CN114466926A - 用于制造重组病毒载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产高效价重组病毒载体，更具体地重组AAV载体的方法，使得该方法可以在适合基因治疗技术实际应用的规模上有效使用。

Description

用于制造重组病毒载体的方法

技术领域

本发明涉及生产高效价重组病毒载体，更具体地重组AAV载体的方法，使得该方法可以在适合基因治疗技术实际应用的规模上有效使用。

背景技术

基因递送是治疗获得性和遗传性疾病的一种很有前途的方法。已经描述了许多用于基因转移目的的基于病毒的系统，包括基于腺相关病毒(AAV)的系统。

AAV具有独特的功能，使其作为基因治疗的载体具有吸引力。AAV感染多种细胞类型。然而，它们是非转化的，并且不涉及任何人类疾病的病因。将DNA引入受体宿主细胞通常会导致DNA的长期持续存在和表达，而不会干扰细胞的正常代谢。

AAV粒子由具有三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的蛋白质衣壳组成，它们包含约4.7kb的线性单链DNA基因组，其中包含Rep和Cap基因，侧翼是病毒反向末端重复序列(ITR)。单个粒子仅包裹一条DNA分子链，但这可能是正链或负链。包含任一链的粒子都具有感染性，通过将亲本感染单链转化为双链体形式并随后进行扩增，后代单链被置换并包装成衣壳，从而发生复制。

通过删除AAV基因组的内部部分并在ITR之间插入感兴趣的DNA序列，可以将AAV载体设计为携带感兴趣的异源核苷酸序列(例如，选定的基因、反义核酸分子、核酶等)。ITR是顺式复制和包装包含感兴趣的异源核苷酸序列的载体基因组所需的唯一序列。异源核苷酸序列通常还与能够在某些条件下驱动患者靶细胞中基因表达的启动子序列链接。终止信号，例如聚腺苷酸化位点，通常包含在载体中。

rep和cap AAV基因产物分别为载体基因组的复制和衣壳化提供功能，它们以反式存在就足够了。

尽管基因疗法作为人类遗传疾病的治疗方法具有潜在的好处，但严重的实际限制阻碍了其在临床中的广泛应用。从这个意义上说，有必要产生大量的rAAV粒子以产生临床有效剂量。使用当前技术生产大量粒子需要大量生产细胞。在实验室规模，它需要数千个组织培养瓶。在商业规模上，需要更高效、更密集的生产平台才能达到临床应用。从商业生产的角度来看，提高生产细胞的数量和每个细胞的粒子产量的好处将是非常显著的。

因此，在重组AAV载体(例如用于基因治疗的那些载体)的开发中，需要获得高效价AAV的策略，以便可以在适合基因治疗技术实际应用的规模上有效地使用这些方法。

本公开提供了实现这些竞争目标的方法，并证明此类技术可用于大规模生产重组AAV载体制剂。

发明概述

本发明的发明人已经发现，通过进行重复转染，可以显著提高重组病毒生产，更特别是rAAV生产。如以下实施例所示，与需要单轮转染的常规方法相反，当进行重复转染轮次时，随时间获得持续水平的基因表达。

因此，在第一方面，本发明涉及生产重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述质粒载体包含异源核苷酸序列以及复制和包装基因序列；

b)在允许病毒复制和包装的条件下培养所述细胞；

c)回收步骤b)中产生的病毒载体，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；

d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及

e)重复步骤b)到c)。

此外，发明人已经发现，用于转染的优化质粒的组合导致比使用通常用于AAV载体生产的标准质粒的生产更高的rAAV产量。此外，如下面的实施例所示，发明人惊奇地发现，使用根据本发明的优化质粒导致细菌序列的反向包装降低。

因此，本发明的另一方面是生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将合适的细胞与以下共转染

i)包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列的第一质粒载体；

ii)包含从5'到3'AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体，以及

iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA-RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列；

b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；以及

c)回收步骤b)中产生的AAV。

本发明人惊奇地发现，通过在转染中使用优化质粒的组合，大大减少了反向包装并且获得了更高的载体基因组产量。

因此，在另一方面，本发明涉及质粒载体，包括：

a)侧翼为ITR的异源核苷酸序列；以及

b)位于所述ITR外部并与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400Kb到4800Kb之间，使得质粒骨架大小在5Kb以上，优选在7000bp到7500bp之间；

其中所述质粒载体在主链序列中不含F1Ori核苷酸序列。

在另一方面，本发明涉及包含腺病毒辅助功能的质粒载体，包括VA-RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。

附图说明

图1是在用一组标准质粒或一组优化质粒三重转染产生的总vg中表达的AAV9-CAG-cohSgsh的产量。

图2是由一组标准质粒或一组优化质粒三重转染产生的AAV9-CAG-cohSgsh中存在的细菌序列副本。

图3是优化质粒pcohSgsh-900单独或与其他优化辅助质粒(pRepCap9-809和pAdhelper861)组合对AAV载体产量(总vg)的影响。

图4是细菌序列的反向包装。优化的超大质粒pcohSgsh-900单独或与其他优化的辅助质粒(pRepCap9-809和pAdhelper861)组合的效果。

图5是细菌序列的反向包装。优化的超大质粒pcohSgsh-900与其他优化的辅助质粒(pRepCap9-809和pAdhelper861)组合时的效果。

图6是用pohIDS-874质粒瞬时转染后回收的总vg。细胞裂解和在执行几轮重新转染后在培养上清液中回收的总vg。时间以转染后的小时数(hpt)表示。

图7是用pohSGSH-900质粒瞬时转染后回收的总vg。细胞裂解和在执行几轮重新转染后在培养上清液中回收的总vg。时间以转染后的小时数(hpt)表示。

微生物沉积

质粒pAdHelper861于2018年12月5日保藏于德意志联邦共和国DSMZ–DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraβe 7B,D-38124Braunschweig，保藏号为DSM 32965。

质粒pcohSgsh-827于2018年12月5日保藏于德意志联邦共和国DSMZ–DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraβe 7B,D-38124Braunschweig，保藏号为DSM 32966。

质粒pcohSgsh-900于2018年12月5日保藏于德意志联邦共和国DSMZ–DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，Inhoffenstraβe 7B，D-38124Braunschweig，保藏号为DSM 32967。

质粒pohIDS-874于2018年12月5日保藏于德意志联邦共和国DSMZ–DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraβe 7B,D-38124Braunschweig，保藏号为DSM 32968。

质粒pRepCap9-809于2018年12月5日保藏于德意志联邦共和国DSMZ–DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraβe 7B,D-38124Braunschweig，保藏号为DSM 32969。

定义

如本文所用，“载体”是指包含多核苷酸或与多核苷酸缔合并且可用于介导多核苷酸向细胞递送的大分子或大分子联合。示例性载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。

术语“腺相关病毒”、“AAV病毒”、“AAV病毒体”、“AAV病毒粒子”和“AAV粒子”在本文中用作同义词，是指由至少一种AAV衣壳蛋白组成的病毒粒子(优选由特定AAV血清型的所有衣壳蛋白组成)和对应于AAV基因组的封装多核苷酸组成。野生型AAV是指属于细小病毒科依赖病毒属的病毒。野生型AAV基因组长约4.7Kb，由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)组成，可以是阳性或阴性。野生型基因组包括DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)和三个开放阅读框(ORF)。ORF rep编码AAV生命周期所需的四种Rep蛋白。ORF cap包含编码衣壳蛋白的核苷酸序列：VP1、VP2和VP3，它们相互作用形成二十面体对称的衣壳。最后，与Cap ORF重叠的AAP ORF编码似乎促进衣壳组装的AAP蛋白。如果粒子包含侧翼为AAV ITR的异源多核苷酸(即不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则它通常被称为“AAV载体粒子”或“AAV病毒载体”或“AAV载体”或“重组AAV载体”。本发明还包括使用双链AAV或自互补AAV，也称为dsAAV或scAAV。

如本文所用，术语“腺相关病毒ITR”或“AAV ITR”是指存在于AAV基因组DNA链两端的反向末端重复序列。AAV基因组的有效增殖需要ITR序列。这些序列的另一个特性是它们形成发夹的能力。这一特性有助于它们的自引发，从而允许第二条DNA链的不依赖引物酶的合成。ITR也被证明是将野生型AAV DNA整合到宿主细胞基因组中(例如在用于血清型2AAV的人类第19号染色体中)并从中拯救以及有效包裹成完全组装的、抗脱氧核糖核酸酶的AAV粒子的AAV DNA所必需。ITR序列长约145bp。优选地，在AAV病毒载体的基因组中使用ITR的完整序列，尽管允许对这些序列进行某种程度的微小修饰。野生型ITR序列可以通过插入、删除或截断来改变，只要ITR介导所需的功能，例如复制、切口、病毒包装、整合和/或原病毒拯救。修饰这些ITR序列的程序是本领域公知的。ITR可以来自任何野生型AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或任何其他已知或后来发现的AAV。AAV包括两个可能相同或不同的ITR。此外，两个AAV ITR可以来自与AAV衣壳相同的AAV血清型，也可以不同。在优选的实施方案中，5'和3'AAV ITR源自AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8和/或AAV9。优选ITR来自AAV2、AAV8和/或AAV9，最优选AAV2。在一个实施方案中，选择AAV2 ITR以产生假型AAV(即，具有衣壳和源自不同血清型的ITR的AAV)。

如本文所用，表述“重组病毒基因组”是指AAV基因组，其中至少一个外来多核苷酸插入到天然存在的AAV基因组中。根据本发明的AAV的基因组通常包含顺式作用的5'和3'反向末端重复序列(ITR)和表达盒。如本文所用，“rAAV载体”是指包含非AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，通常是用于细胞遗传转化的目的序列。在本发明的优选载体构建体中，异源多核苷酸侧接两个AAV反向末端重复序列(ITR)。

“AAV病毒”或“AAV病毒粒子”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(优选由野生型AAV的所有衣壳蛋白)和衣壳化的多核苷酸组成的病毒粒子。如果粒子包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则通常将其称为“rAAV载体粒子”或简称为“rAAV载体”。

“包装”是指导致衣壳蛋白组装和载体基因组衣壳化以形成AAV粒子的一系列细胞内事件。

AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。它们已在所检查的所有AAV血清型中发现，并在下文和本领域进行了描述。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。

术语“CAG启动子”是指由巨细胞病毒早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白启动子和来源于兔β-珠蛋白基因的3'剪接序列形成的组合(参见Alexopoulou A等人，BMC CellBiology 2008；9(2)：1-11，Niwa等，Gene.1991 Dec 15；108(2)：193-9)。

术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸成分中断。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。如本文所用，术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有说明或要求，本文描述的本发明的任何实施方案是多核苷酸，包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。

“基因”是指含有至少一个在转录和翻译后能够编码特定蛋白质的开放阅读框的多核苷酸，或含有至少一种非编码RNA的多核苷酸。

术语“核苷酸序列”是指包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸分子，DNA或RNA。核酸可以是双链、单链，或包含双链或单链序列的部分。

术语“编码”是指决定核苷酸序列如何翻译成多肽或蛋白质的遗传密码。序列中核苷酸的顺序决定了多肽或蛋白质中氨基酸的顺序。

“重组”，当应用于多核苷酸时，是指多核苷酸是克隆、限制或结扎步骤以及产生不同于自然界中发现的多核苷酸的构建体的其他程序的各种组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒粒子。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制品和原始病毒构建体的后代。

“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能调节，包括多核苷酸的复制、加倍、转录、剪接、翻译或降解。该调节可能会影响该过程的频率、速度或特异性，并且本质上可能是增强的或抑制的。本领域已知的控制元件包括例如转录调控序列，例如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(在3'方向)的编码区转录的DNA区域。

“操作性地连接”或“可操作地连接”是指遗传元件的并列，其中所述元件处于允许它们以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子与编码区操作性地连接。只要维持这种功能关系，启动子和编码区之间就可能存在插入残基。

“表达载体”是包含编码感兴趣的多肽的区域的载体，并且用于在预期的靶细胞中实现蛋白质的表达。表达载体还包含与编码区操作性地连接以促进蛋白质在靶标中的表达的控制元件。控制元件和与它们可操作地连接以进行表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多是本领域已知和可获得的，或者可以容易地由本领域可获得的成分构建而成。

“异源”是指从基因型上不同的实体衍生而来，而该基因型上不同的实体与与之比较的实体的其余部分的基因型不同。例如，通过基因工程技术引入源自不同物种的质粒或载体的多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中去除并与未发现与其天然连接的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。特别地，本文使用的术语“异源核苷酸序列”包括编码以及非编码核苷酸序列。

“遗传改变”是指将遗传元件引入细胞而不是通过有丝分裂或减数分裂的过程。该元素可能与细胞异源，或者它可能是细胞中已经存在的元素的附加副本或改进版本。例如，可以通过本领域已知的任何方法，例如电穿孔、磷酸钙沉淀或与多核苷酸-脂质体复合物接触，用重组质粒或其他多核苷酸转染细胞来实现遗传改变。遗传改变也可以通过例如DNA或RNA病毒或病毒载体的转导或感染来实现。优选地，将遗传元件引入细胞中的染色体或微型染色体中；但任何改变细胞及其后代的表型和/或基因型的改变都包括在该术语中。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。该术语还包括经过修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化或与标记成分的缀合。

“分离的”质粒、病毒或其他物质是指没有至少一些其他组分的物质的制剂，这些组分也可能存在于天然存在或最初制备的物质或类似物质中。因此，例如，可以通过使用纯化技术从源混合物中富集分离的物质来制备分离的物质。富集可以在绝对基础上测量，例如每体积溶液的重量，或者可以测量与源混合物中存在的第二种潜在干扰物质有关的物质。本发明的实施方案的增加的富集越来越被优选。因此，例如，优选2倍富集，更优选10倍富集，更优选100倍富集，甚至更优选1000倍富集。

根据本发明治疗的“个体”或“受试者”是指脊椎动物，特别是哺乳动物物种的成员，并且包括但不限于家养动物、运动动物和灵长类动物，包括人类。

个体或细胞的“治疗”是在治疗开始时试图改变个体或细胞的自然过程的任何类型的干预。例如，可以对个体进行治疗以减少或限制由任何病理状况引起的病理，包括(但不限于)遗传或诱导的遗传缺陷、病毒、细菌或寄生虫感染、肿瘤或再生障碍或免疫系统功能障碍，如自身免疫或免疫抑制。治疗包括(但不限于)施用组合物，例如药物组合物，以及施用已经用组合物处理过的相容细胞。治疗可以预防性或治疗性进行；即，在病理事件开始之前或之后或与病原体接触之前或之后。

术语“有效量”是指足以达到预期目的的物质的量。例如，增加磺酰胺酶活性的表达载体的有效量是足以减少糖胺聚糖积累的量。用于治疗疾病或病症的表达载体的“治疗有效量”是足以减轻或消除疾病或病症的症状的表达载体的量。给定物质的有效量会随着物质的性质、给药途径、接受物质的动物的大小和种类以及给予物质的目的等因素而变化。技术人员可以根据本领域已建立的方法凭经验确定每种单个情况下的有效量。

术语“基因治疗”是指将感兴趣的遗传物质(例如DNA或RNA)转移到宿主中以治疗或预防遗传或获得性疾病或病症。感兴趣的遗传物质编码需要在体内产生的产物(例如蛋白质多肽、肽或功能性RNA)。例如，感兴趣的遗传物质可以编码具有治疗价值的酶、激素、受体或多肽。

发明详述

本发明的一个目的是提供用于产生重组病毒载体，特别是重组腺相关病毒载体(rAAV)的高效价制剂的方法，使得该方法能够以适合基因治疗程序的实际应用的规模有效地使用。

正如本发明所附实施方案中所示，本发明人已令人惊讶地发现，通过使用用于三重或双重转染的质粒载体对细胞培养物进行重复轮转，即通过重新转染，可以显著地改善rAAV生产。

因此，在第一方面，本发明涉及生产重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述质粒载体包含异源核苷酸序列以及复制和包装基因序列；

b)在允许病毒复制和包装的条件下培养所述细胞；

c)回收步骤b)中产生的病毒载体，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；

d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及

e)重复步骤b)到c)。

在本发明的一个具体实施方案中，所述重组病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、甲病毒、黄病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、弹状病毒、逆转录病毒、慢病毒、新城疫病毒(NDV)、痘病毒和小核糖核酸病毒。在一个具体实施方案中，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体或AAV载体。

在一个优选的实施方案中，所述病毒载体是AAV载体。

根据本发明的AAV包括AAV已知血清型的任何血清型。一般来说，不同血清型的AAV具有显著同源性的基因组序列，提供一系列相同的遗传功能，产生在物理和功能方面基本相同的病毒粒子，并通过几乎相同的机制进行复制和组装。具体地，本发明的AAV可能属于AAV(AAV1)、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV和任何其他AAV的血清型1。不同AAV血清型的基因组序列的例子可以在文献或公共数据库(如GenBank)中找到。请参阅GenBank保藏号AF028704.1(AAV6)、NC006260(AAV7)、NC006261(AAV8)和AX753250.1(AAV9)。在一个优选的实施方案中，本发明的AAV载体是选自AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAVrh10血清型的血清型。在一个优选的实施方案中，本发明的所述AAV载体是血清型9。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述载体包含侧翼为ITR、AAVrep和AAV cap基因序列的异源核苷酸序列以及腺病毒辅助功能序列；

b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；

c)回收步骤b)中产生的AAV，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；

d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及

e)重复步骤b)到c)。

正如本领域所描述的，可以使用多种方法中的任何一种将遗传物质引入细胞中以转化或转导此类细胞。举例来说，此类技术包括，例如，用细菌质粒转染。实际上，可以使用多种转染技术将根据本发明方法的步骤a)的质粒载体引入细胞中。此类转染方法在本领域中已有描述，包括例如磷酸钙共沉淀、直接微注射到培养细胞中、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转染或使用高速微粒的核酸递送。其他合适的转染培养基包括磷酸锶、聚阳离子聚合物例如Superfect(QIAGEN TM))、脂质体和阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)。在一个优选的实施方案中，使用PEI转染根据本发明方法的质粒载体。在这种情况下，PEI/DNA复合物是通过将PEI添加到质粒DNA中、然后再将其添加到细胞培养物中形成的。

这些技术中的任何一种都可用于将一个或多个外源DNA部分，例如载体构建体，引入合适的宿主细胞。通常，外源DNA必须穿过宿主细胞质膜才能暴露于细胞的转录和复制机制。

所得细胞可用外源核酸分子瞬时转染，即外源DNA不会整合到转染细胞的基因组中，而是游离存在。或者，所得细胞可被稳定转染，即核酸分子将与宿主细胞基因组共价连接或将作为附加体单元维持和复制，其可传递给后代细胞(例如，能够在以足够的速度进行染色体复制)。

根据本发明的方法，待转染的质粒载体包含侧翼为ITR、AAV rep和AAV cap基因序列的异源核苷酸序列以及腺病毒辅助功能序列。

异源核苷酸序列或多核苷酸通常是令人感兴趣的，因为它能够在基因治疗的背景下为靶细胞提供功能，例如上调或下调某种表型的表达。这种异源多核苷酸或“转基因”通常具有足够的长度以提供所需的功能或编码序列。

在预期靶细胞中需要异源多核苷酸转录的情况下，它可以与其自身或异源启动子可操作地链接，这取决于例如靶细胞内所需的转录水平和/或特异性，如在本领域中已知的。各种类型的启动子和增强子都适用于这种情况。组成型启动子提供持续水平的基因转录，并且在希望治疗性多核苷酸持续表达时是优选的。诱导型启动子在没有诱导剂的情况下通常表现出低活性，而在有诱导剂的情况下被上调。当仅在特定时间或特定位置需要表达时，或者当需要使用诱导剂滴定表达水平时，它们可能是优选的。启动子和增强子也可能是组织特异性的，也就是说，它们仅在某些细胞类型中表现出活性，这可能是由于在这些细胞中发现的基因调控元件是独一无二的。

启动子的说明性实例是来自猿猴病毒40的SV40晚期启动子、杆状病毒多面体增强子/启动子元件、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV tk)、来自巨细胞病毒(CMV)的立即早期启动子、CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子和各种逆转录病毒启动子，包括LTR元件。诱导型启动子包括重金属离子诱导型启动子(如小鼠乳腺肿瘤病毒(mMTV)启动子或各种生长激素启动子)，以及在T7 RNA聚合酶存在下具有活性的T7噬菌体启动子。举例来说，组织特异性启动子的实例包括各种表面活性蛋白启动子(用于在肺中表达)、肌球蛋白启动子(用于在肌肉中表达)和白蛋白启动子或人α1-抗胰蛋白酶hAAT(用于在肝脏中表达)。大量其他启动子是本领域已知的并且通常可获得，并且许多此类启动子的序列可在诸如GenBank数据库的序列数据库中获得。在一个优选的实施方案中，使用CAG启动子。

在预期靶细胞中还需要翻译的情况下，异源多核苷酸优选还包含促进翻译的控制元件(例如核糖体结合位点或“RBS”和/或聚腺苷酸化信号)。因此，异源多核苷酸通常包含至少一个与合适启动子可操作链接的编码区，并且还可包含例如可操作链接的增强子、核糖体结合位点和/或poly-A信号。异源多核苷酸可包含一个编码区，或在相同或不同启动子控制下的一个以上编码区。包含控制元件和编码或非编码区的组合的整个单元通常被称为表达盒。在一个具体实施方案中，根据本发明方法的异源多核苷酸含有poly-A信号。

异源多核苷酸通过重组技术整合到或优选代替AAV基因组编码区，并且通常两侧侧接AAV反向末端重复(ITR)区。或者，可以使用仅具有一个ITR的载体构建体。在一个特定的实施方案中，所述异源核苷酸序列的侧翼是两个ITR。

鉴于AAV粒子的衣壳化大小限制，将大的异源多核苷酸插入基因组需要去除AAV序列的一部分。在任何情况下都需要去除一个或多个AAV基因，以减少产生有复制能力的AAV(“RCA”)的可能性。因此，优选去除rep、cap或两者的编码或启动子序列，因为这些基因提供的功能可以反式提供。

在一个实施方案中，异源核苷酸序列的侧翼是AAV ITR，并且以反式提供的AAV包装基因在单独的载体质粒中被引入宿主细胞。

rep基因由两个启动子p5和p19表达，并产生四种蛋白质，分别称为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV双链DNA复制只需要Rep78和Rep68，但后代、单链DNA积累似乎需要Rep52和Rep40。Rep68和Rep78与AAV ITR的发夹构象特异性结合，并具有解决AAV末端复制所需的几种酶活性。Rep78和Rep68还表现出多效性调节活性，包括AAV基因的正负调节和一些异源启动子的表达，以及对细胞生长的抑制作用。

cap基因编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。这些蛋白共享一个共同的重叠序列，但VP1和VP2包含通过使用替代起始密码子从p40启动子转录的额外氨基末端序列。有效的衣壳生产需要所有三种蛋白。

将AAV载体包装成病毒粒子仍然依赖于AAV的合适辅助病毒的存在或辅助病毒功能的提供。根据本发明的方法，在质粒载体中提供辅助病毒功能基因序列。AAV载体制剂中存在大量感染性辅助病毒是有问题的，因为该制剂旨在用于人类给药。

在本发明方法的一个特定实施方案中，使用两个质粒载体进行转染，其中所述质粒载体之一包含侧接ITR的异源核苷酸序列，而第二个质粒载体包含AAV rep和AAV cap基因序列和腺病毒辅助功能序列。在一个优选的实施方案中，所述第二质粒载体从5'到3'包含AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列。

在本发明方法的一个优选实施方案中，使用三种质粒载体进行转染，即宿主细胞用至少一种编码感兴趣的异源核苷酸序列的载体、至少一种编码AAV rep和cap基因的载体以及至少一种编码腺病毒辅助功能的载体进行三重转染。

可以通过本领域的任何技术进行适当改变的细胞的选择。例如，用于改变细胞的多核苷酸序列可以与本领域已知的一种或多种可检测或可选择标记同时引入或可操作链接。举例来说，可以使用抗药性基因作为选择标记。然后可以挑选并培养抗药性细胞，然后测试所需序列的表达——即包装基因产物或异源多核苷酸的产物，视情况而定。可以使用基于DNA杂交的技术(例如Southern印迹和本领域已知的其他程序)进行对引入的多核苷酸的获取、定位和/或维持的测试。通过对从基因改变的细胞中提取的RNA进行Northern分析，或通过对相应基因产物的间接免疫荧光，可以很容易地进行表达测试。

根据本发明方法的步骤b)，转染细胞因此在允许病毒载体复制和包装的条件下培养。在一个特定的实施方案中，细胞在允许rAAV复制和包装的条件下培养。

若干标准影响用于产生本文所述的rAAV粒子的细胞的选择。更优选的细胞和细胞系是那些可以容易地在培养物中生长以促进重组AAV载体制剂的大规模生产的细胞和细胞系。如果需要大规模生产，生产方法的选择也会影响宿主细胞的选择。例如，一些生产技术和培养容器或腔室是为贴壁或附着细胞的生长而设计的，而其他的则是为悬浮细胞的生长而设计的。在后一种情况下，宿主细胞将因此优选适应或能够适应悬浮生长。根据本发明，需要大规模生产rAAV。

多种细胞系被考虑用于大规模生产rAAV。特别适合rAAV细胞培养的是人胚肾(HEK)293细胞系，可以是贴壁细胞系，也可以是选择用于悬浮生长的细胞系。其他适合产生rAAV的细胞系的实例包括：Vero细胞、HeLa细胞和CHO细胞系。如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域已知，在此类克隆群体的储存或转移期间，核型可发生自发或诱导的变化。因此，源自所指细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同。然而，术语“细胞系”包括此类变体。

一旦选择了细胞系，选择的细胞培养装置就会以适合支持细胞培养的密度接种细胞。用于接种特定装置的细胞密度将取决于装置的大小。多种体积可用于在选择的培养装置中培养细胞。所用培养基的体积将根据用于培养细胞的培养装置的大小而变化。可以使用大规模生产方法，例如悬浮培养。然后收集AAV粒子，并从用于制备它们的细胞中分离。

细胞在允许复制AAV和包装rAAV载体的条件下培养。优选地调整培养时间以对应于峰值生产水平。优选地，每个细胞产生至少100个病毒粒子；更优选每个细胞产生至少约1000个病毒粒子，再更优选每个细胞产生至少约10,000个病毒粒子。优选地，在培养期间每2×10⁵个细胞产生至少0.5×10⁶、更优选至少约1×10⁶、甚至更优选至少约2×10⁶RU/ml的AAV载体。

在所公开的发明中可以使用各种生长培养基来实现大规模细胞生长和AAV生产。生长培养基的选择取决于培养的细胞类型。在一个特定的实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，所述细胞是人胚肾(HEK)293细胞系。更优选地，所述细胞是适合悬浮生长的细胞。

对于贴壁细胞的培养，使用滚瓶(以给定速度旋转的圆柱形组织培养瓶)以提供细胞附着所需的表面。或者，微载体也是支持贴壁细胞培养的合适系统。对于悬浮细胞的培养，搅拌罐生物反应器是最适合的系统，因为它们能够达到高细胞密度培养，进而可以在纯化后提供大量rAAV。

在本发明的特定实施方案中，使用摇摆运动型生物反应器。在另一个特定的实施方案中，也可以使用搅拌罐生物反应器。一旦反应器中的细胞培养物达到给定点，如上所述进行细胞转染。

根据本发明的方法，步骤c)包括回收步骤b)中产生的AAV并将细胞培养物中的细胞维持在允许进一步分裂和生长的条件下。在该方法的一个优选实施方案中，步骤b)是通过在搅拌的液体培养基中悬浮培养所述细胞来进行的。

根据本发明方法的一个具体实施方案，在步骤b)中，产生的AAV被分泌到细胞培养物的上清液中。因此，根据本发明方法的步骤c)，从上清液中收获rAAV，并将细胞保持在细胞培养物中用于进一步分裂和生长。然后将用过的培养基或上清液与如此产生的rAAV一起收集，因为如下面的实施例所示，AAV被分泌到细胞培养物的上清液中而无需细胞裂解。

在一个具体实施方案中，在进行重新转染之前，即在步骤d)之前交换细胞培养物的细胞培养基。在一个特定的实施方案中，细胞培养基交换通过离心作用进行。在优选实施方案中，培养基交换通过灌注进行。在更优选的实施方案中，通过灌注进行连续培养基交换。更优选地，所述培养基通过灌注系统自动交换。通过该系统，用新鲜培养基补充培养物，同时使用细胞保留装置去除无细胞上清液。该过程优选在恒定的收获流速下进行。在这方面，在一个优选的实施方案中，将新的、新鲜的培养基添加到保留的细胞中以允许它们进一步分裂和生长。不断添加营养物质和去除有毒代谢物使灌注培养物能够在数周内达到并维持高细胞密度。

发明人已经令人惊讶地发现，可以用上述步骤a)所述的质粒载体重新转染细胞培养物中保留的细胞，从而可以延长AAV的产生。从这个意义上说，使用保留在细胞培养装置中的细胞产生更多的rAAV，这些细胞允许进一步分裂和生长。因此，发明人已经发现，通过进行重复的转染轮次，可以使用相同的细胞培养物随时间延长rAAV的生产。此外，正如在本发明所附实施例中所见，发明人发现通过进行这些培养基交换，AAV被分泌到细胞培养物的上清液中而无需细胞裂解，并且每次在每轮重新转染之前培养基进行交换时都可以收获AAV。所提出的方法的另一个优点是从上清液中回收rAAV，从纯化的角度来看，这是一个优势，因为细胞不需要裂解来收获AAV，因此减少了宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质的污染发生。

因此，本发明的方法包括步骤d)用根据步骤a)的质粒载体重新转染根据步骤c)的保留细胞。

根据本发明方法的步骤d)，在细胞培养物中进行再转染或重复转染轮次，这与需要单轮转染而无需培养基交换的常规瞬时基因表达(TGE)方法相反。

此外，发明人已经惊奇地发现，使用相同的细胞培养物可以将所述再转染和恢复步骤重复两次以上。在本发明方法的一个特定实施方案中，步骤d)、b)和c)在恢复步骤c)之后至少再重复一次。在另一个特定实施方案中，在回收步骤c)之后，将步骤d)、b)和c)重复至少两次。在更具体的实施方案中，在回收步骤c)之后，将步骤d)、b)和c)重复至少3次。在一个优选的实施方案中，在回收步骤c)之后，将步骤d)、b)和c)重复至少四次。在更具体的实施方案中，在回收步骤c)之后，将步骤d)、b)和c)重复1至3次。在一个更具体的实施方案中，在回收步骤c)之后，步骤d)、b)和c)重复1至2次。在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括在回收步骤c)之后重复步骤d)、b)和c)。在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤d)、b)和c)在回收步骤c)之后再重复一次。

如前所述，在本发明方法的一个特定实施方案中，通过灌注进行连续培养基交换。在一个优选的实施方案中，每次进行转染时，灌注保持不变。这允许质粒载体进入细胞。在更优选的实施方案中，灌注持续至少1.5小时，更优选至少2小时，更优选至少3小时，甚至更优选至少4小时的时间段。在优选的实施方案中，每轮重新转染之间存在最小时间间隔。在更优选的实施方案中，在至少36小时，更优选至少48小时的时间间隔之后进行所述再转染。

在另一个特定的实施方案中，所述方法包括在完成所有轮次再转染和回收之后裂解上清液中的细胞的附加步骤。

现有技术中有几种众所周知的技术可用于细胞破碎或细胞裂解。虽然冻融和/或超声处理可用于破坏细胞，但此类技术不太适合大规模制备。因此，在这些方面优选机械裂解技术。也可以使用去污剂和其他化学试剂来介导或促进裂解。已发现用核酸酶(如benzonase)处理裂解物有助于降低粘度和提高过滤性。澄清，例如通过微滤将载体与至少部分细胞碎片分离，也有助于促进回收和纯化。在本发明的一个具体实施方案中，根据本发明方法的所述裂解步骤包括使用核酸酶，更优选地，所述核酸酶是benzonase。

在本发明方法的一个特定实施方案中，进一步处理收集的含有上述本发明rAAV的上清液，以便纯化rAVV。在这点上，在另一个特定的实施方案中，该过程在与细胞滞留膜偶联的生物反应器中进行，使得细胞被保留在反应器系统内，而AAV则通过膜收集在干净的上清液中，不含细胞碎片，因此使净化变得更加容易。

为了对用于基因治疗的AAV的生产特别有用，最理想的是该技术具有“可扩展性”，即可与大规模制造装置和程序结合使用。

举例来说，AAV可以加载到带正电荷的阴离子交换柱上，例如带N电荷的氨基或亚氨基树脂(例如POROS或任何DEAE、TMAE、叔胺或季胺，或基于PEI的树脂)或带负电荷的阳离子交换柱(例如HS、SP、CM或任何基于磺基、磷基或羧基的阳离子树脂)。可以用缓冲液清洗柱。可以用NaCl浓度增加的梯度或pH值降低的梯度洗脱柱，可以收集馏分并分析AAV和/或污染物的存在。

基于由本领域已知的电荷以外的特征介导的分子间缔合，可以使用其他程序代替上述阴离子和阳离子交换程序，或者优选地，作为上述阴离子和阳离子交换程序的补充。此类其他程序包括基于配体-受体对(例如抗体-抗原或凝集素-碳水化合物相互作用)的分子间关联，以及基于分子其他属性的分离，例如基于大小和/或形状的分子筛分色谱。

可以通过切向流过滤(TFF)浓缩和纯化如上所述从柱中洗脱的含有AAV的级分的池。制剂通过膜过滤，产物被保留。保留的材料可以使用膜渗滤，连续洗涤合适的缓冲液。最终样品对产品进行了高度浓缩，可以过滤和储存以备使用。

载体质粒转染可以在进行细胞接种的当天进行，也可以在接种细胞后的第一天、第二天、第三天、第四天或第五天进行，具体取决于细胞接种密度。

在本发明的一个实施方案中，选择的宿主细胞用至少一种编码感兴趣的异源核苷酸序列的载体、至少一种编码AAV rep和cap基因的载体和至少一种编码腺病毒辅助功能的载体进行三重转染。在一个特定的实施方案中，使用PEI转染进行三重转染。

在通过瞬时转染产生rAAV期间包装质粒骨架序列(反向包装)是本领域众所周知的常见问题。如本文所用，术语“反向包装”是指包含ITR的质粒的骨架而非异源序列的衣壳化。事实上，对于AAV载体，包装DNA杂质的主要种类是与ITR相邻的质粒序列，该序列位于表达盒的侧翼，可能是由ITR的反向包装产生的。这些粒子在rAAV原料中的存在可能代表临床应用的安全问题。

如以下实施例1所示，用于转染的优化质粒的组合导致比使用通常用于AAV载体生产的标准质粒的生产更高的产量和更低的细菌序列反向包装。特别地，本发明人已经发现，当用三种质粒载体转染细胞时，其中第一质粒载体i)包含侧接ITR的异源核苷酸序列和位于所述ITR外部的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400Kb到4800Kb，使质粒骨架大小在5Kb以上；第二质粒载体ii)包含从5'到3'的AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列，以及第三质粒载体iii)包含包括VA-RNA、E2Ay E4序列在内的腺病毒辅助功能，其中所述质粒不含E3、pTB(E2B)和Ad ITR、蛋白酶序列，rAAV产量显著增加。在这方面，根据下面显示的结果，当使用这三个优化质粒的组合而不是标准质粒的组合时，AAV产量增加了三倍。此外，与使用本领域技术人员熟知的标准质粒，即包含异源核苷酸序列的非超大质粒、pRepCap载体例如pRep2Cap9载体以及含有AAV生产所需的腺病毒序列的质粒(VA-RNA、E2A y E4)的三重转染相比，反向包装也显著减少。如前所述，本发明中使用的优化辅助质粒含有腺病毒辅助功能，包括AAV生产所需的VA-RNA、E2A y E4序列。所述质粒已被修饰以使其不包含某些序列，包括E3、pTB(E2B)和Ad ITR序列。

如图3清楚所示，使用含有异源核苷酸序列的优化质粒，其中所述质粒是含有填充DNA序列的超大质粒，当与非优化质粒组合使用时，即与用于三重转染的标准载体组合使用时，不会提高载体基因组产量。因此，单独使用优化的超大质粒不会通过三重转染提高载体基因组产量。

然而，这种优化的超大质粒与含有腺病毒辅助功能的优化质粒(pAdhelper861)或含有AAV rep编码区和AAV cap编码区的优化质粒(pRepCap9-809)的组合提高了载体基因组产量(见图3)。此外，当三个优化的载体组合时，载体基因组产量大大提高(见图3)。

此外，本发明人惊奇地发现，当优化的超大质粒(pcohSgsh-900)与优化的辅助质粒pRepCap9-809和/或pAdhelper861之一或两者共转染时，细菌序列的反向包装减少(图4)。特别是，使用这些优化质粒的三重组合可以大大减少反向包装(图4和图5)。实际上，当共转染含有超大骨架的优化质粒(pcohSgsh-900)时，由于使用优化的辅助质粒(pAdhelper861)和/或(pRepCap9-809)而导致的细菌序列百分比降低更为明显(图5)。

如本文所用，术语“超大骨架”是指碱基对大小高于AAV载体衣壳化极限(约4700bp)的质粒骨架。

在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的所述第二质粒载体包含AAV Rep2和AAV Cap9编码区。在一个优选的实施方案中，所述质粒载体是pRepCap-809，其保藏号为DSM 32969，如SEQ ID NO:5所示。

因此，在本发明方法的一个特定实施方案中，在步骤a)中使用以下三质粒载体：

i)第一质粒载体，其包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列和位于所述ITR外部的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400Kb到4800Kb之间，使得质粒骨架大小大于5Kb；

ii)第二质粒载体，其包含从5'到3'的AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAVp5启动子区的核苷酸序列；以及

iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA-RNA、E2Ay E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。

在一个特定的实施方案中，填充DNA序列位于包含异源核苷酸序列的第一质粒载体中的一个ITR附近。

在另一个特定的实施方案中，质粒骨架大小在7000bp到7500bp之间。在更具体的实施方案中，质粒骨架大小在7000bp到7200bp之间。

在一个优选的实施方案中，所述第一质粒载体在主链序列中不包含F1Ori核苷酸序列。

在更优选的实施方案中，所述第一质粒载体是保藏号为DSM 32967的pcohSgsh-900，如SEQ ID NO:2所示。

根据本发明方法的另一个实施方案，可以用两种质粒载体重新转染细胞培养物中的剩余细胞，从而如上所述延长AAV的生产。

因此，本发明还涉及根据本发明的方法，其中在步骤a)中使用以下两种质粒载体：

i)第一质粒载体，其包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列和位于所述ITR外部，优选与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400Kb到4800Kb之间，使得质粒骨架大小大于5Kb，优选在7000bp到7500bp之间，更优选在7000bp到7200bp之间；以及

ii)第二质粒载体，其包含AAV rep编码区、AAV cap编码区、包含AAV p5启动子区的核苷酸序列和包括VA-RNA、E2A和E4序列的腺病毒辅助功能，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。

在另一个具体实施方案中，所述第二质粒载体包含从5'到3'的腺病毒辅助功能，包括VA-RNA、E2A和E4序列、AAV rep编码区、AAV cap编码区、包含AAV p5启动子区的核苷酸序列。

在一个具体实施方案中，所述第一质粒载体在主链序列中不包含F1Ori核苷酸序列。

在另一个具体实施方案中，所述第二质粒载体包含AAV Rep2和AAV Cap9编码区。

如前所述，用于转染的优化质粒的组合比使用通常用于AAV载体生产的标准质粒产生更高的产量和更低的细菌序列反向包装。

在下面的实施例中，表明，与用于通过三重转染生产AAV的标准质粒相比，当使用以下来生产rAAV时：i)包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列的质粒载体；ii)包含从5'到3'的AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的质粒载体；iii)包含腺病毒辅助功能的质粒载体，包括VA-RNA、E2Ay E4序列，其中所述质粒不含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列，反向包装显著减少，而且生产力提高。

因此，在另一方面，本发明涉及生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将合适的细胞与以下共转染

i)包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列的第一质粒载体；

ii)包含从5'到3'AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体，以及

iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA-RNA、E2Ay E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列；

b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；以及

c)回收步骤b)中产生的AAV。

在一个优选的实施方案中，所述第一质粒载体i)的特征在于质粒骨架大小在5000pb以上，优选在7000bp到7500bp之间，更优选在7000bp到7200bp之间，并且它包含位于所述ITR之外，优选地与其中一个ITR相邻的填充DNA序列，并且其中所述填充序列的长度在4400pb到4800之间。在更优选的实施方案中，所述第一质粒载体i)在主链序列中不包含F1Ori核苷酸序列。在本发明的一个更优选的实施方案中，所述第一质粒是保藏号为DSM32967的pcohSgsh-900，如SEQ ID NO:2所示。

在另一个优选实施方案中，所述第二质粒载体ii)包含AAV Rep2和AAV Cap9编码区。在一个优选的实施方案中，所述质粒载体是pRepCap-809，其保藏号为DSM 32969，如SEQID NO:5所示。

在另一个优选的实施方案中，所述第三质粒载体iii)是pAdHelper861，保藏号为DSM 32965，如SEQ ID NO:6所示。

如上所述，在本发明的另一个具体实施方案中，步骤b)是在搅拌的液体培养基中悬浮培养所述细胞来进行的。

在另一方面，本发明还涉及包含以下内容的质粒载体：

a)侧接ITR的异源核苷酸序列；以及

b)位于所述ITR外部并与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度介于4400Kb到4800Kb之间，更优选介于4500Kb到4700Kb之间，甚至更优选介于4600Kb到4700Kb之间,使质粒骨架大小在5Kb以上，优选在7000bp到7500bp之间；更优选地，在7000bp到7200bp之间；

其中所述质粒载体在主链序列中不含F1Ori核苷酸序列。在本发明的一个更优选的实施方案中，所述质粒是pcohSgsh-900，保藏号为DSM 32967，如SEQ ID NO:2所示。

在另一个特定方面，本发明涉及包含腺病毒序列E2、E4和VA-RNA的辅助质粒载体，其中所述质粒载体不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。更具体地，该质粒含有包括VA基因的731bp区、包括E2A基因和E4基因的5346bp区，并且它们的调节区被包括在3181bp片段中。质粒骨架包含高拷贝数细菌复制起点。在更优选的实施方案中，本发明涉及SEQ IDNO：6的质粒载体，其对应于保藏号为DSM 32965的pAdHelper861。

rAAV在基因治疗中的应用

为了基因治疗的目的，本发明的rAAV病毒载体可用于向个体施用。适用于基因治疗的疾病包括但不限于由病毒、细菌或寄生虫感染、各种恶性肿瘤和过度增殖性疾病、自身免疫性疾病和先天性缺陷引起的疾病。在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法产生的rAAV载体用于治疗溶酶体贮积病(LSD)。更优选地，所述载体有助于治疗粘多糖病(MPS)。在优选的实施方案中，所述异源核苷酸序列是编码用于治疗MPS的酶的序列。特别地，所述序列选自人α-L-艾杜糖苷酸酶、人乙酰肝素磺酰胺酶、人N-磺基葡糖胺磺基水解酶、人N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、α、人乙酰氨基葡萄糖苷酸、人N-乙酰转移酶、人艾杜糖苷酸2-硫酸酯酶(IDS)、人N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、人半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、人β-半乳糖苷酶、人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶和人透明质酸酶。

可以进行基因治疗以提高细胞内或细胞分泌的特定蛋白质的表达水平。本发明的载体可用于基因改变细胞以进行基因标记、替换缺失或有缺陷的基因或插入治疗基因。或者，可以向细胞提供降低表达水平的多核苷酸。这可用于抑制不需要的表型，例如在恶性肿瘤过程中扩增或过表达的基因的产物，或在微生物感染过程中引入或过表达的基因。可以通过提供包含序列的治疗性多核苷酸来降低表达水平，该序列能够例如与靶基因或RNA转录物形成稳定的杂交体(反义疗法)，能够作为核酶切割相关mRNA或能够充当目标基因产物的诱饵。

药物组合物可以作为液体溶液或悬浮液、作为乳液或作为适合在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式提供。载体是例如水或缓冲盐水溶液，含有或不含防腐剂。

药物组合物可以在给药时或在溶液中冻干以重新悬浮。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物是注射用混悬液。然后将最终产品配制在合适的缓冲液中，装入小瓶并储存直至使用。

尽管不是必需的，药物组合物可以任选地以适合于精确量给药的单位剂型提供。

已经笼统地描述了本发明，通过参考以下实施方案将更容易理解，这些实施例仅作为说明而不意在以任何方式限制本发明。

实施例

除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的分子生物学、病毒学、动物细胞培养和生物化学的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。

实施例1：使用标准质粒载体与优化载体进行三重转染

1.1.质粒描述

质粒pcohSgsh-827(SEQ ID NO:1)

含有1512bp密码子优化的cDNA的质粒，该cDNA在1756bp CAG启动子和对应于兔b-珠蛋白pA的519bp片段的控制下编码人N-磺基葡糖胺磺基水解酶。这三个元素侧接AAV2ITR序列。质粒骨架大小为3156bp(标准骨架大小)，包含966bp氨苄青霉素抗性基因、514bp噬菌体复制起点和589bp高拷贝数细菌复制起点。

质粒pcohSgsh-900(SEQ ID NO:2)

包含1512bp密码子优化的cDNA的超大质粒，该cDNA在1756bp CAG启动子和对应于兔b-珠蛋白pA的519bp片段的控制下编码人N-磺基葡糖胺磺基水解酶。这三个元素侧接AAV2ITR序列。质粒骨架为7073bp，包含1043bp卡那霉素抗性基因、589bp高拷贝数细菌复制起点，另外包括4657bp随机序列。

质粒pohIDS-874(SEQ ID NO:3)

包含1653bp密码子优化cDNA的超大质粒，该cDNA在1756bp CAG启动子和对应于兔b-珠蛋白pA的519bp片段的控制下编码人艾杜糖酸2-硫酸酯酶。这三个元素侧接AAV 2ITR序列。质粒骨架为7073bp，包含1043bp卡那霉素抗性基因、589bp高拷贝数细菌复制起点，另外还包括4657bp随机序列。

质粒pRepCap9-808(SEQ ID NO:4)

编码rep2和cap9蛋白的质粒，P5启动子位于其原始位置。该质粒包含1866bp的片段，对应于AAV2 Rep基因，随后是编码AAV9 Cap基因的2211bp序列。130bp AAV2 P5启动子位于Rep基因上游的原始位置。质粒骨架包含氨苄青霉素抗性基因和高拷贝数细菌复制起点。

质粒pRepCap9-809(SEQ ID NO:5)

编码rep2和cap9蛋白的质粒，在Cap9基因之后带有P5启动子。该质粒包含1866bp的片段，对应于AAV2 Rep基因，随后是编码AAV9 Cap基因的2211bp序列。对应于AAV2 P5启动子的130bp序列位于Cap基因的下游。质粒骨架包含卡那霉素抗性基因和高拷贝数细菌复制起点。

质粒pXX6

包含AAV生产所需的腺病毒序列(E2、E4和VA-RNA)的质粒。质粒骨架包含氨苄青霉素抗性基因和高拷贝数细菌复制起点(Xiao等人，J Virol.1998 Mar；72(3):2224–2232)。质粒pXX6-80源自pXX6，其中仅改变了主链。pXX6-80图谱和序列在文献中有很好的描述。

质粒pAdHelper861(SEQ ID NO:6)

包含AAV生产所需的腺病毒序列(E2、E4和VA-RNA)的质粒。它包含731bp的区域，其中包括VA基因、5346bp区，其中包括E2A基因和E4基因，并且它们的调节区被包括在3181bp的片段中。质粒骨架包含卡那霉素抗性基因和高拷贝数细菌复制起点。

1.2.通过三重转染产生AAV9-CAG-cohSgsh载体

材料和方法

AAV9-CAG-cohSgsh载体是通过使用PEI-MAX作为转染剂的瞬时三重转染产生的，如前所述(Ayuso E等人，Gene Ther.2010 Apr；17(4):503-10)。简而言之，将融合的HEK293贴壁细胞用等摩尔量的三种质粒转染：pcohSgsh-827、pRepCap9-808和pXX6(标准质粒)或pcohSgsh-900、pRepCap9-809和pAdHelper861(优化质粒)。PEI-MAX以2:1的PEI:DNA比率使用。转染后72小时收获细胞并通过三个循环的冷冻和解冻裂解以从细胞内部释放rAAV载体(参见下面的实施例2)。还描述了使用悬浮HEK293细胞生产rAAV载体(Joshua C Grieger等人，Mol Ther.2016 Feb；24(2):287-297)。

载体基因组通过Taqman qPCR量化，如前所述(Ayuso等人，上文引用)，使用对表达盒中存在的兔β-珠蛋白聚腺苷酸序列特异的引物和探针。此外，反向包装通过Taqman qPCR进行量化，其引物和探针对所有使用的质粒骨架中存在的抗生素抗性启动子序列具有特异性。

使用GraphPad Prism 7.00进行统计分析。

表1.用于三重转染的质粒列表。

结果

如上所述，通过使用优化质粒的三重转染来生产重组AAV9载体AAV9-CAG-cohSgsh，其产量高于使用通常用于AAV载体生产的标准质粒的生产(图1)。

AAV9-CAG-cohSgsh载体通过用优化的质粒进行三重转染产生的细菌序列的反向包装比用通常用于AAV生产的标准质粒获得的更低(图2)。

使用包含异源核苷酸序列的优化质粒，其中所述质粒是包含填充DNA序列(pcohSgsh-900)的超大质粒，当与非优化质粒(即与用于三重转染的标准载体)组合用于三重转染时，不会提高载体基因组产量。因此，单独使用优化的超大质粒不会通过三重转染提高载体基因组产量(图3)。

然而，这种优化的超大质粒与含有腺病毒辅助功能的优化质粒(pAdhelper861)或含有AAV rep编码区和AAV cap编码区的优化质粒(pRepCap9-809)的组合提高了载体基因组产量(见图3)。此外，当三个优化的载体组合时，载体基因组产量大大提高(见图3)。

此外，本发明人惊奇地发现，当优化的超大质粒(pcohSgsh-900)与优化的辅助质粒pRepCap9-809和/或pAdhelper861之一或两者共转染时，细菌序列的反向包装减少(图4)。特别是，使用这些优化质粒的三重组合可以大大减少反向包装(图4和图5)。实际上，当共转染含有超大骨架的优化质粒(pcohSgsh-900)时，由于使用优化的辅助质粒(pAdhelper861)和/或(pRepCap9-809)而导致的细菌序列百分比降低更为明显(图5)。

实施例2:三重转染和扩展基因表达(EGE)

2.1.细胞系、培养基和培养条件

使用的细胞系是由加拿大国家研究委员会生物技术研究所(加拿大蒙特利尔)提供的无血清悬浮适应HEK 293细胞系(HEK 293SF-3F6)。细胞在补充有Glutamax 8mM、0.1％Pluronic1(Invitrogen)和0.05ng/L IGF的Freestyle F17培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。细胞通常保存在20mL培养基中的125mL一次性聚碳酸酯锥形瓶(Corning,Steuben,NY)中。使用定轨摇床(Kuhner摇床，瑞士)以130rpm的速度摇动烧瓶，该摇床放置在保持在37℃、空气中含有5％CO₂的加湿气氛中的培养箱中。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec，丹麦)确定细胞计数和活力。

2.2.瞬时转染(TGE)

使用PEIPro(Polysciences,Warrington,PA)瞬时转染HEK 293悬浮细胞。HEK 293细胞以0.5·10⁶个细胞/mL的浓度接种在125-mL一次性烧瓶中，生长至2·10⁶个细胞/mL并用0.76μg pAdHelper861/mL培养物、0.77μg pRepCap9-809/mL培养物和0.38μg pohIDS-874/mL或0.38μg pcohSgsh-900/mL培养物进行转染，DNA与PEI的质量比为1:2。PEI/DNA复合物是通过将PEI快速添加到DNA中形成的，两者都在新鲜培养基中稀释以达到相同的体积(复合混合物体积是要转染的培养物总体积的5％)。将混合物在室温下孵育15分钟以在将其加入细胞培养物之前形成复合物。

2.3.coh-IDS基因的扩展基因表达方法

与需要单轮转染的传统TGE方法相反，扩展基因表达(EGE)生产策略包括执行重复的转染轮次以随时间实现持续的基因表达水平。第一次转染后，使用与上述2.2.中相同的质粒和条件，通过离心作用进行完全培养基交换(300xg，5分钟)后，每48小时使用相同的质粒和PEI浓度进行再转染轮次。通过进行这些培养基交换，AAV被分泌到培养物的上清液中，并且可以在每次重新转染之前每次培养基交换时收获AAV。

结果显示(参见图3)，当执行EGE方法时，从上清液中收获的总vg增加了3倍。批次(单次转染)后回收的总vg为细胞裂解后获得的8E11 vg。EGE策略后从上清液中回收的总vg为2,5E12 vg，从纯化的角度来看，这是一个优势，因为细胞不需要裂解来收获AAV，因此预期宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白的污染较少。

2.4.coh-Sgsh基因的扩展基因表达方法

EGE方法也已针对基因coh-Sgsh进行了测试，如上文2.3中所述。

结果表明(参见图4)，当执行EGE方法时，从上清液中收获的总vg增加了1.7倍。批次(单次转染)后回收的总vg为细胞裂解后获得的1.9E12 vg。EGE策略后从上清液中回收的总vg为3.18E12 vg。AAV生产遵循与phIDS类似的模式(见上文2.3)，因此支持EGE策略的普遍适用性。

AAVP 序列表

<110> 埃斯蒂维制药有限公司

巴塞罗那自治大学

<120> 用于制造重组病毒载体的方法

<130> ESTA-1818-WO

<150> EP19382220.2

<151> 2019-03-28

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7771

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 质粒pcohSgsh-827（Plasmid pcohSgsh-827）

<400> 1

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg 900

actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa 960

ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg 1020

gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg 1080

cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg 1140

cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg gcggtgcccc 1200

gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg 1260

gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc cccctccccg 1320

agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct 1380

cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg 1440

ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg 1500

cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc 1560

tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg 1620

gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc 1680

gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg 1740

ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc 1800

tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt 1860

gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattg attaattcga gcgaacgcgt 1920

gccaccatga gctgccctgt gcccgcctgt tgtgccctgc tgctggtgct gggactgtgc 1980

agagccagac cccggaacgc tctgctgctg ctggccgacg atggcggatt tgagagcggc 2040

gcctacaaca acagcgccat tgccacccct catctggacg ccctggccag aagaagcctg 2100

ctgttccgga acgccttcac cagcgtgtcc agctgcagcc ctagcagagc ttccctgctg 2160

acaggcctgc cccagcatca gaatggcatg tacggcctgc accaggatgt gcatcacttc 2220

aacagcttcg acaaagtgcg gagcctgcca ctgctcctgt cacaggctgg cgtgagaacc 2280

ggcatcatcg gcaagaaaca cgtgggcccc gagacagtgt accccttcga cttcgcctac 2340

accgaagaga acggcagcgt gctgcaggtc ggccggaaca tcacccggat caagctgctc 2400

gtgcggaagt ttctccagac ccaggacgac cggcccttct tcctgtacgt ggccttccac 2460

gaccctcaca gatgcggcca cagccagccc cagtacggca ccttctgcga gaagttcggc 2520

aacggcgaga gcggcatggg cagaatcccc gactggaccc cccaggcata cgaccctctg 2580

gacgtgctgg tgccctactt cgtgcccaac acccctgccg ccagagctga tctggccgcc 2640

cagtacacca ccgtgggcag aatggatcag ggcgtgggcc tggtgctgca ggaactgagg 2700

gacgctggcg tgctgaacga caccctggtc atcttcacct ccgacaacgg catcccattc 2760

cccagcggcc ggaccaatct gtactggccc ggcacagccg aacctctgct ggtgtccagc 2820

cccgagcacc ctaagagatg gggccaggtg tccgaggcct acgtgtccct gctggacctg 2880

acccccacca tcctggactg gttcagcatc ccctacccca gctacgccat ctttggaagc 2940

aagaccatcc acctgaccgg cagatctctg ctgcctgccc tggaagctga gcctctgtgg 3000

gccaccgtgt tcggcagcca gagccaccac gaagtgacca tgagctaccc catgcggagc 3060

gtgcagcacc ggcacttccg gctggtgcac aacctgaact tcaagatgcc cttcccaatc 3120

gaccaggact tttacgtgtc ccccaccttc caggacctgc tgaacagaac cacagccggc 3180

cagcccaccg gctggtacaa ggacctgcgg cactactact accgggccag atgggagctg 3240

tacgacagaa gccgggaccc ccacgagaca cagaacctgg ccaccgaccc cagattcgcc 3300

cagctcctgg aaatgctgcg ggaccagctg gccaagtggc agtgggagac acacgaccct 3360

tgggtctgcg ctcccgacgg cgtgctggaa gagaagctgt ccccccagtg ccagccactg 3420

cacaacgagc tgtgatgaga attcgagctc ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt 3480

gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca 3540

ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct 3600

gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg 3660

tctctcactc ggaaggacat atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt 3720

ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata 3780

aagaggtcat cagtatatga aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc 3840

cttgacttga ggttagattt tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc 3900

cctaaaattt tccttacatg ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc 3960

agtcatagct gtccctcttc tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agctgtagat 4020

aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga gttggccact 4080

ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg 4140

ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcattaa tgaatcggcc 4200

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 4260

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 4320

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 4380

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 4440

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 4500

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4560

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 4620

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 4680

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 4740

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 4800

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 4860

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 4920

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 4980

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 5040

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 5100

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 5160

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 5220

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 5280

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 5340

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 5400

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 5460

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 5520

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 5580

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 5640

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 5700

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 5760

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 5820

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 5880

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 5940

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 6000

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 6060

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 6120

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 6180

ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 6240

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 6300

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 6360

gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 6420

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgattcc 6480

aacatccaat aaatcataca ggcaaggcaa agaattagca aaattaagca ataaagcctc 6540

agagcataaa gctaaatcgg ttgtaccaaa aacattatga ccctgtaata cttttgcggg 6600

agaagccttt atttcaacgc aaggataaaa atttttagaa ccctcatata ttttaaatgc 6660

aatgcctgag taatgtgtag gtaaagattc aaacgggtga gaaaggccgg agacagtcaa 6720

atcaccatca atatgatatt caaccgttct agctgataaa ttcatgccgg agagggtagc 6780

tatttttgag aggtctctac aaaggctatc aggtcattgc ctgagagtct ggagcaaaca 6840

agagaatcga tgaacggtaa tcgtaaaact agcatgtcaa tcatatgtac cccggttgat 6900

aatcagaaaa gccccaaaaa caggaagatt gtataagcaa atatttaaat tgtaagcgtt 6960

aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag 7020

gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt 7080

gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga 7140

aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg 7200

gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct 7260

tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc 7320

gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt 7380

aatgcgccgc tacagggcgc gtactatggt tgctttgacg agcacgtata acgtgctttc 7440

ctcgttagaa tcagagcggg agctaaacag gaggccgatt aaagggattt tagacaggaa 7500

cggtacgcca gaatcctgag aagtgttttt ataatcagtg aggccaccga gtaaaagagt 7560

ctgtccatca cgcaaattaa ccgttgtcgc aatacttctt tgattagtaa taacatcact 7620

tgcctgagta gaagaactca aactatcggc cttgctggta atatccagaa caatattacc 7680

gccagccatt gcaacggaat cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 7740

gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc a 7771

<210> 2

<211> 11255

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 质粒pcohSgsh-900（Plasmid pcohSgsh-900）

<400> 2

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc 900

ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 960

gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 1020

ccttgagggg ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 1080

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 1140

cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg 1200

cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg 1260

cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc 1320

ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg 1380

cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg 1440

gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg 1500

ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca 1560

gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc 1620

ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg 1680

ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg 1740

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 1800

cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 1860

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattga ttaattcgag 1920

cgaacgcgtg ccaccatgag ctgccctgtg cccgcctgtt gtgccctgct gctggtgctg 1980

ggactgtgca gagccagacc ccggaacgct ctgctgctgc tggccgacga tggcggattt 2040

gagagcggcg cctacaacaa cagcgccatt gccacccctc atctggacgc cctggccaga 2100

agaagcctgc tgttccggaa cgccttcacc agcgtgtcca gctgcagccc tagcagagct 2160

tccctgctga caggcctgcc ccagcatcag aatggcatgt acggcctgca ccaggatgtg 2220

catcacttca acagcttcga caaagtgcgg agcctgccac tgctcctgtc acaggctggc 2280

gtgagaaccg gcatcatcgg caagaaacac gtgggccccg agacagtgta ccccttcgac 2340

ttcgcctaca ccgaagagaa cggcagcgtg ctgcaggtcg gccggaacat cacccggatc 2400

aagctgctcg tgcggaagtt tctccagacc caggacgacc ggcccttctt cctgtacgtg 2460

gccttccacg accctcacag atgcggccac agccagcccc agtacggcac cttctgcgag 2520

aagttcggca acggcgagag cggcatgggc agaatccccg actggacccc ccaggcatac 2580

gaccctctgg acgtgctggt gccctacttc gtgcccaaca cccctgccgc cagagctgat 2640

ctggccgccc agtacaccac cgtgggcaga atggatcagg gcgtgggcct ggtgctgcag 2700

gaactgaggg acgctggcgt gctgaacgac accctggtca tcttcacctc cgacaacggc 2760

atcccattcc ccagcggccg gaccaatctg tactggcccg gcacagccga acctctgctg 2820

gtgtccagcc ccgagcaccc taagagatgg ggccaggtgt ccgaggccta cgtgtccctg 2880

ctggacctga cccccaccat cctggactgg ttcagcatcc cctaccccag ctacgccatc 2940

tttggaagca agaccatcca cctgaccggc agatctctgc tgcctgccct ggaagctgag 3000

cctctgtggg ccaccgtgtt cggcagccag agccaccacg aagtgaccat gagctacccc 3060

atgcggagcg tgcagcaccg gcacttccgg ctggtgcaca acctgaactt caagatgccc 3120

ttcccaatcg accaggactt ttacgtgtcc cccaccttcc aggacctgct gaacagaacc 3180

acagccggcc agcccaccgg ctggtacaag gacctgcggc actactacta ccgggccaga 3240

tgggagctgt acgacagaag ccgggacccc cacgagacac agaacctggc caccgacccc 3300

agattcgccc agctcctgga aatgctgcgg gaccagctgg ccaagtggca gtgggagaca 3360

cacgaccctt gggtctgcgc tcccgacggc gtgctggaag agaagctgtc cccccagtgc 3420

cagccactgc acaacgagct gtgatgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac 3480

tcctcaggtg caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca 3540

caaataccac tgagatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct 3600

tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa 3660

ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa 3720

tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg 3780

ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca 3840

tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc 3900

tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg 3960

actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa 4020

gctgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 4080

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 4140

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcattaat 4200

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 4260

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 4320

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 4380

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 4440

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 4500

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 4560

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 4620

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 4680

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 4740

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 4800

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 4860

ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 4920

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 4980

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 5040

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 5100

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 5160

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 5220

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 5280

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accggggtta acgcgaattt 5340

taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 5400

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 5460

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga ttgaacagga tggcctgcat 5520

gcgggtagcc cggcagcgtg ggtggaacgt ctgtttggct atgattgggc gcagcagacc 5580

attggctgct ctgatgcggc ggtgtttcgt ctgagcgcgc agggtcgtcc ggtgctgttt 5640

gtgaaaaccg atctgagcgg tgcgctgaac gagctgcagg atgaagcggc gcgtctgagc 5700

tggctggcca ccaccggtgt tccgtgtgcg gcggtgctgg atgtggtgac cgaagcgggc 5760

cgtgattggc tgctgctggg cgaagtgccg ggtcaggatc tgctgtctag ccatctggcg 5820

ccggcagaaa aagtgagcat tatggcggat gccatgcgtc gtctgcatac cctggacccg 5880

gcgacctgtc cgtttgatca tcaggcgaaa catcgtattg aacgtgcgcg tacccgtatg 5940

gaagcgggcc tggtggatca ggatgatctg gatgaagaac atcagggcct ggcaccggca 6000

gagctgtttg cgcgtctgaa agcgagcatg ccggatggcg aagatctggt ggtgacccat 6060

ggtgatgcgt gcctgccgaa cattatggtg gaaaatggcc gttttagcgg ctttattgat 6120

tgcggccgtc tgggcgtggc ggatcgttat caggatattg cgctggccac ccgtgatatt 6180

gcggaagaac tgggcggcga atgggcggat cgttttctgg tgctgtatgg cattgcggca 6240

ccggatagcc agcgtattgc gttttatcgt ctgctggatg aatttttcta ataactgtca 6300

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaaca 6360

attggatggg caattggata tcgtcatctt tgagacacaa tctcccacct cactggaatt 6420

tagttcctgc tataattagc cttcctcata agttgcacta cttcagcgtc ccatatgcac 6480

ccttaccacg aagacaggtt tgtccaatcc catattgcga ccttggcagg gggttcgcaa 6540

gtcccacccg aaacgttgct gaaggctcag gtttctgagc gacaaaaggt taatacgcga 6600

gttcccgctc ataacctgga ccgaatgcgg aatcatgcat cgttccactg tgtttgtctc 6660

atgtaggacg ggcgcaaagc atacttagtt caatcttgaa taccttatat tattgtacac 6720

ctaccggtca ccagccaaca atgtgcggac ggcgttgcaa ctttcagggc ctaatctgac 6780

cgttgtagat accgcactct gggcaatacg aggtaatgcc agtcacccag tgtcgaacaa 6840

cacctgacct aacggtaaga ggctcacata atggctctgc cggcgtgccc agggtatatt 6900

aggtcagcat cagatggact gacatgaatc tttacaccga agcggaaacg ggtgcgtgga 6960

ctagcgagga gcaaacgaaa attcctggcc tgcttgatgt ctcgtaatct tcttagagat 7020

ggacgaaatg tttcacgacc taggaaaagg tcgccctaca aaatagattt gcgttactct 7080

cttcatagga tccccggtgt agcgaaagat caaggcgacc ctaggtagca accgccggct 7140

tcggcggtaa ggtatcactc aagaagcaga ctcagtaaga cacggtctag ctgactgtct 7200

atcgcctagg tcaaataggg agctttgatt ctgcatgtcc agctttagat tcactttagc 7260

gcgcagatct gggtcgagat aaaatcacca gtacccaaga ccaggggggc tcgccgcgtt 7320

ggctaatcct ggtacatctt gtaatgaata ttcagtagaa aatttgtgtt agaaggacga 7380

gtcaccatgt accaaaagcg ataacgatcg gtgggagtat tcattgtggt gaagacgctg 7440

ggtttacgtg ggaaaggtgc ttgtgtccca acaggctagg atataatgct gaagcccttc 7500

cccaagcgtt cagggtggga tttgctacaa cttccgagtc caacgtgtcc gtgttcatgt 7560

tatatatgca caaggccgag aattggacgt agctttcgtg ttagtacgta gcatggtcac 7620

acaagcacag tagatcctgc ccgcgcatcc tatatattaa gttaattcta atggaatacg 7680

atgacatgtg gatgggcagt ggccggttgt tacacgccta ccgcgatgct gaatgacccg 7740

gactaaagtg gcgaaaatta tggcgtgtga cccgttatgc tccagttcgg tcagtgggtc 7800

attgcaagta gtcgattgca ttgtcaatct ccgagtgatt tagcgtgaca gccgcaggga 7860

acccataaaa tgcgatcgta gtccatccga tcgtacatag aaatgagggt ccccatacgc 7920

ccacgcacct gttcactcgt cgtttgcatt taagagccgc acgaaccaca gagcataaag 7980

aggacctcta gctcctttac aaagtggggt cgaccgatcg cttgcgcaac ttgtgaagtg 8040

tctaccatcc ctaagcccat ttcccgcata ttaacccctg attgtatccg catctgatgc 8100

taccgtggtt gagttagcgt cgagcacgcg ggacttattg catgagtaga gttgactaag 8160

agccgttaga tggctcgctg agctaatagt tgccgacaga tcgtcaagat tagaaaacgg 8220

ttgtagcatt atcggaggtt ctctaactag tatcgatagc cgtgtcttca ctgtgccgcg 8280

gctacctatc gcctgaaaac cagttggtgt taaggggtcc cctgtccagg acgccaccgg 8340

tagtgagaca tacacgttcg ttgggttcac cgcggtcgga cctgagtgca ccaaggacac 8400

actgcagctc cgacccctac tgtcgagaaa tttgtatccc gcccccgcag cttgccagct 8460

ctttcagtat catggagccc atggttgaat gagtccaata acgaacttcg acatgataaa 8520

atccccccct cgcgacttcc agagaagaag actactgact tgagcgttcc cagcacttca 8580

gccaaggaag ttaccaattt tttgtttccg aatgacaccg gtctccttgc gggtagatcg 8640

ccgaccgcag aacttacgag ccaggggaaa cagtaaggcc taattaggta aagggagtaa 8700

gtgctcgaac gcttcagatg taaccatata cttacgctgg atcttctccc gcgaatttta 8760

accctcacca actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc gctatccgac 8820

tgttcccaaa ttgtaactta tcgttccgtg aaggccagag ttacttcccg gccctttcca 8880

tgcgcgcacc ataccctcct agttccccgg ttatctctcc gaggagggag tgagcgatcc 8940

tccgtttacg ttttgttacc aatgacgtag ctatgtattt tgtacaggtt gccaacgggt 9000

ttcacaattc acagatagtg gggtacccgg caaagggcct atatttgcgg tccaacttag 9060

gcgtaaacta cgatggtacc tactcagacc cagctcgcgc ggcgtaaata acgcactcat 9120

cccagctgat tctcggcgat ctacgcagcg acatgattat caacagctgt ctggcagctc 9180

taatctttta ccatggtcgt aaaagcctcc aagagttaga tcatacctaa cgccacaaaa 9240

gtgacacgac gccgatgggt accggacttt aggtgcacca cagttcggta agggagaggc 9300

cctgcggcgt acttcatttt gtatatgcaa cgtgcccaag tggcgccagg caagtctcag 9360

ctggttcctg tgttagctgc aggctaggca tgggagctga ttgaacatgg gttgggggcc 9420

tcgaaccgtc gaggacccca tagtacgttt aaacccaagt agggcagcct atagtttgaa 9480

gcagtactat ttcagggggg gagccctcat ggtctcttct actgatgact caacacgcta 9540

gggacgtgaa gtcgattcct tcgatggtta taaatcaaag gctcagagtg cagtctggag 9600

cgcccatcta acggtacgca tctcgattgc tcggtcgcct ttcacactcc gcgaaaattc 9660

ataccgctca ttcactaggt tgcgaagcct acactgatat atgaatccaa gctagagcag 9720

ggctcttaaa attcggagtt gtagatgctc aatactccaa tcggtttttt cgtgcaccac 9780

cgcgggtggc tgacaagggt ttgacatcga gaaacaaggc agttccgggc tgaaagtagc 9840

gccgggtaag gtacgcgcct ggtatggcag gactatgaag ccaatacaaa ggctacatcc 9900

tcactcgggt ggacggaaac gcagaattat ggttactttt tggatacgtg aaacatgtcc 9960

catggtagcc caaagacttg ggagtctatc acccctaggg cccatttctg gatatagacg 10020

ccaggttgaa tccgtatttg gaggtacgat ggatcagtct gggtgggacg tgctccattt 10080

ataccctgcg caggctggac cgaggaccgc aagatgcgac ggtgcacaag taattgacaa 10140

caaaccatcg tgttttcatt atggtaccag gatcttcaag ccgagtcaat caagctcgga 10200

ttacagtgtt taccgcgtct tgcggttact cacaaactgt aatccaccac aagtcaagcc 10260

attgcctctc tgagacgccg tatgaattaa tatgtaaact ttgcgcgggt tcactgcgat 10320

ccgttcagtc tcgtccaagg gcacaatcga attcccattt gtatgttcgg ctaacttcta 10380

cccatccccc gaagtttagc aggtcgtgag gtgtcatgga ggctctcgtt catcccgtgg 10440

gacatcgttt aaacgccttg ataaagcacc ccgctcgggt gtagcagaga agacgcctac 10500

tgaattgtgc gatccctcca cctcagctaa ggtagctacc aatatttagt tttttagcct 10560

tgcgacagac ctcctactta gattgccacg cattgagcta gcgagtcagc gataagcatg 10620

acgcgctttc aagcgtcgcg agtatgtgaa ccaaggctcc ggacaggact atatacttgg 10680

gtttgatctc gccccgacaa ctgcaaacct caacatttat agattataag gttagccgaa 10740

attgcacgtg gtggcgcccg ccgactgctc cccgagtgtg gctctttgat ctgacaacgc 10800

gcgacctcca tcgcggccga ttgtttctgc ggaccatgtc gtcctcatag tttgggcatg 10860

tttccgttgt aggagtgaag ccacttagct ttgcgccgta gtcccaatga aaaacctatg 10920

gactttgttt tgggtagcat caggaatctg aaccctgtga atgtgggggt cgcgcgcata 10980

gacctttatc tccggttcaa gttaggcatg aggctgtcga cccctaatca gtgaggccac 11040

cgagtaaaag agtctgtcca tcacgcaaat taaccgttgt cgcaatactt ctttgattag 11100

taataacatc acttgcctga gtagaagaac tcaaactatc ggccttgctg gtaatatcca 11160

gaacaatatt accgccagcc attgcaacgg aatcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 11220

tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgct 11255

<210> 3

<211> 11396

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 质粒pohIDS-874（Plasmid pohIDS-874）

<400> 3

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc 900

ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 960

gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 1020

ccttgagggg ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 1080

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 1140

cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg 1200

cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg 1260

cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc 1320

ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg 1380

cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg 1440

gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg 1500

ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca 1560

gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc 1620

ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg 1680

ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg 1740

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 1800

cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 1860

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattga ttaattcgag 1920

cgaacgcgtg ccaccatgcc cccacctaga accggaagag gattgctctg gctcggactt 1980

gtgctgtcca gcgtgtgtgt ggccctgggc tcggaaaccc aggccaacag caccaccgac 2040

gccctgaatg tgctgctgat tatcgtggac gatctccggc cttcgctggg ctgctacggg 2100

gataagctgg tccgctcccc gaatatcgac caactggctt cacatagcct gcttttccaa 2160

aacgcattcg cccaacaagc cgtgtgcgcc ccgagccgcg tgtctttcct caccggccgg 2220

cgccctgata ctacccggct ctacgacttc aacagctact ggagagtgca cgcaggaaac 2280

ttctccacca ttcctcagta ctttaaggag aacggttacg tcaccatgag cgtggggaag 2340

gtgttccacc ctggaatttc ctccaaccac accgacgact cgccatactc ctggtccttt 2400

cccccttacc acccatcatc cgagaagtac gagaacacca agacgtgcag gggcccagac 2460

ggggaactgc acgcgaacct cctctgcccg gtcgatgtgc tggatgtgcc cgaaggcacc 2520

ctccctgaca aacagagcac cgaacaggcc atccagctcc tcgagaagat gaaaacttca 2580

gcctccccgt tctttctggc cgtgggatac cacaagccgc atatcccctt ccggtaccca 2640

aaggagttcc agaagctgta cccgctggag aacattaccc tggctcctga tcccgaagtg 2700

ccggacggcc tgccgcccgt ggcatacaac ccttggatgg acatccgcca gagggaggat 2760

gtgcaagccc tgaacatctc cgtgccatac ggtccgatcc cggtcgactt ccagcggaag 2820

attaggcagt catatttcgc gtccgtgtcc tacttggaca ctcaggtcgg acgcctcctc 2880

tccgctctcg acgatctgca gctggccaac tcgaccatta tcgcgttcac ctcggaccat 2940

ggttgggctc tgggcgaaca cggagaatgg gccaagtaca gcaatttcga tgtcgcgact 3000

cacgtgcccc tgatcttcta cgtgcccgga cgcacagcca gcttgcctga agcgggggaa 3060

aagctgttcc cttacctgga tcccttcgac tccgcctctc aacttatgga gccaggcaga 3120

cagtcgatgg acctggtgga actcgtgtca ctgttcccta ccctcgccgg tctggccgga 3180

cttcaggtcc cgcctcggtg cccggtgccg tccttccacg tggagctgtg tcgcgaggga 3240

aagaacctcc tgaaacactt ccggttccgc gacctggagg aagatcccta cttgccgggc 3300

aacccgagag aacttatcgc atactcccag taccctcgcc cctccgacat cccgcagtgg 3360

aactccgaca agccgagcct gaaggacatt aagatcatgg ggtactccat ccggactatt 3420

gactatcggt acactgtgtg ggtcgggttc aacccagatg agtttctggc caacttctcc 3480

gatatccatg ccggagagct gtacttcgtg gactcggacc cgctgcagga ccacaacatg 3540

tacaacgact cacagggcgg cgacctgttc cagttgctga tgccctgaga attcgagctc 3600

ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg 3660

tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta 3720

tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt 3780

cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc 3840

aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat 3900

gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga aacagccccc 3960

tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt tttttatatt 4020

ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg ttttactagc 4080

cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc tcttatggag 4140

atccctcgac ctgcagccca agctgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 4200

aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 4260

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 4320

cgagcgcgca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 4380

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 4440

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 4500

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 4560

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 4620

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 4680

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 4740

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 4800

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 4860

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 4920

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 4980

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 5040

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 5100

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 5160

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 5220

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 5280

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 5340

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 5400

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 5460

taccggggtt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt 5520

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 5580

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 5640

attgaacagg atggcctgca tgcgggtagc ccggcagcgt gggtggaacg tctgtttggc 5700

tatgattggg cgcagcagac cattggctgc tctgatgcgg cggtgtttcg tctgagcgcg 5760

cagggtcgtc cggtgctgtt tgtgaaaacc gatctgagcg gtgcgctgaa cgagctgcag 5820

gatgaagcgg cgcgtctgag ctggctggcc accaccggtg ttccgtgtgc ggcggtgctg 5880

gatgtggtga ccgaagcggg ccgtgattgg ctgctgctgg gcgaagtgcc gggtcaggat 5940

ctgctgtcta gccatctggc gccggcagaa aaagtgagca ttatggcgga tgccatgcgt 6000

cgtctgcata ccctggaccc ggcgacctgt ccgtttgatc atcaggcgaa acatcgtatt 6060

gaacgtgcgc gtacccgtat ggaagcgggc ctggtggatc aggatgatct ggatgaagaa 6120

catcagggcc tggcaccggc agagctgttt gcgcgtctga aagcgagcat gccggatggc 6180

gaagatctgg tggtgaccca tggtgatgcg tgcctgccga acattatggt ggaaaatggc 6240

cgttttagcg gctttattga ttgcggccgt ctgggcgtgg cggatcgtta tcaggatatt 6300

gcgctggcca cccgtgatat tgcggaagaa ctgggcggcg aatgggcgga tcgttttctg 6360

gtgctgtatg gcattgcggc accggatagc cagcgtattg cgttttatcg tctgctggat 6420

gaatttttct aataactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 6480

cttcattttt aatttaaaac aattggatgg gcaattggat atcgtcatct ttgagacaca 6540

atctcccacc tcactggaat ttagttcctg ctataattag ccttcctcat aagttgcact 6600

acttcagcgt cccatatgca cccttaccac gaagacaggt ttgtccaatc ccatattgcg 6660

accttggcag ggggttcgca agtcccaccc gaaacgttgc tgaaggctca ggtttctgag 6720

cgacaaaagg ttaatacgcg agttcccgct cataacctgg accgaatgcg gaatcatgca 6780

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<210> 4

<211> 6630

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 质粒pRepCap9-808（Plasmid pRepCap9-808）

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ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 6420

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<223> 质粒pRepCap9-809（Plasmid pRepCap9-809）

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tcgagcacga caaggcctac gaccagcagc tcaaggccgg agacaacccg tacctcaagt 2640

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attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 5760

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gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 6660

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<210> 6

<211> 11584

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 质粒pAdHelper861（Plasmid pAdHelper861）

<400> 6

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attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180

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gaccgtgcaa aaggagagcc tgtaagcggg cactcttccg tggtctggtg gataaattcg 600

caagggtatc atggcggacg accggggttc gagccccgta tccggccgtc cgccgtgatc 660

catgcggtta ccgcccgcgt gtcgaaccca ggtgtgcgac gtcagacaac gggggagtgc 720

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tgattagcac cggtgggttg ctgaaaccca ccatttgtag cgccacatct tctctttctt 2640

cctcgctgtc cacgattacc tctggtgatg gcgggcgctc gggcttggga gaagggcgct 2700

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gcctcatccg cttttttggg ggcgcccggg gaggcggcgg cgacggggac ggggacgaca 2880

cgtcctccat ggttggggga cgtcgcgccg caccgcgtcc gcgctcgggg gtggtttcgc 2940

gctgctcctc ttcccgactg gccatttcct tctcctatag gcagaaaaag atcatggagt 3000

cagtcgagaa gaaggacagc ctaaccgccc cctctgagtt cgccaccacc gcctccaccg 3060

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tgattatcga gcaggaccca ggttttgtaa gcgaagacga cgaggaccgc tcagtaccaa 3180

cagaggataa aaagcaagac caggacaacg cagaggcaaa cgaggaacaa gtcgggcggg 3240

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agcgccagtg cgccattatc tgcgacgcgt tgcaagagcg cagcgatgtg cccctcgcca 3360

tagcggatgt cagccttgcc tacgaacgcc acctattctc accgcgcgta ccccccaaac 3420

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tgccagaggt gcttgccacc tatcacatct ttttccaaaa ctgcaagata cccctatcct 3540

gccgtgccaa ccgcagccga gcggacaagc agctggcctt gcggcagggc gctgtcatac 3600

ctgatatcgc ctcgctcaac gaagtgccaa aaatctttga gggtcttgga cgcgacgaga 3660

agcgcgcggc aaacgctctg caacaggaaa acagcgaaaa tgaaagtcac tctggagtgt 3720

tggtggaact cgagggtgac aacgcgcgcc tagccgtact aaaacgcagc atcgaggtca 3780

cccactttgc ctacccggca cttaacctac cccccaaggt catgagcaca gtcatgagtg 3840

agctgatcgt gcgccgtgcg cagcccctgg agagggatgc aaatttgcaa gaacaaacag 3900

aggagggcct acccgcagtt ggcgacgagc agctagcgcg ctggcttcaa acgcgcgagc 3960

ctgccgactt ggaggagcga cgcaaactaa tgatggccgc agtgctcgtt accgtggagc 4020

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tgcccattaa gtaccgcgaa tgccctccgc cgctttgggg ccactgctac cttctgcagc 4620

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agctgcttaa cgaaagtcaa attatcggta cctttgagct gcagggtccc tcgcctgacg 4800

aaaagtccgc ggctccgggg ttgaaactca ctccggggct gtggacgtcg gcttaccttc 4860

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tacacaggaa acaggagaca caactccaag tgcatactct atgtcatttt catgggactg 6540

gtctggccac aactacatta atgaaatatt tgccacatcc tcttacactt tttcatacat 6600

tgcccaagaa taaagaatcg tttgtgttat gtttcaacgt gtttattttt caattgcaga 6660

aaatttcaag tcatttttca ttcagtagta tagccccacc accacatagc ttatacagat 6720

caccgtacct taatcaaact cacagaaccc tagtattcaa cctgccacct ccctcccaac 6780

acacagagta cacagtcctt tctccccggc tggccttaaa aagcatcata tcatgggtaa 6840

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catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct cataaacacg ctggacataa 7380

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tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat gacagtggag agcccaggac tcgtaaccat 7560

ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca caggcacacg tgcatacact 7620

tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc ccagggaaca acccattcct 7680

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aaacctgtcg tgccagctgc attaacatgg tcatagctgt ttccttgcgt attgggcgct 9780

ctccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cgggtaaagc ctggggtgcc 9840

taatgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 9900

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 9960

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 10020

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 10080

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 10140

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 10200

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 10260

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 10320

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 10380

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 10440

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 10500

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 10560

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 10620

tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt attagaaaaa ttcatccagc 10680

agacgataaa acgcaatacg ctggctatcc ggtgccgcaa tgccatacag caccagaaaa 10740

cgatccgccc attcgccgcc cagttcttcc gcaatatcac gggtggccag cgcaatatcc 10800

tgataacgat ccgccacgcc cagacggccg caatcaataa agccgctaaa acggccattt 10860

tccaccataa tgttcggcag gcacgcatca ccatgggtca ccaccagatc ttcgccatcc 10920

ggcatgctcg ctttcagacg cgcaaacagc tctgccggtg ccaggccctg atgttcttca 10980

tccagatcat cctgatccac caggcccgct tccatacggg tacgcgcacg ttcaatacga 11040

tgtttcgcct gatgatcaaa cggacaggtc gccgggtcca gggtatgcag acgacgcatg 11100

gcatccgcca taatgctcac tttttctgcc ggcgccagat ggctagacag cagatcctga 11160

cccggcactt cgcccagcag cagccaatca cggcccgctt cggtcaccac atccagcacc 11220

gccgcacacg gaacaccggt ggtggccagc cagctcagac gcgccgcttc atcctgcagc 11280

tcgttcagcg caccgctcag atcggttttc acaaacagca ccggacgacc ctgcgcgctc 11340

agacgaaaca ccgccgcatc agagcagcca atggtctgct gcgcccaatc atagccaaac 11400

agacgttcca cccacgctgc cgggctaccc gcatgcaggc catcctgttc aatcatactc 11460

ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 11520

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 11580

ccac 11584

Claims (18)

1.生产重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述质粒载体包含异源核苷酸序列以及复制和包装基因序列；

b)在允许病毒复制和包装的条件下培养所述细胞；

c)回收步骤b)中产生的病毒载体，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；

d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及

e)重复步骤b)到c)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体和AAV载体。

3.生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述载体包含侧翼为ITR、AAV rep和AAV cap基因序列的异源核苷酸序列以及腺病毒辅助功能序列；

b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；

c)回收步骤b)中产生的AAV，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；

d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及

e)重复步骤b)到c)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，AAV被分泌到细胞培养物的上清液中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在步骤d)之前交换所述细胞培养物的细胞培养基。

6.根据权利要求5的方法，其中，通过灌注进行细胞培养基交换。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在恢复步骤c)之后至少再重复步骤d)、b)和c)一次。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，步骤b)是通过在搅拌的液体培养基中悬浮培养所述细胞来进行的。

9.根据权利要求3至8任一项所述的方法，其中，在步骤a)中使用以下三种质粒载体：

i)第一质粒载体，其特征在于质粒骨架大小大于5000pb，优选在7000bp到7500bp之间，并且包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列和位于所述ITR外部，优选与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400pb到4800pb之间；

ii)包含从5'到3'的AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体；以及

iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA-RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。

10.根据权利要求8或9中任一项的方法，其中，所述第一质粒载体在主链序列中不含F1Ori核苷酸序列。

11.生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将合适的细胞与以下共转染

i)包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列的第一质粒载体；

ii)包含从5'到3'AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体，以及

iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA-RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列；

b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；以及

c)回收步骤b)中产生的AAV。

12.根据权利要求11的用于生产重组AAV的方法，其中，所述第一质粒载体i)的特征在于质粒骨架大小大于5000pb，优选在7000bp到7500bp之间，并且它包含位于所述ITR之外，优选地与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400pb到4800pb之间。

13.根据权利要求12的方法，其中，所述第一质粒载体i)在主链序列中不含F1Ori核苷酸序列。

14.根据权利要求11至13中任一项的方法，其中，所述第二质粒载体(ii)包含AAV Rep2编码区和AAV Cap9编码区。

15.质粒载体，包括：

a)侧翼为ITR的异源核苷酸序列；以及

b)位于所述ITR外部并与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400Kb到4800Kb之间，使得质粒骨架大小在5Kb以上，优选在7000bp到7500bp之间；

其中所述质粒载体在主链序列中不含F1Ori核苷酸序列。

16.根据权利要求15所述的质粒载体，其为保藏号为DSM 32967的pcohSgsh-900，如SEQID NO：2所示。

17.包含腺病毒辅助功能的质粒载体，包括VA-RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。

18.根据权利要求17的质粒载体，其是保藏号为DSM 32965的pAdHelper-861，如在SEQID NO:6中所示。

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