CN1224462A - 从克隆的核苷酸序列制备减毒呼吸道合胞病毒疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

通过将与减毒表型有关的特定突变引入野生型或不完全减毒的RSV(由冷传代或引入使病毒有温度敏感性(ts)或冷适应(ca)表型的突变引起)中,来制备减毒的呼吸道合胞病毒(RSV)和疫苗组合物。或者,有重组RSV及其疫苗组合物引入减毒突变以及导致感染性RSV中所需结构和/或表型特性的其它突变。重组RSV具有由感染性RSV克隆中所选的核苷酸序列、基因或基因片段的插入、缺失、取代或重排而确定的所需突变。通过给予减毒的、生物衍生的或重组的RSV,可以刺激个体的免疫系统诱导抗天然RSV感染的保护,或抗RSV以及其它病原体(如PIV)感染的多重保护。

Description

从克隆的核苷酸序列制备减毒呼吸道合胞病毒疫苗的方法

                        相关申请

本申请要求了美国临时申请No.60/047,634(1997年5月23日提交)、60/046,141(1997年5月9日提交)、No.60/021,773(1996年6月15日提交)的优先权，并且是这些申请的部分续展申请，这些申请均纳入本文作为参考。

                        发明背景

作为引起一岁以下婴儿肺炎和细支气管炎的病因，人呼吸道合胞病毒(RSV)比其它所有微生物病原体更为重要。实际上所有儿童在两岁以内都会被感染，而且在年龄较大的儿童和青年中也会经常发生再次感染(Chanock等，ViralInfections of Humans,3rd ed.,A.S.Evans,ed.,Plenum Press,N.Y.(1989))。RSV导致了因呼吸道疾病而住进儿童医院的病例的1/5以上，并且据估计单单在美国每年就会导致91000人住院治疗和4500人死亡。尽管许多健康的成年人没有因RSV感染引起的严重疾病，但是年龄较大的患者和免疫能力较低的人经常会受到该病原体引起的严重的甚至对生命有威胁的感染。

尽管研制抗RSV的疫苗试剂的开发已经有数十年，但是还没有获得安全有效的疫苗来防止RSV感染引起的高发病率和显著的死亡率。不能成功地开发出疫苗的部分原因是，幼小婴儿中对RSV抗原的血清抗体和分泌性抗体应答非常弱。因此，这些婴儿会患有更严重的RSV感染，而积累的免疫力却可保护年龄较大的儿童和成年人免受病毒的更严重的侵袭。一种抗病毒化合物-病毒唑(ribavarin)-表现出具有治疗严重感染婴儿的潜力，但是没有迹象表明它能缩短住院时间或减少婴儿对支持性治疗的需求。

目前，RSV感染的免疫机理已经成为关注的焦点。分泌性抗体在保护上呼吸道方面显得最为重要，而高水平的血清抗体被认为在抗下呼吸道中RSV感染方面起主要作用。含有高滴度针对RSV中和抗体的纯化人免疫球蛋白，在免疫治疗严重的婴儿和青少年下呼吸道疾病的一些病例中表现出可用性。然而，免疫球蛋白的制剂有几个严重缺点，例如可能引入血液传播的病毒，制备与保藏困难且成本很高。

在60年代中期，测试了福尔马林灭活的病毒疫苗抗RSV的能力，但是该疫苗不能防止RSV感染或疾病，而且实际上在以后的病毒感染时病征会恶化。(Kim等，Am.J.Epidemiol.,89:422-434(1969),Chin等，Am J.Epidemiol.,89:449-463(1969)；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.,89:405-421(1969))。

最近，RSV疫苗的开发集中到减毒RSV突变株上。Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204:690-694(1968)报道了RSV的一种冷传代(cold passage)突变株(cpRSV)，它可充分减毒成候选疫苗。该突变株在26℃下的生长效率比其野生型亲代病毒稍高，但是它的复制既不对温度敏感又没有显著的冷适应性。然而，冷传代突变株可减毒并用于成年人。尽管cpRSV突变株对以前被RSV感染过的婴幼儿(即血清阳性个体)有令人满意的减毒性和免疫原性，但是它仍对血清阴性婴儿的上呼吸道有较低的毒力。

类似地，Gharpure等，J.Virol.3:414-421(1969)报道了温度敏感型RSV(tsRSV)突变株的分离，该突变株也是有前途的候选疫苗。在实验室和志愿者中对其中一个突变株ts-1进行广泛的评价。该突变株在成年志愿者中产生了无症状的感染，并且在免疫后45天内赋予了抗野生型病毒侵袭的抗性。同样，尽管血清阳性婴幼儿发生无症状感染，但是血清阴性婴儿表现出鼻炎和其它一些轻微症状。此外，尽管表现出部分或完全丧失温度敏感性的病毒只有少部分能从疫苗回复成病毒，并且与轻微鼻炎以外的疾病症状无关，但是检测到ts表型是不稳定的。

这些研究以及其它研究揭示了，某些冷传代和温度敏感型RSV病毒株减毒不充分而在一些疫苗接种者(尤其是血清阴性婴儿)中引起轻微的病症，而另一些病毒株则过分减毒，因而不能充分复制以引起保护性免疫应答(Wright等，Infect.Immun.,37:397-400(1982))。而且，候选疫苗突变株的遗传不稳定性会导致它们失去温度敏感性表型，这进一步阻碍了有效的RSV疫苗的开发。一般参见Hodes等，Proc.soc.Exp.Biol.Med.145:1158-1164(1974),McIntosh等,Pediatr.Res.8:689-696(1974)和Belshe等,J.Med.Virol.,3:101-110(1978)。

研究者放弃了减毒RS病毒疫苗方法，采用从感染细胞的裂解物中纯化获得的RS病毒包膜糖蛋白来测试潜在的亚单位候选疫苗。糖蛋白会在棉鼠的肺中诱导抗RS病毒感染的抗性(Walsh等，J.Infect.Dis.155:1198-1204(1987))，但是抗体的中和活性非常弱，而且用纯化的亚单位疫苗来免疫啮齿动物会促进患病(Murphy等，Vaccine 8:497-502(1990))。

还研究了表达F或G包膜糖蛋白且基于牛痘病毒重组体的疫苗。这些重组体可表达与真的病毒没有区别的RSV糖蛋白，而且用牛痘-RSV F和G重组病毒经皮肤感染的啮齿动物，会产生高水平的可中和病毒感染的特异性抗体。实际上，用牛痘-F重组体来感染棉鼠可刺激产生抗下呼吸道中RSV复制的几乎完全的抗性，和抗上呼吸道中RSV复制的明显抗性。Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:7462-7466(1986)。然而，用牛痘F和牛痘G重组体来免疫黑猩猩，在上呼吸道中不能提供抗RSV侵袭的抵抗力(Collins等，Vaccine 8:164-168(1990))而在下呼吸道中却可提供不协调的保护(Crowe等，Vaccine 11:1395-1404(1993))。

由于减毒RSV株、亚单位疫苗和其它RSV疫苗开发策略未能实现目标，因此非常需要有一种新的方法来确定新的RSV疫苗重组工程基因靶，并开发出操作重组RSV以掺入基因改变，以便在活的减毒RSV重组体生产新的表型特性。然而，对RSV和其它反义RNA病毒的基因组RNA进行操作至今仍非常困难。在这方面的主要障碍是：这些病毒裸露的基因组RNA没有侵染性，病毒在组织培养物中很难生长，复制周期长，病毒体不稳定，基因组复杂，以及基因产物结构耐处理。

直接对未片段化的负链RNA病毒进行遗传操作的方法最近才刚开始开发(综述可参见，Conzelman,J.Gen.Virol.77:381-89(1996)；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11354-58(1996))。在核衣壳N、磷蛋白P以及聚合酶大亚基L的存在下已经从cDNA编码的反基因组RNA成功地拯救了感染性狂犬病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒和仙台病毒(Garcin等，EMBO J.14:6087-6094(1995)；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-81(1995)；Radecke等，EMBO J.14:5773-5784(1995)；Schnell等，EMBO J.13:4195-203(1994)；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-92(1995))。RSV的成功拯救还需要额外的蛋白质-M2ORF1转录延伸因子(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11563-7(1995))。

感染性RSV的拯救由于多种因素而变得复杂。具体地说，RSV有几个性能，这些性能使其和肺病毒(Pneumovirus)属其它成员与性质熟知的副粘病毒(Paramyxovirus)、Rubulavirus和麻疹病毒(Morbillivirus)属的副粘病毒有区别。这些区别包括：较多的mRNA，基因组3＇端有不同寻常的基因次序，在糖蛋白和M2基因的次序上有种间的可变性，基因间隔区内的多样性较大，有类似粘蛋白性质的吸附蛋白，病毒株之间广泛的序列多样性以及在其它未片段化负链RNA病毒没有发现的几种蛋白。

鉴于前述内容，本领域急需一种制备安全有效的疫苗的工具和方法，以便缓解RSV引起的严重健康问题，尤其是婴幼儿中的疾病。非常令人惊奇的是，本发明满足了这些以及其它相关的需求。

                          发明概述

本发明提供了用于设计和制备分离的减毒呼吸道合胞病毒(RSV)的新方法和新组合物。本发明的RSV从野生型或选定的RSV突变株亲代原种生物衍生获得，或是经重组加工而具有特定表型的基因变化。设计并选来用作疫苗的RSV至少有两个减毒突变，有时至少有三个减毒突变。在一个实例中，至少一个减毒突变发生在RSV聚合酶基因中，它包括核苷酸取代，该核苷酸取代导致了聚合酶蛋白中的氨基酸发生改变，从而产生了温度敏感(ts)表型。典型的生物衍生的和重组的RSV可使在较大的聚合酶基因L中有一个或多个核苷酸取代，从而在氨基酸Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处发生氨基酸改变，代表性的变化是Leu取代Phe₅₂₁、Leu取代Gln₈₃₁、Val取代Met₁₁₆₉和Asn取代Tyr₁₃₂₁。作为备选或额外方式，本发明的RSV可在不同RSV基因(如M2基因)中包含核苷酸取代。

减毒突变可以选自RSV基因的编码部分或非编码部分(如顺式调节序列)。典型的非编码突变包括基因起始序列中的单个或多个碱基变化，代表性的是M2基因起始序列中核苷酸7605位处的单个或多个碱基取代。较佳的，在密码子中引入两个或三个减毒突变导致突变(如在氨基酸Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处确定ts突变的密码子中)，从而减少了从ts表型回复的可能性。

在本发明的另一些实例中，生物衍生的或重组的RSV可筛选或工程改造以掺入至少两个减毒ts突变，例如在聚合酶基因中氨基酸Phe₅₂₁和Met₁₁₆₉(例子是新的生物衍生疫苗株cpts-530/1009,ATCC No.VR 2451),Phe₅₂₁和Tyr₁₃₂₁(例子是生物衍生株cpts-530/1030,ATCC No.VR 2455),Gln₈₃₁和M2基因起始序列中核苷酸7605处的起始突变(例子是生物衍生的RSV株cpts-248/404,ATCC No.VR2454)，或M2基因中核苷酸7605处的起始突变和Phe₅₂₁(例子是重组的RSVrA2cp/248/404/530)。

可引入选择的减毒突变的生物衍生型RSV包括：野生型RSV、宿主范围受限制的冷传代RSV、宿主范围受限制的冷传代RSV的冷适应突变株或温度敏感型病毒株。例如，冷传代的呼吸道合胞病毒可以是cpRSV株，包括其中至少引入两个温度敏感型突变的cpRSV。减毒的RSV病毒可以是亚组A，其例子是cptsRSV 248(ATCC VR 2450)、cpts 248/404(ATCC VR 2454)、cpts 248/955(ATCCVR 2453)、cpts RSV 530(ATCC VR 2452)、cpts 530/1009(ATCC VR 2451)、或cpts 530/1030(ATCC VR 2455)；或是亚组B，其例子是B-1cp52/2B5(ATCC VR2542)或B-1 cp-23，它们均根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USA)，并给予上述保藏号。

在本发明的另一个方面，提供了一种分离的感染性重组RSV，它是用RSV基因组或反基因组、核衣壳(N)蛋白、核衣壳磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子产生的。RNA聚合酶延伸因子可以是RSV的M2(ORF1)。分离的感染性RSV可以是病毒或亚病毒颗粒。基因组或反基因组可以包含野生型RSV序列、导致减毒表型的生物衍生突变株序列、或编码野生型RSV基因组或反基因组的重组RSV序列、或包含在任何生物衍生RSV株中没有的工程改造的突变或突变组合的重组修饰的RSV序列。

感染性RSV克隆可掺入来自任何RSV或RSV样病毒(如人、牛或鼠RSV(小鼠肺炎病毒)或禽类RSV(火鸡鼻气管炎病毒))或来自其它病毒(如副流感病毒(PIV))的编码或非编码核苷酸序列。在一个典型的方面，重组的RSV包含人RSV基因组或反基因组序列与异源RSV序列重组相连而形成的嵌合体。典型的异源序列包括：人RSV株RSV序列与下列序列合并形式的序列：来自不同的人RSV株(例如选自cpts RSV 248、cpts 248/404、cpts 248/955、cpts RSV 530、cpts530/1009或cpts 530/1030的两个或多个病毒株的序列的嵌合体)、亚组(如RSV亚组A和亚组B序列的组合)、非人RSV或其它病毒(如PIV)的序列。

在本发明的一个实例中，提供了重组RSV，其中与野生型或生物衍生的突变序列相比，基因组或反基因组是重组改变过的。掺入重组改变的RSV克隆中的突变可以根据它们能否改变所选RSV蛋白的表达和/或功能、产生所需的表型改变或为了其它各种目的来进行选择。所需的表型改变包括例如：病毒在培养物中的生长情况、温度敏感性、噬斑的大小、减毒程度和免疫原性方面的改变。例如，可以通过核苷酸的插入、重排、缺失或取代可以修饰编码基因组或反基因组的多核苷酸序列，以导致减毒性、温度敏感性、冷适应性、较小的噬斑、宿主范围限制性、基因表达的改变或免疫原性表位的改变。

一方面，提供了重组RSV，其中至少一个减毒突变发生在RSV聚合酶基因L中，并涉及导致ts表型的核苷酸取代。典型的RSV克隆中有核苷酸取代，该取代使聚合酶基因在Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处发生氨基酸变化。较佳的，可掺入两个或三个导致减毒突变的密码子突变。其它典型RSV克隆中有至少两个减毒ts突变。

发生在生物衍生获得的减毒RSV中的突变可以单独或组合地引入全长RSV克隆中，而且含有引入突变的挽救的重组病毒的表型很容易测定。在典型的实例中，减毒的生物衍生病毒相对于野生型RSV而表现出的氨基酸改变(例如冷传代RSV(cpRSV)或进一步减毒的RSV株如cpRSV温度敏感型衍生株(cptsRSV)所表现出的改变)被引入重组RSV克隆中。这些野生型或生物衍生突变株RSV序列的改变在获得的克隆中确定了所需的性能，例如减毒或进一步减毒的表型。与相应野生型或生物衍生突变株序列相比，这些变化最好通过采用两个或三个核苷酸改变而引入重组病毒中(这氧有使突变稳定，以防基因回复的效果)。

本发明也提供了有多个表型-特异性突变按照所选组合方式被引入感染性克隆的基因组或反基因组而形成的重组RSV。该方法与表型评价方法相结合，可提供有所需性能(如减毒性、温度敏感性、冷适应性、较小的噬斑、宿主范围限制性等)的突变重组RSV。如此确定的突变可以编成一个“菜单”并以各种组合方式引入以将疫苗病毒标定成有所选水平的减毒性、免疫原性和稳定性。在较佳的实例中，本发明提供了包括用涉及相同或不同基因的额外类型的突变来补充一种或多种来自生物衍生型RSV(如cp和ts突变)的突变。在本文中，用于突变的靶基因包括吸附蛋白(G)、融合蛋白(F)、小的疏水性蛋白(SH)、RNA结合蛋白(N)、磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)、转录延伸因子(M2)、M2 ORF2、基质蛋白(M)和两个非结构蛋白NS1和NS2。这些蛋白质的每一个可以全部或部分地、单独或与其它所需修饰方式相组合地被选择性缺失、取代或重排，以获得新的RSV重组体。在一个方面，SH基因被缺失，从而形成有新的表型性质(包括体外生长能力增强和/或体内减毒)的重组RSV。一个相关的方面是，这种基因缺失或其它非必需的基因或基因片段缺失(如NS1或NS2基因缺失)可在重组RSV中与一种或多种导致减毒表型的突变(如直接来自生物衍生减毒RSV突变株的突变，或其修饰形式(如通过在密码子中引入多个核苷酸改变以导致突变))相组合。例如，SH基因或NS2基因的缺失可以与选自cpts248/404、cpts530/1009、cpts530/1030的一种或多种cp和/或ts突变，或其它选定的突变RSV株组合，以产生重组的RSV。由于不同突变的组合效果，该重组RSV的病毒产率增加、减毒更充分、并有防止发生减毒表型回复的遗传抗性的效果。

另外，在重组RSV基因组或反基因组中可产生其它各种基因改变，从而可单独或与生物衍生型突变RSV的一种或多种减毒性点突变一起掺入感染性重组RSV中。可以插入全部或部分异源基因(例如来自不同RSV株或亚组或非RSV来源的基因)，基因的次序可以改变，基因的重叠序列可以除去，RSV基因启动子可以用其反基因组对应物代替，基因的部分可以除去或被取代，甚至整个基因可以被缺失。在序列中可以进行不同的或额外的修饰以便于操作(如在各基因间隔区内或其它地方插入独特的限制性位点(如在G和F基因之间插入独特的StuⅠ位点))。可以除去非翻译基因序列，以便增加插入外源序列的容量。

在典型实例中，一种RSV的各基因、基因片段、或单个或多个核苷酸可被来自异源RSV或其它来源的对应序列取代。例如，来自一个RSV的所选异源基因片段(例如编码所选蛋白的胞质尾区、跨膜结构域或胞外结构域、表位位点或区域、结合位点或区域、活性位点或含有活性位点的区域等的基因片段)，可以被另一个RSV中对应的基因片段取代，以产生新的重组体。例如是能表达一种嵌合蛋白的重组体，该嵌合蛋白具有一种RSV的胞质尾区和/或跨膜结构域，并与另一种RSV的胞外结构域融合。在一个实例中，一个RSV株或亚组的F和/或G保护性抗原被取代入不同株或亚组的RSV克隆，从而产生了可在免疫宿主中刺激产生针对株和亚组的交叉保护性免疫应答的重组病毒。另一方面，通过引入生物衍生突变RSV株(如cpts248/404、cpts530/1009或cpts530/1030)的一个或多个减毒的ts或cp点突变，可进一步修饰具有突变(突变包括基因或基因片段的改变(如取代的异源F和/或G基因或基因片段))的嵌合RSV克隆。在其它方面，人RSV中一个或多个编码或非编码区多核苷酸可被来自牛或小鼠RSV的对应序列单独取代，或被其与一个或多个选定的cp或ts突变的组合取代，以产生新的减毒疫苗株。在一个实例中，嵌合的牛-人RSV中的人RSV NP基因或基因片段被对应的牛NP基因或基因片段取代，该嵌合体可以被任意地构建成具有SH基因缺失、一个或多个cp或ts点突变、或本文公开的这些突变与其它突变的各种组合。

或者，编码RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子可被修饰成能编码非RSV序列(如细胞因子、T-辅助表位、限制性位点标记、或能在目标宿主内引起保护性免疫应答的微生物病原体(如病毒、细菌或真菌)的蛋白质)。

本发明的另一个方面提供了将前述结构和表型改变引入重组RSV中以生产感染性减毒疫苗病毒的方法。在一个实例中，提供了一种表达载体，该表达载体包含编码RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子。另外还提供了相同或不同的表达载体，该载体包含一个或多个编码N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的分离的多核苷酸分子。载体在细胞或不含细胞的裂解物中共表达，从而产生了感染性RSV颗粒。RSV基因组或反基因组以及N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白质可用相同或不同的表达载体中共表达。在一些例子中，N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白各自在不同的表达载体中分别表达。编码RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子可来自人、牛或鼠RSV序列，也可以是不同RSV或非RSV序列的嵌合体(例如含有来自亚组A RSV的序列并与来自亚组B RSV的序列操作相连的多核苷酸，或含有与PIV序列操作相连的RSV序列的多核苷酸)。野生型或生物衍生型突变RSV株的RSV基因组或反基因组可以通过一个或多个核苷酸的插入、重排、缺失或取代(包括点突变、位点特异性核苷酸改变和涉及整个基因或基因片段的改变)来进行修饰。这些变化通常界定了形成的重组RSV有所选的表型改变，例如导致产生减毒性、温度敏感性、冷适应性、小的噬斑、宿主范围限制性、基因表达的改变或免疫原性表位改变的表型改变。

在另一个实例中，本发明提供了一个细胞或不含细胞的裂解物，该裂解物含有：包含分离的编码RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子的表达载体；和包含一个或多个分离的多核苷酸分子的表达载体，该多核苷酸分子可编码RSV的N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白质。一旦表达，基因组或反基因组以及N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白质结合形成感染性RSV颗粒，如病毒或亚病毒颗粒。

本发明的减毒RSV可以在受感染的人宿主内引起保护性免疫应答，但该RSV是充分减毒的，从而不会在免疫宿主中引起不可接受的严重的呼吸道疾病症状。减毒的病毒可以存在于细胞培养物上清液中，可从培养物中分离或经部分或完全纯化。病毒也可冻干，并可与其它各种组分混合，以便按照需要进行或按需输递至宿主中。

本发明还提供了新的疫苗，该疫苗包含生理上可接受的载体和/或佐剂以及分离的减毒RSV株。在一个实例中，疫苗包括感染性RSV，该RSV有至少两个突变，有时三个或多个减毒突变，其中至少一个会使呼吸道合胞病毒聚合酶基因的氨基酸Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处有温度敏感性取代。在另一个实例中，疫苗包含重组的减毒RSV。疫苗可以配制成剂量为10³-10⁶pFU减毒病毒。疫苗可以包含抗原亚组A或B的减毒病毒，或亚组A和B的病毒可以组合入疫苗配方中，以便更全面地覆盖流行的RSV感染。

本发明另一个方面提供了一种刺激个体免疫系统以便更全面地抵抗流行的RSV或诱导抗RSV保护性的方法。方法包括用疫苗进行给药，该疫苗中配制有免疫充足量的本发明的减毒呼吸道合胞病毒。在一个实例中，疫苗包含感染性RSV，该RSV有多个减毒突变，其中至少一个减毒突变会使L基因的氨基酸Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处有ts取代。在另一个实例中，疫苗包含重组的减毒RSV。病毒通常与可接受的载体和/或佐剂一起给药。方法可以包括通过喷洒、滴入、气雾剂等方式，以将数量为10³-10⁶PFU亚组A和/或亚组B的减毒病毒施用于个体的上呼吸道。减毒病毒通常是经鼻内来对个体给药的，该个体对所述病毒呈抗体血清阴性，或该个体具有经胎盘获得母体的抗RSV抗体。

                       附图简述

图1表示一系列亚组A呼吸道合胞病毒在小鼠肺中的复制与在黑猩猩中的复制之间存在基本完全的相关性。

图2和图3表示编码RSV反基因组RNA的cDNA的构建，其中图2表示cDNA和编码的反基因组RNA的结构(不成比例)。为了便于本发明附图以及以后的所有的实施例的描述，所用的具体cDNA和病毒是RSV亚组A的A2病毒株。反基因组的框图包括下列特征：T7启动子贡献的5＇端非病毒G三联体，位置1099(使长度增加1个核苷酸)、1139、5611和7559(从新限制性位点的第一个碱基开始数起)处的四个序列标记，核酶和串联T7终止子，核酶切割赋予3＇端的单个非病毒3＇磷酸化U残基(切割位点用箭头表示)。应注意，非病毒的5＇-GGG和3＇-U残基并不包括在这里以及此后的反基因组的长度数值内。然而，位置1099处的核苷酸插入被计数在内，因此与生物衍生的反基因组相比，在该位置下游的cDNA衍生反基因组的编号大一个核苷酸。D46的5＇到3＇正义序列(基因组本身是反义的)如SEQ ID NO:1所示，在位置4的核苷酸可以是C或G。也应注意，在该附图及后图中指定给限制性位点的序列位置是描述性的，它没有单独界定所涉及的所有核苷酸。这里以及后面限制性片段的长度也是描述性的，因为由于一些原因(如消化留下的粘性末端)，长度的赋值可以不同。还显示了连接后成为完全反基因组的克隆的cDNA片段。方框描述了从质粒载体中除去BamHⅠ位点，该修饰有利于装配：天然存在的BamHⅠ-SalⅠ片段(BamHⅠ位点(正义)显示在上行中，用下划线表示)被PCR产生的BglⅡ-SalⅠ片段代替(BglⅡ位点显示在下行中，用下划线表示；其中用斜体字表示的4个核苷酸的粘性末端与BamHⅠ的粘性末端相匹配)。这就产生了单核苷酸变化(短的下划线)，该变化在氨基酸水平上是沉默的。图3显示了cDNA编码的反基因组RNA中含有的序列标记，其中序列是正义序列，相对于编号为1的互补前导区的第一个核苷酸进行编号；在分别表示RSV亚组A和B的A2病毒株和18537间的相同核苷酸用点表示；表示cDNA中的限制性位点的序列用下划线表示；基因起始(GS)和基因末端(GE)转录信号用方框表示；位置1141处的N翻译开放读框的起始密码子用斜体字表示，每个序列下方示出了限制性位点。在上方的序列中，在位置1099处插入一个C残基，从而在NS2-N基因间隔区内形成一个AflⅡ位点，而紧靠N翻译开放读框上游的位置1139和1140的AG被CC代替，从而产生新的NcoⅠ位点。在中间的序列中，在G-F基因间隔区中位置5612和5616处的G和U分别被取代，产生一个新的StuⅠ位点。在下方的序列中，在F-M2基因间隔区中位置7560处的C取代产生了一个新的SphⅠ位点。

图4描述了参与插入突变、完整反基因组构建物的装配和重组病毒的回收的cDNA的结构(大致呈比例)。在下行显示的pUC118-或pC119-cDNA亚克隆中插入了四类突变，即L基因中的6个沉默限制性位点(在上方的D53框图中，用下划线表示)、F基因中的两个HEK改变(H)、5个cp改变(cp)，以及各生物诱变步骤引起的特异性突变：248、404、530、1009和1030(如图所示)。将诱变的亚克隆插入D50(表示从前导区到M2-L重叠区的RSV反基因组，在紧靠前导区上游有T7启动子)或D39(表示从M2-L重叠区到尾随序列的RSV反基因组，其中紧靠尾随序列下游的是核酶和T7终止子)中间质粒中，如中间行所示序列。将合适的D50和D39装配成如上面一行所示的全长D53反基因组cDNA(RTT表示锤头核酶后有两个T7转录终止子)。

图5提供了用来回收重组RSV的6个突变反基因组cDNA的图谱。ts表型的重组体归纳在图的右方。

图6显示了编码RSV反基因组的D46/1024CAT cDNA的结构，该RSV反基因组含有与RSV转录信号侧接的CAT ORF(没有按照比例绘制，RSV特异性片段用实心框表示，CAT序列用空心框表示)。CAT基因转录盒的来源是RSV-CAT微小基因组(minigenome)cDNA 6196(上方方框内)。RSV-CAT微小基因组含有前导区、GS和GE信号、非编码(NC)的RSV基因序列和CAT ORF，以及在GS信号前和GE信号后的XmaⅠ限制性内切核酸酶位点。图中示出了这些元件的核苷酸长度，而XmaⅠ位点周围的序列(正义)显示在框图上方。在亲代质粒D46的StuⅠ位点插入8个核苷酸的XmaⅠ接头，构建成质粒D46/1024。D46是完整的反基因组cDNA，它等价于D53；其命名的不同只是为了表示这两种不同的制备方法。将质粒6196的Xma-XmaⅠ片段插入质粒D46/1024，从而构建成质粒D46/1024CAT。D46编码的RNA显示在下方，它包括T7启动子提供的三个5＇端非病毒G残基，以及锤头核酶酶切提供的3＇端磷酸化U残基；反基因组的核苷酸长度不包括这些非病毒的核苷酸。L基因被错开绘制，以表明基因重叠。

图7表示编码RSV反基因组的亲代野生型D46质粒(顶部)和SH基因缺失的D46/6368衍生株(底部)。RSV基因表示成空心的矩形，而上游和下游末端的GS和GE转录信号分别表示成实心的方框。T7噬菌体启动子(左方)和锤头核酶以及用来形成RNA转录物3＇端的T7终止子(右方)用小的空心方框表示。D46的ScaⅠ和PacⅠ片段被短的合成片段代替，形成D46/6368。D46中SH基因的侧翼序列以及D46/6368中的工程化区域的序列分别在各自的质粒图谱中用方框表示。D46中的ScaⅠ-PacⅠ片段及其在D46/6368中的代替物用粗体表示，并用朝上的箭头来划分边界。M GE、SH GS、SH GE和G GS位点用上划线表示。D46/6368中新的M-G基因间隔区在下方框图中标记成65，以表示其核苷酸长度。在下方描述了SH-(-)(减去SH)D46/6368构建物的正义T7转录物；还显示了T7启动子提供的三个5＇端非病毒G残基和3＇端U残基(Collins等，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11563-11567，其内容纳入本文作参考)。这些非病毒核苷酸在长度测定值内并不包括。

图8提供了被D46野生型或D46/6368 SH-(-)病毒感染的细胞胞内RNA总量的RT-PCR分析结果，以确认SH基因座中的缺失。RT用与SH基因上游退火的正义引物进行，PCR还采用与SH基因下游退火的反义引物。泳道：(1和5)由1kb DNA序列梯组成的标记物(Life Technologies,Gaithersburg,MD)；(2)经RT-PCR的D46/6368 RNA；(3)经RT-PCR的D46 RNA；(4)只经过PCR的D46/6368RNA。PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭染色。一些标记DNA片段的核苷酸长度显示在右方。

图9显示了D46野生型和D46/6368 SH-(-)病毒编码的RNA的Northern印迹杂交结果。从感染的细胞中分离出总的胞内RNA，不预先经过变性，在所选RNA也包括基因组RNA(由于夹心杂交)的条件下进行寡聚(dT)层析。在甲醛-琼脂糖凝胶上进行电泳并在硝酸纤维素膜上印迹。各个相同印迹与[³²P]标记的M、SH、G、F、M2或L基因的DNA探针进行杂交，如图所示。泳道：(1)D46/6368 RNA；(2)D46 RNA；(3)未感染的HEp-2细胞RNA。基因组RNA(gen.)、mRNA(大写字母)和连读转录物(小写字母)的位置显示在左侧。连读转录物P-M和M-G(M探针)的位置是重合的，G-F和F-M2转录物(F探针)的位置也是如此。0.24-9.5kbRNA序列梯分子量标记物(Life Technologies)的位置显示在右侧，它是平行电泳并通过与[³²P]标记的噬菌体λ的DNA杂交来显示。

图10显示了[³⁵S]标记的RSV蛋白质的SDS-PAGE结果，该蛋白在用D46野生型或D46/6368减去SH病毒感染的HEp-2细胞中合成。用针对纯化病毒颗粒的抗血清对蛋白质进行免疫沉淀，并在预制的4％-20％梯度Tris-甘氨酸凝胶(Novex,San Diego,CA)中进行电泳分析。病毒蛋白的位置显示在左侧；标记蛋白(Kaleidoscope Prestained Standards,Bio-Rad,Richmond,CA)的位置和分子量(千道尔顿)显示在右侧。

图11-13提供了D46野生型和D46/6368 SH-(-)病毒在HEp-2细胞(图11)、293细胞(图12)和AGMK-21细胞(图13)中的生长曲线。在25cm2培育瓶中的三个一组的单层细胞用2PFU/细胞的任一病毒进行感染，并在37℃下培育。在所示的时间点取等份，储藏在-70℃下。用抗体染色的噬斑测定来平行地滴定。所示的每个点是三个受感染的单层细胞的平均滴度。

图14和15显示了小鼠上呼吸道(图14)和下呼吸道(图15)中病毒复制的动力学，该小鼠用D46野生型病毒、D46/6368 SH-(-)病毒或生物衍生的cpts248/404病毒来鼻内接种。24个一组的小鼠用10⁶FPU所示病毒来鼻内接种。在指定日，每一组中杀死6只小鼠，并取出鼻甲骨和肺组织匀浆化，对各样品用噬斑测定来确定感染病毒的程度，并确定平均对数滴度。

图16显示了SH-(-)病毒的转录产物和基因次序与其野生型对应物的比较结果。上面一块归纳了SH-(-)病毒产生的某些mRNA的量与野生型亲代重组病毒相比的分析结果。从用SH-(-)病毒或野生型病毒感染的细胞中分离出胞内mRNA，并用基因特异性探针进行Northern印迹杂交来分析。定量测定杂交的放射性，并且显示了对于其野生型亲代而言每种SH-(-)病毒产生的各种mRNA的相对丰度。下面一块表示野生型病毒从M基因(基因次序在位置5处)到L基因(位置10处)的基因次序。将其与SH-(-)病毒的基因次序相比，SH-(-)病毒的基因次序中由于SH基因的缺失，G、F、M2和L基因的基因次序的位置发生改变。

图17显示了通过SH基因的缺失而被修饰的D46反基因组质粒，该缺失没有将任何异源序列插入重组病毒中。SH基因的侧翼序列显示在顶端。还显示了MGE、M-SH基因间隔区(IG)、SH GS、SH GE和SH-GIG序列。通过缺失而除去的区域用下划线表示，缺失点用朝上的三角形表示。该缺失形成的反基因组是D46/6340。

图18显示了将串联的翻译终止密码子引入编码NS2蛋白质的翻译开放读框(ORF)。质粒D13含有反基因组cDNA的左侧末端，它包括T7启动子(带阴影的方框)、前导区、NS1、NS2、N、P、M和SH基因。只显示了D13的cDNA插入片段。将含有T7启动子、NS1和NS2基因的AatⅡ-AflⅡ片段亚克隆入pGem载体中，用定点诱变来修饰用NS2 ORF中的列出序列的区域。示出了密码子18-26的野生型序列(编码的氨基酸显示在下方)，上方的三个核苷酸是三个取代，这些取代引入了两个终止密码子(ter)和一个作为标记的XhoⅠ位点(下划线)。获得的cDNA和随后回收获得的病毒称为NS2-剔除型病毒(KO)。

图19比较了在HEp-2细胞中用野生型RSV(D53)和NS2-剔除RSV生产感染性病毒的情况。用任一病毒以3PFU/细胞的感染复数(moi)来感染三个一组的单层细胞，在指定的间隔时取样，用噬斑测定和免疫染色进行定量。

图20显示了NS1和NS2基因的基因末端(GE)信号的改变。图中显示了质粒D13的cDNA插入片段，它表示从T7启动子(阴影)到4623位处PacⅠ位点的反基因组cDNA的左手末端。将含有T7启动子和NS1和NS2基因的AatⅠ-AflⅡ片段亚克隆入pGem载体中。同时在两个位点处进行定点诱变来修饰，即将NS1和NS2 GE信号各自修饰成与N基因中天然发现的信号相同。图中显示了野生型NS1和NS2 GE信号的序列(由对应于完整反基因组序列的序列位置确定)，且核苷酸取代显示在线的上方。NS2 GE信号的野生型序列中的破折号表示突变使GE信号的长度增加了一个核苷酸。

图21显示了编码NS1蛋白的多核苷酸序列的缺失。下方显示了D13 cDNA的左手部分：D13含有反基因组cDNA的左手部分，从前导区到SH基因的末端，在紧靠前导区的上游有T7启动子。上方显示了缺失点(向上的箭头)两侧的序列。缺失是从紧靠NS1 ORF的翻译起始位点前到紧靠NS2 ORF的翻译起始位点前。因此，它有使NS1 GS与NS2 ORF上游非编码区融合的效果。这可防止任何顺式作用的序列元件被破坏，而这些序列元件会由于其邻近前导区而延伸入NS1基因中。

图22显示了编码NS2 mRNA的多核苷酸序列的缺失。如上所述，显示了D13cDNA的左手部分，并显示了缺失点(向上的箭头)两侧的序列。缺失是从紧靠NS1基因的下游到紧靠NS2基因的下游。因此，编码NS2 mRNA的序列被全部缺失，但是其它序列没有被破坏。获得的cDNA和随后回收的重组病毒称为ANS2。

图23表示G蛋白的分泌形式的翻译起始位点的消除情况。空心的矩形表示289个氨基酸的G蛋白，其中含有信号-锚序列。在上方示出了位置45到53的氨基酸序列，以描述两个将氨基酸48从甲硫氨酸变为异亮氨酸以及氨基酸49从异亮氨酸变为缬氨酸的核苷酸取代。前一突变消除了分泌型的反义起始位点。两个突变还产生了MfeⅠ位点，从而提供检测突变的简便方法。获得的DNA和随后回收的病毒称为M48Ⅰ(甲硫氨酸48变为异亮氨酸48)。

图24表示用野生型RSV(D53)和两个回收的D53/M481膜G突变病毒来生产感染性病毒的结果比较。

                        具体实例描述

本发明提供了适用于人疫苗的生物衍生的和重组的RSV。本文的减毒RSV是通过将特定减毒突变引入和/或结合入不完全减毒的RSV株(如温度敏感型(ts)或冷传代型(cp)RSV)，或结合入野生型病毒(如RSV A2病毒株)中来制得的。生物衍生的RSV中的突变可以自然发生，或可以用熟知的诱变或类似方法而引入所选的RSV株中。例如，不完全减毒的亲代RSV株可通过病毒在细胞培养物中(在该培养物中加入化学诱变剂)生长时的化学诱变法，或者通过对已经加入化学诱变剂，在次优温度下传代的，以引入生长限制突变的病毒进行选择，或通过选择可在细胞培养物中产生小噬斑(sp)的诱变的病毒而制得，这可按本文和USSN08/327,263中所述的那样进行，该申请内容纳入本文作参考。

“生物衍生(型)的RSV”指不用重组方法产生的任何RSV。因此，生物衍生的RSV包括天然存在的所有RSV亚组和病毒株，其包括例如天然存在的有野生型基因组序列的RSV、有与参照野生型RSV序列相比有基因组变化的RSV(如有导致减毒表型的突变的RSV)。同样，生物衍生的RSV也包括通过人工诱变和选择程序而衍生自亲代RSV病毒株的RSV突变株。

为了制得本发明的令人满意的减毒RS病毒，突变最好能引入不完全或部分减毒的亲代病毒株(如ts-1或ts-4突变株或cpRSV)中。对于亚组A的病毒，不完全减毒的亲代病毒最好是ts-1或ts-1NG或cpRSV(它们是亚组A的A2病毒株的众所周知的突变株)或其衍生株或亚克隆。在另一个实例中，对与减毒表型相关的特定突变进行了鉴定，并将该突变引入适用于疫苗的病毒株中。引入特定减毒突变的病毒株可以是野生型病毒，或原来就已部分减毒的病毒，例如在后一种情况下，额外的突变使病毒株进一步减毒。例如减毒至在哺乳动物宿主中具有所需水平的受限制复制，同时也保留了充分的免疫原性以保护受疫苗者。

亚组A或B病毒的部分减毒突变株可这样制得：将野生型病毒生物克隆入合适的细胞基质中，并开发其冷传代的突变株，或对病毒进行化学诱变以产生ts突变株，或选择小的噬斑或类型表型的突变株(例如参见，Murphy等，国际申请WO 93/21310，其内容纳入本文作参考)。对于亚组B的病毒，典型的部分减毒的亲代病毒是cp52/2B5，它是亚组B的B1株系的突变株。可结合各种选择方法，以从非减毒的亚组A或B株系中产生部分减毒的突变株，如本文所述这些突变株还可用于进一步的衍生。而且，导致减毒表型的突变可以单独或组合地引入不完全减毒的亚组A或B病毒中，从而产生有多重所述减毒突变的疫苗病毒，这些病毒突变为受疫苗者提供所需水平的减毒性和免疫原性。

一旦选出了所需的部分减毒亲代株系，就可如本文所述的几种方法进一步地充分减毒，以产生非常适于人用的本发明疫苗。例如，cpRSV突变株可用几种方法来进行进一步地诱变。在一个实例中，方法包括在逐渐降低的减毒温度下，使部分减毒的病毒在细胞培养物中传代。例如，野生型病毒通常在约34-37℃下进行培育，而部分减毒的突变株通过在次优温度(如20-26℃)下细胞培养物(如原代牛肾细胞)中传代来产生。因此，在本发明的一个方法中，通过在MRC-5或Vero细胞中降温至约20-24℃(较佳的为20-22℃)进行传代，使cp突变株或其它部分减毒的病毒株(如ts-1或sp)能适应在较低的温度下有效地生长。选择冷传代时的突变RS病毒基本上消除了衍生病毒株中任何残余的毒力(与部分减毒的亲代相比)。或者，通过诱变或其它方法将可特定的诱变引入重组病毒株中，从而使cp突变株进一步诱变(如引起ts、sp或ca突变)。

在本发明的一个实例中，对不完全减毒的RSV株进行化学诱变，以引入ts突变，或当病毒已经是温度敏感型时，引入额外的ts突变以提高减毒的衍生株的ts表型稳定性。将ts突变引入RS病毒的方法包括：在浓度约为10^-3-10^-6M(较佳的约为10^-4M)的诱变剂(如5-氟尿苷或5-氟尿嘧啶)存在下复制病毒，将病毒暴露在浓度约为100μg/ml的亚硝基胍下(根据例如Gharpure等，J.Virol.3:414-421(1969)和Richardson等，J.Med.Virol.3:91-100(1978)中所述的通用步骤)，或遗传引入特定的ts突变。也可采用其它的化学诱变剂。几乎所有的RS病毒基因的ts突变都可导致减毒，而且如本文所述，ts突变通常与聚合酶(L)基因相关。

在本发明的典型的减毒RSV中，复制的温度敏感程度可通过将允许温度下的复制与几个限制温度下的复制相比较而测得。与在允许温度下的复制相比，病毒的复制减少100倍或更多的最低温度称为停止生长温度(shutoff temperature)。在实验的动物和人中，复制和RSV毒力均与突变株的停止生长温度有关。停止生长温度为39℃的突变株复制是中等限制的，而停止生长温度为38℃的突变株的复制较差，疾病的症状主要限于上呼吸道。停止生长温度为35-37℃的病毒在人体中通常是全部减毒的。因此，本发明的温度敏感型减毒RSV通常有约35-39℃的停止生长温度，以35-38℃为佳。在部分减毒的病毒株中加入ts突变会产生适用于本发明疫苗组合物的多重减毒病毒。

通过多次化学诱变将多个突变引入在冷传代时已经减毒的病毒中，已经开发出了许多作为鼻内给药的候选疫苗的减毒RSV株(例如，Connors等，Virology208:478-484(1995)；Crowe等，Vaccine 12:691-699(1994)；和Crowe等，Vaccine12:783-790(1994)，其内容纳入本文作参考)。在啮齿动物、黑猩猩、成年人和婴儿中的评价表明，这些候选疫苗株中的某些在遗传上是相当稳定的，具有高度免疫原性，并有令人满意的减毒性。对这些减毒病毒中的一些(如下文所示)进行核苷酸序列分析，结果表明，每种减毒性增加的程度与特定核苷酸和氨基酸取代有关。通过单独或以各种组合方式将突变引入感染性RSV克隆的基因组或反基因组中，本发明可以区别偶然的沉默突变和那些造成表型差异的突变。这种方法与评价亲代和衍生病毒的表型特征相结合就可确定造成所需特征(如减毒性、温度敏感性、冷适应性、小的噬斑、宿主范围局限性等)的突变。如此确定的突变编成“菜单”，然后按需单独或以组合方式引入，将疫苗病毒按需调整成具有合适水平的减毒性、免疫原性、防止从减毒表型回复的遗传抗性等。

通过一系列随机化学诱变(以产生有ts表型的进一步减毒的RSV)而被引入RSV的特定突变可用序列分析并将其与亲代背景(如cpRSV背景)进行比较而加以确定。在一个典型的实例中，聚合酶(L)基因的核苷酸10989处的取代(A变为T，使得氨基酸残基831由gln变为leu)形成了cptsRSV248，或者核苷酸10060处的取代(C变为A，使得氨基酸残基521的phe被氨基酸变为leu)形成了cptsRSV530。这些组合的减毒突变导致了比在亲代cpRSV减毒程度更多的表型。cptsRSV248的停止生长温度为38℃，它是减毒的，具有免疫原性，可在血清阴性黑猩猩中完全抵抗野生型RSV的侵袭，在体内复制时，它比以前评价的RSV突变株更具遗传稳定性。抗表型回复的遗传抗性以及体内复制的限制性也表明，该典型的病毒株是引入有其它突变的所需的亲代株。

在另一个典型的实例中，对cptsRSV248突变株进行化学诱变，产生一系列进一步减毒的突变株，例如与亲代株相比，突变株有更多的温度敏感性或者小的噬斑的表型特征。其中一种突变株(cptsRSV248/404)的特征是有降低的停止生长温度(36℃)，这是由于核苷酸7605处还有额外的突变(T变为C)，该突变在非编码的高度保守的基因起始顺式作用调节序列中，因而不会导致氨基酸改变。

在本发明的另一个实例中，产生了有两个或多个减毒突变的RSV突变株。例如，对多重减毒病毒cptsRSV530(停止生长温度为39℃)进行化学诱变，以引入其它的一个或多个在非减毒背景中导致减毒表型的突变。在一个例子中，分离获得克隆cptsRSV 530/1009，测得其停止生长温度为36℃，因为在聚合酶(L)基因中12002处还有一个单核苷酸取代(A变为G，导致氨基酸残基1169由met变成val)。

本发明也提供了用重组方法例如从cDNA制得的感染性RSV。在一个实例中，感染性RSV通过编码RSV基因组或反基因组RNA的cDNA与那些形成转录、复制核衣壳所必需的病毒蛋白质一起在胞内共表达来获得，最好是和一个或多个编码主要的核衣壳蛋白(N)、核衣壳磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)以及转录延伸因子M2 ORF1蛋白的序列一起共表达。

从cDNA产生感染性RSV允许将特定的工程化改变(包括位点特异性减毒突变和各种其它的重组改变形式)引入重组病毒的基因组中，从而产生安全有效的RSV疫苗。

在这里用本发明的感染性重组RSV来鉴定生物衍生的减毒RSV株中的特定突变(例如导致ts、ca、att和其它表型的突变)。因此，本发明可以将生物衍生的突变和其它各种所需的突变一起整合入重组RSV疫苗株中。例如，从cDNA来生产病毒，可以将待引入的减毒RSV候选疫苗中存在的突变单独地或以各种选定组合方式引入全长cDNA克隆中，并很容易测定含有引入突变的挽救的重组病毒的表型。在典型的实例中，可将减毒的生物衍生的病毒(例如冷传代RSV(cpRSV))中，或其衍生的进一步减毒株(如cpRSV的温度敏感型衍生株(cptsRSV))中确定的氨基酸改变引入重组RSV克隆中。这些来自野生型或生物衍生突变RSV序列的改变，可在获得的克隆中导致所需的特征，如减毒的或进一步减毒的表型(与野生型或不完全减毒的亲代RSV表型相比)。

通过鉴定并将与所需表型(如cp或ts表型)有关的特定生物衍生突变引入感染性RSV克隆中，本发明可在鉴定的突变处或其区域内进行其它位点特异的修饰。尽管生物衍生RSV中产生的大多数减毒突变是单核苷酸改变，但是也可用重组技术将其它位点特异的突变引入生物衍生或重组RSV中。如本文所用的，位点特异性突变包括从1-3个到约5-15个或更多个不同核苷酸(例如与野生型RSV序列，选择的突变RSV株的序列，或经诱变的亲代重组RSV克隆不同的核苷酸)的插入、取代、缺失或重排。这样的位点特异性突变可以被引入选定的生物衍生的点突变处或其区域内。或者，突变可以引入RSV克隆的其它序列中，例如在顺式作用的调控序列处或其附近，编码蛋白质活性位点、结合位点、免疫原性表位等的核苷酸序列处或其附近。位点特异性RSV突变株通常保留所需的减毒表型，但是可以表现出与减毒无关的大不相同的表型特征，例如免疫原性的增强或增宽，或生长能力的提高。所需的位点特异性突变的其它实例包括将RSV设计成在导致减毒点突变的密码子中还有附加的起稳定作用的核苷酸突变。可能的话，在导致亲代突变株或重组RSV克隆中减毒性氨基酸改变的密码子处引入两个或多个核苷酸取代，从而形成具有防止减毒表型回复的遗传抗性的生物衍生或重组的RSV。在其它例子中，在靶核苷酸位置的上游(N-端方向)或下游(C端方向)(5＇或3＇)引入位点特异性核苷酸取代、插入、缺失或重排(例如有1-3个、5-10个，可高达15个或更多核苷酸)，以构建或消除已存在的顺式作用调控元件。

除了单个和多个点突变和位点特异性突变外，本文所公开的对重组RSV的改变：包括全部基因或基因片段的缺失、插入、取代或重排。这些突变会影响少量碱基(如15-30个碱基，可高达35-50个碱基或更多)，或大段的核苷酸(如50-100、100-300、300-500、500-1000个碱基)，这要根据变化的特点来确定，即为了插入或消除免疫原性表位或改变小的基因片段就可改变少量碱基，而当基因或基因大片段发生插入、取代、缺失或重排时，则有大段碱基参与。

本发明另一方面是在重组RSV克隆中，除生物衍生RSV中采用的突变(如主要在L基因中产生的cp和ts突变)外，还补充了其它类型的涉及相同或不同基因的突变。RSV编码了10个mRNA和10或11个蛋白质。其中三个是跨膜表面蛋白、即吸附蛋白G、参与渗透的融合蛋白F和小的疏水蛋白SH。G和F是主要的病毒中和和保护性抗原。其它四个蛋白质与病毒核衣壳有关，即RNA结合蛋白N、磷蛋白P、大的聚合酶蛋白L和转录延伸因子M2 ORF1。基质蛋白M是内部毒粒的一部分，它可能介导核衣壳与包膜的缔合。最后是两个非结构蛋白NS1和NS2，它们的功能未知。在重组RSV中，这些蛋白质可选择性地改变其表达水平，或可以全部或部分地、单独或与其它所需改变相结合地进行插入、缺失、取代或重排，以获得新的感染性RSV克隆。

因此，除了生物衍生RSV突变株中采用的减毒突变之外或与其结合，本发明还提供了一种根据感染性RSV克隆重组工程化来减毒的全新的方法。根据本发明的这一方面，现在可以在编码RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸序列中产生各种变化以引入感染性重组RSV。更具体地，为了在重组RSV中获得所需的结构和表型改变，本发明可以将修饰(相对亲代RSV序列而言为一个所选核苷酸或多个核苷酸的缺失、取代、插入或重排)和突变(除去、取代、插入或重排整个基因或基因片段)引入感染性RSV克隆中。

所需的感染性重组RSV修饰通常被选择成可导致所需的表型变化，如病毒生长、温度敏感性、引起宿主免疫应答的能力和减毒性等的变化。这些改变例如可通过诱变亲代RSV克隆，以消除、引入或重排特定基因或基因区域(如编码蛋白质结构域(诸如细胞质、跨膜或胞外结构域)、免疫原性表位、结合区域、活性位点等的基因片段)来实现。在这方面感兴趣的基因包括RSV基因组的所有基因：3＇-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-M2-L-5＇，以及来自其它RSV、其它病毒和其它各种本文所示的非RSV来源的异源基因。另外还提供了只是改变或消除所选基因表达的修饰，它例如通过下列方式实现：在所选RSV编码序列内引入终止密码子；改变RSV基因相对于操作相连的启动子的位置；引入上游起始密码子来改变表达率；改变(例如通过改变位置、改变已存在的序列或用异源序列取代存在的序列)GS和/或GE转录信号来改变表型(如生长能力、对转录的温度限制性等)；以及其它各种导致病毒复制、所选基因的转录、或所选蛋白质的翻译的定量或定性改变的缺失、取代、插入和重排。

如本文中所述的，可用cDNA为基础的方法来构建一系列重组病毒，这些病毒可提供改善的减毒性质和免疫原性以用作疫苗试剂。本文所需的表型改变是防止从减毒表型回复的抗性、在培养物或所选宿主环境中有改善的减毒性、免疫原性(例如通过所引起的免疫应答的增强或削弱加以确定)、所选病毒产物的转录和/或翻译的正调节或负调节等。可以插入全部或部分外源基因，改变基因次序，除去基因重叠区，RSV基因组启动子可用其反基因组对应物代替，加入(例如复制已有的序列或引入异源序列)、除去或取代基因的部分(如糖蛋白基因的胞质尾区)，甚至可以除去整个基因。

在本发明的一个方面，来自一个RSV的所选基因片段(例如编码所选蛋白或蛋白质区域(例如胞质尾区、跨膜结构域或胞外结构域、表位位点或区域、结合位点或区域、活性位点或含有活性位点的区域等)的基因片段)可被来自相同或不同RSV或其它来源的对应基因片段取代，以产生与野生型或亲代RSV株相比有所需表型改变的新的重组体。例如，这类重组可表达一个嵌合蛋白，该蛋白含有一种RSV的胞质尾区和/或跨膜结构域并与另一种RSV的胞外结构域融合。其它典型的这类重组体表达两个蛋白质区域(如两个免疫原性区域)。如本文所用的，“对应”的基因、基因片段、蛋白质或蛋白质区域通常来自异源(如来自不同的RSV基因，或是表示不同RSV株中相同(即同源或等位)的基因或基因片段)。本文中选择的典型的对应物共同享有总的结构特征，例如，每个对应物能编码结构上相当的“结构域”(如细胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域、结合位点或区域、表位位点或区域等)。对应结构域及其编码基因片段包括有一定范围的大小和氨基酸(或核苷酸)序列变化的种类的集合，该范围由结构域或基因片段变体中共同的生物活性确定。例如，本发明中对应基因片段编码的两个所选蛋白质结构域可都具有性质基本相同的活性，例如提供跨膜功能、特异性结合活性、免疫识别位点等。更通常地，对应物间(例如所选的蛋白质片段或蛋白质间)共有的特异性结合活性在量方面也是基本相同的，即它们各自的活性曲线相差不超过30％，以不超过20％为佳，不超过5-10％为更佳。

对应基因和基因片段，以及在本发明中参与重组RSV制备的其它多核苷酸最好具有与所选多核苷酸参照序列(例如另一选定的多核苷酸序列)基本相同的序列。本文所用的术语“参照序列”是用作序列比较基准的确定的序列，例如是全长cDNA或基因的片段，或完全的cDNA或基因序列。通常，参照序列的长度至少为25核苷酸，经常至少为25个核苷酸，更经常地至少为50个核苷酸。由于两个多核苷酸各自含有(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即完整多核苷酸序列的一部分)，且(2)还含有在两个多核苷酸之间互不相同的序列，因此两个(或多个)多核苷酸间的序列比较通常是在“比较窗口(comparison window)”中比较两个多核苷酸的序列，来确定和比较局部区域序列相似性。本文所用的术语“比较窗口”指一个至少有20个连读核苷酸位的概念性片段，其中多核苷酸序列与至少20个连读核苷酸的参照序列相比较，且与不含插入或缺失的参照序列相比，在比较窗口中的多核苷酸序列部分可包含20％或更低的插入或缺失(即间隙)，以便两个序列最优排列时。在比较窗口内进行序列的最佳排列可采用：Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性排列算法；Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜寻方法(这些文献均纳入本文作参考)；这些算法的计算机化执行程序(GAP、BESTFIT、FASTF和TFASTA,Wisonsin GeneticsSoftware Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI,它们被纳入本文作参考)或校验。然后选择各种方法所产生的最佳排列方式(即在比较窗口内获得最高的序列相同性百分数)。术语“序列相同性”指在比较窗口内两个多核苷酸的序列是相同的(即核苷酸对核苷酸的基础上)。术语“序列相同百分数”是这样计算获得的：在比较窗口内比较两个最优排列的序列，确定两个序列上有相同核酸碱基(如A、T、C、G、U或I)的位置的数目，将匹配位置数除以比较窗口内位置总数(即窗口大小)，再将该结果乘以100，从而获得序列相同性的百分数。本文所用的术语“基本相同”表示多核苷酸序列的特征，其中该多核苷酸所含序列在与参照序列在至少20个核苷酸(更常见为至少20-25个核苷酸)的比较窗口中比较时，至少有85％的序列相同性，较佳的至少有90-95％的序列相同性，更通常地有至少99％的序列相同性，其中序列相同性百分数是通过在比较窗口内比较参照序列与该多核苷酸序列(可以包括占参照序列20％或更低的缺失或插入)来计算得出。参照序列可以是较大序列的子集。

除了这些多核苷酸序列的相互关系之外，本发明的重组RSV编码的蛋白质和蛋白质区域也通常被选择成有保守的关系，即基本上与所选参照多核苷酸有序列相同性或相似性。术语“序列相同性”在用于多肽时是指肽在相应的位置上有相同的氨基酸。术语“序列相似性”指肽在相应的位置是有相同或相似的氨基酸(即保守取代)。术语“基本上序列相同”指两个肽序列在最优排列(例如用GAP或BESTFIT程序，采用缺省间隙权重值)时有至少80％的序列相同性，较佳的有至少90％的序列相同性，更佳的有至少95％或更高(如99％)的序列相同性。术语“基本相似”指两个肽序列具有相应的序列相似性百分数。不同的残基的位置最好是保守氨基酸取代而造成的不同。保守氨基酸取代指侧链相似的残基具有可互换性。例如，一组有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组有脂族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。较佳的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。20个常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)、非天然氨基酸如α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也是适用于本发明多肽的组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、正-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸、和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(如4-羟基脯氨酸)。而且，氨基酸可被糖基化、磷酸化等修饰。

在本发明的另一个方面中，cDNA-表达基因组或反基因组产生的感染性RSV可以是RSV或RSV样株系(例如人、牛、小鼠等)或肺炎病毒(如小鼠或火鸡鼻气管炎病毒)的任何一种。为了产生保护性的免疫应答，此RSV株对于待免疫者是内源性的，例如用来免疫接种人的人RSV。然而，内源RSV的基因组或反基因组可经修饰来表达来自不同来源组合的RSV基因或基因片段(例如RSV不同种、亚组或株系，或来自RSV和另一呼吸道病原体(如PIV)的基因或基因片段的组合)(例如参见，Hoffman等，J.Virol.71:4272-4277(1997)；Durbin等，Virology(1997)(在出版中)；Murphy等，美国专利申请号No.60/047,634(名称为RECOVERY OF INFECTIOUS PARAINFLUENZA VIRUS FROM CLONEDNUCLEOTIDE SEQUENCES,1997年5月23日提交，该申请的内容纳入本文作参考)，以及下列用来制备感染性PIV克隆的质粒：p3/7(131)(ATCC 97990)；p3/7(131)2G(ATCC 97889)；和p218(131)(ATCC 97991)；这些质粒均根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC,12031 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USA)，并给予上述保藏号。

在本发明的某些实例中提供了重组RSV，其中人RSV的一个内部基因被例如牛、小鼠或其它RSV对应物代替，或被来自另一呼吸道病原体(如PIV)对应物或外源基因代替。在本文中，RSV基因或基因片段的取代、缺失等可以包括NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)和L基因中一个或多个的全部或部分，或是G和F基因的非免疫原性部分。同样，人RSV顺式作用序列(如启动子或转录信号)可被例如它们的牛RSV对应物代替。相应地，也提供了将人减毒基因或顺式作用序列插入牛RSV基因组或反基因组中，来产生活的减毒牛RSV的方法。

根据宿主范围的限制和有利于疫苗应用的其它所需表型来选择携带有异源基因或顺式作用元件的重组RSV。在典型的实例中，根据已有的关于牛RSV结构和功能的描述(如Pastey等，J.Gen.Virol.76:193-197(1993)；Pastey等，Virus Res.29:195-202(1993)；Zamora等，J.Gen.Virol.73:737-741(1992)；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.74:2001-2004(1993)；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.73:2441-2444(1992)；和Zamora等，Virus Res.24:115-121(1992)中提供的，这些内容均纳入本文作参考)，用本文公开的方法和组分选择牛RSV序列，将其引入人RSV中。在另一实例中，仿照G蛋白胞质尾区缺失的小鼠肺炎病毒组织培养适应型非病原株(人RSV的小鼠对应物)(Randhawa等，Virology 207:240-245(1995))，将感兴趣的突变引入重组RSV中。因此，在本发明的一个方面中，一个或多个人RSV糖蛋白、F、G和SH的胞质和/或跨膜结构域用异源的对应序列(如来自牛RSV或小鼠肺炎病毒的F、G或SH蛋白的胞质或跨膜结构域的序列)进行加入、缺失、修饰或取代，以获得所需的减毒性。在另一个实例中，在F蛋白的断裂位点或G蛋白的推定吸附结构域处或其附近的核苷酸序列可通过点突变、位点特异性改变、或整个基因或基因片段的改变来修饰，以获得新的对组织培养物中病毒的生长和/或实验动物中病毒的感染和致病性有新的效果。

因此，打算对人给药的感染性重组RSV可以是经修饰而含有来自例如牛或小鼠的RSV或PIV(为了减毒的目的)的人RSV。例如，通过插入来自PIV的基因或基因片段，可以提供针对PIV和RSV的二价疫苗。另外，异源RSV种类、亚组或株系、或不同的呼吸道病原体(如PIV)也可修饰成例如含有编码引起对人RSV感染的保护性表位或蛋白的基因。例如，人RSV糖蛋白基因可取代牛糖蛋白基因，使得获得的牛RSV现在带有人RSV的表面糖蛋白，由于剩余的牛遗传背景，它保留了在人宿主中复制的限制性，并会在人体内引起抗RSV株感染的保护性免疫应答。

为发展疫苗，分析其它类型的减毒突变并将其引入感染性RSV中的技术发展到在RSV克隆中进行大量定向改变。例如SH基因的缺失产生了有新表型特征(包括增强的生长能力)的重组RSV。在本发明中，SH基因缺失(或其它任何选定的非必需基因或基因片段的缺失)与一个或多个赋予减毒表型的附加突变(如采用来自生物衍生的减毒RSV突变株的点突变)一起结合入重组RSV中。在典型的实例中，SH基因或NS2基因的消除与来自cpts248/404、cpts530/1009、cpts530/1030或其它选定突变RSV株的一个或多个cp和/或ts突变结合，从而获得病毒产率增加、减毒性增强、具有抗表型回复的遗传性(由于不同突变的组合效应)的重组RSV。在这方面，所有生长非必需RSV基因(例如SH、NP、NS1和NS2基因)可被切除或进行修饰，以获得对毒力、病原性、免疫原性和其它表型特征所需求的效果。例如，非必需基因(如SH)的缺失形成的消除可增强病毒在培养物中生长能力。不拟与任何理论结合，该效果可能部分是由于病毒基因组的核苷酸长度减少的缘故。在一个典型的SH切除克隆中，经修饰的病毒基因组为14825核苷酸长，比野生型少398个核苷酸。例如通过RSV基因组其它编码或非编码区(如P、M、F和M2基因中)用基因工程技术进行类似的突变减少基因组大小，本发明提供了几种容易获得的用来改进RSV生长能力的方法和物质。

此外，在重组RSV基因组或反基因组中可以产生其它各种基因变化，从而单独地或与生物衍生的突变RSV中的一个或多个减毒点突变一起掺入感染性重组RSV中。异源基因(例如来自不同RSV株或类或非RSV来源)可以全部或部分地插入，基因的次序可以改变，基因重叠区可以除去，RSV基因组启动子可用其反基因组对应物代替，部分基因可被除去或取代，甚至整个基因可以缺失。在序列中可进行不同的或其它修饰以利于操作，例如在各个基因间隔区或其它地方插入独特的限制性位点(例如在G和F基因间插入独特的Stul位点)。可以除去非翻译基因序列以增加容量供插入外源基因。

在典型的实例中，一种RSV的单个基因、基因片段、或一个或多个核苷酸可被来自异源RSV或其它来源的对应序列取代。例如来自一种RSV的所选异源基因片段(例如编码所选蛋白的胞质尾区、跨膜结构域或胞外结构域、表位位点或区域、结合位点或区域、活性位点或含有活性位点的区域等的基因片段)可以被另一种RSV中对应的基因片段取代，以产生新的重组体，例如是能表达一种嵌合蛋白的重组体，该嵌合蛋白具有一种RSV的胞质尾区和/或跨膜结构域与另一个RSV的胞外结构域融合。在这方面，在编码蛋白质中较小的功能结构域(如表位位点)的基因片段例子中，有用的基因组片段在约15-35核苷酸范围内，而对于编码较大的结构域或蛋白质区域的基因片段中，基因组片段在约50、75、100、200-500和500-1500或更多的核苷酸范围内。在一个实例中，一种RSV株或亚组的F和/或G保护性抗原被取代成不同株或亚组的RSV的克隆，从而产生了可在免疫宿主中刺激产生抗各株或各亚组的交叉保护性免疫应答的重组病毒。另一方面，通过引入生物衍生突变RSV株(如cpts248/404、cpts530/1009或cpts530/1030)中的一个或多个减毒ts或cp点突变，可进一步修饰有突变的嵌合RSV克隆，该突变包括基因或基因片段(如取代的异源F和/或G基因或基因片段)的改变。

在还有其它方面，人RSV中一个或多个编码或非编码的多核苷酸被来自牛或小鼠RSV的对应序列单独取代，或其与一个或多个cp或ts突变的组合取代，以产生新的减毒疫苗株。在一个实例中，嵌合的牛-人RSV中的人RSV NP基因或基因片段被对应的牛NP基因或基因片段取代，该嵌合体还可任意地构建成具有SH、NP、NS1、NS2或其它基因缺失、一个或多个cp或ts点突变、或这些突变与本文公开的其它突变的各种组合。人RSV编码序列(如NS1、NS2、NP等的编码序列)或非编码序列(如启动子、基因末端、基因起始、基因间或其它顺式作用元件)被对应的牛或小鼠RSV序列的代替可产生有各种可能的减毒效果的减毒重组体。例如，在其它有用的减毒效果中，在人细胞中不会起作用的异源RSV基因会产生宿主范围效果，异源序列或蛋白与可发生生物相互作用的人RSV序列或蛋白(如通常与用于病毒转录、翻译、装配等的取代序列或蛋白发生协同作用的序列或蛋白)的不相容性会产生宿主范围效果。

在本发明的另一方面，将外源基因或基因片段(在一些例子中是非编码的核苷酸序列)插入RSV基因组中会使基因组长度有所需的增加，而且还会产生其它所需的表型效果。基因组长度的增加导致获得的RSV减毒，减毒程度部分取决于插入物的长度。另外，插入重组RSV的基因表达出的蛋白质会由于该蛋白质的作用而使病毒减毒。在对于牛痘病毒表达的IL-2中已有描述(例如，Flexner等，Nature 33:-259-62(1987)，预计γ干扰素也是如此。

本发明重组RSV中的缺失、插入、取代和其它涉及全基因或基因片段变化的突变产生了高度稳定的候选疫苗，这在免疫抑制个体的情况下是特别重要的。这些突变中有许多会使获得的疫苗株减毒，而其它突变会获得不同类型的所需表型改变。例如，已知某些病毒基因可编码特异性干扰宿主免疫力的蛋白(例如参见，Kato等，EMBO.J.16:578-87(1997)，其内容纳入本文作参考)。预计疫苗病毒中这些基因的消除可减少毒力和致病性和/或提高免疫原性。

本发明也提供了在重组RSV中的遗传修饰，该修饰改变或消除了所选基因和基因片段的表达而无须将基因或基因片段从RSV克隆中除去，例如通过下列方式来进行：在所选RSV编码序列内引入终止密码子；改变基因的位置或引入上游起始密码子来改变表达速度；改变GS和/或GE转录信号来改变表型(如生长能力、对转录的温度限制性等)。在本文中较佳的突变包括定位于顺式作用信号的突变，这可通过例如RSV微小基因组的突变分析来鉴定。例如，前导区和尾区以及侧翼序列的插入和缺失分析确定了病毒启动子和转录信号，并提供了一系列与RNA复制或转录水平不同程度减少有关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(每个位置依次被修饰成每种核苷酸的改变物)也确定了存在许多使RNA复制或转录水平降低(或在某种情况下增加)的突变。这些突变中的任一种可以如本文所述的插入完全反基因组或基因组中。采用完全反基因组cDNA对反式作用蛋白和顺式作用RNA序列进行评价和操作，可用RSV微小基因组来辅助(例如参见，Grosfeld等，J.Virol.69:5677-5686(1995)，其内容纳入本文作参考)，其依赖于辅助病毒的状态可用来表征那些过度抑制而不能在复制非依赖型感染性病毒中复原的突变株。

本发明的RSV中其它突变包括用来自反基因组的对应物代替基因组的3＇端(与改变RNA复制和转录有关)。另外，基因间隔区(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4594-4598(1986)，其内容纳入本文作参考)可以缩短或增长或改变序列组成，可以除去天然存在的基因重叠区(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5134-5138(1987))或用本文所述的方法变成不同的基因间隔区。

在一个典型的实例中，通过用合成制得并能有效翻译的序列来取代天然序列，可增加特定RSV蛋白(如保护性F和G抗原)的表达水平。在这方面，已经表明密码子使用是影响哺乳动物病毒蛋白翻译水平的主要因素(Haas等，CurrentBiol.6:315-324(1996))。对编码RSV的F和G蛋白(主要的保护性抗原)的mRNA的密码子选择进行周密检查，结果表明使用不当与低表达一致。因此，可通过本发明的重组方法来提高密码子的使用，以提高所选基因的表达。

在另一个典型的实例中，对所选RSV基因的翻译起始位点的周围序列(最好包括3位的核苷酸)进行单独修饰，或与上游起始密码子的引入结合，从而通过翻译的上调或下调来调节RSV基因的表达。

或者，通过改变病毒的所选基因的转录GS信号，或与本文公开的其它RSV修饰结合，来调节RSV基因的表达。在一个典型的实例中，将NS2的GS信号修饰成具有一个确定突变(如下文所述的404(M2)突变)以在病毒复制中增加一个ts限制。

还有，本发明中的其它RSV克隆将修饰加入转录GE信号中。例如，提供了某些RSV克隆，该克隆可将NS1和NS2的GE信号取代或突变成N基因的GE信号，从而使连读mRNA的水平降低和下游基因的蛋白质表达增加。获得的重组病毒表现出生长动力学提高和噬斑增大，提供了一个通过修饰RSV基因组中顺式作用调节元件来改变RSV生长性能的例子。

在另一个典型的实例中，G蛋白的表达通过修饰G mRNA来增强。G蛋白可以膜结合形式以及分泌形式表达，后者是由G翻译开放读框中起始位点处的翻译起动而表达。分泌形式可多至占表达G蛋白的一半。单独消除内部起始位点(例如通过序列改变、缺失等)，或/和改变上游起始位点的序列，可在G蛋白表达中产生所需的改变。分泌型G蛋白的消除也会改善对典型的重组RSV的宿主免疫应答的质量，因为可溶形式的G蛋白被认为起着捕获中和抗体的“诱饵”作用。并且，可溶性G蛋白优先刺激Th2-偏性应答，因此它表现出增强的免疫病理作用。

在另一实例中，RSV基因表达的水平是在转录水平上进行变化。在一个方面，选定基因在RSV基因图谱中的位置可以变得离启动子更近或更远，从而分别能使基因表达的效率更高或更低。根据这一方面，就可调节特定基因的表达，从而降低基因的表达，或增加基因的表达，比野生型的水平升高2倍(更经常地是4倍，以至升高到10倍或更多)。在一个实例中，NS2基因(RSV基因图谱中第二个)被取代成SH基因(次序中的第六个)，从而降低了NS2的表达。由于位置改变而引起的所选RSV基因的表达增强可达10倍、30倍、50倍、100倍或更高，相反地，这通常伴随有被位置取代基因的表达水平的相应降低。

在其它典型的实例中，F和G基因被单个或一起转座至更接近或远离(重组)RSV基因图谱中的启动子位点，以分别实现更高或更低水平的基因表达。这些以及其它转座改变产生了新的有减毒表型的RSV克隆，这例如是由于参与RNA复制的所选病毒蛋白的表达降低所造成的。

在本发明更详细的方面，提供了一种重组RSV，其中病毒基因(例如NS2基因)的表达在翻译水平上被消除，而无基因或基因片段缺失，这可通过例如将两个串联翻译终止密码子引入翻译开放读框(ORF)来实现。这就产生了选定基因在翻译水平沉默而基因并不缺失的活病毒。这些形式的“剔除”病毒在组织培养中表现出生长速度减慢，噬斑较小。因此，本发明的方法和组合物还提供了其它新类型的RSV减毒突变，该突变消除了并非主要的病毒保护性抗原的病毒基因的表达。在这方面，在基因或基因片段不缺失的情况下，产生的“剔除”病毒表型还可通过缺失诱变(如本文所述)来生产，以有效地预防可能使靶蛋白合成复原的校正突变。用其它设计可制得其它几种基因“剔除”的RSV。例如，将翻译终止密码子插入ORF中，或是破坏RNA编辑位点的方法为使所选基因的表达沉默或减毒提供了变化方案。制备这些以及其它剔除物的方法是本领域中熟知的(如在Kretzschmar等，Virology 216:309-316(1996)；Radecke等，Virology 217:418-412(1996)；和Kato等，EMBO J.16:178-587(1987)；和Schneider等，Virology277:314-322(1996)中所描述的，这些内容均纳入本文作参考)。

在其它实例中，用于疫苗配方的RSV可方便地修饰成适应病毒循环中的抗原漂移。修饰通常在G和/或F蛋白中。整个G或F基因或其中编码特定免疫原性区域的片段通过感染性克隆中相应区域代替或加入一个或多个拷贝的基因来掺人RSV基因组或反基因组cDNA，这样就提供了几种抗原形式。然后将经修饰的RSV cDNA产生的子代病毒用于抗刚形成的病毒株的疫苗接种方案。另外，将RSV的B亚组的G蛋白基因作为增补基因包括在疫苗内，会拓宽应答范围使覆盖人群中存在的各种A和B亚组病毒株。

本发明的感染性RSV克隆也可根据本文公开的方法和组合物来工程化，以增强其免疫原性，并诱导出比野生型RSV或不完全减毒的亲代病毒或克隆感染后提供的更高水平的保护。例如，可通过编码RSV基因组或反基因组的多核苷酸序列中合适的核苷酸改变来加入来自异源RSV株或型或来自非RSV来源(如PIV)的免疫原性表位。或者，可对重组RSV进行工程化以确定和消除(例如通过氨基酸插入、取代或缺失)与免疫病理学反应有关的不希望的表位。在其它实例中，在受一系列独立的转录信号控制下的RSV基因组或反基因组中或其邻近插入附加的基因。感兴趣的基因包括那些编码细胞因子(如IL-2到IL-15，尤其是IL-2、IL-6和IL-12等)、γ干扰素和富含T辅助细胞表位的蛋白的基因。该附加蛋白可以作为分离的蛋白或作为嵌合体(从一种RSV蛋白(例如SH)的第二拷贝工程化制得)表达。这提供了从定量和定性上修饰和改进抗RSV的免疫应答的能力。

在本发明的其它方面，例如，通过将编码那些来自PIV的保护性抗原的序列掺入用来产生感染性疫苗病毒的RSV基因组或反基因组中(如本文所述)，重组RSV可用作其它呼吸道病原体(例如副流感病毒PIV)的保护性抗原的载体。PIVcDNA的克隆和其它出版物在美国临时专利申请No.60/047,575(题目为PRODUCTION OF PARAINFLUENZA VIRUS FRON CLONED NUCLEOTIDESEQUENCES,1997年5月23日提交，其内容纳入本文作参考)中有所描述。在其它实例中，提供了修饰的RSV，其包含RSV基因组或反基因组序列与至少一个PIV序列的嵌合体(例如是含有RSV和PIV1、PIV2、PIV3或牛PIV的序列的多核苷酸)。例如，RSV的各个基因可被来自人PIV的对应基因(如PIV1、PIV2或PIV3的HN和/或F糖蛋白基因)代替。或者，选定的异源基因片段(例如HPIV1、HPIV2或HPIV3的HN或F的胞质尾区、跨膜结构域或胞外结构域)可取代例如RSV克隆中相同基因、不同基因中的对应基因片段，或置换入RSV基因组或反基因组的非编码序列中。在一个实例中，用HPIV3的HN或F的基因片段来代替RSV的A型中对应的基因片段，从而产生能编码嵌合蛋白(例如有RSV的胞质尾区和/或跨膜结构域与RSV的胞外结构域融合的融合蛋白)的构建物，以产生新的减毒病毒和/或抗PIV和RSV的多价疫苗免疫原性。

除了上述对重组RSV的修饰外，在RSV克隆中还可进行不同的或附加的修饰以便于操作，例如在各基因间隔区或其它处插入独特的限制性位点(如在G和F基因之间插入独特的Stul位点)。可以除去非翻译基因序列而为插入外源序列增加容量。

前述确定的突变可通过各种熟知的方法来引入感染性RSV克隆中。“感染性克隆”指cDNA或其产物，合成的或非合成的，它可转录到能够作为模板来生产感染性病毒或亚病毒颗粒的基因组的基因组或反基因组RNA中。因此，确定的突变可通过常规方法(如定点诱变)引入基因组或反基因组的cDNA拷贝中。用反基因组或基因组cDNA亚片段来装配成本文所述的完全的反基因组或基因组cDNA的优点是：每个区域可分开操作(较小的cDNA的操作比大cDNA容易)，然后容易装配成完全cDNA。因此，完全的反基因组或基因组cDNA或其任何亚片段可用作寡核苷酸定向诱变的模板。这可通过单链噬菌粒形式的中间物(例如用Bio-Rad Laboratoris(Richmond,CA)的Muta-gene^_试剂盒)、或用双链质粒直接作为模板(例如Stratagene(La Jolla,CA)的Chameleon诱变试剂盒)、或用含有所需突变的寡核苷酸引物或模板以聚合酶链反应来实现。然后可将突变的亚片段装配成完全反基因组或基因组cDNA。也可用其它各种已知的诱变方法以在RSV反基因组或基因组cDNA中形成感兴趣的突变。突变包括从单个核苷酸变化到含有一个或多个基因或基因区域的大cDNA片段的替换。

因此，在一个描述性例子中，突变是用购自Bio-Rad的Muta-gene噬菌粒体外诱变试剂盒来引入的。简而言之，将编码RSV基因组或反基因组一部分的cDNA克隆人质粒pTZ18U，然后用来转化CJ236细胞(Life Technologies)。噬菌粒制剂的制备按照生产商的建议。寡核苷酸被设计成能通过在基因组或反基因组所需位置处引入改变的核苷酸来进行诱变。然后对含有遗传上改变的基因组或反基因组片段的致力进行扩增，然后将突变的片段重新引入全长基因组或反基因组克隆中。

确定突变引入感染性RSV中有许多应用，包括分析RSV分子生物学和致病机理。例如，通过引入消除或减少其表达水平的突变，或者是产生突变蛋白的突变，就可研究和操纵RSV蛋白(包括NS1、NS2、SH、M2(ORF1)和M2(ORF2)蛋白)的功能。在下文的一个典型的实例中，构建成RSV病毒，其中病毒基因(即SH基因)的表达由于mRNA编码序列和侧翼转录信号的缺失而被消除。令人惊奇的是，该病毒不仅能复原，而且还能在组织培养中有效地生长。实际上，根据感染性病毒的产量和噬斑的大小，它的生长能力大大超过野生型病毒。这种由于SH缺失而在组织培养物中的生长有所改善的情况以及本发明的其它RSV衍生株为研制RSV疫苗提供了有用的工具，它克服了RSV在组织培养物中产量低的问题，在其它系统中提高疫苗病毒的产量较为复杂。这些缺失能对抗遗传回复，具有高度的稳定性，使得从其衍生获得的RSV克隆特别适于用作疫苗制剂。

本发明也提供了从一种或多种分离的多核苷酸(如一个或多个cDNA)来制备感染性RSV的方法。根据本发明，构建编码RSV基因组或反基因组的cDNA用于与必需的病毒蛋白一起在胞内或体外共同表达，形成感染性RSV。“RSV反基因组”指作为子代RSV基因组合成模板的分离的正义多核苷酸分子。cDNA最好能构建成对应于复制中间体RNA或反基因组的RSV基因组的正义分子，以使与互补序列的正义转录物(编码形成转录、复制核衣壳所必需的蛋白质的序列，即编码N、P、L和M2(ORF1)蛋白的序列)杂交的可能性降到最低。在一个RSV微小基因组体系中，基因组和反基因组，无论是通过RSV互补还是通过质粒互补，均具有相同的挽救活性，这表明基因组或反基因组均可采用，因此可以根据方法或其它理由来选择。

天然的RSV基因组通常包含一个反义多核苷酸分子，该分子通过互补的病毒mRNA来编码11种病毒蛋白，即非结构类NS1和NS2、N、P、基质蛋白(M)、小的疏水蛋白(SH)、糖蛋白(G)、融合蛋白(F)、M2(ORF1)、M2(ORF2)和L(基本上如Mink等，Virology 185:615-624(1991),Stec等，Virology 183:273-287(1991)和Connors等，Virol.208:478-484(1995)中所述的，其内容纳入本文作参考)。为了本发明的目的，本发明的重组RSV的基因组或反基因组只需含有这些基因或其必需部分来使其编码的病毒或亚病毒颗粒具有感染性。另外，基因或其部分可以由一个以上的多核苷酸分子提供，即一个基因可通过互补等由分离的核酸分子提供。

重组RSV是指RSV、直接或间接衍生自重组表达系统的RSV样病毒或亚病毒颗粒，或是从其产生的病毒或亚病毒颗粒增殖而得。重组表达系统将采用重组表达载体，该载体包含操作联续的转录单元，该单元包含一组至少一个或多个在RSV基因表达中起调节作用的基因元件(例如启动子)、转录成RSV RNA的结构或编码序列以及合适的转录起始和终止序列。

为了从cDNA表达的基因组或反基因组制备感染性RSV，使基因组或反基因组与那些必需的RSV蛋白共同表达，这些RSV蛋白应该：(ⅰ)产生可进行RNA复制的核衣壳和(ⅱ)使子代核衣壳能够进行RNA复制和转录。基因组核衣壳的转录提供了其它RSV蛋白，并引发了产毒性感染。或者，产毒性感染所需的其它RSV蛋白可由共同表达来提供。

用于本发明的RSV反基因组例如可通过装配克隆的cDNA片段来构建，用RSV mRNA或基因组RNA的逆转录拷贝的聚合酶链反应(PCR；在例如美国专利No.4,683,195和4,683,202，以及PCR Protocols:A guide to Methods andApplications,Innis等，eds.,Academic Press,San Diego(1990)中有所描述，这些内容纳入本文作参考)以聚集形式提供完全反基因组。例如，将含有反基因组左手末端的cDNA(从合适的启动子(如T7RNA聚合酶启动子)和前导区互补到SH基因)装配入合适的表达载体(如质粒pBR322或各种可获得的粘粒、噬菌体或DNA病毒载体)中。可通过诱变和/或插入含有独特的便于装配的限制性位点的合成多接头来修饰载体。例如，这里描述的质粒载体用含有常规限制性酶切位点的合成DNA代替PstⅠ-EcoR1片段来从pBR322衍生获得。用pBR322作为载体可使RSV序列的核苷酸3716-3732稳定化，否则会发生核苷酸缺失或插入，而质粒在细菌株DH10B中进行繁殖，以避免会在核苷酸4499附近发生的人工(artifactual)复制和插入。为了便于制备，G、F和M2基因可以装配在分开的载体中，L和尾区序列也一样。反基因组质粒的右手末端(例如L和尾区序列)可以含有已述的其它序列，如侧翼核酶和串联T7转录终止子。核酶可以是锤头形(例如参见Grosfeld等，J.Virol.69:5677-5686(1995))，它会产生一个含有单一非病毒核苷酸的3＇末端，或可以是其它任何合适的核酶，例如会产生不含非RSV病毒核苷酸的3＇末端的丁型肝炎病毒(Perrotta等，Nature 350:434-436(1991))。将中等的片段(如G到M2的片段)插入前导区到SH区的质粒(此时成为L-尾区-核酶-终止子片段的受体)中合适的限制性位点中，产生完全反基因组。在本文描述的一个实例中，将前导区末端构建成与T7RNA聚合酶的启动子毗邻，该聚合酶包括使活性最优的三个转录的G残基；转录为反基因组5＇末端提供了这三个非病毒G。这三个非病毒G残基可以删除，从而产生了不含非病毒核苷酸的5＇末端。为了产生接近校正的3＇末端，将尾区构建成与锤头核酶相邻，核酶在断裂时会为编码的RNA 3＇末端提供一个3＇磷酸化的U残基。

在本发明的某些例子中，由一个或多个辅助病毒来提供编码产生转录、复制RSV核衣壳所需的蛋白质的互补序列。这些辅助病毒可以是野生型或突变型。辅助病毒最好在表型上能够与RSV cDNA编码的病毒区别开来。例如，希望提供单克隆抗体来与辅助病毒而不是RSV cDNA编码的病毒发生免疫反应。这些抗体可以是中和抗体。在一些实例中，抗体可用于亲和层析，以从重组病毒中分离出辅助病毒。为了便于获得这些抗体，在RSV cDNA中可以引入突变，以提供与辅助病毒不同的抗原差异性(例如在HN或F糖蛋白基因中)。

在RSV基因组或反基因组中可进行各种核苷酸的插入和缺失。野生型人RSV的基因组的核苷酸长度(15222个核苷酸)是6的倍数，副粘病毒和麻疹病毒属核苷酸数目通常遵守“6倍数规则”，即基因组(或微小基因组)只有在其核苷酸长度为6的倍数(认为是使核苷酸残基相对衣壳化NP蛋白精确间隔所需要的)时才有效地复制。增加一个残基来改变RSV基因组长度对复制效率没有影响，在传代后对几个不同的微小基因组突变株的序列分析表明，其保留了长度上的差别而元补偿性变化。因此，RSV没有基因组长度必须是6的倍数的严格需求，在RSV基因组或反基因组中可以有核苷酸的插入和缺失而不会消除本发明的重组RSV的复制。

构建编码基因组或反基因组cDNA的其它方法包括，用改进的PCR条件进行逆转录-PCR(例如Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695-5699(1994)；Samal等，J.Virol 70:5075-5082(1996)中所述的，这些内容纳入本文作参考)，以将亚单位cDNA组分的数量减少至1或2个片段。在其它实例中，可采用不同的启动子(如T3、SP6)或不同的核酶(例如丁型肝炎病毒的核酶)。可采用不同的DNA载体(如粘粒)进行繁殖，以更好地容纳大尺寸的基因组或反基因组。

RNA复制所需的N、P和L蛋白需要一个RNA聚合酶延伸因子(如M2(ORF1)蛋白)以进行持续的转录。因此，感染性RSV的生产需要一个用于负链DNA病毒的M2(ORF1)或其基本上等价的转录延伸因子，在产毒性感染时，M2是功能性核衣壳所需的组件。M2(ORF1)蛋白的需求与其起转录延伸因子的作用相符。本发明的一个特征是需要表达针对负链RNA病毒的RNA聚合酶延伸因子蛋白。M2(ORF1)能通过完全M2-基因的表达来提供，但是在这种形式下第二种ORF2也会表达，并对RNA的复制有抑制作用。因此，为了用完全M2基因来产生感染性病毒，应协调两个ORF的活性，使得能充分表达M(ORF1)以提供转录延伸活性，而不表达大量M(ORF2)来抑制RNA复制。或者，从工程化除去ORF2或编码缺陷型ORF2的cDNA来获得ORF1蛋白。通过与其它病毒蛋白基因(如那些编码包膜组成(即SH、M、G、F蛋白)的基因)的共同表达，也可提高病毒产生的效率。

通过转染、电穿孔、机械插入、转导等方式，将编码基因组或反基因组的以及分开的N、P、L和M2(ORF1)蛋白的分离的多核苷酸(如cDNA)插入支持产毒性RSV感染的细胞(如HEp-2、FRhL-DBS2、MRC和Vero细胞)中。分离的多核苷酸序列例如可以通过磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14:725(1978)；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7:603(1981)；Graham和Van der Eb,Virology 52:456(1973))、电穿孔(Neumann等，EMBO J.1:841-845(1982))、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，(ed.)Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,Inc.,NY(1987))、阳离子脂质介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus15:73-79(1993))或商业上购得的转染试剂(例如Lipofect ACE^_(Life Technologies)(前述文献均纳入本文作参考)来引入培育的细胞中。

N、P、L和M2(ORF1)蛋白由一个或多个表达载体编码，这些表达载体可以是编码基因组或反基因组的同一载体或分开来，及其它们的各种组合。其中还可包含所需的其它蛋白，这些蛋白由其自身载体、或编码N、P、L或M2(ORF1)蛋白的载体、或完全基因组或反基因组编码。例如，使每个cDNA在T7 RNA聚合酶启动子的控制下，转染的质粒就可表达基因组或反基因组以及蛋白，T7RNA聚合酶的启动子是通过T7 RNA聚合酶表达系统(例如表达T7 RNA聚合酶的牛痘病毒MVA株重组体(Wyatt等，Virology,210:202-205(1995)，其内容纳入本文作参考))的感染、转染或转导来提供的。也可从转化的哺乳动物细胞或预先形成的mRNA或蛋白的转染来提供病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶。

或者，可在体外组合的转录-翻译反应中进行反基因组或基因组的合成，然后再转染入细胞。或者，可以在体外合成反基因组或基因组RNA，然后转染入细胞表达RSV蛋白。

为了从本发明提供的生物衍生和重组的RSV株的宿主中选出候选疫苗病毒，可用熟知的方法来确定存活、减毒性和免疫原性的标准。本发明疫苗中最需要的病毒必须有存活能力，具有稳定的减毒表型，能在免疫宿主中复制(尽管水平较低)，以及在受接种者体内有效地引起免疫应答，产生的保护力足以抵抗以后野生型病毒感染引起的严重疾病。很明显，到目前为止已知的、报告的RSV突变株没有满足所有这些标准。实际上，与基于已知的减毒RSV报告的结果的预计相反，本发明的病毒不仅能够存活，比以前的突变株的减毒程度更高，而且比以前研究的突变株在体内遗传上更稳定，保留了刺激保护性免疫应答的能力，在一些例子中，还通过多次修饰扩展了保护性，例如诱导产生抗不同病毒株或亚组的保护性或在不同的免疫基础的机体中产生保护性(如分泌性血清免疫球蛋白、细胞免疫性等)。在本发明之前，体内复制后ts表型的遗传不稳定曾是ts病毒的规律(Murphy等，Infect.Immun.37:235-242(1982))。

为了繁殖疫苗用RSV病毒和其它目的，可以采用许多能使RSV生长的细胞系。使RSV在各种人和动物细胞中生长。用于繁殖疫苗用减毒RS病毒的较佳的细胞系包括DBS-FRhL-2、MRC-5和Vero细胞。上皮细胞系(如Vero细胞)通常能获得最高的病毒产量。细胞通常以约0.001-1.0或更高的感染复数来接种病毒，并在允许病毒复制的条件下培育，例如在约30-37℃下培育约3-5天，或病毒达到足量滴度所需的时间。将病毒从细胞培养物中取出，使其与细胞组分分离(通常采用熟知的纯化步骤，如离心)，并用本领域技术人员熟知的方法按需进行进一步纯化。

本文所述的已减毒的RSV可在各种熟知的、一般可接受的体外和体内模型中进行测试，以确定是否已充分减毒、能抵抗表型回复和用作疫苗所需的免疫原性。在体外测定中，对修饰的病毒(如多次减毒的、生物衍生获得的或重组RSV)进行病毒复制温度敏感性(即ts表型)以及小噬斑表型的测试。另外还在动物模型中对修饰的病毒进一步进行RSV感染测试。各种动物模型描述归纳在Meignier等，eds.,Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection,MerieuxFoundation Publication,(1991)中，该文内容纳入本文作参考。在美国专利4,800,078和Prince等，Virus Res.3:193-206(1985)中描述了RS感染的棉鼠模型，这些内容纳入本文作参考，并且认为它预示了在人体内的减毒性和效率。用黑猩猩作RSV感染的灵长目模型预示了在人体内的减毒性和效率，详细描述参见Richardson等，J.Med.Virol.3:91-100(1978)；Wright等，Infect.Immun.,37:397-400(1982)；Crowe等，Vaccine 11:1395-1404(1993)，这些内容纳入本文作参考。

从小鼠和黑猩猩获得的关于候选RSV减毒水平的数据相关性可以参照图1来证明，该图将呼吸道合胞病毒亚组A在小鼠肺中的复制谱与其在黑猩猩中的复制关联起来。相对复制水平与野生型RSV相比是基本上相同的，因此使得小鼠可以作为模型来初步分析候选RSV疫苗减毒水平的特征。小鼠和棉鼠的模型在那些候选RS病毒在黑猩猩体内不能充分生长的情况下是特别有用的。RSV病毒B亚组是一个在黑猩猩内生长差的RS病毒例子。

而且，RSV中和抗体在感染棉鼠中的治疗效果表现出与随后进行的RSV感染的猴和人的免疫治疗实验高度相关。实际上，棉鼠是受感染猴、黑猩猩和人用RSV中和抗体作免疫治疗观察应答反应的可靠的实验代用品。例如，与棉鼠中治疗效果有关的RSV中和抗体的量(被治疗动物的血清中这些抗体的水平检测)(即血清RSV中和滴度为1∶302-1∶518)与猴(即滴度为1∶539)或婴幼儿(即1∶877)的范围相同。棉鼠中的治疗效果表现为肺中病毒滴度减低100倍或更高(Prince等，J.Virol.61:1851-1854)，而猴中的治疗效果观察到肺病毒滴度降低50倍。(Hemming等，J.Infect.Dis.152:1083-1087(1985))。最后，在患严重RSV细支气管炎和肺炎住院的婴幼儿中治疗效果表现为，治疗组中氧合作用显著增加和经治疗患者的上呼吸道中可回收的RSV量大大降低。(Hemming等，Antimicrob.Agents Chemother.31:1882-1886(1987))。因此，根据这些研究，棉鼠是预示RSV疫苗成功用于婴幼儿的有关模型。其它鼠类，包括小鼠，也同样适用，因为这些动物允许RSV复制，并且体内温度更接近人类(Wright等，J.Infect.Dis 122:501-512(1970)和Anderson等，J.Gen.Virol.71:(1990))。

根据上文描述和下文的实施例，本发明还提供了分离的疫苗用感染性RSV组合物。减毒病毒是疫苗的一个组分，它是分离的，通常纯化的形式。“分离的”指RSV不是天然环境(如受感染个体的鼻咽)中的野生型病毒。更通常的，“分离的”包括作为细胞培养物或其它人工培养基中一个组分的减毒病毒。例如，本发明的减毒RSV可由感染的细胞培养物产生，将其从细胞培养物中分离出来，并加入含有其它非天然存在的RS病毒(例如那些选出来的通过耐受F蛋白的中和单克隆抗体来减毒的病毒)的稳定剂中。

本发明的RSV疫苗含有如本文所述的制得的免疫有效量的RSV作为活性组分。生物衍生的或重组RSV可直接用于疫苗制剂，或冻干。冻干的病毒通常保存在约4℃左右。在准备使用时，稳定化溶液(如盐溶液，或如下文所述的，包含SPG、Mg++和HEPES，加入或不加入佐剂，)中重建冻干的病毒。生物衍生或重组修饰的病毒可以和生理上可接受的载体和/或佐剂一起导入宿主中。适用的载体是本领域所熟知的，其包括例如，水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。获得的水溶液可混合使用，或是冻干，冻干的制品在给药前与无菌溶液混合(如上所述)。组合物可以含有药学上可接受的、获得近似生理环境所需的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、滋补调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸钠、三乙胺油酸酯等。可接受的佐剂包括不完全的Freund佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、或明矾，这些均是本领域内熟知的材料。较佳的佐剂也包括Stimulon^TMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Worchester,MA)、MPL^TM(3-正-脱乙酰单磷酸化脂质A；RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,MT)和白介素-12(Genetics Institute,Cambridge,MA)。

在用本文所述的RSV疫苗组合物经气雾剂、液滴、口服、体表或其它途径进行免疫时，宿主的免疫系统应答疫苗产生抗RSV病毒蛋白(如F和G糖蛋白)的特异性抗体。在接种疫苗后，宿主变得至少部分或完全对RSV感染免疫，或对中度或严重的RSV疾病，尤其是下呼吸道疾病有抵抗力。

施用疫苗的宿主可以是任何易受RSV或密切相关的病毒感染，并能产生抗疫苗株抗原体的保护性免疫反应的哺乳动物。因此，合适的宿主包括人、除人以外的灵长类动物、牛、马、猪、羊、山羊、lagamorph、鼠等。因此，本发明提供了制备各种人用和兽用疫苗的方法。

对易受RSV感染或处于RSV感染危险中的患者给予“免疫有效剂量”的含有本发明的减毒RSV的疫苗组合物，该有效剂量足以诱导或增强个体抗RSV的免疫应答能力。在对象为人的情况下，本发明的减毒病毒可根据已有的人RSV疫苗方法(如Wright等，Infect Immun.37:397-400(1982),Kim等，Pediatrics 52:56-63(1973)和Wright等，J.Pediatr.88:931-936(1976)中所述的，这些文献均纳入本文作参考)来给药。简单地说，成年人或儿童滴鼻接种致免疫有效剂量的RSV疫苗，通常在体积为0.5ml的生理上可接受的稀释剂或载体中。与非复制性疫苗的非肠道免疫相比，该方法的优点是简单而且安全。它也直接刺激了在抗RSV中起主要作用的局部呼吸道免疫性。而且，这种免疫接种的方式有效地避免了从母体获得的RSV特异性血清抗体的免疫抑制作用。同样，尽管RSV抗原的非肠道给药有时会引起免疫病理并发症，但是对于活病毒没有发现有这种情况。

对于所有病人，RSV疫苗给药的精确剂量以及给药的时间和重复次数将根据患者的健康状况和体重、给药方式、制剂的特征等来确定。剂量通常每病人为10³-10⁶或更高的噬斑形成单位(PFU)病毒，更常见地为10⁴-10⁵PFU病毒/患者。在任何一种情况下，疫苗制剂提供的本发明RSV减毒株的剂量应足以有效地刺激或诱导抗RSV的免疫应答(例如，可通过补体固定、噬斑中和、和/或酶联免疫吸附测定等其它方法测定)。在这方面，还监测个体上呼吸道疾病的病征和症状。在对黑猩猩给药时，疫苗的减毒病毒在受疫苗者鼻咽内生长的水平约比野生型病毒低10倍或更低，或比不完全减毒RSV的水平低大约10倍或更低。

在新生儿和婴儿中，需要多次给药以引发足够水平的免疫。给药应当从出生的第一个月开始，在整个儿童时期间隔给药(如2个月、6个月、1岁和2岁时)，这是维持足量的抗天然(野生型)RSV感染保护水平所必需的。同样，特别易受反复或严重的RSV感染的成年人(例如医务工作者、护理工作者、幼儿的家庭成员、老年人、心肺功能衰弱的人)可能需要进行多次免疫，以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导出的免疫性水平可通过测定中和性分泌和血清抗体的量来进行监测，并按照需要调整剂量或重复接种疫苗，以维持所需水平的保护力。另外，不同的人群可给予不同的疫苗病毒。例如，表达细胞因子或富含T细胞表位附加蛋白的工程化RSV株特别适用于成年人而不是儿童。根据本发明制得的RSV疫苗可以与RSV的其它亚组或株的病毒组合，以实现抗多种RSV亚组或株的保护性，例如这些株的保护性表位可以工程化插入一个如上所述的RSV克隆中。通常是混合不同的病毒并同时给药，但是也可分开给药。例如，由于两个RSV亚组的F糖蛋白只有约11％的氨基酸序列不同，因此该相似性是交叉保护性免疫应答(在用RSV和F抗原免疫并用异源株侵染的动物中发现)的基础。因此，用一株免疫可抵抗相同或不同亚组的不同株。

本发明的疫苗会产生免疫应答，当个体在此后被野生型RSV感染时，该免疫应答可以抵抗严重的下呼吸道疾病(如肺炎和细支气管炎)。尽管天然循环病毒仍能引起感染，尤其是上呼吸道感染，但是由于疫苗接种和此后野生型病毒感染可能会增加抵抗力，鼻炎的可能性大大降低。在疫苗接种后，有可检测水平的宿主产生了能在体外和体内中和同源(相同亚组)野生型病毒的血清和分泌型抗体。在许多情况下，宿主抗体也能中和不同的非疫苗亚组的野生型病毒。

与人体内天然生长的野生型病毒相比，本发明的减毒RS病毒表现出毒力有非常显著地降低。减毒病毒是充分减毒的，以致于在大多数免疫个体中没有出现感染症状。在一些情况下，减毒病毒仍能传染给未接种疫苗的个体。然而，它的毒力被充分除去，这样在接种疫苗的或偶然的宿主中均不会发生严重的下呼吸道感染。

疫苗病毒的减毒水平可以这样来确定：例如，测定存在于免疫宿主呼吸道中的病毒的量，将该量与野生型RSV、或作为候选疫苗株评价的其它减毒RS病毒产生的量比较。例如，与野生型病毒的复制水平相比，本发明的减毒病毒在高度易感的宿主(如黑猩猩)上呼吸道中复制的限制程度更高(例如减少10-1000倍)。同样，减毒RSV疫苗株在黑猩猩上呼吸道中的复制水平应低于RSV A2ts-1突变株(以前已经证明在血清抗体阴性婴儿中有不完全的减毒性)的复制水平。为了进一步减少鼻溢的产生(与病毒在上呼吸道中的复制有关)，理想的候选疫苗病毒应当在上呼吸道和下呼吸道中均有受限制的复制水平。然而，本发明的减毒病毒对人必须有足够的感染性和免疫原性以赋予接种疫苗者保护力。测定受感染宿主鼻咽中的RS病毒水平的方法是文献中熟知的。样品通过吸取或洗出鼻咽分泌物获得并在组织培养中测定病毒量，或进行其它实验方法获得。例如参见，Belshe等,J.Med.Virology 1:157-162(1977),Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204:690-694(1968)；Gharpure等，J.Virol.3:414-421(1969)；和Wright等，Arch.Ges.Virusforsch.41:238-247(1973)。病毒可在宿主动物(如黑猩猩)鼻咽中进行方便地测定。

在一些情况下，希望将本发明的RSV疫苗与诱导抗其它传染因子的保护性应答的疫苗(尤其是其它儿童期病毒)结合。例如，本发明的RSV疫苗可以与副流感病毒疫苗同时给药，如Clements等，J.Clin.Microbiol.29:1175-1182(1991)中所述的，这些内容纳入本文作参考。在本发明的另一方面，通过将编码那些保护性抗原的序列掺入(用来产生感染性RSV)的RSV基因组或反基因组中(如本文所述)，可将RSV用作其它呼吸道病原体(例如副流感病毒)的保护性抗原的载体。

本发明还有一个方面是将重组RSV用作呼吸道的瞬时基因治疗的载体。根据这一实例，重组的RSV基因组或反基因组掺入一个能编码感兴趣基因产物的序列。感兴趣的基因产物受到与控制RSV表达的启动子相同或不同的启动子的控制。通过共表达重组RSV基因组或反基因组与N、P、L和M2(ORF1)蛋白，以及含有编码感兴趣基因产物的序列，产生了感染性RSV，将其给予患者。给药通常用气雾剂、喷雾或其它体表方式施用到待治疗患者的呼吸道中。重组RSV的给药量应足以使所需基因产物的表达达到治疗或预防水平。该方法中给药的典型基因产物例子包括，那些编码例如特别适用于瞬时表达的基因产物，如白介素-2、白介素-4、γ干扰素、GM-CSF、G-CSF、红细胞生成素，以及其它细胞因子、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA和疫苗抗原。

提供下列实施例供用来说明，而没有限制性。

                            实施例Ⅰ

                冷传代RSV诱变衍生株的分离和鉴定

本实施例描述了化学诱变不完全减毒的、宿主范围受限制的cpRSV来生产减毒程度更高的衍生性ts和sp突变株，以适用于RSV疫苗的制备。

制备冷传代RSV(cpRSV)的亲代原种。使Flow Laboratories Lot 3131病毒(人体内不完全减毒的cpRSV亲代病毒)在25℃、MRC-5细胞中传代两次，25℃、MRC-5细胞中末端稀释(terminally dilute)两次，然后在MRC-5中传代三次，产生诱变用的cpRSV悬液。

使亲代原种在MRC-5细胞、32℃、含浓度为4×10^-4M的5-氟尿嘧啶的培养基中生长，诱导cpRSV变异。基础研究证明该浓度是最佳的，其依据是，与不含5-氟尿嘧啶的培养基相比，病毒滴度降低100倍。然后在维持生长在琼脂铺层的Vero细胞上进行噬斑测定进行分析，在培育适当间隔时间后，用中性红染料对噬斑进行染色。挑取854个噬斑，使每个噬斑的子代分别生长在新鲜的单层Vero细胞上进行扩增。当Vero细胞的致细胞病变效应达到最大时，分别收获每个接种了单一cpRSV诱变病毒单个噬斑子代的各个组织培养物。在32℃和38℃下在HEp-2细胞上对这些噬斑库进行滴定，选出表现出温度敏感型(ts)或小噬斑(sp)表型的子代病毒。进一步对所有有sp表型(与亲代病毒相比，32℃时的噬斑大小减少50％或更多)或ts表型(与32℃时的相比，在限制性温度[37℃-40℃]下的滴度减少100倍或更多)的病毒进行评价。使这些病毒株在Vero细胞上连续经噬斑纯化三次进行生物克隆，然后在Vero细胞上扩增。在32℃、37℃、38℃、39℃和40℃下滴定克隆株(用噬斑形成效率(EOP)试验)，以确认sp和ts表型。由于一些克隆病毒株甚至在允许温度(32℃)下的滴度也相当低，因而使这些病毒在HEp-2细胞中传代一次，以产生病毒悬液用于体外分析。诱变的cpRSV子代的表型列在表1中。

表1冷传代RSV的9个衍生株(cpts或cpsp突变株)在HEp-2细胞中允许和限制温度下的噬斑形成效率

	指定温度(℃)下病毒的滴度(log10pfu/ml)					停止生长温度	小噬斑
								病毒	32	37	38	39	40	(℃)1	在32℃
A2野生型	4.5	4.4	4.5	3.8	3.8	＞40	没有
								cp-RSV	6.0	5.8	5.8	6.2	5.4	＞40	没有
ts-1	5.7	4.5	2.7	2.4	1.7*	38	没有
								cpts143	4.2*	4.1*	3.8*	3.9*	3.8*	＞40	有
cpts368	6.7	6.3	6.1*	5.8**	2.0**	40	没有
								cpts274	7.3	7.1	6.6	5.8*	1.0**	40	没有
cpts347	6.2	6.1	5.7*	5.5**	＜0.7	40	没有
								cpts142	5.7	5.1	4.5*	3.7**	＜0.7	39	没有
cpts299	6.2	5.5	5.1*	2.0**	＜0.7	39	没有
								cpts475	5.4	4.8*	4.2**	＜0.7	＜0.7	39	没有
cpts530	5.5	4.8*	4.5*	＜0.7	＜0.7	39	没有
								cpts248	6.3	5.3**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	38	没有

¹停止生长温度定义为观察到噬斑滴度降低100倍或更多的最低限制温度(表中的粗体表示)

^*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

一个突变株子代有小噬斑表型，RSVcpsp143(sp指小噬斑(sp)表型)，其余的突变株子代有ts表型。RSVcpts突变株在体外培养单层上37-40℃范围内产生噬斑的能力有所不同，cpts368保留了在40℃下形式噬斑的能力，而温度最敏感(ts)病毒cpts248不能在38℃下形成噬斑。因此，一些诱变的cpRSV子代在噬斑形成的温度敏感性方面明显与其cpRSV亲代病毒不同。

            小鼠中的复制和遗传稳定性研究

下面研究了BALB/c小鼠上呼吸道和下呼吸道中cpRSV衍生的突变株的复制水平(表2)。发现cpts530和cpts248这两个温度敏感性最高(见表1)的突变株，其在小鼠鼻甲中的复制限制在约7-12倍之间(表2)。然而，没有一种病毒在肺中的复制受到限制(与cpRSV亲代病毒相比)。这种鼻甲中的复制比肺中的复制更受限制的特征不是tsRSV突变株的特征，而tsRSV通常是在温度较高的下呼吸道中的复制更受限制(Richman和Murphy,Rev.Infect.Dis.1:413-433(1979))。肺和鼻甲中产生的病毒保留了原来病毒的ts特征(数据未列出)。本发明发现提示，将ts突变结合到cp亲代病毒的突变背景中导致产生cpRSV的ts子代，该子代在体内复制后的ts表型稳定性比以前研究的ts突变株所观察到的更高。

为了进一步研究cpRSV衍生突变株的ts表型的遗传稳定性水平，研究温度最敏感的两个诱变cpRSV子代(即cpts248和cpts530)在裸鼠肺和鼻甲中的病毒噬斑形成效率。选择裸鼠是因为它们先天性缺少功能性T细胞而丧失免疫功能，因此在这些宿主中病毒可复制很长时间。这种更长时间的复制有利于表型改变的病毒突变株产生。鉴定第12天时的病毒(注意，在正常的小鼠中，在这一时间不再检测到有病毒)，发现保留了未变化的ts表型(表3)。如所预计的，测试中作为阳性对照的ts-1突变株在体内表现出不稳定的ts表型。因此，与以前在小鼠中对ts突变株病毒的评价相反，结果表明延长在小鼠内的复制后，获得了cpRSV衍生突变株的ts表型的高水平稳定性，这表明在本发明的病毒中有着显著的、以前从未获得的、非常需要的性能。

                      表2cpts和cpsp-RSW突变株在BALB/c小鼠¹中的复制

                                       32℃下的滴度

                       (8个动物组织的log₁₀pfu/g组织平均值±标准差)

感染动物的病毒株	病毒的停止生长温度(℃)	第4天		第5天
						鼻甲	肺	鼻甲	肺
		A2野生型	＞40	5.0±0.16	5.8±0.20					5.0±0.11	5.8±0.19
cp-RSV	＞40					4.7±0.07	5.3±0.18	4.8±0.16	5.3±0.21
		ts-1	38	4.0±0.19	4.7±0.27					3.8±0.33	4.9±0.13
cpts143	＞40					4.5±0.14	4.1±0.37	4.4±0.39	4.6±0.39
		cpts368	40	4.8±0.15	5.1±0.35					4.7±0.08	5.4±0.23
cpts274	40					4.2±0.19	5.0±0.15	4.2±0.11	5.1±0.55
		cpts347	40	4.4±0.32	4.9±0.40					4.5±0.33	5.2±0.35
cpts142	39					4.1±0.34	5.0±0.19	4.3±0.24	5.8±0.40
		cpts299	39	3.9±0.11	5.2±0.15					3.9±0.32	5.0±0.29
cpts475	39					4.0±0.18	5.3±0.25	4.1±0.23	4.9±0.42
		cpts530	39	3.9±0.18	5.3±0.15					3.9±0.14	5.3±0.19
cpts248	38					3.9±0.33	5.1±0.29	4.2±0.13	5.5±0.35

¹在第0天从鼻内给予小鼠10^6.3p.f.u的0.1ml接种物，然后在第4或5天杀死。

表3 RSVcpts-248和cpts-530在裸鼠中延长复制后的遗传稳定性

裸鼠鼻甲或肺中的病毒在指定温度下的噬斑形成效率1，裸鼠在给予病毒后12天处死
																32℃			37℃			38℃			40℃
感染动物所用的病毒	测试种入病毒所采用的组织	动物数目	有可检测病毒的动物％	平均滴度(log10pfu/g组织或ml接种物)2	有可检测病毒的动物％	有ts表型改变病毒的动物％	平均滴度(log10pfu/g组织或ml接种物)2	有可检测病毒的动物％	有ts表型改变病毒的动物％	平均滴度(log10pfu/g组织或ml接种物)2	有可检测病毒的动物％	有ts表型改变病毒的动物％	平均滴度(log10pfu/g组织或ml接种物)2
														cpts248	鼻甲	19	100	3.8±0.34	0	0	＜2.0	0	0	＜2.0	0	0	＜2.0
cpts248	肺	19	90	2.0±0.29	0	0	＜1.7	0	0	＜1.7	0	0	＜1.7
														cpts530	鼻甲	20	100	3.0±0.26	0	0	＜2.0	0	0	＜2.0	0	0	＜2.0
cpts530	肺	20	100	2.4±0.29	0	0	＜1.7	0	0	＜1.7	0	0	＜1.7
														ts-1	鼻甲	19	100	3.7±0.23	74	74	2.7±0.57	63	63	2.4±0.36	10	10	2.0±0.13
ts-1	肺	19	100	2.5±0.30	74	74	1.8±0.21	35	32	1.8±0.15	0	0	＜0.17
														输入病毒的噬斑形成效率	cpts248	-	-	4.9	-	-	＜0.7	-	-	＜0.7	-	-	＜0.7
cpts530	-	-	5.5	-	-	3.7*	-	-	＜0.7	-	-	＜0.7
													ts-1		-	-	6.1	-	-	3.3	-	-	2.7	-	-	＜0.7

1显示的噬斑滴度表明19或20份样品的平均log₁₀pfu/g±标准差

2每个动物在第0天从鼻内给药10^6.3p.f.u的0.1ml接种物。

°只有小噬斑表型。

                        在黑猩猩中

然后在血清阴性黑猩猩(一种非常接近人类的宿主)中评价cpRSVts衍生株的减毒水平。黑猩猩或枭猴(owl monkey)中的实验按照Richardson等，J.Med.Virol.3:91-100(1979；Crowe等，Vaccine 11:1395-1404(1993))中描述的通用步骤来进行，这些内容纳入本文作参考。将含有约10⁴噬斑形成单位(PFU)的诱变减毒病毒的1ml悬液鼻内给予每个动物。另一种方法是将RSV以10⁴PFU的剂量接种到上呼吸道和下呼吸道各部位。每天从黑猩猩中取样，取样10天，然后每隔3-4天取样直至20天。黑猩猩下呼吸道的取样可按照Snyder等，J.Infect.Dis.154:370-371(1986)和Crowe等，Vaccine 11:1395-1404(1993)中的方法采用气管灌洗。4-6周后一些动物用野生型病毒攻击。每天取鼻咽样品，评价动物呼吸道疾病症状。将鼻溢评分从0至4+,2+或更高被认为有明显的上呼吸道疾病。

如上所述从鼻和喉咙拭子样品以及气管灌洗液分离病毒，接种人RSV-敏感的HEp-2细胞中。也可用HEp-2细胞通过噬斑方法直接测定病毒的量(如Scnitzer等，J.Virol.17:431-438(1976)中所述，其内容纳入本文作参考)。在给予病毒前和接种后3-4周时收集血清样品，以测定RSV中和抗体(如Mills等，J.Immununol.107:123-130(1970)中所述，其内容纳入本文作参考)。

研究温度最敏感的和减毒的cpRSV衍生株(cpts248)，并将其与野生型RSV以及cpRSV亲代病毒比较(表4)。与野生型相比，cpRSV亲代病毒在鼻咽中的复制稍有减少，在鼻溢中的量有所降低，而在下呼吸道中的病毒复制减少600倍左右。很明显，cp病毒在黑猩猩下呼吸道中的复制明显受限制，这是以前在动物或人体内评价cpRSV时没有确定的非常需要的性能。更明显地，cpts248病毒在鼻咽中复制受限制是野生型的10倍，这种受限制伴有鼻溢的显著减少。这些发现表明，cpRSV衍生的突变株有两个活RSV疫苗非常需要的性能，即在非常易感的血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中均有减毒性。下面评价了在用cpts248免疫的黑猩猩呼吸道中的病毒的遗传稳定性(表5)。呼吸道分泌物中的病毒有ts表型，这可以第8天第3号黑猩猩的病毒检测中看出，该病毒在40℃下的滴度减少100倍，并且在40℃下有小的噬斑表型，这些表明病毒复制仍然是温度敏感性的。它代表了该实验前鉴定的最具遗传稳定的ts突变株。cpts248和cpts530的ts表型稳定性增加反映了cp突变对于提供体内ts表型的突变的遗传稳定性有作用。因此，在cp3131亲代病毒中已有的突变内的ts突变表现出比它们不存在时预计的更具稳定性。该重要性能以前没有观察或报道过。用cpts248感染黑猩猩可诱导高滴度的血清中和抗体和抗F和G糖蛋白的抗体(表6)。很明显，用cpts248免疫可保护动物抵御野生型RSV攻击(表7)，这表明，该突变株可作为有效的疫苗病毒用于与人非常接近的宿主中。

上述发现表明，cpts248病毒有活RSV疫苗所需的许多性能，其包括：1)上呼吸道和下呼吸道中的减毒性；2)在体内复制甚至在免疫抑制动物体内延长复制后，遗传稳定性增加；3令人满意的免疫原性；和4)显著的抗野生型RSV侵染的保护性。cpts530病毒具有与cpts248相似的噬斑形成温度敏感性，小鼠鼻甲中的相似程度的复制限制性，以及在免疫缺陷裸鼠中的高度遗传稳定性，因此它也可作为RS病毒疫苗株。

表4 cpts-RSV 248、cp-RSV或野生型RSV A2在血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制

动物感染用用指定病毒	接种途径	黑猩猩编号	病毒回收
									鼻咽		气管		鼻溢评分
			持续期b	峰值滴度(log10pfu/ml)	持续期b	峰值滴度(log10pfu/ml)	持续值c	峰值
									cpts-248	IN+IT	1	10	4.6	8d	5.4	0.2	1
IN+IT	2	10	4.5	6	2.2	0.1	1
								IN+IT		3	9	4.7	10	2.1	0.1	1
IN+IT	4	9	4.2	8d	2.2	0.1	1
											平均9.5	平均4.5	平均8.0	平均3.0	平均0.1
cp-RSV	IN	5	20	5.3	8d	2.9	1.0										3
								IN	6	16	5.8	6d	3.0	1.8	3
	IN+IT	7	13	4.3	6d	3.0	0.6									1
								IN+IT	8	16	5.0	10d	2.8	0.5	1
			平均16	平均5.1	平均7.5	平均2.9	平均1.0
								A2野生型	IN	9	9	5.1	13	5.4	1.0		1
IN	10	9	6.0	8	6.0	1.7	4
									IN+IT	11	13	5.3	8	5.9	2.1	3
IN+IT	12	9	5.4	8	5.6	1.0	3
											平均10	平均5.5	平均9.3	平均5.7	平均1.4

a IN表示只进行鼻内给药，剂量为10⁴p.f.u的1.0ml接种物；IN+IT表示鼻内给药和气管内给药，每处的剂量为10⁴p.f.u的1.0ml接种物。

b表示感染后回收得到病毒的最后一天。

c平均鼻溢评分用在病毒排出的峰值日周围8天的评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。

d表明仅在指定日分离得到的病毒。

表5从用cptsRSV248感染的实验动物中获得的最初鼻咽(NP)拭子或气管灌洗(YL)样品中病毒的遗传稳定性

指定温度下RSV的滴度(log10pfu/ml)
						黑猩猩编号	NP药签或TL样品	获得病毒时的感染后天数	32℃下的滴度	39℃下的滴度	40℃下的滴度
1a	NP	3	3.2	＜0.7	NT
						NP	4	2.7	＜0.7	NT
	NP	5	4.2	＜0.7	NT
						NP	6	3.8	＜0.7	NT
	NP	7	4.6	＜0.7	NT
						NP	8	4.5	＜0.7	NT
	NP	9	2.6	＜0.7	NT
						NP	10	2.0	＜0.7	NT
	TL	6	5.4	＜0.7	NT
						TL	8	2.7	＜0.7	NT
	2a	NP	3	3.2	＜0.7						NT
NP						4	3.7	＜0.7	NT
		NP	5	4.5	＜0.7					NT
NP						6	4.1	＜0.7	NT
		NP	7	3.3	＜0.7					NT
NP						8	4.2	＜0.7	NT
		NP	9	2.8	＜0.7					NT
NP						10	1.6	＜0.7	NT
		TL	6	2.2	＜0.7					NT
3						NP	3	2.7	＜0.7		＜0.7
	NP	4	3.4	＜0.7	＜0.7
						NP	5	2.9	＜0.7	＜0.7
	NP	6	3.3	＜0.7	＜0.7
						NP	7	3.4	0.7b	＜0.7
	NP	8	4.7	3.5b	2.0c
						NP	9	1.9	＜0.7	＜0.7
	TL	6	1.8	＜0.7	＜0.7
						TL	8	1.9	1.2b	＜0.7
	TL	10	2.1	1.3b	＜0.7
						4	NP	3	3.2	＜0.7	NT
NP	4	2.7	＜0.7	NT
					NP		5	3.4	＜0.7	NT
NP	6	3.3	＜0.7	NT
					NP		7	4.2	＜0.7	NT
NP	8	3.5	＜0.7	NT
					NP		9	2.1	＜0.7	NT
TL	8	2.2	＜0.7	NT

NT=未进行实验

^a从这些黑猩猩的每一初始的含病毒鼻咽拭子样品或气管灌洗样品中产生分离物(一次传代的病毒悬液，平均滴度log₁₀pfu/ml为4.0)，在32℃、39℃和40℃下测试噬斑形成效率。没有分离物能够在39℃下形成噬斑。黑猩猩3和4的分离物没有用这种方式测试。

^b39℃时的滴度对应32℃时滴度的百分数：NP拭子第7天=0.2％,NP拭子第8天=6T、TL第8天-20％、TL第10天=16％。所有的噬斑只有小噬斑表型；没有发现有野生型大小的噬斑。

^c40℃滴度对于32℃滴度的百分数为0.2％。所有噬斑是针尖形噬斑表型；没有检测到野生型大小的噬斑。

表6用RSV cpts-248、cpRSV或RSV A2野生型感染的黑猩猩的血清抗体应答

		血清抗体滴度(倒数平均log2)
								动物免疫接种用	黑猩猩数	中和		ELISA-F		ELISA-G
第0天	第28天	第0天	第28天	第0天	第28天
						cpts-248	4			＜3.3	10.7	7.3	15.3	6.3	9.8
cp-RSV	4	＜3.3	11.2	11.3	15.3			9.3	12.3
						RSVA2野生型	4			＜3.3	11.2	8.3	15.3	7.3	10.3

表7用cpts248免疫黑猩猩诱导出对抗第28天RSV A2野生型病毒侵袭的抵抗力

		对于第28天给予的104pfu野生型病毒侵染的应答
												病毒回收				鼻溢评分		指定日的血清中和抗体滴度(log2)
		鼻咽		气管
						用来免疫接种动物的病毒	黑猩猩编号	时间(天)	峰值滴度(logxpfu/ml)	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	平均值*	峰值	第28天	第42或56天
cpts-248	1	8	2.7	0	＜0.7											0	0	10.1	11.0
						2	9	1.8	0	＜0.7	0	0	10.3	14.5
	cp-RSV	5	5	1.0	0										＜0.7	0	0	11.1	13.3
6						8	0.7	0	＜0.7	0	0	11.4	12.9
		没有	9	9	5.1									13	5.4	1.0	1	＜3.3	12.4
10	9					6.0	8	6.0	1.7	4	＜3.3	13.2
			11	13	5.3								8	5.9	2.1	3	＜3.3	11.6
12	9					5.4	8	5.6	1.0	3	＜3.3	11.2

^*平均鼻溢评分用在病毒排出的峰值8天的评分总数除以8表示。最高评分为4。评分为0表示在10天观察期内从未检测到有任何鼻溢。

                        进一步的减毒

由于RS病毒在婴儿下呼吸道中产生了比这些实验研究中所用的1-2年龄黑猩猩更多的病征，而且认为在黑猩猩中有满意的减毒性的突变株在血清阴性婴幼儿中不会有这样的性能，因此对cpts248和530衍生株(具有并不典型的ts突变株在上呼吸道中复制受限制和减毒的性能，以及更高水平的遗传稳定性)进行进一步诱变。

选择体外温度敏感性程度高于cpts248的或小噬斑表型的子代病毒，以进行进一步研究。用5-氟尿嘧啶诱变产生具有一个或多个附加ts突变的cpts248突变衍生株(表8)。鉴定比cpts248亲代株更具温度敏感性的ts突变株，其中一些有小噬斑(sp)表型。将这些cpts248衍生株对小鼠给药。在小鼠的上呼吸道和下呼吸道中，cpts248/802、248/955、248/404、248/26、248/18和248/240突变株的复制比其cpts248亲代病毒的复制更受限制(表9)。因此，鉴定得到比其cpts248亲代病毒更减毒的cpts248活突变株，这些cpts248的衍生株在小鼠中表现出范围较宽的复制效率，其中cpts248/26最受限制。小鼠鼻甲和肺中的病毒的ts表型几乎与所给药病毒相同，这表明了遗传稳定性。高度减毒的cpts248衍生株cpts248/404病毒在鼻咽中的复制限制是野生型的1000倍。有至少三个减毒突变的cpts248/404突变株在四只血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制也高度受限制，而且感染不会引起鼻溢(表10)。该病毒再一次表现出了比野生型更高的复制受限程度，在鼻咽中减少60000倍，在肺中减少100000倍。因此，随后用RSV野生型病毒侵染的两只黑猩猩有很高的抵抗力(表11)。

用上述相似方式通过化学诱变衍生获得cpts248/404的5个小噬斑突变株。用HEp-2细胞上的32℃噬斑滴定筛选扩增一次的噬斑子代悬液的小噬斑(sp)表型，而且病毒的工作悬液如上所述进行制备。

诱变的cpts248/404病毒的5个噬斑子代表现出稳定的sp表型。每个突变株的停止生长温度为35℃或更低(表12)，这表明cpts248/404病毒的各个sp衍生株也获得附加的ts突变。在用10^6.3pfu的cpts248/404的sp衍生株对Balb/c小鼠进行鼻内接种后，在用任何这些sp衍生株接种的小鼠鼻甲中没有检测到病毒。然而，在一个例子中却在肺中检测到较低滴度的病毒。这些结果表明，与野生型RSV相比，在鼻甲中的复制限制大于300倍，在肺中的复制限制大于10000倍。

也进一步获得cpts530病毒的ts衍生株(表13)。如同cpts248衍生株一样，cpts530的衍生株在小鼠体内的复制比cpts530亲代株更受限制。一个突变株cpts-530/1009在小鼠鼻甲中的复制受限制为亲代的30倍。该cpts530衍生株在血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制也高度受限制(表14)。在鼻甲中，cpts530的复制受限制是野生型的30倍，而cpts530/1009是野生型的100倍。与野生型病毒相比，两种cpts突变株在下呼吸道中均是高度受限制的(20000至32000倍)，甚至当突变株直接接种到气管中时也是如此。同样，先用cpts530/1009、cpts530或cpRSV感染的黑猩猩在鼻咽中也表现出明显的病毒复制受限制，而且在以后用野生型RSV鼻内和气管内联合侵染时也不产生明显鼻溢(表15)。另外，预先用任一种突变株感染的黑猩猩，显示下呼吸道中有抗野生型侵染病毒复制的完全抵抗力。

根据以前的研究获得的实验结果完全不能预计到这些结果。例如，以前的研究结果表明，从5-氟尿嘧啶一轮诱变衍生得到的RSVts突变株的体内性能不能事先预测。而且，尽管用这种方式首次获得的四个ts突变株中的一个有与其它突变株相同的噬斑形成停止生长温度，但是当其在易感黑猩猩和易感婴幼儿中进行测试时，它是过度减毒的(Wright等，Infect immun.37(1):397-400(1982))。这表明，ts表型(导致37-38℃的噬斑形成停止生长温度)的获得并不能可靠地产生具有易感黑猩猩、婴幼儿所需要的减毒水平的突变株。实际上，目前为止已知的ts突变株的研究结果不能提供任何根据来得出这样的结论，即通过冷传代然后连续两轮化学诱变将三个独立的突变(或一系列突变)引入RSV，可以产生活突变株，该突变株保留了对黑猩猩(外推到婴幼儿)的感染活性，并有用于防治RSV疾病的活病毒疫苗所需的减毒水平、免疫原性和保护效率。

上述结果明显表明，本发明的cpRSV的某些ts衍生株具有令人满意的感染力，并在小鼠和黑猩猩中表现出显著程度的减毒。这些突变株在体内复制后是减毒的，并且在遗传上是高度稳定的。这些突变株也在黑猩猩中诱导出显著的抗RSV感染的抵抗力。因此，这些cpRSV的衍生株是适用于用来防治严重的人RSV疾病的活RSV疫苗的病毒株。

表8 RSV cpts248经附加5-氟尿嘧啶诱变衍生获得的10个突变株的噬斑形成效率

病毒	指定温度(℃)下病毒的滴度(log10pfu/ml)							停止温度(℃)1	32℃下小噬斑
										32	35	36	37	38	39	40
	A2野生型	4.5	4.6	4.4	4.5	4.5	3.8										3.8	＞40	没有
cpRSV								4.7	4.4	4.3	4.3	4.2	3.7	3.5	＞40	没有
	ts-1	5.6	5.4	4.9	4.4	2.7	2.0										＜0.7	38	没有
cpts-248								3.4	3.0	2.6*	1.7**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	38	没有
	248/1228	5.5*	5.3*	5.3**	＜0.7	＜0.7	＜0.7										＜0.7	37	有
248/1075								5.3*	5.3*	5.1**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37	有
	248/965	4.5	4.2	4.2*	＜0.7	＜0.7	＜0.7										＜0.7	37	没有
248/967								4.4	3.7	3.6*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37	没有
	248/804	4.9	4.5	4.0*	＜0.7	＜0.7	＜0.7										＜0.7	37	没有
248/955								4.8	3.7	2.8*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	没有
	248/404	3.6	2.9*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7										＜0.7	36	没有
248/26								3.1	2.9*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	没有
	248/18	4.0*	4.0**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7										＜0.7	36	有
248/240								5.8*	5.7**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	有

¹停止生长温度定义为在Hep-2细胞中观察到的噬斑滴度降低100倍或更多的最低限制温度(表中的粗体字表示)

^*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

表9衍生自RSV cpts-248的10个突变株在Balb/c小鼠¹中的复制和遗传稳定性

用来感染动物的病毒	病毒的停止生长温度(℃)	病毒滴度(6个动物的log10pfug组织平均值±标准差)
										鼻甲				肺
		32℃	36℃	37℃	38℃	32℃	36℃	37℃	38℃
										A2野生型	＞40	5.1±0.15	5.2±0.23	5.2±0.14	5.2±0.27	6.1±0.14	5.8±0.23	6.0±0.12	5.9±0.17
cp-RSV	＞40	4.9±0.20	5.1±0.16	4.9±0.24	4.9±0.22	6.0±0.16	5.9±0.23	5.6±0.15	5.6±0.13
										ts-1	38	3.9±0.25	2.7±0.27	2.4±0.42	2.5±0.29	4.1±0.21	3.5±0.23	2.6±0.18	2.0±0.23
cpts-248	38	4.0±0.16	2.5±0.34	＜2.0	＜2.0	4.4±0.37	1.8±0.15	＜1.7	＜1.7
										248/1228	37	4.1±0.15	2.4±0.48	＜2.0	＜2.0	2.0±0.37	＜1.7	＜1.7	＜1.7
248/1075	37	4.2±0.18	2.4±0.40	＜2.0	＜2.0	5.5±0.16	3.5±0.18	＜1.7	＜1.7
										248/965	37	3.8±0.23	＜2.0	＜2.0	＜2.0	4.5±0.21	3.4±0.16	＜1.7	＜1.7
248/967	37	4.4±0.20	＜2.0	＜2.0	＜2.0	5.4±0.20	3.6±0.19	＜1.7	＜1.7
										248/804	37	2.9±0.19	＜2.0	＜2.0	＜2.0	3.6±0.19	＜1.7	＜1.7	＜1.7
248/955	36	3.2±0.10	＜2.0	＜2.0	＜2.0	3.2±0.22	＜1.7	＜1.7	＜1.7
										248/404	36	2.1±0.312	＜2.0	＜2.0	＜2.0	4.4±0.122	1.8±0.20	＜1.7	＜1.7
248/26	36	＜2.0	＜2.0	＜2.0	＜2.0	2.3±0.20	＜1.7	＜1.7	＜1.7
										248/18	36	2.9±0.99	＜2.0	＜2.0	＜2.0	4.3±0.23	1.8±0.15	＜1.7	＜1.7
248/240	36	2.9±0.82	＜2.0	＜2.0	＜2.0	3.9±0.12	＜1.7	＜1.7	＜1.7

¹在第0天从鼻内给予轻度麻醉的小鼠10^6.3p.f.u，然后在第4天CO₂窒息杀死。

²在以后的研究中，发现cpts-248/404病毒在鼻甲和肺中的复制水平分别为2.4±0.24和2.6±0.31。

表10血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中cpts-RSV248/404、cpts-RSV248/18、cpts-RSV 248、cp-RSV或野生型RSV A2的复制

动物用指定病毒感染	接种途径	黑猩猩编号	病毒回收
									鼻咽		气管		鼻溢评分
			持续期b	峰值滴度(log10pfu/ml)	持续期b	峰值滴度(log10pfu/ml)	平均值c	峰值
									cpts-248/404	IN+ITIN+ITIN+ITIN+IT	13141516	0089平均4.3	＜0.7＜0.71.92.0平均1.3	0000平均0	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7	000.30.2平均0.1	0021平均0.8
cpts-248#	IN+ITIN+ITIN+ITIN+IT	1234	101099平均9.5	4.64.54.74.2平均4.2	8d6108d平均8.0	5.42.22.12.2平均3.0	0.20.10.10.1平均0.1	1111平均1.0
									cp-RSV#	INININ+ITIN+IT	5678	20161316平均16	5.35.84.35.0平均5.1	8d6d6d10d平均7.5	2.93.03.02.8平均2.9	1.01.80.60.5平均1.0	3311平均2.0
A2野生型#	INININ+ITIN+IT	9101112	99139平均10	5.16.05.35.4平均5.5	13888平均9.3	5.46.05.95.6平均5.7	1.01.72.11.0平均1.4	1433平均2.8

aIN表示只进行鼻内给药；IN+IT表示鼻内给药和气管内给药。

b表示感染后回收得到病毒的最后一天。

c平均鼻溢评分用在病毒排出(shedding)的峰值日周围8天的评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。

d表明仅在指定日分离得到的病毒。

#这些动物与表4和7中的动物相同。

表11用cpts-248/404免疫黑猩猩诱导出对第28天RSV A2野生型病毒侵袭的抗性

		病毒回收				鼻溢评分		指定日b的血清中和抗体滴度(交互log2)
												鼻咽		气管灌洗
用来免疫接种动物的病毒	黑猩猩编	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)											平均值a	峰值	第28天	第49或56天
						cpts-248/404	13	0	＜0.7	0	＜0.7	0	0	7.9	9.0
14	8	3.4	0	＜0.7	0											0	7.0	12.5
								平均4.0	平均2.0	平均0	平均＜0.7	平均0	平均0	平均7.5	平均10.8
cpts-248#	1	5	2.7	0	＜0.7											0	0	11.5	13.0
						2	9	1.8	0	＜0.7	0	0	12.7	14.5
		平均7.0	平均2.3	平均0	平均＜0.7										平均0	平均0	平均12.1	平均13.8
						cp-RSV#	5	5	1.0	0	＜0.7	0	0	12.2					11.1
6	8	0.7	0	＜0.7	0										0	11.9	9.9
								平均6.5	平均0.9	平均0	平均＜0.7	平均0	平均0	平均12.1				平均10.5
没有	9	9	5.1	13	5.4										1.0	1	＜3.3		11.0
						10	9	6.0	8	6.0	1.7	4	＜3.3	9.8
	11	13	5.3	8	5.9										2.1	3	＜3.3	9.4
						12	9	5.4	8	5.6	1.0	3	＜3.3	14.5
		平均10	平均5.5	平均9.2	平均5.7										平均1.4	平均2.8	平均＜3.3	平均11.2

a平均鼻溢评分用在病毒排出(shedding)的峰值日周围8天的评分总数除以8表示。最高评分为4。评分为0表示在10天观察期的任一天内均没有检测到有鼻溢现象。

#这些动物与表4、7和10中的动物相同。

b这个表中的血清中和滴度(包括那些来自前述动物的滴度)在一个测定中同时进行测定。

表12 RSV cpts-248/404的5个小噬斑衍生株在Balb/c小鼠中的噬斑形成效率和复制

在允许温度和限制温度下在HEp-2细胞中测试的噬斑形成效率
													指定温度下(℃)的病毒滴度(log10pfu/ml)							停止生长温度(℃)1	32℃小噬斑	Balb/c小鼠2中的复制
病毒	32	35	36	37	38	39	40	鼻甲3	肺3
										A2野生型	6.0	6.1	6.0	5.8	5.9	5.4	5.4	＞40	没有			4.5±0.34	5.6±0.13
cp-RSV	6.2	6.2	6.0	6.0	5.9	5.6	5.4	＞40	没有											4.5±0.10	5.3±0.20
										cpts-248	7.5	7.3	6.2**	5.3**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37	没有			3.3±0.35	4.8±0.14
248/404	5.5	3.6**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	没有											2.4±0.24	2.6±0.31
										248/404/774	2.9*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	≤35	有			＜2.0	1.8±0.24
248/404/832	5.5**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	≤35	有											＜2.0	＜1.7
										248/404/886	5.0**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	≤35	有			＜2.0	＜1.7
248/404/893	5.4**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	≤35	有											＜2.0	＜1.7
										248/404/1030	4.4*	2.2**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	35	有			＜2.0	＜1.7

¹停止生长温度定义为观察到噬斑滴度降低100倍或更高时的最低限制温度(表中的粗体表示)

²在第0天从鼻内给予轻度麻醉的小鼠10^6.3p.f.u，然后在第4天用CO₂窒息杀死小鼠，收获组织进行病毒滴定。

³6个动物的平均log₁₀pfu/g±标准差

^*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

表13衍生自RSV cpts530的14个突变株在小鼠中的噬斑形成效率和复制水平与对照的比较

体外的噬斑形成效率
													指定温度(℃)下的病毒滴度(log10pfu/ml)								停止生长温度(℃)1	小鼠中的复制2(6个动物的log10pfu/g组织平均值±SE)
RSV	32	34	35	36	37	38	39	40	鼻甲	肺
											A2	6.3	6.3	6.1	6.2	6.3	6.3	6.1	5.6	＞40		5.0±0.14	5.8±0.05
cpRSV	6.5	6.2	6.2	6.2	6.1	6.0	6.1	5.6	＞40	n.d.											n.d.
											cpts248	6.3	6.3	6.3	6.3	3.7**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37/38		4.1±0.08	5.1±0.13
248/404	6.3	5.7	43**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	35/36	2.1±0.19											3.6±0.10
											cpts530	6.2	6.3	6.2	6.1	6.2*	5.5**	＜0.7	＜0.7	39		3.4±0.09	4.3±0.14
530/346	5.9	5.9	5.7	4.7	3.5	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37	3.3±0.11											4.7±0.09
											530/977	5.0	4.4	3.6	3.4	2.8*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37		3.4±0.11	2.7±0.05
530/9	6.0	5.6	5.0	3.5*	3.5*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	2.1±0.06											3.5±0.08
											530/1009	4.8	4.0	3.7*	2.0**	1.5**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36		2.2±0.15	3.5±0.13
530/667	5.5	4.9	4.5*	2.0**	0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	2.4±0.12											2.9±0.15
											530/1178	5.7	4.0	5.5	3.7**	2.0**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36		3.3±0.06	42±0.11
530/464	6.0	5.0*	4.7*	1.8**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	＜2.0											2.6±0.10
											530/403	5.7	5.1	4.3	2.9	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36		＜2.0	＜1.7
530/1074	5.1	4.6	4.1*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	3.0±0.13											3.8±0.13
											530/963	5.3	5.0	4.2*	0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36		2.0±0.05	＜1.7
530/653	5.4	5.1	4.5	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36	2.2±0.10											3.1±0.16
											530/1003	5.6	4.1	2.5	2.1**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	35		＜2.0	＜1.7
530/1030	4.3	3.7*	1.7**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	35	＜2.0											1.8±0.13
											530/188	5.0*	1.0*	1.0	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	≤34		＜2.0	＜1.7

n.d.表示未进行

^*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

¹停止生长温度定义为观察到噬斑滴度降低100倍或更高时的最低限制温度(表中的粗体表示)

²在第0天从鼻内给予轻度麻醉的小鼠10^6.3p.f.u，然后在第4天用CO₂窒息杀死小鼠。

表14cpts-530/1009、cp-RSV或野生型RSV A2在血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制诱导出血清中和抗体

用104pfu指定病毒感染动物	给药途径	黑猩猩编号	病毒复制
										鼻咽		气管		鼻溢评分		第28天血清中和抗体滴度倒数8
			时间b(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间b(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	平均值c	峰值
									cpts-530/1009	IN+IT	1	9	3.1	0	＜1.0		0.5	2	1097
IN+IT	2	10	4.0	10a	1.8	0.5	2	416
										IN+IT	3	9	4.0	0	＜1.0	0.8	2	1552
IN+IT	4	9	3.3	0	＜1.0	0.4	1	1176
												平均9.3	平均3.6	平均2.5	平均1.2	平均0.5	平均1.3	平均1060
cpts-530	IN+IT	5	9	3.5	4e	2.6	0.3	1											10085
									IN+IT	6	9	5.2	0	＜1.0	1.1	3	3566
	IN+IT	7	8	3.3	0	＜1.0	0.6	2										588
									IN+IT	8	8	4.4	0	＜1.0	0.5	2	1911
			平均8.5	平均4.1	平均1.0	平均1.4	平均0.6	平均2.0										平均4038
									cp-RSV	IN	9d	20	5.3	8e	2.9	1.0	3		416
IN	10d	16	5.8	6e	3.0	1.8	3	2048
										IN+IT	11d	13	4.3	6e	3.0	0.6	1	776
IN+IT	12d	16	5.0	10e	2.8	0.5	1	891
												平均16	平均5.1	平均7.5	平均2.9	平均1.0	平均2.0	平均1033
A2野生型	IN	13f	9	5.1	13	5.4	1.0	1											1351
									IN	14f	9	6.0	8	6.0	1.7	4	676
	IN+IT	15d	13	5.3	8	5.9	2.1	3										1261
									IN+IT	16d	9	5.4	8	5.6	1.0	3	20171
			平均10	平均5.5	平均9.3	平均5.7	平均1.4	平均2.8										平均5865

aIN表示只进行鼻内给药；IN+IT表示鼻内给药加上气管内给药。

b表示感染后回收得到病毒的最后一天。

c平均鼻溢评分用在病毒被排出的峰值日周围8天的评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。

d动物来自Crowe等，Vaccine 12:691-699(1994)

e只在指定日分离病毒。

f动物来自Collins等，Vaccine 8:164-168(1990)

g在HEp-2细胞培养单层中，以RSV A2的“补体-增强60％的噬斑减少来测定。所有滴定在同一测定中同时进行。第0天时每个动物的滴度倒数(reciprocal)小于10。

表15用cpts-530/1009或cpts-530对黑猩猩进行免疫接种，第28天诱导抗野生型RSV A2病毒侵染的抵抗力。

用来免疫接种的病毒	黑猩猩编号	病毒复制
										鼻咽		气管灌洗		鼻溢评分		指定日d的血清中和抗体(倒数log2)
		时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	平均值a	峰值	第28天	第49或56天
										cpts-530/1009	3	7	2.1	0	＜0.7	0	0	1552	3823
4	0	＜0.7	0	＜0.7	0	0	1176	1911
									cpts-530		5	0	＜0.7	0	＜0.7	0	0	10085	6654
6	0	＜0.7	0	＜0.7	0.3	2	3566	1911
										cp-RSV	11b	5	1.0	0	＜0.7	0	0	776	2048
12b	8	0.7	0	＜0.7	0	0	891	1783
									没有		13b	9	5.1	13	5.4	1.0	1	＜10	1351
14b	9	6.0	8	6.0	1.7	4	＜10	676
										15c	13	5.3	8	5.9	2.1	3	＜10	1261
16c	9	5.4	8	5.6	1.0	3	＜10	20171

a平均鼻溢评分用在病毒排出峰值8天内的评分总数除以8表示。最高评分为4。

b动物来自Crowe等，Vaccine 12:691-699(1994).

c动物来自Collins等，Vaccine 8:164-168(1990).

d这个表中的血清中和滴度(包括那些前述动物)在一个测定中同时进行测定。

       被动获得的血清RSV抗体对黑猩猩中cpts突变株的影响

为了测定被动获得的血清RSV抗体对于本发明各种cpts突变株在黑猩猩体内的减毒性、免疫原性和保护效率的影响，在血清阴性黑猩猩中评价cpts248、cpts248/404和cpts530/1009的体内复制(表16)，该黑猩猩在免疫前两天灌注了RSV免疫球蛋白。将抗体被动地传递入，以模拟婴儿体内环境(婴儿体内有来自母体的RSV抗体)。通过这种方式，就可以评估每个指定突变株在被动RSV抗体存在下的免疫原性，从而确定高度减毒的病毒是否在婴儿中的复制也有如此程度的减毒，婴儿有适中或高的被动抗体滴度故防止了诱导产生保护性免疫应答。通过这种方式也可确定在被动获得的抗体存在下抗体应答免疫的特征，并可确定抗体应答病毒侵染的程度和功能活性。当将那些动物的感染情况与未输注的血清阴性黑猩猩比较时，鼻咽中的病毒复制水平以及相关的减毒突变株的临床评分并未由于血清RSV抗体的存在而改变，或只有少量改变。相反，被动获得抗体的存在会有效地防止下呼吸道中cpts248的病毒复制。由于其它两个突变株在肺中本来就已高度受限制，因此，不能评价被动抗体对那些突变株的相似作用。

人RSV免疫球蛋白的输注产生了中等高的RSV F血清抗体(滴度为1∶640-1∶1600)以及中和抗体(滴度为1∶199-1∶252)，但是没能检测到超过背景的相应量血清RSV G抗体(表17)。在用cpts248/404、cpts530/1009或cpts248进行免疫前先输注人RSV抗体的黑猩猩在接种后42天内只产生了十分之一的RSVF抗体和约一半滴度的中和抗体(与未输注的接种动物在接种后28天时的测试结果相比)。由于输注的人IgG含有大量的RSV F和RSV中和抗体，因此在42天时血清样品中，残余的输注抗体不能与应答免疫接种重新产生的抗体区分开。假定人血清IgG抗体在黑猩猩中的寿命为一半(Prince等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6944-6948)，则在用cpts接种后42天时观察到的F和中和抗体水平要高于预计的剩余输注量。此外，输注抗体的动物免疫接种后产生的RSV G抗体应答确认这些黑猩猩体内建立了对接种的免疫应答反应。

在黑猩猩免疫接种4-6周后用野生型RSV进行侵染。每个动物在其下呼吸道中表现出完全的抵抗力，无论是否在免疫接种前两天输注了人IgG(表18)。未输注的动物产生了抗侵染的适当量的中和抗体应答，或没有产生(表17)。相反，尽管输注后的黑猩猩中病毒复制受到极大地限制，但是它们却一致应答野生型病毒侵染，产生异常高滴度的RSV中和抗体(表17和18)。而且，在抗体存在下进行免疫接种后，最减毒的病毒cpts248/404(病毒复制水平和免疫作用最低)却有最高的侵染后中和抗体滴度(表17)。相反，三组输注动物中接种减毒程度最差的减毒病毒cpts248却有最低的侵染后中和抗体滴度。除了在抗体存在下的免疫接种诱导出的抗体量有所增加外，抗体质量(定义为中和抗体与ELISA F抗体滴度之比)大大超过血清阴性动物中免疫接种作用诱导产生的质量(表17)。输注并免疫接种的动物在侵染后产生的抗体的中和/ELISA F比约比非输注动物中抗体高10-20倍，该现象在所有组中是一致的，无论采用何种突变株来免疫接种(表17)。

在用活病毒疫苗进行免疫接种时，被动获得的抗体的存在可能以三种不同的方式来改变对疫苗的免疫应答。首先，疫苗病毒的复制水平会有显著下降，从而降低免疫原性。这可能是被动获得的RSV抗体限制了疫苗病毒，尤其是最缺陷的突变株的复制，并大大降低它们的免疫原性。这些结果在这里表现为减毒程度最差的突变株(cpts248)在下呼吸道中的复制实际上由于被动获得的血清IgG RSV抗体的存在而被消除；而在上呼吸道的复制看来没有受到明显的影响。测试的减毒程度最低的突变株cpts248在抗体存在下在下呼吸道中的复制受到大于200倍或更多的限制(即完全限制)。减毒程度较高的突变株cpts530/1009和cpts248/404在下呼吸道中的复制水平高度受限制，甚至是在血清阴性动物中也是如此。因此，不能检测到被动抗体对病毒复制的明显效果。用三种减毒突变株的每一种进行免疫接种在上呼吸道和下呼吸道均诱导出了抗野生型侵染的高度保护性，无论在免疫接种时是否存在被动获得的RSV抗体。因此，在被动免疫接种的黑猩猩上呼吸道中，疫苗病毒的复制水平足以诱导出与非输注动物中相当的对野生型病毒侵染的高水平抵抗力。

第二，被动抗体可通过降低诱导出的抗体量和功能活性来改变抗感染的免疫应答。由于这个原因，对应答被动抗体存在下活病毒免疫接种的抗体的数量和性质进行分析。免疫接种的、输注的动物在免疫接种后血清ELISA IgG F抗体的滴度比未输注的血清阴性动物的免疫接种后低10倍。在这些动物中，血清RSV中和抗体应答也稍有降低，平均比未输注动物低2倍。由于免疫接种后测得的一些ELISA F和中和抗体是来自输注的剩余抗体，因此由于预先存在的抗体引起的中和抗体和F抗体应答的实际下降可能比表观下降值更显著。而且，所用的人免疫球蛋白制品含有少量的抗RSV G糖蛋白的抗体(表17)。这可通过用候选疫苗病毒感染的黑猩猩体内IgG RSV G糖蛋白抗体应答来表明(petted)。G抗体应答证明至少有4倍或更多的增加，这表明每个被动免疫接种的动物被疫苗病毒感染，包括用不会排出病毒的cpts248/404免疫接种的黑猩猩。对免疫接种的G抗体应答的数量看来不会受被动传递抗体的不良影响。

第三，在被动获得的抗体存在下进行免疫接种的动物，RSV野生型病毒侵染的抗体应答可以改变。在没有输注抗体存在下进行免疫接种的黑猩猩有显著的抵抗以后RSV侵染的抵抗力。另外，这些动物不能产生对侵染病毒的明显抗体应答。尽管6个输注的免疫接种动物均表现出显著的RSV抗性，但还是发现对攻击有大大增强的抗体应答。在用cpts530/1009或cpts248/404免疫接种的治疗动物中侵染后F或G抗体水平至少增加10倍，而中和抗体应答增加800倍。这些结果表明，在出生后不久就开始用活的减毒突变株对具有母体抗体的婴儿进行免疫接种会刺激产生有效的抵抗力，并会伴有增强的高质量的二次抗体应答。在没有侵染病毒显著复制时，应答二次感染而产生的增强免疫应答的机理还未知道。免疫接种时血清抗体的存在在允许输注动物中有适量抗体应答免疫接种的同时，也促进了B细胞库的产生，该B细胞库使抗体在以后的RSV侵染时能产生高功能活性的抗体。

本文报道的结果是非常显著的，因为第一次表明活的减毒RSV病毒疫苗在动物模型中是有效的，而该动物模型模拟了RSV疫苗目标群体(即从母体胎盘传递而有被动获得RSV中和抗体的4-6周龄婴儿)。这一发现的重要性可以从上述事实可明显看出，即被动传递RSV抗体会抑制cpts疫苗的复制、使其没有免疫原性和保护性的这种预计，令人惊奇地是，并没有得到支持。

表16 RSV cpts-248/404、cpts-248或cpts-530/1009在血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制情况，其中一些黑猩猩在免疫接种前两天用RSV中和抗体输注

动物用104pfu指定病毒感染	免疫接种时血清RSV中和抗体滴度倒数	黑猩猩编号	病毒复制
									鼻咽		气管		鼻溢评分
			时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	平均值	峰值
									cpts-248/404	＜10＜10＜10＜10	17201920	0989(平均4.3)	＜0.7＜0.71.92.0(平均1.3)	0000(平均0)	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7(平均＜0.7)	001(平均0.8)	000.30.2(平均0.1)
142156	2122	00(平均0)	＜0.7＜0.7(平均＜0.7)	00(平均)	＜0.70.7(平均＜0.7)	1(平均1.5)	0.60.1(平均0.4)
								cpts-530/1009		＜10＜10＜10＜10	1234	91099(平均9.3)	3.14.04.03.3(平均3.6)	01000(平均2.5)	＜1.0＜1.＜1.0＜1.0(平均＜1.2)	1111(平均1.0)	0.31.10.60.5(平均0.6)
259190	2324	87(平均7.5)	3.01.2(平均2.1)	00(平均0)	＜0.70.7(平均＜0.7)	11(平均0.1)	0.10.2(平均0.2)
									cpts-248	＜10＜10＜10＜10	25262728	101099(平均9.5)	4.64.54.74.2(平均4.5)	86108(平均8.0)	5.42.22.12.2(平均3.0)	1111(平均1.0)	0.20.10.10.1(平均0.1)
290213	2930	1316(平均14.5)	4.24.7(平均4.5)	00(平均0)	＜0.7＜0.7(平均＜0.7)	3(平均2.5)	0.40.9(平均0.7)

表17在被动传递的抗体存在或不存在下，在第0天用RSV cpts-248/404、cpts-248或cpts-530/1009免疫接种的黑猩猩在4-6周后用野生型RSV A2侵染时的血清抗体应答

			RSVF				RSVG				中和3
																	动物用指定病毒感染	动物编号	抗体输注	研究前	第0天(抗体输注48小时后)	免疫接种后1	侵染后28天2	研究前	第0天(抗体输注48小时后)	免疫接种后1	侵染后28天2	研究前	第0天(抗体输注48小时后)	免疫接种后1	侵染后28天2	F	G
cpts-248/404cpts530/1009cpts-248	424242	否是否是否是	＜40＜40＜40＜40＜40＜40	＜401.600＜401.600＜40640	6.4006406.4006407.8401.600	2.56025.60010.24010.2406.4005.400	60100＜4040＜4040	60100＜40100＜4040	1.0001.60010.2404002501.600	1.60021.7602.56010.2402.5605.440	＜10＜10＜10＜10＜10＜10	＜10199＜10225＜10252	20811125652147119	36292.6812.52137.64133826.616	0.24.31.03.70.14.9	0.13.60.33.70.14.9

1免疫接种后测定滴度的日子也是进行侵染的日子，即对于未输注抗体的动物为第28天，对于输注抗体的动物为第42天。

2测定侵染后第28天取出的样品的数值。对于未输注抗体动物，侵染在免疫接种后第28天进行，对于输注的动物来说在免疫接种后第42天进行。

3通过HEp-2细胞培养单层中RSV A2的补体增强的60％噬斑减少来测得。中和抗体滴度用两个测试的平均值表示。

表18用RSV cpts-248、cpts-248/404或cpts-530/1009免疫接种的黑猩猩诱导出抗4-6周后对野生型RSV A2侵染的抵抗力。

用来免疫接种的病毒	被动输入RSV抗体存在与否	黑猩猩编号	RSVA2侵染病毒的复制a
									鼻咽		气管		鼻溢评分
			时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	平均值b	峰值
									cpts-248/404	否否是是	17c18c2122	0860	＜0.73.42.7＜0.7	0000	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7	000.50	0020
cpts-530/1009	否否是是	12324	7067	2.1＜0.72.52.0	0000	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7	000.50.2	0011
									cpts-248	否否是是	25c26c2930	5906	2.71.8＜0.72.4	0000	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7	0001.2	0003
没有	否否否否	13d14d15c16c	99139	5.16.05.35.4	13888	5.46.05.95.6	1.01.72.11.0	1433

a在4-6周前用指定病毒免疫接种的动物用10⁴pfu的RSV A2野生型病毒侵染。

b平均鼻溢评分用在病毒排出峰值8天内的评分总数除以8表示。

c动物来自Crowe等，Vaccine 12:691-699(1994).

d动物来自Collins等，Vaccine 8:164-168(1990).

                              实施例Ⅱ

                    用冷适应来使cpRSV突变株减毒

本实施例描述了通过在逐渐降低的温度下使株系进一步传代将生长限制突变引入不完全减毒的宿主范围受限制的cpRSV株中，以产生更具令人满意的减毒性的人疫苗用衍生株。

这些冷适应(ca)方法用来在血清阴性儿童体内不完全减毒的cpRSV3131病毒中进一步引入减毒。

在第一种策略中，如实施例1所述，通过在MRC-5细胞中25℃下传代来制备冷传代RSV A2(cpRSV3131)(从Flow Laboratories获得)的亲代原种。简单地说，是以≥0.01的感染复数将冷传代病毒接种入MRC-5或Vero细胞培养单层中，在下次传代前培育感染的细胞3-14天。使病毒在20-22℃下传代超过20次，以获得更减毒的病毒。迅速传代的方法(一旦有迹象表明病毒复制时(即3-5天)立即传代)适于用来选择能在低温下有效复制的突变株。另外，从非洲绿猴原代肾细胞中分离获得RSV亚组B株(St.Louis/14617/85克隆1A1)，使其在MRC细胞中传代并克隆(1A1-MRC14)，并在32-22℃下在MRC-5或Vero细胞中冷传代52次。

第二种策略采用未克隆的亲代cpRSV3131病毒的生物克隆衍生株。该病毒在牛胚胎肾细胞(BEK)[用来最初获得cpRSV3131病毒的组织，参见Friedewaid等，J.Amer.Med.Assoc.204:690-694(1968)]中进行生物克隆。然后使克隆的病毒在低温下Vero细胞中每隔10天传代。或者，通过在MRC-5细胞中连续两次末端稀释来克隆cpRSV3131，并在MRC-5或Vero细胞中每隔10天传代一次。

第三种策略包括选择低温下生产大噬斑的突变株。已经鉴定出在25℃下产生大噬斑的一个RSV3131衍生病毒，称为噬斑D1。该病毒衍生自cpRSV3131-1(BEK)谱系cpRSV3131-17(BEK)谱系的第三次传代水平(P3)。使P3病毒产生的最大噬斑在32℃下扩增，然后在25℃下再次产生噬斑。再次选择最大的噬斑，扩增，再产生噬斑。在经过5轮后，获得大噬斑的突变病毒D1。D1通过25℃下两轮附加的噬斑到噬斑纯化来生物克隆。

生物克隆病毒D1在25℃下产生了明显比cp3131或野生型病毒A2大的噬斑。这样，依靠25℃下有大噬斑的标准，D1具有冷适应性。噬斑形成效率的研究结果证明，D1不是温度敏感的。在37℃,D1噬斑与野生型RSV或cp3131没有区别，这表明D1在该温度下的生长不受限制。同样，D1在37-40℃(即测试的最高温度)在Vero细胞单层中也产生了广泛的致细胞病变效应。

                             实施例Ⅲ

                     将其它减毒突变引入tsRSV

本实施例描述了用ts突变株作为亲代病毒，以产生减毒更完全的病毒株。为了该目的，选择两个RSV A2ts突变株，即ts-4和ts-1 NG1。选用两种不同的方法来将附加突变引入RSV ts突变株中。第一种方法是：对不完全减毒的RSV ts突变株进行化学诱变，选择噬斑形成温度更敏感的诱变子代进行进一步的分析。第二种方法是：使RSV ts突变株在低温下传代，选择有ca表型的ts突变株，即在次优温度下复制能力高于野生型亲代病毒的突变株。

从Flow Laboratories Lot M4的活的呼吸道合胞病毒(A-2)ts-1 NG-1突变株、MRC-5中生长的病毒中制备ts-1 NG1病毒的亲代原种。该突变株(通过二轮硝基胍诱变从ts-1突变株衍生获得)有两个或多个非依赖型ts突变，但仍会在易感黑猩猩中诱导出显著的鼻溢。使该病毒在32℃下Vero细胞中传代2次，以产生用于诱变的ts-1 NG-1悬液。然后使病毒在4×10^-4M 5-氟尿嘧啶存在下生长以在复制时诱导其它的突变，或在5-氟尿嘧啶处理后在36℃暴露在5-氮胞苷下。然后在维持在琼脂铺层下的Vero细胞上进行噬斑测定来分析诱变的原种，并在培育适当时间后，用显微镜鉴定噬斑。挑取586个噬斑，使每个噬斑的子代在Vero细胞的新鲜单层上生长来分别扩增。当Vero细胞上的致细胞病变效应达到最大时，分别收获接种有诱变的ts-1 NG-1病毒单个噬斑子代的每个组织培养物。在32℃和36℃下在HEp-2细胞上对这些噬斑库进行滴定，选出比ts-1 NG-1更温度敏感型的子代病毒。进一步对所有温度敏感性高于ts-1 NG1(即，与32℃时的相比，在限制性温度[36℃]下的滴度减少100倍或更多)的病毒进行评价。鉴定温度敏感性高于tsRSV ts-1 NG-1亲代病毒的6个噬斑子代，使这些株在Vero细胞上连续噬斑纯化三次来进行生物克隆，然后在Vero细胞上扩增。在32℃、35℃、36℃、37℃和38℃下滴定克隆株(噬斑形成效率(EOP)测定)以确认它们的ts表型。在HEp-2细胞中测定获得噬斑形成效率数据进一步确认了6个突变株的表型(表19)

两个温度最敏感的病毒A-20-4和A-37-8在小鼠中的减毒程度高于它们的ts-1NG1亲代病毒，这表明温度敏感性的增加伴随有减毒的增强(表20)。这些病毒对小鼠具有感染性，因为它们诱导了抗体应答。对于黑猩猩来说，ts-1NG1/A-20-4病毒是减毒的(表21)，而且用ts-1 NG1/A-20-4感染黑猩猩可诱导出对野生型病毒侵染的抵抗力(表22)。没有明显的鼻溢发生。

用ts-1 NG1病毒诱变的相同方法来诱变ts-4病毒。也用冷传代来将突变引入ts-4病毒。在22℃下冷传代43次后，ts-4病毒复制形成高滴度。鉴定6个比RSVts-4亲代病毒更具温度敏感性的噬斑子代(表23)。ts-4 cp-43在Balb/c小鼠中的复制更受限制(表24)。

表19ts-1NG1衍生株的噬斑形成效率

病毒	指定温度下的滴度(log10pfu/ml)
							32℃	35℃	36℃	37℃	38℃
A-204(4-1)aA-37-8(1-2)aA-15-7A-25-8A-21TS1NG1	5.9*6.33.55.35.1**6.6	＜16.3NDNDND6.6	＜1＜12.15.0*4.8**6.5	＜1＜11.54.8*4.5**6.6	＜1＜1＜1＜1＜1＜1

a.3次噬斑纯化

^*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

ND=未进行

表20ts-1 NG1亲代和子代病毒在Balb/c小鼠中的复制

病毒	剂量(log10pfu)	感染后天数	肺中的滴度		肺中的滴度
										32℃	38℃	32℃	38℃
A2野生型Ts1NG1Ts1NG1/A-20-4Ts1NG1/A-37-8	6.15.86.16.3	45454545	4.66±0.32a5.18±0.334.31±0.173.98±0.12＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0	4.80±0.165.25±0.23＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0	3.18±4.03.40±2.02.82±0.252.74±0.31＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0	3.29±0.333.47±0.17＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0

^a指定组织的log₁₀pfu/g平均值±标准差。6个动物/组

表21ts-1 NG1/A-20-4、ts-1 NG1、ts-1或野生型RSV A2在血清阴性黑猩猩上呼吸道和下呼吸道中的复制

用指定病毒感染动物	接种途径	黑猩猩编号	病毒复制
									鼻咽		气管		鼻溢评分
			时间b(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间b(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	平均值e	峰值
									ts-1NG1/A-20-4	IN+ITIN+ITIN+ITIN+IT	15161718	00016d平均4.0	＜0.7＜0.7＜0.72.7平均1.2	0000平均0	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7	0000平均0	0000平均0
ts-NG1	ININININ	19e20e21e22e	871310平均9.5	4.23.95.45.2平均4.7	00010d平均2.5	＜1.1＜1.1＜1.13.7d平均1.8	0.60.70.40.6平均0.6	111平均1.3
									ts-1	ININININ	23e24e25e26e	16131310平均13	3.44.45.03.4平均4.1	0013d0平均3.3	＜1.1＜1.12.2＜1.1平均1.4	0.41.02.01.0平均1.1	1342平均2.5
A2野生型	INININ+ITIN+IT	9b10b11e12e	99139平均10	5.16.05.35.4平均5.5	13888平均9.3	5.46.05.95.6平均5.7	1.01.72.11.0平均1.4	1433平均2.8

aIN表示只进行鼻内给药；IN+IT表示鼻内给药加上气管内给药。

b表示感染后回收得到病毒的最后一天。

c平均鼻溢评分用在病毒排出的峰值日周围8天期间的评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。

d只在指定日分离病毒。

e动物来自Crowe等，Vaccine 11:1395-1404(1993)。

表22用10⁴pfu的RSV ts-1 NG1/A-20-4、ts-1 NG1或ts-1对黑猩猩进行免疫接种诱导出对第28天10⁴pfu RSV A2野生型病毒侵染的抵抗力

		病毒回收				鼻溢评分		指定日b的血清中和抗体滴度(倒数log2)
												鼻咽		气管
用来免疫接种动物的病毒	黑猩猩编号	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)											平均值a	峰值	第28天	第49或56天
						ts-1NG1/A-20-4	15161718	0003平均0.8	＜0.7＜0.7＜0.72.0平均1.0	0000平均0	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7	0000平均0	0000平均0	＜3.3＜3.35.38.2平均5.0	10.711.910.311.8平均11.2
ts-1NG1ts-1没有	19b20b21b22b	0000平均0	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7	0000平均0	＜1.1＜1.1＜1.1＜1.1平均＜1.1											0000平均0	0000平均0	11.112.710.810.0平均11.1	9.89.111.08.6平均9.6
						23b29b25b26b	0055平均2.5	＜0.7＜0.70.70.7平均0.7	0000平均0	＜1.1＜1.1＜1.1＜1.1平均＜1.1	0000平均0	0000平均0	9.412.49.013.4平均11.0	10.512.89.612.0平均11.2
	9c10c11b12b	99139平均10	5.16.05.35.4平均5.5	13888平均9.3	5.46.05.95.6平均5.7										1.01.72.11.0平均1.5	1433平均2.8	＜3.3＜3.3＜3.3＜3.3平均＜3.3	11.09.89.414.5平均11.1

a平均鼻溢评分用在病毒排出的峰值日周围8天期间的评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。

b动物来自Crowe等，Vaccine 11:1395-1404(1993)。

c动物来自Collins等，Vaccine 8:164-168(1990)。

d该表中的血清中和滴度在新的测定中与表中其它样品同时进行测定。

表23从RSV ts-4衍生获得的6个突变株的噬斑形成效率，并在HEp-2细胞中允许温度和限制温度下进行测试，与对照比较

指定温度(℃)下的病毒滴度(log10pfu/ml)
												病毒	32	33	34	35	36	37	38	39	40	32℃下的小噬斑	停止生长温度(℃)1
A2野生型ts-4	5.74.5	5.84.7	5.54.4	5.54.7	5.34.7	5.54.1	5.53.7	5.43.0	5.52.5	否否	＞4040
												ts-4cp-43ts-4/20.7.1ts-4/19.1.2ts-4/15.8.2ts-4/29.7.4ts-4/31.2.4	6.26.05.85.3*5.74.7	6.15.95.75.4*5.64.2	6.15.75.5*4.8*5.64.1	6.05.7*5.6*4.9*5.7*4.0*	4.4*4.5**4.4**2.8**＜0.7＜0.7	4.2**1.8＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7	1.7**＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7	＜0.7**＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7	＜0.7**＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7	否否否是否否	373737363636

1停止生长温度定义为观察到噬斑滴度降低100倍或更多的最低限制温度(表中的粗体表示)

^*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

表24 RSV ts-4和RSV ts-4 cp-43在Balb/c小鼠¹中的复制：

		病毒滴度(6个动物的log10pfu/g平均值±标准差)
				用来感染动物的病毒	病毒的停止温度(℃)	鼻甲	肺
A2野生型ts-4ts-4 cp-43	＞403937	5.0±0.144.3±0.092.1±0.09	5.2±0.054.7±0.112.7±0.27

¹在第0天从鼻内给予轻度麻醉的小鼠10^6.3p.f.u，然后在第4天用CO₂窒息杀死。

                         实施例Ⅳ

                    RSV亚组B的候选疫苗

本实施例描述RSV亚组B病毒候选疫苗的开发。将本发明中开发亚组A突变株的相同方法用于亚组B病毒。使野生型B-1 RS病毒的亲代原种在低温(20-25℃)下Vero细胞中冷传代52次，并在第19和52次传代时对病毒进行噬斑纯化。分别评价衍生自52次传代的悬液的三个克隆，选择一个克隆(命名为RSV B-1cp52/2B5)来作进一步的评价，因为该克隆在棉鼠的上呼吸道和下呼吸道中是高度减毒的(表25)。对cp RSV B-1病毒不同传代水平的几个克隆的评价结果表明，RSV B-1cp52/2B5突变株具有多个单独对其减毒表型有贡献的突变。RSV B-1cp52/2B5突变株在免疫抑制的棉鼠中延长复制后仍保留了减毒表型(表26)。这一高度遗传稳定性的发现与它具有三个对减毒表型有贡献的突变的事实是相符的。

在加勒比绿猴(表27和28)和黑猩猩(表29)中对亚组B突变株作进一步评价，以用亚组A突变株的相同方法对其进行特征分析。用RSV B-1 cp-23或cp52/2B5免疫接种的猴对RSV B-1野生型病毒的复制有抵抗力，这表明用RSV B-1野生型病毒的高度减毒衍生株来感染可诱导出对野生型病毒侵染的抵抗力(表27)。

血清阴性黑猩猩中的结果与绿猴中的一样明显证明在上呼吸道和下呼吸道中RSV B-1cp52/2B5的减毒性。

用5-氟尿嘧啶进一步诱变RSV B-152/2B5突变株，挑取获得的噬斑，并在32到38℃下筛选ts表型。使选定的cpts突变株在Vero细胞中噬斑纯化三次，然后在Vero细胞中扩增二次。结果，鉴定出7个RSV B-1cp52/2B5的cpts突变株(表30)，对它们在棉鼠中的复制水平进行研究(表31)。对这些突变株中的一个(即cpts176)进行进一步诱变，获得一系列比RSV B-1cpts176亲代病毒在体外更温度敏感的突变衍生株(表32)。

与本发明的亚组A突变株一样，亚组B突变株有感染性，并在棉鼠、猴和黑猩猩中有显著程度的减毒。尽管RSV B-1cp突变株病毒有体内减毒性，它还是能在猴中诱导出对野生型病毒侵染的抵抗力。RSV B-1 cpts52/2B5病毒的ts突变株是减毒的，并且表现出在棉鼠的鼻咽和肺中的复制水平比RSV B-1 52/2B5亲代病毒更受限制。

表25在两个单独的实验中将RSV B-1野生型病毒在棉鼠中的复制与5个衍生自RSV B-1的噬斑纯化的冷传代突变株比较

	第4天时病毒回收(log10pfu/g组织)
					在第0天用来感染动物的病毒**	鼻甲		肺
试验1	试验2	试验1	试验2
				RSVB-1野生型RSV B-1 cp-12/B1ARSV B-1 cp-23RSV B-1 cpsp-52/1A1RSV B-1 cp-52/2B5RSV B-1 cp-52/3Cl		4.7±0.14ndnd1.7±0.111.8±0.251.8±0.14	5.1±0.103.3±0.112.4±0.362.1±0.272.2±0.3nd	5.4±0.15ndnd3.0±0.131.8±0.111.8±0.14	5.8±0.084.4±0.103.2±0.312.3±0.071.5nd
RSV A2RSV A2cpts530/1009	5.9±0.093.2±0.11	5.4±0.072.1±0.22	6.6±0.062.1±0.19		6.1±0.061.7±0.12

^*病毒回收通过滴定Vero细胞培养单层上组织匀浆物测得，实验1中在32℃下培育10天，实验2中培育7天。

^**棉鼠用10^5.5pfu的指定病毒经鼻内感染。

nd=未做

表26来自RSV B-1cp52/2B5感染的免疫抑制棉鼠的第14天分离物^*中病毒在棉鼠中的生长与对照比较

病毒回收
						第4天时指定组织中的病毒滴度(log10pfu/g组织的平均值±标准差)		RSV B-1野生型(log10pfu/g)
感染动物的病毒a	鼻甲b	肺c	鼻甲	肺
					RSV B-1野生型RSV B-1cp52/2B5分离物1分离物2分离物3分离物4分离物5分离物6分离物7	3.9±0.03(6/6)2.0±0.07(8/8)1.5±0.07(5/8)1.5±0.13(6/8)1.5±0.16(3/8)1.3±0.09(4/8)1.2±0.00(2/8)1.2±0.00(3/8)1.3±0.06(3/8)	4.8±0.12(6/6)＜1.5(0/8)1.5±0.04(1/8)＜1.5(0/8)＜1.5(0/8)＜1.5(0/8)＜1.5(0/8)＜1.5(0/8)＜1.5(0/8)	--1.92.52.42.52.62.72.72.7	--＞3.33.3＞3.3＞3.3＞3.3＞3.3＞3.3＞3.3

^*分离物是在第14天时，免疫抑制棉鼠的初始鼻甲匀浆物中的病毒进行一次Vero细胞组织培养传代扩增后获得的病毒悬液。

^a第8组棉鼠在第0天用10^5.5pfu指定病毒的0.1ml接种物感染。

^b()表示在1.2 log₁₀pfu/g或更高时检测到有病毒的动物数。

^c()表示在1.5 log₁₀pfu/g或更高时检测到有病毒的动物数。

表27 RSV A2和RSV B-1野生型在加勒比绿猴中的复制与衍生自RSV B-1的两个冷传代突变株比较，然后用同源或异源RSV A2或B-1野生型侵染

用来在第0天感染动物的病毒a	免疫接种				病毒侵染	侵染
								NP拭子		气管灌洗		NP拭子	气管灌洗
	峰值滴度b	消除天数b	峰值滴度	消除天数		峰值滴度b	消除天数b
								A2B-1B-1 cp-23B-1 cp-52	3.43.53.33.21.73.52.44.2平均3.22.82.32.22.21.62.1平均2.21.81.32.01.7平均1.71.31.31.30.7平均1.2	979861089平均8.399798*10平均8.714584平均7.88473*平均5.5	＜0.7＜0.74.80.7＜0.7＜0.70.7＜0.7平均1.21.51.91.71.31.21.7平均1.6＜0.7＜0.70.7＜0.7平均＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7	00107000010*710*10*5*7*001000000	A2A2A2A2B-1B-1B-1B-1B-1B-1B-1B-1A2A2B-1B-1B-1B-1B-1B-1B-1B-1	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7	＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7平均＜0.7

^a动物在第一天进行气管内和鼻内感染，每个部位均用10^5.5p.f.u.病毒的0.1ml接种物。

^bLog10pfu/ml滴度通过噬斑试验来测得，RSV A2在HEp-2细胞培养单层上测定，RSV B-1及其衍生株在Vero细胞培养单层上测定。

^*只在指定日检测病毒

表28用RSVA2、RSVB-1或B-1cp衍生株感染加勒比绿猴，然后在一个月后用同源或异源野生型病毒侵染的中和抗体应答

		抗指定病毒的60％噬斑减小血清中和滴定(倒数平均值)
								RSV A2			RSV B-1
		第0天用指定病毒感染动物(动物数)	第28天侵染用病毒(动物数)	第0天	感染后(第28天)	侵染后(第56天)	第0天							感染后(第28天)	侵染后(第56天)
A2(8)	A2(4)B-1(4)							＜10	53,232	40,34223,170	＜10	1,552	1,9111,911
		B-1(6)	B-1(4)A2(2)	＜10	3,327	3,822	＜10							2,048	2,521
B-1 cp23(4)	B-1(4)							＜10	6,208	10,086	＜10	4,750	7,132
		B-1 cp-52/2B5(4)	B-1(4)	＜10	194	16,384	＜10							239	3,822

表29在气管内和鼻内给药^a后血清阴性黑猩猩中RSV B-1或RSV B-1 cp-52的复制

			病毒复制
									第0天用指定病毒感染动物	感染剂量(pfu)	试验编号	鼻咽		气管		鼻溢评分
时间b(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	时间b(天)	峰值滴度(log10pfu/ml)	峰值	平均值c
						RSVB-1野生型	104105	1				9	3.7	8	3.2	1	0.5
1	10	3.5	0	＜0.7	2				0.9
								1		10	2.8	0	＜0.7	3	1.1
1	10	2.7	8	3.4	3				0.9
										平均9.8	平均3.2	平均4.0	平均2.0	平均2.3	平均0.9
2	7	2.8	8	1.0	1				1.0
								2		7	3.3	4	3.9	3	1.3
	平均7.5	平均3.1	平均6.0	平均2.5	平均2.0				平均1.1
								B-1 cp-52/2B5		104105	1	5	1.5	0	＜0.7	0	0
1	0	＜0.7	0	＜0.7	0	0
							3		0		＜0.7	0	＜0.7	0	0
3	0	＜0.7	0	＜0.7	0	0
									平均1.2		平均0.9	平均0	平均＜0.7	平均0	平均0

^a这些数据来自三个单独的实验的组合，第一个实验中指定病毒的感染剂量为10⁴，第二和第三个实验中为10⁵。

^b表示感染后回收病毒的最后一天。

^c平均鼻溢评分用病毒排出的峰值日周围8天期间的评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。

表30衍生自RSV B-1 cp52/2B5的8个突变株的噬斑形成效率

指定温度(℃)下Vero或HEp-2细胞中的噬斑滴度(log₁₀pfu/ml)

	Vero	HEp-2						HEp-2停止生长温度(℃)
									RSV	32	32	35	36	37	38	39
B-1野生型	6.1	5.8	5.7	5.6	5.6	5.7	5.5	＞39
									B-1 cp52/2B5	5.9	5.4	5.2	5.1	5.0	5.0	4.7**	＞39
cpts452	6.1	5.6	5.2	5.2	3.3**	3.1**	＜0.7	37
									cpts1229	5.7	5.1	4.9	5.1	4.4**	＜0.7	＜0.7	38
cpts1091	5.7	5.1*	4.7**	5.2**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37
									cpts784	5.1	4.3*	4.0**	4.1**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37
cpts176	6.1	5.4*	4.8*	5.0**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37
									cptssp1415a	5.8	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	38
cpts1324	5.9	5.1	5.0*	5.0	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37
									cpts1313	5.7	3.9**	3.0**	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36
AS	6.4	6.3	6.3	6.3	6.3	6.3	6.3	＞39
									A2/248	6.3	6.3	6.2	6.3	5.8	＜0.7	＜0.7	38
A2/248/404	4.4	4.3	3.3	4.0	＜0.7	＜0.7	＜0.7	37
									A2/248/955	4.8	4.8	4.8	4.4	＜0.7	＜0.7	＜0.7	3

^*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

^a32℃下没有发现噬斑。因此噬斑形成效率试验不能确定病毒停止生长温度。指定突变株在HEp-2细胞培养中的停止生长温度为38℃，在液体培养基铺层中测得病毒产量(TCID₅₀)降低100倍。

粗体数字表示停止生长温度(定义为观察到噬斑滴度降低100倍或更多时的最低限制温度)。

表31衍生自RSV B-1 cp-52/2B5的7个ts突变株在棉鼠中的复制水平

在棉鼠中的复制(6个动物log10pfu/g组织平均值±标准差)
	RSV                 鼻甲                    肺
B-1野生型         4.3±0.05  (6/6)2      4.4±0.25 (6/6)B-1cp52/2B5       1.7±0.11  (6/6)         ＜1.5    (0/6)
	cpts452       1.4±0.1       (3/6)       ＜1.5      (0/6)cpts1091      1.7±0.07      (4/6)       ＜1.5      (0/6)cpts784       1.5            (1/6)       ＜1.5      (0/6)cpts1229      1.4±0.15      (3/6)       ＜1.5      (0/6)cpts176       1.5±0.17      (3/6)       ＜1.5      (0/6)cptssp1415    ＜1.2          (0/6)       ＜1.5      (0/6)cpts1324      ＜1.2          (0/6)       ＜1.5      (0/6)

¹在第0天轻度麻醉的棉鼠鼻内接种4.5-5.8log₁₀pfu，然后在第4天用CO₂窒息杀死。

²只含病毒的样品的滴度。括号表示含有病毒的样品的级分。

表32衍生自RSV B-1 cpts176的14个突变株的噬斑形成效率与对照的比较

在体外HEp-2细胞培养单层中的噬斑形成效率

指定温度(℃)下的病毒滴度(log10pfu/ml) 停止生长温度
	RSV         32       35       36        37        (℃)1
B-1野生型     5.6      5.5      5.4        5.3       ＞39B-1 cp52/2B5  5.7      5.7      5.6        5.3       ＞39B-1 cpts176   5.5      3.5      3.0        1.9       36/37
	176/645      3.8      3.0      2.6**     ＜0.7      37176/860      3.1      2.5      2.4        ＜0.7      37176/196      3.3      2.5      2.0**     ＜0.7      37176/219      2.6      2.3      2.0**     ＜0.7      37176/18       4.0      3.2      ＜0.7      ＜0.7      36176/73       2.6      2.0      ＜0.7      ＜0.7      36176/1072     3.2      2.3      ＜0.7      ＜0.7      36176/1038     2.8      2.2      ＜0.7      ＜0.7      36176/81       2.2      2.0      ＜0.7      ＜0.7      36176/1040     3.2      2.0      ＜0.7      ＜0.7      36176/1045     2.5      1.9      ＜0.7      ＜0.7      36176/517      3.1      2.0**   ＜0.7      ＜0.7      36176/273      2.3      ＜0.7    ＜0.7      ＜0.7      35176/427      3.5      ＜0.7    ＜0.7      ＜0.7      35

^**针尖形噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)

¹停止生长温度定义为观察到噬斑滴度降低100倍或更多时的最低限制温度(表中的粗体表示)。

为便于评价和操作RSV B亚组候选疫苗，测定了野生型B-1病毒的全部核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。将该序列与上述的减毒B-1衍生株cp-52/2B5(cp-52)的序列进行比较。该序列分析揭示了在cp-52中有跨越大部分SH和G基因的大缺失，两个基因均没有预计的ORF。更具体地说，缺失了大部分跨越cp-52病毒的SH和G基因的区域，而只保留了SH基因的起始信号和G基因3＇端部分(下游)及其基因末端信号。剩余的SH:G区可以编码一个没有ORF的约91个核苷酸的嵌合转录物。cp-52的Northern印迹分析确认了多个独特的多转录物含有SH:G连读mRNA，这与跨越SH:G基因接头的缺失突变一致。Western印迹和免疫染色测定确认了cp-52病毒没有产生完整的G糖蛋白。除了有较长的缺失外，cp-52病毒还含有7个核苷酸差别(表33)，其中5个是编码改变(1个在F基因内，4个在L基因内)，一个是沉默(F基因内)，一个在非编码的G:F基因间隔区内。重要的是，尽管该RSV突变株缺失了SH和G蛋白，但它仍保留了在组织培养物中的高度感染性。这些数据确定了一类新的有复制能力的缺失突变株，它为开发重组RSV候选疫苗提供了其它或组合方案。

表33 RSV B1和cp-52的序列比较

基因	基因组位置	核苷酸*		氨基酸变化(#)
						S1 cp-52↑		B1→cp-52
		G/F	5626	C	A**					非编码基因间隔区
F	6318					A	G	Glu→Gly	(218)
			6460	U	C**					沉默	(265)
L	10973					G	A	Arg→Lys	(822)
			13492	A	C					Asn→His	(1622)
	14164					U	A**	Leu→Ile	(1886)
			14596	U	C**					Phe→Leu	(2030)

^*正义(+)

↑cp-52中跨越SH和G基因的核苷酸位置4249-5540缺失。

^**cp-23中的突变

在cp-52传代史中不同传代水平的分离获得的其它亚组B突变株中有不同的cp-52突变，这由传代水平确定(表34)。在本文中典型的亚组B突变株包括RSV B-1cp-12、RSV B-1 cp-23、RSV B-1 cp-32、RSV B-1 cp-42。表34显示了(反义)这些特定突变在典型的B亚组突变株中的分布。突变的不同分布可以更精确地确定这些突变在指定株中的减毒效果。例如，cp-23有cp-52中发现的核苷酸5626、6460、14164和14596处的突变(表34)，但是在SH和G基因区(cp-52中缺失)与亲代B-1野生型株没有不同。cp-42中有与cp-52相同的SH和G基因缺失，但是cp32的SH和G基因内却有不同的序列缺失。

                                        表34

                              RSVB1、RSVB1cp12、cp23、cp32、

                                cp42和cp52间的序列比较

核苷酸变化基因组(-)意义
									基因	核苷酸位置	RSVB1	RSVB1CP12	RSVB1··CP23	RSVB1CP32	RSVB1CP42	RSVB1·CP52	氨基酸变化
G/F	5626	G	G	T	T	*ND	T	非编码1Gr
									F	6318	T	ND	T	T	ND	C	Glu→Gly(218)
	6460	A	A	G	G	*ND	G	沉默(265)
									L	10973	C	ND	C	C	T	T	Arg→Lys(822)
	13492	T	ND	T	T	T	G	Asn→His(1662)
										14164	A	A	T	T	T	T	Leu→Ile(1886)
	14592	A	G	G	G	G	G	Phe→**Leu(2030)

·在cp52中跨越SH和G基因的核苷酸区(位置4249-5540)缺失。

··在cp52缺失的SH和G基因区中没有发现与B1亲代有核苷酸差别。

^*这些核苷酸很可能与cp23和cp52中的相同。

^**在RSV2B中也发现了L聚合酶中氨基酸位置2030处的亮氨酸。

                              实施例Ⅴ

                         二价RSV亚组A和B疫苗

对亚组A和B病毒的研究证明，在体外Vero细胞培养单层中，野生型A2和B-1病毒间，以及cpts530/1009和RSV B-1 cp52/2B5衍生株间不发生干扰。表34中表示了棉鼠中二价感染的体内结果。这些结果确认了体外研究结果，它们显示了A-2和B-1野生型RSV间以及cpts530/1009和RSV B-1 cp52/2B5间没有干扰。因此，预计每个疫苗病毒会诱导出抗野生型病毒的同型免疫力，因为二价疫苗的每个组分在双重感染时的复制水平上与单个感染观察到的相当。每个病毒均可单独诱导出抗RSV野生型侵染的同型抵抗力。

表35用RSV A2和RSV B-1二价感染棉鼠

病毒或突变衍生株表明没有体内干扰

用来感染动物的病毒*	从指定组织中回收病毒(log10pfu/g)
					鼻甲		肺
	RSV A滴度	RSV B滴度	RSV A滴度	RSV B滴度
					A2	5.4±0.08	-	5.8±0.07	-
B-1	-	4.6±0.03	-	5.4±0.12
					A2+B-1	5.2±0.11	3.6±0.07	5.7±0.08	5.4±0.05
A2 cpts530/1009	3.2±0.09	-	1.9±0.15	-
					B-1 cp52	-	2.4±0.08	-	＜1.5
A2 cpts530/1009+B1 cp-52	2.8±0.13	2.0±0.14	1.8±0.08	＜1.5

^*在第0天一组六个动物用10⁵pfu的0.1ml接种物进行鼻内感染。

                            实施例Ⅵ

                聚合酶(L)基因内的单一突变引起ts表型

本实施例描述了聚合酶基因(L)中的特定突变，该突变通过对不完全减毒的宿主限制性cpRSV的化学诱变来产生，从而产生了更高减毒而稳定的、适用于RSV疫苗制备的ts株cpts248和cpts530。如上述实施例所述，已经发现cpts248具有减毒性、免疫原性和在血清阴性黑猩猩中抗野生型侵染的完全保护性，并且在体内复制时比以前评价的tsRSV突变株更具遗传稳定性。如上所述，对cpts248株进行化学诱变以进一步降低剩余的反应原性，产生一系列具有温度敏感性增加、噬斑较小的表型的突变株，包括cpts248/404。同样，从cpts530衍生获得cpts530/1009。

通过将cpts248和cpts530病毒的全部基因组序列与以前测得的cpRSV亲代病毒的序列进行比较，确定这两种病毒的减毒性增加和ts表型的遗传基础。测定cpRSV的全部核苷酸序列并与RSV A2野生型病毒(实验株，并不是直接传代链系的部分)及其低温传代的野生型亲代病毒(RSV A2/HEK7)的序列比较。cpRSV与其RSV A2/HEK7亲代病毒在5个核苷酸上不同，一个在核蛋白(N)基因中、两个在融合蛋白(F)基因中、两个在聚合酶(L)基因中。测定cpts248、cpts248/404、cpts530、cpts530/1009和cpts530/1030的全部15222个核苷酸序列以及氨基酸序列。

实施例1中描述了用随机化学诱变来从cpRSV亲代衍生获得RSV突变株cpts248和cpts530。用来感染细胞生产病毒而可用作纯化病毒RNA来源的病毒悬液是含有病毒的澄清的组织培养上清液，该病毒已经在Vero细胞培养单层的液体培养基中传代四次，然后进行生物克隆(即，在琼脂中的Vero细胞单层中进行三次噬斑到噬斑的传代)。

用cpts248、cpts248/404、cpts530、cpts530/1009或cpts530/1030病毒以0.1的感染复数(moi)感染单层细胞。当发现有适量的CPE时(平均为感染后的4-5天)，从感染的细胞单层中制得总的RNA。吸弃上清液，通过异硫氰酸胍水解来收获感染的细胞单层，然后进行苯酚-氯仿抽提。用SuperscriptⅡ TM逆转录酶(LifeTechnologies)随机六聚体引物来逆转录RNA，反应条件按照生产商提供步骤。

用TE-100自旋柱(Clontech,Palo Alto,CA)来分离获得的cDNA和引物，将cDNA作为模板用于聚合酶链反应(PCR)以产生一系列的跨越整个RSV基因组的10个重叠的cDNA克隆。用于PCR的寡核苷酸引物根据原型A2病毒的核苷酸序列来设计(Mink等，Virology 185:615-624(1991)；Stec等，Virology 183:273-287(1991)；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9663-9667(1991)；Connors等，Virology 208:478-484(1995))，并且已经证明引物可用来扩增RSV A2野生型病毒及其衍生株cpRSV亲代病毒。以CloneAmp尿嘧啶DNA糖基化酶系统(LifeTechnologies)，用含有尿嘧啶的寡核苷酸引物，将RSV序列克隆入pAMP1载体中。PCR反应根据生产商(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)的步骤进行，进行34次循环，每次循环包括92.5℃1分钟、55℃1分钟和72℃3分钟。使每个片段在1％琼脂糖/TAE凝胶上电泳，用GenecleanⅡ系统(Bio101,Vista,CA)回收，并克隆入pAMP1载体中。从分开的PCR反应获得每个片段的2个或多个单独的克隆。为了分析3＇引导区，如Mink等，Virology 185:615-624(1991)中所述的，使病毒RNA(vRNA)在50μl反应中聚腺苷化。在37℃下培育10分钟后，用2μl 0.5M EDTA终止反应。用苯酚氯仿抽提和乙醇沉淀纯化聚腺苷化的RNA产物，然后逆转录成cDNA，用PCR扩增，并用3＇RACE系统(Life Technologies)进行迅速扩增克隆。同样，为了分析5＇尾区，将vRNA逆转录成cDNA，用末端脱氧核苷酸转移酶和dCTP加尾，进行柱层析纯化，制成双链，用PCR扩增，然后用5＇RACE系统(LifeTechnologies)进行克隆。

通过双脱氧核苷酸方法用合成的寡核苷酸引物(质粒引物或RSV特异性引物)、[α³⁵S]dATP和Sequenase2.0(United States Biochemicals,Cleveland,OH)从双链质粒中对cpts248的克隆cDNA进行测序。通过在正向和反向上对两个或多个克隆进行测序，并对未克隆的PCR产物进行测序，以确认观察到的序列与以前公开的亲代病毒cpRSV之间的差别。

用不同的方法测定cpts248/404、cpts530、cpts530/1009和cpts530/1030的核苷酸序列。对感染细胞的总RNA或vRNA进行RT-PCR，产生3-10个重叠的表示cptsRSV突变病毒基因组的cDNA克隆。在NCI Frederick Cancer(Frederick,MD)中用Taq试剂盒(ABI,Foster City,CA)对构建在噬菌体M13中的M13超声处理的随机库(针对每个质粒插入物)进行自动的DNA测序，测定每个克隆的全部核苷酸序列。两条链均测序，并且用Sequenase 2.0(USB,Cleveland,OH)通过人工测序(如上所述)第二条非依赖型RT-PCR衍生产物来确认cpRSV和cptsRSV突变株序列之间的差别。3＇和5＇端序列的测定如上所述。

测定cpts248、cpts248/404、cpts530、cpts530/1009和cpts530/1030株的15222个核苷酸的RNA基因组的全部核苷酸序列。在这些cptsRSV突变株的独立衍生的cDNA克隆上确认与cpRSV和RSV A2/HEK7(野生型)亲代病毒的公开序列(Conners等，Virology 208:478-484(1995))相对应的变化，并通过对cpRSV的其它克隆测序来重新检查cpRSV病毒。鉴定cpRSV病毒序列中的多义性(与A2/HEK7野生型病毒比较)。多义性发生在反义基因组3＇端位置1938处，其包括核苷酸异源性(正义为G或A)，该核苷酸异源性预计可在391个氨基酸的核衣壳(N)蛋白中氨基酸位置267处编码氨基酸改变(Val或Ile)。因此，cpRSV实际上是由混合的病毒组成。这是当初不能检测位置1938处的改变的原因(Conners等，同上)。在位置1938处有A突变的病毒是cpts248衍生株和cpts530姐妹克隆的即发型(immediate)亲代。因此，cpts衍生株的即发型亲代病毒cpRSV含有5个与其A2/HEK亲代不同的氨基酸。

在核苷酸位置10989处(A变为T)发现cpRSV和cpts248突变株间的单一核苷酸差别(表36)。该突变发生在聚合酶(L)翻译开放读框内，它编码了预定的氨基酸变化，在2165个氨基酸的L蛋白中将氨基酸位置831处的gln变为leu。cpts248/404突变株有两个核苷酸与其cpts248亲代不同，一个在L基因的核苷酸12046处(T变为A)，另一个在M2基因转录起始信号序列的核苷酸7605处(T变为C)。L基因内的核苷酸取代使得L蛋白中位置1183处的氨基酸从asp变为glu。因此，在cpRSV的两轮独立诱变后，cpts248/404病毒获得了L基因内的两个核苷酸变化(与两个氨基酸取代对应)以及M2基因转录起始信号中的核苷酸变化。cpts248/404突变株在7个氨基酸(4个在L蛋白中，两个在F蛋白中，一个在N蛋白中)和M2基因转录起始信号的一个核苷酸上与其野生型祖先A2/HEK7不同。

表36 cp-RSV、cpts-248、cpts-248/404突变株病毒间的核苷酸区别

			核苷酸和氨基酸变化
							核苷酸1	氨基酸	基因	A2野生型(HEK-7)	cp-RSV	cpts-248	cpts-248/404
1938	267	N	G(val)	A(ile)	A(ile)	A(ile)
							3242		P	A	A	A	AA2
6313	218	F	A(glu)	C(asp)	C(asp)	C(asp)
							7228	523	F	C(thr)	T(ile)	T(ile)	T(ile)
7605		基因起始(M2)	T	T	T	C
							9453	319	L	G(cys)	A(tyr)	A(tyr)	A(tyr)
10989	831	L	A(gln)	A(gln)	T(leu)	T(leu)
							12046	1183	L	T(asp)	T(asp)	T(asp)	A(glu)
13565	1690	L	C(his)	T(tyr)	T(tyr)	T(tyr)

¹正义

²使基因组长度增加1个核苷酸

cpts530与其亲代株cpRSV的不同是，位置10060处还有一个核苷酸取代(C变为A)，它使得L蛋白的位置521处的氨基酸由phe变为leu(表37)。cpts530/1009突变株在核苷酸12002处有单个核苷酸取代(A变为G)，从而使L蛋白的氨基酸1169处由met变为val。cpts530/1009突变株在7个氨基酸(4个在L蛋白中，两个在F蛋白中，一个在N蛋白中)上与其野生型祖先A2/HEK7不同。

cpts530/1030突变株在核苷酸12458处有其它单个核苷酸取代(T变为A)，结果是L蛋白的氨基酸1321处的Tyr被取代成为Asn。cpts530/1030突变株在7个氨基酸(4个在L蛋白中，两个在F蛋白中，一个在N蛋白中)上与其野生型祖先A2/HEK不同。

表37 cp-RSV、cpts-530、cpts-530/1009突变病毒之间的核苷酸序列的区别

			核苷酸和氨基酸变化
							核苷酸1	氨基酸	基因	A2野生型(HEK-7)	cp-RSV	cpts-530	cpts-530/1009
1938	267	N	G(val)	A(ile)	A(ile)	A(ile)
							6313	218	F	A(glu)	C(asp)	C(asp)	C(asp)
7228	523	F	C(thr)	T(ile)	T(ile)	T(ile)
							9453	319	L	G(cys)	A(tyr)	A(tyr)	A(tyr)
10060	521	L	C(phe)	C(phe)	A(leu)	A(leu)
							12002	1169	L	A(met)	A(met)	A(met)	G(val)
13565	1690	L	C(his)	T(tyr)	T(tyr)	T(tyr)

¹正义

因此cpts248和cpts530的ts和减毒表型各自与聚合酶基因中的单一核苷酸改变有关。cpts530和cpts530/1009或cpts530/1030间的ts和减毒表型的递增也各自与L蛋白中的一个氨基酸改变有关。在这四个实例(即cpts248、cpts530、cpts530/1009和cpts530/1030)中，L蛋白中单个的，但是不同的氨基酸取代赋予了祖先株ts和减毒表型。这些氨基酸取代与5个cpRSV突变结合作用以增强在动物体内复制后的ts表型稳定性。cpts248和cpts248/404间观察到的减毒和温度敏感性的递增与两个核苷酸改变有关，这两个改变或其中一个可提供ts和减毒表型。通过本文归纳的发现(即RSV基因组或L蛋白的核心区的突变可导致减毒)，确定了L蛋白中的与ts和减毒表型唯一相关的四个特定位点(即cpts530、cpts530/1009、cpts530/1030和cpts248病毒中特定的位点)以及cpts248/404中的一个或两个位点。尽管L蛋白中的四个位点的特定突变是特异性的氨基酸取代，但是这些位点和特定位点周围约5个氨基酸内的相邻氨基酸的其它氨基酸取代以及读框插入或缺失也会导致减毒。

L中编码的氨基酸改变看来并不涉及副粘病毒聚合酶蛋白保守性最高的序列区域、建议的ATP结合位点(Stec等，Virology 183:273-287(1991))，也不涉及与RNA依赖型RNA和DNA聚合酶的基序同源的区域(Poch等，EMBO J.8:3867-3874(1989))。最可能的是，这些突变的效果是氨基酸水平的，而不是核苷酸水平的，假定突变既不存在于3＇和5＇基因组末端，也不存在于短的基因起始和基因末端序列中。认为这些RNA区含有有效衣壳化、转录、复制和包装成毒粒所需的所有顺式作用RNA序列(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9663-9667(1991)；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996)，这些内容均纳入本文作参考)。

这些结果提供了tsRSV突变株的第一个全长序列。这些结果也表明，引起氨基酸变化的单个核苷酸取代或例如GS序列中的变化可使肺病毒减毒。由于cpts248和cpts530病毒在体外和体内均有高度的ts表型稳定性，因此实际上很明显，发现该表型与单一的不同的氨基酸改变有关。重要地是，cpts248/404、cpts530/1009和cpts530/1030含有至少三个对减毒表型有贡献的突变，两个是温度敏感的，一个是非温度敏感的(如5个cp突变)，这部分地非限制性地解释了这些病毒在体外和体内高度稳定的原因。

测定RSV疫苗病毒株及其亲代病毒的全部序列，就可以在基因水平上分析疫苗病毒生产时以及临床实验时试验者排出病毒时疫苗病毒的稳定性。测定cpts248、cpts530、cpts248/404、cpts530/1009和cpts530/1030病毒的减毒和ts表型的遗传基础提供了重要的新的机会。根据下文描述的重组方法，通过全长RSV cDNA的定点诱变，很容易产生新的候选疫苗，从中获得感染性病毒。例如，可以按照需要将一个或两个位于氨基酸位置：521(cpts530突变株中)或1169(cpts530/1009突变株中)的ts突变、或其它减毒或稳定化突变加入cDNA克隆(例如cpts248/404病毒)中。通过这种方式，cpts248/404病毒的减毒水平可以递增的方式增加，并且可以合理地获得具有安全性和免疫原性所需的特定减毒水平的疫苗株。同样，通过特异性地向cpts248/404病毒引入一个或多个减毒突变，可以提高cpts530/1009和cpts530/1030突变株的减毒水平。这些组合的重组病毒(掺入了生物衍生突变株的多个减毒突变)克服了用常规方法分离和生产遗传稳定的、减毒程度满意的病毒的许多困难。而且，这些重组cptsRSV突变株的表型稳定性可通过在确定特定氨基酸(已知能赋予减毒表型的氨基酸)的密码子中引入两个或多个核苷酸取代(如果可能的话)来增强。这样，可通过全长RSV cDNA的定点诱变来增加减毒表型的稳定性。

                            实施例Ⅶ

                     编码RSV反基因组cDNA的构建

构建编码RSV株A2反基因组的cDNA克隆，如图2所示。以合成的寡核苷酸作为引物，和以胞内RSV mRNA、或从纯化的毒粒中分离获得的基因组RNA作为模板，用逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)合成该cDNA片段。最终的cDNA侧接到T7 RNA聚合酶启动子的前导区末端上，该启动子包括使活性最优的三个转录的G残基；转录会为反基因组的5＇末端提供这三个非病毒的G＇。为了产生接近正确的3＇末端，将cDNA尾区末端构建成与前述锤头核酶相邻，核酶在断裂时会为编码的RNA 3＇末端提供一个3＇磷酸化的U残基(Grosfeld等，J.Virol.69:5677-5686(1995)，其内容纳入本文作参考)。核酶序列在串联的两个T7 RNA聚合酶终止子后。(含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报道基因的cDNA编码的RSV微小基因组中加入3个5＇G残基和1个3＇U残基，当与RSV互补时不会对CAT的表达产生影响。)

图2显示了cDNA以及编码的反基因组RNA的结构。反基因组的框图(图2的上方)包括下列特征：T7启动子贡献的5＇端非病毒G三联体，位置1099(长度增加1个核苷酸)、1139、5611和7559处的四个序列标记，核酶和串联T7终止子，核酶断裂赋予3＇端的单个非病毒3＇磷酸化U残基(断裂位点用箭头表示)。

集聚的表示完全反基因组的克隆的cDNA片段(图2中间)通过RSV mRNA或基因组RNA的RT-PCR构建成。完全反基因组cDNA称为D46或D53；不同的名称指相同质粒的不同制备物。将含有反基因组左手末端从T7启动子和前导区互补到SH基因的cDNA(称为D13)装配在pBR322的一个版本中(图2底部)，pBR322中天然存在的BamHⅠ位点因诱变而被消除，PstⅠ-EcoRⅠ片段被含有独特限制性位点(包括BstBⅠ、BstXⅠ、PacⅠ、BamHⅠ、MluⅠ，以便于装配)的合成多接头代替。图2中的方框显示了BamHⅠ位点的除去。天然存在的BamHⅠ-SalⅠ片段(BamHⅠ位点(正义)显示在上行中，用下划线表示)被PCR产生的BglⅡ-SalⅠ片段代替(BglⅡ位点显示在下行中，用下划线表示；其中用斜体字表示的4个核苷酸的粘性末端与BamHⅠ的粘性末端相容)。这就产生了单个核苷酸变化(短的下划线)，该变化在氨基酸水平上是沉默的。通过在反基因组cDNA中提供的独特的BamHⅠ位点，载体中的这些修饰有利于cDNA的构建。

G、F和M2基因可以装配在分开的载体中，L基因、尾区、侧翼核酶和串联T7转录终止子也一样。然后将G到M2的片段插入前导区-SH质粒的PacⅠ-BamHⅠ窗口中。然后以它作为受体，将L-尾区-核酶-终止子片段插入BamHⅠ-MluⅠ窗口中，产生完全反基因组。

通过将诸变化掺入用于RT-PCR的寡核苷酸引物中，在初始构建时将四个限制性位点标记(图3)引入反基因组cDNA中。这样做有利于装配，它能确定重组病毒，并说明了将变化引入感染性RSV的能力。三个位点在基因间隔区内，第四个在非翻译基因区内，它们包括总共5个核苷酸取代和一个核苷酸插入。这使得编码的反基因组的长度在总共15223个核苷酸的野生型基础上增加一个长度的核苷酸(SEQ ID NO:1，它显示了D46 5＇到3＇的正义序列，而基因组本身是反义的；注意位置4可以是G或C)。

如图3所示，将序列标记插入cDNA-编码的反基因组RNA中。序列是正义的，将前导区互补的第一个核苷酸的数目数为1；分别代表亚组A和B的株A2和18537间的相同处(Johnson和Collins,J.Gen Virol.69:2901-2906(1988)，其内容纳入本文作参考)用点表示；代表cDNA中的限制性位点的序列用下划线表示；GS和基因末端(GE)转录信号用方框表示；位置1141处的N翻译开放读框的起始密码子用斜体字表示，每个序列下方示出了序列标记。在上方的序列中，在位置1099处插入一个C残基，从而在NS2-N基因间隔区内形成一个AflⅡ位点，而紧靠N翻译开放读框上游的位置1139和1140的AG被CC代替，从而产生新的NcoⅠ位点。在中间的序列中，5612和5616位置处的G和U分别被取代，在G-F基因间隔区中产生一个新的StuⅠ位点。在图3下方的序列中，在F-M2基因间隔区中位置7560处的C取代产生了一个新的SphⅠ位点。

在装配前对所有cDNA进行完整地测序，在大多数情况下cDNA来自几个独立的cDNA。编码单个RSV蛋白的质粒在Grosfeld等，J.Virol.69:5677-5686(1995)和Collins等，同上(1995)中有所描述，其内容纳入本文作参考。在装配后也对完全cDNA进行全长测序。

                          实施例Ⅷ

                    重组RSV的转染和回收

本发明从cDNA表达的或反基因组制备感染性RSV的方法包括：使反基因组与那些RSV蛋白共同表达，这些RSV蛋白应足以(ⅰ)产生可进行RNA复制的反基因组核衣壳和(ⅱ)使子代基因组核衣壳能够进行RNA复制和转录。基因组核衣壳的转录提供了所有其它RSV蛋白，并引发了产毒性感染。

将质粒携带的编码反基因组的cDNA与编码蛋白N、P、L和M2(ORF1)的质粒一起转染入HEp-2细胞中，该细胞中已经感染了最近描述的表达T7 RNA聚合酶的牛痘病毒MVA株重组体(Wyatt等，Virol.,210:202-205(1995)，其内容纳入本文作参考)。MVA株是有宿主范围的突变株，它可在禽类细胞中生长，而在哺乳动物细胞中在毒粒成熟的后期其生长会受抑制，从而大大减少了感染性病毒的产生。在HEp-2细胞中，MVA重组体在T7聚合酶的表达和致细胞病变方面与更常用的WR为基础的重组体(Fuerst等，Proc.Natl.Acad.sci.USA 83:8122-8126(1986))相似，但是其产生子代的水平非常低，以致于上清液在新鲜细胞中传代时只有少量致细胞病变。这有利于回收在转染的牛痘病毒感染的细胞中产生的全部重组RSV。

重组RSV的转染和回收根据如下方式进行。6孔碟的每个孔中HEp-2细胞的培养单层接受1ml的感染-转染培养液，该培养基液通过混合5种质粒的最终体积0.1ml的Opti-MEM(Life Technologies)培养基(即每种反基因组各0.4μg,N和P质粒以及L和M2(ORF1)质粒各0.1μg)来制得。将它与含有12μl LipofectACE(Life Technologies)的0.1mlOpti-MEM混合。在室温下培育15分钟后，将其与含有2％热灭活的胎牛血清的0.8ml OptiMEM和1.5×10⁶pfu的编码T7 RNA聚合酶的MVA株牛痘病毒重组体(Wyatt等，同上)混合。将其加入细胞中，在一天后用含有2％血清的Opti-MEM替换。在32℃下培育培养物并在第三天收获。采用32℃培育是因为发现MVA病毒有轻微的温度敏感性，在这较低温度下大为有效。将转染三天后的澄清的培养上清液传代入新鲜的HEp-2细胞中，并用甲基纤维素(用于后续抗体染色)或琼脂糖(用于噬斑分离)来铺层。在甲基纤维素下培育5天后，固定细胞，并用间接的辣根过氧化物酶方法染色(根据Murphy等，Vaccine8:497-502(1990)中的通用步骤，采用三种抗RSV F蛋白的小鼠单克隆抗体混合液，然后使抗小鼠抗体与辣根过氧化物酶连接)。

在假定是由于低水平的MVA-T7重组病毒引起的致细胞病变背景下，检测各种RSV样噬斑。棕黑色表明噬斑含有大量RSVF蛋白，噬斑表现出RSV的致细胞病变特征，和显著的合胞体形成。

从琼脂下培育的噬斑中挑取RSV样噬斑，并用中性红染色。使它们增殖，并通过噬斑测定和抗体染色与RSV株A2的实验株比较。转染的培养物衍生获得的噬斑与实验株的噬斑非常相似。一个差别是转染培养物衍生的噬斑显得稍微小于实验株的噬斑，中心并不很清晰。重组病毒在表型上与该特定野生型分离物不同，可能在细胞到细胞的扩散上更受限制，表现为杀死细胞的速度降低。在释放病毒的繁殖上，重组株和实验株在32℃或37℃下HEp-2中的产量是基本相同的。在基础研究中，重组病毒株和实验病毒株在胞内RSV mRNA和蛋白的积累上没有区别。

通过RT-PCR用侧接四个插入标记的三对引物对来平行地分析噬斑纯化的、传代三次的重组RSV与实验株病毒。使三株独立的噬斑纯化的重组RSV分离物与未感染的对照培养物平行增殖。用聚乙二醇和高浓度盐处理澄清的培养上清液(Zoller和Smith,DNA 3:479-488(1984))，使病毒沉淀，用Trizol^TM(Life Technologies)从沉淀中抽提出RNA。用DNA酶平行地处理这些RNA、不加入RNA的其它对照或0.1μg来自A2株实验室分离物的RNA，然后再纯化，分别与50ng随机六聚体退火，在标准的RT条件(40μl反应物)下，加或不加逆转录酶培育(Connors等，Virol.208:478-484(1995)，其内容纳入本文作参考)。用三对不同的合成脱氧寡核苷酸引物对每个反应的等份进行PCR(35次循环，94℃45秒，37℃30秒，72℃1分钟)。引物对(A)：正义，位置925-942和反义，位置1421-1440，产生516bp的预计产物(重组病毒情况下为517bp)，其在NS2和N基因的接头处以及N基因中分别插入有AflⅡ和NcoⅠ位点。引物对(B)：正义，位置5412-5429和反义，5930-5949，产生538bp的预计产物，该产物跨越G和F基因间接头内插入的StuⅠ位点。引物对(C)：正义，7280-7297和反义，7690-7707，产生428bp的片段，该片段跨越F和M2基因间接头内插入的SphⅠ位点。在含有1％琼脂糖和2％低熔点琼脂糖的中性凝胶上对PCR产物、HaeⅢ消化的X174DNA分子长度标记进行平行的电泳分析，并用溴化乙锭染色来显示。产生了有预计大小的PCR产物。每个产物的产量取决于RT步骤，这表明每个产物均衍生自RNA而不是污染的cDNA。

用限制性酶消化来分析PCR产物。有AflⅡ或NcoⅠ的引物对A的产物经消化产生了与预计的177和340bp(AflⅡ)或217和300bp(NcoⅠ)对应的片段。有StuⅠ的引物对B的产物消化产生了与预计的201和337bp相类似的片段。有SphⅠ的引物对C的反应产物的消化产生了与预计147和281bp对应的产物。消化产物如上所述进行凝胶电泳分析。重新消化证明，存在有残余的未消化的带AflⅡ的PCR产物，这是由于消化不完全的缘故。因此，限制性酶消化表明，表示重组病毒的PCR产物含有预计的限制性位点标记，而表示实验株的产物则没有。克隆的PCR产物的核苷酸序列分析确证该序列跨越包含了限制性位点标记。

如表38中所示，当与N、P、L和M2(ORF1)互补时，RSV的生产效率相当高，在三个实验中其范围是每0.4μg输入反基因组cDNA和1.5×10⁶细胞中平均有9.9-94.8个噬斑。由于这些噬斑是从液体铺层获得的，因此不知道每个孔中初始转染时感染细胞的数目。几乎每个转染的孔(表38中56个之中有54个)产生了病毒。由于每个感染细胞释放的RSV的产量通常非常低(约10pfu)(甚至是在理想的条件下)，而且由于许多孔产生了该量的数倍(高达169个噬斑)，因此在许多转染细胞的孔中有几个RSV产生细胞。

如果缺少任一个质粒，则RSV不能回收，如表38所示。对M2(ORF1)的需求也应满足于完全基因M2(ORF1+2)，只要其输入cDNA的水平非常低(每1.5×10⁶个细胞0.016μg)(表38)。在较高的水平下，病毒的产生大大减少，这表明在产毒性感染时，与M2(ORF2)有关的微小基因组RNA合成的抑制也作用于完全基因组。

这些结果表明，除了N、P和L外，感染性RSV的产生还与M2(ORF1)蛋白的表达密切相关。另外，从ORF2缺失的工程化的cDNA中表达M2(ORF1)是最优的方法，虽然含有两个ORF的完全cDNA也可支持RSV的生产。

因此，本发明证明，RSV的转录与前述未片段化负链RNA病毒的转录的不同之处在于它需要第四种蛋白(在本文中称为M2(ORF1)，而在以前称为22K或M2(Collins等，J.Virol.54:65-71(1985)))。发现M2(ORF1)蛋白是进行持续的依序转录所需的RNA聚合酶延伸因子。Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996)。这一需求可以将特异性的预定的变化引入感染性RSV中，这是本发明的一部分。

表38感染性RSV的产生取决于M2 ORF1的表达

      互补质粒                感染性RSV的产生#噬斑×#孔(μg cDNA/1.5×10⁶细胞和反       例1        例2       例3基因组cDNA)0.4μg

      N(0.4)

      P(0.4)                 0×24       0×12    0×12

      L(0.1)

      N(0.4)                 0×19^$     0×4     9×1

      P(0.4)                 1×2        3×1     10×1

      L(0.1)                 2×2        5×1     14×2

 M2[ORF1+2](0.016)           3×1        6×1     22×1

                           平均0.38      9×1     28×1

                                         10×1    32×1

                                         13×1    49×1

                                         34×1    70×2

                                         51×1    166×1

                                        平均10.9  169×1

                                                 平均48.6

      N(0.4)               0×1 11×1    0×1       55

      P(0.4)               1×1 12×1    2×1     59×1

      L(0.1)               2×2 13×1    4×1     65×1

  M2[ORF1](0.1)            3×2 21×1    5×1     71×1

                           4×1 24×1    8×2     72×1

                           5×2 26×1    10×3    87×1

                           6×4 30×2    19×1    97×1

                           7×2 33×2    20×1    100×1

                           9×1 42×1    23×1    109×1

                           10×2 73×1            128×1

                                                  147×1

                            平均13.7    平均9.9   148×1

                                                  平均94.8

^*使来自转染培养物(每个孔有10⁶个细胞)的上清液在新鲜的HEp-2细胞中传代，用甲基纤维素铺层，用F-特异性单克隆抗体染色。

^$读数如下：19个孔没有噬斑，2个孔分别有1个噬斑，2个孔分别有2个噬斑，1个孔有3个噬斑。

                          实施例Ⅸ

           经修饰而掺入RSV株cpts530的表型特异性突变的感染性重组RSV的构建

本实施例描述了用本文所述的重组方法将特异性的预定突变引入感染性RSV中。如上所述，测定了cpts530的全部核苷酸序列，在进一步减毒的衍生株cpts530中，保留了已知存在于亲代cpRSV中的5个突变。已明确在核苷酸位置10060处还有一个核苷酸变化，这个核苷酸变化导致了大聚合酶(L)蛋白中氨基酸位置521的苯丙氨酸变为亮氨酸(见表37、39)。将该单个氨基酸取代单独地、或与cp突变一起组合引入野生型A2 RSV的全长cDNA克隆中。从突变cDNA回收获得的感染性病毒的分析结果表明，该单个突变完全限制了重组cp530在40℃下HEp-2细胞培养单层中形成噬斑，而5个cpRSV突变的存在对温度敏感性没有影响。这些发现确定了L蛋白中氨基酸位置521由苯丙氨酸变为亮氨酸是确定cpts530ts表型的突变。同样，与其cpts530亲代病毒相比，在cpts530/1009重组体中还鉴定出另一个核苷酸变化(表37)。这一位置12002处的核苷酸取代使得L蛋白中位置1169处发生氨基酸变化，野生型病毒中的甲硫氨酸在cpts530/1009突变株中被缬氨酸代替。将该突变也引入重组RSV中，回收的病毒是温度敏感的。这些发现表明，位置1169处由甲硫氨酸到缬氨酸的变化是使cpts530/1009比cpts530温度敏感程度更高的突变。

通过用酶测定或Northern印迹分析来监测RSV-CAT或RSV-萤光素酶微小基因组(见上)，已经确认了530、530/1009和530/1030重组病毒中的温度敏感水平。例如，在升至37℃的温度下，选定的野生型L蛋白有关的突变株产生的萤光素酶活性为18.4％,1009和530株为1.5％和0.4％，并且双重突变pMT1-L支持质粒。这些典型的突变也在32℃下降低了L功能，与野生型L蛋白相比，1009的活性降低70％,530降低了40％,530/1009L蛋白活性降低了12.5％。这些突变对转录和复制的效果也可用微小基因组系统来单独测定，或与本文公开的重组病毒方法来组合测定。

表39引入RSV全长cDNA克隆的突变突变          野生型序列                   突变序列          限制性位点  氨基酸变化位点(L)¹ ₉₃₉₈C TTAAG A           ₉₃₉₈C CTAAG G          Bsu36Ⅰ    ---位点(L)   ₁₁₈₄₆TAC ATA             ₁₁₈₄₆TAC GTA             SnaBⅠ     ---位点(L)   ₁₃₃₃₉GT CT TAA T       ₁₃₃₃₉GT TT AAA C       PmeⅠ      ---位点(L)   ₁₄₀₈₂CG TAC AG          ₁₄₀₈₂CG GAC CG          RsrⅡ      ---位点(L)   ₁₄₃₁₈ TGTAAC A           ₁₄₃₁₈ GGTAAC C           BstEⅠ     ---位点(L)   ₁₄₄₇₅TA TGTA             ₁₄₄₇₅TA CGTA             SnaBⅠ     ---HEK(F)    ₅₈₄₈AATAT CAAG AAA      ₅₈₄₈AATAT TAAG G*AA    SspⅠ      66lys→gluHEK(F)    ₅₉₅₆AG CAC AC AA       ₅₉₅₆AG TAC TC C*A     ScaⅠ      101gln→procp(F)     ₁₉₃₅ATC AGTT             ₁₉₃₅ATC GA*TT           ClaⅠ      267val→ilecp(F)     ₆₃₁₁T AG AAA            ₆₃₁₁T CG C*GA          NruⅠ      218glu→alacp(F)     ₇₂₂₈A CAAAT              ₇₂₂₈A T*TAAT            AseⅠ      523thr→ilecp(L)     ₉₄₅₃T GTATAC             ₉₄₅₃T A*CATAC           缺失AccⅠ  319cys→tyrcp(L)     ₁₃₅₅₅T ATTAACTAAA CA T ₁₃₅₅₅T GTTAACTAAA T*A   HpaⅠ      1690his→tyr

                           C248(L)    ₁₀₈₉₂ TCATGCTC AA        ₁₀₈₉₂ GCATGCTC T*G       SphⅠ      831gln→leu404(M2)   ₇₆₀₆ TATGTC ACGA         ₇₆₀₆ C*ATGTC GCGA       NruⅠ      ---404(L)    ₁₂₀₄₂ TTG GA T          ₁₂₀₄₂ CT CGA G*         XhoⅠ      1183asp→glu530(L)    ₁₀₀₅₉TT C                ₁₀₀₅₉TT A*               ---        521phe→leu1009(L)   ₁₁₉₉₂CCCATGAGATG AT G   ₁₁₉₉₂CCACTGAGATG G*T     BsfXⅠ     1169met→val

                           C1030(L)   ₁₂₄₅₂G TTAACA TAT       ₁₂₄₅₂G CTAACA A*AT    缺失HpaⅠ   1321tyr→asn

注意：野生型和突变株对应位置的核苷酸差别用下划线表示。限制性内切核酸酶的识别位点用斜体字表示。引入核苷酸变化使得氨基酸取代的密码子用粗体表示。星号表示生物衍生突变株病毒中的单个核苷酸变化。数字系统反映全长cDNA中插入一个核苷酸。

¹表示引入突变的基因。

为了将cpts530和cptsl009特异性突变引入确定的减毒重组RSV疫苗病毒中，如下采用本文所述的cDNA为基础的回收系统。在初始的构建中将前述RSVA2野生型全长cDNA克隆(Collins等，同上，(1995))设计成cDNA克隆中位置1099处有单个C核苷酸插入(产生AflⅡ位点)和4个基因座中总共6个其它核苷酸被取代。因此，天然存在的病毒和衍生自cDNA的重组病毒的核苷酸计数系统，由于位置1099后的一个核苷酸而没有对齐。上表36和37中的核苷酸计数表示天然存在的病毒的位置，而那些cDNA克隆(表39)中和cDNA克隆衍生的重组病毒要多一个核苷酸。6个核苷酸取代中的一个在基因组意义上是在前导序列的核苷酸位置4中由G变为C。检测到该核苷酸变化在非重组RSV中，并且发现该变化对组织培养物中或小鼠体内的病毒复制的温度敏感性没有影响(Firestone等，Virology 225:419-522(1996)，其内容纳入本文作参考)。表39列出了在本实施例以及以下的实施例中插入RSV cDNA的各种突变。

用中间克隆(D50和D39)来装配编码正义RSV反基因组的全长RSV cDNA克隆D53(图4)。D50质粒含有从前导区到T7启动子下游M2-L重叠区的RSV基因组，而D39质粒编码全长L基因和尾区，尾区后有锤头核酶和两个T7终止子(长度约为7kb),D39质粒以BamHⅠ和MluⅠ限制性位点为边界。用于转染以挽救感染性病毒的全长RSV cDNA克隆(D53)通过将D39质粒的BamHⅠ-MluⅠ片段插入DS0质粒来进行装配(参见美国申请No.08/720,132和出版的PCT申请No.PCT/US96/15524，这些文献纳入本文作参考)。为便于诱变，将D50进一步分离分处在一个噬菌粒质粒中的几个片段：一个片段是含有N基因的Xbal-EcoRⅠ片段(cDNA pUC118.D50N)，一个是含有F和M2基因的StuⅠ-BamHⅠ片段。将D39进一步分成两个分别处在一个分开的噬菌粒质粒中的片段：一个片段(左手半，cDNA pUC119.L1)从BamHⅠ位点到核苷酸12255处的PmⅡ位点(注意：这里以及下面指定的限制性位点的序列位置被视为解释性指南，并不单是精确地确定所有涉及的核苷酸)，另一个(右手半，cDNA pUC119.L2)从PmlⅠ位点到T7终止子的末端。

根据标准步骤(例如参见Kunkel等，Methods Enzymol,54:367-382(1987)，其内容纳入本文作参考)将突变置于pUC118-和pUC119-为基的构建物中(如图4下行所述)。使质粒在大肠杆菌dut ung株中(本例中为CJ236)增殖，通过辅助噬菌体(本例中为M13KO7)感染来制备单链DNA。制备每个均含有一个或多个感兴趣的核苷酸变化的磷酸化合成寡核苷酸，使其与一个或组合的单链模板退火，并通过T4 DNA聚合酶来指导DNA合成。连接产物并转化入非dut ung的大肠杆菌中(在本例中是DH5α或DH10B)。用限制性酶切消化或诱变区的核苷酸序列分析对转化体菌落的小量制备DNA筛选有无突变存在。将含有合适突变的片段从pUC构建物转染回D50或D39质粒中，然后将它们装配成全长克隆(称为D53)。如上所述，使D53质粒与编码N、P、L和M2(ORF1)蛋白的四个支持质粒的混合物互补，从而从HEp-2细胞中回收获得重组病毒。

在本实施例和以后实施例中涉及四类突变来描述具有生物衍生突变的特异性重组RSV(见表36、37、39)：

(1)第一组突变涉及引入L基因中的6个新的翻译沉默限制性位点标记，它们总称为“位点”突变。6个位点是Bsu36Ⅰ、SnaBⅠ、PmeⅠ、RsrⅡ、BstEⅡ和第二个下游SnaBⅠ位点，它们在图4中D53框图上方用下划线表示。这6个总称为“位点”突变的变化是为了方便cDNA构建而插入的。同样，知道重组也可在转染时在D53质粒和支持质粒(即N、P、M2(ORF1)和L质粒)间发生(Garcin等，EMBO J.14:6087-6094(1995)，其内容纳入本文作参考)。L中的这些限制性位点在D53构建物中而不在L支持质粒中，因此提供了一个标记来确认L中没有发生重组。这尤其重要，因为许多减毒突变发生在L中。

(2)第二组突变涉及F基因中的两个氨基酸变化(图4，表39)。cpRSV及其所有的衍生株衍生自称为HEK-7的野生型病毒。原始D53 cDNA的序列与HEK-7的序列不同(在7个位置上有单一核苷酸取代)。一个在核苷酸4处，在原始的D53中为C(反义)，而在HEK病毒中是G。然而，已经显示出生物衍生病毒含有二种之任一种排列，并且可在两者间变动，因此认为这一差别是偶然的，这里不再作进一步的讨论。其它四个核苷酸取代在氨基酸水平上是沉默的，它们是F中的两个(位置6222和6387)，一个在F-M2基因间隔区(位置7560)，一个在L中(位置10515)。认为这些也不重要，因此不再讨论。最后是F基因中的两个核苷酸取代，它们分别导致了一个氨基酸取代(表39)。将这两个统称为“HEK”排列的变化引入D53中，从而使编码的重组体野生型病毒在氨基酸水平上与生物衍生cpts突变株的HEK-7野生型亲代相同。注意，这些变化的每一个均用来引入新的限制性酶切识别位点，目的是监测cDNA和回收病毒中引入的突变是否存在。

(3)第三组突变涉及在cpRSV病毒中发现的5个氨基酸取代，它们统称为“cp”突变。它们存在于所有的生物衍生的cpts病毒中，并提供了减毒表型。在生物衍生的cpRSV中，这些氨基酸变化均是由单个核苷酸变化引起。如表39所示，在5个例子中的4个中，当将氨基酸编码改变引入cDNA中以制备重组病毒时，使每个编码改变涉及到两个核苷酸取代，从而使重组RSV有对抗回复到野生型的高度抵抗力。注意，这些变化中的4个用来引入新的限制性酶切位点，而第5个用来消除已有的位点，从而可以通过重组病毒产生的cDNA或RT-PCR产物中限制性位点的存在与否来检测突变的存在。

(4)第四组突变涉及单个生物衍生cpts病毒的特异性点突变(表39，图4)，它们用获得时的生物步骤来命名。例如，在以下实施例中从cpRSV衍生获得cpts248/404病毒的方法包括两个步骤的诱变。第一个步骤产生了cpts248病毒，该病毒保留了一个氨基酸变化，因此称为248突变。第二个诱变步骤是采用cpts248来产生cpts248/404病毒，获得的病毒在L中有一个氨基酸变化(称为404(L)突变)，在M2的基因起始(GS)信号内有一个核苷酸变化(称为404(M2)突变)。其余的突变(即530、1009和1030)各自包括一个(不同)的氨基酸变化。404(M2)突变值得注意，因为它涉及GS转录信号(而不涉及蛋白编码序列)，而且在微小基因组系统中显示出该突变对于mRNA的合成是很重要的。Kuo等，J.Virol.71:4944-4953(1977)，其内容纳入本文作参考。如表36、37和39中所指出的，248、404(L)和1009突变的氨基酸编码改变以两个核苷酸取代来插入重组病毒中，目的是增强遗传稳定性。同样，对重组病毒而言248、404(M2)、404(L)和1009突变各自计划用来引入一个新的限制性位点以进行监测，而1030突变用来消除已有的位点。

在本实施例中，从D50和D39质粒衍生获得几个pUC118-和pUC119-为基础的构建物，并将所需的突变引入这些构建物中(图4、5)。将从含有合适突变的片段从pUC构建物转移回指定的D50或D39质粒中，然后装配成全长克隆。通过这种方式，产生了6类不同类型的D53全长衍生株克隆(图4、5)。在图5中，D53构建物在F中缺失两个HEK突变(见图4)。

根据生产商的建议用Muta-Gene_噬菌粒体外诱变试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)进行诱变。将诱变的构建物转化入感受态大肠杆菌DH10B(Life Technologies)中。用限制性酶切消化(见下文)或诱变区的核苷酸序列分析，对转化体菌落小量制备DNA筛选有无突变存在。

将6个翻译沉默的限制性位点标记、530突变(s21phe→leu)和5个cp突变(表39)引入pUC-为基础的构建物中，并如图4和5所示亚克隆入D50和D39质粒中。用含有上述突变的不同组合的D50和D39构建物装配成不同的全长cDNA构建物。

在最终的cDNA构建物中，通过序列分析来确认530和cp突变的存在，而沉默的限制性位点的存在靠限制性酶切分析来确定。用各种限制性酶(如HpaⅠ、AccⅠ、HindⅢ、PstⅠ)来分析各D53-为基础的构建物，并比较新产生全长cDNA克隆的限制方式与以前挽救的野生型全长cDNA克隆的限制方式。用这种限制分析来确定在细菌扩增全长质粒时是否有100个或更多的核苷酸插入或缺失。

如前所述(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:11563-11567(1995))进行转染。简而言之，是用表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒MVA(MVA-T7)、在感染复数为1下感染HEp-2细胞单层，用LipofectACE(Life Technologies)和D53反基因组构建物以及N、P、L和M2(ORF1)pTM1支持质粒来转染。在第三天，将上清液(澄清的培养液)传代到新鲜的HEp-2细胞上以进行挽救病毒的扩增。在感染5天后收获第一次扩增的病毒悬液，以不同的稀释度接种到HEp-2细胞单层上，然后用甲基纤维素铺层进行噬斑计数或用琼脂糖铺层进行噬斑收获和生物克隆。如前所述(Murphy等，Vaccine,8:497-502(1990)，其内容纳入本文作参考)，用单克隆抗体-辣根过氧化物酶染色步骤来进行噬斑计数。通过连续三次噬斑纯化，对回收的重组病毒进行生物克隆，然后用来在HEp-2细胞上传代两次后产生病毒悬液。生物克隆对于保证回收病毒的均一种群是很重要的，因为在挽救的第一步中，代表RSV的全长cDNA的质粒与含有RSV基因的支持质粒之间可能会发生重组(Garcin等，EMBO J.14:6087-6094(1995)，其内容纳入本文作参考)。这些生物克隆和扩增的病毒悬液用于重组病毒的进一步的分子遗传或表型鉴定。对于每个cDNA构建物形成两个生物克隆的重组病毒，例外的是cp_L530-位点和cp530位点，它们只产生一个生物克隆。在每一例中，如果有姐妹克隆，则它们在下述的遗传和生物分析上是难以区分的。前述对应于D53-530-位点(或称为A2 ts530-scllcp或ts530-位点)的构建物的典型例已经根据布达佩斯条约保藏在ATCC中，给予保藏号VR-2545。

对上述产生的重组RSV进行遗传特征分析，以确定它们是否确实含有每种引入的突变。如上所述，用生物克隆的重组病毒感染HEp-2细胞单层，然后在感染后4-5天收获全部RNA。用随机六聚体引物进行RT，产生的cDNA用作PCR的模板(PCR用Advantage^TM cDNA PCR试剂盒(Clontech Lab.Inc.,Palo Alto,CA)进行)，产生三个代表了重组RSV基因组几乎全部长度的片段。PCR片段对应于核苷酸位置1-1531、5949-10751和8501-15179间的RSV基因组。同样，产生了一个544bp的片段，该片段表示核苷酸位置9665-10209间530突变区域内L基因的一部分。将该PCR短片段用于循环测序(用71001δTAQ^TM*循环测序试剂盒，USB,Cleveland,OH)来确认回收的重组病毒中530突变的存在与否，而将PCR大片段用于限制性酶切消化，以确认沉默的限制性位点标记和用特定限制性位点标记的cp突变的存在。

为了确定根据上述方法制得的重组RSV有所需的表型(即由掺入的序列变化确定的表型)，测定重组RSV和非重组对照病毒的噬斑形成效率(EOP)。具体地，如前所述(Crowe等，Vaccine 11:1395-1404(1993)；Firestone等，Virology 225:419-522(1996)，这些内容纳入本文作参考)在温度控制的水浴中用HEp-2培养单层在32、37、38、39和40℃进行噬斑滴定。用上述的抗体染色来进行噬斑鉴定和计数。

表40中列出了重组病毒、野生型以及生物衍生的突变株cpts530病毒的温度敏感性水平。这些数据表明，沉默的限制性位点或cp突变的引入不会提供ts表型。后一发现与我们以前的发现(即cpRSV是ts病毒(Crowe等，Vaccine 12,691-699(1994))相符。

表40重组和生物衍生病毒在不同温度下HEp-2细胞中的噬斑形成效率的比较

病毒	指定温度下的RSV滴度(log10pfu/ml)b				指定温度下的病毒滴度(log10)比32℃时的降低程度
								32	38	39	40	39	40
野生型c	5.7	5.5	5.4	5.3	0.3	0.4
							r位点	5.4	5.1	5.2	5.2	0.2	0.2
rcp-位点	6.1	5.7	5.7	5.7	0.4	0.4
							r530	6.3	6.0	4.4	＜0.7	1.9	＞5.6
r530-位点	6.4	6.1	4.4	＜0.7	2.0	＞5.7
							rcpL530-位点	5.8	5.9	3.8	＜0.7	2.0	＞5.1
rcp530-位点	6.3	5.0	4.1	＜0.7	2.2	＞5.6
							cpts530c	6.6	5.8	4.4	＜0.7	2.2	＞5.8

a各RSV株的噬斑形成效率通过对在指定温度(℃)下半固态铺层下5天的HEp-2细胞单层进行噬斑滴定来测定。

b病毒滴度是两个实验的平均值，而r-位点和r cp-位点的数据来自一个实验。

c生物衍生的对照病毒

上述发现确认了生物衍生的cpts530病毒的ts表型是由单个突变来确定的，该突变在上文中被认为是该减毒RSV株所特有的。本文中cpts530株的遗传分析通过将530突变引入A2野生型ts亲代病毒的全长cDNA克隆中，然后回收有530突变的ts重组病毒来确认。对该重组病毒以及其它含有530和cp突变的重组病毒的温度敏感水平进行分析，分析结果表明，530突变确定的温度敏感水平不受5个cp突变的影响。因此，本发明的方法和组合物确定了530突变是ts表型特异性的突变，该突变使得cpts530病毒在模型宿主中比其cpRSV亲代进一步减毒(Crowe等，Vaccine 12:783-90(1994),Crowe等，Vaccine,13:847-855(1995)，其内容纳入本文作参考)。

除了上述发现外，将1009突变或1030突变与cpts530突变结合，一起引入重组RSV中，产生了温度敏感水平与各生物衍生的cpts530/1009和cpts530/1030RSV突变株相同的重组体。

上述发现描述了本发明中用来开发减毒RSV活疫苗的重组方法和RSV克隆的几个重要的优点。将选定突变插入重组RSV中以及从RSV A2 cDNA克隆中回收突变是相当有效的。本实施例所用的反基因组cDNA克隆已经在其初始构建物中进行了修饰，以包含5个不同的基因座中的变化(涉及6个核苷酸取代和1个核苷酸插入)。也描述了在其它12个基因座中含有突变(涉及其它24个核苷酸取代)的诱变病毒。只有530突变赋予了组织培养物中可检测表型的事实，表明这个大的RSV基因组的操作相当容易。虽然由牛痘病毒酶介导的支持质粒和全长克隆间会发生重组(Garcin等，EMBO J.14:6087-6094(1995))，但是其发生的频率非常低，在这里分析的10个病毒中每一个都具有cDNA克隆衍生的突变。因此将其它减毒突变依次引入RSV中以获得所需的减毒水平是可行的。

本发明RSV回收系统在减毒突变直接鉴定上已证实的应用以及重组RSV的操作上的成功使得其它所需突变的鉴定及其掺入活的感染性RSV克隆变为可能。以前的临床研究和cpRSV病毒的序列分析揭示，cpRSV中的一组5个非ts突变是血清阳性人的减毒突变(Conners等，Virology,208:478-84(1995),Firestone等,Virology,225:419-522(1996),Friedewald等，JAMA,203:690-694(1968),Kin等，Pediatrics,48:745-755(1971)，这些内容均纳入本文作参考)。用本文所述的方法来选择这些突变以及其它得到肯定的减毒特性和/或ts表型的突变，然后收集到减毒突变的菜单中。然后可将这些以及其它突变(包括ts和非ts)引入RSV A2野生型病毒中，从而产生减毒性和免疫原性间有合适平衡的活的减毒病毒。在这方面，530突变和其它确定的ts突变不在G和F糖蛋白(二者在人体内诱导抗RSV的保护性免疫应答)中是很有利的。这就可以将突变在F和G外的减毒RSV cDNA骨架(作为cDNA底物)发展成RSV亚组B，或流行病学上不同的亚组A株的F和G糖蛋白可被A2的F和G糖蛋白取代。这样，就可迅速将活的减毒RSV疫苗更新以适应亚组A株中的抗原漂移，也可迅速产生亚组B疫苗组分。

                           实施例Ⅹ

                经修饰而具有cpts248/404RSV株表型

                特异性突变的感染性重组RSV的构建

本实施例描述了用本文所述的重组步骤和材料将预定的减毒突变引入感染性RSV中的另一设计方案。

以前的RSV A2 cpts248突变株的序列分析也确定了L基因中的单个突变，即氨基酸位置831的谷氨酰胺变为亮氨酸(表39；Crowe等，Virus Genes,13:269-273(1996)，其内容纳入本文作参考)。通过本文描述的方法确认该突变是减毒的和温度敏感的。对进一步减毒的RSV突变株cpts248/404的序列分析揭示了另两个突变：M2基因起始序列中的核苷酸变化，和L蛋白中氨基酸位置1138处氨基酸取代(天冬氨酸变为谷氨酸)(表39；Firestone等，Virology 225:419-522(1996)，其内容纳入本文作参考)。

根据上述方法将生物衍生的减毒RSV株cpts248/404重新构建成重组病毒(rA2cp/248/404)。编码rA2cp/248/404病毒的cDNA D53通过位点的插入、HEK、cp、248和404改变(表39)来构建。回收重组病毒(rA2cp/248/404)并进行噬斑纯化和扩增。用病毒RNA的RT-PCR，然后进行限制性酶切消化或核苷酸测序(或两者)，来分析重组病毒中突变的存在。用pTML野生型或pTML248/404支持质粒来回收rA2cp/248/404重组物，其中后者包含生物衍生的cpts248/404突变株中L中所有的突变(表39，不包括530、1009或1030病毒特有的突变)。用pTML248/404作为支持质粒可以预防全长克隆中248/404突变由于和支持质粒的同源重组而丧失。

从只有“位点(sites)”和HEK突变的D53 DNA中回收重组病毒(表41中的rA2)，以证实这些变化确实是如预计的那样在表型上沉默。回收含有“位点(sites)”、HEK和cp突变的重组病毒(表41中称为rA2cp)，以评价cp突变确定的表型。同样，如表41丧失，分别构建含有“位点(sites)”、HEK和cp背景与(ⅰ)248突变(rA2cp/248)，(ⅱ)两个404突变(rA2cp/404)；和404(M2)突变(rA2cp/404(M2))、404(L)突变(rA2cp/404(L))病毒。

平行地评价这些病毒在HEp-2细胞中32℃、36℃、37℃、38℃和39℃下形成噬斑的能力。该比较表明，所有的病毒在32℃下均形成噬斑，并且显示各病毒制品的滴度相差在约3个log₁₀单位内，而这在RSV独立制备时常见的实验误差范围内。在野生型重组病毒中引入附加的“位点”和HEK突变(产生病毒rA2)并没有改变病毒在升高温度时的生长能力(与生物衍生的野生型病毒(病毒A2野生型)相比)。其它cp突变的引入(产生病毒rA2cp)也没有改变其在升高温度时的生长能力。这是期望的结果，因为提供突变的生物衍生的cpRSV并没有ts表型；其突变的宿主范围不同。L中的404突变看来不是ts突变，因为rA2cp/404(L)并不是温度敏感的。然而，该突变却被证明是减毒的，这可根据本文的方法进一步分析来确定。因此，在cpts248/404病毒的两个特异性突变中，只有404M2突变是温度敏感的。再加入248和404突变(产生rA2cp/248/404病毒)会产生与其生物衍生等价病毒基本等价的ts表型(证据是在36-37℃形成噬斑的能力被大大破坏，在前一温度下形成针尖形噬斑)。这些重组病毒具有各种预计对组织培养生长没有作用的突变，以及预计可赋予ts表型的其它突变。每种类型的突变产生了与这些期望相符的结果，这证明RSV基因组可以合理的可预计的方式来操纵。

表41选定的RSV突变株的噬斑形成效率

		指定温度(℃)下的病毒滴度(log10pfu/ml)					停止温度
								病毒1	转染子	32	36	37	38	39	(℃)
A2野生型2		5.0	4.8	5.1	4.6	4.7	＞39
								rA2	14-1B-1A2	4.9	4.2	4.4	4.5	3.9	＞39
rA2cp	12-2B-1B1	5.6	5.2	5.1	4.9	5.0	＞39
								rA2cp/248	12-6B-1A1	5.8	4.8*	4.0*	＜0.7	＜0.7	38
rA2cp/404-L	16-1A-1A1	5.4	5.2	5.1	4.9	5.0	＞39
								rA2cp404-M2	15-1A-1A1	4.9	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36
rA2cp/404	16-4B-1B1	3.3	1.2*	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36
								rA2cp/248/404	32-6A-2	6.0	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36
rA2cp248/404/530	13-4B-3	5.7	4.7*	2.5*	nd	＜0.7	37
								cpts24 8/404(WLVP)2		5.1	＜0.7	＜0.7	＜0.7	＜0.7	36

¹重组病毒(r)已经噬斑纯化并在HEp-2细胞中扩增。应注意，没有调节重组的和生物衍生的病毒的原种使其含有等量的pfu/ml：这里见到的差别程度是噬斑扩增早期中RSV分离物常见的。每个重组重组病毒含有L基因位点和F-基因HEK突变。“转染子”列中的代码指转染和噬斑史。

²生物衍生的病毒：A2野生型和cpts248/404(WLVP L16210B-150)

^*针尖形噬斑

表41显示了248和4404诱变步骤中特定的突变特征。具体地说，用“位点(sites)”、HEK和cp背景以及(ⅰ)248突变(产生病毒rA2cp/248)和(ⅱ)两个404突变(病毒rA2cp/404)或404(M2)突变(病毒rA2cp/404(M2))(表39)来构建病毒。这三个病毒每一个均表现出ts表型，因此可通过ts来直接鉴定这些病毒。248突变的温度敏感性较低，而404(M2)突变则温度敏感性较高，而且不会由于404(L)突变的加入被改变。值得注意的是，404(M2)突变是温度敏感型的，因为它是转录起始区或基因起始(GS)信号内的点突变，而且这类突变从来没有表现出温度敏感型。

                         实施例Ⅺ

          构建掺入多重减毒亲代病毒的减毒突变的重组RSV

本实施例描述了制备多重减毒的重组RSV(rA2cp/248/404/530)的组合设计方案，该重组RSV掺入了一个生物衍生RSV株(具体是cpts248/404)的三个减毒突变和另一RSV株(cpts530)的另一减毒突变。该重组RSV列举了本发明中一步步工程化减毒突变以精确调节RSV疫苗中的减毒水平的方法，其中多个突变对疫苗株的进一步减毒的表型有贡献，并且增强了遗传稳定性。

用上述实施例Ⅸ和Ⅹ的cDNA和方法来构建含有“位点(sites)”、HEK、cp、248、404和530变化(表39)的D53 cDNA。它包括来自四个不同的生物衍生病毒(即cpRSV、cpts248、cpts248/404和cpts530)的减毒突变的组合。回收重组病毒(rA2cp/248/404/530)，进行噬斑纯化和扩增。用病毒RNA的RT-PCR然后进行限制性酶切消化或核苷酸测序或这两种方法来确定突变的存在。rA2cp/248/404/530在L中缺少248突变，但是具有530突变和另一个248/404突变。

如上所述(表41)，评价rA2cp/248/404在HEp-2细胞中32℃、36℃、37℃、38℃和39℃下形成噬斑的能力。所有的病毒可在32℃下形成噬斑，并且在该温度下的生长效率与野生型相似。rA2cp/248/404/530病毒在ts表型方面基本上与生物衍生的cpts248/404等价，其证据是它在37℃下形成噬斑的能力受到大大破坏。因此在rA2cp/248/404背景中加入530突变没有增加其ts表型，而且重组体L中缺乏248突变。

根据这一发现和前述实施例，本发明能从一系列突变中回收种类广泛的含有两个或多个ts突变的重组病毒，这一系列突变来自已经被鉴定并被确认的生物衍生RSV突变株(例如248、404、530、1009或1030生物突变株)。这些重组病毒的实例包括含有248/404/530突变、248/404/1009突变、248/404/1030突变、248/404/530/1009突变、248/404/530/1030突变、248/404/1009/1030突变的组合，或本文公开的其它减毒突变组合的RSV。此外，具有来自生物衍生RSV突变株的一个或多个ts突变的重组RSV可以与本文公开的其它突变(如调节RSV基因表达的减毒基因缺失或突变)结合。这样的一个实例是将248/404突变与SH基因缺失结合在重组克隆中，以产生活的候选疫苗。同样提供了其它许多组合的突变株，它们可以掺入一个或多个来自生物衍生RSV的ts突变和本文公开的任何一个或多个其它突变，如基因或基因片段的缺失、取代、加入和/或重排。具有减毒宿主范围的cp突变(而不是减毒的ts突变)也可与本发明其它的一个或多个突变一起被包括在内。这就提供了一组分别具有单独的减毒性、免疫原性和遗传稳定性和三者组合的病毒。这些来自生物衍生RSV突变株的减毒突变还可与本文确定的其它各种结构修饰(也可确定重组RSV中所需的表型变化)结合，以产生其它具有疫苗特征更佳的RSV。

                              实施例Ⅻ

           表达额外外源基因的感染性呼吸道合胞病毒的回收

用上述方法构建含有额外编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因的重组RSV。CAT编码序列侧接RSV特异性基因起始和基因末端基序(依赖于病毒RNA的RNA聚合酶的转录信号)。Kuo等，J.Virol.70:6892-6901(1996)，其纳入本文作参考。将RSV/CAT嵌合转录盒插入cDNA-编码的正义RSV完全反基因组的G和F基因间的基因间隔区内，并回收表达CAT的感染性重组RSV。CATmRNA得到有效表达，G和F mRNA的水平与野生型重组RSV表达的相当。含有CAT病毒在主要病毒蛋白质的合成水平上与野生型病毒相似。

用质粒D46来构建含有CAT基因的cDNA编码的RSV反基因组RNA。(质粒D46和D53是相同反基因组cDNA的不同制品，后者在上文已有描述)。D46可编码全部15223个核苷酸的RSV反基因组(比野生型RSV多一个核苷酸)，并且如上所述被用来制备重组感染性RSV。在其构建中，反基因组cDNA被修饰成含有四个新的限制性位点作为标记。选择其中的一个(G和F基因间的基因间隔区内的StuⅠ位点(野生型基因组3＇-5＇序列的位置5611-5616))作为外源CAT基因的插入位点。上游末端侧接RSV GS信号、下游末端侧接RS GE信号的CAT ORF拷贝衍生自前述的RSV-CAT微小基因组(Collins等，Proc.Natl.Acad.sci.USA88:9663-9667(1991)和Kuo等，J.Virol.70:6892-6901(1996)，其内容纳入本文作参考)。该RSV/CAT转录盒插入STuⅠ位点产生了D46/1024CAT cDNA(根据布达佩斯条约保藏在ATCC中，保藏号为VR-2544)，它使编码的反基因组的长度增加至总共为15984个核苷酸。尽管RSV可编码10个主要的亚基因组mRNA，而预计由D46/1024CAT反基因组制备的重组病毒可编码作为第11个mRNA的CAT基因。构建的策略如图6所示。

如上所述从cDNA-编码的反基因组RNA来制备感染性RSV的方法包括使分别编码反基因组RNA或N、P、L或M2(ORF1)蛋白(病毒RNA复制和转录所必需的)的5个cDNA在HEp-2细胞中共同表达。cDNA表达由基于MVA株的牛痘-T7重组病毒提供的T7 RNA聚合酶来驱动。MVA-T7重组病毒产生了足以在传代时引起广泛的致细胞病变的感染性子代，因此在转染后24小时时加入胞嘧啶阿拉伯糖酐(一种牛痘病毒复制的抑制剂)，并在头6次传代中维持一定量。然而，不必使用胞嘧啶阿拉伯糖酐，而且在本文以后的实例中不再使用。

测试两个反基因组cDNA，即D46 cDNA和D46/1024CAT cDNA以回收RSV。每一个均产生感染性重组RSV。被D46/1024CAT重组病毒感染的细胞表达出高水平的CAT酶。对于每个病毒，使转染上清液在新鲜细胞中传代，以5或6天的间隔、小于0.1PFU/细胞的感染复数总共连续传代8次。

D46/1024CAT基因组中的CAT序列侧接有RSV GS和GE信号，因此它应当表达成附加的、单独的聚腺苷化mRNA。对第8次传代时D46/1024CAT病毒或D46病毒感染的细胞中的RNA进行Northern印迹杂交，以测试该预计的mRNA的存在。与反义CAT特异性核糖探针的杂交检测出与预计CAT mRNA大小相符的主要条带，它含有735个核苷酸(不包括poly(A))。该物质可被寡聚(dT)乳胶颗粒滞留，这表明它是聚腺苷化的。在一些例子中，检测出具有与G-CAT连读mRNA大小相符的未成熟的较大的CAT-特异性物质。在进行感染以制备胞内RNA前，使D46/1024CAT病毒在较低的感染复数下传代8次。没有证据表明有较短形式的CAT mRNA，正如CAT基因有缺失引起的那样。

使复制印迹与CAT、SH、G或F基因的特异性反义核糖探针杂交，其中后两个基因侧接了插入的CAT基因。印迹表明，两个病毒的亚基因组SH、G和F mRNA的表达相似。用磷图象(phosphoimagery)来比较三个RSV mRNA条带与D46/1024CAT和D46的杂交放射活性量。测得每一mRNA与D46/1024CAT和D46的放射活性之比：SH,0.77；G,0.87；F,0.78。偏差统一性也许表明D46/1024CAT中的RNA比D46稍少一些，但是也有可能是D46/1024CAT RSV的mRNA积累的总水平稍低一些。三个比例的近似确认了这些mRNA的表达水平在D46/1024CAT对D46上是大致相同的。因此，在G和F基因间插入CAT基因不会对此两个基因的转录水平有很大影响。

为了分析病毒蛋白的合成的特征，用[³⁵S]甲硫氨酸标记感染的HEp-2细胞，通过PAGE直接测定，或在使标记抗原的回收基本完全的条件下免疫沉淀后进行PAGE测定，来分析细胞裂解物。针对纯化的RSV的兔抗血清的沉淀显示，D46/1024CAT和D46病毒均表达了相似量的主要病毒蛋白F₁、N、P、M和M2。每个病毒回收获得的M2蛋白水平相似，此现象值得注意，因为M2基因在插入的CAT基因的下游。同样，用三个抗-F的单克隆混合抗体免疫沉淀检测F蛋白(它由位于紧靠插入区下游的基因编码)的积累。每个病毒回收获得相似水平的F₁亚基。用上述的主要病毒蛋白作磷图象分析，进行几个独立的实验，它显示样品之间有一些差异，但是总体上两个病毒在回收蛋白质的水平上没有区别。用抗-CAT抗体的沉淀可回收D46/1024CAT而不是D46病毒的一种物质。标记的总蛋白的分析显示，N、P和M蛋白不用免疫沉淀也可进行测定(尽管后者的检测由于其细胞物质的共同迁移而较为复杂)，并且确证两个病毒产生了相似的模式。通过独立试验的磷图象证实，在CAT蛋白相应位置处，D46/1024CAT模式比D46模式含有更高的放射活性。这表明，不必沉淀就可测定全部标记蛋白中的CAT蛋白，虽然在未感染和D46感染模式中有共同迁移背景条带的存在使这种测定复杂化。

用RT-PCR来确认CAT基因存在于重组RSV基因组的预定位置中。从8次传代的D46/1024CAT和D46 RSV的细胞沉淀中分离出全部胞内RNA。选择与插入位点(RSV位置5611-5616处StuⅠ限制性核酸内切酶位点)侧接的两个引物：对应于位置5412-5429的上游正义引物和对应于位置5730-5711的下游反义引物。正义引物用RT步骤，两个引物均包括在PCR中。

D46病毒的RT-PCR产生了单一产物，该产物对应于318个核苷酸的预计片段，其表示不含其它外源序列的G/F基因接头。对D46/1024CAT病毒RNA的分析产生了电泳迁移率与预计的1079核苷酸片段非常对应的单一产物，它表示含有插入的CAT转录盒的G/F基因接头。后一PCR产生了一条主要的条带；缺少可检测的较小产物表明，重组基因组群不含大量的在该区域有缺失的分子。当不用RT步骤在D46/1024CAT病毒RNA上进行PCR分析时，没有发现有条带，这证明分析是RNA特异性的。因此，RT-PCR分析确认了D46/1024CAT重组病毒的基因组RNA中预定位置中有预计长度的插入存在。

用酶表达来测定CAT基因的稳定性。测试了第3次传代后所有代细胞沉淀的CAT表达。对于病毒D46/1024CAT，所有这些测定显示出[¹⁴C]标记的氯霉素被转化成乙酰化形式。为了研究表达的稳定性，分别对第3次或第8次传代的20或25个单个噬斑的病毒进行CAT表达分析。通过对等份细胞裂解物的测定分析判定，所有样品是阳性的，来自第8次传代的25个分离物的CAT表达水平相似。这证明每个分离物编码的CAT蛋白的活性没有被突变破坏。

为了测定噬斑的形态和大小，从第二次传代起，用每代收获的培养上清液的1/8(即0.5ml)来感染6孔板中的新鲜HEp-2细胞，细胞在甲基纤维素铺层下培育5-7天。然后与抗RSV F蛋白的单克隆抗体一起培育，再与连接了辣根过氧化物酶的第二个抗体培育，来使细胞固定和染色。以前就已经发现，cDNA D46产生的重组RSV以下几个方面与天然存在的野生型RSV分离物没有区别：在体外一定温度范围内的噬斑形成效率；复制能力，以及以前未受感染的黑猩猩呼吸道接种时引起疾病的能力。因此，认为D46重组RSV是有毒性的野生型株。用抗体染色法来比较D46和D46/1024CAT重组病毒产生的噬斑。两病毒的噬斑形态非常相似，但是根据对每个病毒的30个随机选出的噬斑进行测定，含有CAT的重组体的噬斑的平均直径是D46病毒的90％。

在单一步骤的生长循环中比较D46和D46/1024CAT病毒在组织培养物中的复制效率。用两个病毒各感染三份一组的单层细胞，在间隔12小时后取出样品，并用噬斑测定来定量。结果表明，D46/1024CAT病毒的产生比D46晚，并且获得的最大滴度低20倍。

这些结果显示，可以构建表达外源基因(在本例中是CAT基因)的、重组的、不依赖于辅助病毒的RSV。重组RSV指导了编码CAT蛋白的、预计的、聚腺苷化亚基因组mRNA的表达，CAT蛋白质可用酶试验和放射性免疫沉淀来检测。其它实例产生了在同一CAT位点插入萤光素酶基因的RSV重组体，或在SH和G基因间插入CAT或萤光素酶基因的RSV重组体。这些病毒也表现出生长能力有所降低，但是回收的大多数野生型重组病毒表现出生长能力没有降低。这表明生长能力的降低实际上是与插入的基因有关，而不是由于基因组中其它地方的偶然突变。减毒水平看来随插入基因长度的增加而增加。外源基因插入重组RSV中会降低其复制水平并且在体外传代时是稳定的这一发现提示，这为研制实用疫苗提供了另一种有效减毒的方法。同样，将表达具有抗病毒活性的蛋白质(如γ干扰素和IL-2以及其它)的基因插入重组RSV中会由于表达的抗病毒蛋白质的活性而使病毒减毒。

除了描述生长特征有所改变RSV的回收外，本文实施例还描述了重组RSV和其它非片段、负链病毒进行基因表达的其它重要方法和优点。例如，本文提供的数据表明，外源编码序列可以作为表达成单独mRNA的单独转录盒来引入。这些结果也表明，RSV可以耐受基因组长度的大量增加，例如在CAT基因情况下，基因组长度增加了762个核苷酸，变为总共有15984个核苷酸(是野生型RSV的长度的1.05倍)。能够成功回收的萤光素酶基因几乎长3倍。

由于没有校正和修复机制，已知病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶有易错特性。在RNA病毒基因组中，估计突变的频率将高达平均10^-4-10^-5/位点(Holland等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.176:1-20(1992)及其参考文献)。以这里制得的重组D46/1024 CAT RSV为例，外源基因的正确表达与病毒的复制无关，并且可以任意积累突变。这里描述的传代涉及感染复数低于0.1PFU/细胞，每次传代水平的持续时间表示了包括多回合的感染。RSV感染的组织培养中的感染性病毒产量通常较低，而胞内大分子合成是旺盛的，因此感染性病毒的产量较低似乎说明包装步骤无效而不是RNA复制的水平较低。因此，在8次连续传代过程中CAT水平的保持涉及到许多回合的RNA复制。令人惊奇的是，在测试的第8次传代的25个分离物中，非必需的CAT基因保持完整并能编码功能完全的蛋白质。而且，在对从第8代分离获得的RNA进行RT-PCR分析中没有检测到CAT基因内有缺失。

构建第二种感染性RSV-CAT重组体，重组体中XmaⅠ位点内插入了CAT转录盒，该XmaⅠ位点预先被工程改造入SH-G基因间隔区内(该位置比上文所用的F-G基因间隔区距启动子更近)。该重组体的生长性质与D46/1024 CAT重组体的相似，而CAT表达水平约高2-3倍，这与其更接近启动子的位置相一致。这说明，外源基因可以插入基因组中第二个不同的位点，而其表达水平将相应地改变。理论上讲，基因组的任何一个部分可以接受编码外源蛋白质的转录单位的插入，只要该插入不破坏mRNA-编码单位并且不干扰基因组两端发现的顺式作用序列元件。

也回收得到感染性重组RSV，其中CAT基因被萤光素酶(LUC)标记酶的基因代替。LUC编码序列约为1750bp(CAT大小的3倍)，它大于除F和L外的任何一个RSV基因。将其插入SH-G或G-F基因间隔区，并回收感染性重组病毒。LUC病毒在组织培养中生长方面比CAT病毒更减毒，这提示基因组长度的增加导致生长效率的降低。分析这些CAT和LUC病毒的特性可以确定外源基因的大小对病毒基因的表达和生长的影响，例如引入附加的转录信号有多少影响，以及增加基因组长度有多少影响。

在小复制子(minireplicon)系统中，将RSV-CAT微小基因组修饰成转录单位以“有义”的方向排列在正义反基因组中而不是微小基因组中。因此，只有当聚合酶能转录反基因组复制中间物时，才能制得亚基因组mRNA。有趣的是，当补充质粒表达的N、P、L和M2 ORF1蛋白时，该反向RSV-CAT微小基因组能够合成亚基因组、聚腺苷化的可翻译的mRNA。和微小基因组转录的情况一样，有效的mRNA合成取决于M2 ORF1蛋白。mRNA对于其反基因组模板的水平大致上和mRNA与标准的小复制子制得的微小基因组模板之比相同。这表明，反基因组和基因组可用来接受外源转录单位。因此，不将外源基因置于基因组转录次序中就可表达外源基因。其优点是，外源基因不是基因组转录程序的一部分，因此不会干扰这些基因的相对表达水平。

由于两个RSV抗原性亚组间的大多数抗原性差别在G糖蛋白中，因此，可以构建重组RSV来表达异源亚组的G蛋白，作为附加基因，以产生二价疫苗。也可插入其它一些呼吸道病毒(如人副流感3号病毒)的包膜蛋白基因，使其被重组RSV表达。其它用途包括使免疫调节剂(如白介素6)共表达，以增强感染性RSV的免疫原性。另外提供了其它应用，例如用本文所述的经修饰的RSV作为基因治疗的载体。

                           实施例ⅩⅢ

                      SH基因缺失的重组RSV

本实施例描述了一种重组RSV的制备方法，其中RSV的SH基因的表达由于除去编码SH mRNA和蛋白质的多核苷酸序列而被消除。SH蛋白是一种在氨基酸位置14-41含有推定跨膜结构域的小蛋白质(在A2株中有64个氨基酸)。它排列在膜中，C端暴露在外，并且在C端和N端结构域中均有潜在的糖基化位点(Collins等，J.Gen.Virol.71:3015-3020(1990)，其内容纳入本文作参考)。在感染的细胞中，A2株的SH蛋白以四种主要的形式积累：(ⅰ)SH0(Mr7500)，全长的未糖基化形式，它是最丰富的(Olmsted等，J.Virol.63:2019-2029(1989)，其内容纳入本文作参考)；(ⅱ)SHg(Mr 13,000-15,000)，它是含有单个N-连接的碳水化合物链的全长形式；(ⅲ)SHp(Mr 21,000-40,000)，它是经修饰的SHg，其中单个N-连接的碳水化合物链通过加入聚乳糖胺聚糖来修饰(Anderson等，Virology 191:417-430(1992)，纳入本文作参考)；(ⅵ)SHt(Mr 4800)，它是截短的、未糖基化的形式，它从第二个甲硫氨酸密码子(位置23)开始，在不同的形式中只有它不被转运到细胞表面。在纯化的毒粒中检测到有SH0和SHp形式，这表明在毒粒形态形成水平上有选择性(Collins等，同上，(1993))。

在副粘病毒中，在下列病毒中发现了表观相似的SH蛋白：猴病毒5(Hiebert等，J.Virol.55:744-751(1985)，纳入本文作参考)、牛RSV(Samal等，J.Gen.Virol.72:1715-1720(1991)，纳入本文作参考)、腮腺炎病毒(Elango等，J.Virol.63:1413-1415(1989)，纳入本文作参考)、和火鸡鼻气管炎病毒(Ling等，J.Gen.Virol.73:1709-1715(1992)，纳入本文作参考)。认为线状病毒的小疏水蛋白VP24是表面蛋白(Bukreyev等，Biochem.Mol.biol.Int.35:603-613(1995)，纳入本文作参考)，并且也是副粘病毒SH蛋白的推定对应物。

SH蛋白的功能一直没能明确。在表达质粒编码的蛋白的细胞中进行融合测定，RSV蛋白与CV-1细胞的有效融合需要F、G和SH蛋白的共同表达(Heminway等，Virology 200:801-805(1994)，纳入本文作参考)。不拟受理论束缚，RSV SH蛋白可能有几种功能：(ⅰ)它可以增强病毒吸附或穿透(Heminway等，同上)；(ⅱ)它可能参与毒粒的形态发生；或(ⅲ)它可能有不同于病毒生长中直接作用的“奢侈”功能，如与宿主免疫系统组分相互反应，如最近关于仙台病毒V蛋白的描述(Kato等，EMBO.J16:187-587(1997)，纳入本文作参考)。上述功能(ⅰ)或(ⅱ)可以包括改变膜通透性的活性，如其它人关于各种病毒的一些疏水蛋白的描述(Maramorosh等(eds.),Advances in Virus Research 45:61-112(1995)；Schubert等，FEBS Lett.(1996)；Lamb等，Virology 229:1-11(1997)，这些内容均纳入本文作参考)。SH蛋白的所有这些潜在的活性可以根据本文描述的方法和策略结合入本发明中，以在RSV重组疫苗中获得其它优点。

为了产生SH基因功能有选定破坏的重组RSV，在亲代RSV克隆中使SH基因全部缺失。上述质粒D46是这样一种克隆，它能编码RSV病毒株A2的全部反基因组RNA，以用来成功地回收重组RSV(参见美国专利申请No.08/720/132；美国专利申请No.60/007,083，这些内容均纳入本文作参考)。该反基因组比天然存在的基因组长一个核苷酸，并且含有几个任选的限制性位点标记。对D46质粒进性修改以使全部SH基因缺失，产生质粒D46/6368(图7)。

质粒D46/6368的构建包括两个亲代亚克隆D50和D39,D50含有一个T7启动子与包括前导区到L基因起始处的基因组左手末端相连，D39含有M2的末端和L基因，L基因的下游末端与锤头核酶和串联的T7转录终止子相连。用ScaⅠ(全部15223个核苷酸反基因组序列中的位置4189处)和PacⅠ(位置4623)消化D50质粒，获得的435bp片段用两个互补寡核苷酸构建成的一个短的DNA片段代替。在这一典型的缺失中，435-bp片段位于ScaⅠ和PacⅠ位点间，它对应于紧靠M基因的下游末端、和M基因的GE信号、以及除GE序列最后6个核苷酸外的全部SH基因(图7)。它被2个合成的部分互补的寡核苷酸代替，寡核苷酸是5＇-ACT CAAATA  AGTTAA TAAAAAA TATC CCGGG AT-3＇(SEQ ID NO:3)(正义链)(M GE序列用下划线表示，XmaⅠ位点用斜体字表示，分别位于左边和右边的ScaⅠ一半位点和PacⅠ粘性末端用粗的斜体字表示)和5＇-CCCGGGAT ATTTTTTAT TAACTTATTTGAGT-3＇(SEQ ID NO:4)(反义链)。该cDNA称为D50/6368，它被用来接受含有其余反基因组的D39的BamHⅠ-MluⅠ片段。这就形成了编码除缺失序列外全部反基因组的质粒D46/6368，该反基因组的长度为14825个核苷酸，比野生型质粒D46编码的反基因组短398个核苷酸。插入序列通过双脱氧序列分析来确认。可任选地引入XmaⅠ位点，这样在以后的工作中插入物能够方便地置于该位置中。

大致根据上述步骤进行转染、病毒的生长和传代、噬斑纯化、以及病毒噬斑的抗体染色，但是有两个变化：(ⅰ)不用胞嘧啶阿拉伯糖酐(一种牛痘病毒的抑制剂)；(ⅱ)用于转染的HEp-2细胞在32℃或37℃下培育，所有回收的病毒在37℃下增殖。

为评价全部RNA和poly(A)+RNA，刮下细胞并重新悬浮在100μl水中，根据生产商的建议用TrizolTM试剂(Life Technologies)来分离获得细胞内全部的RNA(只是在异丙醇沉淀后RNA用苯酚-氯仿抽提两次，然后进行乙醇沉淀)。用Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen,chatsworth,CA)来分离获得Poly(A)+RNA。

为进行逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)，将SH基因拷贝入cDNA中并扩增。以合成的正义寡核苷酸5＇-GAAAGTATATATTATGTT-3＇(SEQ ID NO:5)作为引物，用SuperscriptⅡ(Life Technologies)来对全部细胞内RNA进行逆转录。该引物与核苷酸3958-3975互补，它在SH基因的上游。在PCR中，等份cDNA产物用作模板，用上述寡核苷酸和反义寡核苷酸5＇-TATATAAGCACGATGATATG-3＇(SEQ ID NO:6)一起作为引物。后一引物对应于基因组的核苷酸4763-4782，它在SH基因的下游。在进行最初的2分钟变性步骤时加入TaqDNA聚合酶，然后进行33次循环(变性，94℃1分钟；退火，39℃1分钟；延伸，72℃2分钟)。然后在2.5％琼脂糖凝胶上分析产物。

Northern印迹杂交。在甲醛的存在下在琼脂糖凝胶上电泳分离RNA，并转印到硝酸纤维素上。使印迹与[³²P]-CTP-标记的M、SH、G、F、M2和L基因的DNA探针杂交，上述基因用Klenow聚合酶通过合成六聚体(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)的随机引导在体外各个合成制得。用MolecularDynamics Phosphorlmager 445 SI(Sunnyvale,CA)测定杂交放射活性。

³⁵S甲硫氨酸标记、免疫沉淀以及聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤根据前述方法(Bukreyev等，同上)进行。用预先制备的4％-20％Tris-甘氨酸凝胶(Novex)进行电泳。

体外生长分析。将HEp-2、293、CV-1、Vero、MRC-5、非洲绿猴肾(AGMK)、牛鼻甲(BT)和MDBK的细胞单层用于一步生长循环分析。对于每种细胞，用10⁷pFU D46/6368(减去SH)或D46(野生型重组体)病毒来感染三个25cm²的培养瓶。将含有2％胎牛血清(FBS)(Summit)的Opti-MEM(Life Technologies)用于HEp-2、Vero、293、BT、MRC-5和AGMK细胞；将含有1％或2％FBS的E-MEM(Life Technologies)用于MDBK或BT细胞。在37℃吸附3小时后，用培养液洗涤细胞3次(每次4ml)，加入4ml培养液，使细胞在37℃、5％CO₂下培育。然后，在接种后的不同时间处(见下文)，取出200μl等份的培养上清液，调至含有100mM硫酸镁和50mMHEPES缓冲液(pH7.5)，快速冷冻并保藏在-70℃下直至滴定；将取出的每个等份放在等量新鲜培养液中。滴定时，用10倍稀释的等份来感染HEp-2细胞(24孔板)，并用含有2％FBS和0.9％甲基纤维素(MCBReagents)的Opti-MEM铺层。在培育7天后，吸去培养液并在4℃下用80％甲醇固定细胞单层。使噬斑与抗RSV F蛋白的三个单克隆混合抗体一起培育，然后与连接辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG一起培育(Murphy等，Vaccine 8:497-502(1990)，纳入本文作参考)。

SH基因功能缺失的感染性重组RSV的回收根据上述步骤进行，其中将D46/6368质粒和编码N、P、L和M2 ORFl蛋白的质粒共同转染入HEp-2细胞中，并同时用表达T7 RNA聚合酶的牛痘病毒MVA株的重组体感染HEp-2细胞。平行培养物在相同的条件用D46野生型cDNA转染。转染3天后收获培养上清液并传代1次。在37℃培育6天后，将代表各初始转染的培养上清液等份种入新鲜HEp-2细胞中，在甲基纤维素铺层下培育6天，然后通过与三个抗RSVF蛋白的单克隆抗体的混合物反应，再与和辣根过氧化物酶交联的第二抗体反应来进行染色。野生型重组病毒的噬斑形态与SH-(-)病毒的噬斑形态非常相似，只是后一噬斑较大。应注意的是，每个对照和SH-(-)病毒的噬斑均含有合胞体。

为了确认回收的D46/6368病毒基因组中不含SH基因，用野生型或SH-(-)重组病毒的第1代感染细胞，回收全部的胞内RNA并作RT-PCR分析。用与SH基因上游(基因组位置3958-3975)退火的正义引物进行RT。用与相同的引物以及表示SH基因下游(核苷酸4763-4782)的反义引物进行PCR。如图8所示，野生型D46病毒产生了单个PCR产物，其对应于位置3958和4782间预计的824bp片段(泳道3)。在D46/6368例中，PCR产物较短，其对应于含有缺失的预计的426bp片段(泳道2)。PCR产物的形成取决于RT步骤，正如所预料的，显示出它们是从RNA而不适DNA衍生得到的。因此，RT-PCR分析证明了D46/6368病毒基因组在SH基因座含有预计的398个核苷酸缺失。

为测定位于SH基因上游和下游的基因的转录，从D46或D46/6368病毒感染的细胞中分离出poly(A)+mRNA，并用Northern印迹杂交分析(图9)。在poly(A)+选择前有意不使胞内RNA变性；这样，如下文所示，由于与mRNA的夹心杂交，所选的mRNA也含有基因组RNA。这就可以同时分析mRNA和基因组，而且将同一凝胶泳道中含有的mRNA和基因组RNA的丰度(abudance)相关联，使得有可能比较泳道之间的mRNA丰度。使印迹与[³²P]-标记的DNA探针杂交，这些探针用随机引导从cDNA克隆合成，因此含有两种极性的探针。所选探针各自表示M、SH、G、F、M2和L基因(图9)。

在野生型D46病毒的例子中，使杂交的SH探针与亚基因组SH mRNA以及基因组RNA杂交，但对于D46/6368病毒并不这样进行(图9)。在每一例中使其它RSV基因的特异性探针与基因组以及两种病毒的估计的主要单顺反子mRNA杂交。另外，还对许多前述双顺反子连读mRNA(如F-M2、G-F和P-M mRNA)和两种病毒一起检测。

使G特异性探针与D46/6368病毒特有的新物质杂交，该新物质表现为M和G基因的连读序列。由于干扰的SH基因缺失，这一组合是可能的。D46/6468(而不是D46)特有的同一物质另外只与M特异性探针杂交。

然后定量测定D46的每个mRNA相对于D46/6368的合成相对水平。对于每份成对比较，将给定凝胶泳道中的mRNA量相对基因组的量进行标准化。这一比较显示，D46/6368相对于D46表达下列mRNA的结果(用指定比D46/6368比D46表示)：M(1.1)、G(1.3)、F(0.61)、M2(0.32)和L(0.17)。

为了比较D46和D46/6368RSV克隆合成的病毒蛋白，以2PFU/细胞的感染复数来感染HEp-2细胞，并在感染后16-20小时和[³⁵S]甲硫氨酸培育来作标记。制得细胞裂解物，直接分析，或在用抗纯化RSB毒粒的兔抗血清免疫沉淀后进行分析。使总蛋白和免疫沉淀蛋白在4-20％梯度凝胶上进行PAGE(图10)。

在D46病毒例中，免疫沉淀蛋白的电泳模式包括未糖基化形式的SH蛋白SH0、N-糖基化形式SHg，而这两种物质均没有显示存在于D46/63668病毒中(图10)。在D46例中(而非D46/6368例中)，也可在感染细胞的全部蛋白模式中检测到SH0蛋白。另外，D46与D46/6368合成的蛋白电泳模式基本上没有区别。在免疫沉淀蛋白电泳模式中对N、P、M、F₁和M2蛋白进行磷图象分析，表明两种病毒产生的量相等(图10)。

如上所述，D46和D46/6368病毒通过噬斑测定作初步比较表明，它们在体外生长能力方面有差别。因此，我们进一步比较两种病毒在HEp-2细胞中的噬斑大小。特别注意的是，应保证单层是年轻的，没有过分生长，因为这些差别会影响噬斑的大小。在37℃甲基纤维素下培育7天后，用甲醇固定单层并拍照。结果揭示噬斑大小显著不同。对每个病毒30个噬斑进行测定，表明D46/6368病毒的噬斑平均比D46病毒的大70％。

进行进一步的实验，对表示不同种和不同组织来源的8种不同的细胞系进行生长曲线分析，以比较D46和D46/6368病毒的复制效率(表42)。用两种病毒感染各细胞单层(三个一组)，以12或24小时的间隔取样，用噬斑测定和抗体染色定量。令人惊奇的是，在三个细胞系(即HEp-2、293和AGMK-21细胞)中，D46/6368病毒产生了高于D46野生型的滴度。在HEp-2细胞中(图11)，在感染后36小时时，子代D46/6368病毒的滴度比D46病毒高2.6倍。在293细胞中(图12)，感染后36小时时D46/6368病毒的产量比D46病毒大两倍，而在感染后60和84小时时，该差别分别增加到4.8和12.6倍。在AGMK-21细胞中(图13)，感染后36小时时D46/6368病毒产量为3.2倍。在MRC-5、Vero、CV-1、MDBK和BT细胞中突变株和野生型病毒的复制间未见有显著差别，这表明SH-(-)RSV的生长基本上不受宿主范围效应的影响。

                          表42

  在不同的细胞系中D46/6368病毒的复制与D46病毒的复制的比较

                     D46/6368病毒复制

细胞类型	宿主	组织类型	与D46相比
				HEp-2	人	喉	增加
293	人	肾	增加
				MRC-5	人	肺	相似
Vero	猴	肾	相似
				AGMK-21	猴	肾	相似
CV-1	猴	肾	相似
				BT	牛	鼻甲	相似
MDBK	牛	肾	相似

本文的这些以及其它发现证明，SH基因的缺失不仅能产生可回收、感染性RSV，而且产生的重组RSV在组织培养中的生长能力有显著的改善(根据感染性病毒的产量和噬斑大小可以看出)。这种由于SH缺失而表现出组织培养生长能力的改善为开发RSV疫苗提供了有用的工具，例如克服了RSV在培养物中产量低的问题。而且，这些缺失是高度稳定的，能够抗遗传回复，这使得由其衍生得到的RSV克隆特别适于用作疫苗制剂。

为了评价典型的SH-缺失克隆在小鼠中的复制、免疫原性和保护效率，选取24只一组、呼吸道无病原体、13周龄BALB/c小鼠，第0天在轻度甲氧氟烷麻醉下，以106PFU/动物、0.1ml接种物经鼻接种，接种物是野生型重组D46病毒、SH-(-)重组D46/6368病毒或生物衍生的冷传代(cp)温度敏感型(ts)病毒cpts248/404(Firestone等，同上，(1996)，其内容纳人本文作参考)。后一种病毒在啮齿动物、黑猩猩和人中已进行了广泛的鉴定，它在小鼠的上呼吸道和下呼吸道中的复制是高度受限制的。在接种后4、5、6和8天时，每组中分别有6只小鼠被CO₂窒息杀死，然后分别获取其鼻甲和肺组织，匀浆化，用前述的抗体染色步骤在噬斑测定中对病毒定量。

在上呼吸道中，SH-(-)D46/6368病毒表现出减毒表型(表14)。在本实施例中，其复制水平比野生型病毒低10倍，与cpts248/404病毒相当。相反，在下呼吸道中(图15)，D46/6368病毒的复制水平与野生型非常相似，而cpts248/404病毒高度受限制。在其它研究中，测得亲代D46 cDNA编码的重组病毒在幼小黑猩猩(一种完全允许的实验动物)中的复制和毒力方面有野生型表型。这表明亲代重组病毒与实验室病毒株一样，具有在允许宿主中复制和致毒所需的完整基因的全部组分。列举的基因缺失RSV株的这些以及其它性能为疫苗应用提供了大量方法和病毒株。

为了进一步评价重组RSV的免疫原性和保护效率，用野生型重组体、其SH-(-)衍生株、或cpts248/404病毒如上所述对另外四组小鼠进行接种，或模拟感染。四周后使小鼠麻醉，取血清样品，经鼻给予10⁶PFU/动物的生物衍生RSVA2株作侵染接种。4天后杀死动物，收获鼻甲和肺组织，并如上所述测定感染性RSV。在ELISA中用F糖蛋白(从RSV长株感染的细胞中免疫亲和纯化获得(Murphy等，同上，1990))来测定与RSV F蛋白结合的血清IgG抗体。

D46野生型、D46/6368SH-(-)病毒和cpts248/404病毒的免疫原性测定表明，在第0天被三种病毒任一种感染的小鼠产生了高水平的F-特异性血清抗体(表43)。所有这些测试宿主的上呼吸道和下呼吸道中均有抗RSV侵染病毒复制的高度抵抗力。因此，在小鼠中诱导RSV-特异性血清抗体和保护能力方面，SH-(-)突变株与其野生型亲代没有区别。

表43 RSV D46/6368 SH-(-)病毒是有免疫原性的，它能保护小鼠的上呼吸道和下呼吸道以防御野生型病毒侵染

免疫接种病毒	小鼠编号	血清抗体滴度2(倒数平均log2)		侵染后RSV A2的复制3(log10pfu/g组织的平均值)
						第0天	第28天	鼻甲	肺
		D464	6	7.3	15.0					＜2.0	＜1.7
D46/63685	6					7.3	15.0	2.1	＜1.7
		cpts248/404	6	7.0	12.6					2.3	＜1.7
没有	6					7.6	7.3	4.6	5.1

¹在第0天用10⁶pfu的指定病毒对BALB/c小鼠组经鼻免疫接种。

²在ELISA中用来自RSV亚组A的免疫纯化的F糖蛋白测定血清IgG抗体的应答。

³在第28天用10⁶pfu的RSVA2对小鼠经鼻免疫接种，4天后杀死。

⁴野生型重组病毒。

⁵SH-(-)重组病毒。

不同RSV和不同肺病毒的SH基因的比较为生产有用的RSV重组疫苗提供了其它有用的工具和方法。例如，两个RSV抗原性亚组A和B在某些SH结构域中表现出相当高度的保守性。在两个这样的结构域中，RSV A和B的N-端区域和推定的跨膜结构域在氨基酸水平上表现出84％的相同性，而C端推定的胞内结构域更加趋异(约50％相同性)(Collins等，同上，1990)。对两个人RSV亚组B的病毒株8/60和18537的SH基因进行比较，确定只有一个氨基酸不同(Anderson等，同上)。人和牛RSV的SH蛋白有约40％的相同性，它们共有的主要结构特征包括(ⅰ)与上述相似的保守残基的不对称分布；(ⅱ)非常相似的疏水性外观；(ⅲ)有两个N-连接的糖基化位点，疏水区的两侧各有一个；和(ⅳ)在每个SH蛋白的中间疏水区的羧基端侧有一个半胱氨酸残基。(Anderson等，同上)。通过评价这些以及其它序列的相似和差别，就可对能够取代或插入感染性RSV克隆的异源序列进行选择，例如用来产生有多种特异性免疫原性效应的疫苗。

在本实施例中，D46和D46/6368的转录分析结果提供了其它重要的发现。两种病毒的总体转录水平基本上相同，但是Northern印迹分析揭示了在单个mRNA种类的积累中存在某些差别。应注意，两种病毒中位于SH基因上游的M基因的转录是基本相同的。然而，SH基因的缺失却使其下游邻近的G基因的转录增加(图16)。根据这些结果，所选RSV基因的转录水平可通过改变RSV图谱中基因的各自极性或邻近位置来简单地变化。例如，D46病毒的G基因在基因次序中是第7个，但是SH基因的缺失使其处在第6个位置，从而使在转录水平增加。与基因次序变化相关的转录增加是低于2.5-3倍的增加，这在其它重组病毒系统中已有报道(例如参见Kuo等，同上(1996))。

前述研究中揭示的另一重要的发现是，在SH-(-)突变株中，G基因下游的各个基因(F、M2和L)的表达效率较低，而且这些下游基因显示出D46/6368的极性梯度比野生型D46病毒更陡(图16)。值得注意的是，工程化的D46/6368的M-G基因间隔区在SH缺失后留下的长度为65个核苷酸。相比较而言，病毒株A2中最长的天然存在的基因间隔区是44个核苷酸的M-SH、46个核苷酸的F-M2和52个核苷酸的G-F基因间隔区，而病毒株18537的F-M2基因间隔区有56个核苷酸(Johnson等，J.Gen.Virol.69:2901-2906(1988)，纳入本文作参考)。病毒株A2中天然存在的基因间隔区(大小在1-52个核苷酸范围内)在它们对转录连读的效果和双顺反子微小基因组中的极性上没有显著差别(Kuo等，同上，1996)。然而，在聚合酶受更严重的影响后，根据本发明的方法对长度超过52个核苷酸的G-F区进行测试也许会确定上限。因此，由于SH-(-)缺失克隆中发现的基因次序改变导致了G基因转录中低于预计值的增加，以及下游基因转录降低，也许是因为M和G间工程改造使基因间隔区的长度增加的缘故。在这方面，本发明中调节RSV克隆基因间隔区选定长度的方法预计可为生产有用的RSV疫苗提供额外的工具和方法。

上述发现为改变RSV基因表达水平提供了其它两种方法。第一种方法是，非必需基因的缺失可上调下游基因的表达水平。第二种方法是，插入长度超过野生型基因间隔区的插入物可以降低下游基因的转录水平。预计下游基因表达水平的降低会确定允许宿主(如黑猩猩和人)中重组RSV的减毒表型。

SH-(-)病毒可在组织培养物中良好生长并且在上呼吸道中表现出位点特异性减毒的发现为疫苗开发提供了新的优点。目前作为活病毒疫苗评价的RSV株含有cp突变(在逐渐降低的温度下充分传代时获得cpRSV株)。典型的cp突变株包括N、F和L中的5个氨基酸取代，而且没有提供温度敏感性或冷适应性。另外这些突变对组织培养物中的生长能力没有显著影响。它们是有宿主范围的突变，因为它们在黑猩猩和人下呼吸道中的复制受限制大约100倍。另一类典型的突变ts突变已经通过cpRSV的化学诱变获得。这类突变倾向于优先限制下呼吸道中的病毒复制，因为从上呼吸道到下呼吸道存在体温增加的梯度。与这些cp和ts突变相反，这里描述的SH-(-)突变株有不同的表型，其在上呼吸道中更受限制。这是用于婴幼儿疫苗病毒特别需要的，因为在这一易受感染的主要通过鼻子呼吸的年龄组中，需要限制上呼吸道中的病毒复制以确保安全地疫苗给药。另外，在任何一个年龄组中，减低上呼吸道中的复制会降低中耳炎的发病率。除了这些优点外，SH缺失突变(包括例如近400个核苷酸和整个mRNA的消除)的特征表示了一类非常难以回复的突变。

                        实施例ⅩⅣ

            不引入异源序列、而有SH基因缺失的重组RSV

本实施例描述了一种重组RSV的制备，该RSV中通过除去编码SH蛋白的多核苷酸序列而不表达SH蛋白，而且不引入异源序列(如前述实施例ⅩⅢ那样)。在实施例ⅩⅢ中，SH编码序列被除去的RSV克隆D46/6368的特色是M-G基因间隔区延伸至长度为65个核苷酸(与天然存在的A2病毒株基因间隔区中最长为52个核苷酸相比)。该工程改造的基因间隔区含有包括SmaⅠ位点的异源序列。这些变化产生了某些有利的结果，例如下游基因的转录效率降低。然而，为了其它应用，希望在不伴随引入异源序列下进行缺失或改变，如本实施例所述(图17)。

上述D13质粒(见实施例Ⅶ)含有T7启动子，该启动子与包括前导区、NS1、NS2、N、P、M和SH基因的基因组(全部15223个反基因组序列中的序列位置1-4623)的左手端相连。用两个部分互补的合成核苷酸来代替ScaⅠ(位置4189)至PacⅠ(位置4623)片段，两个核苷酸是：ACTCAAATA AGTTAAT(SEQ IDNO:7)(正义链，ScaⅠ的一半位点在左侧用斜体字表示，PacⅠ粘性末端在右侧用斜体字表示，GE信号部分用下划线表示)和 TAACTTATTTGAGT(SEQ IDNO:8)(反义链，ScaⅠ的一半位点在右侧用斜体字表示，GE信号部分是下划线表示)。该突变使M GE信号、M-SH基因间隔区和全部SH基因缺失，效果是将SHGE信号上移代替M基因GE信号。没有引入异源核苷酸。获得的cDNA称为D13/6340，将其连接入G-F-M2 cDNA片段(见实施例Ⅶ)产生D50/6340,D50/6340从前导区跨越到L基因的开始处。

切下D50/6340的Stui-BamHⅠ片段(从位置5613到8501，包括F和M2基因)，用D50-COR#1(同基因的，只是F基因含有本文描述的两个“HEK”变化)的等价片段代替。获得的D50/6340HEK用来接受D39位点#12的BamⅠ-MluⅠ片段(含有反基因组cDNA其余部分和侧接的核酶以及T7转录终止子(见实施例Ⅸ))。D39位点#12是含有“位点”突变的一种D39(见表39)。这样获得了编码SH基因缺失并含有“HEK”和“位点”改变的反基因组的质粒D46/6340HEK。D46/6340反基因组cDNA比其亲代D46 cDNA短417bp。用双脱氧核苷酸测序法来确定ScaⅠ-PacⅠ合成插入物的序列。然后用上述步骤将cDNA成功地用于回收重组病毒。回收的D46/6340 SH缺失病毒在噬斑表型和生长能力方面与实施例ⅩⅢ描述的D46/6368 SH缺失病毒相似。

                        实施例ⅩⅤ

                     NS2蛋白表达的剔除

本实施例描述了消除RSV蛋白NS2的合成。在本例中选择的消除方法是将终止密码子引入翻译开放读框(ORF)中。

D13是表示完全反基因组cDNA左手端的cDNA，其包括T7启动子、前导区、以及NS1、NS2、N、P、M和SH基因(序列位置1-4623)(图18)。将该cDNA的AatⅡ-AflⅡ片段(含有T7启动子和NSl和NS2基因)亚克隆入pGem载体中，对其进行寡核苷酸定向诱变，以将两个翻译终止密码子和一个XhoⅠ位点(在翻译水平上是沉默的，用作标记)引入NS2 ORF中(图18)。确认突变的序列，将AatⅡ-AflⅡ片段插入D13中，然后将D13与含有G、F和M2基因的PacⅠ-BamHⅠ片段连接，产生含有插入突变的cDNA D50。然后将D50与D39的插入物连接，从而产生用来回收重组病毒的完全反基因组cDNA。重组RSV中突变的存在通过RT-PCR产物的测序和XhoⅠ消化来确认。另外，NS2蛋白的合成缺乏通过Western印迹分析用抗合成肽(表示NS2的C端)的兔抗血清来确定。

图19显示了采用上述用于SH-(-)病毒的测定方法就NS2剔除病毒与重组野生型病毒的生长曲线所作的比较。这些结果证明NS2剔除病毒的感染性病毒释放速度比野生型低。另外，该突变株和野生型病毒的噬斑比较表明NS2剔除病毒的噬斑大大减小。因此这类突变可掺入活的重组RSV中，以产生改变的表型(在本例中是病毒生长速度的降低和体外噬斑的减小)。因此，根据已知的体外噬斑的减小和体内减毒之间的相互关系，这些以及其它剔除方法和突变株可提供更多种类的重组RSV疫苗制剂。

                          实施例ⅩⅥ

            改变顺式作用调节的序列元件来调节RSV表型

本实施例描述了通过改变示范的基因NS1和NS2的顺式作用转录信号来调节重组RSV病毒的生长能力。

对表示基因组左手端的亚克隆的D13的AatⅡ-AflⅡ片段进行寡核苷酸定向诱变，以将变化引入NS1和NS2基因的GE信号中(图20)。NS1 GE信号有一个核苷酸取代，而NS2的GE信号有三个取代和一个插入。这些变化可将各信号变成与天然存在的N基因GE信号相同。

用双脱氧核苷酸测序法来确认这些突变，将AatⅠ-AflⅡ片段替换成D13(D13取自上述步骤)，从而构建成含有这些突变的完全D53 DNA。用该克隆来回收重组病毒。

在HEp-2细胞中分析GE-突变病毒，并与野生型病毒比较噬斑大小和生长曲线。结果表明，其噬斑比野生型大(平均大30％)，而生长速度和病毒产量均有所增加。这些结果与通过改变顺式调节元件来改变基因表达一致，例如降低了连读mRNA的水平，增加了下游基因的蛋白表达。获得的重组病毒最好表现为生长动力学提高和噬斑增大，本文仅仅提供了一个实施例，通过改变基因组或反基因组中顺式作用调节元件来改变RSV表型。本文的这些以及其它实施例证明了具有广泛表型冰花的各种特异性RSV突变对于提供有效的疫苗制剂是有利的。

                        实施例ⅩⅦ

                  具有NS1基因缺失的重组RSV

本实施例描述了重组RSV的制备，其中由于除去了编码NS1蛋白的多核苷酸，NS1蛋白不被表达。NS1蛋白是139个氨基酸的小蛋白，它由3＇-5＇RSV基因图谱中的第一个基因编码(Collins和Wertz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3208-3212(1983)以及Collins和Wertz,Virol.243:442-451(1985))。其mRNA是RSVmRNA中最丰富的，这符合转录梯度(即基因表达的效率随着到启动子3＇端距离的增加而降低)理论。认为NS1蛋白是表达最丰富的RSV蛋白之一，但是还需要进行仔细的定量比较。尽管它很丰富，NS1蛋白的功能却还未得到明确鉴定。在重建的RSV微小基因组系统(微小基因组的转录和RNA复制由质粒提供的病毒蛋白来驱动)(Grosfeld等，J.Virol.69:5677-5686(1995),Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996))中，NS1蛋白看来是转录和RNA复制的负调节蛋白。因此，它可能是调节蛋白。其中非常可能还存在其它功能有待鉴定。NS1蛋白在其它副粘病毒中没有已知的对应物。不拟受理论束缚，NS1可能有以下几个功能：(ⅰ)它可能是如上所述的病毒调节因子；(ⅱ)它可能参与病毒生长循环的其它一些方面；(ⅲ)它可能与宿主细胞反应，以防止编程性细胞死亡；和(ⅳ)它可能与宿主免疫系统反应，从而来抑制宿主防御系统的反应(如产生干扰素、抗原加工或B或T细胞的功能作用)。NS1蛋白的所有这些潜在的活性也许会为RSV重组疫苗提供其它优点。

为了产生具有选定的NS1基因功能破坏的重组RSV，使编码NS1蛋白的序列全部从亲代RSV cDNA中缺失。在该典型的缺失例中，诱变反应的底物是前文所述的质粒D13，它含有完全反基因组cDNA左手端的cDNA，包括T7 RNA启动子、前导区、以及NS1、NS2、N、P、M和SH基因(序列位置1-4623)。诱变根据Byrappa等的方法(Byrappa等，Genome Res.5:404-407(1995))进行，该方法是制备具有所需变化的合成引物，使其面对质粒中的相反方向，然后PCR扩增，连接并转化入细菌中。正向PCR引物是GACACA ACCCA CAATG ATAATACAC CAC(SEQ ID NO:9)(NS2 ORF的第二个密码子用斜体字表示)，反向PCR引物是CATCTC TAACCA AGGGAG TTAAA TTTAA GTGG(SEQ ID NO:10)(NS2ORF的起始密码子的互补处用斜体字表示)。将D13用作高保真性聚合酶进行PCR的模板。产生的缺失从紧靠NS1 ORF的AUG起始位点上游到紧靠NS2 ORFAUG起始位点上游(图21)。这导致了529bp的缺失，其包括NS1编码序列、NS1 GE信号、NS1-NS2基因间隔区和NS2 GS信号。它将NS1基因的上游末端(即它的GS和非蛋白编码区)与NS2 ORF融合。NS1基因的该部分应被特意地保留下来，因为它紧靠前导区，因此可能含有转录或RNA复制中重要的序列。含有突变的区域用序列分析来确认。然后将Aat2和Avr2位点(图21)间约2230bp的节段切下并插入新的D13拷贝中，该步骤可以预防RSV cDNA中其它地方可能出现的PCR错误。用含有NS1缺失的D13质粒(D13ΔNS1)来构建含有“HEK”和“位点”变化的完全反基因组(D53ΔNS1)。

然后用D53ΔNS1质粒来回收病毒。令人感兴趣的是，回收的RSVΔNS1病毒在组织培养物中产生了小噬斑。用RT-PCR来确认缺失的存在。RSVΔNS1病毒能够生长(尽管效率较低)的事实说明NS1蛋白是辅助蛋白，是病毒生长非必需的。RSVΔNS1病毒的噬斑大小与上述的NS2剔除病毒(由于在NS2编码序列中引入翻译终止密码子而使NS2蛋白不能被表达(实施例ⅩⅤ))的噬斑相似。小的噬斑表型通常与减毒突变有关。因此这类突变可掺入活的重组RSV中以产生改变的表型。因此，根据体外噬斑大小与体内减毒性之间的相互关系，这些以及其它剔除方法和突变株提供了更多的重组RSV疫苗制剂。

                           实施例ⅩⅧ

                    具有NS2基因缺失的重组RSV

本实施例描述了由于除去编码蛋白的多核苷酸而使NS2蛋白不能被表达的一种重组RSV的制备方法。在上文实施例ⅩⅤ中，重组病毒(称为NS2剔除或NS2-ko)是通过在NS2编码序列中引入两个翻译终止密码子(而不是除去编码序列来使NS2基因不被表达而制得的。原型NS2剔除病毒中NS2蛋白表达的消除与小噬斑表型以及体外病毒生长的动力学降低有关。随后的分析表明，在NS2剔除病毒传代时，可能会有少量病毒回复成野生型生长能力。序列分析表明，引入的两个翻译终止密码子已经突变成有义密码子，尽管其编码排列与亲代野生型病毒中的不同。经Western印迹分析，这足以恢复NS2蛋白的合成，从而解释了野生型表型出现的原因。本方案提供了改进，因为除去了全部NS2基因，从而使相同位点的回复不可能发生。

NS2蛋白是124个氨基酸的小的蛋白，它由基因次序中的第二个基因编码(Collins和Wertz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3208-3212(1983)以及Collins和Wertz,Virol.243:442 451(1985))。它的mRNA是RSV mRNA中次丰富的，认为NS2蛋白是表达最丰富的RSV蛋白之一，但是还有待作仔细的定量比较。尽管它很丰富，但是NS2蛋白的功能还有待鉴定。在重建的RSV微小基因组系统(微小基因组的转录和RNA复制由质粒提供的病毒蛋白来推动)(Grosfeld等，J.Virol.69:5677-5686(1995),Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996))中，NS2蛋白对转录和RNA的复制有适度的负调节作用。由于需要有相当高水平的NS2蛋白表达水平来观察这一作用，因此它的显著性还不清楚。因此，和对NS1蛋白建议的一样，NS2可能：(ⅰ)是病毒调节因子；(ⅱ)参与病毒生长循环的其它一些方面；(ⅲ)与宿主细胞反应，以防止编程性细胞死亡；和(ⅳ)与宿主免疫系统反应，从而抑制宿主防御系统的反应(如产生干扰素、抗原加工方面或B或T细胞的功能)。根据这里描述的方法和策略，NS2蛋白的所有这些潜在活性可以结合入本发明，从而为RSV重组疫苗提供其它优点。

为了产生具有选定的NS2基因功能破坏的重组RSV，使编码其mRNA的序列从亲代RSV cDNA中缺失。在该典型的缺失例中，诱变反应的底物是前文所述的质粒D13，它含有完全反基因组cDNA左手端，其包括T7 RNA启动子、前导区、以及NS1、NS2、N、P、M和SH基因(序列位置1-4623)。诱变根据Byrappa等的方法(Byrappa等，Genome Res.5:404-407(1995))进行，该方法是制备具有所需变化的合成引物，使其面对质粒中的相反方向，然后进行PCR扩增，连接并转化入细菌中。正向PCR引物是 TTAAGG AGAGAT ATAAGA TAGAA GATG(SEQID NO:11)(NS2 N基因间隔区的序列用下划线表示，N GS信号的第一个核苷酸用斜体字表示)，反向PCR引物是 GTTTT ATATT AACTA ATGGT GTTAGTG(SEQ ID NO:12)(与NS1 GE信号互补处用下划线表示)。将D13用作高保真性聚合酶进行PCR的模板。缺失从紧靠NS1 GE信号的下游到紧靠NS2 GS信号的下游(图22)。因此突变缺失了522个核苷酸，它们包括NS1-NS2基因间隔区和全部的NS2基因(图22)。

在含有缺失的D13质粒中，用序列分析确认突变区域。然后，将Aat2和Avr2位点(图22)间约2230bp的节段切下并插入新的D13拷贝中，该步骤可以预防RSVcDNA中其它地方可能出现的PCR错误。用含有NS2缺失的D13质粒(D13ΔNS2)来构建含有所有“HEK”和“位点”变化的完全反基因组(D53ΔNS2)。

然后用D53ΔNS2质粒来回收病毒。如同上文对NS2剔除病毒所述的(参见实施例ⅩⅤ),RSVΔNS1形成了小噬斑。用RT-PCR来确认缺失的存在。RSVΔNS2病毒能够生长(尽管效率较低)的事实说明NS2蛋白是辅助蛋白，是病毒生长非必需的。小的噬斑表型通常与减毒突变有关，因此可掺入活的重组RSV中以产生改变的表型。因此，根据体外噬斑大小与体内减毒性之间的相互关系，这些以及其它剔除方法和突变株将提供更多的重组RSV疫苗制剂。

                           实施例ⅩⅨ

              分泌形式的G糖蛋白的翻译起始位点的消除

本实施例描述了通过消除分泌形式的G糖蛋白的翻译起始位点来制备重组RSV的方法。RSV G蛋白以两种形式合成：作为锚固着Ⅱ型膜内在蛋白和作为N端切除形式，后者基本上没有任何膜固着点并且被分泌(Hendricks等，J.Virol.62:2228-2233(1988))。这两种形式看来是由两个不同的起始位点处的翻译引发来得到的：较长的形式在G ORF的第一个AUG处引发，第二种形式在密码子48处的ORF的第二个AUG处引发，并被蛋白酶解进一步加工(Roberts等，J.Virol.68:4538-4546(1994))。第二个起始位点的存在是高度保守的，它存在于目前已测序的所有人、牛和羊RSV中。已经指出，G糖蛋白的可溶形式可通过作为捕获中和抗体的诱饵来缓和宿主免疫性。同样，已经指出，可溶性G蛋白能优先刺激Th2偏性应答，该应答在随后接触RSV时的免疫病理学增强有关。对于RSV疫苗病毒，非常希望使抗体捕获或免疫系统的偏性刺激程度减到最小，因此希望消除分泌形式的G糖蛋白的表达。这类突变的作用是定性和/或定量地改变宿主免疫应答，而不是使病毒直接减毒。

在Byrappa等的PCR诱变方法(Byrappa等，Genome Rse.5:404-407(1995))中，将带有G、F、M2基因的质粒pUC19(参见实施例Ⅶ)用作模板。正向引物是：TTATAA TTGCA GCCAT CATAT TCATA GCCTCGG(SEQ ID NO:13)，反向引物是：GTGAAG TTGAG ATTA CA ATTGC CAGAATGG(SEQ ID NO:14)(两个核苷酸变化的互补处用下划线表示)。这导致了两个氨基酸编码改变(见图23)，即AUG-48变为AUU-48(消除了翻译起始位点)和AUA-49变为GUA-49(插入了MfeⅠ位点以便于检测突变)。

用双脱氧核苷酸测序法来确认突变位点周围的序列。然后将含有G基因的PacⅠ-StuⅠ片段取代成质粒D50(前文中有所描述，其含有从前导区到L基因开始处的9个基因)。然后用它来构建完全反基因组cDNA D53/GM48Ⅰ，以用于回收病毒。在以前的文献中已经显示，在重组牛痘病毒表达G cDNA(在其它RSV基因的分离物中)的条件下，这些突变消除了分泌形式的G的表达(Roberts等.J.Virol.68:4538-4546(1994))。

平行地评价回收的D53/M48Ⅰ病毒的两个分离物与野生型重组RSV的体外生长动力学(图24)。结果表明，两种病毒比野生型生长更缓慢，滴度更低。这一生长上的差别可能是由于G蛋白的表达减少的缘故，预计这是能够发生的，因为分泌形式的AUG-48被除去，而本实施例中膜结合形式的AUG-1没有被修饰成增加其表达。事实上，G ORF的AUG-1的表达被认为是次优的，因为它在G序列中是位于另一开放读框的第二AUG之前，所述第二AUG打开了一个与G ORF的AUG-1重叠的短的ORF，因此降低了其表达水平。认为反基因组cDNA中消除该ORF的额外变化也许会恢复全长性能。另一方面，位置48和49处的突变(单独作用或组合作用)也许会对G蛋白的功能产生不利影响。位置49的氨基酸可能会恢复成天然的编码排列，而位置48可能被选择以不同的氨基酸取代，从而可能会恢复全长性能。这些可能性很容易用这里所述的方法和材料来评价。尽管如此，D53/GM48Ⅰ病毒的回收，表明分泌形式的转录起始位点可以被消除，而且该病毒现在可在实验动物和人中进行评价。

尽管前述本发明通过一些描述和便于理解的实施例进行了详细的描述，然而显然，对本发明进行的某些修改和变化都属于本发明附加权利要求的范围之内。

                           序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：

   (A)姓名：美国政府

   (B)街道：Box OTT

   (C)城市：Bethesda

   (D)州：Maryland

   (E)国家：美国

   (F)邮政编码(邮编)：20892

   (G)电话：

   (H)电传：

   (I)电报：(ⅱ)发明名称：从克隆的核苷酸序列制备减毒呼吸道合胞病毒疫苗的方法(ⅲ)序列数目：14(ⅳ)计算机可读形式：

   (A)记录介质类型：软盘

   (B)计算机：IBM PC兼容型

   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.25(ⅴ)本申请资料：

   (A)申请号：US

   (B)申请日：1997年7月15日

   (C)分类：(ⅵ)在先申请资料：

   (A)申请号：US 60/047,634

   (B)申请日：1997年5月23日(ⅵ)在先申请资料：

   (A)申请号：US 60/046,141

   (B)申请日：1997年5月09日(ⅵ)在先申请资料：

   (A)申请号：US 60/021,773

   (B)申请日：1996年7月15日(ⅶ)律师/代理人信息：

   (A)姓名：Parmelee,Steven W.

   (B)登记号：31,990

   (C)参考/案卷号：17634-000510(ⅷ)通讯信息：

   (A)电话：206-467-9600

   (B)电传：415-576-0300(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：15223碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:ACGCGAAAAA ATGCGTACAA CAAACTTGCA TAAACCAAAA AAATGGGGCA AATAAGAATT     60TGATAAGTAC CACTTAAATT TAACTCCCTT GGTTAGAGAT GGGCAGCAAT TCATTGAGTA         120TGATAAAAGT TAGATTACAA AATTTGTTTG ACAATGATGA AGTAGCATTG TTAAAAATAA         180CATGCTATAC TGATAAATTA ATACATTTAA CTAATGCTTT GGCTAAGGCA GTGATACATA         240CAATCAAATT GAATGGCATT GTGTTTGTGC ATGTTATTAC AAGTAGTGAT ATTTGCCCTA         300ATAATAATAT TGTAGTAAAA TCCAATTTCA CAACAATGCC AGTACTACAA AATGGAGGTT         360ATATATGGGA AATGATGGAA TTAACACATT GCTCTCAACC TAATGGTCTA CTAGATGACA         420ATTGTGAAAT TAAATTCTCC AAAAAACTAA GTGATTCAAC AATGACCAAT TATATGAATC         480AATTATCTGA ATTACTTGGA TTTGATCTTA ATCCATAAAT TATAATTAAT ATCAACTAGC         540AAATCAATGT CACTAACACC ATTAGTTAAT ATAAAACTTA ACAGAAGACA AAAATGGGGC         600AAATAAATCA ATTCAGCCAA CCCAACCATG GACACAACCC ACAATGATAA TACACCACAA         660AGACTGATGA TCACAGACAT GAGACCGTTG TCACTTGAGA CCATAATAAC ATCACTAACC         720AGAGACATCA TAACACACAA ATTTATATAC TTGATAAATC ATGAATGCAT AGTGAGAAAA         780CTTGATGAAA AGCAGGCCAC ATTTACATTC CTGGTCAACT ATGAAATGAA ACTATTACAC         840AAAGTAGGAA GCACTAAATA TAAAAAATAT ACTGAATACA ACACAAAATA TGGCACTTTC         900CCTATGCCAA TATTCATCAA TCATGATGGG TTCTTAGAAT GCATTGGCAT TAAGCCTACA         960AAGCATACTC CCATAATATA CAAGTATGAT CTCAATCCAT AAATTTCAAC ACAATATTCA        1020CACAATCTAA AACAACAACT CTATGCATAA CTATACTCCA TAGTCCAGAT GGAGCCTGAA        1080AATTATAGTA ATTTAAAACT TAAGGAGAGA TATAAGATAG AAGATGGGGC AAATACAACC        1140ATGGCTCTTA GCAAAGTCAA GTTGAATGAT ACACTCAACA AAGATCAACT TCTGTCATCC        1200AGCAAATACA CCATCCAACG GAGCACAGGA GATAGTATTG ATACTCCTAA TTATGATGTG        1260CAGAAACACA TCAATAAGTT ATGTGGCATG TTATTAATCA CAGAAGATGC TAATCATAAA        1320TTCACTGGGT TAATAGGTAT GTTATATGCG ATGTCTAGGT TAGGAAGAGA AGACACCATA        1380AAAATACTCA GAGATGCGGG ATATCATGTA AAAGCAAATG GAGTAGATGT AACAACACAT        1440CGTCAAGACA TTAATGGAAA AGAAATGAAA TTTGAAGTGT TAACATTGGC AAGCTTAACA        1500ACTGAAATTC AAATCAACAT TGAGATAGAA TCTAGAAAAT CCTACAAAAA AATGCTAAAA        1560GAAATGGGAG AGGTAGCTCC AGAATACAGG CATGACTCTC CTGATTGTGG GATGATAATA        1620TTATGTATAG CAGCATTAGT AATAACTAAA TTAGCAGCAG GGGACAGATC TGGTCTTACA        1680GCCGTGATTA GGAGAGCTAA TAATGTCCTA AAAAATGAAA TGAAACGTTA CAAAGGCTTA        1740CTACCCAAGG ACATAGCCAA CAGCTTCTAT GAAGTGTTTG AAAAACATCC CCACTTTATA        1800GATGTTTTTG TTCATTTTGG TATAGCACAA TCTTCTACCA GAGGTGGCAG TAGAGTTGAA        1860GGGATTTTTG CAGGATTGTT TATGAATGCC TATGGTGCAG GGCAAGTGAT GTTACGGTGG        1920GGAGTCTTAG CAAAATCAGT TAAAAATATT ATGTTAGGAC ATGCTAGTGT GCAAGCAGAA        1980ATGGAACAAG TTGTTGAGGT TTATGAATAT GCCCAAAAAT TGGGTGGTGA AGCAGGATTC        2040TACCATATAT TGAACAACCC AAAAGCATCA TTATTATCTT TGACTCAATT TCCTCACTTC        2100TCCAGTGTAG TATTAGGCAA TGCTGCTGGC CTAGGCATAA TGGGAGAGTA CAGAGGTACA        2160CCGAGGAATC AAGATCTATA TGATGCAGCA AAGGCATATG CTGAACAACT CAAAGAAAAT        2220GGTGTGATTA ACTACAGTGT ACTAGACTTG ACAGCAGAAG AACTAGAGGC TATCAAACAT        2280CAGCTTAATC CAAAAGATAA TGATGTAGAG CTTTGAGTTA ATAAAAAATG GGGCAAATAA        2340ATCATCATGG AAAAGTTTGC TCCTGAATTC CATGGAGAAG ATGCAAACAA CAGGGCTACT        2400AAATTCCTAG AATCAATAAA GGGCAAATTC ACATCACCCA AAGATCCCAA GAAAAAAGAT        2460AGTATCATAT CTGTCAACTC AATAGATATA GAAGTAACCA AAGAAAGCCC TATAACATCA        2520AATTCAACTA TTATCAACCC AACAAATGAG ACAGATGATA CTGCAGGGAA CAAGCCCAAT        2580TATCAAAGAA AACCTCTAGT AAGTTTCAAA GAAGACCCTA CACCAAGTGA TAATCCCTTT        2640TCTAAACTAT ACAAAGAAAC CATAGAAACA TTTGATAACA ATGAAGAAGA ATCCAGCTAT        2700TCATACGAAG AAATAAATGA TCAGACAAAC GATAATATAA CAGCAAGATT AGATAGGATT        2760GATGAAAAAT TAAGTGAAAT ACTAGGAATG CTTCACACAT TAGTAGTGGC AAGTGCAGGA        2820CCTACATCTG CTCGGGATGG TATAAGAGAT GCCATGGTTG GTTTAAGAGA AGAAATGATA        2880GAAAAAATCA GAACTGAAGC ATTAATGACC AATGACAGAT TAGAAGCTAT GGCAAGACTC        2940AGGAATGAGG AAAGTGAAAA GATGGCAAAA GACACATCAG ATGAAGTGTC TCTCAATCCA        3000ACATCAGAGA AATTGAACAA CCTATTGGAA GGGAATGATA GTGACAATGA TCTATCACTT        3060GAAGATTTCT GATTAGTTAC CAATCTTCAC ATCAACACAC AATACCAACA GAAGACCAAC        3120AAACTAACCA ACCCAATCAT CCAACCAAAC ATCCATCCGC CAATCAGCCA AACAGCCAAC        3180AAAACAACCA GCCAATCCAA AACTAACCAC CCGGAAAAAA TCTATAATAT AGTTACAAAA        3240AAAGGAAAGG GTGGGGCAAA TATGGAAACA TACGTGAACA AGCTTCACGA AGGCTCCACA        3300TACACAGCTG CTGTTCAATA CAATGTCTTA GAAAAAGACG ATGACCCTGC ATCACTTACA        3360ATATGGGTGC CCATGTTCCA ATCATCTATG CCAGCAGATT TACTTATAAA AGAACTAGCT        3420AATGTCAACA TACTAGTGAA ACAAATATCC ACACCCAAGG GACCTTCACT AAGAGTCATG        3480ATAAACTCAA GAAGTGCAGT GCTAGCACAA ATGCCCAGCA AATTTACCAT ATGCGCTAAT        3540GTGTCCTTGG ATGAAAGAAG CAAACTAGCA TATGATGTAA CCACACCCTG TGAAATCAAG        3600GCATGTAGTC TAACATGCCT AAAATCAAAA AATATGTTGA CTACAGTTAA AGATCTCACT        3660ATGAAGACAC TCAACCCTAC ACATGATATT ATTGCTTTAT GTGAATTTGA AAACATAGTA        3720ACATCAAAAA AAGTCATAAT ACCAACATAC CTAAGATCCA TCAGTGTCAG AAATAAAGAT        3780CTGAACACAC TTGAAAATAT AACAACCACT GAATTCAAAA ATGCTATCAC AAATGCAAAA        3840ATCATCCCTT ACTCAGGATT ACTATTAGT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   (A)长度：15225碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SE0 ID NO:2:ACGCGAAAAA ATGCGTACTA CAAACTTGCA CATTCGGAAA AAATGGGGCA AATAAGAATT           60TGATAAGTGC TATTTAAGTC TAACCTTTTC AATCAGAAAT GGGGTGCAAT TCACTGAGCA          120TGATAAAGGT TAGATTACAA AATTTATTTG ACAATGACGA AGTAGCATTG TTAAAAATAA         180CATGTTATAC TGACAAATTA ATTCTTCTGA CCAATGCATT AGCCAAAGCA GCAATACATA         240CAATTAAATT AAACGGTATA GTTTTTATAC ATGTTATAAC AAGCAGTGAA GTGTGCCCTG         300ATAACAACAT TGTAGTAAAA TCTAACTTTA CAACAATGCC AATATTACAA AACGGAGGAT         360ACATATGGGA ATTGATTGAG TTGACACACT GCTCTCAATT AAACGGTCTA ATGGATGATA         420ATTGTGAAAT CAAATTTTCT AAAAGACTAA GTGACTCAGT AATGACTAAT TATATGAATC         480AAATATCTGA TTTACTTGGG CTTGATCTCA ATTCATGAAT TATGTTTAGT CTAACTCAAT         540AGACATGTGT TTATTACCAT TTTAGTTAAT ATAAAAACTC ATCAAAGGGA AATGGGGCAA         600ATAAACTCAC CTAATCAATC AAACTATGAG CACTACAAAT GACAACACTA CTATGCAAAG         660ATTAATGATC ACGGACATGA GACCCCTGTC GATGGATTCA ATAATAACAT CTCTCACCAA         720AGAAATCATC ACACACAAAT TCATATACTT GATAAACAAT GAATGTATTG TAAGAAAACT         780TGATGAAAGA CAAGCTACAT TTACATTCTT AGTCAATTAT GAGATGAAGC TACTGCACAA         840AGTAGGGAGT ACCAAATACA AGAAATACAC TGAATATAAT ACAAAATATG GCACTTTCCC         900CATGCCTATA TTTATCAATC ATGGCGGGTT TCTAGAATGT ATTGGCATTA AGCCTACAAA         960ACACACTCCT ATAATATACA AATATGACCT CAACCCGTAA ATTCCAACAA AAAAAACCAA        1020CCCAACCAAA CCAAGCTATT CCTCAAACAA CAATGCTCAA TAGTTAAGAA GGAGCTAATC        1080CGTTTTAGTA ATTAAAAATA AAAGTAAAGC CAATAACATA AATTGGGGCA AATACAAAGA        1140TGGCTCTTAG CAAAGTCAAG TTAAATGATA CATTAAATAA GGATCAGCTG CTGTCATCCA        1200GCAAATACAC TATTCAACGT AGTACAGGAG ATAATATTGA CACTCCCAAT TATGATGTGC        1260AAAAACACCT AAACAAACTA TGTGGTATGC TATTAATCAC TGAAGATGCA AATCATAAAT        1320TCACAGGATT AATAGGTATG TTATATGCTA TGTCCAGGTT AGGAAGGGAA GACACTATAA        1380AGATACTTAA AGATGCTGGA TATCATGTTA AAGCTAATGG AGTAGATATA ACAACATATC        1440GTCAAGATAT AAATGGAAAG GAAATGAAAT TCGAAGTATT AACATTATCA AGCTTGACAT        1500CAGAAATACA AGTCAATATT GAGATAGAAT CTAGAAAATC CTACAAAAAA ATGCTAAAAG        1560AGATGGGAGA AGTGGCTCCA GAATATAGGC ATGATTCTCC AGACTGTGGG ATGATAATAC        1620TGTGTATAGC AGCACTTGTA ATAACCAAAT TAGCAGCAGG AGACAGATCA GGTCTTACAG        1680CAGTAATTAG GAGGGCAAAC AATGTCTTAA AAAATGAAAT AAAACGCTAC AAGGGTCTCA        1740TACCAAAGGA TATAGCTAAC AGTTTTTATG AAGTGTTTGA AAAACACCCT CATCTTATAG        1800ATGTTTTTGT GCACTTTGGC ATTGCACAAT CATCAACAAG AGGGGGTAGT AGAGTTGAAG        1860GAATCTTTGC AGGATTGTTT ATGAATGCCT ATGGTTCAGG GCAAGTAATG CTAAGATGGG        1920GAGTTTTAGC CAAATCTGTA AAAAATATCA TGCTAGGTCA TGCTAGTGTC CAGGCAGAAA        1980TGGAGCAAGT TGTGGAAGTC TATGAGTATG CACAGAAGTT GGGAGGAGAA GCTGGATTCT        2040ACCATATATT GAACAATCCA AAAGCATCAT TGCTGTCATT AACTCAATTT CCTAACTTCT        2100CAAGTGTGGT CCTAGGCAAT GCAGCAGGTC TAGGCATAAT GGGAGAGTAT AGAGGTACGC        2160CAAGAAACCA GGATCTTTAT GATGCAGCCA AAGCATATGC AGAGCAACTC AAAGAAAATG        2220GAGTAATAAA CTACAGTGTA TTAGACTTAA CAGCAGAAGA ATTGGAAGCC ATAAAGAATC        2280AACTCAACCC TAAAGAAGAT GATGTAGAGC TTTAAGTTAA CAAAAAATAC GGGGCAAATA        2340AGTCAACATG GAGAAGTTTG CACCTGAATT TCATGGAGAA GATGCAAATA ACAAAGCTAC        2400CAAATTCCTA GAATCAATAA AGGGCAAGTT CGCATCATCC AAAGATCCTA AGAAGAAAGA        2460TAGCATAATA TCTGTTAACT CAATAGATAT AGAAGTAACC AAAGAGAGCC CGATAACATC        2520TGGCACCAAC ATCATCAATC CAACAAGTGA AGCCGACAGT ACCCCAGAAA CCAAAGCCAA        2580CTACCCAAGA AAACCCCTAG TAAGCTTCAA AGAAGATCTC ACCCCAAGTG ACAACCCTTT        2640TTCTAAGTTG TACAAAGAAA CAATAGAAAC ATTTGATAAC AATGAAGAAG AATCTAGCTA        2700CTCATATGAA GAGATAAATG ATCAAACAAA TGACAACATT ACAGCAAGAC TAGATAGAAT        2760TGATGAAAAA TTAAGTGAAA TATTAGGAAT GCTCCATACA TTAGTAGTTG CAAGTGCAGG        2820ACCCACTTCA GCTCGCGATG GAATAAGAGA TGCTATGGTT GGTCTGAGAG AAGAAATGAT        2880AGAAAAAATA AGAGCGGAAG CATTAATGAC CAATGATAGG TTAGAGGCTA TGGCAAGACT        2940TAGGAATGAG GAAAGCGAAA AAATGGCAAA AGACACCTCA GATGAAGTGC CTCTTAATCC        3000AACTTCCAAA AAATTGAGTG ACTTGTTGGA AGACAACGAT AGTGACAATG ATCTGTCACT        3060TGATGATTTT TGATCAGTGA TCAACTCACT CAGCAATCAA CAACATCAAT AAAACAGACA        3120TCAATCCATT GAATCAACTG CCAGACCGAA CAAACAAATG TCCGTCAGCG GAACCACCAA        3180CCAATCAATC AACCAACTGA TCCATCAGCA ACCTGACGAA ATTAACAATA TAGTAACAAA        3240AAAAGAACAA GATGGGGCAA ATATGGAAAC ATACGTGAAC AAGCTTCACG AAGGCTCCAC        3300ATACACAGCA GCTGTTCAGT ACAATGTTCT AGAAAAAGAT GATGATCCTG CATCACTAAC        3360AATATGGGTG CCTATGTTCC AGTCATCTGT ACCAGCAGAC TTGCTCATAA AAGAACTTGC        3420AAGCATCAAC ATACTAGTGA AGCAGATCTC TACGCCCAAA GGACCTTCAC TACGAGTCAC        3480GATTAACTCA AGAAGTGCTG TGCTGGCTCA AATGCCTAGT AATTTCATCA TAAGCGCAAA        3540TGTATCATTA GATGAAAGAA GCAAATTAGC ATATGATGTA ACTACACCTT GTGAAATCAA        3600AGCATGCAGT CTAACATGCT TAAAAGTGAA AAGTATGTTA ACTACAGTCA AAGATCTTAC        3660CATGAAGACA TTCAACCCCA CTCATGAGAT CATTGCTCTA TGTGAATTTG AAAATATTAT        3720GACATCAAAA AGAGTAATAA TACCAACCTA TCTAAGACCA ATTAGTGTCA AAAACAAGGA        3780TCTGAACTCA CTAGAAAACA TAGCAACCAC CGAATTCAAA AATGCTATCA CCAATGCGAA        3840AATTATTCCC TATGCTGGAT TA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   (8)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:GTTTTATATT AACTAATGGT GTTAGTG                         27(2)SEQ ID NO:13的信息：   (ⅰ)序列特征：

   (A)长度：33碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：CDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:TTATAATTGC AGCCATCATA TTCATAGCCT CGG                        33(2)SEQ ID NO:14的信息：(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：30碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:GTGAAGTTGA GATTACAATT GCCAGAATGG                           30

Claims (62)

1．一种分离的感染性重组呼吸道合胞病毒RSV，其包含RSV基因组或反基因组、主要核衣壳蛋白N、核衣壳磷蛋白P、大聚合酶蛋白L和RNA聚合酶延伸因子，其中重组RSV至少有两个减毒突变，其中一个突变导致RSV聚合酶基因中氨基酸Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处的温度敏感型取代，或基因M2的基因起始序列中的温度敏感型核苷酸取代。

2．根据权利要求1所述的RSV，它至少有三个减毒突变。

3．根据权利要求1所述的RSV，其中Phe₅₂₁或Gln₈₃₁被Leu取代。

4．根据权利要求1所述的RSV，其中Met₁₁₆₉被Val取代。

5．根据权利要求1所述的RSV，其中Tyr₁₃₂₁被Asn取代。

6．根据权利要求1所述的RSV，其中至少两个突变选自Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉和Tyr₁₃₂₁处的温度敏感型取代。

7．根据权利要求6所述的RSV，其中温度敏感型取代在Phe₅₂₁和Met₁₁₆₉处。

8．根据权利要求6所述的RSV，其中温度敏感型取代在Gln₈₃₁和Tyr₁₃₂₁处。

9．根据权利要求1所述的RSV，其中两个突变发生在编码Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处温度敏感型取代的密码子中。

10．根据权利要求1所述的RSV，它以10³-10⁶PFU的减毒病毒的剂量来配制。

11．根据权利要求1所述的RSV，它还包括一个核苷酸修饰，该修饰可导致选自生长能力改变、减毒作用、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制性或免疫原性改变的表型。

12．根据权利要求11所述的RSV，其中SH、NS1、NS2或G基因被修饰。

13．根据权利要求12所述的RSV，其中SH基因缺失。

14．根据权利要求12所述的RSV，其中NS2基因与SH基因在位置上相互替换。

15．根据权利要求11所述的RSV，其中所述其它核苷酸修饰是对顺式作用调节序列，该调节序列被修饰或在RSV基因组或反基因组中被重排。

16．根据权利要求15所述的RSV，其中顺式作用调节序列被异源调节序列代替。

17．根据权利要求16所述的RSV，其中异源调节序列是不同RSV基因的顺式作用调节序列。

18．根据权利要求11所述的RSV，其中核苷酸修饰选自：在选定基因中引入终止密码子，或相对选定基因的序列、位置的改变，或GS或GE转录信号的存在发生改变。

19．根据权利要求11所述的RSV，其中核苷酸修饰包括RSV基因组或反基因组中翻译起始密码子序列前后中的插入、缺失或改变。

20．根据权利要求11所述的RSV，其中一个RSV亚组病毒中编码免疫原性F或G蛋白的基因或基因片段被引入不同RSV亚组病毒的基因组或反基因组中。

21．根据权利要求11所述的RSV，其中RSV基因组或反基因组被修饰成可编码非RSV分子，这些非RSV分子选自：细胞因子、T辅助表位、限制性位点标记、或能够引发哺乳动物宿主中保护性免疫应答的微生物病原体蛋白。

22．根据权利要求11所述的RSV，它包含代替RSV中相应的基因或基因片段的来自PIV的基因或基因片段。

23．根据权利要求22所述的RSV，其中PIV基因或基因片段编码HN或F糖蛋白。

24．根据权利要求23所述的RSV，其中基因片段编码PIV1、PIV2或PIV3的HN或F的胞质尾区、跨膜结构域或胞外结构域。

25．根据权利要求11所述的RSV，它还包括编码PIV免疫原性表位或蛋白区的多核苷酸序列，从而该RSV可引发对PIV和RSV抗原的免疫应答。

26．一种分离的感染性RSV颗粒，它包含重组的RSV基因组或反基因组、主要核衣壳蛋白N、核衣壳磷蛋白P、大聚合酶蛋白L和RNA聚合酶延伸因子，其中基因组或反基因组被修饰成消除或调控表达SH、NS1、NS2、或G基因或顺式作用调节序列。

27．根据权利要求26所述的RSV，其中SH基因缺失。

28．根据权利要求26所述的RSV，其中NS2基因与SH基因位置上相互取代。

29．根据权利要求26所述的RSV，其中顺式作用调节序列被异源调节序列代替。

30．根据权利要求29所述的RSV，其中异源调节序列是不同RSV基因或PIV中的顺式作用调节序列。

31．根据权利要求26所述的RSV，其中RSV基因组或反基因组还包括编码不同RSV亚组的免疫原性F或G蛋白的基因或基因片段。

32．根据权利要求26所述的RSV，其中基因组或反基因组包含人RSV序列和至少一个非人RSV序列构成的嵌合体。

33．根据权利要求26所述的RSV，其特征在于基因组或反基因组编码的人RSV，其中选定的基因或基因片段被来自异源RSV的对应基因或基因片段代替。

34．根据权利要求33所述的RSV，其中所选基因是NS1或NS2，对应基因是N。

35．根据权利要求26所述的RSV，其中RSV基因组或反基因组还包括非RSV分子的核苷酸序列，该非RSV分子选自细胞因子、T辅助表位、限制性位点标记或能够引发哺乳动物宿主内保护性免疫应答的微生物病原体的蛋白。

36．根据权利要求26所述的RSV，它还包括代替RSV的相应基因或基因片段的来自PIV的基因或基因片段。

37．根据权利要求36所述的RSV，其中PIV基因或基因片段编码PIV1、PIV2或PIV3的HN或F糖蛋白。

38．一种分离的感染性RSV颗粒，它包含重组RSV基因组或反基因组、主要核衣壳蛋白N、核衣壳磷蛋白P、大聚合酶蛋白L和RNA聚合酶延伸因子，其中RSV基因组或反基因组通过下列方式来修饰：在选定基因中引入终止密码子，选定基因的序列、位置的改变，或GS或GE转录信号的存在发生改变。

39．一种刺激个体的免疫系统诱导针对抗呼吸道合胞病毒的保护的方法，该方法包括给予个体免疫充足量的权利要求1、26或38所述的分离的减毒重组RSV，所述RSV在生理上可接受的载体中。

40．根据权利要求39所述的方法，给予剂量为10³-10⁶PFU的减毒RSV。

41．根据权利要求39所述的方法，其中对上呼吸道给予减毒RSV。

42．根据权利要求39所述的方法，其中减毒RSV以喷雾、药滴或气雾剂方式给药。

43．根据权利要求39所述的方法，其中减毒RSV被给予RSV抗体血清阴性的个体，或具有经胎盘获得母体的RSV抗体的个体。

44．一种诱导出抗RSV的保护性的疫苗，它包含免疫充足量的权利要求1、26或38所述的分离的减毒重组RSV，所述RSV在生理上可接受的载体中。

45．根据权利要求44所述的疫苗，其中配制成剂量为10³-10⁶的减毒RSV。

46．根据权利要求44所述的疫苗，它被配制成经过喷雾、药滴或气雾剂来对上呼吸道给药。

47．一种组合物，它包含含有编码RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子的表达载体，所述基因组或反基因组至少有两个减毒突变，至少一个突变导致了RSV聚合酶基因中氨基酸Phe₅₂₁、Gln₈₃₁、Met₁₁₆₉或Tyr₁₃₂₁处的温度敏感型取代或基因M2的基因起始序列中的温度敏感型核苷酸取代，组合物还包含一种或多种包含一或多个编码RSV的N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的多核苷酸分子的表达载体，从而使得表达时能产生感染性RSV颗粒。

48．根据权利要求47所述的组合物，其中感染性RSV颗粒是病毒。

49．一种从一种或多种编码感染性减毒RSV的分离的多核苷酸分子制备所述RSV颗粒的方法，该方法包括：

使权利要求47所述的表达载体在细胞或不含细胞的裂解物中共同表达，从而产生所述的感染性RSV颗粒。

50．根据权利要求49所述的方法，其中RSV基因组或反基因组以及N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白由两种或多种不同的表达载体表达。

51．根据权利要求49所述的方法，其中RSV基因组或反基因组被修饰成消除或调控表达SH、NS1、NS2、或G基因或顺式作用调节序列。

52．根据权利要求51所述的方法，其中SH基因缺失。

53．根据权利要求51所述的方法，其中NS2基因与SH基因在位置上相互替换。

54．根据权利要求51所述的方法，其中顺式作用调节序列被异源调节序列代替。

55．根据权利要求50所述的方法，其中异源调节序列是不同RSV基因或PIV中的顺式作用调节序列。

56．根据权利要求51所述的方法，其中RSV基因组或反基因组还包括编码不同RSV亚组的免疫原性F或G蛋白的基因或基因片段。

57．根据权利要求51所述的方法，其中基因组或反基因组包含人RSV序列和至少一种非人RSV序列构成的嵌合体。

58．根据权利要求51所述的方法，其中基因组或反基因组编码人RSV，其中选定的基因或基因片段被来自异源RSV的对应基因或基因片段代替。

59．根据权利要求51所述的方法，其中RSV基因组或反基因组还包括非RSV分子的核苷酸序列，该非RSV分子选自细胞因子、T辅助表位、限制性位点标记或能够引发哺乳动物宿主内保护性免疫应答的微生物病原体的蛋白。

60．根据权利要求51所述的方法，其中RSV基因组或反基因组还包括编码PIV1、PIV2或PIV3的HN或F糖蛋白的PIV基因或基因片段。

61．一种RSV株，其选自cpts RSV 248-ATCC VR 2450、cpts 248/404-ATCCVR 2454、cpts 248/955-ATCC VR 2453、cpts RSV 530-ATCC VR 2452、cpts530/1009-ATCC VR 2451、或cpts 530/1030-ATCC VR 2455。

62．一种RSV株，其选自B-1 cp52/2B5-ATCC VR2542或B-1 cp-23-ATCCVR。

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