【発明の詳細な説明】
標的化されたヌクレオチド配列送達および組み込みシステム 技術分野
本発明は、一般に、ヌクレオチド配列送達のための方法および組成物に関する
。より詳細には、本発明は、遺伝子送達における使用のためのベクターシステム
であって、レシピエントゲノムへの選択されたヌクレオチド配列の標的化および
組み込みを提供するベクターシステムに関する。発明の背景
遺伝子送達は、後天性疾患および先天性疾患の処置のための有望な方法である
。遺伝子移入の目的のためのウイルスに基づいた多数のシステムが記載されてい
る。例えば、レトロウイルスシステムは、この目的のために現在最も広範に用い
られているウイルスベクターシステムである。種々のレトロウイルスシステムの
記載については、例えば、米国特許第5,219,740号；MillerおよびRosman(1989)B
ioTechniques 7:980-990; Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14; Sca
rpaら、(1991)Virology 180:849-852; Burnsら、(1993)Proc．Natl．Acad．Sci
．USA 90:8033-8037;およびBoris-LawrieおよびTemin(1993)Cur．Opin．Genet．
Develop．3:102-109を参照のこと。
レトロウイルスに基づいたシステムは、適切な宿主細胞に侵入し、そしてそれ
ら自身をその宿主ゲノム中へ組み込み、それによって目的の遺伝子を宿主ゲノム
中へ挿入し得るという望ましい特徴を提供する。しかし、レトロウイルスベクタ
ーシステムは、いくつかの欠点を有する。特に、レトロウイルス粒子は、比較的
変化しやすく、したがって不安定である。従って、組換えウイルスの精製は、力
価の顕著な損失を導き得る。レトロウイルスはまた、制限された宿主域を有し、
そして複製していない細胞中には組み込み得ない。従って、通常は分裂しない細
胞（例えば、成熟ニューロン）、またはゆっくり複製する細胞は、感染前に分裂
するように刺激されない限り、レトロウイルスベクターを用いて遺伝的に変化さ
れ得ない。さらに、そして重要なことに、レトロウイルスは特定の動物（ヒトを
含む）において疾患を生じることが知られており、従って、遺伝子送達法におい
て用いられる場合、著しい健康の危険性を有する。最後に、レトロウイルスベク
ターは、宿主細胞染色体中にランダムに組み込み、これは、オンコジーンを活性
化するかまたは腫瘍抑制遺伝子を不活性化することにより挿入変異誘発を生じ得
る。
アデノウイルスに基づいた多くのシステムはまた、遺伝子送達のために開発さ
れた。ヒトアデノウイルスは、レセプター媒介エンドサイトーシスによって細胞
に侵入する２本鎖DNAウイルスである。これらのウイルスは、遺伝子移入に特に
よく適している。なぜなら、これらは増殖させそして操作することが容易であり
、そしてこれらは広範囲の宿主域をインビボおよびインビトロで示すからである
。アデノウイルスはまた、静止状態のおよび複製している標的細胞を感染し得る
。アデノウイルスは、高力価で容易に産生され、そして安定であり、従ってこれ
は精製されそして貯蔵され得る。複製可能な形態においてさえ、アデノウイルス
は、低レベルの罹患率を生じるのみであり、そしてヒト悪性疾患に関連していな
い。アデノウイルスに基づいた遺伝子送達システムの多くが、記載されている。
例えば、HajAhmadおよびGraham(1986)J．Virol．57:267-274; Bettら、(1993)J
．Virol．67:5911-5921; Mitterederら、(1994)Human Gene Therapy 5:717-729;
Sethら、(1994)J．Virol．68:933-940; Barrら、(1994)Gene Therapy 1:51-58;
Berkner，K．L．(1988)BioTechniques 6: 616-629; Richら、(1993)Human Gene
Therapy 4:461-476を参照のこと。
しかし、その利点にもかかわらず、アデノウイルスに基づいたシステムは、い
くつかの欠点を有する。特に、アデノウイルスベクターはその遺伝物質を宿主ゲ
ノムへ組み込まず、従って、宿主細胞においてタンパク質を一時的に発現し得る
のみである。従って、宿主細胞が分裂すると、移入された遺伝子は失われ、長期
の遺伝子治療が所望される場合には、反復的な処置の必要性が生じる。さらに、
アデノウイルスベクターは、免疫応答を宿主において惹起し得るウイルスタンパ
ク質を発現し、それにより、形質導入された細胞の寿命を減少させる。この免疫
原性はまた、宿主生物による体液性および/または細胞性の免疫応答のために引
き続く処置を妨げる。
アデノ随伴ウイルス（AAV）システムはまた、遺伝子送達のために用いられて
いる。AAVは、Dependovirus属に属するヘルパー依存性DNAパルボウイルスである
。AAVは、生産的な感染を生じるためには、関連していないヘルパーウイルス（
アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアのいずれか）との同時感
染を必要とする。このような同時感染の非存在下では、AAVは、宿主細胞染色体
へのそのゲノムの挿入による潜伏状態を確立する。AAVは、広範な宿主域を有し
、そして適切なヘルパーウイルスでのこのような細胞の好結果な同時感染もまた
存在する限り、任意の種由来の細胞において複製可能である。従って、例えば、
ヒトAAVは、イヌアデノウイルスで同時感染したイヌ細胞において複製する。AAV
は、いかなるヒトまたは動物の疾患とも関連しておらず、そして組み込みの際に
宿主細胞の生物学的性質を変化させるようではない。さらに、宿主ゲノムへのAA
Vの組み込みは高頻度で生じ、そして細胞複製から独立している。AAV粒子はまた
、比較的安定であり、そして超音波処理および加熱のような一般的な物理的精製
技術に対して耐性（refractive）であることが知られている。AAVの詳細な総説
については、BernsおよびBohenzky(1987)Advances in Virus Research(Academic
Press，Inc.)32:243-307を参照のこと。
AAVゲノムは、4681塩基を含有する直線状の１本鎖DNA分子から構成されている
(BernsおよびBohenzky、前出)。ゲノムは、逆方向末端反復配列（ITR）を両末端
に含む。ITRは、DNA複製起点として、およびウイルスのためのパッケージングシ
グナルとして、シスに機能する。ITRは、長さが約145bpである。ゲノムの内部非
反復部分は、それぞれAAV repおよびcap領域として知られる２つの大きなオープ
ンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケ
ージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４つの
ウイルスタンパク質のファミリーは、AAV rep領域から合成され、それらの見か
けの分子量に従いRep 78、Rep 68、Rep 52、およびRep 40と命名されている。AA
V cap領域は、少なくとも３つのタンパク質、VP1、VP2、およびVP3をコードする
。AAVゲノムの詳細な記載については、Muzyczka，N.(1992)Current Topics in M
icrobiol．and Immunol．158:97-129を参照のこと。
AAVは、部位特異的に宿主細胞のゲノムに組み込み得る点で、真核生物ウイル
スのなかでも独特である。特に、AAV組み込み遺伝子座（「AAVS1」と命名される
）は、ヒト染色体19q13.3-qterであることが現在知られている。Samulskiら、(1
991)EMBO J．10:3941-3950; Kotinら、(1992)EMBO J．11:5071-5078。第19染色
体のAAVS1領域は、単離されていて、部分的に特徴付けされ、そして配列決定さ
れている。Kotinら、(1992)、前出；Kotinら、(1991)Genomics 10:831-834;およ
びKotinら、(1990)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2211-2215を参照のこと。さ
らに、AAV Rep認識配列は、ヒト第19染色体上のAAVS1中のウイルス組み込み近傍
部位に同定されていて、そしてこれらの配列は、Repにより認識されるとも考え
られるAAV ITR内の配列に類似の反復したヌクレオチドモチーフを有することが
示されている。Weitzmanら、(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5808-5812
。
宿主細胞ゲノムへ組み込む能力、非病原性、および粒子安定性のようなAAVの
特徴は、遺伝子送達における使用のためのAAVに基づいたベクターシステムを提
供するという興味を当該分野において誘発した。多くの組換えAAVベクターが記
載されている。一般に、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号；国際公
開第WO92/01070（1992年１月23日公開）および同第WO93/03769（1993年３月４日
公開）；Lebkowskiら、(1988)Molec．Cell．Biol．8:3988-3996; Vincentら、(1
990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter，B．J．(199
2)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; およびKotin，R．M．(1994)H
uman Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。
組換えAAV（rAAV）ビリオンは、AAVヘルパープラスミドおよびAAVベクターの
両方でトランスフェクトされた適切な宿主細胞において産生される。例えば、Sh
enkらの米国特許第5,436,146号；ならびに国際公開第WO95/13392号（1995年５月
18日公開）および同第WO95/13365号（1995年５月18日公開）を参照のこと。AAV
ヘルパープラスミドは、一般にAAV repおよびcapコード領域を含むが、AAV ITR
を欠失する。従って、ヘルパープラスミドは、それ自体では複製もパッケージン
グもし得ない。AAVベクターは、一般に、ウイルス複製およびパッケージング機
能を提供するAAV ITRが5'および3'の両方に結合した、選択された目的の遺伝子
を含む。3'および5'のITRは、結合した目的の遺伝子を組換えAAV粒子にパッケー
ジングするために必要である。ヘルパープラスミドおよび選択された遺伝子を有
するAAVベクターの両方は、一過性のトランスフェクションにより適切な宿主細
胞へ導入される。次いで、トランスフェクトされた細胞を、アデノウイルスのよ
うなヘルパーウイルスで感染する。これは、AAV repおよびcap領域の転写および
翻訳を指向するヘルパープラスミド上に存在するAAVプロモーターをトランスに
活性化する。選択された遺伝子を有する組換えAAVビリオンを形成し、そして調
製物から精製し得る。
AAVに基づいたベクターの宿主ゲノムへの首尾良い組み込みは機能的ITR配列の
存在に依存し、従って、AAVゲノムの残りの部分は重要でないと考えられ、そし
て遺伝子送達における使用のために外来DNAで置換し得る。しかし、repコード配
列なしでは、AAVベクターは、部位特異的な様式では宿主細胞ゲノムに組み込ま
ない。従って、隣接するITRの間に位置するAAV repコード領域を有するAAVベク
ターのみが、第19染色体に首尾良く組み込むことが可能であった。Shellingら、
(1994)Gene Therapy 1:165-169。このようなベクターは、限られた価値しかない
が、repコード配列を隣接するITRの間に含むAAVベクターはrep遺伝子を宿主細胞
ゲノムへ挿入するので、ウイルス遺伝子の発現を生じる。さらに、このようなベ
クターは、野生型ウイルス生成のための可能性を増加させ、そしてrepコード配
列とともにパッケージされ得る遺伝物質の大きさがすこぶる制限される。
従って、組換えAAVビリオンが多くの望ましい特性を有するとしても、AAVに基
づいた遺伝子送達システムはいくつかの重大な欠点を有する。組換えAAVビリオ
ンは、宿主細胞のゲノムに組み込むが、部位特異的な様式でではない。産生方法
は、多数のトランスフェクションに依存するので本質的に大きな労働力を要し、
そして非効率的である。そして、混入している野生型AAVを含まない組換えウイ
ルスのストックを産生することが困難である。この点に関して、AAVに基づいた
ベクターシステムにおける野生型AAV粒子の存在は、潜在的に、組換えAAVビリオ
ンの故意ではない蔓延をもたらし得、そして外来遺伝子の効率的な発現と干渉し
得る。AAVに基づいたベクターシステムはまた、約５キロベース（kb）よりも大
きいDNAフラグメントを成熟AAV粒子にパッケージングできないことにより課され
る大きさの制約により、本質的に制限される。従って、約５kbよりも大きい目的
の遺伝子配列は、組換えAAVベクターシステムを用いて送達され得ない。
従って、AAVの部位特異的組み込み特性を提供し得、送達され得るヌクレオチ
ド配列の大きさに関して制限されず、そしてレシピエント細胞ゲノムへのウイル
ス遺伝子配列の組み込みを生じないヌクレオチド配列組み込みシステムを提供す
ることが望ましい。混入している野生型ビリオンの付随的な産生なしに産生され
得るヌクレオチド配列組み込みシステムを提供することもまた望ましい。このよ
うなシステムは、大きなヌクレオチド配列を適切なレシピエント細胞ゲノム中に
、ランダムな組み込み事象に起因する挿入変異誘発を引き起こす危険性なしに、
安全かつ効率的に送達し、そして組み込むために使用され得る。宿主ゲノムへの
ヌクレオチド配列の安定な組み込みは、長期の遺伝子治療を提供し得る。従って
、このような改善されたヌクレオチド配列送達および組み込みシステムを提供す
る必要性が残存する。発明の要旨
本発明は、ヌクレオチド配列の送達および組み込みにおける使用のための新規
なシステムを提供する。特に、選択されたヌクレオチド配列のレシピエントゲノ
ムへの部位特異的標的化および効率的組み込みを提供するベクター送達システム
が記載される。組み込みは、規定された、そして寛容な（benign）ゲノム部位に
標的化され得、それにより、ランダムに組み込むウイルスで生じ得る挿入変異誘
発の危険性を軽減し、一方遺伝子発現の予想可能性を付随的に増大させ得る。組
み込まれるべき選択されたヌクレオチド配列は、以前のシステムにおけるように
は大きさによって制限されない。なぜなら、本発明のシステムはAAVビリオン中
にパッケージングされないからである。
一般に、本発明のヌクレオチド配列送達システムは、２つの成分を含む。第１
に、目的の少なくとも１つのヌクレオチド配列を、AAV Repを結合し得る会合さ
れた標的化配列とともに有する核酸構築物が提供される。標的化配列は、目的の
ヌクレオチド配列をレシピエント細胞ゲノム中の特異的な標的部位への組み込み
を指向させ得るように、目的のヌクレオチド配列に対して構築物において整列さ
れる。
ヌクレオチド配列送達システムはまた、Rep発現産物の供給源を含む。Rep発現
産物は、目的の会合するヌクレオチド配列のレシピエント細胞ゲノムへの部位特
異的組み込みをもたらす第１の構築物中に存在する標的化配列と協同する。本発
明のシステムは、広い宿主域を有し、そして静止細胞および複製中のレシピエン
ト細胞へヌクレオチド配列を導入するために使用され得る。さらに、このシステ
ムは安全であり、そしてヒトに疾患もガンも引き起こさない。
従って、１つの実施態様において、選択されたヌクレオチド配列を適切なレシ
ピエント細胞ゲノムへ挿入し得るヌクレオチド配列組み込みシステムが提供され
る。この組み込みシステムは、AAV Repおよび少なくとも１つの会合する異種ヌ
クレオチド配列を結合し得る標的化配列を有する第１の核酸構築物を含むベクタ
ーを特徴とする。ヌクレオチド組み込みシステムはまた、レシピエント細胞中で
発現され得、それにより、組み込みシステムがレシピエント細胞へ導入されたと
きに、第１の構築物中に存在する異種ヌクレオチド配列のレシピエント細胞ゲノ
ムへの組み込みをもたらすrep翻訳産物を提供する、AAV repコード配列を含む第
２の核酸構築物を特徴とする。
本発明の関連する局面において、上記のヌクレオチド配列組み込みシステムは
、第１および第２の核酸構築物が単一のベクター中に存在するように組み立てら
れる。ベクターは、それには限定されないが、プラスミドまたはコスミドのよう
なDNAの環状断片の形態であり得る。さらなる関連する局面において、第１の核
酸構築物中の標的化配列は、単一の逆方向末端反復（ITR）配列に相同である。
１つの特定のシステムにおいて、標的配列は、野生型（wt）AAV ITR配列に実質
的に相同である。
別の実施態様において、本発明は、選択されたヌクレオチド配列のレシピエン
ト細胞ゲノムへの組み込み方法に関する。このような方法は、一般に以下の工程
を含む：(a) 第１の核酸構築物をレシピエント細胞へ導入する工程であって、こ
こで第１の構築物は、AAV Repを結合し得る標的化配列および標的化配列に対し
て構築物において適切に整列される選択された異種ヌクレオチド配列を含み、そ
れにより標的化配列が選択された配列のレシピエント細胞ゲノム中の標的部位へ
の組み込みを指向させ得る、工程；および(b) 第２の核酸構築物をレシピエント
細胞へ導入する工程であって、ここで、第２構築物は、レシピエント細胞中のre
pコード領域の転写および翻訳を指向させ得る制御エレメントに作動可能に連結
されたAAV repコード領域を含む、工程。
本発明の関連する局面において、上記の方法は、適切なレシピエント細胞の第
１および第２の核酸構築物での同時トランスフェクションを伴う。他の局面にお
いて、第１および第２の核酸構築物は、本発明に従って構築されたヌクレオチド
配列組み込みシステム中で提供される。第１および第２の構築物はさらに、プラ
スミドまたはコスミドのような単一のベクター中に存在し得る。本発明のなおさ
らに関連する局面において、標的化配列はwt AAV ITR配列に実質的に相同である
。１つの特定の方法において、選択されたヌクレオチド配列は、レシピエント細
胞ゲノムの第19染色体に組み込まれる。
各々の上記の方法において、レシピエント細胞ゲノムへ送達されるヌクレオチ
ド配列は、ポリペプチドをコードするコード領域を含み得る。ここで、コード領
域は、適切なレシピエント細胞中のその領域の転写および翻訳を指向させ得る制
御エレメントに作動可能に連結される。さらなる関連する方法において、コード
領域は、レシピエント細胞ゲノムから欠損または消失しているのいずれかである
タンパク質をコードする。他の方法において、コード領域は、レシピエント細胞
ゲノムによりコードされるタンパク質を過剰発現し得る。なおさらなる関連する
方法において、コード領域は抗ウイルス機能を有するタンパク質をコードする。
なおさらなる実施態様において、本発明は、被験体における後天性または先天
性疾患の処置方法に関する。この方法は、一般に、被験体由来の選択されたレシ
ピエント細胞を、本発明に従って構築されたヌクレオチド配列組み込みシステム
で形質転換する工程を含む。この様式で、ヌクレオチド配列組み込みシステムに
より提供されるrep翻訳産物は、選択されたヌクレオチド配列のレシピエント細
胞のゲノムへの部位特異的組み込みをもたらす。
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示に照らして、当業者
に容易に理解される。図面の簡単な説明
図１（配列番号１）は、野生型AAV血清型２ゲノム由来のITRのヌクレオチド配
列を示し、ここでＡ、Ｂ、およびＣパリンドローム領域、Ｄ領域、ならびにRep
結合部位が示されている。
図２は、単一のITRおよびneo遺伝子の部分を含む約0.6 kbフラグメントをコス
ミドpRR23のNotI部位に挿入することにより構築されたコスミドpRR27およびpRR2
8の組立を示す。プラスミドpRR27およびpRR28は、問題の0.6 kbフラグメントの
反対方向を含む。
図３は、293細胞のゲノムDNAへの、標的配列（AAV ITRに相同である）を有す
るプラスミドのrep媒介性部位特異的組み込みを検出するために実施した、PCR−
ドットブロットハイブリダイゼーション手順からの結果を示す。発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に指示しない限り、当該分野内でウイルス学、微生物学、
分子生物学および組換えDNA技術の従来の方法を使用する。このような技術は、
文献に充分に記載されている。例えば、Sambrookら，Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual(現在版)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I & II巻(D.
Glover編)；Oligonucleotide Synthesis(N．Gait編，現在版)；Nucleic Acid Hy
bridization(B．HamesおよびS．Higgins編，現在版)；Transcription and Trans
lation(B．HamesおよびS．Higgins編，現在版)；CRC Handbook of Parvoviruses
，第I & II巻，(P．Tijessen編)；Fundamental Virology，第２版，第I & II巻(
B.N．FieldsおよびD.M．Knipe編)を参照すること。
本明細書中および添付の請求の範囲で使用されるように、単数型「ａ」、「an
」および「the」には、その内容が他に明示しない限り、複数型が含まれる。Ａ．定義
本発明を説明するにおいて、以下の用語が使用され、そしてこの用語は以下に
示されるように定義されると意図される。
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、標的細胞に特定のヌクレオチド配列
(例えば、DNA)を確実に挿入するための方法またはシステムを意味する。このよ
うな方法により、好ましくは、標的細胞のゲノムへの移入された遺伝物質の組み
込みが生じる。遺伝子移入は、後天性疾患および先天性疾患の処置に独特なアプ
ローチを提供し、そして多くのシステムが、哺乳動物細胞への遺伝子移入の分野
で開発されてきた。米国特許第5,399,346号を参照のこと。
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」、「AAV ITR」、または「ITR」と
は、DNA複製起点およびウイルスのパッケージングシグナルとしてシス位置でと
もに機能するAAVゲノムの各末端に見出される、当該分野で認識された約145bpの
パリンドロームヌクレオチド領域を意味する。より詳細には、AAV ITRは、AAV D
NAの複製においてヘアピンＴ形状構造に折り畳まれる、「A」、「B」および「C
」で表される３つのパリンドローム配列から構成される。Lusbyら，(1980)J．Vi
rol．34：402-409；Strausら，(1976)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 73：742-746
。20ヌクレオチドを含み、そして「D」で表される単一の3'非パリンドローム領
域は、145bpのITR配列を完成し、そしてこれもまたAAV DNA複製に関与すると考
えられる。２つの長型のAAV repコードポリペプチドであるRep78およびRep68は
、ヘアピン配置でAAV ITRに結合し(Snyderら(1993)J．Virol．67：6096-6104お
よびAshktorabら(1989)J．Virol．63：3034-3039)、そして末端分離で表される
複製プロセスに関与する。Snyderら，(1990)Cell 60：105-113。最近の研究は、
Rep78およびRep68タンパク質もまた、BおよびCのパリンドロームに近位のAAV IT
RのAステムの25塩基の配列に含まれる直鎖DNA配列を認識しかつ結合し得ること
を示した。McCartyら，(1994a)J．Virol．68：4988-4997；McCartyら，(1994b)J
．Virol．68：4998-5006。AAV ITR中のRep結合部位は、19q13-qterに存在するAA
V組み込み部位(「AAVS1」と呼ばれる)またはその近くに見出されるGCTC反復モチ
ーフに類似する12塩基のヌクレオチド配列としてさらに特徴づけられた。Weitzm
anら，(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：5808-5812；Shellingら，(1994)
Gene Therapy 1：165-169。従って、AAV ITR中のRep結合部位は、AAVS1へのAAV
の標的特異的組み込みに必要とされると考えられる。
本発明の目的のため、単一のAAV ITRは、１つまたはそれ以上の選択された異
種ヌクレオチド配列に対して配置され、そして発現可能なAAVrepコード領域また
はRep発現産物とともに、標的細胞のゲノムへの会合配列の組み込みを提供し得
る。AAV ITR領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、Kotin，R.M．(1994
)Human Gene Therapy 5：793-801；Bern，K.I．「パルボウイルス科およびそれ
らの複製」、Fundamental Virology、第２版、(B.N．FieldsおよびD.M．Knipe編
)、AAV-2配列については図１(配列番号１)を参照のこと。本明細書中で使用され
るように、「AAV ITR」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はな
く、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により改変され得る。さらに
、AAV ITRは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むがこれら
に限定されない、いくつかのAAV血清型のいずれかに由来し得る。しかし、本明
細書中で使用される用語「AAV ITR」は、野生型AAV ITR配列に見出される20塩基
の「D」領域に実質的に相同である１つより多くの領域を有しないヌクレオチド
配列を表す。AAV ITR配列には、意図されるように、すなわち、発現可能なAAV r
epコード領域が(同じかまたは異なるベクターのいずれかに)存在する場合、また
はRep発現産物もまたレシピエント細胞に導入された場合、レシピエント細胞ゲ
ノムへの会合異種配列の組み込みを可能にするように、機能することのみが必要
とされる。
用語「標的化配列」は、本明細書中では、AAV Rep発現産物に結合し得る任意
のポリヌクレオチド配列を含むように定義され、これによって、Rep発現産物は
会合ヌクレオチド配列とともに、適切なレシピエント細胞ゲノムへの標的化配列
の組み込みを媒介する。このようにして、標的化配列は、Rep発現産物により提
供される組み込み機能と組み合わせて、会合ヌクレオチド配列とともに、第19染
色体上の部位、特に19q13-qterのAAVS1部位のヒトゲノムに優先的に組み込み得
る。例えば、Repに結合しかつレシピエント細胞ゲノムに挿入され得るITR配列、
またはそのフラグメントは、用語「標的配列」に含まれる。
「ベクター」とは、適切な制御エレメントと会合されるときに複製し得、かつ
細胞間で遺伝子配列を転移し得る任意の遺伝エレメント(例えば、プラスミド、
ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど)を意
味する。従って、この用語には、クローニングおよび発現のビヒクル、ならびに
ウイルスベクターが含まれる。
「ヌクレオチド配列組み込みベクター」とは、本明細書中で定義されるような
標的化配列および会合異種ヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含有するベクタ
ーを意味する。例えば、ITR配列を標的化配列として使用するなら、これは野生
型ITR配列である必要はなく、そしてこのITRがレシピエント宿主のゲノムへの会
合ヌクレオチド配列の組み込みを指向し得る限り、例えば、ヌクレオチドの挿入
、欠失または置換により改変され得る。
ヌクレオチド配列組み込みベクターは、機能AAV ITR配列または他の適切な標
的化配列と会合した１つまたはそれ以上の異種ヌクレオチド配列を含むように、
当該分野で公知の組換え技術を用いて構築され得る。本発明の実施において、ヌ
クレオチド配列組み込みベクターには、異種ヌクレオチド配列の上流に位置する
単一のAAV ITR配列および適切なプロモーター配列が含まれ得る。
ヌクレオチド配列組み込みベクターには、転写配列(例えば、ポリアデニル化
部位)、ならびに選択マーカーまたはリポーター遺伝子、エンハンサー配列、お
よび転写の誘導を可能にする他の制御エレメントもまた含まれ得る。このような
制御エレメントを以下により詳細に説明する。
ヌクレオチド配列組み込みベクターに使用するための適切なヌクレオチド配列
には、機能的に関係する任意のヌクレオチド配列が含まれる。従って、本発明の
ベクターには、レシピエント細胞ゲノムから欠損または消失しているタンパク質
をコードするか、または所望の生物学的または治療的効果(例えば、抗ウイルス
機能)を有する非天然のタンパク質をコードする任意の所望の遺伝子が含まれ得
るか、あるいはこの配列は、アンチセンス機能またはリボザイム機能を有する分
子に対応し得る。適切な遺伝子には、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性性および
感染性の疾患(例えば、エイズのような疾患、ガン、神経性疾患、心血管性疾患
、高コレステロール血症を含む；種々の貧血、サラセミアおよび血友病を含む種
々の血液疾患；嚢胞性線維症、ゴーシュ病、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠乏
症、肺気腫のような遺伝的欠損症など)の処置のために使用される遺伝子が含ま
れる。ガンおよびウイルス疾患のためのアンチセンス治療に有用である、多くの
アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、mRNAの翻訳開始部位(AUGコドン)周辺
の配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド)が、当該分野に記載されている。例
えば、H
anら，(1991)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：4313-4317；Uhlmannら，(1990
)Chem．Rev．90：543-584；Heleneら，(1990)Biochim．Biophys．Acta．1049：9
9-125；Agarwalら(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：7079-7083；およびHe
ikkilaら，(1987)Nature 328：445-449を参照のこと。適切なリボザイムの議論
については、例えば、Cechら，(1992)J．Biol．Chem．267：17479-17482およびG
oldbergらの米国特許第5,225,347号を参照のこと。
「組換えウイルス」とは、例えば、粒子に異種核酸構築物を付加または挿入す
ることにより、遺伝的に改変されたウイルスを意味する。
「AAV repコード領域」とは、ウイルスゲノムの複製および潜在的な感染の間
で宿主ゲノムへのウイルスゲノムの挿入のために集合的に必要とされるウイルス
の複製タンパク質をコードするAAVゲノム、またはそれらの機能的な相同体(例え
ば、AAV-2 DNA複製を媒介することも知られているヒトヘルペスウイルス６(HHV-
6)rep遺伝子)の当該分野で認識された領域を意味する(Thomsonら，(1994)Virolo
gy 204：304-311)。従って、repコード領域には、少なくとも、AAV Rep 78およ
びRep68(「Repの長型」)、ならびにRep 52およびRep 40(「Repの短型」)をコー
ドする遺伝子、またはその機能的な相同体が含まれる。AAV repコード領域に関
するさらなる記載については、例えば、Muzyczka，N.(1992)Current Topics in
Microbiol．and Immunol．158：97-129；およびKotin，R.M．(1994)Human Gene
Therapy 5：793-801を参照のこと。本明細書中で使用されるように、repコード
領域は、任意のウイルス血清型(例えば、上記のAAV血清型)に由来し得る。この
領域は、野生型遺伝子の全てを含む必要はないが、存在するrep遺伝子が適切な
レシピエント細胞で発現されるときに充分な組み込み機能を提供する限り、例え
ば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により、改変され得る。
「Rep発現産物」は、本明細書中において、レシピエント細胞において組み込
み機能を供給するのに必要かつ十分なそれらのAAV rep転写産物を含むように定
義される。この点に関して、短型および長型のAAV Repの両方(それらの機能的な
相同体を含む)が、この定義に含まれる。
本明細書中で使用されるように、用語「組み込み」および「ヌクレオチド配列
組み込み」には、ヌクレオチド配列(すなわち、DNA配列)をより大きく、正常な
ゲノムのレシピエント配列(１つまたは複数)中に挿入することが含まれる。レシ
ピエント配列(１つまたは複数)中へのウイルスおよび／または異種ヌクレオチド
配列のこのような挿入は、一般に、組換え事象により行われ、それにより、挿入
されたヌクレオチド配列は、レシピエント配列(１つまたは複数)中に共有的に取
り込まれる。「組み込み機能」は、ヌクレオチド配列のレシピエント配列(１つ
または複数)への組み込みを、好ましくは、部位特異的な方式で、媒介する１つ
またはそれ以上のポリペプチドの能力を意味する。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来DNAの取り込みを意味する
ために使用され、そして細胞は、外因性DNAが細胞膜内に導入されている場合に
、「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術は、当該
分野で一般的に知られている。例えば、Grahamら，(1973)Virology，52：456，S
ambrookら，(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Har
bor Laboratories，New York，Davisら，(1986)Basic Methods in Molecular Bi
ology，Elsevier，およびChuら，(1981)Gene 13：197を参照のこと。このような
技術は、１つまたはそれ以上の外因性DNA部分(例えば、ヌクレオチド組み込みベ
クターおよび他の核酸分子)を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
本明細書中で使用されるように、「ヌクレオチド配列組み込みシステム」は、
以下の有効な組み合わせを意図する：(１)AAV Repに結合し得る標的化配列、お
よび標的化配列がレシピエント細胞ゲノム中の標的部位への異種配列の組み込み
を指向し得るように(すなわち、標的化配列が異種配列に対して3'側または5'側
に配置され得るように)、標的化配列に対して整列される少なくとも１つの目的
の異種ヌクレオチド配列を含む、第１の核酸構築物；および(２)適切なレシピエ
ント細胞においてrepコード領域の転写および翻訳を指向し得る制御エレメント
に作動可能に連結されるrepコード領域を有するさらなる核酸構築物、または適
切な量のRep組み込み産物のいずれか。これにより、ヌクレオチド配列組み込み
システムは、この組み込みシステムでトランスフェクトされたレシピエント細胞
のゲノムへの、第１の構築物からの目的のヌクレオチド配列の組み込みを提供す
る。
「レシピエント細胞」または「レシピエント哺乳動物細胞」とは、核酸構築物
または選択された目的のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列組み込みベ
クターにより、形質転換された細胞、または形質転換され得る細胞を意味する。
この用語には、親細胞の子孫が含まれる。ここで、この子孫は、選択されたヌク
レオチド配列が存在する限り、形態学または遺伝的構成でオリジナルの親と同一
かどうかとは関係ない。
レシピエント細胞は、目的の選択されたヌクレオチド配列を含む核酸構築物が
細胞膜の内側に導入され、そして目的の配列がレシピエント細胞ゲノムに組み込
まれ、その結果、この配列が染色体複製を通して娘細胞により受け継がれ得る場
合、この構築物で「安定に形質転換」されている。レシピエント細胞は、形質導
入、トランスフェクション、および感染を含む、任意のいくつかの技術を用いて
形質転換され得る。安定性は、目的のヌクレオチド配列を含む娘細胞の集団から
なる細胞株またはクローンを確立するレシピエント細胞の能力により証明される
。
用語「異種」は、それがコード配列および制御配列のような核酸配列に関する
場合、通常共に連結されない配列、および/または通常特定の細胞に関連しない
配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、他の分子と
共同して事実上見出されない別の核酸分子の内側またはそれに結合した核酸のセ
グメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、コード配列と共同して事実
上見出されない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例
は、コード配列自身が事実上見出されない構築物である（例えば、天然の遺伝子
とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しない構築物
で形質転換された細胞は、本発明のために異種とみなされる。対立遺伝子変化ま
たは天然に存在する変異事象は、本明細書中に使用するように、異種DNAを生じ
ない。
「コード配列」すなわち特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調
節配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボで、（DNAの場合）
転写されそして（mRNAの場合）ポリペプチドに翻訳される核酸配列である。コー
ド配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カルボキシ）
末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、原核生物または真核
生物のmRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、お
よび合成DNA配列でさえも含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は
、通常、コード配列の３’に位置する。
「核酸」配列は、DNAまたはRNA配列をいう。この用語は、以下のような、DNA
およびRNAの任意の公知の塩基アナログを含むが、これらに限定されない配列を
捕らえる：4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジ
ニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラ
シル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチ
ル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラ
シル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプ
ソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン
、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン
、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-
メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクエオシン、5'-メト
キシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペ
ンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ
酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、
5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシ
ル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイ
ドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、および2,6-ジアミノプリン。
用語DNA「制御配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写
終結配列、上流の調節ドメイン、複製起点、内在性リボソーム侵入部位（「IRES
」）、エンハンサーなどを集合的にいい、これらは、レシピエント細胞における
コード配列の複製、転写および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列
が適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの全て
の制御配列は、常に存在する必要はない。
「作動可能に連結された」は、そのように記載された成分がその通常の機能を
行うように配置されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能
に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらし得る。制御配列は、それ
らがその発現を指揮するように機能する限り、コード配列と隣接する必要はない
。
従って、例えば、翻訳されないが転写される介在配列は、プロモーター配列とコ
ード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなおコード配列に「作動
可能に連結された」とみなされる。
ヌクレオチド配列をいう場合、「単離された」は、同じタイプの他の生物学的
なマクロ分子の実質的な非存在下で、示された分子が存在することを意味する。
従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、本発明の
ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう；
しかし、この分子は、組成物の基本的な特性を有害に影響しない、いくつかのさ
らなる塩基または部分を含み得る。
本出願を通して、特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的な位置を
記載する目的のために、例えば、特定のヌクレオチド配列が、別の配列に対して
「上流」、「下流」、「３’」、または「５’」に位置するように記載される場
合、当該分野において慣用的であるように言及されるDNA分子の「センス」鎖ま
たは「コード」鎖における配列の位置であることが理解されるべきである。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの部分間の
同一性の割合をいう。１つの部分から別の部分までの配列間の対応は、当該分野
で公知の技術によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインメ
ントし、そして容易に入手可能なコンピュータープログラムを用いることにより
、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接的な比較により決定され得る。あ
るいは、相同性は、相同的な領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌ
クレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消
化、および消化フラグメントのサイズ決定により決定され得る。上記の方法を用
いて決定された場合、分子の規定された長さにわたってヌクレオチドまたはアミ
ノ酸の、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、および最も好ましく
は少なくとも約99％が適合する場合、２つのDNAまたは２つのポリペプチド配列
は、互いに対して「実質的に相同（的）」である。
所定のポリペプチドの「機能的なホモログ」または「機能的な等価物」は、天
然のポリペプチド配列に由来する分子、ならびに所望の結果を達成するために参
照分子に類似した様式で機能する、組換えにより産生されたまたは化学的に合成
されたポリペプチドを含む。従って、AAV Rep68またはRep78の機能的ホモログは
、組み込み活性が残存する限り、これらのポリペプチドの誘導体およびアナログ
（内部またはそのアミノ末端もしくはカルボキシ末端で生じる、任意の単一また
は複数のアミノ酸の付加、置換および/または欠失を含む）を含む。
所定のAAVヌクレオチド領域の「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は
、異種AAV血清型に由来する類似領域、ならびに所望の結果を達成するために参
照ヌクレオチド領域に類似した様式で機能する、組換えにより産生されたまたは
化学的に合成されたポリヌクレオチドを含む。従って、AAV ITR領域の機能的ホ
モログは、ITRホモログが適切な宿主ゲノムにそれらの組み込みを媒介するため
に十分な塩基またはエレメントの最小数を保持する限り、このような配列の誘導
体およびアナログ（ITR領域内で生じる、任意の単一または複数のヌクレオチド
塩基の付加、置換および/または欠失を含む）を含む。AAV ITR Rep結合部位の機
能的ホモログであるヌクレオチド配列は、その配列がRep発現産物を結合し得る
限り、12塩基ヌクレオチド配列の誘導体およびアナログ、合成ヌクレオチド配列
またはその他のものを含む。Rep発現産物のヌクレオチド配列への首尾良い結合
は、Weitzmanら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5808-5812により記載され
る、移動度シフトアッセイを用いて決定され得る。Ｂ．一般的な方法
本発明は、選択されたヌクレオチド配列がRepを結合し得る単一の標的化配列
を含む限り、AAV Rep発現産物が選択されたヌクレオチド配列の適切なレシピエ
ントヌクレオチド配列への部位特異的な組み込みを媒介し得る発見に基づく。こ
の様式において、本発明は、初めて、送達され得るヌクレオチド配列のサイズに
関して限定されることなく、AAVの部位特異的な組み込み特性を示すヌクレオチ
ド配列組み込みシステムを提供する。これらの新規のシステムを使用して、挿入
されたヌクレオチド配列の予測可能な長期の発現を提供するために、大きなヌク
レオチド配列をレシピエントゲノムに安全にかつ効果的に送達および組み込み得
る。
従って、本発明の主な目的は、AAV Repを結合し得る標的化配列、および標的
化配列に対して構築物中に適切に配置され、これにより標的化配列が適切なレシ
ピエント細胞ゲノム内の標的部位への異種配列の組み込みを指揮し得る、少なく
とも１つの異種ヌクレオチド配列を含む単離された核酸構築物を提供することで
ある。
さらに詳細には、本発明の核酸構築物の標的化配列は、AAV ITR Rep結合部位
に相同的なAAV Rep発現産物の結合部位を提供する。この様式において、AAV Rep
発現産物は、（任意の関連する異種ヌクレオチド配列と共に）レシピエント細胞
ゲノム中への標的化配列の組み込みを媒介し得る。図１を言及すると、本明細書
中に使用される標的化配列は、野生型AAV ITR配列において見出された12塩基のR
ep結合部位に対して機能的に相同的な少なくとも１つの領域を含む。例えば、Ko
tin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801.を参照のこと。Rep結合部位は、
19q13-qterでヒトゲノムに存在するAAV組み込み部位にまたはその近傍に見出さ
れたGCTC反復モチーフ（「AAVS1」と呼ばれる）に類似する配列を含む。Weitzma
nら(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5808-5812;Schellingら、(1994)Gene
Therapy 1:165-169。従って、AAV ITR Rep結合部位は、AAVのAAVS1への標的特
異的組み込みに必要であると思われる。
標的部位は、本発明の核酸構築物中で選択された目的の異種配列に対して3'ま
たは5'のいずれかに配置される。その結果、標的化配列および異種配列は、Rep
発現産物媒介性組み込み機能を介して、レシピエント細胞のゲノム中に挿入され
得る。従って、好ましい実施態様では、標的化配列は、部位特異的様式でのレシ
ピエントゲノムへの（例えば、ヒトレシピエント細胞における第19染色体のAAVS
1への）異種配列の組み込みを指向し得る。
本発明の特定の局面では、単一のAAV ITR配列に相同である標的化配列を有す
る、単離された核酸構築物が提供される。上記のように、AAV ITRは、約145塩基
のヌクレオチド配列である。この配列は、「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」で示さ
れる３つのパリンドローム配列（Lusbyら(1980)J.Virol．34: 402-409; Straus
ら(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73: 742-746）、ならびに単一の3'側の20ヌク
レオチドの「Ｄ」で示される非パリンドローム領域を含む。ITR配列には、上記
の機能的Rep結合部位が含まれる。本発明においては、ITR配列は、野生型配
列（例えば、これはヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により改変され得る
）である必要はない。ITRは公知の方法を用いて合成的に誘導され得るか、およ
び／またはITRはいくつかのAAV血清型のいずれかに由来し得る。AAV血清型は、A
AV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを包含するがこれらに限定され
ない。しかし、ITRは、野生型AAV ITR配列に見出される20塩基の「Ｄ」領域に実
質的に相同である領域を１つより多く有しないように選択される。特定の構築物
では、標的化配列は、図１に示す145塩基対のITR配列（配列番号１）を含む。
本核酸構築物は、当業者に公知の組換え技術を用いて操作され得る。特に、AA
V ITR配列は、これを含有するウイルスゲノムまたはAAVベクタープラスミドから
切り出され得、そして標準的な連結技術（例えば、Sambrookら，前出に記載の技
術）を用いて、別のベクター中に存在する選択されたヌクレオチド配列の5'また
は3'側のいずれかに融合され得る。例えば、連結は、20mM Tris-Cl pH7.5、10mM
MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl、および０℃にて40μM ATP
、0.01〜0.02（Weiss）単位のT4 DNAリガーゼ（「粘着末端」連結について）、
または14℃にて１mM ATP、0.3〜0.6の（Weiss）単位のT4 DNAリガーゼ（「平滑
末端」連結について）のいずれかで達成され得る。分子内「粘着末端」連結は、
通常、30〜100μg/ml 全DNA濃度（５〜100nM 全末端濃度）で行われる。ITRを含
有するAAVベクターは、例えば、米国特許第5,139,941号に記載され、そしてアメ
リカンタイプカルチャーコレクション（「ATCC」）からアクセス番号53222、532
23、53224、53225、および53226で入手可能である。
さらに、キメラヌクレオチド配列は、合成により作製されてAAV ITR配列ホモ
ログ、または適切な標的配列（機能的なRep結合部位を含む）を提供し得、次い
で選択されたヌクレオチド配列の5'または3'側に融合され得る。AAV ITRヌクレ
オチド配列は公知である。例えば、AAV-2配列についてはKotin，R.M．(1994)Hum
an Gene Therapy 5: 793-801；およびBerns，K.I．「パルボウイルス科およびそ
れらの複製」Fundamental Virology，第２版，(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編)
を参照のこと。哺乳動物細胞におけるキメラヌクレオチド配列の発現のために好
ましいコドンが用いられ得る。完全なキメラ配列は、標準的な方法により調製さ
れるオーバーラップするオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。例えば、
Edge，Nature(1981)292: 756; Nambairら，Science(1984)223: 1299; Jayら，J.
Biol.Chem．(1984)259: 6311を参照のこと。
本発明の核酸構築物の選択された異種ヌクレオチド配列は、レシピエント細胞
のゲノムから欠損または喪失しているタンパク質、または所望の生物学的もしく
は治療的効果を有する非天然のタンパク質（例えば、抗ウイルス機能）をコード
する任意の所望の遺伝子を含み得るか、または配列はアンチセンスまたはリボザ
イム機能を有する分子に対応し得る。適切な遺伝子は、炎症性疾患、自己免疫疾
患、慢性および感染性の疾患（AIDS、ガン、神経性疾患、心血管疾患、高コレス
テロール血症のような障害を含む）；種々の貧血、地中海貧血症、および血友病
を含む種々の血液障害；嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（
ADA）欠損症、気腫などのような遺伝的欠損の治療に用いられる遺伝子を包含す
る。
本発明の１つの特定の局面では、標的配列、およびポリペプチドをコードし得
るコード領域を含む結合した異種ヌクレオチド配列を有する核酸構築物が提供さ
れる。コード領域は、例えば、レシピエント細胞のゲノムから欠損または喪失し
たタンパク質をコードし得る。核酸構築物がまた、供給され得る。ここで、選択
されたコード領域は、レシピエントゲノムによりコードされる内在性タンパク質
を過剰発現する。従って、本発明によって提供される構築物は、遺伝子送達にお
ける使用のための遺伝子移入システムをアセンブルするのに特に有用である。
コード領域は、適切なレシピエント細胞における転写およびその翻訳を指向し
得る制御エレメントに作動可能に連結される。適切な制御配列は、プロモーター
配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ドメイン、複製起点
、内部リボゾーム侵入部位（「IRES」）、エンハンサーなどを包含し得る。
本発明の目的は、レシピエント哺乳動物細胞ゲノムへの選択されたヌクレオチ
ド配列の組み込みのためのベクターを提供することでもある。より詳細には、標
的化配列および少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含有し、本発明に従っ
て構築された核酸構築物を含むベクターが本明細書中で提供される。このような
ベクターは、適切な制御エレメントに連結されたときに複製し得、かつ細胞間で
遺伝子を移行させ得る任意の遺伝エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、
トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）の形態であり得
る。本発明の下で特に好ましいベクターは、DNA（例えば、コスミドまたはプラ
スミド）の環状片を含む。
本発明の特定の局面では、本明細書中に定義されるような核酸構築物および選
択マーカーを含有するベクターが提供される。本発明の実施に有用な選択マーカ
ーは、このようなベクターで形質転換された適切な宿主細胞が適切な選択培地で
増殖する場合に、抗生物質耐性または抗生物質感受性を与えるか、着色するか、
または抗原特性を変化させる遺伝子を包含する。
本発明のなおさらなる目的は、適切なレシピエント細胞ゲノム中に選択された
ヌクレオチド配列を挿入し得るヌクレオチド配列組み込みシステムを提供するこ
とである。より詳細には、本発明の組み込みシステムは、以下の有効な組合せで
ある：(1)AAV Repに結合し得る標的化配列を含有する核酸構築物、および標的化
配列がレシピエント細胞ゲノム中の標的部位への異種配列の組み込みを指向し得
るように、標的化配列に対して配置された少なくとも１つの目的の異種ヌクレオ
チド配列を含むベクター；ならびに(2)AAV Rep発現産物、これにより、発現産物
は、標的化配列と関連して、レシピエント細胞ゲノムの標的部位中へのベクター
の異種ヌクレオチド配列の組み込みを媒介し得る。
本発明のヌクレオチド配列組み込みシステムは、標的化配列とRep発現産物に
より提供される組み込み機能との協同作用を介してAAVの部位特異的組み込み特
性を提供し得る。さらに、本発明の組み込みシステムは、大きなヌクレオチド配
列を送達し、そしてレシピエント細胞ゲノムへのその組み込みを媒介し得る。こ
こで、組み込まれた配列は、従来可能であるよりもずっと大きい。この特徴は、
本発明の組み込みシステムが従来のシステムのように送達および組み込みのため
にウイルス粒子内にパッケージされる必要がないことに起因する。このようにし
て、本発明の組み込みシステムはまた、レシピエント細胞ゲノムへのウイルス遺
伝子配列の組み込みをもたらさない。これは、このシステムにはウイルス粒子は
含まれないためである。
ベクター（例えば、コスミドまたはプラスミドだが、これらに限定されない）
の形態で選択されたヌクレオチド配列を含む核酸構築物を構成する能力は、ウイ
ルスに基づく過去の遺伝子送達システムにおいて遭遇する問題を回避する。過去
の遺伝子送達システムでは、これらのシステムは、一般に、混入する野生型ビリ
オンの付随する産生を伴わずに産生され得ない。従って、本発明のヌクレオチド
組み込みシステムは、ランダムな組み込み事象に起因する挿入変異誘発を生じる
危険性または望ましくないウイルス副作用に遭遇する危険性を生じることなく、
大きなヌクレオチド配列を適切なレシピエント細胞ゲノム内に安全かつ効率的に
送達および組み込みするために使用され得る。
従って、本発明の１つの局面では、組み込みシステムが提供される。ここで、
（タンパク質発現のルーチンな方法に従って産生された）適切な量のRep発現産
物は、（上記のように構築された）ベクターに結合されて、ベクターからその中
に適切な標的部位を有するレシピエントゲノムへの選択されたヌクレオチド配列
の部位特異的組み込みの可能なシステムを提供する。これに関して、適切な量の
Rep発現産物は、本明細書中では、レシピエント細胞への組み込み機能を供給す
るために必要かつ充分である量と定義される。
Rep発現産物は、固相ペプチド合成のような化学的合成により、公知のアミノ
酸配列または種々のRepタンパク質をコードする遺伝子のDNA配列に由来するアミ
ノ酸配列を用いて容易に産生され得る。このような方法は、当業者に公知である
。これに関して、repコード領域は、クローン化および配列決定された。例えば
、Muzyczka，N．(1992)Current Topics in Microbiol．and Immunol．158: 97-1
29; およびKotin，R.M．(1994)Human Gene Therapy 5: 793-801を参照のこと。R
ep発現産物はまた、適切なプロモーターの制御下でrepコード領域を含む構築物
でトランスフェクトしたヒト293細胞の核抽出物から、公知の抽出方法および精
製方法を用いて得られ得る。Owensら，(1993)J.Virol．67: 997-1005。さらに、
Rep発現産物は、他のペプチド発現システムにおいて多くの適切なベクターのい
ずれかを用いて産生され得る。多くの適切なベクターは当業者に公知であり、そ
して特定のベクターの選択は選択事項である。例えば、昆虫細胞発現システムが
用いられ得、そして組換えバキュロウイルスに感染したSF9昆虫細胞におけるRep
タンパク質の発現は当該分野で記載されている。例えば、McCartyら(1994)J.Vir
ol．68: 4998-5006; McCartyら(1994)J.Virol．68: 4988-4997，Niら（199
4)J.Virol．68: 1128-1138を参照のこと。
本発明の別の局面では、組み込みシステムが提供される。ここで、Rep発現産
物は、適切なレシピエント細胞においてrepコード領域の転写および翻訳を指向
し得る制御エレメントに作動可能に連結されたrepコード領域を有する第２の核
酸構築物により供給される。このような核酸構築物は、当該分野で公知の方法お
よび上記の方法を用いてアセンブルされ得る。
特に、repコード領域は、ウイルスゲノムまたはこれを含むことが知られるAAV
ベクタープラスミドから得られ得る。これに関して、多くのrep含有AAVベクター
が公知であり、例えば、米国特許第5,139,941号に記載され、ATCCアクセス番号5
3222、53223、53224、53225、および53226を有するいくつかのベクターを包含す
る。同様に、AAV repのHHV-6ホモログを得る方法は、Thomsonら(1994)Virology 204
: 304-311に記載される。
repコード領域は、その転写および翻訳を指向する制御配列に作動可能に連結
される。このような制御エレメントは、１つ以上のプロモーター、ポリアデニル
化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製配列、エンハンサーなどを
包含する。これらは、集合的に、レシピエント細胞に存在する場合にrepコード
領域の転写および翻訳を提供する。
有用なプロモーター配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードす
る配列由来のものを含む。例としては、相同なAAVプロモーター、SV40初期プロ
モーター、マウス乳房腫瘍ウイルスLTRプロモーター；アデノウイルス主要後期
プロモーター(Ad MLP)；単純ヘルペスウイルス（HSV）プロモーター、サイトメ
ガロウイルス（CMV）プロモーター、ラウス肉腫（RSV）プロモーター、合成プロ
モーター、ハイブリッドプロモーターなどを含むがこれに限定されない。さらに
、非ウイルス遺伝子（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子など）由来の配列
も本願において有用である。このようなプロモーター配列は、例えばStratagene
から市販されている。
さらに、レシピエント細胞のrepコード領域の制御された発現を可能にするよ
うな調節エレメントを選んでもよい。このようなエレメントは、適切なエフェク
ターに応答してオンにされる。このようにして、選択されたヌクレオチド配列を
レシピエント細胞のゲノムに組み込むことが所望される場合、Rep発現産物をが
提供され得る。調節配列は当業者に公知であり、例えば、lacオペレーター−リ
プレッサーシステム（例えば、HuおよびDavidson、Cell(1987)48:555-566を参照
のこと）由来のエレメント、パポバウイルス由来のものを含む複製起点（例えば
、Ｔ抗原がエフェクターであるSV40複製起点(SV40ori)など）、ならびに細胞性
複製起点（例えば、メトトレキセートがエフェクターであるジヒドロ葉酸レダク
ターゼ(DHFR)遺伝子など）を含む。例えば、Urlaubら(1980)Proc．Natl．Acad．
Sci．USA 77:4216-4220；Rungoldら(1981)J．Mol．and Appl．Genet．1:165-175
を参照のこと。
特定のシステムにおいて、AAV repコード領域の発現が所望される場合に、適
切なエフェクターがレシピエント細胞中で利用可能である。調節化合物を投与す
るためのシステムは、当該分野において公知である。例えば、国際公開番号WO 8
8/09809、McVeyら(1989)Mol．Cell．Biol.9:5525-5536；およびVan Dorenら(198
4)Mol．Cell．Biol．9:5525-5536を参照のこと。
AAV repコード領域を含む第２の核酸構築物はまた、上述のように、抗生物質
耐性または抗生物質感受性を与えるか、あるいは色を付与するか、あるいは抗原
特性を変化させる遺伝子などの、選択マーカーを含んでもよい。
本発明の特定の局面によれば、本明細書中に記載されるヌクレオチド組み込み
システムは、第１および第２の核酸構築物の両方が単一のベクター上に存在する
ように操作され得る。しかし、この特定の配置は、ウイルス配列のレシピエント
ゲノムへの挿入を避けることが所望される場合においては、好ましくないことが
あり得る。
本発明のさらなる目的は、選択されたヌクレオチド配列をレシピエント細胞ゲ
ノム中に組み込む方法を提供することである。本方法は一般に、(1)第１の核酸
構築物をレシピエント細胞に導入する工程であって、この第１の構築物はAAV Re
pと結合し得る標的化配列を含み、そして、選択された異種ヌクレオチド配列が
、レシピエント細胞ゲノム中の標的化部位への異種配列の組み込みを標的化配列
が導き得るように、標的化配列に対して第１の構築物中に適切に整列される工程
；および(2)Rep発現産物をレシピエント細胞中に導入し、それにより、Rep発現
産
物が、レシピエント細胞ゲノム中へ第１の核酸構築物からの選択された異種ヌク
レオチド配列の組み込みをもたらし得る工程を包含する。
このような方法は、本発明に従って構築された任意の核酸構築物および／また
はベクターを用いて実施し得る。本発明の特定の局面において、上述の方法は、
本明細書中において提供されるヌクレオチド配列組み込みシステムを用いて実施
される。
特に好ましい方法において、レシピエントゲノムへの組み込みのために選択さ
れたヌクレオチド配列は、単一の野生型AAV ITR配列に実質的に相同な標的化配
列に対して、核酸構築物中に整列される。このようにして、標的化配列は、目的
の会合するヌクレオチド配列とともに、レシピエントヒト細胞ゲノム中に第19染
色体上の部位（特に19q13-qterのAAVS1部位）において優先的に(preferentially
)組み込み可能である。
選択されたヌクレオチド配列をレシピエント細胞ゲノム中に組み込む本発明の
方法の各々は、Rep発現産物とともに遺伝情報を適切なレシピエント細胞中に導
入し、それにより目的の選択されたヌクレオチド配列を部位特異的にレシピエン
ト細胞ゲノム中に組み込む工程を包含する。このように、いったん操作および組
み立てがなされれば、本発明の組み込みシステムは、選択されたレシピエント細
胞を形質転換するために直接用い得る。この点に関して、形質転換される細胞は
、遺伝子移入の目的（例えば、処置される疾患状態など）に依存する。例えば、
本発明のヌクレオチド組み込みシステムは、幹細胞、前駆細胞、および赤血球細
胞を含む任意の有核細胞；ならびに任意の様々な白血球（例えば、リンパ球、好
中球、好酸球、好塩基球、単球）；組織特異的細胞(例えば、肺、心臓、腎臓、
肝臓、脾臓、膵臓組織、結合組織、筋肉、および骨細胞を含む骨組織由来の細胞
)、神経節細胞、上皮細胞および内皮細胞、上衣細胞、細網内皮細胞、樹状細胞
および神経細胞などへ、ヌクレオチド配列を送達および組み込むために用いられ
得る。
一般に、レシピエント細胞は、インビボまたはエキソビボのいずれかで本発明
のヌクレオチド配列組み込みシステムによって形質転換される。エキソビボで形
質転換される場合、所望のレシピエント細胞型が被験体から取り出され、形質転
換され、そして被験体内に再導入される。この点に関して、細胞を形質転換する
多くの方法が当該分野において公知であり、これらの方法は、デキストラン媒介
トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェク
ション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、核酸構築物のリポソー
ム中へのカプセル化、および核内へのDNAの直接的なマイクロインジェクション
を含む。このようなシステムは、当該分野において公知であり、例えばFinneyお
よびBishop(1993)Science 260:1524-1527に記載されている。形質転換された細
胞を、薬物耐性スクリーニング、サザンブロット、および／またはPCRなどの従
来技術を用いて、選択された遺伝子を有する細胞についてスクリーニングし得る
。
インビボで送達される場合は、核酸構築物は薬学的組成物中に処方され、そし
て一般に非経口的に（例えば、注射により）投与される。他の投与形態に適した
さらなる剤型としては、経口剤および肺剤(pulmonary fomulation)、座薬、およ
び経皮薬が含まれる。投薬処置としては、単回用量スケジュールであっても複数
回用量スケジュールであってもよい。当業者は、標準的な用量応答曲線を用いて
、適切な投薬量を容易に決定し得る。
本明細書を読むことにより、当業者には容易に理解されるように、選択された
ヌクレオチド配列をレシピエント細胞ゲノム中に組み込む上述の方法が、被験体
における後天性疾患または先天性疾患を処置するために実施され得る。従って、
本発明のさらなる目的は、被験体からの選択された細胞が本発明のヌクレオチド
組み込みシステムを用いて形質転換される、このような処置方法を提供すること
である。このようにして、Rep発現産物は、選択された治療的に有用なヌクレオ
チド配列の、被験体細胞のゲノム内への部位指向性組み込みを引き起こす。これ
らの方法により、疾病を有する宿主被験体由来の選択された細胞中への、治療的
に有用なヌクレオチド配列の安全かつ効率的な組み込みが提供される。
さらに、本発明のヌクレオチド組み込みシステムを用いて、トランスジェニッ
ク生物の生成のために、ならびに遺伝子治療、ワクチン接種、または様々な遺伝
子およびそれらの作用機構を特徴付けるために、選択された配列を様々な細胞型
および組織型に送達し得る。本発明の方法はまた、リボザイムおよびアンチセン
ス治療における使用を見いだす。アンチセンス治療およびこれに有用なオリゴヌ
クレオチドの総説については、Uhlmann、E.およびPeyman、A.(1990)Chem．Rev．90
:543-584を参照のこと。リボザイムの考察については、Cechら(1992)J．Biol
．Chem．267:17479-17482を参照のこと。Ｃ．実験
以下に、本発明を実施するための特定の実施態様の例を示す。実施例は説明目
的のためにのみ記載され、本発明の範囲を何ら制限することを意図するものでは
ない。
使用した数（例えば、量、温度など）について正確を期したが、ある程度の実
験誤差および偏差も当然考慮されるべきである。
実施例１
組み込みの直接検出
哺乳動物標的細胞に形質導入された場合に、AAV Rep発現産物、またはAAV Rep
およびCap発現産物が、ヌクレオチド組み込みベクタープラスミドの組み込みを
容易にするために十分であるかを決定するために、以下の実験を行った。１．コスミドpRR23の構築
図２を参照して、コスミドpRR23を以下のように構築した。ベクターpHC79のBa
mH1部位にクローン化された約28,010塩基対の酵母DNAを含む、コスミドcPM9214
（ATCCから受託番号70892として入手）を、唯一のEcl136I部位において制限した
。次いで、NotIリンカー（5'-TTGCGGCCGCAA-3'）（配列番号２）をその末端に連
結し、そして得られた構築物を再度閉じることにより、唯一のNotI部位を有する
コスミドpRR23を得た。２．コスミドpRR27およびpRR28の構築
図２をなお参照して、AAV ITRに隣接するDHFR遺伝子を含み、さらにneo遺伝子
を含むプラスミドpGN2025を、唯一のStuI部位で切断した。次いで、NotIリンカ
ー（5'-TTGCGGCCGCAA-3'）（配列番号２）をその末端に連結し、構築物をNotIで
消化することにより、neo遺伝子の一部を連続的な単一のITRとともに含む約0.6k
b領域を得た（ここで0.6kb領域の両側にNotI部位が隣接する）。次いで、得られ
た0.6kbフラグメントを、コスミドpRR23の唯一のNotI部位に反対方向に連結する
ことにより、コスミドpRR27およびpRR28を得た。従って、コスミドpRR27およびp
RR28は、核酸構築物中における単一のITR領域と目的のヌクレオチド配列（酵母
コスミド配列）との結合のため、本明細書中で定義するヌクレオチド組み込みベ
クターを含む。３．トランスフェクション
安定なヒト細胞株293（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションか
ら受託番号ATCC CRL1573として容易に入手可能である）を、10％のFBSおよびPen
/Strepを含むDMEMからなる培地中において約75％のコンフルエンシーで増殖させ
た。リン酸カルシウム沈殿法を用いて、約106個の培養された293細胞を、１μg
のコスミドpRR27またはpRR28（単一のAAV ITRを含む）のいずれかでとともにト
ランスフェクトした。
約106個の培養された293細胞のさらなる群を、やはりリン酸カルシウム沈殿法
を用いて、約１μgのコスミドpRR27またはpRR28、ならびにrep遺伝子(pRR5)、ま
たは、repおよびcap遺伝子(pGN1764)を含む１μgのAAVヘルパープラスミドでト
ランスフェクトした。rep含有プラスミド(pRR5)は、AAV repコード領域を含んで
いた（+145から+2942、Srivastavaら、J．Virol.(1983)45:555-564）。より詳細
には、pRR5を以下のように構築した。ApaI部位2759と3862との間の全ての配列を
、AAVプラスミドベクターpAAVSub201から欠失させた（Samulskiら(1987)J．Viro
l．61:3096-3101）。得られたプラスミドをXbaIで制限することにより、3.2kbフ
ラグメントを得た。次いで、3.2kbXbaIフラグメントをE3置換プラスミドベクタ
ーp680E3Δ（Ketnerら(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:6186-6190）のSpe
I部位に挿入することにより、pRR5構築物を得た。repおよびcap含有プラスミド
（pGN1764）は、pBSII KS-(Stratagene)のNot1部位にクローン化された、pAAV-A
d（Samulskiら、J．Virol．(1989)63:3822-3828）と同一の挿入物を含んでいた
。いずれのプラスミドもAAV ITRを含んでいなかった。DNA 単離およびPCR分析
上述のトランスフェクトされた細胞を、適切な条件下で（例えば５％CO2中37
℃で）約２日間継代した後収穫し、そして100μLのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS
)中に再懸濁した。細胞をG-DNA溶解緩衝液中にて37℃で一晩溶解した。次いで、
DNAをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出し、次い
でエタノールで沈殿させた。最終ペレットを100μLのTris-EDTA緩衝液（TE）（p
H7.5）およびRNase（10μg/ml）中に再懸濁した。
部位特異的な組み込みが起こった場合、PCRにより、一対のプライマー（一方
はAAV ITRに相補的なプライマーで、他方は第19染色体のうち好適なAAV組み込み
部位に隣接する領域に相補的であるプライマー）を用いて、検出することが可能
である。PCR増幅されたDNAを、テンプレートDNAを多くの独立な組み込み反応が
起こった細胞プールから得るため、不均一であることが予測される。さらに、こ
の領域内のAAV組み込み部位は数百塩基対にわたって広がっている。しかし、PCR
増幅産物は、AAVS1に相同な配列を含んでいるはずであり、従ってこの領域由来
のプローブにハイブリダイズするはずである。
得られたDNA調製物の２μLおよびオリゴGN97およびGN100の１μgを用いて、PC
Rを行った。オリゴGN97は、AAVS1由来のBamHI部位を含む第19染色体プローブで
あり、そしてヌクレオチド配列：5'-CGGGGAGGATCCGCTCAGAGGTACA-3'（配列番号
３）を有する。オリゴGN100は、AAV ITR（Kotinら(1992)EMBO J．11:5071-5078
）由来であり、そして以下のヌクレオチド配列：5'-CGGCCTCAGTGAGCGAGCGCGC-3'
（配列番号４）を有する。PCR反応物はまた、１×Vent ポリメラーゼ緩衝液（NE
Bから入手可能）を含有し、２mM MgSO4および１U deep vent エキソポリメラー
ゼ（NEBから入手可能）を補った。反応に用いたサイクルは、99℃を10秒間およ
び72℃を４分間の35回繰り返しであった。
次いで、ハイブリダイゼーションを以下のように実行した。ドットブロット装
置を用いて種々の反応物からの10μLアリコートをZeta-プローブ膜（Bioradから
入手可能）上にスポッティングすることによって、PCR産物を分析した。膜を約3
0分間80℃で焼き、１mM EDTA、0.25 M Na2HPO4（pH7.2）および７％SDS中65℃に
て約１時間ハイブリダイズした。用いたプローブは、AAVS1由来の300塩基のSacI
-BamHIフラグメントであった。このフラグメントを、テンプレートpRVK（AAVS1
を含有するベクター）およびプライマーGN79およびGN80を用いたPCRにより得た
。プライマーGN97は、AAVS1由来のSacI部位を含む第19染色体プローブであり、
そして以下のヌクレオチド配列：5'-ACTTTGAGCTCTACTGGCTTC-3'（配列番号５）
を有する。プライマーGN80は、AAVS1由来のBamHI部位を含む第19染色体プローブ
であり、オリゴGN97と重複する配列相同性を有する。プライマーGN80は、以下の
ヌクレオチド配列：5'-GGAGGATCCGCTCAGAGG-3'（配列番号６）を有する。プロー
ブ（Cerekov）の3,000,000 cpmを変性し、新鮮なリン酸緩衝液に加え、65℃にて
約14時間フィルターにハイブリダイズさせるために用いた。フィルターを洗浄し
、約20時間オートラジオグラフにかけた。
０から10 ngの範囲のpRVK由来DNAのアリコートを用いて、コントロールを実施
した。コントロールドットブロットを以下の表１に記載のように調整した。
培養された293細胞（コスミドpRR27またはpRR28（単一のAAV ITRを含有）のい
ずれかとのみでトランスフェクトされたか、あるいはコスミドpRR27またはpRR28
ならびにAAVヘルパープラスミド（rep遺伝子(pRR5)または、repおよびcap遺伝子
(pGN1764)のいずれかを含む）でトランスフェクトされた）から得られたPCR産物
のサンプルドットブロットハイブリダイゼーションを、以下の表２に記載のよう
に構成した。
コントロールおよびサンプルドットブロットハイブリダイゼーションの結果を
示す図３を参照して、AAV Rep発現産物の存在下、ならびにAAV RepおよびCap発
現産物の存在下の両方において、pRR27およびpRR28の両方が293細胞ゲノム中に
部位特異的に首尾よく組み込まれたことが明らかである。
このように、新規なヌクレオチド配列組み込みシステムならびに、その作成方
法および使用方法を開示する。本発明の好適な実施態様を若干詳細に説明したが
、添付の請求の範囲に規定する発明の趣旨および範囲から逸脱することなしに自
明な改変を行い得ることが理解される。