助质粒。在一些实施方案中，辅助质粒分别为pT7-Hu191-N、pT7-Hu191-P、pT7-Hu191-L。

优选地，抗原表达质粒和辅助质粒都是基于真核表达质粒而构建的，且所述反向遗传系统用于在真核细胞中表达。在一些实施方案中，第一细胞系是稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-T7细胞。优选地，第二细胞系是Vero细胞。Vero细胞是世界卫生组织(WHO)和《中国药典》认可的疫苗生产细胞系。

包含重组麻疹病毒颗粒的组合物、疫苗及其应用

在一些方面，本发明还涉及组合物，其包含如上文公开的重组麻疹病毒颗粒和一种或多种药学上可接受的运载体。这些组合物诱导针对新冠病毒的免疫应答，特别是保护性免疫应答，并特别引发针对新冠病毒抗原蛋白的抗体产生和/或引发针对新冠病毒感染的细胞免疫应答。这些组合物相应地可包含对宿主、尤其是人宿主施用的适合的运载体，例如药学上可接受的运载体，并且可进一步包含但非必须的佐剂以增强宿主中的免疫应答。

术语“药学上可接受的”是指由监管机构批准或在各国药典或其他普遍认可的药典中列出可用于动物，尤其是人类的。术语“运载体”是指药物组合物或疫苗组合物(例如，免疫原性或疫苗制剂)与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物运载体的例子在E.W.Martin的 “Remington's Pharmaceutical Sciences”中有所描述。制剂应适合于施用方式。

在一些实施方案中，所述组合物是免疫原性组合物，特别是疫苗组合物。所述组合物或疫苗用于在预防疗法中防止新冠病毒感染，以及任选地，同时防止麻疹病毒感染。该疫苗组合物有利地包含拯救自反向遗传系统的重组麻疹病毒颗粒。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以通过标准施用途径来施用。可以使用许多方法将制剂引入受试者，这些方法包括但不限于鼻内、气管内、口服、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、经结膜和皮下途径。

在一些方面，本发明提供了如本文公开的重组麻疹病毒载体或组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒的疫苗中的用途。疫苗的施用对象可以是哺乳动物受试者，例如猴、猿、黑猩猩、猫、狗、牛、马、小鼠、大鼠、兔和人(包括成人和儿童)等。

本发明还涵盖如本文公开的重组麻疹病毒载体或组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒感染引起的疾病或病况的药物中的用途。所述疾病或病况包括但不限于，发热、肌肉酸痛、周身乏力、呼吸困难、以及新冠病毒传染的并发症，例如急性呼吸拮据综合征、脓毒症、休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍、多器官衰竭、消化道症状及神经系统症状等。

在一些实施方案中，单剂量施用所述组合物或疫苗。备选地，可以在免疫-加强方案中多剂量施用。考虑到关于适于已知人MV疫苗的剂量的可用知识，目前已知的人MV疫苗剂量为10³至10⁴pfu，可以以约 0.1-1000ng的有效剂量施用本文提供的重组麻疹病毒。在这些实施方案的某些中，以约100ng或更少的剂量施用本文提供的重组麻疹病毒，并且在这些实施方案的某些中，剂量是50ng或更少，10ng或更少，5ng 或更少，或0.1ng或更少。在某些实施方案中，施用剂量可以在预防或治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方案中，取决于受试者的反应，施用剂量可以在预防或治疗过程中变化可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答。例如，可以施用单剂量，或者可以随时间施用数个分开的剂量。

联合治疗

在一些方面，本发明提供将如本文公开的重组麻疹病毒颗粒或组合物与其他治疗或预防新冠病毒感染的药物联合使用。所述其他药物包括目前已知或常规使用的新冠治疗药物，包括但不限于抗感染的抗生素类药物以及瑞德西韦、利巴韦林、阿比多尔、干扰素等。

有益效果

与新型冠状病毒灭活疫苗和腺病毒载体新冠疫苗相比，麻疹病毒载体新冠疫苗优势明显。

在本发明中，以麻疹病毒沪191疫苗株作为重组疫苗载体平台，插入新冠病毒融合前的S三聚体蛋白基因，可以有效表达新冠病毒融合前 S三聚体蛋白，获得表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒以作为新冠病毒有效的候选疫苗株。

1)效率高：本发明的重组麻疹病毒载体或重组麻疹病毒颗粒出毒率高，稳定性也高，在生产过程中容易获得高滴度高质量的重组麻疹病毒颗粒。

2)预防性好：能够产生较高的中和抗体滴度，而且同时能用于防止麻疹病毒感染。

3)安全性好：本重组麻疹病毒载体疫苗以麻疹病毒疫苗株 rMV-S191为骨架，“沪191”麻疹减毒活疫苗的生产至今已有近60年，在我国应用超过20亿剂，是世界上产量最大的疫苗株之一。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1：表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒感染性克隆质粒pYES2-rMeV-SC2-ST目的片段的扩增

实验中使用的沪191株由麻疹沪191反向遗传系统拯救而来(Yilong Wang等人,Virology.2018；518:210-20.)。表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组麻疹病毒感染性克隆质粒pYES2-rMeV-SC2-ST目的片段的扩增示意图如图1所示。简言之，以麻疹沪191株全长cDNA为模板，使用9对相互有重叠的引物分段扩增出Hu191疫苗株全长基因组，9个片段分别是N、P、M、F、H、L1、L2、Y1、Y2。以新冠病毒融合前 S蛋白氨基酸序列为模板合成的新冠病毒融合前S蛋白密码子优化序列 (如SEQ ID No:3所示)，在此新冠病毒融合前S三聚体蛋白密码子优化序列为模板基础上设计引物在S蛋白基因两端分别加上5’和3’同源序列，以插入到麻疹病毒P和M之间(引物序列见表1)。

表1

实施例2：pYES2-rMeV-SC2-ST全长感染性克隆的拼接

利用酵母转化的方法，将扩增的10个片段N、P、S、M、F、H、 L1、L2、Y1、Y2以及pYES2质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司) 在酵母中完成拼接。反应体系如下：

随后通过酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，随即电转到TOP 10 大肠杆菌感受态细胞中。

实施例3：pYES2-rMeV-SC2-ST全长感染性克隆的验证

随机挑取单个克隆，分别接种到5mL含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB液体培养基中，37℃摇床中培养12h，按照AxyPrep质粒DNA 小量试剂盒说明书提取所挑取的克隆，进而获得 pYES2-MeV-SARS-CoV-2-S全长感染性克隆质粒，对全长感染性克隆进行PCR扩增，通过核酸电泳验证PCR产物分子量大小是否符合预期；当PCR产物分子量大小正确后，通过基因测序验证序列的正确性。

PCR测序引物采用表1中相同的引物，取5μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶中电泳检测，pYES2-rMeV-SC2-ST全长感染性克隆全部基因片段均可检测到(结果如图4所示)。阳性克隆质粒送往尚亚生物技术有限公司测序。保存测序正确的全长感染性克隆甘油菌，得到pYES2-rMeV-SC2-ST全长感染性克隆质粒。

实施例4：病毒拯救及空斑纯化

辅助质粒的构建：辅助质粒的构建参见Virology 518(2018)210-220，其通过提述全文并入本文。简言之，将pT7CFE1-CMyc载体质粒用NdeI、 XhoI于37℃酶切消化1h，得到线性片段。使用GeneArt^TM Seamless Cloning and Assembly Kit将沪191株的N蛋白编码序列与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段、P蛋白编码序列与pT7CFE1-CMyc 线性化载体片段、L蛋白的两个编码序列与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段分别进行连接并转化，表达获得N、P、L的3种辅助质粒，分别为pT7-Hu191-N、pT7-Hu191-P和pT7-Hu191-L。

用pYES2-rMeV-SC2-ST全长感染性克隆质粒1.2μg，以及其辅助质粒pT7-Hu191-N1.5μg、pT7-Hu191-P 1.5μg和pT7-Hu191-L 0.5μg 共转染BHK-T7细胞。转染4天后收集细胞上清混合物感染Vero细胞 (ATCC)，逐日观察，直到出现细胞合胞体病变(如图5所示)，细胞反复冻融后离心后收集拯救病毒上清液，拯救的病毒命名为 rMeV-SC2-ST。

拯救病毒感染6孔板中的单层Vero细胞，1h后换液，加入含2％ FBS，2％低熔点琼脂糖的MEM，48h后加入0.33％中性红，2％FBS， 2％低熔点琼脂糖的MEM进行染色。37℃培养6天后挑取噬斑至铺有 Vero细胞的96孔板获得纯化的重组拯救病毒。

实施例5：rMeV-SC2-ST的RT-PCR鉴定结果及测序验证

对纯化后rMeV-SC2-ST感染的Vero细胞的上清液和细胞样品提取总RNA，反转录成cDNA。设计引物扩增新冠病毒S基因片段，其中，上游引物rMeV-SC2-ST-F：5’-ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTC-3’；下游引物rMeV-SC2-ST-R：5’-TTAGCCCAGGAATGTGCTCAG-3’，PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，可以检测到 rMeV-SC2-ST的新冠病毒S基因片段(结果如图6)，将新冠病毒S 基因PCR产物送往尚亚生物技术有限公司测序。根据测序结果，成功拯救获得能够稳定传代的带有新冠S蛋白基因的重组麻疹病毒 rMeV-SC2-ST。

实施例6：间接免疫荧光(IFA)检测验证rMeV-SC2-ST中新冠病毒S蛋白的表达

在12孔板铺Vero细胞，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到70％左右进行感染，感染48h后使用MeV-N蛋白鼠单克隆抗体(abcam，ab106292)和SARS-CoV-2-S蛋白兔单克隆抗体(义翘神州，40150-R007)，通过间接免疫荧光检测检测rMeV-SC2-ST中新冠病毒S蛋白的表达情况。结果显示感染重组麻疹病毒的Vero细胞，荧光显微镜下能够明显的观察到红色荧光信号(针对MeV-N蛋白)以及绿色荧光信号(针对SARS-CoV-2-S蛋白)(如图7所示)，表明重组病毒rMeV-SC2-ST能够表达SARS-CoV-2的S蛋白。

实施例7：rMeV-SC2-ST表达新冠病毒S蛋白稳定性检测

rMeV-SC2-ST在Vero细胞中连续传代至第20代，通过间接免疫荧光(IFA)依然可以检测rMeV-SC2-ST中新冠病毒S蛋白的表达，荧光显微镜下能够明显的观察到红色荧光信号(针对MeV-N蛋白)以及绿色荧光信号(针对SARS-CoV-2-S蛋白)(如图8所示)，表明重组病毒rMeV-SC2-ST能够稳定表达SARS-CoV-2的S蛋白。

实施例8：rMeV-SC2-ST感染Vero细胞后检测新冠病毒S蛋白三聚体的表达

在6孔板中铺Vero细胞，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到70％左右进行感染。rMeV-SC2-ST感染Vero细胞96h 后，通过添加300μl非变性细胞裂解液来裂解细胞，然后以12000rpm 离心5min以去除细胞碎片，取上清，该上清即为需要的蛋白质样品。将蛋白质样品分为两份(每份100μl)，一份不进行蛋白变性处理，另一份通过煮沸，将蛋白质样品变性。通过Western Blot检测新冠病毒S 蛋白三聚体的表达，两份蛋白样品首先跑非变性的PAGE胶，接着转膜，孵育一抗(SARS-CoV-2-S蛋白兔单克隆抗体，义翘神州，40150-R007)。通过显影检测到有特异性的条带。变性蛋白泳道(泳道1)在180kDa 左右出现一条单一条带(下方箭头)，蛋白单体分子量大小一致，非变性蛋白泳道(泳道2)，最上方迁移很慢的为三聚体蛋白(上方箭头)，下方有一条与变性蛋白条带一致，表明S三聚体蛋白表达成功(如图9 所示)。

实施例9：rMeV-SC2-ST在Vero细胞中一步生长曲线测定

在6孔板中铺Vero细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到70％左右以MOI＝0.01进行感染，孵育1h后，弃去病毒并用DMEM洗两次，后加入含2％FBS的DMEM培养。在感染后不同时间点收集细胞上清和细胞裂解物并混合，在Vero细胞中通过TCID₅₀测定病毒滴度。结果显示rMeV-SC2-ST在Vero细胞中生长良好，相对于亲本毒rMeV表现出延迟的生长特性，表明该重组毒进一步致弱，但最高滴度接近于10⁶TCID₅₀/ml，可满足于疫苗生产需要(如图10所示)。

实施例10：SARS-CoV-2S三聚体多克隆抗体对假病毒感染的抗中和效果

10.1新型冠状病毒(SARS-CoV2)S单体及三聚体蛋白的质粒构建

利用杆状病毒表达系统(pFastBac，购自ThermoFisher)表达 SARS-CoV2的S蛋白单体及三聚体，并于C端加入His标签利于检测蛋白表达。

10.2SARS-CoV2 S单体及三聚体的表达及纯化

将选取鉴定正确的阳性Bacmid转染Sf21细胞(购自ATCC)， 4-5天后离心收取细胞上清，即为P0代毒；之后经Sf21细胞扩毒2 次后接种于状态良好的H5细胞(购自ATCC)，以22℃，120rpm 培养48h，离心收集细胞上清，利用Ni柱纯化目的蛋白。

10.3SARS-CoV2 S单体及S三聚体多克隆抗体的制备

采购18只雌性BALB/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，饲养于SPF级鼠笼中。小鼠在8周龄时进行一免，取纯化的 S单体及三聚体蛋白各15μg，分别加入等量的博奥龙小鼠五周快速免疫佐剂(Biodragon,KX0210041)，混匀后对小鼠进行后腿小腿肌肉注射，每种蛋白免疫6只小鼠，同时以6只未免疫小鼠作为阴性对照，间隔三周后使用相同剂量对小鼠进行二免，二免两周后对小鼠采血，分别以抗原SARS-CoV2 S单体及S三聚体为检测抗原，作间接 ELISA检测获得的鼠抗多克隆抗体效价，结果显示所有抗体效价均可达到1:50000以上。

10.4利用新冠假病毒进行S单体和三聚体鼠多抗血清的中和抗体滴度检测

将缺少Env基因而表达荧光素酶的HIV骨架质粒pNL4-3 R-E-.Luc与表达SARS-CoV-2-S真核表达质粒共转染至293T细胞，转染后48h收取假病毒。将假病毒分别与连续梯度稀释的SARS-CoV-2 S单体和三聚体多抗混合，放置细胞培养箱中共孵育30min后，将混合物加入到瞬时表达ACE2的BHK-21细胞培养基中，48h后收取细胞。

如图11所示，与对照血清相比，鼠抗SARS-CoV-2S单体蛋白的多克隆抗体和鼠抗SARS-CoV-2S三聚体蛋白的多克隆抗体均能有效中和SARS-CoV-2假病毒的感染(P<0.05)，但两种类型的多抗的中和作用存在显著差异，与鼠抗SARS-CoV-2S单体多克隆抗体相比，采集自鼠抗SARS-CoV-2S三聚体的多克隆抗体在连续稀释的情况下对假病毒感染具有显著更强的中和效果(＊＊＊，p<0.005)，直到达到高稀释下的无差异稳定。

实施例11：在仓鼠中施用rMeV-SC2-ST后产生的抗体的滴度测定

11.1动物实验

约6-7周龄的雌性叙利亚金色仓鼠(无特定病原体(SPF))购自上海市松江区松联实验动物场。接种前，通过商业ELISA试剂盒 (Haitai Biological Pharmacy Co.，中国珠海)确认动物中MeV的抗体呈阴性。所有动物实验均严格按照浙江大学实验动物伦理委员会规定依照动物研究和体内实验报告(ARRIVE)指南进行。

20只仓鼠随机分为四组，每组5只：分别腹腔内接种rMeV-GFP (阴性对照，n＝5)，rMeV-SC2-RBD(n＝5)，rMeV-SC2-S(n＝ 5)或rMeV-SC2-ST(n＝5)。接种的重组麻疹病毒体积为1mL，滴度为1×10⁵TCID₅₀。仓鼠三周后，再次腹腔接种体积为1mL，滴度为 5×10⁵TCID₅₀的rMeV-GFP或3种不同的基于rMeV的候选疫苗。在接种后0、3和7周收集血清样品并分别测试MeV的特异性抗体、 SARS-CoV-2S蛋白的特异性抗体和SARS-CoV-2的中和抗体。接种后7周将仓鼠安乐死。

11.2MeV抗体ELISA

通过使用麻疹病毒IgG抗体ELISA试剂盒(Haitai Biological Pharmacy Co.)以及抗Armenian仓鼠IgG H&L(HRP)(ab5745, Abcam)来测量MeV特异性抗体。结果显示于图12A。检测线低于cut off值，将检测结果判定为阴性。

11.3SARS-CoV-2抗体ELISA

通过BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime Biotechnology，中国上海) 测定SARS-CoV-2S三聚体蛋白的浓度，以SARS-CoV-2S三聚体蛋白包被Elisa板子。用含0.05％Tween的PBS(PBST)将板洗涤3次，然后在37℃下于5％牛血清白蛋白中封闭1h。用PBST洗涤3次后，将板与血清样品(2倍稀释)在37℃孵育1小时。以小鼠三聚体蛋白的高免疫血清是阳性对照(实施例9中制备)。用PBST洗涤3次后，在37℃下加入抗HRP标记的仓鼠IgG或HRP标记的小鼠IgG(1： 25000稀释)。用PBST洗涤3次后，添加1x TMB(四甲基联苯胺) 底物(Invitrogen)并在37℃下孵育15分钟，然后通过添加2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪对450nm处的吸光度进行定量。样品与阴性OD₄₅₀的比率大于0.3被认为是显著阳性。结果显示于图12B。检测线低于cut off值，将检测结果判定为阴性。

11.4病毒-血清中和抗体测定

通过Elisa试剂盒(抗SARS-CoV-2中和抗体ELISA试剂盒， Vazyme)按照说明书测量SARS-CoV-2中和抗体。用酶标仪对450nm 处的吸光度进行定量。100％-(样品OD₄₅₀/阴性样品OD₄₅₀)>20％时，判定中和抗体为阳性。

结果显示于图12C。检测线低于cut off值，将检测结果判定为阴性。在免疫后第7周rMeV-SC2-ST组的仓鼠血清中的SARS-CoV-2中和抗体效价显著高于rMeV-SC2-S、rMeV-SC2-RBD组和rMeV-GFP 组(＊＊＊，p<0.005；＊＊，p<0.01；＊，p<0.05)。

微生物入侵人体后，刺激机体产生多种抗体，其中只有部分抗体能能产生对微生物的识别，并在其入侵细胞前将其捕获，保护人体不受感染。这个过程被称为中和作用，发挥作用的抗体就是中和抗体。因此疫苗诱导中和抗体水平的高低是评判疫苗免疫效果好坏的重要指标。在仓鼠免疫第7周，rMeV-SC2-ST组诱导的中和抗体水平显著高于 rMeV-SC2-S、rMeV-SC2-RBD组和rMeV-GFP组，因此rMeV-SC2-ST 免疫后会为机体提供更好的保护效果。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 表达新冠病毒蛋白的重组麻疹病毒及其应用

<130> IDC206045

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1208

<212> PRT

<213> SARS-Cov-2

<400> 1

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<210> 2

<211> 1238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S变体

<400> 2

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Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Leu Arg

1205 1210 1215

Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu

1220 1225 1230

Ser Thr Phe Leu Gly

1235

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> SARS-Cov-2

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端基序

<400> 4

Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Leu Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val

1 5 10 15

Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly

20 25 30

<210> 5

<211> 3717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S变体编码序列

<400> 5

atgttcgtgt tcctggtgct cctgcctctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

cgaacccagc tcccaccagc ctacaccaac agctttacac ggggcgtgta ctaccctgac 120

aaggtgttca gatctagcgt cctgcacagc actcaggacc tcttcctgcc gttcttcagc 180

aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg agcggcacaa acggaaccaa gcggtttgat 240

aaccccgtcc tgccattcaa tgatggagtt tacttcgcca gtaccgagaa gagtaacatc 300

atccggggct ggatcttcgg caccaccctg gatagcaaaa cacagagcct cctgatcgtg 360

aacaatgcca cgaacgtcgt gatcaaggtg tgcgagttcc agttttgcaa tgatcctttc 420

ctgggtgtgt actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt cagagtctac 480

agcagcgcca acaactgcac attcgagtac gtctctcagc cttttctgat ggaccttgag 540

gggaaacaag gcaacttcaa gaacctgaga gaattcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600

ttcaaaatct actccaagca cacacccatc aacctggtcc gggacctccc tcagggcttc 660

agcgccctgg aacccctggt cgacctgccc ataggcatca acataacgcg gttccaaacc 720

ctgctggccc tgcatagatc ctacctgact cctggcgaca gcagcagcgg atggaccgcc 780

ggagctgcag cctactatgt gggctacctg caacctagaa ccttcctgct gaagtacaac 840

gagaacggca caatcacaga cgccgtcgac tgcgccctgg accctctctc tgagacaaag 900

tgcaccctga agtccttcac cgtggaaaag ggcatctacc agaccagcaa cttccgggtg 960

cagcctacag agagcatcgt gcgatttcca aacattacca acctctgccc cttcggcgag 1020

gtgtttaacg ccacaagatt tgcctccgtt tacgcctgga atagaaagag aatcagcaat 1080

tgtgtggccg actactccgt gctgtataac agcgcctctt tcagcacctt caagtgctac 1140

ggcgtttccc caacaaagct gaatgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc 1200

gtaattagag gcgatgaggt gcggcagatc gcaccaggcc agaccggtaa gatcgctgac 1260

tacaactata agctgcctga tgattttaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320

ctggatagca aggtgggcgg caactacaac tacctgtacc ggctgtttcg caagtctaac 1380

ctgaaacctt tcgagagaga catctccaca gagatctacc aggccggttc tacaccttgt 1440

aacggggtgg aaggcttcaa ctgttacttc cctctgcaaa gctacggctt ccagcctacc 1500

aatggagtcg gctaccagcc ataccgggtg gtcgtgctgt ccttcgagtt actccacgcc 1560

cccgccaccg tctgcggtcc taagaagtcc accaatctgg ttaagaacaa atgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggcctgac cgggaccggc gtgctgaccg aaagcaacaa aaagttcctc 1680

cccttccagc agttcggccg tgatatcgct gacaccacag atgccgtcag agatccacag 1740

accctggaaa tcctggatat tacaccctgc tccttcggag gagtttctgt gatcaccccc 1800

gggaccaata ccagcaacca ggtggctgtg ctgtaccaag atgttaactg caccgaggtt 1860

cctgtggcca tccacgccga tcagctgaca cctacttgga gagtgtactc cactggctcc 1920

aatgtgttcc agaccagggc cggatgtctg atcggcgccg agcacgtgaa taacagttac 1980

gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgtgccagct accagaccca gacaaacagc 2040

cctgggtctg cttcctctgt agctagccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100

gcagagaaca gcgtggccta ttccaacaac tctatcgcca ttcccaccaa ctttacaatt 2160

agcgtcacaa cagagatcct gcccgtgagc atgaccaaga ccagcgtgga ctgtacaatg 2220

tacatctgtg gcgacagcac tgaatgcagc aacctgctgc tgcaatacgg ctccttttgc 2280

acccaactga accgggcgct gaccggaatc gccgtggaac aggacaaaaa tacccaggag 2340

gtgttcgccc aagtgaagca gatctacaag accccaccta tcaaggactt cggcggcttt 2400

aactttagcc agattctccc tgatccttct aagcctagca agcggagctt tatcgaggat 2460

ctgctgttca acaaggtcac cctggccgat gccggcttta tcaaacagta tggcgattgc 2520

ctgggcgaca tagccgccag agatctgatc tgcgcccaga aattcaacgg cctgacagtt 2580

ctcccacctc tgctgaccga cgagatgatc gctcagtaca cctctgccct gctggctggc 2640

accatcacat ctgggtggac atttggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc ctttgccatg 2700

cagatggcct atagattcaa cggaatcggc gtgacccaga acgtgctgta tgaaaaccag 2760

aagctgatcg ctaaccagtt caattctgcc atcggcaaga tccaggactc cctctcctct 2820

accgccagcg ccctgggcaa actgcaggac gtggtgaatc agaacgccca agccctgaac 2880

accctggtga agcagctcag cagcaatttt ggcgccatca gctctgtgct gaacgatatc 2940

ctgtctagac tggaccctcc agaagccgaa gtccagatcg atagactgat cacaggcaga 3000

ctgcagtccc tgcaaaccta cgtgacccaa cagctgatca gggccgctga aataagagcc 3060

agcgccaatc tcgccgctac caagatgtcc gagtgtgtgc tgggacagtc taaacgcgtt 3120

gacttctgcg gcaaaggcta tcacctgatg agcttccccc agagcgcgcc gcacggcgtg 3180

gtgttcctgc atgtgacata cgtgcctgcc caagagaaga atttcacaac cgcccctgcc 3240

atctgccacg acggcaaggc ccacttccca agagagggcg ttttcgtttc caatggcaca 3300

cactggttcg tgacacaaag aaacttctac gaaccccaga ttatcaccac cgacaacacc 3360

ttcgtgagtg gcaattgtga cgtggtcatc ggaatcgtga acaacacagt gtacgaccct 3420

ctgcaacctg agctggactc ttttaaggaa gagctggaca agtactttaa aaaccacacc 3480

agccccgatg tggacctggg cgacatcagt ggcattaacg ccagcgtggt gaacatccaa 3540

aaggaaatcg acagactgaa cgaggtggcc aagaacctga acgagtccct gatcgacctg 3600

caggagctcg gcaaatacga gcagggatcc ggatacatcc ccgaggccct cagagatggc 3660

caggcctacg tgcggaagga cggcgagtgg gtactgctga gcacattcct gggctaa 3717

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

accaaacaaa gttgggtaag gata 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gatggccagt gagccgatgg 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

cagaagagca ggcacgccat gtc 23

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gaggcaggag caccaggaac acgaacatta tacgcgttga tgggctgg 48

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ccagcccatc aacgcgtata atgttcgtgt tcctggtgct cctgcctc 48

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

cctaagtttt ttataatgga tttaggtttt attagcccag gaatgtgctc 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

gagcacattc ctgggctaat aaaacctaaa tccattataa aaaacttagg 50

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gtggggagtt gagtgtcgtc 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

tcctcctctt ctcgaaggga c 21

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

cctaagtttt aattaactac cgata 25

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

tccctctggc cgaacaat 18

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

acgtttttct taattctgat gtctat 26

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

acatcaggca tacccacta 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

cccacatatg gcttcttag 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

gacaaagagt catgttcagt g 21

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

cagacaaagc tgggaatag 19

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

caatatatta aagaaaactt tg 22

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

cagaatgggc agacattacg aatgc 25

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

gcttcaaacc gctaacaata cc 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

taagtgcact agaagatgat c 21

Claims

(b)促进S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变。

2.权利要求1的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体还包含促进S蛋白释放的突变。

3.权利要求1或2的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中消除或破坏Furin蛋白酶酶切位点的突变为在氨基酸序列第682至685位的一个或多个氨基酸位置处的添加、删除、和/或取代。

4.权利要求3的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述突变为R682G/R683S/R685S取代。

5.前述权利要求中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述促进S蛋白融合前三聚体构象稳定化的突变为K986P/V987P取代。

6.前述权利要求中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体在C末端还包含如SEQ ID No:4所示的基序。

7.前述权利要求中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID No:2具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

8.前述权利要求中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述S蛋白突变体在表达后能形成包含三个S1亚基和三个S2亚基的融合前三聚体构象。

9.前述权利要求中任一项的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段，其中所述功能性片段为免疫原性片段，例如受体结合域(RBD)序列。

10.一种重组麻疹病毒载体，其中在麻疹病毒基因组负链RNA序列中包含与编码权利要求1-9中任一项所述的新冠病毒S蛋白突变体或其功能性片段的正链RNA序列互补的负链RNA序列。