KR20220042392A - 종양 용해성 백시니아 바이러스 - Google Patents

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케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤
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Abstract

안전성 및 생산성 모두 향상한 종양 용해성 바이러스를 제공한다. 백시니아 바이러스 성장 인자(VGF), 세포 외 시그널 조절 키나아제(ERK) 활성화 단백질, 및 리보뉴클레오타이드 환원효소(RNR)의 기능이 결손하고 있고, 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한, 안전성이 향상된 제한 성장형 백시니아 바이러스; VGF, ERK 활성화 단백질, 및 RNR의 기능이 결손하고 있고, 추가로, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는, 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한, 안전성 및 생산성이 향상된 제한 성장형 백시니아 바이러스.

Description

종양 용해성 백시니아 바이러스
본 발명은 백시니아 바이러스 성장 인자(VGF), 세포 외 시그널 조절 키나아제(ERK) 활성화 단백질, 및 리보뉴클레오타이드 환원효소(RNR)의 기능을 결손시키는 것에 의해 정상세포 내에서의 바이러스 복제를 제한하고, 안전성을 향상시키는 동시에, 백시니아 바이러스의 세포 외 피막성 바이러스(EEV)의 비리온 형성에 관련되는 단백질의 아미노산 잔기를 변형하는 것에 의해 종양세포 및 공업생산에 사용하는 숙주세포에서의 바이러스 생산성을 향상시킨 것을 특징으로 하는, 정맥내 투여 가능한 종양 용해성 백시니아 바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 백시니아 바이러스는 바이러스의 안전성 및 생산성이 모두 향상하고 있고, 항암제로서 유효하게 사용할 수 있다.
종양 용해성 백시니아 바이러스로서 백시니아 바이러스 성장 인자(이하, 「VGF」 라고 한다) 및 세포 외 시그널 조절 키나아제(이하, 「ERK」 라고 한다)를 활성화하는 단백질인 O1L 단백질을 코딩하는 양쪽 유전자를 결손시키는 것에　의해, 정상세포 내에서는 성장이 제한되고, 암 세포 내에서 특이적으로 성장하고, 암 세포를 장애하는 마이토겐 인자 활성화 단백질 키나아제 의존성 백시니아 바이러스(MD-RVV)가 개시되어 있다(특허문헌 1).
백시니아 바이러스는 상피 성장 인자(이하, 「EGF」 라고도 한다) 수용체 시그널전달경로를 이용하고, 신속해서 직접적인 감염 세포의 운동성을 통해서 바이러스의 확산을 촉진한다(비특허문헌 1). 백시니아 바이러스 감염 초기에 분비되는, EGF와 높은 상동성을 가지는 백시니아 바이러스 성장 인자(VGF)인 C11R 단백질은 감염 세포 및 주위의 세포 상의 EGF 수용체에 결합하고, MAP 키나아제 캐스케이드(Ras/Raf/MEK/ERK 대사경로)에 시그널을 전달한다. 또 백시니아 바이러스의 O1L 단백질은 감염 세포 내의 세포 외 시그널 조절 키나아제(ERK)를 지속적으로 활성화하고, 바이러스의 병원성을 촉진한다(비특허문헌 2). C11R 및 O1L을 결손한 바이러스(MD-RVV)는 정상세포에서는 ERK를 활성화할 수 없기 때문에 바이러스 성장을 저하시키지만, ERK 경로가 이상으로 활성화되어 있는 암 세포에서는 불활성화되어 있는 바이러스의 ERK의 활성화 기능이 보충되고, 바이러스가 성장해서 암 세포를 파괴하는 종양 용해성 바이러스가 된다(특허문헌 1).
바이러스 독성을 경감시키기 위해서, 바이러스 게놈에 코딩된 리보뉴클레오타이드 환원효소를 불활성화시킨 폭스바이러스를 사용한 종양 용해성 바이러스가 개시되어 있다(특허문헌 2).
백시니아 바이러스의 A34R 폴리펩타이드의 아미노산 위치 K151의 점 돌연변이가 세포 외 피막성 바이러스의 생산을 향상시키는 것은 공지이다(비특허문헌 3 및 특허문헌 3).
일본 재공표특허공보 2015/076422 일본 공표특허공보 2011-504104 일본 공표특허공보 2006-506974
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종양 용해성 백시니아 바이러스는 종양내 투여에 의한 원발성 종양에 대한 치료뿐만 아니라, 정맥 주사에서 전신 투여하는 것에 의해, 전신성의 미소 전이암에 대한 효과도 기대할 수 있다. 그렇지만, 지금까지 종양 용해성 백시니아 바이러스를 정맥내 투여한 임상시험에서는 유효성을 시사하는 결과와 함께, 바이러스의 배출을 동반하는 부작용이 관찰되고 있고(비특허문헌 4; 비특허문헌 5), 종양 용해성 바이러스의 가일층의 안전성 향상이 구해지고 있었다.
한편, 안전성 향상을 위해서 정상세포에서의 바이러스의 성장성이 억제되게 유전자 변형된 종양 용해성 바이러스는 암 세포 및 공업생산에서 사용하는 숙주세포에 있어서, 유전자 변형 전의 친주 바이러스와 비교해서 종종 바이러스 성장성의 저하를 동반하고, 유효성 및 생산성의 저하가 염려된다. 그 때문에 바이러스의 안전성을 향상시키는 동시에 생산성도 향상시키는 것이 소망되고 있었다.
그렇지만, 유효성 및 생산성 향상을 위해서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 변형시키고, EEV의 비율을 증가시키는 것은 유용하지만, EEV 생산량의 증가는 바이러스 독성에 관련된다(비특허문헌 6).
지금까지 보고되고 있는 종양 용해성 바이러스의 정맥내 투여 임상시험 데이터는 그것들의 바이러스가 한정된 독성으로 안전하게 전신적으로 전달될 수 있는 것을 나타냈지만, 유효성에 개체 차이가 인정되는 등의 불완전함이 인정된다. 이 주된 이유는 안전성이 확인된 용법ㆍ용량에서 바이러스가 표적에 도달하기 전에 바이러스가 순환으로부터 급속하게 배제되기 때문이다. 이 현상은 폐, 간장 및 비장 등의 다른 조직에 의한 비특이적인 편입과 함께, 주로 중화항체, 보체 활성화, 항바이러스성 사이토카인, 및 조직 내재성 마크로파지를 통해서 수행된다(비특허문헌 7). 종양 용해성 바이러스 중에서, 백시니아 바이러스는 그 많은 바람직한 성질으로 인해 전임상 및 임상연구가 초점이 되고 있다(비특허문헌 8). 일부 종양 용해성 백시니아 바이러스는 정맥내 투여에 의한 임상시험이 실시되고 있다. 백시니아 바이러스가 분비되는 백시니아 바이러스 보체 제어 단백질(이하, 「VCP」 라고 한다)은 보체 C4b 및 C3b를 결합 및 불활성화하고, 그것에 의해 보체 활성화의 고전적 경로 및 대체 경로를 저해한다(비특허문헌 9). 또, EEV 형태의 백시니아 바이러스는 그 막내에 보체 활성화를 방지할 수 있는 숙주 단백질을 편입하는 동시에, EEV 단백질인 A56R이 분비된 VCP를 고정해서 보체 공격으로부터 보호하고 있다(비특허문헌 10).
백시니아 바이러스는 특이적인 리셉터가 존재하지 않고, 동물의 결합조직을 중심으로 모든 조직에 보편적으로 존재하는 헤파란 황산과 같은 글리코사미노글리칸이 백시니아 바이러스와 숙주세포의 상호작용을 매개하고, 원형질막에 바이러스가 직접 융합하고, 엔도사이토시스에 의해 종양세포에 들어 간다(비특허문헌 11). 따라서 종양 용해성 백시니아 바이러스는 장기에 의해 특이적인 세포 지향성을 나타내지 않고, 폭넓은 암종에서의 치료효과를 기대할 수 있다. 그 반면, 정맥내 투여에 의한 치료를 실시할 때는, 바이러스 성장에 의한 전신성의 부작용이 과제가 된다. 이 과제를 해결하기 위해서, 백시니아 바이러스가 정상세포에 감염하고, 침입한 후에 발생하는 세포 내에서의 바이러스 복제를 엄격하게 제한할 필요가 있다. 일반적으로, 항암제는 유효역과 독성역이 근접하고 있기 때문에, 유효성이 기대되는 용법ㆍ용량에서 부작용이 발생한다.
백시니아 바이러스 게놈에는 DNA합성에서의 율속효소인 리보뉴클레오타이드 환원효소(이하, 「RNR」 라고 한다) 유전자가 I4L(대서브 유닛; RRM1) 및 F4L(소서브 유닛; RRM2)로서 코딩되고 있고, 배양세포 중에서의 효율적인 복제 및 마우스에서의 바이러스 독성에는 F4L이 필요하다(비특허문헌 12). 한편, 세포에서의 RNR 발현의 상승은 많은 암의 특징이고, ONCOMINE 데이터베이스를 사용해서 인간의 암에서의 RNR 유전자 발현을 조사한 결과, RRM2는 분석한 168의 암 가운데 73에서 가장 과잉발현되고 있는 유전자의 탑(top) 10%이었다(비특허문헌 13). 또, 포유동물의 RNR 활성은 세포주기에 의존하고, RRM1의 단백질 레벨은 세포주기를 통해서 일정하지만, RRM2는 DNA 복제가 일어나는 G1/S기의 사이에 발현하고, 세포주기 의존성의 효소활성은 RRM2의 레벨에 의해 제어되고 있다(비특허문헌 14). 한편, G1기로부터 S기로의 세포주기의 진행은 활성화한 ERK 경로에 의해 발생된다(비특허문헌 15). 따라서 F4L의 기능을 저해한 백시니아 바이러스는 세포성장이 활발한 암 세포에서는 세포유래의 RRM2를 이용해서 바이러스의 복제가 가능하게 되지만, 정상세포에서는 RRM2의 발현 레벨이 낮기 때문에 바이러스 복제가 제한된다. C11R 및 O1L의 기능이 저해된 MD-RVV로부터 추가로한 F4L을 삭제하는 것에　의해, 정상세포에서의 바이러스 성장성이 현저하게 억제되고, 안전성이 더욱 향상한다.
정상세포 내에서는 성장할 수 없고, 표적으로 하는 암 세포 내에서 선택적으로 성장 가능한 제한 성장형 바이러스인 종양 용해성 바이러스는 종양세포 및 공업생산에 사용하는 숙주세포에서도, 친주 바이러스와 비교해서 성장성이 저하되는 경향이 예측된다. 전술의 C11R 및 O1L에 부가해서 F4L 유전자를 삭제한 종양 용해성 백시니아 바이러스는 성장능이 높은 암 세포에서는 바이러스 복제에 필요한 ERK 및 RNR을 암 세포 내의 효소로 보충하고, 바이러스 복제가 이루어진다.
본 발명자들은 세포성장에 관련되는 ERK 및 RNR의 기능을 결손시킨 바이러스의 생산성을 더욱 보충하는 방법으로서, 바이러스 복제에 필요한 ERK 및 RNR의 활성을 암 세포 유래의 효소에 의해 보충하는 동시에, 바이러스 라이프 사이클의 후기과정에서 발현되는 비리온 형성에 관련되는 분자에 주목했다. 즉, 백시니아 바이러스에 4개의 다른 형태의 비리온(세포 내 성숙 바이러스(이하, 「IMV」 라고 한다), 세포 내 피막성 바이러스(이하, 「IEV」 라고 한다), 세포결합 피막성 바이러스 (이하, 「CEV」 라고도 한다) 및 세포 외 피막성 바이러스(이하, 「EEV」)) 중, EEV의 구성요소인 7종류의 단백질(A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L)을 코딩하는 유전자를, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환하는 것에　의해, 바이러스의 생산성이 향상하는 동시에, 안전하게 정맥 투여를 실시하는 것이 가능하게 되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하의 [1]∼[20]을 제공한다.
[1] 백시니아 바이러스 성장 인자(VGF), 세포 외 시그널 조절 키나아제(ERK) 활성화 단백질, 및 리보뉴클레오타이드 환원효소(RNR)의 기능이 결손한 백시니아 바이러스.
[2] 상기 [1]에서, 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한, 안전성이 향상된 제한 성장형의 바이러스.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에서, C11R, O1L, 및 F4L의 각 유전자의 전부 또는 일부의 영역이 삭제 또는 변형되고, 이것들의 유전자 산물의 기능이 불활성화되어 있는 바이러스.
[4] 백시니아 바이러스 성장 인자(VGF), 세포 외 시그널 조절 키나아제(ERK) 활성화 단백질, 및 리보뉴클레오타이드 환원효소(RNR)의 기능이 결손하고 있고, 추가로, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는, 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한, 안전성 및 생산성이 향상된 제한 성장형 백시니아 바이러스.
[5] 상기 [4]에서, C11R, O1L, 및 F4L의 각 유전자의 전부 또는 일부의 영역이 삭제 또는 변형되고, 이것들의 유전자 산물의 기능이 불활성화되어 있는 바이러스.
[6] 상기 [4] 또는 [5]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 또는 복수의 유전자이고, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는 바이러스.
[7] 상기 [4] 또는 [5]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자이고, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는 바이러스.
[8] 상기 [4] 또는 [5]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자이고, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는 바이러스.
[9] 상기 [4] 내지 [8] 중 어느 하나에서, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 IHD-J주 또는 IHD-W주인 바이러스.
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 바이러스를 포함한, 암 치료를 위한 의약 조성물.
[11] 상기 [10]에서, 정맥내 투여용, 복강내 투여용 또는 종양내 투여용인 의약 조성물.
[12] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 바이러스에 외래 DNA를 도입한 제한 성장형 백시니아 바이러스 벡터.
[13] 상기 [12]에서, 외래 DNA가 암 특이항원 유전자, 면역응답 제어분자, 또는 암 세포 표면항원 친화성 단백질을 코딩하는 DNA인 벡터.
[14] 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 제한 성장형 백시니아 바이러스의 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열이, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자의 DNA 서열로 치환되어 있는 생산성이 향상한 상기 바이러스.
[15] 상기 [14]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나또는 복수의 유전자인 바이러스.
[16] 상기 [14]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 바이러스.
[17] 상기 [14]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 바이러스.
[18] 상기 [14] 내지 [17] 중 어느 하나에서, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 IHD-J주 또는 IHD-W주인 바이러스.
[19] 상기 [14] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 바이러스를 포함하는 암 치료를 위한 의약 조성물.
[20] 상기 [14] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 바이러스에 외래 DNA를 도입한 제한 성장형 백시니아 바이러스 벡터.
[21] 상기 [20]에서, 외래 DNA가 암 특이항원 유전자, 면역응답 제어분자, 또는 암 세포 표면항원 친화성 단백질을 코딩하는 DNA인 벡터.
[0017]
본 발명은 추가로 이하의 [22]∼[26]을 제공한다.
[22] 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 제한 성장형 백시니아 바이러스의 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열을, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자의 DNA 서열로 치환하는 것을 포함하는 제한 성장형 백시니아 바이러스의 생산성을 향상시키는 방법.
[23] 상기 [22]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 또는 복수의 유전자인 방법.
[24] 상기 [22]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 방법.
[25] 상기 [22]에서, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 방법.
[26] 상기 [22]에서, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 IHD-J주 또는 IHD-W주인 방법.
본 발명에 의하면, 백시니아 바이러스 유래의 VGF, ERK 및 RNR의 기능을 결손시키는 것에 의해 정상세포에서의 바이러스 성장을 현저하게 억제해서 안전성을 향상시키는 동시에, 당해 바이러스의 EEV 관련 단백질을 코딩하는 유전자를, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환하는 것에 의해 생산성을 향상시킨, 정맥내 투여 가능한 종양 용해성 백시니아 바이러스가 제공된다. 당해 바이러스는 신규 항암제로서 유효하게 사용된다.
도 1은 본 발명의 예시적인 유전자재조합 백시니아 바이러스의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 유전자 재조합 백시니아 바이러스의 제작방법을 나타내는 도면이다.
도 3은 F4L 결손 변형 바이러스에 의한 암 세포 및 정상세포의 세포 장해성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. A: HeLa(인간 자궁경부암 세포); B: NHDF(인간 정상피부 섬유아 세포).
도 4는 F4L 결손 변형 바이러스를 정맥내 투여한 면역 부전 마우스의 생존율을 나타내는 도면이다.
도 5는 F4L 결손 변형 바이러스를 정맥내 투여한 면역 부전 마우스의 체중변화를 나타내는 도면이다.
도 6은 F4L 결손 변형 바이러스를 정맥내 투여한 면역 부전 마우스의 상태변화를 나타내는 도면이다.
도 7은 EEV 관련 단백질의 변형에 의한 혈청함유 배지를 사용한 HeLa세포에서의 생산성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. MD-RVV(A) 및 MD-RVV의 F4L 유전자를 결손시킨 바이러스(B)를 기초로 변형.
도 8은 EEV 관련 단백질의 변형에 의한 화학적으로 정의된 배지를 사용한 HeLa 세포에서의 생산성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. A: 배양 상청 바이러스; B: 세포 내 바이러스.
도 9는 인간 췌장암 복막 파종 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 복강내 투여후의 바이러스 증상 스코어를 나타내는 도면이다.
도 10은 인간 췌장암 복막 파종 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 복강내 투여후의 생존율을 나타내는 도면이다.
도 11은 인간 췌장암 복막 파종 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 복강내 투여후의 바이러스 증상 스코어를 나타내는 도면이다.
도 12는 인간 췌장암 복막 파종 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 복강내 투여후의 생존율을 나타내는 도면이다.
도 13은 인간 췌장암 동소이식 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 정맥내 투여후의 바이러스 증상 스코어를 나타내는 도면이다.
도 14는 인간 췌장암 동소이식 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 정맥내 투여후의 생존율을 나타내는 도면이다.
도 15는 인간 췌장암 피하이식 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 종양내 투여후의 종양체적을 나타내는 도면이다.
본 명세서 중에 사용되고 있는 유전자 명명법은 백시니아 바이러스 코펜하겐주에 사용되고, 특별하게 한정되지 않는 한, 다른 폭스바이러스과의 상동성 유전자에도 사용된다.
본 발명의 종양 용해성 바이러스는 백시니아 바이러스 게놈의 변형에 의해, 유전자 재조합 백시니아 바이러스로서 제작할 수 있다. 친주 백시니아 바이러스로서 Copenhagen, Western Reserve, Lister, LC16mO, LC16m8, TianTan, Wyeth 등을 들 수 있다.
이러한 백시니아 바이러스 게놈의 변형은 예를 들면, 인체으로의 투여 실적이 있는 두창 백신주인 LC16m8 백시니아 바이러스의 게놈(Morikawa, S., et al., Journal of General Virology, 79(18), 11873-11891, 2005)을 사용해서 실시할 수 있다. 약독주의 LC16m8은 그 친주인 LC16mO의 EEV 구성요소의 하나인 B5R 유전자의 돌연변이에 의해 바이러스 감염 및 전파의 효율이 저하되고 있다. 정상세포에서의 복제능이 제한된 본 발명의 백시니아 바이러스는 암 세포에서는 성장 및 전파가 현저하고, 강한 세포 장해성을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서 종양 용해성 백시니아 바이러스의 구축에는 LC16mO 또는 LC16m8 바이러스 게놈의 B5R 유전자를 LC16mO 바이러스의 B5R 영역의 DNA 서열에 변형한 바이러스를 사용할 수 있다.
백시니아 바이러스 게놈의 변형은 벡터를 사용한 상동 재조합에 의해 실시할 수 있다. 변형되는 DNA 유전자 서열을 함유하는 단리된 플라스미드는 배양세포에 백시니아 바이러스 감염과 함께 형질 이입된다. 플라스미드의 상동 바이러스 DNA와 바이러스 게놈 사이의 재조합은 변형된 DNA 서열의 존재에 의해 변형된 바이러스를 생성한다. 백시니아 바이러스 DNA의 변형에는 Bacterial Artificial Chromosome(BAC) 시스템을 사용할 수 있다. BAC시스템은 BACgfp 서열이 편입된 바이러스 게놈을 대장균내에서 보유하고, 대장균의 유전학을 구사해서 바이러스 게놈의 재조합을 실시하는 방법이다(도 2).
본 발명에 의해, VGF, ERK 활성화 단백질, 및 RNR의 기능을 결손시키는 것에　의해, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 안전성이 향상된 제한 성장형 백시니아 바이러스를 얻을 수 있다.
VGF를 코딩하는 유전자는 C11R이고, ERK 활성화 단백질인 O1L 단백질을 코딩하는 유전자는 O1L이고, RNR의 소서브 유닛인 RRM2를 코딩하는 유전자는 F4L이므로, 백시니아 바이러스의 게놈에 있어서 이것들의 유전자를 변형하는 것에　의해, VGF, ERK 활성화 단백질, 및 RNR의 기능을 결손시킬 수 있다.
백시니아 바이러스의 VGF, O1L단백질 및 RRM2의 기능 결손이란 C11R, O1L, 및 F4L 유전자가 발현하지 않거나, 또는 발현해도 그 발현 단백질이 VGF, O1L 단백질, 및 RRM2가 정상적인 기능을 보유하지 않고 있는 것을 말한다. VGF, O1L 단백질 및 RRM2의 기능을 결손시키기 위해서는 C11R, O1L, 및 F4L 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킬 수 있다. 또, 염기의 치환, 결실 또는 부가에 의해 유전자를 돌연변이시키고, 정상의 VGF, O1L 단백질, 또는 RRM2를 발현할 수 없도록 할 수도 있다. 또, C11R, O1L, 또는 F4L 유전자 중에 외래 유전자를 삽입할 수도 있다. 외래 유전자의 삽입이나 유전자의 결실, 돌연변이는 예를 들면 공지의 상동 재조합이나 부위 특이적 돌연변이 도입법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 유전자의 결실이나 돌연변이에 의해 정상의 유전자 산물이 발현되지 않을 경우, 유전자가 결손하고 있다고 한다. C11R, O1L 및 F4L 유전자의 결손은 이것들의 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머쌍을 사용한 PCR법에 의해 확인할 수 있다.
또, VGF, ERK 활성화 단백질, 및 RNR의 기능을 결손시키는 것에 부가해서, EEV 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환하는 것에　의해, 안전성이 향상된 제한 성장형 백시니아 바이러스의 생산성을 향상시킬 수 있다.
변형시키는 EEV 관련 단백질을 코딩하는 유전자로서는 EEV의 구성요소인 7종류의 단백질(A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L)을 코딩하는 유전자 중의 적어도 하나일 수 있다. 예를 들면, A34R을 코딩하는 유전자를 변형하는 것에 의해 백시니아 바이러스의 생산성을 향상시킬 수 있다. A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L의 전부를 변형하는 것이 바람직하고, A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L의 전부를 변형하는 것이 더욱 바람직하다.
EEV 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 변형하기 위해서 사용하는 DNA 서열의 유래가 되는 백시니아 바이러스로서는 IHD-J, IHD-W 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 생산성을 향상시키기 위해서 EEV 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환하는 대상이 되는 제한 성장형 백시니아 바이러스로서는 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 제한 성장형 백시니아 바이러스라면 특별히 제한되지 않는다. 이러한 제한 성장형 백시니아 바이러스는 VGF, ERK 활성화 단백질, 및 RNR의 기능을 결손시키는 것에 의해 안전성이 향상된, 본 발명에 의한 상기 제한 성장형 백시니아 바이러스가 바람직하지만, 이것에 한정되나 것은 아니다. 예를 들면, C11R 및 O1L을 결손한 바이러스(MD-RVV)도 EEV 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환하는 것에　의해, 생산성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따라서 제작한 변형 백시니아 바이러스의 예시를 도 1에 나타낸다.
「LC16m8-B5RmO」는 LC16m8의 B5R 유전자를 그 친주 바이러스인 LC16mO의 B5R 유전자의 DNA 서열에 변형한 바이러스이다.
「MD-RVV」는 LC16m8-B5RmO 바이러스의 C11R 및 O1L 유전자를 결손시킨 바이러스이다.
「MD-RVV-ΔRR」은 MD-RVV 바이러스의 F4L 유전자를 결손시킨 바이러스이다.
「MD-RVV-A34R」은 MD-RVV의 A34R 유전자를 IHD-J 백시니아 바이러스주의 A34R 유전자 DNA 서열로 치환한 바이러스이다.
「MD-RVV-ΔRR-A34R」은 MD-RVV-ΔRR 바이러스의 A34R 유전자를 IHD-J 백시니아 바이러스주의 A34R 유전자의 DNA 서열로 치환한 바이러스이다.
「MD-RVV-EEV6」은 MD-RVV 바이러스의 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자를 각각, IHD-J 백시니아 바이러스주의 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자의 DNA 서열로 치환한 바이러스이다.
「MD-RVV-ΔRR-EEV6」은 MD-RVV-ΔRR바이러스의 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자를 각각, IHD-J 백시니아 바이러스주의 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자의 DNA 서열로 치환한 바이러스이다.
「MD-RVV-EEV7」은 MD-RVV 바이러스의 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자를 각각, IHD-J 백시니아 바이러스주의 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자의 DNA 서열로 치환한 바이러스이다.
「MD-RVV-ΔRR-EEV7」은 MD-RVV-ΔRR바이러스의 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자를 각각, IHD-J 백시니아 바이러스주의 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, F13L 유전자의 DNA 서열로 치환한 바이러스이다.
본 명세서에서, 「성장세포」란 정상세포보다도 성장 기능이 항진된 세포를 의미하고, 암 세포, 악성 종양 세포를 예로서 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제한 성장형 백시니아 바이러스는 종양세포 및 공업생산에 사용하는 숙주세포 모두에 사용할 수 있다. 종양세포는 주로 악성 종양 세포를 의미하고, 암 세포와 동일한 의미이다. 대상으로 하는 암 세포로서는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 발생 장기별로 분류했을 경우, 폐암, 췌장암, 난소암, 피부암, 위암, 간암, 결장암, 항문ㆍ직장암, 식도암, 자궁암, 유방암, 방광암, 전립선암, 식도암, 뇌ㆍ신경종양, 임파종ㆍ백혈병, 뼈ㆍ골육종, 평활근종, 횡문근종 등 모든 암종의 암 세포가 대상이 된다. 또, 공업생산에 사용하는 숙주세포로서는 예를 들면 Vero, GL37, CHO, HeLa, MRC-5, huGK-14 등의 백신 및 바이오 의약품의 생산에 사용되는 포유동물 세포를 들 수 있다.
본 발명의 제한 성장형 백시니아 바이러스는 의약 조성물로서, 인간을 포함하는 포유동물의 체내에 바이러스를 투여하기 위한 모든 제제화 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 바이오리액터에 의해 배양된 포유동물 세포를 숙주로 하고, 본 발명의 바이러스를 접종 및 배양하고, 세포 배양액으로부터 목적의 바이러스를 추출하고, 정제 후, 의약상 허용되는 염 등을 첨가해서 제제화된다.
본 발명의 제한 성장형 백시니아 바이러스를 포함하는 의약 조성물은 의약적으로 유효량의 본 발명 제한 성장형 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하고 있고, 무균의 수성 또는 비수성의 용액, 현탁액, 또는 에멀션의 형태일 수도 있다. 또한, 염, 완충제, 애주번트 등의 의약적으로 허용할 수 있는 희석제, 보조제, 담체 등을 포함하고 있을 수도 있다. 투여방법은 특별하게 한정되지 않고, 당업자가 이미 알고 있는 방법을 사용해서 체내에 투여하는 것이 가능하다. 예를 들면, 종양내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 피하, 근육내, 뇌실내, 흉강내, 척수강내, 표피내, 점막 표면으로의 주사를 들 수 있다. 정맥내, 복강내 또는 종양내 투여가 바람직하다. 바람직하게는 정맥내 투여에 의해 전신적으로 투여한다. 본 발명에서 정맥내 투여에 의한 전신성 종양 용해성 바이러스 요법을 실시하는 것에　의해, 원발종양뿐만 아니라 미소 전이암도 치료할 수 있다. 유효 투여량은 피험체의 연령, 성별, 건강, 및 체중 등에 따라서 적당하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 한정되지 않지만, 인간 성인에 대해서, 투여당 약 106∼1011 플라크 형성 단위(PFU), 바람직하게는 108∼109 플라크 형성 단위(PFU)이다.
백시니아 바이러스에 감염된 세포는 바이러스의 라이프 사이클에 있어서 다른 역할을　하는 4종류의 바이러스 형태를 생산한다. IMV는 가장 풍부한 형태의 바이러스이고, 물리적으로 강고한 성질 때문에 숙주 간의 수송을 매개하는데 적합하지만, 보체 및 항체에 대한 감수성 때문에 숙주내에서의 전파의 매개로는 그다지 적합하지 않다. IEV는 IMV와 CEV/EEV 사이의 중간체로서 작용하고, EEV 특이적 단백질의 편입을 확실하게 하고, 미소관을 사용해서 비리온을 세포표면에 수송하고, 추가의 막 및 숙주 단백질로 IMV 입자를 덮어서 숨겨서 항체 및 보체에 대한 감수성을 저하시키고, 백시니아 바이러스가 결합할 수 있는 숙주 수용체의 범위를 확대하고 있다. CEV는 세포표면에서 비리온 아래로부터 액틴 테일의 형성을 유도하고, 바이러스가 효율적인 세포 간 전파를 촉진하기 위해서 필요로 하고 있다. 최종적으로 EEV는 세포표면으로부터 방출되고, 숙주내에서의 감염 확대를 매개한다(Smith G.L., Journal of General Virology, 83(Pt 12), 2915-2931, 2002). 정맥 투여에 사용하는 종양 용해성 백시니아 바이러스에는 EEV 형태의 바이러스 제제가 바람직하지만, 바이러스의 라이프 사이클 사이에 비리온의 형태는 연속적으로 변화되기 때문에, 바이러스 배양 시에 배양 상청에는 방출된 EEV뿐만 아니라 바이러스 성장에 의해 파괴된 세포로부터 흘러 나간 IMV 등의 비리온이 혼재한다. 생산성 및 물리적 안정성의 관점으로부터, EEV만을 분리해서 제조하는 것은 곤란이기 때문에, EEV 관련 분자의 변형은 여러 가지의 비리온 형태로 구성되는 종양 용해성 바이러스 제제의 유효성 및 생산성 향상에 기여한다.
종양 용해성 바이러스에 의해 파괴된 암 세포의 단편은 자신의 암에 특이적인 항종양 면역응답을 유도하는 것이 예상된다. 암 특이항원 및 면역응답 제어분자의 유전자를 편입한 여러 종류의 바이러스 벡터가 암백신으로 연구되어 왔다. 백시니아 바이러스는 바이러스 게놈의 사이즈가 비교적 크기 때문에 항원 단백질의 유전자 전체를 삽입 가능하고, 감염 세포의 핵이 아니라 세포질내에서 복제하는 능력을 가지기 때문에 숙주세포의 게놈 중에 유전 물질을 편입하는 리스크를 최소한으로 억제할 수 있기 때문에, 바이러스 벡터로서 우수한다. 포유동물세포에서의 성장성이 매우 낮은 약독 백시니아 바이러스의 MVA주 등이 안전한 바이러스 벡터로서 사용되어 왔다. 종양 용해성 바이러스는 정상세포에서의 성장성이 현저하게 제한된 약독화 바이러스이다. 종양 용해성 바이러스를 바이러스 벡터로서 사용하는 것은 항종양 면역응답의 유도에 유리하다(Guo, Z.S., et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 7(1), 6, 2019). 본 발명의 종양 용해성 백시니아 바이러스는 유전자를 삽입한 벡터로서의 사용도 가능하다. 삽입 유전자 및 삽입 부위는 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면, 암 특이항원 유전자, 면역응답 제어분자, 암 세포 표면항원 친화성 단백질을 본 발명에서 유전자 기능을 결손시키는 C11R, O1L, 및 F4L 유전자, 또는 EEV 관련 유전자 근방에 삽입하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 따른 종양 용해성 바이러스는 백시니아 바이러스 게놈의 C11R, O1L 및 F4L을 결손하고, 추가로 복수의 EEV 관련 단백질의 아미노산 서열을 IHD-J주의 아미노산 서열로 치환하는 것에　의해, 안전성 및 생산성이 향상한다.
다음에, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
백신주 백시니아 바이러스 게놈의 변형에 의한 제한 성장성 백시니아 바이러스의 제작
인체로의 투여 실적이 있는 두창 백신주인 LC16m8 백시니아 바이러스 게놈(Morikawa, S., et al., Journal of General Virology, 79(18), 11873-11891, 2005)의 변형에 의해, 유전자 재조합 백시니아 바이러스를 제작했다(도 1).
1. LC16m8-BACmid의 제작
BAC 시스템을 사용해서 백시니아 바이러스 게놈을 변형했다(도 2 참조). 세포배양에서의 상동 재조합에 의해, 백시니아 바이러스 LC16m8주의 게놈에 BACgfp 서열을 삽입한 BAC 바이러스를 제작하고, BAC 바이러스의 게놈을 환상화해서 LC16m8-BACmid를 제작했다. 제1단계로서 LC16m8에 마커가 되는 BACgfp 서열을 도입하기 위한 인서션(insertion) 플라스미드(pUC-VVTK-BAC-EGFP)의 구축을 실시했다. 구체적인 수법은 백시니아 바이러스LC16m8주 게놈(GenBank: AY678275.1)을 주형으로, TK1 프라이머 Fw(서열번호1) 및 TK1 프라이머 Re(서열번호 2)를 사용해서 TK1을 증폭하고, 또, 동일 주 게놈을 주형으로, TK2 프라이머 Fw(서열번호 3) 및 TK2 프라이머 Re(서열번호 4)를 사용해서 TK2를 증폭했다. TK1에 제한효소 KpnI 및 PacI를 처리하고, TK2에 제한효소 XbaI 및 PacI를 처리한 후, 아가로스겔로부터 목적 단편을 정제했다.
다음에, pUC119 플라스미드(GenBank: U07650.1)를 제한효소 KpnI 및 XbaI로 처리, 정제하고, 알칼리포스파타아제 처리한 플라스미드의 KpnI/XbaI 사이트에, 상술한 2개의 단편을 삽입하고, pUC119-TK1-2를 구축했다. 다음에, pUCIDT-KAN-op7.5+EGFP플라스미드(서열번호 5)를 인공 합성하고, 제한효소 PacI로 처리 후 정제한 것을, pUC119-TK1-2를 제한효소PacI로 처리 후 정제하고, 알칼리포스파타아제 처리한 플라스미드의 PacI 사이트에 삽입하고, pUC-VVTK-op7.5+EGFP 플라스미드를 구축했다. 추가로, pBSII 플라스미드(GenBank: U25267.1)에 pBeloBAC11 서열(GenBank: CVU51113.1)을 삽입한 플라스미드를 제한효소 NotI로 처리 후 아가로스겔로부터 정제한 것을, pUC-VVTK-op7.5+EGFP를 제한효소 NotI로 처리 후 정제해서 알칼리포스파타아제 처리한 플라스미드의 NotI 사이트에 삽입하고, pUC-VVTK-BAC-EGFP 플라스미드를 구축했다.
다음에, LC16m8 게놈으로의 BACgfp 서열의 도입방법을 이하에 나타낸다. 토끼 초대 신장세포(PRK)에 백시니아 바이러스 LC16m8주를 MOI=10로 감염 후, 1시간 배양하고 세포를 회수했다. 회수 세포를 HeBS 버퍼로 현탁 후, 제한효소 HindIII으로 선상화한 pUC-VVTK-BAC-EGFP 플라스미드를 첨가하고, 일렉트로포레이션을 실시했다. 일렉트로포레이션액을 단계 희석하고, 96구-플레이트에서 배양한 PRK에 감염시키고 배양 후, 형광현미경을 사용해서 녹색형 광 단백질(GFP) 발현을 관찰하고, 희석 배율이 높은 웰에서 형광 양성 플라크 혹은 세포 변성 효과(CPE)가 수득된 것을 선택했다. 선택한 웰의 세포를 회수하고, 초음파처리, 원심 후, 상청을 LC16m8에 BACgfp 서열이 삽입된 바이러스(LC16m8-BACgfp)로서 수득했다.
또, LC16m8-BACgfp 게놈의 환상화와 대장균으로의 클로닝에 의한 LC16m8-BACmid의 구축은 아래와 같이 실시했다. LC16m8-BACgfp를 MOI=5로 감염시킨 PRK에, pCAGGS-Cre 플라스미드(자가 조제)를, 트랜스펙션 시약을 사용해서 트랜스펙션하고, 환상화한 바이러스 게놈으로서 LC16m8-BACmid를 추출 후, 대장균GS1783(WO2014077096A1)에 일렉트로포레이션을 사용해서 도입했다. 일렉트로포레이션액을 클로람페니콜 첨가 CG 한천배지에서 배양하고, BACgfp 서열 중의 클로람페니콜 내성을 마커로 해서 LC16m8-BACmid를 보유한 대장균을 선택하고, 목적의 클론을 글리세롤 저장했다.
2. 변형 BACmid의 제작
LC16m8-BACmid를 주형으로 해서 변형 BACmid를 제작했다. 미리, 나중에 배양세포로부터 BACgfp 서열이 제외된 재조합 바이러스를 회수하기 위해서 필요한 BACgfp 제거 서열 카세트(서열번호 6)를 제작했다. BACgfp 제거 서열 카세트의 제작 방법은 아래와 같았다. pUC119 플라스미드(GenBank: U07650.1)를 제한효소HincII 및 BamHI로 처리 후 정제하고, 알칼리포스파타아제 처리하고, 또, pBSII 플라스미드(GenBank: U25267.1)에 pBeloBAC11 서열(GenBank: CVU51113.1)을 삽입한 플라스미드를 제한효소 XbaI로 처리 후 정제한 단편에, 제한효소 ScaI 및 BglII를 처리 후 정제하고, 전술한 플라스미드와 라이게이션시키고, pUC119-pBeloSB를 구축했다. 또, pUC119-pBeloSB에 제한효소 NruI를 처리하고, 정제했다(pUC119-pBeloSB/NruI/elution). 다음에, 백시니아 바이러스 LC16m8주 게놈(GenBank: AY678275.1)을 주형으로, TK 프라이머 Fw(서열번호 7) 및 TK 프라이머 Re(서열번호 8)를 사용해서 TK영역을 증폭하고, 또, pEPkan-S플라스미드(Addgene)를 주형으로, 카나마이신 프라이머1Fw(서열번호 9) 및 카나마이신 프라이머 1Re(서열번호 10)을 사용해서 PCR을 실시하고, 카나마이신 내성 유전자를 증폭시켰다. 상기 2개의 PCR 산물을 정제하고, pUC119-pBeloSB/NruI/elution과 함께, In-Fusion HD Cloning Kit(Takara)를 사용해서 3개의 단편을 반응시키고, 반응액을 대장균 JM109(Takara)에 도입하고, 반응 후, 암피실린, 카나마이신 및 클로람페니콜을 첨가한 CG 한천배지에 플레이팅하고, 목적의 플라스미드(pUC119-BAC-SBTKdup)를 보유한 클론을 얻었다. 배양한 대장균으로부터 pUC119-BAC-SBTKdup 플라스미드를 추출하고, 제한효소 PstI 및 KpnI로 처리 후 정제해서 pUC119-BAC-SBTKdup/PstI/KpnI/elution을 제작하고, BACgfp 제거 서열 카세트(서열번호 6)로 했다.
B5R 변형 카세트:
목적의 재조합 바이러스를 제작하기 위해서, 변형하는 유전자의 발현 카세트를 이하의 방법으로 제작했다. LC16m8주는 안전한 백신주로서 약독화된 바이러스이지만, 종양 용해성 바이러스의 유효성에서는 배양세포에서의 성장성이 높은 친주인 LC16mO주를 사용하는 것이이 바람직하다. LC16m8은 B5R 유전자 서열 중의 1염기 결손(구아닌 결손)에 의한 프레임 시프트에 의해 불완전한 B5R 단백질이 생산되는 것이 알려져 있다(Morikawa, S., et al., Journal of General Virology, 79(18), 11873-11891, 2005). 그래서, LC16m8-BACmid의 B5R 유전자 서열을, 완전한 B5R 유전자 서열을 가지는 LC16mO의 서열로 변형한 BACmid를 구축하기 위해서, B5R 변형 카세트(서열번호 11)를 이하의 방법으로 제작했다. LC16mO의 B5R 유전자 서열 중의, 상기 구아닌으로부터 상류, 하류 각각 약 1kb, 합계 2132bp를 인공 합성하고, pUCFk-B5RmO(서열번호 12)를 구축했다. 이 DNA를 제한효소 EcoRI로 처리하고 정제 후, 알칼리포스파타아제 처리했다(pUCFk-B5RmO/EcoRI/elution/BAP). 또, pEPkan-S 플라스미드(Addgene)를 주형으로, 카나마이신 프라이머 2Fw(서열번호13) 및 카나마이신 프라이머 2Re(서열번호14)를 사용해서 PCR을 실시하고, 카나마이신 내성 유전자를 증폭하고, 정제 후, 제한효소 EcoRI로 처리하고 정제해서 rKanI/EcoRI/elution을 제작했다. pUCFk-B5RmO/EcoRI/elution/BAP와 rKanI/EcoRI/elution을 라이게이션하고, pUCFk-B5RmO-rKanI를 구축했다. pUCFk-B5RmO-rKanI를 제한효소 XbaI 및 DraI로 처리 후 정제하고, pUCFk-B5RmO-rKanI/XbaI/DraI/elution을 제작했다. 이것을 B5R 변형 카세트(서열번호 11)로 해서 BACmid의 변형에 사용했다.
C11R 결손 카세트:
VGF의 기능을 결손한 바이러스를 회수하기 위해서, C11R 결손 카세트(서열번호15)를 제작했다. C11R 유전자 서열의 개시 코돈으로부터 제한효소 AccI 사이트까지의 255bp를 결실시킨 서열 및 그 전후 약 1kb를 인공 합성하고, pUC57-ΔVGF(서열번호 16)를 구축했다. pUC57-ΔVGF를 제한효소 AccI로 처리하고 정제 후, 알칼리포스파타아제 처리하고 pUC57-ΔVGF/AccI/elution/BAP를 제작했다. pEPkan-S 플라스미드(Addgene)를 주형으로, 카나마이신 프라이머 3Fw(서열번호 17) 및 카나마이신 프라이머 3Re(서열번호 18)를 사용한 PCR에 의해 카나마이신 내성 유전자를 증폭하고, 아가로스겔로부터 정제 후, TOPO벡터(Invitrogen)에 클로닝했다. 반응액을 대장균 JM109(Takara)에 도입하고, 수득된 콜로니로부터 플라스미드를 추출해서 TOPO-rKanI를 제작했다. TOPO-rKanI를 제한효소 AccI로 처리하고, 정제 후, 제한효소 ScaI로 처리하고, 아가로스겔로부터 정제하고, rKanI/AccI/ScaI/elution을 제작했다. pUC57-ΔVGF/AccI/elution/BAP와 rKanI/AccI/ScaI/elution을 라이게이션하고, pUC57-ΔVGF-rKanI를 구축했다. pUC57-ΔVGF-rKanI를 제한효소 ScaI로 처리하고, 추가로, 제한효소BamHI 및 EcoRI로 처리 후 아가로스겔로부터 정제하고, C11R 결손 카세트(서열번호 15)로 해서 BACmid의 변형에 사용했다.
O1L 결손 카세트:
O1L의 기능을 결손한 바이러스를 회수하기 위해서, O1L 결손 카세트(서열번호 19)를 제작했다. O1L 유전자 서열의 개시 코돈으로부터 제한효소 XbaI 사이트까지의 1049bp를 결실시킨 후에, XbaI 사이트 직후에 50bp에, 카나마이신 내성 유전자 서열(Addgene)를 삽입한 서열을 인공 합성하고, pUC57-ΔO1L-rKanI(서열번호 20)를 구축했다. pUC57-ΔO1L-rKanI에, 제한효소ScaI 및 EcoRI를 처리하고, 아가로스겔로부터 정제하고, O1L 결손 카세트(서열번호 19)로 해서 BACmid의 변형에 사용했다.
F4L 결손 카세트:
RNR의 기능을 결손한 바이러스를 회수하기 위해서, F4L 결손 카세트(서열번호 21)를 제작했다. F4L 유전자 서열의 개시 코돈으로부터 EcoRI 사이트까지의 765bp를 결실시킨 후에, EcoRI 사이트 직후에 50bp에, 카나마이신 내성 유전자 서열(Addgene)을 삽입한 서열을 인공 합성하고, pUC57-ΔF4L-rKanI(서열번호 22)를 구축했다. pUC57-ΔF4L-rKanI에, 제한효소 BamHI 및 HindIII를 처리하고, 아가로스겔로부터 정제하고, F4L 결손 카세트(서열번호 21)로 해서 BACmid의 변형에 사용했다.
엔벨로프(Envelope) 변형 카세트:
EEV 관련 유전자를 IHD-J주 혹은 IHD-W주의 DNA 서열로 치환한 바이러스를 회수하기 위해서, A33R 변형 카세트(서열번호 23), A34R 변형 카세트(서열번호 24), A36R 변형 카세트(서열번호 25), A33-34-36R변형 카세트(서열번호 26), A56R 변형 카세트(서열번호 27), B5R 변형 카세트(서열번호 28), F12-13L 변형 카세트(서열번호 29)를 제작했다. 그 구체적인 수법은 IHD-J주 혹은 IHD-W주 유래의 각 유전자 서열을 준비하고, 특정한 부위의 직후 50bp에, 카나마이신 내성 유전자 서열(Addgene)을 삽입한 서열을 인공 합성하고, pUC57-A33R-rKanI(서열번호 30), pUC57-A34R-rKanI(서열번호 31), pUC57-A36R-rKanI(서열번호 32), pUC57-A33-34-36R-rKanI(서열번호 33), pUC57-A56R-rKanI(서열번호 34), pUC57-B5R-rKanI(서열번호 35), pUC57-F12-13L-rKanI(서열번호 36)를 구축했다. pUC57-B5R-rKanI(서열번호 35)에 제한효소 XbaI 및 BglI를 처리하고, 그 이외에는 제한효소 BamHI 및 BglI를 처리하고, 아가로스겔로부터 정제하고, 엔벨로프 변형 카세트로 해서 각 BACmid의 변형에 사용했다.
LC16m8-B5RmO-BACmid의 제작:
LC16m8-B5RmO-BACmid의 제작 방법을 하기에 기재한다. 전술한 LC16m8-BACmid를 보유한 대장균을 배양하고, B5R 변형 카세트(서열번호 11)를 일렉트로포레이션에 의해 도입했다. 일렉트로포레이션 용액을, 클로람페니콜 및 카나마이신을 첨가한 CG 한천배지에서 배양하고, 카세트 중의 카나마이신 내성을 마커로 해서, 카세트가 도입된 클론을 선택하고, 추가로 카나마이신 내성 유전자 제거 조작을 실시하고, BACgfp 서열 중의 클로람페니콜 내성을 마커로 해서 목적 클론을 취득했다. 프라이머쌍(서열번호 37 및 서열번호 38)을 사용한 PCR에 의해 목적 유전자 단편을 증폭하고, 정제 후, 시퀀스용 프라이머(서열번호 37)를 사용한 염기서열 해석에 의해, 수득된 클론은 목적의 변형 BACmid(LC16m8-B5RmO-BACmid)인 것이 확인되었다.
그 밖의 변형 BACmid도 상기와 동일한 방법에 의해 제작했다. 변형체에 특이적인 프라이머쌍을 사용한 PCR에 의해 밴드 사이즈를 확인했다. 변형체에 특이적인 프라이머쌍은 아래와 같았다.
C11R 결손 확인 프라이머 Fw(서열번호 39) 및 C11R 결손 확인 프라이머 Re(서열번호 40);
O1L 결손 확인 프라이머 Fw(서열번호 41) 및 O1L 결손 확인 프라이머 Re(서열번호 42);
F4L 결손 확인 프라이머 Fw(서열번호 43) 및 F4L 결손 확인 프라이머 Re(서열번호 44);
A33R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 45) 및 A33R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 46);
A34R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 47) 및 A34R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 48);
A36R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 49) 및 A36R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 50);
A56R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 51) 및 A56R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 52);
B5R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 53) 및 B5R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 54);
F12-13L 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 55) 및 F12-13L 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 56)
또, 게놈 정제 후, 변형 확인용의 시퀀스 프라이머[A33R 변형(서열번호 45), A34R 변형(서열번호 47), A36R 변형(서열번호 49), A56R 변형(서열번호 51, 서열번호 57), B5R 변형(서열번호 53), F12-13L 변형(서열번호 55, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60)]을 사용한 염기서열 해석에 의해, 수득된 클론은 목적의 변형 BACmid(MD-RVV-BACmid, MD-RVV-ΔRR-BACmid, MD-RVV-EEV7-BACmid, MD-RVV-EEV6-BACmid, MD-RVV-A34R-BACmid, MD-RVV-ΔRR-EEV7-BACmid, MD-RVV-ΔRR-EEV6-BACmid, MD-RVV-ΔRR-A34R-BACmid)인 것이 확인되었다.
각 변형 BACmid에 BACgfp 제거 서열 카세트[(SBTKdup 서열)(서열번호 6)를 동일한 수법으로 도입했다. 프라이머쌍(BACgfp 합성 프라이머 Fw(서열번호 61) 및 BACgfp 합성 프라이머 Re(서열번호62)]을 사용한 PCR에 의해 밴드 사이즈를 확인했다. PCR 산물을 정제하고, 시퀀스용 프라이머(서열번호 61)를 사용해서 염기서열을 해석했다. 수득된 클론은 목적의 변형 BACmid(MD-RVV-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-EEV7-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-EEV6-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-A34R-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-EEV7-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-EEV6-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-A34R-SBTKdup-BACmid)인 것이 확인되었다.
3. 바이러스 게놈의 추출
BACgfp 제거 서열 카세트를 가지는 BACmid 유래의 바이러스는 배양세포에서 계대를 거듭함으로써, BACgfp가 제거되도록 설계되어 있다. 전술한 BAC 바이러스(LC16m8-BACgfp)를 헬퍼바이러스로서 사용하고, RK13 세포로부터 LC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid 유래의 바이러스를 회수했다. 6구-플레이트에서 배양한 RK13 세포에, 헬퍼바이러스로서 LC16m8-BACgfp를 MOI=1로 접종하고, 1시간 배양 후에 바이러스를 제거하고, 새롭게 배지를 첨가했다. 다음에, LC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid 및 트랜스펙션 시약을 혼합하고, 15분간 반응 후, 세포에 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 형광현미경을 사용해서 GFP 발현을 확인한 후, GFP형광 음성 플라크의 비율이 많은 웰로부터 세포를 채취하고, 동결 융해 후, 초음파 처치하고, 원심후의 상청을 바이러스액으로서 수득했다. 바이러스액을 배지에서 단계 희석하고, 96구-플레이트에서 배양한 RK13 세포에 접종하고, 37℃에서 이틀 밤 배양했다. 형광현미경으로 GFP 형광 음성 플라크의 비율이 많은 웰로부터 세포를 채취하고, 동결 융해 후, 초음파 처치하고, 원심 후, 상청을 바이러스액으로서 수득했다. 본 작업을 반복하고, 2회 연속으로, RK13 세포에서의 바이러스 플라크가 모두 형광 음성이 된 시점에서, 바이러스 순화 완료로 했다. 회수한 바이러스를 6구-플레이트에서 배양한 RK13 세포에 접종하고, 37℃로 이틀 밤 배양 후, 게놈 추출 키트를 사용해서 바이러스 게놈을 추출했다. 추출한 바이러스 게놈을 주형으로 하고, 프라이머쌍(서열번호 61 및 서열번호 62)을 사용해서 PCR을 실시하고, 밴드 사이즈로부터 BACgfp 서열의 제거를 확인했다. 추가로, PCR 산물을 정제하고, BACgfp 제거 확인 프라이머(서열번호 61) 및 B5R 구아닌 삽입 확인 프라이머(서열번호 37)를 사용해서 염기서열 해석을 실시하고, BACgfp 서열 삽입 부위에서 당해 서열이 제거되어 있는 것, 추가로 B5R 유전자 서열 중의 특정한 위치에, LC16m8에서는 결실하고 있는 염기(구아닌)가 삽입된 것임이 확인되고, 이것을 LC16m8-B5RmO로 했다.
상기 와 동일한 방법에 의해, LC16m8-BACgfp를 헬퍼바이러스로서 사용하고, MD-RVV-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-EEV7-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-EEV6-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-A34R-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-EEV7-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-EEV6-SBTKdup-BACmid, MD-RVV-ΔRR-A34R-SBTKdup-BACmid 유래의 바이러스를 제작했다. 이들로부터 추출한 게놈을 주형으로 해서, 특이적 프라이머쌍을 사용한 PCR에 의해 밴드 사이즈를 확인했다. 특이적 프라이머쌍은 아래와 같았다.
C11R 결손 확인 프라이머 Fw(서열번호 39) 및 C11R 결손 확인 프라이머 Re(서열번호 40);
O1L 결손 확인 프라이머 Fw(서열번호 41) 및 O1L 결손 확인 프라이머 Re(서열번호 42);
F4L 결손 확인 프라이머 Fw(서열번호 43) 및 F4L 결손 확인 프라이머 Re(서열번호 44);
A33R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 45) 및 A33R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 46);
A34R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 47) 및 A34R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 48);
A36R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 49) 및 A36R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 50);
A56R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 51) 및 A56R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호52);
B5R 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호53) 및 B5R 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 54);
F12-13L 변형 확인 프라이머 Fw(서열번호 55) 및 F12-13L 변형 확인 프라이머 Re(서열번호 56);
BACgfp 합성 프라이머 Fw(서열번호 61) 및 BACgfp 합성 프라이머 Re(서열번호 62)
또, 각 PCR 산물을 정제하고, 변형 확인용 시퀀스 프라이머[A33R 변형(서열번호 45), A34R 변형(서열번호 47), A36R 변형(서열번호 49), A56R 변형(서열번호 51, 서열번호 57), B5R 변형(서열번호 53), F12-13L 변형(서열번호 55, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60), BACgfp 제거(서열번호 61)]를 사용한 염기서열 해석에 의해, 수득된 클론은 각각, 목적의 재조합 바이러스(MD-RVV, MD-RVV-ΔRR, MD-RVV-EEV7, MD-RVV-EEV6, MD-RVV-A34R, MD-RVV-ΔRR-EEV7, MD-RVV-ΔRR-EEV6, MD-RVV-ΔRR-A34R)인 것임이 확인되었다.
실시예 2
RNR 유전자 결손에 의한 정상세포에서의 세포 장해성의 저감
C11R 및 O1L 유전자가 결손한 종양 용해성 백시니아 바이러스인 MD-RVV 및 그 EEV 관련 유전자 변형 바이러스, 및 그것들의 바이러스 게놈에 존재하는 리보뉴클레오타이드 환원효소(RNR) 소서브 유닛을 코딩하는 F4L 유전자를 결손시킨 변형 바이러스를, 암 세포 및 정상세포 유래의 배양세포에 감염시키고, 세포 장해성을 세포 수 측정 키트(Cell Counting Kit-8, DOJINDO LABORATORIES)에 의해 평가했다. 암 세포(인간 자궁 경부암 유래 세포주: HeLa 세포) 및 정상세포(인간 피부 섬유아 세포: NHDF)를 96구-플레이트에 파종하고, 혈청 함유 배지에서 접착 배양 후, 무혈청 EMEM 배지에서 혈청 기아 배양한 각 세포에, LC16m8-B5RmO, MD-RVV, MD-RVV-ΔRR, MD-RVV-ΔRR-A34R, MD-RVV-ΔRR-EEV6, MD-RVV-ΔRR-EEV7의 각바이러스를 저농도(0.8×106 PFU/㎖) 및 고농도(4.0×106 PFU/㎖)로 접종하고, 72시간 후, 바이러스를 접종하지 않은 대조그룹의 흡광도를 100%로 했을 경우의 각 바이러스 접종그룹의 세포 생존율을 세포 수 측정 키트에 의해 정량했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 여기에서 사용한 모든 바이러스는 암 세포에 대하여 동일한 세포 장해성을 나타냈지만(도 3의 A), 정상세포에 대하여는 F4L 유전자를 결손한 바이러스(ΔRR)에서 바이러스 독성이 현저하게 경감되었다(도 3의 B).
실시예 3
RNR 유전자 결손에 의한 면역 부전 마우스에의 정맥내 투여에서의 바이러스 독성의 경감
면역 부전 마우스(SCID 마우스, 5주령, 암컷, 각 그룹 5마리)에 LC16m8-B5RmO, MD-RVV, MD-RVV-ΔRR-EEV6을 2.5×104, 5×105, 1×107 PFU/0.1㎖의 용량으로 마우스 정맥내에 투여하고, 생존 수, 체중, 바이러스 증상 스코어를 관찰했다. 바이러스 증상 스코어는 최대 5점이고, 0점: 증상 없음, 1점: 두창 1∼2개, 2점: 두창 3∼4개, 3점: 두창 다수, rough coat, 털세움, 4점: 호흡곤란, 빈사, 5점: 사망으로 했다. 그 결과를 도 4∼6에 나타낸다. LC16m8-B5RmO 및 MD-RVV 투여그룹은 각각, 바이러스 투여 19일후 및 40일후까지 모든 용량그룹의 동물이 사망했지만, MD-RVV-ΔRR-EEV6은 관찰 종료로 한 71일까지, 고용량 투여그룹, 중용량 투여그룹은 5마리 중 3마리가 생존하고, 또, 저용량 투여그룹은 모든 동물이 생존하고 있었다(도 4). 모든 바이러스도 투여량 의존적으로 체중의 감소가 관찰되고, 체중 감소의 정도는 LC16m8-B5RmO, MD-RVV, MD-RVV-ΔRR-EEV6의 차례로 컸다(도 5). 바이러스 증상 스코어도 또한, LC16m8-B5RmO, MD-RVV, MD-RVV-ΔRR-EEV6의 차례로, 투여량 의존적으로 높은 값을 나타냈다(도 6).
실시예 4
EEV 관련 단백질의 변형에 의한 암 세포에서의 생산성 향상
HeLa세포를 24구-플레이트에 파종하고, 혈청 함유 배지에서 접착 배양 후, MD-RVV, MD-RVV-A34R, MD-RVV-EEV6, MD-RVV-EEV7, MD-RVV-ΔRR, MD-RVV-ΔRR-A34R, MD-RVV-ΔRR-EEV6, MD-RVV-ΔRR-EEV7을 MOI=1로 접종하고, 1시간 배양후에 바이러스를 제거하고, 새롭게 혈청 함유 배지를 첨가하고, 16, 24, 32, 48시간후에 배지를 회수하고, 배양 상청 바이러스를 얻었다. 회수 바이러스를 단계 희석하고, 6구-플레이트에서 배양한 RK13 세포에 접종하고, 1시간 배양후에 바이러스를 제거하고, 새롭게 메틸셀룰로오스 배지를 첨가하고, 37℃에서 72시간 배양 후, 플라크를 카운트해서 감염가를 산출했다. 그 결과를 도 7에 나타낸다. MD-RVV(도 7의 A) 및 MD-RVV의 F4L 유전자를 결손시킨 바이러스(도 7의 B)에 대해서, EEV 관련 단백질을 변형시키는 것에　의해, 어느 것의 변형 바이러스도 배양기간을 통해서 배양 상청 바이러스의 생산량의 증가 경향이 나타났다. 특히, EEV 관련 단백질의 변형 수가 많을 수록 그 효과는 컸다.
또, HeLa 세포를 24구-플레이트에 파종하고, 혈청 함유 배지에서 접착 배양 후, 화학적으로 정의된 배지에서 LC16m8-B5RmO, MD-RVV-ΔRR, MD-RVV-ΔRR-A34R, MD-RVV-ΔRR-EEV6, MD-RVV-ΔRR-EEV7을 MOI=0.01로 접종하고, 1시간 배양후에 바이러스를 제거하고, 새롭게 화학적으로 정의된 배지를 첨가하고, 48시간후에 배지를 회수하고, 배양 상청 바이러스를 얻었다. 또, 세포를 회수해서 동결 융해 후, 초음파 처리하고, 원심후의 상청을 세포 내 바이러스로서 얻었다. 회수 바이러스를 단계 희석하고, 6구-플레이트에서 배양한 RK13 세포에 접종하고, 1시간 배양후에 바이러스를 제거하고, 새롭게 메틸셀룰로오스 배지를 첨가하고, 37℃에서 72시간 배양 후, 플라크를 카운트해서 감염가를 산출했다. 그 결과를 도 8에 나타낸다. EEV 관련 단백질의 변형에 의해, 배양 상청 바이러스(도 8의 A) 및 세포 내 바이러스(도 8의 B) 중 모두에 있어서, RNR 유전자의 결손에 의해 저하된 바이러스 생산량을 회복하는 경향이 나타났다. 특히, EEV 관련 단백질의 변형 수가 많을 수록 그 효과는 컸다.
실시예 5
인간 췌장암 복막 파종 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 복강내 투여에 의한 효과
복강내 투여에서, RNR 유전자 결손 바이러스가 복막 파종 모델 마우스의 생존 연장 효과를 나타내는 것을 확인하기 위해서, 3×106개의 인간 췌장암 BxPC3-Luc 세포를, 면역 부전 마우스(SCID 마우스, 6주령, 암컷)의 복강내에 이식해서 인간 췌장암 복막 파종 마우스를 구축 후, 21일후에 MD-RVV 또는 MD-RVV-△RR-EEV6(105PFU/0.1㎖)을 마우스 복강내에 투여했다. 또, 대조로 한 바이러스 비투여그룹에는 동일하게 21일후에, PBS(0.1㎖)를 마우스 복강내에 투여했다. 투여 후, 바이러스 독성, 생 존수를 관찰했다. 또, 바이러스 독성은 그 증상을 스코어화하고, 최대 5점이고, 0점: 증상없음, 1점: 두창 1∼2개, 2점: 두창 3∼4개, 3점: 두창 다수, rough coat, 털세움, 4점: 호흡곤란, 빈사, 5점: 바이러스 관련 사로 했다. 결과를 도 9∼10에 나타낸다(도 9: 바이러스 증상 스코어, 도 10: 생존율).
바이러스 독성에 대해서, MD-RVV 투여그룹은 투여 후 10일째쯤부터 두창 증상이 인정되고, 이후도 두창 수의 증가, rough coat, 호흡곤란 등의 중증 바이러스 증상이 발현하고, 최종적으로 42일까지 전체 예가 그것들 바이러스 독성에 의해 사망했다(도 9). 한편으로, MD-RVV-△RR-EEV6 투여그룹은 바이러스 증상을 전혀 나타내지 않고, RNR 유전자 결손에 의한 안전성 향상 효과가 확인되었다(도 9).
생존 수에 의한 평가에서는 MD-RVV 투여그룹은 중증의 바이러스 독성을 동반하고, 종양이 증대한 바이러스 비투여그룹과 동일한 시기에 전체 예가 사망했다(도 10). 한편으로, 생존기간에 차이가 있는 것을 검정하는 log-ranktest에서, MD-RVV-△RR-EEV6 투여그룹은 바이러스 비투여그룹 및 MD-RVV 투여그룹에 대해서, 유의한 생존 연장 효과를 나타냈다(도 10).
계속해서, 별도의 인간 췌장암 세포 MIA-PaCa2/CMV-Luc 세포 3×106개를, 면역 부전 마우스(SCID마우스, 6주령, 암컷)의 복강내에 이식해서 인간 췌장암 복막 파종 마우스를 구축 후, 14일후에 MD-RVV(106 PFU/0.1㎖) 또는 MD-RVV-△RR-EEV6 (106 또는 107 PFU/0.1㎖)을 마우스 복강내에 투여했다. 또, 바이러스 비투여그룹에는 동일하게 14일후에, PBS(0.1㎖)를 마우스 복강내에 투여했다. 투여 후, 바이러스 독성, 생존 수를 관찰했다. 또, 바이러스 독성은 그 증상을 스코어화하고, 최대 5점이고, 0점: 증상없음, 1점: 두창 1∼2개, 2점: 두창 3∼4개, 3점: 두창 다수, rough coat, 털세움, 4점: 호흡곤란, 빈사, 5점: 바이러스 관련 사로 했다. 결과를 도 11 및 12에 나타낸다(도 11: 바이러스 증상 스코어, 도 12: 생존율).
바이러스 독성에 관해서, MD-RVV 투여그룹은 바이러스 증상이 현저하게 인정되는 개체와 그렇지 않은 개체의 격차가 관찰되었지만, 전체로서 중정도∼중증의 바이러스 증상이 인정되었다(도 11). 한편으로, MD-RVV-△RR-EEV6 투여그룹은 바이러스 증상을 전혀 나타내지 않고, RNR 유전자 결손에 의한 안전성 향상 효과가 확인되었다(도 11).
생존 수에 의한 평가에서는 MD-RVV 투여그룹은 중증의 바이러스 독성 및 종양증대에 의해 바이러스 미접종 그룹과 동일한 시기에 전체 예가 사망했다(도 12). 한편으로, MD-RVV-△RR-EEV6 투여그룹은 바이러스 비투여그룹 및 MD-RVV 투여그룹에 대해서, 용량 의존성적인 생존 연장 경향을 나타냈다(도 12).
이상의 결과로부터, RNR 유전자 결손 바이러스는 복강내 투여 가능한 안정성이 높은 종양 용해성 바이러스인 것ㅇ미이 시사되었다.
실시예 6
인간 췌장암 동소이식 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 정맥내 투여에 의한 효과
정맥내 투여에서, RNR 유전자 결손 바이러스가 췌장암 모델 마우스의 생존 연장 효과를 나타내는 것을 확인하기 위해서, 1×106개의 인간 췌장암 MIA-PaCa2/CMV-Luc세포를, 면역 부전 마우스(SCID마우스, 5주령, 암컷)의 췌장 피막에 이식해서 인간 췌장암 동소 이식 마우스를 구축 후, 12일후에 MD-RVV-RLuc(105 PFU/0.1㎖) 또는 MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc(105 PFU/0.1㎖)를 마우스 정맥내에 투여했다. 또, RLuc는 Renilla 유래 루시페라아제 유전자를 의미하고, 장래 바이러스의 생체 내 분포를 확인하는 것을 목적으로, RLuc 발현 카세트(서열번호 63)를 구축 후, 실시예 1에서 결손 후의 C11R-AccI 사이트의 직전에 삽입했다. 또, MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc는 1회째의 투여 후, 1주일 이내에 추가로 2회 투여했다(빈번한 투여). 또, 바이러스 비투여그룹에는 동일하게 12일후에, PBS(0.1㎖)를 마우스 정맥내에 투여했다. 투여 후, 바이러스 독성, 생존 수를 관찰했다. 또, 바이러스 독성은 그 증상을 스코어화하고, 최대 5점이고, 0점: 증상 없음, 1점: 두창 1∼2개, 2점: 두창 3∼4개, 3점: 두창 다수, rough coat, 털세움, 4점: 호흡곤란, 빈사, 5점: 바이러스 관련 사로 했다. 결과를 도 13 및 14에 나타낸다(도 13: 바이러스 증상 스코어, 도 14: 생존율).
바이러스 독성에 관해서, MD-RVV-RLuc 투여그룹은 투여 후 10일째쯤부터 두창 증상이 인정되고, 이후도 두창 수의 증가, rough coat, 호흡곤란 등의 중증 바이러스 증상이 발현하고, 최종적으로 32일까지 전체 예가 그것들 바이러스 독성을 동반해서 사망했다(도 13). 한편으로, MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc 투여그룹은 단회 투여 및 빈번한 투여 모두에 다소의 바이러스 증상이 인정되었지만, 치사적인 증상은 관찰되지 않고, RNR 유전자 결손에 의한 안전성 향상 효과가 확인되었다(도 13).
생존 수에 의한 평가에서는, MD-RVV-RLuc 투여그룹은 중증의 바이러스 독성에 의해, 종양을 형성한 바이러스 비투여그룹보다도 조기에 전체 예가 사망했다(도 14). 한편으로, 생존기간에 차이가 있는 것을 검정하는 log-ranktest에서, MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc의 단회 투여그룹은 바이러스 비투여그룹과 동일한 생존 변화이었지만, 빈번한 투여그룹은 바이러스 비투여그룹에 대해서, 유의한 생존 연장 효과를 나타냈다(도 14).
이상의 결과로부터, RNR 유전자 결손 바이러스는 정맥내 빈번한 투여 가능한 안정성이 높은 종양 용해성 바이러스인 것임이 시사되었다.
실시예 7
인간 췌장암 피하이식 마우스에서의 RNR 유전자 결손 바이러스의 종양내 투여에 의한 효과
RNR 유전자 결손 바이러스의 종양내 투여에서의 종양 성장 억제효과를 확인하기 위해서, 5×106개의 인간 췌장암 MIA-PaCa2/CMV-Luc 세포를 면역 부전 마우스(SCID 마우스, 6주령, 암컷)의 우대퇴부 피하에 이식하고, 종양체적이 100mm3 이상에 달한 개체에 대해서, MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc(104, 105, 106 PFU/0.1㎖)를 종양내에 투여했다. 또, 바이러스 비투여그룹에는 PBS(0.1㎖)를 종양내에 투여했다. 투여 후, 종양 체적 변화율을 관찰했다. 종양 체적은 단경×단경×장경×1/2로 산출했다.
종양체적변화율에 관해서, MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc는 대략 용량의존적으로 종양 성장의 억제 경향을 나타내고, 종양내 투여에서의 종양 성장 억제효과가 확인되었다(도 15).
실시예 5∼7의 결과로부터, RNR 유전자 결손 바이러스인 MD-RVV-△RR-EEV6 및 MD-RVV-△RR-EEV6-RLuc는 복수의 인간 췌장암 마우스에서, 자기가 가지는 종양 용해 작용에 의해, 안전성을 확보하면서 생존 연장 효과를 발휘하는 것임이 시사되었다.
<<서열표 목록 프리 텍스트>>
서열번호 1은 TK1 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 2는 TK1 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 3은 TK2 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 4는 TK2 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 5는 pUCIDT-KAN-op7.5+EGFP 플라스미드의 염기서열이다.
서열번호 6은 BACgfp 제거 서열 카세트의 염기서열이다.
서열번호 7은 TK 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 8은 TK 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 9는 카나마이신 프라이머 1Fw의 염기서열이다.
서열번호 10은 카나마이신 프라이머 1Re의 염기서열이다.
서열번호 11은 B5R 변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 12는 pUCFk-B5RmO의 염기서열이다.
서열번호 13은 카나마이신 프라이머 2Fw의 염기서열이다.
서열번호 14는 카나마이신 프라이머 2Re의 염기서열이다.
서열번호 15는 C11R 결손 카세트의 염기서열이다.
서열번호 16은 pUC57-ΔVGF의 염기서열이다.
서열번호 17은 카나마이신 프라이머 3Fw의 염기서열이다.
서열번호 18은 카나마이신 프라이머 3Re의 염기서열이다.
서열번호 19는 O1L 결손 카세트의 염기서열이다.
서열번호 20은 pUC57-ΔO1L-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 21은 F4L 결손 카세트의 염기서열이다.
서열번호 22는 pUC57-ΔF4L-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 23은 A33R 변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 24는 A34R 변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 25는 A36R 변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 26은 A33-34-36R변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 27은 A56R 변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 28은 B5R 변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 29는 F12-13L 변형 카세트의 염기서열이다.
서열번호 30은 pUC57-A33R-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 31은 pUC57-A34R-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 32는 pUC57-A36R-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 33은 pUC57-A33-34-36R-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 34는 pUC57-A56R-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 35는 pUC57-B5R-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 36은 pUC57-F12-13L-rKanI의 염기서열이다.
서열번호 37은 B5R 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 38은 B5R 변형 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 39는 C11R 결손 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 40은 C11R 결손 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 41은 O1L 결손 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 42는 O1L 결손 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 43은 F4L 결손 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 44는 F4L 결손 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 45는 A33R 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 46은 A33R 변형 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 47은 A34R 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 48은 A34R 변형 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 49는 A36R 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 50은 A36R 변형 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 51은 A56R 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 52는 A56R 변형 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 53은 B5R 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 54는 B5R 변형 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 55는 F12-13L 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 56은 F12-13L 변형 확인 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 57은 A56R 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 58은 F12-13L 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 59는 F12-13L 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 60은 F12-13L 변형 확인 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 61은 BACgfp 합성 프라이머 Fw의 염기서열이다.
서열번호 62는 BACgfp 합성 프라이머 Re의 염기서열이다.
서열번호 63은 RLuc 발현 카세트의 염기서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> KM Biologics Co., Ltd. <120> Oncolytic vaccinia virus <130> 2022-0116A <150> JP 2019-147885 <151> 2019-08-09 <150> PCT/JP2020/030448 <151> 2020-08-07 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK1 primer Fw <400> 1 cggggtacca taaattagaa gccgtgggtc 30 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK1 primer Re <400> 2 ccttaattaa gaaaaatatt atgagtcgat gtaacacttt 40 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK2 primer Fw <400> 3 ccttaattaa tatatttttt atctaaaaaa ctaaa 35 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK2 primer Re <400> 4 gctctagacg gtagtatatc tcagtagtac gtt 33 <210> 5 <211> 4458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUCIDT-KAN-op7.5+EGFP <400> 5 cccccccccc catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggcca gcttgggaaa 60 ccataagacc gagatagagt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa 120 gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa 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Claims (26)

  1. 백시니아 바이러스 성장 인자(VGF), 세포 외 시그널 조절 키나아제(ERK) 활성화 단백질, 및 리보뉴클레오타이드 환원효소(RNR)의 기능이 결손한 백시니아 바이러스.
  2. 제1 항에 있어서,
    정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 안전성이 향상된 제한 성장형의 바이러스.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    C11R, O1L, 및 F4L의 각 유전자의 전부 또는 일부의 영역이 삭제 또는 변형되고, 이것들의 유전자 산물의 기능이 불활성화되어 있는 바이러스.
  4. 백시니아 바이러스 성장 인자(VGF), 세포 외 시그널 조절 키나아제(ERK) 활성화 단백질, 및 리보뉴클레오타이드 환원효소(RNR)의 기능이 결손하고 있고, 추가로, 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는, 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 안전성 및 생산성이 향상된 제한 성장형 백시니아 바이러스.
  5. 제4 항에 있어서,
    C11R, O1L, 및 F4L의 각 유전자의 전부 또는 일부의 영역이 삭제 또는 변형되고, 이것들의 유전자 산물의 기능이 불활성화되어 있는 바이러스.
  6. 제4 항 또는 제5 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 또는 복수의 유전자이고, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는 바이러스.
  7. 제4 항 또는 제5 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자고, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는 바이러스.
  8. 제4 항 또는 제5 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자고, EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자로 치환되어 있는 바이러스.
  9. 제4 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 IHD-J주 또는 IHD-W주인 바이러스.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스를 포함하는 암 치료를 위한 의약 조성물.
  11. 제10 항에 있어서,
    정맥내 투여용, 복강내 투여용 또는 종양내 투여용인 의약 조성물.
  12. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스에 외래 DNA를 도입한 제한 성장형 백시니아 바이러스 벡터.
  13. 제12 항에 있어서,
    외래 DNA가 암 특이항원 유전자, 면역응답 제어분자, 또는 암 세포 표면항원 친화성 단백질을 코딩하는 DNA인 벡터.
  14. 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 제한 성장형 백시니아 바이러스의 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열이 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자의 DNA 서열로 치환되어 있는 생산성이 향상한 상기 바이러스.
  15. 제14 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 또는 복수의 유전자인 바이러스.
  16. 제14 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 바이러스.
  17. 제14 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 바이러스.
  18. 제14 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 IHD-J주 또는 IHD-W주인 바이러스.
  19. 제14 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스를 포함하는 암 치료를 위한 의약 조성물.
  20. 제14 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스에 외래 DNA를 도입한 제한 성장형 백시니아 바이러스 벡터.
  21. 제20 항에 있어서,
    외래 DNA가 암 특이항원 유전자, 면역응답 제어분자, 또는 암 세포 표면항원 친화성 단백질을 코딩하는 DNA인 벡터.
  22. 정상세포 내에서는 복제하지 않고, 성장세포 내에서 선택적으로 복제 가능한 제한 성장형 백시니아 바이러스의 세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열을 EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 대응하는 유전자의 DNA 서열로 치환하는 것을 포함하는 제한 성장형 백시니아 바이러스의 생산성을 향상시키는 방법.
  23. 제22 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L으로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나또는 복수의 유전자인 방법.
  24. 제22 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 방법.
  25. 제22 항에 있어서,
    세포 외 피막성 바이러스(EEV) 관련 단백질을 코딩하는 유전자가 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, F12L, 및 F13L 유전자인 방법.
  26. 제22 항에 있어서,
    EEV 생산능이 높은 다른 백시니아 바이러스주가 IHD-J주 또는 IHD-W주인 방법.
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