CN114026115A - 用于溶酶体病症的基因疗法 - Google Patents

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CN114026115A CN202080041473.XA CN202080041473A CN114026115A CN 114026115 A CN114026115 A CN 114026115A CN 202080041473 A CN202080041473 A CN 202080041473A CN 114026115 A CN114026115 A CN 114026115A
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Abstract

本公开涉及用于治疗与异常溶酶体功能相关的疾病诸如帕金森病和戈谢病的组合物和方法。本公开提供了表达构建体，其包含编码β葡糖脑苷脂酶的转基因、靶向α突触核蛋白的抑制性RNA或前述的组合。本公开还提供了通过向有需要的受试者施用此类表达构建体来治疗戈谢病、帕金森病或其他突触核蛋白病的方法。

Description

用于溶酶体病症的基因疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月16日提交的美国临时专利申请第62/990,246号和于2019年4月10日提交的美国临时专利申请第62/831,840号的优先权。这些申请中的每一个的公开内容以引用方式整体并入本文。
以电子方式提交的文本文件的描述
随本文以电子方式提交的文本文件的内容以引用方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：PRVL_009_02WO_SeqList.txt，记录日期：2020年4月10日，文件大小约361,154字节)。
背景技术
蛋白质诸如溶酶体酸性β葡糖脑苷脂酶(Gcase)和α突触核蛋白的异常表达涉及许多中枢神经系统病症。戈谢病是一种罕见的先天性糖鞘脂代谢异常，其原因在于Gcase的缺乏。患者具有非CNS症状和发现，包括肝脾肿大、导致全血细胞减少症的骨髓机能不全、肺病和纤维化，以及骨质缺损。此外，大量患者具有神经病学表现，包括有缺陷的眼扫视运动和凝视、癫痫发作、认知缺陷、发育迟滞和运动障碍(包括帕金森病(Parkinson’s disease))。
存在解决外周疾病以及在造血骨髓和内脏中的主要临床表现的几种治疗方法，包括酶替代疗法、结合有缺陷的Gcase并改善稳定性的陪伴分子样小分子药物、以及阻断导致症状和病理学的在戈谢病中积累的底物产生的底物减少疗法。然而，戈谢病的其他方面似乎难以治疗。
除了戈谢病患者(其在GBA1基因的两个染色体等位基因中都具有突变)之外，仅在GBA1的一个等位基因中具有突变的患者处于帕金森病(PD)的高度增加的风险中。升高的α突触核蛋白水平也是突触核蛋白病诸如PD的基础。PD症状(其包括步态困难、休息时的震颤、僵硬和经常抑郁、睡眠困难和认知衰退)的严重性与酶活性降低的程度相关。因此，戈谢病患者具有最严重的病程，然而在GBA1中具有单一轻度突变的患者通常具有更良性的病程。突变携带者还具有其他PD相关病症(包括路易体痴呆(特征在于执行功能障碍、精神病和PD样运动障碍)、以及具有特征性运动和认知缺损的多系统萎缩症)的高风险。目前没有任何治疗方法可以改变这些病症和其他突触核蛋白病的不可阻挡的进程。
技术领域
本公开涉及基因疗法及其使用方法领域。
发明内容
本文提供了用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码葡糖脑苷脂酶(Gcase)蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及(ii)AAV9衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV以从约5×1010vg/g脑至约5×1011vg/g脑范围内的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，所述rAAV以约1.3×1011vg/g脑的剂量施用于受试者。
本文提供了用于治疗患有具有葡糖脑苷脂酶1(GBA1)突变的帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及(ii)AAV9衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，所述rAAV以约1×1014vg或约2×1014vg的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，所述rAAV经由枕骨下注射到小脑延髓池中来施用。
本文提供了用于治疗患有1型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及(ii)AAV9衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，所述rAAV经静脉内施用。
本文提供了用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸包含含有转基因的表达构建体，所述转基因包含(a)包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；和(b)包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及(ii)AAV9衣壳蛋白。
本文提供了用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸包含含有转基因的表达构建体，所述转基因包含含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及AAV9衣壳蛋白。
在一些实施方案中，突触核蛋白病或帕金森症是多系统萎缩症、帕金森病、具有GBA1突变的帕金森病、路易体病、路易体痴呆，具有GBA1突变的路易体痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底综合征。
在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，所述rAAV载体还包含巨细胞病毒(CMV)增强子。在一些实施方案中，所述rAAV载体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在一些实施方案中，所述rAAV载体还包含牛生长激素聚A信号尾。在一些实施方案中，所述核酸包含位于表达构建体侧翼的两个腺相关病毒反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，每个ITR序列是野生型AAV2 ITR序列。在一些实施方案中，所述rAAV载体还包含在5’ITR与表达构建体之间的TRY区，其中所述TRY区包含SEQ IDNO:28。
本文提供了用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸按5'至3'顺序包含：
(a)AAV2 ITR；
(b)CMV增强子；
(c)CBA启动子；
(d)编码Gcase蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(e)WPRE；
(f)牛生长激素聚A信号尾；以及
(g)AAV2 ITR；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白；
其中所述rAAV以从约5×1010vg/g脑至约5×1011vg/g脑范围内的剂量施用于受试者。
本文提供了用于治疗患有具有GBA1突变的帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸按5'至3'顺序包含：
(a)AAV2 ITR；
(b)CMV增强子；
(c)CBA启动子；
(d)编码Gcase蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(e)WPRE；
(f)牛生长激素聚A信号尾；以及
(g)AAV2 ITR；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白；
其中所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于所述受试者。
在一些实施方案中，所述rAAV经由枕骨下注射到小脑延髓池中来施用。在一些实施方案中，所述rAAV以包含约20mM Tris(pH 8.0)、约1mM MgCl2、约200mM NaCl和约0.001％w/v泊洛沙姆188的制剂施用。
本文提供了药物组合物，其包含：
(i)包含以下项的rAAV：
(a)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(b)AAV9衣壳蛋白；以及
(ii)约20mM pH 8.0的Tris，
(iii)约1mM MgCl2，
(iv)约200mM NaCl，和
(v)约0.001％w/v泊洛沙姆188。
本文提供了rAAV，其包含：
(a)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(b)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的1型戈谢病、2型戈谢病、3型戈谢病或具有GBA1突变的帕金森病的方法中。
本文提供了rAAV，其包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸包含表达构建体，所述表达构建体包含与转基因插入物可操作地连接的启动子，所述转基因插入物包含：
(a)含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；以及
(b)含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的突触核蛋白病或帕金森症的方法中。
本文提供了rAAV，其包含：
(i)包含核酸的rAAV载体，所述核酸包含表达构建体，所述表达构建体包含与转基因插入物可操作地连接的启动子，所述转基因插入物包含含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的突触核蛋白病或帕金森症的方法中。
附图说明
图1是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)的表达构建体。
图2是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)和LIMP2(SCARB2)或其部分的表达构建体。Gcase和LIMP2的编码序列由内部核糖体进入位点(IRES)分开。
图3是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)和LIMP2(SCARB2)或其部分的表达构建体。Gcase和LIMP2的编码序列的表达各自由单独的启动子驱动。
图4是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包括编码Gcase(例如，GBA1或其部分)、LIMP2(SCARB2)或其部分和α-Syn的干扰RNA的表达构建体。
图5是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包括编码Gcase(例如，GBA1或其部分)、鞘脂激活蛋白原(例如，PSAP或其部分)和α-Syn的干扰RNA的表达构建体。
图6是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)和鞘脂激活蛋白原(例如，PSAP或其部分)的表达构建体。Gcase和鞘脂激活蛋白原的编码序列由内部核糖体进入位点(IRES)分开。
图7是描绘rAAV载体的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)的表达构建体。在此实施方案中，所述载体包含CBA启动子元件(CBA)以组成型表达人GBA1的密码子优化的编码序列，所述CBA启动子元件由以下四个部分组成：CMV增强子(CMVe)、CBA启动子(CBAp)、外显子1和内含子(int)。3'区还含有WPRE调控元件，其后是bGH聚A尾。在启动子区的5'端包括三个转录调控激活位点：TATA、RBS和YY1。侧翼ITR允许间插序列的正确包装。评价了5'ITR序列(插入框)的两个变体；这些变体在野生型AAV2ITR的20个核苷酸“D”区域内具有几个核苷酸差异。在一些实施方案中，rAAV载体含有在顶行显示的“D”结构域核苷酸序列。在一些实施方案中，rAAV载体包含突变体“D”结构域(例如，具有在底行显示的核苷酸变化的“S”结构域)。
图8是描绘编码图7中所述rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图。
图9A-图9F显示了CBE小鼠模型验证的代表性数据。每天检查存活(图9A)2次，并且每天记录体重(图9B)并在P27进行分析(图9C)。所有组均以n＝8开始。通过在P24落在疲劳转棒仪(rotarod)上的潜伏期(图9D)和通过在空旷场地中行进的总距离(图9F)来评估行为。由于早期致死性，每组中的动物数量不同：对于PBS和25mg/kg CBE，n＝8；对于37.5mg/kg CBE，n＝4。由于在P24的完全致死性，50mg/kg CBE治疗组不在疲劳转棒仪中进行评估。提供统计结果以使用ANOVA、随后使用Tukey HSD检验与PBS组进行比较。在PBS和25mg/kgCBE治疗组中分析小鼠大脑皮质中GCase底物的水平。将聚集体GluSph和GalSph水平(图9E)显示为pmol/mg组织湿重。使用学生t检验呈现统计结果。给出了平均值。误差条是平均值的标准误差(SEM)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图10是描绘CBE小鼠模型中编码GCase的rAAV的最大剂量的研究设计的一个实施方案的示意图。在P3通过ICV注射递送4μL PR001B或dPBS，并且在P8开始每日25mg/kg CBE治疗。在P24的疲劳转棒仪测定中评估行为。在P36(在P35它们的最终CBE剂量之后1天)处死一半动物，而在P38(在P35它们的最终CBE剂量之后3天)处死剩余的一半动物。“vg”是指载体基因组。
图11A-图11D显示了CBE小鼠模型中最大PR001B rAAV剂量的活体评估的代表性数据。在P3，经由ICV递送用赋形剂或8.8e9 vg rAAV治疗小鼠。在P8开始每日IP递送PBS或25mg/kg CBE。在研究结束时，在P36(第1天)最后一次CBE剂量之后一天将一半小鼠处死，而剩余的一半小鼠经历了在P38(第3天)处死之前的3天CBE停用。每天称重所有治疗组(赋形剂+PBS n＝8，rAAV+PBS n＝7，赋形剂+CBE n＝8，和rAAV+CBE n＝9)(图11A)，并且分析在P33的体重(图11B)。通过在P23在空旷场地中行进的总距离(图11D)和在P24落在疲劳转棒仪上的等待时间(图11C)来评估行为，将每只动物评价为3次试验的中值。由于致死率，对于行为测定的赋形剂+CBE组n＝7，而对于所有其他组n＝8。给出了动物中的平均值。误差条是SEM。*p<0.05；***p<0.001，在CBE治疗动物中通过线性回归确定的治疗组的标称p值。
图12A-图12B显示了CBE小鼠模型中最大PR001B rAAV剂量的生物化学评估的代表性数据。所有治疗组的大脑皮质用于测量载体基因组(图12A)和GCase活性(图12B)。生物分布显示为载体基因组数/1μg基因组DNA(gDNA)。虚线(100个载体基因组/μg gDNA)代表阳性载体存在的检测阈值。通过使用Amplex Red(Invitrogen；#A22189)测量由GCase产生葡萄糖的速率，然后使用重组GCase参考标准曲线转化成有效GCase活性水平来评价酶促活性。一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性，归一化为总蛋白质的mg。每组n＝6-9。给出了平均值。误差条是SEM。*P<0.05；在CBE治疗的动物中治疗组的标称P值，其中收集天数和性别作为协变量进行了校正。
图12C-图12D显示了在CBE小鼠模型中最大PR001B rAAV剂量的糖脂分析的代表性数据。使用所有治疗组(PBS+dPBS[每个图中的左条]n＝4，CBE+dPBS[每个图中的中条]n＝6，和CBE+PR001B[每个图中的右条]n＝9)的大脑皮质来测量在CBE停用之前(第1天)或之后(第3天)在各组中的GluSph水平(图12C)和GluCer水平(图12D)。GluSph和GluCer水平显示为pmol/nmol磷酸盐。给出了平均值。误差条是SEM。*P<0.1；**P<0.01；***P<0.001；在CBE治疗的动物中治疗组来自多元线性回归的标称P值，其中收集天数和性别作为协变量进行了校正。
图13显示了在施用赋形剂+PBS、赋形剂+CBE和PR001B rAAV+CBE治疗组之后在CBE小鼠模型中的行为和生物化学相关性的代表性数据。在治疗组之间，在疲劳转棒仪上的表现与GluCer积累呈负相关(A，线性回归p＝0.0012)，并且GluSph积累与GCase活性增加呈负相关(B，线性回归p＝0.0086)。
图14显示了在CBE小鼠模型中PR001B rAAV的生物分布的代表性数据。通过定量PCR使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在；通过A260光密度测量评价基因组DNA浓度。虚线(100个载体基因组/μg gDNA)代表阳性载体存在的检测阈值。给出了平均值。误差条是SEM。每组n＝7-9。
图15A是描绘在CBE小鼠模型中编码GCase的rAAV的剂量范围的研究设计的一个实施方案的示意图。在P3通过ICV注射递送PR001A，并且在P8开始每日25mg/kg CBE治疗。在P21-P22的空旷场地和疲劳转棒仪测定中以及在P28通过楔形横梁来评价行为。在P38-P40(在动物最终CBE剂量之后1天)将动物处死。分析皮质的GluSph和GluCer底物水平和GCase活性。在每个治疗组中有10只小鼠(5只雄性、5只雌性)。
图15B-图15E显示了在CBE小鼠模型中PR001 rAAV剂量范围的活体评估的代表性数据。在P3小鼠通过在4μL中的ICV递送接受了赋形剂或3种不同剂量的PR001A中的1种：低剂量(中间条)、中剂量(右起第二条)或高剂量(最右边的条)。在P8，开始25mg/kg CBE的每日IP治疗。接受赋形剂和CBE(左起第二条)或赋形剂和PBS(最左边的条)的小鼠用作对照。所有治疗组均以每组n＝10(5M/5F)开始。在其最后一次CBE剂量(P38-P40)后1天将所有小鼠处死。所有治疗组每天称重(图15B)，并且在P37分析它们的重量(图15C)。通过在P24时落在疲劳转棒仪上的等待时间(图15D)和在P30时横穿楔形横梁的等待时间(图15E)来评估运动表现。由于早期致死性，参与行为测定的小鼠数量为：赋形剂+PBS(最左边的条)n＝10；赋形剂+CBE(左起第二条)n＝9；低剂量PR001A+CBE(中间条)n＝6；中等剂量PR001A+CBE(右起第二条)n＝10；高剂量PR001A+CBE(最右边的条)n＝7。给出了平均值。误差条是SEM。*P<0.05；**P<0.01，在CBE治疗动物中的标称p值，其中性别作为协变量进行了校正。
图16A显示了在PR001A的剂量范围CBE模型研究中的生物分布的代表性数据。在P3小鼠通过ICV递送接受了赋形剂或3种不同剂量的PR001A中的1种：低剂量(中间条)、中剂量(右起第二条)或高剂量(最右边的条)。在P8，开始25mg/kg CBE的每日IP治疗。接受赋形剂和CBE(左起第二条)或赋形剂和PBS(最左边的条)的小鼠用作对照。在P38-P40(在其最后一次CBE剂量后1天)将所有小鼠处死。在每个组织和所有治疗组中评估载体基因组的存在，显示为每1μg基因组DNA的载体拷贝数。通过qPCR使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在；每组分别为N＝10、9、6、10、7。虚线代表阳性载体存在的检测阈值。给出了平均值。误差条是SEM。
图16B显示了PR001A的剂量范围CBE模型研究中的GCase酶促活性的代表性数据。显示了每个组织和所有治疗组的有效酶促GCase活性。活性以每mg总蛋白质的单位数显示，一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性。给出了平均值。误差条是SEM。提供统计结果用于与赋形剂+CBE组(左起第二条)进行比较。每组分别为N＝10、9、6、10、7。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图16C-图16D显示了PR001A的剂量范围CBE模型研究中的糖脂分析的代表性数据。GluSph(图16C)和GluCer(图16D)水平显示为pmol/nmol磷酸盐。给出了平均值。误差条是SEM。**P<0.01；***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图16E显示了PR001A的剂量范围CBE模型研究中的苏木精和曙红染色分析的代表性数据。加工脑组织以用苏木精和曙红(H&E)染色，并且评价组织切片的病理学变化。显示了呈大脑皮质胶质瘢痕阳性的动物百分比，大脑皮质胶质瘢痕是神经炎症的标志。与赋形剂治疗的对照相比，CBE治疗导致胶质瘢痕显著增加。PR001A以剂量依赖性方式显著地减少CBE诱导的胶质瘢痕形成。提供统计结果用于与CBE+赋形剂组(左条)进行比较。每组分别为N＝10、9、6、10、7。对于Fischer精确检验，*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001。
图16F显示了PR001A的剂量范围CBE模型研究中的大脑皮质免疫组织化学分析的代表性数据。图提供了在大脑皮质内测量的免疫反应区域的平均值(每组n＝5-10)。Iba1(离子化钙结合衔接分子1)免疫反应区域在CBE+赋形剂治疗的动物中(左起第二条)显著高于所研究的所有其他组的小鼠。给出了平均值，并且误差条为SEM。用单因子ANOVA和Sidak事后检验分析数据以进行多重比较。**:P<0.01；***:P<0.001。
图17显示了在遗传小鼠模型中的最大剂量GBA1 rAAV中的楔形横梁分析的代表性数据。在rAAV施用后4周通过横梁行走来测定治疗组(WT+赋形剂(n＝5)、4L/PS-NA+赋形剂(n＝6)和4L/PS-NA+rAAV(n＝5))的运动表现。将总滑动数和活动时间显示为在不同横梁上的5次试验的总和。将速度和每个速度下的滑动数显示为在不同横梁上5次试验的平均值。给出了平均值。误差条是SEM。
图18显示了编码GBA1与鞘脂激活蛋白原(PSAP)、SCARB2和/或一种或多种抑制性核酸组合的rAAV构建体的体外表达的代表性数据。数据表明，相对于GFP转染细胞，用每种构建体转染HEK293细胞导致所关注转基因的过表达。
图19是描绘包含位于ITR“外部”(例如，相对于转基因插入物或表达构建体在ITR的末端近侧)的“D”区的rAAV载体(顶部)和在载体“内部”(例如，在载体的转基因插入物近侧)具有ITR的野生型rAAV载体的示意图。
图20显示了使用具有“D”序列的野生型(圆形)或替代性(例如，“外部”；正方形)放置的ITR的rAAV转导HEK293细胞的数据。具有放置于“外部”的ITR的rAAV能够与具有野生型ITR的rAAV一样有效地转导细胞。
图21是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)的表达构建体。
图22是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)的表达构建体。
图23是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包括编码Gcase(例如，GBA1或其部分)和α-Syn的干扰RNA的表达构建体。
图24是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包括编码Gcase(例如，GBA1或其部分)和α-Syn的干扰RNA的表达构建体。
图25是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码鞘脂激活蛋白原(例如，PSAP或其部分)的表达构建体。
图26是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包含编码Gcase(例如，GBA1或其部分)的表达构建体。
图27是描绘包含rAAV载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述rAAV载体包括编码Gcase(例如，GBA1或其部分)、鞘脂激活蛋白原(例如，PSAP或其部分)和α-Syn的干扰RNA的表达构建体。
图28显示了指示施用编码Gcase的rAAV载体减少体内胶质瘢痕形成的代表性数据。加工组织以用苏木精和曙红(H&E)染色，并且评价载玻片的病理学变化。在每个组中呈胶质瘢痕阳性(反应性星形胶质细胞增生的反映)的动物百分比以浅色阴影显示，而呈胶质瘢痕阴性的那些动物百分比以黑色显示。与赋形剂治疗的对照相比，CBE治疗导致胶质瘢痕显著增加。rAAV-GBA1以剂量依赖性方式显著减少CBE诱导的胶质瘢痕形成。提供统计结果用于与赋形剂+CBE组(红色)进行比较。每组分别为N＝10、9、6、10、7。对于Fischer精确检验，*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001。
图29A-图29B显示了在施用rAAV-GBA1或赋形剂的小鼠皮质(每组n＝6-10)内测量的免疫荧光信号的平均值的代表性数据。GCase免疫标记的定量(图19A)揭示了在高剂量rAAV-GBA1治疗的动物中最强的免疫荧光标记，随后是中剂量和低剂量rAAV-GBA1治疗的动物。Iba1(图29B)免疫反应区域在CBE/赋形剂治疗的动物中显著高于所研究的所有其他组的小鼠。用单因子ANOVA和Sidak事后检验分析数据以进行多重比较。条形图代表组平均值+SEM。
图30是显示在研究PRV-2018-016中在第183天PR001A转基因的生物分布的代表性数据的条形图。在实施例12中描述了该研究。在小脑延髓池内(ICM)注射赋形剂、低剂量PR001A(6.2×1010vg/g脑)或高剂量的PR001A(2.3×1011vg/g脑)后183天，在NHP(非人灵长类动物)中使用qPCR方法分析了转基因水平。每个条代表每组3只动物的平均值±SEM；将低于定量极限的值绘制为零。由于赋形剂治疗的动物的qPCR值对于每个区域为零，赋形剂条在具有该标度的图中未示出。
图31A-图31B是显示研究PRV-2018-016中在第183天人GCase表达的代表性数据的图。在实施例12中描述了该研究。通过Simple WesternTM(Jess)分析在第183天收集的NHP(非人灵长类动物)皮质、海马体和中脑样品中确定GCase表达水平。显示了来自用赋形剂(在每个图中的左边)、低剂量的PR001A(6.2×1010vg/g脑重量；每个图中的中心)或高剂量的PR001A(2.3×1011vg/g脑重量；在每个图中的右边)治疗的NHP的GCase表达水平。图31A提供了来自单个皮质、海马体和中脑区域的数据。图31B显示了赋形剂治疗组(左边)、低剂量组(中心)和高剂量组(右边)的变化百分比。此图的数据在组织内平均归一化，并针对皮质、海马体和中脑进行合并。每个条代表平均归一化数据的每个剂量的赋形剂组中位数的百分比。为了计算显著性，进行单因子ANOVA以考虑包括低和高剂量治疗的动物的组合治疗组相对于赋形剂组的显著性。P值＝0.014(*<0.05)。
图32是显示研究PRV-2019-005中通过qPCR定量的PR001A转基因的生物分布的代表性数据的一系列图。在实施例12中描述了该研究。在小脑延髓池内(ICM)注射赋形剂或PR001A(7.0×1011vg/g脑)之后30天和90天在NHP(非人灵长类动物)中使用qPCR方法分析了转基因水平。每个图以平均值±SEM表示每个个体动物(n＝3/组)。
图33是显示在用PR001A体外转导HEK293T细胞之后GCase活性的代表性数据的线图。测定以不同感染复数(MOI)用PR001A转导的HEK293T细胞的GCase活性。通过前荧光底物试卤灵β-D-吡喃葡萄糖苷的水解来测量活性。使用读板仪在573nm的激发和610nm的发射下确定切割的底物的荧光。值为平均值±SEM，n＝2；一个单位相当于1ng/mL重组纯化的GCase的活性。
图34A-图34B是显示在用PR001A体外转导HeLa细胞之后GCase活性(图34A)和α突触核蛋白水平(图34B)的代表性数据的条形图。在治疗后72小时收集用赋形剂(左条)治疗或用2×105vg/细胞PR001A(中心条)或2×106vg/细胞PR001A(右条)转导的HeLa细胞，并且通过荧光酶测定分析GCase活性水平(图34A)或通过ELISA分析α突触核蛋白水平(图34B)。有效的酶促GCase活性以每mg总蛋白质的单位数显示，一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性。α突触核蛋白浓度表示为每mg总蛋白质的ng/mL。以生物学一式三份进行研究。给出了平均值。误差条是SEM。使用单因子ANOVA，随后进行Dunnett多重比较检验。
图35A-图35B是显示在用PR001A体外转导小鼠海马体神经元之后GCase活性(图35A)和α突触核蛋白水平(图35B)的代表性数据的条形图。在体外第(DIV)2天收集用赋形剂(左条)处理或用1.3×105vg/细胞PR001A(中心条)或1.3×106vg/细胞PR001A(右条)转导的小鼠海马体神经元原代培养物。在DIV9，收集细胞并且通过荧光酶测定分析GCase活性水平(图35A)或通过ELISA分析α突触核蛋白水平(图35B)。GCase活性显示为每小时每mg总蛋白质的相对荧光单位(RFU)。α突触核蛋白浓度表示为每mg总蛋白质的ng/mL。以生物学一式两份进行研究。给出了平均值。误差条是SEM。使用单因子ANOVA，随后进行Dunnett多重比较检验。
图36是描绘在CBE小鼠模型中用编码GCase的rAAV长期治疗的研究设计的一个实施方案的示意图。在P3通过ICV注射递送PR001A，并且在P8开始每日CBE治疗。在第3周、第6周和第15周的疲劳转棒仪测定中和在第4周、第7周、第13周的楔形横梁测定中评估行为。在第26周左右(在动物最终CBE剂量之后1天)将动物处死。分析大脑皮质的GluSph和GluCer底物水平和GCase活性。每个治疗组有10-11只动物，每组包括雄性和雌性小鼠。
图37A-图37D显示了在CBE模型中评估长期PR001A治疗的代表性数据。使用所有治疗组(PBS+赋形剂：左条，CBE+赋形剂：中心条，CBE+2.0×1010vg PR001A：右条)的皮质来测量载体基因组(图37A)、GCase活性(图37B)、GluSph水平(图37C)和GluCer水平(图37D)。在每个组织和所有治疗组中评估载体基因组的存在，显示为每1μg基因组DNA的载体拷贝数。通过qPCR使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在。有效的酶促GCase活性以每mg总蛋白质的单位数显示，一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性。GluSph和GluCer水平显示为pmol/nmol磷酸盐。给出了平均值。误差条是SEM。每组分别为N＝10、11、10。(*)P<0.1，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图38A-图38E显示了在CBE模型中另外的剂量范围PR001A的活体评估的代表性数据。所有治疗组每天称重(图38A)，并且在P45分析它们的重量(图38B)。通过在第3周(图38C)和第5周(图38D)落在疲劳转棒仪上的等待时间和在第4周横穿楔形横梁的等待时间(图38E)来评估运动表现。每组n＝8-11。给出了平均值。误差条是SEM。提供统计结果用于与CBE+赋形剂组(左起第二条)进行比较。***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD检验。
图39显示了另外的剂量范围CBE模型研究中的生物分布的代表性数据。在每个组织和所有治疗组中评估载体基因组的存在，显示为每1μg gDNA的载体拷贝数。通过qPCR使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在；每组n＝9-11。黑色虚线(100个载体基因组/μg gDNA)代表阳性载体存在的检测阈值。给出了平均值。误差条是SEM。
图40显示了另外的剂量范围CBE模型研究中的GCase酶促活性的代表性数据。测量并显示所有治疗组的大脑皮质的有效酶促GCase活性。活性以每mg总蛋白质的单位数显示，一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性。给出了平均值。误差条是SEM。提供统计结果用于与CBE+赋形剂组(左起第二条)进行比较。每组n＝9-11。(*)P<0.1，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD检验。
图41A-图41B显示了在另外的剂量范围CBE模型研究中的糖脂分析的代表性数据。GluSph(图41A)和GluCer(图41B)水平显示为pmol/nmol磷酸盐。给出了平均值。误差条是SEM。提供统计结果用于与CBE+赋形剂组(左起第二条)进行比较。每组n＝9-11。**P<0.01；***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD检验。
图42A-图42D显示了在CBE模型研究中另外的剂量范围PR001A的活体评估的代表性数据。所有治疗组每天称重(图42A)，并且在P37分析它们的重量(图42B)。通过在第3周落在疲劳转棒仪上的等待时间(图42C)和在第4周横穿楔形横梁的等待时间(图42D)来评估运动表现。每组n＝9-10。给出了平均值。误差条是SEM。提供统计结果用于与CBE+赋形剂组(左起第二条)进行比较。***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD检验。
图43A-图43B显示了在CBE模型研究中另外的剂量范围PR001A中的生物分布和GCase酶促活性的代表性数据。在所有治疗组的大脑皮质中测量载体基因组(图43A)，并且显示为每1μg基因组DNA(gDNA)的载体拷贝数。通过qPCR使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在。黑色虚线代表阳性载体存在的检测阈值(在100个载体基因组/μg gDNA)。在大脑皮质中测量有效的酶促GCase活性(图43B)，并且以每mg总蛋白质的单位数显示，一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性。给出了平均值。误差条是SEM。每组N＝9-10。***P<0.001；通过ANOVA、随后通过Tukey HSD检验。
图44A-图44B显示了在CBE模型研究中另外的剂量范围PR001A中的糖脂分析的代表性数据。GluSph(图44A)和GluCer(图44B)水平显示为pmol/nmol磷酸盐。给出了平均值。误差条是SEM。提供统计结果用于与CBE+赋形剂组(左起第二条)进行比较。每组n＝9-10。***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD检验。
图45是描绘在4L/PS-NA遗传小鼠模型中用编码GCase的rAAV治疗的研究设计的一个实施方案的示意图。PR001A通过ICV注射递送至3-4周龄的4L/PS-NA小鼠中。在生命的第8周、第12周和第18周(ICV治疗后5周、9周和15周)测试横梁行走，并且在生命的第12周和第18周(ICV治疗后9周和15周)测试疲劳转棒仪。在第18周将小鼠处死。分析大脑皮质的GCase酶促活性，并且分析小脑的GluSph和GluCer底物水平。在每个治疗组中有3只雄性和3只雌性小鼠。
图46显示了在4L/PS-NA遗传小鼠模型中在最大剂量PR001A中的生物分布的代表性数据。在每个组织和所有治疗组中评估载体基因组的存在，显示为每1μg基因组DNA(gDNA)的载体拷贝数。通过qPCR使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在。给出了平均值。误差条是SEM。每组n＝4-5。虚线代表阳性载体存在的检测阈值(在100个载体基因组/μg gDNA)。
图47显示了在4L/PS-NA遗传小鼠模型中在最大剂量PR001A中的GCase酶促活性的代表性数据。测量并显示每个组织和所有治疗组的有效酶促GCase活性。活性以每mg总蛋白质的单位数显示，一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性。给出了平均值。误差条是SEM。每组N＝4-5。*：P<0.05；**:P<0.01；***：P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图48A-图48B显示了在4L/PS-NA遗传小鼠模型中PR001A的糖脂分析的代表性数据。在出生后第P23天通过ICV递送4L/PS-NA小鼠接受赋形剂(中心条)或1.5×1010vgPR001A(右条)并且对照小鼠接受赋形剂(左条)。使用小脑测量GluSph(图48A)和GluCer(图48B)水平。水平以pmol/nmol磷酸盐显示。给出了平均值。误差条是SEM。每组分别为n＝4、5、5。*：P<0.05；**:P<0.01；***：P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图49A-图49B显示了在4L/PS-NA遗传小鼠模型中大脑皮质α突触核蛋白积累的生物化学评估的代表性数据。在出生后第23天，4L/PS-NA小鼠接受ICV赋形剂(中心条)或1.5×1010vg PR001A(右条)并且对照小鼠接受ICV赋形剂(左条)。使用定制的免疫吸附测定分析来自大脑皮质的脑裂解物的Triton X可溶性和Triton X不溶性级分的α突触核蛋白水平。显示了不溶性α突触核蛋白(图49A)和不溶性α突触核蛋白与可溶性α突触核蛋白的比率(图49B)。给出了平均值。误差条是SEM。每组N＝3-5。(*):P<0.20，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图50是描绘在4L/PS-NA遗传小鼠模型中的剂量范围PR001A rAAV的研究设计的一个实施方案的示意图。PR001A通过ICV注射递送至3-4周的4L/PS-NA小鼠中。在生命的第8周、第12周和第18周(ICV治疗后5周、9周和15周)评估横梁行走，并且在生命的第12周和第18周(ICV治疗后9周和15周)评估疲劳转棒仪。在第18周将小鼠处死。分析大脑皮质的GCase酶促活性，并且分析小脑的GluSph和GluCer底物水平。每个治疗组有10-11只小鼠。
图51显示了在4L/PS-NA遗传小鼠模型中的剂量范围PR001A中的第18周行为分析的代表性数据。评价横梁行走中的运动表现，并且在不同横梁上的2次试验中显示了每个速度下的平均总滑动数。每组分别为N＝10、6、5、7、4、8。给出了平均值。误差条是SEM；*：P<0.05；***：P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图52A-图52B显示了在4L/PS-NA遗传小鼠模型中的剂量范围PR001A中的生物分布和GCase酶促活性的代表性数据。在所有治疗组的大脑皮质中测量载体基因组(图52A)，并且显示为每1μg基因组DNA(gDNA)的载体拷贝数。通过qPCR使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在。虚线代表阳性载体基因组存在的检测阈值(在100个载体基因组/μggDNA)。在大脑皮质中测量有效的酶促GCase活性(图52B)，并且以每mg总蛋白质的单位数显示，一个单位被定义为1ng/mL重组纯化的GCase的活性。给出了平均值。误差条是SEM。每组分别为n＝10、10、10、10、7、8。***P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图53A-图53B显示了在4L/PS-NA遗传小鼠模型中的剂量范围PR001A中的糖脂分析的代表性数据。使用小脑测量GluSph(图53A)和GluCer(图53B)水平。水平以pmol/nmol磷酸盐显示。给出了平均值。误差条是SEM。每组分别为n＝10、10、10、10、7、8。***：P<0.001，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。(#):P<0.1；#:P<0.05，通过对所有动物的基因型和剂量进行多元线性回归。
图54A-图54B显示在CBE治疗的α突触核蛋白转基因小鼠中α突触核蛋白的蛋白质水平的生物化学评估的代表性数据。使用Simple WesternTM(Jess)自动化毛细管western印迹系统和MJFR-14-6-4-2α突触核蛋白抗体来分析海马体脑裂解物的α突触核蛋白浓度。在48kDa和230kDa之间观察到多个条带，并分组为“高分子量”(HMW)。单一条带以18kDa存在，与α突触核蛋白单体的预测分子量一致。提供了A53T+赋形剂组的归一化平均值的平均倍数变化。误差条是SEM。每组N＝3-5。*：P<0.05，通过ANOVA、随后通过Tukey HSD多重检验校正。
图55是描绘编码包含编码人Gcase的表达构建体的重组腺相关病毒载体(PR001A)的质粒的一个实施方案的示意图。“bp”是指“碱基对”。“kan”是指赋予卡那霉素抗性的基因。“ORF1”是指Gcase的开放阅读框。“ITR”是指腺相关病毒反向末端重复序列。“TRY”是指包含三个转录调控激活位点TATA、RBS和YY1的序列。“CBAp”是指鸡β肌动蛋白启动子。“CMVe”是指巨细胞病毒增强子。“WPRE”是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。“bGH”是指牛生长激素聚A信号尾。“int”是指内含子。PR001A的两条链的核苷酸序列在SEQ ID NO:39和40中提供。
图56是描绘编码包含编码人Gcase和靶向α突触核蛋白的shRNA的表达构建体的重组腺相关病毒载体(PR004X)的质粒的一个实施方案的示意图。“bp”是指“碱基对”。“kan”是指赋予卡那霉素抗性的基因。“aSyn_MshRNA”是指编码抑制α突触核蛋白的shRNA的区域。“GBA_CDSopt”是指Gcase的开放阅读框。“ITR”是指腺相关病毒反向末端重复序列。“TRY”是指包含三个转录调控激活位点TATA、RBS和YY1的序列。“CBAp”是指鸡β肌动蛋白启动子。“CMVe”是指巨细胞病毒增强子。“WPRE”是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。“bGH”是指牛生长激素聚A信号尾。“int”是指内含子。PR004X的两条链的核苷酸序列(经验证的序列)在SEQ ID NO:41和42中提供。
图57是描绘编码包含编码人Gcase和靶向α突触核蛋白的shRNA的表达构建体的重组腺相关病毒载体(PR004Y)的质粒的一个实施方案的示意图。“bp”是指“碱基对”。“kan”是指赋予卡那霉素抗性的基因。“shSNCA”是指编码抑制α突触核蛋白的shRNA的区域。“GBA_CDSopt”是指Gcase的开放阅读框。“ITR”是指腺相关病毒反向末端重复序列。“TRY”是指包含三个转录调控激活位点TATA、RBS和YY1的序列。“CBAp”是指鸡β肌动蛋白启动子。“CMVe”是指巨细胞病毒增强子。“WPRE”是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。“bGH”是指牛生长激素聚A信号尾。“int”是指内含子。PR004Y的两条链的核苷酸序列(理论的)在SEQ ID NO:43和44中提供。
图58是描绘编码包含编码靶向α突触核蛋白的shRNA的表达构建体的重组腺相关病毒载体(PR014X)的质粒的一个实施方案的示意图。“bp”是指“碱基对”。“kan”是指赋予卡那霉素抗性的基因。“aSyn_MshRNA”是指编码抑制α突触核蛋白的shRNA的区域。“ITR”是指腺相关病毒反向末端重复序列。“TRY”是指包含三个转录调控激活位点TATA、RBS和YY1的序列。“CBAp”是指鸡β肌动蛋白启动子。“CMVe”是指巨细胞病毒增强子。“WPRE”是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。“bGH”是指牛生长激素聚A信号尾。“int”是指内含子。PR014X的两条链的核苷酸序列(理论的)在SEQ ID NO:45和46中提供。编码shRNA的区域的两条链的核苷酸序列(理论的)在SEQ ID NO:47和48中提供。
图59是描绘在D409V Hom遗传小鼠模型中的剂量范围PR001rAAV的研究设计的一个实施方案的示意图。通过静脉内(IV)注射将PR001递送至D409V Hom小鼠中。5周后评估图中列出的参数。
图60A-图60C显示了PR001静脉内(IV)施用在D409V Hom遗传小鼠模型中的肝脏生物化学的代表性数据。IV注射后5周将小鼠处死。对细胞因子水平(图60A)和糖脂水平(图60B；图60C)进行定量。使用ANOVA、随后通过与D409V Hom+赋形剂组比较的Dunnett检验确定统计学。平均值以+/-SEM表示(n＝8-10/组)。****:p<0.0001；***:p<0.001；**:p<0.01；*:p<0.05；(*):p＝0.10。GluCer＝葡糖神经酰胺。GluSph＝葡糖基鞘氨醇。WT＝野生型。
图61A-图61B显示了PR001静脉内(IV)施用在D409V Hom遗传小鼠模型中的脑生物化学的代表性数据。IV注射后5周将小鼠处死。对糖脂水平进行定量。使用ANOVA、随后通过与D409V Hom+赋形剂组比较的Dunnett检验确定统计学。平均值以+/-SEM表示(n＝8-10/组)。****：p<0.0001；*：p<0.05。GluCer＝葡糖神经酰胺。GluSph＝葡糖基鞘氨醇。WT＝野生型。
图62显示了PR001静脉内(IV)施用在D409V Hom遗传小鼠模型中的肺生物化学的代表性数据。IV注射后5周将小鼠处死。对细胞因子水平进行定量。使用ANOVA、随后通过与D409V Hom+赋形剂组比较的Dunnett检验确定统计学。平均值以+/-SEM表示(n＝8-10/组)。*：p<0.05。WT＝野生型。
图63是描绘在4L/PS-NA遗传小鼠模型中的剂量范围PR001rAAV的研究设计的一个实施方案的示意图。通过静脉内(IV)注射将PR001递送至4L/PS-NA小鼠中。在所示的时间点评估图中列出的参数。
图64A-图64B显示了PR001静脉内(IV)施用在4L/PS-NA遗传小鼠模型中的肝脏生物化学的代表性数据。IV注射后15周将小鼠处死。对糖脂水平进行定量。使用ANOVA、随后通过与4L/PS-NA+赋形剂组比较的Dunnett检验确定统计学。平均值以+/-SEM表示(n＝10/组)。****：p<0.0001；***：p<0.001；*：p<0.05。GluCer＝葡糖神经酰胺。GluSph＝葡糖基鞘氨醇。
图65A-图65B显示了PR001静脉内(IV)施用在4L/PS-NA遗传小鼠模型中的脑生物化学的代表性数据。IV注射后15周将小鼠处死。对糖脂水平进行定量。使用ANOVA、随后通过与4L/PS-NA+赋形剂组比较的Dunnett检验确定统计学。平均值以+/-SEM表示(n＝10/组)。****：p<0.0001；**：p<0.01；*：p<0.05。GluCer＝葡糖神经酰胺。GluSph＝葡糖基鞘氨醇。
图66A-图66B显示了在用PR004或PR014转导之后在HeLa细胞中的α突触核蛋白的蛋白质水平和Gcase活性的代表性数据。用PR004、PR014或赋型剂处理HeLa细胞，并且在72小时后测量细胞裂解物中的α突触核蛋白水平(图66A)和GCase活性(图66B)。数据表示为平均值±SEM(n＝3/条件)。
图67A-图67C显示了在来自帕金森病患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)的神经元培养物中的PR004功效的代表性数据。源自具有SNCA三倍体的帕金森病患者的诱导多能干细胞被分化成神经元(图67A)。用PR004或赋型剂处理iPSC来源的神经元，并且在两周后测量在细胞裂解物中的GCase活性(图67B)和α-突触核蛋白水平(图69C)。通过非配对t检验确定统计学；*＝p<0.05,**＝p<0.01。数据表示为平均值±SEM(n＝2-3/组)。
图68A-图68B显示了通过qRT-PCR评估在HEK293细胞中来自PR004载体的靶向SNCA的shRNA的研究的代表性数据。用PR004或对照转染HEK293细胞，并且在72小时后提取RNA。进行各种基因的qRT-PCR并归一化为GAPDH表达。将数据归一化为对照条件，并表示为平均值±SEM(n＝3/组)。
图69是描绘在施用PR004之后在SNCA-A53T PAC小鼠模型中检查胃肠道、运动行为和生物化学终点的研究设计的一个实施方案的示意图。ICV＝脑室内。
图70是描绘在施用PR004之后在AAV2-SNCA-A53T IPa注射小鼠模型中检查运动行为和生物化学分析的研究设计的一个实施方案的示意图。IPa＝脑实质内。SN＝黑质。ICV＝脑室内。
图71A-图71B显示了在AAV2-SNCA-A53T小鼠模型中评估在施用PR004之后的运动表型的研究的代表性数据。对十周龄小鼠给予(1)通过IPa注射至SN中的AAV-空或AAV-SNCA-A53T，和(2)经由ICV注射的赋形剂或PR004。在治疗后4周(图71A)和9周(图71B)进行精细运动的运动学步态分析(MotoRater)。通过ANOVA、随后通过Dunnett多重检验校正确定统计学；*＝p<0.05,**＝p<0.01。数据表示为平均值±SEM(n＝10/组)。IPa＝脑实质内。SN＝黑质。ICV＝脑室内。
具体实施方式
本公开部分地基于用于在受试者中表达某些基因产物(例如，与CNS疾病相关的基因产物)的组合的组合物和方法。基因产物可以是蛋白质、蛋白质片段(例如部分)、抑制CNS疾病相关基因的干扰核酸等。在一些实施方案中，基因产物是由CNS疾病相关基因编码的蛋白质或蛋白质片段。在一些实施方案中，基因产物是抑制CNS疾病相关基因的干扰核酸(例如shRNA、siRNA、miRNA、amiRNA等)。
CNS疾病相关基因是指编码在遗传上、在生物化学上或在功能上与中枢神经系统(CNS)疾病诸如帕金森病(PD)、戈谢病(GD)或突触核蛋白病相关的基因产物的基因。例如，已经观察到在GBA1基因(其编码蛋白质Gcase)中具有突变的个体与在GBA1中不具有突变的个体相比具有增加的发生PD的风险。在另一个实例中，PD与包含α突触核蛋白(α-Syn)蛋白质的蛋白质聚集体的积累相关；因此，SNCA(其编码α-Syn)是CNS疾病相关基因。在一些实施方案中，本文所述的表达盒编码CNS疾病相关基因(或其编码序列)的野生型或非突变型形式。CNS疾病相关基因的实例列于表1中。
表1：CNS疾病相关基因的实例
Figure BDA0003391213180000241
酶诸如溶酶体酸性β葡糖脑苷脂酶(例如，GBA1基因的基因产物；也被称为GCase)的缺陷、以及涉及溶酶体功能或大分子运输至溶酶体的许多基因(例如，溶酶体膜蛋白1(LIMP)，也称为SCARB2)中的常见变体，已经与增加的PD风险和/或增加的戈谢病(例如，神经元病性戈谢病，诸如2型戈谢病或3型戈谢病)风险相关。本公开部分地基于编码Gcase(或其部分)、鞘脂激活蛋白原(或其部分)、LIMP2(或其部分)、或Gcase(或其部分)和来自与中枢神经系统(CNS)疾病例如PD、戈谢病等相关的基因(例如，LIMP2、鞘脂激活蛋白原和/或α突触核蛋白(α-Syn))的一种或多种另外的基因产物的组合的表达构建体(例如载体)。在一些实施方案中，本文所述的基因产物的组合当在受试者中表达时一起(例如协同地)发挥作用以减少CNS疾病的一种或多种体征和症状。
因此，在一些方面，本公开提供了包含编码Gcase(例如，GBA1基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的Gcase编码序列。在一些实施方案中，编码Gcase的核酸序列编码包含如SEQ ID NO:14所示(例如，如NCBI参考序列NP_000148.2所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如SEQ ID NO:15所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，例如位于编码Gcase的核酸序列侧翼的AAV ITR。
在一些方面，本公开提供了包含编码鞘脂激活蛋白原(例如，PSAP基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的鞘脂激活蛋白原编码序列。在一些实施方案中，编码鞘脂激活蛋白原的核酸序列编码包含如SEQ ID NO:16所示(例如，如NCBI参考序列NP_002769.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如SEQ ID NO:17所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，例如位于编码鞘脂激活蛋白原的核酸序列侧翼的AAV ITR。
在一些方面，本公开提供了包含编码LIMP2/SCARB2(例如，SCARB2基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的SCARB2编码序列。在一些实施方案中，编码LIMP2/SCARB2的核酸序列编码包含如SEQ ID NO:18所示(例如，如NCBI参考序列NP_005497.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如SEQ ID NO:29所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，例如位于编码SCARB2的核酸序列侧翼的AAV ITR。
在一些方面，本公开提供了包含编码第一基因产物和第二基因产物的表达构建体的分离的核酸，其中每个基因产物独立地选自表1中所示的基因产物或其部分。
在一些实施方案中，第一基因产物或第二基因产物是Gcase蛋白或其部分。在一些实施方案中，第一基因产物或第二基因产物是LIMP2或其部分、或鞘脂激活蛋白原或其部分。在一些实施方案中，第一基因产物是Gcase蛋白，并且第二基因产物是LIMP2或其部分、或鞘脂激活蛋白原或其部分。
在一些实施方案中，表达构建体编码(例如，单独或除了另一基因产物以外)干扰核酸(例如，shRNA、miRNA、dsRNA等)。在一些实施方案中，干扰核酸抑制α突触核蛋白(α-Synuclein)的表达。在一些实施方案中，靶向α突触核蛋白的干扰核酸包含如SEQ ID NO:20-25中任一者所示的序列。在一些实施方案中，靶向α突触核蛋白的干扰核酸包含如SEQID NO:20所示的序列。在一些实施方案中，靶向α突触核蛋白的干扰核酸与如SEQ ID NO:20-25中任一者所示的序列结合(例如，杂交)。在一些实施方案中，靶向α突触核蛋白的干扰核酸与如SEQ ID NO:20所示的序列结合(例如，杂交)。
在一些实施方案中，表达构建体还包含一个或多个启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、CAG启动子、CD68启动子或JeT启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA pol II启动子(例如，或RNA pol III启动子(例如，U6等)。
在一些实施方案中，表达构建体还包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，IRES位于第一基因产物与第二基因产物之间。
在一些实施方案中，表达构建体还包含自切割肽编码序列。在一些实施方案中，自切割肽是T2A肽。
在一些实施方案中，表达构建体包含两个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)序列。在一些实施方案中，ITR序列位于第一基因产物和第二基因产物侧翼(例如，从5'端至3'端如下排列：ITR-第一基因产物-第二基因产物-ITR)。在一些实施方案中，分离的核酸的ITR序列之一缺乏功能性末端分辨位点(terminal resolution site，trs)。例如，在一些实施方案中，ITR之一是ΔITR。
在一些方面，本公开涉及包含具有经修饰的“D”区(例如，相对于野生型AAV2 ITR(SEQ ID NO:29)经修饰的D序列)的ITR的rAAV载体。在一些实施方案中，具有经修饰的D区的ITR是rAAV载体的5'ITR。在一些实施方案中，经修饰的“D”区包含“S”序列，例如，如SEQID NO:26所示。在一些实施方案中，具有经修饰的“D”区的ITR是rAAV载体的3'ITR。在一些实施方案中，经修饰的“D”区包含3'ITR，其中所述“D”区位于ITR的3'端(例如，相对于载体的转基因插入物在ITR的外部或终末端)。在一些实施方案中，经修饰的“D”区包含如SEQ IDNO:26或27所示的序列。
在一些实施方案中，分离的核酸(例如rAAV载体)包含TRY区。在一些实施方案中，TRY区包含如SEQ ID NO:28所示的序列。
在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸包含SEQ ID NO:1至13、15、17、19和32-48中任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸编码包含如SEQ ID NO:14、16和18中任一者所示的序列或由其组成的肽。
在一些方面，本公开提供了包含如本公开所描述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是重组AAV(rAAV)载体。在一些实施方案中，rAAV载体是单链的(例如单链DNA)。
在一些方面，本公开提供了包含如本公开所描述的分离的核酸或如本公开所描述的载体的宿主细胞。
在一些方面，本公开提供了包含衣壳蛋白和如本公开所描述的分离的核酸或载体的重组腺相关病毒(rAAV)。
在一些实施方案中，衣壳蛋白能够穿过血脑屏障，例如AAV9衣壳蛋白或AAVrh.10衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV转导中枢神经系统(CNS)的神经元细胞和非神经元细胞。
在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有中枢神经系统(CNS)疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或rAAV的组合物)。在一些实施方案中，CNS疾病是神经退行性疾病，诸如表4中所列出的神经退行性疾病。在一些实施方案中，CNS疾病是突触核蛋白病，诸如表5中所列出的突触核蛋白病。在一些实施方案中，CNS疾病是tau蛋白病，诸如表6中所列出的tau蛋白病。在一些实施方案中，CNS疾病是溶酶体贮积病，诸如表7中所列出的溶酶体贮积病。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是神经元病性戈谢病，诸如1型戈谢病、2型戈谢病或3型戈谢病。
在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或rAAV的组合物)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，将所述rAAV以约1.3×1011个载体基因组(vg)/g脑的剂量施用于患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有具有葡糖脑苷脂酶1(GBA1)突变的帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，将所述rAAV以约1×1014个载体基因组(vg)或约2×1014vg的剂量施用于患有帕金森病的受试者。
在一些实施方案中，所述rAAV经由枕骨下注射到小脑延髓池中来施用。
在一些实施方案中，组合物包含编码两种或更多种基因产物(例如CNS疾病相关的基因产物)，例如本申请中所描述的2种、3种、4种、5种或更多种基因产物的核酸(例如rAAV基因组，例如被AAV衣壳蛋白衣壳化)。在一些实施方案中，组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种或更多种)不同的核酸(例如，两种或更多种rAAV基因组，例如分别被AAV衣壳蛋白衣壳化)，每种编码一种或多种不同的基因产物。在一些实施方案中，将两种或更多种不同的组合物施用于受试者，每种组合物包含一种或多种编码不同基因产物的核酸。在一些实施方案中，不同的基因产物可操作地连接至相同的启动子类型(例如，相同的启动子)。在一些实施方案中，不同的基因产物可操作地连接至不同的启动子。
分离的核酸和载体
分离的核酸可以是DNA或RNA。在一些方面，本公开提供了包含编码Gcase(例如，GBA1基因的基因产物)或其部分的表达构建体的分离的核酸。Gcase，也称为β葡糖脑苷脂酶或GBA，是指切割化学葡糖脑苷脂(糖脂代谢中的中间体)的β糖苷键的溶酶体蛋白质。Gcase(糖脂正常代谢所必需的关键溶酶体酶)的缺乏导致Gcase糖脂底物葡糖神经酰胺(GluCer)和葡糖基鞘氨醇(GluSph)的积累。在人类中，Gcase由位于第1号染色体上的GBA1基因编码。在一些实施方案中，GBA1编码由NCBI参考序列NCBI参考序列NP_000148.2表示的肽(SEQ IDNO:14)。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的Gcase编码序列，诸如SEQ ID NO:15所示的序列。
在一些方面，本公开提供了包含编码鞘脂激活蛋白原(例如，PSAP基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。鞘脂激活蛋白原是鞘脂激活蛋白(鞘脂激活蛋白(saposin))A、B、C和D的前体糖蛋白，其促进具有短的寡糖基团的糖鞘脂的分解代谢。在人类中，PSAP基因位于第10号染色体上。在一些实施方案中，PSAP编码由NCBI参考序列NP_002769.1表示的肽(例如，SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的鞘脂激活蛋白原编码序列，诸如SEQ ID NO:17所示的序列。
本公开的方面涉及包含编码LIMP2/SCARB2(例如，SCARB2基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。SCARB2是指调节细胞内的溶酶体和内体转运的膜蛋白。在人类中，SCARB2基因位于第4号染色体上。在一些实施方案中，SCARB2基因编码由NCBI参考序列NP_005497.1表示的肽(SEQ ID NO:18)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如SEQ ID NO:19所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的SCARB2编码序列。
在一些方面，本公开提供了包含编码第一基因产物和第二基因产物的表达构建体的分离的核酸，其中每个基因产物独立地选自表1中所示的基因产物或其部分。
在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含如SEQ ID NO:1-48中任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含与如SEQ ID NO:1-48中任一者所示的序列互补(例如，为如SEQ ID NO:1-48中任一者所示的序列的互补序列)的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含为如SEQ ID NO:1-48中任一者所示序列的反向互补序列的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含如SEQ ID NO:1-48中任一者所示序列的一部分或由其组成。一部分可以包含如SEQ ID NO:1-48中任一者所示的序列的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本公开所描述的核酸序列是核酸有义链(例如，5'至3'链)，或在病毒序列的背景下是正(+)链。在一些实施方案中，本公开所描述的核酸序列是核酸反义链(例如，3'至5'链)，或在病毒序列的背景下是负(-)链。
在一些实施方案中，基因产物由天然存在的基因的编码部分(例如cDNA)编码。在一些实施方案中，第一基因产物是由GBA1基因编码的蛋白质(或其片段)。在一些实施方案中，基因产物是由SCARB2/LIMP2基因和/或PSAP基因编码的蛋白质(或其片段)。然而，技术人员认识到第一基因产物(例如，Gcase)和第二基因产物(例如，LIMP2)的表达顺序通常可以颠倒(例如，LIMP2是第一基因产物，并且Gcase是第二基因产物)。在一些实施方案中，基因产物是表1中所列出的基因的片段(例如部分)。蛋白质片段可以包含由表1中所列出的基因编码的蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，蛋白质片段包含由表1中所列出的基因编码的蛋白质的50％至99.9％(例如50％与99.9％之间的任何值)。
在一些实施方案中，表达构建体是单顺反子的(例如，表达构建体编码包含第一基因产物和第二基因产物的单一融合蛋白)。在一些实施方案中，表达构建体是多顺反子的(例如，表达构建体编码两种不同的基因产物，例如两种不同的蛋白质或蛋白质片段)。
多顺反子表达载体可以包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多个)启动子。可以使用任何合适的启动子，例如组成型启动子、诱导型启动子、内源启动子、组织特异性启动子(例如CNS特异性启动子)等。在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白启动子(CBA启动子)、CAG启动子(例如，如Alexopoulou等人(2008)BMC Cell Biol.9:2；doi:10.1186/1471-2121-9-2所述的)、CD68启动子或JeT启动子(例如，如
Figure BDA0003391213180000321
等人(2002)Gene 297(1-2):21-32所述的)。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至编码第一基因产物、第二基因产物、或第一基因产物和第二基因产物的核酸序列。在一些实施方案中，表达盒包含一个或多个另外的调控序列，包括但不限于转录因子结合序列、内含子剪接位点、聚(A)添加位点、增强子序列、阻遏物结合位点或前述各项的任何组合。
在一些实施方案中，编码第一基因产物的核酸序列和编码第二基因产物的核酸序列被编码内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列分开。IRES位点的实例由例如Mokrejs等人(2006)Nucleic Acids Res.34(数据库发布):D125-30进行了描述。在一些实施方案中，编码第一基因产物的核酸序列和编码第二基因产物的核酸序列被编码自切割肽的核酸序列分开。自切割肽的实例包括但不限于T2A、P2A、E2A、F2A、BmCPV 2A和BmIFV 2A，以及由Liu等人(2017)Sci Rep.7:2193描述的那些。在一些实施方案中，自切割肽是T2A肽。
在病理学上，病症诸如PD和戈谢病与主要由α突触核蛋白(α-Syn)蛋白构成的蛋白质聚集体的积累相关。因此，在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸包含减少或阻止α-Syn蛋白表达的抑制性核酸。可以将编码抑制性核酸的序列置于表达载体的非翻译区(例如内含子、5'UTR、3'UTR等)中。
在一些实施方案中，抑制性核酸位于表达构建体的内含子中，例如位于编码第一基因产物的序列上游的内含子中。抑制性核酸可以是双链RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、微小RNA(miRNA)、人工miRNA(amiRNA)或RNA适体。通常，抑制性核酸与靶RNA(例如，mRNA)的约6个与约30个之间(例如，在6个与30个之间的任何整数，包括端值)连续核苷酸结合(例如，与之杂交)。在一些实施方案中，抑制性核酸分子是miRNA或amiRNA，例如靶向SNCA(编码α-Syn蛋白的基因)的miRNA。在一些实施方案中，miRNA不包含与其杂交的SNCA mRNA区域的任何错配(例如，miRNA是“完美的”)。在一些实施方案中，抑制性核酸是shRNA(例如，靶向SNCA的shRNA)。在一些实施方案中，靶向SNCA的shRNA由SEQ ID NO:47编码。在一些实施方案中，靶向SNCA的shRNA由包含SEQ ID NO:20的序列编码。
本领域技术人员认识到，当提及包含或编码抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、amiRNA等)的核酸序列时，本文所提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸或尿苷(U)核苷酸可以被适合与腺苷核苷酸碱基配对(例如，经由沃森-克里克碱基对)的任何其他核苷酸替换。例如，T可以被U替换，并且U可以被T替换。
如本文所述的分离的核酸可以其自身存在，或作为载体的一部分存在。通常，载体可以是质粒、粘粒、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)或病毒载体(例如腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体等)。在一些实施方案中，载体是质粒(例如，包含如本文所述的分离的核酸的质粒)。在一些实施方案中，载体是重组AAV(rAAV)载体。在一些实施方案中，rAAV载体是单链的(例如单链DNA)。在一些实施方案中，载体是杆状病毒载体(例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体(AcNPV)载体)。
通常，rAAV载体(例如，rAAV基因组)包含侧翼有两个AAV反向末端重复(ITR)序列的转基因(例如，包含以下各项中的一种或多种的表达构建体：启动子、内含子、增强子序列、蛋白质编码序列、抑制性RNA编码序列、聚A尾序列等)。在一些实施方案中，rAAV载体的转基因包含如本公开所描述的分离的核酸。在一些实施方案中，rAAV载体的两个ITR序列中的每一个是全长ITR(例如，长度为大约145bp，并且含有功能性Rep结合位点(RBS)和末端分辨位点(trs))。在一些实施方案中，rAAV载体的ITR之一被截短(例如缩短的或非全长)。在一些实施方案中，截短的ITR缺乏功能性末端分辨位点(trs)并且被用于产生自身互补AAV载体(scAAV载体)。在一些实施方案中，截短的ITR是ΔITR，例如，如McCarty等人(2003)Gene Ther.10(26):2112-8所述。
本公开的方面涉及分离的核酸(例如rAAV载体)，其包含相对于野生型AAV ITR(例如相对于野生型AAV2 ITR(例如SEQ ID NO:29))具有一个或多个修饰(例如核酸添加、缺失、取代等)的ITR。野生型AAV2ITR的结构如图19所示。通常，野生型ITR包含自退火形成回文双链T形发夹结构的125个核苷酸区域，所述回文双链T形发夹结构由两个交叉臂(分别由称为B/B′和C/C′的序列形成)、较长的茎区(由序列A/A′形成)和称为“D”区的单链末端区组成。(图19)。通常，ITR的“D”区位于由A/A′序列形成的茎区域和含有rAAV载体的转基因的插入物之间(例如，相对于ITR的末端定位于ITR的“内部”或者在rAAV载体的转基因插入物或表达构建体近侧)。在一些实施方案中，“D”区包含如SEQ ID NO:27所示的序列。已观察到“D”区在通过衣壳蛋白对rAAV载体的衣壳化中起重要作用，例如，如Ling等人(2015)J MolGenet Med 9(3)所公开的。
本公开部分地基于令人惊讶的发现，即与具有未经修饰(例如，野生型)ITR的ITR的rAAV载体相比，包含位于ITR“外部”(例如，相对于转基因插入物或表达构建体在ITR末端近侧)的“D”区的rAAV载体被AAV衣壳蛋白有效地衣壳化。在一些实施方案中，具有经修饰的“D”序列(例如，在“外部”位置的“D”序列)的rAAV载体相对于具有野生型ITR序列的rAAV载体具有降低的毒性。
在一些实施方案中，相对于野生型“D”序列(例如，SEQ ID NO:27)，经修饰的“D”序列包含至少一个核苷酸取代。相对于野生型“D”序列(例如，SEQ ID NO:27)，经修饰的“D”序列可能具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个核苷酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型“D”序列(例如，SEQ ID NO:27)，经修饰的“D”序列包含至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个核酸取代。在一些实施方案中，经修饰的“D”序列与野生型“D”序列(例如，SEQ ID NO:27)具有约10％与约99％之间(例如，10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的同一性。在一些实施方案中，经修饰的“D”序列包含如SEQ ID NO:26所示的序列，也称为“S”序列，如Wang等人(1995)J Mol Biol 250(5):573-80所述。
如本公开所描述的分离的核酸或rAAV载体还可以包含“TRY”序列，例如，如SEQ IDNO:28所示或如Francois等人(2005)J.Virol.79(17):11082–11094所述。在一些实施方案中，TRY序列定位于分离的核酸或rAAV载体的ITR(例如5'ITR)与表达构建体(例如编码转基因的插入物)之间。
在一些方面，本公开涉及包含如本公开所描述的分离的核酸或rAAV载体的杆状病毒载体。在一些实施方案中，所述杆状病毒载体是苜蓿银纹夜蛾核型多角体(AcNPV)载体，例如，如Urabe等人(2002)Hum Gene Ther 13(16):1935-43和Smith等人(2009)Mol Ther17(11):1888-1896所述。
在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。例如，宿主细胞可以是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞等。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如HEK293T细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞。
rAAV
在一些方面，本公开涉及包含编码如本文所述的核酸(例如，如本文所述的rAAV载体)的转基因的重组AAV(rAAV)。术语“rAAV”通常是指包含被一种或多种AAV衣壳蛋白衣壳化的rAAV载体的病毒颗粒。本公开所描述的rAAV可以包含具有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV包含来自非人宿主的衣壳蛋白，例如恒河猴AAV衣壳蛋白诸如AAVrh.10、AAVrh.39等。在一些实施方案中，本公开所描述的rAAV包含为野生型衣壳蛋白的变体的衣壳蛋白，诸如相对于其所来源的野生型AAV衣壳蛋白包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个(例如，15个、20个、25个、50个、100个等)氨基酸置换(例如突变)的衣壳蛋白变体。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白变体是AAV1RX衣壳蛋白，例如，如Albright等人Mol Ther.2018年2月7日；26(2):510-523所述。在一些实施方案中，衣壳蛋白变体是AAV TM6衣壳蛋白，例如，如Rosario等人Mol Ther Methods Clin Dev.2016；3:16026所述。
在一些实施方案中，本公开所描述的rAAV容易地通过CNS扩散，特别是当引入CSF空间或直接引入脑实质中时。因此，在一些实施方案中，本公开所描述的rAAV包含能够穿过血脑屏障(BBB)的衣壳蛋白。例如，在一些实施方案中，rAAV包含具有AAV9或AAVrh.10血清型的衣壳蛋白。例如Samulski等人(1989)J Virol.63(9):3822-8和Wright(2009)Hum GeneTher.20(7):698–706描述了rAAV的产生。在一些实施方案中，rAAV包含特异性地或优先地靶向骨髓细胞例如小胶质细胞的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR001”的rAAV。此rAAV表达人GBA1的密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR001A”的rAAV。PR001A(AAV9.CBA.GBA1.A)是递送功能性人GBA1基因、从而导致功能性人Gcase的表达增加的rAAV。PR001A载体插入物包含鸡β肌动蛋白(CBA)启动子元件，其包含以下4个部分：巨细胞病毒(CMV)增强子、CBA启动子、外显子1和内含子(int)，以组成型表达人GBA1的密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:15)。3'区域还含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，随后是牛生长激素聚腺苷酸化信号尾。三个已充分描述的转录调控激活位点被包括在启动子区域的5'端：TATA、RBS和YY1(参见例如Francois等人,(2005)J.Virol.79(17):11082–11094)。侧翼反向末端重复序列(ITR)允许间插序列的正确包装。提供了5'ITR序列的两个变体(图7，插入框，底部序列)；这些变体在ITR的20个核苷酸“D”区内具有几个核苷酸差异，这被认为影响包装和表达的效率。PR001A含有图7中所示的“D”结构域核苷酸序列(插入框，顶部序列；SEQ ID NO:30)。在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR001B”的变体载体，其具有突变的“D”结构域(在本文中称为“S”结构域，其中核苷酸变化通过图7中SEQID NO:31中的阴影显示)。除了不同的5'ITR序列，PR001B与PR001A相同。主链含有赋予卡那霉素抗性的基因以及防止反向包装的填充序列。图55中显示了描绘编码rAAV载体的质粒的示意图。SEQ ID NO:39提供了编码图55中所示的PR001A载体的质粒的第一链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。SEQ ID NO:40提供了编码图55中所示的PR001A载体的质粒的第二链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。PR001A包含AAV9衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR004”的rAAV。此rAAV表达人GBA1的密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:15)和靶向减少α突触核蛋白并包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列。在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR004X”的rAAV。在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR004Y”的rAAV。PR004X和PR004Y中的每一者是下述rAAV，其(i)递送功能性人GBA1基因，从而导致功能性人Gcase的表达增加，以及(ii)编码经由RNA干扰降低α突触核蛋白水平的shRNA。PR004载体插入物包含鸡β肌动蛋白(CBA)启动子元件，其包含以下4个部分：巨细胞病毒(CMV)增强子、CBA启动子、外显子1和内含子(int)，以组成型表达人GBA1的密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:15)和包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列。3'区域还含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，随后是牛生长激素聚腺苷酸化信号尾。三个已充分描述的转录调控激活位点被包括在启动子区域的5'端：TATA、RBS和YY1(参见例如Francois等人,(2005)J.Virol.79(17):11082–11094)。侧翼反向末端重复序列(ITR)允许间插序列的正确包装。主链含有赋予卡那霉素抗性的基因以及防止反向包装的填充序列。图56显示了描绘编码rAAV PR004X载体的质粒的示意图。SEQ ID NO:41提供了编码图56中所示的PR004X载体的质粒的第一链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。SEQ ID NO:42提供了编码图56中所示的PR004X载体的质粒的第二链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。图57显示了描绘编码rAAV PR004Y载体的质粒的示意图。SEQID NO:43提供了编码图57中所示的PR004Y载体的质粒的第一链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。SEQ ID NO:44提供了编码图57中所示的PR004Y载体的质粒的第二链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。PR004X和PR004Y各自包含AAV9衣壳蛋白。设计PR004X和PR004Y载体以减少所有形式的α突触核蛋白(包括聚集形式和细胞外形式)的积累。
在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR014”的rAAV。此rAAV表达靶向减少α突触核蛋白并包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列。在一些实施方案中，本公开提供了称为“PR014X”的rAAV。PR014X是编码经由RNA干扰降低α突触核蛋白水平的shRNA的rAAV。PR014X载体插入物包含鸡β肌动蛋白(CBA)启动子元件，其包含4个部分：巨细胞病毒(CMV)增强子、CBA启动子、外显子1和内含子(int)，以组成型表达包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列。3'区域还含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，随后是牛生长激素聚腺苷酸化信号尾。三个已充分描述的转录调控激活位点被包括在启动子区域的5'端：TATA、RBS和YY1(参见例如Francois等人,(2005)J.Virol.79(17):11082–11094)。侧翼反向末端重复序列(ITR)允许间插序列的正确包装。主链含有赋予卡那霉素抗性的基因以及防止反向包装的填充序列。图58中显示了描绘编码rAAV载体的质粒的示意图。SEQ ID NO:45提供了编码图60中所示的PR014X载体的质粒的第一链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。SEQ ID NO:46提供了编码图60中所示的PR014X载体的质粒的第二链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。SEQ ID NO:47提供了编码图58中所示的PR014X载体的质粒中的shRNA的第一链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。SEQ ID NO:48提供了编码图58中所示的PR014X载体的质粒中的shRNA的第二链(按5'至3'顺序)的核苷酸序列。PR014X包含AAV9衣壳蛋白。设计PR014X载体以减少所有形式的α突触核蛋白(包括聚集形式和细胞外形式)的积累。
在一些实施方案中，在杆状病毒载体表达系统(BEVS)中产生如本公开所描述的rAAV(例如，包含由AAV衣壳蛋白衣壳化以形成rAAV衣壳颗粒的重组rAAV基因组)。例如Urabe等人(2002)Hum Gene Ther 13(16):1935-43；Smith等人(2009)Mol Ther 17(11):1888-1896；美国专利号8,945,918；美国专利号9,879,282以及国际PCT公开WO 2017/184879描述了使用BEVS生产rAAV。然而，可以使用任何合适的方法(例如，使用重组rep和cap基因)生产rAAV。在一些实施方案中，在HEK293(人胚肾)细胞中生产本文所公开的rAAV。
药物组合物
在一些方面，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的分离的核酸或rAAV和药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料，诸如载剂或稀释剂，例如，所述材料可以施用于个体而不引起不期望的生物效应或以有害方式与包含其的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或载剂，诸如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料，它们涉及将可用于本发明内的化合物携带或运输至患者体内或之中，使得所述化合物可以执行预期的功能。在实施本发明中使用的药物组合物中可以包括的其他成分是本领域已知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Genaro编辑,MackPublishing Co.,1985,Easton,PA)中，其以引用方式并入本文。
本文提供的组合物(例如，药物组合物)可以通过任何途径施用，包括肠内(例如，口服)、肠胃外、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、透皮、皮内、直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏、乳膏和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或作为口腔喷雾剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂。具体考虑的途径是口服施用、静脉内施用(例如，全身静脉内注射)、经由血液和/或淋巴供应的区域性施用、和/或直接施用于受累的部位。通常，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括药剂的性质(例如，其在胃肠道环境中的稳定性)和/或受试者的状况(例如，受试者是否能够耐受口服施用)。在某些实施方案中，本文所述的化合物或药物组合物适合于局部施用于受试者的眼睛。
在一些实施方案中，本公开提供了包含上文所述的在水溶液中呈现的PR001 rAAV的PR001(例如，PR001A)药物制成品。在一些实施方案中，最终制剂缓冲液包含约20mM Tris[pH 8.0]、约1mM MgCl2、约200mM NaCl和约0.001％[w/v]泊洛沙姆188。在一些实施方案中，药物制成品和最终制剂缓冲液适合于小脑延髓池内(ICM)注射或静脉内施用。
方法
本公开的方面涉及将被工程化以表达CNS疾病相关基因产物的组合物(例如，分离的核酸、rAAV等)递送至一个或多个细胞(例如，受试者的一个或多个细胞)。
如实施例章节中所进一步描述的，本公开的方面涉及表达抑制或预防胶质瘢痕形成(例如胶质增生)的基因产物的组合物。因此，在一些方面，本公开提供了用于抑制受试者中的胶质瘢痕形成的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的组合物(例如，分离的核酸或rAAV)。
在一些实施方案中，所述受试者患有或疑似患有中枢神经系统(CNS)疾病。在一些实施方案中，所述受试者患有戈谢病(GD)。在一些实施方案中，所述受试者患有神经元病性GD(nGD)(例如，2型GD或3型GD)。在一些实施方案中，所述受试者患有1型GD。在一些实施方案中，患有GD的受试者不患有PD或不具有PD症状。在一些实施方案中，所述受试者患有帕金森症。在一些实施方案中，受试者患有帕金森病(PD)。在一些实施方案中，所述受试者患有非典型帕金森病障碍。在一些实施方案中，非典型帕金森病障碍是路易体痴呆、进行性核上性麻痹、多系统萎缩症或皮质基底综合征。
本公开部分地基于用于在受试者中表达一种或多种CNS疾病相关基因产物以治疗CNS相关疾病的组合物。一种或多种CNS疾病相关基因产物可以由一种或多种分离的核酸或rAAV载体编码。在一些实施方案中，向受试者施用编码一种或多种(1种、2种、3种、4种、5种或更多种)基因产物的单一载体(例如，分离的核酸、rAAV等)。在一些实施方案中，向受试者施用多种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)载体(例如分离的核酸、rAAV等)，其中每种载体编码不同的CNS疾病相关基因产物。在一些实施方案中，所述组合物表达GBA或其部分。在一些实施方案中，所述组合物表达靶向α突触核蛋白的干扰RNA。在一些实施方案中，所述组合物表达GBA或其部分和靶向α突触核蛋白的干扰RNA。
CNS相关疾病可以是神经退行性疾病、突触核蛋白病、Tau蛋白病或溶酶体贮积病。神经退行性疾病及其相关基因的实例列于表4中。
“突触核蛋白病”是指(例如，相对于健康受试者，例如未患有突触核蛋白病的受试者)以受试者中α突触核蛋白(SNCA的基因产物)的积累为特征的疾病或病症。突触核蛋白病及其相关基因的实例列于表5中。
“tau蛋白病”是指(例如，相对于未患有tau蛋白病的健康受试者)以受试者中异常Tau蛋白积累为特征的疾病或病症。tau蛋白病及其相关基因的实例列于表6中。
“溶酶体贮积病”是指以受试者的溶酶体中毒性细胞产物的异常积累为特征的疾病。溶酶体贮积病及其相关基因的实例列于表7中。
如本文所用的“治疗”(“treat”或“treating”)是指(a)预防或延迟CNS疾病的发作；(b)降低CNS疾病的严重性；(c)减少或预防CNS疾病特征性症状的发展；(d)和/或预防CNS疾病特征性症状的恶化。CNS疾病的症状可以包括例如运动功能障碍(例如，抖动、僵硬、运动缓慢、行走困难、瘫痪)、认知功能障碍(例如，痴呆、抑郁、焦虑、精神病)、记忆困难、以及情绪和行为功能障碍。
本公开部分地基于用于在受试者中表达一种或多种PD相关基因产物的组合物，所述一种或多种PD相关基因产物一起(例如协同地)发挥作用以治疗帕金森病。
因此，在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或rAAV的组合物)。
本公开部分地基于用于在受试者中表达一种或多种CNS疾病相关基因产物以治疗戈谢病(GD)的组合物。GD的诊断通过在GBA1中双等位基因致病性突变的存在或外周血白细胞中小于15％的正常GCase活性的发现来确定。引起更深远的酶缺乏的GBA1突变与疾病的更早发作、症状的更快进展和发展神经症状的较高可能性相关(Svennerholm等人,ClinGenet.1986；30(2):131-5；Cox,Biologics.2010；4:299-313)。GD在传统上已经被细分为通过神经学表现的存在来区分的三种更广泛的表型(神经元病性[2型GD和3型GD；nGD]或非神经元病性[1型GD])。
在nGD内，2型GD和3型GD之间的区别可以代表CNS和内脏症状的急性到慢性表现的表型连续体。患有2型GD的婴儿，称为急性神经元病性形式，典型地表现为早期延髓体征(诸如斜视和/或吞咽困难)、角弓反张或痉挛状态、核上性凝视麻痹、以及无法实现运动、行为和认知里程碑。大多数儿童在2岁时死亡(Goker-Alpan等人,J Pediatr.2003；143(2):273-6；Roshan和Sidransky,Diseases.2017；5(1):pii:E10)。在3型GD中，标志性临床体征是缓慢的水平核上性凝视麻痹，具有范围从认知损害到共济失调到癫痫发作到儿童期或青春期早期死亡的其他神经学表现(Goker-Alpan等人,J Pediatr.2003；143(2):273-6；Tylki-Szymańska等人,J Inherit Metab Dis.2010；33(4):339-46)。
因此，在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有神经元病性戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或rAAV的组合物)。
在一些方面，本公开提供了用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的神经症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，2型戈谢病或3型戈谢病的神经症状为核上性凝视麻痹、张力减退、癫痫发作、痉挛状态、运动功能减退、运动或行为发育延迟或损伤、认知延迟或损伤、共济失调、意向震颤或僵硬。
在一些实施方案中，患有某些形式的戈谢病的患者表现出周围神经病的症状，例如，如Biegstraaten等人(2010)Brain 133(10):2909–2919所述。在一些实施方案中，本公开提供用于治疗患有戈谢病(例如，1型戈谢病)的受试者中的周围神经病变的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，本公开提供用于治疗受试者中的1型戈谢病的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，将所述rAAV静脉内地施用于所述受试者以治疗1型戈谢病。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有具有葡糖脑苷脂酶1(GBA1)突变(例如，致病性GBA1突变)的帕金森病(PD)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有具有GBA1突变的PD的受试者的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含含有表达构建体的核酸，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的序列可操作地连接的启动子，其中所述编码Gcase蛋白的序列包含SEQ ID NO:15；并且其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，PD的运动症状是静止性震颤、运动徐缓、僵硬或步态困难。在一些实施方案中，PD的非运动症状是认知损害/痴呆、抑郁、妄想/幻觉、精神病、睡眠障碍、便秘、泌尿症状、疼痛、嗅觉丧失、吞咽困难或低血压。在一些实施方案中，患有PD的受试者具有一个GBA1突变。在一些实施方案中，患有PD的受试者具有两个GBA1突变。
在一些实施方案中，用于治疗1型戈谢病、2型戈谢病或3型戈谢病或具有GBA1突变的帕金森病的编码Gcase蛋白的rAAV从以约1×1012个载体基因组(vg)至约1×1015vg、或从约1×1013vg至约5×1014vg、或从约5×1013vg至约5×1014vg、或从约3.4×1013vg至约1×1014vg、或从约1×1014vg至约5×1014vg、或从约1×1014vg至约3×1014vg、或从约1×1014vg至约2×1014vg范围内的剂量施用于受试者。总剂量假定成人脑质量为1.3kg(Hakim和Mathieson,Neurology,1979；29(9 Pt1):1209-14)。对于儿科受试者，可以相应地调整剂量。在一些实施方案中，儿科受试者的剂量可以使用按年龄估计的脑重量(例如，基于包括从21篇尸检和神经成像出版物中推导出的脑重量的复合数据集合)来进行调整(Vannucci和Vannucci,Am J Phys Anthropol.2019；168(2):247-61)。
在一些实施方案中，用于治疗具有GBA1突变的帕金森病的编码Gcase蛋白的rAAV以约1×1014vg、约2×1014vg、约3×1014vg、约4×1014vg、或约5×1014vg的剂量施用于受试者(例如，人类成人受试者)。在一些实施方案中，用于治疗具有GBA1突变的帕金森病的rAAV以约1×1014vg(约7.7×1010vg/g脑)、约2×1014vg(约1.5×1011vg/g脑)、或约3×1014vg(约1.9×1011vg/g脑)的剂量施用于受试者(例如，人类成人受试者)。
在一些实施方案中，将用于治疗2型或3型戈谢病的编码Gcase蛋白的rAAV以约5×1010vg/g脑至约5×1011vg/g脑范围内的剂量施用于受试者(例如，人类儿科受试者)。在一些实施方案中，用于治疗2型戈谢病或3型戈谢病的rAAV以约1.3×1011vg/g脑(从约5.9×1013vg至约1.7×1014vg)的剂量施用于受试者(例如，人类儿科受试者)。在一些实施方案中，用于治疗2型戈谢病或3型戈谢病的rAAV以约1.9×1011vg/g脑(从约8.6×1013vg至约2.5×1014vg)的剂量施用于受试者(例如，人类儿科受试者)。在一些实施方案中，用于治疗2型戈谢病或3型戈谢病的rAAV以约7.7×1010vg/g脑(从约3.4×1013vg至约1×1014vg)的剂量或约2.3×1011vg/g脑(从约1×1014vg至约3×1014vg)的剂量施用于受试者(例如，人类儿科受试者)。
在一些实施方案中，将用于治疗1型、2型或3型戈谢病或具有GBA1突变的帕金森病的编码Gcase蛋白的rAAV以单剂量施用于受试者，并且随后不将rAAV施用于受试者。
在一些实施方案中，编码Gcase蛋白的rAAV经由单次枕骨下注射施用到小脑延髓池内。在一些实施方案中，注射到小脑延髓池中是在放射摄影引导下进行的。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含含有表达构建体的核酸的rAAV，所述表达构建体包含转基因，所述转基因包含(a)含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；和(b)含有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:47的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有多系统萎缩症、帕金森病、具有GBA1突变的帕金森病、路易体病、路易体痴呆、具有GBA1突变的路易体痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底综合征的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含含有表达构建体的核酸的rAAV，所述表达构建体包含转基因，所述转基因包含(a)含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；和(b)含有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:47的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含含有表达构建体的核酸的rAAV，所述表达构建体包含转基因，所述转基因包含含有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:47的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有多系统萎缩症、帕金森病、具有GBA1突变的帕金森病、路易体病、路易体痴呆、具有GBA1突变的路易体痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底综合征的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含含有表达构建体的核酸的rAAV，所述表达构建体包含转基因，所述转基因包含含有SEQ ID NO:20或SEQID NO:47的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；其中所述rAAV包含具有AAV9血清型的衣壳蛋白。
受试者通常是哺乳动物，优选人。在一些实施方案中，受试者的年龄在1月龄与10岁之间(例如，1月龄、2月龄、3月龄、4月龄、5月龄、6月龄、7月龄、8月龄、9月龄、10月龄、11月龄、12月龄、13月龄、14月龄、15月龄、16月龄、17月龄、18月龄、19月龄、20月龄、21月龄、22月龄、23月龄、24月龄、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁或其间的任何年龄)。在一些实施方案中，受试者在2岁与20岁之间。在一些实施方案中，受试者在30岁与100岁之间。在一些实施方案中，受试者大于55岁。
在一些实施方案中，将组合物直接施用于受试者的CNS，例如通过直接注射到受试者的脑和/或脊髓中。CNS-直接施用形式的实例包括但不限于脑内注射、心室内注射、池内注射、实质内注射、鞘内注射和前述各项的任何组合。在一些实施方案中，组合物通过小脑延髓池内(ICM)注射施用于受试者。在一些实施方案中，直接注射到受试者的CNS中导致受试者的中脑、纹状体和/或大脑皮质中的转基因表达(例如，第一基因产物、第二基因产物和如果适用的话第三基因产物的表达)。在一些实施方案中，直接注射到CNS中导致受试者的脊髓和/或CSF中的转基因表达(例如，第一基因产物、第二基因产物和如果适用的话第三基因产物的表达)。
在一些实施方案中，直接注射至受试者的CNS包括对流增强递送(CED)。对流增强递送是一种治疗策略，其涉及手术暴露脑和将小直径导管直接放置到脑的目标区域中，随后将治疗剂(例如，如本文所述的组合物或rAAV)直接输注到受试者的脑中。例如Debinski等人(2009)Expert Rev Neurother.9(10):1519-27等人对CED进行了描述。
在一些实施方案中，将组合物外周地(例如通过外周注射)施用于受试者。外周注射的实例包括皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射或前述各项的任何组合。在一些实施方案中，外周注射是动脉内注射，例如注射到受试者的颈动脉中。
在一些实施方案中，将如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或rAAV的组合物)外周地和直接地施用至受试者的CNS。例如，在一些实施方案中，通过动脉内注射(例如，注射到颈动脉中)和通过实质内注射(例如，通过CED的实质内注射)向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向CNS的直接注射和外周注射是同时的(例如，同时发生)。在一些实施方案中，直接注射发生在外周注射之前(例如，之前1分钟与1周之间或更长时间)。在一些实施方案中，直接注射发生在外周注射之后(例如，之后1分钟与1周之间、或更长时间)。
在一些实施方案中，在如本文所述的组合物之前(例如，之前1个月与1分钟之间)或同时向受试者施用免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂是皮质类固醇(例如，泼尼松、布地奈德等)、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司等)、抗体(例如，阿达木单抗、依那西普、那他珠单抗等)或甲氨蝶呤。
向受试者施用的如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或rAAV的组合物)的量将根据施用方法而变化。例如，在一些实施方案中，将如本文所述的rAAV以约109个基因组拷贝(GC)/kg至约1014GC/kg(例如，约109GC/kg、约1010GC/kg、约1011GC/kg、约1012GC/kg、约1012GC/kg、或约1014GC/kg)的滴度施用于受试者。在一些实施方案中，通过注射至CSF空间或通过实质内注射向受试者施用高滴度(例如，>1012个基因组拷贝GC/kg)的rAAV。在一些实施方案中，将如本文所述的rAAV通过静脉内注射以从约1×1010个载体基因组(vg)至约1×1017vg范围内的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，将如本文所述的rAAV通过注射到小脑延髓池中以从约1×1010vg至约1×1016vg范围内的剂量施用于受试者。
如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或rAAV的组合物)可以一次或多次(例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、20次或更多次)施用于受试者。在一些实施方案中，例如经由输注泵连续地(例如长期地)向受试者施用组合物。
实施例
实施例1：rAAV载体
使用诸如HEK293细胞的细胞产生AAV载体以用于三质粒转染。ITR序列位于表达构建体的侧翼，所述表达构建体包含每种所关注转基因的启动子/增强子元件、3'聚A信号和翻译后信号诸如WPRE元件。通过融合蛋白质序列；或使用2A肽接头，诸如T2A或P2A，其由于防止肽键的产生而导致具有添加的氨基酸的2个肽片段；或使用IRES元件；或通过用2个分开的表达盒表达可以同时表达多种基因产物，诸如GBA1和LIMP2和/或鞘脂激活蛋白原。在所表达的基因的上游存在可有效剪接的短内含子序列可以提高表达水平。shRNA和其他调控RNA可能也包括在这些序列内。包含本公开所描述的rAAV载体的质粒的实例显示于图1-6、图21-27和图55-58以及下表2中。
表2
Figure BDA0003391213180000501
Figure BDA0003391213180000511
实施例2：病毒转导到GBA缺陷型细胞中的基于细胞的测定
获得GBA1缺陷的细胞，例如作为来自GD患者的成纤维细胞、单核细胞或hES细胞、或患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)。这些细胞积累底物诸如葡糖神经酰胺和葡糖基鞘氨醇(GluCer和GluSph)。用Gcase抑制剂诸如CBE处理野生型或突变型培养细胞系也用于获得GBA缺陷型细胞。
使用此类细胞模型，根据蛋白质聚集体(诸如具有针对该蛋白质的抗体的α突触核蛋白或磷酸-αSyn的)的积累，对溶酶体缺陷进行定量，随后使用荧光显微镜进行成像。还通过ICC对蛋白质标志物诸如LAMP1、LAMP2、LIMP1、LIMP2，或使用染料诸如Lysotracker，或通过经荧光葡聚糖的胞吞区室摄取或其他标志物进行溶酶体异常的成像。还可以进行由于与溶酶体(诸如LC3)的缺陷性融合而导致的自噬标志物积累的成像。将Western印迹和/或ELISA用于定量这些标志物的异常积累。此外，使用标准方法测量糖脂底物和GBA1产物的积累。
在AAV载体转导的表达的情况下测量治疗终点(例如，PD相关病理的减少)，以确认和定量活性和功能。还可以使用蛋白质ELISA量度或通过标准Gcase活性测定来定量Gcase。
实施例2.1：编码Gcase的rAAV的体外药理学研究
转导和效力
评价包含人GBA1的密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:15)的PR001A(AAV9.CBA.GBA1.A)(图55中提供的编码载体的质粒的示意图)在HEK293T细胞中表达GBA1转基因的能力的体外研究证明了在HEK293T细胞中进行PR001A转导后GCase活性的剂量依赖性增加(图33)。
功效测量(α突触核蛋白)
还在HeLa细胞、人细胞系和原代小鼠海马体神经元中进行了体外研究。在用2×106vg/细胞PR001A处理的HeLa细胞中，与赋形剂处理的对照细胞相比，观察到GCase活性水平增加大约2倍和总α突触核蛋白水平降低(图34A和图34B)。用较低剂量的PR001A没有观察到类似的效果。
用1.3×105vg/细胞或1.3×106vg/细胞PR001A转导的小鼠海马体神经元显示增加的GCase活性水平并且趋向于降低总α突触核蛋白水平(图35A和图35B)。
总之，细胞系和原代神经元培养物中的PR001A转导导致GCase活性增加。在HeLa细胞和小鼠海马体神经元中，PR001A转导也导致α突触核蛋白水平降低，支持在GCase活性和α突触核蛋白水平之间的联系(Mazzulli等人,Cell.2011；146(1):37-52)。
实施例3：使用突变小鼠的体内测定
本实施例描述了使用突变型小鼠的AAV载体的体内测定。上述AAV载体在突变型小鼠中的体内研究使用例如以下文献所描述的测定来进行：Liou等人(2006)J.Biol.Chem.281(7):4242–4253；Sun等人(2005)J.Lipid Res.46:2102–2113；以及Farfel-Becker等人(2011)Dis.Model Mech.4(6):746–752。
使用浓缩的AAV储备液，例如以5-10μL之间的注射体积，进行媒介物对照和AAV载体的鞘内或心室内递送(例如，以2×1011vg/小鼠的剂量)。通过对流增强递送进行实质内递送。
在症状发作之前或发作之后开始治疗。所测量的终点是底物在CNS和CSF中的积累、通过ELISA的Gcase酶和酶活性的积累、运动和认知终点、溶酶体功能障碍，以及α突触核蛋白单体、初原纤维或原纤维的积累。
实施例4：疾病的化学模型
本实施例描述了使用戈谢病的化学诱导的小鼠模型(例如，CBE小鼠模型)的AAV载体的体内测定。这些AAV载体的体内研究在戈谢病的化学诱导的小鼠模型中进行，例如，如Vardi等人(2016)J Pathol.239(4):496-509所述。
使用浓缩的AAV储备液，例如用5-10μL之间的注射体积，进行媒介物对照和AAV载体的鞘内或心室内递送(例如，以2×1011vg/小鼠的剂量)。通过对流增强递送进行实质内递送。通过尾静脉注射实现外周递送。
在症状发作之前或发作之后开始治疗。所测量的终点是底物在CNS和CSF中的积累、通过ELISA的Gcase酶和酶活性的积累、运动和认知终点、溶酶体功能障碍、以及α突触核蛋白单体、初原纤维或原纤维的积累。
实施例5：PD、LBD、戈谢病患者的临床试验
在一些实施方案中，患有某些形式的戈谢病(例如GD1)的患者发展帕金森病(PD)或路易体痴呆(LBD)的风险增加。本实施例描述了在患有戈谢病、PD和/或LBD的患者中评估如本公开所描述的rAAV的安全性和功效的临床试验。
使用类似于Grabowski等人(1995)Ann.Intern.Med.122(1):33-39所述的研究设计进行此类载体治疗戈谢病、PD和/或LBD的临床试验。
实施例6：外周疾病的治疗
在一些实施方案中，患有某些形式的戈谢病的患者表现出周围神经病的症状，例如，如Biegstraaten等人(2010)Brain 133(10):2909–2919所述。
本实施例描述了如本文所述的AAV载体用于治疗与戈谢病(例如，1型戈谢病)相关的周围神经病的体内测定。简言之，向鉴定为具有周围神经病的体征或症状的1型戈谢病患者施用如本公开所描述的rAAV。在一些实施方案中，在施用rAAV之后，例如使用Biegstraaten等人所描述的方法监测受试者的外周神经病体征和症状。
例如通过Western印迹分析、酶促功能测定或成像研究来测定在患者中(例如，在患者的血清中，在患者的外周组织(例如，肝组织、脾组织等)中)存在的如本公开所描述的所转导的基因产物的水平。
实施例7：CNS形式的治疗
本实施例描述了如本文所述的rAAV用于治疗CNS形式的戈谢病的体内测定。简言之，向鉴定为患有CNS形式的戈谢病(例如，2型或3型戈谢病)的戈谢病患者施用如本公开所描述的rAAV。例如通过Western印迹分析、酶促功能测定或成像研究来测定在患者CNS中(例如患者CNS的血清中、在患者的脑脊液(CSF)中或在患者的CNS组织中)存在的如本公开所描述的所转导的基因产物的水平。
实施例8：在具有GBA1突变的受试者中的帕金森病的基因疗法
本实施例描述了将编码GBA1的重组腺相关病毒(rAAV)施用于患有以GBA1基因突变为特征的帕金森病的受试者。
rAAV载体插入物含有CBA启动子元件(CBA)，其由四个部分组成：CMV增强子(CMVe)、CBA启动子(CBAp)、外显子1和内含子(int)以组成型表达人GBA1(栗色)的密码子优化的编码序列(CDS)。3'区还含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)转录后调控元件，其后是牛生长激素聚A信号(bGH聚A)尾。侧翼ITR允许间插序列的正确包装。评价了5'ITR序列的两个变体(图7，插入框，底部序列)；这些变体在ITR的20个核苷酸“D”区内具有几个核苷酸差异，这被认为影响包装和表达的效率。rAAV产物含有图7中所示的“D”结构域核苷酸序列(插入框，顶部序列)。变体载体具有突变的“D”结构域(本文中称为“S”结构域，其中核苷酸变化通过阴影显示)，其在临床前研究中类似地进行。主链含有赋予卡那霉素抗性的基因以及防止反向包装的填充序列。图8显示了描绘rAAV载体的示意图。使用AAV9血清型衣壳蛋白将rAAV载体包装成rAAV。
将GBA1-rAAV作为单剂量经由荧光透视引导的枕骨下注射到小脑延髓池(小脑延髓池内；ICM)施用于受试者。给药方案研究的一个实施方案如下：
实施例8.1：编码Gcase的rAAV的体内药理学研究
在化学小鼠模型中进行初始研究，其包括每日递送作为GCase抑制剂的环己烯四醇-β-环氧化物(CBE)以评估包含人GBA1的密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:15)的PR001A rAAV载体(AAV9.CBA.GBA1.A)(图55中提供的编码载体的质粒的示意图)和PR001BrAAV S变体构建体(如下文进一步所述)的功效和安全性。另外，在携带纯合的GBA1突变且鞘脂激活蛋白部分缺陷(4L/PS-NA)的遗传小鼠模型中进行初始研究。在小鼠和非人灵长类动物(NHP)中进行另外的剂量范围研究以进一步评价载体安全性和功效。
这些小鼠模型表现出nGD(神经元病性戈谢病)和PD-GBA(具有以GBA1基因的突变为特征的帕金森病)的表型特征，包括降低的GCase活性、GCase的糖脂底物的积累、运动行为缺陷和反映炎症的神经病理学变化(包括星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生)。脑室内注射PR001A抑制了所有这些疾病相关表型。另外，4L/PS-NA小鼠模型显示出α突触核蛋白的积累，并且在4L/PS-NA模型中ICV施用PR001A减少了α突触核蛋白的积累。
测试AAV主链中5'反向末端重复序列(ITR)的两种略微不同的型式以评估可制造性和转基因表达(图7)。在145bp 5’ITR内的20bp“D”结构域被认为是最佳病毒载体生产所必需的，但也已报道“D”结构域内的突变在一些情况下增加转基因表达。因此，除了具有完整“D”结构域的PR001A病毒载体之外，还评价了具有突变的D结构域(本文称为“S”结构域)的第二种载体形式(PR001B)。PR001A rAAV和变体PR001B rAAV两者都表达相同的转基因。虽然两种载体都产生如下文详述的在体内有效的病毒，但是选择含有野生型“D”结构域的PR001A rAAV用于进一步开发。
非临床体内药理学(功效)研究总结于表14中。总共完成了10项研究；在后续章节中详细讨论了4项主要研究。
实施例8.1.1：CBE小鼠模型研究
CBE模型的概述
在CBE化学小鼠模型中，使用GCase的选择性和不可逆共价竞争性抑制剂实现GCase活性的药理学抑制，导致糖脂(GluCer和GluSph)积累、神经病理学变化(包括星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生)、和运动行为缺陷(Manning-
Figure BDA0003391213180000571
等人,Neurotoxicology.2009；30(6):1127-32；Farfel-Becker et等人,Dis Model Mech.2011；4(6):746-52；Rocha等人,Antioxid Redox Signal.2015；23(6):550-64)。
CBE是GCase的药理学抑制剂，并且用CBE治疗的小鼠显示出与GCase功能丧失一致的表型。通过改变CBE剂量并因此改变体内GCase抑制的程度，有可能再现在不同GBA1相关病症中所见到的不同程度的酶缺乏，从而调节所得表型的严重性。出于这个原因，CBE小鼠模型与GCase缺乏的遗传模型相比具有显著的技术优势，使其成为有吸引力的PD-GBA模型。在CBE模型中GCase活性的全身性降低将人类疾病再现为PD-GBA患者呈现出在整个CNS和外周器官中的GCase活性降低。预期此模型将低估PR001A的作用，因为CBE将抑制内源性GCase活性以及由PR001A治疗产生的外源性GCase活性两者。
研究PRV-2017-001：CBE剂量范围研究
为了建立GCase缺乏的CBE模型，向幼年小鼠给药CBE，CBE是GCase的特异性抑制剂。从出生后第8天(P8)开始每天通过IP注射向小鼠给予CBE。测试三种不同的CBE剂量(25mg/kg、37.5mg/kg、50mg/kg)或每日腹膜内(IP)媒介物(PBS)以建立表现出行为表型的模型(图9A-图9F)。较高剂量的CBE以剂量依赖性方式导致致死率。用50mg/kg CBE治疗的所有小鼠死于P23，用37.5mg/kg CBE治疗的8只小鼠中有5只死于P27(图9A)。在用25mg/kgCBE治疗的小鼠中没有致死性。用CBE治疗的小鼠显示出不能增加与CBE剂量相关的体重。在P27，研究的活体部分结束时，在对照动物和用25或37.5mg/kg CBE治疗的动物之间的体重差异是统计学显著的；用50mg/kg CBE治疗的小鼠没有存活到P27(图9B、图9C)。然而注射CBE的小鼠在空旷场地测定中没有显示出一般的运动缺陷(以与给予PBS的小鼠相同的速度行进相同的距离；图9F)，CBE治疗的小鼠表现出运动协调和平衡缺陷，如通过疲劳转棒仪测定所测量的(图9D)。
在其最后一次CBE剂量后(P27，“第1天”)或在CBE停用三天后(P29，“第3天”)将存活至研究结束的小鼠处死。在给予25mg/kg CBE的小鼠皮质上进行脂质分析，以评价第1天和第3天群组中GCase底物的积累。与PBS治疗的对照相比，在CBE治疗的小鼠中GluSph和GalSph水平(在本实施例中以聚集体测量)显著积累，这与GCase不足一致(图9E)。
总之，每天IP注射25mg/kg CBE的剂量导致运动行为缺陷和GCase底物的积累(GluSph和GalSph水平的聚集)，这与对GCase活性的抑制一致。因此，选择25mg/kg剂量用于随后的研究，因为这再现了人类疾病的核心特征，同时允许更长的研究来评价载体的持久性。
研究PRV-2018-002：PR001B在CBE模型中的功效
基于上文所述的研究，选择25mg/kg CBE剂量，因为其产生行为缺陷而不影响存活。对于所有非临床小鼠研究，选择脑室内(ICV)注射作为施用途径(ROA)。由于在小鼠中小脑延髓池内(ICM)注射(预期的临床ROA)在技术上是困难的，因此ICV注射被认为是再现将治疗剂ICM递送到脑脊液(CSF)中的最合适的替代方法。为了在CBE治疗期间实现GBA1在整个脑中的广泛分布和转基因表达，在P3经由ICV注射递送4μL媒介物(dPBS+0.001％普朗尼克F68，“dPBS”)或8.8×109vg(5.9×1010vg/g脑，基于150mg的脑重量)PR001B，并且在P8开始每日IP注射PBS或25mg/kg CBE治疗(图10)。为了确定CBE治疗是否会完全地掩盖PR001B的作用，在P36(在动物最终CBE注射后1天)处死一半动物，而另一半经历CBE停用并在P38(在动物最终CBE注射后3天)处死。对于所有测量，将各组合并用于校正收集日作为协变量的分析。
经CBE治疗的小鼠显示出用PR001B治疗减弱的体重减轻演变(图11A；图11B)。接受rAAV的经CBE治疗的小鼠在疲劳转棒仪上的表现在统计学上显著好于接受赋形剂的小鼠(图11C)。在不同载体治疗组中的小鼠与赋形剂治疗的小鼠在测试期间行进的总距离方面没有差异(图11D)。
在活体研究完成时，在最后一次CBE剂量之后一天(P36，“第1天”)或在CBE停用三天之后(P38，“第3天”)处死一半小鼠用于生物化学分析(图12B-图12D)。使用生物学一式三份进行的荧光酶测定，评价皮质中的GCase活性。在用PR001B rAAV治疗的小鼠中GCase活性增加，而CBE治疗降低了GCase活性(图12B)。另外，接受CBE和PR001B rAAV两者的小鼠具有与PBS治疗组相似的GCase活性水平，表明rAAV的递送能够克服由CBE治疗诱导的GCase活性的抑制。对小鼠的运动皮质进行脂质分析以检测底物GluCer和GluSph的水平。给予CBE和rAAV治疗的小鼠脑中积累的脂质均显著减少了GluCer积累并倾向于减少GluSph积累(图12C；图12D)。
在治疗组中，脂质水平与GCase活性和在疲劳转棒仪上的表现均呈负相关。在rAAV施用之后增加的GCase活性与底物减少和增强的运动功能相关(图13)。
如图14所示，通过如借助qPCR所测量的载体基因组存在来评估初步生物分布(将>100个载体基因组/1μg基因组DNA定义为阳性)。接受PR001B rAAV(有和没有CBE两者)的小鼠在皮质中对于rAAV载体基因组呈阳性(图12A)，表明ICV递送导致rAAV递送至皮质。另外，在肝、脾、心脏和肺中检测到载体基因组，其中在肾中水平较低，而在性腺中没有(图14)。对于所有测量，在第1天组和第3天组之间没有统计学显著差异(数据未示出)。
总之，以8.8×109vg(5.9×1010vg/g脑)的剂量ICV注射，PR001B分布在脑和外周组织中，并且在脑中表达了酶促活性的GCase。PR001B改善了生物化学(即糖脂水平)缺陷和在疲劳转棒仪上的表现。因为CBE停用对于便于见到PR001B的作用不是必需的，所以在所有将来的研究中在最后一次CBE剂量后1天将小鼠处死。
研究PRV-2018-005：CBE模型中的剂量范围PR001A
图15A中提供了显示说明性剂量范围研究设计的示意图。
在CBE模型中进行的更大规模研究进一步探索了PR001 rAAV在CBE模型中的有效剂量。使用25mg/kg CBE剂量模型，在P3经由ICV递送赋形剂或PR001 rAAV，并且在P8开始每日IP PBS或CBE治疗。考虑到在先前研究中观察到的有和没有CBE停用的组之间的相似性，在最后一次CBE剂量(P38-40)后一天将所有小鼠处死。评估三种不同rAAV剂量的效果，产生以下五组，每组10只小鼠(5M/5F)：
赋形剂ICV+PBS IP
赋形剂ICV+25mg/kg CBE IP
2.0e9vg(1.3e10vg/g脑)rAAV ICV+25mg/kg CBE IP
6.2e10vg(4.2e10vg/g脑)rAAV ICV+25mg/kg CBE IP
2.0e10vg(1.3e11vg/g脑)rAAV ICV+25mg/kg CBE IP。
经CBE治疗的动物比对照动物以更低的速率增加体重，这是这种动物模型中的典型观察结果。在最高剂量下，PR001A校正了CBE治疗相关的体重增加失败。此外，与未接受PR001A的CBE治疗组相比，此剂量导致疲劳转棒仪和楔形横梁任务的统计学显著的改善(图15B-图15E)。脑GCase活性与疲劳转棒仪上的表现呈正相关。在几个组中观察到致死性，包括赋形剂治疗组和rAAV治疗组两者。
在活体研究完成时，将小鼠处死用于生物分布和生物化学分析(图16A-图16D)。在所检查的组织中，脑、脊髓、肝、脾、心脏、肾和肺在中剂量和最高剂量下对载体基因组呈阳性。脑、脊髓、肺和心脏在低剂量下也呈阳性(图16A)。在任何剂量下性腺都不呈阳性。通过使用荧光测定法测量所有组织中的酶促活性评价的有效GCase活性在用CBE治疗后降低了高达60％(图16B)。在PR001A的最高剂量下，GCase活性在脑、脊髓和心脏中显著增加。注意，因为CBE治疗以与内源性GCase相同的程度抑制PR001A编码的GCase的活性达到大约50％，所以CBE模型研究可能低估了如通过GCase活性所测量的PR001A的效力大约2倍。CBE治疗的小鼠在大脑皮质中表现出GluCer和GluSph的积累。高剂量的PR001A减少了它们的积累(图16C；图16D)。
反应性星形胶质细胞增生和小胶质细胞激活是在神经元病性GD和PD-GBA患者中所描述的CNS病理学的突出炎症方面(Wong等人2004；Ginns等人2014)。在此研究中，CBE治疗的小鼠在大脑皮质中显示出胶质瘢痕形成(反应性星形胶质细胞增生的表现)，与在CBE的背景下显示出CNS激活的先前研究一致(Sun等人2011)。PR001A治疗导致统计学上显著的剂量依赖性的胶质瘢痕形成表型减少(图16E)。因此，PR001治疗抑制与CNS中的GCase缺乏相关的神经病理学。在毒理学章节中讨论了本研究的组织病理学发现的完整描述。
对GCase和离子化钙结合衔接分子1(Iba1；小胶质细胞增生的标志物)在皮质中的表达进行了免疫组织化学研究(图16F)(Wong等人2004；Vitner等人2016)。与CBE+赋形剂治疗的动物相比在用PR001A治疗的所有小鼠中GCase的表达显著增加，并且与所递送的剂量相关。与接受CBE+赋形剂的小鼠相比在用PR001A治疗的小鼠中Iba1染色以剂量依赖性方式显著减少，其中与接受PBS的小鼠相比，Iba1染色显著增加。
总之，研究PRV-2018-005的结果显示，以3个剂量水平ICV施用PR001A导致广泛的载体基因组生物分布、GCase活性增加、运动行为终点改善和糖脂积累减少。神经炎症的两种不同测量(小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生)显示在用PR001A治疗的小鼠中剂量依赖性的统计学上显著的减少。CBE模型固有地低估了PR001A的效力，因为CBE还抑制了由PR001A治疗引起的酶活性。总之，这些结果表明以2.0×1010vg(1.3×1011vg/g脑)ICV施用PR001A在CBE小鼠模型中是有效的。在较低剂量的PR001A下，在终点的子集中观察到趋于功效的趋势。
研究PRV-2018-007：CBE模型中的长期PR001A效应
本研究评估了PR001A载体拷贝数生物分布的持久性和在CBE小鼠模型中PR001A介导的GCase表达的持久性。在P3经由ICV递送了单剂量的赋形剂或PR001A，并且在P8开始每日IP PBS或CBE治疗，并且持续直至P183至P185(图36)。在最终CBE剂量后1天将所有小鼠处死。在任何组中都没有观察到致死性。
在CBE治疗的小鼠中PR001A的单一ICV剂量导致在给药后6个月载体基因组拷贝的存在(图37A)，其水平与在ICV给药后大约1个月观察到的水平相当(参见研究PRV-2018-005)。慢性CBE治疗导致GCase活性水平降低；GCase活性在接受PR001A的小鼠中几乎正常化，表明单剂量的PR001A导致GCase的持久表达(图37B)。与接受1个月CBE治疗的那些小鼠相比，六个月CBE治疗的小鼠显示出糖脂底物GluCer和GluSph在大脑皮质中的显著积累。在P3单次施用PR001A导致GluCer和GluSph水平显著降低至接近野生型水平(图37C；图37D)。
研究PRV-2018-008：CBE模型中的另外的剂量范围PR001A
本研究旨在评价另外剂量的PR001A以确定最小有效剂量并检查较高剂量的耐受性。然而，由于意想不到的给药偏差，本研究复制了PRV-2018-005的剂量。遵循与PRV-2018-005(图15A)类似的设计，在P3经由ICV递送4μL赋形剂或PR001A，并且在P8开始每日IP PBS或CBE治疗并且持续直到P51至P53。
与以前的研究不同，CBE治疗没有导致体重的显著变化。尽管CBE治疗导致在疲劳转棒仪和楔形横梁上的表现显著较差，但是用PR001A治疗没有显著改变这种表现(图38A-图38E)。
在所检查的组织中，脑、脊髓、肝、心脏和肺在所有剂量水平下对于PR001A呈阳性。肾在中剂量和最高剂量下也呈阳性，而脾仅在最高剂量下呈阳性。还检查了性腺，但在任何剂量水平下都不呈阳性(图39)。仅在选择的器官中评估GCase活性。在大脑皮质中，低剂量和中剂量的PR001A使GCase活性水平恢复至相当于PBS+赋形剂水平或更高，但是这没有达到统计学显著性。与CBE+赋形剂治疗的动物中的水平相比，PR001A的高剂量趋向于GCase活性的显著增加(图40)。
与该模型中的其他研究一致，CBE治疗的小鼠表现出脑中GluSph和GluCer的积累，其通过施用PR001A而减少(图41；图41B)。以剂量依赖性方式，所有剂量的PR001A显著降低GluSph水平，而中剂量和高剂量显著降低GluCer水平。
本研究证实了来自PRV-2018-005的发现，表明PR001A治疗导致宽的生物分布和GCase活性的稳健升高，这显著降低了由CBE治疗引起的糖脂底物积累。本研究未复制PRV-2018-005中观察到的行为表型；然而，已知这些表型在小鼠中是可变的且不太可靠。
PRV-2018-025：在CBE模型中另外的剂量范围PR001A
鉴于PRV-2018-008中的研究偏倚，在CBE模型中进行了另外的研究，以扩展先前的剂量范围研究。PR001A的ICV给药和PBS或CBE的IP注射遵循与PRV-2018-005相同的方案。然而，此研究包括较低的PR001A剂量以检查最小有效剂量和较高剂量以检查耐受性。
在本研究中，CBE治疗没有导致随时间推移体重增加的失败；然而，在CBE+赋形剂动物中在疲劳转棒仪和楔形横梁两者中观察到运动表现的统计学显著降低。用5.2×1010vg的PR001A治疗显著改善了运动表现至与PBS+赋形剂动物几乎相同的水平。在用1.7×1010vgPR001A治疗的动物中也观察到改善，但是这没有达到显著性(图42A-图42D)。
在所有剂量下用PR001A治疗的动物的大脑皮质对于载体基因组都呈阳性，并且用5.2×1010vg PR001A治疗导致GCase活性的显著增加。用1.7×1010vg PR001A治疗恢复活性至接近野生型水平(图43A-图43B)，但是这没有达到统计学显著性。
与此模型中的其他研究一致，CBE治疗的小鼠表现出脑中GluSph和GluCer的积累，其通过施用1.7×1010vg或5.2×1010vg的PR001A而显著减少(图44A-图44B)。
本研究证实并扩展了CBE模型中以前研究的发现。尽管本研究未完全复制在PRV-2018-005中观察到的行为表型，但是在用1.7×1010vg PR001A的情况下在疲劳转棒仪和楔形横梁两者中都观察到不显著的改善，并且用5.2×1010vg PR001A治疗显著地改善了在两种任务中的表现。另外，在任一剂量下的治疗都降低了糖脂底物积累，证实了其他CBE研究的结果。
CBE模型研究的总结
来自CBE模型研究的结果显示，PR001A可以通过ICV注射有效地递送至CNS以及外周组织。在CNS内，PR001A的ICV递送导致GCase活性的一致增加、糖脂底物GluCer和GluSph的减少、胶质瘢痕形成的减少和一些运动缺陷的改善。这些效应在评估的情况下持续到治疗后6个月时。
实施例8.1.2：4L/PS-NA遗传小鼠模型研究
4L/PS-NA模型的概述
4L/PS-NA小鼠是已建立的GD和PD-GBA遗传模型(Sun等人,JLipid Res.2005；46(10):2102-13；Mazzulli等人,Cell.2011；146(1):37-52；Xu等人,Mol Genet Metab.2011；102(4):436-47)。这些小鼠对于GBA1中的V394L突变是纯合的并且另外具有在PSAP中的突变，所述PSAP编码GCase激活剂鞘脂激活蛋白(saposin)C；突变型GCase酶的存在和低水平的GCase激活剂鞘脂激活蛋白C一起导致GCase活性的严重降低、糖脂底物的积累以及运动行为缺陷。这些小鼠表现出运动强度、协调性和平衡缺陷，如它们在横梁行走、疲劳转棒仪和金属丝悬挂测定中的表现所证明的。通常，这些小鼠的寿命少于22周。本研究中的“对照”小鼠对于Gba1中的V394L突变是纯合的，但是对于内源性鞘脂激活蛋白原基因是野生型的，并且因此具有更适度的GCase活性降低。注意，因为用PR001A治疗对鞘脂激活蛋白C没有影响，所以在4L/PS-NA小鼠中获得的结果可能低估了在人类中的预测效果。在这些小鼠中用PR001A进行了两项研究。
研究PRV-2018-006：4L/PS-NA遗传模型中的PR001A
在研究PRV-2018-006中，将PR001A或赋形剂ICV递送至3至4周龄的4L/PS-NA小鼠中，并且在施用PR001A后15周将动物处死。施用一个剂量的3μL未稀释载体(总共1.5×1010vg；3.7×1010vg/g脑)(图45)。
在4L/PS-NA小鼠中观察到进行性运动缺陷，并且用PR001A治疗导致治疗后5周和9周的横梁行走的不显著改善。在治疗后15周，各组之间没有统计学显著的差异。在给药后大约15周对PR001A载体基因组在4L/PS-NA小鼠中的生物分布进行定量。所有所检查的组织，包括大脑皮质、脊髓、肝、肾、心脏、肺、脾和性腺对于载体基因组呈阳性。(图46)。使用荧光测定评价的在组织裂解物中GCase活性的分析揭示了在皮质和肝中有效GCase活性的显著增加(图47)。
相对于来自对照动物的裂解物，在来自4L/PS-NA小鼠的脑裂解物中存在统计学上显著的GluSph和GluCer积累。在4L/PS-NA小鼠中，用PR001A治疗导致GluSph积累的统计学显著减少和趋于GluCer减少的趋势(P＝0.16)(图48A；图48B)。
先前的研究已经证明了蛋白质α突触核蛋白在4L/PS-NA小鼠模型的皮质中的积累增加，这与GCase在α突触核蛋白病理学中的提议作用一致(Sun等人,J Lipid Res.2005；46(10):2102-13；Mazzulli等人,Cell.2011；146(1):37-52；Xu等人,Mol Genet Metab.2011；102(4):436-47)。生物化学地检查可溶性和不溶性α突触核蛋白的大脑皮质水平。在用赋形剂治疗的4L/PS-NA小鼠中，在大脑皮质中不溶性α突触核蛋白以及不溶性α突触核蛋白与可溶性α突触核蛋白的比率没有显著增加；用ICV PR001A治疗逆转了这些作用(分别为P＝0.19，P＝0.87)(图49A；图49B)。这些数据与实施例2.1中所述的证明α突触核蛋白积累减少的体外研究一致。
rAAV递送后4周评估了通过横梁行走测试确定的运动表现。与用赋形剂治疗的突变型小鼠相比，接受PR001A rAAV的突变型小鼠的组显示出更少的总滑动数和更少的每个速度下的滑动数的趋势，将运动功能恢复至接近野生型水平(图17)。
研究PRV-2018-011：4L/PS-NA遗传模型中的剂量范围的PR001A
使用4L/PS-NA小鼠的第二项研究使用与在研究PRV-2018-006中所使用的设计相似的设计探索PR001A剂量的范围(图50)。
在横梁行走测试中，4L/PS-NA小鼠的表现显著差于对照小鼠。当与在第18周用赋形剂治疗的4L/PS-NA小鼠相比，用2.9×1011vg、9.3×1010vg或2.9×1010vg PR001A治疗的4L/PS-NA小鼠显示出显著的改善(图51)。在更早的时间点，PR001A没有效果。在4L/PS-NA小鼠和对照小鼠之间疲劳转棒仪测试结果没有差异，并且PR001A治疗似乎对此结果没有影响。
所有PR001A治疗组对于皮质中的载体基因组均呈阳性。使用荧光测定评价的有效GCase活性在皮质中进行了测量，并且发现在用2.9×1011vg PR001A治疗的小鼠中显著增加(图52A；图52B)。
生物化学地检查可溶性和不溶性α突触核蛋白的大脑皮质和海马体水平。在4L/PS-NA小鼠和对照动物之间在这些水平上没有差异；文献中公开的报道已经显示出可变的α突触核蛋白表型。
在用赋形剂治疗的4L/PS-NA小鼠的小脑中存在统计学显著的GluSph和GluCer积累。用PR001A治疗导致降低的GluSph水平的剂量依赖性趋势和GluCer的统计学上显著的剂量依赖性降低(图53A；图53B)。
4L/PS-NA遗传小鼠模型的总结
尽管4L/PS-NA小鼠在2项研究中显示出关于测量表型的可变性，但是总体数据与CBE模型发现和公布的数据一致：GCase缺乏与糖脂底物水平增加和运动行为缺陷相关。用ICV PR001A治疗强烈减弱这些表型。在研究PRV-2018-006中，相对于对照小鼠在4L/PS-NA中大脑皮质中的不溶性α突触核蛋白水平非显著增加，如所公开的研究中所报道(Sun等人,J Lipid Res.2005；46(10):2102-13；Mazzulli等人,Cell.2011；146(1):37-52；Xu等人,Mol Genet Metab.2011；102(4):436-47)。用ICV PR001A治疗逆转了这种积累，与本文所公开的体外分析一致。总之，这些研究支持PR001A的临床开发。
实施例8.1.3：体内α-突触核蛋白模型研究
研究PRV-2018-019和PRV-2019-001：用CBE治疗的α突触核蛋白转基因小鼠中的 PR001A
为了进一步检查PR001A对α突触核蛋白病理学的作用，在dbl-PAC-Tg(SNCAA53T)；Snca-/-小鼠中进行了2项研究，所述小鼠对于Snca敲除背景(Snca编码鼠蛋白质α突触核蛋白)上的人PD相关α突触核蛋白A53T突变转基因纯合的。据报道，这些小鼠在6至12月龄之间显示出胃肠表型和轻微的运动异常，但在脑中没有广泛的α突触核蛋白病理学(Kuo等人,Hum Mol Genet.2010；19(9):1633-50)。在人α突触核蛋白A53T转基因小鼠模型中的先前研究已经报道了用CBE治疗此类小鼠导致升高的α突触核蛋白水平(Rockenstein等人,HumMol Genet.2016；25(13):2645-60；Papadopoulos等人,Hum Mol Genet.2018；27(10):1696-1710)。由于这些公开的发现，并且为了验证GCase缺乏在此模型中的作用，我们用CBE治疗这些小鼠。在9至10周龄时，经由ICV注射用10μL赋形剂或2.9×1011vg(7.4×1011vg/g脑，基于400mg脑重量)PR001A治疗小鼠。ICV治疗后两周，每天给予IP PBS或100mg/kg CBE，持续1周。
在大脑皮质中评估载体基因组的存在和GCase活性。对于PRV-2018-019，证实了在用CBE治疗的情况下的皮质糖脂底物增加，并且使用自动化毛细管Simple WesternTM免疫印迹系统在Jess仪器上评估了来自海马体裂解物的α突触核蛋白水平。观察到多个α突触核蛋白免疫反应条带，与单体和高分子量(HMW)种类的存在一致。用PR001A治疗CBE给药的α突触核蛋白转基因小鼠观察到HMWα突触核蛋白种类与单体α突触核蛋白水平的比率的统计学显著降低(图54A；图54B)。
非临床功效研究的总结
上述研究显示PR001A的单次ICV注射有效地将GBA1递送至小鼠的CNS和外周组织。在PD-GBA和nGD的两种动物模型中，PR001A提高了CNS中的GCase活性。增加的GCase活性减少了糖脂底物在脑中的积累；这些糖脂底物被提议作为预期临床试验的生物标志物结果量度。重要的是，这些益处在用PR001A单次治疗后持续至少6个月。CBE模型呈现反应性星形胶质细胞增生以及小胶质细胞增生，其是PD-GBA、nGD患者以及这些病症的动物模型中的典型组织病理学发现(Hamby和Sofroniew,Neurotherapeutics.2010；7(4):494-506；Farfel-Becker等人,Dis.Model Mech.2011；4(6):746–752；Farfel-Becker等人,Hum MolGenet.2011；20(7):1375-86；Booth等人,Trends Neurosci.2017；40(6):358-70；McMahon等人,Mol Genet Metab.2018；123(2):S93)。PR001A能够预防或逆转CBE诱导的反应性胶质增生和小胶质细胞增生。两种模型均显示运动缺陷，并且用PR001A治疗改善两种模型中的这些缺陷中的一些缺陷。与这两种模型一起，使用另外的小鼠模型研究α突触核蛋白病理学。尽管α突触核蛋白表型在小鼠模型中是可变的，但当观察到它们时，PR001A能够抑制或逆转表型；另外的体外研究支持PR001A在降低α突触核蛋白水平中的有效性。总之，这些研究支持PR001A在PD-GBA和nGD模型中的功效。
实施例8.1.4：毒理学
单剂量小鼠研究
在小鼠模型中用PR001A进行的安全性和毒理学研究总结于表15中。两个小鼠模型功效研究(PRV-2018-005和PRV-2018-006)还包括选择安全性终点诸如组织病理学以评价PR001A在疾病模型中的安全性。
研究PRV-2018-005：CBE模型中的剂量范围PR001A
通过脑、胸脊髓、心脏、肝、脾、肺和肾的苏木精和曙红(H&E)染色进行组织病理学分析；结果由委员会认证的兽医病理学家进行评价。在用CBE治疗的小鼠中，CNS中的发现包括在大脑皮质、脑干和胸脊髓中的胶质瘢痕和神经元坏死。高达1.3×1011vg/g的剂量下的脑室内PR001A在这些小鼠中耐受良好，并且此最高剂量导致这些CNS发现的发生率显著降低；低剂量和中剂量PR001A在大脑皮质中具有胶质瘢痕的动物数量方面具有剂量依赖性减少，对其他CNS发现诸如神经元坏死具有模棱两可的影响。在外周组织中没有观察到CBE或PR001A的不良反应。总之，在使用CBE小鼠模型的研究中，没有由于用PR001A治疗而引起的不良组织病理学发现或毒性证据。
实施例9：rAAV载体的体外分析
进行试点研究以评估单独的或与GBA1和/或一种或多种抑制性RNA组合的编码鞘脂激活蛋白原(PSAP)和SCARB2的rAAV载体的体外活性。还测试了编码PSAP和颗粒蛋白前体(PGRN)的一种构建体。所测试的载体包括表3中所示的那些。“Opt”是指为了在哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达而进行密码子优化的核酸序列。图18显示了表明与用模拟转染的细胞相比用每种构建体转染HEK293细胞导致对应基因产物的过表达的代表性数据。
表3
Figure BDA0003391213180000701
实施例10：ITR“D”序列放置和细胞转导
研究了放置ITR“D”序列对rAAV载体的细胞转导的影响。如图19所示，用编码Gcase的rAAV转导HEK 293细胞，所述编码Gcase的rAAV具有1)野生型ITR(例如，“D”序列在转基因插入物近侧且在ITR末端远侧)或2)具有位于载体“外部”的“D”序列(例如，在ITR末端近侧且在转基因插入物远侧的“D”序列)的ITR。令人惊讶的是，数据表明具有位于“外部”位置的“D”序列的rAAV保留了有效地包装和转导细胞的能力(图20)。
实施例11：体内毒性研究
在出生后第3天经由4μl脑室内(ICV)注射向五十(50)只小鼠施用编码GBA1的rAAV。从出生后第8天到研究结束，取决于治疗组，所有小鼠接受每日腹膜内(IP)注射环己烯四醇B-环氧化物(CBE)或PBS。在动物最后一次IP剂量后24小时对动物实施安乐死。在安乐死后，收获靶组织，投下固定在冷冻的4％多聚甲醛中，并储存在4℃，然后送去组织病理学加工和评价。
在38-40天时实施安乐死的四十二(42)只动物的组织被修剪，加工并包埋在石蜡块中。然后将它们以～5μm切片，用苏木精和曙红(H&E)染色并固定在载玻片上进行评价。
没有由于用rAAV治疗引起的组织病理学发现或毒性的证据。在用环己烯四醇B-环氧化物(CBE)治疗的小鼠中，存在在中枢神经系统(CNS)中的包括在大脑皮质中的胶质瘢痕和神经元坏死、以及在脑干和胸脊髓中的神经元坏死在内的发现。高剂量rAAV治疗导致这些CNS发现的发生率显著降低，而低剂量和中剂量病毒具有大脑皮质中胶质瘢痕发生率的剂量依赖性降低，对其他CNS发现具有模棱两可的影响(图28)。
进行免疫组织化学研究以评估皮质中的GCase和Iba1表达(图29A-29B)。与CBE/赋形剂治疗的动物相比，在用rAAV-GBA1治疗的所有动物中GCase表达均显著增加。GCase表达的增加与所递送的剂量相关，在高剂量治疗的动物中观察到最高的GCase表达，然后是中和低剂量治疗的动物。Iba1(一种小胶质细胞增生的标志物)在用CBE/赋形剂治疗的动物中显著增加。所有剂量的rAAV-GBA1都减少Iba1染色，因此减轻CBE模型中的小胶质细胞增生。小胶质细胞增生是神经元病性GD和此病症模型中已充分描述的终点。
表4：神经退行性疾病的实例
Figure BDA0003391213180000711
Figure BDA0003391213180000721
表5：突触核蛋白病的实例
Figure BDA0003391213180000722
表6：tau蛋白病的实例
Figure BDA0003391213180000723
表7：溶酶体贮积病的实例
Figure BDA0003391213180000731
实施例12：用编码Gcase的rAAV进行的非人灵长类动物研究
在非人灵长类动物(NHP)中体内评价了包含人GBA1的密码子优化的编码序列(SEQID NO:15)的PR001A(AAV9.CBA.GBA1.A)的安全性。上文提供了PR001A组分的另外详细信息。NHP的脑与人的脑最相似，并且NHP脊髓和CSF体积和流量的解剖学特征允许ICM(小脑延髓池内)注射。由于与人的解剖学相似性，预期NHP研究将提供支持PR001A的临床给药的可靠的生物分布数据。
在食蟹猴(cynomolgus macaque)中在以下三项毒理学研究中评价了PR001A的安全性和生物分布(表8)：两项非GLP(良好实验室规范(Good Laboratory Practice))研究(PRV-2018-015和PRV-2019-005)和一项更大的21CFR58 GLP依从性研究(PRV-2018-016)。
表8：使用PR001A的NHP非临床安全性研究的概述
Figure BDA0003391213180000741
缩写：CBC，全血细胞计数；D，天数；GLP，良好实验室规范；ICM；小脑延髓池内；IPa，脑实质内；NHP，非人灵长类动物；ROA，施用途径；vg，载体基因组。
在NHP中进行了试点非GLP研究(PRV-2018-015)以证实在ICM施用后最终PR001A制品被递送至NHP脑。NHP中的GLP毒理学和生物分布研究(PRV-2018-016)评估了PR001A的安全性和生物分布。
在NHP中测试的剂量包括如通过所施用体积和测试制品滴度确定的最大可行剂量。此外，在GLP研究中还评价了较低剂量。选择GLP研究的时间点以评价在治疗之后但在峰值表达之前(第7天)、峰值表达开始时(第30天)和峰值后长期表达(第183天)的安全性。
研究PRV-2018-015：PR001A的非GLP NHP研究
在雄性食蟹猴中进行了PR001A的非GLP试点耐受性和生物分布研究。本研究的目的是验证在ICM递送后PR001A到达不同脑区域和主要外周器官的生物分布。选择处死的时间点，因为据预测允许对潜在的早期毒性进行有意义的测量以告知计划的GLP NHP毒理学研究，最值得注意的是通过功能性观察试验组合(FOB)测量的早期活体观察结果。对鞘内AAV递送的研究已经证实转基因表达在注射后2至3周达到峰值(Hinderer等人,MolTher.2014；22(12):2018-27；Hinderer等人,Mol Ther Methods Clin Dev.2014；1:14051；Hinderer等人,Mol Ther.2015；23(8)1298-307；Hinderer等人,Mol Genet Metab.2016；119(1-2):124-30)。因此，第18天的评价应检测由于注射程序引起的即刻毒性或对供试品的先天炎症反应，以及提供关于转基因生物分布和在与早期峰值表达对应的时间点的表达的信息。研究设计包括用与PR001A组合的雷帕霉素治疗(0.3mg/kg口服，第-3天至第18天)的组以确定免疫抑制是否将有益于减轻潜在毒性。为了增加脑中的转基因表达，研究中的一个组包括与ICM递送组合将PR001A直接脑实质内(IPa)施用到靶向双侧黑质致密部的中脑中。ICM剂量体积为0.5mL(这是根据给药经历的最大体积)，并且IPa剂量为双侧10μL，对于单独的ICM转化为1.47×1013vg的剂量，并且对于用ICM和IPa两者的治疗转化为1.53×1013vg的剂量。以74g的估计脑重计算，这转化为2.0×1011vg/g脑的ICM剂量，并且对于接受ICM施用以及IPa的组转化为2.1×1011vg/g脑的剂量。表9中提供了本研究设计的制表汇总。
表9：非GLP NHP研究PRV-2018-015的概述
Figure BDA0003391213180000761
缩写：FOB，功能性观察试验组合；GLP，良好实验室规范；H&E，苏木精和曙红；ICM；小脑延髓池内；Immunosupp，免疫抑制；IPa，脑实质内；MgCl2；氯化镁；NaCl，氯化钠；NHP，非人灵长类动物；qPCR，定量聚合酶链反应；ROA，施用途径；vg，载体基因组。
由两名独立的经委员会认证的兽医病理学家进行H&E分析，并且两者得出的结论均为无PR001A相关毒性发现。所观察到的脊髓变化可能是在ICM注射的时候的创伤的结果，并且被认为与PR001A无关。在非神经系统组织中的所有组织病理学发现都被认为是在对照猴中常见的自发或偶然变化。总之，在脑或脊髓中没有明确的不良PR001A影响。
审查病理学家发现在脑膜、脑或脊髓实质中和/或在注射部位(在这些组织中)的非特异性变化(主要是单核细胞的可变浸润)可能与供试品相关，但病理学家认为这些变化不是不良事件。在注意到的严重性下，可以合理地预期在具有破坏脑膜和/或血脑屏障的实验程序的任何猴中观察到类似的浸润。另外，在对照猴中通常观察到一些浸润(特别是在脉络丛内和偶尔在实质中的那些浸润)(Butt等人,Toxicol Pathol.2015；43:513-8)。在赋形剂和PR001A治疗的动物中观察到的所有其他组织病理学发现被认为是偶然的和/或具有相似的发生率和严重性，并且因此被认为与施用PR001A无关。审查相同组织样品的第二名独立的经委员会认证的兽医病理学家注意到，所有发现与注射程序期间发生的偶然发现或创伤无法区分，因为发现是非特异性的并且是在所有组之间，包括仅接受赋形剂的对照组。此外，一名不同的经委员会认证的兽医病理学家审查了非GLP组织，并得出结论没有PR001A相关影响。
总体上，在研究过程期间不管组如何并且在时间点之间FOB得分、体重增加或食物消耗没有变化。中脑中的小胶质细胞形态在治疗组之间似乎没有差异(如用Iba1染色所确定的)。中脑的酪氨酸羟化酶阳性神经元的表达和形态在治疗组之间似乎没有差异。到第18天，AAV9-nAb滴度在所有PR001A治疗的动物中增加，而赋形剂治疗的对照动物与基线相比仅显示出适度的变化。与接受PR001A治疗的其他动物(>1:256)相比，接受口服雷帕霉素的组中的一只猴在第18天具有较低的AAV9 nAb滴度(1:64)；滴度的差异似乎并不影响生物分布，但样品量太低而无法得出结论。
使用定量聚合酶链反应(qPCR)在所收集的所有测试样品中评价了生物分布；认为具有至少100vg/μg DNA的组织呈阳性(这些标准也用于在小鼠功效研究中评估阳性组织)。在用PR001A治疗的所有组中所有测试的组织都呈阳性，表明在整个CNS和外周中广泛分布。此外，接受PR001A的ICM施用以及双侧IPa施用到中脑中的动物具有增加的局部表达。用雷帕霉素治疗似乎对安全性或生物分布没有任何影响(选定代表性区域示于图30中)。值得注意的是，如通过qPCR所确定，来自对照动物的几种组织(脑桥、脊髓、室旁、背根神经节和肺)也呈阳性。关于尸检程序注意到几个问题，其表明在不同治疗组中的动物之间和在每只动物内的不同器官之间交叉污染的风险增加。在尸检程序中实施了变更，以最小化未来研究的污染。然而，在对qPCR呈阳性的任何动物中都没有不良毒性发现。转基因表达(GCase活性)的分析表明，与对照相比，在PR001A治疗的动物中GCase活性没有显著增加；在GLP NHP毒性研究PRV-2018-016中更详细地探索了GCase活性。
总之，非GLP NHP研究PRV-2018-015的结果表明任何活体或死后评估均没有安全性或毒性问题。所有动物均存活至它们计划的尸检日期，并且死后病理学分析表明无不良毒性顾虑。该研究还显示PR001A在脑中的均匀生物分布。
研究PRV-2018-016：PR001A的GLP NHP研究
研究设计
本GLP研究的目的是评价PR001A在食蟹猴中经由ICM注射施用一次时的毒性和生物分布，其中施用后观察期为7天、30天或183天。本研究被设计为评价2种剂量水平：最高剂量是用1.2mL体积(根据给药经历的最大体积)的未稀释测试制品可达到的最大可行剂量，并且较低剂量比高剂量低了1/2对数单位。剂量为4.6×1012vg的低剂量和1.7×1013vg的高剂量；在食蟹猴中，脑重量估计为74g，这转化为大约6.2×1010vg/g脑和2.3×1011vg/g脑。该研究还包括对照组，其中动物仅接受1.2mL赋形剂(20mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、1mMMgCl2和0.001％[w/v]泊洛沙姆188)。本研究利用雄性和雌性食蟹猴。第7天组包括在最高剂量下的1只雄性，并被设计为早期毒性的前哨；其余2个时间点(第30天和第183天)包括在每个剂量下的2只雄性和1只雌性。除了来自多个脑区域的样品之外，收集外周组织样品用于qPCR分析。分析qPCR呈阳性的所有样品的转基因表达。表10中提供了本研究设计的制表汇总。
表10：GLP NHP研究PRV-2018-016的概述
Figure BDA0003391213180000791
Figure BDA0003391213180000801
Figure BDA0003391213180000811
缩写：CSF，脑脊液；DRG，背根神经节；F，雌性；GALT，肠相关淋巴组织；GLP，良好实验室规范；ICM；小脑延髓池内；M，雄性；MgCl2；氯化镁；NaCl，氯化钠；NHP，非人灵长类动物；qPCR，定量聚合酶链反应；vg，载体基因组。a 20mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、1mM MgCl2和0.001％(w/v)泊洛沙姆188。
通过多个活体观察和测量评估食蟹猴NHP，包括死亡率/发病率(每天)、临床观察(每天)、体重(基线和此后每周)、食物消耗的视觉检查(每天)、神经学观察(基线和在第2周和第26周期间)、间接检眼镜检查(基线和在第2周和第26周期间)和心电图测量(基线和在第2周和第26周期间)。
在基线时和在第7天、第30天或第183天处死时进行AAV9衣壳的nAb分析。基线时(血液检查；一次尿分析)进行两次和在给药阶段的第1周和第13周期间进行一次由血液学、凝血、临床化学和尿分析组成的临床病理学检查。
将动物实施安乐死，并在第7天、第30天或第183天收获组织。组织收集自所有动物，称重(如果适用)并分成重复样。一份重复样保存在10％中性缓冲福尔马林中(除非当最佳固定需要特殊固定剂时)用于组织病理学评价(所有动物)。收集另外的重复样用于qPCR和转基因表达分析。
安全性和毒性
所有动物均存活至预定的尸检日期，无意外死亡。任何组的活体评估均无顾虑或问题；尸检时总体肉眼检查显示在任何群组中均无PR001A相关异常。
在第7天或第30天中间处死时或在第183天终末处死时，在任何组中均未出现PR001A相关器官重量差异或肉眼检查或显微镜检查发现。在所有组(包括对照组)中均存在出血，其特征为主要在脑干区域中的血管周围出血的局灶性区域，因此被认为与手术相关(在尸检前进行CSF收集)，而与PR001A无关。所有其他显微镜检查结果(包括脑或脊髓中的最小单核浸润)被认为是自发的和/或偶然的，因为它们以低发生率发生，在各组(包括并行对照)之间随机分布，和/或它们的严重性与此年龄的猴所预期的一样；因此，认为它们与PR001A无关。
临床病理学测试结果未观察到PR001A相关发现；在表现出与针对载体的免疫应答一致的最高抗AAV9滴度的动物中注意到纤维蛋白原增加。在第7天在施用过PR001A的所有动物中观察到抗AAV9抗体的阳性滴度。未注意到PR001A相关临床观察结果、体重变化、眼科观察结果、或身体或神经学检查发现。在施用过任一剂量PR001A的仅雄性或组合两种性别中没有观察到平均PR间期、QRS持续时间、QT间期、校正QT(QTc)间期或心率的PR001A相关差异。未观察到PR001A相关心律失常或异常波形。
当经由在小脑延髓池单次注射施用于雄性和雌性猴时，0、6.2×1010或2.3×1011vg/g脑PR001A的剂量水平是良好耐受的。没有观察到被认为与PR001A中的基因产物相关的活体的临床病理学或解剖病理学观察结果。
生物分布和免疫应答
使用基于qPCR的测定(载体存在)进行载体基因组拷贝的生物分布分析；在对载体基因组存在呈阳性的样品中测量了转基因(GBA1)的表达。在第30天和第183天，所检查的所有组织(包括CNS和外周)在用高剂量(2.3×1011vg/g脑)治疗后通过qPCR分析呈阳性(第183天的选定代表性区域示于图30中)。在第30天，从睾丸和卵巢收集的组织样品在用高剂量PR001A(2.3×1011vg/g脑)治疗的所有NHP中对于转导呈阳性。此外，用低剂量PR001A(6.2×1010vg/g脑)治疗的1只雄性NHP在第30天在睾丸中呈阳性。在第183天，1只雄性和1只雌性在用高剂量治疗之后在性腺中对于PR001A转导呈阳性，并且用低剂量治疗的2只雄性在睾丸中呈阳性。
为了证实在经治疗的NHP中产生了人GCase，在Jess仪器上的Simple WesternTM免疫印迹系统上评价蛋白质水平。得自从用PR001A给药的NHP获得的皮质、海马体和中脑样品的结果表明，与来自仅接受赋形剂的正常NHP的样品相比，当以聚集体形式分析时，GCase表达水平升高；将低剂量组和高剂量组合并用于与对照组进行统计比较(图31A和图31B)。这些结果表明，在ICM施用后PR001A在NHP中的有效且广泛的转导导致GCase表达增加。
总之，生物分布发现表明，在NHP中ICM施用PR001A导致人GBA1转基因在脑和外周器官中的稳健且广泛的转导。在NHP生物分布数据的总结中，ICM施用PR001A导致遍及整个脑的广泛生物分布，其水平相当于在小鼠模型中显示为有效的水平；这种转导导致脑中GCase蛋白水平的升高。
研究PRV-2019-005：PR001A的非GLP NHP研究
研究设计
在12只雄性食蟹猴中进行非GLP研究以评价PR001A当经由ICM注射施用一次时的毒性和生物分布，其中施用后观察期为30天和90天。本研究被设计为评价单剂量水平：5.2×1013vg或7.0×1011vg/g脑，假设食蟹猴中的平均脑重量为74g。所施用剂量是用1.2mL体积(根据给药经历的最大体积)的未稀释PR001A制品可达到的最大可行剂量。该研究包括对照组，其中动物仅接受1.2mL赋形剂(20mM pH 8.0的Tris、200mM NaCl和1mM MgCl2+0.001％[w/v]普朗尼克F68)。收集来自多个脑区域和外周器官的样品用于qPCR分析以测量生物分布，并且进行临床病理学测量和组织病理学以评价安全性。表11中提供了本研究设计的制表汇总。
表11：非GLP NHP研究PRV-2019-005的概述
Figure BDA0003391213180000841
Figure BDA0003391213180000851
缩写：CSF，脑脊液；FOB，功能性观察试验组合；GLP，良好实验室规范；H&E，苏木精和曙红；NHP，非人灵长类动物；qPCR，定量聚合酶链反应；vg，载体基因组。
作为本研究的一部分，将组织固定在10％福尔马林中，包埋在石蜡中，并加工以产生H&E染色的载玻片。制备数字载玻片并由独立的经委员会认证的兽医病理学家进行检查。在治疗后第30天和第90天，
没有发现归因于用PR001A治疗，因为在PR001A治疗的动物中的发现与在食蟹猴中通常观察到的那些一致(Chamanza等人,Toxicol Pathol.2010；38(4):642-57)，和/或在媒介物对照动物和用PR001A治疗的动物两者中都观察到，因此被认为是偶然的。
施用于小脑延髓池的PR001A对体重增加或食物消耗没有影响，因为在研究过程期间在治疗组和对照组之间没有统计学差异。此外，不管组别如何并且在时间点之间FOB得分均无变化，表明在研究的活体阶段没有问题或顾虑。使用体外测定测量了抗AAV9的nAb的血浆水平。在基线(ICM施用前)和在处死时(第30天或第90天)从研究的动物中制备样品。在第30天和第90天，用PR001A治疗导致在基线和尸检时候之间AAV9 nAb滴度增加，而媒介物治疗的动物的总滴度保持稳定或降低。
PR001A的生物分布和表达
在使用qPCR收集的所有测试样品中评价PR001A转基因的生物分布；在用至少50vg/μg DNA(该测定的定量下限)的情况下认为组织呈阳性。在用PR001A治疗的所有组中所有测试的组织都呈阳性，表明在整个CNS和外周中广泛分布。图32中显示了来自第30天和第90天群组两者的选定代表性区域的数据。
总之，非GLP NHP研究PRV-2019-005的结果表明任何活体或死后评估均无安全性或毒性顾虑。所有动物均存活至它们计划的尸检日期，并且死后病理学分析表明无不良毒性顾虑。
在NHP中用PR001A进行的安全性和毒理学研究总结于表16中。
实施例13：人类受试者中的1/2期试验
具有GBA1突变的帕金森病
将在PR001A rAAV的随机化双盲假程序对照的试验中招募人类受试者。受试者入选标准包括：单或双等位基因GBA1突变、中度至重度帕金森病，并且在研究制品给药前稳定使用背景帕金森病药物。受试者将被分为两组：(1)PR001低剂量(1×1014vg)与安慰剂(N＝8，6:2)；以及(2)PR001高剂量(2×1014vg)与安慰剂(N＝8，6:2)。每名受试者将通过单次ICM(小脑延髓池内)注射接受研究性产品。试验将包括3个月生物标志物读数、12个月临床读数以及5年安全性和临床随访。试验将分析：(1)安全性和耐受性；(2)关键生物标志物，包括：Gcase，GluCer和GluSph(CSF和血液)；(3)另外的生物标志物，包括：α突触核蛋白、NfL(神经丝轻链)、DAT(多巴胺转运蛋白)、SPECT(单光子发射计算机断层扫描)；和MRI(磁共振成像)；以及(4)功效：MDS-UPDRS(运动障碍学会统一帕金森病评定量表(Movement DisordersSociety Unified Parkinson's disease Rating Scale))；认知；和ADL(日常生活活动)。
2型戈谢病
将在PR001A rAAV的开放标签试验中招募人类受试者(n＝15)。受试者入选标准包括：0-24个月大的婴儿；双等位基因GBA1突变；与2型戈谢病一致的神经体征和症状；以及稳定的护理标准背景药物。每名受试者将通过单次ICM(小脑延髓池内)注射接受研究性产品。试验将包括3个月生物标志物读数、12个月临床读数以及5年安全性和临床随访。试验将分析：(1)安全性和耐受性；(2)关键生物标志物，包括：Gcase，GluCer和GluSph(CSF和血液)；(3)至临床事件(例如，气管造口术、PEG(经皮内窥镜胃造口术)置入、死亡)发生的时间；以及(4)功效：行为、认知、大运动、功能、QoL(生活质量)。
实施例14：静脉内施用编码Gcase的rAAV的研究
在D409V Hom小鼠模型中进行PR001静脉内剂量范围研究。纯合的Gba1D409V/D409V(D409V Hom)小鼠(杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)，Bar Harbor,ME)显示出戈谢病相关的表型，包括降低的GCase活性(参见例如，Sardi等人,Proc Natl Acad Sci U SA.2011；108(29):12101-6)。图59中提供了研究设计。表12中提供了组别和剂量。
表12：D409V Hom小鼠中PR001静脉内施用研究的组别和剂量
Figure BDA0003391213180000881
Figure BDA0003391213180000882
从杰克逊实验室(Bar Harbor,ME)购买的野生型动物，而不是同窝。
静脉内施用PR001减少了肝中的炎症(图60A)。D409V Hom小鼠显示出肝中的糖脂积累，其通过PR001治疗以剂量依赖性方式被抑制(图60B；图60C)。D409V Hom小鼠显示出脑中的GluSph积累，其通过PR001治疗被减少(图61B)。静脉内施用PR001减少了肺中的炎症(图62)。
还在4L/PS-NA小鼠模型中进行了PR001静脉内剂量范围研究。图63中提供了研究设计。表13中提供了组别和剂量。
表13：4L/PS-NA小鼠中PR001静脉内施用研究的组别和剂量
Figure BDA0003391213180000883
Figure BDA0003391213180000891
4L/PS-NA小鼠显示出肝中的糖脂积累，其通过PR001治疗而被减少(图64A；图64B)。4L/PS-NA小鼠显示出脑中的糖脂积累，其通过PR001治疗而被减少(图65A；图65B)。
实施例15：编码靶向α突触核蛋白的抑制性RNA的rAAV的研究
用PR004或PR014以几个感染复数(MOI)转导HeLa细胞。PR004和PR014两者均以剂量依赖性方式降低α突触核蛋白的蛋白质水平(图66A)。PR004以剂量依赖性方式增加GCase活性(图66B)。
在来自帕金森病患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)的神经元培养物中评估了PR004功效。源自具有SNCA三倍体的帕金森病患者的诱导多能干细胞被分化成神经元(图67A)。用PR004转导的神经元具有增加的GCase活性(图67B)和降低的α突触核蛋白的蛋白质水平(图67C)。
没有观察到PR004 rAAV载体的脱靶效应。通过qRT-PCR在HEK293细胞中评估来自PR004载体的靶向SNCA的shRNA的脱靶效应。评价了序列上与SNCA的靶区域最相似的15个基因的表达(图68A)。还评价了SNCA家族成员β-和γ-突触核蛋白(分别为SNCB和SNCG)的表达(图68B)。这些基因的mRNA水平不受PR004影响。
在帕金森病的AAV2-SNCA-A53T AAV小鼠模型中评估了PR004功效(图69；图70)。将编码具有A53T突变的人SNCA的AAV2直接注射到成年野生型小鼠的黑质中。从注射后4周开始，动物表现出步态异常、多巴胺代谢改变、多巴胺能神经元丧失、神经炎症和磷酸化α突触核蛋白的表达。在PR004脑室内注射后4周(图71A)和9周(图71B)进行了自动化运动学步态分析(MotoRater)。在两个时间点均观察到PR004治疗效果的趋势。
本申请以引用方式整体并入以下文件的内容：国际PCT申请公开号WO 2019/070894；国际PCT申请公开号WO 2019/070891；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS)”的美国临时申请序列号62/567,311；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(GENE THERAPIES FORLYSOSOMAL DISORDERS)”的62/567,319；2018年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS)”的62/567,301；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS)”的62/567,310；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(GENETHERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS)”的62/567,303；和2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS)”的62/567,305。
已经如此描述了本发明的至少一个实施方案的若干方面，应当理解，本领域技术人员将容易地想到各种改变、修改和改进。此类改变、修改和改进旨在是本公开的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为实例。
虽然本文已经描述和说明了本发明的几个实施方案，但是本领域的普通技术人员将容易地想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一个被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造都意味着是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明的教导的一种或多种具体应用。本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明可以按不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料和/或方法不是相互不一致的，则两种或更多种此类特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围内。
如本文在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个”和“一种”应该理解为意指“至少一个”，除非清楚地相反指示。
如本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“任一者或两者”，即要素在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在。除了由“和/或”条款具体指明的要素之外可以任选地存在其他要素，无论与具体指明的那些要素相关还是不相关，除非明确地相反指示。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言诸如“包含”使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可以是指A而没有B(任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，指B而没有A(任选地包括除A以外的要素)；在再一个实施方案中，指A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中所用，“或”应理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含许多要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，另外的未列出的项目。清楚地相反指示的仅有术语，诸如“其中的仅一个”或“其中的确切地一个”，或当在权利要求中使用时，“由……组成”将是指包含许多要素或要素列表中的确切一个要素。一般而言，如本文所用的术语“或”应仅被解释为表示排他性替代物(即，“一个或另一个但不是两者”)，在其之前是排他性术语，诸如“任一个”、“其中的一个”、“其中的仅一个”或“其中的确切一个”。
如本文在说明书和权利要求中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素可以任选地存在，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以是指至少一个，任选地包括多于一个A，而没有B存在(并且任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个B而没有A存在(并且任选地包括除A以外的要素)；在再一个实施方案中，是指至少一个(任选地包括多于一个)A以及至少一个(任选地包括多于一个)B(以及任选地包括其他要素)；等等。
在权利要求中使用序数术语如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求要素，其本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先性、优先级或顺序或者其中执行方法行为的时间顺序，而是仅用作区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但使用序数术语)的标记，以区分权利要求要素。
还应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文所要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必限于陈述所述方法的步骤或动作的顺序。
在本申请中提及的每一个美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均以引用方式整体并入本文。
序列
在一些实施方案中，编码一种或多种基因产物(例如，第一、第二和/或第三基因产物)的表达盒包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48中任一者所示的序列或由其组成(或编码具有其的肽)。在一些实施方案中，基因产物由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48中任一者的一部分(例如片段)编码。
编号的实施方案
尽管有随附的权利要求，但是本公开提出了以下编号的实施方案：
1.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的Gcase蛋白的表达构建体，其中
(i)相对于野生型AAV2 ITR(SEQ ID NO:29)，所述ITR中的至少一个包含经修饰的“D”区；和/或
(ii)所述Gcase由密码子优化的核酸序列编码。
2.如实施方案1所述的分离的核酸，其中所述Gcase蛋白包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其部分。
3.如实施方案1或2所述的分离的核酸，其中所述Gcase蛋白由密码子优化的核酸序列、任选地如SEQ ID NO:15所示的核酸序列编码。
4.如实施方案1至3中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“D”区是相对于所述表达构建体位于所述ITR外部的“D”序列。
5.如实施方案1至4中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“D”序列的所述ITR是3'ITR。
6.如实施方案1至5中任一项所述的分离的核酸，其还包含TRY序列，任选地其中所述TRY序列如SEQ ID NO:28所示。
7.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的鞘脂激活蛋白原蛋白的表达构建体，其中
(i)相对于野生型AAV2 ITR(SEQ ID NO:29)，所述ITR中的至少一个包含经修饰的“D”区；和/或
(ii)所述鞘脂激活蛋白原由密码子优化的核酸序列编码。
8.如实施方案7所述的分离的核酸，其中所述鞘脂激活蛋白原蛋白包含如SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列或其部分。
9.如实施方案7或8所述的分离的核酸，其中所述鞘脂激活蛋白原蛋白由密码子优化的核酸序列、任选地如SEQ ID NO:17所示的核酸序列编码。
10.如实施方案7至9中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“D”区是相对于所述表达构建体位于所述ITR外部的“D”序列。
11.如实施方案7至10中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“D”序列的所述ITR是3'ITR。
12.如实施方案7至11中任一项所述的分离的核酸，其还包含TRY序列，任选地其中所述TRY序列如SEQ ID NO:28所示。
13.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的SCARB2蛋白的表达构建体，其中
(i)相对于野生型AAV2 ITR(SEQ ID NO:29)，所述ITR中的至少一个包含经修饰的“D”区；和/或
(ii)所述SCARB2由密码子优化的核酸序列编码。
14.如实施方案13所述的分离的核酸，其中所述SCARB2蛋白包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其部分。
15.如实施方案13或14所述的分离的核酸，其中所述SCARB2蛋白由密码子优化的核酸序列或如SEQ ID NO:19所示的核酸序列编码。
16.如实施方案13至15中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“D”区是相对于所述表达构建体位于所述ITR外部的“D”序列。
17.如实施方案13至16中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“D”序列的所述ITR是3'ITR。
18.如实施方案13至17中任一项所述的分离的核酸，其还包含TRY序列，任选地其中所述TRY序列如SEQ ID NO:28所示。
19.一种包含编码第一基因产物和第二基因产物的表达构建体的分离的核酸，其中每个基因产物独立地选自如表1中所示的基因产物或其部分。
20.如实施方案19所述的分离的核酸，其中所述第一基因产物是Gcase蛋白或其部分。
21.如实施方案19或实施方案20所述的分离的核酸，其中所述第二基因产物是LIMP2或其部分、或鞘脂激活蛋白原或其部分。
22.如实施方案19至21中任一项所述的分离的核酸，其还编码干扰核酸(例如shRNA、miRNA、dsRNA等)，任选地其中所述干扰核酸抑制α-Syn的表达。
23.如实施方案19至22中任一项所述的分离的核酸，其还包含一种或多种启动子，任选地其中所述一种或多种启动子中的每一种独立地为鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、CAG启动子、CD68启动子或JeT启动子。
24.如实施方案19至23中任一项所述的分离的核酸，其还包含内部核糖体进入位点(IRES)，任选地其中所述IRES位于所述第一基因产物和所述第二基因产物之间。
25.如实施方案19至23中任一项所述的分离的核酸，其还包含自切割肽编码序列，任选地其中所述自切割肽是T2A。
26.如实施方案19至24中任一项所述的分离的核酸，其中所述表达构建体包含位于所述第一基因产物和所述第二基因产物侧翼的两个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，任选地其中所述ITR序列中的一个缺乏功能性末端分辨位点。
27.如实施方案26所述的分离的核酸，其中相对于野生型AAV2ITR(SEQ ID NO:29)，所述ITR中的至少一个包含经修饰的“D”区。
28.如实施方案27所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“D”区是相对于所述表达构建体位于所述ITR外部的“D”序列。
29.如实施方案27或28所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“D”序列的所述ITR是3'ITR。
30.如实施方案27至29中任一项所述的分离的核酸，其还包含TRY序列，任选地其中所述TRY序列如SEQ ID NO:28所示。
31.如实施方案1至30中任一项所述的分离的核酸，其具有SEQ ID NO:1至12、14、16和18中任一者所示的序列。
32.一种载体，其包含如实施方案1至31中任一项所述的分离的核酸。
33.如实施方案32所述的载体，其中所述载体是质粒。
34.如实施方案32所述的载体，其中所述载体是病毒载体，任选地其中所述病毒载体是重组AAV(rAAV)载体或杆状病毒载体。
35.一种组合物，其包含如实施方案1至31中任一项所述的分离的核酸或如实施方案32至34中任一项所述的载体。
36.一种宿主细胞，其包含如实施方案1至31中任一项所述的分离的核酸或如实施方案32至34中任一项所述的载体。
37.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：
(i)衣壳蛋白；以及
(ii)如实施方案1至31中任一项所述的分离的核酸、或如实施方案32至34中任一项所述的载体。
38.如实施方案37所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白能够穿过血脑屏障，任选地其中所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白或AAVrh.10衣壳蛋白。
39.如实施方案37或实施方案38所述的rAAV，其中所述rAAV转导中枢神经系统(CNS)的神经元细胞和非神经元细胞。
40.一种用于治疗患有或疑似患有帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案1至31中任一项所述的分离的核酸、如实施方案32至34中任一项所述的载体、如实施方案35所述的组合物或如实施方案37至39中任一项所述的rAAV。
41.如实施方案40所述的方法，其中所述施用包括直接注射到所述受试者的CNS，任选地其中所述直接注射是脑内注射、实质内注射、鞘内注射、小脑延髓内注射或其任何组合。
42.如实施方案41所述的方法，其中直接注射到所述受试者的CNS包括对流增强递送(CED)。
43.如实施方案40至42中任一项所述的方法，其中所述施用包括外周注射，任选地其中所述外周注射是静脉内注射。
44.一种用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码葡糖脑苷脂酶(Gcase)蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
45.如实施方案44所述的方法，其中所述rAAV以从约5×1010vg/g脑至约5×1011vg/g脑的剂量施用于所述受试者。
46.如实施方案44所述的方法，其中所述rAAV以约1.3×1011vg/g脑的剂量施用于所述受试者。
47.一种用于治疗患有具有葡糖脑苷脂酶1(GBA1)突变的帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
47.如实施方案46所述的方法，其中所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于所述受试者。
48.如实施方案46所述的方法，其中所述rAAV以约1×1014vg或约2×1014vg的剂量施用于所述受试者。
49.如实施方案44-48中任一项所述的方法，其中所述rAAV经由枕骨下注射到小脑延髓池中来施用。
50.一种用于治疗患有1型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
51.如实施方案50所述的方法，其中所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于所述受试者。
52.如实施方案50或51所述的方法，其中所述rAAV经静脉内施用。
53.一种用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸包含含有转基因的表达构建体，所述转基因包含：
(a)含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；以及
(b)含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
54.一种用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含核酸的rAAV载体，所述核酸包含含有转基因的表达构建体，所述转基因包含含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
55.如实施方案53或54所述的方法，其中所述突触核蛋白病或帕金森症是多系统萎缩症、帕金森病、具有GBA1突变的帕金森病、路易体病、路易体痴呆、具有GBA1突变的路易体痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底综合征。
56.如实施方案44-55中任一项所述的方法，其中所述启动子是鸡β肌动蛋白(CBA)启动子。
57.如实施方案44-56中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含巨细胞病毒(CMV)增强子。
58.如实施方案44-57中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
59.如实施方案44-58中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含牛生长激素聚A信号尾。
60.如实施方案44-59中任一项所述的方法，其中所述核酸包含位于所述表达构建体侧翼的两个腺相关病毒反向末端重复(ITR)序列。
61.如实施方案60所述的方法，其中每个ITR序列是野生型AAV2ITR序列。
62.如实施方案44-61中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含在5'ITR与所述表达构建体之间的TRY区，其中所述TRY区包含SEQ ID NO:28。
63.一种用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸按5'至3'顺序包含：
(a)AAV2 ITR；
(b)CMV增强子；
(c)CBA启动子；
(d)编码Gcase蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(e)WPRE；
(f)牛生长激素聚A信号尾；以及
(g)AAV2 ITR；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白；
其中所述rAAV以从约5×1010vg/g脑至约5×1011vg/g脑范围内的剂量施用于受试者。
64.一种用于治疗患有具有GBA1突变的帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸按5'至3'顺序包含：
(a)AAV2 ITR；
(b)CMV增强子；
(c)CBA启动子；
(d)编码Gcase蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(e)WPRE；
(f)牛生长激素聚A信号尾；以及
(g)AAV2 ITR；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白；
其中所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于所述受试者。
65.如实施方案63或64所述的方法，其中所述rAAV经由枕骨下注射到小脑延髓池中来施用。
66.如实施方案44-52和63-65中任一项所述的方法，其中所述rAAV以包含约20mMpH 8.0的Tris、约1mM MgCl2、约200mM NaCl和约0.001％w/v泊洛沙姆188的制剂施用。
67.一种药物组合物，其包含：
(i)包含以下项的rAAV：
(a)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(b)AAV9衣壳蛋白；以及
(ii)约20mM pH 8.0的Tris，
(iii)约1mM MgCl2，
(iv)约200mM NaCl，和
(v)约0.001％w/v泊洛沙姆188。
68.一种rAAV，其包含：
(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的1型戈谢病、2型戈谢病、3型戈谢病或具有GBA1突变的帕金森病的方法中。
69.一种rAAV，其包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸包含表达构建体，所述表达构建体包含与转基因插入物可操作地连接的启动子，所述转基因插入物包含：
(a)含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；以及
(b)含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的突触核蛋白病或帕金森症的方法中。
70.一种rAAV，其包含：
(i)包含核酸的rAAV载体，所述核酸包含表达构建体，所述表达构建体包含与转基因插入物可操作地连接的启动子，所述转基因插入物包含含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的突触核蛋白病或帕金森症的方法中。
表14：非临床体内药理学(功效)研究的总结
Figure BDA0003391213180001041
Figure BDA0003391213180001051
缩写：CBE，环己烯四醇-β-环氧化物；CNS，中枢神经系统；GCase，葡糖脑苷脂酶；GluSph，葡糖基鞘氨醇；ICV，脑室内；vg，载体基因组。
a PR001B是PR001A的一种具有改变的D结构域的型式；PR001A和PR001B在其他方面是相同的。
表15：PR001A在小鼠有效性研究中的安全性评价的总结
Figure BDA0003391213180001052
Figure BDA0003391213180001061
缩写：CBE，环己烯四醇-β-环氧化物；ICV，脑室内；vg，载体基因组。
a PR001A治疗后
表16：PR001A在NHP安全性研究中的安全性评价的总结
Figure BDA0003391213180001062
缩写：GLP，良好实验室规范；ICM；小脑延髓池内；IPa，脑实质内；NHP，非人灵长类动物；vg，载体基因组。
序列表
<110> 普利维尔治疗公司(Prevail Therapeutics, Inc.)
<120> 用于溶酶体病症的基因疗法
<130> PRVL-009/02WO 334806-2090
<150> US 62/990,246
<151> 2020-03-16
<150> US 62/831,840
<151> 2019-04-10
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10697
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480
caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1020
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 1080
gcgcttggtt taatgacggc ttgttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg 1140
gagctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1200
acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcctcgaa gatccgaagg 1260
gaaagtcttc cacgactgtg ggatccgttc gaagatatca ccggttgagc caccatggaa 1320
ttcagcagcc ccagcagaga ggaatgcccc aagcctctga gccgggtgtc aatcatggcc 1380
ggatctctga caggactgct gctgcttcag gccgtgtctt gggcttctgg cgctagacct 1440
tgcatcccca agagcttcgg ctacagcagc gtcgtgtgcg tgtgcaatgc cacctactgc 1500
gacagcttcg accctcctac ctttcctgct ctgggcacct tcagcagata cgagagcacc 1560
agatccggca gacggatgga actgagcatg ggacccatcc aggccaatca cacaggcact 1620
ggcctgctgc tgacactgca gcctgagcag aaattccaga aagtgaaagg cttcggcgga 1680
gccatgacag atgccgccgc tctgaatatc ctggctctgt ctccaccagc tcagaacctg 1740
ctgctcaaga gctacttcag cgaggaaggc atcggctaca acatcatcag agtgcccatg 1800
gccagctgcg acttcagcat caggacctac acctacgccg acacacccga cgatttccag 1860
ctgcacaact tcagcctgcc tgaagaggac accaagctga agatccctct gatccacaga 1920
gccctgcagc tggcacaaag acccgtgtca ctgctggcct ctccatggac atctcccacc 1980
tggctgaaaa caaatggcgc cgtgaatggc aagggcagcc tgaaaggcca acctggcgac 2040
atctaccacc agacctgggc cagatacttc gtgaagttcc tggacgccta tgccgagcac 2100
aagctgcagt tttgggccgt gacagccgag aacgaacctt ctgctggact gctgagcggc 2160
tacccctttc agtgcctggg ctttacaccc gagcaccagc gggactttat cgcccgtgat 2220
ctgggaccca cactggccaa tagcacccac cataatgtgc ggctgctgat gctggacgac 2280
cagagactgc ttctgcccca ctgggctaaa gtggtgctga cagatcctga ggccgccaaa 2340
tacgtgcacg gaatcgccgt gcactggtat ctggactttc tggcccctgc caaggccaca 2400
ctgggagaga cacacagact gttccccaac accatgctgt tcgccagcga agcctgtgtg 2460
ggcagcaagt tttgggaaca gagcgtgcgg ctcggcagct gggatagagg catgcagtac 2520
agccacagca tcatcaccaa cctgctgtac cacgtcgtcg gctggaccga ctggaatctg 2580
gccctgaatc ctgaaggcgg ccctaactgg gtccgaaact tcgtggacag ccccatcatc 2640
gtggacatca ccaaggacac cttctacaag cagcccatgt tctaccacct gggacacttc 2700
agcaagttca tccccgaggg ctctcagcgc gttggactgg tggcttccca gaagaacgat 2760
ctggacgccg tggctctgat gcaccctgat ggatctgctg tggtggtggt cctgaaccgc 2820
agcagcaaag atgtgcccct gaccatcaag gatcccgccg tgggattcct ggaaacaatc 2880
agccctggct actccatcca cacctacctg tggcgtagac agtgacaatt gttaattaag 2940
tttaaaccct cgaggccgca agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga 3000
aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 3060
aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 3120
atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 3180
gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 3240
cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 3300
ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 3360
ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 3420
gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 3480
gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 3540
cctttgggcc gcctccccgc atcgataccg tcgactagag ctcgctgatc agcctcgact 3600
gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 3660
gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 3720
agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 3780
gaagacaata gcaggcatgc tggggagaga tccacgataa caaacagctt ttttggggtg 3840
aacatattga ctgaattccc tgcaggttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 3900
ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga 3960
gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc tgcggccgct 4020
cgtacggtct cgaggaattc ctgcaggata acttgccaac ctcattctaa aatgtatata 4080
gaagcccaaa agacaataac aaaaatattc ttgtagaaca aaatgggaaa gaatgttcca 4140
ctaaatatca agatttagag caaagcatga gatgtgtggg gatagacagt gaggctgata 4200
aaatagagta gagctcagaa acagacccat tgatatatgt aagtgaccta tgaaaaaaat 4260
atggcatttt acaatgggaa aatgatggtc tttttctttt ttagaaaaac agggaaatat 4320
atttatatgt aaaaaataaa agggaaccca tatgtcatac catacacaca aaaaaattcc 4380
agtgaattat aagtctaaat ggagaaggca aaactttaaa tcttttagaa aataatatag 4440
aagcatgcag accagcctgg ccaacatgat gaaaccctct ctactaataa taaaatcagt 4500
agaactactc aggactactt tgagtgggaa gtccttttct atgaagactt ctttggccaa 4560
aattaggctc taaatgcaag gagatagtgc atcatgcctg gctgcactta ctgataaatg 4620
atgttatcac catctttaac caaatgcaca ggaacaagtt atggtactga tgtgctggat 4680
tgagaaggag ctctacttcc ttgacaggac acatttgtat caacttaaaa aagcagattt 4740
ttgccagcag aactattcat tcagaggtag gaaacttaga atagatgatg tcactgatta 4800
gcatggcttc cccatctcca cagctgcttc ccacccaggt tgcccacagt tgagtttgtc 4860
cagtgctcag ggctgcccac tctcagtaag aagccccaca ccagcccctc tccaaatatg 4920
ttggctgttc cttccattaa agtgacccca ctttagagca gcaagtggat ttctgtttct 4980
tacagttcag gaaggaggag tcagctgtga gaacctggag cctgagatgc ttctaagtcc 5040
cactgctact ggggtcaggg aagccagact ccagcatcag cagtcaggag cactaagccc 5100
ttgccaacat cctgtttctc agagaaactg cttccattat aatggttgtc cttttttaag 5160
ctatcaagcc aaacaaccag tgtctaccat tattctcatc acctgaagcc aagggttcta 5220
gcaaaagtca agctgtcttg taatggttga tgtgcctcca gcttctgtct tcagtcactc 5280
cactcttagc ctgctctgaa tcaactctga ccacagttcc ctggagcccc tgccacctgc 5340
tgcccctgcc accttctcca tctgcagtgc tgtgcagcct tctgcactct tgcagagcta 5400
ataggtggag acttgaagga agaggaggaa agtttctcat aatagccttg ctgcaagctc 5460
aaatgggagg tgggcactgt gcccaggagc cttggagcaa aggctgtgcc caacctctga 5520
ctgcatccag gtttggtctt gacagagata agaagccctg gcttttggag ccaaaatcta 5580
ggtcagactt aggcaggatt ctcaaagttt atcagcagaa catgaggcag aagacccttt 5640
ctgctccagc ttcttcaggc tcaaccttca tcagaataga tagaaagaga ggctgtgagg 5700
gttcttaaaa cagaagcaaa tctgactcag agaataaaca acctcctagt aaactacagc 5760
ttagacagag catctggtgg tgagtgtgct cagtgtccta ctcaactgtc tggtatcagc 5820
cctcatgagg acttctcttc tttccctcat agacctccat ctctgttttc cttagcctgc 5880
agaaatctgg atggctattc acagaatgcc tgtgctttca gagttgcatt ttttctctgg 5940
tattctggtt caagcatttg aaggtaggaa aggttctcca agtgcaagaa agccagccct 6000
gagcctcaac tgcctggcta gtgtggtcag taggatgcaa aggctgttga atgccacaag 6060
gccaaacttt aacctgtgta ccacaagcct agcagcagag gcagctctgc tcactggaac 6120
tctctgtctt ctttctcctg agccttttct tttcctgagt tttctagctc tcctcaacct 6180
tacctctgcc ctacccagga caaacccaag agccactgtt tctgtgatgt cctctccagc 6240
cctaattagg catcatgact tcagcctgac cttccatgct cagaagcagt gctaatccac 6300
ttcagatgag ctgctctatg caacacaggc agagcctaca aacctttgca ccagagccct 6360
ccacatatca gtgtttgttc atactcactt caacagcaaa tgtgactgct gagattaaga 6420
ttttacacaa gatggtctgt aatttcacag ttagttttat cccattaggt atgaaagaat 6480
tagcataatt ccccttaaac atgaatgaat cttagatttt ttaataaata gttttggaag 6540
taaagacaga gacatcagga gcacaaggaa tagcctgaga ggacaaacag aacaagaaag 6600
agtctggaaa tacacaggat gttcttggcc tcctcaaagc aagtgcaagc agatagtacc 6660
agcagcccca ggctatcaga gcccagtgaa gagaagtacc atgaaagcca cagctctaac 6720
caccctgttc cagagtgaca gacagtcccc aagacaagcc agcctgagcc agagagagaa 6780
ctgcaagaga aagtttctaa tttaggttct gttagattca gacaagtgca ggtcatcctc 6840
tctccacagc tactcacctc tccagcctaa caaagcctgc agtccacact ccaaccctgg 6900
tgtctcacct cctagcctct cccaacatcc tgctctctga ccatcttctg catctctcat 6960
ctcaccatct cccactgtct acagcctact cttgcaacta ccatctcatt ttctgacatc 7020
ctgtctacat cttctgccat actctgccat ctaccatacc acctcttacc atctaccaca 7080
ccatctttta tctccatccc tctcagaagc ctccaagctg aatcctgctt tatgtgttca 7140
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aagaaaaaca aaactaccag cctggccagg ctcaggagta gtaagctgca gtgtctgttg 7260
tgttctagct tcaacagctg caggagttcc actctcaaat gctccacatt tctcacatcc 7320
tcctgattct ggtcactacc catcttcaaa gaacagaata tctcacatca gcatactgtg 7380
aaggactagt catgggtgca gctgctcaga gctgcaaagt cattctggat ggtggagagc 7440
ttacaaacat ttcatgatgc tccccccgct ctgatggctg gagcccaatc cctacacaga 7500
ctcctgctgt atgtgttttc ctttcactct gagccacagc cagagggcag gcattcagtc 7560
tcctcttcag gctggggctg gggcactgag aactcaccca acaccttgct ctcactcctt 7620
ctgcaaaaca agaaagagct ttgtgctgca gtagccatga agaatgaaag gaaggcttta 7680
actaaaaaat gtcagagatt attttcaacc ccttactgtg gatcaccagc aaggaggaaa 7740
cacaacacag agacattttt tcccctcaaa ttatcaaaag aatcactgca tttgttaaag 7800
agagcaactg aatcaggaag cagagttttg aacatatcag aagttaggaa tctgcatcag 7860
agacaaatgc agtcatggtt gtttgctgca taccagccct aatcattaga agcctcatgg 7920
acttcaaaca tcattccctc tgacaagatg ctctagccta actccatgag ataaaataaa 7980
tctgcctttc agagccaaag aagagtccac cagcttcttc tcagtgtgaa caagagctcc 8040
agtcaggtta gtcagtccag tgcagtagag gagaccagtc tgcatcctct aattttcaaa 8100
ggcaagaaga tttgtttacc ctggacacca ggcacaagtg aggtcacaga gctcttagat 8160
atgcagtcct catgagtgag gagactaaag cgcatgccat caagacttca gtgtagagaa 8220
aacctccaaa aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg 8280
cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg 8340
gagttagggg cgggatgggc ggagttaggg gcgggactat ggttgctgac taattgagat 8400
gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac ctggttgctg 8460
actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac 8520
accctaactg acacacattc cacagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 8580
cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 8640
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 8700
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 8760
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 8820
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 8880
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 8940
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 9000
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 9060
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 9120
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 9180
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 9240
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 9300
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 9360
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 9420
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 9480
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 9540
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 9600
agttgcctga ctcctgcaaa ccacgttgtg tctcaaaatc tctgatgtta cattgcacaa 9660
gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg 9720
ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcga ggccgcgatt aaattccaac 9780
atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg 9840
acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa 9900
ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt 9960
atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc 10020
actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa 10080
aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat 10140
tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac 10200
ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc 10260
tggaaagaaa tgcataagct tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat 10320
ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga 10380
cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag 10440
ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg 10500
aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagggcggcc tgccaccata 10560
cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg 10620
atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgag ggcgcgccaa 10680
gtcgacgtcc ggcagtc 10697
<210> 2
<211> 11355
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg agggcggagt 300
tagggcggag ccaatcagcg tgcgccgttc cgaaagttgc cttttatggc tgggcggaga 360
atgggcggtg aacgccgatg attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg 420
tcgcagccgg gatttgggtc gcggttcttg tttgtggatc cctgtgatcg tcacttggta 480
agtcactgac tgtctatgcc tgggaaaggg tgggcaggag atggggcagt gcaggaaaag 540
tggcactatg aaccctgcag ccctaggaat gcatctagac aattgtacta accttcttct 600
ctttcctctc ctgacagtcc ggaaagccac catgggccgc tgctgcttct acaccgccgg 660
caccctgagc ctgctgctgc tggtgaccag cgtgaccctg ctggtggccc gcgtgttcca 720
gaaggccgtg gaccagagca tcgagaagaa gatcgtgctg cgcaacggca ccgaggcctt 780
cgacagctgg gagaagcccc ccctgcccgt gtacacccag ttctacttct tcaacgtgac 840
caaccccgag gagatcctgc gcggcgagac cccccgcgtg gaggaggtgg gcccctacac 900
ctaccgcgag ctgcgcaaca aggccaacat ccagttcggc gacaacggca ccaccatcag 960
cgccgtgagc aacaaggcct acgtgttcga gcgcgaccag agcgtgggcg accccaagat 1020
cgacctgatc cgcaccctga acatccccgt gctgaccgtg atcgagtgga gccaggtgca 1080
cttcctgcgc gagatcatcg aggccatgct gaaggcctac cagcagaagc tgttcgtgac 1140
ccacaccgtg gacgagctgc tgtggggcta caaggacgag atcctgagcc tgatccacgt 1200
gttccgcccc gacatcagcc cctacttcgg cctgttctac gagaagaacg gcaccaacga 1260
cggcgactac gtgttcctga ccggcgagga cagctacctg aacttcacca agatcgtgga 1320
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cagcgacttc tgccgcagcg tgtacatcac cttcagcgac tacgagagcg tgcagggcct 1500
gcccgccttc cgctacaagg tgcccgccga gatcctggcc aacaccagcg acaacgccgg 1560
cttctgcatc cccgagggca actgcctggg cagcggcgtg ctgaacgtga gcatctgcaa 1620
gaacggcgcc cccatcatca tgagcttccc ccacttctac caggccgacg agcgcttcgt 1680
gagcgccatc gagggcatgc accccaacca ggaggaccac gagaccttcg tggacatcaa 1740
ccccctgacc ggcatcatcc tgaaggccgc caagcgcttc cagatcaaca tctacgtgaa 1800
gaagctggac gacttcgtgg agaccggcga catccgcacc atggtgttcc ccgtgatgta 1860
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cctggtgttc acctggctgg cctgcaaggg ccagggcagc atggacgagg gcaccgccga 2040
cgagcgcgcc cccctgatcc gcacctgatt gtggccgaac cgccgaactc agaggccggc 2100
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ccagattagc ggacgcggtg cccgcggttg caacgggatc ccgggcgctg cagcttggga 2280
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cgccggctcg ccgcgcacca ggggccggcg gacagaagag cggccgagcg gctcgaggct 2400
gggggaccgc gggcgcggcc gcgcgctgcc gggcgggagg ctggggggcc ggggccgggg 2460
ccgtgccccg gagcgggtcg gaggccgggg ccggggccgg gggacggcgg ctccccgcgc 2520
ggctccagcg gctcggggat cccggccggg ccccgcaggg accatgatgg aattcagcag 2580
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gagctacttc agcgaggaag gcatcggcta caacatcatc agagtgccca tggccagctg 3060
cgacttcagc atcaggacct acacctacgc cgacacaccc gacgatttcc agctgcacaa 3120
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aacaaatggc gccgtgaatg gcaagggcag cctgaaaggc caacctggcg acatctacca 3300
ccagacctgg gccagatact tcgtgaagtt cctggacgcc tatgccgagc acaagctgca 3360
gttttgggcc gtgacagccg agaacgaacc ttctgctgga ctgctgagcg gctacccctt 3420
tcagtgcctg ggctttacac ccgagcacca gcgggacttt atcgcccgtg atctgggacc 3480
cacactggcc aatagcaccc accataatgt gcggctgctg atgctggacg accagagact 3540
gcttctgccc cactgggcta aagtggtgct gacagatcct gaggccgcca aatacgtgca 3600
cggaatcgcc gtgcactggt atctggactt tctggcccct gccaaggcca cactgggaga 3660
gacacacaga ctgttcccca acaccatgct gttcgccagc gaagcctgtg tgggcagcaa 3720
gttttgggaa cagagcgtgc ggctcggcag ctgggataga ggcatgcagt acagccacag 3780
catcatcacc aacctgctgt accacgtcgt cggctggacc gactggaatc tggccctgaa 3840
tcctgaaggc ggccctaact gggtccgaaa cttcgtggac agccccatca tcgtggacat 3900
caccaaggac accttctaca agcagcccat gttctaccac ctgggacact tcagcaagtt 3960
catccccgag ggctctcagc gcgttggact ggtggcttcc cagaagaacg atctggacgc 4020
cgtggctctg atgcaccctg atggatctgc tgtggtggtg gtcctgaacc gcagcagcaa 4080
agatgtgccc ctgaccatca aggatcccgc cgtgggattc ctggaaacaa tcagccctgg 4140
ctactccatc cacacctacc tgtggcgtag acagtgacaa ttgttaatta agtttaaacc 4200
ctcgaggccg caagccgcat cgataccgtc gactagagct cgctgatcag cctcgactgt 4260
gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 4320
aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 4380
taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 4440
agacaatagc aggcatgctg gggagagatc cacgataaca aacagctttt ttggggtgaa 4500
catattgact gaattccctg caggttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact 4560
gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 4620
gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg cggccgctcg 4680
tacggtctcg aggaattcct gcaggataac ttgccaacct cattctaaaa tgtatataga 4740
agcccaaaag acaataacaa aaatattctt gtagaacaaa atgggaaaga atgttccact 4800
aaatatcaag atttagagca aagcatgaga tgtgtgggga tagacagtga ggctgataaa 4860
atagagtaga gctcagaaac agacccattg atatatgtaa gtgacctatg aaaaaaatat 4920
ggcattttac aatgggaaaa tgatggtctt tttctttttt agaaaaacag ggaaatatat 4980
ttatatgtaa aaaataaaag ggaacccata tgtcatacca tacacacaaa aaaattccag 5040
tgaattataa gtctaaatgg agaaggcaaa actttaaatc ttttagaaaa taatatagaa 5100
gcatgcagac cagcctggcc aacatgatga aaccctctct actaataata aaatcagtag 5160
aactactcag gactactttg agtgggaagt ccttttctat gaagacttct ttggccaaaa 5220
ttaggctcta aatgcaagga gatagtgcat catgcctggc tgcacttact gataaatgat 5280
gttatcacca tctttaacca aatgcacagg aacaagttat ggtactgatg tgctggattg 5340
agaaggagct ctacttcctt gacaggacac atttgtatca acttaaaaaa gcagattttt 5400
gccagcagaa ctattcattc agaggtagga aacttagaat agatgatgtc actgattagc 5460
atggcttccc catctccaca gctgcttccc acccaggttg cccacagttg agtttgtcca 5520
gtgctcaggg ctgcccactc tcagtaagaa gccccacacc agcccctctc caaatatgtt 5580
ggctgttcct tccattaaag tgaccccact ttagagcagc aagtggattt ctgtttctta 5640
cagttcagga aggaggagtc agctgtgaga acctggagcc tgagatgctt ctaagtccca 5700
ctgctactgg ggtcagggaa gccagactcc agcatcagca gtcaggagca ctaagccctt 5760
gccaacatcc tgtttctcag agaaactgct tccattataa tggttgtcct tttttaagct 5820
atcaagccaa acaaccagtg tctaccatta ttctcatcac ctgaagccaa gggttctagc 5880
aaaagtcaag ctgtcttgta atggttgatg tgcctccagc ttctgtcttc agtcactcca 5940
ctcttagcct gctctgaatc aactctgacc acagttccct ggagcccctg ccacctgctg 6000
cccctgccac cttctccatc tgcagtgctg tgcagccttc tgcactcttg cagagctaat 6060
aggtggagac ttgaaggaag aggaggaaag tttctcataa tagccttgct gcaagctcaa 6120
atgggaggtg ggcactgtgc ccaggagcct tggagcaaag gctgtgccca acctctgact 6180
gcatccaggt ttggtcttga cagagataag aagccctggc ttttggagcc aaaatctagg 6240
tcagacttag gcaggattct caaagtttat cagcagaaca tgaggcagaa gaccctttct 6300
gctccagctt cttcaggctc aaccttcatc agaatagata gaaagagagg ctgtgagggt 6360
tcttaaaaca gaagcaaatc tgactcagag aataaacaac ctcctagtaa actacagctt 6420
agacagagca tctggtggtg agtgtgctca gtgtcctact caactgtctg gtatcagccc 6480
tcatgaggac ttctcttctt tccctcatag acctccatct ctgttttcct tagcctgcag 6540
aaatctggat ggctattcac agaatgcctg tgctttcaga gttgcatttt ttctctggta 6600
ttctggttca agcatttgaa ggtaggaaag gttctccaag tgcaagaaag ccagccctga 6660
gcctcaactg cctggctagt gtggtcagta ggatgcaaag gctgttgaat gccacaaggc 6720
caaactttaa cctgtgtacc acaagcctag cagcagaggc agctctgctc actggaactc 6780
tctgtcttct ttctcctgag ccttttcttt tcctgagttt tctagctctc ctcaacctta 6840
cctctgccct acccaggaca aacccaagag ccactgtttc tgtgatgtcc tctccagccc 6900
taattaggca tcatgacttc agcctgacct tccatgctca gaagcagtgc taatccactt 6960
cagatgagct gctctatgca acacaggcag agcctacaaa cctttgcacc agagccctcc 7020
acatatcagt gtttgttcat actcacttca acagcaaatg tgactgctga gattaagatt 7080
ttacacaaga tggtctgtaa tttcacagtt agttttatcc cattaggtat gaaagaatta 7140
gcataattcc ccttaaacat gaatgaatct tagatttttt aataaatagt tttggaagta 7200
aagacagaga catcaggagc acaaggaata gcctgagagg acaaacagaa caagaaagag 7260
tctggaaata cacaggatgt tcttggcctc ctcaaagcaa gtgcaagcag atagtaccag 7320
cagccccagg ctatcagagc ccagtgaaga gaagtaccat gaaagccaca gctctaacca 7380
ccctgttcca gagtgacaga cagtccccaa gacaagccag cctgagccag agagagaact 7440
gcaagagaaa gtttctaatt taggttctgt tagattcaga caagtgcagg tcatcctctc 7500
tccacagcta ctcacctctc cagcctaaca aagcctgcag tccacactcc aaccctggtg 7560
tctcacctcc tagcctctcc caacatcctg ctctctgacc atcttctgca tctctcatct 7620
caccatctcc cactgtctac agcctactct tgcaactacc atctcatttt ctgacatcct 7680
gtctacatct tctgccatac tctgccatct accataccac ctcttaccat ctaccacacc 7740
atcttttatc tccatccctc tcagaagcct ccaagctgaa tcctgcttta tgtgttcatc 7800
tcagcccctg catggaaagc tgaccccaga ggcagaacta ttcccagaga gcttggccaa 7860
gaaaaacaaa actaccagcc tggccaggct caggagtagt aagctgcagt gtctgttgtg 7920
ttctagcttc aacagctgca ggagttccac tctcaaatgc tccacatttc tcacatcctc 7980
ctgattctgg tcactaccca tcttcaaaga acagaatatc tcacatcagc atactgtgaa 8040
ggactagtca tgggtgcagc tgctcagagc tgcaaagtca ttctggatgg tggagagctt 8100
acaaacattt catgatgctc cccccgctct gatggctgga gcccaatccc tacacagact 8160
cctgctgtat gtgttttcct ttcactctga gccacagcca gagggcaggc attcagtctc 8220
ctcttcaggc tggggctggg gcactgagaa ctcacccaac accttgctct cactccttct 8280
gcaaaacaag aaagagcttt gtgctgcagt agccatgaag aatgaaagga aggctttaac 8340
taaaaaatgt cagagattat tttcaacccc ttactgtgga tcaccagcaa ggaggaaaca 8400
caacacagag acattttttc ccctcaaatt atcaaaagaa tcactgcatt tgttaaagag 8460
agcaactgaa tcaggaagca gagttttgaa catatcagaa gttaggaatc tgcatcagag 8520
acaaatgcag tcatggttgt ttgctgcata ccagccctaa tcattagaag cctcatggac 8580
ttcaaacatc attccctctg acaagatgct ctagcctaac tccatgagat aaaataaatc 8640
tgcctttcag agccaaagaa gagtccacca gcttcttctc agtgtgaaca agagctccag 8700
tcaggttagt cagtccagtg cagtagagga gaccagtctg catcctctaa ttttcaaagg 8760
caagaagatt tgtttaccct ggacaccagg cacaagtgag gtcacagagc tcttagatat 8820
gcagtcctca tgagtgagga gactaaagcg catgccatca agacttcagt gtagagaaaa 8880
cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag aggccgaggc ggcctcggcc 8940
tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga 9000
gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagatgc 9060
atgctttgca tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacacct ggttgctgac 9120
taattgagat gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac 9180
cctaactgac acacattcca cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 9240
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 9300
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 9360
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 9420
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 9480
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 9540
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 9600
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 9660
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 9720
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 9780
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 9840
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 9900
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 9960
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 10020
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 10080
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 10140
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 10200
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 10260
ttgcctgact cctgcaaacc acgttgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga 10320
taaaaatata tcatcatgaa caataaaact gtctgcttac ataaacagta atacaagggg 10380
tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc ttgctcgagg ccgcgattaa attccaacat 10440
ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac 10500
aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg 10560
tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat 10620
gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac 10680
tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa 10740
tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg 10800
tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg 10860
tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg 10920
gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt 10980
ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg 11040
agtcggaatc gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt 11100
ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa 11160
taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa gggcggcctg ccaccatacc 11220
cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat 11280
gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgaggg cgcgccaagt 11340
cgacgtccgg cagtc 11355
<210> 3
<211> 11420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg agggcggagt 300
tagggcggag ccaatcagcg tgcgccgttc cgaaagttgc cttttatggc tgggcggaga 360
atgggcggtg aacgccgatg attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg 420
tcgcagccgg gatttgggtc gcggttcttg tttgtggatc cctgtgatcg tcacttggta 480
agtcactgac tgtctatgcc tgggaaaggg tgggcaggag atggggcagt gcaggaaaag 540
tggcactatg aaccctgcag ccctaggaat gcatctagac aattgtacta accttcttct 600
ctttcctctc ctgacagtcc ggaaagccac catggaattc agcagcccca gcagagagga 660
atgccccaag cctctgagcc gggtgtcaat catggccgga tctctgacag gactgctgct 720
gcttcaggcc gtgtcttggg cttctggcgc tagaccttgc atccccaaga gcttcggcta 780
cagcagcgtc gtgtgcgtgt gcaatgccac ctactgcgac agcttcgacc ctcctacctt 840
tcctgctctg ggcaccttca gcagatacga gagcaccaga tccggcagac ggatggaact 900
gagcatggga cccatccagg ccaatcacac aggcactggc ctgctgctga cactgcagcc 960
tgagcagaaa ttccagaaag tgaaaggctt cggcggagcc atgacagatg ccgccgctct 1020
gaatatcctg gctctgtctc caccagctca gaacctgctg ctcaagagct acttcagcga 1080
ggaaggcatc ggctacaaca tcatcagagt gcccatggcc agctgcgact tcagcatcag 1140
gacctacacc tacgccgaca cacccgacga tttccagctg cacaacttca gcctgcctga 1200
agaggacacc aagctgaaga tccctctgat ccacagagcc ctgcagctgg cacaaagacc 1260
cgtgtcactg ctggcctctc catggacatc tcccacctgg ctgaaaacaa atggcgccgt 1320
gaatggcaag ggcagcctga aaggccaacc tggcgacatc taccaccaga cctgggccag 1380
atacttcgtg aagttcctgg acgcctatgc cgagcacaag ctgcagtttt gggccgtgac 1440
agccgagaac gaaccttctg ctggactgct gagcggctac ccctttcagt gcctgggctt 1500
tacacccgag caccagcggg actttatcgc ccgtgatctg ggacccacac tggccaatag 1560
cacccaccat aatgtgcggc tgctgatgct ggacgaccag agactgcttc tgccccactg 1620
ggctaaagtg gtgctgacag atcctgaggc cgccaaatac gtgcacggaa tcgccgtgca 1680
ctggtatctg gactttctgg cccctgccaa ggccacactg ggagagacac acagactgtt 1740
ccccaacacc atgctgttcg ccagcgaagc ctgtgtgggc agcaagtttt gggaacagag 1800
cgtgcggctc ggcagctggg atagaggcat gcagtacagc cacagcatca tcaccaacct 1860
gctgtaccac gtcgtcggct ggaccgactg gaatctggcc ctgaatcctg aaggcggccc 1920
taactgggtc cgaaacttcg tggacagccc catcatcgtg gacatcacca aggacacctt 1980
ctacaagcag cccatgttct accacctggg acacttcagc aagttcatcc ccgagggctc 2040
tcagcgcgtt ggactggtgg cttcccagaa gaacgatctg gacgccgtgg ctctgatgca 2100
ccctgatgga tctgctgtgg tggtggtcct gaaccgcagc agcaaagatg tgcccctgac 2160
catcaaggat cccgccgtgg gattcctgga aacaatcagc cctggctact ccatccacac 2220
ctacctgtgg cgtagacagt gacaattgtt aattaagttt catcgatacc gtcgactaga 2280
gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 2340
cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 2400
gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 2460
gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggagag atccacgata 2520
acaaacagct tttttggggg ggcggagtta gggcggagcc aatcagcgtg cgccgttccg 2580
aaagttgcct tttatggctg ggcggagaat gggcggtgaa cgccgatgat tatataagga 2640
cgcgccgggt gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc ggttcttgtt 2700
tgtggatccc tgtgatcgtc acttggtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg 2760
ggcaggagat ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc 2820
atctagacaa ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacagtccgg aaagccacca 2880
tgggccgctg ctgcttctac accgccggca ccctgagcct gctgctgctg gtgaccagcg 2940
tgaccctgct ggtggcccgc gtgttccaga aggccgtgga ccagagcatc gagaagaaga 3000
tcgtgctgcg caacggcacc gaggccttcg acagctggga gaagcccccc ctgcccgtgt 3060
acacccagtt ctacttcttc aacgtgacca accccgagga gatcctgcgc ggcgagaccc 3120
cccgcgtgga ggaggtgggc ccctacacct accgcgagct gcgcaacaag gccaacatcc 3180
agttcggcga caacggcacc accatcagcg ccgtgagcaa caaggcctac gtgttcgagc 3240
gcgaccagag cgtgggcgac cccaagatcg acctgatccg caccctgaac atccccgtgc 3300
tgaccgtgat cgagtggagc caggtgcact tcctgcgcga gatcatcgag gccatgctga 3360
aggcctacca gcagaagctg ttcgtgaccc acaccgtgga cgagctgctg tggggctaca 3420
aggacgagat cctgagcctg atccacgtgt tccgccccga catcagcccc tacttcggcc 3480
tgttctacga gaagaacggc accaacgacg gcgactacgt gttcctgacc ggcgaggaca 3540
gctacctgaa cttcaccaag atcgtggagt ggaacggcaa gaccagcctg gactggtgga 3600
tcaccgacaa gtgcaacatg atcaacggca ccgacggcga cagcttccac cccctgatca 3660
ccaaggacga ggtgctgtac gtgttcccca gcgacttctg ccgcagcgtg tacatcacct 3720
tcagcgacta cgagagcgtg cagggcctgc ccgccttccg ctacaaggtg cccgccgaga 3780
tcctggccaa caccagcgac aacgccggct tctgcatccc cgagggcaac tgcctgggca 3840
gcggcgtgct gaacgtgagc atctgcaaga acggcgcccc catcatcatg agcttccccc 3900
acttctacca ggccgacgag cgcttcgtga gcgccatcga gggcatgcac cccaaccagg 3960
aggaccacga gaccttcgtg gacatcaacc ccctgaccgg catcatcctg aaggccgcca 4020
agcgcttcca gatcaacatc tacgtgaaga agctggacga cttcgtggag accggcgaca 4080
tccgcaccat ggtgttcccc gtgatgtacc tgaacgagag cgtgcacatc gacaaggaga 4140
ccgccagccg cctgaagagc atgatcaaca ccaccctgat catcaccaac atcccctaca 4200
tcatcatggc cctgggcgtg ttcttcggcc tggtgttcac ctggctggcc tgcaagggcc 4260
agggcagcat ggacgagggc accgccgacg agcgcgcccc cctgatccgc acctgaccca 4320
ggggactcaa tcagcctcga agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 4380
acaagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 4440
gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 4500
caggttcagg gggagatgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 4560
atgaacatat tgactgaatt ccctgcaggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 4620
tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 4680
tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctgcggcc 4740
gctcgtacgg tctcgaggaa ttcctgcagg ataacttgcc aacctcattc taaaatgtat 4800
atagaagccc aaaagacaat aacaaaaata ttcttgtaga acaaaatggg aaagaatgtt 4860
ccactaaata tcaagattta gagcaaagca tgagatgtgt ggggatagac agtgaggctg 4920
ataaaataga gtagagctca gaaacagacc cattgatata tgtaagtgac ctatgaaaaa 4980
aatatggcat tttacaatgg gaaaatgatg gtctttttct tttttagaaa aacagggaaa 5040
tatatttata tgtaaaaaat aaaagggaac ccatatgtca taccatacac acaaaaaaat 5100
tccagtgaat tataagtcta aatggagaag gcaaaacttt aaatctttta gaaaataata 5160
tagaagcatg cagaccagcc tggccaacat gatgaaaccc tctctactaa taataaaatc 5220
agtagaacta ctcaggacta ctttgagtgg gaagtccttt tctatgaaga cttctttggc 5280
caaaattagg ctctaaatgc aaggagatag tgcatcatgc ctggctgcac ttactgataa 5340
atgatgttat caccatcttt aaccaaatgc acaggaacaa gttatggtac tgatgtgctg 5400
gattgagaag gagctctact tccttgacag gacacatttg tatcaactta aaaaagcaga 5460
tttttgccag cagaactatt cattcagagg taggaaactt agaatagatg atgtcactga 5520
ttagcatggc ttccccatct ccacagctgc ttcccaccca ggttgcccac agttgagttt 5580
gtccagtgct cagggctgcc cactctcagt aagaagcccc acaccagccc ctctccaaat 5640
atgttggctg ttccttccat taaagtgacc ccactttaga gcagcaagtg gatttctgtt 5700
tcttacagtt caggaaggag gagtcagctg tgagaacctg gagcctgaga tgcttctaag 5760
tcccactgct actggggtca gggaagccag actccagcat cagcagtcag gagcactaag 5820
cccttgccaa catcctgttt ctcagagaaa ctgcttccat tataatggtt gtcctttttt 5880
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ctagcaaaag tcaagctgtc ttgtaatggt tgatgtgcct ccagcttctg tcttcagtca 6000
ctccactctt agcctgctct gaatcaactc tgaccacagt tccctggagc ccctgccacc 6060
tgctgcccct gccaccttct ccatctgcag tgctgtgcag ccttctgcac tcttgcagag 6120
ctaataggtg gagacttgaa ggaagaggag gaaagtttct cataatagcc ttgctgcaag 6180
ctcaaatggg aggtgggcac tgtgcccagg agccttggag caaaggctgt gcccaacctc 6240
tgactgcatc caggtttggt cttgacagag ataagaagcc ctggcttttg gagccaaaat 6300
ctaggtcaga cttaggcagg attctcaaag tttatcagca gaacatgagg cagaagaccc 6360
tttctgctcc agcttcttca ggctcaacct tcatcagaat agatagaaag agaggctgtg 6420
agggttctta aaacagaagc aaatctgact cagagaataa acaacctcct agtaaactac 6480
agcttagaca gagcatctgg tggtgagtgt gctcagtgtc ctactcaact gtctggtatc 6540
agccctcatg aggacttctc ttctttccct catagacctc catctctgtt ttccttagcc 6600
tgcagaaatc tggatggcta ttcacagaat gcctgtgctt tcagagttgc attttttctc 6660
tggtattctg gttcaagcat ttgaaggtag gaaaggttct ccaagtgcaa gaaagccagc 6720
cctgagcctc aactgcctgg ctagtgtggt cagtaggatg caaaggctgt tgaatgccac 6780
aaggccaaac tttaacctgt gtaccacaag cctagcagca gaggcagctc tgctcactgg 6840
aactctctgt cttctttctc ctgagccttt tcttttcctg agttttctag ctctcctcaa 6900
ccttacctct gccctaccca ggacaaaccc aagagccact gtttctgtga tgtcctctcc 6960
agccctaatt aggcatcatg acttcagcct gaccttccat gctcagaagc agtgctaatc 7020
cacttcagat gagctgctct atgcaacaca ggcagagcct acaaaccttt gcaccagagc 7080
cctccacata tcagtgtttg ttcatactca cttcaacagc aaatgtgact gctgagatta 7140
agattttaca caagatggtc tgtaatttca cagttagttt tatcccatta ggtatgaaag 7200
aattagcata attcccctta aacatgaatg aatcttagat tttttaataa atagttttgg 7260
aagtaaagac agagacatca ggagcacaag gaatagcctg agaggacaaa cagaacaaga 7320
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accagcagcc ccaggctatc agagcccagt gaagagaagt accatgaaag ccacagctct 7440
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ctctctccac agctactcac ctctccagcc taacaaagcc tgcagtccac actccaaccc 7620
tggtgtctca cctcctagcc tctcccaaca tcctgctctc tgaccatctt ctgcatctct 7680
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tggacttcaa acatcattcc ctctgacaag atgctctagc ctaactccat gagataaaat 8700
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gatatgcagt cctcatgagt gaggagacta aagcgcatgc catcaagact tcagtgtaga 8940
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aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc 10500
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caagtcgacg tccggcagtc 11420
<210> 4
<211> 11171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
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tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg agggcggagt 300
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tggcactatg aaccctcctg gtggcgaggg gaggggggtg gtcctcgaac gccttgcaga 600
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agcctgcctg aagaggacac caagctgaag atccctctga tccacagagc cctgcagctg 3000
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ctggccaata gcacccacca taatgtgcgg ctgctgatgc tggacgacca gagactgctt 3360
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atcgccgtgc actggtatct ggactttctg gcccctgcca aggccacact gggagagaca 3480
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tgggaacaga gcgtgcggct cggcagctgg gatagaggca tgcagtacag ccacagcatc 3600
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gaaggcggcc ctaactgggt ccgaaacttc gtggacagcc ccatcatcgt ggacatcacc 3720
aaggacacct tctacaagca gcccatgttc taccacctgg gacacttcag caagttcatc 3780
cccgagggct ctcagcgcgt tggactggtg gcttcccaga agaacgatct ggacgccgtg 3840
gctctgatgc accctgatgg atctgctgtg gtggtggtcc tgaaccgcag cagcaaagat 3900
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tccatccaca cctacctgtg gcgtagacag tgacaattgt taattaagtt taaaccctcg 4020
aggccgcaag ccgcatcgat accgtcgact agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct 4080
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tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 4260
aatagcaggc atgctgggga gagatccacg ataacaaaca gcttttttgg ggtgaacata 4320
ttgactgaat tccctgcagg ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 4380
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 4440
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atcaagattt agagcaaagc atgagatgtg tggggataga cagtgaggct gataaaatag 4680
agtagagctc agaaacagac ccattgatat atgtaagtga cctatgaaaa aaatatggca 4740
ttttacaatg ggaaaatgat ggtctttttc ttttttagaa aaacagggaa atatatttat 4800
atgtaaaaaa taaaagggaa cccatatgtc ataccataca cacaaaaaaa ttccagtgaa 4860
ttataagtct aaatggagaa ggcaaaactt taaatctttt agaaaataat atagaagcat 4920
gcagaccagc ctggccaaca tgatgaaacc ctctctacta ataataaaat cagtagaact 4980
actcaggact actttgagtg ggaagtcctt ttctatgaag acttctttgg ccaaaattag 5040
gctctaaatg caaggagata gtgcatcatg cctggctgca cttactgata aatgatgtta 5100
tcaccatctt taaccaaatg cacaggaaca agttatggta ctgatgtgct ggattgagaa 5160
ggagctctac ttccttgaca ggacacattt gtatcaactt aaaaaagcag atttttgcca 5220
gcagaactat tcattcagag gtaggaaact tagaatagat gatgtcactg attagcatgg 5280
cttccccatc tccacagctg cttcccaccc aggttgccca cagttgagtt tgtccagtgc 5340
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acctcctagc ctctcccaac atcctgctct ctgaccatct tctgcatctc tcatctcacc 7440
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<211> 11309
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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gctgggcgcc gccctggccg gccccgtgct gggcctgaag gagtgcaccc gcggcagcgc 720
cgtgtggtgc cagaacgtga agaccgccag cgactgcggc gccgtgaagc actgcctgca 780
gaccgtgtgg aacaagccca ccgtgaagag cctgccctgc gacatctgca aggacgtggt 840
gaccgccgcc ggcgacatgc tgaaggacaa cgccaccgag gaggagatcc tggtgtacct 900
ggagaagacc tgcgactggc tgcccaagcc caacatgagc gccagctgca aggagatcgt 960
ggacagctac ctgcccgtga tcctggacat catcaagggc gagatgagcc gccccggcga 1020
ggtgtgcagc gccctgaacc tgtgcgagag cctgcagaag cacctggccg agctgaacca 1080
ccagaagcag ctggagagca acaagatccc cgagctggac atgaccgagg tggtggcccc 1140
cttcatggcc aacatccccc tgctgctgta cccccaggac ggcccccgca gcaagcccca 1200
gcccaaggac aacggcgacg tgtgccagga ctgcatccag atggtgaccg acatccagac 1260
cgccgtgcgc accaacagca ccttcgtgca ggccctggtg gagcacgtga aggaggagtg 1320
cgaccgcctg ggccccggca tggccgacat ctgcaagaac tacatcagcc agtacagcga 1380
gatcgccatc cagatgatga tgcacatgca gcccaaggag atctgcgccc tggtgggctt 1440
ctgcgacgag gtgaaggaga tgcccatgca gaccctggtg cccgccaagg tggccagcaa 1500
gaacgtgatc cccgccctgg agctggtgga gcccatcaag aagcacgagg tgcccgccaa 1560
gagcgacgtg tactgcgagg tgtgcgagtt cctggtgaag gaggtgacca agctgatcga 1620
caacaacaag accgagaagg agatcctgga cgccttcgac aagatgtgca gcaagctgcc 1680
caagagcctg agcgaggagt gccaggaggt ggtggacacc tacggcagca gcatcctgag 1740
catcctgctg gaggaggtga gccccgagct ggtgtgcagc atgctgcacc tgtgcagcgg 1800
cacccgcctg cccgccctga ccgtgcacgt gacccagccc aaggacggcg gcttctgcga 1860
ggtgtgcaag aagctggtgg gctacctgga ccgcaacctg gagaagaaca gcaccaagca 1920
ggagatcctg gccgccctgg agaagggctg cagcttcctg cccgacccct accagaagca 1980
gtgcgaccag ttcgtggccg agtacgagcc cgtgctgatc gagatcctgg tggaggtgat 2040
ggaccccagc ttcgtgtgcc tgaagatcgg cgcctgcccc agcgcccaca agcccctgct 2100
gggcaccgag aagtgcatct ggggccccag ctactggtgc cagaacaccg agaccgccgc 2160
ccagtgcaac gccgtggagc actgcaagcg ccacgtgtgg aactgattgt ggccgaaccg 2220
ccgaactcag aggccggccc cagaaaaccc gagcgagtag ggggcggcgc gcaggaggga 2280
ggagaactgg gggcgcggga ggctggtggg tgtggggggt ggagatgtag aagatgtgac 2340
gccgcggccc ggcgggtgcc agattagcgg acgcggtgcc cgcggttgca acgggatccc 2400
gggcgctgca gcttgggagg cggctctccc caggcggcgt ccgcggagac acccatccgt 2460
gaaccccagg tcccgggccg ccggctcgcc gcgcaccagg ggccggcgga cagaagagcg 2520
gccgagcggc tcgaggctgg gggaccgcgg gcgcggccgc gcgctgccgg gcgggaggct 2580
ggggggccgg ggccggggcc gtgccccgga gcgggtcgga ggccggggcc ggggccgggg 2640
gacggcggct ccccgcgcgg ctccagcggc tcggggatcc cggccgggcc ccgcagggac 2700
catgatggaa ttcagcagcc ccagcagaga ggaatgcccc aagcctctga gccgggtgtc 2760
aatcatggcc ggatctctga caggactgct gctgcttcag gccgtgtctt gggcttctgg 2820
cgctagacct tgcatcccca agagcttcgg ctacagcagc gtcgtgtgcg tgtgcaatgc 2880
cacctactgc gacagcttcg accctcctac ctttcctgct ctgggcacct tcagcagata 2940
cgagagcacc agatccggca gacggatgga actgagcatg ggacccatcc aggccaatca 3000
cacaggcact ggcctgctgc tgacactgca gcctgagcag aaattccaga aagtgaaagg 3060
cttcggcgga gccatgacag atgccgccgc tctgaatatc ctggctctgt ctccaccagc 3120
tcagaacctg ctgctcaaga gctacttcag cgaggaaggc atcggctaca acatcatcag 3180
agtgcccatg gccagctgcg acttcagcat caggacctac acctacgccg acacacccga 3240
cgatttccag ctgcacaact tcagcctgcc tgaagaggac accaagctga agatccctct 3300
gatccacaga gccctgcagc tggcacaaag acccgtgtca ctgctggcct ctccatggac 3360
atctcccacc tggctgaaaa caaatggcgc cgtgaatggc aagggcagcc tgaaaggcca 3420
acctggcgac atctaccacc agacctgggc cagatacttc gtgaagttcc tggacgccta 3480
tgccgagcac aagctgcagt tttgggccgt gacagccgag aacgaacctt ctgctggact 3540
gctgagcggc tacccctttc agtgcctggg ctttacaccc gagcaccagc gggactttat 3600
cgcccgtgat ctgggaccca cactggccaa tagcacccac cataatgtgc ggctgctgat 3660
gctggacgac cagagactgc ttctgcccca ctgggctaaa gtggtgctga cagatcctga 3720
ggccgccaaa tacgtgcacg gaatcgccgt gcactggtat ctggactttc tggcccctgc 3780
caaggccaca ctgggagaga cacacagact gttccccaac accatgctgt tcgccagcga 3840
agcctgtgtg ggcagcaagt tttgggaaca gagcgtgcgg ctcggcagct gggatagagg 3900
catgcagtac agccacagca tcatcaccaa cctgctgtac cacgtcgtcg gctggaccga 3960
ctggaatctg gccctgaatc ctgaaggcgg ccctaactgg gtccgaaact tcgtggacag 4020
ccccatcatc gtggacatca ccaaggacac cttctacaag cagcccatgt tctaccacct 4080
gggacacttc agcaagttca tccccgaggg ctctcagcgc gttggactgg tggcttccca 4140
gaagaacgat ctggacgccg tggctctgat gcaccctgat ggatctgctg tggtggtggt 4200
cctgaaccgc agcagcaaag atgtgcccct gaccatcaag gatcccgccg tgggattcct 4260
ggaaacaatc agccctggct actccatcca cacctacctg tggcgtagac agtgacaatt 4320
gttaattaag tttaaaccct cgaggccgca agcaataaaa tatctttatt ttcattacat 4380
ctgtgtgttg gttttttgtg tggagatcca cgataacaaa cagctttttt ggggtgaaca 4440
tattgactga attccctgca ggttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 4500
ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga 4560
gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg ggttcctgcg gccgctcgta 4620
cggtctcgag gaattcctgc aggataactt gccaacctca ttctaaaatg tatatagaag 4680
cccaaaagac aataacaaaa atattcttgt agaacaaaat gggaaagaat gttccactaa 4740
atatcaagat ttagagcaaa gcatgagatg tgtggggata gacagtgagg ctgataaaat 4800
agagtagagc tcagaaacag acccattgat atatgtaagt gacctatgaa aaaaatatgg 4860
cattttacaa tgggaaaatg atggtctttt tcttttttag aaaaacaggg aaatatattt 4920
atatgtaaaa aataaaaggg aacccatatg tcataccata cacacaaaaa aattccagtg 4980
aattataagt ctaaatggag aaggcaaaac tttaaatctt ttagaaaata atatagaagc 5040
atgcagacca gcctggccaa catgatgaaa ccctctctac taataataaa atcagtagaa 5100
ctactcagga ctactttgag tgggaagtcc ttttctatga agacttcttt ggccaaaatt 5160
aggctctaaa tgcaaggaga tagtgcatca tgcctggctg cacttactga taaatgatgt 5220
tatcaccatc tttaaccaaa tgcacaggaa caagttatgg tactgatgtg ctggattgag 5280
aaggagctct acttccttga caggacacat ttgtatcaac ttaaaaaagc agatttttgc 5340
cagcagaact attcattcag aggtaggaaa cttagaatag atgatgtcac tgattagcat 5400
ggcttcccca tctccacagc tgcttcccac ccaggttgcc cacagttgag tttgtccagt 5460
gctcagggct gcccactctc agtaagaagc cccacaccag cccctctcca aatatgttgg 5520
ctgttccttc cattaaagtg accccacttt agagcagcaa gtggatttct gtttcttaca 5580
gttcaggaag gaggagtcag ctgtgagaac ctggagcctg agatgcttct aagtcccact 5640
gctactgggg tcagggaagc cagactccag catcagcagt caggagcact aagcccttgc 5700
caacatcctg tttctcagag aaactgcttc cattataatg gttgtccttt tttaagctat 5760
caagccaaac aaccagtgtc taccattatt ctcatcacct gaagccaagg gttctagcaa 5820
aagtcaagct gtcttgtaat ggttgatgtg cctccagctt ctgtcttcag tcactccact 5880
cttagcctgc tctgaatcaa ctctgaccac agttccctgg agcccctgcc acctgctgcc 5940
cctgccacct tctccatctg cagtgctgtg cagccttctg cactcttgca gagctaatag 6000
gtggagactt gaaggaagag gaggaaagtt tctcataata gccttgctgc aagctcaaat 6060
gggaggtggg cactgtgccc aggagccttg gagcaaaggc tgtgcccaac ctctgactgc 6120
atccaggttt ggtcttgaca gagataagaa gccctggctt ttggagccaa aatctaggtc 6180
agacttaggc aggattctca aagtttatca gcagaacatg aggcagaaga ccctttctgc 6240
tccagcttct tcaggctcaa ccttcatcag aatagataga aagagaggct gtgagggttc 6300
ttaaaacaga agcaaatctg actcagagaa taaacaacct cctagtaaac tacagcttag 6360
acagagcatc tggtggtgag tgtgctcagt gtcctactca actgtctggt atcagccctc 6420
atgaggactt ctcttctttc cctcatagac ctccatctct gttttcctta gcctgcagaa 6480
atctggatgg ctattcacag aatgcctgtg ctttcagagt tgcatttttt ctctggtatt 6540
ctggttcaag catttgaagg taggaaaggt tctccaagtg caagaaagcc agccctgagc 6600
ctcaactgcc tggctagtgt ggtcagtagg atgcaaaggc tgttgaatgc cacaaggcca 6660
aactttaacc tgtgtaccac aagcctagca gcagaggcag ctctgctcac tggaactctc 6720
tgtcttcttt ctcctgagcc ttttcttttc ctgagttttc tagctctcct caaccttacc 6780
tctgccctac ccaggacaaa cccaagagcc actgtttctg tgatgtcctc tccagcccta 6840
attaggcatc atgacttcag cctgaccttc catgctcaga agcagtgcta atccacttca 6900
gatgagctgc tctatgcaac acaggcagag cctacaaacc tttgcaccag agccctccac 6960
atatcagtgt ttgttcatac tcacttcaac agcaaatgtg actgctgaga ttaagatttt 7020
acacaagatg gtctgtaatt tcacagttag ttttatccca ttaggtatga aagaattagc 7080
ataattcccc ttaaacatga atgaatctta gattttttaa taaatagttt tggaagtaaa 7140
gacagagaca tcaggagcac aaggaatagc ctgagaggac aaacagaaca agaaagagtc 7200
tggaaataca caggatgttc ttggcctcct caaagcaagt gcaagcagat agtaccagca 7260
gccccaggct atcagagccc agtgaagaga agtaccatga aagccacagc tctaaccacc 7320
ctgttccaga gtgacagaca gtccccaaga caagccagcc tgagccagag agagaactgc 7380
aagagaaagt ttctaattta ggttctgtta gattcagaca agtgcaggtc atcctctctc 7440
cacagctact cacctctcca gcctaacaaa gcctgcagtc cacactccaa ccctggtgtc 7500
tcacctccta gcctctccca acatcctgct ctctgaccat cttctgcatc tctcatctca 7560
ccatctccca ctgtctacag cctactcttg caactaccat ctcattttct gacatcctgt 7620
ctacatcttc tgccatactc tgccatctac cataccacct cttaccatct accacaccat 7680
cttttatctc catccctctc agaagcctcc aagctgaatc ctgctttatg tgttcatctc 7740
agcccctgca tggaaagctg accccagagg cagaactatt cccagagagc ttggccaaga 7800
aaaacaaaac taccagcctg gccaggctca ggagtagtaa gctgcagtgt ctgttgtgtt 7860
ctagcttcaa cagctgcagg agttccactc tcaaatgctc cacatttctc acatcctcct 7920
gattctggtc actacccatc ttcaaagaac agaatatctc acatcagcat actgtgaagg 7980
actagtcatg ggtgcagctg ctcagagctg caaagtcatt ctggatggtg gagagcttac 8040
aaacatttca tgatgctccc cccgctctga tggctggagc ccaatcccta cacagactcc 8100
tgctgtatgt gttttccttt cactctgagc cacagccaga gggcaggcat tcagtctcct 8160
cttcaggctg gggctggggc actgagaact cacccaacac cttgctctca ctccttctgc 8220
aaaacaagaa agagctttgt gctgcagtag ccatgaagaa tgaaaggaag gctttaacta 8280
aaaaatgtca gagattattt tcaacccctt actgtggatc accagcaagg aggaaacaca 8340
acacagagac attttttccc ctcaaattat caaaagaatc actgcatttg ttaaagagag 8400
caactgaatc aggaagcaga gttttgaaca tatcagaagt taggaatctg catcagagac 8460
aaatgcagtc atggttgttt gctgcatacc agccctaatc attagaagcc tcatggactt 8520
caaacatcat tccctctgac aagatgctct agcctaactc catgagataa aataaatctg 8580
cctttcagag ccaaagaaga gtccaccagc ttcttctcag tgtgaacaag agctccagtc 8640
aggttagtca gtccagtgca gtagaggaga ccagtctgca tcctctaatt ttcaaaggca 8700
agaagatttg tttaccctgg acaccaggca caagtgaggt cacagagctc ttagatatgc 8760
agtcctcatg agtgaggaga ctaaagcgca tgccatcaag acttcagtgt agagaaaacc 8820
tccaaaaaag cctcctcact acttctggaa tagctcagag gccgaggcgg cctcggcctc 8880
tgcataaata aaaaaaatta gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt 8940
taggggcggg atgggcggag ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgcat 9000
gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta 9060
attgagatgc atgctttgca tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc 9120
taactgacac acattccaca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 9180
ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 9240
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 9300
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 9360
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 9420
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 9480
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 9540
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 9600
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 9660
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 9720
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 9780
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 9840
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 9900
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 9960
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 10020
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 10080
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 10140
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 10200
gcctgactcc tgcaaaccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt gcacaagata 10260
aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg 10320
ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 10380
atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 10440
tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 10500
gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 10560
ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg 10620
cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata 10680
ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc 10740
cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt 10800
tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga 10860
aagaaatgca taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct 10920
cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag 10980
tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt 11040
ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata 11100
aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaagg gcggcctgcc accataccca 11160
cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt 11220
cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgagggcg cgccaagtcg 11280
acgtccggca gtc 11293
<210> 7
<211> 10700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 360
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 420
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 480
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 540
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 600
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 660
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 720
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 780
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 840
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 900
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc 960
tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1020
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 1080
cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc 1140
cgggagctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1200
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattcctc gaagatccga 1260
agggaaagtc ttccacgact gtgggatccg ttcgaagata tcaccggttg agccaccatg 1320
gaattcagca gccccagcag agaggaatgc cccaagcctc tgagccgggt gtcaatcatg 1380
gccggatctc tgacaggact gctgctgctt caggccgtgt cttgggcttc tggcgctaga 1440
ccttgcatcc ccaagagctt cggctacagc agcgtcgtgt gcgtgtgcaa tgccacctac 1500
tgcgacagct tcgaccctcc tacctttcct gctctgggca ccttcagcag atacgagagc 1560
accagatccg gcagacggat ggaactgagc atgggaccca tccaggccaa tcacacaggc 1620
actggcctgc tgctgacact gcagcctgag cagaaattcc agaaagtgaa aggcttcggc 1680
ggagccatga cagatgccgc cgctctgaat atcctggctc tgtctccacc agctcagaac 1740
ctgctgctca agagctactt cagcgaggaa ggcatcggct acaacatcat cagagtgccc 1800
atggccagct gcgacttcag catcaggacc tacacctacg ccgacacacc cgacgatttc 1860
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agagccctgc agctggcaca aagacccgtg tcactgctgg cctctccatg gacatctccc 1980
acctggctga aaacaaatgg cgccgtgaat ggcaagggca gcctgaaagg ccaacctggc 2040
gacatctacc accagacctg ggccagatac ttcgtgaagt tcctggacgc ctatgccgag 2100
cacaagctgc agttttgggc cgtgacagcc gagaacgaac cttctgctgg actgctgagc 2160
ggctacccct ttcagtgcct gggctttaca cccgagcacc agcgggactt tatcgcccgt 2220
gatctgggac ccacactggc caatagcacc caccataatg tgcggctgct gatgctggac 2280
gaccagagac tgcttctgcc ccactgggct aaagtggtgc tgacagatcc tgaggccgcc 2340
aaatacgtgc acggaatcgc cgtgcactgg tatctggact ttctggcccc tgccaaggcc 2400
acactgggag agacacacag actgttcccc aacaccatgc tgttcgccag cgaagcctgt 2460
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cgcagcagca aagatgtgcc cctgaccatc aaggatcccg ccgtgggatt cctggaaaca 2880
atcagccctg gctactccat ccacacctac ctgtggcgta gacagtgaca attgttaatt 2940
aagtttaaac cctcgaggcc gcaagcttat cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg 3000
tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 3060
tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta 3120
taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt 3180
ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca 3240
gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc 3300
ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 3360
gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg 3420
cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg 3480
cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat 3540
ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta gagctcgctg atcagcctcg 3600
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 3660
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 3720
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 3780
tgggaagaca atagcaggca tgctggggag agatccacga taacaaacag cttttttggg 3840
gtgaacatat tgactgaatt ccctgcaggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 3900
tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 3960
tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctgcggcc 4020
gctcgtacgg tctcgaggaa ttcctgcagg ataacttgcc aacctcattc taaaatgtat 4080
atagaagccc aaaagacaat aacaaaaata ttcttgtaga acaaaatggg aaagaatgtt 4140
ccactaaata tcaagattta gagcaaagca tgagatgtgt ggggatagac agtgaggctg 4200
ataaaataga gtagagctca gaaacagacc cattgatata tgtaagtgac ctatgaaaaa 4260
aatatggcat tttacaatgg gaaaatgatg gtctttttct tttttagaaa aacagggaaa 4320
tatatttata tgtaaaaaat aaaagggaac ccatatgtca taccatacac acaaaaaaat 4380
tccagtgaat tataagtcta aatggagaag gcaaaacttt aaatctttta gaaaataata 4440
tagaagcatg cagaccagcc tggccaacat gatgaaaccc tctctactaa taataaaatc 4500
agtagaacta ctcaggacta ctttgagtgg gaagtccttt tctatgaaga cttctttggc 4560
caaaattagg ctctaaatgc aaggagatag tgcatcatgc ctggctgcac ttactgataa 4620
atgatgttat caccatcttt aaccaaatgc acaggaacaa gttatggtac tgatgtgctg 4680
gattgagaag gagctctact tccttgacag gacacatttg tatcaactta aaaaagcaga 4740
tttttgccag cagaactatt cattcagagg taggaaactt agaatagatg atgtcactga 4800
ttagcatggc ttccccatct ccacagctgc ttcccaccca ggttgcccac agttgagttt 4860
gtccagtgct cagggctgcc cactctcagt aagaagcccc acaccagccc ctctccaaat 4920
atgttggctg ttccttccat taaagtgacc ccactttaga gcagcaagtg gatttctgtt 4980
tcttacagtt caggaaggag gagtcagctg tgagaacctg gagcctgaga tgcttctaag 5040
tcccactgct actggggtca gggaagccag actccagcat cagcagtcag gagcactaag 5100
cccttgccaa catcctgttt ctcagagaaa ctgcttccat tataatggtt gtcctttttt 5160
aagctatcaa gccaaacaac cagtgtctac cattattctc atcacctgaa gccaagggtt 5220
ctagcaaaag tcaagctgtc ttgtaatggt tgatgtgcct ccagcttctg tcttcagtca 5280
ctccactctt agcctgctct gaatcaactc tgaccacagt tccctggagc ccctgccacc 5340
tgctgcccct gccaccttct ccatctgcag tgctgtgcag ccttctgcac tcttgcagag 5400
ctaataggtg gagacttgaa ggaagaggag gaaagtttct cataatagcc ttgctgcaag 5460
ctcaaatggg aggtgggcac tgtgcccagg agccttggag caaaggctgt gcccaacctc 5520
tgactgcatc caggtttggt cttgacagag ataagaagcc ctggcttttg gagccaaaat 5580
ctaggtcaga cttaggcagg attctcaaag tttatcagca gaacatgagg cagaagaccc 5640
tttctgctcc agcttcttca ggctcaacct tcatcagaat agatagaaag agaggctgtg 5700
agggttctta aaacagaagc aaatctgact cagagaataa acaacctcct agtaaactac 5760
agcttagaca gagcatctgg tggtgagtgt gctcagtgtc ctactcaact gtctggtatc 5820
agccctcatg aggacttctc ttctttccct catagacctc catctctgtt ttccttagcc 5880
tgcagaaatc tggatggcta ttcacagaat gcctgtgctt tcagagttgc attttttctc 5940
tggtattctg gttcaagcat ttgaaggtag gaaaggttct ccaagtgcaa gaaagccagc 6000
cctgagcctc aactgcctgg ctagtgtggt cagtaggatg caaaggctgt tgaatgccac 6060
aaggccaaac tttaacctgt gtaccacaag cctagcagca gaggcagctc tgctcactgg 6120
aactctctgt cttctttctc ctgagccttt tcttttcctg agttttctag ctctcctcaa 6180
ccttacctct gccctaccca ggacaaaccc aagagccact gtttctgtga tgtcctctcc 6240
agccctaatt aggcatcatg acttcagcct gaccttccat gctcagaagc agtgctaatc 6300
cacttcagat gagctgctct atgcaacaca ggcagagcct acaaaccttt gcaccagagc 6360
cctccacata tcagtgtttg ttcatactca cttcaacagc aaatgtgact gctgagatta 6420
agattttaca caagatggtc tgtaatttca cagttagttt tatcccatta ggtatgaaag 6480
aattagcata attcccctta aacatgaatg aatcttagat tttttaataa atagttttgg 6540
aagtaaagac agagacatca ggagcacaag gaatagcctg agaggacaaa cagaacaaga 6600
aagagtctgg aaatacacag gatgttcttg gcctcctcaa agcaagtgca agcagatagt 6660
accagcagcc ccaggctatc agagcccagt gaagagaagt accatgaaag ccacagctct 6720
aaccaccctg ttccagagtg acagacagtc cccaagacaa gccagcctga gccagagaga 6780
gaactgcaag agaaagtttc taatttaggt tctgttagat tcagacaagt gcaggtcatc 6840
ctctctccac agctactcac ctctccagcc taacaaagcc tgcagtccac actccaaccc 6900
tggtgtctca cctcctagcc tctcccaaca tcctgctctc tgaccatctt ctgcatctct 6960
catctcacca tctcccactg tctacagcct actcttgcaa ctaccatctc attttctgac 7020
atcctgtcta catcttctgc catactctgc catctaccat accacctctt accatctacc 7080
acaccatctt ttatctccat ccctctcaga agcctccaag ctgaatcctg ctttatgtgt 7140
tcatctcagc ccctgcatgg aaagctgacc ccagaggcag aactattccc agagagcttg 7200
gccaagaaaa acaaaactac cagcctggcc aggctcagga gtagtaagct gcagtgtctg 7260
ttgtgttcta gcttcaacag ctgcaggagt tccactctca aatgctccac atttctcaca 7320
tcctcctgat tctggtcact acccatcttc aaagaacaga atatctcaca tcagcatact 7380
gtgaaggact agtcatgggt gcagctgctc agagctgcaa agtcattctg gatggtggag 7440
agcttacaaa catttcatga tgctcccccc gctctgatgg ctggagccca atccctacac 7500
agactcctgc tgtatgtgtt ttcctttcac tctgagccac agccagaggg caggcattca 7560
gtctcctctt caggctgggg ctggggcact gagaactcac ccaacacctt gctctcactc 7620
cttctgcaaa acaagaaaga gctttgtgct gcagtagcca tgaagaatga aaggaaggct 7680
ttaactaaaa aatgtcagag attattttca accccttact gtggatcacc agcaaggagg 7740
aaacacaaca cagagacatt ttttcccctc aaattatcaa aagaatcact gcatttgtta 7800
aagagagcaa ctgaatcagg aagcagagtt ttgaacatat cagaagttag gaatctgcat 7860
cagagacaaa tgcagtcatg gttgtttgct gcataccagc cctaatcatt agaagcctca 7920
tggacttcaa acatcattcc ctctgacaag atgctctagc ctaactccat gagataaaat 7980
aaatctgcct ttcagagcca aagaagagtc caccagcttc ttctcagtgt gaacaagagc 8040
tccagtcagg ttagtcagtc cagtgcagta gaggagacca gtctgcatcc tctaattttc 8100
aaaggcaaga agatttgttt accctggaca ccaggcacaa gtgaggtcac agagctctta 8160
gatatgcagt cctcatgagt gaggagacta aagcgcatgc catcaagact tcagtgtaga 8220
gaaaacctcc aaaaaagcct cctcactact tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct 8280
cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc agccatgggg cggagaatgg gcggaactgg 8340
gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct gactaattga 8400
gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca cacctggttg 8460
ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc 8520
cacaccctaa ctgacacaca ttccacagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 8580
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 8640
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 8700
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 8760
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 8820
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 8880
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 8940
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 9000
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 9060
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 9120
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 9180
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 9240
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 9300
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 9360
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 9420
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 9480
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 9540
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 9600
catagttgcc tgactcctgc aaaccacgtt gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 9660
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 9720
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc 9780
aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt 9840
gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc 9900
aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa 9960
tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc 10020
accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt 10080
gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt 10140
aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat 10200
aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa 10260
gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt 10320
gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt 10380
ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt 10440
gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat 10500
atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaagggcg gcctgccacc 10560
atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg 10620
gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gagggcgcgc 10680
caagtcgacg tccggcagtc 10700
<210> 8
<211> 10700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactatt agatctgatg gccgcgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 360
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 420
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 480
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 540
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 600
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 660
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 720
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 780
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 840
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 900
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc 960
tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1020
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 1080
cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc 1140
cgggagctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1200
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattcctc gaagatccga 1260
agggaaagtc ttccacgact gtgggatccg ttcgaagata tcaccggttg agccaccatg 1320
gaattcagca gccccagcag agaggaatgc cccaagcctc tgagccgggt gtcaatcatg 1380
gccggatctc tgacaggact gctgctgctt caggccgtgt cttgggcttc tggcgctaga 1440
ccttgcatcc ccaagagctt cggctacagc agcgtcgtgt gcgtgtgcaa tgccacctac 1500
tgcgacagct tcgaccctcc tacctttcct gctctgggca ccttcagcag atacgagagc 1560
accagatccg gcagacggat ggaactgagc atgggaccca tccaggccaa tcacacaggc 1620
actggcctgc tgctgacact gcagcctgag cagaaattcc agaaagtgaa aggcttcggc 1680
ggagccatga cagatgccgc cgctctgaat atcctggctc tgtctccacc agctcagaac 1740
ctgctgctca agagctactt cagcgaggaa ggcatcggct acaacatcat cagagtgccc 1800
atggccagct gcgacttcag catcaggacc tacacctacg ccgacacacc cgacgatttc 1860
cagctgcaca acttcagcct gcctgaagag gacaccaagc tgaagatccc tctgatccac 1920
agagccctgc agctggcaca aagacccgtg tcactgctgg cctctccatg gacatctccc 1980
acctggctga aaacaaatgg cgccgtgaat ggcaagggca gcctgaaagg ccaacctggc 2040
gacatctacc accagacctg ggccagatac ttcgtgaagt tcctggacgc ctatgccgag 2100
cacaagctgc agttttgggc cgtgacagcc gagaacgaac cttctgctgg actgctgagc 2160
ggctacccct ttcagtgcct gggctttaca cccgagcacc agcgggactt tatcgcccgt 2220
gatctgggac ccacactggc caatagcacc caccataatg tgcggctgct gatgctggac 2280
gaccagagac tgcttctgcc ccactgggct aaagtggtgc tgacagatcc tgaggccgcc 2340
aaatacgtgc acggaatcgc cgtgcactgg tatctggact ttctggcccc tgccaaggcc 2400
acactgggag agacacacag actgttcccc aacaccatgc tgttcgccag cgaagcctgt 2460
gtgggcagca agttttggga acagagcgtg cggctcggca gctgggatag aggcatgcag 2520
tacagccaca gcatcatcac caacctgctg taccacgtcg tcggctggac cgactggaat 2580
ctggccctga atcctgaagg cggccctaac tgggtccgaa acttcgtgga cagccccatc 2640
atcgtggaca tcaccaagga caccttctac aagcagccca tgttctacca cctgggacac 2700
ttcagcaagt tcatccccga gggctctcag cgcgttggac tggtggcttc ccagaagaac 2760
gatctggacg ccgtggctct gatgcaccct gatggatctg ctgtggtggt ggtcctgaac 2820
cgcagcagca aagatgtgcc cctgaccatc aaggatcccg ccgtgggatt cctggaaaca 2880
atcagccctg gctactccat ccacacctac ctgtggcgta gacagtgaca attgttaatt 2940
aagtttaaac cctcgaggcc gcaagcttat cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg 3000
tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 3060
tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta 3120
taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt 3180
ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca 3240
gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc 3300
ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 3360
gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg 3420
cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg 3480
cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat 3540
ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta gagctcgctg atcagcctcg 3600
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 3660
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 3720
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 3780
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gtgaacatat tgactgaatt ccctgcaggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 3900
tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 3960
tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctgcggcc 4020
gctcgtacgg tctcgaggaa ttcctgcagg ataacttgcc aacctcattc taaaatgtat 4080
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ccactaaata tcaagattta gagcaaagca tgagatgtgt ggggatagac agtgaggctg 4200
ataaaataga gtagagctca gaaacagacc cattgatata tgtaagtgac ctatgaaaaa 4260
aatatggcat tttacaatgg gaaaatgatg gtctttttct tttttagaaa aacagggaaa 4320
tatatttata tgtaaaaaat aaaagggaac ccatatgtca taccatacac acaaaaaaat 4380
tccagtgaat tataagtcta aatggagaag gcaaaacttt aaatctttta gaaaataata 4440
tagaagcatg cagaccagcc tggccaacat gatgaaaccc tctctactaa taataaaatc 4500
agtagaacta ctcaggacta ctttgagtgg gaagtccttt tctatgaaga cttctttggc 4560
caaaattagg ctctaaatgc aaggagatag tgcatcatgc ctggctgcac ttactgataa 4620
atgatgttat caccatcttt aaccaaatgc acaggaacaa gttatggtac tgatgtgctg 4680
gattgagaag gagctctact tccttgacag gacacatttg tatcaactta aaaaagcaga 4740
tttttgccag cagaactatt cattcagagg taggaaactt agaatagatg atgtcactga 4800
ttagcatggc ttccccatct ccacagctgc ttcccaccca ggttgcccac agttgagttt 4860
gtccagtgct cagggctgcc cactctcagt aagaagcccc acaccagccc ctctccaaat 4920
atgttggctg ttccttccat taaagtgacc ccactttaga gcagcaagtg gatttctgtt 4980
tcttacagtt caggaaggag gagtcagctg tgagaacctg gagcctgaga tgcttctaag 5040
tcccactgct actggggtca gggaagccag actccagcat cagcagtcag gagcactaag 5100
cccttgccaa catcctgttt ctcagagaaa ctgcttccat tataatggtt gtcctttttt 5160
aagctatcaa gccaaacaac cagtgtctac cattattctc atcacctgaa gccaagggtt 5220
ctagcaaaag tcaagctgtc ttgtaatggt tgatgtgcct ccagcttctg tcttcagtca 5280
ctccactctt agcctgctct gaatcaactc tgaccacagt tccctggagc ccctgccacc 5340
tgctgcccct gccaccttct ccatctgcag tgctgtgcag ccttctgcac tcttgcagag 5400
ctaataggtg gagacttgaa ggaagaggag gaaagtttct cataatagcc ttgctgcaag 5460
ctcaaatggg aggtgggcac tgtgcccagg agccttggag caaaggctgt gcccaacctc 5520
tgactgcatc caggtttggt cttgacagag ataagaagcc ctggcttttg gagccaaaat 5580
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tttctgctcc agcttcttca ggctcaacct tcatcagaat agatagaaag agaggctgtg 5700
agggttctta aaacagaagc aaatctgact cagagaataa acaacctcct agtaaactac 5760
agcttagaca gagcatctgg tggtgagtgt gctcagtgtc ctactcaact gtctggtatc 5820
agccctcatg aggacttctc ttctttccct catagacctc catctctgtt ttccttagcc 5880
tgcagaaatc tggatggcta ttcacagaat gcctgtgctt tcagagttgc attttttctc 5940
tggtattctg gttcaagcat ttgaaggtag gaaaggttct ccaagtgcaa gaaagccagc 6000
cctgagcctc aactgcctgg ctagtgtggt cagtaggatg caaaggctgt tgaatgccac 6060
aaggccaaac tttaacctgt gtaccacaag cctagcagca gaggcagctc tgctcactgg 6120
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ccttacctct gccctaccca ggacaaaccc aagagccact gtttctgtga tgtcctctcc 6240
agccctaatt aggcatcatg acttcagcct gaccttccat gctcagaagc agtgctaatc 6300
cacttcagat gagctgctct atgcaacaca ggcagagcct acaaaccttt gcaccagagc 6360
cctccacata tcagtgtttg ttcatactca cttcaacagc aaatgtgact gctgagatta 6420
agattttaca caagatggtc tgtaatttca cagttagttt tatcccatta ggtatgaaag 6480
aattagcata attcccctta aacatgaatg aatcttagat tttttaataa atagttttgg 6540
aagtaaagac agagacatca ggagcacaag gaatagcctg agaggacaaa cagaacaaga 6600
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accagcagcc ccaggctatc agagcccagt gaagagaagt accatgaaag ccacagctct 6720
aaccaccctg ttccagagtg acagacagtc cccaagacaa gccagcctga gccagagaga 6780
gaactgcaag agaaagtttc taatttaggt tctgttagat tcagacaagt gcaggtcatc 6840
ctctctccac agctactcac ctctccagcc taacaaagcc tgcagtccac actccaaccc 6900
tggtgtctca cctcctagcc tctcccaaca tcctgctctc tgaccatctt ctgcatctct 6960
catctcacca tctcccactg tctacagcct actcttgcaa ctaccatctc attttctgac 7020
atcctgtcta catcttctgc catactctgc catctaccat accacctctt accatctacc 7080
acaccatctt ttatctccat ccctctcaga agcctccaag ctgaatcctg ctttatgtgt 7140
tcatctcagc ccctgcatgg aaagctgacc ccagaggcag aactattccc agagagcttg 7200
gccaagaaaa acaaaactac cagcctggcc aggctcagga gtagtaagct gcagtgtctg 7260
ttgtgttcta gcttcaacag ctgcaggagt tccactctca aatgctccac atttctcaca 7320
tcctcctgat tctggtcact acccatcttc aaagaacaga atatctcaca tcagcatact 7380
gtgaaggact agtcatgggt gcagctgctc agagctgcaa agtcattctg gatggtggag 7440
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cttctgcaaa acaagaaaga gctttgtgct gcagtagcca tgaagaatga aaggaaggct 7680
ttaactaaaa aatgtcagag attattttca accccttact gtggatcacc agcaaggagg 7740
aaacacaaca cagagacatt ttttcccctc aaattatcaa aagaatcact gcatttgtta 7800
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cagagacaaa tgcagtcatg gttgtttgct gcataccagc cctaatcatt agaagcctca 7920
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tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 9540
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 9600
catagttgcc tgactcctgc aaaccacgtt gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca 9660
caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca 9720
aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc 9780
aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt 9840
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aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa 9960
tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc 10020
accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt 10080
gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt 10140
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gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt 10320
gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt 10380
ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt 10440
gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat 10500
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gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gagggcgcgc 10680
caagtcgacg tccggcagtc 10700
<210> 9
<211> 10700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 360
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 420
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 480
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 540
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 600
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 660
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 720
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 780
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 840
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accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 1080
cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc 1140
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gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattcctc gaagatccga 1260
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acctggctga aaacaaatgg cgccgtgaat ggcaagggca gcctgaaagg ccaacctggc 2040
gacatctacc accagacctg ggccagatac ttcgtgaagt tcctggacgc ctatgccgag 2100
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tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta 3120
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ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 3360
gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg 3420
cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg 3480
cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat 3540
ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta gagctcgctg atcagcctcg 3600
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 3660
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 3720
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 3780
tgggaagaca atagcaggca tgctggggag agatccacga taacaaacag cttttttggg 3840
gtgaacatat tgactgaatt ccctgcaggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 3900
tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 3960
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ataaaataga gtagagctca gaaacagacc cattgatata tgtaagtgac ctatgaaaaa 4260
aatatggcat tttacaatgg gaaaatgatg gtctttttct tttttagaaa aacagggaaa 4320
tatatttata tgtaaaaaat aaaagggaac ccatatgtca taccatacac acaaaaaaat 4380
tccagtgaat tataagtcta aatggagaag gcaaaacttt aaatctttta gaaaataata 4440
tagaagcatg cagaccagcc tggccaacat gatgaaaccc tctctactaa taataaaatc 4500
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caaaattagg ctctaaatgc aaggagatag tgcatcatgc ctggctgcac ttactgataa 4620
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gattgagaag gagctctact tccttgacag gacacatttg tatcaactta aaaaagcaga 4740
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ttagcatggc ttccccatct ccacagctgc ttcccaccca ggttgcccac agttgagttt 4860
gtccagtgct cagggctgcc cactctcagt aagaagcccc acaccagccc ctctccaaat 4920
atgttggctg ttccttccat taaagtgacc ccactttaga gcagcaagtg gatttctgtt 4980
tcttacagtt caggaaggag gagtcagctg tgagaacctg gagcctgaga tgcttctaag 5040
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cccttgccaa catcctgttt ctcagagaaa ctgcttccat tataatggtt gtcctttttt 5160
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ctagcaaaag tcaagctgtc ttgtaatggt tgatgtgcct ccagcttctg tcttcagtca 5280
ctccactctt agcctgctct gaatcaactc tgaccacagt tccctggagc ccctgccacc 5340
tgctgcccct gccaccttct ccatctgcag tgctgtgcag ccttctgcac tcttgcagag 5400
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tttctgctcc agcttcttca ggctcaacct tcatcagaat agatagaaag agaggctgtg 5700
agggttctta aaacagaagc aaatctgact cagagaataa acaacctcct agtaaactac 5760
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agccctcatg aggacttctc ttctttccct catagacctc catctctgtt ttccttagcc 5880
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agccctaatt aggcatcatg acttcagcct gaccttccat gctcagaagc agtgctaatc 6300
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catctcacca tctcccactg tctacagcct actcttgcaa ctaccatctc attttctgac 7020
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cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 9600
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gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt 10380
ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt 10440
gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat 10500
atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaagggcg gcctgccacc 10560
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctgagcgg ctaccccttt cagtgcctgg gctttacacc cgagcaccag cgggacttta 2700
tcgcccgtga tctgggaccc acactggcca atagcaccca ccataatgtg cggctgctga 2760
tgctggacga ccagagactg cttctgcccc actgggctaa agtggtgctg acagatcctg 2820
aggccgccaa atacgtgcac ggaatcgccg tgcactggta tctggacttt ctggcccctg 2880
ccaaggccac actgggagag acacacagac tgttccccaa caccatgctg ttcgccagcg 2940
aagcctgtgt gggcagcaag ttttgggaac agagcgtgcg gctcggcagc tgggatagag 3000
gcatgcagta cagccacagc atcatcacca acctgctgta ccacgtcgtc ggctggaccg 3060
actggaatct ggccctgaat cctgaaggcg gccctaactg ggtccgaaac ttcgtggaca 3120
gccccatcat cgtggacatc accaaggaca ccttctacaa gcagcccatg ttctaccacc 3180
tgggacactt cagcaagttc atccccgagg gctctcagcg cgttggactg gtggcttccc 3240
agaagaacga tctggacgcc gtggctctga tgcaccctga tggatctgct gtggtggtgg 3300
tcctgaaccg cagcagcaaa gatgtgcccc tgaccatcaa ggatcccgcc gtgggattcc 3360
tggaaacaat cagccctggc tactccatcc acacctacct gtggcgtaga cagtgacaat 3420
tgttaattaa gtttaaaccc tcgaggccgc aagcttatcg ataatcaacc tctggattac 3480
aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 3540
tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 3600
tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa 3660
cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc 3720
acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc 3780
atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 3840
gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg 3900
attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct 3960
tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg 4020
agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgactaga gctcgctgat 4080
cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 4140
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 4200
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 4260
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggagag atccacgata acaaacagct 4320
tttttggggt gaacatattg actgaattcc ctgcaggttg gccactccct ctctgcgcgc 4380
tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 4440
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 4500
ctgcggccgc tcgtacggtc tcgaggaatt cctgcaggat aacttgccaa cctcattcta 4560
aaatgtatat agaagcccaa aagacaataa caaaaatatt cttgtagaac aaaatgggaa 4620
agaatgttcc actaaatatc aagatttaga gcaaagcatg agatgtgtgg ggatagacag 4680
tgaggctgat aaaatagagt agagctcaga aacagaccca ttgatatatg taagtgacct 4740
atgaaaaaaa tatggcattt tacaatggga aaatgatggt ctttttcttt tttagaaaaa 4800
cagggaaata tatttatatg taaaaaataa aagggaaccc atatgtcata ccatacacac 4860
aaaaaaattc cagtgaatta taagtctaaa tggagaaggc aaaactttaa atcttttaga 4920
aaataatata gaagcatgca gaccagcctg gccaacatga tgaaaccctc tctactaata 4980
ataaaatcag tagaactact caggactact ttgagtggga agtccttttc tatgaagact 5040
tctttggcca aaattaggct ctaaatgcaa ggagatagtg catcatgcct ggctgcactt 5100
actgataaat gatgttatca ccatctttaa ccaaatgcac aggaacaagt tatggtactg 5160
atgtgctgga ttgagaagga gctctacttc cttgacagga cacatttgta tcaacttaaa 5220
aaagcagatt tttgccagca gaactattca ttcagaggta ggaaacttag aatagatgat 5280
gtcactgatt agcatggctt ccccatctcc acagctgctt cccacccagg ttgcccacag 5340
ttgagtttgt ccagtgctca gggctgccca ctctcagtaa gaagccccac accagcccct 5400
ctccaaatat gttggctgtt ccttccatta aagtgacccc actttagagc agcaagtgga 5460
tttctgtttc ttacagttca ggaaggagga gtcagctgtg agaacctgga gcctgagatg 5520
cttctaagtc ccactgctac tggggtcagg gaagccagac tccagcatca gcagtcagga 5580
gcactaagcc cttgccaaca tcctgtttct cagagaaact gcttccatta taatggttgt 5640
ccttttttaa gctatcaagc caaacaacca gtgtctacca ttattctcat cacctgaagc 5700
caagggttct agcaaaagtc aagctgtctt gtaatggttg atgtgcctcc agcttctgtc 5760
ttcagtcact ccactcttag cctgctctga atcaactctg accacagttc cctggagccc 5820
ctgccacctg ctgcccctgc caccttctcc atctgcagtg ctgtgcagcc ttctgcactc 5880
ttgcagagct aataggtgga gacttgaagg aagaggagga aagtttctca taatagcctt 5940
gctgcaagct caaatgggag gtgggcactg tgcccaggag ccttggagca aaggctgtgc 6000
ccaacctctg actgcatcca ggtttggtct tgacagagat aagaagccct ggcttttgga 6060
gccaaaatct aggtcagact taggcaggat tctcaaagtt tatcagcaga acatgaggca 6120
gaagaccctt tctgctccag cttcttcagg ctcaaccttc atcagaatag atagaaagag 6180
aggctgtgag ggttcttaaa acagaagcaa atctgactca gagaataaac aacctcctag 6240
taaactacag cttagacaga gcatctggtg gtgagtgtgc tcagtgtcct actcaactgt 6300
ctggtatcag ccctcatgag gacttctctt ctttccctca tagacctcca tctctgtttt 6360
ccttagcctg cagaaatctg gatggctatt cacagaatgc ctgtgctttc agagttgcat 6420
tttttctctg gtattctggt tcaagcattt gaaggtagga aaggttctcc aagtgcaaga 6480
aagccagccc tgagcctcaa ctgcctggct agtgtggtca gtaggatgca aaggctgttg 6540
aatgccacaa ggccaaactt taacctgtgt accacaagcc tagcagcaga ggcagctctg 6600
ctcactggaa ctctctgtct tctttctcct gagccttttc ttttcctgag ttttctagct 6660
ctcctcaacc ttacctctgc cctacccagg acaaacccaa gagccactgt ttctgtgatg 6720
tcctctccag ccctaattag gcatcatgac ttcagcctga ccttccatgc tcagaagcag 6780
tgctaatcca cttcagatga gctgctctat gcaacacagg cagagcctac aaacctttgc 6840
accagagccc tccacatatc agtgtttgtt catactcact tcaacagcaa atgtgactgc 6900
tgagattaag attttacaca agatggtctg taatttcaca gttagtttta tcccattagg 6960
tatgaaagaa ttagcataat tccccttaaa catgaatgaa tcttagattt tttaataaat 7020
agttttggaa gtaaagacag agacatcagg agcacaagga atagcctgag aggacaaaca 7080
gaacaagaaa gagtctggaa atacacagga tgttcttggc ctcctcaaag caagtgcaag 7140
cagatagtac cagcagcccc aggctatcag agcccagtga agagaagtac catgaaagcc 7200
acagctctaa ccaccctgtt ccagagtgac agacagtccc caagacaagc cagcctgagc 7260
cagagagaga actgcaagag aaagtttcta atttaggttc tgttagattc agacaagtgc 7320
aggtcatcct ctctccacag ctactcacct ctccagccta acaaagcctg cagtccacac 7380
tccaaccctg gtgtctcacc tcctagcctc tcccaacatc ctgctctctg accatcttct 7440
gcatctctca tctcaccatc tcccactgtc tacagcctac tcttgcaact accatctcat 7500
tttctgacat cctgtctaca tcttctgcca tactctgcca tctaccatac cacctcttac 7560
catctaccac accatctttt atctccatcc ctctcagaag cctccaagct gaatcctgct 7620
ttatgtgttc atctcagccc ctgcatggaa agctgacccc agaggcagaa ctattcccag 7680
agagcttggc caagaaaaac aaaactacca gcctggccag gctcaggagt agtaagctgc 7740
agtgtctgtt gtgttctagc ttcaacagct gcaggagttc cactctcaaa tgctccacat 7800
ttctcacatc ctcctgattc tggtcactac ccatcttcaa agaacagaat atctcacatc 7860
agcatactgt gaaggactag tcatgggtgc agctgctcag agctgcaaag tcattctgga 7920
tggtggagag cttacaaaca tttcatgatg ctccccccgc tctgatggct ggagcccaat 7980
ccctacacag actcctgctg tatgtgtttt cctttcactc tgagccacag ccagagggca 8040
ggcattcagt ctcctcttca ggctggggct ggggcactga gaactcaccc aacaccttgc 8100
tctcactcct tctgcaaaac aagaaagagc tttgtgctgc agtagccatg aagaatgaaa 8160
ggaaggcttt aactaaaaaa tgtcagagat tattttcaac cccttactgt ggatcaccag 8220
caaggaggaa acacaacaca gagacatttt ttcccctcaa attatcaaaa gaatcactgc 8280
atttgttaaa gagagcaact gaatcaggaa gcagagtttt gaacatatca gaagttagga 8340
atctgcatca gagacaaatg cagtcatggt tgtttgctgc ataccagccc taatcattag 8400
aagcctcatg gacttcaaac atcattccct ctgacaagat gctctagcct aactccatga 8460
gataaaataa atctgccttt cagagccaaa gaagagtcca ccagcttctt ctcagtgtga 8520
acaagagctc cagtcaggtt agtcagtcca gtgcagtaga ggagaccagt ctgcatcctc 8580
taattttcaa aggcaagaag atttgtttac cctggacacc aggcacaagt gaggtcacag 8640
agctcttaga tatgcagtcc tcatgagtga ggagactaaa gcgcatgcca tcaagacttc 8700
agtgtagaga aaacctccaa aaaagcctcc tcactacttc tggaatagct cagaggccga 8760
ggcggcctcg gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag ccatggggcg gagaatgggc 8820
ggaactgggc ggagttaggg gcgggatggg cggagttagg ggcgggacta tggttgctga 8880
ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg actttccaca 8940
cctggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg 9000
ggactttcca caccctaact gacacacatt ccacagctgc attaatgaat cggccaacgc 9060
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 9120
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 9180
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 9240
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 9300
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 9360
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 9420
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 9480
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 9540
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 9600
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 9660
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 9720
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 9780
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 9840
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 9900
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 9960
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 10020
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 10080
cgttcatcca tagttgcctg actcctgcaa accacgttgt gtctcaaaat ctctgatgtt 10140
acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca 10200
gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg aggccgcgat 10260
taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc 10320
aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga 10380
aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc 10440
tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat 10500
ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg 10560
attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc 10620
ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac 10680
gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg 10740
ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca 10800
ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta 10860
ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact 10920
gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata 10980
atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taagggcggc 11040
ctgccaccat acccacgccg aaacaagcgc tcatgagccc gaagtggcga gcccgatctt 11100
ccccatcggt gatgtcggcg atataggcgc cagcaaccgc acctgtggcg ccggtgatga 11160
gggcgcgcca agtcgacgtc cggcagtc 11188
<210> 12
<211> 11187
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac ctagttataa 60
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 120
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 180
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 240
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 300
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 360
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag 420
gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg 480
tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc 540
gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 600
gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 660
cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc 720
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 780
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 840
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagctaga 900
gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg 960
gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattcctcg aagatccgaa gggaaagtct 1020
tccacgactg tgggatccgt tcgaagatat caccggttga gccaccatgg aattcagcag 1080
ccccagcaga gaggaatgcc ccaagcctct gagccgggtg tcaatcatgg ccggatctct 1140
gacaggactg ctgctgcttc aggccgtgtc ttgggcttct ggcgctagac cttgcatccc 1200
caagagcttc ggctacagca gcgtcgtgtg cgtgtgcaat gccacctact gcgacagctt 1260
cgaccctcct acctttcctg ctctgggcac cttcagcaga tacgagagca ccagatccgg 1320
cagacggatg gaactgagca tgggacccat ccaggccaat cacacaggca ctggcctgct 1380
gctgacactg cagcctgagc agaaattcca gaaagtgaaa ggcttcggcg gagccatgac 1440
agatgccgcc gctctgaata tcctggctct gtctccacca gctcagaacc tgctgctcaa 1500
gagctacttc agcgaggaag gcatcggcta caacatcatc agagtgccca tggccagctg 1560
cgacttcagc atcaggacct acacctacgc cgacacaccc gacgatttcc agctgcacaa 1620
cttcagcctg cctgaagagg acaccaagct gaagatccct ctgatccaca gagccctgca 1680
gctggcacaa agacccgtgt cactgctggc ctctccatgg acatctccca cctggctgaa 1740
aacaaatggc gccgtgaatg gcaagggcag cctgaaaggc caacctggcg acatctacca 1800
ccagacctgg gccagatact tcgtgaagtt cctggacgcc tatgccgagc acaagctgca 1860
gttttgggcc gtgacagccg agaacgaacc ttctgctgga ctgctgagcg gctacccctt 1920
tcagtgcctg ggctttacac ccgagcacca gcgggacttt atcgcccgtg atctgggacc 1980
cacactggcc aatagcaccc accataatgt gcggctgctg atgctggacg accagagact 2040
gcttctgccc cactgggcta aagtggtgct gacagatcct gaggccgcca aatacgtgca 2100
cggaatcgcc gtgcactggt atctggactt tctggcccct gccaaggcca cactgggaga 2160
gacacacaga ctgttcccca acaccatgct gttcgccagc gaagcctgtg tgggcagcaa 2220
gttttgggaa cagagcgtgc ggctcggcag ctgggataga ggcatgcagt acagccacag 2280
catcatcacc aacctgctgt accacgtcgt cggctggacc gactggaatc tggccctgaa 2340
tcctgaaggc ggccctaact gggtccgaaa cttcgtggac agccccatca tcgtggacat 2400
caccaaggac accttctaca agcagcccat gttctaccac ctgggacact tcagcaagtt 2460
catccccgag ggctctcagc gcgttggact ggtggcttcc cagaagaacg atctggacgc 2520
cgtggctctg atgcaccctg atggatctgc tgtggtggtg gtcctgaacc gcagcagcaa 2580
agatgtgccc ctgaccatca aggatcccgc cgtgggattc ctggaaacaa tcagccctgg 2640
ctactccatc cacacctacc tgtggcgtag acagtgacaa ttgttaatta agtttaaacc 2700
ctcgaggccg caagcttatc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 2760
ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 2820
tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 2880
tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 2940
tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 3000
ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 3060
gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat 3120
catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 3180
tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 3240
ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 3300
ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgactag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 3360
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 3420
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 3480
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 3540
tagcaggcat gctggggaga gatccacgat aacaaacagc ttttttgggg tgaacatatt 3600
gactgaattc cctgcaggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 3660
gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga 3720
gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt cctgcggccg ctcgtacggt 3780
ctcgaggaat tcctgcagga taacttgcca acctcattct aaaatgtata tagaagccca 3840
aaagacaata acaaaaatat tcttgtagaa caaaatggga aagaatgttc cactaaatat 3900
caagatttag agcaaagcat gagatgtgtg gggatagaca gtgaggctga taaaatagag 3960
tagagctcag aaacagaccc attgatatat gtaagtgacc tatgaaaaaa atatggcatt 4020
ttacaatggg aaaatgatgg tctttttctt ttttagaaaa acagggaaat atatttatat 4080
gtaaaaaata aaagggaacc catatgtcat accatacaca caaaaaaatt ccagtgaatt 4140
ataagtctaa atggagaagg caaaacttta aatcttttag aaaataatat agaagcatgc 4200
agaccagcct ggccaacatg atgaaaccct ctctactaat aataaaatca gtagaactac 4260
tcaggactac tttgagtggg aagtcctttt ctatgaagac ttctttggcc aaaattaggc 4320
tctaaatgca aggagatagt gcatcatgcc tggctgcact tactgataaa tgatgttatc 4380
accatcttta accaaatgca caggaacaag ttatggtact gatgtgctgg attgagaagg 4440
agctctactt ccttgacagg acacatttgt atcaacttaa aaaagcagat ttttgccagc 4500
agaactattc attcagaggt aggaaactta gaatagatga tgtcactgat tagcatggct 4560
tccccatctc cacagctgct tcccacccag gttgcccaca gttgagtttg tccagtgctc 4620
agggctgccc actctcagta agaagcccca caccagcccc tctccaaata tgttggctgt 4680
tccttccatt aaagtgaccc cactttagag cagcaagtgg atttctgttt cttacagttc 4740
aggaaggagg agtcagctgt gagaacctgg agcctgagat gcttctaagt cccactgcta 4800
ctggggtcag ggaagccaga ctccagcatc agcagtcagg agcactaagc ccttgccaac 4860
atcctgtttc tcagagaaac tgcttccatt ataatggttg tcctttttta agctatcaag 4920
ccaaacaacc agtgtctacc attattctca tcacctgaag ccaagggttc tagcaaaagt 4980
caagctgtct tgtaatggtt gatgtgcctc cagcttctgt cttcagtcac tccactctta 5040
gcctgctctg aatcaactct gaccacagtt ccctggagcc cctgccacct gctgcccctg 5100
ccaccttctc catctgcagt gctgtgcagc cttctgcact cttgcagagc taataggtgg 5160
agacttgaag gaagaggagg aaagtttctc ataatagcct tgctgcaagc tcaaatggga 5220
ggtgggcact gtgcccagga gccttggagc aaaggctgtg cccaacctct gactgcatcc 5280
aggtttggtc ttgacagaga taagaagccc tggcttttgg agccaaaatc taggtcagac 5340
ttaggcagga ttctcaaagt ttatcagcag aacatgaggc agaagaccct ttctgctcca 5400
gcttcttcag gctcaacctt catcagaata gatagaaaga gaggctgtga gggttcttaa 5460
aacagaagca aatctgactc agagaataaa caacctccta gtaaactaca gcttagacag 5520
agcatctggt ggtgagtgtg ctcagtgtcc tactcaactg tctggtatca gccctcatga 5580
ggacttctct tctttccctc atagacctcc atctctgttt tccttagcct gcagaaatct 5640
ggatggctat tcacagaatg cctgtgcttt cagagttgca ttttttctct ggtattctgg 5700
ttcaagcatt tgaaggtagg aaaggttctc caagtgcaag aaagccagcc ctgagcctca 5760
actgcctggc tagtgtggtc agtaggatgc aaaggctgtt gaatgccaca aggccaaact 5820
ttaacctgtg taccacaagc ctagcagcag aggcagctct gctcactgga actctctgtc 5880
ttctttctcc tgagcctttt cttttcctga gttttctagc tctcctcaac cttacctctg 5940
ccctacccag gacaaaccca agagccactg tttctgtgat gtcctctcca gccctaatta 6000
ggcatcatga cttcagcctg accttccatg ctcagaagca gtgctaatcc acttcagatg 6060
agctgctcta tgcaacacag gcagagccta caaacctttg caccagagcc ctccacatat 6120
cagtgtttgt tcatactcac ttcaacagca aatgtgactg ctgagattaa gattttacac 6180
aagatggtct gtaatttcac agttagtttt atcccattag gtatgaaaga attagcataa 6240
ttccccttaa acatgaatga atcttagatt ttttaataaa tagttttgga agtaaagaca 6300
gagacatcag gagcacaagg aatagcctga gaggacaaac agaacaagaa agagtctgga 6360
aatacacagg atgttcttgg cctcctcaaa gcaagtgcaa gcagatagta ccagcagccc 6420
caggctatca gagcccagtg aagagaagta ccatgaaagc cacagctcta accaccctgt 6480
tccagagtga cagacagtcc ccaagacaag ccagcctgag ccagagagag aactgcaaga 6540
gaaagtttct aatttaggtt ctgttagatt cagacaagtg caggtcatcc tctctccaca 6600
gctactcacc tctccagcct aacaaagcct gcagtccaca ctccaaccct ggtgtctcac 6660
ctcctagcct ctcccaacat cctgctctct gaccatcttc tgcatctctc atctcaccat 6720
ctcccactgt ctacagccta ctcttgcaac taccatctca ttttctgaca tcctgtctac 6780
atcttctgcc atactctgcc atctaccata ccacctctta ccatctacca caccatcttt 6840
tatctccatc cctctcagaa gcctccaagc tgaatcctgc tttatgtgtt catctcagcc 6900
cctgcatgga aagctgaccc cagaggcaga actattccca gagagcttgg ccaagaaaaa 6960
caaaactacc agcctggcca ggctcaggag tagtaagctg cagtgtctgt tgtgttctag 7020
cttcaacagc tgcaggagtt ccactctcaa atgctccaca tttctcacat cctcctgatt 7080
ctggtcacta cccatcttca aagaacagaa tatctcacat cagcatactg tgaaggacta 7140
gtcatgggtg cagctgctca gagctgcaaa gtcattctgg atggtggaga gcttacaaac 7200
atttcatgat gctccccccg ctctgatggc tggagcccaa tccctacaca gactcctgct 7260
gtatgtgttt tcctttcact ctgagccaca gccagagggc aggcattcag tctcctcttc 7320
aggctggggc tggggcactg agaactcacc caacaccttg ctctcactcc ttctgcaaaa 7380
caagaaagag ctttgtgctg cagtagccat gaagaatgaa aggaaggctt taactaaaaa 7440
atgtcagaga ttattttcaa ccccttactg tggatcacca gcaaggagga aacacaacac 7500
agagacattt tttcccctca aattatcaaa agaatcactg catttgttaa agagagcaac 7560
tgaatcagga agcagagttt tgaacatatc agaagttagg aatctgcatc agagacaaat 7620
gcagtcatgg ttgtttgctg cataccagcc ctaatcatta gaagcctcat ggacttcaaa 7680
catcattccc tctgacaaga tgctctagcc taactccatg agataaaata aatctgcctt 7740
tcagagccaa agaagagtcc accagcttct tctcagtgtg aacaagagct ccagtcaggt 7800
tagtcagtcc agtgcagtag aggagaccag tctgcatcct ctaattttca aaggcaagaa 7860
gatttgttta ccctggacac caggcacaag tgaggtcaca gagctcttag atatgcagtc 7920
ctcatgagtg aggagactaa agcgcatgcc atcaagactt cagtgtagag aaaacctcca 7980
aaaaagcctc ctcactactt ctggaatagc tcagaggccg aggcggcctc ggcctctgca 8040
taaataaaaa aaattagtca gccatggggc ggagaatggg cggaactggg cggagttagg 8100
ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact atggttgctg actaattgag atgcatgctt 8160
tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac acctggttgc tgactaattg 8220
agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc acaccctaac 8280
tgacacacat tccacagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 8340
gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 8400
ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 8460
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 8520
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 8580
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 8640
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 8700
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 8760
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 8820
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 8880
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 8940
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 9000
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 9060
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 9120
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aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 9240
aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 9300
gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 9360
gactcctgca aaccacgttg tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa 9420
tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat 9480
gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc 9540
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tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct 9720
tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat 9780
ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt 9840
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tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga 10020
aatgcataag cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact 10080
tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg 10140
aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc 10200
ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt 10260
gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaagggcgg cctgccacca tacccacgcc 10320
gaaacaagcg ctcatgagcc cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc 10380
gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc gccggtgatg agggcgcgcc aagtcgacgt 10440
ccggcagtct tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 10500
aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 10560
gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctgctagc tctgggtatt taagcccgag 10620
tgagcacgca gggtctccat tttgaagcgg gaggttacgc gttcgtcgac tactagtggg 10680
taccagagcg tggtgactga gatgttttct aggaaacaca aaagatacaa aaaagaacac 10740
gtggaaggat agccaaaaag gggggctgcc cccatttcct gcaccccgct gcgatggctg 10800
gcaccatttg gaagacttcg agatacactg ttgagcgcag taagacaaca gtgtatctcg 10860
aagtcttcca gatggggcca gccggtccac tctgtatcca ggccagttct gcaaggcgtt 10920
cgaggaccac ccccctcccc tcgccaccag ggtggtctca tacagaactt ataagattcc 10980
caaatccaaa gacatttcac gtttatggtg atttcccaga acacatagcg acatgcaaat 11040
attgcagggc gccactcccc tgtccctcac agccatcttc ctgccagggc gcacgcgcgc 11100
tgggtgttcc cgcctagtga cactgggccc gcgattcctt ggagcgggtt gatgacgtca 11160
gcgtttccca tggtgaatcc ctaggtt 11187
<210> 13
<211> 10960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 13
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480
caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1020
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 1080
gcgcttggtt taatgacggc ttgtcctggt ggcgagggga ggggggtggt cctcgaacgc 1140
cttgcagaac tggcctggat acagagtgga ccggctggcc ccatctggaa gacttcgaga 1200
tacactgttg tcttactgcg ctcaacagtg tatctcgaag tcttccaaat ggtgccagcc 1260
atcgcagcgg ggtgcaggaa atgggggcag cccccctttt tggctatcct tccacgtgtt 1320
cttttttgta tcttttgtgt ttcctagaaa acatctcagt caccaccttt ctgtggctgc 1380
gtgaaagcct tgaggggctc cgggagctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt 1440
ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa 1500
agaattcctc gaagatccga agggaaagtc ttccacgact gtgggatccg ttcgaagata 1560
tcaccggttg agccaccatg gaattcagca gccccagcag agaggaatgc cccaagcctc 1620
tgagccgggt gtcaatcatg gccggatctc tgacaggact gctgctgctt caggccgtgt 1680
cttgggcttc tggcgctaga ccttgcatcc ccaagagctt cggctacagc agcgtcgtgt 1740
gcgtgtgcaa tgccacctac tgcgacagct tcgaccctcc tacctttcct gctctgggca 1800
ccttcagcag atacgagagc accagatccg gcagacggat ggaactgagc atgggaccca 1860
tccaggccaa tcacacaggc actggcctgc tgctgacact gcagcctgag cagaaattcc 1920
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tgtctccacc agctcagaac ctgctgctca agagctactt cagcgaggaa ggcatcggct 2040
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cctctccatg gacatctccc acctggctga aaacaaatgg cgccgtgaat ggcaagggca 2280
gcctgaaagg ccaacctggc gacatctacc accagacctg ggccagatac ttcgtgaagt 2340
tcctggacgc ctatgccgag cacaagctgc agttttgggc cgtgacagcc gagaacgaac 2400
cttctgctgg actgctgagc ggctacccct ttcagtgcct gggctttaca cccgagcacc 2460
agcgggactt tatcgcccgt gatctgggac ccacactggc caatagcacc caccataatg 2520
tgcggctgct gatgctggac gaccagagac tgcttctgcc ccactgggct aaagtggtgc 2580
tgacagatcc tgaggccgcc aaatacgtgc acggaatcgc cgtgcactgg tatctggact 2640
ttctggcccc tgccaaggcc acactgggag agacacacag actgttcccc aacaccatgc 2700
tgttcgccag cgaagcctgt gtgggcagca agttttggga acagagcgtg cggctcggca 2760
gctgggatag aggcatgcag tacagccaca gcatcatcac caacctgctg taccacgtcg 2820
tcggctggac cgactggaat ctggccctga atcctgaagg cggccctaac tgggtccgaa 2880
acttcgtgga cagccccatc atcgtggaca tcaccaagga caccttctac aagcagccca 2940
tgttctacca cctgggacac ttcagcaagt tcatccccga gggctctcag cgcgttggac 3000
tggtggcttc ccagaagaac gatctggacg ccgtggctct gatgcaccct gatggatctg 3060
ctgtggtggt ggtcctgaac cgcagcagca aagatgtgcc cctgaccatc aaggatcccg 3120
ccgtgggatt cctggaaaca atcagccctg gctactccat ccacacctac ctgtggcgta 3180
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cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt 3300
acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct 3360
ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 3420
gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 3480
ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc 3540
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 3600
actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt 3660
gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca 3720
gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt 3780
cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta 3840
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aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 4020
aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggag agatccacga 4080
taacaaacag cttttttggg gtgaacatat tgactgaatt ccctgcaggt tggccactcc 4140
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ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat 4260
cactaggggt tcctgcggcc gctcgtacgg tctcgaggaa ttcctgcagg ataacttgcc 4320
aacctcattc taaaatgtat atagaagccc aaaagacaat aacaaaaata ttcttgtaga 4380
acaaaatggg aaagaatgtt ccactaaata tcaagattta gagcaaagca tgagatgtgt 4440
ggggatagac agtgaggctg ataaaataga gtagagctca gaaacagacc cattgatata 4500
tgtaagtgac ctatgaaaaa aatatggcat tttacaatgg gaaaatgatg gtctttttct 4560
tttttagaaa aacagggaaa tatatttata tgtaaaaaat aaaagggaac ccatatgtca 4620
taccatacac acaaaaaaat tccagtgaat tataagtcta aatggagaag gcaaaacttt 4680
aaatctttta gaaaataata tagaagcatg cagaccagcc tggccaacat gatgaaaccc 4740
tctctactaa taataaaatc agtagaacta ctcaggacta ctttgagtgg gaagtccttt 4800
tctatgaaga cttctttggc caaaattagg ctctaaatgc aaggagatag tgcatcatgc 4860
ctggctgcac ttactgataa atgatgttat caccatcttt aaccaaatgc acaggaacaa 4920
gttatggtac tgatgtgctg gattgagaag gagctctact tccttgacag gacacatttg 4980
tatcaactta aaaaagcaga tttttgccag cagaactatt cattcagagg taggaaactt 5040
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ggttgcccac agttgagttt gtccagtgct cagggctgcc cactctcagt aagaagcccc 5160
acaccagccc ctctccaaat atgttggctg ttccttccat taaagtgacc ccactttaga 5220
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gagcctgaga tgcttctaag tcccactgct actggggtca gggaagccag actccagcat 5340
cagcagtcag gagcactaag cccttgccaa catcctgttt ctcagagaaa ctgcttccat 5400
tataatggtt gtcctttttt aagctatcaa gccaaacaac cagtgtctac cattattctc 5460
atcacctgaa gccaagggtt ctagcaaaag tcaagctgtc ttgtaatggt tgatgtgcct 5520
ccagcttctg tcttcagtca ctccactctt agcctgctct gaatcaactc tgaccacagt 5580
tccctggagc ccctgccacc tgctgcccct gccaccttct ccatctgcag tgctgtgcag 5640
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catctctgtt ttccttagcc tgcagaaatc tggatggcta ttcacagaat gcctgtgctt 6180
tcagagttgc attttttctc tggtattctg gttcaagcat ttgaaggtag gaaaggttct 6240
ccaagtgcaa gaaagccagc cctgagcctc aactgcctgg ctagtgtggt cagtaggatg 6300
caaaggctgt tgaatgccac aaggccaaac tttaacctgt gtaccacaag cctagcagca 6360
gaggcagctc tgctcactgg aactctctgt cttctttctc ctgagccttt tcttttcctg 6420
agttttctag ctctcctcaa ccttacctct gccctaccca ggacaaaccc aagagccact 6480
gtttctgtga tgtcctctcc agccctaatt aggcatcatg acttcagcct gaccttccat 6540
gctcagaagc agtgctaatc cacttcagat gagctgctct atgcaacaca ggcagagcct 6600
acaaaccttt gcaccagagc cctccacata tcagtgtttg ttcatactca cttcaacagc 6660
aaatgtgact gctgagatta agattttaca caagatggtc tgtaatttca cagttagttt 6720
tatcccatta ggtatgaaag aattagcata attcccctta aacatgaatg aatcttagat 6780
tttttaataa atagttttgg aagtaaagac agagacatca ggagcacaag gaatagcctg 6840
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catcaagact tcagtgtaga gaaaacctcc aaaaaagcct cctcactact tctggaatag 8520
ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc agccatgggg 8580
cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac 8640
tatggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg 8700
ggactttcca cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc 8760
tggggagcct ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca ttccacagct gcattaatga 8820
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 8880
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 8940
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 9000
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 9060
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 9120
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 9180
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 9240
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 9300
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 9360
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 9420
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 9480
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 9540
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 9600
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 9660
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 9720
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 9780
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 9840
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactcctgc aaaccacgtt gtgtctcaaa 9900
atctctgatg ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg 9960
cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct 10020
cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg 10080
ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag 10140
agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca 10200
gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 10260
ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag 10320
aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt 10380
tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc 10440
aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 10500
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg 10560
attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 10620
taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 10680
tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 10740
atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 10800
tctaagggcg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc 10860
gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg 10920
cgccggtgat gagggcgcgc caagtcgacg tccggcagtc 10960
<210> 14
<211> 536
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe
35 40 45
Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser
50 55 60
Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu
65 70 75 80
Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln
85 90 95
Ala Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln
100 105 110
Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu
130 135 140
Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val
145 150 155 160
Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp
165 170 175
Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp
180 185 190
Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln
195 200 205
Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu
210 215 220
Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu
245 250 255
Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu
260 265 270
Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu
275 280 285
Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly
290 295 300
Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu
305 310 315 320
Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr
325 330 335
Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr
340 345 350
Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg
355 360 365
Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser
370 375 380
Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met
385 390 395 400
Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly
405 410 415
Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp
420 425 430
Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys
450 455 460
Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys
465 470 475 480
Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val
485 490 495
Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys
500 505 510
Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile
515 520 525
His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln
530 535
<210> 15
<211> 1608
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
atggaattca gcagccccag cagagaggaa tgccccaagc ctctgagccg ggtgtcaatc 60
atggccggat ctctgacagg actgctgctg cttcaggccg tgtcttgggc ttctggcgct 120
agaccttgca tccccaagag cttcggctac agcagcgtcg tgtgcgtgtg caatgccacc 180
tactgcgaca gcttcgaccc tcctaccttt cctgctctgg gcaccttcag cagatacgag 240
agcaccagat ccggcagacg gatggaactg agcatgggac ccatccaggc caatcacaca 300
ggcactggcc tgctgctgac actgcagcct gagcagaaat tccagaaagt gaaaggcttc 360
ggcggagcca tgacagatgc cgccgctctg aatatcctgg ctctgtctcc accagctcag 420
aacctgctgc tcaagagcta cttcagcgag gaaggcatcg gctacaacat catcagagtg 480
cccatggcca gctgcgactt cagcatcagg acctacacct acgccgacac acccgacgat 540
ttccagctgc acaacttcag cctgcctgaa gaggacacca agctgaagat ccctctgatc 600
cacagagccc tgcagctggc acaaagaccc gtgtcactgc tggcctctcc atggacatct 660
cccacctggc tgaaaacaaa tggcgccgtg aatggcaagg gcagcctgaa aggccaacct 720
ggcgacatct accaccagac ctgggccaga tacttcgtga agttcctgga cgcctatgcc 780
gagcacaagc tgcagttttg ggccgtgaca gccgagaacg aaccttctgc tggactgctg 840
agcggctacc cctttcagtg cctgggcttt acacccgagc accagcggga ctttatcgcc 900
cgtgatctgg gacccacact ggccaatagc acccaccata atgtgcggct gctgatgctg 960
gacgaccaga gactgcttct gccccactgg gctaaagtgg tgctgacaga tcctgaggcc 1020
gccaaatacg tgcacggaat cgccgtgcac tggtatctgg actttctggc ccctgccaag 1080
gccacactgg gagagacaca cagactgttc cccaacacca tgctgttcgc cagcgaagcc 1140
tgtgtgggca gcaagttttg ggaacagagc gtgcggctcg gcagctggga tagaggcatg 1200
cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccacg tcgtcggctg gaccgactgg 1260
aatctggccc tgaatcctga aggcggccct aactgggtcc gaaacttcgt ggacagcccc 1320
atcatcgtgg acatcaccaa ggacaccttc tacaagcagc ccatgttcta ccacctggga 1380
cacttcagca agttcatccc cgagggctct cagcgcgttg gactggtggc ttcccagaag 1440
aacgatctgg acgccgtggc tctgatgcac cctgatggat ctgctgtggt ggtggtcctg 1500
aaccgcagca gcaaagatgt gcccctgacc atcaaggatc ccgccgtggg attcctggaa 1560
acaatcagcc ctggctactc catccacacc tacctgtggc gtagacag 1608
<210> 16
<211> 524
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Leu Gly Leu Lys Glu Cys Thr Arg Gly Ser Ala Val Trp
20 25 30
Cys Gln Asn Val Lys Thr Ala Ser Asp Cys Gly Ala Val Lys His Cys
35 40 45
Leu Gln Thr Val Trp Asn Lys Pro Thr Val Lys Ser Leu Pro Cys Asp
50 55 60
Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp Met Leu Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu Lys Thr Cys Asp Trp
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys Glu Ile Val Asp Ser
100 105 110
Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly Glu Met Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu Ser Leu Gln Lys His
130 135 140
Leu Ala Glu Leu Asn His Gln Lys Gln Leu Glu Ser Asn Lys Ile Pro
145 150 155 160
Glu Leu Asp Met Thr Glu Val Val Ala Pro Phe Met Ala Asn Ile Pro
165 170 175
Leu Leu Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Pro Arg Ser Lys Pro Gln Pro Lys
180 185 190
Asp Asn Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile
195 200 205
Gln Thr Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu
210 215 220
His Val Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile
225 230 235 240
Cys Lys Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met
245 250 255
Met His Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp
260 265 270
Glu Val Lys Glu Met Pro Met Gln Thr Leu Val Pro Ala Lys Val Ala
275 280 285
Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Leu Glu Leu Val Glu Pro Ile Lys Lys
290 295 300
His Glu Val Pro Ala Lys Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe
305 310 315 320
Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys
325 330 335
Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile
355 360 365
Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met
370 375 380
Leu His Leu Cys Ser Gly Thr Arg Leu Pro Ala Leu Thr Val His Val
385 390 395 400
Thr Gln Pro Lys Asp Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val
405 410 415
Gly Tyr Leu Asp Arg Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile
420 425 430
Leu Ala Ala Leu Glu Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln
435 440 445
Lys Gln Cys Asp Gln Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu
450 455 460
Ile Leu Val Glu Val Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly
465 470 475 480
Ala Cys Pro Ser Ala His Lys Pro Leu Leu Gly Thr Glu Lys Cys Ile
485 490 495
Trp Gly Pro Ser Tyr Trp Cys Gln Asn Thr Glu Thr Ala Ala Gln Cys
500 505 510
Asn Ala Val Glu His Cys Lys Arg His Val Trp Asn
515 520
<210> 17
<211> 1572
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
atgtacgccc tgttcctgct ggccagcctg ctgggcgccg ccctggccgg ccccgtgctg 60
ggcctgaagg agtgcacccg cggcagcgcc gtgtggtgcc agaacgtgaa gaccgccagc 120
gactgcggcg ccgtgaagca ctgcctgcag accgtgtgga acaagcccac cgtgaagagc 180
ctgccctgcg acatctgcaa ggacgtggtg accgccgccg gcgacatgct gaaggacaac 240
gccaccgagg aggagatcct ggtgtacctg gagaagacct gcgactggct gcccaagccc 300
aacatgagcg ccagctgcaa ggagatcgtg gacagctacc tgcccgtgat cctggacatc 360
atcaagggcg agatgagccg ccccggcgag gtgtgcagcg ccctgaacct gtgcgagagc 420
ctgcagaagc acctggccga gctgaaccac cagaagcagc tggagagcaa caagatcccc 480
gagctggaca tgaccgaggt ggtggccccc ttcatggcca acatccccct gctgctgtac 540
ccccaggacg gcccccgcag caagccccag cccaaggaca acggcgacgt gtgccaggac 600
tgcatccaga tggtgaccga catccagacc gccgtgcgca ccaacagcac cttcgtgcag 660
gccctggtgg agcacgtgaa ggaggagtgc gaccgcctgg gccccggcat ggccgacatc 720
tgcaagaact acatcagcca gtacagcgag atcgccatcc agatgatgat gcacatgcag 780
cccaaggaga tctgcgccct ggtgggcttc tgcgacgagg tgaaggagat gcccatgcag 840
accctggtgc ccgccaaggt ggccagcaag aacgtgatcc ccgccctgga gctggtggag 900
cccatcaaga agcacgaggt gcccgccaag agcgacgtgt actgcgaggt gtgcgagttc 960
ctggtgaagg aggtgaccaa gctgatcgac aacaacaaga ccgagaagga gatcctggac 1020
gccttcgaca agatgtgcag caagctgccc aagagcctga gcgaggagtg ccaggaggtg 1080
gtggacacct acggcagcag catcctgagc atcctgctgg aggaggtgag ccccgagctg 1140
gtgtgcagca tgctgcacct gtgcagcggc acccgcctgc ccgccctgac cgtgcacgtg 1200
acccagccca aggacggcgg cttctgcgag gtgtgcaaga agctggtggg ctacctggac 1260
cgcaacctgg agaagaacag caccaagcag gagatcctgg ccgccctgga gaagggctgc 1320
agcttcctgc ccgaccccta ccagaagcag tgcgaccagt tcgtggccga gtacgagccc 1380
gtgctgatcg agatcctggt ggaggtgatg gaccccagct tcgtgtgcct gaagatcggc 1440
gcctgcccca gcgcccacaa gcccctgctg ggcaccgaga agtgcatctg gggccccagc 1500
tactggtgcc agaacaccga gaccgccgcc cagtgcaacg ccgtggagca ctgcaagcgc 1560
cacgtgtgga ac 1572
<210> 18
<211> 478
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Met Gly Arg Cys Cys Phe Tyr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Ser Val Thr Leu Leu Val Ala Arg Val Phe Gln Lys Ala
20 25 30
Val Asp Gln Ser Ile Glu Lys Lys Ile Val Leu Arg Asn Gly Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ser Trp Glu Lys Pro Pro Leu Pro Val Tyr Thr Gln Phe
50 55 60
Tyr Phe Phe Asn Val Thr Asn Pro Glu Glu Ile Leu Arg Gly Glu Thr
65 70 75 80
Pro Arg Val Glu Glu Val Gly Pro Tyr Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Asn
85 90 95
Lys Ala Asn Ile Gln Phe Gly Asp Asn Gly Thr Thr Ile Ser Ala Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Tyr Val Phe Glu Arg Asp Gln Ser Val Gly Asp Pro
115 120 125
Lys Ile Asp Leu Ile Arg Thr Leu Asn Ile Pro Val Leu Thr Val Ile
130 135 140
Glu Trp Ser Gln Val His Phe Leu Arg Glu Ile Ile Glu Ala Met Leu
145 150 155 160
Lys Ala Tyr Gln Gln Lys Leu Phe Val Thr His Thr Val Asp Glu Leu
165 170 175
Leu Trp Gly Tyr Lys Asp Glu Ile Leu Ser Leu Ile His Val Phe Arg
180 185 190
Pro Asp Ile Ser Pro Tyr Phe Gly Leu Phe Tyr Glu Lys Asn Gly Thr
195 200 205
Asn Asp Gly Asp Tyr Val Phe Leu Thr Gly Glu Asp Ser Tyr Leu Asn
210 215 220
Phe Thr Lys Ile Val Glu Trp Asn Gly Lys Thr Ser Leu Asp Trp Trp
225 230 235 240
Ile Thr Asp Lys Cys Asn Met Ile Asn Gly Thr Asp Gly Asp Ser Phe
245 250 255
His Pro Leu Ile Thr Lys Asp Glu Val Leu Tyr Val Phe Pro Ser Asp
260 265 270
Phe Cys Arg Ser Val Tyr Ile Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Ser Val Gln
275 280 285
Gly Leu Pro Ala Phe Arg Tyr Lys Val Pro Ala Glu Ile Leu Ala Asn
290 295 300
Thr Ser Asp Asn Ala Gly Phe Cys Ile Pro Glu Gly Asn Cys Leu Gly
305 310 315 320
Ser Gly Val Leu Asn Val Ser Ile Cys Lys Asn Gly Ala Pro Ile Ile
325 330 335
Met Ser Phe Pro His Phe Tyr Gln Ala Asp Glu Arg Phe Val Ser Ala
340 345 350
Ile Glu Gly Met His Pro Asn Gln Glu Asp His Glu Thr Phe Val Asp
355 360 365
Ile Asn Pro Leu Thr Gly Ile Ile Leu Lys Ala Ala Lys Arg Phe Gln
370 375 380
Ile Asn Ile Tyr Val Lys Lys Leu Asp Asp Phe Val Glu Thr Gly Asp
385 390 395 400
Ile Arg Thr Met Val Phe Pro Val Met Tyr Leu Asn Glu Ser Val His
405 410 415
Ile Asp Lys Glu Thr Ala Ser Arg Leu Lys Ser Met Ile Asn Thr Thr
420 425 430
Leu Ile Ile Thr Asn Ile Pro Tyr Ile Ile Met Ala Leu Gly Val Phe
435 440 445
Phe Gly Leu Val Phe Thr Trp Leu Ala Cys Lys Gly Gln Gly Ser Met
450 455 460
Asp Glu Gly Thr Ala Asp Glu Arg Ala Pro Leu Ile Arg Thr
465 470 475
<210> 19
<211> 1434
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
atgggccgct gctgcttcta caccgccggc accctgagcc tgctgctgct ggtgaccagc 60
gtgaccctgc tggtggcccg cgtgttccag aaggccgtgg accagagcat cgagaagaag 120
atcgtgctgc gcaacggcac cgaggccttc gacagctggg agaagccccc cctgcccgtg 180
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cgcgaccaga gcgtgggcga ccccaagatc gacctgatcc gcaccctgaa catccccgtg 420
ctgaccgtga tcgagtggag ccaggtgcac ttcctgcgcg agatcatcga ggccatgctg 480
aaggcctacc agcagaagct gttcgtgacc cacaccgtgg acgagctgct gtggggctac 540
aaggacgaga tcctgagcct gatccacgtg ttccgccccg acatcagccc ctacttcggc 600
ctgttctacg agaagaacgg caccaacgac ggcgactacg tgttcctgac cggcgaggac 660
agctacctga acttcaccaa gatcgtggag tggaacggca agaccagcct ggactggtgg 720
atcaccgaca agtgcaacat gatcaacggc accgacggcg acagcttcca ccccctgatc 780
accaaggacg aggtgctgta cgtgttcccc agcgacttct gccgcagcgt gtacatcacc 840
ttcagcgact acgagagcgt gcagggcctg cccgccttcc gctacaaggt gcccgccgag 900
atcctggcca acaccagcga caacgccggc ttctgcatcc ccgagggcaa ctgcctgggc 960
agcggcgtgc tgaacgtgag catctgcaag aacggcgccc ccatcatcat gagcttcccc 1020
cacttctacc aggccgacga gcgcttcgtg agcgccatcg agggcatgca ccccaaccag 1080
gaggaccacg agaccttcgt ggacatcaac cccctgaccg gcatcatcct gaaggccgcc 1140
aagcgcttcc agatcaacat ctacgtgaag aagctggacg acttcgtgga gaccggcgac 1200
atccgcacca tggtgttccc cgtgatgtac ctgaacgaga gcgtgcacat cgacaaggag 1260
accgccagcc gcctgaagag catgatcaac accaccctga tcatcaccaa catcccctac 1320
atcatcatgg ccctgggcgt gttcttcggc ctggtgttca cctggctggc ctgcaagggc 1380
cagggcagca tggacgaggg caccgccgac gagcgcgccc ccctgatccg cacc 1434
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 20
tggaagactt cgagatacac tgt 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 21
acagtgtatc tcgaagtctt cca 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 22
tttagaaata agtggtagtc a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
tgactaccac ttatttctaa a 21
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
agggtatcaa gactacgaa 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
ttcgtagtct tgataccct 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
tattagatct gatggccgc 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
ctccatcact aggggttcct 20
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
agctctgggt atttaagccc gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggtta 60
<210> 29
<211> 145
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> AAV2 ITR
<400> 29
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<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
tattagatct gatggccgcg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
tccatcacta ggggttcctg 20
<210> 32
<211> 4013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 32
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<210> 33
<211> 4013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 33
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggagag 3960
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<210> 35
<211> 4162
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 35
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 360
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 420
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 480
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 540
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 600
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 660
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 720
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<211> 3977
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 36
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<210> 37
<211> 4013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 37
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
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ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 780
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<210> 38
<211> 4606
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR001A载体第一链序列
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tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca 900
tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga 960
atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat 1020
gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggttt 1080
gcaggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 1140
tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 1200
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 1260
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 1320
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 1380
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 1440
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 1500
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 1560
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 1620
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 1680
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 1740
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 1800
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 1860
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 1920
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 1980
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 2040
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 2100
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgtggaa 2160
tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 2220
catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 2280
aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc 2340
catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt 2400
ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg 2460
aggctttttt ggaggttttc tctacactga agtcttgatg gcatgcgctt tagtctcctc 2520
actcatgagg actgcatatc taagagctct gtgacctcac ttgtgcctgg tgtccagggt 2580
aaacaaatct tcttgccttt gaaaattaga ggatgcagac tggtctcctc tactgcactg 2640
gactgactaa cctgactgga gctcttgttc acactgagaa gaagctggtg gactcttctt 2700
tggctctgaa aggcagattt attttatctc atggagttag gctagagcat cttgtcagag 2760
ggaatgatgt ttgaagtcca tgaggcttct aatgattagg gctggtatgc agcaaacaac 2820
catgactgca tttgtctctg atgcagattc ctaacttctg atatgttcaa aactctgctt 2880
cctgattcag ttgctctctt taacaaatgc agtgattctt ttgataattt gaggggaaaa 2940
aatgtctctg tgttgtgttt cctccttgct ggtgatccac agtaaggggt tgaaaataat 3000
ctctgacatt ttttagttaa agccttcctt tcattcttca tggctactgc agcacaaagc 3060
tctttcttgt tttgcagaag gagtgagagc aaggtgttgg gtgagttctc agtgccccag 3120
ccccagcctg aagaggagac tgaatgcctg ccctctggct gtggctcaga gtgaaaggaa 3180
aacacataca gcaggagtct gtgtagggat tgggctccag ccatcagagc ggggggagca 3240
tcatgaaatg tttgtaagct ctccaccatc cagaatgact ttgcagctct gagcagctgc 3300
acccatgact agtccttcac agtatgctga tgtgagatat tctgttcttt gaagatgggt 3360
agtgaccaga atcaggagga tgtgagaaat gtggagcatt tgagagtgga actcctgcag 3420
ctgttgaagc tagaacacaa cagacactgc agcttactac tcctgagcct ggccaggctg 3480
gtagttttgt ttttcttggc caagctctct gggaatagtt ctgcctctgg ggtcagcttt 3540
ccatgcaggg gctgagatga acacataaag caggattcag cttggaggct tctgagaggg 3600
atggagataa aagatggtgt ggtagatggt aagaggtggt atggtagatg gcagagtatg 3660
gcagaagatg tagacaggat gtcagaaaat gagatggtag ttgcaagagt aggctgtaga 3720
cagtgggaga tggtgagatg agagatgcag aagatggtca gagagcagga tgttgggaga 3780
ggctaggagg tgagacacca gggttggagt gtggactgca ggctttgtta ggctggagag 3840
gtgagtagct gtggagagag gatgacctgc acttgtctga atctaacaga acctaaatta 3900
gaaactttct cttgcagttc tctctctggc tcaggctggc ttgtcttggg gactgtctgt 3960
cactctggaa cagggtggtt agagctgtgg ctttcatggt acttctcttc actgggctct 4020
gatagcctgg ggctgctggt actatctgct tgcacttgct ttgaggaggc caagaacatc 4080
ctgtgtattt ccagactctt tcttgttctg tttgtcctct caggctattc cttgtgctcc 4140
tgatgtctct gtctttactt ccaaaactat ttattaaaaa atctaagatt cattcatgtt 4200
taaggggaat tatgctaatt ctttcatacc taatgggata aaactaactg tgaaattaca 4260
gaccatcttg tgtaaaatct taatctcagc agtcacattt gctgttgaag tgagtatgaa 4320
caaacactga tatgtggagg gctctggtgc aaaggtttgt aggctctgcc tgtgttgcat 4380
agagcagctc atctgaagtg gattagcact gcttctgagc atggaaggtc aggctgaagt 4440
catgatgcct aattagggct ggagaggaca tcacagaaac agtggctctt gggtttgtcc 4500
tgggtagggc agaggtaagg ttgaggagag ctagaaaact caggaaaaga aaaggctcag 4560
gagaaagaag acagagagtt ccagtgagca gagctgcctc tgctgctagg cttgtggtac 4620
acaggttaaa gtttggcctt gtggcattca acagcctttg catcctactg accacactag 4680
ccaggcagtt gaggctcagg gctggctttc ttgcacttgg agaacctttc ctaccttcaa 4740
atgcttgaac cagaatacca gagaaaaaat gcaactctga aagcacaggc attctgtgaa 4800
tagccatcca gatttctgca ggctaaggaa aacagagatg gaggtctatg agggaaagaa 4860
gagaagtcct catgagggct gataccagac agttgagtag gacactgagc acactcacca 4920
ccagatgctc tgtctaagct gtagtttact aggaggttgt ttattctctg agtcagattt 4980
gcttctgttt taagaaccct cacagcctct ctttctatct attctgatga aggttgagcc 5040
tgaagaagct ggagcagaaa gggtcttctg cctcatgttc tgctgataaa ctttgagaat 5100
cctgcctaag tctgacctag attttggctc caaaagccag ggcttcttat ctctgtcaag 5160
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gtgcccacct cccatttgag cttgcagcaa ggctattatg agaaactttc ctcctcttcc 5280
ttcaagtctc cacctattag ctctgcaaga gtgcagaagg ctgcacagca ctgcagatgg 5340
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agagcaggct aagagtggag tgactgaaga cagaagctgg aggcacatca accattacaa 5460
gacagcttga cttttgctag aacccttggc ttcaggtgat gagaataatg gtagacactg 5520
gttgtttggc ttgatagctt aaaaaaggac aaccattata atggaagcag tttctctgag 5580
aaacaggatg ttggcaaggg cttagtgctc ctgactgctg atgctggagt ctggcttccc 5640
tgaccccagt agcagtggga cttagaagca tctcaggctc caggttctca cagctgactc 5700
ctccttcctg aactgtaaga aacagaaatc cacttgctgc tctaaagtgg ggtcacttta 5760
atggaaggaa cagccaacat atttggagag gggctggtgt ggggcttctt actgagagtg 5820
ggcagccctg agcactggac aaactcaact gtgggcaacc tgggtgggaa gcagctgtgg 5880
agatggggaa gccatgctaa tcagtgacat catctattct aagtttccta cctctgaatg 5940
aatagttctg ctggcaaaaa tctgcttttt taagttgata caaatgtgtc ctgtcaagga 6000
agtagagctc cttctcaatc cagcacatca gtaccataac ttgttcctgt gcatttggtt 6060
aaagatggtg ataacatcat ttatcagtaa gtgcagccag gcatgatgca ctatctcctt 6120
gcatttagag cctaattttg gccaaagaag tcttcataga aaaggacttc ccactcaaag 6180
tagtcctgag tagttctact gattttatta ttagtagaga gggtttcatc atgttggcca 6240
ggctggtctg catgcttcta tattattttc taaaagattt aaagttttgc cttctccatt 6300
tagacttata attcactgga atttttttgt gtgtatggta tgacatatgg gttccctttt 6360
attttttaca tataaatata tttccctgtt tttctaaaaa agaaaaagac catcattttc 6420
ccattgtaaa atgccatatt tttttcatag gtcacttaca tatatcaatg ggtctgtttc 6480
tgagctctac tctattttat cagcctcact gtctatcccc acacatctca tgctttgctc 6540
taaatcttga tatttagtgg aacattcttt cccattttgt tctacaagaa tatttttgtt 6600
attgtctttt gggcttctat atacatttta gaatgaggtt ggcaagttat cctgcaggaa 6660
ttcctcgaga ccgtacgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 6720
tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 6780
tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca acctgcaggg 6840
aattcagtca atatgttcac cccaaaaaag ctgtttgtta tcgtggatct ctccccagca 6900
tgcctgctat tgtcttccca atcctccccc ttgctgtcct gccccacccc accccccaga 6960
atagaatgac acctactcag acaatgcgat gcaatttcct cattttatta ggaaaggaca 7020
gtgggagtgg caccttccag ggtcaaggaa ggcacggggg aggggcaaac aacagatggc 7080
tggcaactag aaggcacagt cgaggctgat cagcgagctc tagtcgacgg tatcgatgcg 7140
gggaggcggc ccaaagggag atccgactcg tctgagggcg aaggcgaaga cgcggaagag 7200
gccgcagagc cggcagcagg ccgcgggaag gaaggtccgc tggattgagg gccgaaggga 7260
cgtagcagaa ggacgtcccg cgcagaatcc aggtggcaac acaggcgagc agccaaggaa 7320
aggacgatga tttccccgac aacaccacgg aattgtcagt gcccaacagc cgagcccctg 7380
tccagcagcg ggcaaggcag gcggcgatga gttccgccgt ggcaataggg agggggaaag 7440
cgaaagtccc ggaaaggagc tgacaggtgg tggcaatgcc ccaaccagtg ggggttgcgt 7500
cagcaaacac agtgcacacc acgccacgtt gcctgacaac gggccacaac tcctcataaa 7560
gagacagcaa ccaggattta tacaaggagg agaaaatgaa agccatacgg gaagcaatag 7620
catgatacaa aggcattaaa gcagcgtatc cacatagcgt aaaaggagca acatagttaa 7680
gaataccagt caatctttca caaattttgt aatccagagg ttgattatcg ataagcttgc 7740
ggcctcgagg gtttaaactt aattaacaat tgtcactgtc tacgccacag gtaggtgtgg 7800
atggagtagc cagggctgat tgtttccagg aatcccacgg cgggatcctt gatggtcagg 7860
ggcacatctt tgctgctgcg gttcaggacc accaccacag cagatccatc agggtgcatc 7920
agagccacgg cgtccagatc gttcttctgg gaagccacca gtccaacgcg ctgagagccc 7980
tcggggatga acttgctgaa gtgtcccagg tggtagaaca tgggctgctt gtagaaggtg 8040
tccttggtga tgtccacgat gatggggctg tccacgaagt ttcggaccca gttagggccg 8100
ccttcaggat tcagggccag attccagtcg gtccagccga cgacgtggta cagcaggttg 8160
gtgatgatgc tgtggctgta ctgcatgcct ctatcccagc tgccgagccg cacgctctgt 8220
tcccaaaact tgctgcccac acaggcttcg ctggcgaaca gcatggtgtt ggggaacagt 8280
ctgtgtgtct ctcccagtgt ggccttggca ggggccagaa agtccagata ccagtgcacg 8340
gcgattccgt gcacgtattt ggcggcctca ggatctgtca gcaccacttt agcccagtgg 8400
ggcagaagca gtctctggtc gtccagcatc agcagccgca cattatggtg ggtgctattg 8460
gccagtgtgg gtcccagatc acgggcgata aagtcccgct ggtgctcggg tgtaaagccc 8520
aggcactgaa aggggtagcc gctcagcagt ccagcagaag gttcgttctc ggctgtcacg 8580
gcccaaaact gcagcttgtg ctcggcatag gcgtccagga acttcacgaa gtatctggcc 8640
caggtctggt ggtagatgtc gccaggttgg cctttcaggc tgcccttgcc attcacggcg 8700
ccatttgttt tcagccaggt gggagatgtc catggagagg ccagcagtga cacgggtctt 8760
tgtgccagct gcagggctct gtggatcaga gggatcttca gcttggtgtc ctcttcaggc 8820
aggctgaagt tgtgcagctg gaaatcgtcg ggtgtgtcgg cgtaggtgta ggtcctgatg 8880
ctgaagtcgc agctggccat gggcactctg atgatgttgt agccgatgcc ttcctcgctg 8940
aagtagctct tgagcagcag gttctgagct ggtggagaca gagccaggat attcagagcg 9000
gcggcatctg tcatggctcc gccgaagcct ttcactttct ggaatttctg ctcaggctgc 9060
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atccgtctgc cggatctggt gctctcgtat ctgctgaagg tgcccagagc aggaaaggta 9180
ggagggtcga agctgtcgca gtaggtggca ttgcacacgc acacgacgct gctgtagccg 9240
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agtcgtggaa gactttccct tcggatcttc gaggaattct ttgccaaaat gatgagacag 9480
cacaataacc agcacgttgc ccaggagctg taggaaaaag aagaaggcat gaacatggtt 9540
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agccgtcatt aaaccaagcg ctaattacag cccggaggag aagggccgtc ccgcccgctc 9660
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tagggccgcc gccgccgccg cctcgccata aaaggaaact ttcggagcgc gccgctctga 9840
ttggctgccg ccgcacctct ccgcctcgcc ccgccccgcc cctcgccccg ccccgccccg 9900
cctggcgcgc gccccccccc cccccccgcc cccatcgctg cacaaaataa ttaaaaaata 9960
aataaataca aaattggggg tggggagggg ggggagatgg ggagagtgaa gcagaacgtg 10020
gggctcacct cgaccatggt aatagcgatg actaatacgt agatgtactg ccaagtagga 10080
aagtcccata aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg gccatttacc gtcattgacg 10140
tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgta ctgccaagtg ggcagtttac 10200
cgtaaatact ccacccattg acgtcaatgg aaagtcccta ttggcgttac tatgggaaca 10260
tacgtcatta ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg gtcagccagg cgggccattt 10320
accgtaagtt atgtaacgcg gaactccata tatgggctat gaactaatga ccccgtaatt 10380
gattactatt aataactagg taccgaattc agatccaagc ttcaccatgg gagacgtcac 10440
cggttctaga acctagggag ctctggtacc cactagtagt cgacgaacgc gtaacctccc 10500
gcttcaaaat ggagaccctg cgtgctcact cgggcttaaa tacccagagc tagcaggaac 10560
ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 10620
gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 10680
gcagagaggg agtggccaa 10699
<210> 41
<211> 10960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR004B载体第一链序列
<400> 41
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480
caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1020
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 1080
gcgcttggtt taatgacggc ttgtcctggt ggcgagggga ggggggtggt cctcgaacgc 1140
cttgcagaac tggcctggat acagagtgga ccggctggcc ccatctggaa gacttcgaga 1200
tacactgttg tcttactgcg ctcaacagtg tatctcgaag tcttccaaat ggtgccagcc 1260
atcgcagcgg ggtgcaggaa atgggggcag cccccctttt tggctatcct tccacgtgtt 1320
cttttttgta tcttttgtgt ttcctagaaa acatctcagt caccaccttt ctgtggctgc 1380
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ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa 1500
agaattcctc gaagatccga agggaaagtc ttccacgact gtgggatccg ttcgaagata 1560
tcaccggttg agccaccatg gaattcagca gccccagcag agaggaatgc cccaagcctc 1620
tgagccgggt gtcaatcatg gccggatctc tgacaggact gctgctgctt caggccgtgt 1680
cttgggcttc tggcgctaga ccttgcatcc ccaagagctt cggctacagc agcgtcgtgt 1740
gcgtgtgcaa tgccacctac tgcgacagct tcgaccctcc tacctttcct gctctgggca 1800
ccttcagcag atacgagagc accagatccg gcagacggat ggaactgagc atgggaccca 1860
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cctctccatg gacatctccc acctggctga aaacaaatgg cgccgtgaat ggcaagggca 2280
gcctgaaagg ccaacctggc gacatctacc accagacctg ggccagatac ttcgtgaagt 2340
tcctggacgc ctatgccgag cacaagctgc agttttgggc cgtgacagcc gagaacgaac 2400
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tcggctggac cgactggaat ctggccctga atcctgaagg cggccctaac tgggtccgaa 2880
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tgttctacca cctgggacac ttcagcaagt tcatccccga gggctctcag cgcgttggac 3000
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ccgtgggatt cctggaaaca atcagccctg gctactccat ccacacctac ctgtggcgta 3180
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acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct 3360
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gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 3480
ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc 3540
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 3600
actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt 3660
gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca 3720
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cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta 3840
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aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggag agatccacga 4080
taacaaacag cttttttggg gtgaacatat tgactgaatt ccctgcaggt tggccactcc 4140
ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac 4200
ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat 4260
cactaggggt tcctgcggcc gctcgtacgg tctcgaggaa ttcctgcagg ataacttgcc 4320
aacctcattc taaaatgtat atagaagccc aaaagacaat aacaaaaata ttcttgtaga 4380
acaaaatggg aaagaatgtt ccactaaata tcaagattta gagcaaagca tgagatgtgt 4440
ggggatagac agtgaggctg ataaaataga gtagagctca gaaacagacc cattgatata 4500
tgtaagtgac ctatgaaaaa aatatggcat tttacaatgg gaaaatgatg gtctttttct 4560
tttttagaaa aacagggaaa tatatttata tgtaaaaaat aaaagggaac ccatatgtca 4620
taccatacac acaaaaaaat tccagtgaat tataagtcta aatggagaag gcaaaacttt 4680
aaatctttta gaaaataata tagaagcatg cagaccagcc tggccaacat gatgaaaccc 4740
tctctactaa taataaaatc agtagaacta ctcaggacta ctttgagtgg gaagtccttt 4800
tctatgaaga cttctttggc caaaattagg ctctaaatgc aaggagatag tgcatcatgc 4860
ctggctgcac ttactgataa atgatgttat caccatcttt aaccaaatgc acaggaacaa 4920
gttatggtac tgatgtgctg gattgagaag gagctctact tccttgacag gacacatttg 4980
tatcaactta aaaaagcaga tttttgccag cagaactatt cattcagagg taggaaactt 5040
agaatagatg atgtcactga ttagcatggc ttccccatct ccacagctgc ttcccaccca 5100
ggttgcccac agttgagttt gtccagtgct cagggctgcc cactctcagt aagaagcccc 5160
acaccagccc ctctccaaat atgttggctg ttccttccat taaagtgacc ccactttaga 5220
gcagcaagtg gatttctgtt tcttacagtt caggaaggag gagtcagctg tgagaacctg 5280
gagcctgaga tgcttctaag tcccactgct actggggtca gggaagccag actccagcat 5340
cagcagtcag gagcactaag cccttgccaa catcctgttt ctcagagaaa ctgcttccat 5400
tataatggtt gtcctttttt aagctatcaa gccaaacaac cagtgtctac cattattctc 5460
atcacctgaa gccaagggtt ctagcaaaag tcaagctgtc ttgtaatggt tgatgtgcct 5520
ccagcttctg tcttcagtca ctccactctt agcctgctct gaatcaactc tgaccacagt 5580
tccctggagc ccctgccacc tgctgcccct gccaccttct ccatctgcag tgctgtgcag 5640
ccttctgcac tcttgcagag ctaataggtg gagacttgaa ggaagaggag gaaagtttct 5700
cataatagcc ttgctgcaag ctcaaatggg aggtgggcac tgtgcccagg agccttggag 5760
caaaggctgt gcccaacctc tgactgcatc caggtttggt cttgacagag ataagaagcc 5820
ctggcttttg gagccaaaat ctaggtcaga cttaggcagg attctcaaag tttatcagca 5880
gaacatgagg cagaagaccc tttctgctcc agcttcttca ggctcaacct tcatcagaat 5940
agatagaaag agaggctgtg agggttctta aaacagaagc aaatctgact cagagaataa 6000
acaacctcct agtaaactac agcttagaca gagcatctgg tggtgagtgt gctcagtgtc 6060
ctactcaact gtctggtatc agccctcatg aggacttctc ttctttccct catagacctc 6120
catctctgtt ttccttagcc tgcagaaatc tggatggcta ttcacagaat gcctgtgctt 6180
tcagagttgc attttttctc tggtattctg gttcaagcat ttgaaggtag gaaaggttct 6240
ccaagtgcaa gaaagccagc cctgagcctc aactgcctgg ctagtgtggt cagtaggatg 6300
caaaggctgt tgaatgccac aaggccaaac tttaacctgt gtaccacaag cctagcagca 6360
gaggcagctc tgctcactgg aactctctgt cttctttctc ctgagccttt tcttttcctg 6420
agttttctag ctctcctcaa ccttacctct gccctaccca ggacaaaccc aagagccact 6480
gtttctgtga tgtcctctcc agccctaatt aggcatcatg acttcagcct gaccttccat 6540
gctcagaagc agtgctaatc cacttcagat gagctgctct atgcaacaca ggcagagcct 6600
acaaaccttt gcaccagagc cctccacata tcagtgtttg ttcatactca cttcaacagc 6660
aaatgtgact gctgagatta agattttaca caagatggtc tgtaatttca cagttagttt 6720
tatcccatta ggtatgaaag aattagcata attcccctta aacatgaatg aatcttagat 6780
tttttaataa atagttttgg aagtaaagac agagacatca ggagcacaag gaatagcctg 6840
agaggacaaa cagaacaaga aagagtctgg aaatacacag gatgttcttg gcctcctcaa 6900
agcaagtgca agcagatagt accagcagcc ccaggctatc agagcccagt gaagagaagt 6960
accatgaaag ccacagctct aaccaccctg ttccagagtg acagacagtc cccaagacaa 7020
gccagcctga gccagagaga gaactgcaag agaaagtttc taatttaggt tctgttagat 7080
tcagacaagt gcaggtcatc ctctctccac agctactcac ctctccagcc taacaaagcc 7140
tgcagtccac actccaaccc tggtgtctca cctcctagcc tctcccaaca tcctgctctc 7200
tgaccatctt ctgcatctct catctcacca tctcccactg tctacagcct actcttgcaa 7260
ctaccatctc attttctgac atcctgtcta catcttctgc catactctgc catctaccat 7320
accacctctt accatctacc acaccatctt ttatctccat ccctctcaga agcctccaag 7380
ctgaatcctg ctttatgtgt tcatctcagc ccctgcatgg aaagctgacc ccagaggcag 7440
aactattccc agagagcttg gccaagaaaa acaaaactac cagcctggcc aggctcagga 7500
gtagtaagct gcagtgtctg ttgtgttcta gcttcaacag ctgcaggagt tccactctca 7560
aatgctccac atttctcaca tcctcctgat tctggtcact acccatcttc aaagaacaga 7620
atatctcaca tcagcatact gtgaaggact agtcatgggt gcagctgctc agagctgcaa 7680
agtcattctg gatggtggag agcttacaaa catttcatga tgctcccccc gctctgatgg 7740
ctggagccca atccctacac agactcctgc tgtatgtgtt ttcctttcac tctgagccac 7800
agccagaggg caggcattca gtctcctctt caggctgggg ctggggcact gagaactcac 7860
ccaacacctt gctctcactc cttctgcaaa acaagaaaga gctttgtgct gcagtagcca 7920
tgaagaatga aaggaaggct ttaactaaaa aatgtcagag attattttca accccttact 7980
gtggatcacc agcaaggagg aaacacaaca cagagacatt ttttcccctc aaattatcaa 8040
aagaatcact gcatttgtta aagagagcaa ctgaatcagg aagcagagtt ttgaacatat 8100
cagaagttag gaatctgcat cagagacaaa tgcagtcatg gttgtttgct gcataccagc 8160
cctaatcatt agaagcctca tggacttcaa acatcattcc ctctgacaag atgctctagc 8220
ctaactccat gagataaaat aaatctgcct ttcagagcca aagaagagtc caccagcttc 8280
ttctcagtgt gaacaagagc tccagtcagg ttagtcagtc cagtgcagta gaggagacca 8340
gtctgcatcc tctaattttc aaaggcaaga agatttgttt accctggaca ccaggcacaa 8400
gtgaggtcac agagctctta gatatgcagt cctcatgagt gaggagacta aagcgcatgc 8460
catcaagact tcagtgtaga gaaaacctcc aaaaaagcct cctcactact tctggaatag 8520
ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc agccatgggg 8580
cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac 8640
tatggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg 8700
ggactttcca cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc 8760
tggggagcct ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca ttccacagct gcattaatga 8820
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 8880
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 8940
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 9000
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 9060
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 9120
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 9180
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 9240
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 9300
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 9360
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 9420
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 9480
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 9540
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 9600
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 9660
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 9720
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 9780
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 9840
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactcctgc aaaccacgtt gtgtctcaaa 9900
atctctgatg ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg 9960
cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct 10020
cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg 10080
ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag 10140
agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca 10200
gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 10260
ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag 10320
aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt 10380
tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc 10440
aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 10500
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg 10560
attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 10620
taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 10680
tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 10740
atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 10800
tctaagggcg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc 10860
gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg 10920
cgccggtgat gagggcgcgc caagtcgacg tccggcagtc 10960
<210> 42
<211> 10960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR004B载体第二链序列
<400> 42
gactgccgga cgtcgacttg gcgcgccctc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc 60
gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc 120
gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cgcccttaga aaaactcatc gagcatcaaa 180
tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc 240
tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 300
tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata 360
aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc 420
ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca 480
ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga 540
tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc 600
agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt 660
ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg 720
atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca 780
tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca 840
tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca 900
tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga 960
atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat 1020
gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggttt 1080
gcaggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 1140
tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 1200
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 1260
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 1320
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 1380
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 1440
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 1500
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 1560
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 1620
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 1680
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 1740
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 1800
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 1860
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 1920
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 1980
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 2040
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 2100
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgtggaa 2160
tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 2220
catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 2280
aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc 2340
catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt 2400
ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg 2460
aggctttttt ggaggttttc tctacactga agtcttgatg gcatgcgctt tagtctcctc 2520
actcatgagg actgcatatc taagagctct gtgacctcac ttgtgcctgg tgtccagggt 2580
aaacaaatct tcttgccttt gaaaattaga ggatgcagac tggtctcctc tactgcactg 2640
gactgactaa cctgactgga gctcttgttc acactgagaa gaagctggtg gactcttctt 2700
tggctctgaa aggcagattt attttatctc atggagttag gctagagcat cttgtcagag 2760
ggaatgatgt ttgaagtcca tgaggcttct aatgattagg gctggtatgc agcaaacaac 2820
catgactgca tttgtctctg atgcagattc ctaacttctg atatgttcaa aactctgctt 2880
cctgattcag ttgctctctt taacaaatgc agtgattctt ttgataattt gaggggaaaa 2940
aatgtctctg tgttgtgttt cctccttgct ggtgatccac agtaaggggt tgaaaataat 3000
ctctgacatt ttttagttaa agccttcctt tcattcttca tggctactgc agcacaaagc 3060
tctttcttgt tttgcagaag gagtgagagc aaggtgttgg gtgagttctc agtgccccag 3120
ccccagcctg aagaggagac tgaatgcctg ccctctggct gtggctcaga gtgaaaggaa 3180
aacacataca gcaggagtct gtgtagggat tgggctccag ccatcagagc ggggggagca 3240
tcatgaaatg tttgtaagct ctccaccatc cagaatgact ttgcagctct gagcagctgc 3300
acccatgact agtccttcac agtatgctga tgtgagatat tctgttcttt gaagatgggt 3360
agtgaccaga atcaggagga tgtgagaaat gtggagcatt tgagagtgga actcctgcag 3420
ctgttgaagc tagaacacaa cagacactgc agcttactac tcctgagcct ggccaggctg 3480
gtagttttgt ttttcttggc caagctctct gggaatagtt ctgcctctgg ggtcagcttt 3540
ccatgcaggg gctgagatga acacataaag caggattcag cttggaggct tctgagaggg 3600
atggagataa aagatggtgt ggtagatggt aagaggtggt atggtagatg gcagagtatg 3660
gcagaagatg tagacaggat gtcagaaaat gagatggtag ttgcaagagt aggctgtaga 3720
cagtgggaga tggtgagatg agagatgcag aagatggtca gagagcagga tgttgggaga 3780
ggctaggagg tgagacacca gggttggagt gtggactgca ggctttgtta ggctggagag 3840
gtgagtagct gtggagagag gatgacctgc acttgtctga atctaacaga acctaaatta 3900
gaaactttct cttgcagttc tctctctggc tcaggctggc ttgtcttggg gactgtctgt 3960
cactctggaa cagggtggtt agagctgtgg ctttcatggt acttctcttc actgggctct 4020
gatagcctgg ggctgctggt actatctgct tgcacttgct ttgaggaggc caagaacatc 4080
ctgtgtattt ccagactctt tcttgttctg tttgtcctct caggctattc cttgtgctcc 4140
tgatgtctct gtctttactt ccaaaactat ttattaaaaa atctaagatt cattcatgtt 4200
taaggggaat tatgctaatt ctttcatacc taatgggata aaactaactg tgaaattaca 4260
gaccatcttg tgtaaaatct taatctcagc agtcacattt gctgttgaag tgagtatgaa 4320
caaacactga tatgtggagg gctctggtgc aaaggtttgt aggctctgcc tgtgttgcat 4380
agagcagctc atctgaagtg gattagcact gcttctgagc atggaaggtc aggctgaagt 4440
catgatgcct aattagggct ggagaggaca tcacagaaac agtggctctt gggtttgtcc 4500
tgggtagggc agaggtaagg ttgaggagag ctagaaaact caggaaaaga aaaggctcag 4560
gagaaagaag acagagagtt ccagtgagca gagctgcctc tgctgctagg cttgtggtac 4620
acaggttaaa gtttggcctt gtggcattca acagcctttg catcctactg accacactag 4680
ccaggcagtt gaggctcagg gctggctttc ttgcacttgg agaacctttc ctaccttcaa 4740
atgcttgaac cagaatacca gagaaaaaat gcaactctga aagcacaggc attctgtgaa 4800
tagccatcca gatttctgca ggctaaggaa aacagagatg gaggtctatg agggaaagaa 4860
gagaagtcct catgagggct gataccagac agttgagtag gacactgagc acactcacca 4920
ccagatgctc tgtctaagct gtagtttact aggaggttgt ttattctctg agtcagattt 4980
gcttctgttt taagaaccct cacagcctct ctttctatct attctgatga aggttgagcc 5040
tgaagaagct ggagcagaaa gggtcttctg cctcatgttc tgctgataaa ctttgagaat 5100
cctgcctaag tctgacctag attttggctc caaaagccag ggcttcttat ctctgtcaag 5160
accaaacctg gatgcagtca gaggttgggc acagcctttg ctccaaggct cctgggcaca 5220
gtgcccacct cccatttgag cttgcagcaa ggctattatg agaaactttc ctcctcttcc 5280
ttcaagtctc cacctattag ctctgcaaga gtgcagaagg ctgcacagca ctgcagatgg 5340
agaaggtggc aggggcagca ggtggcaggg gctccaggga actgtggtca gagttgattc 5400
agagcaggct aagagtggag tgactgaaga cagaagctgg aggcacatca accattacaa 5460
gacagcttga cttttgctag aacccttggc ttcaggtgat gagaataatg gtagacactg 5520
gttgtttggc ttgatagctt aaaaaaggac aaccattata atggaagcag tttctctgag 5580
aaacaggatg ttggcaaggg cttagtgctc ctgactgctg atgctggagt ctggcttccc 5640
tgaccccagt agcagtggga cttagaagca tctcaggctc caggttctca cagctgactc 5700
ctccttcctg aactgtaaga aacagaaatc cacttgctgc tctaaagtgg ggtcacttta 5760
atggaaggaa cagccaacat atttggagag gggctggtgt ggggcttctt actgagagtg 5820
ggcagccctg agcactggac aaactcaact gtgggcaacc tgggtgggaa gcagctgtgg 5880
agatggggaa gccatgctaa tcagtgacat catctattct aagtttccta cctctgaatg 5940
aatagttctg ctggcaaaaa tctgcttttt taagttgata caaatgtgtc ctgtcaagga 6000
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aaagatggtg ataacatcat ttatcagtaa gtgcagccag gcatgatgca ctatctcctt 6120
gcatttagag cctaattttg gccaaagaag tcttcataga aaaggacttc ccactcaaag 6180
tagtcctgag tagttctact gattttatta ttagtagaga gggtttcatc atgttggcca 6240
ggctggtctg catgcttcta tattattttc taaaagattt aaagttttgc cttctccatt 6300
tagacttata attcactgga atttttttgt gtgtatggta tgacatatgg gttccctttt 6360
attttttaca tataaatata tttccctgtt tttctaaaaa agaaaaagac catcattttc 6420
ccattgtaaa atgccatatt tttttcatag gtcacttaca tatatcaatg ggtctgtttc 6480
tgagctctac tctattttat cagcctcact gtctatcccc acacatctca tgctttgctc 6540
taaatcttga tatttagtgg aacattcttt cccattttgt tctacaagaa tatttttgtt 6600
attgtctttt gggcttctat atacatttta gaatgaggtt ggcaagttat cctgcaggaa 6660
ttcctcgaga ccgtacgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 6720
tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 6780
tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca acctgcaggg 6840
aattcagtca atatgttcac cccaaaaaag ctgtttgtta tcgtggatct ctccccagca 6900
tgcctgctat tgtcttccca atcctccccc ttgctgtcct gccccacccc accccccaga 6960
atagaatgac acctactcag acaatgcgat gcaatttcct cattttatta ggaaaggaca 7020
gtgggagtgg caccttccag ggtcaaggaa ggcacggggg aggggcaaac aacagatggc 7080
tggcaactag aaggcacagt cgaggctgat cagcgagctc tagtcgacgg tatcgatgcg 7140
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gccgcagagc cggcagcagg ccgcgggaag gaaggtccgc tggattgagg gccgaaggga 7260
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aggacgatga tttccccgac aacaccacgg aattgtcagt gcccaacagc cgagcccctg 7380
tccagcagcg ggcaaggcag gcggcgatga gttccgccgt ggcaataggg agggggaaag 7440
cgaaagtccc ggaaaggagc tgacaggtgg tggcaatgcc ccaaccagtg ggggttgcgt 7500
cagcaaacac agtgcacacc acgccacgtt gcctgacaac gggccacaac tcctcataaa 7560
gagacagcaa ccaggattta tacaaggagg agaaaatgaa agccatacgg gaagcaatag 7620
catgatacaa aggcattaaa gcagcgtatc cacatagcgt aaaaggagca acatagttaa 7680
gaataccagt caatctttca caaattttgt aatccagagg ttgattatcg ataagcttgc 7740
ggcctcgagg gtttaaactt aattaacaat tgtcactgtc tacgccacag gtaggtgtgg 7800
atggagtagc cagggctgat tgtttccagg aatcccacgg cgggatcctt gatggtcagg 7860
ggcacatctt tgctgctgcg gttcaggacc accaccacag cagatccatc agggtgcatc 7920
agagccacgg cgtccagatc gttcttctgg gaagccacca gtccaacgcg ctgagagccc 7980
tcggggatga acttgctgaa gtgtcccagg tggtagaaca tgggctgctt gtagaaggtg 8040
tccttggtga tgtccacgat gatggggctg tccacgaagt ttcggaccca gttagggccg 8100
ccttcaggat tcagggccag attccagtcg gtccagccga cgacgtggta cagcaggttg 8160
gtgatgatgc tgtggctgta ctgcatgcct ctatcccagc tgccgagccg cacgctctgt 8220
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ggcagaagca gtctctggtc gtccagcatc agcagccgca cattatggtg ggtgctattg 8460
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tgtgccagct gcagggctct gtggatcaga gggatcttca gcttggtgtc ctcttcaggc 8820
aggctgaagt tgtgcagctg gaaatcgtcg ggtgtgtcgg cgtaggtgta ggtcctgatg 8880
ctgaagtcgc agctggccat gggcactctg atgatgttgt agccgatgcc ttcctcgctg 8940
aagtagctct tgagcagcag gttctgagct ggtggagaca gagccaggat attcagagcg 9000
gcggcatctg tcatggctcc gccgaagcct ttcactttct ggaatttctg ctcaggctgc 9060
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agtcgtggaa gactttccct tcggatcttc gaggaattct ttgccaaaat gatgagacag 9480
cacaataacc agcacgttgc ccaggagctg taggaaaaag aagaaggcat gaacatggtt 9540
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actgagatgt tttctaggaa acacaaaaga tacaaaaaag aacacgtgga aggatagcca 9660
aaaagggggg ctgcccccat ttcctgcacc ccgctgcgat ggctggcacc atttggaaga 9720
cttcgagata cactgttgag cgcagtaaga caacagtgta tctcgaagtc ttccagatgg 9780
ggccagccgg tccactctgt atccaggcca gttctgcaag gcgttcgagg accacccccc 9840
tcccctcgcc accaggacaa gccgtcatta aaccaagcgc taattacagc ccggaggaga 9900
agggccgtcc cgcccgctca cctgtgggag taacgcggtc agtcagagcc ggggcgggcg 9960
gcgcgaggcg gcggcggagc ggggcacggg gcgaaggcag cgtcgcagcg actcccgccc 10020
gccgcgcgct tcgcttttta tagggccgcc gccgccgccg cctcgccata aaaggaaact 10080
ttcggagcgc gccgctctga ttggctgccg ccgcacctct ccgcctcgcc ccgccccgcc 10140
cctcgccccg ccccgccccg cctggcgcgc gccccccccc cccccccgcc cccatcgctg 10200
cacaaaataa ttaaaaaata aataaataca aaattggggg tggggagggg ggggagatgg 10260
ggagagtgaa gcagaacgtg gggctcacct cgaccatggt aatagcgatg actaatacgt 10320
agatgtactg ccaagtagga aagtcccata aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg 10380
gccatttacc gtcattgacg tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgta 10440
ctgccaagtg ggcagtttac cgtaaatagt ccacccattg acgtcaatgg aaagtcccta 10500
ttggcgttac tatgggaaca tacgtcatta ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg 10560
gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt atgtaacgcg gaactccata tatgggctat 10620
gaactaatga ccccgtaatt gattactatt aataactagg gtaccgaatt cagatccaag 10680
cttcaccatg ggagacgtca ccggttctag aacctaggga gctctggtac ccactagtag 10740
tcgacgaacg cgtaacctcc cgcttcaaaa tggagaccct gcgtgctcac tcgggcttaa 10800
atacccagag ctagcaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 10860
gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 10920
cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 10960
<210> 43
<211> 10960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR004E载体第一链序列
<400> 43
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180
agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240
tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300
cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480
caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840
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cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960
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gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 1080
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tacactgttg tcttactgcg ctcaacagtg tatctcgaag tcttccaaat ggtgccagcc 1260
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tgtctccacc agctcagaac ctgctgctca agagctactt cagcgaggaa ggcatcggct 2040
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tgcggctgct gatgctggac gaccagagac tgcttctgcc ccactgggct aaagtggtgc 2580
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tgttcgccag cgaagcctgt gtgggcagca agttttggga acagagcgtg cggctcggca 2760
gctgggatag aggcatgcag tacagccaca gcatcatcac caacctgctg taccacgtcg 2820
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tgttctacca cctgggacac ttcagcaagt tcatccccga gggctctcag cgcgttggac 3000
tggtggcttc ccagaagaac gatctggacg ccgtggctct gatgcaccct gatggatctg 3060
ctgtggtggt ggtcctgaac cgcagcagca aagatgtgcc cctgaccatc aaggatcccg 3120
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acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct 3360
ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 3420
gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg 3480
ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc 3540
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 3600
actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt 3660
gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca 3720
gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt 3780
cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta 3840
gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 3900
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aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 4020
aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggag agatccacga 4080
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ggggatagac agtgaggctg ataaaataga gtagagctca gaaacagacc cattgatata 4500
tgtaagtgac ctatgaaaaa aatatggcat tttacaatgg gaaaatgatg gtctttttct 4560
tttttagaaa aacagggaaa tatatttata tgtaaaaaat aaaagggaac ccatatgtca 4620
taccatacac acaaaaaaat tccagtgaat tataagtcta aatggagaag gcaaaacttt 4680
aaatctttta gaaaataata tagaagcatg cagaccagcc tggccaacat gatgaaaccc 4740
tctctactaa taataaaatc agtagaacta ctcaggacta ctttgagtgg gaagtccttt 4800
tctatgaaga cttctttggc caaaattagg ctctaaatgc aaggagatag tgcatcatgc 4860
ctggctgcac ttactgataa atgatgttat caccatcttt aaccaaatgc acaggaacaa 4920
gttatggtac tgatgtgctg gattgagaag gagctctact tccttgacag gacacatttg 4980
tatcaactta aaaaagcaga tttttgccag cagaactatt cattcagagg taggaaactt 5040
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acaccagccc ctctccaaat atgttggctg ttccttccat taaagtgacc ccactttaga 5220
gcagcaagtg gatttctgtt tcttacagtt caggaaggag gagtcagctg tgagaacctg 5280
gagcctgaga tgcttctaag tcccactgct actggggtca gggaagccag actccagcat 5340
cagcagtcag gagcactaag cccttgccaa catcctgttt ctcagagaaa ctgcttccat 5400
tataatggtt gtcctttttt aagctatcaa gccaaacaac cagtgtctac cattattctc 5460
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tccctggagc ccctgccacc tgctgcccct gccaccttct ccatctgcag tgctgtgcag 5640
ccttctgcac tcttgcagag ctaataggtg gagacttgaa ggaagaggag gaaagtttct 5700
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caaaggctgt gcccaacctc tgactgcatc caggtttggt cttgacagag ataagaagcc 5820
ctggcttttg gagccaaaat ctaggtcaga cttaggcagg attctcaaag tttatcagca 5880
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ctactcaact gtctggtatc agccctcatg aggacttctc ttctttccct catagacctc 6120
catctctgtt ttccttagcc tgcagaaatc tggatggcta ttcacagaat gcctgtgctt 6180
tcagagttgc attttttctc tggtattctg gttcaagcat ttgaaggtag gaaaggttct 6240
ccaagtgcaa gaaagccagc cctgagcctc aactgcctgg ctagtgtggt cagtaggatg 6300
caaaggctgt tgaatgccac aaggccaaac tttaacctgt gtaccacaag cctagcagca 6360
gaggcagctc tgctcactgg aactctctgt cttctttctc ctgagccttt tcttttcctg 6420
agttttctag ctctcctcaa ccttacctct gccctaccca ggacaaaccc aagagccact 6480
gtttctgtga tgtcctctcc agccctaatt aggcatcatg acttcagcct gaccttccat 6540
gctcagaagc agtgctaatc cacttcagat gagctgctct atgcaacaca ggcagagcct 6600
acaaaccttt gcaccagagc cctccacata tcagtgtttg ttcatactca cttcaacagc 6660
aaatgtgact gctgagatta agattttaca caagatggtc tgtaatttca cagttagttt 6720
tatcccatta ggtatgaaag aattagcata attcccctta aacatgaatg aatcttagat 6780
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aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 10500
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg 10560
attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 10620
taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 10680
tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 10740
atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 10800
tctaagggcg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc 10860
gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg 10920
cgccggtgat gagggcgcgc caagtcgacg tccggcagtc 10960
<210> 44
<211> 10960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR004E载体第二链序列
<400> 44
gactgccgga cgtcgacttg gcgcgccctc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc 60
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tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 300
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tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc 600
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gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggttt 1080
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cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 1680
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 1740
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 1800
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 1860
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 1920
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 1980
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 2040
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gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgtggaa 2160
tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 2220
catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 2280
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catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt 2400
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aggctttttt ggaggttttc tctacactga agtcttgatg gcatgcgctt tagtctcctc 2520
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aatgtctctg tgttgtgttt cctccttgct ggtgatccac agtaaggggt tgaaaataat 3000
ctctgacatt ttttagttaa agccttcctt tcattcttca tggctactgc agcacaaagc 3060
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tcatgaaatg tttgtaagct ctccaccatc cagaatgact ttgcagctct gagcagctgc 3300
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ctgttgaagc tagaacacaa cagacactgc agcttactac tcctgagcct ggccaggctg 3480
gtagttttgt ttttcttggc caagctctct gggaatagtt ctgcctctgg ggtcagcttt 3540
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ctccttcctg aactgtaaga aacagaaatc cacttgctgc tctaaagtgg ggtcacttta 5760
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<210> 45
<211> 9348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR014A载体第一链序列
<400> 45
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
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atccacgata acaaacagct tttttggggt gaacatattg actgaattcc ctgcaggagg 2520
aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 2580
cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag 2640
cgcgcagaga gggagtggcc aagcggccgc tcgtacggtc tcgaggaatt cctgcaggat 2700
aacttgccaa cctcattcta aaatgtatat agaagcccaa aagacaataa caaaaatatt 2760
cttgtagaac aaaatgggaa agaatgttcc actaaatatc aagatttaga gcaaagcatg 2820
agatgtgtgg ggatagacag tgaggctgat aaaatagagt agagctcaga aacagaccca 2880
ttgatatatg taagtgacct atgaaaaaaa tatggcattt tacaatggga aaatgatggt 2940
ctttttcttt tttagaaaaa cagggaaata tatttatatg taaaaaataa aagggaaccc 3000
atatgtcata ccatacacac aaaaaaattc cagtgaatta taagtctaaa tggagaaggc 3060
aaaactttaa atcttttaga aaataatata gaagcatgca gaccagcctg gccaacatga 3120
tgaaaccctc tctactaata ataaaatcag tagaactact caggactact ttgagtggga 3180
agtccttttc tatgaagact tctttggcca aaattaggct ctaaatgcaa ggagatagtg 3240
catcatgcct ggctgcactt actgataaat gatgttatca ccatctttaa ccaaatgcac 3300
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cacatttgta tcaacttaaa aaagcagatt tttgccagca gaactattca ttcagaggta 3420
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ttattctcat cacctgaagc caagggttct agcaaaagtc aagctgtctt gtaatggttg 3900
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accacagttc cctggagccc ctgccacctg ctgcccctgc caccttctcc atctgcagtg 4020
ctgtgcagcc ttctgcactc ttgcagagct aataggtgga gacttgaagg aagaggagga 4080
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ccttggagca aaggctgtgc ccaacctctg actgcatcca ggtttggtct tgacagagat 4200
aagaagccct ggcttttgga gccaaaatct aggtcagact taggcaggat tctcaaagtt 4260
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atcagaatag atagaaagag aggctgtgag ggttcttaaa acagaagcaa atctgactca 4380
gagaataaac aacctcctag taaactacag cttagacaga gcatctggtg gtgagtgtgc 4440
tcagtgtcct actcaactgt ctggtatcag ccctcatgag gacttctctt ctttccctca 4500
tagacctcca tctctgtttt ccttagcctg cagaaatctg gatggctatt cacagaatgc 4560
ctgtgctttc agagttgcat tttttctctg gtattctggt tcaagcattt gaaggtagga 4620
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ttttcctgag ttttctagct ctcctcaacc ttacctctgc cctacccagg acaaacccaa 4860
gagccactgt ttctgtgatg tcctctccag ccctaattag gcatcatgac ttcagcctga 4920
ccttccatgc tcagaagcag tgctaatcca cttcagatga gctgctctat gcaacacagg 4980
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gttagtttta tcccattagg tatgaaagaa ttagcataat tccccttaaa catgaatgaa 5160
tcttagattt tttaataaat agttttggaa gtaaagacag agacatcagg agcacaagga 5220
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ctcctcaaag caagtgcaag cagatagtac cagcagcccc aggctatcag agcccagtga 5340
agagaagtac catgaaagcc acagctctaa ccaccctgtt ccagagtgac agacagtccc 5400
caagacaagc cagcctgagc cagagagaga actgcaagag aaagtttcta atttaggttc 5460
tgttagattc agacaagtgc aggtcatcct ctctccacag ctactcacct ctccagccta 5520
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cactctcaaa tgctccacat ttctcacatc ctcctgattc tggtcactac ccatcttcaa 6000
agaacagaat atctcacatc agcatactgt gaaggactag tcatgggtgc agctgctcag 6060
agctgcaaag tcattctgga tggtggagag cttacaaaca tttcatgatg ctccccccgc 6120
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agtagccatg aagaatgaaa ggaaggcttt aactaaaaaa tgtcagagat tattttcaac 6360
cccttactgt ggatcaccag caaggaggaa acacaacaca gagacatttt ttcccctcaa 6420
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gaacatatca gaagttagga atctgcatca gagacaaatg cagtcatggt tgtttgctgc 6540
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ggagaccagt ctgcatcctc taattttcaa aggcaagaag atttgtttac cctggacacc 6780
aggcacaagt gaggtcacag agctcttaga tatgcagtcc tcatgagtga ggagactaaa 6840
gcgcatgcca tcaagacttc agtgtagaga aaacctccaa aaaagcctcc tcactacttc 6900
tggaatagct cagaggccga ggcggcctcg gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag 6960
ccatggggcg gagaatgggc ggaactgggc ggagttaggg gcgggatggg cggagttagg 7020
ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg 7080
gagcctgggg actttccaca cctggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt 7140
ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca caccctaact gacacacatt ccacagctgc 7200
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 7260
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 7320
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 7380
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 7440
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cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 7560
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 7620
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 7680
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 7740
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 7800
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gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 7920
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tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 8040
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 8100
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 8160
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tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actcctgcaa accacgttgt 8280
gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa 8340
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gtcttgctcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 8460
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gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 8640
ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca 8700
ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 8760
gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg 8820
tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 8880
cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt 8940
ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga 9000
ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga 9060
tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt 9120
tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga 9180
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gaagtggcga gcccgatctt ccccatcggt gatgtcggcg atataggcgc cagcaaccgc 9300
acctgtggcg ccggtgatga gggcgcgcca agtcgacgtc cggcagtc 9348
<210> 46
<211> 9348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR014A载体第二链序列
<400> 46
gactgccgga cgtcgacttg gcgcgccctc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc 60
gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc 120
gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cgcccttaga aaaactcatc gagcatcaaa 180
tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc 240
tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 300
tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata 360
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ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca 480
ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga 540
tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc 600
agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt 660
ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg 720
atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca 780
tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca 840
tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca 900
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atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat 1020
gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggttt 1080
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tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 1200
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ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 1800
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tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 1920
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 1980
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 2040
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 2100
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgtggaa 2160
tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 2220
catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 2280
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catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt 2400
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aggctttttt ggaggttttc tctacactga agtcttgatg gcatgcgctt tagtctcctc 2520
actcatgagg actgcatatc taagagctct gtgacctcac ttgtgcctgg tgtccagggt 2580
aaacaaatct tcttgccttt gaaaattaga ggatgcagac tggtctcctc tactgcactg 2640
gactgactaa cctgactgga gctcttgttc acactgagaa gaagctggtg gactcttctt 2700
tggctctgaa aggcagattt attttatctc atggagttag gctagagcat cttgtcagag 2760
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aatgtctctg tgttgtgttt cctccttgct ggtgatccac agtaaggggt tgaaaataat 3000
ctctgacatt ttttagttaa agccttcctt tcattcttca tggctactgc agcacaaagc 3060
tctttcttgt tttgcagaag gagtgagagc aaggtgttgg gtgagttctc agtgccccag 3120
ccccagcctg aagaggagac tgaatgcctg ccctctggct gtggctcaga gtgaaaggaa 3180
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tcatgaaatg tttgtaagct ctccaccatc cagaatgact ttgcagctct gagcagctgc 3300
acccatgact agtccttcac agtatgctga tgtgagatat tctgttcttt gaagatgggt 3360
agtgaccaga atcaggagga tgtgagaaat gtggagcatt tgagagtgga actcctgcag 3420
ctgttgaagc tagaacacaa cagacactgc agcttactac tcctgagcct ggccaggctg 3480
gtagttttgt ttttcttggc caagctctct gggaatagtt ctgcctctgg ggtcagcttt 3540
ccatgcaggg gctgagatga acacataaag caggattcag cttggaggct tctgagaggg 3600
atggagataa aagatggtgt ggtagatggt aagaggtggt atggtagatg gcagagtatg 3660
gcagaagatg tagacaggat gtcagaaaat gagatggtag ttgcaagagt aggctgtaga 3720
cagtgggaga tggtgagatg agagatgcag aagatggtca gagagcagga tgttgggaga 3780
ggctaggagg tgagacacca gggttggagt gtggactgca ggctttgtta ggctggagag 3840
gtgagtagct gtggagagag gatgacctgc acttgtctga atctaacaga acctaaatta 3900
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cactctggaa cagggtggtt agagctgtgg ctttcatggt acttctcttc actgggctct 4020
gatagcctgg ggctgctggt actatctgct tgcacttgct ttgaggaggc caagaacatc 4080
ctgtgtattt ccagactctt tcttgttctg tttgtcctct caggctattc cttgtgctcc 4140
tgatgtctct gtctttactt ccaaaactat ttattaaaaa atctaagatt cattcatgtt 4200
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gaccatcttg tgtaaaatct taatctcagc agtcacattt gctgttgaag tgagtatgaa 4320
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accaaacctg gatgcagtca gaggttgggc acagcctttg ctccaaggct cctgggcaca 5220
gtgcccacct cccatttgag cttgcagcaa ggctattatg agaaactttc ctcctcttcc 5280
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ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 6780
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gccgcagagc cggcagcagg ccgcgggaag gaaggtccgc tggattgagg gccgaaggga 7260
cgtagcagaa ggacgtcccg cgcagaatcc aggtggcaac acaggcgagc agccaaggaa 7320
aggacgatga tttccccgac aacaccacgg aattgtcagt gcccaacagc cgagcccctg 7380
tccagcagcg ggcaaggcag gcggcgatga gttccgccgt ggcaataggg agggggaaag 7440
cgaaagtccc ggaaaggagc tgacaggtgg tggcaatgcc ccaaccagtg ggggttgcgt 7500
cagcaaacac agtgcacacc acgccacgtt gcctgacaac gggccacaac tcctcataaa 7560
gagacagcaa ccaggattta tacaaggagg agaaaatgaa agccatacgg gaagcaatag 7620
catgatacaa aggcattaaa gcagcgtatc cacatagcgt aaaaggagca acatagttaa 7680
gaataccagt caatctttca caaattttgt aatccagagg ttgattatcg ataagcttgc 7740
ggcctcgagg gtttaaactt aattaacaat tgggtggctc aaccggtgat atcttcgaac 7800
ggatcccaca gtcgtggaag actttccctt cggatcttcg aggaattctt tgccaaaatg 7860
atgagacagc acaataacca gcacgttgcc caggagctgt aggaaaaaga agaaggcatg 7920
aacatggtta gcagaggctc tagctcccgg agcccctcaa ggctttcacg cagccacaga 7980
aaggtggtga ctgagatgtt ttctaggaaa cacaaaagat acaaaaaaga acacgtggaa 8040
ggatagccaa aaaggggggc tgcccccatt tcctgcaccc cgctgcgatg gctggcacca 8100
tttggaagac ttcgagatac actgttgagc gcagtaagac aacagtgtat ctcgaagtct 8160
tccagatggg gccagccggt ccactctgta tccaggccag ttctgcaagg cgttcgagga 8220
ccacccccct cccctcgcca ccaggacaag ccgtcattaa accaagcgct aattacagcg 8280
ctgaggagaa gggccgtccc gcccgctcac ctgtgggagt aacgcggtca gtcagagccg 8340
gggcgggcgg cgcgaggcgg cggcggagcg gggcacgggg cgaaggcagc gtcgcagcga 8400
ctcccgcccg ccgcgcgctt cgctttttat agggccgccg ccgccgccgc ctcgccataa 8460
aaggaaactt tcggagcgcg ccgctctgat tggctgccgc cgcacctctc cgcctcgccc 8520
cgccccgccc ctcgccccgc cccgccccgc ctggcgcgcg cccccccccc ccccccgccc 8580
ccatcgctgc acaaaataat taaaaaataa ataaatacaa aattgggggt ggggaggggg 8640
gggagatggg gagagtgaag cagaacgtgg ggctcacctc gaccatggta atagcgatga 8700
ctaatacgta gatgtactgc caagtaggaa agtcccataa ggtcatgtac tgggcataat 8760
gccaggcggg ccatttaccg tcattgacgt caataggggg cgtacttggc atatgataca 8820
cttgatgtac tgccaagtgg gcagtttacc gtaaatactc cacccattga cgtcaatgga 8880
aagtccctat tggcgttact atgggaacat acgtcattat tgacgtcaat gggcgggggt 8940
cgttgggcgg tcagccaggc gggccattta ccgtaagtta tgtaacgcgg aactccatat 9000
atgggctatg aactaatgac cccgtaattg attactatta ataactaggt accgaattca 9060
gatccaagct tcaccatggg agacgtcacc ggttctagaa cctagggagc tctggtaccc 9120
actagtagtc gacgaacgcg taacctcccg cttcaaaatg gagaccctgc gtgctcactc 9180
gggcttaaat acccagagct agcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 9240
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 9300
ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaa 9348
<210> 47
<211> 263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码aSyn shRNA的第一链序列
<400> 47
cctggtggcg aggggagggg ggtggtcctc gaacgccttg cagaactggc ctggatacag 60
agtggaccgg ctggccccat ctggaagact tcgagataca ctgttgtctt actgcgctca 120
acagtgtatc tcgaagtctt ccaaatggtg ccagccatcg cagcggggtg caggaaatgg 180
gggcagcccc cctttttggc tatccttcca cgtgttcttt tttgtatctt ttgtgtttcc 240
tagaaaacat ctcagtcacc acc 263
<210> 48
<211> 263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码aSyn shRNA的第二链序列
<400> 48
ggtggtgact gagatgtttt ctaggaaaca caaaagatac aaaaaagaac acgtggaagg 60
atagccaaaa aggggggctg cccccatttc ctgcaccccg ctgcgatggc tggcaccatt 120
tggaagactt cgagatacac tgttgagcgc agtaagacaa cagtgtatct cgaagtcttc 180
cagatggggc cagccggtcc actctgtatc caggccagtt ctgcaaggcg ttcgaggacc 240
acccccctcc cctcgccacc agg 263

Claims (28)

1.一种用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码葡糖脑苷脂酶(Gcase)蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQID NO:15的核苷酸序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV以从约5×1010vg/g脑至约5×1011vg/g脑的剂量施用于所述受试者。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV以约1.3×1011vg/g脑的剂量施用于所述受试者。
4.一种用于治疗患有具有葡糖脑苷脂酶1(GBA1)突变的帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于所述受试者。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述rAAV以约1×1014vg或约2×1014vg的剂量施用于所述受试者。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述rAAV经由枕骨下注射到小脑延髓池中来施用。
8.一种用于治疗患有1型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于所述受试者。
10.如权利要求7或8所述的方法，其中所述rAAV经静脉内施用。
11.一种用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸包含含有转基因的表达构建体，所述转基因包含：
(a)含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；以及
(b)含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
12.一种用于治疗患有突触核蛋白病或帕金森症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含：
(i)包含核酸的rAAV载体，所述核酸包含含有转基因的表达构建体，所述转基因包含含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述突触核蛋白病或帕金森症是多系统萎缩症、帕金森病、具有GBA1突变的帕金森病、路易体病、路易体痴呆、具有GBA1突变的路易体痴呆、进行性核上性麻痹或皮质基底综合征。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述启动子是鸡β肌动蛋白(CBA)启动子。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含巨细胞病毒(CMV)增强子。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含牛生长激素聚A信号尾。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述核酸包含位于所述表达构建体侧翼的两个腺相关病毒反向末端重复(ITR)序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中每个ITR序列是野生型AAV2ITR序列。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体还包含在5'ITR与所述表达构建体之间的TRY区，其中所述TRY区包含SEQ ID NO:28。
21.一种用于治疗患有2型戈谢病或3型戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸按5'至3'顺序包含：
(a)AAV2 ITR；
(b)CMV增强子；
(c)CBA启动子；
(d)编码Gcase蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(e)WPRE；
(f)牛生长激素聚A信号尾；以及
(g)AAV2 ITR；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白；
其中所述rAAV以从约5×1010vg/g脑至约5×1011vg/g脑范围内的剂量施用于受试者。
22.一种用于治疗患有具有GBA1突变的帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用rAAV，所述rAAV包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸按5'至3'顺序包含：
(a)AAV2 ITR；
(b)CMV增强子；
(c)CBA启动子；
(d)编码Gcase蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(e)WPRE；
(f)牛生长激素聚A信号尾；以及
(g)AAV2 ITR；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白；
其中所述rAAV以从约5×1013vg至约5×1014vg范围内的剂量施用于所述受试者。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述rAAV经由枕骨下注射到小脑延髓池中来施用。
24.如权利要求1-10和21-23中任一项所述的方法，其中所述rAAV以包含约20mM pH8.0的Tris、约1mM MgCl2、约200mM NaCl和约0.001％w/v泊洛沙姆188的制剂施用。
25.一种药物组合物，其包含：
(i)包含以下项的rAAV：
(a)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(b)AAV9衣壳蛋白；以及
(ii)约20mM pH 8.0的Tris，
(iii)约1mM MgCl2，
(iv)约200mM NaCl，和
(v)约0.001％w/v泊洛沙姆188。
26.一种rAAV，其包含：
(a)包含含有表达构建体的核酸的rAAV载体，所述表达构建体包含与编码Gcase蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；以及
(b)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的1型戈谢病、2型戈谢病、3型戈谢病或具有GBA1突变的帕金森病的方法中。
27.一种rAAV，其包含：
(i)含有核酸的rAAV载体，所述核酸包含表达构建体，所述表达构建体包含与转基因插入物可操作地连接的启动子，所述转基因插入物包含：
(a)含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的Gcase蛋白编码序列；以及
(b)含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的突触核蛋白病或帕金森症的方法中。
28.一种rAAV，其包含：
(i)包含核酸的rAAV载体，所述核酸包含表达构建体，所述表达构建体包含与转基因插入物可操作地连接的启动子，所述转基因插入物包含含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的抑制性核酸编码序列；以及
(ii)AAV9衣壳蛋白，
用于治疗受试者中的突触核蛋白病或帕金森症的方法中。
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