CN108103097B - 麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体而言，公开了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用。本发明提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到，可以降低拯救出来的麻疹病毒的复制能力，达到减弱病毒毒力的目的，且不会改变病毒的免疫原性。本发明提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，通过辅助质粒和上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到，该麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株致病力较低甚至高度致弱，同时能激发机体产生并维持高滴度的中和抗体，达到更好的免疫效果。

Description

麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用。
背景技术
麻疹病毒(Measles virus，MV)属于副粘病毒病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，为不分节段的单股负链RNA病毒，病毒颗粒呈多形态或球形，外部由囊膜包裹。麻疹是麻疹病毒引起的严重威胁公众健康的急性传染病，能够引起严重的临床症状，甚至导致患者死亡，属于国家法定乙类传染病。
国内所用的麻疹疫苗株为沪191(S191)株，沪191株生产的麻疹疫苗稳定性良好，其临床安全性和免疫原性均良好，有效性和安全性已经得到明确的肯定，是中国麻疹疫苗的主要生产株。麻疹疫苗接种能激发持久的免疫应答，带来长期的保护作用，遗传性稳定同时无致病性的返祖现象。但最初制备麻疹疫苗的工艺复杂，需要在不同的细胞系中传代许多次才能得到减毒的毒株，费时费力。同时，国内研究发现现有“沪191”麻疹疫苗对麻疹流行株保护能力正在下降，且接种疫苗株后仍会引起一定副反应，5％～15％的接种者会出现高于39℃的高热，5％的接种者会出现皮疹。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，可通过体外定点突变技术对该质粒载体中麻疹病毒基因组的任意位点进行致弱突变，缓解现有技术中制备的麻疹疫苗株费时、费力、病毒毒力较高等问题。
为了解决接种麻疹疫苗后仍会引起一定副反应等问题，本发明提供了一种致病力进一步减弱的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，该疫苗株是以经典的麻疹病毒减毒株(S191)基因组为骨架，对其甲基转移酶区域进行突变后，结合辅助质粒拯救获得的重组疫苗。
本发明提供了一种上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株在制备具有高免疫力的减毒麻疹疫苗中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到。
进一步地，所述甲基转移酶保守序列为麻疹病毒结构蛋白中的L蛋白第VI保守区的氨基酸序列。
进一步地，所述氨基酸序列包括K1766，G1788，G1790，G1792，D1881，K1917或E1954。
进一步地，所述包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体为pYES-MV-S191。
进一步地，对所述pYES-MV-S191中G1788，G1790或G1792氨基酸分别进行G到A的突变得到麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A或pYES-MV-S191-G1792A。
进一步地，用于制备pYES-MV-S191-G1788A质粒的引物为：
G1788A-F：5’-gacggcttgttcttggctgagggatcgggttc-3’(SEQ ID NO.1)；
G1788A-R：5’-gaacccgatccctcagccaagaacaagccgtc-3’(SEQ ID NO.2)；
用于制备pYES-MV-S191-G1790A质粒的引物为：
G1790A-F:5’-gttcttgggtgaggcatcgggttctatgttg-3’(SEQ ID NO.3)；
G1790A-R:5’-caacatagaacccgatgcctcacccaagaac-3’(SEQ ID NO.4)；
用于制备pYES-MV-S191-G1792A质粒的引物为：
G1792A-F:5’-cttgggtgagggatcggcttctatgttgatcac-3’(SEQ ID NO.5)；
G1792A-R:5’-gtgatcaacatagaagccgatccctcacccaag-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明还提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，由辅助质粒pT7CFE1-N、辅助质粒pT7CFE1-P、辅助质粒pT7CFE1-L和上述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到；
其中，辅助质粒pT7CFE1-N含有麻疹病毒的核衣壳蛋白编码基因；
辅助质粒pT7CFE1-P含有麻疹病毒的磷蛋白编码基因；
辅助质粒pT7CFE1-L含有麻疹病毒RNA聚合酶编码基因。
本发明还提供了上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株在制备预防或治疗麻疹的疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到。用所述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救出来的麻疹病毒为甲基转移酶缺陷型，甲基转移酶活性受到抑制，由此影响病毒的帽甲基化结构的形成；从而实现降低拯救出来的病毒的复制能力及病毒蛋白表达水平，达到减弱病毒毒力的目的，且不会改变病毒的免疫原性。
本发明提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，通过辅助质粒和上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到，该麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株致病力较低甚至高度致弱，同时能激发机体产生并维持高滴度的中和抗体，达到更好的免疫效果。
附图说明
图1为本发明实施例2中麻疹病毒分段扩增示意图；
图2为本发明实施例2中N、P、M1、M2、F、H、L1和L2核苷酸序列片段PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳验证结果图；
图3为本发明实施例4中辅助质粒pT7CFE1-N、pT7CFE1-P和pT7CFE1-L构建过程流程示意图；
图4为本发明实施例5中麻疹病毒S191疫苗株的全长基因组质粒构建过程流程示意图；
图5为本发明实施例5中麻疹病毒S191疫苗株的全长基因组质粒琼脂糖凝胶电泳验证结果图；
图6A为本发明实施例6中麻疹病毒拯救检测的CPE结果图；
图6B为本发明实施例6中麻疹病毒拯救检测的CPE结果图；
图7为本发明实施例6中麻疹病毒拯救检测的测序结果图；
图8为本发明实施例6中麻疹病毒拯救检测的间接免疫荧光法检测结果图；
图9为本发明实施例7中麻疹病毒的甲基转移酶保守序列预测结果图；
图10为本发明实施例9中rMV-S191-G1788A、rMV-S191-G1790A和rMV-S191-G1792A突变疫苗测序结果图；
图11为本发明实施例10中rMV-S191、rMV-S191-G1788A、rMV-S191-G1790A和rMV-S191-G1792A的噬斑大小测定结果图；
图12为本发明实施例12中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A一步生长曲线结果图；
图13为本发明实施例12中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A不同时间点引起细胞病变的改变结果图；
图14为本发明实施例13中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A对棉鼠致病力滴度实验研究结果图；
图15A为本发明实施例14中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A接种棉鼠后四周的抗体中和滴度实验结果图；
图15B为本发明实施例14中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A接种棉鼠后第四周的中和抗体量结果图；
图16为本发明实施例14中rMV-S191、rMV-S191-G1788A和rMV-S191-G1792A接种棉鼠四周后体内病毒滴度实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到。用上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救出来的麻疹病毒为甲基转移酶缺陷型，甲基转移酶活性受到抑制，由此影响病毒的帽甲基化结构的形成；从而实现降低拯救出来的病毒的复制能力及病毒蛋白表达水平，达到减弱病毒毒力的目的，且不会改变病毒的免疫原性。
在一个优选的实施方式中，甲基转移酶保守序列为麻疹病毒结构蛋白中的L蛋白第VI保守区的氨基酸序列。麻疹病毒为单股负链RNA病毒，通过病毒自身的L蛋白完成对病毒mRNA加帽并对帽子结构进行甲基化，运用DNAStar对包含麻疹病毒在内的副黏病毒科病毒的L蛋白进行比对，发现麻疹病毒所属的副黏病毒科中所有病毒的L蛋白第VI保守区氨基酸序列中的甲基供体依赖性甲基转移酶家族是一系列富含G、D和E的保守序列。该保守序列可能与麻疹病毒甲基转移酶活性有关。
在一个优选的实施方式中，氨基酸序列包括K1766，G1788，G1790，G1792，D1881，K1917或E1954。
在一个优选的实施方式中，包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体为pYES-MV-S191。pYES-MV-S191中含有S191麻疹病毒的全基因组序列，通过使用GeneArtTMHigh-Order Genetic Assembly System试剂盒将涵盖麻疹病毒S191疫苗株全基因组序列的N、P、M1、M2、F、H、L1和L28个片段一次性连到pYES-T7载体中制备得到。
在一个优选的实施方式中，对重组载体pYES-MV-S191中G1788，G1790或G1792氨基酸分别进行G到A的突变得到麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A或pYES-MV-S191-G1792A。
通过对包含麻疹病毒在内的副黏病毒科病毒的L蛋白进行比对，发现麻疹病毒的甲基转移酶保守序列为结构蛋白L蛋白第VI保守区的氨基酸序列，包括K1766，G1788，G1790，G1792，D1881，K1917或E1954。对含有S191麻疹病毒全基因组野生型的重组载体pYES-MV-S191中的G1788，G1790或G1792氨基酸进行突变处理，可以抑制麻疹病毒的甲基转移酶活性，进而影响麻疹病毒的帽甲基化结构的形成，实现降低麻疹病毒毒力的目的。将G1788，G1790或G1792氨基酸分别由G(甘氨酸)突变成A(丙氨酸)，具体地，将编码G1788，G1790或G1792氨基酸的核苷酸序列中的第二个碱基G点突变成碱基C，构建麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A或pYES-MV-S191-G1792A。
在一个优选的实施方式中，用于制备pYES-MV-S191-G1788A质粒的引物为：
G1788A-F：5’-gacggcttgttcttggctgagggatcgggttc-3’(SEQ ID NO.1)；
G1788A-R：5’-gaacccgatccctcagccaagaacaagccgtc-3’(SEQ ID NO.2)；
用于制备pYES-MV-S191-G1790A质粒的引物为：
G1790A-F:5’-gttcttgggtgaggcatcgggttctatgttg-3’(SEQ ID NO.3)；
G1790A-R:5’-caacatagaacccgatgcctcacccaagaac-3’(SEQ ID NO.4)；
用于制备pYES-MV-S191-G1792A质粒的引物为：
G1792A-F:5’-cttgggtgagggatcggcttctatgttgatcac-3’(SEQ ID NO.5)；
G1792A-R:5’-gtgatcaacatagaagccgatccctcacccaag-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明还提供了一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，由辅助质粒pT7CFE1-N、辅助质粒pT7CFE1-P、辅助质粒pT7CFE1-L和上述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到；
其中，辅助质粒pT7CFE1-N含有麻疹病毒的核衣壳蛋白编码基因；
辅助质粒pT7CFE1-P含有麻疹病毒的磷蛋白编码基因；
辅助质粒pT7CFE1-L含有麻疹病毒RNA聚合酶编码基因。
麻疹病毒属于单股负链RNA病毒，病毒的基因组RNA不具有感染性，单独的正义和反义基因组RNA不能做作为模板进行复制与翻译。病毒的基因组需要与病毒的聚合酶一起形成功能性核糖核蛋白复合体(RNPs)才能在细胞内启动基因组的自我复制和翻译，所以实现遗传性拯救的关键条件是在靶细胞提供RNPs。对于负链RNA病毒麻疹病毒的拯救可以通过病毒全基因组克隆与辅助质粒共转染于哺乳动物细胞获得。这种技术手段称之为反向遗传学技术。应用这种技术手段可以选择性的在基因水平对麻疹病毒基因组进行定点修饰，按照设计位点获得相应重组病毒。麻疹病毒基因组由N、P、M、F、H和L 6个基因组成。RNA前体需要通过5’端加帽甲基化、3’端多聚核苷酸化和RNA剪接三个过程才能够转化为成熟的mRNA。帽甲基化结构对于mRNA的稳定，转运，翻译以及前体mRNA的剪接至关重要。单股负链RNA病毒mRNA帽子结构的形成与甲基化的机制与宿主细胞完全不同，且单股负链RNA病毒的复制与转录都在细胞质中完成。这预示着病毒mRNA帽子结构的形成可以成为一个很好靶向用来研究抗病毒药物和研发新型疫苗。通过影响病毒mRNA帽子结构的形成可以影响病毒的基因表达进而影响病毒的复制、病毒的扩散和病毒的感染能力。麻疹病毒mRNA需要经过加帽和甲基化后才能成为成熟的mRNA，麻疹病毒蛋白的翻译也可视作为是帽依赖性的翻译过程。通过抑制麻疹病毒mRNA帽子结构的甲基化可以降低病毒的复制及病毒蛋白表达从而使病毒毒力减弱，麻疹病毒的甲基化转移酶位于病毒L蛋白上，L蛋白不是机体中和抗体作用的靶位，理论上病毒甲基转移酶活性的改变不会影响到病毒免疫原性。本发明提供的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株通过辅助质粒和上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到，该麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株致病力低或高度致弱，同时能激发机体产生并维持高滴度的中和抗体，达到更好的免疫效果。
本发明还提供了上述麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株在制备预防或治疗麻疹的疫苗中的应用。
为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
如无特殊说明，本发明实施例中所用仪器或试剂如下：
TRIzol Reagent细胞裂解液，
Figure GDA0001697311130000091
III反转录酶，随机引物(RandomPrimer Mix)，PCR高保真酶(
Figure GDA0001697311130000092
High-Fidelity 2X Master Mix)，内切酶和连接酶购于New England Biolabs；pEASY-Blunt Cloning Kit、感受态细胞(Trans10 ChemicallyCompetent Cell)和Trans2K Plus DNA Marker购于全式金公司；质粒抽提试剂盒(QIAprepspin mini prep kit)，胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)以及RNA抽提试剂盒RNeasy Mini Kit购买于Qiagen公司；羧苄青霉素钠购于索莱宝公司；实验用引物均由华大基因公司合成。
实施例1提取病毒基因组RNA
沪191(S191)麻疹减毒疫苗株由浙江省疾病预防控制中心提供，按照TRIzolReagent细胞裂解液说明书操作实验。
实施例2 PCR扩增制备S191疫苗株全基因组的DNA片段
按照
Figure GDA0001697311130000093
III反转录试剂盒的说明书，以抽提的麻疹病毒RNA为模板，利用Random Primer Mix将麻疹病毒RNA逆转录为cDNA，置于负20℃保存备用。
以cDNA为模板，采用8对相互有重叠的引物扩增制备涵盖S191疫苗株全长基因组的8个DNA片段，8个片段分别是N、P、M1、M2、F、H、L1和L2，麻疹病毒的分段扩增示意图如图1所示。反应程序为：98℃预变性40s，98℃变性8s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸2min。用1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图2所示，成功扩增得到8个目标DNA片段，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit对麻疹病毒基因组PCR产物进行纯化与回收。
上述实验用8对引物分别为：
Figure GDA0001697311130000094
Figure GDA0001697311130000101
实施例3重组质粒的构建
采用pEASY-Blunt Cloning Kit将目的片段N、P、M1、M2、F、H、L1和L2片段与pEASY-Blunt Cloning克隆载体相连接分别获得pEASY-N、pEASY-P、pEASY-M1、pEASY-M2、pEASY-F、pEASY-H、pEASY-L1和pEASY-L2，其中发现本实验保有毒株的H片段上的8762位置存在T-C的点突变，采用体外定点突变技术将突变位置改回，最终构建得到重组质粒pEASY-N、pEASY-P、pEASY-M1、pEASY-M2、pEASY-F、pEASY-H-M、pEASY-L1和pEASY-L2。突变位置作为基因标记，用于与实验室原有毒株进行区分。
实施例4辅助质粒的构建
使用GeneArtTM Seamless Cloning and Assembly Kit试剂将MV-N-CDS、MV-P-CDS、MV-L-CDS1、MV-L-CDS2分别连到经过本实验室改造过的表达载体pT7CFE1-CMyc中，构建过程流程示意图如图3所示。具体步骤如下：以pEASY-N、pEASY-P、pEASY-L1和pEASY-L2分别为模板，利用引物分别扩增麻疹病毒S191疫苗株的MV-N-CDS、MV-P-CDS、MV-L-CDS1、MV-L-CDS2。pT7CFE1-CMyc载体质粒用NdeI、XhoI于37℃酶切消化1h，得到线性片段。使用GeneArtTM Seamless Cloning and Assembly Kit将MV-N-CDS与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段、MV-P-CDS与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段、MV-L-CDS1和MV-L-CDS2与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段分别进行连接并转化，表达获得N、P、L的3种辅助质粒，分别为pT7CFE1-N、pT7CFE1-P、pT7CFE1-L。
上述实验所用引物如下：
Figure GDA0001697311130000111
Figure GDA0001697311130000121
实施例5麻疹病毒S191疫苗株的全长质粒的构建
首先，人工合成含有T7RNA聚合酶启动序列，丁型肝炎病毒核酶序列和T7RNA终止子序列的双链DNA片段，通过双酶切的方式连接到pYES-2载体中，构建中间质粒pYES-TRZ。
接着，用GeneArtTM High-Order Genetic Assembly System试剂盒将涵盖麻疹病毒S191疫苗株全基因组序列的N、P、M1、M2、F、H、L1和L28个片段一次性连到pYES-T7载体中获得阳性质粒pYES-MV-S191。构建过程流程示意图如图4所示，PCR鉴定结果如图5所示。构建全长质粒后M1的质粒引物与M基因末端序列同源性很高，故扩增出全长M序列序列比原M1更长。其余片段凝胶电泳条带的大小与理论结果一致。
实施例6麻疹病毒拯救及检测
麻疹病毒拯救
麻疹病毒S191疫苗株全长克隆pYES-MV-S191 5μg，以及其辅助质粒pT7CFE1-N1.5μg、pT7CFE1-P 1.5μg和pT7CFE1-L 0.5μg共转染BHK-T7细胞。转染3天后收集细胞上清混合物感染Vero细胞，培养4-5天后，观察细胞病变情况，冻融细胞，离心收集上清，继续传至下一代并观察细胞病变情况，重复拯救麻疹病毒8次，拯救效率为100％，冻融细胞收集上清，提取病毒RNA。
观察病毒产生的特异性的细胞病变
麻疹病毒能够导致Vero细胞形成合胞体，产生特异性的合胞体样病变(CPE)，转染质粒接种BHK-T7细胞3天后，上清接到Vero细胞中若拯救成功可观察到明显的CPE。结果如图6A和图6B所示。
测序验证
抽提病毒RNA，测序检测H8672位置的突变情况，排除实验室原毒株污染，结果如图7所示，表明麻疹病毒质粒构建和拯救成功。
间接免疫荧光发验证
通过间接免疫荧光法进一步对拯救获得的重组麻疹病毒进行鉴定，结果如图8所示，通过在荧光显微镜下观察，结果可见感染麻疹病毒的Vero，荧光显微镜下可见阳性的红色荧光信号，而未感染病毒的未观察到任何荧光信号。
实施例7包含麻疹病毒在内的副黏病毒甲基转移酶位点分析
麻疹病毒为不分节段的单股负链RNA病毒，病毒mRNA帽甲基化结构的形成完成不同于宿主细胞，不分节段的单股负链RNA病毒通过病毒自身的L蛋白完成对病毒mRNA加帽并对帽子结构进行甲基化，运用DNAStar对包含麻疹病毒在内的副黏病毒科病毒的L蛋白进行比对，发现麻疹病毒所属的副黏病毒科中所有病毒的L蛋白第VI保守区氨基酸序列中的甲基供体依赖性甲基转移酶家族是一系列富含G、D和E的保守区域。该保守区域可能与麻疹病毒甲基转移酶活性有关。比对结果见于图9。具体保守序列包括K1766，G1788，G1790，G1792，D1881，K1917或E1954。
实施例8麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒的构建及鉴定
利用下述引物，以重组质粒pYES-MV-S191为模板，用Site-Directed MutagenesisPCR对pYES-MV-S191进行点突变实验，获得阳性甲基转移酶缺陷型质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A和pYES-MV-S191-G1792A。
引物名称 序列表号 引物序列(5’-3’)
G1788A-F SEQ ID NO.1 gacggcttgttcttggctgagggatcgggttc
G1788A-R SEQ ID NO.2 gaacccgatccctcagccaagaacaagccgtc
G1790A-F SEQ ID NO.3 gttcttgggtgaggcatcgggttctatgttg
G1790A-R SEQ ID NO.4 caacatagaacccgatgcctcacccaagaac
G1792A-F SEQ ID NO.5 cttgggtgagggatcggcttctatgttgatcac
G1792A-R SEQ ID NO.6 gtgatcaacatagaagccgatccctcacccaag
实施例9麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株的拯救
分别取麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A或pYES-MV-S191-G1792A 5ug，与其辅助质粒pT7CFE1-N 1.5ug、pT7CFE1-P 1.5ug和pT7CFE1-L 0.5ug共转染BHK-T7细胞。转染3天后收集细胞上清混合物感染Vero细胞，培养4-5天后，观察细胞病变情况，冻融细胞，离心收集上清，继续传至下一代并观察细胞病变情况，冻融细胞收集上清，提取病毒RNA，利用RT-PCR扩增目的片段，测序鉴定鉴定拯救的病毒。如图10所示,成功拯救出的rMV-S191-G1788A、rMV-S191-G1790A和rMV-S191-G1792A突变疫苗。
实施例10麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株噬斑大小测定
将麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株与亲本麻疹病毒减毒疫苗株接种在6孔中的单层Vero细胞后，加入含有5％FBS，1％低熔点琼脂糖的MEM中，37℃培养6天后用5％(W/V)结晶紫染色。rMV-S191-G1788A、rMV-S191-G1790A、rMV-S191-G1792A突变株在琼脂上形成的噬斑明显的小于rMV-S191亲本株所形成的噬斑。结果如图11所示。
实施例11病毒一步生长曲线的绘制
以MOI＝0.1的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株感染铺满6孔板的Vero细胞，用病毒噬斑实验来滴定病毒滴度，根据不同时间点病毒的滴度绘制病毒一步生长曲线。rMV-S191-G1790A由于高度致弱，病毒不能稳定下传，未做病毒的生长曲线。病毒一步生长曲线结果如图12所示，亲本rMV-S191达到最高滴度的时间明显早于麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，rMV-S191-G1788A的最高滴度与亲本病毒相近，rMV-S191-G1792A的最高滴度比亲本病毒低。
实施例12麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株不同时间点引起细胞病变的改变
以MOI＝0.1感染铺满6孔板的Vero细胞，感染后分别于0h，24h，48h，60h，72h，84h和96h光镜下拍摄，比较麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株和亲本病毒的细胞病变，结果显示亲本病毒在Vero细胞上生长的速度明显快于麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株。两株麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株中rMV-S191-G1788A在Vero细胞上的生长速度要快于rMV-S191-G1792A。如图13所示。
实施例13麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株对棉鼠致病性的研究
本次麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株致病力研究的动物实验中，一共4组。20只三周龄的SPF棉鼠随机分到4组内，分别是rMV-S191、rMV-S191-G1788A、rMV-S191-G1792A和正常对照组。所有的棉鼠均于同一天接种病毒，不同的实验组置于不同的笼子分别饲养。免疫的途径为滴鼻，接种剂量为1.0×106。观察接种病毒后棉鼠是否会有临床症状发生，是否会死亡等进行记录。接种病毒后每天观察动物。
在接种病毒第四天后，通过CO2窒息法处死棉鼠。感染rMV-S191、rMV-S191-G1788A的棉鼠的肺脏内都能够测到大量感染性病毒的存在，接种rMV-S191-G1792A组的5只棉鼠仅有一只检测到感染性病毒颗粒，而且滴度明显低于接种rMV-S191组的棉鼠。总体来说，接种rMV-S191棉鼠肺脏内的病毒滴度最高、接种rMV-S191-G1788A次之，接种rMV-S191-G1792A几乎不能在棉鼠体内复制，病毒高度致弱。结果分析见图14所示。
实施例14免疫保护试验
20只3周龄SPF级别的棉鼠随机分为4组，每组5只。按照实验用疫苗，将实验动物分为：rMV-S191(107PFU/100μL)试验组、rMV-S191-G1788A(107PFU/100μL)、rMV-S191-G1792A(107PFU/100μL)和DMEM培养基(100μL)。分别鼻腔吸入方式接种如棉鼠体内，免疫接种1次，每周采血分离血清，采用抗体中和实验检测棉鼠体内产生抗体的滴度。结果如图15A所示，第四周的中和抗体量如图15B所示。
免疫接种4周后采用rMV-S191(107PFU/100μL)鼻腔吸入接种攻毒，接种100μL，攻毒后观察记录临床表现。攻毒4天后，处死棉鼠，观察棉鼠肺内病毒的滴度，小鼠肺部的病理改变，判定疫苗免疫保护效率，结果如图16所示。
麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株接种后28天之内(即攻毒之前)，试验组的小鼠均无发现异常现象，说明了麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株是安全可靠的。接种病毒后亲本病毒株中和抗体在第二周达到高峰，而麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株接种组的棉鼠体内的中和抗体第二周后仍在上升。中和抗体滴度实验表明接种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株组高于接种亲本减毒疫苗株组。而处死棉鼠检测肺内病毒含量结果显示，疫苗接种组肺组织内均未检测到麻疹病毒。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacggcttgt tcttggctga gggatcgggt tc 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaacccgatc cctcagccaa gaacaagccg tc 32
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttcttgggt gaggcatcgg gttctatgtt g 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caacatagaa cccgatgcct cacccaagaa c 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cttgggtgag ggatcggctt ctatgttgat cac 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtgatcaaca tagaagccga tccctcaccc aag 33
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accaaacaaa gttgggtaag gata 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtaggcgga tgttgttctg 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cttctagact aggtgcga 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaacttggga ggcaatcact t 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccaactagta caacctaaat cca 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtggggagtt gagtgtcgtc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggggcacca gtcttcacat at 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
catgaatatg gcagagacgt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cccgacgaca ctcaactccc 20
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cctaagtttt aattaactac cgata 25
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tccctctggc cgaacaat 18
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
acgtttttct taattctgat gtctat 26
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acatcaggca tacccacta 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cccacatatg gcttcttag 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gacaaagagt catgttcagt g 21
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cagacaaagc tgggaatag 19
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
taatatcgcc accacccaat ggccacactt ttaag 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggagcagaag ctgatctcct agtctagaag atttc 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
taatatcgcc accacccaat ggcagaagag caggc 35
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggagcagaag ctgatctcct acttcattat tatcttc 37
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
taatatcgcc accacccaat ggactcgcta tctgtc 36
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cccacatatg gcttcttag 19
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gacaaagagt catgttcagt g 21
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ggagcagaag ctgatctctt agtccttaat cagggc 36

Claims (6)

1.一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，通过定点突变包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体中的麻疹病毒L蛋白上的甲基转移酶保守序列得到；
所述甲基转移酶保守序列为麻疹病毒结构蛋白中的L蛋白第VI保守区的氨基酸序列；氨基酸序列突变位点为G1788A，G1790A或G1792A。
2.根据权利要求1所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，所述包含麻疹病毒减毒疫苗株S191基因组重组载体为pYES-MV-S191。
3.根据权利要求2所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，对所述pYES-MV-S191中G1788，G1790或G1792氨基酸进行G到A的突变得到麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒pYES-MV-S191-G1788A、pYES-MV-S191-G1790A或pYES-MV-S191-G1792A。
4.根据权利要求3所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒，其特征在于，
用于制备pYES-MV-S191-G1788A质粒的引物为：
G1788A-F：5’-gacggcttgttcttggctgagggatcgggttc-3’(SEQ ID NO.1)；
G1788A-R：5’-gaacccgatccctcagccaagaacaagccgtc-3’(SEQ ID NO.2)；
用于制备pYES-MV-S191-G1790A质粒的引物为：
G1790A-F:5’-gttcttgggtgaggcatcgggttctatgttg-3’(SEQ ID NO.3)；
G1790A-R:5’-caacatagaacccgatgcctcacccaagaac-3’(SEQ ID NO.4)；
用于制备pYES-MV-S191-G1792A质粒的引物为：
G1792A-F:5’-cttgggtgagggatcggcttctatgttgatcac-3’(SEQ ID NO.5)；
G1792A-R:5’-gtgatcaacatagaagccgatccctcacccaag-3’(SEQ ID NO.6)。
5.一种麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株，其特征在于，由辅助质粒pT7CFE1-N、辅助质粒pT7CFE1-P、辅助质粒pT7CFE1-L和权利要求1-4任一项所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株质粒拯救得到；
其中，辅助质粒pT7CFE1-N含有麻疹病毒的核衣壳蛋白编码基因；
辅助质粒pT7CFE1-P含有麻疹病毒的磷蛋白编码基因；
辅助质粒pT7CFE1-L含有麻疹病毒RNA聚合酶编码基因。
6.如权利要求5所述的麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株在制备预防或治疗麻疹的疫苗中的应用。
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