NO334756B1

NO334756B1 - Virion fra humant Respiratorisk Syncytial Virus, sammensetninger omfattende nevnte virus, fremgangsmåte for fremstilling derav, og anvendelser derav.

Info

Publication number: NO334756B1
Application number: NO20062967A
Authority: NO
Inventors: Willem Luytjes; Myra Noorely Widjojoatmodjo
Original assignee: Nederlanden Staat
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2006-06-26
Publication date: 2014-05-19
Also published as: TR201808496T4; HUE032898T2; ZA200605218B; US9107939B2; KR101266715B1; EP1699919A1; SI1699919T1; DK1699919T3; WO2005061698A1; IL176500A0; EP2500419B1; EP2500419A1; CA2551009C; BRPI0418093A; JP2007516721A; CN1922309A; JP4814799B2; AU2004303719B2; US9889168B2; CN1922309B

Abstract

Sammendrag Den foreliggende oppfinnelsen vedrører pneumovirale virioner omfattende et viralt genom som har en mutasjon i et gen som koder for et protein som er essensielt for infektivitet av pneumovi ruset, hvor ved mutasjonen fører til at et virus som fremstilles bare fra det virale genomet mangler infektivitet, og hvor virionet omfatter proteinet i en form og mengde som kreves for infektivitet av virionet. Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåter for å produsere de pneumovirale virionene og for anvendelse av virionene i behandling eller forebygging av pneumoviral infeksjon og sykdom. Et foretrukket pneumoviralt virion er et virion til Respiratorisk Syncytial Virus hvori fortrinnsvis genet for G tilknytningsproteinet er inaktivert og komplimentert in trans.

Description

Området for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører virion fra humant Respiratorisk Syncytial Virus, samt en fremgangsmåte for fremstilling av humane Respiratorisk Syncytial Virus, en sammensetning, anvendelse av et virion av et humant Respiratorisk Syncytial Virus, samt en sammensetning for å forebygge eller behandle en (human) Respiratorisk Syncytial Virusinfeksjon.

Derved har oppfinnelsen relevans på vaksineringsfagfeltet, mer spesifikt vaksiner mot sykdom forårsaket av pneumoviruset Respiratorisk Syncytial Virus (RSV). Oppfinnelsen vedrører RSV virioner som bærer et RSV genom hvori et gen som er en grunnforutsetning for infeksjon er inaktivert, mens det korresponderende villtype genproduktet er komplimentert in trans med virionet. Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåter for fremstilling av slike RSV virioner, samt deres anvendelse i vaksiner og fremgangsmåter for vaksinering mot pneumoviruser.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Humant respiratorisk Syncytial virus er klassifisert i genuset Pneumovirus, familien Paramyxoviruser. Det er en hovedårsak til alvorlig sykdom i de nedre luftveier hos spebarn, eldre personer og hos personer med nedsatt immunforsvar. Det er også en viktig faktor i sykdom i de øver luftveier hos eldre barn og voksne. I dag finnes det ingen effektiv h-RSV vaksine tilgjengelig på dette området.

RSV er et innpakket RNA virus som uttrykker to hovedantigener på overflaten; forankringsprotein G og fusjonsprotein F. Begge proteinene synes å fremkalle beskyttende antistoffer. G er determinanten til de to kjente h-RSV undergruppene A og B. Antigen forskjeller kan finnes innenfor de to gruppene. G proteinet oppviser et høyt variasjonsnivå med bare 53 % aminosyrehomologi mellom A- og B-gruppene, og opp til 20 % forskjeller i G proteinsekvensene innenfor gruppe A. (Mufson 1988, Cane 1991).

Passiv immunisering med RSV-anriket immunoglobulin (Respigam) eller syntetiske humaniserte monoklonale antistoffer mot F (Palivizumab) anvendes fortiden til å behandle og beskytte nyfødte med visse predisposisjoner (for eksempel for tidlig fødte) mot RSV infeksjon (Robinson 2000, Greenough 2000). RSV patologi har to hovedaspekter: celleskade forårsaket av selve viruset og skade på vev forårsaket av det overreagerende immunsystemet. Det siste aspektet er en særdeles kompliserende faktor for vaksinedesign.

RSV infeksjoner er sesongbetonte, begrenset til vinteren, og har størst utbredelse i den nordlige halvkule rundt nyttår. RSV infiserer hvert barn før de fyller to år, og i mange tilfeller to ganger. Eldre personer infiseres i gjennomsnitt annet hvert år avhengig av miljøet: mennesker med nærkontakt med spedbarn og småbarn har en risiko på 50 %. Viruset spres ved nærkontakt, i små dråper eller via forurensede overflater. RSV spres ikke effektivt via aerosoler siden viruspartiklene er relativt ustabile. Intern spredning av viruset fra de øvre luftveier (Upper Reporatory Tract; URT) til de nedre luftveier (Lower Respiratory Tract; LTR) skjer hovedsakelig ved inhalering av viruspartikler produsert i URT epitelet i løpet av den primære infeksjonen. Spredning gjennom syncytium formasjon (en av de patologiske egenskapene til viruset, som gav den dets navn) kan ikke avkreftes og kan spille en sekundær rolle i LTR infeksjon.

Generelt sett begynner RSV patologien i URT, inngangen er gjennom nesen og i en mindre utstrekning gjennom øynene, men ikke gjennom munnen. Når den begrenses til URT vev er sykdommen begrenset til vanlig forkjølelse, selv om den kan være alvorlig hos voksne. Men når viruset kan nå LRT kan det føre til i bronkitt og lungebetennelse hos ubeskyttede personer. Hos unge spedbarn kan dette være livstruende, omlag en av hundre vil kreve sykehusinnlegging og mekanisk lufttilførsel, og av disse kan en prosent dø. Hos de eldre er RV-indusert LRT sykdom en hovedårsak til sykehusinnlegging; man mistenker at RSV ligger til grunn for 25 % av influensalignende sykdommer.

Immunresponsen til RSV er kompleks. Generelt sett vil eksponering for h-RSV bygge opp en respons som beskytter mot LRT sykdom. Denne responsen blir svakere ved høyere alder, noe som fører til en større mottakelighet for RSV i den eldre befolkningen. Effektiv langvarig beskyttelse mot RSV infeksjon involverer antistoffer mot virusproteinene F og G som sirkulerer i blodet, noe som kan forebygge LRT sykdom. URT infeksjon kan kontrolleres ved mukonale antistoffer mot F og G, men disse har en begrenset levetid. CD8+T celler mot fremdeles ikke-identifiserte virusproteiner er nødvendig for klarering av viruset fra infisert vev, men de ser ut til å ha en kort levetid eller være ineffektivt rekruttert fra deres reservoar. Dette er mest trolig forårsaket av RSV uttrykte faktorer, muligens kodet for i G genet (Srikiatkhachorn, 1997a).

Et viktig aspekt ved RSV sykdom er immunforsterkning av patologien. I begrensede tilfeller kan den cellulære immunresponsen forverre RSV sykdom ved påvirkningen av cytokiner på infisert vev frigitt av overdrevent tiltrukne granulocytter. Predisposisjon hos verten er involvert i denne reaksjonen, samt muligens også timingen av den første RSV infeksjonen etter fødselen. Dessverre har tidlige vaksineringsforsøk med formalininaktivert RSV vist at under slike vaksinasjons-forhold var immunforsterket patologi ved villtypeinfeksjon utbredt (Kim 1969). Faktorer i RSV er tilsynelatende ansvarlige for dette fenomenet og ble tydeligvis frigitt ved formalinbehandling. I løpet av de 40 årene som har gått siden den gang er det gradvis vist at virus G proteinet er den dominerende formidleren av disse problemene, men andre aspekter av mekanismen er fremdeles uklar (Sirikiathachorn 1997b). I alle fall ser det ut til at vaksinering med et G protein ute av sammenheng med virionet (med andre ord i inaktiverte virus fremstillinger, som et ekspresjons-produkt ikke skikkelig fastsatt i membranen, eller i form av peptider) fører til immunforsterkning i modellsystemene. Så selv om G bidrar noe til RSV immunitet kompliserer dets egenskaper vaksineutforming.

Opprinnelige levende RSV vaksinekandidater inkluderte kuldevidereførte eller temperatursensitive mutanter. De første er svekket ved dyrking ved fallende temperatur, noe som fører til en avhengighet av lav temperatur for vekst, mens de andre mutantene er gjort avhengige av en spesifikk, vanligvis høyere temperatur for replikasjon ved kjemisk- eller strålingsinduserte mutasjoner. Disse levende virusvaksinekandidatene synes å være enten under- eller oversvekket (Crowe, 1998).

Underenhet vaksinekandidater er fremskaffet fra enten RSV-F eller -G proteinene, som er hovedmålene for nøytraliserende antistoffer. En aktuell underenhetvaksine, PFP2, med renset F protein, er trygg i RSV-seropositive pasienter, men førte ikke til full beskyttelse mot LTR infeksjon og assosierte sykdommer (Gonzalez 2000). En annen underenhetvaksine tilnærming er BBG2Na, som består av et polypeptid omfattende aminosyrer 130-230 av h-RSV-G sammensmeltet med det albumin-bindende domenet til streptococcal G proteinet (Power 1997). BBG2Na fremkaller en T hjelper type 2 respons i nyfødde mus, og det fører ikke til lungeimmunpatologi (Siegrist 1999). Det er ennå ikke data vedrørende beskyttelse. Bruken av nye adjutanter for å oppnå en balansert humoral og cellulær immunrespons blir nå undersøkt i dyremodeller (Plotnicky 2003).

Bruken av plasmid-DNA vektorer som koder for RSV-F og G antigener som vaksinekandidater har blitt studert i dyremodeller. Disse vaksinene frembringer beskyttende responser i gnagere (Li 2000), men i et forsøk utviklet RSV-F DNA vaksinekandidat immuniserte mus en litt forsterket lungeinflammatorisk respons etterfølgende utfordring med villtype virus (Bembridge 2000). Anvendbarheten av bruk av plasmid DNA-vaksiner i mennesker er fortsatt ukjent og det vil trolig ta minst 15 år for denne tilnærmingsmåten er tilstrekkelig studert og, noe som er viktigere, akseptert, særlig for nyfødte. Aktuelle vaksiner basert på et vektorleveringssystem består av levende rekombinante vektorer som utrykker RSV proteiner. For eksempel gav rekombinante vaccinia virus som utrykte RSV-F og G proteiner beskyttelse til mus, men manglet denne effekten i sjimpanser (Collins 1990). Spørsmålet er om disse systemene er trygge (særlig vaccinia virus) og anvendbare sett i lys av de eksisterende (maternale) antistoffene mot poxviruser i nærmiljøet og hovedmålgruppen som er nyfødte.

Flere vaksinekandidater er basert på rekombinant levende RSV, fremstilt ved revers genetikk. En forskningsretning fokuserer på å svekke disse virusene ved introduksjon av individuelle eller kombinerte mutasjoner ansvarlige for kuldetilpassing og temperatursensitivitet inn i rekombinante virus. Ingen av disse vaksinekandidatene var anvendbare pga. enten over eller undersvekking. En annen forskningsretning fokuserer på fjerning av en eller flere ikke-strukturelle virusgener. Begrenset data er tilgengelig vedrørende virkningen av disse virusene i modellsystemer (Jin 2003).

WO 03029416 A2 vedrører testing og utvikling av en vaksine for RSV.

Patentsøknaden tilveiebringer et rekombinant RSV der genene som koder for forankringsprotein G, fusjonsprotein F og det hydrofobiske protein SH er fjernet. Det komplimenterende G-proteinet kommer ikke fra den samme virusundergruppen som det virale genomet i virionet, men det kommer i stedet fra et helt urelatert virus. Artikkelen Karron 1997 vedrører et cp-52 Respiratorisk Syncytial Virus. Dette viruset er et kandidatvirus for vaksine, og omfatter et genom hvor de fleste kodende sekvensene for SH- og G-proteiner er fjernet.

Michael N Teng fremlegger RSVer som ikke utrykker G-protein (AG) eller som koder for og utrykker trunkerte RSV G-protein typer, men viser ikke trans-komplimentering av virionene med et funksjonelt RSV G-protein.

Sunee Techaarpornkul omtaler transfeksjon av Hep-2 celler med et plasmid som utrykker RSV NS, N, P, L og M gener fra en 17 promotor, det vil si plasmid SN3 .For å studer rollen til G, F og SH glykoproteiner blir fragmenter som koder for F, G og F, og F og SH innsatt i plasmid SN3 for å produsere henholdsvis plasmidene SN11, SN 10 og SN 12. Fragmentene som koder for G, F og SH glykoproteiner er derved ikke samtransfekterte med plasmidet som utrykker RSV NS, N, P L og M genene. I stedet er de transfekterte som en integral del av plasmidet som utrykker RSV NS, N P, L og M genene. Dokumentet frembringer derfor ikke trans-komplimentering av virionene med et funksjonelt RSV G-protein.

Derved finnes det nå ingen effektiv h-RSV vaksine tilgengelig på feltet. Alle RSV vaksinekandidatene som er testet i dyremodeller er ikke anvendbare for mennesker. Det har derved lenge vært bruk for på feltet RSV vaksiner som er både effektive og trygge, og det er formålet ved den foreliggende oppfinnelsen å frembringe slike vaksiner.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

I beskrivelsen og kravene er verbet "å omfatte" og dets avledninger brukt i dets ikke-begrensende betydning til å mene at trekkene som etterfølger ordet er inkludert, men trekk som ikke spesifikt nevnes er ikke ekskludert. I tillegg skal referanser til et element ved den ubestemte artikkelen "en" eller "et" ikke ekskludere muligheten for at mer enn bare et av elementene er tilstede, dersom det ikke kommer klart frem at det bare er ett av elementene. Den ubestemte artikkelen "en" eller "et" betyr derved vanligvis "minst en/et"

Utrykket "virion" som brukt heri refererer til en viruspartikkel som inneholder nukleonkapsidproteinet, virusgenomet og replikasekomplekset i en lipidkonvolutt som inneholder de strukturelle virusglykoproteinene.

Utrykkene "smittsomhet av et virus", "virus som kan infisere", "infiserende viruspartikkel" eller "infiserende virion" viser til virus, virale partikler eller virioner som er i stand til å trenge seg inn i passende vertsceller og sette i gang en viral reproduksjonssyklus, uavhengig av om dette fører til produksjon av nye smittsomme virus.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det humane RSV virionet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen er derved kjennetegnet ved at det omfatter et viralt genom som bare har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein tilhørende viruset, hvor mutasjonen funksjonelt inaktiverer G-forankringsproteinet, og hvor ved virionet omfatter G-forankringsproteinet fra den samme virale undergruppen som det virale genomet i en form og mengde som kreves for infektivitet av virionet.

I følge en foretrukket utførelse av virionet er forankringsproteinet homologt med det virale genomet.

I følge en foretrukket utførelse av virionet får mutasjonen viruset fremstilt fra bare det virale genomet til å mangle G-forankringsproteinet.

I følge en foretrukket utførelse av virionet omfatter mutasjonen fjerning av sekvensen som koder for proteinet.

Fremgangsmåten i samsvar med den foreliggende er derved kjennetegnet ved at virionene omfatter et virusgenom som har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein til viruset, hvor ved mutasjonen funksjonelt inaktiverer G-forankringsproteinet, og hvor virionet omfatter et G-forankringsprotein fra den samme virale undergruppen som det virale genomet i en form og mengde som kreves for infektivitet av virionet, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å infisere en kultur av en første vertscelle med et humant Respiratorisk Syncytial Virus som omfatter et viralt genom som har en mutasjon, hvor ved vertscellen omfatter en ekspresjonsvektor som leder ekspresjon i verstcellen til G-forankringsproteinet fra den samme virale undergruppen som det virale genomet i en form og mengde som kreves for infektivitet av virionet; og

(b) gjenvinning av virionene fra den infiserte vertscellekulturen.

I følge en foretrukket utførelse av fremgangsmåten brukes det humane Respiratorisk Syncytial Viruset for å infisere kulturen til en første cellekultur som er fremstilt ved fremgangsmåten som omfatter trinnene: (a) å fremskaffe til en andre vertscelle en eller flere ekspresjonsvektorer som leder ekspresjon i vertscellen av: i) et viralt genomisk RNA som har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein av det humane Respiratorisk Syncytial Viruset, hvor mutasjonen funksjonelt inaktiverer G-f oran kri ngs protei net;

ii) et pneumoviralt polymerase enzymkompleks og valgfritt en eller flere ekstra virale proteiner, og,

(b) dyrking av den andre vertscellen hvor ved virionene fremstilles.

Mer foretrukket omfatter fremgangsmåten i tillegg amplifisering av virionene produsert av den andre vertscellen ved en eller flere ekstra cellulære infeksjonstrinn som bruker vertsceller som er de samme eller forskjellige fra den andre vertscellen. Det virale genomiske RNAet er fortrinnsvis transkribert fra en viral DNA kopi som er kontrollert av en bakteriofag DNA avhengig RNA polymerasepromotor, og hvor vertscellen er fremskaffet ved en ekspresjonsvektor som leder ekspresjon i vertscellen til den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerasen. Den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerasen er fortrinnsvis T7, T3 eller SP6 polymerasen, det pneumovirale polymerase enzymkomplekset inkluderer fortrinnsvis i det minste L, P og N proteinene. En eller flere ekstra virale proteiner er fortrinnsvis pneumovirale matriks membranproteiner, fortrinnsvis M2-1 proteinet.

Sammensetningen i samsvar med den foreliggende er derved kjennetegnet ved at den omfatter et virion i samsvar med et eller flere av krav 1 -4, eller som kan fremstilles ved en fremgangsmåte i samsvar med et eller flere av krav 6-11 , og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Anvendelse i samsvar med den foreliggende er derved kjennetegnet ved anvendelse av et virion av et humant Respiratorisk Syncytial Virus omfattende et viralt genom som bare har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein for viruset, hvor muteringen funksjonelt inaktiverer G-forankringsproteinet for fremstilling av et medikament for forebygging eller behandling av en human Respiratorisk Syncytial Virusinfeksjon.

I samsvar med en foretrukket utførelse av anvendelsen fjernes hele sekvensen som koder for G-forankringsproteinet fra det virale genomet.

I samsvar med en foretrukket utførelse av anvendelsen omfatter virionet et G-forankringsprotein fra den samme virale undergruppen som virusgenomet, på en form og i en mengde som kreves for infektivitet av virionet.

Fortrinnsvis er medikamentet som anvendes et preparat for intranasal administrering.

Sammensetningen i samsvar med den foreliggende er derved kjennetegnet ved at den er for å forebygge eller behandle en (human) Respiratorisk Syncytial Virusinfeksjon, omfattende et virion i samsvar med et eller flere av krav 1 -4, i en mengde som er effektiv i å forebygge eller behandle infeksjonen. Fortrinnsvis er sammensetningen for intranasal administrasjon.

En første utførelse av den foreliggende oppfinnelsen vedrører et virion til et pneumovirus, nærmere bestemt Respiratorisk Syncytial Virus (RSV). Virionet omfatter et virusgenom som har en mutasjon i et gen som koder for et protein som er essensielt for smittsomheten til pneumoviruset, nærmere bestemt et G-forankringsprotein, hvor mutasjonen fører til et virus produsert fra bare det virale genomet som ikke er smittsomt, og hvor virionet omfatter G-forankringsproteinet fra den samme virale undergruppen som det virale genomet i en utgave og mengde påkrevd for smittsomhet til virionet.

Pneumoviruset er et Respiratorisk Syncytial Virus, mer fortrinnsvis et humant eller bovint RSV. Det humane RSVet kan enten være fra undergruppe A eller B virus, og er fortrinnsvis et klinisk isolat, mer fortrinnsvis et isolat som ikke har blitt dyrket lenge in vitro (fortrinnsvis videreført mindre enn 10, 8, 6 eller 5 ganger som beskrevet i Eksemplene). Derfor kan en RSV stamme eller et isolat anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen, hvor det er forstått at oppfinnelsen bare er eksemplifisert ved det humane RSV isolatet 98-25147-X, referert til som RSV isolat X. Videre foretrekkes det at viruset er et nylig isolert klinisk isolat, hvor nylig er definert som isolert for mindre enn 10, 8, 6, 4, 3 eller 2 dager siden. Det skal forstås at selv om nukleotid-sekvensene i virionet ikke nødvendigvis må korrespondere med de av det nylige isolatet, er aminosyresekvensene til proteinene tilstede i virionet i følge oppfinnelsen fortrinnsvis identiske med proteinene slik de forekommer i et nylig klinisk isolat.

Det virale genomet omfatter minst en mutasjon i minst et virusgen som koder for et G-forankringsprotein som er vesentlig for smittsomheten til pneumovirus, hvor smittsomheten til viruset er slik som definert ovenfor. Derved er proteinet som er essensielt for smittsomhet av pneumovirus et protein som er vesentlig for evnen til virionet i følge oppfinnelsen til å trenge inn i en passende vertscelle og sette i gang virusreplikasjonssyklusen, hvor ved replikasjonssyklusen ikke nødvendigvis fører til produksjon av nye smittsomme virus. I foretrukne virioner i følge oppfinnelsen fører mutasjonene til at virionet mangler smittsomhet in vivo, med andre ord i en passende vert, slik at virionene fremdeles kan være smittsomme for passende vertsceller dyrket in vitro.

Det er det muterte genet som koder for et G-forankringsprotein som i følge oppfinnelsen er vesentlig for infeksjonsevnen til pneumovirus er et gen som koder for et strukturelt protein tilhørende viruset. Et strukturelt protein tilhørende et pneumovirus skal her forstås å være et protein som er tilstede i virioner til smittsomme villtypevirus. Gener som koder for strukturelle proteiner som muteres i virionene i følge oppfinnelsen er gener som koder for tilknytningsprotein G. Fjerning og/eller inaktivering av genet som koder for G proteinet har flere hensikter og forebygger et antall problemer og komplikasjoner ved de nåværende RSV vaksinekandidatene. Et formål er vaksinesikkerhet, da RSV uten G protein er sterkt svekket i verten (Karron 1997, Schmidt 2002) fordi det ikke vil være i stand til å infisere vertscellene effektivt. En komplikasjon er at G protein er sterkt involvert i å føre til uønskede immunologiske prosesser, inkludert økt immunpatologi (Alwan 1993, Srikiatkhachorn 1997b) og muligens forskyving av immunsystemet mot en allergi- (og astma-) tilbøyelig tilstand ved visse genetiske predisposisjoner (Openshaw 2003, Peebles 2003). Dette kan forebygges ved å fjerne eller inaktivere G genet. Et pneumoviralt virion i følge oppfinnelsen omfatter et virusgenom som har en inaktiverende mutasjon i genet som koder for et G tilknytningsprotein i form av, og i en mengde som trengs for smittsomhet av virionet, og er referert til som et "AG+G"

(pneumo) virus eller virion. På lignende vis blir virionet som har den inaktiverende mutasjonen i genet som koder for et G tilknytningsprotein men som ikke er komplimentert in trans med en funksjonell mengde G protein referert til som et "AG"

(pneumo) virus eller virion.

RSV virionene i følge oppfinnelsen er derved forbigående og funksjonelt rekonstituerte med et eksternt kodet G-forankringsprotein som er nødvendig for infeksjon. Det eksternt kodede proteinet som er nødvendig for infeksjon er fra den samme virale undergruppen (A eller B) som genomet som er tilstede i virionet. Fortrinnsvis er det eksternt kodede proteinet som er nødvendig for infeksjon homologt med genomet som er tilstede i virionet, og med det menes at proteinet har den samme aminsyresekvensen som aminsyresekvensen som ble kodet for av genomet til viruset før det ble inaktivert. Alternativt kan dette bety at det eksternt kodede proteinet har den samme aminsyresekvensen som er tilstede i et villtype virion, hvor fra aminsyresekvensene med en eller flere interne koder for proteiner som er 100 % identiske med deres motpart i virionet i følge oppfinnelsen.

I virionene i følge oppfinnelsen er mutasjonen i genet til det essensielle strukturelle G-forankringsproteinet en mutasjon som fører til at viruset produsert ifra bare det virale genomet mangler proteinet har evnen til å uttrykke et biologisk inaktivert protein. Produksjon av viruset fra bare det virale genomet er forstått å bety virus produsert bare fra det virale genomet slik det foreligger i virionene og i fravær av enhver kodende sekvens som komplimenterer det virale genomet in trans. Det virale genomet slik det er tilstede i virionene kan derved ikke føre til ekspresjon av det essensielle strukturelle proteinet. Dette kan oppnås på forskjellige vis kjent av fagmannen, inkludert for eksempel inaktivering av det translasjonsinisjierende kodonet, introduksjon av stop kodoner nær N-terminusen til proteinet det kodes for, en eller flere rammeskiftemutasjoner, samt deletering av en eller flere fragmenter fra genet. Fortrinnsvis inaktiveres genet ved fjerning av minst 10, 20, 50, 75, 90 eller 95 % av sekvensen som koder for det essensielle strukturelle proteinet. Mest fortrukket er derimot et virion hvori mutasjonen omfatter fjerning av hele sekvensen som koder for proteinet.

Eksplisitt inkludert i oppfinnelsen er virioner hvori mer enn en mutasjon er tilstede. I særdeleshet kan mer en et viralt proteinkodende gen omfatter mutasjoner som inaktiverer eller endrer funksjonen til proteinet det er snakk om, eller som fører til at proteinet mangler fra virionene som beskrevet ovenfor. For eksempel kan kuldevidereførte eller varmesensitive mutasjoner som kjent på fagfeltet kombineres med inaktivering av de essensielle strukturelle proteinene som beskrevet ovenfor.

Klarering av pneumoviruser som RSV fra de infiserte vertsorganismene krever passende cellulær immunitet, som ikke vil bli effektivt frembrakt uten virusinfeksjon av epiteliale celler. Men de mutante pneumovirusene i følge oppfinnelsen mangler genetisk informasjon for et protein som er essensielt for infeksjon av hostcellene in vivo. Derfor fremlegger den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter f or å produsere de mutante pneumovirusene som inkluderer replikasjon av mutante pneumoviruser i celler som komplimenterer ( in trans) for fraværet av proteinet som er essensielt for infeksjon.

En annen utførelse av oppfinnelsen vedrører derfor en fremgangsmåte for fremstilling av de ovenfor definerte mutante RSV virionene. Fremgangsmåten er en fremgangsmåte for å produsere RSV virioner, hvorved virionene omfatter et viralt genom som har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein, hvor ved mutasjonen fører til at et virus produsert fra bare det virale genomet mangler infektivitet, hvor ved virionet omfatter proteinet i en form og mengde som kreves for infeksjon av virionet. Fremgangsmåten omfatter de følgende trinnene: (a) å infisere en kultur av den første vertscellen med et RAV virus som omfatter et viralt genom som har en mutasjon som definert ovenfor, hvor ved vertscellen omfatter en ekspresjonsvektor som leder ekspresjonen, enten forbigående eller konstant, i vertscellen til proteinet i en form og mengde som kreves for virioninfektivitet, og (b) gjenvinning av virionene fra den infiserte vertscellekulturen. Gjenvinning av virionene fra den infiserte vertscellekulturen kan inkludere enten eller både gjenvinning fra kuturmediumet eller cellene.

Den første vertscellen kan være enhver vertscelle som pneumovirus er i stand til å replikere i, med eller uten samtidig ekspresjon in trans av proteinet som kreves for infektivitet av virionet. Passende vertsceller for dette formålet er for eksempel afrikansk grønnape nyrecellekulturer(så som f.eks. Vero, ECACC lot 10-87, 134th vekstrunde 1990, EMEA godkjent).

I følge en foretrukket fremgangsmåte i følge oppfinnelsen er RAV viruset som anvendes for å infisere kulturen av en første vertscellekultur fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter trinnene: (a) å fremskaffe til en andre vertscelle en eller flere ekspresjonsvektorer med målrettet ekspresjon i vertscellen av (i) et viralt genomisk RNA som har en mutasjon i et gen som koder for et protein som er essensielt for ( in vivo) infektivitet av RAV virusene, nærmere bestemt et gen for G-forankringsprotein, hvor ved mutasjonen fører til at et virus fremstilt fra bare det virale genomet mangler infektivitet, og (ii) et pneumoviral polymerase enzymkompleks, og valgfritt tillegg av en eller flere virale proteiner, og (b) kultivering av den andre vertscellen hvor ved virionene fremstilles. I følge en foretrukket fremgangsmåte blir virionene fremstilt av den andre vertscellen forsterket ved en eller flere cellulære infeksjonstrinn ved bruk av vertsceller som er de samme eller forskjellige fra den andre vertscellen.

Den andre vertscellen kan være enhver vertscelle som pneumoviruset er i stand til å replikere i, med eller uten samtidig ekspresjon in trans av proteinet som er krevd for infektivitet av virionet. Passende vertsceller for dette formålet er for eksempel afrikanske grønnape nyrecellekulturer (så som f.eks. Vero, ECACC lot 10-187,134th vekstrunde 1990, EMEA godkjent), eller Hep-2 celler. Den andre vertscellen kan være den samme eller forskjellig fra den første vertscellen.

I fremgangsmåtene i følge oppfinnelsen er det virale genomiske RNAet transkriptert fra en viral DNA kopi som er kontrollert av en bakteriofag DNA-avhengig RNA polymerase promotor, og hvor ved den (andre) vertscellen er fremskaffet med en ekspresjonsvektor som leder ekspresjon i vertscellen til den bakteriofag DNA-avhengige RNA polymerasen. Fortrinnsvis er den bakteriofage DNA-avhengige RNA polymerasen en 17, T3 eller SP6 polymerase.

Det pneumovirale polymerase komplekset som utrykkes fra en eller flere ekspresjonsvektor(er) i den andre vertscellen inkluderer minst L, P, N proteiner utrykket fra deres respektive gener eller cDNAer i ekspresjonsvektor(ene). For forbedret effektivitet av viral sammensetning og innpakking av det nakne virale genomiske RNAet er valgfritt et eller flere ekstra virale proteiner utrykt i de andre vertscellene. Fortrukne virale proteiner for dette formål inkluderer de virale matriksmembranproteinene hvor av M2-1 proteinet er særdeles fortrukket. L, P, N, M2-1, G eller F proteinene er fortrinnsvis fremskaffet fra det virale genomet til det virale isolatet som er introdusert og uttrykt i vertscellen, men alternativt kan også homologe proteiner fra andre heterologe virale eller ikke-virale kilder anvendes.

En fagperson vil forstå at en mengde forskjellige ekspresjonsvektorer og regulerende sekvenser (så som promotere) er tilgjengelige på fagfeltet for ekspresjon av det virale genomiske RNAet, den DNA-avhengige RNA polymerasen, pneumoviralt polymerase enzym kompleks, og valgfritt andre virale proteiner, så vel som det essensielle

strukturelle proteinet, i de første og/eller andre vertscellene

(se f.eks. Sambrook og Russel (2991) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

For revers genetikk av RNA virus, det vil si ekspresjon av et rekombinant RNA virus så som virionene I følge den foreliggende oppfinnelsen, blir en cDNA kopi av det virale genomiske RNAet klonet inn i plasmidene, og er plassert under kontroll av sekvenser som tillater syntese av RNA fra DNAet ved visse forhold. Generelt er promotorsekvensen for Bakteriofag RNA polymerase (for eksempel 17 RNA polymerase) plassert oppstrøms av DNA kopien av RNA genomet, mens en passende terminator for RNA polymerasen er plassert nedstrøms av genomet. Selvsplittende ribosym sekvenser plasseres oppstrøms fra terminatorsekvensene for å tillate syntese av RNA med korrekte terminale nukleotider. Korrekte terminale sekvenser er vanligvis påkrevd for å redde virus fra det syntetiske RNAet. For ikke-segmentert negativ tråd RNA virus er samekspresjon av polymerase enzym komplekset (N, P og L proteiner for Paramyxoviruser) i sammen med det genomiske eller anti-genomiske RNAet påkrevd for å oppnå rekombinante virus (gjennomgått av Neumann 2002 og eksemplifisert i eksemplene heri).

Andre foretrukne fremgangsmåter kan omfatte et videre trinn for å isolere og/eller rense virionene i følge oppfinnelsen og/eller formulere disse virionene til farmasøytiske komposisjoner. Fremgangsmåter for isolering og/eller rense virioner er velkjente for virologer. Slike fremgangsmåter inkluderer for eksempel forskjellige sentrifugeringsteknikker (for eksempel differensial eller tetthets sentrifugering), eller kromatografiske teknikker. En fremgangsmåte for å formulere virionene i følge oppfinnelsen til en farmakologisk sammensetning omfatter i det minste et trinn for å behandle virionene med en farmasøytisk akseptabel bærer som definert nedenfor.

Et videre aspekt av oppfinnelsen vedrører en sammensetning som omfatter et virion slik definert ovenfor, eller som kan skaffes ved en fremgangsmåte som definert ovenfor, og en farmasøytisk akseptabel bærer. Sammensetningen er fortrinnsvis en farmasøytisk sammensetning som fortrinnsvis er passende for bruk som en vaksine, det vil si at sammensetningen fortrinnsvis er en vaksine.

I følge enda en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat omfattende som en aktiv ingrediens et virion i følge oppfinnelsen, og en farmasøytisk akseptabel bærer. Farmasøytisk akseptable stabiliserende midler, osmotiske midler, buffere, spredningsmidler og lignende kan også innlemmes i de farmasøytiske sammensetningene. Den foretrukne formen kommer an på den tiltenkte administrasjonsmåten og den terapeutiske applikasjonen. Den farmasøytiske bæreren kan være enhver stabil, ikke-toksisk substans passende for å levere de rekonstituerte virale membranene til pasienten. Farmasøytisk akseptable bærere for intranasal levering er for eksempel vann, bufrede saltvannsoppløsninger, glyserin, polysorbat 20, cremophor EL, og en vandig blanding av caprylic/capric glyserid, og kan bufres for å tilveiebringe en nøytral pH omgivelse.

For administrasjon ved inhalering blir de farmasøytiske sammensetningene i følge den foreliggende oppfinnelsen passende levert i form av en aerosol spray fra pakninger under trykk eller en nebulisator, hvori virionene er tilstede i en bærer som beskrevet for levering men ved hjelp av en passende drivgass, for eksempel diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller en annen passende gass. I tilfellet av en aerosol under trykk kan doseringsmengden bestemmes ved å tilveiebringe en ventil for å levere en bestemt mengde. Fremgangsmåter for å preparere intranasale eller inhalasjonssammensetninger er velkjente på feltet og beskrevet i flere detaljer i forskjellige kilder, inkludert for eksempel Remington's Pharmaceutical Science (15th utgave, Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (inkorporert heri ved referanse til dets helhet for alle formål. Virionene kan derved formuleres som den aktive bestanddelen i ethvert preparat for vaksinering, som videre kan for eksempel inkludere bærere, adjuvanter, stabilisatorer, oppløsningsmidler, konserveringsmidler og andre hjelpestoffer kjent på fagfeltet for å tillate eller hjelpe en effektiv administrering av preparatet for vaksinering til individer, fortrinnsvis humane og husdyr gårdsdyr (så som kuer, griser, hester, geiter, sauer).

På lignende vis vedrører oppfinnelsen virioner i følge oppfinnelsen som definert ovenfor, eller som kan fremskaffes som definert ovenfor, for anvendelse som et medikament, fortrinnsvis et medikament for vaksinering mot, eller forebygging eller terapi av en pneumoviral infeksjon. Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av virionene i følge oppfinnelsen i fremstilling av et medikament for vaksinering mot, eller forebygging eller terapi av en pneumoviral sykdom eller infeksjon. Fortrinnsvis er medikamentet et preparat for intranasal administrasjon.

Sammensetningene som omfatter virionene i følge oppfinnelsen for vaksinering er fortrinnsvis administrert intranasalt til passende verter. I følge en annen utførelse beskyttes kalver fra b-RSV infeksjoner. I følge enda en annen utførelse blir mennesker, fortrinnsvis spedbarn og de eldre eller individer med svekket immunitet beskyttet fra h-RSV infeksjoner. Formuleringer omfatter fortrinnsvis formuleringer passende for administrasjon som intranasale dråper eller spray, fortrinnsvis en nesespray. AG+G pneumovirale partikler i sammensetningen vil infisere epitelceller i den øvre luftvei bare en gang fordi den andre generasjonen av virioner framstilt fra de opprinnelige infiserte URT epitelcellene mangel G forankringsproteinet som den kodende sekvensen har blitt fjernet for fra genomet. Disse AG virionene er derfor ikke-infektive in vivo i vertsorganismene. Men den initiale ene infeksjonssyklusen tillater utviklingen av en passende cellulær immunitet - det vil si en respons som er i stand til å klarere en villtype virusinfeksjon - som blir satt i gang mor pneumoviruser, eller RSV i særdeleshet, mens beskyttende antistoffer mot F - for eksempel antistoffer som vil forebygge infeksjoner i de nedre luftveier - vil bli frembrakt av vaksinen og det ikke-smittsomme avkommet. Anti-F antistoffer er effektive i å begrense RSV infeksjon, som vist av effektiviteten av Palivimuzab behandling, som er et humanisert monoklonalt antistoff mot F. Dette er basisen for effektiviteten til de rekombinante levende svekkede pneumovirus vaksinene i følge oppfinnelsen. Disse levende virus vaksinene løser en mengde problemer assosiert med nåværende pneumovirus vaksinekandidater. Tilstedeværelsen av G-protein i dets naturlige sammenheng i virionet tillater utviklingen av passende cellulær immunitet mens de uønskede effektene av immunitet mot det isolerte G-proteinet som er hovedsakelig ansvarlig for immun økning av b-RSV og h-RSV patologi i kveg og mennesker respektivt er unngått.

Beskrivelse av figurene

Figur 1: Diagram av konstruksjonen av pRSVXAG, hvor den øvre linjen representerer RSV isolat X genomisk RNA, med genene indikert. Rammene nedenfor representerer RT-PCR produkter og oligonukleotid duplekser brukt i Konstruksjonen. Numrene inne i rammene indikerer oligonukleotid numrene slik de er opplistet i tabell I. Restriksjonsområder introdusert for kloning er indikerte. Den endelige kloningsplanen er indikert nedenfor, hvor sirklene er plasmider og pilene viser kloningsrekkefølgen. Figur 2. Oppstillinger side ved side viser forskjellene mellom RSV isolat X og pRSVXAG sekvensene. Sekvensene er vist som oppstillinger av den genomisk senstråden. For bare pRSVXAG er nukleotider som er forskjellige fra RSV isolat X indikerte. Lignende sekvenser er indikerte ved prikker (.) og huller er indikerte ved (-). Genstartsignaler har en enkel understreking, genstoppsignaler har en dobbel understreking, og genene er indikerte i undertekstene. Rammer innrammer restriksjonsenzymgjengkjennelsesområdene som resulterer fra de introduserte nukleotidendringene. Figur 3. Identifisering av sekvensmarkørene i RSV RT-PCR amplifikasjonsprodukter, digestrodukter: a) Mlul, b) Xmal, c) SexA-l, d) SnaB-l. Figur 4. Vekstkurver for RSV isolat X og AG-RSV isolat X. Vero (hele linjer) og Hep-2 (stiplede linjer) celler ble infiserte med virus ved MOI=0,1 og inkubert ved 376 C. På de indikerte tidspunktene ble cellene innhøstet og CCID50 titrer ble bestemte for Verocellene.

Tabell I. Primere anvendt for RT-PR kloning av RSV isolat X.

Tabell II. Primere anvendt for kloning av hjelpeplasmider og for plasmider anvendt for Konstruksjon av stabile cellelinjer.

Tabell III. Primere anvendt for diagnostisk RT-PCR på RNA fra RSV infiserte Veroceller.

Tabell IV. Resultater av bommulsråtte immuniseringseksperimenter, beskyttelse mot RSV infeksjon og RSV indusert patologi av AG-RSV isolat X immunisering.

Eksempler

Den foreliggende oppfinnelsen er illustrert ved de følgende ikke-begrensende eksemplene som bare er brukt for å illustrere spesifikke utførelser av oppfinnelsen og ikke bør leses som begrensende for den generelle utstrekningen eller noen del av oppfinnelsen.

Eksempel 1

Viralt isolat, virus isolering, vekstforhold og oppbevaring.

Basisen for den rekombinante h-RSV klonen er et klinisk RSV isolat, fremskaffet fra det diagnostiske laboratoriet ved Leiden University Medical Centre. Viruset, som var navngitt 98-25147-X, en kode gitt ut ifra pasienten det var isolert i fra, kom fra diagnostiske prøver på Hep-2 celler i tidsrommet 21-24 desember 1998. Det ble senere fastslått å være et undertype A isolat og kalt RSV isolat X. Viruset ble videreført fire ganger på Hep-2 celler i T75 flasker i DMEM (Gibco), 10 % FCS, pen/strep7glu, og så fem ganger på Veroceller i T75 flasker på i DMEM (Gibco), 10 % FCS, pen/strep/glu. Det resulterende RSV isolat X viruset be brukt som en arbeidskilde og oppbevart ved -1356 C i 25 % eller 45 % sukkrose.

Eksempel 2

Konstruksjon av RSV-X cDNA som koder for det virale genomet

Totalt RNA ble fremskaffet ved fenol-guanidin isotiocyanat ekstrahering (Trizol, invitrogen) av Veroceller infiserte med arbeidskilde RSV isolat X. cDNA ble fremstilt ved revers transkripsjon ved bruk av Thermoscript (Invitrogen) reverstranskriptase ved bruk av tilfeldige hekksamer primere. Dette cDNAet ble anvendt som template for PCR som brukte High Fidelety Taq polymerase (Invitrogen), ved bruk av primere som inneholder restriksjonsenzymgjengkjennelsesområder (Tabell og sekvensopplistingen). Primere ble bestemt basert på de publiserte sekvensene for RSV-A2 (Genbank tilgengelighetsnummer M74568) og RSV-RSS2 (Genbank tilgjengelighetsnummer U39662).

PCR produkter ble først klonet individuelt i forskjellige vektorer: primerpar, vektorer, restriksjonsenzymgjengkjenningsområder samt navnene på de resulterende vektorene er opplistet nedenfor.

RSV021/RSV047:pCAP vektor (Roche), butte ender inn i Mlu N1, pCAP3 (SH/M/P region)

RSV018/019: pCAP vektor, butte ender inn i Mlu N1, pCAP2 (G region) RSV016/RSV017: PUC21, Mlu I/Barn Hl, pUK5 (M2-2/M2-1/F region) RSV024/RSV025a: PUC21, Barn Hl/Afl II, pUK1 (NS2/NS1 region) RSV022/RSV023: PUC21, EcoR V, pUK4 (N region)

RSV014/RSV015: PUC21, Kpn l/Mlu I, pUK2 (L region)

Minst to individuelle kloner ble oppnådd fra to uavhengige sekvenserte cDNA templater; regioner som inneholdt forskjeller mellom to kloner ble sekvenserte på en tredje klone. Dersom nødvendig ble klonene reparerte ved bruk av standard molekylærbiologi teknikker kjent av fagfolk. Ekstra PCR produkter som dekket bindingsområdene til primerne som ble brukt for kloning ble fremskaffet og sekvenserte. De 5X gemoniske terminusene ble bestemte ved polyadenylering av genomisk RNA, etterfulgt av RT-PCR med en oligo(d)T inneholdende primer ALG018: og en NS1 gen primer RSV126:

Dette fragmentet ble klonet inn i pUC21 ved bruk av Hind Ill/Pst I. 3'-enden ble bestemt ved RACE (rapid amplification of cDNA ends) ligerings PCR. Alle sekvensene ble satt i sammen for å oppnå RSV-X konsenssekvensen (Seg ID No. 1)

Alle sekvensene ble bekreftet ved PCR syklussekvensering ved bruk av BigDye terminator kitt (Applied Biosystems) og analysert med en ABI Prism 310 genetisk analyseenhet.

Eksempel 3.

Konstruksjon av AG-RSV isolat X plasmid av full lengde

cDNA av full lengde som omfatter hele RSV isolat X genomet ble satt i sammen ved etterfølgende ligering av PCR fragmenter (Figur 1). Den "etterfølgende" enden kommer etter promotoren for bakteriofag 17 polymerase. For å generere korrekte 3' ender ble cDNA "leder" enden sammensmeltet med hepatitt deltavirus ribosym (HDVR) etterfulgt av en terminator av 17 RNA polymerase transkriptering (se Figur 1)-

Først ble to sett med komplementære oligomerer som kodet for HDVR og 17 terminator RSV026/RSV027 oligoer og RSV028/029 oligoer fosforylert med T4 DAN kinase, hybridisert og ligert inn i klon pUK1 (inneholdende genene NS1/NS2) via Rsrll/Notl, resulterende i plasmid pUK9. Så ble Xmal/SexAI fragmentet av klon pUK4 inneholdende N ligert inn i plasmid pUK3 via Xmal/SexAI. Dette plasmidet (pUK6) inneholder regionen fra N genet opp til 3' ledersekvensen, sammensmeltet med HDVR og en 17 terminator.

Videre ble Xmal/EcoRV fragmentet av plasmid pCAP3 innført i plasmid pUK5 ved bruk av Xmal og et innfylt Hindi 11 område. Dette gav plasmid pUK8. Videre ble pUK8 digestert med BssHII og BsiWI, endene ble fylt inn med Klenow polymerase og satt i samen. Dette plasmidet inneholder genene M2-2, M2-1, F, SH, M og P, og er navngitt pUK9

For å fremstille en vektor med lavt kopiantall for RSV isolat X cDNA ble de to komplementære oliomerene RSV011: og RSV012:

fosforylert med T4 DNA kinase, hybridisert og innsatt i det alkalisk fosforylase behandlede og Clal/Hindlll digesterte plasmidet pACYC184 (New England Bilabs). Det resulterende plasmidet ble navngitt pACYC184-MCS. Så ble et Mlul-Knpl fragment av pUK2 inneholdende 17 promotoren og L genet innsatt, og dette intermediære plasmidet ble navngitt pACYCI. Videre ble regionen fra N genet opp til 3'-ledersekvensen, inkludert den sammensmeltede HDVR og 17 terminator sekvensen til pUK6 tilsatt pACYCI ved hjelp av Xmal/Notl. Dette gir det intermediære plasmidet pACYC2. Til slutt ble Xmal/Mlul fragmentet i pUK9

inneholdende M2-2, M2-1, F, SH, M og P genene innsatt i pACYC2, resulterende i plasmid pACYC3, som omfatter hele RSV genomet til stamme X uten G genet. Sekvensanalyse av det siste plasmidet viste en fjernet del i HDVR området, som ble reparert, og det resulterende plasmidet ble navngitt pRSVXAG.

I tillegg til konstrukt pRSVXAG ble konstrukt pACYC24 fremstilt, hvori den genomiske RSV isolat C innsats ble revers komplimentert ved invers PCR. Fra konstruktet kan antigenomisk RSV DNA fremstilles. I pACYC24 kommer T7 promotoren før 3'-ledersekvensen, mens HDVR og T7 terminatoren er sammensmeltet med 5'-endeskvensen.

Alle restriksjonsenzym gjenkjenningsområder anvendt for å fremstille pRSVXAG er lokalisert inne i RSV intergeniske områder og forandrer ikke kodingssekvenser og har ingen effekt på transkripsjonssignaler (som vist i Figur 2).

Eksempel 4

Konstruksjon av hjelperplasmider

Hjelperplasmider som utrykker flere RSV proteiner ble konstruert som følger. Alle nødvendige gener ble oppnådd fra labbstamme RSV-A2 (ATCC #VR1302), Virus ble plaque renset på Hep-2 celler og så anvendt for å infisere Veroceller. Totalt RNA ble isolert fra disse cellene ved fenol-guanidin isotiocyanat ekstrahering. /Trizol, Invitrogen) og utsatt for RT-PCR ved bruk av Hig Fidelety Taq polymerase (Invitrogen) og et sett primere spesifikke for henholdsvis RSV gener L, P, N og M2-1 (se tabell II). PCR produkter ble så klonet inn i ekspresjonsplasmider pcDNA3, pcDNA6 eller pCI ved bruk av restriksjonsenzym gjenkjenningsområder som indikert i tabell II. Klonesekvenser ble fastslått ved PCR syklisk sekvensering ved bruk av BigDye terminator kittet (Applied Biosystems) og analysert på en ABI Prism 310 genetisk analyseenhet.

Eksempel 5

Konstruksjon av G-produserende Verocellelinjer

Cellelinjer som produserer RSV-G protein ble konstruert ved bruk av flere fremgangsmåter: I følge fremgangsmåte 1 ble G genet fra enten RSV-A2 eller RSV isolat X, eller G genet fra RSV-A2 hvori det interne translasjonsinjeksjonskodonet hadde blitt gjort udugelig ved modifisering ved bruk av primerne RSV033 og RSV034 klonet inn i ekspresjonsvektor pcDNA3 eller pcDA6 (Invitrogen) ved bruk av RT-PCR på RNA fra RSV-A2 eller RSV isolat X infiserte Veroceller ved bruk av primere som indikert i tabell II. Plasmidene ble introduserte inn i Veroceller ved bruk av enten kjemiske midler, CaCI2, samtidig presipitering, liposom basert eller elektroforese (Ausubel 1998). To fremgangsmåter for isolasjon av stabile cellelinjer ble anvendt. I følge den første fremgangsmåten ble cellene delt ved bruk av forskjellige utblandinger inn i nytt medium inneholdende selektivt medium, zeocin for pcDNA3 og blasticidin for pcDNA6, 72 timer etter transfeksjonering. Cellene ble matet med selektivt medium hver 3-4 dag til cellefokus ble identifisert. Enslige kolonier ble plukket ut og overført til en 96-brønns plate, eller sådd i forskjellige utblandinger for å oppnå enslige celler i en 96-brønns plate. Kolonier som var antibiotika resistente ble testet for ekspresjon av RSV-G ved immunfargingsteknikker eller FACS ved bruk av RSV-G spesifikke antistoffer 72 timer etter transfeksjonering. RSV-G utrykkende celler ble sådd ved serieutblandinger for å oppnå enslige celler i en 96-brønns plate, og kultivert med selektivt medium. Kolonier fra enslige celler ble videreført på selektivt medium og så testet igjen for ekspresjon av RSV-G, noe som resulterte i cellelinjer som utrykker

RSV-G.

I følge fremgangsmåte 2 blir Flp-ln systemet anvendt for å produsere Veroceller med målgeninnsettingsområder ved kromosomposisjoner som tillater forskjellige nivåer av målgenekspresjon. RSV-G genet, oppnådd fra plasmidene fra fremgangsmåte 1 men med en endring (introdusert ved bruk av primer RSV151: Tabell II) i den G-omgitte sekvensen til translasjonsigangsettelseskodonet for å tillate høyere translasjonsnivåer, ble innsatt i hver av disse cellelinjene ved bruk av den generiske fremgangsmåten, og resulterte i Verocellelinjer som stabilt utrykte forskjellige nivåer av G protein.

I følge fremgangsmåte 3 utrykte Veroceller forbigående G protein, enten ved transfeksjon med ekspresjonsplasmidene inneholdende G genet fra fremgangsmåte 1, eller ved infeksjon med Modified Vaccina Virus Ankara (MVA) (Slutter 1992) eller fuglepoksviruser (Spehner 1990) som utrykker G proteinet.

Eksempel 6

Konstruksjon av bakteriofag T7 polymeraseproduserende cellelinjer

Bakteriofag T7 polymerasegenet ble PCR forsterket fra plasmid pRTT7 (van Gennip 1997) som inneholdt genet, ved bruk av primerene ALG022 og ALG023 (Tabell II). PCR produktet ble klonet inn i pcDNA6b vektoren ved bruk av Hindlll/Xbal og resulterte i plasmidet pc6T7pol. Verocellene ble transfektert ved bruk av Iipofectamine2000 slik anbefalt av produsenten (Invitrogen). 72 timer etter transfeksjonen ble cellene delt og dyrket i nytt medium inneholdende blasticidin. Cellene ble matet med nytt medium hver 3-4 dag, og delt to ganger for å oppnå større kulturvolumer. 20 dager etter transfeksjonen ble blasticidin resistente celler transfekterte med promoterplasmidet pT7IRE2-EGFR ved bruk av Iipofectamine2000. For Konstruksjon av plasmid pT7-IRES2-HGFP ble plasmid pT7-EGFP først konstruert ved innsetting via Hindlll/BamH1 i plasmid p-EGFP-N1 (Clonetech) et sett komplementære oligomerer som koder for T7 promoter sekvens

Plasmid pT7-IRES2-EGFP ble så konstruert ved kloning av T7-EGFP fragmentet til plasmid pT7-EGFP inn i plasmid p-IRES2-EGFP via Xma1-Not1. Celler som utrykte EGFP ble sortert ved FACS og dyrket ved begrenset utblanding for å oppnå kolonier fra enslige celler. Enslige kolonier som utrykte T7 RNA polymerase ble testet for stabilitet, dyrket til større kulturvolumer, og lagret.

Eksempel 7

Fremgangsmåte til fremstilling av rekombinante A-RSV isolat X virus

Hep-2 celler ble kultiverte i DMEM + 10 % FCS (kalvefosterserum) + penicillin/streptomycin/glutamat, mens Veroceller og derivater derav blir kultivert i M199 + 5 % FCS + pen/strep/glu. Cellene ble dyrket over natten til 80 % sammenløpning på 10 mm<2>plater ved 37'C. For Veroceller og Hep-2 celler ble cellene infiserte med modifisert virus Ankara-T7 (MVA-T7) (Slutter 1992, Wyatt 1995) eller fuglepoks-T7 virus (Britton 1996) ved MOI=3 (multeplicety of infection 3) og innkubert ved 32 "C i 60 minutter før transfeksjon, for å tillate utrykking av bakteriofag T7 polymerase. Cellene (Hep-2, Vero eller Vero-T7 celler) ble vasket med Optimem medium (Optimeml med glutamax, Invitrogen) og så transfektert med hjelperplasmider som kodet for N, P, L og M2.1 genene til RSV, og med plasmid pRSVXAG, ved bruk av Lipofectamine2000 (Invitrogen) i Optimem (totalt volum på 500 uj). De følgende mengdene plasmider ble tilsatt: 1,6fjg pRSVXAG, 1,6fjg pcDNA6-A2-N, 1,2 y$ pcDNA3-P, 0,4 y$ pcDNA6-A2-L, 0,8 y$ pcDNA6-A2-M2.1. Etter 3-4 timers innkubering ved 32'C ble 500/7/Optimem medium med 2 % FCS tilsatt og cellene ble innkuberte ved 32'C i 3 dager. Cellene ble så skrapte og blandingen av skrapte celler og medium inneholdende viruset ble anvendt for å infisere nye kulturer med Veroceller eller Hep-2 celler dyrket i DMEM + 2 % FCS + pen/strep/glu. Den sistnevnte fremgangsmåten ble gjentatt 4-5 ganger for å oppnå en virusbestand med høy titer.

Identiteten til AG-RSV isolat X viruset ble bekreftet ved RT-PCR på RNA isolert fra AG-RSV isolat X infiserte Veroceller og digestering av de oppnådde produktene med de unike restriksjonsenzymene hvis gjenkjenningsområder ble introduserte inn i pRSVXAG (figur 2). RSV isolat X ble brukt som kontroll.

For identifisering av sekvensmarkører i RSV ble Verocellene infiserte med RSV isolat X eller med AG-RSV isolat X med MOI=0,1. 72 timer etter infeksjon ble RNA fra kultur overskuddsmediet isolert of brukt som template for RT-PCR. Primere ble utviklet for å flankere de ønskede sekvensmarkørene i det rekombinante AG-RSV isolat X viruset. Etter RT-PCR ble de oppnådde produktene digestert med passende restriksjonsenzymer. De følgende restriksjonsproduktene ble oppnådd (figur 3): a) PCR med primer RSV065 (GTCCATTGTTGGATTTAATC) og RSV093 (CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC) og digestering med Mlu-I gav de forventede fragmentene på 937 bp for RSV isolat X og 459 og 478 bp for AG-RSV isolat X.

b) PCR med primere RSV105 (GTTGGATTGAGAGACACTT) og RSV113 (AGTATTAGGCAATGCTGC) etterfulgt av digestering med

Xma-I gav fragmenter på 880 bp for RSV isolat X og 656 og 224 bp for AG-RSV isolat X.

c) PCR med primere RSV112 (CCCAGTGAATTTATGATTAG) og

RSV160 (AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA) og

digestering med SexA-l gav de forventede fragmentene på 694 bp for RSV isolat X og 492 og 202 bp for AG-RSV isolat X.

d) PCR med primere RSV098 (TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG) og RSV114 (ATCCCCAAGTCATTGTTCA) etterfulgt av digestering med

SnaB-l gav de forventede fragmentene på 1820 bp for RSV isolat X og 507 og 387 bp for AG-RSV isolat X.

Vekstkarakteristikker til AG-RSV isolat X ble sammenlignet med RSV isolat X på Veroceller og Hep-2 celler (figur 4).

Eksempel 8

Fremgangsmåter til fremstilling av rekombinante AG+G isolat X virus

AG+G isolat X virus oppnådd fra transfekterte Veroceller ble videreført flere ganger for å oppnå titrer på minst 10<5>pfu/ml (plakkformende unit per ml). Forskjellige moi'er av dette viruset ble så anvendt for å infisere Verocellelinjen som produserte RSV-G protein. Det resulterende AG+G-RSV isolat X ble innhøstet fra mediet og/eller fra cellene og analysert for tilstedeværelse av G protein i virionene ved immundeteksjonsteknikker. Infeksjonstitrer ble bestemt på Veroceller eller Hep-2 celler, og integriteten til AG genomet ble bestemt ved bruk av RT-PCR på viralt RNA ekstrahert fra cellene infiserte med AG+G-RSV isolat X virus. Virus ble lagret ved ISSV i 25 % eller 40 % sukkrose.

Eksempel 9

Fremgangsmåte for å beskytte mot RSV infeksjon og RV-indusert patologi i en bommulsrottemodell ved AG-RSV isolat X immunisering.

Beskyttelseseksperimenter ble utført i bommulsrotter (Sigmodon hispidus, 5-6 uker gamle, 4-6 dyr per gruppe av begge kjønn). I de initiale eksperimentene ble det vist at dette dyret er sårbart for RSV infeksjon og viser alvorlig vaksinefrembrakt lungepatologi som beskrevet av Prince, 2001, noe som er svært lik situasjonen i mennesker. Etter intranasal påføring av RSV ble lungepatologikarakterisert vedinflammasjonsinfiltrat i og rundt bronchus/bronchioli og hyperplasia av epitelium. En mer alvorlig patologi ble observert etter intramuskulær immunisering med formalininaktivert RSV-A2 etterfulgt av intranasal utfordring med RSV-A2. I tilegg til den omenfornevnte patologien ble perivaskulært og peribronchiolært infiltrat og alveolitis observert, noe som er karakteristisk ved en immunfrembrakt patologi. Disse observasjonene ble anvendt som "interne" referanser for alle immuniserings og utfordrings eksperimentene. Infeksjon og immunisering av bommulsrotter med RSV fremstillinger ble utført intranasalt, i begge nesebor. Bommulsrottelunger ble undersøkt for patologi ved lysmikroskopi og virustitrer ved forskjellige tidspunkter etter utfordringene eller etter infeksjon/immunisering ble bestemt på Veroceller ved bruk av etterfølgende utblandinger av lungehemogenater med RSV spesifikk ELISA for å oppnå CCID50titrer, og immunfarging med RSV spesifikke antistoffer oppnådde pfu titrer. Etter immunisering to ganger med AG-RSV isolat X ble bommulsrottene helt beskyttet mot infeksjon og patologi frembrakt av RSV isolat X i lungene. Resultatene av flere eksperimenter er summert i Tabell IV.

Claims

1. Virion fra humant Respiratorisk Syncytial Virus,karakterisert vedat det omfatter et viralt genom som bare har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein tilhørende viruset, hvor mutasjonen funksjonelt inaktiverer G-forankringsproteinet, og hvor ved virionet omfatter G-forankringsproteinet fra den samme virale undergruppen som det virale genomet i en form og mengde som kreves for infektivitet av virionet.

2. Virion i samsvar med krav 1, karakt risert ved at G-forankringsproteinet er homologt med det virale genomet.

3. Virion i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedat mutasjonen får viruset fremstilt fra bare det virale genomet til å mangle G-forankringsproteinet.

4. Virion i samsvar med krav 1,karakterisert vedat mutasjonen omfatter fjerning av sekvensen som koder for proteinet.

5. En fremgangsmåte for fremstilling av humane Respiratorisk Syncytial Virus,karakterisert vedat virionene omfatter et virusgenom som har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein til viruset, hvor ved mutasjonen funksjonelt inaktiverer G-forankringsproteinet, og hvor virionet omfatter et G-forankringsprotein fra den samme virale undergruppen som det virale genomet i en form og mengde som kreves for infektivitet av virionet, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å infisere en kultur av en første vertscelle med et humant Respiratorisk Syncytial Virus som omfatter et viralt genom som har en mutasjon, hvor ved vertscellen omfatter en ekspresjonsvektor som leder ekspresjon i verstcellen til G-forankringsproteinet fra den samme virale undergruppen som det virale genomet i en form og mengde som kreves for infektivitet av virionet; og (b) gjenvinning av virionene fra den infiserte vertscellekulturen.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5,karakterisert vedat det humane Respiratorisk Syncytial Viruset som brukes for å infisere kulturen til en første cellekultur er fremstilt ved fremgangsmåten som omfatter trinnene: (a) å fremskaffe til en andre vertscelle en eller flere ekspresjonsvektorer som leder ekspresjon i vertscellen av: i) et viralt genomisk RNA som har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein av det humane Respiratorisk Syncytial Viruset, hvor mutasjonen funksjonelt inaktiverer G-forankringsproteinet; ii) et pneumoviralt polymerase enzymkompleks og valgfritt en eller flere ekstra virale proteiner, og, (b) dyrking av den andre vertscellen hvor ved virionene fremstilles.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 6,karakterisert vedat den i tillegg omfatter amplifisering av virionene produsert av den andre vertscellen ved en eller flere ekstra cellulære infeksjonstrinn som bruker vertsceller som er de samme eller forskjellige fra den andre vertscellen.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 6 eller 7,karakterisert vedat det virale genomiske RNAet er transkribert fra en viral DNA kopi som er kontrollert av en bakteriofag DNA avhengig RNA polymerasepromotor, og hvor vertscellen er fremskaffet ved en ekspresjonsvektor som leder ekspresjon i vertscellen til den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerasen.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8,karakterisert vedat den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerasen er 17, T3 eller SP6 polymerasen.

10. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 6-9,karakterisert vedat det pneumovirale polymerase enzymkomplekset i det minste inkluderer L, P og N proteinene.

11. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 6-10,karakterisert vedat en eller flere ekstra virale proteiner er pneumovirale matriks membranproteiner, fortrinnsvis M2-1 proteinet.

12. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et virion i samsvar med et eller flere av krav 1 -4, eller som kan fremstilles ved en fremgangsmåte i samsvar med et eller flere av krav 6-11 , og en farmasøytisk akseptabel bærer.

13. Anvendelse av et virion av et humant Respiratorisk Syncytial Virus omfattende et viralt genom som bare har en mutasjon i et gen som koder for et G-forankringsprotein for viruset, hvor muteringen funksjonelt inaktiverer G-forankringsproteinet for fremstilling av et medikament for forebygging eller behandling av en human Respiratorisk Syncytial Virusinfeksjon.

14. Anvendelse i samsvar med krav 13, hvor hele sekvensen som koder for G-forankringsproteinet fjernes fra det virale genomet.

15. Anvendelse i samsvar med krav 13 eller 14, hvor virionet omfatter et G-forankringsprotein fra den samme virale undergruppen som virusgenomet, på en form og i en mengde som kreves for infektivitet av virionet.

16. Anvendelse i samsvar med et eller flere av krav 13-15, hvor medikamentet er et preparat for intranasal administrering.

17. Sammensetning for å forebygge eller behandle en (human) Respiratorisk Syncytial Virusinfeksjon, omfattende et virion i samsvar med et eller flere av krav 1-4, i en mengde som er effektiv i å forebygge eller behandle infeksjonen.

18. Sammensetning i samsvar med krav 17, for intranasal administrasjon.