TW202039856A - 製造重組病毒載體之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明關於用於生產高效價之重組病毒載體、更特別是重組AAV載體之方法,從而可以在適合基因療法技術實際應用規模上有效地使用所述方法。
Description
本發明關於用於生產高效價之重組病毒載體、更特別是重組AAV載體之方法,從而可以在適合基因療法技術實際應用的規模上有效地使用該方法。
基因遞送係用於治療獲得性疾病和遺傳性疾病的有前景之方法。已經描述了用於基因轉移目的之許多基於病毒的系統,包括基於腺相關病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)之系統。
AAV具有獨特的特徵,使得它成為有吸引力之基因療法載體。AAV感染廣泛細胞類型。然而,它們係非轉化性的,並且不涉及任何人類疾病之病因。將DNA導入受體宿主細胞通常會導致DNA的長期存留和表現,而不會干擾細胞的正常代謝。
AAV顆粒由具有三個衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的蛋白質衣殼組成,包含約4.7 kb線性單股DNA基因組,該基因組含有Rep和Cap基因,其側接病毒反向末端重複序列(Inverted Terminal Repeats, ITR)。單個顆粒僅包裝一條DNA分子股,但這條股可為正股或負股。含有任一股的顆粒具有感染性,並且藉由將親本感染單股轉化為雙股體形式發生複製,以及隨後進行擴增,由此置換掉子代單股並包裝成衣殼。
可以將AAV載體工程化以藉由缺失AAV基因組的內在部分並將目的DNA序列插入ITR之間來,攜帶目的異源核苷酸序列(例如,選定基因、反義核酸分子、核酶等)。ITR係複製和包裝含有目的異源核苷酸序列的載體基因組所需的唯一以順式作用的序列。異源核苷酸序列還典型地與能夠在某些條件下驅動患者目標細胞中基因表現的啟動子序列連接。載體中通常包括終止訊號,例如聚腺苷酸化位點。
rep和cap AAV基因產物分別為載體基因組的複製和衣殼化提供功能,且它們以反式存在就足夠了。
儘管基因療法作為人類遺傳性疾病的治療有潛在益處,但在臨床上廣泛使用仍存在嚴重的實際限制。在這個意義上,有必要生產大量的rAAV顆粒以產生臨床有效劑量。使用當前技術生產大量顆粒需要大量生產細胞。在實驗室規模上,將需要數千個組織培養瓶。在商業規模上,需要更有效和集約化的生產平臺來達到臨床應用。從商業生產的角度來看,同時改善生產細胞的數量和每個細胞的顆粒產率的益處將非常重要。
因此,在重組AAV載體(例如用於在基因療法中使用的那些)的開發中,需要實現高效價AAV的策略,從而可以在適合基因療法技術實際應用的規模上有效地使用方法。
本揭示內容提供了用於實現該等競爭目標之方法,並證明了此類技術可用於大規模生產重組AAV載體製劑。
本發明之發明人出人意料地發現,可以藉由進行重複的轉染而顯著改善重組病毒生產,更特別是rAAV生產。如以下實例所示,與進行單輪轉染的通常方法相反,當進行重複多輪的轉染時,獲得了隨時間推移的持續量的基因表現。
因此,在第一方面,本發明關於用於生產重組病毒載體之方法,所述方法包括以下步驟:
a) 用至少兩個質體載體共轉染合適的細胞培養物,所述質體載體包含異源核苷酸序列以及複製和包裝基因序列;
b) 在允許病毒複製和包裝的條件下培養所述細胞;
c) 回收步驟 b) 中產生的病毒載體並在允許進一步分裂和生長的條件下將該細胞保留在該細胞培養物中;
d) 用根據步驟 a) 之質體載體再轉染根據步驟 c) 之細胞;和
e) 重複步驟 b) 至 c)。
此外,諸位發明人已經發現,相比用通常用於AAV載體生產的標準質體進行生產,用於轉染的最佳化的質體之組合導致更高的rAAV產率。此外,如以下實例所示,諸位發明人出人意料地發現,使用根據本發明之最佳化的質體可導致更低的細菌序列之反向包裝(reverse packaging)。
因此,本發明之另一方面係用於生產重組AAV之方法,所述方法包括以下步驟:
a) 用以下質體載體共轉染合適的細胞
i) 第一質體載體,該第一質體載體包含側接ITR之異源核苷酸序列;
ii) 第二質體載體,該第二質體載體從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列;以及
iii) 第三質體載體,該第三質體載體包含腺病毒協助工具序列,該腺病毒協助工具序列包括VA-RNA、E2A和E4序列,其中所述質體不包含E3、pTB(E2B)、Ad ITR和蛋白酶序列;
b) 在允許AAV複製和包裝的條件下培養所述細胞;和
c) 回收步驟 b) 中產生的AAV。
諸位發明人出人意料地發現,藉由在轉染中使用最佳化的質體的組合,大大減少了反向包裝並獲得了更高的載體基因組產率。
因此,在另一個方面,本發明關於質體載體,該質體載體包含:
a) 側接ITR的異源核苷酸序列;和
b) 位於所述ITR外部並與一個ITR相鄰的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 Kb和4800 Kb之間,從而使得質體主鏈尺寸大於5 Kb,較佳的是在7000 bp和7500 bp之間;
其中所述質體載體在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。
在另一方面,本發明關於質體載體,該質體載體包含腺病毒協助工具序列,該腺病毒協助工具序列包括VA-RNA、E2A和E4序列,其中所述質體不包含E3、pTB(E2B)、Ad ITR和蛋白酶序列。
微生物之保藏:
質體pAdHelper861於2018年12月5日以登錄號DSM 32965保藏於DSMZ - 德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),德意志聯邦共和國布倫瑞克D-38124因霍芬大街(Inhoffenstraße)7 B。
質體pcohSgsh-827於2018年12月5日以登錄號DSM 32966保藏於DSMZ - 德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),德意志聯邦共和國布倫瑞克D-38124因霍芬大街(Inhoffenstraße)7 B。
質體pcohSgsh-900於2018年12月5日以登錄號DSM 32967保藏於DSMZ - 德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),德意志聯邦共和國布倫瑞克D-38124因霍芬大街(Inhoffenstraße)7 B。
質體pohIDS-874於2018年12月5日以登錄號DSM 32968保藏於DSMZ - 德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),德意志聯邦共和國布倫瑞克D-38124因霍芬大街(Inhoffenstraße)7 B。
質體pRepCap9-809於2018年12月5日以登錄號DSM 32969保藏於DSMZ - 德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),德意志聯邦共和國布倫瑞克D-38124因霍芬大街(Inhoffenstraße)7 B。
定義:
如本文所用,「載體」係指包含多核苷酸或與多核苷酸締合、並且可用於介導多核苷酸向細胞的遞送的大分子或大分子締合物。說明性載體包括,例如,質體、病毒載體、脂質體和其他基因遞送媒介物。
本文中作為同義詞的術語「腺相關病毒」、「AAV病毒」、「AAV病毒體」、「AAV病毒顆粒」和「AAV顆粒」係指由至少一種AAV衣殼蛋白(較佳的是,特定AAV血清型的所有衣殼蛋白)和對應於AAV基因組的包封的多核苷酸組成的病毒顆粒。野生型AAV係指屬於細小病毒科(Parvoviridae
)家族的依賴病毒(Dependovirus
)屬的病毒。野生型AAV基因組的長度約為4.7 Kb,並且由單股去氧核糖核酸(ssDNA)組成,該單股去氧核糖核酸可為正義的或反義的。野生型基因組包括在DNA股兩端的反向末端重複序列(ITR),和三個開放閱讀框(open reading frames, ORF)。ORF rep編碼AAV生命週期必需的四種Rep蛋白。ORF cap含有編碼衣殼蛋白之核苷酸序列:VP1、VP2和VP3,它們相互作用以形成二十面體對稱的衣殼。最後,與Cap ORF重疊的AAP ORF編碼似乎促進衣殼組裝的AAP蛋白。如果顆粒包含側接AAV ITR的異源多核苷酸(即除了野生型AAV基因組之外的多核苷酸,例如待遞送至哺乳動物細胞的轉基因),則該顆粒典型地被稱為「AAV載體顆粒」或「AAV病毒載體」或「AAV載體」或「重組AAV載體」。本發明還涵蓋使用雙股AAV或自身互補的AAV,也稱為dsAAV或scAAV。
如本文所用,術語「腺相關病毒ITR」或「AAV ITR」係指存在於AAV基因組DNA股的兩端的反向末端重複。ITR序列係AAV基因組高效增殖所必需的。該等序列的另一個特性係它們形成髮夾的能力。該特徵有助於它們的自啟動(self-priming),其允許第二DNA股的不依賴於引子酶的合成。還已經顯示ITR對於將野生型AAV DNA整合到宿主細胞基因組(例如,在人類第19條染色體上(血清型2 AAV))並從其拯救,以及將AAV DNA有效地衣殼化成完全組裝的、耐去氧核糖核酸酶的AAV顆粒而言係必需的。ITR序列的長度為約145 bp。較佳的是,ITR的整個序列都用於AAV病毒載體之基因組中,儘管允許對該等序列進行某種程度的微小修飾。可以藉由插入、缺失或截短來改變野生型ITR序列,只要該ITR介導所需功能,例如複製、切刻、病毒包裝、整合和/或前病毒拯救。用於修飾該等ITR序列的程序係本領域熟知的。ITR可以來自任何野生型AAV,包括但不限於血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或任何其他已知或以後發現的AAV。AAV包含兩個ITR,其可為相同或不同的。此外,這兩個AAV ITR可以與AAV衣殼來自相同的AAV血清型,也可以與其來自不同的AAV血清型。在較佳的實施方式中,5'和3'AAV ITR源自於AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8和/或AAV9。ITR較佳的是來自AAV2、AAV8和/或AAV9,其中最佳的是AAV2。在一個實施方式中,選擇AAV2 ITR生成假型AAV(即具有來自不同血清型的衣殼和ITR的AAV)。
如本文所用,表現「重組病毒基因組」係指其中至少一個外源多核苷酸插入天然存在的AAV基因組中的AAV基因組。根據本發明之AAV的基因組典型地包含順式作用的5'和3'反向末端重複序列(ITR)以及表現盒。如本文所用,「rAAV載體」係指包含非AAV來源之多核苷酸序列(即,與AAV異源的多核苷酸)的AAV載體,該多核苷酸序列典型地是用於細胞遺傳轉化之目的序列。在本發明之較佳的載體構建體中,異源多核苷酸側接兩個AAV反向末端重複序列(ITR)。
「AAV病毒」或「AAV病毒顆粒」係指由至少一種AAV衣殼蛋白質(較佳的是,野生型AAV的所有衣殼蛋白質)和衣殼化的多核苷酸組成之病毒顆粒。如果顆粒包含異源多核苷酸(即,除了野生型AAV基因組之外的多核苷酸,例如待遞送至哺乳動物細胞的轉基因),則該顆粒典型地被稱為「rAAV載體顆粒」或簡稱為「rAAV載體」。
「包裝」係指一系列細胞內事件,其導致衣殼蛋白的組裝和載體基因組的衣殼化以形成AAV顆粒。
AAV「rep」和「cap」基因係指編碼腺相關病毒的複製和衣殼化蛋白之多核苷酸序列。已經發現它們存在於所有檢查的AAV血清型中,並在下文和本領域中描述。AAV rep和cap在本文中稱為AAV「包裝基因」。
術語「CAG啟動子」係指由巨細胞病毒早期增強子元件、雞β-肌動蛋白啟動子和源自於兔β-珠蛋白基因的3'剪接序列形成的組合(參見Alexopoulou A等人, BMC Cell Biology [BMC細胞生物學] 2008; 9(2): 1-11,Niwa 等人, Gene [基因]. 1991年12月15日; 108(2): 193-9)。
術語「多核苷酸」係指任何長度的核苷酸的聚合形式,包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸,例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物,並且可以被非核苷酸組分中斷。當存在修飾時,可以在聚合物組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。如本文所用,術語多核苷酸可互換地是指雙股和單股分子。除非另外指明或要求,否則本文描述的本發明之多核苷酸的任何實施方式涵蓋雙股形式和已知的或預測構成雙股形式的兩條互補單股形式中的每一個。
「基因」係指含有至少一個在轉錄和轉譯後能夠編碼特定蛋白質的開放閱讀框的多核苷酸,或含有至少一個非編碼RNA的多核苷酸。
術語「核苷酸序列」係指含有去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸分子,即DNA或RNA。核酸可為雙股的、單股的、或含有雙股或單股序列兩者的部分。
術語「編碼(codify)」係指確定核苷酸序列如何轉譯成多肽或蛋白質的遺傳密碼。序列中核苷酸的順序決定了沿著多肽或蛋白質的胺基酸之順序。
「重組」當應用於多核苷酸時意指多核苷酸係選殖、限制或連接步驟以及產生形成不同於自然界發現的多核苷酸的構建體的其他程序的各種組合之產物。重組病毒係包含重組多核苷酸之病毒顆粒。該術語分別包括原始多核苷酸構建體的複製和原始病毒構建體的子代。
「控制元件」或「控制序列」係參與分子相互作用之核苷酸序列,該核苷酸序列有助於多核苷酸的功能調節,包括多核苷酸的複製(replication/duplication)、轉錄、剪接、轉譯或降解。調節可影響過程的頻率、速度或特異性,並且本質上可能是增強的或抑制性的。本領域已知的控制元件包括例如轉錄調控序列,例如啟動子和增強子。啟動子係在某些條件下能夠結合RNA聚合酶並啟動通常位於啟動子下游(在3'方向)的編碼區的轉錄的DNA區域。
「可操作地連接」(「operatively linked」或「operably linked」)係指遺傳元件的並置,其中該元件處於允許它們以預期方式操作的關係中。例如,如果啟動子有助於啟動編碼序列的轉錄,則該啟動子可操作地連接至編碼區。只要保持這種功能關係,在啟動子和編碼區之間就可存在居間殘基。
「表現載體」係包含編碼目的多肽的區域並且用於實現蛋白質在預期目標細胞中的表現的載體。表現載體還包含可操作地連接至編碼區以促進蛋白質在標靶中表現的控制元件。控制元件和它們可操作地連接到以用於表現的一種或多種基因的組合有時被稱為「表現盒」,其中許多表現盒係本領域已知且可獲得的,或者可以從本領域中可獲得的部件容易地構建。
「異源」意指源自於在基因型上與其所比較的剩餘實體不同的實體。例如,藉由基因工程技術引入到源自於不同物種的質體或載體中的多核苷酸係異源多核苷酸。從啟動子的天然編碼序列中取出並與天然未發現該啟動子連接的編碼序列可操作地連接的啟動子係異源啟動子。特別地,如本文所用的術語「異源核苷酸序列」包括編碼核苷酸序列以及非編碼核苷酸序列。
「遺傳改變」係指其中藉由有絲分裂或減數分裂以外的方式將遺傳元件引入細胞的過程。該元件可以與細胞異源,或者可為已經存在於細胞中的元件的附加拷貝或改進形式。遺傳改變可以例如藉由經由本領域已知的任何方法(例如電穿孔、磷酸鈣沈澱或與多核苷酸-脂質體複合物接觸)用重組質體或其他多核苷酸轉染細胞來實現。遺傳改變也可以例如藉由用DNA或RNA病毒或病毒載體進行轉導或感染來實現。較佳的是,將遺傳元件引入細胞中的染色體或微型染色體中;但是該術語中包括改變細胞及其子代的表型和/或基因型的任何改變。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用,係指任何長度的胺基酸的聚合物。該術語還涵蓋已經修飾的胺基酸聚合物;該修飾為例如,二硫鍵形成、糖基化、脂化或與標記組分軛合。
「分離的」質體、病毒或其他物質係指物質的製劑,該物質的製劑不含該物質或類似的物質天然存在或由最初製備之地方也可能存在的其他組分中之至少一些組分。因此,例如,可以藉由使用純化技術從源混合物中富集所分離出的物質來製備分離之物質。可以在絕對基礎(例如每體積溶液的重量)上測量富集,或者可以相對於源混合物中存在的第二潛在干擾物質測量富集。本發明之實施方式的增加的富集越來越佳。因此,例如,較佳的是2倍富集、更佳的是10倍富集、更佳的是100倍富集、甚至更佳的是1000倍富集。
根據本發明治療的「個體」或「受試者」係指脊椎動物,特別是哺乳動物物種的成員,並且包括但不限於家畜、運動型動物(sports animals)和靈長類動物,包括人。
個體或細胞的「治療」係在治療開始時試圖改變個體或細胞的自然進程的任何類型的干預。例如,可以對個體進行治療以減少或限制由任何病理狀況引起的病理,包括(但不限於)遺傳或誘導的遺傳缺陷,病毒、細菌或寄生生物感染,致瘤性或再生障礙性病症,或免疫系統功能障礙(例如自體免疫或免疫抑制)。治療包括(但不限於)投與組成物(例如藥物組成物)以及投與已經用組成物治療過的相容性細胞。可以預防性地或治療性地進行治療;也就是說,在發生病理事件之前或之後或與病原體接觸之前或之後進行。
術語「有效量」係指足以實現預期目的的物質之量。例如,用於增加磺醯胺酶活性的表現載體的有效量係足以減少糖胺聚糖積聚之量。用於治療疾病或障礙的表現載體的「治療有效量」係足以減輕或消除該疾病或障礙的症狀的表現載體之量。給定物質的有效量將隨因素(例如物質的性質、投與途徑、接受該物質的動物的尺寸和物種以及給予該物質之目的)而變化。每種情況下的有效量可以由技術人員根據本領域中已建立之方法憑經驗確定。
術語「基因療法」係指將目的遺傳物質(例如DNA或RNA)轉移到宿主中以治療或預防遺傳性或獲得性疾病或病症。目的遺傳物質編碼需要在其體內進行生產的產物(例如蛋白多肽、肽或功能性RNA)。例如,目的遺傳物質可編碼具有治療價值的酶、激素、受體或多肽。
本發明之一個目之係提供用於產生高效價重組病毒載體(特別是重組腺相關病毒載體(rAAV))製劑之方法,從而可以在適合基因療法程序實際應用的規模上有效地使用該方法。
如本發明之實例所示,諸位發明人出人意料地發現,藉由用(用於三重或兩重轉染的)質體載體對細胞培養物進行重複多輪的轉染(即再轉染),可以顯著改善rAAV生產。
因此,在第一方面,本發明關於用於生產重組病毒載體之方法,所述方法包括以下步驟:
a) 用至少兩個質體載體共轉染合適的細胞培養物,所述質體載體包含異源核苷酸序列以及複製和包裝基因序列;
b) 在允許病毒複製和包裝的條件下培養所述細胞;
c) 回收步驟 b) 中產生的病毒載體並在允許進一步分裂和生長的條件下將該細胞保留在該細胞培養物中;
d) 用根據步驟 a) 之質體載體再轉染根據步驟 c) 之細胞;和
e) 重複步驟 b) 至 c)。
在本發明之特定實施方式中,所述重組病毒載體選自由以下組成之群組:腺病毒、腺相關病毒(AAV)、甲病毒、黃病毒、單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)、麻疹病毒、棒狀病毒、反轉錄病毒、慢病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、痘病毒和小核糖核酸病毒。在一個特定的實施方式中,所述病毒載體選自反轉錄病毒載體、腺病毒載體或AAV載體。
在較佳的實施方式中,所述病毒載體係AAV載體。
根據本發明之AAV包括AAV已知血清型的任何血清型。一般來講,AAV的不同血清型具有顯著同源性的基因組序列,提供相同的一系列遺傳功能,產生在物理和功能上基本相同的病毒體,並藉由實際上相同的機制進行複製和組裝。特別地,本發明之AAV可以屬於AAV(AAV1)、AAV2、AAV3(包括類型3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、以及任何其他AAV的血清型1。不同AAV血清型的基因組序列的實例可以在文獻中或在例如GenBank的公共資料庫中找到。參見GenBank登錄號AF028704.1(AAV6)、NC006260(AAV7)、NC006261(AAV8)和AX753250.1(AAV9)。在較佳的實施方式中,本發明之AAV載體的血清型選自由以下組成之群組:AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAVrh10血清型。在較佳的實施方式中,本發明之所述AAV載體係血清型9。
在一個特定的實施方式中,本發明關於用於生產重組AAV之方法,所述方法包括以下步驟:
a) 用至少兩個質體載體共轉染合適的細胞培養物,所述載體包含側接ITR之異源核苷酸序列、AAV rep和AAV cap基因序列以及腺病毒協助工具序列;
b) 在允許AAV複製和包裝的條件下培養所述細胞;
c) 回收步驟 b) 中產生的AAV並在允許進一步分裂和生長的條件下將該細胞保留在該細胞培養物中;
d) 用根據步驟 a) 之質體載體再轉染根據步驟 c) 之細胞;和
e) 重複步驟 b) 至 c)。
如本領域所述之,可以使用多種手段中的任何一種將遺傳物質引入細胞中,以轉化或轉導此類細胞。作為說明,此類技術包括例如用細菌質體轉染。實際上,可以使用多種轉染技術將根據本發明之方法的步驟 a) 之質體載體引入細胞。此類轉染方法在本領域中已有描述,並且包括例如磷酸鈣共沈澱、直接微注射入培養細胞、電穿孔、脂質體介導之基因轉移、脂質介導之轉染或使用高速微粒之核酸遞送。其他適合的轉染介質包括磷酸鍶,聚陽離子聚合物,例如Superfect(QIAGEN(TM))、脂質體和陽離子聚合物,例如聚乙烯亞胺(PEI)。在較佳的實施方式中,使用PEI轉染根據本發明之方法之質體載體。在這種情況下,藉由將PEI添加到細胞培養物之前先添加到質體DNA中形成PEI/DNA複合物。
該等技術中的任一種均可用於將一個或多個外源DNA部分(例如載體構建體)引入適合的宿主細胞中。通常,外源DNA必須穿過宿主細胞質膜才能暴露於細胞之轉錄和複製機制中。
可以用外源核酸分子暫態轉染所得細胞,即,外源DNA將不會整合到所轉染的細胞的基因組中,而是游離地存在。可替代地,所得細胞可以被穩定地轉染,即核酸分子將與宿主細胞基因組共價連接,或者將其作為游離型單位進行維持和複製,並可以傳遞給子代細胞(例如,能夠以足夠的速率進行染色體外複製)。
根據本發明之方法,待轉染的質體載體包含側接ITR之異源核苷酸序列、AAV rep和AAV cap基因序列以及腺病毒協助工具序列。
由於在基因療法的情況下具有向目標細胞提供功能(例如上調或下調某種表型的表現)之能力,異源核苷酸序列或多核苷酸典型地是令人感興趣的。這種異源多核苷酸或「轉基因」通常將具有足夠的長度以提供所需功能或編碼序列。
在預期的目標細胞中需要異源多核苷酸轉錄的情況下,如本領域所知,可以將該異源多核苷酸可操作地連接至其自身或異源啟動子,這取決於例如目標細胞內所需的轉錄量和/或特異性。各種類型的啟動子和增強子適合用於這種情況。組成型啟動子提供持續量的基因轉錄,並且當需要以持續基礎數據表現治療性多核苷酸時係較佳的。誘導型啟動子通常在沒有誘導劑的情況下表現出低活性,並且在誘導劑的存在下被上調。當僅在某些時間或某些位置需要表現時,或者當需要使用誘導劑滴定表現量時,它們可能是較佳的。啟動子和增強子也可能是組織特異性的,也就是說,它們僅在某些細胞類型中展示其活性,這大概係因為基因調控元件獨特地存在於那些細胞中。
啟動子的說明性實例係來自猿猴病毒40的SV40晚期啟動子、桿狀病毒多面體增強子/啟動子元件、單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV tk)、來自巨細胞病毒(CMV)的立即早期啟動子、CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子和包括LTR元件在內的各種反轉錄病毒啟動子。誘導型啟動子包括重金屬離子誘導型啟動子(例如小鼠乳腺腫瘤病毒(mMTV)啟動子或各種生長激素啟動子),以及在T7 RNA聚合酶存在下具有活性的來自T7噬菌體的啟動子。作為說明,組織特異性啟動子的實例包括各種界面活性劑蛋白啟動子(用於在肺中表現)、肌球蛋白啟動子(用於在肌肉中表現)和白蛋白啟動子或人α1-抗胰蛋白酶hAAT(用於在肝臟中表現)。多種其他啟動子係已知的,並且在本領域中通常可用,並且許多此類啟動子的序列在序列資料庫如GenBank資料庫中可用。在較佳的實施方式中,使用CAG啟動子。
在預期的目標細胞中還需要轉譯的情況下,異源多核苷酸將較佳的是還包含促進轉譯的控制元件(例如核糖體結合位點或「RBS」和/或聚腺苷酸化訊號)。因此,異源多核苷酸通常將包含至少一個可操作地連接至適合的啟動子的編碼區,並且還可包含例如可操作地連接的增強子、核糖體結合位點和/或聚-A(poly-A)訊號。異源多核苷酸可以在相同或不同啟動子的控制下包含一個編碼區或一個以上編碼區。含有控制元件和編碼區或非編碼區的組合的整個單元通常被稱為表現盒。在一個特定的實施方式中,根據本發明之方法的異源多核苷酸包含聚-A訊號。
藉由重組技術將異源多核苷酸整合到AAV基因組編碼區中或較佳的是代替AAV基因組編碼區,並且通常在任一側側接AAV反向末端重複(ITR)區。可替代地,可以使用僅具有一個ITR的載體構建體。在一個特定的實施方式中,所述異源核苷酸序列側接兩個ITR。
根據AAV顆粒的衣殼化尺寸限制,將大的異源多核苷酸插入基因組需要去除AAV序列的一部分。在任何情況下,都需要去除一個或多個AAV基因,以減少產生具有複製能力的AAV(「RCA」)的可能性。因此,較佳的是去除rep、cap或兩者的編碼序列或啟動子序列,因為該等基因提供的功能可以反式提供。
在一個實施方式中,異源核苷酸序列側接AAV ITR,將以反式提供的AAV包裝基因引入單獨的載體質體中的宿主細胞。
rep基因由兩個啟動子p5和p19表現,並產生四種指定蛋白質:Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV雙螺旋DNA複製僅需要Rep78和Rep68,而子代的單股DNA積累似乎需要Rep52和Rep40。Rep68和Rep78特異性結合AAV ITR的髮夾構象,並具有解決AAV末端複製所需的幾種酶活性。Rep78和Rep68還展現出多效性調控活性,包括AAV基因的正調控和負調控以及一些異源啟動子的表現以及對細胞生長的抑制作用。
cap基因編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3。該等蛋白質共有一個共同的重疊序列,但是VP1和VP2含有藉由使用替代性起始密碼子從p40啟動子轉錄而來的其他胺基末端序列。有效衣殼的生產需要全部三種蛋白質。
將AAV載體包裝到病毒顆粒中仍然依賴於AAV適合的輔助病毒的存在或提供輔助病毒功能。根據本發明之方法,在質體載體中提供了輔助病毒功能基因序列。在AAV載體製劑中大量感染性輔助病毒的存在係有問題的,因為該製劑打算用於人類投與。
在本發明之方法的特定實施方式中,使用兩個質體載體進行轉染,其中所述質體載體之一包含側接ITR之異源核苷酸序列,並且第二質體載體包含AAV rep和AAV cap基因序列以及腺病毒協助工具序列。在較佳的實施方式中,所述第二質體載體從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列。
在本發明之方法之較佳的實施方式中,使用三種質體載體進行轉染,即用至少一種編碼目的異源核苷酸序列的載體、至少一種編碼AAV rep和cap基因的載體以及至少一種編碼腺病毒協助工具的載體對宿主細胞進行三重轉染。
可以藉由本領域中的任何技術來選擇適當改變的細胞。例如,如本領域已知,用於改變細胞之多核苷酸序列可以與一種或多種檢測性或選擇性標記同時引入或與其可操作地連接。作為說明,可以採用藥物抗性基因作為選擇性標記。然後可以選擇藥物抗性細胞並使其生長,然後測試所需序列的表現,即包裝基因產物或適當的異源多核苷酸產物。可以使用基於DNA雜交的技術(例如Southern印跡法和本領域已知的其他程序)對引入的多核苷酸進行獲取、定位和/或維持的測試。藉由從遺傳改變的細胞中提取的RNA的Northern分析,或藉由針對相應基因產物的間接免疫螢光法,即可容易地進行表現測試。
因此,根據本發明之方法的步驟 b),在允許病毒載體複製和包裝的條件下培養轉染的細胞。在一個特定的實施方式中,在允許rAAV複製和包裝的條件下培養細胞。
如本文所述,幾個標準影響用於在生產rAAV顆粒中使用的細胞的選擇。更佳的細胞和細胞系為可以容易地在培養中生長以便促進大規模生產重組AAV載體製劑的那些細胞和細胞系。在需要大規模生產的情況下,生產方法的選擇也將影響宿主細胞的選擇。例如,一些生產技術和培養容器或腔室設計用於貼壁或附著細胞的生長,而其他一些技術設計用於懸浮細胞的生長。因此,在後一種情況下,宿主細胞將較佳的是適於或適應懸浮生長。根據本發明,需要大規模生產rAAV。
考慮將多種細胞系用於在rAAV的大規模生產中使用。特別適合rAAV細胞培養的是人胚腎(Human Embryo Kidney, HEK)293細胞系,可以貼壁生長或選擇懸浮生長。產生rAAV的其他合適的細胞系的實例包括:Vero細胞、HeLa細胞和CHO細胞系。如本文所用,術語「細胞系」係指能夠在體外連續或延長生長和分裂的細胞群體。通常,細胞系係源自於單個祖細胞的選殖群體。本領域已知,在此類選殖群體的儲存或轉移期間,核型中可能發生自發或誘導的變化。因此,源自於該細胞系的細胞可能與上代細胞或培養物不完全相同。然而,術語「細胞系」包括此類變體。
一旦選擇了細胞系,就將選擇的細胞培養裝置以適合支持細胞培養的密度接種細胞。特定裝置中用於接種的細胞密度將取決於該裝置之尺寸。可以使用多種體積在選擇的培養裝置中生長細胞。所用培養基的體積將根據用於生長培養細胞的培養裝置的尺寸而變化。可以使用大規模生產方法(例如懸浮培養)。然後收集AAV顆粒,並從用於製備它們的細胞中分離出來。
在允許複製AAV和包裝rAAV載體的條件下培養細胞。培養時間較佳的是調節為對應於峰值生產量。較佳的是,產生至少100個病毒顆粒/細胞;更佳的是至少約1000個/細胞、還更佳的是至少約10,000個/細胞。較佳的是,在培養期間每2 × 105
個細胞產生至少0.5 × 106
、更佳的是至少約1 × 106
、甚至更佳的是至少約2 × 106
RU/ml的AAV載體。
各種生長培養基可以用於所揭露的發明中以實現大規模細胞生長和AAV生產。生長培養基的選擇取決於所培養的細胞之類型。在一個特定的實施方式中,所述細胞係哺乳動物細胞。在較佳的實施方式中,所述細胞係人胚腎(HEK)293細胞系。更佳的,所述細胞係適合懸浮生長的細胞。
對於貼壁細胞的培養,使用轉瓶(以給定速度旋轉的圓柱形組織培養瓶)來提供細胞附著所需的表面。可替代地,微載劑也是支持貼壁細胞培養的適合系統。對於懸浮細胞的培養,攪拌罐式生物反應器係最受關注之系統,因為它們能夠達到高細胞密度的培養,而純化後又可以提供大量rAAV。
在本發明之特定實施方式中,使用搖擺運動型生物反應器。在另一個特定的實施方式中,也可以使用攪拌罐式生物反應器。一旦反應器中的細胞培養物達到給定點,就如上所述進行細胞轉染。
根據本發明之方法,步驟 c) 包括回收步驟 b) 中產生的AAV並在允許進一步分裂和生長的條件下將該細胞保留在該細胞培養物中。在該方法的較佳的實施方式中,在攪拌的液體培養基中懸浮培養所述細胞來進行步驟 b)。
根據本發明之方法的特定實施方式,在步驟 b) 中,將產生的AAV分泌到細胞培養物之上清液中。因此,根據本發明之方法的步驟 c),從上清液中收穫rAAV,並將細胞保持在細胞培養物中用於進一步分裂和生長。然後,將用過的培養基或上清液與由此產生的rAAV一起收集,因為(如以下實例所示)AAV分泌到細胞培養物的上清液中而無需細胞裂解。
在一個特定的實施方式中,在進行再轉染之前,即在步驟 d) 之前,更換細胞培養物的細胞培養基。在一個特定的實施方式中,藉由離心進行細胞培養基更換。在較佳的實施方式中,藉由灌注進行培養基更換。在更佳的實施方式中,藉由灌注進行連續培養基更換。更佳的,藉由灌注系統自動更換所述培養基。藉由該系統,用新鮮培養基補充培養物,同時使用細胞保留裝置去除無細胞的上清液。該過程較佳的是在恆定的收穫流速下進行。在這方面,在較佳的實施方式中,將新的新鮮培養基添加到保留的細胞中,以使它們進一步分裂和生長。營養素的不斷添加和有毒代謝物的去除使灌注培養物可以在數週內達到並維持高細胞密度。
諸位發明人出人意料地發現,可以用上述步驟 a) 所述之質體載體再轉染細胞培養物中保留的細胞,從而可以延長AAV之生產。在這個意義上,使用保留在細胞培養裝置中的細胞可以產生更多的rAAV,該細胞可以進一步分裂和生長。因此,諸位發明人已經發現,藉由進行重複多輪的轉染,可以使用相同的細胞培養物隨著時間延長rAAV之生產。此外,如本發明之實例中可以看出的,諸位發明人已經發現藉由進行該等培養基更換,AAV分泌到細胞培養物的上清液中而無需細胞裂解,並且在每輪再轉染前每次進行培養基更換時均可收穫AAV。所提出方法的另一個優點係從上清液中回收了rAAV,從純化的角度來看這是一個優點,因為不需要裂解細胞即可收穫AAV,且因此,宿主細胞DNA和宿主細胞蛋白質的污染較少。
因此,本發明之方法包括步驟 d),用根據步驟 a) 之質體載體再轉染根據步驟 c) 的保留之細胞。
根據本發明之方法的步驟 d),與需要單輪轉染而不進行培養基更換的通常暫態基因表現(transient gene expression, TGE)方法相反,再轉染或重複多輪轉染係在細胞培養物中進行的。
此外,諸位發明人出人意料地發現,可以使用相同的細胞培養物將所述再轉染和回收步驟重複兩次以上。在本發明之方法的特定實施方式中,在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 至少再重複一次。在另一個特定的實施方式中,在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 至少重複兩次。在更特定的實施方式中,在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 至少重複三次。在較佳的實施方式中,在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 至少重複四次。在更特定的實施方式中,在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 至少重複一到三次。在更特定的實施方式中,在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 至少重複一到兩次。在較佳的實施方式中,本發明之方法包括在回收步驟 c) 之後重複一次步驟 d)、b) 和 c)。在本發明之方法的較佳的實施方式中,在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 再重複一次。
如上所述,在本發明之方法的特定實施方式中,藉由灌注進行連續的培養基更換。在較佳的實施方式中,每次進行轉染時,均需進行灌注。這允許質體載體進入細胞。在更佳的實施方式中,灌注持續至少1.5小時、更佳的是至少2小時、更佳的是至少3小時、甚至更佳的是至少4小時的時間段。在較佳的實施方式中,每輪再轉染之間均存在最短時間間隔。在更佳的實施方式中,在至少36小時、更佳的是至少48小時的時間間隔後,進行所述再轉染。
在另一個特定的實施方式中,所述方法包括另外的步驟,即在所有回合再轉染和回收結束後,裂解上清液中的細胞。
先前技術中有幾種熟知的技術可用於細胞破壞或細胞裂解。儘管凍融和/或超音波處理可用於破壞細胞,但此類技術不適合用於大規模製備。因此,在那些方面,機械裂解技術係較佳的。洗滌劑和其他化學試劑也可用於介導或促進裂解。已經發現用核酸酶(例如benzonase)處理裂解物有助於降低黏度和改善過濾性。澄清(例如藉由微濾)從至少一部分細胞碎片中分離載體,也有助於促進回收和純化。在本發明之特定實施方式中,根據本發明之方法的所述裂解步驟包括使用核酸酶,更佳的是,所述核酸酶係benzonase。
在本發明之方法的特定實施方式中,將收集的含有如上所述之本發明之rAAV的上清液進一步處理,從而純化rAVV。在這方面,在另一個特定的實施方式中,該過程在與細胞保留膜偶聯的生物反應器中進行,從而使細胞保留在反應器系統內部,而將AAV藉由膜收集在乾淨的、沒有細胞碎片的上清液中,因此使純化變得更加容易。
為了特別有用於基因療法的AAV的生產,最需要的技術係「可擴展的」,即可與大規模製造裝置和程序結合使用。
作為說明,可以將AAV載入到帶正電荷的陰離子交換柱上,例如N-電荷的胺基或亞胺基樹脂(例如POROS或任何DEAE、TMAE、三級胺或季胺或基於PEI的樹脂)或帶負電荷的陽離子交換柱(例如HS、SP、CM或任何基於磺基、磷基或羧基的陽離子樹脂)。可用緩衝液洗滌柱。可以用遞增的NaCl濃度梯度或遞減的pH梯度洗脫柱,並且可以收集級分並測定AAV和/或污染物的存在。
基於如本領域已知的除電荷以外的特徵介導的分子間締合,可以使用其他程序代替上述陰離子和陽離子交換過程或較佳的是除其之外再添加其他程序。此類其他程序包括基於配位基-受體對的分子間締合(例如抗體-抗原或凝集素-碳水化合物相互作用),以及基於分子其他屬性的分離,例如基於尺寸和/或形狀之分子篩層析。
可以藉由切向流過濾(tangential flow filtration, TFF)來濃縮和純化如上所述之從柱中洗脫的含AAV的級分的池。將製劑藉由膜過濾,並將產物保留。可以用合適緩衝液連續洗滌並使用膜對保留的材料進行滲濾。最終樣品的產物非常豐富,且可以過濾並儲存使用。
根據細胞接種密度,可以在進行細胞接種的當天,或者可以在細胞接種後第一天、第二天、第三天、第四天或第五天用載體質體進行轉染。
在本發明之一個實施方式中,將所選擇的宿主細胞用至少一種編碼目的異源核苷酸序列的載體、至少一種編碼AAV rep和cap基因的載體和至少一種編碼腺病毒協助工具的載體進行三重轉染。在一個特定的實施方式中,使用PEI轉染進行三重轉染。
藉由暫態轉染在rAAV生產期間包裝質體主鏈序列(反向包裝)係本領域熟知的常見問題。如本文所用,術語「反向包裝」係指含有ITR的質體的主鏈的衣殼化,而不是異源序列的衣殼化。實際上,對於AAV載體,包裝的DNA雜質的主要種類係與側接於表現盒的ITR相鄰的質體序列,可能是由ITR反向包裝產生的。在rAAV儲備中該等顆粒的存在可能代表了臨床應用的安全性問題。
如下面的實例1中所示,相比用通常用於AAV載體生產的標準質體進行生產,用於轉染的最佳化的質體的組合導致更高的產率,以及更低的細菌序列的反向包裝。特別地,諸位發明人發現當用三種質體載體轉染細胞時,其中第一質體載體 i) 包含側接ITR之異源核苷酸序列和位於所述ITR外部的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 Kb和4800 Kb之間,從而使得質體主鏈尺寸大於5 Kb;第二質體載體 ii) 從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列;以及第三質體載體 iii) 包含腺病毒協助工具序列,該腺病毒協助工具序列包括VA-RNA、E2A y E4序列,其中所述質體不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列,rAAV的產生顯著增加。在這方面,根據下面顯示的結果,當使用這三種最佳化的質體的組合而不是標準質體的組合時,AAV產率提率了三倍。此外,與使用熟悉該項技術者熟知的標準質體(即包含異源核苷酸序列的非超大質體、pRepCap載體(例如pRep2Cap9載體)以及含有AAV生產所需的腺病毒序列(VA-RNA、E2A和E4)的質體)進行三重轉染相比,反向包裝也顯著減少。如上所述,用於本發明之最佳化的輔助質體含有AAV生產所需的腺病毒協助工具序列(包括VA-RNA、E2A和E4序列)。所述質體已被修飾,從而使其不含包括E3、pTB(E2B)和Ad ITR序列在內的某些序列。
如圖3中清楚所示,含有異源核苷酸序列的最佳化的質體(其中所述質體係含有填充DNA序列的超大質體)與非最佳化的質體組合使用(即,與用於三重轉染的標準載體組合使用)時,不會改善載體基因組之產率。因此,單獨使用最佳化的超大質體並不能藉由三重轉染改善載體基因組產率。
然而,該最佳化的超大質體與包含腺病毒協助工具的最佳化的質體(pAdhelper861)或含有AAV rep編碼區和AAV cap編碼區的最佳化的質體(pRepCap9-809)之組合改善了載體基因組之產率(參見圖3)。此外,當組合三個最佳化的載體時,載體基因組的產率將大大提高(參見圖3)。
此外,諸位發明人出人意料地發現,當將最佳化的超大質體(pcohSgsh-900)與一種或兩種最佳化的輔助質體(pRepCap9-809和/或pAdhelper861)進行共轉染時,減少了細菌序列之反向包裝(圖4)。特別地,使用該等最佳化的質體的三重組合導致反向包裝更大減少(圖4和5)。實際上,當共轉染含有超大主鏈的最佳化質體(pcohSgsh-900)時,使用最佳化的輔助質體(pAdhelper861)和/或(pRepCap9-809)而導致的細菌序列百分比降低更為明顯(圖5)。
如本文所用,術語「超大主鏈」係指鹼基對尺寸大於AAV載體的衣殼化極限(大約4700 bp)的質體主鏈。
在較佳的實施方式中,用於本發明之方法的所述第二質體載體包含AAV Rep2和AAV Cap9編碼區。在較佳的實施方式中,所述質體載體係如SEQ ID NO: 5中列出的登錄號為DSM 32969的pRepCap-809。
因此,在本發明之方法的特定實施方式中,在步驟 a) 中,使用以下三個質體載體:
i) 第一質體載體,該第一質體載體包含側接ITR之異源核苷酸序列和位於所述ITR外部的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 Kb和4800 Kb之間,從而使得質體主鏈尺寸大於5 Kb;
ii) 第二質體載體,該第二質體載體從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列;和
iii) 第三質體載體,該第三質體載體包含腺病毒協助工具序列,該腺病毒協助工具序列包括VA-RNA、E2A y E4序列,其中所述質體不包含E3、pTB(E2B)、和Ad ITR蛋白酶序列。
在一個特定的實施方式中,填充DNA序列位於包含異源核苷酸序列的第一質體載體中的ITR之一附近。
在另一個特定的實施方式中,質體主鏈的尺寸在7000 bp和7500 bp之間。在更特定的實施方式中,質體主鏈的尺寸在7000 bp和7200 bp之間。
在較佳的實施方式中,所述第一質體載體在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。
在更佳的實施方式中,所述第一質體載體係如SEQ ID NO: 2中列出的登錄號為DSM 32967的pcohSgsh-900。
根據本發明之方法的另一個實施方式,可以用兩個質體載體再轉染細胞培養物中的剩餘細胞,從而如上解釋的可以延長AAV之產生。
因此,本發明還關於根據本發明之方法,其中在步驟 a) 中使用以下兩種質體載體:
i) 第一質體載體,該第一質體載體包含側接ITR之異源核苷酸序列和位於所述ITR外部、較佳的是與一個ITR相鄰的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 Kb和4800 Kb之間,從而使得質體主鏈尺寸大於5 Kb,較佳的是在7000 bp和7500 bp之間,更佳的是在7000 bp和7200 bp之間;和
ii) 第二質體載體,該第二質體載體包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區、包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列和腺病毒協助工具序列(包括VA-RNA、E2A和E4序列),其中所述質體不含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。
在另一個特定的實施方式中,所述第二質體載體從5'至3'包含腺病毒協助工具序列(包括VA-RNA、E2A和E4序列)、AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列。
在一個特定的實施方式中,所述第一質體載體在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。
在另一個特定的實施方式中,所述第二質體載體包含AAV Rep2和AAV Cap9編碼區。
如上所述,相比使用通常用於AAV載體生產之標準質體進行生產,用於轉染的最佳化的質體的組合導致更高的產率,以及更低的細菌序列之反向包裝。
在以下實例中,顯示了與用於藉由三重轉染生產AAV之標準質體相比,當使用 i) 包含側接ITR之異源核苷酸序列之質體載體; ii) 從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列的質體載體;以及 iii) 包含腺病毒協助工具序列(包括VA-RNA、E2A y E4序列)之質體載體(其中所述質體不含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列)生產rAAV時,顯著減少了反向包裝,且此外提高了生產率。
因此,在另一方面,本發明關於用於生產重組AAV之方法,所述方法包括以下步驟:
a) 用以下質體載體共轉染合適的細胞
i) 第一質體載體,該第一質體載體包含側接ITR之異源核苷酸序列;
ii) 第二質體載體,該第二質體載體從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列;和
iii) 第三質體載體,該第三質體載體包含腺病毒協助工具序列(包括VA-RNA、E2A y E4序列),其中所述質體不含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列;
b) 在允許AAV複製和包裝的條件下培養所述細胞;和
c) 回收步驟 b) 中產生的AAV。
在較佳的實施方式中,所述第一質體載體 i) 特徵在於質體主鏈尺寸大於5000 pb,較佳的是在7000 bp和7500 bp之間,更佳的是在7000 bp和7200 bp之間,並且其包含位於所述ITR外部,較佳的是與一個ITR相鄰的填充DNA序列,且其中所述填充序列的長度在4400 pb和4800 pb之間。在更佳的實施方式中,所述第一質體載體 i) 在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。在本發明之更佳的實施方式中,所述第一質體係如SEQ ID NO: 2中列出的登錄號為DSM 32967的pcohSgsh-900。
在另一個較佳的實施方式中,所述第二質體載體 ii) 包含AAV Rep2和AAV Cap9編碼區。在較佳的實施方式中,所述質體載體係如SEQ ID NO: 5中列出的登錄號為DSM 32969的pRepCap-809。
在另一個較佳的實施方式中,所述第三質體載體 iii) 係如SEQ ID NO: 6中列出的登錄號為DSM 32965的pAdHelper861。
如上所述,在本發明之另一個特定實施方式中,在攪拌的液體培養基中懸浮培養所述細胞來進行步驟 b)。
在另一個方面,本發明還關於質體載體,該質體載體包含:
a) 側接ITR的異源核苷酸序列;和
b) 位於所述ITR外部並與一個ITR相鄰的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 Kb和4800 Kb之間,更佳的是在4500 Kb和4700 Kb之間,甚至更佳的是在4600 Kb和4700 Kb之間,從而使得質體主鏈尺寸大於5 Kb,較佳的是在7000 bp和7500 bp之間;更佳的是在7000 bp和7200 bp之間;
其中所述質體載體在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。在本發明之更佳的實施方式中,所述質體係如SEQ ID NO: 2中列出的登錄號為DSM 32967的pcohSgsh-900。
在另一特定的方面,本發明關於含有腺病毒序列E2、E4和VA-RNA的輔助質體載體,其中所述質體不含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。更特別地,該質體含有包括VA基因的731 bp區域、包括E2A基因和E4基因的5346 bp區域,並且它們的調控區被包括在3181 bp片段中。質體主鏈含有高拷貝數細菌複製起點。在更佳的實施方式中,本發明關於SEQ ID NO: 6的質體載體,其對應於登錄號為DSM 32965的pAdHelper861。
rAAV 用於基因療法之用途
出於基因療法的目的,本發明之rAAV病毒載體可用於投與給個體。適於基因療法的疾病包括但不限於由病毒、細菌或寄生蟲感染,各種惡性腫瘤和過度增殖性病症、自體免疫性病症和先天性缺陷所引起的那些疾病。在較佳的實施方式中,根據本發明之方法產生的rAAV載體用於治療溶酶體貯積病(LSD)。更佳的是,所述載體有助於黏多醣貯積症(MPS)之治療。在較佳的實施方式中,所述異源核苷酸序列係編碼用於治療MPS的酶的序列。特別地,所述序列選自由以下組成之群組:人α-L-艾杜糖醛酸酶、人乙醯肝素磺醯胺酶、人N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶、人α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶、人乙醯肝素-α-胺基葡萄糖苷、人N-乙醯轉移酶、人艾杜糖(Iduronate)2-硫酸酯酶(IDS)、人N-乙醯胺基葡萄糖6-硫酸酯酶、人半乳糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶、人β-半乳糖苷酶、人N-乙醯半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和人透明質酸酶。
可以進行基因療法以增強細胞內或由細胞分泌的特定蛋白質之表現量。本發明之載體可用於遺傳改變細胞以進行基因標記、替換缺失或有缺陷的基因或插入治療性基因。可替代地,可以向細胞提供降低表現量之多核苷酸。這可用於抑制不需要的表型,例如在惡性腫瘤過程中擴增的或過度表現的基因的產物,或在微生物感染過程中引入的或過度表現的基因之產物。可藉由提供治療性多核苷酸來降低表現量,該治療性多核苷酸包含能夠例如與目標基因或RNA轉錄物形成穩定雜交體(反義療法)、能夠充當核酶來裂解相關的mRNA或能夠充當目標基因產物的誘餌的序列。
藥物組成物能以液體溶液或懸浮液、乳劑或適合於在使用前溶解或懸浮在液體中的固體形式提供。載劑係例如水或緩衝鹽水溶液,含有或不含防腐劑。
可以將藥物組成物凍乾用於在投與時或在溶液中再懸浮。在較佳的實施方式中,本發明之藥物組成物係注射用懸浮液。然後將最終產品配製在合適的緩衝液中,裝入小瓶中並儲存直至使用。
儘管不是必需的,藥物組成物也可以視需要以適合於精確量投與的單位劑型提供。
已經大體上描述了本發明,藉由參考以下實例將更容易理解本發明,該實例僅作為說明來呈現,並不旨在以任何方式限制本發明。
實例
除非另有說明,否則本發明之實踐將採用本領域技術範圍內之分子生物學、病毒學、動物細胞培養和生物化學之通常技術。文獻中對此類技術進行了充分解釋。
實例
1
:使用標準質體載體對比最佳化的載體進行三重轉染
1.1.
質體說明
質體 pcohSgsh-827 ( SEQ ID NO: 1 )
含有1512 bp密碼子最佳化的cDNA(在1756 bp CAG啟動子的控制下編碼人N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶)和對應於兔b-珠蛋白pA的519 bp片段的質體。這三個元件側接AAV 2 ITR序列。質體主鏈尺寸為3156 bp(標準主鏈尺寸),並且包含966 bp的胺苄青黴素抗性基因、514 bp的噬菌體複製起點和589 bp的高拷貝數細菌複製起點。
質體 pcohSgsh-900 ( SEQ ID NO: 2 )
含有1512 bp密碼子最佳化的cDNA(在1756 bp CAG啟動子的控制下編碼人N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶)和對應於兔b-珠蛋白pA的519 bp片段的超大質體。這三個元件側接AAV 2 ITR序列。質體主鏈為7073 bp,包含1043 bp康黴素抗性基因、589 bp高拷貝數細菌複製起點,且另外包含4657 bp隨機序列。
質體 pohIDS-874 ( SEQ ID NO: 3 )
含有1653 bp密碼子最佳化的cDNA(在1756 bp CAG啟動子的控制下編碼人艾杜糖2-硫酸酯酶)和對應於兔b-珠蛋白pA的519 bp片段的超大質體。這三個元件側接AAV 2 ITR序列。質體主鏈為7073 bp,且包含1043 bp康黴素抗性基因、589 bp高拷貝數細菌複製起點,且另外包含4657 bp隨機序列。
質體 pRepCap9-808 ( SEQ ID NO: 4 )
編碼rep2和cap9蛋白的質體,其中P5啟動子在其原始位置。該質體包括對應於AAV2 Rep基因的1866 bp片段,隨後是編碼AAV9 Cap基因的2211 bp的序列。130 bp AAV2 P5啟動子位於Rep基因上游的原始位置。質體主鏈包含胺苄青黴素抗性基因和高拷貝數細菌複製起點。
質體 pRepCap9-809 ( SEQ ID NO: 5 )
編碼rep2和cap9蛋白的質體,其中P5啟動子在Cap9基因後。該質體包括對應於AAV2 Rep基因的1866 bp片段,隨後是編碼AAV9 Cap基因的2211 bp的序列。對應於AAV2 P5啟動子的130 bp的序列位於Cap基因的下游。質體主鏈包含康黴素抗性基因和高拷貝數細菌複製起點。
質體 pXX6
含有AAV生產所需的腺病毒序列(E2、E4和VA-RNA)的質體。質體主鏈包含胺苄青黴素抗性基因和高拷貝數細菌複製起點(Xiao等人,J Virol [病毒學雜誌]. 1998年3月;72(3): 2224-2232)。質體pXX6-80源自於僅主鏈被改變的pXX6。pXX6-80的圖譜和序列在文獻中詳細描述。
質體 pAdHelper861 ( SEQ ID NO: 6 )
含有AAV生產所需的腺病毒序列(E2、E4和VA-RNA)的質體。它含有包括VA基因的731 bp區域、包括E2A基因和E4基因的5346 bp區域,並且它們的調控區被包括在3181 bp的片段中。質體主鏈包含康黴素抗性基因和高拷貝數細菌複製起點。
1.2. 藉由三重轉染生產 AAV9-CAG-cohSgsh 載體 材料與方法
如前所述,藉由使用PEI-MAX作為轉染劑進行暫態三重轉染來生產AAV9-CAG-cohSgsh載體(Ayuso E等人,Gene Ther. [基因療法] 2010年4月; 17(4): 503-10)。簡而言之,用等莫耳量的以下三種質體轉染融合的HEK293貼壁細胞:pcohSgsh-827、pRepCap9-808和pXX6(標準質體)或pcohSgsh-900、pRepCap9-809和pAdHelper861(最佳化的質體)。以PEI : DNA比例為2 : 1使用PEI-MAX。轉染後72小時收穫細胞,並藉由三個冷凍和解凍週期裂解以從該細胞內釋放rAAV載體(參見以下實例2)。還描述了使用懸浮HEK293細胞生產rAAV載體(Joshua C Grieger等人. Mol Ther [分子治療學]. 2016年2月; 24(2): 287-297)。
如前所述(Ayuso等人,同上引用),使用對表現盒中存在的兔β-球蛋白聚A序列具有特異性的引子和探針,藉由Taqman qPCR對載體基因組進行定量。同樣,使用對所有使用的質體主鏈中存在的抗生素抗性啟動子序列具有特異性的引子和探針,藉由Taqman qPCR定量反向包裝。
用GraphPad Prism 7.00進行統計分析。
[表 1
].
用於三重轉染的質體的列表。
名稱 | 質體類型 |
pcohSgsh-827 | 標準 |
pRepCap9-808 | 標準 |
pXX6 | 標準 |
pcohSgsh-900 | 最佳化的 |
pRepCap9-809 | 最佳化的 |
pAdHelper861 | 最佳化的 |
結果
如上所述,相比使用通常用於AAV載體生產的標準質體進行生產,藉由使用最佳化的質體的三重轉染進行重組AAV9載體AAV9-CAG-cohSgsh的生產可導致更高的產率(圖1)。
藉由使用最佳化的質體進行三重轉染產生的AAV9-CAG-cohSgsh載體比使用通常用於AAV生產的標準質體獲得的那些導致更低的細菌序列之反向包裝(圖2)。
使用含有異源核苷酸序列的最佳化的質體(其中所述質體係含有填充DNA序列的超大質體(pcohSgsh-900))與非最佳化的質體組合使用(即,與用於三重轉染的標準載體組合使用)時,不會改善載體基因組之產率。因此,單獨使用最佳化的超大質體並不能藉由三重轉染改善載體基因組產率(圖3)。
然而,該最佳化的超大質體與包含腺病毒協助工具的最佳化的質體(pAdhelper861)或含有AAV rep編碼區和AAV cap編碼區的最佳化的質體(pRepCap9-809)的組合改善了載體基因組之產率(參見圖3)。此外,當組合三個最佳化的載體時,載體基因組的產率將大大提高(參見圖3)。
此外,諸位發明人出人意料地發現,當將最佳化的超大質體(pcohSgsh-900)與一種或兩種最佳化的輔助質體(pRepCap9-809和/或pAdhelper861)進行共轉染時,減少了細菌序列之反向包裝(圖4)。特別地,使用該等最佳化的質體的三重組合導致反向包裝更大減少(圖4和5)。實際上,當共轉染含有超大主鏈的最佳化質體(pcohSgsh-900)時,使用最佳化的輔助質體(pAdhelper861)和/或(pRepCap9-809)而導致的細菌序列百分比降低更為明顯(圖5)。
實例 2 :三重轉染和擴展基因表現( Extended Gene Expression, EGE ) 2.1. 細胞系、培養基和培養條件
使用的細胞系係加拿大國家研究委員會生物技術研究所(蒙特利爾,加拿大)提供的適應無血清懸浮培養的HEK 293細胞系(HEK 293SF-3F6)。在補充有麩醯胺酸8 mM、0.1% Pluronic1(英傑公司(Invitrogen))和0.05 ng/L IGF的Freestyle F17培養基(英傑公司,卡爾斯巴德,加利福尼亞州)中培養細胞。將細胞通常保持在20 mL培養基中的125 mL一次性聚碳酸酯錐形瓶(康寧公司(Corning),斯圖本(Steuben),紐約)中。使用置於保持在37ºC、空氣中5% CO2
的濕潤氣氛中的培養箱中的定軌搖床(科耐搖床(Kuhner shakers),瑞士)以130 rpm振盪燒瓶。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec公司,丹麥)確定細胞計數和活力。
2.2. 暫態轉染( TGE )
使用PEIPro(波利塞斯公司(Polysciences),沃靈頓,賓夕法尼亞州)暫態轉染HEK 293懸浮細胞。將HEK 293細胞以0.5·106
細胞/mL接種在125 mL一次性燒瓶中,生長至2·106
細胞/mL,並用0.76 µg pAdHelper861/mL培養物、0.77 µg pRepCap9-809/mL培養物和0.38 µg pohIDS-874/mL或0.38 µg pcohSgsh-900/mL培養物轉染,且DNA與PEI的質量比為1:2。藉由將PEI快速添加到DNA中來形成PEI/DNA複合物,二者均在新鮮培養基中稀釋以達到相同體積(複雜混合物體積為待轉染培養物總體積之5%)。將混合物在室溫下孵育15 min以允許形成複合物,然後將其加入細胞培養物中。
2.3.coh-IDS 基因的擴展基因表現方法
擴展基因表現(EGE)的生產策略在於進行重複多輪的轉染,以實現隨時間推移的持續量之基因表現,這與需要單輪轉染的傳統TGE方法相反。第一次轉染後,使用與上述2.2.中所述相同的質體和條件,在藉由離心(300 xg,在5分鐘內)進行完全培養基更換後,使用相同的質體和PEI濃度每48小時進行一輪再轉染。藉由進行該等培養基更換,AAV被分泌到培養物的上清液中,並且進行每次再轉染之前的每次培養基更換都可以收穫AAV。
結果顯示(參見圖3),當進行EGE方法時,從上清液中收穫的總vg增加了3倍。分批(單次轉染)後回收的總vg為8E11 vg(細胞裂解後獲得)。EGE策略後回收的總vg為上清液中的2,5E12 vg,從純化的角度來看這是一個優點,因為不需要裂解細胞即可收穫AAV,且因此,預期宿主細胞DNA和宿主細胞蛋白質的污染較少。
2.4.coh-Sgsh 基因的擴展基因表現方法
如上文2.3中所述,還已經針對基因coh-Sgsh
對EGE方法進行了測試。
結果顯示(參見圖4),當進行EGE方法時,從上清液中收穫的總vg增加了1.7倍。分批(單次轉染)後回收的總vg為1.9E12 vg(細胞裂解後獲得)。EGE策略後從上清液中回收的總vg為3.18E12 vg。AAV的生產遵循與phIDS
相似模式(參見上述2.3),因此支持EGE策略的普遍適用性。
無
[圖1].藉由用一組標準質體或一組最佳化的質體三重轉染產生的以總vg表示的AAV9-CAG-cohSgsh之產率。
[圖2].藉由用一組標準質體或一組最佳化的質體三重轉染產生的AAV9-CAG-cohSgsh中存在的細菌序列之副本。
[圖3].最佳化的質體pcohSgsh-900單獨或與其他最佳化的輔助質體(pRepCap9-809和pAdhelper861)組合對AAV載體產率(總vg)之作用。
[圖4].細菌序列的反向包裝。最佳化的超大質體pcohSgsh-900單獨或與其他最佳化的輔助質體(pRepCap9-809和pAdhelper861)組合之作用。
[圖5].細菌序列之反向包裝。最佳化的超大質體pcohSgsh-900與其他最佳化的輔助質體(pRepCap9-809和pAdhelper861)組合時的作用。
[圖6].用pohIDS-874質體暫態轉染後回收的總vg。進行幾輪再轉染後,細胞裂解和在培養上清液中回收的總vg。時間以轉染後的小時數(hpt)表示。
[圖7].用pohSGSH-900質體暫態轉染後回收的總vg。進行幾輪再轉染後,細胞裂解和在培養上清液中回收的總vg。時間以轉染後的小時數(hpt)表示。
無
Claims (18)
- 一種用於生產重組病毒載體之方法,所述方法包括以下步驟: a) 用至少兩個質體載體共轉染合適的細胞培養物,所述質體載體包含異源核苷酸序列以及複製和包裝基因序列; b) 在允許病毒複製和包裝的條件下培養所述細胞; c) 回收步驟 b) 中產生的病毒載體並在允許進一步分裂和生長的條件下將該細胞保留在該細胞培養物中; d) 用根據步驟 a) 之質體載體再轉染根據步驟 c) 之細胞;和 e) 重複步驟 b) 至 c)。
- 如請求項1所述之方法,其中所述重組病毒載體選自由以下組成之群組:反轉錄病毒載體、腺病毒載體和AAV載體。
- 一種用於生產重組AAV之方法,所述方法包括以下步驟: a) 用至少兩個質體載體共轉染合適的細胞培養物,所述載體包含側接ITR之異源核苷酸序列、AAV rep和AAV cap基因序列以及腺病毒協助工具序列; b) 在允許AAV複製和包裝的條件下培養所述細胞; c) 回收步驟 b) 中產生的AAV並在允許進一步分裂和生長的條件下將該細胞保留在該細胞培養物中; d) 用根據步驟 a) 之質體載體再轉染根據步驟 c) 之細胞;和 e) 重複步驟 b) 至 c)。
- 如請求項1至3中任一項所述之方法,其中在步驟 b) 中,AAV分泌到該細胞培養物之上清液中。
- 如請求項1至4中任一項所述之方法,其中,在步驟 d) 之前更換該細胞培養物之細胞培養基。
- 如請求項5所述之方法,其中藉由灌注進行細胞培養基更換。
- 如請求項1至6中任一項所述之方法,其中在回收步驟 c) 之後,將步驟 d)、b) 和 c) 至少再重複一次。
- 如請求項1至7中任一項所述之方法,其中在攪拌的液體培養基中懸浮培養所述細胞來進行步驟 b)。
- 如請求項3至8中任一項所述之方法,其中在步驟 a) 中,使用以下三個質體載體: i) 第一質體載體,其特徵在於質體主鏈尺寸大於5000 pb、較佳的是在7000 bp和7500 bp之間,並且包含側接ITR之異源核苷酸序列和位於所述ITR外部、較佳的是與一個ITR相鄰的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 pb和4800 pb之間; ii) 第二質體載體,該第二質體載體從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列;和 iii) 第三質體載體,該第三質體載體包含腺病毒協助工具序列,包括VA-RNA、E2A和E4序列,其中所述質體不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。
- 如請求項8或9中任一項所述之方法,其中所述第一質體載體在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。
- 一種用於生產重組AAV之方法,所述方法包括以下步驟: a) 用以下質體載體共轉染合適的細胞 i) 第一質體載體,該第一質體載體包含側接ITR之異源核苷酸序列; ii) 第二質體載體,該第二質體載體從5'至3'包含AAV rep編碼區、AAV cap編碼區和包含AAV p5啟動子區之核苷酸序列;以及 iii) 第三質體載體,該第三質體載體包含腺病毒協助工具序列,包括VA-RNA、E2A和E4序列,其中所述質體不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列; b) 在允許AAV複製和包裝的條件下培養所述細胞;和 c) 回收步驟 b) 中產生的AAV。
- 如請求項11所述之生產重組AAV之方法,其中所述第一質體載體 i) 特徵在於質體主鏈尺寸大於5000 pb、較佳的是在7000 bp和7500 bp之間,並且其包含位於所述ITR外部、較佳的是與一個ITR相鄰的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 pb和4800 pb之間。
- 如請求項12所述之方法,其中所述第一質體載體 i) 在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。
- 如請求項11至13中任一項所述之方法,其中所述第二質體載體 (ii) 包含AAV Rep2和AAV Cap9編碼區。
- 一種質體載體,該質體載體包含: a) 側接ITR的異源核苷酸序列;和 b) 位於所述ITR外部並與一個ITR相鄰的填充DNA序列,其中所述填充序列的長度在4400 Kb和4800 Kb之間,從而使得質體主鏈尺寸大於5 Kb,較佳的是在7000 bp和7500 bp之間; 其中所述質體載體在主鏈序列中不含F1Ori核苷酸序列。
- 如請求項15所述之質體載體,該質體載體係如SEQ ID NO: 2中列出的登錄號為DSM 32967的pcohSgsh-900。
- 一種質體載體,該質體載體包含腺病毒協助工具序列,包括VA-RNA、E2A和E4序列,其中所述質體不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。
- 如請求項17所述之質體載體,該質體載體係如SEQ ID NO: 6中列出的登錄號為DSM 32965的pAdHelper-861。
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