JP2024514956A - 組織標的化された改変ａａｖカプシドおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
筋肉組織における形質導入の改善、免疫原性の低減、中和抗体結合の低減、肝臓組織形質導入の低減、およびこれらの組合せを有する改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む改変ＡＡＶカプシドが、本明細書において提供される。改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターで患者を処置する方法も提供される。一部の態様では、カプシドタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質である。一部の態様では、改変されたＶＲ ＶＩＩＩが、ペプチド挿入を含む。
Description
開示の分野
本開示は、分子生物学、遺伝子治療、ならびに改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドの形質導入を増強するための組成物および方法を対象とする。特に、筋肉組織における（is muscle tissue）形質導入の増強および／または肝臓組織における形質導入の低減を有する、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む改変ＡＡＶカプシドが提供される。
本開示は、分子生物学、遺伝子治療、ならびに改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドの形質導入を増強するための組成物および方法を対象とする。特に、筋肉組織における（is muscle tissue）形質導入の増強および／または肝臓組織における形質導入の低減を有する、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む改変ＡＡＶカプシドが提供される。
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年４月２３日に出願した米国特許仮出願第６３／１７８，９６５号および２０２２年１月１４日に出願した米国特許仮出願第６３／２９９，６９７号に基づく優先権および利益を主張するものである。各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年４月２３日に出願した米国特許仮出願第６３／１７８，９６５号および２０２２年１月１４日に出願した米国特許仮出願第６３／２９９，６９７号に基づく優先権および利益を主張するものである。各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組込み
２０２２年４月２１日に作成された１．３３ＭＢサイズの「ＬＯＣＮ＿０１１＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルの内容は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２０２２年４月２１日に作成された１．３３ＭＢサイズの「ＬＯＣＮ＿０１１＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルの内容は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく治療薬は、特定の組織型における形質導入が限定的であり得、形質導入は、特定のＡＡＶ血清型に対して特異的な既存の中和抗体（ＮＡｂ）に起因して限定され得る。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく治療薬は、特定の組織型における形質導入が限定的であり得、形質導入は、特定のＡＡＶ血清型に対して特異的な既存の中和抗体（ＮＡｂ）に起因して限定され得る。
特に、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、骨格筋形質導入のために全身注射によって送達される治療に一般的に使用されるベクターである。しかし、これらの血清型は、肝臓にも形質導入し、患者集団の有意なパーセンテージが、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対して中程度から高度のＮＡｂ力価を有する。それ故、所望の組織における組織特異的形質導入の増強および／または所望されない組織における形質導入の低減を有する改変ＡＡＶカプシドタンパク質を有するＡＡＶカプシドの開発の必要性が存在する。一部の態様では、筋肉組織における形質導入の増強および／または肝臓組織における形質導入の低減を有することが望ましい。
増強された筋肉、形質導入、ならびに肝臓組織における形質導入の低減を有する、改変おびキメラＡＡＶカプシドタンパク質配列で構成されるＡＡＶカプシドが、本明細書に開示される。一部の態様では、ＡＡＶカプシドは、既存の中和抗体に対する感度を低下させた改変およびキメラＡＡＶカプシドタンパク質配列で構成される。
概要
本開示は、改変された可変領域（ＶＲ）ＶＩＩＩを含む、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。一部の態様では、カプシドタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質である。一部の態様では、改変されたＶＲ ＶＩＩＩが、ペプチド挿入を含む。
本開示は、改変された可変領域（ＶＲ）ＶＩＩＩを含む、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。一部の態様では、カプシドタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質である。一部の態様では、改変されたＶＲ ＶＩＩＩが、ペプチド挿入を含む。
一部の態様では、ペプチド挿入が、ＲＧＤモチーフペプチド挿入を含む。一部の態様では、ＲＧＤモチーフ挿入が、ＲＧＤＬＧＬＳ（配列番号３０３）、ＲＧＤＬＳＴＰ（配列番号３０４）、ＳＮＳＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０５）、ＥＮＲＲＧＤＦＮＮＴ（配列番号３０６）、ＳＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０７）、ＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０８）、ＲＧＤＬＳＴ（配列番号３０９）またはＲＧＤＹＶＧＬ（配列番号３１０）を含む。
一部の態様では、ＲＧＤモチーフ挿入が、ラクダ科動物重鎖のみの抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）ＲＧＤペプチドを含む。一部の態様では、ＶＨＨ ＲＧＤペプチドが、アミノ酸配列
と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、ペプチド挿入が、アセチルコリンエステラーゼ膠原質形成テイル（ＣｏｌＱ）ペプチドを含む。一部の態様では、ＣｏｌＱペプチドが、アミノ酸配列
と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、ペプチド挿入が、前記挿入されたペプチドのＮ末端またはＣ末端に１つまたは複数のリンカー配列を含む。一部の態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号３１１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１５）を含む。
一部の態様では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９またはＡＡＶＲｈ７４である。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む。一部の態様では、１つまたは複数のアミノ酸変異が、肝臓形質導入を低減させる。一部の態様では、変異が、ｉ）Ｒｈ７４のＦ５０３Ｉ、Ｇ５０７Ｉ、Ｙ７０７Ｃ、および／もしくはＹ７０８Ｃのうちの少なくとも１つ、またはｉｉ）ＡＡＶ９のＮ４９８Ｉを含む。
一部の態様では、カプシドタンパク質は、配列番号５３、７５、１０２、１２４、２４５、２４９、２５５、２５８、２６２、または２６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
本開示は、配列番号５３、７５、１０２、１２４、２４５、２４９、２５５、２５８、２６２、または２６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む改変ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。
一部の態様では、カプシドタンパク質が、配列番号１５１、１７３、１９９、２２１、２７０、２７４、２８０、２８３、２８７、または２９２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の核酸配列によってコードされる。
本開示は、本開示のいずれかの実施形態による１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドを提供する。
一部の態様では、ＡＡＶカプシドが他の組織または細胞型と比べて標的化された組織または細胞型における形質導入の増強を有する。一部の態様では、標的化された組織型が、筋肉組織または筋肉細胞である。一部の態様では、ＡＡＶカプシドが筋肉組織における形質導入の増強を有する。一部の態様では、ＡＡＶカプシドが標的化されていない組織または細胞型における形質導入の低減を有する。一部の態様では、標的化されていない組織が、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、腸、脊髄、または生殖器を含む。
一部の態様では、筋肉組織における形質導入が、親および／または未改変ＡＡＶカプシドと比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約１００％、約２００％、または約３００％増強される。
一部の態様では、カプシドが、ｉ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、ｉｉ）配列番号１０２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。
一部の態様では、カプシドが、ｉ）配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、ｉｉ）配列番号１２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。
一部の態様では、カプシドが、ｉ）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、ｉｉ）配列番号２５８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。
一部の態様では、カプシドが、ｉ）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、ｉｉ）配列番号２６２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。
一部の態様では、カプシドが、ｉ）配列番号２５５で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、ｉｉ）配列番号２６７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。
本開示は、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列が、宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する調節エレメントに作動可能に連結されている。
本開示は、本開示の改変カプシドタンパク質または本開示のＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶウイルスベクターを提供する。
一部の態様では、ＡＡＶウイルスベクターは、治療用導入遺伝子または目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）をコードする、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを含む。
本開示は、本開示のベクターまたは本開示のＡＡＶウイルスベクターを含む、細胞を提供する。
本開示は、本開示の請求項のＡＡＶウイルスベクターと少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤とを含む医薬組成物を提供する。
本開示は、治療用導入遺伝子またはタンパク質を対象に提供する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターまたは本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本開示は、疾患および／または障害を有する対象を処置する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターまたは本開示の医薬組成物の少なくとも１治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、疾患および／または障害は、筋および／または神経筋障害である。一部の態様では、筋および／または神経筋障害は、筋ジストロフィーまたは筋強直性ジストロフィーである。
一部の態様では、ＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、前記対象に、静脈内、髄腔内、脳内、室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは目周囲、経口、直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、大槽内、神経内、胸膜内、局部、リンパ内、大槽内、または神経内に投与される。
詳細な説明
本開示は、パッケージングされた治療薬を筋肉組織に送達するための改変およびキメラＡＡＶカプシドタンパク質を含む遺伝子治療用組成物を提供する。
本開示は、パッケージングされた治療薬を筋肉組織に送達するための改変およびキメラＡＡＶカプシドタンパク質を含む遺伝子治療用組成物を提供する。
用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書で使用される場合、この名前に関連するウイルスの綱のメンバーであって、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属に属するメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能がヘルパーウイルスの同時感染により提供される細胞において成長する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報および総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ， １９８９， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． １６９－ ２２８、およびＢｅｒｎｓ， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｐｐ． １７４３－１７６４， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において見つけることができる。これらの総説に記載されている同じ原理が、これらの総説の発表日後に特徴付けられた追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることは、十分に予想される。なぜなら、多様な血清型が、構造的にも機能的にも、さらには遺伝子レベルで、非常に密接に関連していることは周知であるからである。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ， １９８８， ｐｐ． １６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｊ． Ｒ． Ｐａｔｔｉｓｏｎ， ｅｄ．；およびＲｏｓｅ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３： １－６１ （１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子により媒介される非常に類似した複製特性を示すようであり、全てが、３つの関連カプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２に発現されるものを有する。この類似度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の過度の交差ハイブリダイゼーションを明示するヘテロ二本鎖解析；および「末端逆位反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。類似した感染力パターンも、各血清型における複製機能が、類似した調節制御下にあることを示唆する。このウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に好適であることが公知であり、あらゆる公知血清型が、種々の組織型からの細胞に感染し得る。連番が付けられた少なくとも１１のＡＡＶ血清型が、当技術分野において公知である。本明細書に開示される方法において有用な非限定的な例示的血清型は、１１の血清型のいずれか、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアント血清型、例えば、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂを含む。ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という３つの主要ウイルスタンパク質を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。一部の態様では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＯ１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶｒｈ．１０を指す。
例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、全ての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＯ１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶｒｈ．１０）を含むが、これらに限定されない。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、および１つの血清型のゲノムと別の血清型のカプシドとを含むＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ－ＤＪ８）を含むが、これらに限定されない。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＫＰ－１（Kerun et al. JCI Insight, 2019; 4(22):e131610に詳細に記載されている）およびＡＡＶ－ＮＰ５９（Paulk et al. Molecular Therapy, 2018; 26(1): 289-303に詳細に記載されている）を含むが、これらに限定されない。
ＡＡＶ構造および機能
ＡＡＶ構造および機能
ＡＡＶは、複製欠損型パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、長さ約４．７ｋｂであり、２つの１４５ヌクレオチド末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供されており；ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびSrivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)で提供されており；ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供されており；ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供されており；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供されており；ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供されており；ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９でそれぞれ提供されており；ＡＡＶ－９ゲノムは、Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)で提供されており；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)で提供されており；ＡＡＶ－１１ゲノムは、Virology, 330(2): 375-383 (2004)で提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号は、カプシドタンパク質および自己相補的ゲノムの配列も提供している。一態様では、ＡＡＶゲノムは、自己相補的ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド封入／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するシス作用性配列が、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有されている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられた）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、およびｒｅｐ ４０）が生じることになる。ｒｅｐタンパク質は、複数の酵素特性を有し、これらが、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する。
ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の各々が翻訳される単一のｍＲＮＡが転写された後、それは２つの異なる様式でスプライシングされ得る：より長いイントロンまたはより短いイントロンどちらかが切除され、その結果、ｍＲＮＡの２つのプール：２．３ｋｂ長および２．６ｋｂ長のｍＲＮＡプール、が形成されることになり得る。より長いイントロンが、多くの場合、好ましく、それ故、２．３ｋｂ長ｍＲＮＡは、主要スプライスバリアントと呼ばれ得る。この形態は、ＶＰ１タンパク質の合成が開始する第１のＡＵＧコドンを欠いており、その結果、ＶＰ１タンパク質合成の全体的なレベルが低下することになる。主要スプライスバリアントに残存する第１のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかし、同じオープンリーディングフレーム内のそのコドンの上流に、最適なコザック（翻訳開始）コンテキストに囲まれているＡＣＧ配列（トレオニンをコードする）がある。これは、Becerra SP et al., (December 1985)."Direct mapping of adeno-associated virus capsid proteins B and C: a possible ACG initiation codon". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (23): 7919-23, Cassinotti P et al., (November 1988). "Organization of the adeno-associated virus (AAV) capsid gene: mapping of a minor spliced mRNA coding for virus capsid protein 1". Virology. 167 (1): 176-84, Muralidhar S et al., (January 1994). "Site-directed mutagenesis of adeno-associated virus type 2 structural protein initiation codons: effects on regulation of synthesis and biological activity". Journal of Virology. 68 (1): 170-6,およびTrempe JP, Carter BJ (September 1988). "Alternate mRNA splicing is required for synthesis of adeno-associated virus VP1 capsid protein".Journal of Virology. 62 (9): 3356-63に記載されているように、ＶＰ１と同様に、実際には追加のＮ末端残基を有するＶＰ３タンパク質であるＶＰ２タンパク質の低レベルの合成の一因となり、前記参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。単一のコンセンサスポリＡ部位が、ＡＡＶゲノムのマップ９５位に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝的特徴は、Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)において概説されている。
各ＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分およびＶＰ３部分を含有する。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質に特有であるＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分にも見られる、ＶＰ１タンパク質内に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分とＶＰ３タンパク質は、同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質と共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。
ＶＰ３タンパク質は、別個の可変表面領域Ｉ～ＩＸ（ＶＲＩ～ＩＸ、これらはＶＲ１～ＶＲ８とも呼ばれる）にさらに分けることができる。可変表面領域（ＶＲ）の各々は、DiMatta et al., "Structural Insight into the Unique Properties of Adeno-Associated Virus Serotype 9" J. Virol., Vol. 86 (12): 6947-6958, June 2012に記載されているように、特定の血清型に独特な感染表現型（例えば、他のＡＡＶ血清型と比べて低下した抗原性、改善された形質導入および／または組織特異的トロピズム）を、単独でまたは他のＶＲの各々の特定のアミノ酸配列との組合せでのどちらかで付与することができる、特定のアミノ酸配列を含むことまたは含有することができ、前記参考文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＡＶは、そのＡＡＶを、例えば遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するベクターとして魅力的なものにする、独特の特徴を有する。培養下の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、無症状および無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的とする可能性が認められる。さらに、ＡＡＶは、分裂および非分裂細胞に緩徐に形質導入し、本質的にこれらの細胞の寿命にわたって転写活性核エピソーム（染色体外エレメント）として存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド内にクローン化ＤＮＡとして挿入され、そのため組換えゲノムの構築が実現可能になる。さらに、ＡＡＶの複製およびゲノムカプシド封入を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されているため、ＡＡＶベクターを生成するために内部のおおよそ４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐ、をコードする）の一部または全てを外来ＤＮＡに置き換えることができる。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をｉｎ ｔｒａｎｓで提供することができる。ＡＡＶのもう１つの有意な特徴は、極めて安定している丈夫なウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃、数時間）にたやすく耐え、そのためＡＡＶの低温保存があまり重要でなくなる。ＡＡＶを凍結乾燥させることさえできる。最終的に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に対して耐性がない。
複数の研究によって、筋肉における長期（＞１．５年）組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); and Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). See also, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) and Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001)を参照。さらに、筋肉は高度に血管形成されているため、組換えＡＡＶ形質導入によって、Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997)およびMurphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997)に記載されているように、筋肉内注射後に体循環において導入遺伝子産物が出現するという結果をもたらした。さらに、Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)によって、骨格筋線維は、筋肉が分泌型タンパク質治療薬を安定的に発現できることを示す的確な抗体グリコシル化、フォールディングおよび分泌に必要な細胞因子を有することが実証された。本発明の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、治療用タンパク質をコードする核酸分子、およびその核酸分子に隣接している１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ２００１０８３６９２において開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも、企図される。例えば、Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)を参照されたい。多様なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当技術分野において公知である。
組換えＡＡＶベクター
組換えＡＡＶベクター
「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の導入遺伝子配列および１つまたは複数のＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む、それらから本質的になる、またはそれからなる、ベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、例えば宿主細胞へのトランスフェクションにより、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物の機能性を提供する宿主細胞に存在する場合、複製され、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸、および／または感染性ＡＡＶ粒子にパッケージングされるフランキングＩＴＲ内のエンハンサーおよび／もしくはターミネーターを含有する。カプシドに封入された核酸部分は、ＡＡＶベクターゲノムと呼ばれ得る。ｒＡＡＶベクターを含有するプラスミドは、製造のためのエレメント、例えば、抗生物質耐性遺伝子、複製起点配列なども含有し得るが、これらは、カプシドに封入されず、したがって、ＡＡＶ粒子の一部を形成しない。
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの導入遺伝子核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのエンハンサー配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのポリＡ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのレポータータンパク質を含み得る。
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、導入遺伝子核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、導入遺伝子核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、１つより多くの導入遺伝子核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つの導入遺伝子核酸分子を含み得、したがって、ｒＡＡＶベクターは、第１の導入遺伝子核酸分子および少なくとも第２の導入遺伝子核酸分子を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２の導入遺伝子核酸分子は、同じ核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２の導入遺伝子核酸分子は、異なる核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２の導入遺伝子核酸配列は、互いに隣接していることがある。
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、１つより多くのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのプロモーター配列を含み得、したがって、ｒＡＡＶベクターは、第１のプロモーター配列および少なくとも第２のプロモーター配列を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、同じ配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、異なる配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、互いに隣接していることがある。ｒＡＡＶベクターが第１の導入遺伝子核酸分子および少なくとも第２の導入遺伝子核酸分子も含む、一部の態様では、第１のプロモーターは、第１の導入遺伝子核酸分子の上流（５’）側に位置し得、少なくとも第２のプロモーターは、第１の導入遺伝子核酸分子と少なくとも第２の導入遺伝子核酸分子の間に位置し得、したがって、少なくとも第２のプロモーターは、第１の導入遺伝子核酸分子の下流（３’）側、かつ少なくとも第２の導入遺伝子核酸分子の上流（５’）側にある。
前記ｒＡＡＶベクターのいずれかは、少なくとも１つのエンハンサーをさらに含み得る。少なくとも１つのエンハンサーは、ｒＡＡＶベクター内のどこかに位置し得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターの直ぐ上流（５’）側に位置し得る。したがって、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、エンハンサー、プロモーター配列、導入遺伝子核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターの直ぐ下流（３’）側に位置し得る。したがって、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、エンハンサー、導入遺伝子核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、導入遺伝子核酸分子の直ぐ下流側に位置し得る。したがって、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、導入遺伝子核酸分子、エンハンサー、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。
本開示のｒＡＡＶベクターは、当技術分野で公知の任意の導入遺伝子核酸分子を含み得る。一部の態様では、導入遺伝子核酸は、治療用導入遺伝子である。一部の態様では、導入遺伝子核酸分子は、互換的に、目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）と呼ばれる。ＮＯＩは、限定することなく、ベクターにより送達され得る任意のヌクレオチド配列または導入遺伝子を含む。ＮＯＩは、合成のものであることがあり、天然に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡに由来することがあり、コドン最適化されていることがあり、組換えＲＮＡ／ＤＮＡであることがあり、ｃＤＮＡであることがあり、部分的ゲノムＤＮＡであることがあり、および／またはこれらの組合せであることがある。ＮＯＩは、コード領域または部分的コード領域であることがあるが、コード領域である必要はない。ＮＯＩは、センスまたはアンチセンス配向でのＲＮＡ／ＤＮＡであることがある。ＮＯＩは、本明細書では、限定することなく、導入遺伝子、異種配列、遺伝子、治療用遺伝子とも呼ばれる。ＮＯＩは、ＰＯＩ（目的のタンパク質）、部分的ＰＯＩ、ＰＯＩの変異型バージョンまたはバリアントをコードすることもある。ＰＯＩは、野生型タンパク質に類似していることがあり、または野生型タンパク質に相当することがある。ＰＯＩは、融合タンパク質または核タンパク質複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ核タンパク質複合体であることもある。ＰＯＩは、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質であることもある。一部の態様では、ＰＯＩは、ＲＮＡ標的化もしくはＲＮＡ結合タンパク質または核タンパク質複合体であることがある。ガイドされないＲＮＡ結合融合タンパク質を含む、ＮＯＩまたは導入遺伝子
一部の実施形態では、ＮＯＩは、ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合融合タンパク質ではない、それ故、対応するｇＲＮＡ配列なしで標的ＲＮＡに結合することができる少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドを含む、標的ＲＮＡ結合融合タンパク質をコードする核酸である。そのようなガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドとしては、限定することなく、ＰＵＦ（ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦホモロジーファミリー）タンパク質である少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分が挙げられる。この型のＲＮＡ結合性ポリペプチドを、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓなどのｇＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質の代わりに使用することができる。ｍＲＮＡの安定性および翻訳の媒介に関与するＰＵＦタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＰｕｍｉｌｉｏおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｆｅｍ－３結合因子に由来する）の独特のＲＮＡ認識方式は当技術分野で周知である。同じく当技術分野で公知のヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは同族ＲＮＡ配列に密接に結合し、また、その特異性は改変することができる。ヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは、８つの連続したＲＮＡ塩基を認識する８つのＰＵＦモジュールを含有し、各モジュールが一塩基を認識する。各モジュール内の２つのアミノ酸側鎖は、対応する塩基のワトソン・クリック端を認識し、そのモジュールの特異性が決定されるので、ＰＵＦモジュールは、最大の８～１６ｎｔのＲＮＡに特異的に結合するように設計することができる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００９； ６ （１１）： ８２５－８３０。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０６８６２７も参照されたい。
ＰＵＦ－ＲＮＡ相互作用のモジュール的性質は、ＰＵＦドメインの結合特異性を合理的に操作するために使用されている（Ｃｈｅｏｎｇ， Ｃ． Ｇ． ＆ Ｈａｌｌ， Ｔ． Ｍ． （２００６） ＰＮＡＳ １０３： １３６３５－１３６３９；Ｗａｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ （２００２） Ｃｅｌｌ １１０： ５０１－５１２）。しかし、アデニン、グアニンまたはウラシルを認識するモジュールを有するＰＵＦタンパク質の設計の成功しか、上掲のＷＯ２０１２／０６８２７の教示より前に報告されていない。野生型ＰｕｍＨＤは、シトシン（Ｃ）に結合しないが、分子操作によって、Ｐｕｍユニットの一部が良好な収率および特異性でＣに結合するように変異され得ることが示されている。例えば、Ｄｏｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ （ＰＵＦ） ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８６， ２６７３２－２６７４２ （２０１１）を参照されたい。したがって、ＰｕｍＨＤは、ＲＮＡの任意の８塩基配列へのプログラム可能な結合を示す、ＷＴ Ｐｕｍｉｌｉｏタンパク質の改変バージョンである。ＰｕｍＨＤの８ユニットの各々は、４つ全てのＲＮＡ塩基に結合することができ、標的配列に隣接しているＲＮＡ塩基は、結合に影響を与えない。ＰＵＦ設計の当技術分野において認知されているＲＮＡ結合規則については以下の参考文献も参照されたい：Ｆｉｌｉｐｏｖｓｋａ Ａ， Ｒａｚｉｆ ＭＦ， Ｎｙｇａｒｄ ＫＫ， ＆ Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ． Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＰＵＦ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， ７（７）， ４２５－４２７ （２０１１）；Ｆｉｌｉｐｏｖｓｋａ Ａ， ＆ Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ． Ｍｏｄｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ＰＵＦ， ＴＡＬＥ ａｎｄ ＰＰＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ， ８（３）， ６９９－７０８ （２０１２）；Ａｂｉｌ Ｚ， Ｄｅｎａｒｄ ＣＡ， ＆ Ｚｈａｏ Ｈ． Ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＰＵＦ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＲＮＡ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８（１）， ７ （２０１４）；Ｚｈａｏ Ｙ， Ｍａｏ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｌｉ Ｈ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｚ， ＆ Ｗｕ Ｊ． Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＰＵＦ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４６（９）， ４７７１－４７８２ （２０１８）；Ｓｈｉｎｏｄａ Ｋ， Ｔｓｕｊｉ Ｓ， Ｆｕｔａｋｉ Ｓ， ＆ Ｉｍａｎｉｓｈｉ Ｍ． Ｎｅｓｔｅｄ ＰＵＦ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ， １９（２）， １７１－１７６ （２０１８）；Ｋｏｈ ＹＹ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｑｉｕ Ｃ， Ｏｐｐｅｒｍａｎ Ｌ， Ｇｒｏｓｓ Ｌ， Ｔａｎａｋａ Ｈａｌｌ ＴＭ， ＆ Ｗｉｃｋｅｎｓ Ｍ． Ｓｔａｃｋｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＵＦ－ＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． ＲＮＡ， １７（４）， ７１８－７２７ （２０１１）。
しかるが故に、ヒトＰＵＭ１（１１８６個のアミノ酸）が、このタンパク質のＣ末端にＲＮＡ結合性ドメイン（ＲＢＤ）（Ｐｕｍｉｌｉｏ相同ドメインＰＵＭ－ＨＤアミノ酸８２８～アミノ酸１１７５としても公知）を含有すること、およびＰＵＦがヒトＰＵＭ１のＲＢＤに基づくことは、当技術分野において周知である。ＲＮＡ結合のための３６個のアミノ酸の８つの構造リピートモジュール（４３個のアミノ酸を有するモジュール７を除く）、ならびにタンパク質の構造および安定性に重要なフランキングＮまたはＣ末端領域がある。各リピートモジュール内の、アミノ酸１２、１３および１６は、ＲＮＡ結合にとって重要であり、１２および１６がＲＮＡ塩基認識に関与する。アミノ酸１３は、ＲＮＡ塩基とスタックし、特異性および親和性を調整するために改変され得る。あるいは、ＰＵＦ設計は、ヒトＰＵＭ１のネイティブな残基としてアミノ酸１３を維持し得る。本明細書に開示されるＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ組成物の一部の実施形態では、アミノ酸１３は（スタッキングのために）、Ｈで操作されることになり、他の実施形態では、Ｙで操作されることになる。一部の実施形態では、スタッキング残基は、結合および特異性を改善するために改変され得る。認識は、Ｎ末端からＣ末端へＰＵＦが３’から５’へＲＮＡを認識するのとは逆の配向で行われる。したがって、当技術分野において公知の８モジュール（８ＰＵＦ）のＰＵＦ操作は、ヒトタンパク質を模倣する。例示的な８－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（８ＰＵＦ）は、次のように設計されることになる：Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’。一実施形態では、８ＰＵＦは、ＲＢＤとして使用される。別の実施形態では、８ＰＵＦ設計のバリエーションが、１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）ＲＢＤ、１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）ＲＢＤ、または１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）ＲＢＤを作出するために使用される。別の実施形態では、ＰＵＦは、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１１－ｍｅｒ、１２－ｍｅｒ、１３－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、１６－ｍｅｒ、２４－ｍｅｒ、３０－ｍｅｒ、３６－ｍｅｒ、またはその間の任意の数のモジュールを含むように操作され得る。Ｓｈｉｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｃｒｉｓｃｕｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２０２０。その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許９，５８０，７１４も参照されたい。
本開示のガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質の一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＵＭＢＹ（Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ）タンパク質である少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分を含む。ＲＮＡを標的とするためネイティブな形態および改変された形態で広く使用されているＲＮＡ結合性タンパク質ＰｕｍＨＤは、それぞれが１つのＲＮＡ塩基を標的とする４つの標準的なタンパク質モジュールのセットをもたらすように設計したタンパク質構造に操作されている。これらのモジュール（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリに関してはＰｕｍｂｙ）を、所望の標的ＲＮＡに結合するように様々な組成および長さの鎖に連結される。本質的に、ＰＵＭＢＹは、ＰｕｍＨＤの単一のタンパク質ユニットが連結されて任意のサイズおよび結合性配列特異性のアレイになる、より単純なモジュール形態のＰｕｍＨＤである。そのようなＰｕｍｂｙ－ＲＮＡ相互作用の特異性は高く、Ｐｕｍｂｙ鎖の、標的配列から３つまたはそれよりも多くのミスマッチを有するＲＮＡ配列への結合は検出不可能である。Ｋａｔａｒｚｙｎａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ２０１６； １１３ （１９）： Ｅ２５７９－Ｅ２５８８。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２３８５９３も参照されたい。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（Ｅ１７）として公知のジンクフィンガーエンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼドメインと融合している。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分の少なくとも１つは、ＰＰＲタンパク質である。ＰＰＲタンパク質（植物に由来するペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）モチーフを有するタンパク質）は、核にコードされ、ＲＮＡレベルで、細胞小器官（葉緑体およびミトコンドリア）、切り取り（ｃｕｔｔｉｎｇ）、翻訳、スプライシング、ＲＮＡの編集、ＲＮＡ安定性に特異的に作用する遺伝子を排他的に制御する。ＰＰＲタンパク質は、一般には、３５アミノ酸のモチーフであり、ＰＰＲモチーフが約１０個の連続したアミノ酸である構造を有する。ＰＰＲモチーフの組合せをＲＮＡへの配列選択的結合に使用することができる。ＰＰＲタンパク質は、多くの場合、約１０リピートドメインのＰＰＲモチーフで構成される。ＰＰＲドメインまたはＲＮＡ結合性ドメインは、触媒として不活性になるように構成することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５８４０４。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、少なくとも２つのＲＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１つまたは複数のリピートを含む。他の実施形態では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ｃｏ－ポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＲＮＡ結合性タンパク質を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、終点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質の少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、ＲＮＡ結合タンパク質のＮ末端に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、タンパク質のＣ末端にＮＬＳを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、第１のＮＬＳをコードする第１の配列、および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳは、ＲＮＡ結合タンパク質のＮ末端に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、タンパク質のＣ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳ（tdhe second NLS）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＥＳ（核外輸送シグナル）または他のペプチドタグまたは分泌シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、タグは、ＦＬＡＧタグである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる第２のＲＮＡ結合タンパク質と一緒に第１のＲＮＡ結合タンパク質として少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質を含む。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドのＣ末端において第１のＲＮＡ結合ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドのＮ末端において第１のＲＮＡ結合ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一実施形態では、例示的な融合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａとして公知のジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである第２のＲＮＡ結合タンパク質と融合している、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹに基づく第１のＲＮＡ結合タンパク質である。
ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合タンパク質のためのガイドＲＮＡを含む、ＮＯＩまたは導入遺伝子
ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合タンパク質のためのガイドＲＮＡを含む、ＮＯＩまたは導入遺伝子
Ｃａｓに基づくＲＮＡ標的化遺伝子治療用の系では、ＮＯＩまたは導入遺伝子は、ガイドＲＮＡを含む。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）という用語と単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）という用語は、本開示全体を通して互換的に使用される。
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、スペーサー配列および「ダイレクトリピート」（ＤＲ）配列で構成され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、連続したスペーサー配列およびＤＲ配列を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、スペーサー配列とＤＲ配列は連続していない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＤＲ配列を含む。ＤＲ配列は、スペーサー配列が散在する、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（細菌ゲノムまたはプラスミドに天然に存在する）内の反復配列を指す。関連するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の配列が分かっている場合には、対応する（または同族の）Ｃａｓタンパク質のＤＲ配列を推測することができることは周知である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列およびスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡをコードする配列は、リンカー配列によって分離されているスペーサー配列とＤＲ配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチド（ｎｔ）を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄ ＤＲ配列である。
一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ媒介様式で１つまたは複数の標的ＲＮＡ分子とハイブリダイズするｇＲＮＡは、１つまたは複数のダイレクトリピート（ＤＲ）配列、１つまたは複数のスペーサー配列、例えば、ＤＲ－スペーサー－ＤＲ－スペーサーのアレイを含む１つまたは複数の配列などを含む。一実施形態では、各ｇＲＮＡが異なり得る、例えば、異なるＲＮＡ、または単一のＲＮＡからの複数の標的領域、またはこれらの組合せを標的とし得る、複数のｇＲＮＡが、単一のアレイから生成される。一部の実施形態では、単離されたｇＲＮＡは、１つまたは複数のダイレクトリピート配列、例えば、プロセシングされていない（例えば、約３６ｎｔ）またはプロセシングされたＤＲ（例えば、約３０ｎｔ）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して特異的な１つまたは複数のスペーサー配列をさらに含み得る（例えば、標的ＲＮＡと相補的である）。ある特定のそのような実施形態では、複数のｐｏｌＩＩＩプロモーターを使用して、複数のｇＲＮＡ、スペーサーおよび／またはＤＲを駆動することができる。一実施形態では、ガイドアレイは、ＤＲ（約３６ｎｔ）－スペーサー（約３０ｎｔ）－ＤＲ（約３６ｎｔ）－スペーサー（約３０ｎｔ）を含む。
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする配列は、改変または合成されたＲＮＡヌクレオチドを含むまたはそれからなる。例示的な改変されたＲＮＡヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、および７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ヒポキサンチン、キサンチン、キサントシン、７－メチルグアニン、５、６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシトシン（ｈｙｄｒｏｐｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、イソグアニン、およびイソシトシンが挙げられる。
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変されたＲＮＡに結合し得る。本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変されたまたは変異型（例えば、病原性）ＲＮＡに結合し得る。例示的なエピジェネティック的にまたは転写後に改変されたＲＮＡとしては、これだけに限定されないが、２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）（２’－Ｏ－メチル化がリボース部分の遊離の２’－ＯＨの酸素に存在する）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、および５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）が挙げられる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、非コードＣ／Ｄボックス核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列をコードする少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、ＲＮＡ分子の標的配列は、少なくとも１つの２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列は、ボックスＣモチーフ（ＲＵＧＡＵＧＡ）およびボックスＤモチーフ（ＣＵＧＡ）を含む。
本開示のスペーサー配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に結合する。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、病原性標的ＲＮＡに結合する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２６個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、２８個のヌクレオチド、または２９個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２６個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、プロセシングされておらず、３０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、プロセシングされていないスペーサー配列は、３０～３６個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。
本開示のＤＲ配列は、本開示のＣａｓポリペプチドに結合する。ｇＲＮＡのスペーサー配列が標的ＲＮＡ配列に結合すると、ｇＲＮＡのＤＲ配列に結合しているＣａｓタンパク質は、標的ＲＮＡ配列に配置される。その同族Ｃａｓタンパク質またはその核酸に対して十分な相補性を有するＤＲ配列は、Ｃａｓタンパク質の標的核酸配列に選択的に結合し、その配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ同一性を有する。一部の実施形態では、十分な相補性を有する配列は、１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、本開示のＤＲ配列は、二次構造または三次構造を含む。例示的な二次構造としては、これだけに限定されないが、へリックス、ステムループ、バルジ、テトラループおよびシュードノットが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、Ａ形態のへリックス、Ｂ形態のへリックス、およびＺ形態のへリックスが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったステムループが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったシュードノットが挙げられる。一部の実施形態では、本開示のＤＲ配列は、少なくとも１つの二次構造または少なくとも１つの三次構造を含む。一部の実施形態では、本開示のＤＲ配列は、１つもしくは複数の二次構造または１つもしくは複数の三次構造を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、本開示のＲＮＡ分子内のテトラループモチーフに選択的に結合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、テトラループモチーフを含む。一部の実施形態では、テトラループモチーフは、ＧＡＡＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＡＡまたはＧＡＧＡである配列の１つまたは複数を含むまたはそれからなる「ＧＲＮＡ」モチーフである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、ＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に共有結合により結合する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に非共有結合により結合する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、終点を含めて、１０個から１００個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、終点を含めて、１０個から３０個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２１個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２６個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。
ガイド分子は、一般に、種々のプロセシング状態で存在する。一例では、プロセシングされていないガイドＲＮＡは、３６ｎｔのＤＲであり、これに３０～３２ｎｔのスペーサーが続く。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｄ自体または他のＲＮａｓｅによって、より短い「成熟」形態へとプロセシング（短縮化／改変）される。一部の実施形態では、プロセシングされていないガイド配列は、長さ約または少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、またはそれを超えるヌクレオチド（ｎｔ）である。一部の実施形態では、プロセシングされたガイド配列は、約４４～６０ｎｔ（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０ｎｔ）である。一部の実施形態では、プロセシングされていないスペーサーは、約２８～３２ｎｔ長（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）であるが、成熟（プロセシングされた）スペーサーは、約１０～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１４～２５ｎｔ、２０～２２ｎｔ、または１４～３０ｎｔ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）であり得る。一部の実施形態では、プロセシングされていないＤＲは、約３６ｎｔ（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１ｎｔ）であるが、プロセシングされたＤＲは、約３０ｎｔ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）である。一部の実施形態では、ＤＲ配列は、例えば５’末端で、１～１０ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、～１０ヌクレオチド）短縮化されて、成熟した予めプロセシングされたガイドＲＮＡとして発現される。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含まない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサーフランキング配列（ＰＦＳ）と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、ＰＦＳと相補的な配列を含まない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列を含むベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列を含むベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列（ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｓ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、組織特異的かつ／または細胞型特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ハイブリッドまたは組換えプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡを哺乳動物細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡをヒト細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡを発現させ、ガイドＲＮＡを細胞の核に制限することができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＵ６プロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、Ｕ６プロモーターは、ヒトＵ６プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトｔＲＮＡプロモーターまたはヒトｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトバリンｔＲＮＡプロモーターまたはヒトバリンｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含むベクターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、調節エレメントは、ガイドＲＮＡの発現を増強するものである。例示的な調節エレメントとしては、これだけに限定されないが、エンハンサーエレメント、イントロン、エクソン、またはこれらの組合せが挙げられる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ガイドＲＮＡをコードする配列、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列および調節エレメントをコードする配列のうちの１つまたは複数を含む。本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、本開示の融合タンパク質をコードする配列をさらに含む。
ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質
ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ＲＮＡ分子、およびＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質に対応する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性融合タンパク質に対応し、この融合タンパク質は、第１および第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質中の第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、不活性化ＲＮＡ結合性タンパク質、例えば、不活性化Ｃａｓまたは触媒的に失活しているＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して５’側に位置する。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に選択的に結合することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しない、またはいかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊（ｂｒｅａｋ）を誘導することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しない、またはいかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合せず、その破壊も誘導しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合せず、その破壊も誘導しない、または、いかなるＤＮＡ分子にも結合せず、その破壊も誘導しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有さないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質ではない。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質ではない。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲＮＡ（ＲＣａｓ９）を標的とするように操作される。本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質またはその一部を含む。一部の実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはその一部を含む。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ １／２ｂ（ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ ３５９６７／ＤＳＭ ２０７５１／ＣＩＰ １００１００／ＳＬＣＣ ３９５４）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓを含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、ＤＮＡヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質としては、これだけに限定されないが、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄおよびそれらのオルソログが挙げられる。本開示の例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが、本明細書ではそれぞれＣｓｘ２７およびＣｓｘ２８と称される亜型１および２が挙げられる。
ＡＡＶウイルスベクター
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲＮＡ（ＲＣａｓ９）を標的とするように操作される。本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質またはその一部を含む。一部の実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはその一部を含む。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ １／２ｂ（ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ ３５９６７／ＤＳＭ ２０７５１／ＣＩＰ １００１００／ＳＬＣＣ ３９５４）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓを含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、ＤＮＡヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質としては、これだけに限定されないが、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄおよびそれらのオルソログが挙げられる。本開示の例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが、本明細書ではそれぞれＣｓｘ２７およびＣｓｘ２８と称される亜型１および２が挙げられる。
ＡＡＶウイルスベクター
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞に送達されることになるポリヌクレオチドを含有する、組換え産生ウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。アルファウイルスベクター、例えば、セムリキ森林ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクターは、遺伝子治療および免疫療法における使用のためにも開発されている。例えば、Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439およびYing, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照されたい。
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ｒＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質とカプシドに封入されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターとで構成されるウイルス粒子を指す。したがって、ｒＡＡＶウイルスベクターの産生は、ｒＡＡＶベクターの産生を必然的に含み、それ故、ベクターは、ｒＡＡＶベクター内に含有される。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性殻または外被を指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシドに封入し、保護し、輸送し、宿主細胞内に放出するように、機能する。カプシドは、一般に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「カプシドタンパク質」）で構成されている。本明細書で使用される場合、用語「カプシドに封入された（encapsidated）」は、ウイルスカプシド内に封入されたという意味である。ＡＡＶのウイルスカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という３つのウイルスカプシドタンパク質の混合物で構成される。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の混合物は、Sonntag F et al., (June 2010). "A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22): 10220-5、およびRabinowitz JE, Samulski RJ (December 2000). "Building a better vector: the manipulation of AAV virions". Virology. 278 (2): 301-8に記載されているように、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）または１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比でＴ＝１の正二十面体対称に配列されている６０の単量体を含有し、前記参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、ａ）本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれかとｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質とを含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。
ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術分野で公知の任意のＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質である。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質であり得る。ＡＡＶカプシドタンパク質は、本開示の任意の改変ＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。
改変ＡＡＶカプシドタンパク質
改変ＡＡＶカプシドタンパク質
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性殻または外被を指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシドに封入し、保護し、輸送し、宿主細胞内に放出するように、機能する。カプシドは、一般に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「カプシドタンパク質」）で構成されている。本明細書で使用される場合、用語「カプシドに封入された」は、ウイルスカプシド内に封入されたという意味である。改変および／またはキメラＡＡＶベクターまたはＡＡＶカプシドを構築するために使用され得る改変ＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書において提供される。
ＡＡＶカプシドは、一般に、約１：１：１０の比のウイルスタンパク質（ＶＰ）ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の合計６０分子で構成されている。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、ｃａｐオープンリーディングフレームによってコードされ、ｍＲＮＡの選択的スプライシング、および代替翻訳開始コドンの使用によって、生成される。約５２４～５４４アミノ酸（ａａ）のＶＰ３配列は、全てのＶＰ間で共有され、ＶＰ２配列は、ＶＰ３（約５８０～６０１ａａ）よりおおよそ５７ａａ長く、ＶＰ１配列は、ＶＰ２（約７１３～７３８ａａ）よりおおよそ１３７ａａ長い。ＶＰ３共通領域は、正十二面体カプシドをアセンブルする。Woerner et al. Nature Communications Vol. 12, Article number: 1642 (2021)を参照されたい。
一部の態様では、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術分野で公知の任意のＡＡＶ血清型に由来する。ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術分野で公知の任意のＡＡＶカプシドタンパク質に由来し得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ８カプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶ－ＴＴ（ＡＡＶｖ６６）カプシドタンパク質、ＡＡＶ ＰＯ１カプシドタンパク質、ＡＡＶＤＪ、もしくはＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質に由来し得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ－ＴＴカプシドタンパク質である。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質である。一部の態様では、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、２つまたはそれより多くのＡＡＶカプシドタンパク質に由来するキメラＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。
改変ＡＡＶカプシドタンパク質配列が、本明細書に開示される。本明細書で使用される場合、「改変ＡＡＶカプシドタンパク質」または「改変カプシドタンパク質」は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質配列に対して改変されているＡＡＶカプシドタンパク質を指す。改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のいずれか１つを含み得る。ＡＡＶカプシドタンパク質配列の改変は、アミノ酸欠失、変異、挿入または再配列を含む、当技術分野で公知の任意のタンパク質改変であり得る。ＡＡＶカプシドタンパク質の改変は、２つまたはそれより多くのＡＡＶカプシドタンパク質の領域がスプライシングされ、互いに組み合わせられてハイブリッドまたはキメラＡＡＶカプシドタンパク質を形成する、キメラＡＡＶカプシドタンパク質の形成であり得る。一部の態様では、ハイブリッドまたはキメラＡＡＶカプシドタンパク質で構成される改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、独特の血清型を各々が有する２つまたはそれより多くのＡＡＶカプシドタンパク質の領域を含む。一部の態様では、ハイブリッドカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質の可変ドメインループ領域が交換されたものである。一部の態様では、ハイブリッドＡＡＶカプシドタンパク質は、異なる血清型を有する２つまたはそれより多くのカプシド配列からの可変領域ループを含む。
本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術分野で公知の任意のタンパク質またはペプチドからのペプチドの挿入を含み得る。一部の態様では、挿入されるペプチドは、非ＡＡＶカプシドタンパク質に由来し得る。
本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、改変の任意の組合せを含み得る。非限定的な例として、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、キメラであり得るばかりでなく、アミノ酸欠失、変異、挿入または再配列のうちの少なくとも１つを含有もし得る。
本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を使用して、特定の組織型における形質導入の増加（すなわち、「オンターゲット形質導入」）および／または望ましくない組織型における形質導入の低減（すなわち、「オフターゲット形質導入」）を含む改善された特性を有するＡＡＶカプシドを形成することができる。一部の態様では、筋肉組織特異的形質導入が観察される。一部の態様では、眼組織特異的形質導入が観察される。一部の態様では、ニューロンまたは神経組織特異的形質導入が観察される。一部の態様では、肝臓における形質導入は、低減または消失される。一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドは、標的化されていない組織または細胞型における形質導入の低減を有する。一部の態様では、標的化されていない組織は、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、腸、脊髄、または生殖器を含む。
理論により拘束されることを望まないが、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターは、一般的に使用されるＡＡＶカプシド血清型において観察されない特徴的な結合エピトープを産生するカプシドの改変に起因して、ヒト対象における既存の中和抗体に対する反応性の低下を有し得る。
ＡＡＶカプシドタンパク質におけるペプチド挿入
ＡＡＶカプシドタンパク質におけるペプチド挿入
ペプチドまたはアミノ酸をＡＡＶカプシドタンパク質の任意の領域に挿入することができる。挿入は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端で行われ得る。一部の態様では、挿入は、ＶＲ１（ＶＲＩ）、ＶＲ２（ＶＲＩＩ）、ＶＲ３（ＶＲＩＩＩ）、ＶＲ４（ＶＲＩＶ）、ＶＲ５（ＶＲＶ）、ＶＲ６（ＶＲＶＩ）、ＶＲ７（ＶＲＶＩＩ）、ＶＲ８（ＶＲＶＩＩＩ）、またはＶＲ９（ＶＲＸ）を含むカプシドタンパク質の任意の可変領域（ＶＲ）において行われ得る。
一部の態様では、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、改変された可変領域を含む。一部の態様では、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、改変されたＶＲ ＶＩＩＩ領域を含む。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質の改変は、ＶＲ ＶＩＩＩへの挿入である。
ペプチド挿入配列
ペプチド挿入配列
ペプチド配列は、組織特異的様式で形質導入を増強するように選択された。組織特異的形質導入を増強する任意の配列が企図される。一部の態様では、筋肉組織特異的形質導入が観察される。一部の態様では、眼組織特異的形質導入が観察される。一部の態様では、ニューロンまたは神経組織特異的形質導入が観察される。挿入されるペプチドは、組織特異的受容体を標的とすることができ、その結果、前記組織における形質導入の増加をもたらす。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）を標的とするペプチド挿入を含む。ＩＮＳＲを標的とするように設計されたＡＡＶベクターは、筋肉内形質導入を増強することが示されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Jackson et al. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 2020, 19, 11, 496-506を参照されたい）。一部の態様では、挿入されるＩＮＳＲ標的化ペプチドは、Ｓ５１９と呼ばれるインスリン模倣ペプチドである。一部の態様では、Ｓ５１９ペプチドは、アミノ酸配列ＳＬＥＥＥＷＡＱＶＥＣＥＶＹＧＲＧＣＰＳＧＳＬＤＥＳＦＹＤＷＦＥＲＱＬ（配列番号３０１）と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、筋肉特異的キナーゼ（ＭＵＳＫ）を標的とするペプチド挿入を含む。肝臓におけるＭＵＳＫ発現は、極めて低いか非存在であるかのいずれかであることが示されている。アセチルコリンエステラーゼ膠原質形成テイルペプチド（ＣｏｌＱ）がＭＵＳＫに結合することおよびそれを標的とすることは公知である。一部の態様では、挿入されるＭＵＳＫ標的化ペプチドは、ＣｏｌＱのＣ末端部分（ＣｏｌＱ ＣＴＤ）である。一部の態様では、ＣｏｌＱ ＣＴＤペプチドは、アミノ酸配列
と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、インテグリンを標的とするペプチド挿入を含む。一部の態様では、インテグリン標的化ペプチドは、ＲＧＤモチーフを含む。ＲＧＤ配列は、当技術分野で公知であり、例えば、インテグリンクラスの受容体による標的化のためにＡＡＶウイルスベクターに挿入され得るモチーフＲＧＤＸＸＸＸを含む。本明細書に記載される改変ＡＡＶカプシドにおいて使用され得るＲＧＤ配列の例については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるMichelfelder et al., PLoS One. 2009; 4(4): e5122を参照されたい。ＡＡＶ９のＶＲ８へのＲＧＤモチーフペプチド挿入は、マウス筋肉形質導入を増加させることが示されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれるWeinmann et al. Nature Communications, 11:5432を参照されたい）。一部の態様では、ＲＧＤペプチドは、ＲＧＤＹまたはＲＧＤＦモチーフを産生するために部分配列ＹまたはＦアミノ酸を含む。ＲＧＤＹまたはＲＧＤＦモチーフは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において筋肉形質導入の増強を生じさせることが実証されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Tabebordbar et al. Cell, 184, 19, 2021, 4919-4938を参照されたい）。一部の態様では、ＲＧＤ配列は、ＲＧＤＬＧＬＳ（配列番号３０３）を含む。一部の態様では、ＲＧＤ配列は、ＲＧＤＬＳＴＰ（配列番号３０４）、ＳＮＳＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０５）、ＥＮＲＲＧＤＦＮＮＴ（配列番号３０６）、ＳＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０７）、ＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０８）、ＲＧＤＬＳＴ（配列番号３０９）またはＲＧＤＹＶＧＬ（配列番号３１０）を含む。
一部の態様では、本開示のＲＧＤ配列は、足場に挿入され得る（図８）。一部の態様では、本開示のＲＧＤ配列は、リンカー足場を形成するＮ末端およびＣ末端の１つまたは複数にリンカーを含む。一部の態様では、リンカー足場は、フレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号３１１）を含む。一部の態様では、リンカー足場は、堅い足場、例えば、ＶＨＨ、ＧＰ２、環状ペプチド、またはノッチン足場を含む。
一部の態様では、ＲＧＤ配列は、ラクダ科動物重鎖のみ抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）ＲＧＤペプチド、例えば、アミノ酸配列
（ＲＧＤモチーフに下線が引かれている）と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなるＶＨＨ ＲＧＤペプチドを含む。
（ＲＧＤモチーフに下線が引かれている）と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなるＶＨＨ ＲＧＤペプチドを含む。
一部の態様では、ＲＧＤペプチド挿入は、糖タンパク質２（ＧＰ２）ペプチド足場挿入を含む。一部の態様では、ＧＰ２足場ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＫＦＷＡＴＶＧＲＧＤＬＳＴＰＦＥＶＰＶＹＡＥＴＬＤＥＡＬＥＬＡＥＮＲＲＧＤＦＮＮＴＶＴＲＶＲＰ（配列番号３１７）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＦＷＡＴＶＧＲＧＤＬＳＴＰＦＥＶＰＶＹＡＥＴＬＤＥＡＬＥＬＡＥＮＲＲＧＤＦＮＮＴＶＴＲＶＲＰＧＧＧＧＳ（配列番号３１８）を含む。
一部の態様では、ＲＧＤペプチド挿入は、ノッチン足場ペプチド挿入を含み得る。一部の態様では、ノッチン足場ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＮＳＲＧＤＹＮＳＬＳＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣ（配列番号３１９）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＣＳＮＳＲＧＤＹＮＳＬＳＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号３２０）を含む。
一部の態様では、ＲＧＤペプチド挿入は、環状ペプチド足場ＲＧＤペプチド挿入を含み得る。一部の態様では、環状ペプチド足場ＲＧＤペプチド挿入は、アミノ酸配列ＡＣＲＧＤＹＮＳＬＣＲＧＤＬＳＴＣ（配列番号３２１）またはＧＧＧＧＡＣＲＧＤＹＮＳＬＣＲＧＤＬＳＴＣＧＧＧＧＳ（配列番号３２２）を含む。
足場を使用して、当技術分野で公知の任意のペプチドを挿入することができる。したがって、ＶＨＨ、ＧＰ２、環状ペプチド、ノッチン、またはフレキシブルリンカーを使用して、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質への挿入のために任意のペプチドを足場にすることまたは隣接させることができる。
挿入されるペプチドは、任意の長さのフレキシブルリンカーペプチドとＮ末端またはＣ末端側で隣接し得る。一部の態様では、フレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号３１１）が、使用される。一部の態様では、フレキシブルＧＧＧＳリンカーは、より長いリンカー配列を形成するために、複数回、反復され得る。一部の態様では、リンカーは、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回、反復される。一部の態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号３１１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１４）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１５）を含む。
点変異
点変異
さらに、またはあるいは、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、所望の組織型における形質導入の増加を生じさせるアミノ酸変異を含み得る。一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、特定の（specic）組織型における形質導入の低減を生じさせるアミノ酸変異を含み得る。一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、肝臓組織形質導入の低減を生じさせるアミノ酸変異を含み得る。
一部の実施形態では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのアミノ酸変化を有する、本明細書において提供されるアミノ酸配列（例えば、表１から選択される配列）を含む。アミノ酸変化は、あるアミノ酸での、天然アミノ酸および非天然もしくは改変アミノ酸を含む任意の他のアミノ酸の、置換であり得る。一部の態様では、変異は、保存的アミノ酸変異である。保存的アミノ酸置換は、所与のアミノ酸を、同様の生化学的性質（例えば、電荷、疎水性またはサイズ）を有する異なるアミノ酸に変える、タンパク質中のアミノ酸の置き換えである。保存的アミノ酸置換の例としては、ある疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンでの、別の疎水性残基の置換；またはある荷電もしくは極性残基での別の荷電もしくは極性残基の置換、例えば、アルギニンでのリシンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、グルタミンでのアスパラギンの置換などが挙げられる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アラニンからセリンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；リシンからアルギニン、グルタミンまたはグルタミン酸へ；フェニルアラニンからチロシンへ、セリンからトレオニンへ；トレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ、から選択される。
一部の態様では、ＡＡＶｒｈ８の５０３位における変異は、肝臓形質導入の低減を生じさせる。一部の態様では、ＡＡＶｒｈ８の５０３位におけるアラニンのトリプトファンでの置換は、肝臓形質導入の低減を生じさせる。一部の態様では、ＡＡＶｒｈ７４の５０５位における変異は、肝臓形質導入の低減を生じさせる。一部の態様では、ＡＡＶｒｈ７４の５５位におけるアラニンのトリプトファンでの置換は、肝臓形質導入の低減を生じさせる。一部の態様では、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の４９８位における変異は、肝臓形質導入の低減を生じさせる。一部の態様では、ＡＡＶ９点変異は、Ｎ４９８変異を含む。一部の態様では、ＡＡＶ９点変異は、Ｎ４９８Ｉ変異を含む。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０２位における変異は、肝臓形質導入の低減を生じさせる。
ＮＨＰにおけるロバストな肝臓脱標的化がＡＡＶ９における次の残基（Ｆ５０１Ｉ、Ｇ５０５Ｒ、Ｙ７０６Ｃ）を変異させることによって示唆されている。一部の態様では、ＡＡＶ９の肝臓脱標的化変異は、Ｆ５０１Ｉ、Ｇ５０５Ｒ、Ｙ７０６Ｃのうちの少なくとも１つを含む。本開示のある特定のベクターにおける等価の変異は、ＬＢＶ９２を生成するためのＬＢＶ３０におけるＦ５０３Ｉ、Ｇ５０７Ｒ、およびＹ７０８Ｃを含む。一部の態様では、ＡＡＶ Ｒｈ７４肝臓脱標的化変異は、ＡＡＶ Ｒｈ７４の残基Ｆ５０３、Ｇ５０７、Ｙ７０７、および／またはＹ７０８の任意の組合せの変異を含む。一部の態様に関して、これらの変異は、ＡＡＶ Ｒｈ７４のＦ５０３Ｉ、Ｇ５０７Ｒ、Ｙ７０７Ｃ、および／またはＹ７０８Ｃを含む。
一部の態様では、本開示の点変異は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質配列に関連して番号が付けられる。野生型ＡＡＶカプシドタンパク質配列は、表ＸＸＸに開示される。一部の態様では、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質配列の長さを変更し得る、挿入および／または欠失または可変領域交換を含む。表Ｘ１において参照される点変異は、野生型または未改変ＡＡＶカプシドタンパク質配列に関連していることを理解されたい。
改変ＡＡＶカプシド配列
改変ＡＡＶカプシド配列
本開示は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質アミノ酸配列を提供する。本開示は、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列をさらに提供する。
本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、表１に示される。表１は、本明細書に開示される改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質を含む、アセンブルされたＡＡＶカプシドのＩＤを収載する。表１は、カプシドタンパク質の血清型ならびにカプシド配列に加えた任意の改変を記載する。
表1:本開示のAAVカプシドタンパク質配列
表1:本開示のAAVカプシドタンパク質配列
一部の態様では、本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドＶＰ１タンパク質は、表１で示されるＶＰ１配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
一部の実施形態では、本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドＶＰ２／３タンパク質は、表１で示されるＶＰ２／ＶＰ３配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドＶＰ１タンパク質は、表１で示されるＶＰ１配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドＶＰ２／３タンパク質は、表１で示されるＶＰ２／ＶＰ３配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の態様では、本明細書において提供される筋肉標的化改変ＡＡＶカプシドＶＰ１タンパク質は、表１で示されるＶＰ１配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
一部の態様では、本明細書において提供される筋肉標的化改変ＡＡＶカプシドＶＰ２／３タンパク質は、表１で示されるＶＰ２／ＶＰ３配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
一部の実施形態では、本明細書において提供される筋肉標的化改変ＡＡＶカプシドＶＰ１タンパク質は、表１で示されるＶＰ１配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、本明細書において提供される筋肉標的化改変ＡＡＶカプシドＶＰ２／３タンパク質は、表１で示されるＶＰ２／ＶＰ３配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
別の態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入に有用である改変ＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書において提供される。
一部の態様では、改変ＶＰ１カプシドタンパク質配列は、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号５３は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入を含むＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号５３で示される改変ＶＰ１カプシドタンパク質は、配列番号１５１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列は、配列番号１０２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号１０２は、ＡＡＶ９ ＶＰ２／３カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号１０２で示されるＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号１９９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ１カプシドタンパク質配列は、配列番号７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号７５は、ｍＣｏｌＱペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＲｈ７４ ＶＰ１カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号７５で示される改変ＶＰ１カプシドタンパク質は、配列番号１７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列は、配列番号１２４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号１２４は、ＲＧＤペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含む改変Ｒｈ７４ ＶＰ２／３カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号１２４で示される改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号２２１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ１カプシドタンパク質配列は、配列番号２４５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号２４５は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＲｈ７４ ＶＰ１カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号２４５で示される改変ＶＰ１カプシドタンパク質は、配列番号２７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列は、配列番号２５８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号２５８は、ＲＧＤペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含む改変Ｒｈ７４ ＶＰ２／３カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号２５８で示される改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号２８３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ１カプシドタンパク質配列は、配列番号２４９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号２４９は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入と変異Ｎ４９８Ｉ（野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号２４９で示される改変ＶＰ１カプシドタンパク質は、配列番号２７４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列は、配列番号２６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号２６２は、ＲＧＤペプチド挿入と変異Ｎ４９８Ｌ（野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含む改変ＡＡＶ９ ＶＰ２／３カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号２６２で示される改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号２８７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ１カプシドタンパク質配列は、配列番号２５５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号２５５は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入を含むＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号２５５で示される改変ＶＰ１カプシドタンパク質は、配列番号２８０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
一部の態様では、改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列は、配列番号２６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一である。一部の態様では、配列番号２６７は、ＲＧＤペプチド挿入を含む改変ＡＡＶ９ ＶＰ２／３カプシドタンパク質である。一部の態様では、配列番号２６７で示される改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質は、配列番号２９２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列によってコードされる。
改変ＡＡＶカプシド
改変ＡＡＶカプシド
本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を使用してＡＡＶカプシドを形成することによって改変ＡＡＶカプシドを形成することができる。本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドタンパク質を使用して、改変、キメラおよび／またはハイブリッドＡＡＶカプシドを構築することができる。本明細書において提供されるＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３配列、またはＶＰ１およびＶＰ２／ＶＰ３タンパク質の（ov）任意の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドは、表１およびそこで参照される配列番号で示されるＶＰ１配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の野生型または改変ＶＰ１カプシド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドは、表１およびそこで参照される配列番号で示されるＶＰ２／ＶＰ３配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一の野生型または改変ＶＰ２／ＶＰ３カプシド配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変ＡＡＶカプシドは、表１に収載されている配列から選択されるＶＰ１カプシドタンパク質、および表１に収載されている配列から選択されるＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質を含む。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドは、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ１カプシドタンパク質配列、および配列番号１０２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列を含む。一部の態様では、前記配列を有するＡＡＶカプシドは、ＬＢＶ５５と呼ばれる。ＬＢＶ５５は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入を含むＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質と、ＡＡＶ９ ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含む。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドは、配列番号７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ１カプシドタンパク質配列、および配列番号１２４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列を含む。一部の態様では、前記配列を有するＡＡＶカプシドは、ＬＢＶ９３と呼ばれる。ＬＢＶ９３は、ｍＣｏｌＱペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＲｈ７４ ＶＰ１カプシドタンパク質、およびＲＧＤペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＲｈ７４ ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質を含む。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドは、配列番号２４５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ１カプシドタンパク質配列、および配列番号２５８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列を含む。一部の態様では、前記配列を有するＡＡＶカプシドは、ＬＢＶ１１０と呼ばれる。ＬＢＶ１１０は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＲｈ７４ ＶＰ１カプシドタンパク質、およびＲＧＤペプチド挿入と変異Ｆ５０３Ｉ、Ｇ５０７ＲおよびＹ７０７Ｃ（野生型Ｒｈ７４カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＲｈ７４ ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質を含む。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドは、配列番号２４９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ１カプシドタンパク質配列、および配列番号２６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列を含む。一部の態様では、前記配列を有するＡＡＶカプシドは、ＬＢＶ１１４と呼ばれる。ＬＢＶ１１４は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入と変異Ｎ４９８Ｉ（野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質、およびＲＧＤペプチド挿入と変異Ｎ４９８Ｌ（野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質に関連するアミノ酸番号付け）とを含むＡＡＶ９ ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質を含む。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドは、配列番号２５５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ１カプシドタンパク質配列、および配列番号２６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％（または間の任意のパーセンテージ）同一のＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質配列を含む。一部の態様では、前記配列を有するＡＡＶカプシドは、ＬＢＶ１２１と呼ばれる。ＬＢＶ１２１は、ＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入を含むＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質、およびＲＧＤペプチド挿入を含むＡＡＶ９ ＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質を含む。
本開示の改変ＡＡＶカプシドは、親または野生型ＡＡＶカプシドと比較して形質導入効率の改善を示す。一部の態様では、形質導入の改善は、筋肉組織におけるものである。一部の態様では、筋肉組織は、骨格筋、平滑筋または心筋である。一部の実施形態では、本明細書において提供される改変された筋肉標的化されたＡＡＶカプシドの筋肉細胞における形質導入効率は、免疫蛍光検査によって決定して、親ＡＡＶカプシドと比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加する。一部の実施形態では、本明細書において提供される改変された筋肉標的化されたＡＡＶカプシドの筋肉細胞における形質導入効率は、免疫蛍光検査によって決定して、親ＡＡＶカプシドと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍増加する。
ウイルスベクターおよび医薬組成物
本開示のＡＡＶカプシドを任意の好適なＡＡＶウイルスベクターにおいて使用することができる。ＡＡＶカプシドは、おおよそ４．８キロベース（ｋｂ）の小さい一本鎖ＤＮＡゲノムを囲んでいる。ＡＡＶのゲノムは、ゲノム複製およびパッケージングに必要とされる末端逆位反復（ＩＴＲ）に挟まれている３つの遺伝子Ｒｅｐ（複製）、Ｃａｐ（カプシド）およびａａｐ（アセンブリ）を含有する。Naso et al., BioDrugs. 2017; 31(4): 317-334を参照されたい。組換えＡＡＶベクターは、ウイルス遺伝子を欠いており、その代わりに、２つのウイルスＩＴＲに挟まれている導入遺伝子を含む。
それ故、別の態様では、本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶウイルスベクターが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。
本明細書において提供される改変ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶウイルスベクターと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も、本明細書において提供される。医薬組成物を、例えば、静脈内、髄腔内、頭蓋内または眼内投与を含む、任意の好適な投与経路用に製剤化することができる。本明細書に開示される使用のための医薬組成物は、必要に応じて免疫直交性でもある、タンパク質（複数可）または必要に応じてＡＡＶ内に含められたタンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドを、１つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物を、例えば、経口、経腸、局部、経皮、鼻腔内および／または吸入投与経路などの、投与経路用に、ならびに例えば、静脈内、筋肉内、軟膜下、くも膜下、実質内、くも膜下、線条体内、皮下、皮内、腹腔内、腫瘍内、静脈内、眼内および／または非経口投与などの、注射または注入による投与経路用に、製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、脳内または線条体内投与用に製剤化される。
使用方法
使用方法
本開示は、対象における目的の組織に導入遺伝子またはＮＯＩを送達する方法であって、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターを投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターとＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子へのガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のＲＮＡ分子の発現またはそのＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターとＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ分子へのガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶウイルスベクターは、本開示のガイドＲＮＡ、および本開示のＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質を含む。
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターとＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ分子へのガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のＲＮＡ分子の発現またはそのＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターとＲＮＡ分子を、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターとＲＮＡ分子を、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のＲＮＡ分子の発現またはそのＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターとＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶウイルスベクターは、本開示のガイドＲＮＡ、および本開示のＲＮＡ結合融合タンパク質を含む。
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターとＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶウイルスベクターは、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ、および本開示のＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。
本開示は、疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、疾患または障害は、筋および／または神経筋疾患または障害である。一部の態様では、筋および／または神経筋障害は、筋ジストロフィーまたは筋強直性ジストロフィーである。
本開示は、疾患の処置を、そのような処置を必要とする患者において行う方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物の治療有効量を患者に投与するステップを含み、ＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物が、本開示のガイドＲＮＡと本開示のＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質融合タンパク質をコードする核酸配列とを含むベクターを含み、ＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物が、毒性リピートＲＮＡの発現のレベルを（非標的化（ＮＴ）対照で処置された毒性リピートＲＮＡの発現のレベルと比較して、または無処置と比較して）改変する、低下させる、破壊する、下げるまたは取り除く、方法を提供する。別の実施形態では、低減のレベルは、１倍である、またはそれより大きい。別の実施形態では、低減のレベルは、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍である。別の実施形態では、低減のレベルは、１０倍である、またはそれより大きい。別の実施形態では、低減のレベルは、１０倍～２０倍の間である。別の実施形態では、低減のレベルは、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍である。別の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子治療用組成物は、患者に投与されたとき、毒性リピートＲＮＡの２０％～１００％分解をもたらす。一実施形態では、毒性リピートＲＮＡの％消失は、２０～９９％、２５％～９９％、５０％～９９％、８０％～９９％、９０％～９９％、９５％～９９％のいずれかである。一実施形態では、％消失は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。別の実施形態では、％消失は、毒性リピートＲＮＡの完全消失または１００％消失である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、処置されることになる疾患の診断を受けている。一部の実施形態では、本開示の対象は、処置されることになる障害または疾患についての少なくとも１つの徴候または症状を示している。一部の実施形態では、本開示の対象は、疾患についての少なくとも１つの徴候または症状を示している。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、女性である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、男性である。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹを有する。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹおよび第３の染色体、ＸまたはＹのいずれかを有する。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、新生児、乳児、小児、成人、年配成人、または高齢成人である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１日齢、２日齢、３日齢、４日齢、５日齢、６日齢、７日齢、８日齢、９日齢、１０日齢、１１日齢、１２日齢、１３日齢、１４日齢、１５日齢、１６日齢、１７日齢、１８日齢、１９日齢、２０日齢、２１日齢、２２日齢、２３日齢、２４日齢、２５日齢、２６日齢、２７日齢、２８日齢、２９日齢、３０日齢または３１日齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１カ月齢、２カ月齢、３カ月齢、４カ月齢、５カ月齢、６カ月齢、７カ月齢、８カ月齢、９カ月齢、１０カ月齢、１１カ月齢または１２カ月齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、１００歳またはその間の任意の年齢または部分年齢である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、本開示の対象は、非ヒト哺乳動物である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、ヒトである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、単回用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、少なくとも１用量の本開示の組成物を含む、治療有効量を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、１用量または複数用量の本開示の組成物を含む、治療有効量を含む。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状を排除するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害を排除するものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を防止するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を遅延させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、対象の予後を改善するものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に脳内投与を介して投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に線条体内経路によって投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に定位固定注射または注入によって投与される。一部の実施形態では、組成物は、脳に投与される。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に局所的に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物を医薬組成物として製剤化する。簡単に述べると、本明細書に開示される使用のための医薬組成物は、必要に応じて免疫直交性でもある、タンパク質（複数可）または必要に応じてＡＡＶ内に含められたタンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドを、１つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物を、例えば、経口、経腸、局部、経皮、鼻腔内および／または吸入投与経路などの投与経路用に；ならびに例えば、静脈内に、髄腔内に、脳内に、室内に、鼻腔内に、気管内に、耳内に、眼内にもしくは目周囲に、経口的に、直腸に、経粘膜的に、吸入により、経皮的に、非経口的に、皮下に、皮内に、筋肉内に、大槽内に、神経内に、胸膜内に、局部的に、リンパ内に、大槽内になどの、注射または注入による投与経路用に、製剤化することができ；そのような導入はまた、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内のもの、全身性に、またはこれらの任意の組合せであり得る。
一部の態様では、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの送達後に、筋肉組織における形質導入の増強が生じる。一部の態様では、未改変、野生型または親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと比べて改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターの網膜下送達後に、眼組織における形質導入の増強が生じる。一部の態様では、未改変、野生型または親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと比べて改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターの送達後に、神経組織における形質導入の増強が生じる。一部の態様では、未改変、野生型または親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと比べて改変ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶベクターの全身性送達後に、肝臓もしくは肝細胞形質導入の低減が生じる、または肝臓もしくは肝細胞形質導入が生じない。一部の態様では、未改変、野生型または親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと比べて改変ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶベクターの全身性送達後に、中和抗体結合の低減が生じる、または中和抗体結合が生じない。一部の態様では、中和抗体力価は、未改変、野生型または親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと比べて改変ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶベクターの送達後に最小になる。一部の態様では、中和抗体力価は、未改変、野生型または親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと比較して、非改変ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶベクターの送達と比較して低下する。
細胞
細胞
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、原核細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ウシ類、ネズミ類、ネコ類、ウマ類、ブタ類、イヌ類、サル類、またはヒトの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞などの非ヒト哺乳動物細胞である。
一部の実施形態では、本開示の細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、生殖細胞系列細胞である。一部の実施形態では、本開示の生殖細胞系列細胞は、ヒト細胞ではない。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、胚性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の胚性幹細胞は、ヒト細胞ではない。一部の実施形態では、本開示の細胞は、複能性幹細胞または多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、成体幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、筋芽細胞または筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞または平滑筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、横紋細胞である。一実施形態では、本明細書に開示される組成物で処置される患者の細胞（単数または複数）としては、限定することなく、骨格筋（発達中のおよび成熟した筋肉線維およびサテライト細胞）、神経筋接合部、心筋細胞、平滑筋細胞、末梢神経系（ニューロン）、末梢運動ニューロン、および／または感覚ニューロンが挙げられる。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、上皮細胞である。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、線維芽細胞、扁平上皮細胞、立方上皮細胞、円柱上皮細胞、重層上皮細胞、多列円柱上皮細胞または移行上皮細胞を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、松果体、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、アポクリン腺、ホロクリン腺、部分分泌腺、漿液腺、粘液腺および脂腺を含めた腺を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、肺、脾臓、胃、膵臓、膀胱、腸、腎臓、胆嚢、肝臓、喉頭または咽頭を含めた器官の外表面と接触している。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、血管または静脈の外表面と接触している。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、初代細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、培養細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、自家細胞または同種異系細胞である。
このセクションにおいて提供される実施例は、単に例証を目的としたものであり、本発明を限定することを目的としたものではない。
（実施例１）
標的化ペプチドのＶＰ１特異的提示
（実施例１）
標的化ペプチドのＶＰ１特異的提示
標的化ペプチドの使用は、ある特定の組織または細胞型におけるトランスフェクション効率を上昇させることができる。しかし、ペプチドのＡＡＶカプシドによる提示のされ方は、それが及ぼす効果に影響を与える。
図５は、ペプチド挿入を含むＡＡＶ Ｒｈ７４粒子によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光画像を示す。ｅＡＡＶ Ｒｈ７４およびＬＢＶ２８は両方とも、インスリン受容体標的化ペプチド、Ｓ５１９を含有する。ｅＡＡＶ Ｒｈ７４における、野生型タンパク質への変異体の１～１０でのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の挿入部位ＶＲ８。ＬＢＶ２８は、ＶＲ８ ＶＰ１に特異的に挿入されるがＶＰ２にもＶＰ３にもされないペプチドを有する。これらのデータは、ＬＢＶ２８のＶＰ１特異的挿入が標的化ペプチドのより大きな有効性をもたらすことを示す。理論により拘束されることを望まないが、ＶＰ１特異的挿入は、ペプチドをより自由に提示することを可能にし、その結果、より大きな有効性をもたらすが、その一方で、ペプチドをＶＰ１～３タンパク質全てに挿入する場合にはカプシドアセンブリに伴う問題によってリンカーの使用が制限されると仮定する。
（実施例２）
新規の筋肉標的化されたＡＡＶカプシドの生成および試験
新規の筋肉標的化されたＡＡＶカプシドの生成および試験
ＡＡＶ９、ＡＡＶＲｈ７４およびＡＡＶｐｏ１から新規の改善された筋肉標的化カプシドタンパク質を合理的に設計した。合理的に標的化されたカプシド変異および挿入をクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞およびイオジキサノール勾配超遠心機による精製を使用してＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーターウイルスを産生した。クマシー染色を使用して、調製物にタンパク質夾雑物がないことを検証した。エンドトキシンレベルは、１．５ＥＵ／ｍｌ未満でなければならない。力価をＩＴＲ ｑＰＣＲによって測定し、操作されたカプシドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に進むために親カプシドの２５％で産生しなければならなかった。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を使用して、操作されたカプシドの潜在的な筋肉標的化を評価した。細胞は、１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、蛍光顕微鏡を使用してＧＦＰシグナル（ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとＧＦＰ発現レベルの両方）によって形質導入を視覚的に評定した。手短に述べると、Ｃ２Ｃ１２細胞を１日目に４８ウェルプレートに１ウェル当たり５Ｅ４個の細胞の密度で播種した。３日目に細胞に、１ウェル当たり１Ｅ５個の細胞に基づいて１Ｅ５および１Ｅ６の感染多重度（（ＭＯＩ）；送達されたウイルスゲノムの数を細胞の総数で割ったもの）のＡＡＶによって形質導入した。ＧＦＰシグナルを４～１０日目にモニターした。
ＲＧＤペプチド挿入を含む改変ＡＡＶカプシドタンパク質を有するＡＡＶカプシドを評価した。ＬＢＶ５４は、ＡＡＶ９ ＶＲ ＶＩＩＩ（ＶＲ８）におけるフレキシブルリンカーＲＧＤペプチド挿入を含む。ＬＢＶ５５は、ＡＡＶ９ ＶＲ ＶＩＩＩ（ＶＲ８）におけるＶＨＨ ＲＧＤペプチド挿入を含む。ＬＢＶ５６は、ＡＡＶ９ ＶＲ ＶＩＩＩ（ＶＲ８）におけるＧＰ２ ＲＧＤペプチド挿入を含む。ＬＢＶ５７は、ＡＡＶ９ ＶＲ ＶＩＩＩ（ＶＲ８）における環状ペプチドＲＧＤペプチド挿入を含む。ＬＢＶ５８は、ＡＡＶ９ ＶＲ ＶＩＩＩ（ＶＲ８）におけるノッチンＲＧＤペプチド挿入を含む（図８）。ＣｏｌＱペプチド挿入を含む改変ＡＡＶカプシドタンパク質を有するＡＡＶカプシドも評価した（ＬＢＶ３１）。
ベクターゲノム収量およびペプチドを２に要約する。
表2:代替RGD提示足場
表2:代替RGD提示足場
結果を図６Ａから６Ｄまでに示す。形質導入から５日後にＶＨＨ ＲＧＤ挿入カプシドＬＢＶ５５について野生型ＡＡＶ９と比較してＣ２Ｃ１２形質導入の有意な強化が観察された（図６Ａおよび図６Ｂ）。さらに、形質導入から４日後に改変ＰＯ１カプシドＬＢＶ３１について野生型ＡＡＶＰＯ１と比べて有意な形質導入増強が観察された（図６Ｃ）。形質導入から６日後にＲｈ７７４由来ＬＢＶ３０についてＲｈ７４と比べて形質導入の増強が観察された。
（実施例３）
ＡＡＶ９、ＬＢＶ３０およびＬＢＶ３１のｅｘ ｖｉｖｏイメージング
（実施例３）
ＡＡＶ９、ＬＢＶ３０およびＬＢＶ３１のｅｘ ｖｉｖｏイメージング
改変ＡＡＶカプシドのｉｎ ｖｉｖｏ標的化を評価するために、マウスにレポーターウイルスを１Ｅ１２ｖｇ／マウスの用量で静脈内注射した。注射から４週間後に、骨格筋、平滑筋、心筋、ＣＮＳ、肝臓および他の内臓のｅｘ ｖｉｖｏイメージングを行った。結果を図７Ａ～７Ｃに示す。図７Ａは、改変カプシドをＬＢＶ３０およびＬＢＶ３１バリアントと比較する代表画像を示す。ＬＢＶ３０は、ＣｏｌＱペプチド挿入を有する改変ＶＰ１カプシドタンパク質とＲＧＤペプチド挿入を有するＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含むＡＡＶ Ｒｈ７４カプシドである。ＬＢＶ３１は、ＣｏｌＱペプチド挿入を有する改変ＶＰ１カプシドタンパク質とＲＧＤペプチド挿入を有するＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質とを含むＡＡＶ ＰＯ１カプシドである。図７Ｂにおけるデータは、ＬＢＶ３１はオフターゲット組織への形質導入が限定的であることを示し、その一方で、図７Ｃにおけるデータは、ＬＢＶ３１は標的筋肉に形質導入することを示す。これらのデータは、ＬＢＶ３１が、骨格筋、平滑筋および心筋形質導入が妥当であり、複数の非筋肉組織への形質導入がほとんどまたは全くない（最も重要なこととして、肝臓への形質導入がない）という、好ましいプロファイルを示すことを示す。ＬＢＶ３０は、ＡＡＶ９と比べて一部の筋肉への形質導入の増加を示す。しかし、有意な量の肝臓形質導入もある。
（実施例４）
改変ＡＡＶカプシドタンパク質における肝臓脱標的化変異
（実施例４）
改変ＡＡＶカプシドタンパク質における肝臓脱標的化変異
ＬＢＶ５５は、筋肉形質導入の増強を提示した。肝臓脱標的化を増強するために、変異Ｆ５０１Ｉ、Ｇ５０５ＲおよびＹ７０６ＣをＬＢＶ５５のＶＰ１およびＶＰ２／ＶＰ３に導入してＬＢＶ９１を生成した。さらに、変異Ｆ５０１Ｉ、Ｇ５０５ＲおよびＹ７０６ＣをＶＰ１およびＶＰ２／ＶＰ３に組み込むことによってＬＢＶ３０からＬＢＶ９２を生成した。ルシフェラーゼレポーティングベクターｐＡＡＶ－ｔＣＡＧホタルルシフェラーゼ－Ｐ２Ａ－Ｃｌｏｖｅｒ３ ＷＰＲＥを含むウイルスベクターを調製し（表３）、マウスに投与した（表４）。ルシフェラーゼレポーターウイルスのマウスＩＶ注射、１Ｅ１２ｖｇ／マウス。注射から２～４週間後に、骨格筋、平滑筋、心筋、ＣＮＳ、肝臓および他の内臓のｅｘ ｖｉｖｏイメージング。
表3:研究に使用したAAVベクター
表4:時間、用量およびnを含む、研究基準
表3:研究に使用したAAVベクター
ＬＢＶ９１は、ほぼ完全な肝臓脱標的化を示したが、筋肉形質導入もＬＢＶ５５と比べて低減された。ＬＢＶ９２は、筋肉形質導入の維持または増強および肝臓脱標的化（Ｒｈ７４またはＡＡＶ９の１％未満）を示した。図９。したがって、ＬＢＶ９２は、１）筋肉形質導入の増加（四頭筋（ｑｕａｄ）、前脛骨筋（ＴＡ）、および横隔膜）；２）肝臓形質導入の２桁を超える低減；および３）他の臓器における形質導入の増加なしを達成する。
Claims (41)
- 改変された可変領域（ＶＲ）ＶＩＩＩを含む、改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質である、請求項１に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記改変されたＶＲ ＶＩＩＩが、ペプチド挿入を含む、請求項１に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記ペプチド挿入が、ＲＧＤモチーフペプチド挿入を含む、請求項３に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記ＲＧＤモチーフ挿入が、ＲＧＤＬＧＬＳ（配列番号３０３）、ＲＧＤＬＳＴＰ（配列番号３０４）、ＳＮＳＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０５）、ＥＮＲＲＧＤＦＮＮＴ（配列番号３０６）、ＳＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０７）、ＲＧＤＹＮＳＬ（配列番号３０８）、ＲＧＤＬＳＴ（配列番号３０９）またはＲＧＤＹＶＧＬ（配列番号３１０）を含む、請求項４に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記ＲＧＤモチーフ挿入が、ラクダ科動物重鎖のみの抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）ＲＧＤペプチドを含む、請求項４に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記ＶＨＨ ＲＧＤペプチドが、アミノ酸配列
- 前記ペプチド挿入が、アセチルコリンエステラーゼ膠原質形成テイル（ＣｏｌＱ）ペプチドを含む、請求項３に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記ＣｏｌＱペプチドが、アミノ酸配列
- 前記ペプチド挿入が、前記挿入されたペプチドのＮ末端またはＣ末端に１つまたは複数のリンカー配列を含む、請求項３に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記リンカー配列が、ＧＧＧＧＳ（配列番号３１１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１５）を含む、請求項８に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ９またはＡＡＶＲｈ７４である、請求項１に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- １つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む、請求項１に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記１つまたは複数のアミノ酸変異が、肝臓形質導入を低減させる、請求項１３に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 前記変異が、
ｉ）Ｒｈ７４のＦ５０３Ｉ、Ｇ５０７Ｉ、Ｙ７０７Ｃ、および／もしくはＹ７０８Ｃのうちの少なくとも１つ、または
ｉｉ）ＡＡＶ９のＮ４９８Ｉ
を含む、請求項１３に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。 - 配列番号５３、７５、１０２、１２４、２４５、２４９、２５５、２５８、２６２、または２６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 配列番号５３、７５、１０２、１２４、２４５、２４９、２５５、２５８、２６２、または２６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 配列番号１５１、１７３、１９９、２２１、２７０、２７４、２８０、２８３、２８７、または２９２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の核酸配列によってコードされる、請求項１７に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
- 請求項１から１８のいずれか一項に記載の１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシド。
- 他の組織または細胞型と比べて標的化された組織または細胞型における形質導入の増強を有する、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。
- 前記標的化された組織型が、筋肉組織または筋肉細胞である、請求項２０に記載のＡＡＶカプシド。
- 筋肉組織における形質導入の増強を有する、請求項２０に記載のＡＡＶカプシド。
- 標的化されていない組織または細胞型における形質導入の低減を有する、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。
- 前記標的化されていない組織が、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、腸、脊髄、または生殖器を含む、請求項２３に記載のＡＡＶカプシド。
- 筋肉組織における前記形質導入が、親および／または未改変ＡＡＶカプシドと比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約１００％、約２００％、または約３００％増強される、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。
- ｉ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、
ｉｉ）配列番号１０２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質と
を含む、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。 - ｉ）配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、
ｉｉ）配列番号１２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質と
を含む、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。 - ｉ）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、
ｉｉ）配列番号２５８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質と
を含む、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。 - ｉ）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、
ｉｉ）配列番号２６２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質と
を含む、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。 - ｉ）配列番号２５５で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ１カプシドタンパク質と、
ｉｉ）配列番号２６７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質と
を含む、請求項１９に記載のＡＡＶカプシド。 - 請求項１に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター。
- 改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする前記核酸配列が、宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項３１に記載のベクター。
- 請求項１から１８のいずれか一項に記載の改変カプシドタンパク質または請求項１８に記載のＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶウイルスベクター。
- 治療用導入遺伝子または目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）をコードする組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを含む、請求項３３に記載のＡＡＶウイルスベクター。
- 請求項３１に記載のベクターまたは請求項３３に記載のＡＡＶウイルスベクターを含む、細胞。
- 請求項３３に記載のＡＡＶウイルスベクターと少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤とを含む医薬組成物。
- 治療用導入遺伝子またはタンパク質を対象に提供する方法であって、請求項３３に記載のＡＡＶウイルスベクターまたは請求項３６に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 疾患および／または障害を有する対象を処置する方法であって、請求項３３に記載のＡＡＶウイルスベクターまたは請求項３６に記載の医薬組成物の少なくとも１治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 前記疾患および／または障害が、筋および／または神経筋障害である、請求項３８に記載の方法。
- 前記筋および／または神経筋障害が、筋ジストロフィーまたは筋強直性ジストロフィーである、請求項３９に記載の方法。
- 前記ＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、前記対象に、静脈内、髄腔内、脳内、室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは目周囲、経口、直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、大槽内、神経内、胸膜内、局部、リンパ内、大槽内、または神経内に投与される、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
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