KR20210148227A - 재조합 바이러스 벡터의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 방법이 유전자 치료 기법의 실제 적용에 적합한 규모로 효과적으로 사용될 수 있게 하는, 고역가 재조합 바이러스 벡터, 보다 구체적으로 재조합 AAV 벡터의 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 방법이 유전자 치료 기법의 실제 적용에 적합한 규모로 효과적으로 사용될 수 있게 하는, 고역가 재조합 바이러스 벡터, 보다 구체적으로 재조합 AAV 벡터의 생산 방법에 관한 것이다.
유전자 전달은 후천성 및 유전성 질환의 치료를 위한 유망한 방법이다. 아데노-관련 바이러스(AAV)-기반 시스템을 포함한, 유전자 전달 목적의 많은 바이러스-기반 시스템이 기술되어 있다.
AAV는 바이러스를 유전자 요법용 벡터로서 매력적으로 만드는 특유한 특징을 가지고 있다. AAV는 광범위한 세포 유형을 감염시킨다. 그러나, 그것들은 형질전환을 하지 않으며, 어떠한 인간 질환의 병인에 연루되지 않는다. 수령체 숙주 세포에의 DNA의 도입은 일반적으로 세포의 정상적인 대사를 방해하지 않으면서 DNA의 장기 지속 및 발현을 유발한다.
AAV 입자는 3개의 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 가진 단백질성 캡시드로 구성되며, 이것은 바이러스 역 말단 반복부(ITR)가 양옆에 있는 Rep 및 Cap 유전자를 함유한 ~4.7 kb 선형 단일 가닥 DNA 게놈을 둘러싸고 있다. 개별 입자는 하나의 DNA 분자 가닥만을 포장하지만, 이것은 플러스 또는 마이너스 가닥일 수 있다. 어느 하나의 가닥을 함유한 입자는 감염성이며, 복제는 부모의(parental) 감염 단일 가닥의 듀플렉스 형태로의 전환, 및 후속 증폭에 의해 발생하며, 그것으로부터 자손 단일 가닥이 대체되고 캡시드로 포장된다.
AAV 벡터는 AAV 게놈의 내부 부분을 결실시키고 ITR 사이에 관심의 DNA 서열을 삽입함으로써 관심의 이종성 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 선택된 유전자, 안티센스 핵산 분자, 리보자임 등)을 운반하기 위해 조작될 수 있다. ITR은 관심의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 함유한 벡터 게놈의 복제 및 포장을 위해 시스 (cis)에서 필요한 유일한 서열이다. 이종성 뉴클레오타이드 서열은 또한 특정 조건 하에서 환자의 표적 세포에서 유전자 발현을 구동할 수 있는 프로모터 서열에 전형적으로 연결된다. 종결 신호, 예컨대 폴리아데닐화 부위가 보통 벡터에 포함된다.
rep 및 cap AAV 유전자 생성물은 각각 벡터 게놈의 복제 및 캡시드화를 위한 기능을 제공하며, 이것은 그것들이 트랜스 (trans) 에서 존재하기에 충분하다.
인간 유전자 질환에 대한 치료법으로서 유전자 요법의 잠재적 이익에도 불구하고, 임상에서 광범위하게 사용되는 방법에는 심각한 실제적인 제한이 있다. 이런 의미에서, 임상적으로 효과적인 용량을 생산하기 위해 대량의 rAAV 입자를 생산하는 것이 필요하다. 현재 기술을 사용하여 대다수의 입자를 생산하는 것은 대다수의 생산자 세포를 필요로 한다. 실험실 규모로는, 수천 개의 조직 배양 플라스크를 필요로 할 것이다. 상업적 규모로는, 임상 적용에 도달하기 위해서 보다 효율적이고 집중적인 생산 플랫폼이 필요하다. 생산 세포의 수 및 세포당 입자 수율 둘 다를 개선하는 이점은 상업적 생산 관점에서 매우 중요할 것이다.
따라서, 유전자 요법에 사용하기 위한 것과 같은 재조합 AAV 벡터의 개발에서, 방법이 유전자 치료 기법의 실제적인 적용에 적합한 규모로 효과적으로 사용될 수 있도록 AAV의 고역가를 달성하는 전략에 대한 필요성이 있다.
본 개시는 이들 경쟁적인 목표를 달성하기 위한 방법을 제공하며 그러한 기법이 재조합 AAV 벡터 제제의 대규모 생산에 사용될 수 있는 것을 입증한다.
본 발명의 발명자들은, 놀랍게도, 재조합 바이러스 생산, 보다 구체적으로 rAAV 생산이 반복된 트랜스펙션을 수행함으로써 상당히 개선될 수 있음을 발견하였다. 하기 실시예에서 나타나는 것과 같이, 시간에 따른 지속적인 수준의 유전자 발현은, 단일 회기의 트랜스펙션을 수반하는 종래 접근법과는 대조적으로, 반복된 회기의 트랜스펙션이 수행될 때 얻어진다.
그러므로, 제1 측면으로, 발명은 재조합 바이러스 벡터의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a) 적합한 세포 배양을 적어도 2개의 플라스미드 벡터로 공동 트랜스펙션하는 단계로, 상기 플라스미드 벡터는 이종성 뉴클레오타이드 서열 및 복제 및 포장 유전자 서열을 포함하고 있는 것인 단계;
b) 상기 세포를 바이러스 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계;
c) 단계 b)에서 생산된 바이러스 벡터를 회수하고 세포를 추가의 분할 및 성장을 허용하는 조건 하에서 세포 배양에서 유지하는 단계;
d) 단계 c)에 따른 세포를 단계 a)에 따른 플라스미드 벡터로 재-트랜스펙션하는 단계; 및
e) 단계 b) 내지 c)를 반복하는 단계를 포함한다.
나아가, 발명자들은 트랜스펙션을 위한 최적화된 플라스미드의 조합이 AAV 벡터 생산에 일반적으로 사용된 표준 플라스미드를 사용한 생산보다 더 높은 수율의 rAAV를 초래하는 것을 발견하였다. 더욱이, 하기 실시예에서 나타나는 것과 같이, 발명자들은 놀랍게도 발명에 따른 최적화된 플라스미드의 사용이 박테리아 서열의 더 낮은 역 포장(reverse packaging)을 초래하는 것을 발견하였다.
그러므로 본 발명의 추가의 측면은 재조합 AAV의 생산 방법이고 상기 방법은:
a) 적합한 세포를
i) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터;
ii) 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역, 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터, 및
iii) VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 제3 플라스미드 벡터, 여기서 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), Ad ITR 및 프로테아제 서열을 함유하지 않는 것인 제3 플라스미드 벡터
로 공동 트랜스펙션하는 단계;
b) 상기 세포를 AAV 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생산된 AAV를 회수하는 단계
를 포함한다.
발명자들은 놀랍게도 트랜스펙션에서 최적화된 플라스미드의 조합을 사용함으로써, 역 포장이 크게 감소되며 더 높은 벡터 게놈 수율이 얻어지는 것을 발견하였다.
그러므로, 또 다른 측면으로, 발명은:
a) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열; 및
b) 상기 ITR 외부에 위치하고 한 ITR에 인접한 스터퍼(stuffer) DNA 서열, 여기서 상기 스터퍼 서열은 플라스미드 골격 크기가 5 Kb를 초과하도록, 바람직하게는 7000 bp 내지 7500 bp가 되도록 4400 Kb 내지 4800 Kb의 길이를 가지는 스터퍼 DNA 서열
을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것이며,
상기 플라스미드 벡터는 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다.
추가의 측면으로, 발명은 VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함하는 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것이며, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는다.
도 1. 표준 플라스미드 세트 또는 최적화된 플라스미드 세트로의 삼중 트랜스펙션에 의해 생산된 총 vg으로 표시된 AAV9-CAG-cohSgsh의 수율.
도 2. 표준 플라스미드 세트 또는 최적화된 플라스미드 세트로의 삼중 트랜스펙션에 의해 생산된 AAV9-CAG-cohSgsh에 존재하는 박테리아 서열의 복사물.
도 3. 최적화된 플라스미드 pcohSgsh-900 단독 또는 다른 최적화된 헬퍼 플라스미드(pRepCap9-809 및 pAdhelper861)와의 조합이 AAV 벡터 수율(총 vg)에 미치는 효과.
도 4. 박테리아 서열의 역 포장. 최적화된 오버사이즈 플라스미드 pcohSgsh-900 단독 또는 다른 최적화된 헬퍼 플라스미드(pRepCap9-809 및 pAdhelper861)와의 조합의 효과.
도 5. 박테리아 서열의 역 포장. 다른 최적화된 헬퍼 플라스미드(pRepCap9-809 및 pAdhelper861)와 조합되었을 때 최적화된 오버사이즈 플라스미드 pcohSgsh-900의 효과.
도 6. pohIDS-874 플라스미드로의 일시적인 트랜스펙션 후 회수된 총 vg. 세포 용해, 및 여러 번의 재-트랜스펙션 회기를 수행한 후 배양 상층액에서 회수된 총 vg. 시간은 트랜스펙션 후 시간(hpt)으로 표시된다.
도 7. pohSGSH-900 플라스미드로의 일시적인 트랜스펙션 후 회수된 총 vg. 세포 용해, 및 여러 번의 재-트랜스펙션 회기를 수행한 후 배양 상층액에서 회수된 총 vg. 시간은 트랜스펙션 후 시간(hpt)으로 표시된다.
도 2. 표준 플라스미드 세트 또는 최적화된 플라스미드 세트로의 삼중 트랜스펙션에 의해 생산된 AAV9-CAG-cohSgsh에 존재하는 박테리아 서열의 복사물.
도 3. 최적화된 플라스미드 pcohSgsh-900 단독 또는 다른 최적화된 헬퍼 플라스미드(pRepCap9-809 및 pAdhelper861)와의 조합이 AAV 벡터 수율(총 vg)에 미치는 효과.
도 4. 박테리아 서열의 역 포장. 최적화된 오버사이즈 플라스미드 pcohSgsh-900 단독 또는 다른 최적화된 헬퍼 플라스미드(pRepCap9-809 및 pAdhelper861)와의 조합의 효과.
도 5. 박테리아 서열의 역 포장. 다른 최적화된 헬퍼 플라스미드(pRepCap9-809 및 pAdhelper861)와 조합되었을 때 최적화된 오버사이즈 플라스미드 pcohSgsh-900의 효과.
도 6. pohIDS-874 플라스미드로의 일시적인 트랜스펙션 후 회수된 총 vg. 세포 용해, 및 여러 번의 재-트랜스펙션 회기를 수행한 후 배양 상층액에서 회수된 총 vg. 시간은 트랜스펙션 후 시간(hpt)으로 표시된다.
도 7. pohSGSH-900 플라스미드로의 일시적인 트랜스펙션 후 회수된 총 vg. 세포 용해, 및 여러 번의 재-트랜스펙션 회기를 수행한 후 배양 상층액에서 회수된 총 vg. 시간은 트랜스펙션 후 시간(hpt)으로 표시된다.
미생물의 기탁
플라스미드 pAdhelper861은 2018년 12월 5일에 DSMZ - 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(독일연방공화국 D-38124 브라운슈바이그 인호펜슈트라쎄 7 B)에 수탁 번호 DSM 32965로 기탁되었다.
플라스미드 pcohSgsh-827은 2018년 12월 5일에 DSMZ - 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(독일연방공화국 D-38124 브라운슈바이그 인호펜슈트라쎄 7 B)에 수탁 번호 DSM 32966으로 기탁되었다.
플라스미드 pcohSgsh-900은 2018년 12월 5일에 DSMZ - 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(독일연방공화국 D-38124 브라운슈바이그 인호펜슈트라쎄 7 B)에 수탁 번호 DSM 32967로 기탁되었다.
플라스미드 pohIDS-874는 2018년 12월 5일에 DSMZ - 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(독일연방공화국 D-38124 브라운슈바이그 인호펜슈트라쎄 7 B)에 수탁 번호 DSM 32968로 기탁되었다.
플라스미드 pRepCap9-809는 2018년 12월 5일에 DSMZ - 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(독일연방공화국 D-38124 브라운슈바이그 인호펜슈트라쎄 7 B)에 수탁 번호 DSM 32969로 기탁되었다.
정의
본원에서 사용되는 "벡터"는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 회합되고 세포에 폴리뉴클레오타이드의 전달을 매개하기 위해 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 회합체(association)를 나타낸다. 예시적인 벡터로는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 및 기타 유전자 전달 비히클을 포함한다.
본원에서 동의어로서 사용되는 용어 "아데노-관련 바이러스", "AAV 바이러스", "AAV 비리온", "AAV 바이러스 입자" 및 "AAV 입자"는 AAV의 적어도 하나의 캡시드 단백질(바람직하게 특정 AAV 혈청형의 모든 캡시드 단백질로 구성됨) 및 AAV 게놈에 상응하는 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드로 구성된 바이러스 입자를 나타낸다. 야생형 AAV는 디펜도바이러스(Dependovirus) 속 파르보비리다에(Parvoviridae) 과에 속하는 바이러스를 나타낸다. 야생형 AAV 게놈은 대략 4.7 Kb의 길이이며 포지티브 또는 네거티브-센스일 수 있는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 이루어진다. 야생형 게놈은 DNA 가닥의 양 단부에 역 말단 반복부(ITR), 및 3개의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. ORF rep는 AAV 생명주기에 필요한 4개의 Rep 단백질을 암호화한다. ORF cap은 이십면체 대칭의 캡시드를 형성하기 위해 상호작용하는 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 마지막으로, Cap ORF와 중복되는 AAP ORF는 캡시드 어셈블리를 촉진하는 것으로 나타난 AAP 단백질을 암호화한다. 만약 입자가 AAV ITR이 측면에 있는 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉 야생형 AAV 게놈과 상이한 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 포유류 세포에 전달될 도입유전자)를 포함한다면, 그것은 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터" 또는 "재조합 AAV 벡터"로서 알려진다. 발명은 또한 dsAAV 또는 scAAV로도 불리는 이중 가닥 AAV 또는 자체-상보성 AAV의 사용을 포함한다.
본원에 사용되는 바, 용어 "아데노-관련 바이러스 ITR" 또는 "AAV ITR"은 AAV의 게놈의 DNA 가닥의 양 단부에 존재하는 역 말단 반복부를 나타낸다. ITR 서열은 AAV 게놈의 효율적인 증식에 필요하다. 이들 서열의 또 다른 특성은 헤어핀을 형성하는 능력이다. 이 특징은 제2 DNA 가닥의 프리마제(primase)-독립적 합성을 허용하는 자체 프라이밍에 기여한다. ITR은 또한 숙주 세포 게놈으로의 야생형 AAV DNA의 통합(예컨대 혈청형 2 AAV에 대해 인간의 19번째 염색체에서) 및 그것으로부터의 구제 둘다, 뿐만 아니라 AAV DNA의 완전히 조립된, 데옥시리보뉴클레아제-내성 AAV 입자로의 효율적인 캡시드화에 필요한 것으로 나타났다. ITR 서열은 약 145 bp의 길이이다. 바람직하게, ITR의 전체 서열은 AAV 바이러스 벡터의 게놈에 사용되지만, 이들 서열의 약간의 미미한 변형이 허용될 수 있다. 야생형 ITR 서열은 ITR이 원하는 기능, 예컨대 복제, 닉킹(nicking), 바이러스 포장, 통합, 및/또는 프로바이러스 구제를 매개하는 한, 삽입, 결실 또는 절단에 의해 변경될 수 있다. 이들 ITR 서열을 변형시키는 과정은 기술분야에 잘 알려져 있다. ITR은 한정하는 것은 아니지만, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 또는 알려진 또는 나중에 발견된 임의의 다른 AAV를 포함한, 임의의 야생형 AAV로부터 유래될 수 있다. AAV는 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 ITR을 포함한다. 추가로, 2개의 AAV ITR은 AAV 캡시드와 동일한 AAV 혈청형으로부터 이거나, 상이할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 5' 및 3' AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 및/또는 AAV9로부터 유래된다. 바람직하게 ITR은 AAV2, AAV8 및/또는 AAV9로부터이며, AAV2가 가장 바람직하다. 한 구현예에서, AAV2 ITR은 유사 유형(pseudotyped) AAV(즉 상이한 혈청형으로부터 유래된 캡시드 및 ITR을 가지는 AAV)를 생산하기 위해 선택된다.
본원에서 사용되는 바, 표현 "재조합 바이러스 게놈"은 적어도 하나의 관련 없는 폴리뉴클레오타이드가 자연적으로 발생하는 AAV 게놈에 삽입된 AAV 게놈을 나타낸다. 발명에 따른 AAV의 게놈은 전형적으로 시스-작용 5' 및 3' 역 말단 반복 서열(ITR) 및 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용되는 "rAAV 벡터"는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오타이드 서열(즉, AAV에 이종성인 폴리뉴클레오타이드)을 포함하는 AAV 벡터, 전형적으로 세포의 유전자 형질전환을 위한 관심의 서열을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 벡터 구조체에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드는 2개의 AAV 역 말단 반복 서열(ITR)이 측면에 있다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자"는 (바람직하게 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의한) 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드로 구성된 바이러스 입자를 나타낸다. 만약 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉 포유류 세포에 전달될 도입유전자와 같이 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하면, 그것은 전형적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단하게 "rAAV 벡터"로서 언급된다.
"포장"은 캡시드 단백질의 어셈블리 및 벡터 게놈의 캡시드화를 초래하여 AAV 입자를 형성하는 일련의 세포내 사건을 나타낸다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노-관련 바이러스의 복제 및 캡시드화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 그것들은 조사된 모든 AAV 혈청형에서 발견되었고, 하기에서 및 기술분야에서 기술된다. AAV rep 및 cap은 본원에서 AAV "포장 유전자"로서 언급된다.
용어 "CAG 프로모터"는 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서 요소, 닭 β-액틴 프로모터 및 토끼 베타-글로빈 유전자로부터 유래된 3' 스플라이스 서열에 의해 형성된 조합을 나타낸다(참고, Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11, Niwa et al, Gene. 1991 Dec 15;108(2):193-9).
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 그것들의 유사체를 포함한, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 방해될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 잇다. 본원에서 사용되는 바, 용어 폴리뉴클레오타이드는 이중- 및 단일-가닥 분자를 상호교환적으로 나타낸다. 다르게 명시되거나 요구하지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본원에 기술된 발명의 임의의 구현예는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려진 또는 예측된 2개의 상보하는 각각의 단일-가닥 형태를 모두 포함한다.
"유전자"는 전사되고 번역된 후에 특정 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 적어도 하나의 비-코딩 RNA를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다.
용어 "뉴클레오타이드 서열"은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 함유하는 핵산 분자인 DNA 또는 RNA를 나타낸다. 핵산은 이중 가닥, 단일 가닥이거나, 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다.
용어 "코딩한다"는 뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역되는 방법을 결정하는 유전자 코드를 나타낸다. 서열에서 뉴클레오타이드의 순서는 폴리펩타이드 또는 단백질을 따라 아미노산의 순서를 결정한다.
폴리뉴클레오타이드에 적용될 때 "재조합"은 폴리뉴클레오타이드가 클로닝, 제한 또는 결찰 단계, 및 자연계에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드와 구별되는 구조체를 초래하는 다른 과정의 다양한 조합의 생성물인 것을 의미한다. 재조합 바이러스는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자이다. 용어는 원래의 폴리뉴클레오타이드 구조체의 복제물 및 원래의 바이러스 구조체의 자손을 각각 포함한다.
"제어 요소" 또는 "제어 서열"은 폴리뉴클레오타이드의 복제, 중복, 전사, 스플라이싱, 번역, 또는 분해를 포함한, 폴리뉴클레오타이드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용에 관여하는 뉴클레오타이드 서열이다. 조절은 과정의 빈도, 속도, 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있고, 본질적으로 향상시키는 것이거나 억제성일 수 있다. 기술분야에 알려져 있는 제어 요소로는, 예를 들어, 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 특정 조건 하에서 RNA 중합효소에 결합할 수 있고 프로모터로부터 보통 하류에(3' 방향으로) 위치한 코딩 영역의 전사를 개시할 수 있는 DNA 영역이다.
"작동적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자 요소들의 병렬위치를 나타내며, 여기서 요소들은 그것들이 예상된 방식으로 작동하는 것을 허용하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사를 개시하는 것을 돕는다면 코딩 영역에 작동적으로 연결된 것이다. 이런 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 코딩 영역 사이에는 개재하는 잔기들이 있을 수 있다.
"발현 벡터"는 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는 벡터이며, 의도된 표적 세포에서 단백질의 발현을 이루기 위해 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 단백질의 발현을 용이하게 하기 위하여 암호화 영역에 작동적으로 연결된 제어 요소를 포함한다. 제어 요소와 그것들이 발현을 위해 작동 가능하게 연결되는 유전자 또는 유전자들의 조합은 때때로 "발현 카세트"로서 언급되며, 그것의 대다수가 기술분야에서 알려져 있고 이용 가능하거나 또는 기술분야에서 이용 가능한 구성요소로부터 쉽게 구성될 수 있다.
"이종성"은 비교되는 실체의 나머지의 유전자형과 구별되는 유전자형을 가진 실체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 공학 기법에 의해 상이한 종으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터로 도입된 폴리뉴클레오타이드는 이종성 폴리뉴클레오타이드이다. 천연 코딩 서열로부터 제거되고 자연적으로 발견되지 않는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다. 특히, 본원에서 사용되는 용어 "이종성 뉴클레오타이드 서열"은 코딩 서열뿐만 아니라 비-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"유전자 변경"은 유전자 요소가 유사분열 또는 감수분열 이외의 것에 의해 세포에 도입되는 과정을 나타낸다. 요소는 세포에 대해 이종성이거나, 또는 세포에 이미 존재하는 요소의 추가적인 복사물이거나 개선된 버전일 수 있다. 유전자 변경은, 예를 들어, 세포를 기술분야에 알려져 있는 임의의 과정, 예컨대 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, 또는 폴리뉴클레오타이드-리포솜 복합체와의 접촉을 통해 재조합 플라스미드 또는 다른 폴리뉴클레오타이드로 트랜스펙션함으로써 이루어질 수 있다. 유전자 변경은 또한, 예를 들어, DNA 또는 RNA 바이러스 또는 바이러스 벡터로의 형질도입 또는 감염에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게, 유전자 요소는 세포의 염색체 또는 미니-염색체로 도입되지만; 세포 및 그 자손의 표현형 및/또는 유전자형을 변경시키는 임의의 변경이 이 용어에 포함된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 변형된; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 또는 표지화 구성요소와의 콘쥬게이션을 포함한 아미노산 중합체를 포함한다.
"분리된" 플라스미드, 바이러스, 또는 다른 물질은 물질 또는 유사한 물질이 자연적으로 발생하거나 또는 처음에 제조된 곳에 또한 존재할 수 있는 다른 구성요소의 적어도 일부가 없는 물질의 제제(preparation)를 나타낸다. 그러므로, 예를 들어, 분리된 물질은 공급 혼합물로부터 그것을 풍부하게 하기 위한 정제 기법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 풍부화(enrichment)는 절대적인 기준, 예컨대 용액의 부피당 무게를 토대로 측정되거나, 또는 공급 혼합물에 존재하는 제2, 잠재적 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다. 본 발명의 구현예의 풍부화를 증가시키는 것이 점점 더 바람직하다. 그러므로, 예를 들어, 2배 풍부화가 바람직하고, 10배 풍부화가 더 바람직하며, 100배 풍부화가 더 바람직하고, 1000배 풍부화가 보다 더 바람직하다.
본 발명에 따라 치료된 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물, 특히 포유류 종의 구성원을 나타내며, 한정하는 것은 아니지만 가축 동물, 스포츠용 동물, 및 인간을 포함한 영장류를 포함한다.
개체 또는 세포의 "치료"는 치료가 시작되는 시점에서 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경시키는 시도에서의 임의의 유형의 개입이다. 예를 들어, 개체의 치료는 (한정하는 것은 아니지만) 유전된 또는 유도된 유전적 결핍, 바이러스, 박테리아, 또는 기생충 유기체에 의한 감염, 신생물 또는 재생불량 상태, 또는 자가면역 또는 면역억제와 같은 면역 체계 기능장애를 포함한, 임의의 병리적 상태에 의해 유발된 병리를 감소시키거나 제한하기 위해 착수될 수 있다. 치료는 (한정하는 것은 아니지만) 조성물, 예컨대 제약학적 조성물의 투여, 및 조성물로 치료된 부합하는 세포의 투여를 포함한다. 치료는 예방적으로 또는 치료적으로; 즉, 병리적 사건의 개시 또는 병인체와의 접촉 전에 또는 후속하여 수행될 수 있다.
용어 "유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 물질의 양을 나타낸다. 예를 들어, 설파미다제 활성을 증가시키기 위한 발현 벡터의 유효량은 글리코사미노글리칸 축적을 감소시키기에 충분한 양이다. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 발현 벡터의 "치료적 유효량"은 질환 또는 장애의 증상을 감소 또는 제거하기에 충분한 발현 벡터의 양이다. 주어진 물질의 유효량은 물질의 본질, 투여 경로, 물질을 받는 동물의 크기 및 종 및 물질을 제공하는 목적과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 각 개체에서의 유효량은 기술분야에 확립된 방법에 따라 숙련된 전문가에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
용어 "유전자 요법"은 유전적 또는 획득된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 관심 있는 유전자 물질(예컨대 DNA 또는 RNA)의 숙주 안으로의 전달을 나타낸다. 관심 있는 유전자 물질은 생체내에서의 생산이 바람직한 생성물(예컨대 단백질 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능적 RNA)을 암호화한다. 예를 들어, 관심 있는 유전자 물질은 치료적 가치가 있는 효소, 호르몬, 수용체, 또는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 목적은 재조합 바이러스 벡터, 특히, 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)의 고역가 제제를 생산하는 방법을 제공하여 방법이 유전자 요법 과정의 실제 적용에 적합한 규모로 효과적으로 사용될 수 있도록 하는 것이다.
본 발명에 수반되는 실시예에서 나타나는 것과 같이, 발명자들은 놀랍게도, rAAV 생산이 삼중 또는 이중 트랜스펙션에 사용된 플라스미드 벡터로 세포 배양의 반복된 회기의 트랜스펙션을 수행함으로써, 즉 재-트랜스펙션에 의해 상당히 개선될 수 있는 것을 발견하였다.
그러므로, 제1 측면으로, 발명은 재조합 바이러스 벡터의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a) 적합한 세포 배양을 적어도 2개의 플라스미드 벡터로 공동 트랜스펙션하는 단계로, 상기 플라스미드 벡터는 이종성 뉴클레오타이드 서열 및 복제 및 포장 유전자 서열을 포함하고 있는 것인 단계;
b) 상기 세포를 바이러스 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계;
c) 단계 b)에서 생산된 바이러스 벡터를 회수하고 세포를 추가의 분할 및 성장을 허용하는 조건 하에서 세포 배양에서 유지하는 단계;
d) 단계 c)에 따른 세포를 단계 a)에 따른 플라스미드 벡터로 재-트랜스펙션하는 단계; 및
e) 단계 b) 내지 c)를 반복하는 단계를 포함한다.
발명의 특정 구현예에서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 알파바이러스, 플라비바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 홍역 바이러스, 랍도바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스(NDV), 폭스바이러스, 및 피코르나바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 AAV 벡터로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.
본 발명에 따른 AAV는 AAV 알려진 혈청형의 임의의 혈청형을 포함한다. 일반적으로, AAV의 상이한 혈청형은 상당한 상동성을 가진 게놈 서열을 가짐으로써, 동일한 시리즈의 유전자 기능을 제공하고, 물리적 및 기능적 측면에서 본질적으로 동등한 비리온을 생산하며, 실제적으로 동일한 메커니즘을 통해 복제하고 조립된다. 특히, 본 발명의 AAV는 AAV의 혈청형 1(AAV1), AAV2, AAV3(3A 및 3B 유형을 포함함), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 및 임의의 다른 AAV에 속할 수 있다. 상이한 AAV 혈청형의 게놈의 서열의 예는 문헌에서 또는 GenBank와 같은 공공 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. GenBank 수탁 번호 AF028704.1(AAV6), NC006260(AAV7), NC006261(AAV8), 및 AX753250.1(AAV9) 참고. 바람직한 구현예에서, 발명의 AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh10 혈청형으로 이루어지는 군으로부터 선택된 혈청형의 것이다. 바람직한 구현예에서, 발명의 상기 AAV 벡터는 혈청형 9의 것이다.
특정 구현예에서, 발명은 재조합 AAV의 생산 방법에 관한 것이며 상기 방법은:
a) 적합한 세포 배양을 적어도 2개의 플라스미드 벡터로 공동 트랜스펙션하는 단계로, 상기 벡터는 ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열, AAV rep 및 AAV cap 유전자 서열, 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 서열을 포함하는 것인 단계;
b) 상기 세포를 AAV 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계;
c) 단계 b)에서 생산된 AAV를 회수하고 세포를 추가의 분할 및 성장을 허용하는 조건 하에서 세포 배양에서 유지하는 단계;
d) 단계 c)에 따른 세포를 단계 a)에 따른 플라스미드 벡터로 재-트랜스펙션하는 단계; 및
e) 단계 b) 내지 c)를 반복하는 단계를 포함한다.
기술분야에서 기술되는 것과 같이, 유전자 물질은 세포 안으로, 그러한 세포를 형질전환 또는 형질도입하기 위한 다양한 수단 중 임의의 수단을 사용하여 도입될 수 있다. 예를 들자면, 그러한 기법에는, 예를 들어, 박테리아 플라스미드를 사용하는 트랜스펙션이 포함될 수 있다. 실제로, 발명의 방법의 단계 a)에 따른 플라스미드 벡터는 다양한 트랜스펙션 기법을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 그러한 트랜스펙션 방법은 기술분야에 기술되어 있고, 예를 들어, 칼슘 포스페이트 공침전, 배양된 세포에의 직접 마이크로 주입, 전기천공, 리포솜 매개된 유전자 전달, 지질-매개 트랜스펙션 또는 고속 미세발사체를 사용하는 핵산 전달을 포함한다. 다른 적합한 트랜스펙션 배지로는 스트론튬 포스페이트, 다가양이온 중합체, 예컨대, 슈퍼펙트(QIAGEN(TM)), 리포솜, 및 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양이온 중합체를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발명의 방법에 따른 플라스미드 벡터는 PEI를 사용하여 트랜스펙션된다. 이런 경우에, PEI/DNA 복합체는 PEI를 세포 배양에 첨가하기 전에 플라스미드 DNA에 첨가함으로써 형성된다.
이들 기법 중 어느 것이든지 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티, 예컨대 벡터 구조체를 적합한 숙주 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 외인성 DNA는 세포의 전사 및 복제 기계에 노출되기 위해 숙주 세포 원형질 막을 가로질러야 한다.
결과적으로 얻어진 세포는 외인성 핵산 분자로 일시적으로 트랜스펙션될 수 있다, 즉, 외인성 DNA는 트랜스펙션된 세포의 게놈으로 통합되지 않을 것이고, 오히려 에피솜에 존재할 것이다. 대안으로, 결과적으로 얻어진 세포는 안정적으로 트랜스펙션될 수 있다, 즉, 핵산 분자는 숙주 세포 게놈과 공유적으로 연결되거나 또는 자손 세포로 계대될 수 있는(예컨대, 충분한 속도로 염색체 외에서 복제할 수 있는) 에피솜 단위로서 유지되고 복제될 것이다.
발명의 방법에 따르면, 트랜스펙션될 플라스미드 벡터는 ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열, AAV rep 및 AAV cap 유전자 서열, 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 서열을 포함한다.
이종성 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드는 유전자 요법의 맥락에서 표적 세포에 기능, 예컨대 특정 표현형의 발현의 상향- 또는 하향-조절을 제공하는 능력으로 인해 전형적으로 관심이 있다. 그러한 이종성 폴리뉴클레오타이드 또는 "도입유전자"는 일반적으로 원하는 기능 또는 암호화 서열을 제공하기에 충분한 길이일 것이다.
이종성 폴리뉴클레오타이드의 전사가 의도된 표적 세포에서 바람직한 경우에, 그것은 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 예를 들어 표적 세포 내에서 전사의 원하는 수준 및/또는 특이성에 따라 그 자체의 또는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다양한 유형의 프로모터 및 인핸서가 이런 맥락에서 사용하기에 적합하다. 구조적 프로모터는 지속적 수준의 유전자 전사를 제공하며, 치료적 폴리뉴클레오타이드가 지속적인 수준으로 발현되는 것이 요구될 때 바람직하다. 유도성 프로모터는 일반적으로 인듀서의 부재 하에서 낮은 활성을 나타내며, 인듀서의 존재 하에서 상향 조절된다. 그것은 발현이 특정 시간 또는 특정 위치에서만 요구될 때, 또는 유도제를 사용하는 발현 수준을 적정하는 것이 바람직한 경우에 바람직할 수 있다. 프로모터 및 인핸서는 또한 조직-특이적일 수 있다, 즉, 그것들은 아마도 특정 세포 유형에서 특유하게 발견되는 유전자 조절 요소로 인해 그런 특정 세포 유형에서만 활성을 나타낸다.
프로모터의 예시적인 예는 유인원 바이러스 40으로부터의 SV40 후기 프로모터, 배큘로바이러스 다면체 인핸서/프로모터 요소, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(HSV tk), 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 즉시 초기 프로모터, CMV 초기 인핸서/닭 β 액틴(CAG) 프로모터 및 LTR 요소를 포함한 다양한 레트로바이러스 프로모터이다. 유도성 프로모터로는 중금속 이온 유도성 프로모터(예컨대 마우스 유선 종양 바이러스(mMTV) 프로모터 또는 다양한 성장 호르몬 프로모터), 및 T7 RNA 중합효소의 존재 하에 활성인 T7 파지로부터의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들자면, 조직-특이적 프로모터의 예로는 다양한 계면활성 단백질 프로모터(폐에서의 발현에 대해), 미오신 프로모터(근육에서의 발현에 대해), 및 알부민 프로모터 또는 인간 α1-항트립신 hAAT(간에서의 발현에 대해)를 포함할 수 있다. 매우 다양한 다른 프로모터가 알려져 있고 일반적으로 기술분야에서 이용 가능하며, 많은 그러한 프로모터에 대한 서열이 GenBank 데이터베이스와 같은 서열 데이터베이스에서 이용 가능하다. 바람직한 구현예에서, CAG 프로모터가 사용된다.
번역이 또한 의도된 표적 세포에서 바람직한 경우, 이종성 폴리뉴클레오타이드는 또한 번역을 용이하게 하는 제어 요소(예컨대 리보솜 결합 부위 또는 "RBS" 및/또는 폴리아데닐화 신호)를 바람직하게 포함할 것이다. 따라서, 이종성 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 코딩 영역을 포함할 것이고, 또한, 예를 들어, 작동적으로 연결된 인핸서, 리보솜 결합 부위 및/또는 폴리-A 신호를 포함할 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오타이드는 동일한 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 하나의 코딩 영역, 또는 하나 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다. 제어 요소 및 코딩 또는 비-코딩 영역의 조합을 함유하는 전체 유닛은 종종 발현 카세트로서 언급된다. 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 이종성 폴리뉴클레오타이드는 폴리-A 신호를 함유한다.
이종성 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기법에 의해 AAV 게놈 코딩 영역 안에 또는 바람직하게는 AAV 게놈 코딩 영역 대신 통합되며 일반적으로 AAV 역 말단 반복부(ITR) 영역이 어느 한 쪽 측면에 있다. 대안으로, 단지 하나의 ITR을 가진 벡터 구조체가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 이종성 뉴클레오타이드 서열의 측면에는 2개의 ITR 이 있다.
AAV 입자의 캡시드화 크기 제한을 고려하면, 큰 이종성 폴리뉴클레오타이드의 게놈 안으로의 삽입은 AAV 서열의 일부의 제거를 필요로 한다. 하나 이상의 AAV 유전자의 제거는,은 복제할 수 있는 AAV("RCA")를 생산할 가능성을 감소시키기 위해, 어떤 경우에도 바람직하다. 따라서, rep, cap, 또는 둘 다에 대한 암호화 또는 프로모터 서열은, 이들 유전자에 의해 제공된 기능이 트랜스로 제공될 수 있기 때문에, 바람직하게 제거된다.
한 구현예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 AAV ITR 이 측면에 있고, 트랜스로 제공될 AAV 포장 유전자는 별도의 벡터 플라스미드에서 숙주 세포에 도입된다.
rep 유전자는 2개의 프로모터, p5 및 p19로부터 발현되고, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40으로 지정된 4개의 단백질을 생산한다. Rep78 및 Rep68만이 AAV 듀플렉스 DNA 복제에 필요하지만, Rep52 및 Rep40도 자손인 단일 가닥 DNA 축적에 필요한 것으로 나타난다. Rep68 및 Rep78은 AAV ITR의 헤어핀 형태에 특이적으로 결합하며 AAV 말단에서 복제를 해결하는 데 필요한 여러 효소 활성을 가지고 있다. Rep78 및 Rep68은 또한 AAV 유전자의 양성 및 음성 조절 및 일부 이종성 프로모터로부터의 발현, 뿐만 아니라 세포 성장에 미치는 억제 효과를 포함한 다면발현 조절 활성을 나타낸다.
cap 유전자는 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 암호화한다. 이들 단백질은 공통 중복 서열을 공유하지만, VP1 및 VP2는 대체 개시 코돈을 사용함으로써 p40 프로모터로부터 전사된 추가 아미노 말단 서열을 함유한다. 전부 3개의 단백질이 효과적인 캡시드 생산에 필요하다.
AAV 벡터의 바이러스 입자로의 포장은 여전히 AAV에 대한 적합한 헬퍼 바이러스의 존재 또는 헬퍼 바이러스 기능의 제공에 의존한다. 본 발명의 방법에 따르면, 헬퍼 바이러스 기능 유전자 서열이 플라스미드 벡터에 제공된다. AAV 벡터의 제제에 상당한 양의 감염성 헬퍼 바이러스의 존재는 제제가 인간 투여에 사용하기 위해 의도된 것이라는 점에서 문제의 소지가 있다.
발명의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스펙션은 2개의 플라스미드 벡터를 사용하여 수행되는데, 상기 플라스미드 벡터 중 하나는 ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 제2 플라스미드 벡터는 AAV rep 및 AAV cap 유전자 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 제2 플라스미드 벡터는 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 트랜스펙션은 3개의 플라스미드 벡터를 사용하여 수행된다, 즉 숙주 세포는 관심 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 적어도 하나의 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 벡터, 및 아데노바이러스 액세서리 기능을 암호화하는 적어도 하나의 벡터로 삼중-트랜스펙션된다.
적합하게 변경된 세포의 선택은 기술분야의 임의의 기법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포를 변경시키기 위해 사용된 폴리뉴클레오타이드 서열은 기술분야에 알려져 있는 것과 같이 하나 이상의 검출 가능한 또는 선택 가능한 마커와 동시에 도입되거나 또는 그것에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들자면, 당업자는 약물 내성 유전자를 선택 가능한 마커로서 사용할 수 있다. 약물 내성 세포는 그런 후 선택되고 성장될 수 있고, 그런 후 필요에 따라 원하는 서열 - 즉, 포장 유전자 생성물, 또는 이종성 폴리뉴클레오타이드의 생성물의 발현에 대해 테스트된다. 도입된 폴리뉴클레오타이드의 획득, 국지화 및/또는 유지에 대한 테스트는 DNA 혼성화-기반 기법(예컨대 서던 블롯팅 및 기술분야에 알려져 있는 다른 과정)을 사용하여 수행될 수 있다. 발현에 대한 테스트는 유전자 변경된 세포로부터 추출된 RNA의 노던 분석에 의해, 또는 상응하는 유전자 생성물에 대한 간접적인 면역형광에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
발명의 방법의 단계 b)에 따르면, 그로써 트랜스펙션된 세포는 바이러스 벡터 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 rAAV 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양된다.
여러 기준이 본원에서 기술된 rAAV 입자를 생산하는 데 사용하기 위한 세포의 선택에 영향을 미친다. 보다 바람직한 세포 및 세포주는 재조합 AAV 벡터 제제의 대규모 생산을 용이하게 하기 위해 배양에서 쉽게 성장할 수 있는 것이다. 대규모 생산이 바람직한 경우, 생산 방법의 선택은 또한 숙주 세포의 선택에 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, 일부 생산 기법 및 배양 용기 또는 챔버는 점착 또는 부착된 세포의 성장을 위해 설계되는 반면, 다른 것은 현탁에서의 세포의 성장을 위해 설계된다. 후자의 경우에, 숙주 세포는 그러므로 바람직하게 현탁에서의 성장에 적응되거나 적응될 수 있을 것이다. 본 발명에 따르면, rAAV의 대규모 생산이 바람직하다.
다양한 세포주가 rAAV의 대규모 생산에 사용하기 위해 고려된다. rAAV의 세포 배양에 특히 적합한 것은 부착성이거나 현탁에서의 성장을 위해 선택된 인간 배아 신장(HEK) 293 세포주이다. rAAV를 생산하기에 적합한 다른 세포주의 예로는: Vero 세포, HeLa 세포, 및 CHO 세포주를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "세포주"는 시험관내에서 연속적인 또는 장기간 성장 및 분할을 할 수 있는 세포 집단을 나타낸다. 자주, 세포주는 단일 전구 세포로부터 유래된 클론 집단이다. 기술분야에는 그러한 클론 집단의 보관 또는 전달 중에 핵형에서 자발적인 또는 유도된 변화가 일어날 수 있는 것으로 알려진다. 그러므로, 언급된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양과 정확하게 동일하지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 용어 "세포주"는 그러한 변이체를 포함한다.
세포주가 선택되면, 선택된 세포 배양 장치가 세포 배양을 지지하기에 적합한 밀도의 세포로 시딩된다. 특정 장치를 시딩하기 위해 사용된 세포의 밀도는 장치의 크기에 따라 좌우될 것이다. 선택된 배양 장치에서 세포를 성장시키기 위해 다양한 부피가 사용될 수 있다. 사용된 배지의 부피는 배양 세포를 성장시키기 위해 사용된 배양 장치의 크기에 따라 달라질 것이다. 현탁 배양과 같은 대규모 생산 방법이 사용될 수 있다. 그런 후 AAV 입자가 수집되고, 그것을 제조하기 위해 사용된 세포로부터 분리된다.
세포는 AAV의 복제 및 rAAV 벡터의 포장에 허용적인 조건 하에서 배양된다. 배양 시간은 바람직하게 피크 생산 수준에 상응하도록 조정된다. 바람직하게, 세포당 적어도 100개; 보다 바람직하게 세포당 적어도 약 1000개, 보다 더 바람직하게 세포당 적어도 약 10,000개의 바이러스 입자가 생산된다. 바람직하게, 배양 주기 중에 2 x 105 세포당 적어도 0.5 x 106, 보다 바람직하게 적어도 약 1 x 106, 보다 더 바람직하게 적어도 약 2 x 106 RU/ml AAV 벡터가 생산된다.
대규모 세포 성장 및 AAV 생산을 달성하기 위해 다양한 성장 배지가 개시된 발명에 사용될 수 있다. 성장 배지의 선택은 배양되는 세포 유형에 따라 달라진다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 포유류 세포이다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 인간 배아 신장(HEK) 293 세포주이다. 보다 바람직하게, 상기 세포는 현탁에서 성장하기에 적합한 세포이다.
부착 세포의 배양의 경우, 롤러 보틀(주어진 속도에서 회전하는 원통형 조직 배양 플라스크)이 세포 부착을 위해 필요한 표면을 제공하기 위해 사용된다. 대안으로, 마이크로 캐리어가 또한 부착 세포 배양을 지지하기에 적합한 시스템이다. 현탁 세포의 배양의 경우, 교반 탱크 생물반응기가 높은 세포 밀도 배양에 도달할 수 있고 계속해서 정제 후에 대량의 rAAV를 제공할 수 있기 때문에, 가장 대표적인 시스템이다.
발명의 특정 구현예에서, 로킹 모션형(rocking-motion-type) 생물반응기가 사용된다. 또 다른 특정 구현예에서 교반 탱크 생물반응기가 또한 사용될 수 있다. 반응기에서 세포 배양이 주어진 포인트에 도달하면, 세포의 트랜스펙션이 위에서 언급된 것과 같이 수행된다.
발명의 방법에 따르면, 단계 c)는 단계 b)에서 생산된 AAV를 회수하고 추가의 분할 및 성장을 허용하는 조건 하에서 세포 배양에 세포를 유지하는 것을 포함한다. 방법의 바람직한 구현예에서, 단계 b)는 교반된 액체 배지에서 현탁으로 상기 세포를 배양하는 것으로 수행된다.
발명의 방법의 특정 구현예에 따르면, 단계 b)에서 생산된 AAV는 세포 배양의 상층액으로 분비된다. 그러므로, 발명의 방법의 단계 c)에 따라, rAAV는 상층액으로부터 수득되고 세포가 추가의 분할 및 성장을 위해 세포 배양에 유지된다. 사용된 배지 또는 상층액은 그런 후, 하기 실시예에서 나타나는 것과 같이, AAV가 세포 용해의 필요 없이 세포 배양의 상층액으로 분비되기 때문에, 그렇게 생산된 rAAV와 함께 수집된다.
특정 구현예에서, 세포 배양의 세포 배지는 재-트랜스펙션 수행 전에, 즉 단계 d) 전에 교환된다. 특정 구현예에서, 세포 배지 교환은 원심분리에 의해 수행된다. 바람직한 구현예에서, 배지 교환은 관류에 의해 수행된다. 보다 바람직한 구현예에서, 연속적인 배지 교환은 관류에 의해 수행된다. 보다 바람직하게, 상기 배양 배지는 관류 시스템에 의해 자동적으로 교환된다. 이 시스템에 의해, 배양은 새로운 배지로 보충되는 한편 세포가 없는 상층액은 세포 유지 장치를 사용하여 제거된다. 이 과정은 바람직하게 일정한 수득 유량에서 수행된다. 이런 견지에서, 바람직한 구현예에서, 세포가 추가로 분할 및 성장하는 것을 허용하기 위해 새롭고, 신선한 배양 배지가 보유된 세포에 첨가된다. 영양소의 일정한 첨가 및 독성 대사산물의 제거는 관류 배양이 여러 주에 걸쳐 높은 세포 밀도에 도달하여 유지할 수 있게 한다.
발명자들은 놀랍게도, AAV의 생산이 연장될 수 있도록 단계 a)에 대해 위에서 기술된 플라스미드 벡터로 세포 배양에 보유된 세포를 재-트랜스펙션하는 것이 가능함을 발견하였다. 이런 의미에서, 더 많은 rAAV가 추가로 분할 및 성장하도록 허용된 세포 배양 장치에 보유된 세포를 사용하여 생산된다. 그러므로, 발명자들은 반복된 회기의 트랜스펙션을 수행함으로써, 동일한 세포 배양을 사용하는 시간 동안 rAAV의 생산이 확대될 수 있는 것을 발견하였다. 더욱이, 본 발명에 수반되는 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, 발명자들은 이들 배지 교환을 실시함으로써, AAV가 세포 용해의 필요성 없이 세포 배양의 상층액으로 분비되고 각각의 재-트랜스펙션 회기 전에 배지 교환이 수행될 때마다 수득될 수 있는 것을 발견하였다. 제안된 방법의 또 다른 장점은 rAAV가 상층액으로부터 회수되는 것이고, 이것은 세포가 AAV를 수득하기 위해 용해될 필요가 없고, 숙주 세포 DNA 및 숙주 세포 단백질로의 오염이 더 적게 일어나기 때문에 정제 관점에서의 장점이다.
그러므로, 발명의 방법은 단계 c)에 따라 보유된 세포를 단계 a)에 따른 플라스미드 벡터로 재-트랜스펙션하는 단계 d)를 포함한다.
발명의 방법의 단계 d)에 따르면, 배지 교환 없이 단일 트랜스펙션 회기를 수반하는 종래의 일시적인 유전자 발현(TGE) 접근법과는 반대로, 재-트랜스펙션 또는 반복된 회기의 트랜스펙션이 세포 배양에서 수행된다.
더욱이, 발명자들은 놀랍게도 상기 재-트랜스펙션 및 회수 단계가 동일한 세포 배양을 사용하여 2회 이상 반복될 수 있는 것을 발견하였다. 발명의 방법의 특정 구현예에서, 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 적어도 1회 이상 반복된다. 또 다른 특정 구현예에서 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 적어도 2회 반복된다. 보다 구체적인 구현예에서, 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 적어도 3회 반복된다. 바람직한 구현예에서, 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 적어도 4회 반복된다. 보다 구체적인 구현예에서, 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 1 내지 3회 반복된다. 보다 구체적인 구현예에서, 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 1 내지 2회 반복된다. 바람직한 구현예에서, 발명의 방법은 회수 단계 c) 후에 단계 d), b) 및 c)의 1회 반복을 포함한다. 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 한 번 더 반복된다.
앞서 언급된 것과 같이, 발명의 방법의 특정 구현예에서, 연속적인 배지 교환은 관류에 의해 수행된다. 바람직한 구현예에서, 트랜스펙션이 수행될 때마다, 관류가 중단된다. 이것은 플라스미드 벡터가 세포에 들어가는 것을 허용한다. 보다 바람직한 구현예에서, 관류는 적어도 1.5시간, 보다 바람직하게, 적어도 2시간, 보다 바람직하게 적어도 3시간, 보다 더 바람직하게 적어도 4시간의 시간 동안 중단된다. 바람직한 구현예에서, 각각의 재-트랜스펙션 회기 사이에 최소한의 시간 간격이 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 재-트랜스펙션은 적어도 36시간, 보다 바람직하게, 적어도 48시간의 시간 간격 후에 수행된다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 방법은 모든 회기의 재-트랜스펙션 및 회수가 완료된 후에 상층액에서 세포를 용해시키는 추가 단계를 포함한다.
세포 파괴 또는 세포 용해를 위해 사용될 수 있는 잘 알려져 있는 여러 기법이 최신 기술분야에 있다. 비록 냉동-해동 및/또는 초음파처리가 세포를 파괴하기 위해 사용될 수 있지만, 그러한 기법은 대규모 제조에는 매우 적합하지 않다. 그러므로 그런 관점에서 기계적 용해 기법이 바람직하다. 계면활성제 및 다른 화학적 작용제가 또한 용해를 매개하거나 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 용해물의 뉴클레아제(예컨대 벤조나제(benzonase))로의 처리는 점도를 감소시키고 여과 가능성을 개선하는 데 도움이 되는 것으로 나타났다. 정화(clarification), 예컨대 세포 파편의 적어도 일부로부터 벡터를 분리하기 위한 마이크로여과에 의한 정화가 또한 회수 및 정제를 촉진하는 데 도움이 된다. 발명의 특정 구현예에서, 발명의 방법에 따른 상기 용해 단계는 뉴클레아제를 사용하는 것을 포함하며, 보다 바람직하게, 상기 뉴클레아제는 벤조나제이다.
발명의 방법의 특정 구현예에서, 위에서 기술된 발명의 rAAV를 함유하는 수집된 상층액은 rAAV가 정제되도록 추가로 가공된다. 이런 관점에서, 또 다른 특정 구현예에서, 세포 보유 막에 결합된 생물반응기에서 가공이 수행됨으로써, 세포가 반응기 시스템 내부에 보유되는 한편 AAV는 막을 통해, 세포 파편이 없는 깨끗한 상층액에 수집되고 따라서 정제를 더 쉽게 한다.
유전자 요법을 위한 AAV의 생산에 대해 특별히 유용해지기 위해, 기법이 "확장 가능한(scalable)", 즉 대규모 제조 장치 및 과정과 함께 적용 가능하게 되는 것이 가장 바람직하다.
예를 들자면, AAV는 양전하의 음이온-교환 칼럼, 예컨대 N-전하의 아미노 또는 이미노 수지(예컨대 POROS 또는 임의의 DEAE, TMAE, 삼차 또는 사차 아민, 또는 PEI-기반 수지) 또는 음전하의 양이온-교환 칼럼(예컨대 HS, SP, CM 또는 임의의 설포-, 포스포- 또는 카르복시-기반 양이온 수지) 상에 로딩될 수 있다. 칼럼은 완충제로 세척될 수 있다. 칼럼은 증가하는 NaCl 농도의 구배 또는 감소하는 pH의 구배로 용출될 수 있고 분획이 수집되어 AAV 및/또는 오염물의 존재에 대해 검정될 수 있다.
기술분야에 알려져 있는 것과 같이 전하 이외의 특징에 의해 매개된 분자간 회합을 토대로, 다른 과정이 상기 기술된 음이온 및 양이온 교환 과정 대신, 바람직하게는, 이에 더하여 사용될 수 있다. 그러한 다른 과정으로는 리간드-수용체 쌍을 토대로 한 분자간 회합(예컨대 항체-항원 또는 렉틴-탄수화물 상호작용), 뿐만 아니라 분자의 다른 속성을 토대로 한 분리, 예컨대 크기 및/또는 형상을 토대로 한 분자 체 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
위에서 기술된 칼럼으로부터 용출된 AAV-함유 분획의 풀(pool)은 농축되고 접선 흐름 여과(TFF)에 의해 정제될 수 있다. 제제는 막을 통해 여과되고, 생성물이 보유된다. 보유된 물질은 막을 사용하여 투석여과되고 적합한 완충제로 연속적으로 세척된다. 최종 샘플은 생성물에 대해 고도로 풍부하며 여과되고 사용을 위해 보관될 수 있다.
벡터 플라스미드로의 트랜스펙션은 세포 시딩이 수행된 날에 일어날 수 있거나, 또는 세포 시딩 밀도에 따라 세포 시딩 후 1일 째, 2일 째, 3일 째, 4일 째, 또는 5일 째에 실시될 수 있다.
발명의 한 구현예에서, 선택된 숙주 세포는 관심 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 적어도 하나의 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 벡터, 및 아데노바이러스 액세서리 기능을 암호화하는 적어도 하나의 벡터로 삼중-트랜스펙션된다. 특정 구현예에서, 삼중-트랜스펙션은 PEI 트랜스펙션을 사용하여 수행된다.
일시적인 트랜스펙션에 의한 rAAV 생산 중에 플라스미드 골격 서열의 포장(역 포장)은 기술분야에 알려져 있는 공통된 문제이다. 본원에서 사용되는 용어 "역 포장"은 이종성 서열 대신 ITR을 함유한 플라스미드의 골격의 캡시드화를 나타낸다. 실제로, AAV 벡터의 경우, 포장된 DNA 불순물의 우세한 종은, ITR로부터 역 포장에 의해 생산될 가능성이 있는, 발현 카세트 측면에 있는 ITR에 인접한 플라스미드 서열이다. rAAV 스톡에서 이들 입자의 존재는 임상 적용을 위한 안전성 문제를 나타낼 수 있다.
하기 실시예 1에서 나타낸 것과 같이, 트랜스펙션을 위한 최적화된 플라스미드의 조합은 AAV 벡터 생산에 통상 사용된 표준 플라스미드로의 생산보다 더 높은 수율 및 박테리아 서열의 더 낮은 역 포장을 초래한다. 특히, 발명자들은 세포가 3개의 플라스미드 벡터로 트랜스펙션될 때 rAAV 생산이 상당히 증가하는 것을 발견하였는데, 여기서 제1 플라스미드 벡터 i)은 ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열 및 상기 ITR 외부에 위치한 스터퍼 DNA 서열을 포함하고, 상기 스터퍼 서열은 플라스미드 골격 크기가 5 Kb를 초과하도록 4400 Kb 내지 4800 Kb의 길이를 가지며; 제2 플라스미드 벡터 ii)는 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 그리고 제3 플라스미드 벡터 iii)은 VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하며, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR, 프로테아제 서열을 함유하지 않는다. 이런 관점에서, 하기 제시된 결과에 따르면, AAV 수율은 이들 3개의 최적화된 플라스미드의 조합이 표준 플라스미드의 조합 대신 사용될 때 3배 증대된다. 더욱이, 역 포장은 또한 기술분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있는 표준 플라스미드, 즉 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-오버사이즈 플라스미드, pRepCap 벡터, 예를 들어 pRep2Cap9 벡터, 및 AAV 생산에 필요한 아데노바이러스 서열(VA-RNA, E2A 및 E4)을 함유한 플라스미드를 사용하는 삼중 트랜스펙션과 비교할 때 상당히 감소된다. 앞서 언급된 것과 같이, 본 발명에 사용된 최적화된 헬퍼 플라스미드는 AAV 생산에 필요한 VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유한다. 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR 서열을 포함한 특정 서열을 함유하지 않도록 변형되었다.
도 3에서 분명하게 도시된 것과 같이, 스터퍼 DNA 서열을 함유하는 오버사이즈 플라스미드인, 이종성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 최적화된 플라스미드의 사용은 비-최적화된 플라스미드와 함께, 즉 삼중 트랜스펙션에 사용된 표준 벡터와 함께 사용될 때 벡터 게놈 수율을 개선하지 못한다. 그러므로, 최적화된 오버사이즈 플라스미드 단독의 사용은 삼중 트랜스펙션에 의한 벡터 게놈 수율의 개선을 초래하지 못한다.
그러나, 이런 최적화된 오버사이즈 플라스미드와 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유하는 최적화된 플라스미드(pAdhelper861) 또는 AAV rep 코딩 영역 및 AAV cap 코딩 영역을 함유하는 최적화된 플라스미드(pRepCap9-809)와의 조합은 벡터 게놈 수율을 개선시켰다(도 3 참고). 나아가, 3개의 최적화된 벡터가 조합될 때, 벡터 게놈 수율은 크게 향상된다(도 3 참고).
더욱이, 발명자들은 놀랍게도 최적화된 오버사이즈 플라스미드(pcohSgsh-900)와 하나 또는 둘 다의 최적화된 헬퍼 플라스미드, pRepCap9-809 및/또는 pAdhelper861과의 공동 트랜스펙션이 수행될 때 박테리아 서열의 역 포장의 감소를 발견하였다(도 4). 특히, 이들 최적화된 플라스미드의 삼중 조합의 사용은 역 포장의 더 큰 감소를 초래한다(도 4 및 5). 실제로, 최적화된 헬퍼 플라스미드(pAdhelper861) 및/또는 (pRepCap9-809)의 사용으로 인한 박테리아 서열의 백분율의 감소는 오버사이즈 골격을 함유한 최적화된 플라스미드(pcohSgsh-900)가 공동 트랜스펙션되었을 때 더 명백하였다(도 5).
본원에서 사용되는 용어 "오버사이즈 골격"은 AAV 벡터의 캡시드화의 한계(대략 4700 bp)를 초과하는 염기쌍의 크기를 가진 플라스미드 골격을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 발명의 방법에 사용된 상기 제2 플라스미드 벡터는 AAV Rep2 및 AAV Cap9 코딩 영역을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 5에 제시된 수탁 번호 DSM 32969를 가진 pRepCap-809이다.
그러므로, 발명의 방법의 특정 구현예에서, 단계 a)에서 다음의 3개의 플라스미드 벡터가 사용된다:
i) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열 및 상기 ITR 외부에 위치한 스터퍼 DNA 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터, 여기서 상기 스터퍼 서열은 플라스미드 골격 크기가 5 Kb를 초과하도록 4400 Kb 내지 4800 Kb의 길이를 가지는 제1 플라스미드 벡터;
ii) 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터; 및
iii) VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 제3 플라스미드 벡터로, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는 것인 제3 플라스미드 벡터.
특정 구현예에서, 스터퍼 DNA 서열은 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터의 ITR 중 하나에 인접하여 위치한다.
또 다른 특정 구현예에서, 플라스미드 골격 크기는 7000 bp 내지 7500 bp이다. 보다 구체적인 구현예에서, 플라스미드 골격 크기는 7000 bp 내지 7200 bp이다.
바람직한 구현예에서, 상기 제1 플라스미드 벡터는 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다.
보다 바람직한 구현예에서, 상기 제1 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 2에 제시된 것과 같은 수탁 번호 DSM 32967을 가지는 pcohSgsh-900이다.
발명의 방법의 또 다른 구현예에 따르면, 세포 배양의 나머지 세포를 2개의 플라스미드 벡터로 재-트랜스펙션하여 AAV의 생산이 위에서 설명된 것과 같이 연장될 수 있도록 하는 것이 가능하다.
그러므로, 발명은 또한 단계 a)에서 다음의 2개의 플라스미드 벡터가 사용되는 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
i) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열 및 상기 ITR 외부에, 바람직하게 하나의 ITR에 인접하여 위치한 스터퍼 DNA 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터, 여기서 상기 스터퍼 서열은 플라스미드 골격 크기가 5 Kb를 초과하도록, 바람직하게 7000 bp 내지 7500 bp, 보다 바람직하게 7000 bp 내지 7200 bp가 되도록 4400 Kb 내지 4800 Kb의 길이를 가지는 제1 플라스미드 벡터; 및
ii) AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역, AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열, 및 VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 제2 플라스미드 벡터로, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는 것인 제2 플라스미드 벡터.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 제2 플라스미드 벡터는 5'에서 3' 쪽으로 VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능, AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역, AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 플라스미드 벡터는 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 제2 플라스미드 벡터는 AAV Rep2 및 AAV Cap9 코딩 영역을 포함한다.
앞서 언급된 것과 같이, 트랜스펙션을 위한 최적화된 플라스미드의 조합은 AAV 벡터 생산에 대해 통상적으로 사용된 표준 플라스미드로의 생산보다 더 높은 수율 및 박테리아 서열의 더 낮은 역 포장을 초래한다.
하기 실시예에서 rAAV의 생산이 i) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터; ii) 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터; 및 iii) VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 플라스미드 벡터로, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는 것인 플라스미드 벡터를 사용하여 수행될 때, 역 포장이 상당히 감소되고 더욱이, 생산성은 삼중 트랜스펙션에 의한 AAV의 생산에 사용된 표준 플라스미드와 비교할 때 증가되는 것으로 나타난다.
그러므로, 또 다른 측면으로 발명은 재조합 AAV의 생산 방법에 관한 것이며 상기 방법은:
a) 적합한 세포를
i) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터;
ii) 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터, 및
iii) VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 제3 플라스미드 벡터, 여기서 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는 것인 제3 플라스미드 벡터
로 공동 트랜스펙션하는 단계;
b) 상기 세포를 AAV 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생산된 AAV를 회수하는 단계
를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 제1 플라스미드 벡터 i)은 플라스미드 골격 크기가 5000 bp를 초과인, 바람직하게 7000 bp 내지 7500 bp, 보다 바람직하게, 7000 bp 내지 7200 bp인 것과, 상기 ITR 외부에, 바람직하게 ITR 중 하나에 인접하여 위치한 스터퍼 DNA 서열을 포함하고, 상기 스터퍼 서열은 4400 bp 내지 4800 bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 제1 플라스미드 벡터 i)은 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다. 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 상기 제1 플라스미드는 SEQ ID NO: 2에 제시된, 수탁 번호 DSM 32967을 가진 pcohSgsh-900이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 제2 플라스미드 벡터 ii)는 AAV Rep2 및 AAV Cap9 코딩 영역을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 5에 제시된 수탁 번호 DSM 32969를 가진 pRepCap-809이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 제3 플라스미드 벡터 iii)은 SEQ ID NO: 6에 제시된 수탁 번호 DSM 32965를 가진 pAdhelper861이다.
위에서 언급된 것과 같이, 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 단계 b)는 교반된 액체 배지에서 현탁으로 상기 세포를 배양하여 수행된다.
또 다른 측면으로, 발명은 또한:
a) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열; 및
b) 상기 ITR 외부에 및 하나의 ITR에 인접하여 위치한 스터퍼 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것으로, 상기 스터퍼 서열은 플라스미드 골격 크기가 5 Kb를 초과하도록, 바람직하게는 7000 bP 내지 7500 bp; 보다 바람직하게는 7000 bp 내지 7200 bp가 되도록, 4400 Kb 내지 4800 Kb, 보다 바람직하게, 4500 Kb 내지 4700 Kb, 보다 더 바람직하게, 4600 Kb 내지 4700 Kb의 길이를 가진다;
상기 플라스미드 벡터는 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다. 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 상기 플라스미드는 SEQ ID NO: 2에 제시된 수탁 번호 DSM 32967을 가진 pcohSgsh-900이다.
또 다른 특정 측면으로, 발명은 아데노바이러스 서열 E2, E4 및 VA-RNA를 함유하는 헬퍼 플라스미드 벡터에 관한 것으로, 상기 플라스미드 벡터는 E3, pTB(E2B), 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는다. 보다 구체적으로, 이 플라스미드는 VA 유전자를 포함하는 731 bp의 영역, E2A 유전자 및 E4 유전자를 포함하는 5346 bp 영역 및 3181 bp 단편에 포함된 그것들의 조절 영역을 함유한다. 플라스미드 골격은 높은 복사수의 박테리아 복제 기원을 함유한다. 보다 바람직한 구현예에서, 발명은 수탁 번호 DSM 32965 하에 기탁된 pAdhelper861에 상응하는 SEQ ID NO: 6의 플라스미드 벡터에 관한 것이다.
rAAV의 유전자 요법에의 용도
본 발명의 rAAV 바이러스 벡터는 유전자 요법의 목적으로 개체에 투여하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 요법에 적합한 질환으로는 한정하는 것은 아니지만, 바이러스, 박테리아, 또는 기생충 감염, 다양한 악성 종양 및 과증식성 상태, 자가면역 상태, 및 선천적 결함에 의해 유도된 질환을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발명의 방법에 따라 생산된 rAAV 벡터는 리소좀 축적 질환(LSD)의 치료에 사용된다. 보다 바람직하게, 상기 벡터는 뮤코다당질축적증(MPS)의 치료에 도움이 된다. 바람직한 구현예에서, 상기 이종성 뉴클레오타이드 서열은 MPS의 치료에 유용한 효소를 코딩하는 서열이다. 특히, 상기 서열은 인간 α-L-이두로니다제(iduronidase), 인간 헤파란 설파미다제, 인간 N-설포글루코사민 설포하이드롤라제, 인간 N-아세틸글루코사미니다제, 알파, 인간 헤파란-α-글루코사미니드, 인간 N-아세틸트랜스퍼라제, 인간 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 인간 N-아세틸글루코사민 6-설파타제, 인간 갈락토스-6-설페이트 설파타제, 인간 β-갈락토시다제, 인간 N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, β-글루쿠로니다제, 및 인간 히알루로니다제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
유전자 요법은 세포 내의 또는 세포에 의해 분비된 특정 단백질의 발현 수준을 향상시키기 위해 수행될 수 있다. 본 발명의 벡터는 유전자 마킹, 누락되거나 결핍된 유전자의 대체, 또는 치료 유전자의 삽입을 위해 세포를 유전자상으로 변경하기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오타이드는 발현 수준을 감소시키는 세포에 제공될 수 있다. 이것은 바람직하지 못한 표현형, 예컨대 악성 종양의 과정 중에 증폭되거나 과다발현된 유전자의 생성물, 또는 미생물 감염 과정 중에 도입되거나 과다발현된 유전자의 억제에 사용될 수 있다. 발현 수준은, 예를 들어, 표적 유전자 또는 RNA 전사체와의 안정적인 하이브리드를 형성할 수 있거나(안티센스 요법), 관련된 mRNA를 절단하는 리보자임으로서 작용할 수 있거나 또는 표적 유전자의 생성물에 대한 유인물(decoy)로서 작용할 수 있는 서열을 포함하는 치료 폴리뉴클레오타이드를 공급함으로써 감소될 수 있다.
제약학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 에멀션으로서, 또는 사용 전에 액체에 용해 또는 현탁되기에 적합한 고체 형태로서 공급될 수 있다. 담체는, 예를 들면 보존제가 있거나 없는 물, 또는 완충 식염수 용액이다.
제약학적 조성물은 투여시 재현탁하기 위해 동결건조되거나 용액일수 있다. 바람직한 구현예에서, 발명의 제약학적 조성물은 주사용 현탁액이다. 그런 후 최종 제품이 적합한 완충제에 제형화되고, 바이알에 충전되고 사용할 때까지 보관된다.
비록 필요하지는 않지만, 제약학적 조성물은 정확한 양의 투여에 적합한 단위 투여 형태로 선택적으로 공급될 수 있다.
발명이 일반적인 용어로 기술되었지만, 발명은 예시로서 제공되고 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하려고 의도되지 않은 다음의 실시예를 참조로 하여 보다 쉽게 이해될 것이다.
실시예
본 발명의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학, 바이러스학, 동물 세포 배양 및 생화학의 종래 기법을 사용할 것이다. 그러한 기법들은 문헌에서 전체적으로 설명된다.
실시예 1: 최적화된 벡터 대비 표준 플라스미드 벡터를 사용하는 삼중 트랜스펙션
1.1. 플라스미드 설명
플라스미드 pcohSgsh-827(SEQ ID NO: 1)
1756 bp CAG 프로모터의 제어 하에 인간 N-설포글루코사민 설포하이드롤라제를 코딩하는 1512 bp 코돈 최적화된 cDNA 및 토끼 b-글로빈 pA에 상응하는 519 bp 단편을 함유하는 플라스미드. 이들 3개의 요소는 AAV 2 ITR 서열이 측면에 있다. 플라스미드 골격 크기는 3156 bp(표준 골격 크기)이고 966 bp 암피실린 내성 유전자, 514 bp 박테리오파지 복제 기원 및 589 bp의 높은 복사 수의 박테리아 복제 기원을 포함한다.
플라스미드 pcohSgsh-900(SEQ ID NO: 2)
1756 bp CAG 프로모터의 제어 하에 인간 N-설포글루코사민 설포하이드롤라제를 코딩하는 1512 bp 코돈 최적화된 cDNA 및 토끼 b-글로빈 pA에 상응하는 519 bp 단편을 함유하는 오버사이즈 플라스미드. 이들 3개의 요소는 AAV 2 ITR 서열이 측면에 있다. 플라스미드 골격은 7073 bp이고, 1043 bp 카나마이신 내성 유전자, 589 bp의 높은 복사수의 박테리아 복제 기원을 포함하며 추가적으로 4657 bp의 무작위 서열을 포함한다.
플라스미드 pohIDS-874(SEQ ID NO: 3)
1756 bp CAG 프로모터의 제어 하에 인간 이두로네이트 2-설파타제를 코딩하는 1653 bp 코돈 최적화된 cDNA 및 토끼 b-글로빈 pA에 상응하는 519 bp 단편을 함유하는 오버사이즈 플라스미드. 이들 3개의 요소는 AAV 2 ITR 서열이 측면에 있다. 플라스미드 골격은 7073 bp이고 1043 bp 카나마이신 내성 유전자, 589 bp의 높은 복사수의 박테리아 복제 기원을 포함하며 추가적으로 4657 bp의 무작위 서열을 포함한다.
플라스미드 pRepCap9-808(SEQ ID NO: 4)
원래의 위치에 P5 프로모터를 가지며 rep2 및 cap9 단백질을 암호화하는 플라스미드. 이 플라스미드는 AAV2 Rep 유전자에 상응하는 1866 bp 단편과 이어서 AAV9 Cap 유전자를 암호화하는 2211 bp의 서열을 포함한다. 130 bp AAV2 P5 프로모터는 Rep 유전자의 상류의 원래 위치에 위치한다. 플라스미드 골격은 암피실린 내성 유전자 및 높은 복사수의 박테리아 복제 기원을 포함한다.
플라스미드 pRepCap9-809(SEQ ID NO: 5)
Cap9 유전자 뒤에 P5 프로모터를 가지며 rep2 및 cap9 단백질을 암호화하는 플라스미드. 이 플라스미드는 AAV2 Rep 유전자에 상응하는 1866 bp 단편과 이어서 AAV9 Cap 유전자를 암호화하는 2211 bp의 서열을 포함한다. AAV2 P5 프로모터에 상응하는 130 bp의 서열은 Cap 유전자의 하류에 위치한다. 플라스미드 골격은 카나마이신 내성 유전자 및 높은 복사수의 박테리아 복제 기원을 포함한다.
플라스미드 pXX6
AAV 생산에 필요한 아데노바이러스 서열(E2, E4 및 VA-RNA)을 함유하는 플라스미드. 플라스미드 골격은 암피실린 내성 유전자 및 높은 복사수의 박테리아 복제 기원을 포함한다(Xiao et al. J Virol. 1998 Mar; 72(3): 2224-2232). 플라스미드 pXX6-80은 골격만이 변경된 pXX6으로부터 유래된다. pXX6-80 map 및 서열은 문헌에 잘 기술되었다.
플라스미드 pAdhelper861(SEQ ID NO: 6)
AAV 생산에 필요한 아데노바이러스 서열(E2, E4 및 VA-RNA)을 함유하는 플라스미드. 그것은 VA 유전자를 포함하는 731 bp의 영역, E2A 유전자 및 E4 유전자를 포함하는 5346 bp 영역을 함유하고 이것들의 조절 영역은 3181 bp 단편에 포함된다. 플라스미드 골격은 카나마이신 내성 유전자 및 높은 복사수의 박테리아 복제 기원을 포함한다.
1.2. 삼중 트랜스펙션에 의한 AAV9-CAG-cohSgsh 벡터 생산
물질 및 방법
AAV9-CAG-cohSgsh 벡터를 이전에 기술된 것과 같이 트랜스펙션 작용제로서 PEI-MAX를 사용하여 일시적인 삼중-트랜스펙션에 의해 생산하였다(Ayuso E, et al. Gene Ther. 2010 Apr;17(4):503-10). 간단히 설명하면, 합류 시의 HEK293 부착 세포를 등몰량의 3개의 플라스미드: pcohSgsh-827, pRepCap9-808 및 pXX6(표준 플라스미드) 또는 pcohSgsh-900, pRepCap9-809 및 pAdhelper861(최적화된 플라스미드)로 트랜스펙션하였다. PEI-MAX를 2:1의 PEI:DNA 비율로 사용하였다. 세포를 트랜스펙션 후 72시간 후에 수득하고 동결 및 해동의 3회 주기에 의해 용해하여 세포 내부로부터 rAAV 벡터를 방출시켰다(하기 실시예 2 참고). 현탁 HEK293 세포를 사용하는 rAAV 벡터의 생산이 또한 기재되어 있다(Joshua C Grieger, et al. Mol Ther. 2016 Feb;24(2):287-297).
벡터 게놈을 이전에 기술된 것과 같이(Ayuso et al. 상기에서 기술됨) 발현 카세트에 존재하는 토끼 베타-글로빈 폴리 A 서열에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 Taqman qPCR에 의해 정량화하였다. 또한, 역 포장을 사용된 모든 플라스미드 골격에 존재하는 항생물질 내성 프로모터 서열에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 Taqman qPCR에 의해 정량화하였다.
통계적 분석을 GraphPad Prism 7.00으로 수행하였다.
명칭 | 플라스미드 유형 |
pcohSgsh-827 | 표준 |
pRepCap9-808 | 표준 |
pXX6 | 표준 |
pcohSgsh-900 | 최적화된 |
pRepCap9-809 | 최적화된 |
pAdhelper861 | 최적화된 |
결과
위에서 기술한 것과 같이, 최적화된 플라스미드를 사용하는 삼중 트랜스펙션에 의한 재조합 AAV9 벡터 AAV9-CAG-cohSgsh의 생산은, AAV 벡터 생산에 통상적으로 사용된 표준 플라스미드로의 생산보다 더 높은 수율을 초래한다(도 1).
최적화된 플라스미드로의 삼중 트랜스펙션에 의해 생산된 AAV9-CAG-cohSgsh 벡터는 AAV 벡터 생산에 통상적으로 사용된 표준 플라스미드로 얻어진 것보다 박테리아 서열의 더 낮은 역 포장을 초래한다(도 2).
플라스미드가 스터퍼 DNA 서열을 함유하는 오버사이즈 플라스미드(pcohSgsh-900)인, 이종성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 최적화된 플라스미드의 사용은 비-최적화된 플라스미드, 즉 삼중 트랜스펙션에 사용된 표준 벡터와 함께 삼중 트랜스펙션에 사용될 때 벡터 게놈 수율을 개선하지 못한다. 그러므로, 최적화된 오버사이즈 플라스미드 단독의 사용은 삼중 트랜스펙션에 의해 벡터 게놈 수율의 개선을 초래하지 못한다(도 3).
그러나, 최적화된 오버사이즈 플라스미드와 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유한 최적화된 플라스미드(pAdhelper861) 또는 AAV rep 코딩 영역 및 AAV cap 코딩 영역을 함유한 최적화된 플라스미드(pRepCap9-809)와의 조합은 벡터 게놈 수율을 개선하였다(도 3 참고). 나아가, 3개의 최적화된 벡터가 조합될 때, 벡터 게놈 수율은 크게 향상된다(도 3 참고).
더욱이, 발명자들은 놀랍게도 최적화된 오버사이즈 플라스미드(pcohSgsh-900)와 하나 또는 둘 다의 최적화된 헬퍼 플라스미드, pRepCap9-809 및/또는 pAdhelper861과의 공동 트랜스펙션이 수행될 때 박테리아 서열의 역 포장의 감소를 발견하였다(도 4). 특히, 이들 최적화된 플라스미드의 삼중 조합의 사용은 역 포장의 더 큰 감소를 초래한다(도 4 및 5). 실제로, 최적화된 헬퍼 플라스미드(pAdhelper861) 및/또는(pRepCap9-809)의 사용으로 인한 박테리아 서열의 백분율의 감소는 오버사이즈 골격을 함유한 최적화된 플라스미드(pcohSgsh-900)가 공동 트랜스펙션되었을 때 더 명백하였다(도 5).
실시예 2: 삼중 트랜스펙션 및 연장된 유전자 발현(EGE)
2.1. 세포주, 배지, 및 배양 조건
사용된 세포주는 캐나다 국립 연구 위원회의 생명 공학 연구소(Montreal, Canada)에 의해 제공된 무혈청(serum-free) 현탁-적응된 HEK 293 세포주(HEK 293SF-3F6)이다. 세포를 글루타맥스 8 mM, 0.1% 플루로닉1(Invitrogen) 및 0.05 ng/L IGF가 보충된 프리스타일 F17 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양한다. 세포를 125-mL의 일회용 폴리카보네이트 에를렌마이어 플라스크(Corning, Steuben, NY)에서 20 mL의 배양 배지에서 일상적으로 유지한다. 플라스크를 공기 중의 5% CO2의 가습 분위기에서 37℃에서 유지된 인큐베이터에 배치된 궤도형 셰이커(Kuhner shakers, Switzerland)를 사용하여 130 rpm에서 흔들어준다. 세포수 및 생존율을 Nucleocounter NC-3000(Chemometec, Denmark)을 사용하여 측정한다.
2.2. 일시적인 트랜스펙션(TGE)
HEK 293 현탁 세포를 PEIPro(Polysciences, Warrington, PA)를 사용하여 일시적으로 트랜스펙션한다. HEK 293 세포를 0.5·106 세포/mL로 125-mL 일회용 플라스크에 시딩하고, 2·106 세포/mL로 성장시키고 0.76 μg의 pAdhelper861/mL 배양, 0.77 μg의 pRepCap9-809/mL 배양 및 0.38 μg의 pohIDS-874/mL 또는 0.38 μg의 pcohSgsh-900/mL 배양으로, 그리고 1:2의 DNA 대 PEI의 질량 비로 트랜스펙션한다. PEI/DNA 복합체를 PEI를 DNA에 빠르게 첨가함으로써 형성시키며, 둘 다 새로운 배양 배지에 희석하여 동일한 부피를 얻는다(복합체 혼합물 부피는 트랜스펙션될 배양의 총 부피의 5%임). 혼합물을 15분 동안 실온에서 인큐베이션하여 세포 배양에 첨가되기 전에 복합체가 형성되게 한다.
2.3.
coh-IDS
유전자에 대한 연장된 유전자 발현 방법
연장된 유전자 발현(EGE) 생산 전략은 단일 트랜스펙션 회기를 수반하는 종래의 TGE 접근법과 대조적으로 시간 경과에 따라 지속적인 수준의 유전자 발현을 달성하기 위하여 반복된 회기의 트랜스펙션을 수행하는 것으로 이루어진다. 위의 2.2에서 기술된 것과 동일한 플라스미드 및 조건을 사용한 제1 트랜스펙션 후에, 재트랜스펙션 회기를 48시간마다 원심분리(300 xg에서 5분 동안)에 의해 완전한 배지 교환을 수행한 후 동일한 플라스미드 및 PEI 농도를 사용하여 수행하였다. 이들 배지 교환을 실시함으로써, AAV는 배양 상층액으로 분비되고 각각의 재트랜스펙션이 수행되기 전 배지 교환 때마다 수득될 수 있다.
결과는 EGE 방법이 수행될 때 상층액으로부터 수득된 총 vg으로 3배 증가를 나타낸다(도 3 참고). 배치(단일 트랜스펙션) 후 회수된 총 vg은 세포 용해 후 얻어진 8E11 vg이었다. EGE 전략 후 회수된 총 vg은 상층액으로부터 2,5E12 vg이었고, 이것은 AAV를 수득하기 위해 세포가 용해될 필요가 없고 따라서 숙주 세포 DNA 및 숙주 세포 단백질로의 오염이 적을 것으로 예상되기 때문에 정제의 관점에서 장점이다.
2.4.
coh-Sgsh
유전자에 대한 연장된 유전자 발현 방법
EGE 방법을 또한 위의 2.3에서 설명한 것과 같이 유전자 coh-Sgsh에 대해 테스트하였다.
결과는 EGE 방법이 수행될 때 상층액으로부터 수득된 총 vg으로 1.7배 증가를 나타낸다(도 4 참고). 배치(단일 트랜스펙션) 후 회수된 총 vg은 세포 용해 후 얻어진 1.9E12 vg이었다. EGE 전략 후 회수된 총 vg은 상층액으로부터 3.18E12 vg이었다. AAV 생산은 phIDS에 대한 것과 유사한 패턴을 따랐고(위의 2.3 참고), 그로써 EGE 전략의 일반적인 적용 가능성을 지지한다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Plasmid pcohSgsh-827
<400> 1
gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120
taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180
attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240
gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360
acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540
tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600
cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660
gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720
gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780
gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840
gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg 900
actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa 960
ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg 1020
gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg 1080
cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg 1140
cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg gcggtgcccc 1200
gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg 1260
gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc cccctccccg 1320
agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct 1380
cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg 1440
ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg 1500
cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc 1560
tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg 1620
gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc 1680
gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg 1740
ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc 1800
tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt 1860
gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattg attaattcga gcgaacgcgt 1920
gccaccatga gctgccctgt gcccgcctgt tgtgccctgc tgctggtgct gggactgtgc 1980
agagccagac cccggaacgc tctgctgctg ctggccgacg atggcggatt tgagagcggc 2040
gcctacaaca acagcgccat tgccacccct catctggacg ccctggccag aagaagcctg 2100
ctgttccgga acgccttcac cagcgtgtcc agctgcagcc ctagcagagc ttccctgctg 2160
acaggcctgc cccagcatca gaatggcatg tacggcctgc accaggatgt gcatcacttc 2220
aacagcttcg acaaagtgcg gagcctgcca ctgctcctgt cacaggctgg cgtgagaacc 2280
ggcatcatcg gcaagaaaca cgtgggcccc gagacagtgt accccttcga cttcgcctac 2340
accgaagaga acggcagcgt gctgcaggtc ggccggaaca tcacccggat caagctgctc 2400
gtgcggaagt ttctccagac ccaggacgac cggcccttct tcctgtacgt ggccttccac 2460
gaccctcaca gatgcggcca cagccagccc cagtacggca ccttctgcga gaagttcggc 2520
aacggcgaga gcggcatggg cagaatcccc gactggaccc cccaggcata cgaccctctg 2580
gacgtgctgg tgccctactt cgtgcccaac acccctgccg ccagagctga tctggccgcc 2640
cagtacacca ccgtgggcag aatggatcag ggcgtgggcc tggtgctgca ggaactgagg 2700
gacgctggcg tgctgaacga caccctggtc atcttcacct ccgacaacgg catcccattc 2760
cccagcggcc ggaccaatct gtactggccc ggcacagccg aacctctgct ggtgtccagc 2820
cccgagcacc ctaagagatg gggccaggtg tccgaggcct acgtgtccct gctggacctg 2880
acccccacca tcctggactg gttcagcatc ccctacccca gctacgccat ctttggaagc 2940
aagaccatcc acctgaccgg cagatctctg ctgcctgccc tggaagctga gcctctgtgg 3000
gccaccgtgt tcggcagcca gagccaccac gaagtgacca tgagctaccc catgcggagc 3060
gtgcagcacc ggcacttccg gctggtgcac aacctgaact tcaagatgcc cttcccaatc 3120
gaccaggact tttacgtgtc ccccaccttc caggacctgc tgaacagaac cacagccggc 3180
cagcccaccg gctggtacaa ggacctgcgg cactactact accgggccag atgggagctg 3240
tacgacagaa gccgggaccc ccacgagaca cagaacctgg ccaccgaccc cagattcgcc 3300
cagctcctgg aaatgctgcg ggaccagctg gccaagtggc agtgggagac acacgaccct 3360
tgggtctgcg ctcccgacgg cgtgctggaa gagaagctgt ccccccagtg ccagccactg 3420
cacaacgagc tgtgatgaga attcgagctc ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt 3480
gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca 3540
ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct 3600
gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg 3660
tctctcactc ggaaggacat atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt 3720
ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata 3780
aagaggtcat cagtatatga aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc 3840
cttgacttga ggttagattt tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc 3900
cctaaaattt tccttacatg ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc 3960
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ccgcgtccag gtcctccgcg ttgctcaggg cgaacggagt caactttggt agctgccttc 1740
ccaaaaaggg cgcgtgccca ggctttgagt tgcactcgca ccgtagtggc atcaaaaggt 1800
gaccgtgccc ggtctgggcg ttaggataca gcgcctgcat aaaagccttg atctgcttaa 1860
aagccacctg agcctttgcg ccttcagaga agaacatgcc gcaagacttg ccggaaaact 1920
gattggccgg acaggccgcg tcgtgcacgc agcaccttgc gtcggtgttg gagatctgca 1980
ccacatttcg gccccaccgg ttcttcacga tcttggcctt gctagactgc tccttcagcg 2040
cgcgctgccc gttttcgctc gtcacatcca tttcaatcac gtgctcctta tttatcataa 2100
tgcttccgtg tagacactta agctcgcctt cgatctcagc gcagcggtgc agccacaacg 2160
cgcagcccgt gggctcgtga tgcttgtagg tcacctctgc aaacgactgc aggtacgcct 2220
gcaggaatcg ccccatcatc gtcacaaagg tcttgttgct ggtgaaggtc agctgcaacc 2280
cgcggtgctc ctcgttcagc caggtcttgc atacggccgc cagagcttcc acttggtcag 2340
gcagtagttt gaagttcgcc tttagatcgt tatccacgtg gtacttgtcc atcagcgcgc 2400
gcgcagcctc catgcccttc tcccacgcag acacgatcgg cacactcagc gggttcatca 2460
ccgtaatttc actttccgct tcgctgggct cttcctcttc ctcttgcgtc cgcataccac 2520
gcgccactgg gtcgtcttca ttcagccgcc gcactgtgcg cttacctcct ttgccatgct 2580
tgattagcac cggtgggttg ctgaaaccca ccatttgtag cgccacatct tctctttctt 2640
cctcgctgtc cacgattacc tctggtgatg gcgggcgctc gggcttggga gaagggcgct 2700
tctttttctt cttgggcgca atggccaaat ccgccgccga ggtcgatggc cgcgggctgg 2760
gtgtgcgcgg caccagcgcg tcttgtgatg agtcttcctc gtcctcggac tcgatacgcc 2820
gcctcatccg cttttttggg ggcgcccggg gaggcggcgg cgacggggac ggggacgaca 2880
cgtcctccat ggttggggga cgtcgcgccg caccgcgtcc gcgctcgggg gtggtttcgc 2940
gctgctcctc ttcccgactg gccatttcct tctcctatag gcagaaaaag atcatggagt 3000
cagtcgagaa gaaggacagc ctaaccgccc cctctgagtt cgccaccacc gcctccaccg 3060
atgccgccaa cgcgcctacc accttccccg tcgaggcacc cccgcttgag gaggaggaag 3120
tgattatcga gcaggaccca ggttttgtaa gcgaagacga cgaggaccgc tcagtaccaa 3180
cagaggataa aaagcaagac caggacaacg cagaggcaaa cgaggaacaa gtcgggcggg 3240
gggacgaaag gcatggcgac tacctagatg tgggagacga cgtgctgttg aagcatctgc 3300
agcgccagtg cgccattatc tgcgacgcgt tgcaagagcg cagcgatgtg cccctcgcca 3360
tagcggatgt cagccttgcc tacgaacgcc acctattctc accgcgcgta ccccccaaac 3420
gccaagaaaa cggcacatgc gagcccaacc cgcgcctcaa cttctacccc gtatttgccg 3480
tgccagaggt gcttgccacc tatcacatct ttttccaaaa ctgcaagata cccctatcct 3540
gccgtgccaa ccgcagccga gcggacaagc agctggcctt gcggcagggc gctgtcatac 3600
ctgatatcgc ctcgctcaac gaagtgccaa aaatctttga gggtcttgga cgcgacgaga 3660
agcgcgcggc aaacgctctg caacaggaaa acagcgaaaa tgaaagtcac tctggagtgt 3720
tggtggaact cgagggtgac aacgcgcgcc tagccgtact aaaacgcagc atcgaggtca 3780
cccactttgc ctacccggca cttaacctac cccccaaggt catgagcaca gtcatgagtg 3840
agctgatcgt gcgccgtgcg cagcccctgg agagggatgc aaatttgcaa gaacaaacag 3900
aggagggcct acccgcagtt ggcgacgagc agctagcgcg ctggcttcaa acgcgcgagc 3960
ctgccgactt ggaggagcga cgcaaactaa tgatggccgc agtgctcgtt accgtggagc 4020
ttgagtgcat gcagcggttc tttgctgacc cggagatgca gcgcaagcta gaggaaacat 4080
tgcactacac ctttcgacag ggctacgtac gccaggcctg caagatctcc aacgtggagc 4140
tctgcaacct ggtctcctac cttggaattt tgcacgaaaa ccgccttggg caaaacgtgc 4200
ttcattccac gctcaagggc gaggcgcgcc gcgactacgt ccgcgactgc gtttacttat 4260
ttctatgcta cacctggcag acggccatgg gcgtttggca gcagtgcttg gaggagtgca 4320
acctcaagga gctgcagaaa ctgctaaagc aaaacttgaa ggacctatgg acggccttca 4380
acgagcgctc cgtggccgcg cacctggcgg acatcatttt ccccgaacgc ctgcttaaaa 4440
ccctgcaaca gggtctgcca gacttcacca gtcaaagcat gttgcagaac tttaggaact 4500
ttatcctaga gcgctcagga atcttgcccg ccacctgctg tgcacttcct agcgactttg 4560
tgcccattaa gtaccgcgaa tgccctccgc cgctttgggg ccactgctac cttctgcagc 4620
tagccaacta ccttgcctac cactctgaca taatggaaga cgtgagcggt gacggtctac 4680
tggagtgtca ctgtcgctgc aacctatgca ccccgcaccg ctccctggtt tgcaattcgc 4740
agctgcttaa cgaaagtcaa attatcggta cctttgagct gcagggtccc tcgcctgacg 4800
aaaagtccgc ggctccgggg ttgaaactca ctccggggct gtggacgtcg gcttaccttc 4860
gcaaatttgt acctgaggac taccacgccc acgagattag gttctacgaa gaccaatccc 4920
gcccgccaaa tgcggagctt accgcctgcg tcattaccca gggccacatt cttggccaat 4980
tgcaagccat caacaaagcc cgccaagagt ttctgctacg aaagggacgg ggggtttact 5040
tggaccccca gtccggcgag gagctcaacc caatcccccc gccgccgcag ccctatcagc 5100
agcagccgcg ggcccttgct tcccaggatg gcacccaaaa agaagctgca gctgccgccg 5160
ccacccacgg acgaggagga atactgggac agtcaggcag aggaggtttt ggacgaggag 5220
gaggaggaca tgatggaaga ctgggagagc ctagacgagg aagcttccga ggtcgaagag 5280
gtgtcagacg aaacaccgtc accctcggtc gcattcccct cgccggcgcc ccagaaatcg 5340
gcaaccggtt ccagcatggc tacaacctcc gctcctcagg cgccgccggc actgcccgtt 5400
cgccgaccca accgtagatg ggacaccact ggaaccaggg ccggtaagtc caagcagccg 5460
ccgccgttag cccaagagca acaacagcgc caaggctacc gctcatggcg cgggcacaag 5520
aacgccatag ttgcttgctt gcaagactgt gggggcaaca tctccttcgc ccgccgcttt 5580
cttctctacc atcacggcgt ggccttcccc cgtaacatcc tgcattacta ccgtcatctc 5640
tacagcccat actgcaccgg cggcagcggc agcggcagca acagcagcgg ccacacagaa 5700
gcaaaggcga ccggatagca agactctgac aaagcccaag aaatccacag cggcggcagc 5760
agcaggagga ggagcgctgc gtctggcgcc caacgaaccc gtatcgaccc gcgagcttag 5820
aaacaggatt tttcccactc tgtatgctat atttcaacag agcaggggcc aagaacaaga 5880
gctgaaaata aaaaacaggt ctctgcgatc cctcacccgc agctgcctgt atcacaaaag 5940
cgaagatcag cttcggcgca cgctggaaga cgcggaggct ctcttcagta aatactgcgc 6000
gctgactctt aaggactagt ttcgcgccct ttctcaaatt taagcgcgaa aactacgtca 6060
tctccagcgg ccacacccgg cgccagcacc tgtcgtcagc gccattatga gcaaggaaat 6120
tcccacgccc tacatgtgga gttaccagcc acaaatggga cttgcggctg gagctgccca 6180
agactactca acccgaataa actacatgag cgcgggaccc cacatgatat cccgggtcaa 6240
cggaatccgc gcccaccgaa accgaattct cttggaacag gcggctatta ccaccacacc 6300
tcgtaataac cttaatcccc gtagttggcc cgctgccctg gtgtaccagg aaagtcccgc 6360
tcccaccact gtggtacttc ccagagacgc ccaggccgaa gttcagatga ctaactcagg 6420
ggcgcagctt gcgggcggct ttcgtcacag ggtgcggtcg cccgggtcgc gagtttaaac 6480
tacacaggaa acaggagaca caactccaag tgcatactct atgtcatttt catgggactg 6540
gtctggccac aactacatta atgaaatatt tgccacatcc tcttacactt tttcatacat 6600
tgcccaagaa taaagaatcg tttgtgttat gtttcaacgt gtttattttt caattgcaga 6660
aaatttcaag tcatttttca ttcagtagta tagccccacc accacatagc ttatacagat 6720
caccgtacct taatcaaact cacagaaccc tagtattcaa cctgccacct ccctcccaac 6780
acacagagta cacagtcctt tctccccggc tggccttaaa aagcatcata tcatgggtaa 6840
cagacatatt cttaggtgtt atattccaca cggtttcctg tcgagccaaa cgctcatcag 6900
tgatattaat aaactccccg ggcagctcac ttaagttcat gtcgctgtcc agctgctgag 6960
ccacaggctg ctgtccaact tgcggttgct taacgggcgg cgaaggagaa gtccacgcct 7020
acatgggggt agagtcataa tcgtgcatca ggatagggcg gtggtgctgc agcagcgcgc 7080
gaataaactg ctgccgccgc cgctccgtcc tgcaggaata caacatggca gtggtctcct 7140
cagcgatgat tcgcaccgcc cgcagcataa ggcgccttgt cctccgggca cagcagcgca 7200
ccctgatctc acttaaatca gcacagtaac tgcagcacag caccacaata ttgttcaaaa 7260
tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc tcatggcggg gaccacagaa cccacgtggc 7320
catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct cataaacacg ctggacataa 7380
acattacctc ttttggcatg ttgtaattca ccacctcccg gtaccatata aacctctgat 7440
taaacatggc gccatccacc accatcctaa accagctggc caaaacctgc ccgccggcta 7500
tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat gacagtggag agcccaggac tcgtaaccat 7560
ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca caggcacacg tgcatacact 7620
tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc ccagggaaca acccattcct 7680
gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac gtaactcacg ttgtgcattg 7740
tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag tatggtagcg cgggtttctg 7800
tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg ccgagacaac cgagatcgtg 7860
ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt catatttcct gaagcaaaac 7920
caggtgcggg cgtgacaaac agatctgcgt ctccggtctc gccgcttaga tcgctctgtg 7980
tagtagttgt agtatatcca ctctctcaaa gcatccaggc gccccctggc ttcgggttct 8040
atgtaaactc cttcatgcgc cgctgccctg ataacatcca ccaccgcaga ataagccaca 8100
cccagccaac ctacacattc gttctgcgag tcacacacgg gaggagcggg aagagctgga 8160
agaaccatgt tttttttttt attccaaaag attatccaaa acctcaaaat gaagatctat 8220
taagtgaacg cgctcccctc cggtggcgtg gtcaaactct acagccaaag aacagataat 8280
ggcatttgta agatgttgca caatggcttc caaaaggcaa acggccctca cgtccaagtg 8340
gacgtaaagg ctaaaccctt cagggtgaat ctcctctata aacattccag caccttcaac 8400
catgcccaaa taattctcat ctcgccacct tctcaatata tctctaagca aatcccgaat 8460
attaagtccg gccattgtaa aaatctgctc cagagcgccc tccaccttca gcctcaagca 8520
gcgaatcatg attgcaaaaa ttcaggttcc tcacagacct gtataagatt caaaagcgga 8580
acattaacaa aaataccgcg atcccgtagg tcccttcgca gggccagctg aacataatcg 8640
tgcaggtctg cacggaccag cgcggccact tccccgccag gaaccatgac aaaagaaccc 8700
acactgatta tgacacgcat actcggagct atgctaacca gcgtagcccc gatgtaagct 8760
tgttgcatgg gcggcgatat aaaatgcaag gtgctgctca aaaaatcagg caaagcctcg 8820
cgcaaaaaag aaagcacatc gtagtcatgc tcatgcagat aaaggcaggt aagctccgga 8880
accaccacag aaaaagacac catttttctc tcaaacatgt ctgcgggttt ctgcataaac 8940
acaaaataaa ataacaaaaa aacatttaaa cattagaagc ctgtcttaca acaggaaaaa 9000
caacccttat aagcataaga cggactacgg ccatgccggc gtgaccgtaa aaaaactggt 9060
caccgtgatt aaaaagcacc accgacagct cctcggtcat gtccggagtc ataatgtaag 9120
actcggtaaa cacatcaggt tgattcacat cggtcagtgc taaaaagcga ccgaaatagc 9180
ccgggggaat acatacccgc aggcgtagag acaacattac agcccccata ggaggtataa 9240
caaaattaat aggagagaaa aacacataaa cacctgaaaa accctcctgc ctaggcaaaa 9300
tagcaccctc ccgctccaga acaacataca gcgcttccac agcggcagcc ataacagtca 9360
gccttaccag taaaaaagaa aacctattaa aaaaacacca ctcgacacgg caccagctca 9420
atcagtcaca gtgtaaaaaa gggccaagtg cagagcgagt atatatagga ctaaaaaatg 9480
acgtaacggt taaagtccac aaaaaacacc cagaaaaccg cacgcgaacc tacgcccaga 9540
aacgaaagcc aaaaaaccca caacttcctc aaatcgtcac ttccgttttc ccacgttacg 9600
taacttccca ttttaagaaa actacaattc ccaacacata caagttactc cgccctaaaa 9660
cgttaacgcg gccgcctggg cctcatgggc cttcctttca ctgcccgctt tccagtcggg 9720
aaacctgtcg tgccagctgc attaacatgg tcatagctgt ttccttgcgt attgggcgct 9780
ctccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cgggtaaagc ctggggtgcc 9840
taatgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 9900
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 9960
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 10020
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 10080
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 10140
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 10200
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 10260
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 10320
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 10380
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 10440
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 10500
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 10560
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 10620
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt attagaaaaa ttcatccagc 10680
agacgataaa acgcaatacg ctggctatcc ggtgccgcaa tgccatacag caccagaaaa 10740
cgatccgccc attcgccgcc cagttcttcc gcaatatcac gggtggccag cgcaatatcc 10800
tgataacgat ccgccacgcc cagacggccg caatcaataa agccgctaaa acggccattt 10860
tccaccataa tgttcggcag gcacgcatca ccatgggtca ccaccagatc ttcgccatcc 10920
ggcatgctcg ctttcagacg cgcaaacagc tctgccggtg ccaggccctg atgttcttca 10980
tccagatcat cctgatccac caggcccgct tccatacggg tacgcgcacg ttcaatacga 11040
tgtttcgcct gatgatcaaa cggacaggtc gccgggtcca gggtatgcag acgacgcatg 11100
gcatccgcca taatgctcac tttttctgcc ggcgccagat ggctagacag cagatcctga 11160
cccggcactt cgcccagcag cagccaatca cggcccgctt cggtcaccac atccagcacc 11220
gccgcacacg gaacaccggt ggtggccagc cagctcagac gcgccgcttc atcctgcagc 11280
tcgttcagcg caccgctcag atcggttttc acaaacagca ccggacgacc ctgcgcgctc 11340
agacgaaaca ccgccgcatc agagcagcca atggtctgct gcgcccaatc atagccaaac 11400
agacgttcca cccacgctgc cgggctaccc gcatgcaggc catcctgttc aatcatactc 11460
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 11520
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 11580
ccac 11584
Claims (18)
- 재조합 바이러스 벡터의 생산 방법으로서, 상기 방법은:
a) 적합한 세포 배양을 적어도 2개의 플라스미드 벡터로 공동 트랜스펙션하는 단계로, 상기 플라스미드 벡터는 이종성 뉴클레오타이드 서열 및 복제 및 포장 (packaging) 유전자 서열을 포함하는 것인 단계;
b) 상기 세포를 바이러스 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계;
c) 단계 b)에서 생산된 바이러스 벡터를 회수하고, 세포를 추가의 분할 및 성장을 허용하는 조건 하 세포 배양에서 유지하는 단계;
d) 단계 c)에 따른 세포를 단계 a)에 따른 플라스미드 벡터로 재-트랜스펙션하는 단계; 및
e) 단계 b) 내지 c)를 반복하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 AAV 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 재조합 AAV의 생산 방법으로서, 상기 방법은:
a) 적합한 세포 배양을 적어도 2개의 플라스미드 벡터로 공동 트랜스펙션하는 단계로, 상기 벡터는 ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열, AAV rep 및 AAV cap 유전자 서열, 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 서열을 포함하는 것인 단계;
b) 상기 세포를 AAV 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계;
c) 단계 b)에서 생산된 AAV를 회수하고, 세포를 추가의 분할 및 성장을 허용하는 조건 하 세포 배양에서 유지하는 단계;
d) 단계 c)에 따른 세포를 단계 a)에 따른 플라스미드 벡터로 재-트랜스펙션하는 단계; 및
e) 단계 b) 내지 c)를 반복하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 AAV는 세포 배양의 상층액으로 분비되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양의 세포 배지는 단계 d) 전에 교환되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 세포 배지 교환은 관류에 의해 수행되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d), b) 및 c)는 회수 단계 c) 후에 적어도 한 번 더 반복되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)는 교반된 액체 배지에서 현탁으로 상기 세포를 배양하여 수행되는 것인 방법.
- 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 다음 3개의 플라스미드 벡터가 사용되는 것인 방법:
i) 플라스미드 골격 크기가 5000 bp를 초과하는, 바람직하게는 7000 bp 내지 7500 bp인 것을 특징으로 하고, ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열 및 상기 ITR 외부에, 바람직하게는 하나의 ITR에 인접하여 위치한 스터퍼 DNA 서열을 포함하며, 상기 스터퍼 서열은 4400 bp 내지 4800 bp의 길이를 가지는 것인 제1 플라스미드 벡터;
ii) 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터; 및
iii) VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 제3 플라스미드 벡터로, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B) 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는 것인 제3 플라스미드 벡터. - 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 벡터는 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는 것인 방법.
- 재조합 AAV의 생산 방법으로서, 상기 방법은:
a) 적합한 세포를
i) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터;
ii) 5'에서 3' 쪽으로 AAV rep 코딩 영역, AAV cap 코딩 영역 및 AAV p5 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터, 및
iii) VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 제3 플라스미드 벡터로, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B) 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는 것인 제3 플라스미드 벡터
로 공동 트랜스펙션하는 단계;
b) 상기 세포를 AAV 복제 및 포장을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생산된 AAV를 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제11항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 벡터 i)은 플라스미드 골격 크기가 5000 bp를 초과하는, 바람직하게는 7000 bp 내지 7500 bp인 것과, 상기 ITR 외부에, 바람직하게는 하나의 ITR에 인접하여 위치한 스터퍼 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 스터퍼 서열은 4400 bp 내지 4800 bp의 길이를 가지는 것인, 재조합 AAV의 생산 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 벡터 i)은 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는 것인 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 플라스미드 벡터 (ii)는 AAV Rep2 및 AAV Cap9 코딩 영역을 포함하는 것인 방법.
- 플라스미드 벡터로서,
a) ITR이 측면에 있는 이종성 뉴클레오타이드 서열; 및
b) 상기 ITR 외부에 그리고 하나의 ITR에 인접하여 위치한 스터퍼 DNA 서열로서, 상기 스터퍼 서열은 플라스미드 골격 크기가 5 Kb를 초과하도록, 바람직하게는 7000 bp 내지 7500 bp가 되도록 4400 Kb 내지 4800 Kb의 길이를 가지는 스터퍼 DNA 서열
을 포함하고;
상기 플라스미드 벡터는 골격 서열에 F1Ori 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는 것인, 플라스미드 벡터. - 제15항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시된 수탁 번호 DSM 32967을 가진 pcohSgsh-900인 것인 플라스미드 벡터.
- 플라스미드 벡터로서, VA-RNA, E2A 및 E4 서열을 포함한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하며, 상기 플라스미드는 E3, pTB(E2B) 및 Ad ITR 프로테아제 서열을 함유하지 않는 플라스미드 벡터.
- 제17항에 있어서, SEQ ID NO: 6에 제시된 수탁 번호 DSM 32965를 가진 pAdhelper-861인 것인 플라스미드 벡터.
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