KR101440159B1 - 이동가능한 혼성 복제개시점 플라스미드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한 개 이상의 플라스미드 유래의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 혼성 복제개시점을 만들어 내기 위한 변형된 플라스미드 복제개시점과 관련되어 있다. 또한 본 발명은 복제개시점에 인접하는 다중클로닝부위에 의해 이동가능하거나 교환가능한, 변형된 복제개시점 카세트와 관련되어 있다. 복제개시점을 교환하는 방법과 이용을 위한 플라스미드는 공지되었다. 이러한 변형된 또는 혼성 플라스미드는 원하는 단백질의 발현수준을 조절하는데 유용한 클로닝 도구들을 제공한다.

뉴클레오티드 서열, 복제개시점, 플라스미드, 단백질의 발현수준

Description

이동가능한 혼성 복제개시점 플라스미드{HYBRID PORTABLE ORIGIN OF REPLICATION PLASMIDS}

본 발명은 플라스미드 복제개시점들의 변형에 관한 것이고, 좀 더 상세하게는, 플라스미드 pBR322 또는 pACYC184의 변형된 이동가능한 복제개시점에 관한 것이다. 특히, 복제개시점들의 교환에 사용하기 위한 방법들과 플라스미드들이 개시되어 있다.

수많은 종들의 박테리아는 플라스미드로 알려진, 작은 원형의 염색체의 유전자 요소들을 포함한다. 플라스미드들은 박테리아세포의 염색체를 독립적으로 복제한다. 이들은 통상적으로 작고, 원형이고, 이중가닥 분자들이고, 모든 유형의 박테리아(비록 모든 균주는 아니지만, 아마도 박테리아의 모든 종들)에서 발견된다. 복사체들의 수(즉, 복제수(copy number))는 플라스미드 유형에 따라 다르고, 세포는 하나 이상의 유형의 플라스미드를 가질 수 있다. 플라스미드들은, 박테리아에 필수적이지는 않지만, 종종 유용한 유전자들을 포함한다. 플라스미드들에서 발견된 통상적인 유전자들은 플라스미드 복제를 암호화하는 유전자(즉, 복제개시점) 및 세포유지, 항생제 내성, 박테리오신 생성, 성별 결정 및 다른 세포기능들을 암호화하는 유전자들을 포함한다(Kornberg와 Baker, DNA 복제, 2판(1991)).

pBR322, pMB1, p15A, pACYC184, pACYC177, ColE1, pBR3286, p1, pBR26, pBR313, pBR327, pBR328, pPIGDM1, pPVU1, pF, pSC101 및 pC101p-157과 같은 다수의 플라스미드들이 당 분야에 공지되어 있다.

많은 미생물 플라스미드 발현벡터들은 pBR322 플라스미드의 유도체들이다. 상기 플라스미드 pBR322는 가장 널리 사용되는 대장균(Escherichia coli) 클로닝벡터들 중의 하나이며, 이것의 제한지도는 도 1에 도시되어 있다. pBR322는 4361개의 염기쌍들로 이루어지고, 다음의 유전적 요소들을 포함한다:

(1) 플라스미드의 복제에 관여하는 레플리콘(복제개시점은 플라스미드 pMB1으로부터이다); (2) 불안정한 RNAI-RNAⅡ 복합체를 안정한 복합체로 전환하는 것을 촉진시키고, 복제수를 감소시키는 역할을 하는, Rop 단백질을 암호화하는 rop 유전자; (3) 앰피실린에 대해 내성을 제공하는 베타-락타마제를 암호화하는 bla 유전자; 및 (4) 테트라사이클린 내성 단백질을 암호화하는 tetR 유전자. 플라스미드 pBR322의 완전한 뉴클레오티드 서열은 결정되었고, 이는 DNA 단편들의 클로닝을 위해 유용한 몇 개의 특정한 제한 부위들을 나타내고 있다.

제시된 rep 영역은 복제를 촉진시키기에 충분하다. DNA복제는 위치 2533에서 개시되고, 도 1에 나타낸 방향으로 진행된다. pMB1과 ColE1 레플리콘을 운반하는 플라스미드들은 상용성이 없지만, 이들은 p15A 레플리콘을 운반하는 것들(pACYC177 및 pACYC184와 같은 표준 클로닝벡터)과는 완전히 상용가능하다.

플라스미드 pBR322는 많은 발현벡터들을 구성하기 위한 출발 플라스미드로서 널리 성공적으로 이용되게 하는 몇가지의 중요한 이점들을 가지고 있다. 이러한 이 점들은 pBR322가 완전히 서열화되었다는 점, DNA 단편들을 클로닝하기 위해 유용한 몇 개의 특정한 제한부위들을 가지고 있다는 점, 자기-전달성이 없다는 점, 및 쉽게 입수가능하다는 점을 포함한다.

그러나, pBR322의 사용과 관련해서는 수많은 단점들이 있다. 플라스미드의 중요한 특징들 중의 하나는, 복제개시점으로 불리우는 플라스미드상의 영역에 의해 결정되는 복제수이다. 플라스미드 pBR322상의 복제개시점은 좌표(coordinate) 번호 1766으로부터 3148까지이다.

세포당 플라스미드 분자들의 평균 수인, 플라스미드의 복제수는, 플라스미드 유전적 요소들의 배열에 의해 결정되고 통제되는, 플라스미드의 기본적인 특성이다(The Biology of Plasmids, David K. Summers, Blackwell Science, 1996 ; 및 Plasmid Biology, Barbara E. Funnell과 Gregory J. Phillips, American Society for Microbiology Press, 2004에서 검토.) 각각의 특정한 플라스미드는 특징적인 플라스미드 복제수를 갖는다. 오늘날까지 연구된 다수의 플라스미드들에 있어서 특정한 플라스미드 복제수들은, 세포당 하나의 복제수와 같은 작은 수로부터, 세포당 수백개의 복제수에 이르는 범위가 알려져있다. 플라스미드 복제수는 숙주세포상에서 많은 중요한 효과들을 갖는다. 흔히, 다복제수(multicopy number) 플라스미드상에서 목적유전자의 과발현은 세포에 대해 독성효과를 나타낼 수 있고, 목적유전자의 클로닝을 불가능하게 하거나 어렵게 할 수 있다. 복제수가 많은 것이 바람직하지 않은 조건하에서는, 복제수가 적은 것으로 여겨지는 플라스미드 pACYC184와 같은, 그러한 환경하에서 더 적은 복제수를 갖는 플라스미드를 이용하는 것이 가능하 다. 어떤 경우들에서는, 다른 유용한 특징들과 높은 복제수를 갖는 변형된 ColE1 플라스미드들인, pBluescript® 시리즈의 벡터(Stratagene, La Jolla, Califonia로부터 입수가능하다)들과 같은 높은 복제수의 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다.

pBR322의 단점들 중의 하나는, 낮은 범위의 복제수인 약 20의 복제수를 갖는 것이다. pBR322의 복제개시점은 플라스미드 pMB1으로부터 유래되고, 이는 플라스미드 ColE1상의 복제개시점 영역과 상동성이다. 따라서, 종종 pBR322가 ColE1 복제개시점을 갖는 것으로 언급되지만, 그것은 실질적으로 pMB1 복제개시점을 갖는다.

플라스미드 pBR322가 낮은 복제수를 갖기 때문에, 다량의 과발현된 원하는 단백질을 생성하기 위해서는, 종종 높은 복제수를 갖는 다른 플라스미드를 이용하는 것이 필요하다. 다른 경우들에서는, 숙주세포가 과발현을 용인하지 않는 경우에, 어떤 독성단백질들의 발현을 위하여, 낮은 복제수의 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다. 따라서 pBR322의 플라스미드 복제수 보다 상당히 더 높거나 또는 더 낮은 플라스미드 복제수를 지닌 플라스미드가 클로닝을 위해서 필요하다면 pBR322의 많은 유용한 특징들이 없는 플라스미드가 이용되어야 한다는 것은 이미 사례화 되었다. 이는 pMB1 ORI의 몇 가지 특징들과 ColE1의 ORI와 같은 다른 ORI의 몇가지 특징들을 갖는, 변형된 pBR322 플라스미드를 제공하는 경우 큰 이점이 될 수 있다. 또한, 발현 플라스미드로서 이용될 수 있도록 복제개시점을 쉽게 교환시킬 수 있고, 그렇지 않은 경우에는 미변화된 상태로 남아 있는, 변형된 pBR322 플라스미드를 제공하는 경우도 큰 이점이 될 수 있다. 이러한 방식으로, 당업자는 여 전히 pBR322 플라스미드의 이점을 이용할 수 있고, 또한 복제개시점을 원하는 어떤 치환 복제개시점으로 변경시킬 수 있는 융통성을 가질 수 있다.

원하는 항생제 내성 마커 또는 제한 부위들과 같은, 특별한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직한 경우에는, 원하는 복제수를 얻기 위해 복제개시점을 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 기존에는, pBR322 복제개시점 영역인 1766~3148은 특정의 제한부위에 인접해 있지 않기 때문에, pBR322의 복제개시점을 다른 플라스미드의 복제개시점 영역으로 변형시키는 것에 실패했다. 좌표 3148 이후에, 제1의 특정 제한부위가 앰피실린 내성유전자 내에 위치한다. 따라서, pBR322 플라스미드 골격 내로 다른 복제개시점을 간단히 "절단하여 붙이는 것(cut and paste)"은 불가능하다.

따라서, 이동가능한 복제개시점을 포함하고, 다중클로닝부위들(MCS)로 알려진 다수의 특정 제한부위들에 인접하며, 교환이 용이한 pBR322 복제개시점을 만드는, 변형된 pBR322 플라스미드들에 대한 요구가 존재한다. 이러한 변형된 pBR322 플라스미드들은, 원하는 또는 목표하는 유전자 생성물들의 발현수준의 조정을 가능케하는, 유용한 클로닝 도구들을 제공할 것이다.

pACYC184, p1, 플라스미드F 및 pSC101과 같은 몇 개의 다른 플라스미드들에 대해서도 유사한 상황이 존재한다. 낮은 복제수와, 복제개시점 영역의 교환을 촉진시키기 위한 특정 제한부위가 결핍된 복제개시점 영역을 갖는 pACYC184가 인접된 MCS로 변형된다면 쉽게 사용될 수 있다.

박테리오파아지 P1은 대부분의 다른 프로파아지와 같이 E. Coli 염색체 내에 통합되기보다는, 오히려 세포당 약 2~3의 복제수를 갖는 독립 플라스미드로서 정지(quiescent) 프로파아지 상태로 E. Coli 세포들 내에 존재한다. 따라서, P1 게놈의 복제개시점은 플라스미드 복제개시점으로서 이용될 수 있다. P1의 복제개시점은, 이 복제개시점이 안정된 2~3 복제수 플라스미드 클로닝 벡터의 기초로서 이용되기에 적합하도록 만드는, 플라스미드의 안정된 유전질을 제공하는 유전적 요소들을 포함한다.

세포당 약 1~2의 플라스미드 복제수를 갖는 플라스미드 F는 유전적 교환에 관련된 E. Coli의 플라스미드이다. 플라스미드 F의 복제개시점은, 이 복제개시점이 안정된 1~2 복제수 플라스미드 클로닝 벡터의 기초로 이용되기에 적합하도록 만드는, 플라스미드의 안정된 유전질을 제공하는 유전적 요소들을 포함한다.

세포당 약 5의 플라스미드 복제수를 갖는 플라스미드 pSC101은 E. Coli 세포들 내에서 복제가능한 살모넬라로부터 분리된 플라스미드이다. pSC101의 모(parent)플라스미드는, 플라스미드 R6으로부터 유래되는 플라스미드 R6-5이다. 따라서, 플라스미드 pSC10, R6-5 및 R6에 있어서 복제개시점은 동일하다. P1의 복제개시점은, 이 복제개시점이 안정된 5 복제수 플라스미드 클로닝 벡터의 기초로서 사용되기에 적합하도록 만드는, 플라스미드의 안정된 유전질을 제공하는 유전적 요소들을 포함한다.

가장 통상적으로 사용되는 다수-복제(multi-copy) 클로닝벡터들은 1세대당 1세포에 대하여 10^-2~10^-5의 빈도로 비-선택적 조건하에서 유실되는, 불안정한 방식으 로 유전된다(Summers와 Sherratt, 1984). 그러나, 다수-복제 플라스미드 ColE1은 안정되게 유전되는데, 이는 ColE1이 안정화 기능을 포함한다는 사실을 암시한다. 세포분열시 세포들 간의 ColE1-유사 플라스미드의 분배는 랜덤하고, ColE1은 안정되게 유전되는데 반하여 작은 ColE1-유사 클로닝 벡터들은 불안정하게 유전되는, 혼란스러운 문제가 밝혀졌다. 이 혼란스러운 문제는, 플라스미드 다량체 형태는 작은 ColE1-유사 클로닝 벡터들로 형성되고, 플라스미드 다량체(multimers)가 플라스미드 단량체보다 더 낮은 복제수에서 유지되기 때문에(세포당 상응하는 플라스미드-단량체의 함량은 동일하다), 이러한 다량체화가 불안정한 유전의 원인이었고, 따라서 플라스미드 다량체를 포함하는 세포들은 세포분열 후에 플라스미드가 없는 분리개체들(segregants)을 생성시킬 위험이 더 많이 존재한다는 사실을 발견하므로써 해결되었다. ColE1 상의 어느 영역이, 플라스미드 다량체들을 다시 단량체들로 분해시키는 기능을 하는 것으로 밝혀졌고, 이는 cer(ColE1 resolution)으로 지칭되었다(Summers와 Sherratt, 1984).

유사한 안정성 기능은 플라스미드 Co1K 상에서도 발견되었고, 이 두 개의 플라스미드들에 관한 뉴클레오티드 서열 상동성 영역의 동정에 의해 Cer 위치가 약 150개 염기쌍(bp)의 영역에 위치한다는 것을 정확히 밝혀낼 수 있었다(Summers 등, 1985). Cer 부위의 분자생물학과 다량체 분해능에 대한 숙주인자들의 관련성이 광범위하게 연구되었다(Summers와 Sherratt, 1988; Summers, 1989; Summers, 1991; Summers 등, 1993; Hodgman 등, 1998). 적어도 4개의 염색체-암호화된 단백질들이 관련되어 있고, 이는 아르기닌 생합성 억제제인 ArgR(Striling 등, 1988); 아미노 펩티다제 A (PepA) (Stirling 등, 1989); 및 재조합효소 XerC(Colloms 등, 1990) 및 XerD(Blakely 등, 1993)를 포함한다. 숙주인자들에 대한 이러한 의존성은, Cer 시스템의 기능적 숙주범위에 제한을 가할 수 있다. Cer-매개 재조합은, 일방적 방식, 즉 다량체에서 단량체로의 전환만 일어난다(Guhathakurta와 Summers, 1995; Guhathakurta 등, 1996).

다량체 분해능은 ColE1를 안정하게 유지하는데 필요조건이나, 충분조건은 아니다. cer, pcer 내의 프로모터는 다량체 분해에 필요하지 않은 70 뉴클레오티드의 미번역 RNA 분자의 합성을 지시하지만, 이는 안정된 플라스미드 유지를 위해서는 필수적이다. RCD(regulator of cell division)로 알려진, 이같은 RNA 분자는 플라스미드 다량체들을 포함하는 세포들의 분열을 저지시킨다(Patient와 Summers, 1993). RCD의 이 같은 효과는 다량체를 포함하는 세포들이 분열되어, 플라스미드 없는 분리개체 세포를 생성시키는 것을 방해한다. pcer로부터의 전사는 거의 다량체를 포함하는 세포들에서만 일어나고, 단량체를 포함하는 세포들에서는 매우 적은 량의 RCD가 검출된다. 이는 pcer 프로모터가 위상적으로 강제로 제한받고, 이 프로모터가 활성화되기 위해서 플라스미드 다량체들 상에서만 발견되는 슈퍼코일링 정도를 필요로 한다는 사실을 암시한다. 세포분열시에 RCD가 어떻게 그것의 효과들을 발휘하는지는 알려져 있지 않다. '정지' 세포들을 만들기 위한 RCD 분자의 이용은 Summers와 Rowe의 미국특허 제6,190,867호에 청구되어 있다.

따라서 본 발명은 변형된 혼성 pBR322 또는 pACYC184 플라스미드들을 제조함으로써, 당 분야에서 전술한 문제점들을 해결한다. 당 분야에서 기술된 문제점들의 예들은 1) 높거나 또는 낮은 복제수의 플라스미드들에 대한 필요성; 2) 플라스미드들 사이에서 복제개시점의 이동가능성에 대한 필요성; 및 3) 주문에 따라서 만들 수 있는 플라스미드들에 대한 필요성, 즉, 배양시에 플라스미드 안정성을 증가시키는 cer영역과 같은, 플라스미드에 대해 특이적인 유전적 요소들을 첨가시키는 능력이다.

몇몇의 혼성 pBR322 또는 pACYC184 플라스미드들은 배양시에 연장된 플라스미드 안정성을 제공하기 위한 cer 부위를 포함한다. 이 플라스미드 안정성은 원하는 단백질을 생산하는 변형된 구조체들이 항생제 선택의 부재하에 많은(>20) 세대를 위해 배양될 필요가 있을 때 특히 바람직하다.

발명의 요약

본 발명은 적어도 두 개의 다른 플라스미드들 유래의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 혼성(hybrid) 복제개시점에 관한 것이다. 본 발명은 이동가능한 복제개시점을 포함하도록 변형된 플라스미드들, 바람직하게는 다중클로닝부위(MCS:Multiple Cloning Sites)로서 알려진 다수의 특정한 제한부위들에 인접하여 위치하고, 쉽게 교환가능한 복제개시점을 만드는 플라스미드들을 포함한다. 이러한 변형된 플라스미드들은, 원하는 또는 목표로 하는 유전자 생성물들의 발현 수준의 조정을 가능케하는 유용한 클로닝 도구들을 제공할 것이다.

본 발명의 구체예는 적어도 두 개의 상이한 플라스미드들 유래의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 키메릭 또는 혼성 복제개시점을 포함한다. 이와 같은 혼성 복제개시점들은 pBR322으로부터의 뉴클레오티드 서열들(SEQ ID 1)과 ColE1로부터의 뉴클레오티드 서열들(SEQ ID 6)을 포함한다. 다른 혼성 복제개시점은 ColE1 플라스미드내의 AlwNi 제한부위로부터 위치 3148에 이르는 뉴클레오티드 서열에 연결된, pBR322 플라스미드 내의 위치 1766으로부터 AlwNi 제한부위에 이르는 뉴클레오티드 서열들(SEQ ID 7)을 포함한다. 또 다른 혼성 복제개시점은 pBr322 플라스미드내의 AlwNI 제한부위로부터 위치 3148에 이르는 뉴클레오티드 서열에 연결된, ColE1 플라스미드 내의 위치 1766으로부터 AlwNI 제한부위에 이르는 뉴클레오티드 서열들(SEQ ID 12)을 포함한다. 다른 혼성 복제개시점은 pBR322와 pACYC184로부터의 뉴클레오티드 서열들(SEQ ID 28)을 포함한다. 본 발명의 몇 가지 구체예들을 위하여, 하나의 복제개시점으로부터 적어도 200 뉴클레오티드들, 더 바람직하게는 250 뉴클레오티드들이 다른 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드들에 연결된다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 각각에 인접하여 적어도 하나의 클로닝부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열들이 인접한 복제개시점의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 교환가능한 복제개시점 카세트를 포함하고; 여기에서 상기 클로닝부위는 조절영역 또는 구조적 암호화 영역 내에 있지 않다. 어떤 구체예들에서는, 상기 교환가능한 복제개시점 카세트는 SEQ ID NO:30(Bg1II-NsiI-NotI 다중클로닝부위(MCS) 단편) 및/또는 SEQ ID NO:31(SacI- SpeI- Bg1II 다중클로닝부위(MCS) 단편)과 같은 다중클로닝부위들을 포함할 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식부위는 Bg1II에 대해서는 AGATCT, NsiI에 대해서는 ATGCAT, NotI에 대해서는 GCGGCCGC, SacI에 대해서는 GAGCTC, 및 SpeI에 대해서는 ACTAGT이다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 각각에 인접하여 적어도 하나의 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열들이 인접한 복제개시점의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 교환가능한 복제개시점 카세트를 포함하는 변형된 플라스미드들을 포함한다. 추가적인 구체예들은 교환가능한 복제개시점이 pBR322, ColE1, pMB1, P15A 또는 pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는, 변형된 플라스미드를 포함한다.

더 나아가 다른 구체예들은, 교환가능한 복제개시점이 혼성 ColE1 및 pMB1 복제개시점을 포함하는, 변형된 플라스미드를 포함한다.

본 발명의 구체예들은, pBR322 플라스미드 골격에 기초를 둔 변형된 플라스미드, 또는 pBR322의 복제개시점 영역들과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 나타내는 플라스미드를 포함한다. 복제개시점의 나머지는 플라스미드들 pACYC184 및/또는 ColE1로부터의 서열들을 포함한다. 이는 pBR322의 ORI와, 혼성 ORI를 만드는데 사용되는 제2의 ORI 사이에 적어도 70%의 전체 상동성이 있음을 의미한다. 이러한 하나의 구체예에서 플라스미드는 pXT977이다.

이 플라스미드는 다중클로닝부위들이 혼성 복제개시점에 인접하여 위치할 수 있도록 더 변형될 수 있다. 이러한 구체예에서, 플라스미드는 pXT988이다. 추가적인 구체예는 pBR322 플라스미드 골격에 기초를 둔 변형된 플라스미드, 또는 다중클로닝부위들에 인접하여 위치한 pMB1 복제개시점을 포함하는 pBR322 또는 pACYC184의 복제개시점 영역과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 나타내는 플라스미드를 포함한다. 이러한 하나의 구체예에서 플라스미드는 pXT955이다.

추가적인 구체예들에서, 변형된 플라스미드 벡터는 소 소마토트로핀(bST) 발현요소들을 포함하고, 이는 대표적으로 pXT757, pXT985, pXT986, pXT987, pXT996, pXT1002, pXT1003, pXT1004, pXT1007, pXT1109 또는 pXT1110이다.

추가적인 구체예들은, 다음의 단계들을 포함하는, 제1의 플라스미드 내에 교환가능한 복제개시점 카세트를 만드는 방법을 포함한다:

(a) 어닐링영역, 및 제2의 플라스미드 내의 클로닝 부위에 상응하는 적어도 하나의 클로닝 부위를 포함하는 영역을 포함하는 프라이머를, 제1의 플라스미드 내에 존재하는 복제개시점을 증폭시키기 위하여 사용하는 단계;

(b) 복제개시점 영역, 어닐링 영역, 및 적어도 하나의 클로닝 부위를 포함하는 PCR 앰플리콘을 분리하는 단계.

또 다른 추가적인 구체예들에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 제1의 플라스미드와 제2의 플라스미드 간에 복제개시점 영역을 교환하는 방법을 포함한다:

(a) 어닐링 영역, 및 제2의 플라스미드 내의 클로닝 부위에 상응하는 적어도 하나의 클로닝 부위를 포함하는 영역을 포함하는 프라이머를, 제1의 플라스미드 내에 존재하는 복제개시점을 증폭시키기 위해 사용하는 단계;

(b) 복제개시점 영역, 어닐링 영역, 및 적어도 하나의 클로닝 부위를 포함하는 PCR 앰플리콘을 분리하는 단계;

(c) 적어도 하나의 클로닝 부위를 인식하는 제한효소로 상기 PCR 앰플리콘을 소화시키는 단계;

(d) 상기 존재하는 복제개시점을 절단하기 위해 적어도 하나의 클로닝 부위를 인식하는 제한효소로 상기 제2의 플라스미드를 소화시키는 단계;

(e) 상기 제1의 플라스미드의 상기 PCR 앰플리콘을 상기 제2의 플라스미드 내로 결찰하는 단계.

또 다른 구체예들은, 상기의 변형된 플라스미드들 중의 어떤 것으로 형질전환된 박테리아 숙주세포를 포함한다. 추가적인 구체예들은 상기의 변형된 플라스미드들 중의 어떤 것을 포함하는 킷트(kit)를 포함한다. 상기 킷트들은 또한 상용성이 있는 적합한 숙주세포들을 포함할 수 있다.

본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 목적 재조합 단백질의 제조방법을 포함할 수 있다:

(a) ColE1, MB1, p15A, 또는 혼성 ColE1, MB1, p15A 복제시스템과 조화되는 적합한 박테리아 숙주세포를, 발현조절 뉴클레오티드 서열들에 작동적으로 연결된, 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 상기의 변형된 플라스미드들 중의 어느 것으로 형질전환시키는 단계;

(b) 상기 재조합 단백질의 발현을 위해 적합한 조건하에서, 상기의 변형된 플라스미드들로 형질전환된 상기 적합한 박테리아 숙주의 배양물을 성장시키는 단계; 및

(c) 상기 목적 단백질을 회수하고 정제하는 단계.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, E. Coli 내에서 플라스미드 DNA를 생산하는 방법을 포함할 수 있다:

(a) 적합한 E. Coli 균주를 상기의 어떤 변형된 플라스미드들로 형질전환시키는 단계; 및

(b) 상기 벡터의 복제를 허용하는 조건하에서, 상기 변형된 플라스미드들로 형질전환된 상기 E. Coli의 배양물을 성장시키는 단계;

도면들의 설명

다음의 도들은 본 발명의 명세서의 일부를 이루고, 본 발명의 어떠한 측면들을 구체적으로 예시하기 위해 포함되어 있다. 본 발명은 여기에서 제공된 구체예들의 상세한 설명과, 하나 이상의 이들 도 들을 참고로 하여, 좀 더 잘 이해될 것이다.

도 1은 pBR322의 복제개시점의 선형지도를 보여준다(뉴클레오티드 1766~3148).

도 2는 변형된 pBR322 구조체인, pXT975의 디자인을 보여준다. 패널 2A에는변형된 플라스미드를 만들기 위해 사용된 프라이머들 중의 하나의 디자인이, pBR322에 상동성인 좌표 3149에서의 영역 및 ColE1 복제개시점에 대해 상동성인 긴 꼬리 영역과 함께 도시되어 있다.

패널 2B에는, 제2의 프라이머의 디자인이 ColE1 복제개시점에 상동성인 좌표 2892에서의 영역 및 좌표 3149에서의 pBR322 플라스미드에 대해 상동성인 꼬리 영역과 함께 도시되어 있다.

패널 2C는 변형된 pBR322 구조체인 pXT975를 보여주고, 여기에서 복제개시점의 위치 2892~3148은 혼성 복제개시점을 만들기 위해 ColE1으로부터의 상응하는 영역으로 치환되었다.

도 3은 변형된 pBR322 구조체인 pXT976의 디자인을 보여준다. 패널 3A에는, 변형된 플라스미드를 만들기 위해 사용된 프라이머들 중의 하나의 디자인이, pBR322에 상동성인 좌표 1677에서의 영역 및 ColE1 복제개시점에 대해 상동성인 긴 꼬리 영역과 함께 도시되어 있다.

패널 3B에는, 제2의 프라이머의 디자인이, ColE1 복제개시점에 대해 상동성인 좌표 2892에서의 영역 및 좌표 1667에서의 pBR322 플라스미드에 대해서 상동성인 꼬리 영역과 함께 도시되어 있다. 패널 3C는, 변형된 pBR322 구조체인 pXT976을 보여주고, 여기에서 복제개시점의 위치 1766~2892는 혼성 복제개시점을 만들기 위해 ColE1 개시점으로부터의 상응하는 영역으로 치환되었다.

도 4는 pBR322, pXT975, pXT976 및 pXT977 사이의 복제개시점 영역들의 개시점의 비교를 보여준다. 변형된 pBR322 구조체인 pXT977은, ColE1의 복제개시점으로 치환된 완전한 pBR322(pMB1) 복제개시점을 갖는다(뉴클레오티드 1766~3148).

도 5는 다중클로닝부위(MCS)가 인접한 ColE1 복제개시점 영역을 가진 변형된 pBR322 구조체인 pXT988의 구성을 보여준다. 패널 5A에서, 변형된 플라스미드를 만들기 위해 사용된 프라이머들중 하나의 디자인이, pBR322에 대해 상동성인 좌표 3430에서의 영역, 다수의 제한효소 인지부위들의 서열들을 포함하는 긴 꼬리영역, 및 ColE1 복제개시점에 대해 상동성인 서열들의 영역과 함께 도시되어 있다. 패널 5B에는, 제2의 프라이머의 디자인이, ColE1 복제개시점에 대해 상동성인 좌표 2892에서의 영역, 다수의 제한효소 인지부위들의 서열들을 포함하는 꼬리영역, 및 좌표 3430에서의 pBR322 플라스미드에 대해 상동성인 서열들의 영역과 함께 도시되어 있다. 패널 5C에서, 제2의 프라이머의 디자인이, pBR322 복제개시점에 대해 상동성인 좌표 1667에서의 영역, 다수의 제한효소 인지부위들의 서열들을 포함하는 꼬리영역, 및 ColE1 플라스미드에 대해 상동성인 서열들의 영역과 함께 도시되어 있다. 패널 5D에서, 제2의 프라이머의 디자인이, ColE1 복제개시점에 대해 상동성인 좌표 2892에서의 영역, 다수의 제한효소 인지부위들의 서열들을 포함하는 꼬리영역, 및 좌표 1667에서의 pBR322 플라스미드에 대해 상동성인 서열들의 영역과 함께 도시되어 있다. 패널 5E는, MCS에 인접된, 전장 ColE1 복제개시점을 포함하는 변형된 pBR322 구조체인 pXT988을 보여준다.

도 6은 다중클로닝부위들(MCS)이 인접한 복제개시점 영역을 가진 플라스미드들의 특징들을 보여준다. 패널 6A에 도시된 것은 플라스미드 pXT995로, 여기에서 복제개시점은 전부 pBR322로부터 유래되고, MCS에 인접해있다. 패널 6B는 혼성 플라스미드 pXT1001을 보여주고, 여기에서 복제개시점은 ColE1과 pBR322(pMB1) 복제개시점들로부터의 세그먼트들을 포함하고 있으며, MCS에 인접해있다. 패널 6C는 혼성 플라스미드 pXT1000을 보여주고, 여기에서 복제개시점은 ColE1과 pBR322(pMB1) 복제개시점들로부터의 세그먼트들을 포함하고 있으며, MCS에 인접해있다. 패널 6D는 혼성 플라스미드 pXT988을 보여주고, 여기에서 복제개시점은 전부 ColE1로부터 유래되고, MCS에 인접해있다.

도 7은 pXT1092의 특징들을 보여주고, 여기에서 MCS가 인접한 pBR322(pMB1) 복제개시점은 pXT995상에서 발견된 것과는 반대방향으로 뒤집기(flip)되어 있다.

도 8은 플라스미드 pACYC184(뉴클레오티드 580~1407)상의 복제개시점 영역의 선형지도와 제한효소 BstZ171을 위한 좌표 596에서의 단일 제한효소 부위를 보여준다.

도 9는 pBR322(상부 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO:1)과 pACYC184(하부 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO:24)로부터의 복제개시점들의 뉴클레오티드 서열들의 비교를 보여준다.

도 10은 cer부위를 포함하는 혼성 플라스미드 pXT1007(SEQ ID NO:32)의 NsiⅠ-NotⅠ 단편의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.

도 11은 cer부위를 포함하는 플라스미드 pXT1221의 복제개시점 지역의 선형지도를 보여준다.

발명의 상세한 설명

다음의 정의들은 본 발명의 상세한 설명을 이해하는데 있어서 당업자들에게 도움을 주기 위하여 제공된다.

"발현구조체", "재조합 발현구조체", 및 "발현시스템"이라는 용어들은, 최소한복제개시점, 선택가능한 마커 및 수용 숙주세포에서 발현되어질 목적의 유전자 또는 폴리펩티드-암호화 핵산을 암호화하는, 유전학적으로 설계된 핵산서열들을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

"플라스미드" 또는 "벡터"라는 용어는, 공유결합으로 연속된 어떤 염색체외 이중가닥 핵산분자를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

"복제수"라는 용어는, 세포상의 또는 세포내의, 또는 세포의 일부상의 또는 세포의 일부내의 특정 유형의 플라스미드 분자들의 수이다. 이는 세포당 단일 복사체보다 더 많은 수로 숙주세포내에 존재하는 재조합 발현구조체의 특징을 설명하는 것으로 이해될 것이다. 대부분의 플라스미드들은 플라스미드/염색체 분자들의 비율을 설명하는 용어인 "다수 복제수", "낮은 복제수" 또는 "높은 복제수"로 분류된다.

"조절가능한 프로모터"라는 용어는, 세포내에서 핵산의 전사를 조정하는 DNA 서열들을 포함하는 의미이다. 조절가능한 프로모터들은, 폴리펩티드-암호화 핵산의 전사를 조정 또는 조절하는 핵산서열들로 이해될 수 있는 "cis-작용 전사조절요소들"에 작동적으로 연결된다는 점에서, 조절 불가능한 프로모터들과 구별이 된다. 여기에서 사용된 용어, "cis-작용 전사조절요소"는 특히 이하에서 정의된 바와 같이, 상기 조절가능한 프로모터를 "유도가능하게" 만드는 핵산서열들에 관한 것이다. 상기 cis-작용 전사조절요소들을 포함하는, 본 발명의 상기 조절가능한 프로모터들은, 폴리펩티드-암호화 핵산에 작동적으로 연결되어, 본 발명의 재조합 발현구조물이 도입된 세포내에서, 가장 바람직하게는 박테리아 세포내에서, 더욱 바람직하게는 E- coli 세포내에서 상기 핵산의 전사를 조절한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 조절가능한 프로모터들의 전사조절은, cis-작용 전사조절요소들과 본 발명의 재조합 발현구조체들에 의해 암호화된 trans-작용 전사요인 사이의 상호작용에 의해 달성된다. 박테리오파아지 람다 P_L 프로모터, lac 오페론의 프로모터들, trp 오페론, 및 ara 오페론 및 이들의 몇몇 유도체들과 같은 조절가능한 프로모터들이 유전자 발현을 조절하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 조절가능한 프로모터들의 다른 패밀리는 날리딕식산에 의해 유도되는, 합성 cpex 프로모터 시리즈들이다(본 명세서에 그 전체내용이 참고문헌으로 통합된 Bogosian 등, 미국특허 제6,617,130호에 설명).

"작동적으로 연결된"이라는 용어는, 연결 위치와 근접도가 커플링된 복제를 확실히 해주고, trans-작용 전사요인들과 다른 세포요인들에 의해 인식되기에 충분하고 적절하며, 그에 의해 폴리펩티드-암호화 핵산이 적절한 조건하에서 효율적으로 발현되게 하는, 핵산들 사이의 연결을 설명하기 위한 것이다.

여기에서 사용된 용어 "복제개시점" 또는 "ORI"는 플라스미드의 복제를 위해 필요한 뉴클레오티드들의 영역들을 포함하는 것을 의미한다. 복제개시점의 예들의 몇 가지는 pBR322의 뉴클레오티드 1766~3148; ColE1의 뉴클레오티드 1667-2892; 및 pACYC184의 뉴클레오티드 580~1407이다.

"혼성" 또는 "키메릭"이라는 용어들은, 둘 또는 그 이상의 플라스미드들로부터의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 어떤 플라스미드를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

여기에서 사용된 용어들 "혼성 복제개시점" 또는 "키메릭 복제개시점"은, 플라스미드의 복제를 허용하는 뉴클레오티드 영역을 만들기 위한 제2의 플라스미드 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열과 결합된 또는 연결된 제1의 플라스미드의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 의미한다. 혼성 복제개시점을 포함하는 플라스미드들의 몇 가지 예들은 pXT975 및 pXT976이다.

"제한효소"라는 용어는, 특정의 염기서열들에서 DNA 분자들을 내부적으로 절단하는, 박테리아에 의해 생산된 어떤 그룹의 효소들을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 제한효소들의 예로는 BspEI; Bg1II; NSiI; NotI; SacI; SpeI; 및 AlwNI를 들 수 있다.

"제한부위"라는 용어는, 제한효소에 의해 인식되는 DNA 분자 내의 염기들의 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

"다중클로닝부위들"이라는 용어는, 하나 이상의 제한부위를 포함하는 뉴클레오티드들의 영역을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 다중클로닝부위들을 포함하는 뉴클레오티드 서열들의 예로는 SEQ ID 14; SEQ ID 15; SEQ ID 19; 및 SEQ ID 20를 들 수 있다.

용어 "PCR 앰플리콘"은 폴리머라제 연쇄반응(PCR)의 증폭생성물들을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

폴리펩티드 발현에 관하여 본 발명의 목적을 이루기 위하여, "상승된" 또는 "상승된 발현" 또는 "과발현"이라는 용어들은, 본 발명의 적어도 하나의 재조합 발현구조체로 형질전환된 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 좀더 바람직하게는 E. Coli 세포내에서 생성된 폴리펩티드의 양이 자연적으로 또는 다른 재조합 발현구조체를 사용하는 것에 의해 생산된 폴리펩티드의 양보다 더 높거나, 더욱 바람직하게 훨씬 더 높은 양을 의미하는 것이다. 내생적으로 생성된 폴리펩티드에 대하여, 상기 용어는 내생적 발현수준과 비교하여 증가된 발현을 의미하는 것이다. 이종성 폴리펩티드에 대하여, 상기 용어는 종래의 재조합체 또는 유전공학적으로 관련된 발현벡터들, 시스템들 및 방법들과 연관된 상기 이종성 폴리펩티드들의 증가된 생산을 반영하는 것이다.

본 발명은, 박테리아 내에서 원하거나 또는 목표로 하는 폴리펩티드들의 과발현을 위하여, 박테리아 유전자 발현을 조절하기 위한 핵산들, 재조합 발현구조체, 박테리아세포들, 시약들 및 방법들을 제공한다.

적어도 두 개의 상이한 플라스미드들로부터의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 혼성 복제개시점들이 만들어질 수 있다. pBR322, pACYC184, p15A, MB1, 또는 ColE1로부터의 서열들은 조합되어 혼성 복제개시점을 만들 수 있다. 플라스미드들은 이동가능한 혼성 복제개시점을 포함하도록 변형될 수도 있다. 사용자의 필요에 따라서, 상이한 복제개시점의 상이한 영역들이 사용자의 필요에 적합하도록, 복제개시점의 특성들을 설계하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 몇 가지 구체예들의 경우, 하나의 복제개시점으로부터의 적어도 200개의 뉴클레오티드들, 더욱 바람직하게는 250개의 뉴클레오티드들이 상이한 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드들에 연결된다.

플라스미드들은 혼성 복제개시점을 포함할 수 있도록 또한 변형될 수 있다. 다중클로닝부위들(MCS)로서 공지된 다수의 특정한 제한부위에 인접하여 위치한 혼성 복제개시점이 만들어진다. 복제개시점의 각 측면상의 다중클로닝부위들로 인하여, 혼성 복제개시점은 쉽게 교환될 수 있거나 또는 이동가능할 수 있다. 이러한 변형된 플라스미드들은 플라스미드의 복제수를 조절하는 것이 가능하기 때문에, 원하거나 또는 목표로 하는 유전자 생성물들의 발현수준을 조절가능케 하는 유용한 클로닝 도구들을 제공할 것이다.

본 발명은 pBR322 플라스미드 변형에 의해 만들어진 다수의 변형된 플라스미드들을 포함한다. 이들 변형된 pBR322 플라스미드들 중의 하나인 pXT995 플라스미드는 다수의 특정한 제한부위들(다중클로닝부위 또는 MCS)에 인접하여 위치한 pBR322 상에 정상적으로 존재하는 표준 pMB1 복제개시점 영역을 가진다. 본 발명에 의한, 다른 변형된 pBR322 플라스미드인 pXT988은 ColE1개시점으로 치환된 pMB1 복제개시점을 갖는다. 또한 이는, MCS에 인접하여 위치한 개시점영역을 갖는다는 바람직한 특징을 갖는다. 본 발명의 pXT995와 pXT988 플라스미드들은, 복제개시점이 어떤 원하는 복제개시점으로나 쉽게 치환될 수 있게 한다. 이 플라스미드들은 또한 모(parent)pBR322 플라스미드의 바람직한 특징들을 보유한다.

pXT995와 pXT988 플라스미드들은, 숙주세포가 잘 견디지 못하는 유전자의 과발현을 위하여, 낮은 복제수가 바람직한 경우와 같이, 복제개시점을 교환시킴으로써 플라스미드 복제수를 변형시키는 것이 바람직한 경우에 유용할 것이다. 그러나 다른 환경들에서는, 과발현된 단백질을 정제할 때와 같이, 높은 복제수의 플라스미드를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 더욱이, 차별적으로 조절가능한 복제개시점을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 선택사항 또는 적용요건들 모두는, 본 발명의 변형된 플라스미드 pXT995 또는 pXT988을 사용하거나, 또는 본 발명의 개시내용들에 기초하여 다른 맞춤 플라스미드들을 제조함으로써 이루어질 수 있다.

다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 예시하기 위해 포함되어 있다. 당업자들은 다음의 실시예들에서 개시된 기술들이 본 발명의 실시가 잘 이루어지도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술들을 나타낸다는 사실을 알아야 할 것이고, 따라서 본 발명의 실시를 위한 바람직한 형태들을 구성하는 것으로 볼 수 있다. 그러나, 본 발명의 개시내용들을 비추어볼 때, 당업자는 개시된 특별한 구체예들에서 수많은 변화들이 이루어질 수 있고, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 비슷하거나 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 알아야 할 것이다.

실시예

배양절차. 박테리아는 Luria-Bertani(LB)배지, 또는 앰피실린(100㎍/㎖), 클로람페니콜(25㎍/㎖), 테트라사이클린(10㎍/㎖), 카나마이신(25㎍/㎖), 스트렙토마이신(25㎍/㎖) 또는 스펙티노마이신(25㎍/㎖)으로 적절히 영양보충된 LB 아가 내에서 통상적으로 배양되었다.

DNA 절차. 플라스미드 DNA는 알카라인 분해법(alkaline lysis method)을 사용하여 분리되었고, 필요에 따라 Qiaprep Spin Miniprep(Qiagen)을 사용하여 정제되었다. 폴리머라제 연쇄반응(PCR)은 Roche PCR 마스터킷트를 사용하여, Roche Gene Amp PCR system 2700으로 실시되었다. 주문 프라이머들은 InVitrogen에 의해 합성되었다. 제한소화는 각각의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 효소제조자들의 지침서에 따라서 실시되었다. DNA 단편들의 분리를 위하여, 단편들을 0.9%(wt/vol) 아가로즈 겔 상에서 분리시키고, Qiaquick Gel 추출킷트(Qiagen)를 사용해 분리했다. Roche T4 DNA 리가제가 DNA결찰을 위해 사용되었다. 플라스미드 형질전환은 InVitrogen ElectroMax DH5α Competent Cells을 사용하여, BioRad Micropulser 내에서 실시되었다. 뉴클레오티드 서열화를 위하여, ABI Prism 3730 XL DNA 서열화기(PE Biosystems)와 Big Dye 터미네이터 믹스를 사용하여 자동화 서열화가 수행되었다.

본 발명은 좌표 1766~3148로부터의 pBR322(pMB1)의 복제개시점 영역을 유전적으로 변형시키고, 특정한 제한부위들(예, 다중클로닝부위들, MCS)에 인접하여 위치한, 교환가능한 복제개시점 영역을 만드는 것을 포함한다.

본 발명의 변형된 pBR322 구조체들을 만들기 위해 "중첩확장에 의한 접합(SEO;Splicing by Overlap Extension)" 기술이 이용되었으나, 다른 적당한 방법들 또한 이용될 수 있다. 이들 SEO 방법들은 공지이고, 본 명세서에 그 전체내용이 참고문헌으로 통합된 Horton 등에 의한 Gene, 77:61-68(1989)에 개시되어 있다.

플라스미드 pBR322는 약 20~30의 복제수를 갖고, 이 수는 그것의 pMB1 복제개시점에 의해 부분적으로 결정되었다. 본 발명의 일면은, pBR322의 pMB1 복제개시점 영역을, 변형된 복제개시점 영역을 가지는 pXT975, pXT976, pXT1000, 및 pXT1001과 같은 수개의 혼성 플라스미드를 만드는 것을 포함하는 많은 다른 개시점 구조로 치환하는 것을 포함한다. 이들 플라스미드들은, pMB1 복제개시점 뉴클레오티드 서열과 ColE1 복제개시점 뉴클레오티드 서열을 포함하는 혼성 복제개시점을 포함한다.

ColE1은 플라스미드 복제개시점들에 관한 수많은 전통적인 실험들에 이용된 표준 플라스미드들 중의 하나이기 때문에, ColE1 복제개시점 영역으로 치환된 복제개시점 영역을 갖는 변형된 pBR322를 기초로 한 플라스미드의 구성은, 미래의 복제개시점 실험뿐 아니라, 클로닝과 발현구조체들을 위한 매우 유용한 도구를 제공한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 일면은, 전체 복제개시점이 ColE1으로부터의 상응하는 개시점으로 치환되고, 다중클로닝부위에 인접하여 위치하는 변형된 pBR322 구조체의 제조를 포함한다.

복제개시점이 MCS에 인접하여 위치할 때, 다른 원하는 복제개시점들로 쉽게 교환될 수 있는 복제개시점 영역이 생성된다. 이러한 유형의 변형된 구조체의 예로 플라스미드 pXT988을 포함한다. 플라스미드 pXT988은 MCS에 인접하여 위치하는 쉽게 치환가능한 개시점카세트를 갖기 때문에, 어떤 원하는 복제개시점을 갖는 어떤 원하는 pBR322 기초 플라스미드 구조체를 제조하기 위한 주형의 역할을 한다. 본 발명의 관련 플라스미드인 pXT995는, MCS에 인접하여 위치하고, 또한 더 낮은 복제수, 더 높은 복제수 또는 다른 원하는 특징과 같은 원하는 특징들을 갖는 복제개시점으로 치환되기 쉬운 미변형 pBR322(pMB1) 복제개시점을 갖는다.

이들 다양한 플라스미드 변형체들의 디자인에 있어서, pBR322상의 pMB1 복제개시점 영역은, ColE1 복제개시점 영역의 양을 변화시킴으로써 단계적으로 치환되었다. pBR322 상의 특정한 제한부위들을 보여주는 지도는 도 1에 도시되어 있다. 두 개의 MCS들, SEQ ID NO:30 AGATCTATGCATGCGGCCGC를 갖는 Bg1II-NsiI-NotI 단편 ; 및 SEQ ID NO:31 GAGCTCACTAGTAGATCT을 갖는 SacI-SpeI-Bg1II 단편이 몇몇 원하는 변형된 플라스미드들을 구성하기 위해 사용되었다.

최초의 중첩확장에 의한 접합(SEO) 조작은 1766~3148 복제개시점 영역의 외부에 위치한 pBR322상의 2개의 존재하는 특정한 제한부위들을 사용한다. 플라스미드 조작의 이 단계에서, 이들 부위들이 복제개시점 영역의 외부에 어느정도 거리를 두고 있다는 것은 문제가 되지 않았다. 사용된 제한부위들은 좌표 1667에서 BspEI, 좌표 3430에서 BsaI였다. 세번째 부위인 좌표 2892에서의 복제개시점 영역내의 특정한 AlwNI 부위는 SOE 작업을 촉진시키기 위해 사용되었다. 이 AlwNI 부위는 ColE1 복제개시점 내의 동일한 상대 위치에 또한 존재한다.

실시예 1. pXT975 의 구성

프라이머들은, 도 2에서 도시된 바와 같이, PCR에 의해서 복제개시점 영역내의 좌표 약 3149로부터, 좌표 3430에서의 BsaI 부위를 거쳐 좌표 약 3500에 이르는 pBR322 상의 영역을 증폭시키기 위해 사용되었다. pBR322의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO :1에 설명되어 있다. 여기에서 주어진 뉴클레오티드 서열은 유전자 은행에서 발견된 것과는 상이하고, 본 발명자들에 의한 최근의 플라스미드 pBR322의 뉴클레오티드 서열화는 유전자은행 뉴클레오티드 서열과 차이가 있다는 점을 보여주었으며, 본 발명자들은 여기에서 주어진 뉴클레오티드 서열이 pBR322의 정확한 뉴클레오티드 서열일 것으로 믿는다.

다음의 프라이머들은 이들 초기의 증폭단계들을 위해 이용되었다;

SEQ ID NO :2: 5'-GCTCGGCCCTTCCGGCTGGC-3',

SEQ ID NO :3:

5'-TTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTAATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGG

AACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTC-3'

좌표 3149(SEQ ID NO:3)에서의 영역을 위한 프라이머는 ColE1 복제개시점의 상응하는 영역에 매치(match)되는 긴 꼬리를 포함하였다.

결과로 얻은 399 염기쌍 PCR 단편은, AlwNI 부위(SEQ ID NO :5, 5'- CCTTCTAGTGTAGCCGTAGTCGGGCC-3')의 바로 상류의 플라스미드 ColE1 복제개시점에 매치되는 제2의 규칙적인 프라이머와 함께, ColE1 플라스미드 DNA로부터의 PCR 단편을 만들기 위해, 하기의 399 염기쌍 프라이머(SEQ ID NO:4)의 공급원으로 사용되었다:

플라스미드 ColE1의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO :6에 개시점되어 있다. 여기에서 주어진 뉴클레오티드 서열은 유전자 은행에서 발견된 것과는 상이하고, 본 발명자들에 의한 최근의 플라스미드 ColE1의 뉴클레오티드 서열화는 유전자은행 뉴클레오티드 서열과 차이가 있다는 점을 보여주었으며, 본 발명자들은 여기에서 주어진 뉴클레오티드 서열이 ColE1의 정확한 뉴클레오티드 서열일 것으로 믿는다. 결과로 얻은 PCR 단편은 제한 엔도뉴클레아제 AlwNI와 BsaI로 소화되고, 얻어진 단편은 pBR322 내로 삽입되어 플라스미드 pXT975를 만들었으며, 이는 ColE1 복제개시점의 상응하는 영역으로 치환된, 좌표 2892에서의 AlwNI 부위로부터 좌표 3148에서의 pBR322 복제개시점 영역의 말단에 이르는 영역을 갖는다. pXT975의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO :7에 설명되어 있다.

실시예 2. pXT976 의 구성

도 3에 도시된 바와 같이, 프라이머들은, PCR에 의해 좌표 1667에서의 BspEl 부위 바로 전부터 좌표 1776에 이르는 pBR322상의 영역을 증폭시키기 위해 사용되었다. 다음의 프라이머들은 이들 초기의 증폭단계들을 위해 이용되었다:

(SEQ ID NO :8 5'-GCGACCTGAGCAACAACATGAATGG-3')

(SEQ ID NO :9

5'-TTACTTGAACGCTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCA

GGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATG-3')

좌표 1765(SEQ ID NO:9)에서의 영역을 위한 프라이머는 ColE1 복제개시점의 상응하는 영역에 매치되는 긴 꼬리를 포함했다.

결과로 얻은 236 염기쌍 PCR 단편은, AlwNI 부위(SEQ ID NO :11 5'-GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGG-3') 바로 다음의 ColE1 복제개시점에 매치되는 제2의 규칙적인 프라이머와 함께, ColE1 플라스미드 DNA로부터의 PCR 단편을 만들기 위해,하기의 236 염기쌍 프라이머(SEQ ID NO :10)의 공급원으로서 사용되었다.

결과로 얻은 PCR 단편은 BspEI와 AlwNI로 소화되었고, 도 3c에 도시된 바와 같이 pBR322 내로 삽입되었다. 그 결과, ColE1 복제개시점으로부터의 상응하는 영역에 의해 치환된, 좌표 1766에서의 pBR322 복제개시점의 말단으로부터 좌표 2892에서의 AlwNI 부위에 이르는 영역을 갖는 플라스미드 pXT976이 수득되었다. pXT976에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO :12에 개시되어 있다.

실시예 3. pXT977 의 구성

pXT975와 pXT976의 구성에 대해 위에서 설명된 최종의 두 개의 PCR 단편들을 AlwNI로 절단하고, 함께 결찰한 다음에, BspEI과 BsaI 부위들 외부의 꼬리 영역들 에 매치되는 PCR 프라이머들(위에서 개시된 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:8)로 증폭시켰다.

결과로 얻은 PCR 단편을 BspEl와 BsaI로 소화하고, pBR322 내로 삽입했다. 그 결과, ColE1 복제개시점으로부터의 상응하는 영역으로 치환된, 좌표 1766으로부터 3148에 이르는 pBR322 복제개시점 영역을 갖는 플라스미드 pXT977이 수득되었다. pXT977의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO :13으로 나타내어진다.

실시예 4. pBR322 , pXT975 , pXT976 및 pXT977 의 복제개시점 영역의 비교지도들

실시예 1~3에서 설명된 3개의 플라스미드들의 구성에 의해, 도 4에서 도시된 바와 같은 다음의 동종의(하나의 공급원) 또는 혼성/키메릭 복제개시점 영역들을 포함하는, pBR322를 기초로 한 변형된 플라스미드들이 수득되었다:

pBR322 : pMB1유래의 1766~3148으로부터의 복제개시점 영역(동종 복제개시점);

pXT975 : pMB1유래의 좌표 1766으로부터 AlwNI에 이르는 복제개시점 영역과, ColE1유래의 AlwNI로부터 3148에 이르는 복제개시점 영역(혼성 복제개시점);

pXT976 : ColE1유래의 1766으로부터 AlwNI에 이르는 복제개시점 영역과, pMB1유래의 AlwNI으로부터 3148에 이르는 복제개시점 영역(혼성 복제개시점);

pXT977 : ColE1유래의 1766~3148의 복제개시점영역(동종 복제개시점).

실시예 5. pBR322 , 및 변형된 pBR322 -기초 플라스미드들인 pXT975 , pXT976 , 및 pXT977 의 실험적으로 결정된 플라스미드 복제수

플라스미드 pBR322, pXT975, pXT976, 및 pXT977의 복제수는 fhuA 유전자를 불활성화하는 돌연변이를 가진 표준 야생형 E. Coli K-12 균주 W3110인 균주 LBB427에서 결정되었다. 복제수 측정은 L-브로스+앰피실린(100㎍/㎖) 중에서 성장된 두 셋트의 진탕 플라스크 배양물 상에서 이루어졌다. 각각의 복제수 측정시점에서, 배양물 시료를 희석하고, 배양물 1mml당 플라스미드-포함 세포의 수를 얻기 위하여 앰피실린(100㎍/㎖)을 포함하는 L-브로스 아가플레이트 위에 평판 배양했다. 이와 같은 배양물 시료로부터, 플라스미드 DNA를 분리 및 정량했다. 플라스미드 DNA 정량화는, 단하나의 부위에서 플라스미드 분자를 절단하는 제한효소에 의한 플라스미드의 선형화, 상기 선형화된 플라스미드 DNA를 폴리아크릴아마이드 겔에 통과시킴, 에티디움 브로마이드로 상기 겔을 염색시킴, 및 착색된 플라스미드 DNA 밴드에 대한 주사밀도측정(scanning densitometry)을 실시하는 것에 의해 수행되었다. 결과로 얻은 밀도스캔 수치는 배양물 ㎖당 플라스미드 DNA의 양을 결정하기 위한 공지량의 플라스미드 DNA 표준으로부터 얻어진 밀도스캔 수치와 비교되었다. 이 양은 배양물 ㎖당 플라스미드 DNA의 분자들로 전환되었고, 그 다음 세포당 플라스미드 DNA 분자로 표시되는 플라스미드 복제수를 얻기 위해 배양물 ㎖당 세포들의 수로 나누었다. 표 1은 이 실험의 결과들을 보여주고; 각각의 시점에서, 두 개의 플라스미드 복제수들이 주어지고, 이는 평가된 이중의 배양물들로부터의 결과들을 보여준다.

표 1. 앰피실린과 테트라사이클린이 혼합된 L- 브로스 배지를 포함한 진탕 플 라스크내에서의 성장기간동안의 플라스미드 복제수 .

상기 결과들은, pMB1 개시점을 갖는 pBR322의 플라스미드 복제수와 비교시(또한 완전한 pMB1 개시점을 갖는 pXT976에 비교시), 좌표 2892(AlwNI 부위)로부터 위치 3148에 이르는 복제개시점 영역이 (플라스미드 pXT975와 pXT977에서와 같이) ColE1으로부터의 상응하는 영역으로 치환될 경우, 플라스미드 복제수는감소된다는 것을 나타낸다. 이 결과들은, 두 가지 범위의 플라스미드 복제수를 지닌 새로운 플라스미드 벡터들 즉, 약 10의 플라스미드 복제수를 지닌 플라스미드 pXT975와 pXT977 및 약 20의 플라스미드 복제수를 지닌 플라스미드 pXT976을 제공하는 본 발명의 유용성을 예증해 준다.

실시예 6. 치환가능한 복제개시점 영역을 만드는 다중클로닝부위 에 인접하여 위치한 ColE1 복제개시점 영역을 포함하는 변형된 pBR322 플라스미드인 pXT988 의 구성

다중클로닝부위에 인접하여 위치한 복제개시점 영역을 가진 플라스미드를 구성하기 위해, 실시예 1~4에서 설명된 긴 ColE1 꼬리를 포함하는 개시점 프라이머를 사용하는 SOE 구성법이 반복되었고, 다만 프라이머들은 도 5에서 나타낸 바와 같이 pBR322와 ColE1 뉴클레오티드 서열 간의 접속부에 다중클로닝부위를 포함하도록 약간 변경되었다. 프라이머(SEQ ID NO :14):

5'-GCTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGGCGGCCGCATGCATAGATCTACCAGAGAA

AAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTT-3'는 프라이머 SEQ ID NO:9로 치환되었고,

프라이머 (SEQ ID NO :15):

5'-AGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTAATCTTTTCTACGAGCTCACTAGTAGATCTGGGGTCTGACGCTC

AGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGA-3'는 프라이머 SEQ ID:3으로 치환되었다. 프라이머 SEQ ID NO:14상에 포함된 다중클로닝부위의 뉴클레오티드 서열은 제한 엔도뉴클레아제 Bg1II(AGATCT), NsiI(ATGCAT) 및 NotI(GCGGCCGC) 인식부위를 포함하였다. 프라이머 SEQ ID NO:15상에 포함된 다중클로닝부위의 뉴클레오티드 서열은 제한 엔도뉴클레아제 SacI(GAGCTC), SpeI(ACTAGT) 및 Bg1II(AGATCT) 인식부위를 포함하였다.

다중클로닝부위(MCS)를 가진 BsaI-AlwNI 단편의 제조는 도 5a와 5b에 설명되어 있다. 409 염기쌍 PCR 단편을 만드는데 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:15 프라이머들이 사용되었다. 이 PCR 단편은, ColE1 플라스미드 DNA로부터 PCR 단편을 생성하기 위해, AlwNI 부위의 바로 상류의 ColE1 복제개시점에 매치되는 제2의 규칙적인 프라이머(SEQ ID NO:5)와 함께, 하기의 409염기쌍 프라이머(SEQ ID NO:16)의 공급원으로 이용되었다:

다중클로닝부위를 갖는 AlwNI-BspEI 단편의 제조는 도 5c와 5d에 설명되어 있다. 246 염기쌍 PCR 단편을 만드는데 SEQ ID NO:8과 SEQ ID NO:14 프라이머들이 사용되었다. 이 PCR단편은, ColE1 플라스미드 DNA로부터 PCR 단편을 생성하기 위해, AlwNI 부위(SEQ ID NO:11)의 바로 다음의 ColE1 복제개시점에 매치되는 제2의 규칙적인 프라이머와 함께, 246 염기쌍 프라이머(SEQ ID NO:17)의 공급원으로 이용되었다

상술한 바와 같이 제조된 최종의 2개의 PCR 단편들은 A1wE1 부위로 절단되었고, 함께 결찰된 후, BspEI과 BsaI 부위들(SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:8) 외부의 꼬리 영역들에 매치되는 PCR 프라이머들로 증폭되었다. 결과로 얻은 PCR 단편은 BspEI와 BsaI로 소화되었고, pBR322내로 삽입되었다.

도 5e에 도시된 바와 같은, 결과로 얻어진 플라스미드는 pXT988이고, 이는 ColE1 복제개시점으로부터의 상응하는 영역으로 치환된 좌표 1766으로부터 3148에 이르는 pBR322(pMB1) 복제개시점 영역을 갖고, 또한 다중클로닝부위에 인접하여 위치하여 치환가능한 ColE1 복제개시점 영역을 만드는 ColE1 복제개시점 영역을 갖는다. 또한 두 개의 다중클로닝부위들에서의 제한부위들은 도 5e에 나타나 있다. pXT988의 뉴클레오티드서열은 SEQ ID NO:18에 나타나 있다.

실시예 7. 다중클로닝부위들에 인접하여 위치한 pMB1 복제개시점 영역을 갖는 변형된 pBR322 플라스미드인 pXT995 의 구성

ColE1 복제개시점 영역으로 치환되고, 다중클로닝부위들에 인접하여 위치한 pMB1 복제개시점 영역을 갖는 변형된 pBR322-기초 플라스미드인 pXT988의 구성은, 이 복제개시점을 어떤 원하는 치환의 복제개시점으로 신속하고 용이하게 치환하기 위해 제공된다. pXT988은 ColE1 복제개시점 영역을 가지므로, 이 새로운 도구의 유용성을 입증하는데 있어서 분명한 첫번째의 선택은 ColE1 복제개시점 영역을 pBR322(pMB1) 복제개시점 영역으로 치환하는 것이었다.

pMB1 복제개시점 영역을 ColE1 복제개시점 영역으로 교환하는 첫번째 단계는, pBR322의 pMB1 복제개시점 영역을 증폭시키기 위해, 다중클로닝부위들이 위치한 바로 그 내부에 위치한 프라이머들을 사용하는 것이었다. 프라이머들은 같은 다중클로닝부위들을 가진 꼬리를 포함했고, 이는 SEQ ID NO :19

5‘-AGGAAGATCTATGCATGCGGCCGCCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTG-3' 및 SEQ ID NO:20 5'-AGGAAGATCTACTAGTGAGCTCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTG-3'에 나타낸 바와 같다.

프라이머 SEQ ID NO:19 상에 포함된 다중클로닝부위의 뉴클레오티드 서열은 제한 엔도뉴클레아제 Bg1II(AGATCT), NsiI(ATGCAT) 및 NotI(GCGGCCGC)에 대한 제한부위들을 포함하였다. 프라이머 SEQ ID NO:20 상에 포함된 다중클로닝부위의 뉴클레오티드 서열은 제한 엔도뉴클레아제 SacI(GAGCTC), SpeI(ACTAGT) 및 Bg1II(AGATCT)에 대한 제한부위들을 포함하였다.

결과로 얻어진 PCR 단편은 NotI와 SpeI으로 소화되었고, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pXT995를 얻기 위하여 pXT988상의 ColE1 복제개시점 영역을 치환하는데 이용되었다. 플라스미드 pXT995는 pMB1 개시점 카세트를 생성하는, pBR322(pMB1) 복제개시점 영역과 다중클로닝부위들을 가지고 있다. 플라스미드 pXT995의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:21에 나타나있다.

실시예 8. 다중클로닝부위에 인접하여 위치한 혼성 복제개시점 을 갖는 변형된 pBR322 플라스미드인 pXT1000 의 구성

플라스미드 pXT1000은 pXT996으로부터의 AlwNI-SpeI 단편(이 단편은 AlwNI 부위로부터 다중클로닝부위까지의 pBR322의 복제개시점 영역을 운반한다)을 pXT988에 삽입함으로써 구성된다. 이는, ColE1 ORI 유래의 다중클로닝부위로부터 AlwNI 부위까지의 복제개시점의 영역, 및 pMB1 ORI 유래의 AlwNI 부위로부터 다중클로닝부위까지의 복제개시점의 영역을 가진, 복합 또는 혼성 복제개시점을 지닌 플라스미드를 생성한다. 결과로 얻은 플라스미드는 도 6c에 나타나있다. 플라스미드 pXT1000의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:22에 나타나 있다.

실시예 9. 다중클로닝부위에 인접하여 위치한 복합 복제개시점 ; AlwNI 로부터 다중클로닝부위에 이르는 ColE1 을 가진 pXT1001 의 구성

플라스미드 pXT1001은 pXT996으로부터의 NsiI-AlwNI 단편(이 단편은 다중클로닝부위로부터 AlwNI 부위에 이르는 pMB1 복제개시점 영역이다)을 pXT988에 삽입함으로써 구성된다. 이는, pMB1 ORI유래의 다중클로닝부위로부터 AlwNI 부위까지의 복제개시점의 영역 및, ColE1 ORI유래의 AlwNI로부터 다중클로닝부위까지의 복제개시점의 영역을 가진, 복합 또는 혼성 복제개시점을 지닌 플라스미드를 생성한다. 혼성 플라스미드 pXT1001은 도 6b에 나타나있고, pXT988은 도 6d에 나타나있다. 플라스미드 pXT1001의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:23에 나타나 있다.

위에서 설명된 pXT995, pXT1001, pXT1000 및 pXT988 플라스미드들의 구성은, 모두 다중클로닝부위에 인접하여 위치한, 다음의 동질성 또는 혼성/복합 복제개시점을 포함하는 플라스미드를 생성하였다:

pXT995: 다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322로부터의 1766~3148 복제 개시점영역(동종 복제개시점);

pXT1001: 다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322 유래의 1766으로부터 AlwNI까지의 복제개시점 영역 및 ColE1유래의 AlwNI로부터 3148에 이르는 복제개시점 영역(혼성/키메릭 복제개시점);

pXT1000: 다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1 유래의 1766으로부터 AlwNI에 이르는 복제개시점 영역 및 pBR322 유래의 AlwNI로부터 3148에 이르는 복제개시점 영역(혼성/키메릭 복제개시점);

pXT988 : 다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1 유래의 1766~3148의 복제개시점 영역(동종 복제개시점).

하기 표3은 새로운 복제개시점들을 갖는 플라스미드 구조체들을 상세히 설명한다.

표 3

신규의 복제개시점을 갖는 플라스미드구조체들

클로닝벡터	복제개시점(ORI)	플라스미드 SEQ ID No.
pBR322	pBR322(pMB1)에서 취한 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	1
pXT995	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322(pMB1)에서 취한 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	21
pXT975	pBR322에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 ColE1에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	7
pXT1001	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 ColE1에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	23
pXT976	ColE1에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 pBR322에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	12
pXT1000	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI)과 pBR322에서 취한 다른영역(AlwNI~3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	22
pXT977	ColE1로부터의 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	13
pXT988	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1로부터의 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	18
pXT1092	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322(pMB1)에서 취한 전환된 복제개시점 영역(위치 1766~3148) (SEQ ID NO.1과 비교할때 위치 1766~3148이 전환된다)	33
pXT1091	pXT995내로 삽입된 pACYC184 복제개시점 영역 (pXT1094의 BstZ17I-SacI 제한단편)	28
pXT1094	pXT995의 다중클로닝부위로 삽입된 pACYC184 복제개시점 영역 (위치 517~1464)	27
pXT1109	pBR322 rop 유전자서열을 갖는 pACYC184 복제개시점 영역	34

실시예 10. 인접한 다중클로닝부위를 포함하거나 포함하지 않는, 동종 pMB1 또는 혼성 pMB1 / ColE1 복제개시점 영역을 지닌 플라스미드들의 플라스미드 복제수들

복제수들은, fhuA 유전자를 불활성화하는 돌연변이를 갖는 표준의 야생형 E. Coli K-12 균주 W3110인 균주 LBB427에서 결정되었다. 복제수 측정은 L-브로스+앰피실린(100㎍/㎖) 내에서 성장된 두 셋트의 진탕 플래스크 배양물에 대해 이루어졌다. 복제수 측정은 상술한 바에 따라 이루어졌다. 하기 표4는 이 실험의 결과들을 보여준다; 각각의 시점에서, 두 가지의 플라스미드 복제수들이 주어지는데, 이는 평가된 이중 배양물들로부터의 결과들을 보여준다.

표 4 L- 브로스배지 + 앰피실린을 포함한 진탕 플라스크내에서 중간단계 성장기 동안의 플라스미드 복제수

이 실험들로부터 얻어진 결과들은, 변형된 pBR322 플라스미드들 내에 교환가능한 복제개시점 카세트를 만드는 것은(즉, 복제개시점 영역이 다중클로닝부위에 인접하여 위치함) 다중클로닝부위가 결핍된 플라스미드들과 비교했을 때, 플라스미드들의 복제수들을 바꾸지 못한다는 사실을 보여준다. 또한, 이전에 관찰된 경향이 또다시 관찰되었다: AlwNI로부터 3148에 이르는 복제개시점 영역이(플라스미드 pXT975, pXT1001, pXT977 및 pXT888에서와 같이) ColE1으로부터 유래하는 경우, 동일한 복제개시점 영역이(플라스미드 pBR322, pXT995, pXT976 및 pXT1000에서와 같이) pBR322로부터 유래되는 경우에 비하여 감소된다. 이 결과들은, 두 가지 범위의 플라스미드 복제수를 지닌 새로운 플라스미드 벡터들, 즉, 약 10의 플라스미드 복제수를 지닌 pXT975, pXT977, pXT988 및 pXT1001 플라스미드들과 약 20의 플라스미드 복제수를 지닌 pXT976, pXT995 및 pXT1000 플라스미드들을 제공하는 본 발명의 유용성을 예증한다.

실시예 11. 동종 pMB1 , ColE1 또는 혼성 pMB1 / ColE1 복제개시점중 하나를 갖는 소 소마토트로핀 ( bST ) 발현 플라스미드들의 구성

소 소마토트로핀(bST)은 모든 가축의 뇌하수체 내에서 생성되는 천연단백질이고, 이는 성우의 우유생산을 돕는다. bST 단백질 발현을 위해 필요한 유전적 요소들을 포함하는 몇 개의 플라스미드들은 이미 공지되어 있다. 하나의 이러한 플라스미드인 pXT757(pXT709와 동일, Bogosian 등, 미국특허 제6,828,124호에 개시되어 있다)로부터의 bST 발현영역을 변형된 pBR322 기초 플라스미드들: pXT975, pXT976, pXT977, pXT988, pXT995, pXT1000 및 pXT1001 각각의 내부로 이동시켰다. 플라스미드 pXT757은 합성 소 소마토트로핀(bst) 유전자의 발현을 유발하는 합성 cpex-20 프로모터(본 명세서에 그 전체내용이 참고문헌으로 통합된 Bogosian 등의 미국특허 제6,617,130호에 개시)를 포함한다. 상기 cpex-20 프로모터는 E. Coli SOS 레귤론(regulon)의 LexA 억제단백질에 의해 조절될 수 있도록 디자인되었고, 이는 날리딕식산의 첨가에 의해 유도될 수 있다. pXT757의 EcoRI-BamHI 단편(pXT757로부터의 완전한 bST 발현영역을 포함)은 pXT975, pXT976 및 pXT977 플라스미드들의 각각의 내부로 삽입되었다. 유사한 pXT757의 EcoRI-Sa1I 단편은 pXT988, pXT995, pXT1000 및 pXT1001 플라스미드들의 각각의 내부로 삽입되었다. 이러한 구성에 의해 아래의 표 5에 설명된 bST 발현 플라스미드들이 생성되었다.

표 5 bST 발현 플라스미드들

Bst 발현벡터	클로닝벡터	복제개시점(ORI)
pXT757	pBR322	pBR322(pMB1)에서 취한 복제개시점 영역(위치 1766~3148)
pXT996	pXT995	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322(pMB1)에서 취한 복제개시점 영역(위치 1766~3148)
pXT985	pXT975	pBR322에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 ColE1에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역
pXT1003	pXT1001	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 ColE1에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역
pXT986	pXT976	ColE1에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 pBR322에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역
pXT1002	pXT1000	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI)과 pBR322에서 취한 다른영역(AlwNI~3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역
pXT987	pXT977	ColE1로부터의 복제개시점 영역(위치 1766~3148)
pXT1004	pXT988	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1로부터의 복제개시점 영역(위치 1766~3148)

실시예 12. 동종 pMB1 , ColE1 , 또는 혼성 pMB1 / ColE1 복제개시점들 중의 하나를 포함하는 변형된 pBR322 -기초 플라스미드들로부터의 소 소마토트로핀(bST)의 발현

숙주균주 LBB427이 단백질 bST의 발현수준에 관한 혼성 ORI의 효과를 결정하기 위한 실험들에 사용되었다. bST 단백질 발현의 수준은 화학적으로 규정된 무기염들과 포도당 최소배지(어떤 항생제들도 포함되지 않은)를 포함하는 발효기 내에서 배양되는 동안 측정되었고, 이 때 bST 합성은 660nm에서의 흡광도 23에서 날리딕식산 50ppm의 첨가에 의해 유도되었다. bST 발현의 수준은 ℓ당 bST 1㎎의 검출한계에서 HPLC 분석에 의해 측정되었다. 발효 성장조건들과 HPLC 분석법은 Bogosian 등(1989)의 논문에 설명되어 있고; 상기 논문에 설명된 바와 같이 발효기는 어떤 항생제도 함유되지 않은 최소배지를 포함했다.

이들 실험들로부터, 플라스미드 복제개시점이 AlwNI 부위로부터 좌표 3148에서의 복제개시점 영역의 말단에 이르는 ColE1-유도 복제개시점 뉴클레오티드 서열을 포함할 경우, bST 발현이 완전히 소멸되었다는 것은 예상밖의 발견이었다. 복제개시점에서의 미묘한 변화들이, 플라스미드 벡터 상의 어떤 다른 곳에서의 유전자들의 발현에 그러한 상당한 영향을 미친다는 것은 예상하지 못한 것이었다. 이와 같은 발견은, 이종 유전자 발현에 대한 이러한 조작들의 효과를 테스트하기 위한 플라스미드 복제개시점들의 용이한 조작을 가능케 하는 본 발명의 유용성을 한층 더 예증한다.

표 6

bST 유전자를 포함하는 플라스미드로부터의 bST 단백질 발현의 정량화

플라스미드	ORI	bST 발현 (mg/l)
pXT757	pBR322에서 취한 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	6400
pXT996	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322에서 취한 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	5700
pXT985	pBR322에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 ColE1에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	발현이 검출되지 않았음
pXT1003	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, pBR322에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 ColE1에서 취한 다른영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	발현이 검출되지 않았음
pXT986	ColE1에서 취한 일부영역(위치 1766~AlwNI제한부위)과 pBR322에서 취한 다른 영역(AlwNI제한부위~위치 3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	6200
pXT1002	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1으로부터의 일부영역(위치 1766~AlwNI)과 pBR322로부터의 다른영역(AlwNI~3148)을 갖는 혼성 복제개시점 영역	6200
pXT987	ColE1로부터의 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	발현이 검출되지 않았음
pXT1004	다중클로닝부위에 인접하여 위치한, ColE1로부터의 복제개시점 영역(위치 1766~3148)	발현이 검출되지 않았음

실시예13 : 인접한 다중클로닝부위 영역을 갖는 pBR322 복제개시점 영역을 전환시키기 위한 주형으로서 pXT995 를 사용하는, pXT1092 의 구성

플라스미드 pXT995는 BglII-NsiI-NotI, 복제개시점, SacI-Spel-BglII로 설명된 바와 같은, 복제개시점의 위치에 인접한 다중클로닝부위 카세트를 갖는 변형된 pBR322이다. pXT995의 복제개시점 영역의 전환 또는 뒤집기(flipping)는, BglII로 소화한 후, 이어서 재-결찰에 의해 이루어졌다. 재-결찰 실험들의 결과로서, 8개의 형질전환체들이 얻어졌고, 3개는 전환된 복제개시점 영역을 포함했다. 이들 형질전환체들 중의 하나는 pXT1092(SEQ ID NO :33)로 지칭되었고, 도 7에 나타나있다.

플라스미드 pXT996은 BglII-Nsil-NotI, 복제개시점, SacI-Spel-BglII로 설명된 바와 같은, 다중클로닝부위에 인접하여 위치한 pBR322 복제개시점을 갖는 변형된 pXT757이다. 흥미롭게도, BglII로 소화한 후, 이어서 재-결찰에 의하여 전환 또는 뒤집어진 복제개시점 영역을 갖는 pXT996의 bST 발현을 평가하기 위한 수많은 시도들은 모두 실패했다.

이 결과들은, 복제개시점 영역의 뒤집기 또는 전환이 bST 발현요소들을 포함하는 pXT996과 유사한 플라스미드 내에서는 실행될 수 없다는 것을 암시했다. 따라서, bST 발현요소들을 포함하는 플라스미드들의 경우, 복제개시점 영역은 비변형된 pBR322 플라스미드 상에서 발견되는 한 방향으로만 견뎌낼 수 있는 것으로 여겨진다. 이 역시 예측하지 못한 발견이었고, 이는 구조체의 조작 및 플라스미드에서 유래한 이종 유전자들의 발현을 증진시키기 위한 플라스미드 복제개시점의 배향과 관련한 본 발명의 유용성을 더 예증한다.

실시예 14. pACYC184 로부터의 복제개시점 영역을 가진 플라스미드들의 구성

플라스미드 pACYC184는 플라스미드 P15A로부터 유래되었다(Chang과 Cohen, 1978). 플라스미드 pACYC184의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:24에 주어진 바와 같다. P15A의 복제수는 약 15인 것으로 보고되었고(Cozzarelli 등, 1968), pACYC184의 복제수는 약 18(Chang과 Cohen, 1978), 또는 약 30(Ray Skurray 등, 1984), 또는 약 9(Atlung 등, 1999)의 범위로 다양하게 보고되었다. 4245 염기쌍 플라스미드인 pACYC184는 pMB1-연관 또는 ColE1-연관 플라스미드들과 조화되고, 따라서 동일한 세포 내에서 pMB1-유도체 또는 ColE1-유도체와 함께 사용가능하다. pACYC184는 (1) 플라스미드의 복제에 관련되는 레플리콘(rep)(이 복제개시점은 플라스미드 p15A로부터 유래된다), (2) 테트라사이클린 내성단백질을 암호화하는 tetR 유전자, 및 (3) 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하고, 따라서 클로람페니콜에 대해 내성을 제공하는 cat 유전자를 포함한다.

rop 유전자는 rop 유전자가 없는 플라스미드들과 비교할 때, 플라스미드 복제수를 더 낮추는 역할을 하는 단백질을 암호화한다. 따라서, rop 유전자가 높은 복제수 플라스미드의 ORI에 첨가될 수 있다면, 세포 내에서 플라스미드의 복제수를 변경시킬 수 있다. 플라스미드 pACYC184는 rop 유전자가 없다.

도 8은 단일 BstZ17I 제한부위를 포함하는 pACYC184 복제개시점의 선형지도를 보여준다. 도 9에서 나타낸 바와 같이, pACYC184의 뉴클레오티드 서열(뉴클레오티드들 568~1407)은 pBR322상의 복제개시점 영역(뉴클레오티드들 2222~3139)에 대해 광범위한 상동성을 지닌 복제개시점 영역을 나타낸다. pBR322 상에서 rop 유전자는, pBR322 상의 좌표 2249 및 pACYC184 상의 좌표 596에 위치하는, BstZ17I 부위의 바로 반시계방향에 위치한다. 이들 두 가지의 복제개시점점 영역들간의 상동성 영역은 이 BstZ17I 부위 바로 전에서 시작된다.

A. 다중클로닝부위에 인접하여 위치한 pACYC184 복제개시점을 갖는 pXT1094 의 구성

좌표 517로부터 1464에 이르는(SEQ ID 24) pACYC184 복제개시점은 948염기쌍 NotI-SacI PCR 단편으로 증폭되었고, pXT995의 다중클로닝부위내로 삽입되었다. 이로써 bla와 tetR 유전자들의 pBR322 골격을 지닌 플라스미드인 pXT1094(SEQ ID NO:27)가 생성되었으며, 여기서 pBR322 복제개시점은 pACYC184 복제개시점(플라스미드 p15A 복제개시점)으로 치환되었고, 다중클로닝부위에 인접하여 위치하였다.

상류 프라이머(SEQ ID NO :25)

5'-GGCTCAGCAGCGGCCGCGCTGTCCCTCCTGTTCAGCTATTGACGGGG-3'은, pBR322와 pACYC184 복제개시점 영역간의 상동성 영역 이외의 다중클로닝부위 근처의 영역 내에서, CAG-CTA-CTG를 CAG-CTA-TTG로 부위를 변화시킴으로써 거기에서 AlwNI 부위를 제거하는, 단일의 뉴클레오티드 변화를 포함한다.

하류 프라이머(SEQ ID NO :26)

5'-GGCTCTGACGAGCTCGGTGCTACATTTGAAGAGATAAATTGCACTGAAATCTAGG-3'은, 바로 그 다중클로닝부위 근처의 상응하는 영역 내에서, TCTAGA를 CCTAGA로 부위를 변화시킴으로써 거기에서 XbaI 부위를 제거하는, 단일의 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 플라스미드 pXT1094의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO :27에 주어진 바와 같다.

B. 다중클로닝부위에 인접하여 위치하고, pACYC184 복제개시점과 pBR322 rop 유전자를 갖는 복합 플라스미드인 pXT1091 의 구성

pACYC184 복제개시점은 pXT1094로부터의 BstZ17I-Sac1 제한단편으로서 절단되고, pXT995내로 삽입되어, pXT1091을 생성하였다. pXT1091의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:28에 주어진 바와 같다. pBR322 상에서, BstZ17I 부위는 rop 유전자와 복제개시점 영역 사이에 위치함을 주목해야만 한다. pACYC184 상에서, BstZ17I 부위는 복제개시점 영역에 대해 동일한 상대적 위치 내에 놓이고, 이 경우에는 2개의 복제개시점 영역 간의 상동성 영역의 첫 머리에 위치한다(도 9의 정렬에 도시된 바와 같고, pACYC184 복제개시점은 도 8에 도시되어있다). 미변형 pACYC184는 rop 유전자를 포함하지 않는다. 따라서, 신규의 플라스미드 pXT1091은 다음의 유전적 요소들, 즉 pBR322 tetR 유전자, 제1의 다중클로닝부위, pBR322 rop 유전자, BstZ17I 부위, pACYC184 복제개시점 영역, 제2의 다중클로닝부위 및 pBR322 bla 유전자를 시계방향 순서로 갖는다. 플라스미드 pXT1091의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:28에 주어진 바와 같다.

이 구조체는 pBR322 rop 유전자 생성물이 pACYC184 복제개시점 영역(p15A 복제개시점)을 갖는 플라스미드의 복제수에 대해 어떤 효과를 가지는지를 결정하기 위해 평가되었다. 복제수 결과들은 표7에 나타나 있고, 아래에 설명되어있다.

실시예 15. pACYC184 , pXT1091 및 pXT1094 의 플라스미드 복제수들

본 발명의 유용성의 예로서, rop 유전자를 포함하는 혼성 ORI로 변형된 플라스미드들은 박테리아 내에서 그들의 복제수들을 변경시킬 수 있다는 사실을 들 수 있다. pACYC184, pXT1091 및 pXT1094를 위한 복제수들은, L-브로스+적당한 항생제(특히 pACYC184를 위해서 ㎖당 10㎍의 테트라사이클린 및 pXT1091과 pXT1094를 위해서는 ㎖당 100㎍의 앰피실린)내에서 성장된, 한 셋트의 진탕 플라스크 배양물 내에서 성장한 균주 DH5α에서 결정되었다. 복제수 측정은 상술한 바에 따라 이루어졌다. 표7은 이 실험의 결과들을 보여준다.

표 7.

L-브로스배지( 테트라사이클린 또는 앰피실린 첨가)를 갖는 진탕 플라스크 내에서의 성장동안의 플라스미드 복제수

이 결과들은, 플라스미드 pXT1091 상에서의 rop 유전자의 존재는 플라스미드 복제수를 낮추기보다 실제로는 오히려 기대했던 대로 증가시켰다는 것을 시사한다. 이러한 발견들은 플라스미드 유래의 이종 유전자들의 발현을 향상시키기 위해 플라스미드 복제개시점들의 구조의 조작에 관한 본 발명의 유용성을 더 예증한다. 이 결과들은 두 가지 범위의 플라스미드 복제수를 갖는 새로운 플라스미드 벡터들 즉, 약 500의 플라스미드 복제수를 지닌 플라스미드 pXT1091, 및 약 200의 플라스미드 복제수를 지닌 플라스미드 pXT1094를 제공하는데 있어서의 본 발명의 유용성을 예증한다.

실시예 16. 다중클로닝부위에 인접하여 위치한 pACYC184 복제개시점과 pXT757- 유래 bST 단백질 발현요소들을 갖는 pXT1110 의 구성과, pACYC184 와 다중클 로닝부위에 인접하여 위치한 rop 유전자 및 pXT757 -유래 bST 단백질 발현요소들을 갖는 pXT1109 의 구성

다중클로닝부위에 인접하여 위치한 pACYC184 복제개시점을 운반하는, pXT1094로부터의 NotI-SpeI 단편을 pXT996 내로 삽입하므로써, pBR322 복제개시점 영역을 치환시켜, 플라스미드 pXT1110을 제조했다. 다중클로닝부위에 인접하여 위치한 rop 유전자와 pACYC184 복제개시점을 운반하는, pXT1091로부터의 NotI-SpeI 단편을 pXT996 내로 삽입하므로써, pBR322 복제개시점 영역을 치환시켜, 플라스미드 pXT1109(SEQ ID NO :34)를 만들었다.

실시예 17. pMB1 , pACYC184 복제개시점 또는 pACYC184 + rop 복제개시점을 포함하는, 변형된 pBR322 -기초 플라스미드로부터의 bST 단백질의 발현

본 발명의 유용성의 한 예로서, 혼성 ORI로 변형된 플라스미드가 목표 단백질의 발현의 수준을 변경시킬 수 있다는 사실을 들 수 있다. 숙주균주 LBB427은 단백질 bST(소 소마토트로핀)의 발현수준에 대한 혼성 ORI의 효과를 결정하기 위한 실험에 사용되었다. bST단백질 발현수준은, 화학적으로 규정된 무기염과 포도당 최소배지를 포함하는 발효기에서 배양되는 동안 측정되었고, 이때 bTS 단백질 합성은 660nm에서의 흡광도 23에서 50ppm의 날리딕식산의 첨가에 의해 유도되었다. bST단백질의 발현수준은, 리터당 1mg의 bST의 검출한계에서, HPLC 분석을 사용하여 측정하였다. 발효 성장조건들과 HPLC 분석은 Bogosian 등(1989)에 설명되어있는데, 이 논문에 기술된 바에 따라, 발효기는 어떠한 항생제도 없는 최소배지를 포함하였다.

표 8

pACYC184 복제개시점 또는 pACYC184 + rop 복제개시점을 갖는 플라스미드로부터의 bST 단백질의 발현

이러한 결과들은 높은 플라스미드 복제수가 이 특정의 bST 단백질 발현시스템에 해로운 영향을 미친다는 사실을 시사한다. 이러한 발견은, 플라스미드 유래의 이종 유전자의 발현을 향상시키기 위한, 플라스미드 복제개시점의 구조의 조작에 관한 본 발명의 유용성을 더 예증해준다.

실시예 18. cer 부위를 갖는 플라스미드 pXT1007 의 구성

cer 단백질은 통상적으로 플라스미드의 유전안정성을 증가시킨다. 따라서, 세포내에서 플라스미드의 보유율을 증가시키기 위해, 플라스미드 상에 cer 유전자를 포함시키는 것이 유용할 수 있다. 본 발명은 혼성 ORI에 cer 유전자를 도입하는 것을 허용가능케 하며, 이로써 사용자의 요구에 부응하도록 플라스미드의 ORI를 재단할 수 있게 하는 이점을 나타내게 된다.

cer 부위 및 몇몇의 인접한 뉴클레오티드 서열을 운반하는 ColE1 영역은, ColE1 플라스미드 DNA로부터 제조된 357 bp NsiI-NotI PCR 단편으로서 분리되었고, 플라스미드 pXT1007을 제조하기 위해, pXT996상의 MCS내로 삽입되었다. NsiI-NotI단편의 뉴클레오티드 서열이 결정되었고, 이는 도 10에 나타나 있다(SEQ ID 32). 도 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열은, 본 발명자들에 의한 최근의 플라스미드 ColE1의 뉴클레오티드 서열화에 의해, 유전자은행 뉴클레오티드 서열과의 차이점을 보여준 바와 같이, 유전자은행에서 발견된 ColE1의 뉴클레오티드 서열과는 다르고; 본 발명자들은 여기에서 제시된 뉴클레오티드 서열이 플라스미드 ColE1의 cer 부위의 정확한 뉴클레오티드 서열이라고 믿는다. 밑줄친 부분은, RNA 분자 RCD를 발생시키는 전사영역이다(Patient와 Summers, 1993).

실시예 19. 플라스미드 pXT757 ( cer 부위 없음)과 pXT1007 ( cer 부위 있음)의 안정성

균주 LBB427[pXT757]과 LBB427[pXT1007]의 유전안정성은 항생제 없는 LB에서 배양함으로써 연구되었다. 앰피실린과 테트라사이클린을 함유한 LB에서 밤새 배양한 배양물, 및 항생제 없는 LB내에서 배양한 계대 배양물을 출발물로 사용하여 실험과정이 시작되었다. 각각의 계대배양물을 얻기 위해, 미리 얻어진 전밀도(full-density) 배양물의 10㎕가 10ml의 LB로 옮겨졌다. 이는 1000배의 희석으로서, 다시 전밀도에 도달하기 위해서는 배양물의 10세대의 성장이 요구된다. 즉, 2¹⁰=1024이기 때문에, 배양물이 다시 전밀도로 되기 위한 약 1000배의 증가를 위해서는 1000배 희석된 배양물을 10 배가(doubling)해야 한다. 이들 E. Coli 균주들은 37℃에서, 약 20분의 배가시간동안 LB에서 성장하기 때문에, 10 배가를 이루는데 단지 3시간을 조금 넘는 시간동안의 지수성장(exponential growth)이 요구될 것이다. 어떤 지체시간을 허용하기 위해, 계대배양물은 최소한 8시간동안 성장되었다. 오전에 계대배양을 실시하기 시작하여, 8시간 동안 성장시키고, 그 다음 계대배양물을 다시 밤샘 성장시켰다. 그 결과, 24시간동안 20세대의 계대접종이 이루어졌다. 각각의 10세대 성장 사이클의 종료시점에서, 플라스미드를 보유하는 세포의 백분율을 결정하기 위해, 전밀도 배양물을 희석하고, LB와 LB Amp위에 평판 배양하였다.

표 9 연속적 세대들후 플라스미드를 보유하는 세포의 백분율

cer 유전자를 pXT757 플라스미드에 첨가하는 것이 LBB427 세포내의 플라스미드 보유율을 향상시켰다는 사실은 분명하다.

실시예 20. cer 부위를 가진 플라스미드로부터의 bST 의 발현

숙주균주 LBB427은 단백질 bST의 발현수준에 대한 혼성 ORI의 효과를 결정하기 위한 실험에 사용되었다. 화학적으로 규정된 무기염과 포도당 최소배지를 포함하는 발효기에서 배양되는 동안, bST단백질 발현수준이 측정되었고, 이때 bST 단백질 합성은 660nm에서의 흡광도 23에서 50ppm의 날리딕식산을 첨가하므로써 유도되었다. bST단백질 발현의 수준은 리터당 bST 1mg의 검출한계에서 HLPC 분석을 사용하여 측정되었다. 발효 성장조건들 및 HPLC 분석은 Bogosian 등(1989)에 상세히 설명되어 있는데; 이 논문에 기술된 바에 따라, 발효기는 항생제 없는 최소배지를 포함하였다.

표 10 bST 발현에 대한 cer 부위의 영향

균주와 플라스미드	발효	bST 발현 (mg/l)	평균
LBB427[pXT1007]	1차	6300	6300
	2차	6300

표6에서 보여지는 바와 같이, pXT757(cer부위 결여)로부터의 bST단백질 발현은 리터당 약 6400mg이었다. 이 결과는 pXT757에서의 복제개시점에 cer부위를 첨가하는 것(이를 통해 플라스미드 pXT1007이 형성된다)이 bST단백질의 발현의 증가를 유도하지 않았다는 것을 나타낸다. cer부위의 첨가와 관련된 증가된 플라스미드 보유량이라는 유리한 효과의 결여는, 발효배양물이 플라스미드 보유를 위한 항생제 선택의 부재시에, 낮은 수의 세대 동안 성장되었다는 사실을 반영할 수 있다. 여기에서 사용된 발효배양 조건하에서, 접종물이 항생제가 첨가된 L-브로스에서 성장되었고, 그 결과 접종물내의 세포의 100%가 플라스미드를 포함하고 있을 것이다. 그러나 발효용기의 접종 후, 항생제가 결여된 발효배지에서 단지 약 7~8세대의 성장만이 있었다. 단지 7~8세대에서, cer부위가 없는 경우에 조차도, 플라스미드를 포함한 세포의 검출가능한 정도의 소실은 없을 것으로 기대된다. 실제로, 표9에서 보여지는 바와 같이, 적어도 20세대에서 세포의 90% 이상에서 pXT757이 유지되고 있었다.

실시예 21. cer 부위와 MCS 에 인접하여 위치한 복제개시점을 포함하는 복합체 pBR322인 pXT1221 의 구성

도 11에 나타낸 바와 같은 pXT1221을 얻기 위해, pXT1007의 NsiI-SpeI 단편은 pXT995(MCS에 인접하여 위치한 복제개시점을 가진 pBR322)내로 삽입되었다. MCS에 관하여, pXT1221상의 cer부위와 pBR322 복제개시점 정렬은 Bg1Ⅱ-NsiⅠ-cer-NotⅠ-pBR322 복제개시점-SacⅠ-SpeⅠ-Bg1Ⅱ이다.

DH5α[pXT1221]의 안정성은, cer부위를 포함하거나 포함하지 않는 플라스미드에 대해, 상술된 바에 의해 시험되었고, 그 결과는 표11에 나타내었다. 놀랍게도, cer부위를 갖는 구조체의 경우 300세대이상의 세대에서 실질적으로 플라스미드 안정성이 변하지 않았다.

표 11 . 연속적 세대들후 플라스미드를 보유하는 세포의 백분율

이러한 발견은, 본 발명에 의해 정확하게 이루어진 첨가에 따라 플라스미드상에 cer부위를 포함시키는 것은, 항생제 선택의 부재시에 더 많은 수(20을 넘는)의 성장세대에서 높은 플라스미드 보유를 필요로 하는 배양조건을 위해 고려할 가치가 있다는 것을 나타낸다.

전술한 실시예들이 보여주는 바와 같이, 본 발명은 변형된 복제개시점을 갖는, 다양한 새로운 타입의 플라스미드 벡터들의 구축을 가능하게 해준다. 본 발명의 유용성은, 세포당 10~500 플라스미드 복제수에 걸친, 넓은 범위의 플라스미드 복제수를 가진 새로운 플라스미드 벡터의 구성에 의해 부분적으로 예증되었다. 또한 본 발명의 유용성은, cer부위를 포함하고, 항생제 선택의 부재시에 연장된 성장(20세대를 넘는)동안 증가된 플라스미드 보유를 나타내는 플라스미드의 구성에 있어서의 용이성에 의해 예증된다. 또한, 이같이 변형된 플라스미드는, 원하거나 목적하는 유전자 생성물의 발현수준을 조절하게 하는, 유용한 클로닝 도구들을 제공할 것이다.

본 명세서에서의 실시예들에 기초하여, 당업자는 플라스미드의 복제수를 변경시킬 수 있는 유용한 혼성 ORI를 만들 수 있을 것이다. 또한 당업자는 교환가능한 ORI, 또는 플라스미드의 특성들을 변경시키기 위해 첨가된 유전적 요소들을 가질 수 있는 ORI를 만들 수 있을 것이다. 당업자는 본 발명을 참고하여, 사용자의 요구에 걸맞는 플라스미드를 맞춤제작하는 것이 가능할 것이다.

여기에서 개시되고 청구된 모든 구성물 및/또는 방법들 및/또는 과정들 및/또는 장치들은 본 발명의 개시점에 비추어 보아, 과도한 실험없이 구성되고 실행될 수 있다. 본 발명의 구성 및 방법들이 바람직한 구체예들의 관점에서 기술되었으나, 본 발명의 범위와 개념을 벗어나지 않고도, 여기에서 기술된 구성물 및/또는 방법들 및/또는 장치들 및/또는 과정들 및 방법들의 단계들 또는 일련의 단계들에서 변형이 적용될 수 있다는 것은 당 분야의 통상의 기술자들에게는 자명할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적으로, 생리학적으로 연관된 어떤 시약들이, 동일하거나 유사한 결과들을 달성하기 위해, 여기에서 기술된 시약들에 대체될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 그러한 모든 유사한 대체 및 변형은 본 발명의 개념 및 범위에 속하는 것으로 간주된다.

SEQUENCE LISTING <110> Bogosian, Gregg O'Neil, Julia Smith, Hong Q. <120> Hybrid Portable Origin of Replication Plasmids <130> 11916.0063.PCUS00 <140> PCT/US2006/035433 <141> 2006-09-13 <150> 60,718,083 <151> 2005-09-16 <160> 34 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 4361 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Recombinant plasmid pBR322 <400> 1 gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60 aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120 cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180 cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240 atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300 ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360 gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420 cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480 ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540 gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600 cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660 gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720 cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780 gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840 gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900 caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960 cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020 ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080 ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcattgg 1140 accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200 gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260 ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320 agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag 1380 aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc ggcgcatctc gggcagcgtt 1440 gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg 1500 cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 1560 tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 1620 tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 1680 gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 1740 tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca 1800 caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct 1860 cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg 1920 accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 1980 cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 2040 cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 2100 aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 2160 agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 2220 acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 2280 ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 2340 accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 2400 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 2460 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 2520 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 2580 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 2640 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 2700 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 2760 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 2820 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 2880 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 2940 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3000 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3060 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3120 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 3180 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 3240 aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 3300 aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 3360 cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 3420 ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 3480 cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 3540 ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 3600 ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 3660 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 3720 gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 3780 ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 3840 ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 3900 gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 3960 ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 4020 cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 4080 ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 4140 aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 4200 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 4260 gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 4320 cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca a 4361 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 2 gctcggccct tccggctggc 20 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 3 ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttaat cttttctacg 50 <210> 4 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 4 gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 60 ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 120 acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 180 cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 240 atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 300 tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 360 ttaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaa 399 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccttctagtg tagccgtagt cgggcc 26 <210> 6 <211> 6647 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Recombinant plasmid ColE1 <400> 6 ttctatgctc ctatattgat aagaataaac ttaatactat aaatgaggtg ttagggattt 60 aattattctt tattgatata aaaagtccta gcaatccaaa tgggattgct aggaccaaac 120 aaagtagatt atatagcata aataggttta attttgctac gggggcgtta tttaggtttt 180 ttcttctttc gaaaaaatct ttctttatga agttaaaagc tatgtattca atagcatatt 240 ttgaatatgg acatagaata gtgcttatca ctattgcata tagcatctta tctgacacaa 300 ggaaataata cccttcgctg ttttttgtta taaggtatat atatataagt gtgcagtaca 360 ggccaaataa aatatttttt atgtagtatc ttaagctcat aaattaaacc tcgccatata 420 ttcttttcat tttataagga tcgagttatg aggaaaagat tttttgtggg aatattcgcg 480 ataaacctcc ttgttggatg tcaggctaac tatatacgtg atgttcaggg agggaccatc 540 gcaccatcct cctcttctaa actgacgggg atcgcggttc agtagaaaag attaaaggat 600 cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 660 taccaacggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 720 gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag tcgggccact 780 acttcaagaa ctctgtagca ccgtttgtgc catcatcgct ctgctaatcc ggttaccagt 840 ggctgctgcc agtggcgtta aggcgtgcct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 900 ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 960 aacgacctac accgaactga gataccaaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 1020 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 1080 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 1140 ctgacttgag cgtctatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 1200 ctgctacgtg gccttcttcc tgttcctggt cttttgctca catgttcttt ccggccttat 1260 cccctgattc tgtggataac tgtgttaccg tttttgtgtg agtcagtacc gctcgccgca 1320 gtcgaacgac cgagcgtagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaaaagcgc ctggacgtgc 1380 attttctcct tacgcatctg tgcggcattt cacacccggc atggcgtact tttcatacaa 1440 tccgcactga tgccgcatgg ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt 1500 cagggctgcg ccccgacacc cgctaaaacc tgctgacgcg ccctgacggg cttgtcagct 1560 cccggcatcc gctcacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 1620 ttcaccgtca tccccgaaac gtgcgaggca gctgcggtaa agctcatcgg cgtggtcgtg 1680 aagcgattca caaatatcgg cctgttcatc tgcgtccagt tcgttgagct tctccagcag 1740 cgttaatgtc tggcttctga taaagcgggc catgttaagg gcggtttttt cctgtttagt 1800 cactgatgcc tccgtgtaag ggggatttct gttcatgggg taatgatacc gatgaaacgc 1860 gagaggatgc tcacaatacg ggttactgat gatgaacatg cccggttact tgaacgctgt 1920 gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg cgggtctgcc tgggggagcc ggttgcccgt 1980 tccggaaaac tgccgacact ggcaccgccg ttactgcgtc agctggccgc catcggaaat 2040 aacctgaatc agacagcccg taaggtgaac agcgggcagt ggtcttccgg tgaccgggtt 2100 caggtggtgg ccgcactgat ggccatcggg gatgagctgc gccggctgcg tctggctgtc 2160 agggaacagg gggcgcggga tgatagttaa atttcatgcc aggggaaaag gtggtggcag 2220 tggtccggtt gattacctgc tggggaggga gcgtaaccgc gaaggcgcaa cggtgcttca 2280 gggtaatccg gaagaagtcc gggaactcat cgatgccacg ccatttgcga agaaatacac 2340 gtccggtgtt ctgtcgttcg cggagaagga gctgccgccg ggaggacgtg aaaaagtgat 2400 ggcgagcttt gagcgtgtac tgatgcccgg tctcgaaaaa aatcagtaca gcatcctgtg 2460 ggtggagcac caggacaagg gacggcttga gctgaatttt gtcattccga acatggagct 2520 acagaccgga aaacgcctcc agccgtacta cgaccgcgca gacaggccta gaattgatgc 2580 ctggcagacg ctggtaaatc accattacgg gctgcatgac ccgaacgccc cggagaaccg 2640 caggacgctg acactccctg ataacctgcc tgaaacgaaa caggcgcttg ctgagggcgt 2700 cacgcgaggt atagatgcac tttaccatgc cggagagata aaaggccgtc aggatgtgat 2760 tcaggcgctc actgaggcgg ggctggaagt ggtcagggtg acgcgaagca gtatcagcat 2820 tgcagatccg aacggcggga agaatatcag gctgaaagga gcattttatg agcaatcttt 2880 tgcagacggg cgcggagttc gagaaaaagc tgaaagagag agccgaatct acagagaaaa 2940 tgctgaacaa cgagttcagg aggctcggcg aatctgtaag cgaggctgtg acatcaaacg 3000 agacgaaaat cagagacgct atagccctgt tcacagcctc gacagaggaa tcgctggaaa 3060 aacaccggga aggggtgaaa gaggcgatga tgcagcacag gagggacgtg ttaaagctgg 3120 cagggaatac gggcatgatg ttactgggga tagtctttct cctgtttacc gcgagtggcg 3180 ggacgctctg gtatcttgga gggaggatac aggcgaacct ggaagaaatc aggaagcagg 3240 aagagacatt gcagaaactg aacgcgaaga catggggcgt ggagtttgtg caggacggga 3300 acaggaaatt ccttgtcctt ccgtacggga aatcagcgga ggtgattccc tttcagggga 3360 aagagtgggt acatctgaag gagtgacaca gagtgacaga gctggaaaca catttgctga 3420 acgccttaga gcagctgcaa caggactata tgcagcggct gagcgaatgg gagagcgcct 3480 tcgtggaatt gcagaagatg ttttcgctta cgcaacggga caacgcgatg ctgaacgagc 3540 gggtcatgca gttgagtcag caggtgcagc acttgagcga gcagacagaa cgcttgagcc 3600 agttatacag cgagaactgg agataagaga ggaacggctg atacaggagc gcgaacatgt 3660 gttatccctg gaacgggagc gtcagccgga aatacaggaa cgcacgctgg atggcccttc 3720 gctgggatgg tgaaaccatg aaaaatggca gcttcagtgg attaagtggg ggtaatgtgg 3780 cctgtaccct ctggttgcat aggtattcat acggttaaaa tttatcaggc gcgatcgcgg 3840 cagtttttcg ggtggtttgt tgccattttt acctgtctgc tgccgtgatc gcgctgaacg 3900 cgttttagcg gtgcgtacaa ttaagggatt atggtaaatc cacttactgt ctgccctcgt 3960 agccatcgag ataaaccgca gaaatcgtgt cagccagcag cctggatttt ttcggggtaa 4020 ggtctttgct gcggtaatca gtacccgcaa attgagttgt gccccggagt gagtttaaaa 4080 attcctggct gtgaaactgc tgaatgcgtt gttgcacatc actccgtgat tttcctgtcg 4140 ctttatcttt agctcccata tcccagaact gccgaaaaaa aggcaccatc attcgtgttg 4200 tgtcggcttt ttgggtggaa aagttgggat caaaaccgtc atcagaagca tatacgtaat 4260 gccgggtatg ttgttccacg ctgccctttg gggtacaggc tgtgagagct actgttgctg 4320 ttatcatggc gataagacaa agtttgtttc cggtacgtct catgagtgtc tccctacctt 4380 aaagtattta ttctcggtga gttattatcc gaagactatt ttatcatcag tctctgacag 4440 cgttcagcga ccgaacaacc tggaccagaa tccccgtttc ttttccagtt ccagtgcctg 4500 cctgagctgg gctatctcat tttgtagctg ttcccgttct gcttcctggc gtctgcgatc 4560 catatcctgt gcctgtttat cctcaagcat cagcgtcagg cattgtttca gctcattcag 4620 ttcccggaga atgcgttctg tctgctgatc atgtggattt tctgcatgtc cctcactgtg 4680 cctttctggt gtctcattct gctttaattc gccgtatgcc cggatcagtt cactggtttc 4740 aaactcccgt cgtccgtccc tgccggtacg gtaactgaca aggcctgcgc gcatatcacg 4800 gtaaaactgt gaacgcgatc tgcctgtcat ttttagtgcg tcccggagtg tgtgccatgc 4860 cataaagtga cagtgtccca tagatgtctc atctcatagt ttcagtaaaa cataatgagg 4920 tctgagaacg gtaatgtttg tgctggtttt tgtggcatcg ggcgagaata gcgcgtggtg 4980 tgaaagactg tttttttgat cgttttcaca aaaatggaag tccacagtct tgacagggaa 5040 aatgcagcgg cgtagctttt atgctgtata taaaaccagt ggttatatgt acagtattta 5100 tttttaactt attgttttaa aagtcaaaga ggattttata atggaaaccg cggtagcgta 5160 ctataaagat ggtgttcctt atgatgataa gggacaggta attattactc ttttgaatgg 5220 tactcctgac gggagtggct ctggcggcgg aggtggaaaa ggaggcagta aaagtgaaag 5280 ttctgcagct attcatgcaa ctgctaaatg gtctactgct caattaaaga aaacacaggc 5340 agagcaggct gcccgggcaa aagctgcagc ggaagcacag gcgaaagcaa aggcaaacag 5400 ggatgcgctg actcagcgcc tgaaggatat cgtgaatgag gctcttcgtc acaatgcctc 5460 acgtacgcct tcagcaacag agcttgctca tgctaataat gcagctatgc aggcggaagc 5520 agagcgtttg cgccttgcga aagcagaaga aaaagcccgt aaagaagcgg aagcagcaga 5580 aaaggctttt caggaagcag aacaacgacg taaagagatt gaacgggaga aggctgaaac 5640 agaacgccag ttgaaactgg ctgaagctga agagaaacga ctggctgcat tgagtgaaga 5700 agctaaagct gttgagatcg cccaaaaaaa actttctgct gcacaatctg aagtggtgaa 5760 aatggatgga gagattaaga ctctcaattc tcgtttaagc tccagtatcc atgcccgtga 5820 tgcagaaatg aaaacgctcg ctggaaaacg aaatgaactg gctcaggcat ccgctaaata 5880 taaagaactg gatgagctgg tcaaaaaact atcaccaaga gccaatgatc cgcttcagaa 5940 ccgtcctttt tttgaagcaa ccagacgacg ggttggggcc ggtaagatta gagaagaaaa 6000 acaaaaacag gtaacagcat cagaaacacg tattaaccgg ataaatgctg atataactca 6060 gatccagaag gctatttctc aggtcagtaa taatcgtaat gccggtatcg ctcgtgttca 6120 tgaagctgaa gaaaatttga aaaaagcaca gaataatctc cttaattcac agattaagga 6180 tgctgttgat gcaacagtta gcttttatca aacgctgact gaaaaatatg gtgaaaaata 6240 ttcgaaaatg gcacaggaac ttgctgataa gtctaaaggt aagaaaatcg gcaatgtgaa 6300 tgaagctctc 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gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480 ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540 gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600 cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660 gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720 cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780 gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840 gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900 caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960 cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020 ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080 ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140 accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200 gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260 ccgggccacc tcgacctgaa 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cactggcagc agccactggt 2460 aattgattta gaggagttag tcttgaagtc atgcgccggt taaggctaaa ctgaaaggac 2520 aagttttggt gactgcgctc ctccaagcca gttacctcgg ttcaaagagt tggtagctca 2580 gagaaccttc gaaaaaccgc cctgcaaggc ggttttttcg ttttcagagc aagagattac 2640 gcgcagacca aaacgatctc aagaagatca tcttattaat cagataaaat attcctagat 2700 ttcagtgcaa tttatctctt caaatgtagc accgagctca ctagtagatc tggggtctga 2760 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 2820 cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 2880 gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 2940 tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 3000 gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 3060 agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 3120 tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 3180 agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 3240 gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 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ctggtagatc tatgcatgcg gccgccccgc cgcatccata 1800 ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc 1860 gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc 1920 cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta 1980 tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg 2040 cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc 2100 gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 2160 gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 2220 ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttac 2280 tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg tggcaggaga aaaaaggctg 2340 caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc cgcttcctcg ctcactgact 2400 cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc ttacgaacgg ggcggagatt 2460 tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag agggccgcgg caaagccgtt 2520 tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc tgacgctcaa atcagtggtg 2580 gcgaaacccg acaggactat 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tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 1560 tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 1620 tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 1680 gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 1740 tgaccctgag tgatttttct ctggtagatc tatgcatgtt atccctagaa cgggagcgtc 1800 agccggaaat acaggaacgc acgctggatg gcccttcgct gggatggtga aaccatgaaa 1860 aatggcagct tcagtggatt aagtgggggt aatgtggcct gtaccctctg gttgcatagg 1920 tattcatacg gttaaaattt atcaggcgcg atcgcggcag tttttcgggt ggtttgttgc 1980 catttttacc tgtctgctgc cgtgatcgcg ctgaacgcgt tttagcggtg cgtacaatta 2040 agggattatg gtaaatccac ttactgtctg ccctcgtagc catcgagata aaccgcacga 2100 aatcgtgtca gccagcagcc gcggccgccc cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc 2160 tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc 2220 tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca 2280 gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag ccagacatta 2340 acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg 2400 cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt 2460 gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc 2520 gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc 2580 atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc 2640 agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 2700 aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 2760 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 2820 gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2880 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2940 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 3000 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 3060 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 3120 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 3180 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 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Artificial sequence <220> <223> SacI SpeI BglII multiple cloning site <400> 31 gagctcacta gtagatct 18 <210> 32 <211> 398 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> cer site on the plasmid pXT1007 <400> 32 atgcatgtta tccctagaac gggagcgtca gccggaaata caggaacgca cgctggatgg 60 cccttcgctg ggatggtgaa accatgaaaa atggcagctt cagtggatta agtgggggta 120 atgtggcctg taccctctgg ttgcataggt attcatacgg ttaaaattta tcaggcgcga 180 tcgcggcagt ttttcgggtg gtttgttgcc atttttacct gtctgctgcc gtgatcgcgc 240 tgaacgcgtt ttagcggtgc gtacaattaa gggattatgg taaatccact tactgtctgc 300 cctcgtagcc atcgagataa accgcacgaa atcgtgtcag ccagcagccg cggccgccct 360 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaa 398 <210> 33 <211> 4399 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Recombinant plasmid pXT1092 <400> 33 gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60 aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120 cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180 cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240 atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300 ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360 gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420 cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480 ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540 gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600 cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660 gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720 cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780 gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840 gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900 caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960 cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020 ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080 ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcattgg 1140 accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200 gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260 ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320 agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag 1380 aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc ggcgcatctc gggcagcgtt 1440 gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg 1500 cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 1560 tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 1620 tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 1680 gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 1740 tgaccctgag tgatttttct ctggtagatc tactagtgag ctcgtagaaa agatcaaagg 1800 atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 1860 gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 1920 tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 1980 ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 2040 ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 2100 ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 2160 aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 2220 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 2280 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 2340 ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 2400 cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 2460 tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 2520 cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg 2580 cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac 2640 tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta 2700 cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 2760 gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 2820 tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca 2880 gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt 2940 ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt 3000 tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata 3060 ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta 3120 ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcggggcgg ccgcatgcat 3180 agatctgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 3240 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 3300 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3360 tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3420 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 3480 acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3540 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 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<212> DNA <213> Unknown <220> <223> Recombinant plasmid pXT1109 <400> 34 gaattctact gtatgagcat acagttaagg gttgacaacc gatatttatt cacttaatat 60 ataaatatca actgaggcgc gcccataaca tcaagaggat atgaaattat gtttccagcc 120 atgagcttgt ccggactctt tgccaatgct gtactccggg ctcagcacct gcatcagctg 180 gctgctgaca ccttcaaaga gtttgagcgc acctacatcc cggagggaca gcgttactcc 240 atccagaaca cccaggttgc cttctgcttc tctgaaacca tcccggcccc gacgggcaag 300 aatgaggccc agcagaaatc agacttggag ctgcttcgca tctcactgct cctcatccag 360 agctggcttg ggccgctgca gttcctcagc cgtgtcttca ccaacagctt ggtgtttggc 420 accagcgacc gtgtctatga gaagctgaag gacctggagg aaggcatcct ggccctgatg 480 cgtgagctgg aagatggcac cccgcgtgct gggcagatcc tcaagcagac ctatgacaaa 540 tttgacacaa acatgcgcag tgacgacgcg ctgctcaaga actacggtct gctctcctgc 600 ttccgtaagg acctgcataa gacggagacg tacctgcgtg tcatgaagtg ccgccgcttc 660 ggggaggcga gctgcgcctt ctaatagctc gagtctagac tcactcatta ggcaccccag 720 gctttacact ttatgcttcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 780 cacacaggaa aaagctgatt gcccttcacc gcctggcctc cgttgagcca tctggatcgg 840 cagcgttgtc ttcatcaacc ggaacgagca tgccggagag cagctcactc attaggcacc 900 ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 960 atttcacaca gaagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt aaattgctaa cgcagtcagg 1020 caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct cggcaccgtc accctggatg 1080 ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct cttgcgggat atcgtccatt 1140 ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct atatgcgttg atgcaatttc 1200 tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg ccgccgccca gtcctgctcg 1260 cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc gaccacaccc gtcctgtgga 1320 tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc cacaggtgcg gttgctggcg 1380 cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg ccacttcggg ctcatgagcg 1440 cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct 1500 ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct 1560 gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc gatgcccttg agagccttca 1620 acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg 1680 tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc attttcggcg 1740 aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta ttcggaatct 1800 tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc ggcgagaagc 1860 aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta cgtcttgctg gcgttcgcga 1920 cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc ttccggcggc atcgggatgc 1980 ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga ccatcaggga cagcttcaag 2040 gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcattgg accgctgatc gtcacggcga 2100 tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg gattgtaggc gccgccctat 2160 accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag ccgggccacc tcgacctgaa 2220 tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca agaattggag ccaatcaatt 2280 cttgcggaga actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag aacatatcca tcgcgtccgc 2340 catctccagc agccgcacgc ggcgcatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg 2400 catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 2460 gcagaatgaa 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ggatatattc cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga 3360 ctgcggcgag cggaaatggc ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag 3420 atacttaaca gggaagtgag agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc 3480 ctgacaagca tcacgaaatc tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat 3540 aaagatacca ggcgtttccc cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc 3600 ggtttaccgg tgtcattccg ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc 3660 agttccgggt aggcagttcg ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc 3720 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa 3780 gcaccactgg cagcagccac tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc 3840 cggttaaggc taaactgaaa ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc 3900 tcggttcaaa gagttggtag ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt 3960 ttcgttttca gagcaagaga ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat 4020 taatcagata aaatattcct agatttcagt gcaatttatc tcttcaaatg tagcaccgag 4080 ctcactagta gatctggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 4140 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 4200 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 4260 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 4320 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 4380 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 4440 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 4500 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc 4560 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 4620 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 4680 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 4740 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 4800 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac 4860 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 4920 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 4980 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 5040 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 5100 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 5160 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 5220 aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 5280 gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaa 5308

Claims (56)

1. 적어도 두 개의 다른 플라스미드들 유래의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 혼성 복제개시점으로서, 상기 혼성 복제개시점은 pBR322, pACYC184, pACYC177, ColE1, pBR3286, p1, pBR26, pBR313, pPIGDM1, pPVU1, pF, pSC101 및 pC101p-157로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 플라스미드의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 혼성 복제개시점.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
3. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
4. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
5. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322, pACYC184, pACYC177, ColE1, pBR3286, p1, pBR26, pBR313, pPIGDM1, pPVUI, pF, pSC101 및 pC101p-157로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 플라스미드의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
6. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pBR322 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
7. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pACYC184 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
8. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 ColE1 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
9. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pACYC184 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
10. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 ColE1 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
11. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
12. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
13. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
14. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322, pACYC184, pACYC177, ColE1, pBR3286, p1, pBR26, pBR313, pPIGDM1, pPVUI, pF, pSC101 및 pC101p-157로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 플라스미드의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
15. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pBR322 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
16. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pACYC184 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
17. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 ColE1 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
18. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pACYC184 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
19. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 ColE1 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
20. 삭제
21. 삭제
22. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은 SEQ ID NO:7 또는 12의 서열 내에 포함되는 것인 혼성 복제개시점.
23. 제 1항에 있어서, pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열과 ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 혼성 복제개시점.
24. 제 23항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 위치 1766~3148의 서열의 일부가 ColE1(SEQ ID NO:6)의 적어도 200개의 연속적인 뉴클레오티드로 치환된 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
25. 제 23항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, ColE1(SEQ ID NO:6)에서의 AlwNI 제한부위부터 위치 3148까지의 뉴클레오티드 서열에 연결된 pBR322(SEQ ID NO:1)에서의 위치 1766부터 AlwNI 제한부위까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
26. 제 23항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, pBR322(SEQ ID NO:1)에서의 AlwNI 제한부위부터 위치 3148까지의 뉴클레오티드 서열에 연결된 ColE1(SEQ ID NO:6)에서의 위치 1766부터 AlwNI 제한부위까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
27. 제 1항에 있어서, pBR322의 복제개시점으로부터의 서열, 및 ColE1 또는 pACYC184의 복제개시점으로부터의 서열을 포함하는 혼성 복제개시점.
28. 삭제
29. 제 1항에 있어서, pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열 및 ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 혼성 복제개시점.
30. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 22항 내지 제 27항 또는 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은 각 측면에 적어도 하나의 클로닝부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열들이 인접하여 위치하는 혼성 복제개시점.
31. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 22항 내지 제 27항 또는 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은 각 측면에 다중클로닝부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열들이 인접하여 위치하는 혼성 복제개시점.
32. 삭제
33. 삭제
34. 제 30항에 있어서, 상기 인접하여 위치하는 클로닝부위는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼성 복제개시점.
35. 제 31항에 있어서, 상기 다중클로닝부위는 적어도 하나의 BspEI, Bg1II, NsiI, NotI, SacI, SpeI, 또는 AlwNI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼성 복제개시점.
36. 제 30항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은 ColE1, pBR322 또는 pACYC184의 복제개시점을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼성 복제개시점.
37. 클로닝부위에 인접하여 위치하는 제 1항 내지 제 19항 또는 제 22항 내지 제 27항 또는 제 29항 중 어느 한 항의 혼성 복제개시점을 포함하는 변형된 플라스미드.
38. 제 37항에 있어서, 상기 변형된 플라스미드는, pBR322, pMB1, p15A, pACYC184, pACYC177, ColE1, pBR3286, p1, pBR26, pBR313, pBR327, pBR328, pPIGDM1, pPVUI, pF, pSC101 또는 pC101p-157인 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
39. 제 37항에 있어서, 상기 변형된 플라스미드는 pUC 플라스미드인 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
40. 제 37항에 있어서, 상기 변형된 플라스미드는 pACYC184인 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
41. 제 37항에 있어서, 상기 변형된 플라스미드는 pBR322인 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
42. 제 37항에 있어서, 상기 변형된 플라스미드는 ColE1인 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
43. 제 37항에 있어서, 상기 변형된 플라스미드는 SEQ ID NO: 22 또는 23인 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
44. 제 37항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은 pBR322 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열 및 ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
45. 제 37항에 있어서, 상기 변형된 플라스미드는 SEQ ID NO: 7 또는 12인 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
46. 제 37항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은 pACYC184 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 플라스미드.
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48. 제 37항의 변형된 플라스미드로 형질전환된 박테리아 숙주세포.
49. (a) 제1의 플라스미드 내에 존재하는 혼성 복제개시점을 증폭시키기 위하여, 어닐링영역, 및 제2의 플라스미드 내의 클로닝부위에 상응하는 적어도 하나의 클로닝부위를 포함하는 영역을 포함하는 프라이머들을 사용하는 단계;

    (b) 복제개시점 영역, 어닐링 영역, 및 적어도 하나의 클로닝 부위를 포함하는 PCR 앰플리콘을 분리하는 단계;

    를 포함하는, 제1의 플라스미드 내에 교환가능한 혼성 복제개시점 카세트를 만드는 방법.
50. (a) 제1의 플라스미드 내에 존재하는 복제개시점을 증폭시키기 위하여, 어닐링 영역, 및 제2의 플라스미드 내의 클로닝부위에 상응하는 적어도 하나의 클로닝부위를 포함하는 영역을 포함하는 프라이머들을 사용하는 단계;

    (b) 복제개시점 영역, 어닐링 영역 및 적어도 하나의 클로닝 부위를 포함하는 PCR 앰플리콘을 분리하는 단계;

    (c) 상기 적어도 하나의 클로닝 부위를 인식하는 제한효소로 상기 PCR 앰플리콘을 소화시키는 단계;

    (d) 상기 존재하는 복제개시점을 절단하기 위하여, 상기 적어도 하나의 클로닝부위를 인식하는 제한효소로 상기 제2의 플라스미드를 소화시키는 단계;

    (e) 상기 제1의 플라스미드의 상기 PCR 앰플리콘을 제2의 플라스미드 내로 결찰시키는 단계;

    를 포함하는, 제1의 플라스미드와 제2의 플라스미드 간에 혼성 복제개시점 영역을 교환시키는 방법.
51. (a) 발현조절 서열들에 작동적으로 연결된, 목적의 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제37항의 플라스미드로 적합한 숙주세포를 형질전환시키는 단계;

    (b) 상기 재조합 단백질의 발현을 위해 적합한 조건하에서, 상기 플라스미드로 형질전환된 상기 적합한 숙주세포를 배양시키는 단계; 및

    (c) 목적의 단백질을 회수하고 정제시키는 단계;

    를 포함하는, 목적의 재조합 단백질의 제조방법.
52. (a) 적합한 박테리아 균주를 제 37항의 플라스미드로 형질전환시키는 단계; 및

    (b) 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 조건하에서, 상기 플라스미드로 형질전환된 상기 박테리아를 배양시키는 단계;

    를 포함하는, 박테리아 내에서 플라스미드 DNA를 생산하는 방법.
53. 제 1항에 있어서, 제1의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열들이 제2의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열들과 치환되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
54. 제2의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드로 제1의 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드를 치환하는 것을 포함하는, 제 1항의 혼성 복제개시점을 만드는 방법.
55. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pBR322 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.
56. 제 1항에 있어서, 상기 혼성 복제개시점은, ColE1 복제개시점으로부터의 뉴클레오티드 서열의 적어도 250 뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 pBR322 복제개시점으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혼성 복제개시점.

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