JP2001500376A

JP2001500376A - 組換えａａｖベクターを使用する治療分子の肝臓特異的送達のための方法および組成物

Info

Publication number: JP2001500376A
Application number: JP10512823A
Authority: JP
Inventors: スリバスタバ，アロン; ポンナザーガン，セルバランガン; エイチ．クロエマー，ロバート; ワン，ズ―シャン; シー．ヨダー，マービン; ジョウ，シャン―ジェン; エスコベド，ジェイム; ドワーキ，バラバーニ
Original assignee: カイロンコーポレイション; インディアナユニバーシティ
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-02
Publication date: 2001-01-16
Also published as: US20010051611A1; US20030166284A1; US6521225B1; EP0933997A1; WO1998009524A1; EP0933997A4

Abstract

(57)【要約】肝臓における、分泌タンパク質、アンチセンス分子、およびリボザイムのような治療分子を選択的に発現するための方法が提供される。この方法は、肝臓疾患または状態の処置における使用を見出した。この方法はまた、例えば、分泌タンパク質のような治療物質の全身投与が所望される任意の疾患または状態の処置における使用を見出した。この方法は、治療分子の治療的有効量を含有する治療分子AAVベクターの肝臓発現の必要性を有する哺乳動物患者に投与する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】組換えAAVベクターを使用する治療分子の肝臓特異的送達のための方法および組成物背景遺伝子治療による疾患および障害の治療的処置には細胞への新規の遺伝子情報の移入および安定な挿入が含まれる。種々の物理学的および化学的方法が、真核生物細胞への外因性DNAの導入のために開発されているが、ウイルスがこの目的のためにより効果的であることが、一般に証明されている。いくつかのDNA含有ウイルス（例えば、パルボウイルス、アデノウイルス、およびヘルペスウイルス）、およびRNA含有ウイルス（例えば、レトロウイルス）が、真核生物クローニングベクターおよび発現ベクターを構築するために使用され、そして遺伝子治療ビヒクルとして探索されてきた。レトロウイルスおよびアデノウイルスに基づくベクターは、特定の合併症および損傷に関連する。例えば、レトロウイルスは、新生物形成事象に深く関連する。Donahue，Helper virus induced T cell lymphoma in non-human primates af ter retroviral mediated gene transfer，J.Exp.Med．176（1992）1125-1135を参照のこと。アデノウイルスは、CTL応答を誘導する。Yang，MHC class 1-restr icted cytotoxic T lymphocytes to viral antigens destroy hepatocytes in m ice infected with E1-deleted recombinant adenoviruses，Immunity 1（1994 ）433-442を参照のこと。アデノウイルスはまた、比較的大きな（35kb）ウイルスゲノムを必要とし、その制限された大きな配列を送達するためのビヒクルとしての有用性を達成する。従って、病原性または免疫原性のいずれでもない別のベクターが、有利である。アデノウイルスと比較して、パルボウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）は、多くのより小さなゲノムを有し、そのほとんどは外来DNAにより置換され得る。パルボウイルスは、直径約25nmの小さなicohedralウイルスであり、約５キロベース（kb）の一本鎖DNAゲノムを含有する。これは２つの主要なクラスから構成される：AAVおよびそのサブタイプを含有する依存性ウイルス（AAV1，AAV2、AAV 3、AAV4、およびAAV5）、ならびに自律性パルボウイルス。後者は、溶菌的に感染して、ヘルパーウイルスの援助なしに、組込みでない様式で細胞増殖を可能にする。一方で、AAVは、その最適な複製のために、へルパーウイルス（通常はアデノウイルス（または、ヘルペスウイルス））との同時感染を必要とする非病原性ヒトパルボウイルスである。例えば、Berns，Parvovirus replication，Micro biol．Rev．54（1990）316-329、ならびにBernsおよびBohenzky，Adeno-associa ted viruses;更新，Adv.Virus Res．32（1987）243-306を参照のこと。ヘルパーウイルスの非存在下で、野生型（wt）AAVは、ヒト19番染色体に部位特異的様式で組み込むことを示している。KotinおよびBerns，Organization of adeno-associated virus DNA in latently infected Detroit 6 cells，Virol． 170（1989）460-467；Kotin，Mapping and direct visualization of a region- specific viral DNA integration site on chromosome 19q13-qter，Genomics 1 0（1991）831-834;Kotin，Site-specific integration by adeno-associated vi rus，Proc.Natl.Acad.Sci．87（1990）2211-2215、およびSamulski，Targeted i ntegration of adeno-associated virus（AAV）into human chromosome 19，EMB O J．10（1991）3941-3950を参照のこと。組換えAAVベクターは、組込みのこの部位特異性を欠如するようである。Ponnazhagan，Adeno-associated virus 2-me diated transduction of murine hematopoietic cells and long-term expressi on of ahuman globin gene in vivo,第６回Parvovirus Workshop，Montpellier ，France．29頁、（1995）を参照のこと。それにもかかわらず、AAVに基づくベクター系は、より一般的に使用されるレトロウイルスに基づくベクターおよびアデノウイルスに基づくベクターに対する安全な代替物であることが証明され得ることが示唆されている。例えば、Muzyczka，Use of adeno-associated virus as a general transduction vector for mammalian cells，Curr．Top．Microbiol ．Immunol．158（1992）97-129を参照のこと。人口の約90％がAAVに対して血清陽性である（例えば、Blacklow，A sero-epidemiologic study of adeno-associ ated virus infection in infants and children，Am.J.Epidemiol．94（1971） 359-366を参照のこと）ので、組換えAAVによる偶発的な感染は、問題ないようである。さらに、AAVの比較的高度な安定性、高度な力価、および高度な形質転換効率は、AAVベクターの所望の特性に加えられる。Carter，Adeno-associated viru s vectors，Curr.Opin.Biotechnol．3（1993）533-538、およびSrivastava，Par vovirus-based vectors for human gene therapy，Blood Cells 20（1994）531- 538を参照のこと。多数の研究が、AAV媒介性の首尾良い形質導入およびインビトロでの治療的遺伝子の発現を報告している。例えば、以下を参照のこと：いくつかの研究が、インビボでのAAVベクターの安全性および効率を試験した（Flotte，Stable in vivo expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an adeno-associated virus vector，Proc.Natl ．Acad.Sci．90（1993）10613-10617、およびKaplitt，Long-term gene express io n and phenotypic correction using adeno-associated virus vecters in the mammalian brain，Nature Genet．8（1994）148-153を参照のこと）。いくつかの臨床徴候におけるAAVベクターの欠点は、AAV感染の一般的な性質である。以前の研究は、AAVが、種の境界を超える広い宿主範囲を有することを示唆した。例えば、Muzyczka，Use of adeno-associated virus as a general tra nsduction vector for mammalian cells，Curr.Top.Microbiol.Immunol．158（1 992）97-129を参照のこと。自律性パルボウイルスLuIIIは、肝臓特異的発現が、肝臓特異的エンハンサーおよび調節プロモーターを含む組換え体の使用を介してのみ得られているので、同様に広い宿主範囲を有するようである。Maxwell，Aut onomous parvovirus transduction of a gene under control of tissue-specif ic or inducible promoters，Gene Therapy 3（1996）28036を参照のこと。驚くことに、本発明者らは、AAVが肝臓に対して器官向性を示し、そしてそれゆえ、肝臓の疾患または状態の処置に独自に適合されることを発見した。ここで、疾患または状態は、肝臓または疾患または状態において作製されたタンパク質に関与することにより特徴付けられ、ここで、肝臓を介する治療薬の全身投与が所望されるかまたは有利である。発明の要旨１つの局面において、本発明は、肝臓における治療分子（例えば、分泌タンパク質、アンチセンス分子、およびリボザイム）の選択的な発現のための方法を提供する。この方法は、肝臓の疾患または状態を処置することにおける用途を見出す。この方法はまた、治療物質（例えば、分泌タンパク質）の全身投与が所望される任意の疾患または状態を処置することにおける用途を見出す。この方法はまた、肝臓に由来するかまたは肝臓において通常作成されるタンパク質に関与する、疾患または状態の処置における用途を見出した。この方法は、治療分子の肝臓発現を必要としている哺乳動物患者に、治療分子を含むAVVベターの治療有効量を投与することを包含する。本明細書中に記載される方法を用いて投与され得る、肝臓疾患または状態を処置することにおいて有用である治療分子として、例えば、インスリンおよびチミジンキナーゼが挙げられる。肝臓由来のタンパク質または肝臓において通常作成されるタンパク質を含む治療分子として、例えば、LDLレセプター、第VIII因子、第IX因子、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC ）、およびα1-抗トリプシンが挙げられる。分泌タンパク質を含む治療分子（ここで、全身投与が肝臓特異的送達を介して有意に達成される）として、例えば、サイトカイン、増殖因子、およびコロニー刺激因子、G-CSFおよびGM-CSFが挙げられる。本発明の方法および組成物における使用のために意図されるさらなるタンパク質治療分子は、以下に記載される。肝臓疾患を処置することにおいて有用であるアンチセンス分子をコードする核酸配列もまた含まれる。アンチセンス分子は、標的配列（アンチセンス配列が標的配列に結合する）に対して、配列において十分に相補的であることによって、過剰生産、欠損、または他の所望でない分子の発現を妨げるかまたは限定し得る RNA配列である。例えば、標的配列は、タンパク質をコードするmRNAの一部であり得、そしてアンチセンスRNAは、mRNAに結合し、そして翻訳を妨げる。標的配列は、転写に必要な遺伝子の一部であり得、そしてアンチセンスRNAは、遺伝子セグメントに結合し、そして転写を妨げるかまたは制限する。例えば、Ｃ群アデノウイルスAd2およびAd5は、ウイルス（これは、細胞の小胞体網状組織でクラス I MHC分子に結合し、そして細胞表面への分子の末端グリコシル化および翻訳を妨げる）のE3領域にコードされる19キロダルトンの糖タンパク質（gp19）を有する。肝臓移植の前に、肝臓細胞は、gp19をコードするAAVベクターまたはウイルス粒子（gp19の発現の際にクラスI MHC移植抗原の表面発現を阻害する）で感染させられ得る。これらのドナー細胞は、低い危険性の移植片拒絶で移植され得、そして患者に対する最小の免疫抑制療法を必要とし得る。これはまた、ドナー- レシピエント状態がより低い合併症を有して存在することを許容する。同様の処置が、慢性Ｂ型肝炎感染または非Ａ非Ｂ型肝炎を処置するために使用され得る。ベクターは、構造的肝炎遺伝子、ポリアデニル化シグナル、または逆方向のそのフラグメントを含むように操作され得、その結果、発現産物が肝炎ウイルスmRNA転写物に結合し、構造タンパク質の転写を妨げ、そして最終的にウイルスを「不活化する」。例えば、Wu，Specific inhibition of hepatitis B vir al gene expression in vitro by targeted antisense oligonucleotides，J.Bi ol.Chem．267（1992）12436-12439、およびOffensperger，In vitro inhibition of duck hepatitis B virus replication and gene expression by phosphorot hioate modified antisense oligodeoxynyucleotides，EMBO J．12（1993）1257 -1262を参照のこと。種々の疾患および状態を処置することにおいて有用であるリボザイムをコードする核酸配列もまた含まれる。リボザイムは、特定の配列でRNA切断を触媒し得、そしてそれゆえ特定のmRNA分子を攻撃するのに有用である、RNAポリヌクレオチドである。慢性骨髄性白血病において、例えば、「フィラデルフィア染色体転座」は、bcr-abl融合タンパク質の発現およびabl腫瘍タンパク質の異常な機能を引き起こす。融合mRNAが染色体転座を行った細胞においてのみ起こるので、そして融合転写物がスプライス接合部で２つの可能な配列のみを含有するので、２つのbcr-abl融合mRNAスプライス接合部のいずれかに特異的なリボザイムは、腫瘍タンパク質の発現を阻害し得る。例示的なリボザイムには、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎に対するリボザイムが挙げられる。ChristoffersenおよびMarr ，J.Med.Chem．38（1995）2023-2037ならびにBarpolome，J.Hepatol．22（1995 ）57-64を参照のこと。現在好ましい治療分子は、LDLレセプター、第VIII因子、第IX因子、PAH、TPO （トロンボポイエチン）、およびEPO（エリスロポイエチン）である。増殖因子およびサイトカインもまた好ましい。本発明の目的のための治療分子の治療有効量は、少なくとも約10⁹〜約10¹¹粒子／身体である。患者は任意の哺乳動物であり得るが、霊長類の患者（特にヒトの患者）が、処置の方法から最も有利であることが意図される。他の患者には、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマの種が含まれ得る。本発明者らは、任意のAAVベクターが、本発明の方法において使用され得ることを意図する。このようなベクターの本発明における使用のための主な例および好ましい例は、Srivastava，PCT Patent Publication WO 93/09239に開示されているAAV-2基礎ベクターである。本明細書中に開示されている本発明のベクターが最も好ましい。このようなベクターには、２個のAAV ITR（末端配列が反転している）が含まれ、ここで、ITRの真正（すなわち、天然）Ｄ-配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５個の真正ヌクレオチドから18個までの真正ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも10個の真正ヌクレオチドから18個の真正ヌクレオチド、最も好ましくは10個の真正（すなわち、天然）ヌクレオチドが保持され、そしてＤ-配列の残りのヌクレオチドは、欠失されるかまたは非天然（すなわち、外因性）ヌクレオチドで置換される。保持される５個の天然ヌクレオチドの好ましい配列は、5'CTCCA 3'である。AAV ITRの真正（すなわち、天然）Ｄ-配列は、HP形成に関与しないAAV ITR（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）の各々における20の連続ヌクレオチドである。外因性または非天然置換ヌクレオチドは、天然のＤ-配列の同じ位置に見出されるヌクレオチドとは違って、任意のヌクレオチドであり得る。例えば、天然のＤ-配列ヌクレオチドＣの適切な置換ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、およびＧであり、そして天然のＤ-配列ヌクレオチドＡの適切な置換ヌクレオチドは、Ｔ、Ｇ、およびＣである。このような４つのベクターの構築は、実施例４に例示され、理解されるように、ベクターpD-5、pD-15、およびpD-20が好ましく、そしてベクターpD-10が最も好ましく、出発物質としてべクターpXS-22が使用される。他の使用可能な例示的ベクターは、Nahreini，Gene 124(1993)257-262に開示されているpWP-19、pWN-1である。このようなAACベクターの他の例は、psub201 である。Samulski，J.Virol．61(1987)3096を参照のこと。他の例は、Double-D ITRベクターである。Double-D ITRベクターをどのように作製するかは、米国特許第5,478,745号に開示されている。さらに別のベクターは、Carter、米国特許第4,797,368号、およびMuzyczka、米国特許第5,139,941号、Chartejee、米国特許第5,474,935号、およびKotin、PCT特許公開WO 94/28157に開示されるベクターである。本発明の方法において使用可能なAAVベクターのなおさらなる例は、SSV 9AFABTKneoであり、これはAFPエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓における優勢な発現を導く。その構造およびそれをどのように作製するかは、Su、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のアデノ随伴ウイルス送達によるAFP陽性肝細胞ガン細胞の選択的殺傷、Human Gene Therapy 7( 1996)463-470に開示されている。これらの科学論文の開示、米国特許、および特許刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の実施に絶対必要ではないが、さらなる実施態様において、本発明のAA Vベクターは、ベクター中に含まれる外因性DNA配列の肝臓特異的発現の可能性を最大化するために、肝臓特異的プロモーターを含み得る。プロモーターは、治療的分子をコードする核酸の上流で、かつAAVベクター配列の間（例えば、psub201 内の逆末端反復間またはDouble D ITR配列の下流）に作動可能に連結される。好ましい肝臓特異的プロモーターとしては、Ｂ型肝炎X遺伝子プロモーターおよびＢ型肝炎コアタンパク質プロモーターが挙げられる。これらの肝臓特異的プロモーターは、好ましくはそれらの関連するエンハンサーとともに使用される。エンハンサーエレメントは、治療的分子をコードする核酸の5'末端または3'末端のいずれかに連結され得る。Ｂ型肝炎X遺伝子プロモーターおよびそのエンハンサーは、Twu，J.Virol．61(1987)3448-3453において記載の方法を使用して、332塩基対EcoRV-NcoI DNAフラグメントとして、ウイルスゲノムから得られ得る。Ｂ型肝炎コアタンパク質プロモーターは、Gerlach，Virol 189(1992)59-66に記載の方法を使用して、584塩基対のBamHI-BglII DNAフラグメントとしてウイルスゲノムから得られ得る。BamHI-BglIIフラグメントは、それが挿入される前に負の調節配列を除去する必要があるかもしれない。他の肝臓特異的プロモーターとしては、欧州特許公開0 415 731に開示されるようなAFP(α胎性タンパク質)遺伝子プロモーター、およびRettenger，Proc.Natl.Acad.Sci．91(1994)1460-1464に開示されるようなα-1抗トリプシン遺伝子プロモーター、フィブリノーゲン遺伝子プロモーター、およびアルブミン遺伝子プロモーター、APO-Al(アポリポタンパク質A l)遺伝子プロモーター、ならびに例えば、SGOT、SGPTおよびγグルタミルトランスフェラーゼのような肝臓転移酵素に対するプロモーター遺伝子が挙げられる。 PCT特許公開WO 90/07936およびWO 91/02805もまた参照のこと。本発明者らはまた、先天性であろうと後天性であろうと、任意の肝臓疾患または任意の肝臓機能の欠損が、本発明の方法による処置に感受性であることを意図する。例示的な肝臓疾患または肝臓機能の欠損としては、肝細胞ガン腫、黄疸、感染性肝炎、アルコール肝損傷（アルコール誘導肝硬変を含む）、および非アルコール誘導肝硬変が挙げられる。本発明者らはまた、肝臓において正常に作製される治療的分子の投与を必要とする任意の先天性または後天性疾患または欠損の処置が、本発明の方法による処置に感受性であることを意図する。例示的な先天性疾患としては、LDLレセプター欠損に起因する家族性高コレステロール血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損に起因するフェニルケトン尿症、尿素回転疾患、有機酸疾患、ウィルソン病、チロシン血症、α₁-抗トリプシン欠損、およびオルニチントランスカルバミラーゼ機能の先天性欠損に起因する高アンモニア血症が挙げられる。例示的な後天性疾患としては、非家族性高コレステロール血症および他の高リポタンパク質血症が挙げられる。本発明者らはまた、本明細書に記載の方法が、治療的物質（例えば、分泌タンパク質）が、例えば肝臓系による循環系内への侵入を介して全身投与を得るために肝臓内で有利に発現される任意の疾患または条件を処置することにおける使用を見出すことを意図する。本明細書に記載の任意のサイトカインおよび免疫調節タンパク質をコードする遺伝子が、肝臓特異的インビボ発現を達成するために、 AAVベクターにおいて発現され得る。当業者に公知の本明細書に記載される形態とは違ったこれらのサイトカインの形態が使用され得る。例えば、天然のIL-2（インターロイキン２）およびγインターフェロンをコードする核酸配列は、それぞれ米国特許第4,738,927号および同第5,326,859号に記載のように得られ得るが、一方それらのタンパク質の有用な変異体が、米国特許番号第4,853,332号に記載のように得られ得る。さらなる例として、M-CSF（マクロファージコロニー刺激因子）の短い形態または長い形態をコードする核酸配列は、それぞれ米国特許第4,847,201号および同第4,879,227号に記載のように得られ得る。AAVベクター発現サイトカインまたは免疫調節遺伝子は、本明細書に記載のように産生され得る。種々の既知のペプチドホルモンおよび増殖因子を産生するAAVベクターは、本発明の方法において使用されて、これらのタンパク質の治療的発現を生じ得る。そのようなホルモン、増殖因子、および他のタンパク質のいくつかは、例えば欧州特許0 437 478 B1に記載されている。例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、カルシトニン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ヒト卵膜ゴナドトロピン、胸腺刺激ホルモンを含む種々のホルモンをコードする核酸配列が使用され得る。ポリペプチドホルモンおよび増殖因子を発現するAAVべクターは、当業者に公知の方法によって調製され得る。さらなる例として、異なる形態のヒトインスリンをコードする核酸配列は、欧州特許公開026598または070632に記載のように単離され得、そして本明細書に記載のようにAAVベクターに取り込まれ得る。任意のポリペプチド増殖因子はまた、AAVベクターを用いるインビボでの肝臓特異的発現によって治療的に投与され得る。例えば、IGF-1およびIGF-2増殖因子ポリペプチドの異なる形態が、当該分野で周知であり、そして肝臓特異的発現のためにAAVベクター中に取り込まれ得る。欧州特許0 123 228 B1を参照のこと。線維芽細胞増殖因子の異なる形態の肝臓特異的発現もまた、本発明の方法によって達成され得る。米国特許第5,464,774号；第5,155,214号、および第4,994,559 号を参照のこと。本発明の方法によって発現され得る、遺伝的疾患の処置に有用な多数のタンパク質が存在する。欠陥遺伝子の遺伝に起因する多くの遺伝的疾患（例えば、重症複合免疫不全(SCID)、血友病Ａ、血友病Ｂ、アデニンデアミナーゼ欠損、ゴシェ症候群、遺伝的乳糖過敏症、および遺伝性肺気腫は、正常な遺伝子産物を産生することの不全を生じる。適切なホルモンの適切なレベルを産生する遺伝子の不能に起因する疾患（例えば、糖尿病および下垂体機能低下症）もまた意図される。血友病のような血液凝固疾患の処置に有用なVIII因子またはIX因子の肝臓特異的発現は、本発明の方法を用いて入手可能である。PCT特許公開WO 96/21014は、 AAV発現のために当業者によって容易に適応し得るレトロウイルス発現のためのV III因子およびHGH（ヒト成長ホルモン）構築物を記載する。VIII因子ミニ遺伝子（欧州特許公開232112およびPCT特許公開WO 91/07490を参照のこと）は、AAV発現のために有利に使用され得る。遺伝性乳糖過敏症の処置のためのラクターゼの発現、ADA欠損の処置のためのADAの発現、およびα-1抗トリプシンの処置のためのα-1抗トリプシンの発現もまた意図される。Ledley，J.Pediatrics 110:(1987 )157-174;Verma，Scientific American(1987年11月)68-84頁、およびPCT特許公開WO95/27512を参照のこと。本発明の方法を用いて肝臓特異的な様式で発現され得る、治療目的の種々の他のタンパク質が存在する。例えば、組織因子阻害タンパク質(TFPI)の持続性の発現は、敗血症およびDICを含む状態の処置、ならびに再灌流傷害の予防において有用である。PCT特許公開WO 93/24143、WO 93/25230、およびWO 96/06637を参照のこと。TFPIの種々の形態をコードする核酸配列は、例えば、米国特許第4,966, 852号、第5,106,833号、および第5,466,783号に記載のように入手され得、そして本明細書に記載のように、AAVベクター中に取り込まれ得る。エリスロポエチン(EPO)およびレプチンのような治療目的の他のタンパク質は、本発明の方法に従ってAAVベクターによって肝臓内で発現され得る。EPOは、貧血を含む種々の疾患の遺伝子治療処置に有用である。PCT特許公開WO95/13376を参照のこと。レプチン遺伝子の遺伝子治療送達および肥満の処置におけるその使用は、PCT特許公開WO 96/05309に記載されている。EPOまたはレプチンを発現するAAVベクターは容易に産生され得、そして肝臓特異的発現は、記載される方法を使用して達成され得る。他の例示的なタンパク質およびポリペプチドとしては、インターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9 、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、およびIL-15のようなサイトカイン、α インターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、GM-CSF、腫瘍壊死因子(TNF)、CD3、ICAM-1、LFA-1、 LFA-3、ケモカイン（RANTES 1α、MIP-1α 、MIP-1β(Cocchi，Science 720（1996）1811-1815を参照のこと)、またはそのようなタンパク質のアナログを含む）が挙げられる。可溶形態のレセプターが、因子自体が形態を変異され得る場合、しばしばアンタゴニストとして振る舞い得るので、治療目的の核酸配列はまた、これらのタンパク質およびペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、またはリガンドであり得る。本発明のAAVベクターおよび方法を使用して肝臓特異的様式において発現され得る、治療目的のなおさらなるタンパク質およびポリペプチドとしては、プロテインＳおよびGas6、トロンビン、凝血Xa因子、CSF-1、またはM-CSF、IGF-1、IGF -2、酸性FGF、塩基性FGF、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、TGF、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)およびHGFアクチベーター、PSA、神経細胞増殖因子(NCGF),グリア細胞由来神経増殖因子(GDNF)、VFGF、 Arg-バソプレッシン、胸腺ホルモン、アゾキシメタン、トリヨードチロニン、LI F、アンフィレギュリン(amphiregulin)、可溶性トロンボモジュリン(thrombomod ulin)、幹細胞因子、骨形成タンパク質１、骨形態形成タンパク質、MGF、MGSA、ヘレグリン（heregulin）、およびメラニン細胞刺激ホルモンが挙げられる。増殖因子はまた、例えば、DGF、IGF、PDGF、FGF、またはKGFの１つまたはいくつかからなる混合物を組み合わせて使用され得る。完全長の増殖因子が使用され得るか、または活性フラグメント、短縮形態およびアナログのような増殖因子の形態が使用され得る。「活性フラグメント」によって、本発明者らは、本発明の方法に使用されるのに充分な生物学的活性が保持される、完全長より少ない配列を含むポリペプチドを意味する。「アナログ」によって、本発明者らは、完全長タンパク質もしくはポリペプチドの１以上の天然の生物活性を有する成熟タンパク質またはポリペプチドの短縮形態、スプライス変異体、アミノ酸置換、欠失、または付加を有する変異体、対立遺伝子、および誘導体を意味する。従って、成熟タンパク質のアミノ酸配列に対して、同一であるか、または少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、および最も好ましくは90％のアミノ酸配列相同性を含むポリペプチドは、ヒト供給源に由来しようと非ヒト供給源に由来しようと、この定義内に含まれる。例えば、KGFの好ましい短縮型形態は、PCT特許公開WO95/10434に記載されている。ヒトEGFに関しては、PCT特許公開WO 90/08771 および米国特許第5,096,825号を参照のこと。増殖因子ポリペプチド、フラグメント、およびアナログは、天然に存在する供給源からの単離、ペプチド合成法および製造によるポリペプチド鎖合成、または組換えタンパク質の産生によって産生され得る。これらの方法は当業者に周知である。例えば、組換えPDGFの産生は、米国特許第5,045,633号および同第4,769,3 28号に記載され、そして組換えFGFおよびアナログの産生は、米国特許第5,229,5 01号；同第5,331,095号、および同第5,143,829号に記載されている。他の種々の疾患が、本発明の方法によって処置され得る。例えば、高脂血症の処置において有用なアポリポタンパク質Ｅまたはアポリポタンパク質Ａの産生は、本発明の肝臓特異的AAVベクターの投与を介して達成され得る。Breslow，Biot e chnology 12(1994)365を参照のこと。アンジオテンシンレセプターインヒビター (Goodfriend，N.Engl.J.Med．334(1996)1469を参照のこと)または腫瘍の処置に有用なアンジオスタチン(O'Reilly，Nature Med．2(1996)689)の持続的産生が達成され得る。上記のタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸配列は、種々の供給源から入手可能である。例えば、変化された細胞生成物をコードする配列を含むプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC，Rockville．Mary land)のような寄託機関、または商業的供給源（例えば、Advanced Biotechnolog ies(Columbia，Maryland)およびBritish Bio-Technology Limited(Cowley，Oxfo rd,Great Britain)から入手され得る。例示的なプラスミドとしては、rasの変異タンパク質を含むATCC番号41000および同41049が挙げられる。上記のタンパク質およびポリペプチドをコードする他の核酸配列、ならびに本発明で有利に使用されるアンチセンス配列およびリボザイムのような他の核酸分子は、このような公共の供給源から容易に入手され得る。例示的なものは、完全長GM-CSFコード配列を含むBBG12、γ-インターフェロンコード配列を含むBBG6、TNFをコードする配列を含むATCC番号39656、α-インターフェロンをコードする配列を含むATCC番号 20663、β-インターフェロンをコードする配列を含むATCC番号31902および同395 17、インターロイキン-1bコード配列を含むATCC番号67024、インターロイキン-2 をコードする配列を含むATCC番号39405、同39452、同39516、同39626、および同 39673、インターロイキン-4をコードする配列を含むATCC番号57592、インターロイキン-5をコードする配列を含むATCC番号59394および同59395、ならびにインターロイキン-6をコードする配列を含むATCC番号67153である。Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子クローン化ゲノムがATCCから入手可能である。ATCC番号45020 は、精製デーン粒子から抽出されたＢ型肝炎ウイルス（修正可能な誤差を有する）の全ゲノムDNAを、pBR322のBamHI部位中に含む。Blum TIG5(1989)154-158およびMoriarty，Proc.Natl.Acad.Sci．78(1981)2606-2610を参照のこと。あるいは、本発明で使用するためのcDNA配列は、その配列を発現するかまたは含む細胞から入手可能である。簡単には、１つの実施態様において、目的の遺伝子を発現する細胞由来のmRNAは、オリゴdTプライマーまたはランダムプライマーを用いて逆転写酵素で逆転写される。次いで、一本鎖cDNAは、所望の配列のいずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCR(米国特許第4, 683,202号；同第4,683,195号、および同第4,800,159号．PCR Technology:Princi ples and Applications for DNA Amphlification，Erlich(編)，Stockton Press ，1989)によって増幅され得る。特に、二本鎖DNAは、熱安定性Taqポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、ATP、CTP、GTP、およびTTPの存在下で、加熱によって変性される。合成が完全である場合に、可溶性DNA鎖(Soluble-stranded DNA )が生成される。このサイクルは、多くの回を繰り返されて、所望のDNAの階乗増幅を生じ得る。核酸配列はまた、例えば、Applied Biosystems Inc．DNA合成機によって新規に合成され得る。別の実施態様において、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコードするDNA配列またはその機能的フラグメント、およびAAVキャプシドタンパク質をコードするDNA配列を含むAAVハイブリッド（すなわち、キメラ）ベクターが提供される。このHBV 表面抗原ペプチドに対応するオリゴヌクレオチド配列は、平滑末端化され、AAVV P-1遺伝子の5'末端で連結される。詳細には、preS1領域のアミノ酸20〜47に対応するHBV表面抗原の第27アミノ酸配列(Ishikawa，Proc.Natl.Acad.Sci．92(1995) 6259-6263;Klingmuller，J.Virol．67(1993)7414-7422、ならびにNeurath，Cell 46(1986)429-436およびVirol．176(1990)448-457を参照のこと)は、インフレームで、AAVウイルスキャプシドVP-1遺伝子へ融合される(Srivastava，J.Virol．4 5(1983)555-564を参照のこと)。組換えAAVベクター中にクローン化された治療的分子をコードする核酸は、このAAV-HBVキメラヘルパーベクターを用いて、組換えAAVウイルス粒子中へパッケージングされ得る。AAV-2キャプシド遺伝子はクローン化され、そして利用可能である。Samulski，J.Virol．63(1989)3822-3828を参照のこと。しかし、任意のAAV由来（詳細には、AAV-1、AAV-3、またはAAV-4由来）のキャプシド遺伝子が使用され得る。HBVの分子生物学、構造、および遺伝子産物の一般的な総説については、Yoffe、ヒトＢ型肝炎ウイルス研究における進歩と展望、Prog.Med．Virol．40，107-140頁(Melnick，J,L.編)1993を参照のこと。ベクターの宿主細胞の染色体内への組み込みを確立するために、宿主細胞はベクターでトランスフェクトされるか、またはベクターを含む成熟ウイルス粒子で感染される。トランスフェクションの方法は当該分野で周知であり、そして例えば、裸のDNAトランスフェクション、マイクロインジェクション、および細胞融合を含む。ウイルス粒子は、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルス）との同時感染によって産生され得る。ベクターおよびヘルパーウイルスの同時感染の後、宿主細胞が単離され、そしてヘルパーウイルスが不活化される。得られたヘルパーを含まないウイルス粒子のストックを使用して、宿主細胞を感染させる。あるいは、ウイルス粒子はヘルパーウイルス感染細胞とベクターおよびヘルパープラスミドとの同時トランスフェクションによって産生される。プラスミドは、パルボウイルスrep遺伝子および非AAV ITR(例えば、アデノウイルスITR)を含む。同時トランスフェクションの後、成熟ウイルス粒子は、標準的な方法を用いて単離され、そして任意の夾雑アデノウイルスは、当業者に公知の方法を用いて不活化される。得られる成熟ウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの非存在下で宿主細胞を感染させるために使用され得る。組換えAAVベクターおよびパッケージング細胞株を作製する方法、精製方法、回収方法、および高力価べクターストックを生成する方法は、当該分野で公知である。例えば、Samulski、インビトロで切除され得る感染性アデノ随伴ウイルスゲノム由来の組換えプラスミドおよびウイルス複製を研究するためのその使用、 J.Virol.61(1987)3096-3101、および組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパーを含まないストック：正常な組み込みはウイルス遺伝子発現に必要ではない、J.Viro l．63(1989)3822-3828、McLaughlin、アデノ随伴ウイルスの一般的形質導入ベクター：プロウイルス構造の分析、J.Virol．62(1988)1963-1973、Flotte、インビボ形質導入の可能なパッケージング組換えアデノ随伴ウイルスベクターの改良系、Gene Therapy 2(1995)29-37、Holscher、アデノ随伴ウイルス(AAV)rep遺伝子を誘導性に発現する細胞株：rep陰性AAV変異体の生産的複製の必要性、J.Virol ．68(1994)7169-7177、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)Rep78タンパク質の高レベル発現は、rep陰性AAV変異体による感染性の粒子形成に充分である、J.Virol ．69(1995)6880-6885、Yang、アデノ随伴ウイルスRepタンパク質を誘導性に発現する細胞株の特徴づけ、J.Virol．68(1994)4847-4856、Ponnazhagan、組換えAAVベクターを生成するための代替ストラテジー、VIth parvovirus Workshop，Montpell ier，France，71頁(1995)、Luhovy、組換えアデノ随伴ウイルスの正常および鎌状細胞患者由来の造血幹細胞への安定な形質導入、Bio．Blood Marrow Transpl ．2(1996)24-30、Tamayose、スルホン化セルロースカラムクロマトグラフィーを用いることによる高力価組換えアデノ随伴ウイルスベクターの大量調製のための新しいストラテジー、Hum.Gene Therap．7(1996)507-513、Maxwell、組換えAAV の産生および感染力価の決定のための改良法、VIth Parvovirus Workshop，Mont pellier．France,72頁(1995)、Chiorini、高力価組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いたＴ細胞同時刺激分子B7-2のリンパ系細胞への高効率な移入、Hum．G ene Therap．6(1995)1531-1541、ならびにColosi、AAVベクターはヘルパーウイルスなしで効率的に産生され得る、Blood 10(1995)627aを参照のこと。ベクターまたはウイルス粒子は、哺乳動物病体、特にヒトへの投与のために薬学的組成物に取り込まれ得る。ベクターまたはウイルス粒子は、非毒性の不活性な薬学的に受容可能な水性キャリア（好ましくは、３〜８の範囲、より好ましくは６〜８の範囲のpHで）において処方され得る。このような滅菌組成物は、再構成の際に受容可能なpHを有する水性緩衝液に溶解される治療的分子をコードする核酸を含むベクターまたはウイルス粒子を含む。このような処方物は、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または賦形剤（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、リン酸、およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、保存剤、および他のタンパク質）との混合物中に治療的有効量のAAVベクターまたはウイルス粒子を含む。例示的なアミノ酸、ポリマー、および糖等は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアリン酸化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖、果糖、ブドウ糖、麦芽糖、ブドウ糖、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、キシリトール、乳糖、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸、アセテート、リンゲル溶液およびハンクス溶液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、およびグリコールである。好ましくは、この処方物は４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。ウイルス粒子は、静脈内注入によって全身に投与され得る。投与量措置は、例えば、患者の健康状態、状態の重篤度、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床的素因のような薬物の作用を改変することが知られる種々の素因を考慮して主治医または獣医によって決定される。一般的に、措置は身体あたり約10⁹〜約10¹¹粒子の範囲であるべきである。好ましい用量は、身体あたり約10¹⁰粒子である。投与される用量の数は、上述の素因に依存して変化し得る。 AAVベクターまたはウイルス粒子はまた、例えばChakrabarti，J.Biol.Chem．2 64(1989)15494-15500の手順に従うエレクトロポレーションによるか、またはKan eda，Science 243(1989)375-78およびFerguson，J.Biol.Chem 261(1986)14760-1 4763の手順に従うプロトプラスト送達による当該分野で認識される方法を使用してエキソビボで投与され得る。あるいは、肝細胞前駆細胞は本発明のベクターで形質導入され、組織培養容器中で増殖され、取り出され、そして移植(grafting) または移植(transuplantation)によって外科的に患者内に導入され得る。前駆細胞は、患者の腹腔空間内へか、または肝臓内、門脈系内、もしくは脾臓内へ直接注入される微小キャリアビーズのような支持体に付着され得る。患者の肝細胞は、肝臓生検、部分的肝切除を通してか、または同所肝臓移植のために取られた検体から入手され、精製され、そして培養において増殖され得る。AAVベクターは、ウイルスに曝露することによって肝細胞内へ導入され得、そして肝細胞は、移植するかまたは患者の肝臓の除去されない部分と接触する腹腔内に細胞を配置することによって患者内へ再び導入され得る。このような方法は当該分野で公知である。例えば、Chang、遺伝子治療：胃腸の疾患および肝臓疾患の処置への適用、Gastroenterology 106(1994)1076-1084を参照のこと。エキソビボ投与について、投薬量措置は、１〜100m.o.iの範囲内、好ましくは５〜20m.o.i.の範囲内であるべきである。投薬量措置は、例えば、健康状態、体重、性別、食事、状態の重篤度、投与時間、および他の臨床的素因のような薬物の作用を改変することが既知の種々の素因を考慮して主治医によって決定される。投与される用量の数は、上記の素因に応じて変化し得る。本発明の肝臓特異的送達法は、肝臓の前処置を有するかまたは有さずに使用され得る。前処理としては、HGFおよび／またはトランスフォーミング増殖因子α での処置によって誘導され得る良性肥厚を含む。Lui，Hepatology 19(1994)1521 を参照のこと。肝細胞増殖を誘導するのに有用なHGFの異なる形態が当該分野で公知であり、そして使用され得る。例えば、欧州特許公開EP 0 461 560を参照のこと。HGFはまた、Joplin，J.Clin.Invest．90(1992)1284に記載のようにインビボで肝細胞増殖を誘導するために産生および投与され得る。肝細胞はまた、内因性HGFの活性化を媒介または増強する薬剤の投与によって刺激され得る。HGFは、増殖因子としては不活性である一本鎖タンパク質として産生される。次いで、一本鎖HGFは、生物学的に活性な二本鎖形態に切断される。一本鎖HGFをその生理活性形態へ変換することが示される酵素は、肝細胞増殖を誘導することに有用である。それゆえ、これらの酵素は、単独または肝臓の増殖を増強する外因性HGFとの組合せのいずれかで投与され得る。例示的な酵素としては、凝血因子XIIa、HG Fアクチベーター、HGF変換酵素、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターが挙げられる。例えば、HGFおよびウロキナーゼは、同時処方され得、そしてIV注入によって投与されるかまたは注入の前に直ちに混合される。同時処方される場合、低いpHでの貯蔵は、ウロキナーゼの活性を有利に最小化する。高力価組換えレトロウイルスの産生および投与という表題を付けられた、PCT 特許公開WO 96/21014を参照のこと。本発明の別の実施態様において、AAVベクターは、高コレステロール血症を罹患する霊長類患者へコレステロール低下薬物とともに同時投与される。好ましいコレステロール低下薬物は、M-CSFである。米国特許第5,021,239号および同第5, 019,381号を参照のこと。他の好ましいコレステロール低下薬物としては、ナイアシン、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、およびメバコール(mevacor)が挙げられる。図面の説明図１：種々のネズミ組織において、実施例１に記載されるようにマウスに投与されたvＣＭＶp-lacＺベクターのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントのサザンブロット分析の説明図。図２：種々のネズミ組織において、実施例２に記載されるようにマウスに投与されたvＨＳ2-βp-^Aγ-グロビンベクターのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントのサザンブロット分析の説明図。図３：実施例２で詳述されるように、半定量的ＰＣＲ増幅の結果のオートラジオグラムの説明図。図４：実施例５で詳述されるように、pＳub201組換えＡＡＶベクターおよびp Ｄ-10組換えＡＡＶベクターの模式図。プラスミドpＳub201におけるＤ-配列が陰をつけた箱として示される。プラスミドpＤ-10において、Ｄ-配列内の遠位の10 個のヌクレオチドが代用(S)配列で置き換えられた。発明の詳細な説明ネズミ科哺乳動物被験体において、直接的な静脈内注射後、ＡＡＶベクターの運命が追跡され、そして驚くべきことにＡＡＶベクターが肝臓に対する器官向性 (organ-tropism)を有することが見出された。本発明のＡＡＶベクターは、lacＺレポーター遺伝子またはヒトグロビン遺伝子を含んだ。lacＺレポーター遺伝子を含むＡＡＶベクターを投与されたマウスにおいて、肝細胞中に発現が起こったが、βGalに対する細胞毒性Ｔリンパ球応答は、検出されなかった。組換えＡＡＶベクターは、マウスに直接に静脈内注射された場合、肝細胞中に大部分が貯留した。ＡＡＶ逆末端反復(inverted terminal repeat(ＩＴＲ))の間でクローン化されたＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ_p）駆動型lacＺ遺伝子(vＣＭＶp-lacＺ)を含むＡＡＶ組換えウイルス株、ならびにＡＡＶＩＴＲの間でクローン化された、ヒト β-グロビンプロモーター(βp)および上流の高感受性部位２エンハンサーエレメント(upstream Hypersensitive site 2 enhancer element)により駆動される正常のヒト^Aγ-グロビン遺伝子のゲノムコピーを含むＡＡＶ組換えウイルス株は、 Samulski，Helper-free Stocks of Recombinant Adeno-associated Viruses:Nor mal Integration Does Not Require Viral Gene Expression，J．Virol．63（19 89）3822-3828;Nahreini，Versatile Adeno-associated Virus 2-based Vectors for Constructing Recombinant Virions，Gene 124（1993）257-262;Zhou，Ad eno-associated Virus 2-mediated High Efficiency Gene Transfer into Immat ure and Mature Subsets of Hematopoietic Progenitor Cells in Human Umbili cal Cord Blood，J．Exp．Med．179（1994）1867-1875;Ponnazhagan，Lack of S ite-specific Integration of the Recombinant Adeno-associated Virus Genom es in Human Cells，5th Parvovirus Workshop，Crystal River，FL，USA p.P1- 29(1993);Ponnazhagan，Adeno-associated Virus 2-mediated Transduction of Murine Hematopoietic Cells and Long-term Expression of a Human Globin Ge ne in Vivo，6th Parvovirus Workshop，Montpellier，France，p29(1995);およびPonnazhagan，Differential Expression in Human Cells from the P6 Promot er of Human Parvovirus B19 Following Plasmid Trans fection and Recombina nt Adeno-associated Virus 2（AAV2）Infection:Human Megakaryocytic Leukae mia Cells Are Non-Permissive for AAV Infection，J．Gen．Virol．77（1996 ）1111-1122に記載される方法によってそれぞれの組換えプラスミドから生成された。ウイルス株は、Wang，Parvovirus B19 Promoter at Map Unit 6 Confers Replication Competence and Erythroid Specificity to Adeno-associated Vir us 2 in Primary Human Hematopoietic Progenitor Cells，Proc．Natl．Acad． Sci．92（1995）12416-12420に記載されるプロトコルに従って、ＣsＣl密度勾配上で精製された。力価は、Srivastava，Parvovirus B19-induced．Perturbation of Human Megakaryocytopoiesis In Vitro，Blood 76（1990）1997-2004;Sriva stava，Construction of a Recombinant Human Parvovirus B19:Adeno-associat ed Virus 2（AAV）DNA Inverted Terminal Repeats Are Functional in an AAV- B19 Hybrid Virus，Proc．Natl．Acad．Sci．86（1989）8078-8082;NahreiniおよびSrivastava，Rescue of the Adeno-associated Virus 2 Genome Correlates with Alterations in DNA-modifying Enzymes in Human Cells，Intervirol．3 3（1992）109-115;Zhou，Adeno-associated Virus 2-mediated Gene Transfer i n Murine HematopoieticbProgenitor Cells，Exp．Hematol．21（1993）928-933 ;Zhou，Adeno-associated Virus 2-mediated High Efficiency Gene Transfer i nto Immature and Mature Subsets of Hematopoietic Progenitor Cells in Hum an Umbilical Cord Blood，J．Exp．Med．179（1994）1867-1875および Zhou，Adeno-associated Virus 2-mediated Transduction and Erythroid Cell Specific Expression of aHumanβ-globin Gene，Gene Therapy 3（1996）223-2 29に記載されるように定量的なＤＮＡスロットブロット上で決定された。これらの高度に精製された組換えＡＡＶベクターは、尾部静脈への直接的な静脈注射によってＣ57Ｂ1/6マウスに投与された。実施例１サイトメガロウイルス(ＣＭＶ）プロモーター駆動型lacＺ遺伝子(vＣＭＶ_p-la cＺ)を含む高度に精製された組換えＡＡＶベクターをＣ57Ｂ1/6マウスに直接に注射した。vＣＭＶp-lacＺの約1×10¹⁰個のウイルス粒子を各３匹ずつ４つの群の12匹の動物の尾部静脈に静脈内注射した。これらの動物を注射後(post-inject ion(p.i.))の様々な時刻で屠殺し、そしてlacＺ特異的プライマー対を使用するポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅、それに続くサザンブロット分析によって、組換えＡＡＶウイルスのゲノムの存在について、種々の器官からの等量の組織を検査した。 vＣＭＶp-lacＺ r-ウイルスの約1×10¹⁰個の粒子を0.2mlのイスコーヴ修正ダルベッコ培地に入れ、生後８週間のＣ57Ｂ1/6マウスの尾部静脈に注射した。１群当たり３匹の動物を注射後１時間目、２４時間目、７２時間目、および１週間目に屠殺した。個々の組織および器官を得、リン酸緩衝生理食塩水で広範にリンスし、そしてlacＺ特異的プライマー対(すなわち、5'-GATGAGCGTGGTGGTTATGおよび5'-TACAGCGCGTCGTGATTAG)を使用する35サイクルＰＣＲ増幅反応において、等量を使用した。プラスミドpＣＭＶp-lacＺ(Ponnazhaganら、1996)およびpUC19(S ambrook，FritschおよびManiatis，Molecular Clonlng:A Laboratory Manual，C SHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)を、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。ＰＣＲ生成物を１％のアガロースゲル上で電気泳動し、そしてlacＺ特異的³²P標識化ＤＮＡプローブを使用して、サザンブロット(Southern，Detection of specific sequences among DNA f ragments separated by gel electrophoresis，J．Mol．Biol．98（1975）503-5 17)で分析した。サザンブロット分析の結果を図１に示す。組換えＡＡＶゲノムは、各群の動物において注射後一週間目まで肝組織において大部分が検出された。矢印は、588 塩基対のlacＺ特異的ＤＮＡフラグメントを示す。実施例２実施例１の結果を、実施例１と同一の条件下で組換えvＨＳ2-βp-^Aγ-グロビンウイルス粒子を注射すること、およびβ-グロビンプロモーター-^Aγ-グロビン遺伝子特異的プライマー対を用いる以外は、同じ技術を使用して、注射後７週間目に種々の器官からの組織を検査することによって実証した。ヒトβ-グロビン遺伝子クラスター(vＨＳ2-βp-^Aγ-グロビン)からの遺伝子座制御領域(locus control region(LCR))からのＤＮase高感受性部位２(ＨＳ-2)エンハンサーエレメントを含むヒトβ-グロビンプロモーター駆動型ヒト^Aγ-グロビン遺伝子を含む高度に精製された組換えＡＡＶベクター(Tuan，An erythroid specific，development stage-independent enhancer far upstream of the hum an”β-like globin"genes，Proc．Natl．Acad．Sci．86（1989）2554-2559を参照のこと)をＣ57Ｂ1/6マウスに直接に注射した。実施例１に記述されたように、vＨＳ2-βp-^Aγ-グロビンr-ウイルスの約1×10¹⁰ 個の粒子を静脈内注射した。注射後７週間目に、種々の器官を得、そしてヒト β-グロビンプロモーター(5'-GATGGTATGGGGCCAAGAGA)および^Aγ-グロビン遺伝子 (5'-GGGTTTCTCCTCCAGCATCT)の特異的オリゴデオキシヌクレオチドプライマー対を用いてr-ウイルスゲノムの存在について分析した。偽の注射をした(mock-inje cted)マウスから得た肝組織をまたネガティブコントロールとして含んだ。サザンブロットの結果を図２に示す。矢印は、354塩基対のヒトγ-グロビン特異的ＤＮＡフラグメントを示す。次に、肝細胞中のvＨＳ2-βp-^Aγ-グロビンベクターのコピー数を調査した。ヒトβ-グロビンプロモーター-^Aγ-グロビン遺伝子特異的オリゴデオキシヌクレオチドプライマーまたはマウスβ-アクチン特異的オリゴデオキシヌクレオチドプライマーのいずれかを使用する半定量的ＰＣＲ増幅アッセイにおいて、偽の注射をしたマウスの肝臓およびvＨＳ2-βp-^Aγ-グロビンウイルスを注射したマウスの肝臓から単離した等量のＤＮＡを使用した。各動物からのほぼ等量の肝組織を、1ml当たり10mM Tris.HCl/50mM KCl/2.5mM MgCl₂/0.5％ Tween-20/100μgプロテイナーゼＫを含む55℃の緩衝液の中で一晩、溶解した。プロテイナーゼＫを不活性化するために溶解物を90℃で10分間熱し、そして５μｌの各サンプルに対し同一の条件下で二組のプライマー対を用いた30サイクルＰＣＲ増幅を行った。形質導入したヒトグロビン遺伝子配列を増幅するためのプライマーは、実施例１に記載するプライマーと同じであって、そしてマウスβ-アクチン遺伝子のプライマー配列は以下の通りである：5'-ACCTTCAACACCCCAGCCATおよび5'-TCAGGCAGCT CATAGCTCTT。各配列から354塩基対のＤＮＡフラグメントを産出するようにプライマーを設計した。各反応混合物において２μCi[α-³²P]dCTP(比活性800Ci/mmo l)の存在下でＰＣＲ反応を行った。ヒトグロビン遺伝子からの10パーセントのDN A生成物およびβ-アクチン遺伝子増幅反応からの15倍に希釈されたサンプルを６％のポリアクリルアミドゲル上で分析し、そしてオートラジオグラフを行った。対応するバンドの相対的強度をPhotoshop3.0プログラムを使用して、オートラジオグラフをスキャンすることによって決定した。注射後７週間目の肝細胞の約４％で、形質導入されたグロビン遺伝子が検出された。図３を参照のこと。実施例３次にr-ＡＡＶの直接注射によって送達されたlacＺ遺伝子が転写的に活性かどうかを検査した。偽の注射したＣ57Ｂ1/6マウスおよびvＣＭＶp-lacＺを注射したＣ57Ｂ1/6マウスからの肝臓を注射後一週間目に得、そして凍結保存した。Che ng，Separable Regulatory Elements Governing Myogenin Transcription in Mo use Embryogenesis，Science 261（1993）215-218に記載されるように組織切片を固定し、そして5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X Gal)で染色し、そして光学顕微鏡下で可視化した。注射後一週間目に肝臓を得、そして-40℃のイソ-ペンタン中で直ちに凍結した。クリオスタットを使用して15μmの切片を調製し、そしてCheng，Separable re gulatory elements governing myogenin transcription in mouse embryogenesi s，Science 261（1993）215-218に以前に記載されたように、リン酸緩衝生理食塩水(PBS，135mM NaCl/2.5mM KCl/8mM Na₂HPO₄/0.6mM KH₂PO₄/0.55mMブドウ糖/リットル)中に２％ホルムアルデヒド/0.2％パラ-ホルムアルデヒドを含む溶液中で５分間、氷上にて固定し、PBSで二度洗い、そして1mlのPBS中に5mM K₃Fe(CN)₆/5 mM K₄Fe(CN)₆/1mM MgCl₂/1mg ＸGalを含む溶液中で37℃で一晩、染色した。組織切片を光学顕微鏡(拡大率40倍)下で可視化した。偽の注射をした動物からの肝細胞では、導入遺伝子の発現は全くなかった。肝細胞において、lacＺ遺伝子の発現は容易に検出された。実施例４ＡＡＶＩＴＲおよび治療学的な分子をコードする核酸配列を含むrＡＡＶベクターならびに必要なrep機能およびcap機能を含むヘルパープラスミドをアデノウイルス２(Ａd2)感染293細胞に同時トランスフェクションすることは、組換えベクターストックの作成の間に混入(contaminating)野生型(Wt)ＡＡＶの産生に導く相同組換え事象を除去すると予期された。しかしながら、混入「野生型様ＡＡＶ」粒子がそのようなストック中で0.1％〜10％の範囲で観察された。混入wt ＡＡＶの生成の機構を決定するために、293細胞においてＡd2で四連続回の同時感染により、株を増幅した。低分子量のＤＮＡフラグメントを単離し、 BalＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてpBlueScriptプラスミドベクター中へ分子的にクローン化した。ＡＡＶ配列陽性クローンに対し、Ｔ３プライマーおよびＴ７プライマーを使用して、ヌクレオチド配列決定を行った。12個の独立したクローンのヌクレオチド配列分析は、混入wt ＡＡＶに導く組換え事象のほとんどがウイルスのヘアピン構造に対して遠位のＡＡＶＤ-配列内の10個のヌクレオチドを巻き込んでいることを明らかにした。さらに、Ａd2 ＩＴＲを欠失したヘルパープラスミドで生成した22個の異なるクローンを分析することによって、限定された数だけの組換え部位を観察し、そして生物学的に活性のある野生型様のＡＡＶの生成に導く、ＡＡＶ-ＩＴＲを使用した非正統的な組換えの役割をＡd2 ＩＴＲが果たしていると結論した。従って、ヘルパープラスミドからＡd2 ＩＴＲを取り除くことによって、非正統的な組換えの頻度が５倍近く減少することが達成され得る。ＡＡＶヘアピン構造に対して近位のＤ-配列内の最初の10個のヌクレオチドは、ウイルスゲノムの複製およびキャピシド形成が成功するために必要である。W ang，J．Virol．71:3077-82(1997)を参照のこと。配列決定された組換えの接合部の各々において、同じ10個のヌクレオチドが保持された。ＡＡＶベクターの次の生成においてＤ-配列内の遠位の10個のヌクレオチドを欠失させることによって、組換えＡＡＶベクターストック中のwt ＡＡＶ様粒子の生成は減少または除去され得る。このようなベクターの製造については、以下の実施例５を参照のこと。実施例５四つの組換えＡＡＶベクター（すなわちpＤ-5、pＤ-10、pＤ-15、およびpＤ-2 0）を以下のように構築した。出発物質としてプラスミドpＸＳ-22を用い得る。プラスミドpＸＳ-22は、公共の寄託機関から得られ得るか、または出発物質としてpＳub201を使用してWang，J．Mol．Biol．250（1995）573-580に記載される方法に従って構築され得る。プラスミドpＸＳ-22は、右ＩＴＲ(逆末端反復)だけを含む：一つのヘアピンおよび一つのＤ-配列。Ｄ-配列は、ＨＰ形成に関与しないＡＡＶＩＴＲのその部分である。上記のWangを参照のこと。Wang，J．Virol．7 0（1996）1668-1677に記載されるようにＤ-配列は、代用(Ｓ)配列によって置き換え得る。ヌクレオチド配列は、以下の通りである：Ｄ-配列：Ｓ配列：Ｓ配列内のヌクレオチドの代わりに真正のまたは天然のＤ-配列と同一な選択されたヌクレオチドを含んだ四つのさらなるオリゴヌクレオチド配列を合成した。これら四つのオリゴヌクレオチドは以下のようである：Ｄ-5オリゴヌクレオチドＤ-10オリゴヌクレオチドＤ-15オリゴヌクレオチドＤ-20オリゴヌクレオチドＡＡＶＩＴＲ中の真正であり、天然であるＤ-配列に準拠する、選択されたヌクレオチドを太字体で上記に示す。Ｄ-5、Ｄ-10、Ｄ-15、およびＤ-20オリゴヌクレオチド配列をそれぞれプラスミドpＸＳ-22のXba Ｉ部位とBal Ｉ部位の間に挿入した（これは、Wang，J．Mol ．Biol．250（1995）573-580およびJ．Virol．70（1996）1668-1677において記載される）。その結果の四つのプラスミドをそれぞれpＸＳ-64Ｄ-5、pＸＳ-64Ｄ -10、pＸＳ-64Ｄ-15、およびpＸＳ-64Ｄ-20と名付けた。次いで、pＸＳ-64Ｄ-5 、pＸＳ-64Ｄ-10、pＸＳ-64Ｄ-15、およびpＸＳ-64Ｄ-20からの平滑末端化されたClaI-PvuIIフラグメントを切除し、これらのプラスミドのClaI部位とXbaI部位の間で連結して、両方のＩＴＲにおけるＳ配列の代わりにＤ-5、Ｄ-10、Ｄ-15、およびＤ-20オリゴヌクレオチド配列をそれぞれに含むプラスミドpＤ-5、pＤ-10 、pＤ-15、およびpＤ-20を生成した。四つの前出の組換えＡＡＶベクター（すなわち、pＤ-5、pＤ-10、pＤ-15、およびpＤ-20）のそれぞれが本発明の方法において用いられ得る。天然のＤヌクレオチドのうち10個のパッケージングを最適化することが十分であると決定した。最も好ましい天然の10個のＤヌクレオチドは、pＤ-10ベクターの中に含まれ、かつ上記のＤ-10オリゴヌクレオチド配列において太字体で示したヌクレオチドである。pＤ-15ベクターおよびpＤ-20ベクター、またはそれらそれぞれの示されたオリゴヌクレオチド（上記参照のこと）は使用され得るが、しかしそれらは、望ましい治療分子をコードするヌクレオチドのためにＡＡＶベクターにおいてより大きいスペースを許容するために有利に除去される、余分であり、および不必要であるヌクレオチドを含む。pＤ-5ベクターは、目的通りに機能するが、効率が低い。従って、絶対最小限に必要な配列は、上記のＤ-5オリゴヌクレオチド配列において太字体で列挙され、かつpＤ-5ベクターに含まれる５ヌクレオチド配列である。pＤ-10ベクターは、さらなる106個のヌクレオチドの挿入を許容する。治療学的な分子をコードする核酸配列は、公知の技術を使用して、これらのベクターのＩＴＲの間に連結され得る。ベクターまたはウイルス粒子は、ヒト患者または他の哺乳動物被験体において投与するための薬学的組成物の中へ処方され得る。プラスミドpＸＳ-22を、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure)の規約に従い、ＡＴＣＣ（12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，USA）に、1996年9月10日に、寄託した。受託番号は、97710である。この寄託は、寄託の日付から３０年間、ウイルス培養液を維持することを保証する。寄託した微生物は、ブダペスト条約の規約に従い、ＡＴＣＣによって入手可能にされ、および関係する米国特許の発行に際して無制限に入手可能であることを保証する、出願者とＡＴＣＣとの間の合意に従属する。この寄託物は、当業者に対して利便なように提供されるものであって、米国特許法112条に従い寄託が要求されるという許可ではない。この寄託物の核酸配列、およびこれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書中において援用し、および本明細書中において記載する配列内にエラーが起きた場合に参照するべきである。寄託された物質を製造する、使用する、または販売するためには実施権が要求され得、そしてそのような実施権は、本明細書によっては全く下付されない。本明細書において言及した、すべての特許、特許公開、特許出願、および科学論文は、本明細書中において参考として援用する。本発明は、今や完全に記述され、多くの変更および変形が付属の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが当業者に明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者スリバスタバ，アロンアメリカ合衆国インディアナ 46202― 5120，インディアナポリス，インディアナユニバーシティスクールオブメディシン（番地なし) (72)発明者ポンナザーガン，セルバランガンアメリカ合衆国インディアナ 46202― 5120，インディアナポリス，インディアナユニバーシティスクールオブメディシン（番地なし) (72)発明者クロエマー，ロバートエイチ. アメリカ合衆国インディアナ 46202― 5120，インディアナポリス，インディアナユニバーシティスクールオブメディシン（番地なし) (72)発明者ワン，ズ―シャンアメリカ合衆国インディアナ 46202― 5120，インディアナポリス，インディアナユニバーシティスクールオブメディシン（番地なし) (72)発明者ヨダー，マービンシー. アメリカ合衆国インディアナ 46202― 5120，インディアナポリス，インディアナユニバーシティスクールオブメディシン（番地なし) (72)発明者ジョウ，シャン―ジェンアメリカ合衆国カリフォルニア，アラメダ（番地なし) (72)発明者エスコベド，ジェイムアメリカ合衆国カリフォルニア 94507, アラモ（番地なし) (72)発明者ドワーキ，バラバーニアメリカ合衆国カリフォルニア，アラメダ（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物の患者において治療分子の肝臓特異的送達を実現するための方法であって、該治療分子を含む治療学的に有効量のＡＡＶベクターを該哺乳動物の患者に投与する工程を包含する、方法。２．前記治療分子が、分泌タンパク質、アンチセンス分子、またはリボザイムをコードする核酸配列である、請求項１に記載の方法。３．前記ＡＡＶベクターが、pＤ-5、pＤ-10、pＤ-15、およびpＤ-20からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。４．前記ＡＡＶベクターが、静脈内注射または門脈内注射によって投与される、請求項１に記載の方法。５．前記ＡＡＶベクターがエキソビボで投与される、請求項１に記載の方法。６．前記ＡＡＶベクターが直接的な注射によって投与される、請求項１に記載の方法。７．前記治療分子が、LDLレセプターをコードする核酸配列である、請求項１に記載の方法。８．前記ＡＡＶベクターがさらに肝臓特異的プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。９．前記ＡＡＶベクターがさらに肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項８に記載の方法。１０．前記プロモーターが、Ｂ型肝炎ウイルスＸ遺伝子プロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質プロモーター、ＡＦＰ遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、α-1抗トリプシン遺伝子プロモーター、フィブリノーゲン遺伝子プロモーター、ＡＰＯ-Ａｌ遺伝子プロモーター、および肝臓転移酵素( liver transference enzymes)のためのプロモーター遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。１１．前記ＡＡＶベクターがさらに肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１０に記載の方法。１２．Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコードするＤＮＡ配列、またはその機能的フラグメントを包含する、ハイブリッドヘルパーＡＡＶベクターであって、該フラグメントは、キメラＤＮＡ配列を形成するためのＡＡＶＶＰ-1タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結する、ベクター。１３．二つのＡＡＶＩＴＲ（逆末端反復物）を含有する組換えＡＡＶベクターであって、該ＡＡＶＩＴＲにおいて、該ＩＴＲの各々の天然のＤ-配列は、少なくとも５個の天然のヌクレオチドから18個までの天然のヌクレオチドが維持され、そしてＤ-配列の残りのヌクレオチドが欠失または非天然のヌクレオチドで置換されるようなヌクレオチドの置換によって、改変される、組換えＡＡＶベクター。１４．前記少なくとも５個の天然のヌクレオチドが5'CTCCA3'である、請求項１３に記載の組換えＡＡＶべクター。１５．二つのＡＡＶＩＴＲ（逆末端反復物）を含有する組換えＡＡＶベクターであって、該ＡＡＶＩＴＲにおいて、該ＩＴＲの各々の天然のＤ-配列は、少なくとも10個の天然のヌクレオチドから18個までの天然のヌクレオチドが維持され、そしてＤ-配列の残りのヌクレオチドが欠失または非天然のヌクレオチドで置換されるようなヌクレオチドの置換によって、改変される、組換えＡＡＶベクター。１６．二つのＡＡＶＩＴＲ（逆末端反復物）を含有する組換えＡＡＶベクターであって、該ＡＡＶＩＴＲにおいて、該ＩＴＲの各々の天然のＤ-配列は、10 個の天然のヌクレオチドが維持され、そしてＤ-配列の残りのヌクレオチドが欠失または非天然のヌクレオチドで置換されるようなヌクレオチドの置換によって、改変される、組換えＡＡＶベクター。１７．前記10個の天然のヌクレオチドが、ヌクレオチド5'CTCCA3'および前記Ｄ-配列の５個の他の天然のヌクレオチドを包含する、請求項１６に記載の組換えＡＡＶベクター。１８．pＤ-5、pＤ-10、pＤ-15、およびpＤ-20からなる群から選択される、組換えＡＡＶベクター。