CN114990079B - 治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用 - Google Patents

治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114990079B
CN114990079B CN202210467320.2A CN202210467320A CN114990079B CN 114990079 B CN114990079 B CN 114990079B CN 202210467320 A CN202210467320 A CN 202210467320A CN 114990079 B CN114990079 B CN 114990079B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rsv
therapeutic
defect
sequence
atdip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210467320.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114990079A (zh
Inventor
刘文宽
周荣
许多
张丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority to CN202210467320.2A priority Critical patent/CN114990079B/zh
Publication of CN114990079A publication Critical patent/CN114990079A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114990079B publication Critical patent/CN114990079B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18523—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18541—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18543—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18551—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/18552—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/70—Vectors containing special elements for cloning, e.g. topoisomerase, adaptor sites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治RSV病毒感染的产品中的应用，治疗性缺陷干扰颗粒从3’末端至5’末端的方向依次包括以下元件：RSV病毒基因组的前导序列以及RSV病毒基因组的尾随序列。该治疗性缺陷干扰颗粒具备感染后的治疗性作用以及感染前的预防性作用，具备持续抗病毒能力，而且对于同种属病毒均有良好的抗病毒作用，能够实现针对突变体的快速、灵活应变，有效解决病毒高突变引起的耐受性问题。

Description

治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治RSV病毒感染的产 品中的应用
技术领域
本发明涉及疾病治疗技术领域，特别是涉及一种治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治RSV病毒感染的产品中的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是造成婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒，是目前除新型冠状病毒外造成全球范围内医疗、社会负担最重的呼吸道病原体。RSV感染仅引起轻微的呼吸道纤毛上皮细胞损伤，但在2～6个月的婴幼儿感染中，可引起细支气管炎和肺炎等严重呼吸道疾病，其发生机制除病毒感染直接作用外，可能与婴幼儿呼吸道组织学特性、免疫功能发育未完善及免疫病理损伤有关。该病毒不能在鸡胚中生长，但可在多种培养细胞中缓慢增殖，约2～3周出现细胞病变，病变特点是形成细胞融合形成的多核巨细胞，胞质内有嗜酸性包涵体。RSV感染仍缺乏经济有效的特异性治疗手段，也无疫苗可用，多为对症支持治疗，其中包括了病毒唑(Ribavirin)、激素类药物的使用，但其副作用严重。Synagis帕利珠单抗(palivizumab)是目前唯一用于预防RSV的抗体，但其仅用作预防性治疗，价格昂贵，有严格用药限制并有耐药性问题，医疗救治迫切需要RSV特效抗病毒药物。
对于抗病毒药物研究来说，存在两个主要难点。首先，病毒“寄生性”导致的病毒生命过程与机体细胞生命过程难以区分。药物在针对病毒起作用的同时也影响到机体细胞，杀敌一千，自损八百。如何尽可能有效区分两者是成药的关键。其次，病毒特别是RNA病毒的高变异特性带来的耐受性，极大增加药物开发难度和成本。病毒高变异特点可能使研究成本高昂的药物/疫苗的效果大打折扣。如何应对病毒特别是RNA病毒高突变特点，提高药物适应能力亦为成药的关键。而目前，针对呼吸道合胞病毒的特异性防治药物仍然十分缺乏。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够特异性防治呼吸道合胞病毒感染的治疗性缺陷干扰颗粒。
一种治疗性缺陷干扰颗粒，从3’末端至5’末端的方向依次包括以下元件：RSV病毒基因组的前导序列和RSV病毒基因组的尾随序列。
在其中一个实施例中，所述RSV病毒基因组的前导序列和所述RSV病毒基因组的尾随序列之间，沿3’末端至5’末端的方向还依次包括RSV病毒基因组的转录起始信号、RSV病毒NS1基因的非编码区、报告基因序列、RSV病毒L基因的非编码区和RSV病毒基因组的转录终止信号。
在其中一个实施例中，所述报告基因序列为荧光蛋白基因序列。
在其中一个实施例中，所述RSV病毒基因组的前导序列、所述RSV病毒基因组的转录起始信号、所述RSV病毒NS1基因的非编码区、所述RSV病毒L基因的非编码区、所述RSV病毒基因组的转录终止信号以及RSV病毒基因组的尾随序列均来源于RSV-long株。
本发明还提供了一种DNA片段，所述DNA片段编码如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如上所述的DNA片段。
在其中一个实施例中，所述重组表达载体还含有T7启动子序列、T7终止子序列、锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列中的一种或多种。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组中含有如上所述的DNA片段或如上所述的重组表达载体。
本发明还提供了一种如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒、DNA片段、重组表达载体或宿主细胞在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。
本发明还提供了一种抗呼吸道合包病毒药物，其包括如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒，以及药学上可用的辅料。
自然情况下，病毒在感染增殖过程中会产生某些缺陷突变，从而产生缺陷干扰颗粒(defective interfering particle,DIP)，这些DIP无单独的自我复制能力，但在有正常病毒的细胞中可竞争抑制正常病毒并“盗取”病毒重要蛋白实现自身复制、包装、释放，并可感染新细胞，这就为人工设计DIP用于抑制病毒复制提供了重要基础，并且这种抑制作用是特异性的，但是对于不同的病毒而言，具体何种结构的缺陷干扰颗粒能够获得优异的病毒抑制作用则是不同且未知的。本发明通过分析RSV病毒的基因组结构及其复制、转录机制，开发并筛选得到一种人工RSV治疗性缺陷干扰颗粒(artificial therapeutic defectiveinterfering particle,ATDIP)作为特异性抗病毒药物，并对其抗病毒效果进行了分析，证明该治疗性缺陷干扰颗粒具备感染后的治疗性作用以及感染前的预防性作用，具备持续抗病毒能力，而且对于同种属病毒均有良好的抗病毒作用，能够实现针对突变体的快速、灵活应变，有效解决病毒高突变引起的耐受性问题。
附图说明
图1为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒RSV-ATDIP-EGFP(A)及其对照RSV-ATDIP-Control(B)的结构示意图；
图2为本发明一实施例的利用pBR322构建RSV-ATDIP核酸载体pRSV-ATDIP-EGFP(A)及其对照pRSV-ATDIP-Control(B)的结构示意图；
图3为本发明一实施例的体外转录RNA的电泳检测结果；其中，M为RNA marker，ATDIP为RSV-ATDIP-EGFP条带，Ctrl为RSV-ATDIP-Control条带；
图4为本发明一实施例的转染RSV-ATDIP-EGFP和RSV-ATDIP-Control培养48h(48h.p.i.)后观察细胞病变产生的情况的显微照片；其中，RSV(-)Control为阴性对照，RSV(+)Control为阳性对照，RSV-ATDIP-Control为对照干扰颗粒，RSV-ATDIP-EGFP为本发明实施例的治疗性缺陷干扰颗粒；
图5为本发明一实施例的转染RSV-ATDIP-EGFP和RSV-ATDIP-Control培养48h(48h.p.i.)后分别取培养上清进行RSV qRT-PCR定量检测和利用斑点形成实验进行RSVPFU测定的结果；其中，A为qRT-PCR定量检测的核酸水平浓度，B为斑点形成实验的活病毒粒子显微照片，RSV(-)Control为阴性对照，RSV(+)Control为阳性对照，RSV-ATDIP-Control为对照干扰颗粒，RSV-ATDIP-EGFP为本发明实施例的治疗性缺陷干扰颗粒；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值±SEM，t-test分析显著性，其中***表示p<0.001，ns表示无显著差异；
图6为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒RSV-ATDIP-EGFP对感染前的预防性效果分析结果；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值±SEM，t-test分析显著性，其中***表示p<0.001，ns表示无显著差异；
图7为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒RSV-ATDIP-EGFP在RSV感染细胞中的持续抗病毒能力分析结果；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值±SEM；
图8为呼吸道合胞病毒不同型别主要启动子序列的对比示意图；
图9为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒RSV-ATDIP-EGFP对不同呼吸道合胞病毒株的抗病毒作用分析结果；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值±SEM，t-test分析显著性，***表示p<0.001。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒，如图1所示，从3’末端至5’末端的方向依次包括以下元件：RSV病毒基因组的前导序列(leader，le)以及RSV病毒基因组的尾随序列(trailer，tr)。
分析RSV病毒的特点，其属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的肺病毒属(Pneumovirus)，为有囊膜的非分节段的负链RNA病毒[(-)ssRNA]。基因组约15.2kb，RSV的基因顺序为3’-leader-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-trailer-5’，整个基因组可转录10个mRNA、编码11个蛋白，包括4个与基因组转录与复制密切相关的N、P、L和M2-1，2个粘附蛋白G、F。目前，RSV分为两种抗原亚型A和B，进一步分为11个RSV-A和23个RSV-B基因型，而病毒变异就主要集中位于G、F蛋白。RSV的leader(le)和trailer(tr)分别位于基因组3’和5’末端，长度分别为44nt和155nt，是基因组RNA合成的启动子区，也是病毒包装信号所在，其中前11nt是其启动子核心元件，可以直接启动RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)进行病毒转录和复制两种不同的RNA合成过程，且其中3、5、8、9、10和11位是关键核苷酸。转录、复制后最终产生新的病毒粒子所需的蛋白、基因组，从而实现RSV复制增殖。该过程是为病毒的核心生命过程，同样的，该过程如遭到破坏将可直接抑制病毒复制，是重要的抗病毒研究靶点。
自然情况下，病毒在感染增殖过程中会产生某些缺陷突变，从而产生缺陷干扰颗粒(defective interfering particle,DIP)，这些DIP无单独的自我复制能力，但在有正常病毒的细胞中可竞争抑制正常病毒并“盗取”病毒重要蛋白实现自身复制、包装、释放，并可感染新细胞，这就为人工设计DIP用于抑制病毒复制提供了重要基础，并且这种抑制作用是特异性的，但是对于不同的病毒而言，具体何种结构的缺陷干扰颗粒能够获得优异的病毒抑制作用则是不同且未知的。本发明通过分析RSV病毒的基因组结构及其复制、转录机制，开发并筛选得到一种人工RSV治疗性缺陷干扰颗粒(artificial therapeutic defectiveinterfering particle,ATDIP)作为特异性抗病毒药物，并对其抗病毒效果进行了分析，证明该治疗性缺陷干扰颗粒具备感染后的治疗性作用以及感染前的预防性作用，具备持续抗病毒能力，而且对于同种属病毒均有良好的抗病毒作用，能够实现针对突变体的快速、灵活应变，有效解决病毒高突变引起的耐受性问题。
在一些具体示例中，RSV病毒基因组的前导序列和RSV病毒基因组的尾随序列之间，沿3’末端至5’末端的方向还依次包括RSV病毒基因组的转录起始信号、RSV病毒NS1基因的非编码区、报告基因序列、RSV病毒L基因的非编码区和RSV病毒基因组的转录终止信号。如此，通过报告基因的表达便于进行实验分析检测，但可以理解其并非抗病毒作用所必需。可选地，报告基因序列为荧光蛋白基因序列，例如绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白序列等，但不限于此。
在一些具体示例中，上述RSV病毒基因组的前导序列、RSV病毒基因组的转录起始信号、RSV病毒NS1基因的非编码区、RSV病毒L基因的非编码区、RSV病毒基因组的转录终止信号以及RSV病毒基因组的尾随序列均来源于RSV-long株(Genbank accessionno.KF713490)，但来源于其他RSV病毒株的上述序列也可。
本发明一实施例的DNA片段，其编码如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒。
本发明一实施例的重组表达载体，该重组表达载体含有如上所述的DNA片段，可以利用重组表达载体进行体外转录以获得上述治疗性缺陷干扰颗粒。
可以理解，载体类型包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
在一个具体示例中，重组表达载体还含有T7启动子序列、T7终止子序列、锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列中的一种或多种。通过锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列可以辅助切割以提高转录RNA的准确性。
在一个具体示例中，重组表达载体基于pBR322构建得到。
本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞的基因组中含有如上所述的DNA片段或重组表达载体。宿主细胞的类型包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞等的人细胞，或动物细胞。
本发明还提供了如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒、DNA片段、重组表达载体或宿主细胞在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。
在一个具体示例中，上述产品为试剂、试剂盒、药物或装置等，可以理解，具体类型不限于此。
本发明一实施例的用于防治呼吸道合胞病毒感染的药物，其包括如上所述治疗性缺陷干扰颗粒，以及药学上可用的辅料。
在一个具体示例中，上述药物的剂型为注射剂、微粒制剂等，但不限于此。
在一个具体示例中，辅料包括稀释剂、防腐剂、缓冲剂、崩解剂、抗氧剂、助悬剂、着色剂和赋形剂中的一种或多种。
在一个具体示例中，稀释剂选自聚乙二醇、丙二醇、植物油和矿物油中的一种或多种。在一个具体示例中，防腐剂选自山梨酸、山梨酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸苄酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯甲酸和苯甲醇中的一种或多种。在一个具体示例中，缓冲剂选自磷酸氢钠、磷酸二氢钠、枸橼酸钠、酒石酸钠和醋酸钠中的一种或多种。在一个具体示例中，崩解剂选自交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种。在一个具体示例中，抗氧剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、二丁基羟基甲苯、甘氨酸、肌醇、抗坏血酸、抗坏血酸钠、卵磷脂、苹果酸、氢醌、枸橼酸、琥珀酸和焦亚硫酸钠中的一种或多种。在一个具体示例中，助悬剂选自蜂蜡、乙基羟乙基纤维素、甲壳素、甲壳糖、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂、羟丙基甲基纤维素和黄原胶中的一种或多种。在一个具体示例中，着色剂选自炭黑、铁黑、铁棕、铁红和二氧化钛中的一种或多种。在一个具体示例中，赋形剂选自甘露醇、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、右旋糖苷和氯化钠中的一种或多种。
本发明一实施例的抑制RSV病毒增殖的方法，包括以下步骤：向靶标位置递送上述治疗性缺陷干扰颗粒。可以理解，抑制RSV病毒增殖的方法可以用于疾病诊断和治疗目的，也可以用于非疾病诊断和治疗目的。
本发明一实施例的防治呼吸道合胞病毒感染的方法，包括以下步骤：向患者细胞递送上述治疗性缺陷干扰颗粒。
本发明的治疗性缺陷干扰颗粒针对的是RSV基因组复制与转录，是病毒特异性的关键核心生命过程，所涉及的核心顺式作用因子和反式作用因子均来源于病毒，与细胞生命过程相对区分，最大限度解决病毒“寄生性”带来的对机体细胞的影响，且启动子核心区关键核苷酸在RSV中都是高度保守的，可实现同种属病毒的抗病毒，其作用机制及核酸分子本身特点确保了其灵活性，即便产生重大突变，也能够实现针对突变体的快速、灵活应变，有效解决病毒高突变引起的耐受性问题。
下面主要结合具体实施方式和附图对去本发明作进一步详细的说明。
实施例一：RSV ATDIP制备
1、RSV-ATDIP核酸构成元件
根据RSV基因组结构特点，本发明构建RSV-ATDIP核酸的主要元件如图1所示。其中le和tr分别位于3’和5’末端，长度分别为44nt和155nt；基因的起始(gene start,gs)和终止(gene end,ge)及非编码区NCR1(NS1非编码区)和NCR2(L非编码区)，以上元件均为RSV-long株来源(Genbank accession no.KF713490)，为RSV自身序列；绿色荧光蛋白EGFP的加入为便于实验分析，可以不加或为其他基因，本实施例使用含有EGFP的RSV-ATDIP-EGFP及无le和tr启动子区的RSV-ATDIP-Control作为对比进行制备及分析。
2、RSV-ATDIP核酸载体构建
如图2A所示，利用pBR322骨架载体，在BamHI和HindIII酶切位点之间构建含有T7启动子和终止子以及锤头状核酶(hammerhead-type ribozyme)、丁型肝炎病毒核酶(HDVribozyme)的核酸载体(pRSV-ATDIP-EGFP)：5’-T7promoter-hammerhead-typeribozyme-tr-ge-NCR(L)-EGFP-NCR(NS)-gs-le-HDV ribozyme-T7 teminator-3’，同时如图2B所示，构建缺少le和tr序列的pRSV-ATDIP-Control。
3、体外转录
(1)pRSV-ATDIP-EGFP及pRSV-ATDIP-Control质粒使用EcoRV单酶切；
(2)酶切产物分别使用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit进行体外转录；
(3)体外转录产物使用DNase I消化30min去除DNA；
(4)RNA回收试剂盒回收RNA；
(5)1.5％Agarose gel电泳检测核酸完整性，如图3所示，并使用Nanodrop检测RNA浓度和纯度。
实施例二：RSV-ATDIP对感染后的治疗性效果分析
1、使用96孔板，接种HEp-2 1×104cell/well DMEM+10％FBS培养基于37℃5％CO2培养箱中过夜；
2、RSV-long(MOI 0.05)接种感染HEp-2 2h，后使用PBS洗一次去除未结合病毒，培养于DMEM+2％FBS中；
3、使用lipo3000转染RSV-ATDIP-EGFP和RSV-ATDIP-Control；感染后培养48h(48h.p.i.)后观察细胞病变产生的情况，如图4所示。
4、为分析不同组别下病毒增殖情况，分别取48h.p.i.后培养上清进行RSV qRT-PCR定量检测和利用斑点形成实验(focus-forming assay,FFA)进行RSV PFU(plaque-forming unit)测定，如图5所示。
(1)RSV qRT-PCR定量分析采用本发明申请人过往专利技术进行(ZL201610044078.2)。
(2)RSV PFU测定使用特异性抗体测得细胞感染病毒后的F蛋白，并通过显色反应显示出来。
1)接毒前12h铺HEp-2细胞至96孔板；
2)待细胞密度达到90％～95％；
3)D2(DMEM含2％FBS,Hepes,L-G,P/S,NEAA)10倍梯度稀释病毒并接种细胞，每个稀释度接4～6个复孔；
4)放入35℃5％CO2培养箱，每隔15min摇板；
5)感染1h后吸弃培养基，加入200μL DMEM-agarose mulch(2％SeaPlaque GTG-agarose mixed 1:1with 2×DMEM medium containing 4％FBS)；
6)48h后去除琼脂；
7)冰冻无水乙醇固定细胞20min；
8)使用RSV F抗体、HRP二抗孵育；
9)使用Trueblue显色。
图5.RSV-ATDIP可显著抑制RSV感染后细胞病毒增殖
结果显示与对照组相比，转染RSV-ATDIP-EGFP的细胞的病变明显少于RSV感染对照组和RSV-ATDIP-Control组，与感染阴性组基本一致(图4)。且RSV-ATDIP-EGFP组比对照组病毒量从病毒核酸(图5A)到具感染性的病毒粒子(图5B)均显著降低，达到2log差异，可见RSV-ATDIP具备感染后的治疗作用。
实施例三：RSV-ATDIP对感染前的预防性效果分析
1、使用96孔板，接种HEp-2 1×104cell/well DMEM+10％FBS培养基于37℃5％CO2培养箱中过夜；
2、使用lipo3000转染RSV-ATDIP-EGFP和RSV-ATDIP-Control；4h后去除培养上清；
3、RSV-long(MOI 0.05)接种感染HEp-2 2h，后使用PBS洗一次去除未结合病毒，培养于DMEM+2％FBS中；
4、感染后培养48h(48h.p.i.)后，取培养上清进行RSV qRT-PCR定量检测，如图6所示。
结果显示在RSV-ATDIP-EGFP存在下，细胞感染RSV后，其病毒复制能力有显著下降，RSV核酸下降>2log，表明RSV-ATDIP具备感染前的预防作用。
实施例四：RSV-ATDIP的持续抗病毒能力分析
1、使用96孔板，接种HEp-2 1×104cell/well DMEM+10％FBS培养基于37℃5％CO2培养箱中过夜；
2、RSV-long(MOI 0.05)接种感染HEp-2 2h，后使用PBS洗一次去除未结合病毒，培养于DMEM+2％FBS中；
3、使用lipo3000转染RSV-ATDIP-EGFP和RSV-ATDIP-Control；
4、48h.p.i.后，
(1)取细胞培养上清接种新鲜培养的HEp-2细胞；之后每48h.p.i.后都取上清接种新鲜HEp-2细胞，总计连续接种10代；
(2)取细胞培养上清进行RSV qRT-PCR定量检测，后续接种代数同样进行定量分析。
结果显示在RSV-ATDIP存在下，病毒增殖受到持续的抑制，表明RSV-ATDIP具备持续抗病毒作用。
实施例五：RSV启动子核心区分析及同种属病毒抗病毒效果
1、RSV启动子核心区关键核苷酸序列分析
目前，RSV可分为两种抗原亚型A和B，进一步分为11个RSV-A和23个RSV-B基因型，病毒变异主要集中位于G、F蛋白。RSV基因组3’-le(44nt)为其启动子区，其中前11nt为其核心区，可直接启动后续RNA合成，且3、5、8、9、10和11位核苷酸为关键核苷酸。分析RSV不同型别主要启动子序列，关键核苷酸在各型别中都高度保守，如图8所示。
2、不同RSV病毒株抗病毒分析
使用启动子核心区第4位核苷酸(4C/4G，但非关键核苷酸)与RSV-long存在差异的RSV-A2病毒株及启动子非核心区存在差异的RSV-B(201804037)株病毒(实验室分离保存)对本发明所设计RSV-ATDIP进行抗病毒分析。
(1)使用96孔板，接种HEp-2 1×104cell/well DMEM+10％FBS培养基于37℃5％CO2培养箱中过夜；
(2)RSV-A2和RSV-B(201804037)(MOI 0.05)接种感染HEp-2 2h，后使用PBS洗一次去除未结合病毒，培养于DMEM+2％FBS中；
(3)使用lipo3000转染RSV-ATDIP-EGFP和RSV-ATDIP-Control；
(4)分别取48h.p.i.后培养上清进行RSV qRT-PCR定量检测。
结果显示启动子非关键核苷酸的差异不影响ATDIP的抗病毒作用，如图9所示。综合图8和图9的实验结果表明RSV-ATDIP具备同种属病毒的抗病毒能力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种治疗性缺陷干扰颗粒在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用，其特征在于，所述治疗性缺陷干扰颗粒从3’末端至5’末端的方向依次由以下元件组成：RSV病毒基因组的前导序列、转录起始信号、NS1非编码区、L非编码区、转录终止信号和RSV病毒基因组的尾随序列；上述序列均来源于RSV-long株。
2.一种DNA片段在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用，其特征在于，所述DNA片段编码权利要求1中所述的治疗性缺陷干扰颗粒。
3.一种重组表达载体在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2中所述的DNA片段。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体还含有T7启动子序列、T7终止子序列、锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列中的一种或多种。
5.一种宿主细胞在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用，其特征在于，所述宿主细胞的基因组中含有权利要求2中所述的DNA片段或权利要求3~4任一项中所述的重组表达载体。
6.一种抗呼吸道合包病毒药物，其特征在于，包括权利要求1中所述的治疗性缺陷干扰颗粒，以及药学上可用的辅料。
CN202210467320.2A 2022-04-29 2022-04-29 治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用 Active CN114990079B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210467320.2A CN114990079B (zh) 2022-04-29 2022-04-29 治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210467320.2A CN114990079B (zh) 2022-04-29 2022-04-29 治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114990079A CN114990079A (zh) 2022-09-02
CN114990079B true CN114990079B (zh) 2023-07-04

Family

ID=83024643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210467320.2A Active CN114990079B (zh) 2022-04-29 2022-04-29 治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114990079B (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716821A (en) * 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
CN1224462A (zh) * 1996-07-15 1999-07-28 美国政府健康及人类服务部 从克隆的核苷酸序列制备减毒呼吸道合胞病毒疫苗的方法
HUE032898T2 (hu) * 2003-12-24 2017-11-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Mini Van Volksgezondheid Welzijn En Sport Légúti óriássejtes vírus transz komplementált genomi hiányossággal
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
CN105200069A (zh) * 2015-10-16 2015-12-30 北京交通大学 基于rna聚合酶ⅰ的rsv微型复制基因组及其应用
CN107022530A (zh) * 2017-03-02 2017-08-08 北京交通大学 重组腺病毒载体表达体内自组装呼吸道合胞病毒样颗粒及其制备方法和应用
CN107384958B (zh) * 2017-07-14 2020-04-10 北京交通大学 基于反向遗传学构建的rsv反基因组质粒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114990079A (zh) 2022-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11419926B2 (en) Identification of mutations in herpes simplex virus envelope glycoproteins that enable or enhance vector retargeting to novel non-HSV receptors
CA2305269C (en) Treatment of neoplasms with viruses
Sun et al. Functional evaluation of the role of reticuloendotheliosis virus long terminal repeat (LTR) integrated into the genome of a field strain of Marek's disease virus
JPH10503372A (ja) Ｈｓｖウイルスベクター
RU2461630C2 (ru) Применение комбинации вируса миксомы и рапамицина для терапевтического лечения
JP2023519640A (ja) 脱最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその方法および使用
Koyama et al. Virus multiplication and induction of apoptosis by Sendai virus: role of the C proteins
EP3907281A1 (en) Oncolytic virus expressing interferon and application therefor
Bao et al. IKKε modulates RSV-induced NF-κB-dependent gene transcription
US11793844B2 (en) Virus for treatment of tumor
WO2024056106A1 (zh) 一种节段化的水泡性口炎病毒载体及其制备方法和应用
WO2002006513A2 (en) A method for treating herpes viruses
CN114990079B (zh) 治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用
EP4112724A1 (en) Herpes simplex virus and use thereof
Chen et al. Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain
CN111041001B (zh) 治疗kras突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物
EP3783100A1 (en) Coxsackie virus b for treating tumors
Kang et al. Persistent infection of a gammaherpesvirus in the central nervous system
EP1181381B1 (de) Organ-, gewebs- und zellspezifisches immuntherapeutikum für chronische virale infektionen, sowie entzündliche, degenerative und proliferative erkrankungen insbesondere der leber sowie krebs auf der basis von rekombinantem parapoxvirus
Brandt et al. Tyrosine 116 of the herpes simplex virus type 1 IEα22 protein is an ocular virulence determinant and potential phosphorylation site
EP2647645B1 (en) Recombinant proteins of Parapoxvirus ovis and pharmaceutical compositions therefrom
CN105671006B (zh) 一种高效表达海肾荧光素酶基因的产品及其应用
Yu et al. Replication and pathogenicity of attenuated human metapneumovirus F mutants in severe combined immunodeficiency mice
KR100845643B1 (ko) 기관 섬유증에 대한 파라폭스바이러스 오비스 균주의 용도
US20240050549A1 (en) Recombinant Ranavirus, Methods of Production, and Its Use As A Mammalian Expression System

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant