KR20110126586A - 단일 재조합 계 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단일 재조합 이벤트에 의해 재조합 폭스바이러스의 생성을 허용하는 변형된 폭스바이러스 벡터에 관한 것이다. 상동 재조합을 위하여 2개의 인접 서열 사이에 위치한 적어도 1개의 리포터 유전자를 포함하는 변형된 폭스바이러스 벡터가 개시되어 있다. 또한 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 상기 벡터를 사용하여 재조합 폭스바이러스를 제조하는 방법이 제공된다.

Description

단일 재조합 계 및 그의 사용 방법{Single recombination system and method of use}
본 발명은 변형된 폭스바이러스(poxvirus) 벡터에서 단일 재조합 이벤트에 의해 재조합 폭스바이러스를 클로닝하기 위한 단일 재조합 계에 관한 것이다. 본 발명은 또한 변형된 폭스바이러스 벡터, 그의 용도 및 재조합 폭스바이러스의 제조 방법에도 관한 것이다.
최근, 재조합 폭스바이러스를 기본으로 한 기술을 개발하고 개선하기 위한 상당한 노력이 집중되고 있다. 폭스바이러스 벡터는 새로운 백신 요법의 개발에서 백신을 통하여 면역반응을 생성하는 것과 같은 다수의 용도 및 유전자 요법 적용에서의 용도에 유리한 것으로 확인되었다. 재조합 폭스바이러스 벡터와 관련된 이점은 공지되어 있고 또 유전자 물질을 복수의 세포 유형으로의 효과적인 전달; 단백질 발현의 관대한 수준; 및 항체-반응 이외에 세포-매개된 면역반응을 유발하는 능력을 포함한다.
폭스바이러스는 공지된 세포질 바이러스이므로, 이러한 바이러스성 벡터에 의해 운반된 유전자 물질은 보통 숙주 게놈 세포로 우연히 통합되는 결점없이 세포질에 잔류한다. 폭스바이러스는 예컨대 상동 재조합(homologous recombination)과 같은 클로닝 수법을 이용하여 이들의 게놈에 삽입된 외래 유전자를 함유하고 발현하도록 용이하게 유전자 조작(genetically engineered)될 수 있다. 이들 외래 유전자는 1 이상의 감염제에 대한 보호를 유도하는 항원, 공-자극 분자와 같은 면역 조절 단백질, 또는 효소 단백질과 같은 다양한 범위의 단백질을 암호화할 수 있다. 예컨대, 재조합 폭스바이러스는 헤르피스 바이러스(herpes virus), 인플루엔자, 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 면역화 항원을 발현하도록 조작되어 왔다.
벡터와 같은 폭스바이러스의 주요 이점 중의 하나는 이들의 게놈 크기가 커서 예컨대, 복수의 유전자(즉, 다가의 벡터로서)를 포함하는 다량의 이종(heterologous) 유전자 물질의 삽입을 허용하는 것이다. 그러나, 상기 이종 유전자 물질은 재조합 바이러스가 생존성으로 잔류하기 위하여 폭스 게놈 내의 적합한 부위에 삽입되어야 한다. 따라서, 상기 유전자 물질은 바이러스성 DNA 내의 비필수적 부위에 삽입되어야 한다.
재조합 폭스바이러스를 클로닝하기 위한 잘 확립된 방법은 2개의 별도의 재조합 이벤트를 기초로 한다. 제1 재조합 단계 동안, 목적하는 유전자 및 리포터 및/또는 마커 카세트(reporter and/or marker cassette)를 바이러스성 게놈에 통합시킨다. 선택 과정을 위하여, 항생물질 내성 유전자가 흔히 사용된다. 선택/마커 카세트를 사용하여 재조합 및 비-재조합 폭스바이러스의 푸울(pool)로부터 재조합 폭스바이러스를 단리한 이후, 상기 재조합 폭스바이러스를 예컨대 인간에서 백신으로 사용하려는 경우 상기 선택 및 마커 카세트는 제거되어야 한다. 이를 위하여, 재조합 폭스바이러스의 추가의 패시징(passaging) 및 플라크 정제를 포함하는 제2 재조합 이벤트가 실시되어야 한다. 따라서, 재조합 폭스바이러스를 클로닝하기 위한 현재 공지된 수법은 재조합 발현 벡터의 다른 유형의 클로닝에 흔히 사용되는 과정에 비교하여 보통 시간 소모적이고 또 노동 집약적이다.
따라서, 재조합 폭스 바이러스의 효과적인 생성을 위한 개선된 클로닝 계 및 방법이 요청되고 있는 실정이다.
발명의 요약
본 발명은 단일 재조합 이벤트에 의해 재조합 폭스바이러스의 생성을 허용하는 변형된 폭스바이러스 벡터를 기본으로 한다. 본 발명의 변형된 바이러스성 벡터는 목적하는 삽입물을 갖도록 재조합이 성공적으로 실시되면 제거되는 리포터 유전자를 포함한다.
제1 요지로서, 본 발명은 상동 재조합을 위하여 2개의 인접 서열 사이에 위치하는 적어도 1개의 리포터 유전자를 포함하는 변형된 폭스바이러스 벡터에 관한 것이다. 일 구체예로서, 상기 변형된 폭스바이러스 벡터는 수용성(permissive) 숙주 세포에서 상동 재조합을 위해 2개의 인접 영역 사이에 위치한 적어도 1개의 선택 성분을 더 포함한다. 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 숙주 세포에서 폭스 바이러스 복제를 억제하거나 또는 늦추거나 또는 숙주 세포에 대하여 세포독성인 선택 유전자를 포함한다. 다른 구체예로서, 상기 리포터 유전자 및 선택 성분은 상동 재조합을 허용하도록 단일 쌍의 인접 서열 사이에 위치한다. 또 다른 구체예로서, 상기 리포터 유전자 및 선택 성분은 상동 재조합을 허용하는 1쌍 이상의 인접 서열 사이에 위치한다. 또 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 그의 발현이 유도성인 선택 유전자를 포함한다. 특정 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질, 예컨대, 녹색 형광 단백질을 암호화한다. 다른 특정 구체예로서, 상기 선택 성분은 DNAse, RNase, 또는 프로테아제를 암호화하는 유전자로부터 선택된 선택 유전자를 포함한다. 다른 특정 구체예로서, 상기 선택 유전자의 발현은 조절 서열, 바람직하게는 프로모터의 제어하에 있다. 다른 특정 구체예로서, 상기 선택 유전자는 유도성 발현계, 예컨대, 테트라시클린 오퍼레이터/리프레서(TetO2/TetR) 계에 의해 조절된다.
다른 요지로서, 본 발명은 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 사용하여 생성된 재조합 폭스바이러스에 관한 것이다.
다른 요지로서, 본 발명은 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 다른 요지로서, 본 발명은 본 발명의 변형된 폭스바이러스를 사용하여 생성된 재조합 폭스바이러스를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 요지로서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 생성하기 위하여 변형된 폭스바이러스 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 일 요지로서, 본 발명은 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스 벡터를 사용하여 수용성 숙주 세포를 감염시킨 다음 상기 숙주 세포를, 벡터와 플라스미드 사이의 상동 재조합을 허용하는 조건하에서, 목적하는 이종 유전자 물질을 포함하는 플라스미드에 의해 형질감염시키는 것을 포함하는 재조합 폭스바이러스를 생성하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예로서, 상기 방법은 선택 유전자의 유도성 발현을 포함한다. 또 다른 구체예로서, 상기 방법은 비-재조합 폭스바이러스를 포함하는 숙주 세포로부터 상기 재조합 폭스바이러스를 포함하는 숙주 세포를 분리하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예로서, 상기 방법은 이전에 미감염 수용성 숙주 세포에서 적어도 1개의 부가적 패시징(passage)을 위해 재조합 폭스바이러스를 포함하는 수용성 숙주 세포를 사용하는 것을 포함한다.
다른 요지로서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 생성하기 위해 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스 벡터를 사용하는 것에 관한 것이다.
특별한 구체예로서, 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스 벡터는 백시니아(vaccinia) 바이러스이다. 다른 특별한 구체예로서, 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스 벡터는 변형 백시니아 앙카라 바이러스(Modified Vaccinia Ankara; MVA로 칭함)이다. 다른 요지로서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스, 본 발명에 따른 재조합 폭스바이러스, 및 변형된 또는 재조합 폭스바이러스를 의약으로 포함하는 본 발명에 따른 세포에 관한 것이다. 특정 구체예로서 본 발명은 암, 인플루엔자, 간염, AIDS, 이하선염, 광견병, 뇌염, 위궤양 또는 십이지장궤양, 말라리아, 수면병, 라임병, 반응성 관절염, 폐렴, 나병, 디프테리아, 칸디다증 및/또는 톡소플라스마증을 치료 또는 예방하기 위한 치료용 또는 예방용 백신으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스, 본 발명에 따른 재조합 폭스바이러스, 및 본 발명에 따른 변형된 또는 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포에 관한 것이다. 특정 구체예로서, 상기 의약은 치료용 또는 예방용 백신이다. 다른 특정 구체예로서, 상기 의약은 암을 치료하기 위한 치료용 또는 예방용 백신이다.
본 발명의 다른 구체예는 상세한 설명, 실시예 및 첨부한 특허청구범위에 의해 제공된다.
도 1은 본 발명에 따른 예시적으로 변형된 폭스바이러스 벡터의 리포터/선택 카세트를 도시한다. 상기 벡터는 리포터/선택 카세트가 삽입 부위(Deletion III)에 도입된 MVA 게놈(Gene Bank Accession # U94848; Antoine, G., Scheiflinger, F., Dorner, F. and Falkner, F.G. "The complete genomic sequence of modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxvirus", Virology 244(2), 365-396(1998))을 기초로 한다. Flank1 Del3 = MVA 게놈의 Deletion III 부위의 인접 서열 상류; Ps 프로모터 = 강한 합성 프로모터; TetO2 = 테트라시클린 오퍼레이터(TetR에 대한 결합 부위); TetR = 테트라시클린 리프레서; Flank2 Del3 = MVA 게놈의 Deletion III 부위의 인접 서열 하류.
도 2는 폭스바이러스 수용성인 숙주 세포에서 상동 재조합 과정의 개략도이다. 숙주 세포와 같은 MVA 폭스바이러스는 예컨대, 닭 배아 섬유아세포(CEF)를 포함한다. 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 이용하여 세포를 감염시킨 다음, 상동 재조합의 2개의 인접 서열(Flank 1/2 Del3) 사이에 위치하는 목적하는 유전자 물질(예컨대 LacZ)을 함유하는 플라스미드에 의해 상기 세포를 형질감염시킨다. 상동하는 인접물이 재조합되어 재조합 폭스바이러스가 생성되며, 목적하는 유전물질의 혼입과 리포터/선택 카세트의 결실을 초래한다.
도 3은 도 2에 개략적으로 도시한 바와 같은 MVA 게놈으로 유전물질의 삽입을 위해 사용된 예시적 플라스미드(vEM07; 서열번호: 1)의 지도를 제공한다. LacZ = β-갈락토시다제를 암호화하는 박테리아 유전자.
도 4는 PCR에 의해 달성된 DNAse 유전자에 테트라시클린 오퍼레이터(TetO2)가 융합되는 것을 개략적으로 도시한다.
도 5는 Ps 프로모터가 TetO2-DNAse 단편에 융합되는 것을 개략적으로 도시한다.
도 6은 재조합 MVA을 클로닝하기 위해 사용된 표준 재조합 플라스미드 vEM11의 지도를 도시한다.
도 7은 재조합 플라스미드 vEM12의 지도를 도시한다. Ps-TetO2-DNAse 카세트는 SacI 및 SpeI 제한부위를 통하여 vEMll 플라스미드에 클로닝되었다. BsdR = 블라스티시딘(Blasticidine) 내성 유전자.
도 8은 Ps 프로모터가 테트라시클린 리프레서 코딩 영역(TetR)에 융합되는 것을 개략적으로 도시한다.
도 9는 재조합 플라스미드 vEM31의 지도를 도시한다. Ps-TetR 카세트는 SacI 및 NheI 효소 제한부위를 통하여 vEM12 플라스미드에 클로닝되었다.
도 10은 MVA 복제시 유도성 DNAse 발현의 효과를 도시한다. CEF 세포는 재조합 MVA mEM07(7.5 = 7.5 프로모터), mEMO6(Ps = Ps 프로모터), mEM08(H5 = H5 프로모터)에 의해 감염되어 상이한 농도의 테트라시클린(Tet 0 = 테트라시클린 없음; Tet 25 = 25μ 테트라시클린/ml)을 함유하는 매질을 이용하여 배양하였다. 대조군으로서, CEF 세포를 MVA 벡터(MVA)를 사용하여 감염시켰다. 1세트의 샘플을 vEM12(MVA + DNase)에 의해 감염시켰다. 37℃, 5% CO2 에서 48시간 배양 한 후, 세포를 수집하고 바이러스 역가를 측정하였다. MVA 빈(empty) 벡터에 의해 감염된 CEF 세포는 테트라시클린(MVA + Tet)과 배양하였다. TCID50= 조직 배양 감염 용량 50.
도 11은 Deletion III 부위의 PCR 분석을 도시한다. MVA 게놈 중의 외래 유전자에 대한 삽입 부위(deletion 3)는 PCR을 이용하여 조사하였다.
상세한 설명
본 발명은 단일 재조합 이벤트에 의해 재조합 폭스바이러스의 생성을 허용하는 폭스바이러스로부터 유도된 변형된 벡터를 기초로 한다. 본 발명의 변형된 바이러스성 벡터는 목적하는 삽입물과의 재조합이 성공적으로 일어나면 결실될 리포터 유전자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 변형된 바이러스성 벡터는 재조합 바이러스성 벡터에서 리포터/선택 카세트의 결실 및 목적하는 이종 유전자 물질의 삽입을 동시에 행하는 단일 재조합 이벤트의 검출을 제공한다.
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 수용성 숙주 세포에서 폭스바이러스의 재생을 허용하는 충분한 유전자 정보를 함유하는 폭스바이러스의 게놈 또는 그의 일부 또는 단편을 의미한다. 본 발명에 따른 벡터는 유전자 조작된 벡터일 수 있으므로, 그것이 유도되는 폭스바이러스의 요소의 일부 또는 전부 및/또는 부가적인 유전 요소를 함유할 수 있다. 특정 구체예로서, 본 발명에 따른 벡터는 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스의 게놈 또는 그의 일부 또는 단편이다. 다른 특정 구체예로서, 본 발명에 따른 벡터는 MVA-F6(예를 들어, Lotz et al. "Partial tyrosinase-specific self tolerance by HLA-A*0201-restricted cytotoxic T lymphocytes in mice and man", Intern. J. of Cancer 2003; 108(4): 571-79), MVA575(ECACC 기탁번호 VOOl 20707), MVA-M4(Ober et al. "Immunogenicity and safety of defective vaccinia virus lister: Comparison with modified vaccinia virus Ankara", J. Virol 2002; 76(15): 7713-23), Acam3000(수탁번호 AY603355), MVA-ATCC(ATCC VR-1508), MVATGN33.1(수탁번호 EF675191), 및 MVA-I721(수탁번호 DQ983236)로 이루어진 군으로부터 선택된 MVA 바이러스의 게놈 또는 그의 일부이다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 벡터는 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브(Vaccinia virus Western Reserve)(수탁번호 NC006998), 백시니아 바이러스 Wyeth(예를 들어 Fogg et al, "Virus induced by Vaccination with multiple recombinant outer membrane proteins of intracellular and extracellular virions", J. Virol. 2004; 78(19): 10230-37), 백시니아 바이러스 리스터(수탁번호 DQ191324), NYCBH(New York City Board of Health); CDC(Centers for Disease Control and Prevention), ACIP(Immunization Practices Advisory Committee)의 백시니아(천연두) 백신 추천, Morbidity and Mortality Weekyl Report 40(R14): 1-10, 1991.), 카나리 폭스(수탁번호 005309 and AY318871), 파울폭스(수탁번호 581527), 백시니아 바이러스 코펜하겐(수탁번호 M35027) NYVAC, ALVAC, TROVAC(Paoletti et al. "Highly attenuated poxvirus vector: NYVAC, ALVAC, TROVAC", Dev. Biol. Stand. 1995, 84: 159-63)로 이루어진 군으로부터 선택된 폭스바이러스의 게놈 또는 그의 일부이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "리포터 유전자"는 용이하게 검출, 확인 또는 측정될 수 있는 세포 또는 이들을 발현하는 생물 상에 특정 특징을 부여하는 유전자를 의미한다. 리포터 유전자는 목적하는 유전자가 혼입되었는지 또는 세포 또는 생물 집단에 의해 발현되는지 여부를 결정하기 위하여 흔히 사용된다. 본 발명의 내용에서, 리포터 유전자로부터 발현 산물의 검출은 상동 재조합이 일어나지 않았고 또 상기 목적하는 유전자 삽입물이 바이러스성 벡터에 성공적으로 삽입되지 않았음을 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 원래 벡터를 포함하는 세포 및 상동 재조합이 일어난 벡터를 포함하는 세포의 분리를 허용하는 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 리포터 유전자의 비제한적인 예는 가시적으로 확인가능한 특징(예를 들어 형광 포함)을 유도할 수 있어 해파리 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 유전자, 개선된 GFP(eGFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, mRaspberry, mRFPl, mTangerine, mYFP(Tsien), J-Red, AceGFP, CopGFP, HcRed-tandem, PhiYFP(Evrogen), DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-monomer, EGFPAcGFPl, AmCyanl, AsRed2, EBFP, HcRedl, ZsYellowl(클론테크 제조), mKO, Azami-Green, mAG, Kaede, MiCy(MBL Intl.), Venus(Miyawaki), Ypet, CyPer(Dougherty), EYFP, Emerald(인비트로겐 제조), Cerulean(Priston), T-Sapphire(Griesbeck), AQ143(Lukyanov), cOFP(스트라타진 제조), eqFP611(바이덴만 제조), Renilla GFPs(다양한 제조자, 예를 들어 스트라타진 제조)를 코딩하는 유전자, 루시페라제 유전자 또는 lacZ 유전자와 같은 발광성 단백질과 FACS에 의한 분리를 가능하게 하는 리포터 유전자를 포함한다. 본 발명의 일 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 형광 코딩 유전자이다.
리포터 유전자의 다른 비제한적인 예는 특정 항체가 존재하고 또 숙주 세포 상의 표면에서 표현되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 이러한 리포터 유전자는 본 발명의 원래 벡터를 포함하는 세포와 상동 재조합이 친화성 정제에 의해, 예컨대 항체 피복된 수지 또는 상기 항체로 피복된 자성 비드에 의해 실시된 벡터를 포함하는 세포의 분리를 허용하며, 상기 항체는 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질에 특이적이다. 특정 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 세포 표면 수용체와 친화성 태그의 융합 유전자를 암호화하므로 친화성 태그가 세포 표면 상에서 표현된다. 당업자들은 다양한 치환성 태그 및 일반적으로 사용되는 상응하는 리간드를 잘 알고 있을 것이다. 다른 특정 구체예로서, 상기 유전자는 세포 표면 수용체의 융합 유전자를 암호화하며 또 상기 융합된 친화성 태그는 FLAG-태그(N-DYKDDDDK-C), 항원결정부위 태그, V5-태그, c-myc-태그, His-태그 및/또는 HA-태그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 알파바이러스 El 및 E2, 플라비바이러스 El 및 E2, 코로나바이러스 S, HE, M 및 E, 아르테리바이러스 GP, 랍도바이러스 G, 필로바이러스 GP, 파라믹소바이러스 F, HN, H 및 G, 또는 토믹소바이러스 M2, NA, HA 및 HEF, 부냐바이러스 Gn 및 Gc, 아레나바이러스 GP, 보르나바이러스 G, 레트로바이러스 Env, 헤파드나바이러스 S, M 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된 소형 바이러스성 표면 단백질을 암호화한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "선택 성분"은 선택 성분을 포함하는 숙주 세포 상에서 선택 압력을 발휘하도록 이용될 수 있는 핵산을 지칭한다. 일 구체예로서, 선택 압력은 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하거나 지연시키는 선택 유전자의 발현에 의해 표현된다. 다른 구체예로서, 선택 압력은 숙주 세포의 치사를 초래하는 선택 유전자의 발현에 의해 표현된다. 일 구체예로서, 선택 성분은 그의 발현이 유도성인 적어도 1개의 선택 유전자를 포함한다. 특정 구체예로서, 상기 발현의 유도는 조절 서열, 예컨대, 프로모터에 의해 제어된다. 또 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 선택 유전자의 발현을 조절하는 박테리아 유도성 계를 더 포함한다. 일개의 특정 구체예로서, 상기 박테리아 유도성 계는 리프레서 결합 부위에 융합된 프로모터의 제어하에 있는 선택 유전자를 특징으로 하며, 상기 선택 성분은 리프레서 결합 부위에 결합되는 리프레서를 코딩하는 유전자를 더 포함한다. 다른 특정 구체예로서, 상기 리프레서 결합 부위는 테트라시클린 리프레서 결합 부위/오퍼레이터(TetO2)이고 또 리프레서를 코딩하는 유전자는 테트라시클린 리프레서 유전자(TetR)이며, pcDNA6TR 플라스미드(인비트로겐 로부터 입수가능)로부터 단리될 수 있다. 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 선택 유전자의 발현을 조절하는 포유류 유도성 계를 더 포함한다. 특정 구체예로서, 상기 포유류 유도성 계는 RheoSwitch(뉴 잉글랜드 바이오랩스 제조) 계이다. 다른 특정 구체예로서, 상기 유도성 계는 LentiX 계(클론테크 제조), Q-mate 계(크랙켈러 사이언티픽 인코포레이티드 제조), Cumate-유도성 발현계(NRC 캐나다 제조), 및/또는 Genostat 계(업스테이트 제조)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 선택 유전자는 세포독성 유전자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성 유전자"는 발현시 숙주 세포의 손실 또는 완전한 세포자살(apoptosis)을 초래하는 유전자를 지칭하며, 숙주 세포의 상기 손실 또는 세포자살은 발현된 유전자 산물 그 자체에 의해 유발되며 또 발현된 유전자 산물과 숙주 세포의 천연 산출 성분(예를 들어 숙주세포의 DNA, RNA, 프로테오좀, 막 또는 대사물질) 사이의 직접적인 상호작용을 포함한다. 특정 구체예로서, 상기 세포독성 유전자는 DNase(예를 들어 인비트로겐으로부터 입수가능; ORF 클론 pENTR221, 클론 ID IOH23149), RNase, 프로테아제, 이온 채널, 또는 카스파제와 같은 세포자살 유도제 및/또는 ROS를 암호화한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "삽입물" 또는 "목적하는 삽입물"은 상동 재조합에 의해 본 발명의 벡터로 도입되는 핵산을 지칭한다. 일 구체예로서, 상기 삽입물은 본 발명의 벡터와 함께 상동 재조합이 일어나게 하는 인접 서열과 접하는 적어도 1개의 이종(heterologous) 유전자를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예로서, 적어도 1개의 이종 유전자는 조절 서열, 바람직하게는 프로모터의 제어하에 있다.
목적하는 삽입물의 일례는 도 2에 도시되어 있다. 여기서, 상기 삽입물은 숙주 세포를 형질감염시키기 위하여 사용된 플라스미드 벡터로 구성되며 또 2개의 인접 영역 및 lac 프로모터의 제어하에 있는 LacZ 유전자를 포함한다. 특정 구체예로서, 상기 이종 유전자는 적어도 1개의 항원, 바람직하게는 환자에서 면역반응을 유도할 수 있는 항원을 암호화한다. 특정 구체예로서, 상기 이종 유전자는 이종 바이러스의 항원, 박테리아의 항원, 원핵생물의 항원, 진균의 항원, 및/또는 헬민쓰(helminth)의 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 암호화한다. 특별한 구체예로서, 상기 이종 유전자는 인플루엔자 바이러스 A, B, C, 간염 바이러스 A, B, C, E, 인간 면역결핍 바이러스, 풍진 바이러스, 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 엡슈타인 바르 바이러스, 틱본 바이러스, 크리미안 콩고열 바이러스, 에볼라 바이러스, 니파 바이러스, 뎅기 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 엔테로바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 한타바이러스, 로타바이러스, SARS 코로나바이러스, 신생 바이러스, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)(Menigococcus), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 미코박테륨 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 속(Borrelia spp .)[회귀열, 히스파니카(hispanica), 파르케리(parkeri), 부르그도르페리(burgdorferi)], 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리케츠시아 속(Rickettsia spp .), 콕시엘라 부르네트(Coxiella burnettii), 미코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia), 코리네박테륨 디프테리아에(Corynebacterium diphteriae), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium malariae), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba hystolytica), 기아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis), 트리파노소마 부루세이(Trypanosoma brucei), 레쉬마니아 속(Leishmania spp .), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 아스페르길루스 속(Aspergillus spp .), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 부체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) 및/또는 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 항원을 암호화한다.
다른 특정 구체예로서, 상기 이종 유전자는 전염병(예를 들어 바이러스성 및 박테리아 표면 단백질) 또는 암 세포, 예컨대, 경부암, 흑색종, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 여포성 B-세포 비-호지킨스 림프종 및/또는 신장암의 세포에 대한 예방적 또는 치료적 면역반응을 유도하는 적어도 1개의 항원을 암호화한다.
본 발명의 벡터
제1 요지로서, 본 발명은 상동 재조합을 위하여 2개의 인접 서열 사이에 위치한 적어도 1개의 리포터 유전자를 포함하는 변형된 폭스바이러스 벡터에 관한 것이다. 상기 리포터 유전자는 변형된 폭스바이러스 벡터에 의해 감염된 숙주 세포에서 상동 재조합을 통하여 목적하는 삽입물로 치환될 수 있다. 따라서, 상동 재조합이 일어난 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포는 상동 재조합이 일어나지 않은 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포로부터 구별될 수 있다. 이것은 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질을 검출하는 것에 의해 달성될 수 있다. 예컨대, 상기 리포터 유전자가 GFP 또는 아자미 그린(azami green) 단백질을 암호화하면, 상동 재조합이 일어난 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포는 GFP 또는 아자미 그린 단백질을 생성하지 않을 것이며, 그 이유는 GFP 또는 아자미 그린 단백질에 대한 유전자 정보가 상동 재조합 이벤트에 의해 상기 벡터로부터 제거되고 목적하는 삽입물로 치환되었기 때문이다. 따라서, 이러한 숙주 세포는 여기(excitation)시 형광을 나타내지 않을 것이고 또 예컨대 형광 활성화된 분류법(FACS)에 의해 형광을 나타내는 세포로부터 분리될 수 있다.
일 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 프로모터, 바람직하게는 바이러스 프로모터, 더욱 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터 또는 합성 프로모터의 제어하에 있다. 다른 구체예로서, 상기 프로모터는 강한 프로모터, 바람직하게는 강한 합성 프로모터이다. 특정 구체예로서, 상기 프로모터는 다음 서열
Figure pct00001
(Sekhar Chakrabarti, Jerry R. Sisler and Bernard Moss: Compact, synthetic, Vaccinia Virus Early/Late Promoter for Proetin Expression. Biotechniques 23:1094-1097, 1997)을 갖는 Ps 프로모터이다. 다른 특정 구체예로서, 상기 프로모터는 다음 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
(Rosel JL, Earl PL, Wek JP, Moss B, "Conserved TAAATG 서열 at the transcriptional and translational initiation site of vaccinia virus late genes deduced by structural and functional analysis of the HindIII H genome fragment", J. Virol. 60(2): 236-249, 1986)을 갖는 변형된 H5 프로모터이다.
또 다른 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화한다. "빈" 벡터(즉, 재조합 이벤트가 일어나지 않은 벡터)는 리포터 유전자를 발현하므로, 이러한 벡터를 포함하는 세포는 형광을 낼 수 있다. 수용성 세포 중에서 상동 재조합은 리포터 유전자의 결실을 초래하며, 또 상기 과정은 숙주 세포에서 형광을 유발하지 않는 목적하는 삽입물을 함유하는 재조합 벡터를 초래한다. 특정 구체예로서, 상기 형광 단백질은 GFP, 향상된 GFP(eGFP), 또는 아자미 그린 단백질(MBL International Inc., Woburn, Massachusetts, USA로부터 입수가능 및 MoBiTec GmbH, Goettdngen, Germany에 의해 배급됨)이다.
다른 요지로서, 본 발명의 벡터는 상동 재조합을 위하여 2개의 인접 서열 사이에 유사하게 위치한 적어도 1개의 선택 성분을 더 포함한다. 일 구체예로서, 상기 리포터 유전자 및 선택 성분은 상동 재조합을 허용하는 1쌍 이상의 인접 서열 사이에 위치한다. 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 그의 발현이 유도성인 선택 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 선택 유전자의 발현을 조절하는 박테리아 유도성 계를 더 포함한다. 일개의 특정 구체예로서, 상기 박테리아 유도성 계는 리프레서 결합 부위에 융합되는 프로모터의 제어하에 있는 선택 유전자를 특징으로 하며, 상기 선택 성분은 리프레서 결합 부위에 결합하는 리프레서를 코딩하는 유전자를 더 포함한다. 다른 특정 구체예로서, 상기 리프레서 결합 부위는 테트라시클린 리프레서 결합 부위/오퍼레이터(TetO2)이고 또 리프레서를 코딩하는 유전자는 테트라시클린 리프레서 유전자(TetR)이며, pcDNA6TR 플라스미드(인비트로겐 로부터 입수가능)로부터 단리될 수 있다. 숙주세포의 형질감염시, 상기 리프레서는 세포에서 발현되며 선택 유전자에 대하여 상류인 선택 성분의 리프레서 결합 부위에 결합하여 선택 유전자의 발현을 억제한다. 테트라시클린이 상기 계에 부가되면, 테트라시클린 리프레서에 결합하여 즉시 DNA 상의 결합 부위로부터 떨어져서 선택 유전자의 발현을 초래한다. 따라서, 선택 유전자의 발현은 테트라시클린의 부가에 의존적이므로, 선택 유전자의 발현은 유도성으로 된다. 또 다른 구체예로서, 선택 유전자 및 리프레서를 코딩하는 유전자의 발현을 제어하는 프로모터는 바이러스 프로모터, 백시니아 바이러스 프로모터이거나 또는 가장 바람직하게는, Ps 프로모터 또는 변형된 H5 프로모터와 같은 강한 합성 프로모터이다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 발현시 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하거나 지연시키는 선택 유전자를 포함한다. 선택 유전자가 유도되면, 상동 재조합이 일어나서 리포터 유전자가 목적하는 삽입물로 치환된 본 발명의 벡터를 포함하는 바이러스의 향상된 선택을 허용한다. 따라서, 상동 재조합이 일어난 벡터를 포함하는 숙주 세포는 상동 재조합이 일어나지 않은 숙주 세포에 비하여 더욱 복제된 재조합 바이러스를 보유한다. 또한, 바이러스성 복제의 억제제가 발현되면, 바이러스성 복제의 감소을 유발하거나 또는 심지어 완전한 억제를 초래한다. 따라서, 목적하는 삽입물을 갖지 않는 게놈을 포함하는 바이러스에 비교한 목적하는 삽입물을 비롯한 게놈을 포함하는 제조된 바이러스의 비율은 현저히 전자 쪽으로 이동한다. 따라서, 퍼센트로서, 상기 계는 목적하는 삽입물을 포함하는 바이러스의 향상된 수율을 생성하도록 조작될 수 있다. 특별한 구체예로서, 상기 선택 유전자는 RNase, 이온 채널 또는, DNase(인비트로겐 로부터 입수가능; ORF 클론 pENTR221, 클론 ID IOH23149)이다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 선택 성분은 세포독성 유전자, 즉 발현시 숙주 세포의 손실 또는 완전한 세포자살을 초래하는 유전자이다. 특정 구체예로서, 상기 세포독성 유전자는 DNase, RNase, 프로테아제, 이온 채널, 또는 세포자살 유도제를 암호화한다.
본 발명에 따르면, 상기 선택 성분은 본 발명의 선택적인 구체예인데 이는 목적하는 삽입물을 포함하는 본 발명의 재조합 벡터를 갖는 숙주 세포가 선택되어 리포터 유전자 단독에 의해 단리될 수 있기 때문이다. 리포터 유전자가 재조합 벡터의 결실 및/또는 선택을 위해 필수적인 반면에, 선택 성분의 선택적 유도성 발현은 예컨대 벡터 제조의 단일 또는 다수 패시징을 위해 사용될 수 있다.
특별한 구체예로서, 상기 선택 성분은 예컨대 목적하는 삽입물을 포함하는 재조합 폭스바이러스의 생성을 현저하게 촉진할 수 있는데, 상기 삽입물을 포함하는 본 발명의 재조합 벡터를 갖지 않는 숙주 세포는 선택 성분의 유도시 적은 바이러스를 생성하거나 또는 바이러스를 전혀 생성하지 않는다(또는 전체적으로 치사시킴). 이 경우에서, 리포터 유전자 및 선택 성분을 함유하는 본 발명의 재조합 벡터는 테트라시클린에 대해 감수성인 "빈" 벡터를 발현하는 형광을 초래하고 또 테트라시클린-비감수성 재조합 벡터는 형광을 갖지 않는다. 즉, 빈 벡터를 함유하는 세포만이 형광을 나타내었으므로 비-재조합은 플라크 선택 또는 FACS 분류를 비롯한 수법에 의해 분리될 수 있다. 선택 성분의 발현이 이전에 유도되면, 상기 선택은 훨씬 개선된 방식으로 실시될 수 있는데, 이는 "빈" 벡터를 갖는 세포의 수가 분리 이전에 현저하고 유리하게 감소되기 때문이다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 인접 영역은 상동 재조합을 허용한다. 상동 재조합은 일반적으로 핵산 가닥들 사이에서 물질 교환을 초래하는, 유사 서열의 정렬, 홀리데이 정션(Holliday junction)의 형성, 및 핵산의 파열 및 수선(용출로도 공지)를 포함한다. 그러므로 상동 재조합을 허용하기에 충분히 유사한 인접 영역은 본 발명에 포함된다. 특정 구체예로서, 상기 인접 영역은 동일하다. 다른 특정 구체예로서, 상기 인접 영역은 50 내지 1000 bp의 크기를 갖고, 바람직하게는 100 내지 1000 bp의 크기를 갖는다.
특별한 구체예로서, 상기 재조합 폭스바이러스 벡터의 인접 영역은 MVA 게놈의 결실 부위의 상류 및 하류에 있는 인접 영역이다. 특정 구체예로서, 상기 인접 영역은 50 내지 1000 bp, 바람직하게는 100 내지 1000 bp의 인접 영역으로서, MVA 게놈의 상류 및 하류의 결실 부위 I, II, III, IV, V, 또는 VI(MVA 게놈 위치: Del I: 7608/7609, Del II: 20718/20719; Del III: 149341/149342; Del IV: 170480; Del V: 19754/19755; Del VI 9831/9832)이다. 서열번호: 2-7은 결실 부위 Del I-VI의 인접 영역을 각각 나타내며, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 결실 부위 주변에 집중되어 있다. 일례로서, 서열번호: 2는 2002 bp의 서열로서, MVA 게놈의 결실 부위 I 주변(위치 7608/7609)에 집중되어 있다. 따라서, 서열번호: 2의 위치 1001/1002는 MVA 게놈의 위치 7608/7609에 상응한다. 따라서, 상기 인접 영역의 일개의 특정 구체예로서 본 발명의 인접 영역은 서열번호: 2의 위치 1001의 50 내지 1000 bp 상류 및 서열번호:2의 위치 1002의 1000 bp 하류이다.
다른 특정 구체예로서, 상기 재조합 폭스바이러스 벡터의 인접 영역은 삽입 부위가 폭스바이러스의 비-코딩 영역 내에 위치되도록 선택된다. 폭스바이러스의 비-코딩 영역은 길이가 다양하며 또 약 100 내지 1000 bp 이상으로 포함될 수 있다. 이러한 비-코딩 영역의 뉴클레오티드 각각이 선택 부위로서 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 인접 영역은 50 내지 1000 bp, 바람직하게는 100 내지 1000 bp로서 비-코딩 영역 내에 위치한 선택된 삽입 부위의 상류 및 하류이다. 예컨대, 비-코딩 영역은 1000 bp의 길이이며 또 삽입 부위는 본 발명에 따른 상기 인접 영역이 위치 500으로부터 50 내지 1000 bp 상류 및 위치 501에 대하여 50 내지 1000 bp 하류일 것에 비하여 위치 500 및 501 사이에 있도록 선택될 것이다. 특정 구체예로서, 상기 비-코딩 영역은 MVA의 비-코딩 영역이다. 다른 특정 구체예로서, 상기 비-코딩 영역은 MVA(Gen Bank Accession # U94848)의 하기 유전자 사이에 있는 뉴클레오티드 서열이다: 001L-002L, 002L-003L, 005R-006L, 006L-007R, 007R-008L, 017L-018L, 018L-019L, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L- 036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-042L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047L, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052L, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 056L-057R, 061L- 062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079L, 080R-081L, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R- 104R, 105L-106R, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 137L- 138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 161R- 162R, 165R-166R, 166R-167R, 170R-173R, 173R-174R, 174R-175R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R- 188R 및/또는 188R-189R.
다른 특정 구체예로서, 상기 재조합 폭스바이러스 벡터의 인접 영역은 삽입 부위가 폭스바이러스의 비-필수 유전자 내에 위치하도록 선택된다. 어떤 유전자가 소정 폭스바이러스의 생산적 복제에 필요하지 않다면 비-필수 유전자로 간주된다. 특정 구체예로서, 상기 비-필수 유전자는 티미딘 키나제 유전자(= Tk; Scheiflinger F. et al. "Evaluation of Thymidine 키나제(tk) locus as an insertion site in the highly attenuated vaccinia MVA strain", Arch. Virol. 1996, 141(3-4): 663-9.), 헤마글루티닌 유전자(= HA; Antoine G. et al. "Characterization of the vaccinia MVA hemaglutinin gene locus and its evaluation as an insertion site for foreign gene", Gene, 1996 Oct 24; 177(1-2): 43-6), I4L 암호화된 리보뉴클레오티드 환원효소(Howley PM et al. "Vaccinia Virus transfer vector using a GUS reporter gene inserted into the I4L locus", Gene, 1996 Jun 26; 172(2): 233-7), E3L(Langland JO & Jacobs BL, "The role of the PKR-inhibitory genes, E3L and K3L, in determining vaccinia virus host range", Virology, 2002 JuI 20; 299(1): 133-41), KlL(Staib C. et al. "Recombinant MVA and method for generation thereof EP 1594970, 2005 November 16) 및 ATI 유전자(Wintersperger S. et a/. "Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes", 2002 Feb 20)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 특정 구체예로서, 상기 비-필수 유전자는 MVA으로부터 얻은 유전자이며 또 032L(리보뉴클레오티드 환원효소), 137L(기능은 알려지지 않음), 166R(구아닐레이트 키나제 단편), 170(기능은 알려지지 않음), 188R(기능은 알려지지 않음) 및 189R(기능은 알려지지 않음)로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스이다. 또 다른 구체예로서, 상기 폭스바이러스는 MVA이다.
다른 요지로서, 본 발명은 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 갖는 세포에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 수용하기 위해 수용성인 모든 세포가 포함된다. 바람직하게는, 세포는 진핵생물 세포이다. 특정 구체예로서, 세포는 포유류 또는 조류 세포이다. 특정 구체예로서, 세포는 닭 배아 섬유아세포(CEF)이다. 또 다른 구체예로서, 세포는 단리된 인간 세포이다. 다른 요지로서 본 발명은 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스 벡터의 생성에 사용되는 신규 플라스미드 및 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호: 15-23로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 또는 그의 보체이거나 또는 단편 또는 그에 대해 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 서열 동일성을 갖는 상동 핵산을 포함하며, 상기 단편은 서열번호: 15-23으로 이루어진 군으로부터 선택된 각 핵산의 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 99.9%의 길이를 갖는다.
본 발명의 방법
다른 요지로서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 생성하는 방법에 관한 것으로, 여기서 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터에 대해 수용성인 숙주 세포는 상기 벡터에 의해 형질감염되며 또 숙주 세포 내에서 벡터와 플라스미드 사이의 상동 재조합을 허용하는 조건하에서 목적하는 이종 유전자 물질을 포함하는 플라스미드에 의해 형질감염된다. 필연적으로, 변형된 폭스바이러스 벡터 및 플라스미드는 상동 재조합이 일어나게 하기에 충분히 유사한 인접 서열을 포함한다. 또한, 변형된 폭스바이러스 벡터는 리포터 유전자 및 특정 구체예로서 상기 인접 영역 사이에 상기 기재한 바와 같은 선택 성분을 포함하는 반면에, 상기 플라스미드는 상기 인접 영역 사이에 목적하는 이종 유전자 물질을 갖는다. 따라서, 변형된 폭스바이러스 벡터와 플라스미드 사이의 상동 재조합은 리포터 유전자(및 선택 성분, 존재하는 경우)를 목적하는 이종 유전자 물질로 치환하는 것을 통하여 본 발명의 재조합 벡터를 생성한다.
특정 구체예로서, 본 방법은 선택 성분을 포함하는 본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터를 이용하며, 또 숙주 세포에서 선택 유전자의 발현을 유도하는 추가의 단계를 더 포함한다. 선택 유전자 발현의 유도는 이용된 유도성 선택 성분에 따라 달라진다. 일례 및 특정 구체예로서, 선택 성분은 상기 기재한 바와 같은 박테리아 유도성 테트라시클린 리프레서 결합 부위/오퍼레이터(TetO2)의 조절 제어하에서 발현되는 DNase 단백질을 암호화하는 선택 유전자를 포함한다. 유도는 DNA 상의 결합 부위로부터 즉시 분리되는 테트라시클린 리프레서에 결합되는 테트라시클린의 부가에 의해 실시되며, 이것은 다시 바이러스 복제를 억제하는 DNase의 발현을 허용한다. 이러한 유도는 목적하는 유전자 삽입물을 포함하지 않는 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포에 비하여 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포의 바람직한 선택을 초래한다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 방법은 또한 비-재조합 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포로부터 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 분리하는 부가적인 단계를 더 포함한다. 특정 구체예로서, 이러한 분리는 발현된 리포터 유전자의 유전자 산물에 의해 실시된다. 일 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화하며 또 상기 분리는 FACS 및 부착된 세포 분류기에 의해 실시된다. 다른 구체예로서, 상기 리포터 유전자는 세포 표면 상에서 발현되고 항체가 존재하는 임의 단백질이다. 분리는 항체에 의해 자성 비드를 코팅하고 또 2개의 세포 집단을 분리하기 위하여 상기 자성 비드와 세포들을 접촉시키는 것에 의해 달성된다. 다른 구체예로서, 상기 항체는 수지에 부착되며 2개 세포 집단을 분리하기 위하여 컬럼에 사용된다.
또 다른 구체예로서, 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포는 신선한 숙주 세포 상에서 적어도 1개의 부가적 패시징에 이용된다. 따라서, 재조합 벡터를 갖는 세포의 수 및 생성된 재조합 폭스바이러스의 수는 현저히 증가한다. 특별한 구체예로서, 상기 재조합 폭스바이러스를 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 추가 패시징을 실시한다. 특정 구체예로서, 재조합 폭스바이러스의 6회의 패시징 처리를 실시한다. 또 다른 구체예로서, 상기 방법은 선택 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 또 다른 구체예로서, 상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스 또는 MVA이다.
생성된 재조합 폭스바이러스는 당업자에게 공지된 적합한 수법, 예컨대 원심분리에 의해 단리될 수 있다.
본 발명의 의약 용도
다른 요지로서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스, 본 발명에 따른 재조합 폭스바이러스, 또는 본 발명에 따른 변형된 또는 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포에 관한 것이다. 특정 구체예로서, 본 발명의 의약은 치료용 또는 예방용 백신으로 사용하기에 유리하다. 다른 구체예로서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A, B, C, 간염 바이러스 A, B, C, E, 인간 면역결핍 바이러스, 풍진 바이러스, 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 엡슈타인 바르 바이러스, 틱본 바이러스, 크리미안 콩고열 바이러스, 에볼라 바이러스, 니파 바이러스, 뎅기 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 엔테로바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 한타바이러스, 로타바이러스, SARS 코로나바이러스, 신생 바이러스, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)(Menigococcus), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 미코박테륨 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 속(Borrelia spp.)(회귀열, 히스파니카, 파르케리, 부르그도르페리), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리케츠시아 속(Rickettsia spp .), 콕시엘라 부르네트(Coxiella burnettii ), 미코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia), 코리네박테륨 디프테리아에(Corynebacterium diphteriae), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium malariae), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba hystolytica), 기아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis), 트리파노소마 부루세이(Trypanosoma brucei), 레쉬마니아 속(Leishmania spp .), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 아스페르길루스 속(Aspergillus spp .), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 부체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) 및/또는 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)로 이루어진 군으로부터 선택된 종에서 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스, 본 발명에 따른 재조합 폭스바이러스, 또는 본 발명에 따른 변형된 또는 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포에 관한 것이다. 다른 특정 구체예로서, 의약은 이들 종에 의해 유발된 질병 또는 증상을 치료하기 위해 사용된다. 특별한 구체예로서, 상기 질병은 인플루엔자, 간염, AIDS, 이하선염, 광견병, 뇌염, 위궤양 또는 십이지장궤양, 말라리아, 수면병, 라임병, 반응성 관절염, 폐렴, 나병, 디프테리아, 칸디다증 및/또는 톡소플라스마증이다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 변형된 폭스바이러스, 본 발명에 따른 재조합 폭스바이러스, 또는 본 발명에 따른 변형된 또는 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포에 관한 것이다. 특정 구체예로서, 상기 암은 경부암, 흑색종, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 여포성 B-세포 비-호지킨스 림프종 및/또는 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 의약은 백신화를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 사용된다. 본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명의 상기 재조합 폭스바이러스 또는 상기 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포는 백신화를 필요로 하는 환자에서 면역반응을 유도할 수 있는 항원을 암호화하는 적어도 1개의 유전자를 포함한다. 특정 구체예로서, 상기 항원은 이종 바이러스의 항원, 박테리아의 항원, 원핵생물의 항원, 진균의 항원, 및/또는 헬민쓰의 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특별한 구체예로서, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스 A, B, C, 간염 바이러스 A, B, C, E, 인간 면역결핍 바이러스, 풍진 바이러스, 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 엡슈타인 바르 바이러스, 틱본 바이러스, 크리미안 콩고열 바이러스, 에볼라 바이러스, 니파 바이러스, 뎅기 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 엔테로바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 한타바이러스, 로타바이러스, SARS 코로나바이러스, 신생 바이러스, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)(Menigococcus), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 미코박테륨 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 속(Borrelia spp .)(회귀열, 히스파니카, 파르케리, 부르그도르페리), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리케츠시아 속(Rickettsia spp .), 콕시엘라 부르네트(Coxiella burnettii ), 미코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia), 코리네박테륨 디프테리아에(Corynebacterium diphteriae), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium malariae), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba hystolytica), 기아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis), 트리파노소마 부루세이(Trypanosoma brucei), 레쉬마니아 속(Leishmania spp .), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 아스페르길루스 속(Aspergillus spp .), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 부체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) 및/또는 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 항원이다. 다른 특정 구체예로서, 상기 항원은 암 세포에 의해 발현된 단백질이다. 다른 특정 구체예로서, 상기 항원은 암 세포의 표면 상에서 발현되고 표시되는 단백질이다.
다른 특정 구체예로서, 본 발명의 재조합 폭스바이러스, 또는 상기 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포는 암세포에 의해 발현된 항원을 포함한다. 암세포에 의해 발현된 이러한 항원의 예는 비제한적으로 알파-태아단백질(AFP); 전립선 특이적 항원(PSA); 암배아성 항원(CEA); 디시알로실 LEA 항원; Melan-A/MART-1; SART3; 다약제 내성-관련된 단백질 3(MRP3); 제스테 상동체 2(EZH2)의 폴리콤브 그룹 단백질 향상제; ALDHl; Her-2; 넥틴-4; gp96 열충격 단백질; gplOO; 티로시나제; GM2; MAGE-A3; 및 NY-ESO-I를 포함한다. 또 다른 구체예로서 본 발명의 상기 재조합 폭스바이러스 또는 상기 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포는 항체를 암호화하는 유전자를 포함한다. 특정 구체예로서, 이러한 항체는 종양 세포 상에서 발현된 세포 마커에 대해 특이적이다.
본 발명의 의약은 당업자에게 공지된 방법에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예로서, 의약은 주사에 의해 투여된다.
실시예
본 발명의 변형된 폭스바이러스 벡터의 효능을 평가하기 위하여, 몇 개의 기본적인 MVA 벡터를 창제하였다. 이들 MVA 벡터는 강한 백시니아 바이러스 프로모터 제어하의 형광 코딩 리포터 유전자, 및 강한 백시니아 바이러스 프로모터와 테트라시클린 오퍼레이터(TetO2) 요소 제어하의 DNase 선택 유전자를 포함하는 선택 성분, 및 상이한 프로모터 제어하의 테트라시클린 리프레서(TetR) 코딩 유전자를 함유한다.
도 1에 도시한 바와 같이, 기본적 MVA 게놈은 리포터 유전자/선택 성분 카세트를 MVA 게놈의 삽입 부위(Deletion III 또는 Del3)에 도입하는 것에 의해 변형되었다: Deletion III(Flankl Del3) 리포터 유전자의 상류 인접 영역 근처에, 예컨대, 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 강한 합성 백시니아 바이러스 프로모터(Ps) 제어하에서 리포터 계로서 삽입하였다. 이 리포터, 예컨대, GFP는 카세트 삽입물을 함유하는 MVA의 검출을 적절하게 허용한다. 리포터 유전자의 하류(Flank2 Del3 근처)에 선택 성분을 게놈에 삽입하였다. 이것은 예컨대 리프레서(TetR)와 상호작용하는 박테리아 오퍼레이터 요소(TetO2)에 의해 제어되는 강한 합성 백시니아 바이러스 프로모터(Ps) 제어하의 DNase 유전자로 구성된다. 상기 리프레서 상호작용은 테트라시클린에 의해 제어된다. 테트라시클린 부재시, TetR는 TetO2 제어 서열에 결합하여 DNase 유전자의 발현을 억제한다. 그러나, 테트라시클린의 존재하에서는, TetR은 TetO2 부위로부터 방출되어 DNase 유전자의 발현을 허용한다. 발현된 DNase 단백질은 감염된 세포의 세포질 중에서 바이러스성 DNA의 증폭을 억제한다.
목적하는 이종 유전자 물질을 포함하는 재조합 MVA의 단리를 위하여, 리포터 유전자/선택 성분 카세트를 상동 재조합에 의해 결실시킨다. 이어, 생성한 바이러스를 테트라시클린 존재하에서 패시징시킨다. 비-재조합 변형된 MVA를 포함하는 세포는 형광에 의해 검출될 수 있고, 또 DNase 발현은 MVA의 생장을 억제한다. 재조합 MVA를 포함하는 세포는 리포터 유전자/선택 성분 카세트를 결여하고 있으므로, 형광을 나타내지 않으며, 또 이들의 MVA 생장은 억제되지 않는데 이는 DNase 발현이 생기지 않기 때문이다. 재조합 및 비-재조합 MVA의 단리는 형광생성 및 비-형광생성 세포를 분리하는 것에 의해 실시될 수 있다.
목적하는 이종 유전자 물질을 변형된 MVA 벡터에 삽입하기 위한 셔틀(shuttle)로서 MVA Deletion III의 인접서열을 함유하는 박테리아 플라스미드(도 2 및 도 3)가 사용된다. 상기 플라스미드는 복수의 단일 커터(cutter) 제한 부위와 인접한 LacZ 발현 카세트를 더 포함한다. 변형된 MVA 벡터에 삽입될 목적하는 이종 유전자 물질은 1 이상의 단일 커터 제한부위에 의해 박테리아 벡터 vEM07(서열번호: 1)에 클로닝된다. LacZ 유전자를 결실시키고 또 목적하는 이종 유전자 물질을 함유하는 플라스미드는 X-Gal을 사용한 청백 선택(blue white selection)에 의해 검출될 수 있다. 생성한 플라스미드는 변형된 MVA 벡터 내에 목적하는 이종 유전자 물질을 상동 재조합에 의해 삽입하기 위해 사용된다.
실시예 1: 변형된 MVA 벡터 선택 성분의 클로닝
리포터 유전자/선택 성분 카세트는 상동 재조합에 의해 MVA 게놈에 삽입하였다. 이를 위하여, (i) 리포터 유전자, (ii) Ps-TetO2-DNAse, 및 (iii) TetR의 단일 성분들을 박테리아 플라스미드에 순서대로 클로닝하였다.
DNAse 유전자의 클로닝
DNase 단편(SpeI-Ps-TetO2-DNAse-SacI)은 2단계 PCR 공정을 통하여 합성하였고 또 벡터 vEM11(SpeI/SacI)(서열번호: 15)에 클로닝하여, vEM12(서열번호: 16)를 얻었다.
제1 PCR 단계를 위하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
1) oEM167: TetO2-DNAse start; TCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTG ATAGAGATATGAGGGGCATGAAGCTGCTG(서열번호: 8)
2) oEM168: DNase end - SacI; GAGCTCCTACTTCAGCATCACC(서열번호: 9)
이 PCR 공정에 대한 주형은 인간 DNase 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유하는 플라스미드 pENTR-DNAse(인비트로겐 ORF 클론 콜렉션, 클론 ID IOH23149)이었다. 상기 제1 PCR 단계는 도 4에 도시한 단편을 초래하였다.
PCR의 제2 단계를 위해, 제1 PCR 단계의 정제된 PCR 산물 및 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
1) oEM169: SpeI-Ps-TetO2; GACTAGTAAAAATTGAAATITTATTTTTTTTTTTTGG AATATAAATATCCCTATCAGTGATAGAG(서열번호: 10)
2) oEM168: DNase end - SacI; GAGCTCCTACTTCAGCATCACC(서열번호: 9)
이 제2 PCR 단계는 도 5에 도시한 단편을 초래하였다.
생성한 단편은 Spel 및 SacI 제한부위 사용을 통하여 재조합 벡터 vEM11(도 6)에 클로닝하였다. 이 클로닝 단계는 벡터 vEM12(도 7)를 초래하였다.
TetR 의 클로닝
다음 클로닝 단계 동안, TetR 코딩 영역을 벡터 vEM12에 삽입하였다. 발현된 TetR의 양은 중요한 실험 변수인데, 이는 세포에 존재하는 모든 TetO2 서열을 커버하도록 충분히 발현(약 200 카피/세포)되어야 하기 때문이지만, 과량으로 발현되지는 않아야 하는데, 왜냐하면 DNase의 발현을 유도하기 위하여 테트라시클린의 발현을 필요로하기 때문이다. 그러므로, TetR 발현은 3개의 상이한 프로모터: Ps(강한 발현), H5(중간 발현) 및 p7.5(낮은 발현)의 제어하에서 평가하였다.
Ps 프로모터를 사용한 TetR 의 클로닝
Ps - 테트라시클린 리프레서(TetR) 카세트는 PCR에 의해 합성하였다. 주형은 pcDNA6/TR 플라스미드(인비트로겐 제조)이었고, 또 하기 올리고뉴클레오티드가 Ps 프로모터의 융합 및 증폭에 사용되었다:
1) oEM163: SacI-Ps-TetR start; GGGAGCTCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTT TGGAATATAAATAATGTCTAGATTAGATAAAAG(서열번호: 11)
2) oEM164: TetR end-NheI; GCTAGCTTAATAAGATCTGAATTCC(서열번호: 12)
생성한 PCR 단편(도 8)은 SacI 및 NheI를 사용하여 벡터 vEM12에 클로닝되었다. 이 클로닝 단계는 벡터 vEM31, 서열번호: 17(도 9)을 초래하였다.
p7 .5/ H5 프로모터를 사용한 TetR 의 클로닝
p7.5 및 H5 프로모터는 플라스미드 pVTVO6(서열번호: 18) 및 pVIV07(서열번호: 19)에 존재하며, 또 TetR은 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR에 의하여 이들 벡터에 삽입되도록 증폭되었다:
1) oEM165: XhoI-TetR start; CTCGAGATGTCTAGATTAGATAAAAG(서열번호: 13)
2) 0EM166: TetR end-ApaI; CCGGGCCCTTAATAAGATCTGAATTCC(서열번호: 14)
TetR 코딩 영역을 프로모터에 적합하게 융합시키기 위하여, PCR 단편은 벡터 pVIVO6(p7.5) 및 벡터 pVIV07(H5) 중의 ApaI 및 XhoI를 통하여 클로닝하였다.
TetR를 pVIVO6에 클로닝하여 벡터 pEM12(7.5)(서열번호:20)를 얻었고, 또 pVIV07에 클로닝하여 벡터 pEM13(HS)(서열번호: 21)을 얻었다. TetR 발현 카세트를 SacI 및 ApaI를 사용하여 추출한 다음 vEM12에 클로닝하였다. 그에 의해 벡터 vEM32(7.5)(서열번호: 22) 및 벡터 vEM33(HS)(서열번호: 23)을 초래하며, 이들은 TetR 유전자를 발현하기 위해 사용된 프로모터를 제외하고는 벡터 vEM31(도 9)과 동일하였다.
실시예 2: 변형된 MVA 벡터의 클로닝
vEM31, 32 및 33을 사용하여 변형된 MVA 벡터를 창제하였다. 이를 위하여, CEF 세포를 MVA(moi 0.05)에 의해 감염시킨 다음 vEM31, 32 또는 33에 의해 개별적으로 형질감염시켰다. 감염된 CEF 세포에 의해 방출된 MVA 입자는 신선한 CEF 세포 및 선택 조건(예를 들어 블라스티시딘 함유 배지; 5 ㎍/ml)하에서 3회 더 처리하며, 이는 재조합 MVA(즉, 변형된 MVA 벡터)를 함유하는 세포가 상기 항생물질에 내성이기 때문이다. 재조합 MVA 입자는 FACS 장치(형광 활성화 세포 분류기)를 이용하여 플라크 정제에 의해 정제하였다.
vEM31(mEM06, Ps-TetR), vEM32(mEM07, 7.5-TetR) and vEM33(mEM08, H5-TetR)을 사용하여 MVA의 재조합에 의해 생성한 변형된 MVA 벡터의 증폭과 특징화 후에, 테트라시클린/DNase 계를 시험에 사용하였다.
실시예 3: 테트라시클린/ DNAse 계의 평가
유도성 역(reverse) 선택 계를 시험하기 위하여, 세포들을 변형된 MVA 바이러스 mEMO06, 07 및 08에 의해 개별적으로 감염시키고 또 테트라시클린-함유 배지에서 배양하였다. 상이한 농도의 테트라시클린을 분석에 사용하였다(0-500 ㎍/ml).
비변형 MVA의 복제에 대한 유도성 DNAse 발현의 영향을 평가하기 위하여, MVA-감염 세포를(vEM12)에 의해 형질감염시켜 DNAse의 일시적 발현을 용이하게 하였다. 또한, 비변형 MVA에 대한 테트라시클린의 영향은 MVA-감염 세포를 테트라시클린 만을 사용하여 배양하는 것에 의해 분석하였다. 부가적으로, 세포의 생장 및 상태에 대한 테트라시클린의 영향을 모니터링하기 위하여, MVA 감염 및 미감염 CEF 세포를 변형된 바이러스 벡터의 시험에 사용된 것과 동일한 테트라시클린 농도와 함께 배양하였다.
간단히 말해, CEF 세포는 변형된 MVA 바이러스 mEM07(7.5 = 7.5 프로모터), mEM06(Ps = Ps 프로모터), mEM08(H5 = H5 프로모터)에 의해 감염되었고 또 상이한 농도의 테트라시클린(Tet 0 = 테트라시클린 없음; Tet 25 = 25 ㎍ 테트라시클린/ml)을 함유하는 배지와 함께 배양하였다. 대조를 위하여, CEF 세포를 비변형 MVA 빈 벡터(MVA)에 의해 감염시키고, 또 일부 MVA 감염 세포는 vEM12(MVA + DNase)에 의해 형질감염시켰다. 비변형 MVA 빈 벡터에 의해 감염된 CEF 세포는 테트라시클린(MVA + Tet)와 배양하였다. 37℃(5% CO2)에서 48시간 배양한 후, 세포를 수집하고 또 바이러스 역가를 측정하였다. 도 10은 얻어진 결과의 요약을 제공한다.
비변형 MVA 대조군(도 10, MVA)은 8.75E+06 TCID50의 역가를 초래하였다. 따라서, 이것은 이들 조건하에서 어떠한 억제 물질의 존재없이 비변형 MVA에 의한 감염에 의해 달성될 수 있는 역가이다. DNase의 발현은 역가를 2 로그 스케일(도 10, MVA + DNase, 6.56E+04 TCID50/ml) 정도로 감소시켰다. 그러나, MVA 감염은 1.00 E+05 TCID50/ml의 비변형 MVA의 접정에 의해 달성되었기 때문에, 이 처리는 바이러스 양에서 증가를 초래하지 않았고(즉, 생산적 복제 없음), 따라서 DNase 발현은 바이러스성 복제를 효과적으로 억제한다.
비변형 MVA에 의해 감염되고 또 테트라시클린에 의해 배양된 세포는 테트라시클린 자체는 세포독성 효과로 인하여 MVA 복제에 영향을 주는 것으로 나타났다. 25 - 50 ㎍ 테트라시클린/ml이 사용되면, MVA 복제에 대한 검출가능한 효과가 없었던 반면에, lOO ㎍/ml의 농도를 사용하면 MVA 복제를 1 로그 정도 감소시켰다; 또한 250 ㎍/ml의 농도는 일시적으로 발현된 DNase(도 10, MVA + Tet)의 관찰된 효과에 필적하는 바이러스성 복제를 억제하였다. 변형된 MVA 벡터 mEM06 및 mEM08에 의해 감염된 세포를 75 ㎍/ml 테트라시클린에 의해 처리하면 유도된 DNase 발현(도 10, mEM06 and mEM08)을 통하여 감소된 바이러스성 복제를 초래하였고, 또 이것은 직접적으로 테트라시클린에만 기인한 것이 아닌데, 이는 바이러스성 역가가 더욱 더 현저하게 감소되었기 때문이다. 100 ㎍ 테트라시클린/ml을 사용하여도 이와 같은 동일한 효과가 관찰될 수 있다. 150 ㎍/ml 농도는 테트라시클린의 현저한 세포 독성 효과를 초래하므로 변형된 MVA 바이러스는 전혀 복제되지 않는다. 따라서, 더 시험하기 위하여, 75 내지 100 ㎍ 테트라시클린/ml의 좁은 농도 윈도우를 사용하였다. 변형된 MVA 벡터 mEM07은 TetR을 반현하며, 약한 p7.5 프로모터는 분명히 정량적인 양으로 DNase 발현을 억제하기에 불충분한 양의 TetR를 생성하였다. 따라서, 바이러스성 복제는 모든 실험에서 현저하게 감소되었고, 또 바이러스 자체는 단일 재조합 벡터를 사용하여 재조합 바이러스를 클로닝하기 위한 기본적인 바이러스로서 적용할 수 없다.
실시예 4: 단일 재조합 계를 사용한 재조합 폭스바이러스 벡터의 클로닝
변형된 MVA 바이러스 mEM06 및 mEM08은 유사한 복제 패턴을 나타내기 때문에, mEM06을 사용하여 부가적인 실험을 실시하였다.
세포를 변형된 MVA 바이러스 mEM06으로 감염시키고 또 vEM07(도 3)에 의해 형질감염시켰다. 상동 재조합으로 인하여, lacZ 유전자를 선택 변형된 MVA 바이러스 게놈에 삽입하고 또 리포터/선택 카세트를 결실시켰다. 방출된 바이러스 입자는 테트라시클린(100 ㎍/ml)를 함유하는 배지 중의 새로운 CEF 세포 상에서 패시징시킨 다음 선택 조건없이 일련의 희석에 의해 통과시켰다. 감염된 세포는 FACS에 의해 분류하여 비-형광 세포를 선택하였다. 분류 공정에 대한 세팅이 최적화되면, 분류된 세포를 균질화하고 또 CEF 세포 상에서 패시징시켰다. 감염된 세포를 분류하고 또 바이러스를 새로운 CEF 세포 상에서 1회 더 증폭하였다. 상기 세포들은 분명히 감염되었고 또 형광을 나타내지 않았으며, 이는 이들이 정제된 재조합 MVA 바이러스를 함유함을 의미한다. 재조합 바이러스 순도는 변형된 MVA 벡터(도 11)의 삽입 부위를 증폭한 PCR 과정에 의해 확인하였다. PCR은 변형된 MVA 벡터에 대해 3.0 kb 시그널을 생성하였고 상동 재조합에 의해 리포터/선택 카세트가 치환된 LacZ를 함유하는 재조합 MVA에 대해서는 더 작은 0.76 kb 단편이 생성되었다.
상기 재조합 MVA 바이러스 샘플은 0.76 kb(도 11, rec MVA)에서 분명한 시그널을 제공하지만, 변형된 MVA(mEMO06) 또는 비변형된 MVA(MVA)에 대해서는 어떠한 시그널도 제공하지 않았다. 재조합 벡터 vEM07은 또한 0.76 kb(도 11, vEM07)의 예상된 시그널을 생성하였다. 결실 부위 내에 선택/리포터 카세트를 함유하는 변형된 MVA를 대조군으로 사용하였고, 이것은 3.0 kb(mEM06)의 예상된 시그널을 나타내었다. 비변형 MVA 벡터는 또한 약 200 염기상(MVA)의 예상된 시그널을 초래하였다.
본 발명의 계에 의해 달성된 강인한 결과를 확인하기 위하여, 상기 기재된 과정을 이용하여 클로닝 공정을 반복하였다. 재조합 MVA는 상기 기재된 단일 재조합 계를 사용하여 용이하게 단리하였다.
실시예 5: 단일 재조합 계를 사용한 다른 재조합 폭스바이러스 벡터의 클로닝
상동 재조합을 허용하는 1쌍의 인접 서열 사이에 위치한 리포터 유전자를 포함하는 변형된 폭스바이러스 벡터를 사용하여 본 발명에 따른 단일 재조합 계를 사용하여 재조합 폭스바이러스를 클로닝하였다.
세포를 변형 MVA 바이러스에 의해 감염시킨 다음 vEM07(도 3)에 의해 형질감염시켰다. 상동 재조합으로 인하여, LacZ 유전자를 선택 변형된 MVA 바이러스 게놈에 삽입하고 그에 따라 리포터 카세트를 결실시켰다. 방출된 바이러스 입자는 테트라시클린(100 ㎍/ml)을 함유하는 배지에서 새로운 CEF 세포 상에서 적어도 1회 패시징시켰다.
감염된 세포는 FACS를 사용하여 분류하여 상기 기재한 바와 같은 비-형광 세포를 선택하였다. 감염된 세포를 분류한 후, 신선한 CEF 세포 상에서 1회 더 바이러스를 증폭시켰다.
재조합 바이러스 순도는 변형된 MVA 벡터(도 11)의 삽입 부위를 증폭한 PCR 과정에 의해 확인하였다. 상기 PCR은 상동 재조합에 의해 리포터 카세트를 교체한 LacZ를 함유하는 재조합 MVA에 대한 단편을 생성하였다.
SEQUENCE LISTING <110> EMERGENT PRODUCT DEVELOPMENT GERMANY GMBH LEYRER, Sonja MAYER, Katja <120> SINGLE RECOMBINATION SYSTEM AND METHODS OF USE <130> 145-009P <150> EP 08022296.1 <151> 2008-12-22 <150> US 61/139,991 <151> 2008-12-22 <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4335 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombination vector vEM07 <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaccac tatttagttg gtggtcgcca tggatggtgt 360 tattgtatac tgtctaaacg cgttagtaaa acatggcgag gaaataaatc atataaaaaa 420 tgatttcatg attaaaccat gttgtgaaaa agtcaagaac gttcacattg gcggacaatc 480 taaaaacaat acagtgattg cagatttgcc atatatggat aatgcggtat ccgatgtatg 540 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caattcactg tataaaaaga atgtatcaag aatatccaga tttgctaatt tgataaagat 600 agatgacgat gacaagactc ctactggtgt atataattat tttaaaccta aagatgccat 660 tcctgttatt atatccatag gaaaggatag agatgtttgt gaactattaa tctcatctga 720 taaagcgtgt gcgtgtatag agttaaattc atataaagta gccattcttc ccatggatgt 780 ttcctttttt accaaaggaa atgcatcatt gattattctc ctgtttgatt tctctatcga 840 tgcggcacct ctcttaagaa gtgtaaccga taataatgtt attatatcta gacaccagcg 900 tctacatgac gagcttccga gttccaattg gttcaagttt tacataagta taaagtccga 960 ctattgttct atattatata tggttgttga tggatctgtg atgcatgcaa tagctgataa 1020 tagaacttac gcaaatatta gcaaaaatat attagacaat actacaatta acgatgagtg 1080 tagatgctgt tattttgaac cacagattag gattcttgat agagatgaga tgctcaatgg 1140 atcatcgtgt gatatgaaca gacattgtat tatgatgaat ttacctgatg taggcgaatt 1200 tggatctagt atgttgggga aatatgaacc tgacatgatt aagattgctc tttcggtggc 1260 tggcacatcg gtggcggccg cttacttggc ctgactcggc agcatagaat agcgagcaac 1320 ggcattctca tagagcttga ccttgttgta atctttgtca tgcttcaaaa tctcaatgcg 1380 gtggtccaca 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gctgggcact gctgctgctg cggcagctgg caacctgact tgtatcgtcg 2280 cgatcggaaa tgagaacagg ggcatcttga gcccctgcgg acggtgccga caggtgcttc 2340 tcgatctgca tcctgggatc aaagccatag tgaaggacag tgatggacag ccgacggcag 2400 ttgggattcg tgaattgctg ccctctggtt atgtgtggga gggctaaact agtaaaaatt 2460 gaaattttat tttttttttt tggaatataa atatccctat cagtgataga gatctcccta 2520 tcagtgatag agatatgagg ggcatgaagc tgctgggggc gctgctggca ctggcggccc 2580 tactgcaggg ggccgtgtcc ctgaagatcg cagccttcaa catccagaca tttggggaga 2640 ccaagatgtc caatgccacc ctcgtcagct acattgtgca gatcctgagc cgctatgaca 2700 tcgccctggt ccaggaggtc agagacagcc acctgactgc cgtggggaag ctgctggaca 2760 acctcaatca ggatgcacca gacacctatc actacgtggt cagtgagcca ctgggacgga 2820 acagctataa ggagcgctac ctgttcgtgt acaggcctga ccaggtgtct gcggtggaca 2880 gctactacta cgatgatggc tgcgagccct gcgggaacga caccttcaac cgagagccag 2940 ccattgtcag gttcttctcc cggttcacag aggtcaggga gtttgccatt gttcccctgc 3000 atgcggcccc gggggacgca gtagccgaga tcgacgctct ctatgacgtc tacctggatg 3060 tccaagagaa atggggcttg gaggacgtca tgttgatggg cgacttcaat gcgggctgca 3120 gctatgtgag accctcccag tggtcatcca tccgcctgtg gacaagcccc accttccagt 3180 ggctgatccc cgacagcgct gacaccacag ctacacccac gcactgtgcc tatgacagga 3240 tcgtggttgc agggatgctg ctccgaggcg ccgttgttcc cgactcggct cttcccttta 3300 acttccaggc tgcctatggc ctgagtgacc aactggccca agccatcagt gaccactatc 3360 cagtggaggt gatgctgaag taggagctcc accgcggtgg cggccgctct agaataaata 3420 ataaatacaa taattaattt ctcgtaaaag tagaaaatat attctaattt attgcaggat 3480 cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc ttatcgatac cgtcgacccg agatgtctag 3540 attagataaa agtaaagtga ttaacagcgc attagagctg cttaatgagg tcggaatcga 3600 aggtttaaca acccgtaaac tcgcccagaa gctaggtgta gagcagccta cattgtattg 3660 gcatgtaaaa aataagcggg ctttgctcga cgccttagcc attgagatgt tagataggca 3720 ccatactcac ttttgccctt tagaagggga aagctggcaa gattttttac gtaataacgc 3780 taaaagtttt agatgtgctt tactaagtca tcgcgatgga gcaaaagtac atttaggtac 3840 acggcctaca gaaaaacagt atgaaactct cgaaaatcaa ttagcctttt tatgccaaca 3900 aggtttttca ctagagaatg cattatatgc actcagcgct gtggggcatt ttactttagg 3960 ttgcgtattg gaagatcaag agcatcaagt cgctaaagaa gaaagggaaa cacctactac 4020 tgatagtatg ccgccattat tacgacaagc tatcgaatta tttgatcacc aaggtgcaga 4080 gccagccttc ttattcggcc ttgaattgat catatgcgga ttagaaaaac aacttaaatg 4140 tgaaagtggg tccgcgtaca gcggatcccg ggaattcaga tcttattaag ggcccggaaa 4200 gttttatagg tagttgatag aacaaaatac ataattttgt aaaaataaat cactttttat 4260 actaatatga cacgattacc aatacttttg ttactaatat cattagtata cgctacacct 4320 tttcctcaga catctaaaaa aataggtgat gatgcaactt tatcatgtaa tcgaaataat 4380 acaaatgact acgttgttat gagtgcttgg tataaggagc ccaattccat tattctttta 4440 gctgctaaaa gcgacgtctt gtattttgat aattatacca aggataaaat atcttacgac 4500 tctccatacg atgatctagt tacaactatc acaattaaat cattgactgc tagagatgcc 4560 ggtacttatg tatgtgcatt ctttatgaca tcgcctacaa atgacactga taaagtagat 4620 tatgaagaat actccacaga gttgattgta aatacagata gtgaatcgac tatagacata 4680 atactatctg gatctacaca ttcaccggaa actagggctt cctcgctcac tgactcgctg 4740 cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 4800 tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 4860 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 4920 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 4980 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 5040 ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 5100 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 5160 gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 5220 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 5280 ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 5340 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 5400 tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 5460 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 5520 tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 5580 tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 5640 tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 5700 cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 5760 ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 5820 tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 5880 gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 5940 agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 6000 atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 6060 tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 6120 gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 6180 agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 6240 cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 6300 ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 6360 ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 6420 actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 6480 ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 6540 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 6600 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 6640 <210> 23 <211> 6624 <212> DNA <213> artificial <220> <223> vector vEM33 (H5) <220> <221> misc_feature <222> (338)..(1263) <223> Fliank1 Del3 <220> <221> gene <222> (1283)..(1962) <223> Azami green <220> <221> misc_feature <222> (2002)..(1963) <223> Ps <220> <221> misc_feature <222> (2009)..(2048) <223> Ps <220> <221> gene <222> (2049)..(2447) <223> BsdR <220> <221> promoter <222> (2454)..(2493) <223> Ps promoter <220> <221> misc_feature <222> (2494)..(2534) <223> TetO2 <220> <221> gene <222> (2535)..(3383) <223> DNAse <220> <221> promoter <222> (3414)..(3483) <223> H5 promoter <220> <221> gene <222> (3517)..(4173) <223> TetR <220> <221> misc_feature <222> (4180)..(4690) <223> Flank2 Del3 <220> <221> gene <222> (5639)..(6496) <223> AmpR <400> 23 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaccac tatttagttg gtggtcgcca tggatggtgt 360 tattgtatac tgtctaaacg cgttagtaaa acatggcgag gaaataaatc atataaaaaa 420 tgatttcatg attaaaccat gttgtgaaaa agtcaagaac gttcacattg gcggacaatc 480 taaaaacaat acagtgattg cagatttgcc atatatggat aatgcggtat ccgatgtatg 540 caattcactg tataaaaaga atgtatcaag aatatccaga tttgctaatt tgataaagat 600 agatgacgat gacaagactc ctactggtgt atataattat tttaaaccta aagatgccat 660 tcctgttatt atatccatag gaaaggatag agatgtttgt gaactattaa tctcatctga 720 taaagcgtgt gcgtgtatag agttaaattc atataaagta gccattcttc ccatggatgt 780 ttcctttttt accaaaggaa atgcatcatt gattattctc ctgtttgatt tctctatcga 840 tgcggcacct ctcttaagaa gtgtaaccga taataatgtt attatatcta gacaccagcg 900 tctacatgac gagcttccga gttccaattg gttcaagttt tacataagta taaagtccga 960 ctattgttct atattatata tggttgttga tggatctgtg atgcatgcaa tagctgataa 1020 tagaacttac gcaaatatta gcaaaaatat attagacaat actacaatta acgatgagtg 1080 tagatgctgt tattttgaac cacagattag gattcttgat agagatgaga tgctcaatgg 1140 atcatcgtgt gatatgaaca gacattgtat tatgatgaat ttacctgatg taggcgaatt 1200 tggatctagt atgttgggga aatatgaacc tgacatgatt aagattgctc tttcggtggc 1260 tggcacatcg gtggcggccg cttacttggc ctgactcggc agcatagaat agcgagcaac 1320 ggcattctca tagagcttga ccttgttgta atctttgtca tgcttcaaaa tctcaatgcg 1380 gtggtccaca aagtgatagt ctggcaaacg gacatccttc tttgctttgt aagtagtttt 1440 gaaatcacat cgataatggc cacctccttc aagcaacaga gccatgttaa catcaccctt 1500 cagcactcca tcacgtacgt acattttctc agtggatggc tcccatttaa gagtcttctt 1560 ctgcataacc ggaccattgg gaggaaagtt cacaccatca aaacgaatgt catagaaaaa 1620 acagtcgccc ctcatgctta tgttgcttgt ggcggtgcaa atgccctggt cttcataagt 1680 catgcttctt tcccagtgat acccctcagg aaaagtctgc ttgaaatagt cctgaatatc 1740 tgctgggtac ttggtgaatg ccctgttgcc gtactggaac actgttgtca agatatcgta 1800 agcgaaaggc agaggtgcgc cttcagtgac gttcaggtct aaaatctgcg ttccctcgta 1860 aggatttcct tttccttctc cttcaatcac gaaattatgc ccgtttacag tgcctctcat 1920 acacagcttg atcttcatct ctggtttaat cacactcacc attatttata ttccaaaaaa 1980 aaaaaataaa atttcaattt ttgccggcaa aaattgaaat tttatttttt ttttttggaa 2040 tataaataat ggccaagcct ttgtctcaag aagaatccac cctcattgaa agagcaacgg 2100 ctacaatcaa cagcatcccc atctctgaag actacagcgt cgccagcgca gctctctcta 2160 gcgacggccg catcttcact ggtgtcaatg tatatcattt tactggggga ccttgtgcag 2220 aactcgtggt gctgggcact gctgctgctg cggcagctgg caacctgact tgtatcgtcg 2280 cgatcggaaa tgagaacagg ggcatcttga gcccctgcgg acggtgccga caggtgcttc 2340 tcgatctgca tcctgggatc aaagccatag tgaaggacag tgatggacag ccgacggcag 2400 ttgggattcg tgaattgctg ccctctggtt atgtgtggga gggctaaact agtaaaaatt 2460 gaaattttat tttttttttt tggaatataa atatccctat cagtgataga gatctcccta 2520 tcagtgatag agatatgagg ggcatgaagc tgctgggggc gctgctggca ctggcggccc 2580 tactgcaggg ggccgtgtcc ctgaagatcg cagccttcaa catccagaca tttggggaga 2640 ccaagatgtc caatgccacc ctcgtcagct acattgtgca gatcctgagc cgctatgaca 2700 tcgccctggt ccaggaggtc agagacagcc acctgactgc cgtggggaag ctgctggaca 2760 acctcaatca ggatgcacca gacacctatc actacgtggt cagtgagcca ctgggacgga 2820 acagctataa ggagcgctac ctgttcgtgt acaggcctga ccaggtgtct gcggtggaca 2880 gctactacta cgatgatggc tgcgagccct gcgggaacga caccttcaac cgagagccag 2940 ccattgtcag gttcttctcc cggttcacag aggtcaggga gtttgccatt gttcccctgc 3000 atgcggcccc gggggacgca gtagccgaga tcgacgctct ctatgacgtc tacctggatg 3060 tccaagagaa atggggcttg gaggacgtca tgttgatggg cgacttcaat gcgggctgca 3120 gctatgtgag accctcccag tggtcatcca tccgcctgtg gacaagcccc accttccagt 3180 ggctgatccc cgacagcgct gacaccacag ctacacccac gcactgtgcc tatgacagga 3240 tcgtggttgc agggatgctg ctccgaggcg ccgttgttcc cgactcggct cttcccttta 3300 acttccaggc tgcctatggc ctgagtgacc aactggccca agccatcagt gaccactatc 3360 cagtggaggt 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atacataatt ttgtaaaaat aaatcacttt ttatactaat atgacacgat 4260 taccaatact tttgttacta atatcattag tatacgctac accttttcct cagacatcta 4320 aaaaaatagg tgatgatgca actttatcat gtaatcgaaa taatacaaat gactacgttg 4380 ttatgagtgc ttggtataag gagcccaatt ccattattct tttagctgct aaaagcgacg 4440 tcttgtattt tgataattat accaaggata aaatatctta cgactctcca tacgatgatc 4500 tagttacaac tatcacaatt aaatcattga ctgctagaga tgccggtact tatgtatgtg 4560 cattctttat gacatcgcct acaaatgaca ctgataaagt agattatgaa gaatactcca 4620 cagagttgat tgtaaataca gatagtgaat cgactataga cataatacta tctggatcta 4680 cacattcacc ggaaactagg gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 4740 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 4800 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 4860 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 4920 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 4980 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 5040 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 5100 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 5160 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 5220 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 5280 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 5340 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 5400 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 5460 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 5520 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 5580 aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 5640 aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 5700 cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 5760 ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 5820 cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 5880 ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 5940 ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 6000 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 6060 gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 6120 ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 6180 ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 6240 gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 6300 ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 6360 cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 6420 ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 6480 aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 6540 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 6600 gcacatttcc ccgaaaagtg ccac 6624

Claims (20)

  1. 상동 재조합을 허용하는 1쌍의 인접 서열 사이에 위치한 리포터 유전자를 포함하는 변형된 폭스바이러스 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 형광 단백질을 암호화하는 변형된 폭스바이러스 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 상동 재조합을 허용하는 1쌍의 인접 서열 사이에 위치한 적어도 1개의 선택 성분을 더 포함하는 변형된 폭스바이러스 벡터.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 선택 성분은 숙주 세포에서 폭스바이러스 복제를 억제하거나 또는 지연시키거나 또는 숙주 세포에 세포독성인 선택 유전자를 포함하는 변형된 폭스바이러스 벡터.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 리포터 유전자 및 선택 성분은 상동 재조합을 허용하는 단일 쌍의 인접 서열 사이에 위치하는 변형된 폭스바이러스 벡터.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 리포터 유전자 및 선택 성분은 상동 재조합을 허용하는 1쌍 이상의 인접 서열 사이에 위치하는 변형된 폭스바이러스 벡터.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스 또는 변형된 백시니아 앙카라 바이러스인 변형된 폭스바이러스 벡터.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  9. 재조합 폭스바이러스를 생성하기 위한 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 폭스바이러스 벡터 또는 제8항의 세포의 용도.
  10. (1) 수용성 숙주 세포를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변형된 폭스바이러스 벡터에 의해 감염시키는 단계; 및
    (2) 상기 감염된 수용성 숙주 세포를 벡터와 플라스미드 사이의 상동 재조합을 허용하는 조건하에서 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질감염시켜 재조합 폭스바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 재조합 폭스바이러스를 제조하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 선택 성분의 존재에 대하여 선택하는 것에 의해 재조합 폭스바이러스의 제조를 향상시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 목적하는 유전자를 포함하는 벡터와 상동 재조합이 일어나지 않은 변형된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 수용성 숙주 세포로부터 재조합 폭스바이러스를 포함하는 수용성 숙주 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 미감염 수용성 숙주 세포에서 미리 적어도 1개의 부가적 패시징을 하기 위해 재조합 바이러스를 포함하는 수용성 숙주 세포를 사용하는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스가 백시니아 바이러스 또는 변형된 백시니아 앙카라 바이러스인 방법.
  15. 제10항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 재조합 폭스바이러스를 포함하는 세포.
  16. 재조합 폭스바이러스를 제조하기 위한 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법 또는 제15항의 세포의 용도.
  17. 제10항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법 또는 제15항의 세포를 사용하여 제조된 재조합 폭스바이러스.
  18. 의약으로서 제1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 폭스바이러스, 제8항 또는 제15항의 세포 또는 제17항에 따른 재조합 폭스바이러스.
  19. 암, 인플루엔자, 간염, AIDS, 이하선염, 광견병, 뇌염, 위궤양 또는 십이지장궤양, 말라리아, 수면병, 라임병, 반응성 관절염, 폐렴, 나병, 디프테리아, 칸디다증 및/또는 톡소플라스마증의 치료 또는 예방을 위한 치료용 또는 예방용 백신으로서 제1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 변형된 폭스바이러스, 제8항 또는 제15항의 세포 또는 제17항에 따른 재조합 폭스바이러스.
  20. 서열번호: 15-23으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 또는 그의 보체이거나 또는 단편 또는 그에 대해 적어도 40% 서열 상동성을 갖는 상동 핵산, 상기 단편은 각 핵산의 적어도 40%의 길이를 가짐.
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