JP2022527407A - 組換えウイルスベクターの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)少なくとも2つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含むプラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
b)ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生されたウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
d)ステップa)に記載のプラスミドベクターでステップc)に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
e)ステップb)からステップc)まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
a)
i)ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第1プラスミドベクター、
ii)5’から3’まで、AAV repコード領域、AAV capコード領域および、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第2プラスミドベクター、
iii)VA-RNA、E2AおよびE4配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第3プラスミドベクターであって、プラスミドがE3、pTB(E2B)、Ad ITRおよびプロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
b)AAVの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生されたAAVを回収するステップと、
を含む、方法は、本発明のさらなる側面である。
a)ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
b)ITRの外側にあり、ITRの1つに隣接するスタッファーDNA配列であって、プラスミドの骨格サイズが5Kb超、好ましくは7000bp~7500bpであるようにスタッファー配列が長さ4400Kb~4800Kbを有するスタッファーDNA配列と、
を含むプラスミドベクターにおいて、骨格配列中にF1Oriヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクターに関する。
プラスミドpAdHelper861は、2018年12月5日、アクセス番号DSM 32965としてDSMZ(ドイツ微生物細胞培養コレクション、ドイツ連邦共和国D-38124ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ7B)に寄託された。
定義
本明細書で用いる場合、「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むかまたはそれと結合した高分子または高分子の結合体であって、細胞へのそのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができるものを指す。例示的なベクターは、たとえば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルを含む。
発明の詳細な説明
組換えウイルスベクターの高力価調製物を生成する方法、特に、遺伝子治療法の実用化に適した規模でその方法を効果的に使用することができる組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)の高力価調製物を生成する方法を提供することが本発明の目的である。
a)少なくとも2つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含むプラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
b)ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生されたウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
d)ステップa)に記載のプラスミドベクターでステップc)に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
e)ステップb)からステップc)まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
a)少なくとも2つのプラスミドベクターであって、ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列、AAV repおよびAAV cap遺伝子配列ならびにアデノウイルスヘルパー機能配列を含むベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
b)AAVの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生されたAAVを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
d)ステップa)に記載のプラスミドベクターでステップc)に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
e)ステップb)からステップc)まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
i)第1プラスミドベクターであって、ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列と、ITRの外側にあるスタッファーDNA配列とを含み、プラスミドの骨格サイズが5Kb超になるように、スタッファー配列が長さ4400Kb~4800Kbを有する第1プラスミドベクター、
ii)5’から3’まで、AAV repコード領域、AAV capコード領域および、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第2プラスミドベクター、
iii) VA-RNA、E2A y E4配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第3プラスミドベクターであって、プラスミドがE3、pTB(E2B)およびAd ITRプロテアーゼ配列を含まない第3プラスミドベクター、
が用いられる。
i)ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列と、ITRの外側にあり、好ましくはITRの1つに隣接するスタッファーDNA配列とを含む第1プラスミドベクターであって、プラスミドの骨格サイズが5Kb超であり、好ましくは7000bp~7500bpであり、より好ましくは7000bp~7200bpであるように、スタッファー配列が長さ4400Kb~4800Kbを有する第1プラスミドベクター、
ii)AAV repコード領域、AAV capコード領域、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列ならびに、VA-RNA、E2AおよびE4配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第2プラスミドベクターであって、プラスミドがE3、pTB(E2B)およびAd ITRプロテアーゼ配列を含まない第2プラスミドベクター、
が用いられる本発明の方法にも関する。
組換えAAVの産生方法であって、
a)
i)ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第1プラスミドベクター、
ii)5’から3’まで、AAV repコード領域、AAV capコード領域および、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第2プラスミドベクター、
iii)VA-RNA、E2A y E4配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第3プラスミドベクターであって、プラスミドがE3、pTB(E2B)およびAd ITR プロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
b)AAVの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生されたAAVを回収するステップと、
を含む、方法に関する。
a)ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
b)ITRの外側にあり、ITRの1つに隣接するスタッファーDNA配列であって、プラスミドの骨格サイズが5Kb超、好ましくは7000bp~7500bp、より好ましくは、7000bp~7200bpになるように、スタッファー配列が長さ4400Kb~4800Kb、より好ましくは、4500Kb~4700Kb、より一層好ましくは、4600Kb~4700Kbを有するスタッファーDNA配列と、
を含むプラスミドベクターにおいて、骨格配列中にF1Oriヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクターにも関する。本発明のより好ましい実施形態において、プラスミドは、アクセッション番号DSM 32967を有する、配列番号2に記載のpcohSgsh-900である。
遺伝子治療のためのrAAVの使用
本発明のrAAVウイルスベクターは、遺伝子治療の目的で個人への投与のために使用することができる。遺伝子治療のための適切な疾患は、限定するものではないが、ウイルス、細菌または寄生虫感染によって誘発される疾患、様々な悪性腫瘍および過剰増殖状態、自己免疫状態および先天性欠損を含む。好ましい実施形態において、本発明の方法によって産生されるrAAVベクターは、ライソゾーム病(LSD)の治療に使用される。より好ましくは、ベクターは、ムコ多糖症(MPS)の治療に有益である。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、MPSの治療に有用な酵素をコードする配列である。特に、配列は、ヒトα-L-イズロニダーゼ、ヒトヘパランスルファミダーゼ、ヒトN-スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ヒトα-N-アセチルグルコサミニダーゼ、ヒトヘパラン-α-グルコサミニド、ヒトN-アセチルトランスフェラーゼ、ヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)、ヒトN-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、ヒトガラクトース6-硫酸スルファターゼ、ヒトβ-ガラクトシダーゼ、ヒトN-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ、β-グルクロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼからなる群から選択される。
実施例
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の従来技術を用いる。これらの技術は、文献で十分に説明されている。
実施例1:標準プラスミドベクターと比較した、最適化されたベクターを用いる三重トランスフェクション
1.1.プラスミドの説明
プラスミドpcohSgsh-827(配列番号1)
1756bpのCAGプロモーターおよび、ウサギβ-グロビンpAに相当する519bpのフラグメントの制御下にあるヒトN-スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードする1512bpのコドン最適化cDNAを含むプラスミド。これらの3つの因子は、AAVの2つのITR配列に隣接する。このプラスミドの骨格サイズは3156bp(標準骨格サイズ)であり、966bpのアンピシリン耐性遺伝子、514bpのバクテリオファージ複製起点および589bpの高コピー数の細菌の複製起点を含む。
プラスミドpcohSgsh-900(配列番号2)
1756bpのCAGプロモーターおよび、ウサギβ-グロビンpAに相当する519bpのフラグメントの制御下にあるヒトN-スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードする1512bpのコドン最適化cDNAを含む大きすぎるプラスミド。これらの3つの因子は、AAVの2つのITR配列に隣接する。このプラスミド骨格は7073bpであり、1043bpのカナマイシン耐性遺伝子、589bpの高コピー数の細菌の複製起点を含み、さらに4657bpのランダム配列を含む。
プラスミドpohlDS-874(配列番号3)
1756bpのCAGプロモーターおよび、ウサギβ-グロビンpAに相当する519bpのフラグメントの制御下にあるヒトイズロン酸-2-スルファターゼをコードする1653bpのコドン最適化cDNAを含む大きすぎるプラスミド。これらの3つの因子は、AAVの2つのITR配列に隣接する。このプラスミド骨格は7073bpであり、1043bpのカナマイシン耐性遺伝子、589bpの高コピー数の細菌の複製起点を含み、さらに4657bpのランダム配列を含む。
プラスミドpRepCap9-808(配列番号4)
その元の位置に、P5プロモーターとともにrep2およびcap9タンパク質をコードするプラスミド。このプラスミドは、AAV2 Rep遺伝子に相当する1866bpのフラグメントと、それに続く、AAV9Cap遺伝子をコードする2211bpの配列とを含む。130bpのAAV2 P5プロモーターは、Rep遺伝子の上流のその元の位置に配置される。このプラスミド骨格は、アンピシリン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む。
プラスミドpRepCap9-809(配列番号5)
Cap9遺伝子の後のP5プロモーターとともにrep2およびcap9タンパク質をコードするプラスミド。このプラスミドは、AAV2 Rep遺伝子に相当する1866bpのフラグメントと、それに続く、AAV9Cap遺伝子をコードする2211bpの配列とを含む。AAV2 P5プロモーターに相当する130bpの配列は、Cap遺伝子の下流にある。このプラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む。
プラスミドpXX6
AAV産生に必要なアデノウイルス配列(E2、E4およびVA-RNA)を含むプラスミド。このプラスミド骨格は、アンピシリン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む(Xiaoら J Virol. 1998年3月;72(3):2224-2232)。プラスミドpXX6-80は、骨格のみが改変されたpXX6に由来する。pXX6-80の地図および配列は文献で詳細に説明されている。
プラスミドpAdHelper861(配列番号6)
AAV産生に必要なアデノウイルス配列(E2、E4およびVA-RNA)を含むプラスミド。このプラスミドは、VA遺伝子を含む731bpの領域、E2A遺伝子およびE4遺伝子を含む5346bpの領域を含み、それらの調節領域は3181bpのフラグメントに含まれる。このプラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子および高コピー数の細菌の複製起点を含む。
1.2.三重トランスフェクションによるAAV9-CAG-cohSgshベクターの産生
材料および方法
AAV9-CAG-cohSgshベクターは、既述のように(Ayuso Eら Gene Ther. 2010年4月;17(4):503-10)、トランスフェクション剤としてPEI-MAXを用いる一過性の三重トランスフェクションによって産生された。簡潔に言えば、集密状態のHEK 293付着細胞を、等モル量の3つのプラスミド:pcohSgsh-827、pRepCap9-808およびpXX6(標準プラスミド)またはpcohSgsh-900、pRepCap9-809およびpAdHelper861(最適化されたプラスミド)、でトランスフェクトした。PEI-MAXは、2:1のPEI:DNA比で用いた。トランスフェクション後72時間で細胞を採取し、3サイクルの凍結融解によって溶解して、細胞内からrAAVベクターを放出させた(以下の実施例2参照)。HEK 293懸濁細胞を用いるrAAVベクターの産生についても記述がある(Joshua C Griegerら Mol Ther. 2016年2月;24(2):287-297)。
前述のように、最適化されたプラスミドを用いる三重トランスフェクションによる組換えAAV9ベクターAAV9-CAG-cohSgshの産生は、AAVベクターの産生によく使用される標準プラスミドでの産生よりも高収量をもたらす(図1)。
実施例2:三重トランスフェクションおよび長期遺伝子発現(EGE)
2.1.細胞株、培地および培養条件
用いた細胞株は、カナダ国立研究機構バイオテクノロジー研究所(カナダ、モントリオール)によって提供された無血清懸濁液適応HEK 293細胞株(HEK 293SF-3F6)である。細胞は、Glutamax(8mM)、Pluronic1(インビトロゲン社)(0.1%)およびIGF(0.05ng/L)を添加したFreestyle F17培地(インビトロゲン社、カリフォルニア州カールスバッド)で培養する。細胞は、125mLディスポーザブルポリカーボネートエルレンマイヤーフラスコ(コーニング社、ニューヨーク州スチューベン)中、20mLの培地で継続的に維持される。フラスコは、空気中5%CO2の加湿雰囲気下で37℃に維持したインキュベーター内に設置したオービタルシェーカー(キューナーシェーカー社、スイス)を用いて130rpmで振盪する。細胞数および生存率は、Nucleocounter NC-3000(ケモメテック社、デンマーク)を用いて測定した。
2.2.一過性トランスフェクション(TGE)
HEK 293懸濁細胞は、PEIPro(ポリサイエンス社、ペンシルベニア州ウォリントン)を用いて一過性にトランスフェクトする。HEK 293細胞を、125mLディスポーザブルフラスコ中、0.5・106細胞/mLで播種し、2・106細胞/mLまで増殖させ、pAdHelper861を0.76μg/培養物1mL、pRepCap9-809を0.77μg/培養物1mLおよび、pohlDS-874を0.38μg/培養物1mLまたはpcohSgsh-900を0.38μg/培養物1mLで、DNA対PEI重量比1:2でトランスフェクトする。DNAにPEIを迅速に添加し、両方とも新鮮培地で同じ容量に希釈することによって、PEI/DNA複合体が形成される(複合体混合物の容量は、トランスフェクトされる培養物の全量の5%である)。細胞培養物への添加の前に、混合物を室温で15分間インキュベートして複合体を形成させる。
2.3.coh-IDS遺伝子の長期遺伝子発現方法論
長期遺伝子発現(EGE)産生戦略は、経時的な遺伝子発現レベルの持続を達成するために、単一のトランスフェクションラウンドを必要とする従来のTGEアプローチとは対照的に、反復ラウンドのトランスフェクションを行うことからなる。上記の2.2.で記述したものと同じプラスミドおよび条件を用いた最初のトランスフェクション後に、遠心分離(300xg、5分間)によって完全培地交換を行った後、同じプラスミドおよびPEI濃度を用いて48時間ごとに再トランスフェクションラウンドを行った。これらの培地交換を行うことによって、AAVは培養物の上清に分泌され、再トランスフェクションが行われる前に、培地交換ごとに採取することができる。
2.4.coh-Sgsh遺伝子の長期遺伝子発現方法論
上記の2.3.で述べたように、遺伝子coh-Sgshについて、EGE方法論も試験した。
Claims (18)
- 組換えウイルスベクターの産生方法であって、
a)少なくとも2つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含む前記プラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
b)ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で前記細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生された前記ウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で前記細胞培養物中に前記細胞を保持するステップと、
d)ステップa)に記載の前記プラスミドベクターでステップc)に記載の前記細胞を再トランスフェクトするステップと、
e)ステップb)からステップc)まで繰り返すステップと、
を含む、方法。 - 前記組換えウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびAAVベクターからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 組換えAAVの産生方法であって、
a)少なくとも2つのプラスミドベクターであって、ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列、AAV repおよびAAV cap遺伝子配列ならびにアデノウイルスヘルパー機能配列を含む前記ベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
b)AAVの複製およびパッケージングを可能にする条件で前記細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生された前記AAVを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で前記細胞培養物中に前記細胞を保持するステップと、
d)ステップa)に記載の前記プラスミドベクターでステップc)に記載の前記細胞を再トランスフェクトするステップと、
e)ステップb)からステップc)まで繰り返すステップと、
を含む、方法。 - ステップb)において、AAVが前記細胞培養物の上清に分泌される、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞培養物の細胞培地が、ステップd)の前に交換される、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞培地交換が灌流によって行われる、請求項5に記載の方法。
- ステップd)、ステップb)およびステップc)が、回収ステップc)の後に少なくとももう1回繰り返される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)が、撹拌液体培地の懸濁液中で前記細胞を培養することによって行われる、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- ステップa)において、以下の3つのプラスミドベクター:
i)第1プラスミドベクターであって、前記プラスミドの骨格サイズが5000pb超、好ましくは7000bp~7500bpであり、ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列と、前記ITRの外側にあり、好ましくはITRの1つに隣接するスタッファーDNA配列とを含み、前記スタッファー配列が長さ4400pb~4800pbを有することを特徴とする第1プラスミドベクター、
ii)5’から3’まで、AAV repコード領域、AAV capコード領域および、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第2プラスミドベクター、
iii)VA-RNA、E2AおよびE4配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第3プラスミドベクターであって、前記プラスミドがE3、pTB(E2B)およびAd ITRプロテアーゼ配列を含まない第3プラスミドベクター、
が用いられる、請求項3~8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1プラスミドベクターが、前記骨格配列中にF1Oriヌクレオチド配列を含まない、請求項8または9のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えAAVの産生方法であって、
a)
i)ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第1プラスミドベクター、
ii)5’から3’まで、AAV repコード領域、AAV capコード領域および、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第2プラスミドベクター、
iii)VA-RNA、E2AおよびE4配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第3プラスミドベクターであって、前記プラスミドがE3、pTB(E2B)およびAd ITRプロテアーゼ配列を含まない前記プラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
b)AAVの複製およびパッケージングを可能にする条件で前記細胞を培養するステップと、
c)ステップb)で産生された前記AAVを回収するステップと、
を含む、方法。 - 前記第1プラスミドベクターi)が、前記プラスミドの骨格サイズが5000pb超、好ましくは7000bp~7500bpであり、かつ前記ITRの外側にあり、好ましくはITRの1つに隣接するスタッファーDNA配列を含み、前記スタッファー配列が長さ4400pb~4800pbを有することを特徴とする、請求項11に記載の組換えAAVの産生方法。
- 前記第1プラスミドベクターi)が、前記骨格配列中にF1Oriヌクレオチド配列を含まない、請求項12に記載の方法。
- 前記第2プラスミドベクター(ii)がAAV Rep2およびAAV Cap9コード領域を含む、請求項11~13のいずれか1項に記載の方法。
- プラスミドベクターであって、
a)ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
b)前記ITRの外側にあり、ITRの1つに隣接するスタッファーDNA配列であって、前記プラスミドの骨格サイズが5Kb超、好ましくは7000bp~7500bpであるように、前記スタッファー配列が長さ4400Kb~4800Kbを有するスタッファーDNA配列と、
を含む前記プラスミドベクターにおいて、前記骨格配列中にF1Oriヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクター。 - アクセッション番号DSM 32967を有する、配列番号2に記載のpcohSgsh-900である、請求項15に記載のプラスミドベクター。
- VA-RNA、E2AおよびE4配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含むプラスミドベクターであって、前記プラスミドが、E3、pTB(E2B)およびAd ITRプロテアーゼ配列を含まない、プラスミドベクター。
- アクセッション番号DSM 32965を有する、配列番号6に記載のpAdHelper-861である、請求項17に記載のプラスミドベクター。
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