JP6175167B2 - 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス - Google Patents
新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス Download PDFInfo
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Description
本発明は、新型インフルエンザの発症原因であるH5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）感染及びH1N1パンデミックインフルエンザウイルス（H1N1 (2009) pdm）感染の予防薬及び治療薬に関する。詳しくは、H5N1 HPAIV及びH1N1(2009) pdmのヘマグルチニン（HA）タンパク質遺伝子を発現することができる組換えワクシニアウイルス、ならびに当該組換えワクシニアウイルスを含む新型インフルエンザ用の予防薬及び治療薬に関する。
H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）は、1997年に最初の感染患者が報告され、その後中国、東南アジア、中近東地域を中心に感染者が拡大した。これまでに、500人が病院に搬送され、高度集中治療を受けたにもかかわらず、約60%にあたる296人が死亡した。現在、H5N1 HPAIV用ワクチンとしては、その流行株を予測して作製されたプレパンデミックワクチンが4つのクレード（クレード1、2.1、2.2、2.3）について、孵化鶏卵を用いて感染・増殖させたウイルスの全粒子不活化ウイルスワクチンとして、備蓄されている。しかし、孵化鶏卵へのH5N1 HPAIV感染は、致死性が高く、ウイルス収量が低いために大量調製が困難であるなどの問題点がある。また、保存期限が3年であることから、2006年度に製造されたものから順次その期限を超過してきている。2009年度は、H1N1(2009) pdmの世界的な大流行の影響により、H5N1用プレパンデミックワクチンの製造は行われていない。しかも、あくまで流行株を予測して作製されるワクチンであるため、実際に流行する株に対してワクチン効果を発揮できるか否かについては不明な点も多い。
一方、2009年4月にメキシコから発生したと考えられているH1N1パンデミックインフルエンザウイルス（H1N1(2009) pdm）は、これまでの季節性インフルエンザウイルスと抗原性が大きく異なり、免疫を有していない人が多いことから、急速に全世界へと感染拡大した。H1N1(2009) pdm用ワクチンは、季節性インフルエンザワクチンと同一方法により製造された不活化スプリットワクチンである。このスプリットワクチンについても、不活化ワクチンであるため、必ずしも流行株に対してワクチン効果を発揮できるとは限らない。
現在、インフルエンザ治療薬としては、インフルエンザウイルスの出芽に重要であるノイラミニダーゼ（NA）の作用を阻害するタミフル及びリレンザがあるものの、発症後48時間以内の投薬が重要であるなど、その効果は限られている。その他、NA阻害剤の静注剤やインフルエンザウイルスのポリメラーゼ阻害剤などが開発中であるが、現在のところ臨床治験段階である。
現在、インフルエンザ治療薬としては、インフルエンザウイルスの出芽に重要であるノイラミニダーゼ（NA）の作用を阻害するタミフル及びリレンザがあるものの、発症後48時間以内の投薬が重要であるなど、その効果は限られている。その他、NA阻害剤の静注剤やインフルエンザウイルスのポリメラーゼ阻害剤などが開発中であるが、現在のところ臨床治験段階である。
このような現状から、流行予測が困難であるインフルエンザウイルスに対して、幅広くかつ長期にわたり効果を発揮できる予防薬及び治療薬の確立が強く望まれている。
日本で製造・備蓄されたH5N1 HPAIV用プレパンデミックワクチンについては、2008年から2009年にかけて6000人規模で実施された「安全性試験」、ならびに200人を対象にした「初回接種試験」、及び既に初期済みの200人を対象にした「追加接種試験」の3つの臨床試験が行われた。安全性については、予測の範囲内であったとの見解が出されている。一方、既に「ベトナム株」のH5N1ワクチンにて初期済みの被験者に対して異なるワクチン株であるインドネシア株あるいは、安徽株で接種された「追加接種試験」では、反応交叉性が確認されたものの、3週間間隔で同一ワクチンにより2回接種された「初回接種試験」では、異なるウイルス株に対する中和抗体誘導が不十分であることが報告されている。また、マウスモデルを用いた感染防御実験においても、実験室レベルにて同様の手法により作製したこれら4種のワクチンのうち、特に、クレード2.2及び2.3の亜型間における反応交叉性が低く、致死性を完全に抑えることができなかったとの報告がされている（非特許文献１：Muarakami S. et al., Cross-clade protective immunity of H5N1 influenza vaccines in a mouse model., Vaccine, vol. 26(50), p. 6398-6404, 2008.）。
日本で製造・備蓄されたH5N1 HPAIV用プレパンデミックワクチンについては、2008年から2009年にかけて6000人規模で実施された「安全性試験」、ならびに200人を対象にした「初回接種試験」、及び既に初期済みの200人を対象にした「追加接種試験」の3つの臨床試験が行われた。安全性については、予測の範囲内であったとの見解が出されている。一方、既に「ベトナム株」のH5N1ワクチンにて初期済みの被験者に対して異なるワクチン株であるインドネシア株あるいは、安徽株で接種された「追加接種試験」では、反応交叉性が確認されたものの、3週間間隔で同一ワクチンにより2回接種された「初回接種試験」では、異なるウイルス株に対する中和抗体誘導が不十分であることが報告されている。また、マウスモデルを用いた感染防御実験においても、実験室レベルにて同様の手法により作製したこれら4種のワクチンのうち、特に、クレード2.2及び2.3の亜型間における反応交叉性が低く、致死性を完全に抑えることができなかったとの報告がされている（非特許文献１：Muarakami S. et al., Cross-clade protective immunity of H5N1 influenza vaccines in a mouse model., Vaccine, vol. 26(50), p. 6398-6404, 2008.）。
Muarakami S. et al., Cross-clade protective immunity of H5N1 influenza vaccines in a mouse model., Vaccine, vol. 26(50), p. 6398-6404, 2008.
本発明が解決しようとする課題は、H5N1 HPAIV及びH1N1(2009) pdmを含む新型インフルエンザウイルス感染による発症を阻止するのに有効な組換えワクシニアウイルスを含む治療薬及び予防薬を提供することにある。
本発明者らは、前記新型インフルエンザウイルス感染に関する解析及び検討結果をもとに、さらに鋭意研究を行った結果、組換えワクシニアワクチンを用いて免疫の強力な活性化をもたらすことが、有力な新型インフルエンザウイルス感染予防法につながるものと考えた。そして、本発明者らは、これまでに上記課題を解決するべく鋭意検討を行なった。その結果、H5N1 HPAIV及びH1N1(2009) pdmの感染発症を阻止するのに有効な組換えワクシニアウイルスを作製することに成功した。特に、H5N1 HPAIV用組換えワクシニアウイルスにおいては、単回接種により、クレードの異なる株による攻撃感染に対しても、発症防御できることが確認され、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）発現プロモーターと、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）又はH1N1パンデミックインフルエンザウイルス（H1N1(2009) pdm）のヘマグルチニン（HA）タンパク質をコードするcDNAの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルス。
（１）発現プロモーターと、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）又はH1N1パンデミックインフルエンザウイルス（H1N1(2009) pdm）のヘマグルチニン（HA）タンパク質をコードするcDNAの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルス。
ここで、ワクシニアウイルスとしては、例えばLC16m8株が挙げられる。また、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスとしては、例えばH5亜型に属するウイルス株、具体的にはH5亜型クレード1、H5亜型クレード2.1、H5亜型クレード2.2又はH5亜型クレード2.3に属するウイルス株が挙げられ、H1N1パンデミックインフルエンザウイルスとしては、例えばH1亜型に属するウイルス株が挙げられる。
上記HAタンパク質をコードするcDNAとしては、以下の(a)〜(j)のDNAを例示することができる。
(a) 配列番号1（H5亜型クレード1；ベトナム株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード1に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号2（H5亜型クレード2.1；インドネシア株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.1に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(a) 配列番号1（H5亜型クレード1；ベトナム株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード1に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号2（H5亜型クレード2.1；インドネシア株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.1に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(e) 配列番号3（H5亜型クレード2.2；青海株のワクチン株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(f) 配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.2に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(g) 配列番号4（H5亜型クレード2.3；安徽株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(h) 配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.3に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(f) 配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.2に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(g) 配列番号4（H5亜型クレード2.3；安徽株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(h) 配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.3に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(i) 配列番号5（H1亜型；カリフォルニア株のワクチン株の配列）に示す塩基配列からなるDNA
(j) 配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1亜型に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
(j) 配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1亜型に属するウイルス株のHAタンパク質をコードするDNA
さらに、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターとしては、例えばハイブリッドプロモーターが挙げられる。具体的には、ハイブリッドプロモーターとしては、以下の(a)又は(b)のDNAからなるものを例示することができる。
(a) 配列番号6に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNA
(a) 配列番号6に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNA
（２）上記(1)の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
上記医薬組成物は、新型インフルエンザの予防薬及び／又は治療薬、具体的にはH5N1高病原性鳥インフルエンザ又はH1N1パンデミックインフルエンザの予防薬及び／又は治療薬として使用することができる。
上記医薬組成物は、新型インフルエンザの予防薬及び／又は治療薬、具体的にはH5N1高病原性鳥インフルエンザ又はH1N1パンデミックインフルエンザの予防薬及び／又は治療薬として使用することができる。
本発明によれば、新型インフルエンザの予防又は治療に有効であり、かつ安全性の高い新規な組換えワクシニアウイルス、及びこれを含む新型インフルエンザ用予防薬又は治療薬（新型インフルエンザの予防又は治療用ワクチン）を提供することができる。
以下、本発明にかかる組換えワクシニアウイルス及びその用途について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2010-233064号明細書（2010年10月15日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用した特許文献、非特許文献その他の刊行物は、参照として本明細書に組み込まれるものとする。
１．本発明の概要
各種ワクチンの中でも、生ワクチンは特に有効なものの一つであるが、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンを開発するには非常に長い期間が必要となることが知られており、このことは新型インフルエンザに関しても同様であると考えられる。
このような場合に採られる手法の一つとして、生ワクチンとして組換えワクシニアウイルス（RVV）を作製するという遺伝子工学的手法が知られている。例えば、本発明者らが開発した、狂犬病ウイルス用又はリンダペスト用の組換えワクシニアウイルスは、野外試験等において、優れた感染発症予防効果を発揮することが実証されている（例えば、Tsukiyama K. et al., Arch. Virol., 1989, vol. 107, p. 225-235参照）。
また本発明者らは、新型肺炎SARSに関して、その病原体として知られるSARS-CoVのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製に成功しており（WO 2006/038742）、優れた予防効果と再投与可能な製剤であることが確認されている（例えば、Kitabatake M. et al., Vaccine, 2007, vol. 25, p. 630-637 参照）。
各種ワクチンの中でも、生ワクチンは特に有効なものの一つであるが、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンを開発するには非常に長い期間が必要となることが知られており、このことは新型インフルエンザに関しても同様であると考えられる。
このような場合に採られる手法の一つとして、生ワクチンとして組換えワクシニアウイルス（RVV）を作製するという遺伝子工学的手法が知られている。例えば、本発明者らが開発した、狂犬病ウイルス用又はリンダペスト用の組換えワクシニアウイルスは、野外試験等において、優れた感染発症予防効果を発揮することが実証されている（例えば、Tsukiyama K. et al., Arch. Virol., 1989, vol. 107, p. 225-235参照）。
また本発明者らは、新型肺炎SARSに関して、その病原体として知られるSARS-CoVのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製に成功しており（WO 2006/038742）、優れた予防効果と再投与可能な製剤であることが確認されている（例えば、Kitabatake M. et al., Vaccine, 2007, vol. 25, p. 630-637 参照）。
RVVの作製に用いる組換え母体となるワクシニアウイルスとしては、安全性の確立されているワクチン株である必要があるが、そのようなワクチン株としてはワクシニアウイルスLC16m8株（例えば、臨床とウイルス, vol. 3, No. 3, p. 269, 1975参照）が知られている。LC16m8株はリスター株から分離されたものであって、実際に予防ワクチンとしての投与実績があり、かつ安全性及び有効性が確認されており、現在製造されている唯一のワクチン株である。また本発明者らは、リンダペスト、HIV、SARS-CoV等に対する組換えワクシニアウイルスの開発検討の過程で、抗体産生能及び細胞性免疫の誘導能を非常に高めることのできる遺伝子発現プロモーターを用いることが、本発明のワクシニアウイルスに有効であることを見出した。具体的にはプラスミドベクターとしてpSFJ1-10やpSFJ2-16を用いることが好ましいことを見出した（例えば、Jin N-Y et al., Arch. Virol., 1994, vol. 138, p. 315-330；Elmowalid GA. et al., Pros. Natl. Acad. Sci., 2007, vol. 104, p. 8427-8432；Arch. Virol., vol. 138, p. 315-330, 1994；特開平6-237773号公報参照）。
その結果、本発明者は、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）又はH1N1パンデミックインフルエンザウイルス（H1N1(2009) pdm）のヘマグルチニン（HA）タンパク質をコードする遺伝子を、発現プロモーターとともにワクシニアウイルスに組み込むことにより、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdm由来HAタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを作製することに成功したものである。
本発明にかかる組換えワクシニアウイルスの母体となるウイルスは、上記のとおりワクシニアウイルスである。そのゲノム中にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコードするcDNA（当該cDNAの全部又は一部）が組み込まれたものが、本発明の組換えワクシニアウイルスである。H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコードするcDNA（当該cDNAの全部又は一部）をそれぞれ発現ユニットとし、それぞれワクシニアウイルスベクターに導入した。この発現ユニットをワクシニアウイルスLC16m8株のHA遺伝子領域に導入した。HA遺伝子領域に外来遺伝子を導入してもワクシニアウイルスの増殖活性には影響を与えないので増殖能の弱い安全なワクチン株を組換え母体ウイルスとして使用することができることはすでに知られている（Vaccine, vol. 12, p. 675-681, 1994 参照）。
本発明にかかる組換えワクシニアウイルスの母体となるウイルスは、上記のとおりワクシニアウイルスである。そのゲノム中にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコードするcDNA（当該cDNAの全部又は一部）が組み込まれたものが、本発明の組換えワクシニアウイルスである。H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコードするcDNA（当該cDNAの全部又は一部）をそれぞれ発現ユニットとし、それぞれワクシニアウイルスベクターに導入した。この発現ユニットをワクシニアウイルスLC16m8株のHA遺伝子領域に導入した。HA遺伝子領域に外来遺伝子を導入してもワクシニアウイルスの増殖活性には影響を与えないので増殖能の弱い安全なワクチン株を組換え母体ウイルスとして使用することができることはすでに知られている（Vaccine, vol. 12, p. 675-681, 1994 参照）。
組換えワクシニア生ワクチンは、狂犬病ウイルスやリンダペストウイルスに対するものが野外試験されており、その感染発症予防効果の優秀性が証明されている。
本発明者は、ハイブリットプロモーターの下流にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子を挿入し、これらの遺伝子を弱毒ワクシニアウイルスLC16m8株のHAタンパク質遺伝子領域に組み込むことで組換えワクシニアウイルス（RVV）を作製した。ハイブリッドプロモーターは、ポックスウイルスA型封入体（ATI）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス7.5 kDaタンパク質（p7.5）前期発現プロモーターにより構成される（Jin N-Y et al., Arch. Virol., 1994, vol. 138, p. 315-330 参照）。このプロモーターは、北海道大学の志田壽利博士により開発され、同博士から提供を受けることも可能である。
作製したLC16m8株由来RVVは、動物細胞に感染させることにより、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質を大量に発現することが確認され、また動物個体に接種することでH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質に対する高力価の抗体が早期に産生することが併せて確認され、本発明を完成した。
本発明者は、ハイブリットプロモーターの下流にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子を挿入し、これらの遺伝子を弱毒ワクシニアウイルスLC16m8株のHAタンパク質遺伝子領域に組み込むことで組換えワクシニアウイルス（RVV）を作製した。ハイブリッドプロモーターは、ポックスウイルスA型封入体（ATI）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス7.5 kDaタンパク質（p7.5）前期発現プロモーターにより構成される（Jin N-Y et al., Arch. Virol., 1994, vol. 138, p. 315-330 参照）。このプロモーターは、北海道大学の志田壽利博士により開発され、同博士から提供を受けることも可能である。
作製したLC16m8株由来RVVは、動物細胞に感染させることにより、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質を大量に発現することが確認され、また動物個体に接種することでH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質に対する高力価の抗体が早期に産生することが併せて確認され、本発明を完成した。
２．新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの作製
H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子は、すでに米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）において、所定のアクセッション番号(Accession No.)により登録されている。例えば、GenBankアクセッション番号：EF541402に、H5N1 HPAIVのクレード1（H5亜型クレード1に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号1）が登録され、GenBankアクセッション番号：EF541394に、H5N1 HPAIVのクレード2.1（H5亜型クレード2.1に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号2）が登録され、GenBankアクセッション番号：DQ371928に、H5N1 HPAIVのクレード2.3（H5亜型クレード2.3に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号4）が登録されている。また、GenBankアクセッション番号：FJ969540に、H1N1(2009) pdm（H1亜型に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号5）が登録されている。
H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子は、すでに米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）において、所定のアクセッション番号(Accession No.)により登録されている。例えば、GenBankアクセッション番号：EF541402に、H5N1 HPAIVのクレード1（H5亜型クレード1に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号1）が登録され、GenBankアクセッション番号：EF541394に、H5N1 HPAIVのクレード2.1（H5亜型クレード2.1に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号2）が登録され、GenBankアクセッション番号：DQ371928に、H5N1 HPAIVのクレード2.3（H5亜型クレード2.3に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号4）が登録されている。また、GenBankアクセッション番号：FJ969540に、H1N1(2009) pdm（H1亜型に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA：配列番号5）が登録されている。
本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれるHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA）としては、上記各遺伝子のほか、その一部やその変異配列も用いることができる。例えば、H5N1 HPAIVのクレード1のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA）としては、配列番号1に示される塩基配列からなるDNAの一部を欠損させたDNA（具体的には、配列番号12に示される塩基配列からなるDNA）、H5N1 HPAIVのクレード2.1のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA）としては、配列番号2に示される塩基配列からなるDNAの一部を欠損させたDNA（具体的には、配列番号13に示される塩基配列からなるDNA）、H5N1 HPAIVのクレード2.3のHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA）としては、配列番号4に示される塩基配列からなるDNAの一部を欠損させたDNA（具体的には、配列番号14に示される塩基配列からなるDNA）を用いることができる。また、H1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコードする遺伝子（cDNA）としては、配列番号5に示される塩基配列からなるDNAの一部の塩基を変異（置換変異）させたDNA（具体的には、配列番号15に示される塩基配列からなるDNA）を用いることができる。なお、H5N1 HPAIVのクレード2.2（H5亜型クレード2.2に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子に関しては、当該遺伝子（cDNA）の一部を欠損させた遺伝子（cDNA：配列番号3）が、GenBankアクセッション番号：DQ659327に登録されている。
これらHAタンパク質遺伝子（一部欠損・変異させた遺伝子も含む）は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。従って、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる遺伝子、すなわちH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコードするcDNAの全部（変異配列も含む）又はその一部は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、「Moleculer cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）等を参照して行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。また、変異配列、特に変異置換型のDNAについては、例えば、上記「Moleculer cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」や「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)」等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
本発明の好ましい態様においては、上記プラスミドに挿入されているH5N1 HPAIVのHAタンパク質遺伝子又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子を、上記PCRの鋳型に用いることができる。そして、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子のcDNAを鋳型とし、各遺伝子特異的なプライマーを用いてPCRを行うことにより、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子領域を調製することができる。本発明においては、H5N1 HPAIVのクレード1（H5亜型クレード1に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号12に示す塩基配列からなるDNAによりコードされる遺伝子を「mCl 1」と称し、H5N1 HPAIVのクレード2.1（H5亜型クレード2.1に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号13に示す塩基配列からなるDNAによりコードされる遺伝子を「mCl 2.1」と称し、H5N1 HPAIVのクレード2.2（H5亜型クレード2.2に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号3に示す塩基配列からなるDNAによりコードされる遺伝子を「mCl 2.2」と称し、H5N1 HPAIVのクレード2.3（H5亜型クレード2.3に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号14に示す塩基配列からなるDNAによりコードされる遺伝子を「mCl 2.3」と称し、H1N1(2009) pdm（H1亜型に属するウイルス株）由来のHAタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号15に示す塩基配列からなるDNAによりコードされる遺伝子を「mIVR153」と称する。
本発明においては、配列番号1〜5及び12〜15に示される塩基配列からなるDNAのほか、以下の各DNAも、上記各HAタンパク質遺伝子（例えばmCl 1、mCl 2.1、mCl 2.2、mCl 2.3及びmIVR153等）のDNAとして使用することができる。
配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）。
配列番号12に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl 1の変異型DNA）。
配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）。
配列番号12に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl 1の変異型DNA）。
配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.1由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）。
配列番号13に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.1由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl 2.1の変異型DNA）。
配列番号13に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.1由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl 2.1の変異型DNA）。
配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.2由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl 2.2の変異型DNA）。
配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.3由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）。
配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.3由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）。
配列番号14に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.3由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl 2.3の変異型DNA）。
配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1N1(2009) pdm由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）。
配列番号15に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1N1(2009) pdm由来のHAタンパク質をコードするDNA（mIVR153の変異型DNA）。
配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1N1(2009) pdm由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）。
配列番号15に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1N1(2009) pdm由来のHAタンパク質をコードするDNA（mIVR153の変異型DNA）。
上記の各変異型DNAは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号1〜5及び12〜15で表される塩基配列からなるDNA又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることもできる。上記ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、例えば、0.1×SSC〜10×SSC、0.1％〜1.0％SDS及び20℃〜80℃の条件が挙げられ、より詳細には、37℃〜56℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、0.1×SSC、0.1％SDS中、室温で10〜20分の洗浄を1〜3回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press (1989)）等を参照することができる。
また、配列番号1に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）、配列番号12に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl1の変異型DNA）、配列番号2に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.1由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）、配列番号13に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.1由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl2.1の変異型DNA）、配列番号3に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.2由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl2.2の変異型DNA）、配列番号4に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.3由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）、配列番号14に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.3由来のHAタンパク質をコードするDNA（mCl2.3の変異型DNA）、配列番号5に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H1N1(2009) pdm由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）、配列番号15に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H1N1(2009) pdm由来のHAタンパク質をコードするDNA（mIVR153の変異型DNA）を用いることができる。
本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターは、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（HA）遺伝子領域内に挿入されるものであり、ポックスウイルスA型封入体（ATI）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス7.5 kDaタンパク質（p7.5）前期発現プロモーターにより構成されるハイブリットプロモーターである。このプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができ、例えばpBMSF7Cが知られている（Arch. Virol. vol. 138, p. 315-330, 1994；特開平6-237773号公報 参照）。
本発明において使用可能なハイブリッドプロモーターの塩基配列を配列番号6に示す。但し、本発明においては、配列番号6に示す塩基配列からなるDNAのほか、配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNAも、発現プロモーター（特にハイブリッドプロモーター）として使用することができる。「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質又は非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。
このハイブリットプロモーターにより発現されるタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。本発明においては、pBMSF7Cのプロモーター下流にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3、pBMSF7C-mIVR153という。
このハイブリットプロモーターにより発現されるタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。本発明においては、pBMSF7Cのプロモーター下流にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3、pBMSF7C-mIVR153という。
これらのプラスミドベクターを、宿主であるワクシニアウイルスに導入することで、組換えワクシニアウイルスを作製することができる。プラスミドベクターの宿主への導入は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば弱毒ワクシニアウイルスLC16m8株を感染した動物細胞中にプラスミドベクターpBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3、pBMSF7C-mIVR153をそれぞれ導入することにより、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン(HA)遺伝子領域において相同組換えを引き起こし、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子をそれぞれ発現する組換えワクシニアウイルス（RVV- Flu HA (H5-mCl1)、RVV-Flu HA (H5-mCl2.1)、RVV-Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV-Flu HA (H1-mIVR153)）を作製することができる。
なお、RVVの作製に用いたワクシニアウイルスLC16m8株は、動物個体で増殖可能であるが、神経細胞における増殖性は極めて低い弱毒株である。日本では痘瘡ワクチンとして認可されており、約5万人の小児に接種の結果、重篤な副作用は発生していない（厚生省種痘研究班研究報告：臨床とウイルス, vol. 3, No. 3, 269, 1975 参照）。一方、免疫誘導能に関しては親株であるLister株と同等であることが報告されており、LC16m8株は安全で効果的なワクチンである。
作製した組換えワクシニアウイルス（RVV- Flu HA (H5-mCl1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)）は、ワクシニアウイルスのHAタンパク質遺伝子領域にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子が挿入されるため、ワクシニアウイルス由来のHAタンパク質の発現が欠如する。インフルエンザウイルス由来のHAタンパク質は、モルモット赤血球に対して凝集反応を示すが、ワクシニアウイルス由来のHAタンパク質はモルモット赤血球に対して凝集反応を起こさない。従って、RVV- Flu HA (H5-mCl1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)を動物細胞に感染させ、これにより形成するプラークへのモルモット赤血球の凝集反応を指標にして、RVVのスクリーニングを行う。目的のRVVは、赤血球凝集活性を持つレッドプラークを選別すればよい。
レッドプラークより得られたウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子特異的なプライマーによりPCRを行い、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子の導入を確認することができる。
レッドプラークより得られたウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子特異的なプライマーによりPCRを行い、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子の導入を確認することができる。
H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質の発現は、RVV- Flu HA (H5-mCl1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)を感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウエスタンブロット法により確認することができる。なお、抗体は、H5N1 HPAIVのHAタンパク質由来のHAペプチド（a.a. 198-217（配列番号10）等）、又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質由来のHAペプチド（a.a. 223-234（配列番号11）等）を免疫して作製したウサギ抗血清を用いることができる。
RVVの作製において目的遺伝子の挿入部位としては、HAタンパク質遺伝子領域以外として、一般にはチミジンキナーゼ（TK）遺伝子領域が用いられるが、TK遺伝子領域に目的遺伝子を挿入することによるTKの発現欠損によりRVVの増殖性が低下することが知られている。一方、HAタンパク質発現欠損によるRVVの増殖性はほとんど影響がないことが報告されている（Vaccine, vol. 12, p. 675-681, 1994 参照）。従って、本発明においては、目的遺伝子の挿入部位としてHAタンパク質遺伝子領域が好ましい。
RVVの作製において目的遺伝子の挿入部位としては、HAタンパク質遺伝子領域以外として、一般にはチミジンキナーゼ（TK）遺伝子領域が用いられるが、TK遺伝子領域に目的遺伝子を挿入することによるTKの発現欠損によりRVVの増殖性が低下することが知られている。一方、HAタンパク質発現欠損によるRVVの増殖性はほとんど影響がないことが報告されている（Vaccine, vol. 12, p. 675-681, 1994 参照）。従って、本発明においては、目的遺伝子の挿入部位としてHAタンパク質遺伝子領域が好ましい。
３．新型インフルエンザの予防用及び治療用医薬組成物
本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを含む、新型インフルエンザ（すなわちH5N1高病原性鳥インフルエンザ及びH1N1パンデミックインフルエンザ）の予防薬及び治療薬（予防用及び治療用医薬組成物）を提供する。また本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを患者（被験者）に投与することを含む、上記新型インフルエンザの予防及び治療方法や、上記新型インフルエンザの予防及び治療のための上記組換えワクシニアウイルスの使用や、上記新型インフルエンザの予防薬及び治療薬を製造するための上記組換えワクシニアウイルスの使用等も提供することができる。
本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを含む、新型インフルエンザ（すなわちH5N1高病原性鳥インフルエンザ及びH1N1パンデミックインフルエンザ）の予防薬及び治療薬（予防用及び治療用医薬組成物）を提供する。また本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを患者（被験者）に投与することを含む、上記新型インフルエンザの予防及び治療方法や、上記新型インフルエンザの予防及び治療のための上記組換えワクシニアウイルスの使用や、上記新型インフルエンザの予防薬及び治療薬を製造するための上記組換えワクシニアウイルスの使用等も提供することができる。
本発明の医薬組成物は、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えワクシニアウイルスと、既存の抗ウイルス薬（例えば、タミフル、リレンザ）を併用することも可能である。併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の組換えワクシニアウイルスと既存の抗ウイルス薬とを同時に投与することもでき、また、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、ウイルスの一日投与量としては、経口の場合は1000〜1000000000 PFU（plaque forming units）程度、好ましくは100000〜100000000 PFU程度であり、非経口の場合は100〜1000000000 PFU程度、好ましくは1000〜100000000 PFU程度である。ウイルスは、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、ウイルスの一日投与量としては、経口の場合は1000〜1000000000 PFU（plaque forming units）程度、好ましくは100000〜100000000 PFU程度であり、非経口の場合は100〜1000000000 PFU程度、好ましくは1000〜100000000 PFU程度である。ウイルスは、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
本発明の組換えワクシニアウイルスは、新型インフルエンザ予防用及び治療用ワクチンとして使用される。また、これまでに、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmに対するワクチンの開発では、H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmに対する抗体と細胞障害性T細胞（CTL）に着目した研究が行われている。従って、予めワクチンとしての抗体価又は細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
例えば、作製した組換えワクシニアウイルス（RVV- Flu HA (H5-mCl1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.1)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)）又は親株であるLC16m8株に対する抗体価は、これらのウイルス株をマウスに接種後、経時的に血清を回収し、血清のH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子に対するELISA価を測定することで得ることができる。RVV- Flu HA (H5-mCl2.2) 及びRVV- Flu HA (H5-mCl2.3)を接種したマウスの血清では、接種1週間後からH5N1 HPAIVのHAタンパク質に対する抗体価の上昇が認められており、RVV- Flu HA (H1-mIVR153)を接種したマウスの血清は、接種2週間後からH1N1(2009) pdmのHAタンパク質に対する抗体価の上昇が認められる。
以上のとおり、本発明者らが作製した組換えワクシニアウイルス（総称して「Flu HA-RVVs」という）は、新型インフルエンザに対する液性免疫を誘導し得るものである。
以上のとおり、本発明者らが作製した組換えワクシニアウイルス（総称して「Flu HA-RVVs」という）は、新型インフルエンザに対する液性免疫を誘導し得るものである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
組換えワクシニアウイルス（RVV）の作製
pBMSF7Cプラスミド（特開平6-237773号公報 参照）のSbfI−SgfIサイト間に、H5N1 HPAIV（クレード1、クレード2.1、クレード2.2、クレード2.3）及びH1N1(2009) pdmの各HAタンパク質遺伝子をそれぞれ組み込むことにより、ヘマグルチニン(HA)遺伝子領域内のATI・p7.5ハイブリットプロモーター下流に上記各HAタンパク質遺伝子が挿入されたプラスミドベクターpBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3 及びpBMSF7C-mIVR153を作製した（図1）。具体的には、pBMSF7C-mCl1には配列番号12に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード1のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mCl2.1には配列番号13に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード2.1のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mCl2.2には配列番号3に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード2.2のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mCl2.3には配列番号14に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード2.3のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mIVR153には配列番号15に示す塩基配列からなるDNAがH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子として挿入されている。
pBMSF7Cプラスミド（特開平6-237773号公報 参照）のSbfI−SgfIサイト間に、H5N1 HPAIV（クレード1、クレード2.1、クレード2.2、クレード2.3）及びH1N1(2009) pdmの各HAタンパク質遺伝子をそれぞれ組み込むことにより、ヘマグルチニン(HA)遺伝子領域内のATI・p7.5ハイブリットプロモーター下流に上記各HAタンパク質遺伝子が挿入されたプラスミドベクターpBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3 及びpBMSF7C-mIVR153を作製した（図1）。具体的には、pBMSF7C-mCl1には配列番号12に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード1のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mCl2.1には配列番号13に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード2.1のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mCl2.2には配列番号3に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード2.2のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mCl2.3には配列番号14に示す塩基配列からなるDNAがH5N1 HPAIVクレード2.3のHAタンパク質遺伝子として挿入されており、pBMSF7C-mIVR153には配列番号15に示す塩基配列からなるDNAがH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子として挿入されている。
初代腎培養細胞を35mmディッシュに播種し、コンフルエントに達したところで、ワクシニアウイルス弱毒株LC16m8株を、moi=10で、30℃で1時間感染させた。なお、moi（multiplicity of infection）とは、細胞1個あたりのPFU（plaque forming units）をいう。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、細胞をPBS(-)で洗浄した。次いで、5倍希釈 TrypLE/0.5mM EDTA/PBS(-)により処理し、10%FCS/DMEM培地 抗生物質(-)、PBS(-)、HeBS bufferで洗浄後、細胞をHeBS buffer 600μlに懸濁した。プラスミドベクターpBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3 及びpBMSF7C-mIVR153の各1.5μgを、それぞれ全量30μlになるようにHeBS bufferを用いて希釈し、細胞懸濁液に加えて混和し、氷上で10分間静置した。プラスミドベクターを加えた細胞懸濁液を10μlチップ型金電極で吸い上げ、エレクトロポレーター（Invitrogen社製）を用いてエレクトロポレーション（1200 V、パルス幅40 ms、パルス回数1回）を行った。エレクトロポレーション後、直ちに10%FCS/DMEM培地 抗生物質(-)培地2 mlであらかじめ35 mmディッシュに播種しておいたRK13細胞又は初代腎培養細胞に、添加した。エレクトロポレーション2回分を35 mmディッシュに添加し、30℃で24時間培養した。
24時間培養後、スクレーパーを用いて細胞をディッシュから剥がし、細胞懸濁液を回収し、冷水中において超音波処理（30 sec×4回）を行った後、遠心分離（2000 rpm、10 min）した。その上清をウイルス溶液として使用した。ウイルス溶液を5%FCS/MEM培地に希釈し、150 mmディッシュに播種しておいた初代腎培養細胞に30℃、1時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、PBS(-)で細胞を洗浄した。5%FCS/0.5%メチルセルロース/MEM培地を添加して、30℃で96時間培養した。96時間培養後、上清を吸引除去し、PBS(-)で洗浄した。PBS(+)で希釈したモルモット赤血球溶液を150 mmディッシュに添加し、30℃で30 min培養した。赤血球溶液を吸引除去した後、細胞をPBS(+)で2回洗浄した。モルモット赤血球が吸着したプラークを、ピペットマンを用いて回収した。回収したプラークについて、PCRならびに遺伝子配列の決定により前記各HAタンパク質遺伝子の導入を確認した。遺伝子導入が確認されたプラークについてはプラーク精製を3回繰り返した。
3回プラーク精製したウイルスについて、小スケール培養を行った。3回目に得たコロニーを500μlの5%FCS/MEM培地に懸濁し、冷水中で超音波処理を行った。遠心分離（2000 rpm、10 min）を行った後、上清250μlを60mmディッシュに播種しておいた初代腎培養細胞に添加し、30℃で1時間感染させた。感染後、2.5 mlの5%FCS/MEM培地を添加し、30℃で96時間培養した。96時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコから剥がし、細胞懸濁液を回収した。回収した細胞懸濁液を冷水中で超音波処理（30 sec、4回）した後、遠心分離し、その上清をウイルス溶液として回収した。回収したウイルス溶液は、段階希釈して6ウェルプレートに播種しておいたRK13細胞又は初代腎培養細胞に添加し、30℃で1時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、PBS(-)で細胞を2回洗浄した後、5%FCS/0.5%メチルセルロース/MEM培地を添加して、30℃で96時間培養した。96時間後に、ウェル中に形成されるプラーク数をカウントすることによりtiterを算出した。
この算出したtiterをもとに大スケール培養を行った。150 mmディッシュ10枚にRK13細胞又は初代腎培養細胞を播種し、コンフルエントに達したところで、組換えワクシニアウイルス溶液（2 ml）を、moi=0.1で、30℃で1時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、18 mlの5%FCS/MEM培地を添加し、30℃、96時間培養した。96時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコからはがし、細胞懸濁液を回収し、-80℃で凍結保存した。この細胞懸濁液は凍結融解を1回行った後、冷水中で超音波処理（30 sec、4回）、遠心分離をし、その上清をウイルス溶液として回収した。このウイルス溶液を段階希釈して、6ウェルプレートに播種しておいたRK13細胞又は初代腎培養細胞に感染させて、上記と同様の方法により溶液中のウイルスtiterを算出した。titerを算出したこれらの各ウイルス溶液（組換えワクシニアウイルス）を、以下の各実施例に示す種々の実験に使用した。
PCRによるHAタンパク質遺伝子の導入確認
実施例１に示した各HAタンパク質遺伝子（cDNA：配列番号12、13、3、14及び15）に特異的な以下のプライマーを用い、得られた組換えワクシニアウイルスのゲノムを鋳型としてPCRを行うことにより、当該ウイルスゲノム中に各HAタンパク質遺伝子が導入されているか確認した（図2及び3）。
実施例１に示した各HAタンパク質遺伝子（cDNA：配列番号12、13、3、14及び15）に特異的な以下のプライマーを用い、得られた組換えワクシニアウイルスのゲノムを鋳型としてPCRを行うことにより、当該ウイルスゲノム中に各HAタンパク質遺伝子が導入されているか確認した（図2及び3）。
インサート確認PCR用プライマーの塩基配列
＜Fプライマー＞
Fw: Cl2.2-1229-S20
5’-CACTCAGTTTGAGGCCGTTG -3’ （配列番号7）
（H5N1 HPAIVのHAタンパク質遺伝子（4種）確認用）
Fw: mIVR153-1889-S20
5’- AATGCGAACTGTTGGTTCT- 3’ （配列番号8）
（H1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子確認用）
＜Fプライマー＞
Fw: Cl2.2-1229-S20
5’-CACTCAGTTTGAGGCCGTTG -3’ （配列番号7）
（H5N1 HPAIVのHAタンパク質遺伝子（4種）確認用）
Fw: mIVR153-1889-S20
5’- AATGCGAACTGTTGGTTCT- 3’ （配列番号8）
（H1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子確認用）
＜Rプライマー＞
Rv: HA-6-R
5’- CTAGTTCTGAGAAACCAGAGG -3’ （配列番号9）
（H5N1 HPAIV及びH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子確認用）
Rv: HA-6-R
5’- CTAGTTCTGAGAAACCAGAGG -3’ （配列番号9）
（H5N1 HPAIV及びH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子確認用）
具体的には、反応液組成は、市販のポリメラーゼに添付の緩衝液50μlに対しDNAポリメラーゼ1 U、dNTP 0.3mM、Fプライマー 1μM、Rプライマー 1μMとし、サイクル条件は、融解を95℃で0.5分、アニーリングを58℃で0.5分、伸長を72℃で2分とするサイクルを計25サイクルとした。得られたPCR産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドを確認した。その結果、プライマー設計により予め想定した長さの単一のバンドが認められれば、組換えウイルスゲノム中にH5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子が導入されていることが分かり、一方、当該バンドが認められなければ、H5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子は導入されていないことが分かることになる。
図3に示すように、PCR産物（増幅断片）の1％アガロースゲル電気泳動の結果、組換えウイルスゲノム中にH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子遺伝子が導入されていることが分かった。
ウエスタンブロット法によるH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質の発現確認
組換えワクシニアウイルスを、予め6ウェルプレートに播種しておいたRK13細胞に、moi=10で、30℃で1時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、PBS(-)により細胞を1回洗浄した。各ウェルに2 mlの5%FCS/MEM培地を添加し、30℃、18時間培養した。18時間後、培地を吸引除去し、PBS(-)により細胞を2回洗浄した。100μlの溶解 buffer（1% SDS、0.5% NP-40、0.15 M NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)）を添加して細胞を溶解させ、その溶液を1.5 mlのエッペンドルフチューブに移し入れた。回収した溶液は粘性がなくなるまで冷水中で超音波処理を行った。調製した溶液中のタンパク質量は、Lowry法により定量した。
組換えワクシニアウイルスを、予め6ウェルプレートに播種しておいたRK13細胞に、moi=10で、30℃で1時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、PBS(-)により細胞を1回洗浄した。各ウェルに2 mlの5%FCS/MEM培地を添加し、30℃、18時間培養した。18時間後、培地を吸引除去し、PBS(-)により細胞を2回洗浄した。100μlの溶解 buffer（1% SDS、0.5% NP-40、0.15 M NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)）を添加して細胞を溶解させ、その溶液を1.5 mlのエッペンドルフチューブに移し入れた。回収した溶液は粘性がなくなるまで冷水中で超音波処理を行った。調製した溶液中のタンパク質量は、Lowry法により定量した。
電気泳動は、10% アクリルアミドゲルを用い、30μgのタンパク質に対して行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出し、Semi-dry blotterを用いて2 mA/cm2で60分間通電し、ゲル中のタンパク質をPVDFメンブレンにトランスファーした。メンブレンをTBS-T溶液で洗浄した後、5%スキムミルク-TBS-T溶液につけてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、メンブレンをTBS-T溶液で3回洗浄した。一次抗体は、H5N1 HPAIVのHAタンパク質由来のHAペプチド（a.a. 198-217（配列番号10； NDAAEQTKLYQNPTTYISVG））又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質由来のHAペプチド（a.a. 223-234（配列番号11； YSKKFKPEIAIR））に対するウサギポリクローナル抗体を使用した。一次抗体との反応終了後、メンブレンをTBS-T溶液で3回洗浄した。二次抗体には抗ウサギIgG-linked HRPO（from Donkey、Amersham社製）を使用した。二次抗体との反応終了後、再度TBS-T溶液でメンブレンを3回洗浄し、Immobilon western検出用試薬（Millipore社製）をメンブレンに添加し、蛍光をCCDカメラで取り込み、画像解析した。
その結果、図4に示すように、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)の組換えウイルスゲノム中においてH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質が発現していることが分かった。
マウスへの組換えワクシニアウイルス接種実験（図5）
図5は、組換えワクシニアウイルス（Flu HA-RVVs）の液性免疫誘導能の確認方法を示す図である。
実施例１で得た組換えワクシニアウイルス又は空ベクターを挿入したRVV-EmptyをBALB/cマウス（雌）に1×107 PFUで経内皮接種（皮内接種(i.d.)）した後、1、2、3及び4週間後に、眼窩静脈より採血を行った。採取した血液は、すべて血清分離剤を入れた0.5 mlチューブにとり、遠心分離（15000 rpm、10分間）して血清を分離回収した。血清は、後述するELISA試験を行うまで、-80℃に凍結保存した。
図5は、組換えワクシニアウイルス（Flu HA-RVVs）の液性免疫誘導能の確認方法を示す図である。
実施例１で得た組換えワクシニアウイルス又は空ベクターを挿入したRVV-EmptyをBALB/cマウス（雌）に1×107 PFUで経内皮接種（皮内接種(i.d.)）した後、1、2、3及び4週間後に、眼窩静脈より採血を行った。採取した血液は、すべて血清分離剤を入れた0.5 mlチューブにとり、遠心分離（15000 rpm、10分間）して血清を分離回収した。血清は、後述するELISA試験を行うまで、-80℃に凍結保存した。
組換えワクシニアウイルス（Flu HA-RVVs）で免疫したマウス血清中のH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質に対する、ELISA法による抗体価測定
96ウェルプレートにH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコートしておき、凍結しておいた血清サンプルを100〜1000倍に希釈して添加し、4度で一晩静置した。96ウェルプレートをTBS-T溶液で洗浄した後、96ウェルプレートに抗マウスIgG-linked HRPO（from Sheep、Amersham社製）を二次抗体として添加した。室温で2時間反応させた後、再度TBS-T溶液で96ウェルプレートを3回洗浄した。発色液を100μl/wellで添加した。室温で30分間静置後、2M硫酸溶液を50μl/wellで添加して反応を停止した。マイクロプレートリーダーで490 nmの吸光度を測定した。
その結果、図6及び7に示すように、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)を接種したマウス血清中にH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質に対して高い抗体価の誘導が認められた。
96ウェルプレートにH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質をコートしておき、凍結しておいた血清サンプルを100〜1000倍に希釈して添加し、4度で一晩静置した。96ウェルプレートをTBS-T溶液で洗浄した後、96ウェルプレートに抗マウスIgG-linked HRPO（from Sheep、Amersham社製）を二次抗体として添加した。室温で2時間反応させた後、再度TBS-T溶液で96ウェルプレートを3回洗浄した。発色液を100μl/wellで添加した。室温で30分間静置後、2M硫酸溶液を50μl/wellで添加して反応を停止した。マイクロプレートリーダーで490 nmの吸光度を測定した。
その結果、図6及び7に示すように、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)を接種したマウス血清中にH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質に対して高い抗体価の誘導が認められた。
組換えワクシニアウイルス（RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)）の新型インフルエンザに対する予防効果の検討
図8に示すように、RVV- Flu HA (H1-mIVR153)接種による免疫誘導効果が確認されたため、これら組換えワクシニアウイルス（ワクチン）接種マウスに対して、ワクチン接種から5週間後に、鼻からH1N1(2009) pdmを攻撃感染させた。経日的な体重変化を測定し、感染から9日後に剖検を行い、肺の病理解析を行った。ワクチンを接種していないマウスでは、インフルエンザウイルス感染後、経日的に体重が減少していき、9日後には、約20%の低下が認められるのに対して、ワクチン接種群ではH1N1(2009) pdm感染後の初期に一過性に体重減少が見られるものの、その後は速やかに体重が増加し、正常値付近にまで回復することが分った。
図8に示すように、RVV- Flu HA (H1-mIVR153)接種による免疫誘導効果が確認されたため、これら組換えワクシニアウイルス（ワクチン）接種マウスに対して、ワクチン接種から5週間後に、鼻からH1N1(2009) pdmを攻撃感染させた。経日的な体重変化を測定し、感染から9日後に剖検を行い、肺の病理解析を行った。ワクチンを接種していないマウスでは、インフルエンザウイルス感染後、経日的に体重が減少していき、9日後には、約20%の低下が認められるのに対して、ワクチン接種群ではH1N1(2009) pdm感染後の初期に一過性に体重減少が見られるものの、その後は速やかに体重が増加し、正常値付近にまで回復することが分った。
また、肺病理組織を解析から、ワクチンを接種していないマウスへのH1N1(2009) pdmの感染により、肺は、間質細胞の肥厚化や、粘液の滲出、免疫担当細胞であるリンパ球侵潤により肺胞の空間が局所的に充満した肺炎像を示したのに対して、ワクチン接種群では、感染部位である気管支周囲への顕著なリンパ球侵潤は、認められるものの、肺胞腔は、きれいに維持されており、肺炎が顕著に軽減されることが分かった（図9）。
一方、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2) 又はRVV- Flu HA (H5-mCl2.3)を単回接種したマウスに対して、これら組換えワクシニアウイルス（ワクチン）接種から5週間後に、H5N1 HPAIVのクレード2.3を攻撃感染させ、ワクチン効果を検討した。攻撃感染は、1×104 PFU及び1×105 PFUの2つの濃度で行った。1×104 PFU及び1×105 PFUのいずれの攻撃感染に対しても、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2) 又はRVV- Flu HA (H5-mCl2.3)接種群では生存率100%であり、体重変化もインフルエンザウイルス感染3日後より増加していき、ほぼ感染前と同じ体重にまで回復した。さらに、高濃度側である1×105PFUの攻撃感染における肺病理組織を解析したところ、ワクチンを接種していないマウスへのH5N1ウイルス感染により、生存していた個体の肺においても、間質細胞の肥厚化が認められたのに対して、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2) 又はRVV- Flu HA (H5-mCl2.3)接種群では、感染部位である気管支周囲や、血管周囲への顕著なリンパ球侵潤と間質部分の局所的な肥厚化が観察されるものの、肺胞腔は、比較的きれいに維持されており、肺炎が顕著に軽減されていた。よって、今回作製した組換えワクシニアウイルス（ワクチン）は、致死性を示すH5N1 HPAIV感染に対しても、感染防御効果を示した。また、クレードの異なるクレード2.2のワクチン接種群でもクレード2.3のウイルス感染に対して十分なワクチン効果を示した。
新型インフルエンザ組換えワクシニアウイルスとしては、ヘマグルチニン（HA）タンパク質を発現するRVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)を用いた（図1）。これらFlu HA-RVVsの効果を評価するために、RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 又はRVV- Flu HA (H1-mIVR153) を1×107PFUで単回皮内接種し、接種から5週間後にH5N1 HPAIV 又はH1N1(2009) pdmを経鼻感染させ、その後経日的な体重変化測定を行い、感染から9日後に肺組織を採材し（図8〜11）、肺病理組織解析を行った（図9及び11）。
RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)接種群は、それぞれのインフルエンザウイルスによる攻撃感染に対して、いずれも体重減少抑制及び肺炎軽減効果を認めた（図8〜11）。
従って、本発明のワクシニアウイルスは、新型インフルエンザの予防及び治療効果を有し、新型インフルエンザワクチンとして有用であることが示された。
RVV- Flu HA (H5-mCl2.2)、RVV- Flu HA (H5-mCl2.3) 及びRVV- Flu HA (H1-mIVR153)接種群は、それぞれのインフルエンザウイルスによる攻撃感染に対して、いずれも体重減少抑制及び肺炎軽減効果を認めた（図8〜11）。
従って、本発明のワクシニアウイルスは、新型インフルエンザの予防及び治療効果を有し、新型インフルエンザワクチンとして有用であることが示された。
配列番号7：合成DNA
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- 配列番号6に示す塩基配列からなるDNA、又は配列番号6に示す塩基配列と90％以上の同一性を有し、かつ、プロモーター活性を有するDNAからなる発現プロモーターと、
配列番号15に示す塩基配列からなるDNA、又は配列番号15に示す塩基配列と95％以上の同一性を有し、かつ、H1亜型に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNAと
を含む、組換えワクシニアウイルスLC16m8株。 - 請求項１に記載の組換えワクシニアウイルスLC16m8株を含む、H1N1パンデミックインフルエンザの予防用又は治療用医薬組成物。
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