JP2003511038A

JP2003511038A - 単純化したａａｖ産生のための材料および方法

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Publication number: JP2003511038A
Application number: JP2001528615A
Authority: JP
Inventors: ヴァラヴァニドワーキ，; マーサラドナー，; ジェイミーエスコベド，; シャン−チェンチョウ，
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2003-03-25
Also published as: EP1220938A1; CA2386722A1; WO2001025464A1; AU1441400A

Abstract

(57)【要約】本発明は、精製された複製欠損組換えＡＡＶビリオンを産生するための方法を提供する。本方法は、適切な宿主細胞にＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー構築物およびアデノプラスミドアクセサリー構築物を導入する工程を包含する。アデノプラスミドアクセサリープラスミドは、アデノウイルス粒子にパッケージされ得ないアデノウイルスプラスミドＤＮＡを構成される。なぜなら、これは、パッケージングシグナル配列を欠くかまたはパッケージするためには大きすぎるさらなる配列を含むからである。宿主細胞は、粗製のｒＡＡＶビリオンを産生するために培養され、次いで、溶解される。生じる細胞溶解物は、スルホン化したセルロースを含むクロマトグラフィーカラムに適用されるか、または塩化セシウム平衡勾配遠心分離に供され、そして精製されたｒＡＡＶビリオンは回収される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（背景）（Ａ．発明の分野）本発明は、目的の遺伝子を含む組換えＡＡＶビリオンの産生のための方法に関
する。より特定すると、本発明は、野生型ＡＡＶおよびヘルパーウイルスのない
ｒＡＡＶビリオンを産生するための方法に関する。本発明は、遺伝子治療プロト
コールの評価のため、および／または遺伝子治療における使用のために適した、
高度に純粋なｒＡＡＶビリオンを産生するので、有用である。

【０００２】（Ｂ．発明の背景）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、二相性の生活環を有する、非病原性の複製
欠損パルボウイルスである。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶゲノムは
、宿主細胞のゲノムに取り込まれて、潜在性感染を確立する。ヘルパーウイルス
（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス）
の存在下では、ＡＡＶゲノムは、潜伏期間からレスキューされ、そして再生され
て、溶解性感染を確立する。Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１５８（１９９２）９７−１２９；Ｂｅｒｎ
ｓおよびＬｉｎｄｅｎ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ１７（１９９５）２３７−２４５
を参照のこと。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶ複製のために必要な機能を提供する
ことが公知である。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、ヒト染色体１
９に部位特異的に安定に取り込まれる。Ｋｏｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８７（１９９０）２２１１−１５；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＥＭＢＯ
Ｊ１０（１９９１）３９４１−５０を参照のこと。ＡＡＶゲノムは、各末端
において１４５ｂｐの逆方向末端反復を有する、４．７ｋｂの直鎖状の一本鎖Ｄ
ＮＡ分子から構成される。残りの非反復配列は、ｒｅｐおよびｃａｐと呼ばれる
、ウイルスの複製およびパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコード
する。ＡＡＶＩＴＲは、ウイルスの複製、パッケージングおよび取り込みのた
めに必要とされる、唯一のシスエレメントである；ｒｅｐおよびｃａｐの機能は
、トランスで提供され得る。ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（１
９８８）１９６３−７３；ＳａｍｕｌｓｋｉＪ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９
）３８２２−２８を参照のこと。

【０００３】組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ヒト遺伝子治療のための魅力的なビヒ
クルである。なぜなら、これらのベクターは、ＡＡＶコード配列が発現されるウ
イルスコード配列である必要がなく、ウイルス（ウイルス粒子）が分裂していな
い細胞および分裂している細胞を効率的に感染し得、広範な宿主範囲を有し、そ
してこれらのビリオンは、高い物理的安定性を有するからである。Ｃａｒｔｅｒ
，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ３（１９９２）５３３−３９；Ｂａｃ
ｈｍａｎ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ１１（１９７９）２４８−５４を参照
のこと。ｒＡＡＶ粒子を作製する最も広範に使用される方法は、感染（ｉｎｖｅ
ｎｔｉｏｎ）／トランスフェクション法と呼ばれる。この方法は、宿主細胞（代
表的には２９３細胞）の、ＡＡＶベクタープラスミド（すなわち、ＡＡＶＩＴ
Ｒにより結合された目的の遺伝子を有するプラスミド）およびヘルパープラスミ
ド（すなわち、ＡＡＶヘルパー機能ｒｅｐおよびｃａｐを提供するがＩＴＲを欠
くプラスミド）でのトランスフェクション、ならびにアデノウイルスまたはヘル
ペスウイルスでの感染を包含する。ＭｃＣｏｗｎ，ＢｒａｉｎＲｅｓ．７１３
（１９９６）９９−１０７；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６２（１
９８８）１９６３−７３を参照のこと。この標準的な方法において、ヘルパーウ
イルスは、密度勾配遠心分離によってＡＡＶベクターから分離され得、そして任
意の残りの感染性ヘルパーウイルスは、熱によって不活化され得る。しかし、得
られるＡＡＶベクター調製物は、依然として、低レベルの感染性ヘルパーウイル
スおよびタンパク質を含み得、このことは、この組成物の免疫原性に寄与し得、
そしてヒトへの投与に関する潜在的な危険性を提示し得る。また、ヘルパーウイ
ルスは、病原性ウイルスであり、そして製造プロセスに関与する実験室の人員に
対して、健康の危険性を呈する。さらに、感染プロセスの間に生成する、多量の
ヘルパーウイルス粒子およびタンパク質は、高レベルの純度を達成することを困
難にする。熱処理は、感染性アデノウイルスを不活化し得るが、この処理は、機
能的ｒＡＡＶビリオンの力価（ｔｉｅｒ）の３０〜４０％の低下をもたらし、そ
して複数ラウンドのＣｓＣｌ勾配精製によってさえも、全てのアデノウイルスタ
ンパク質を除去することは、困難である。

【０００４】近年、ｒＡＡＶのパッケージングのために必要なヘルパー機能を提供する細胞
株を使用する、ｒＡＡＶ産生の報告がなされた。例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ３（１９９６）１１２４−３２；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｈｕｍ
ａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６（１９９５）１５３１−４２；Ｃｌａｒｋ
，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６（１９９５）１３２９−４１；Ｆｌｏｔｔｅ，
ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２（１９９５）２９−３７およびＴａｍａｙｏｓｅ
，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７（１９９５）５０７−１３を参照
のこと。この方法は、同様に、感染性のアデノウイルスまたはヘルパーウイルス
の生成を導き、これらは、ｒＡＡＶ粒子から精製により除去されなければならな
い。ｒＡＡＶ粒子は、ＣｓＣｌ勾配で精製し得るが、しばしば、最終調製物は、
アデノウイルスで汚染される。また、ＣｓＣｌ勾配遠心分離プロトコールは、大
規模の製造に順応させるには、厄介である。

【０００５】ＡＡＶ産生のために必要なアデノウイルス（ヘルパーウイルス）の種々の領域
の役割を描写するアデノウイルス変異体を使用する、いくつかの研究が存在する
。アデノウイルスＤＮＡ複製遺伝子である、Ｅ２ｂ、Ｅ３およびいくつかのアデ
ノウイルス後期遺伝子はＡＡＶ複製のために必要とされないことを実証する証拠
が存在する。Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１（１９８２）８６８−８
７６；Ｍｙｅｒｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５（１９８０）６５−７５；Ｊａｙ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８（１９８１）２９２７−３１；Ｃａ
ｒｔｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２６（１９８３）５０５−１６；Ｉｔｏおよび
Ｓａｚｕｋｉ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９（１９７０）２４３−４５；Ｓｔｒ
ａｕｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７（１９７５）１４０−４８；ならびにＪａｎｉ
ｋ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６８（１９８９）３２０−２９を参照のこと。これら
の結果から、ＡＡＶ複製を支持するために必要であり得る「アクセサリー（ａｃ
ｃｅｓｓｏｒｙ）」機能として、アデノタンパク質Ｅ２ａおよびＥ４、ならびに
ＶＡＩＲＮＡが挙げられることを予測し得る。ｒＡＡＶを産生する代替の方
法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／１７４５８（１９９７年５月１５日公開）に開示さ
れている。この文献において、ｒＡＡＶビリオン産生を支持し得るアクセサリー
機能は、アデノウイルスＶＡ配列、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ６コード領域お
よび／またはアデノウイルスＥ２ａ７２ｋＤコード領域を含む１つ以上のベク
ターの形態で提供される。しかし、ｒＡＡＶビリオンの産生の際に、上記配列に
よりコードされる多数のアデノウイルスタンパク質が産生され、そして除去され
なければならない。さらに、ＷＯ９７／１７４５８に記載されるヘルパーベクタ
ーを用いるｒＡＡＶの産生は、所望ではない。なぜなら、ベクターの連続的な存
在および作動性を確認するために、周期的な検査を必要とするからである。従っ
て、当該分野において、産業的に有意なレベルのｒＡＡＶビリオンを単純かつ効
率的に産生し得る系を提供する必要性が、残っている。

【０００６】（発明の要旨）本発明は、生存アデノウイルスの産生、複数のアデノウイルスアクセサリー機
能のモニタリングの必要性、および厄介な精製プロトコールの必要性を回避する
、複製欠損ＡＶＶビリオンの産生のための方法に関する。より具体的には、本発
明は、野生型ＡＡＶおよびヘルパーアデノウイルスを実質的に含まない、複製欠
損組換えＡＡＶビリオンを産生するための方法に関し、この方法は、以下：ａ．適切な宿主細胞に、（ｉ）ＡＡＶコード配列がなく、かつ２つのＡＡＶ
ＩＴＲの間に操作可能に位置される異種遺伝子を含む、ＡＡＶベクター、（ｉｉ
）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する、複
製欠損ＡＡＶヘルパー構築物、および（ｉｉｉ）パッケージングシグナルを欠く
かまたはパッケージされ得ないようにするに十分なさらなるヌクレオチドを含む
かのいずれかであるアデノウイルスゲノム全長を有する、アデノプラスミドアク
セサリー構築物を導入して、形質転換された宿主細胞を産生する工程；ｂ．この形質転換した宿主細胞を培養して、この異種遺伝子を有する複製欠損
組換えＡＡＶビリオンを産生する工程；ならびにｃ．この培養された宿主細胞を溶解して、野生型ＡＡＶおよびアデノウイルス
粒子が実質的にない複製欠損組換えＡＡＶビリオンを得る工程、を包含する。

【０００７】本発明の方法における使用に適した宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞であり、好
ましくはヒト宿主細胞である。

【０００８】別の局面において、本発明は、精製された組換えＡＡＶビリオンを産生する方
法に関し、この方法は、以下：ａ．適切な宿主細胞に、（ｉ）ＡＡＶコード配列がなく、かつ２つのＡＡＶ
ＩＴＲの間に操作可能に位置される異種遺伝子を含む、ＡＡＶベクター、（ｉｉ
）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する、複
製欠損ＡＡＶヘルパー構築物、および（ｉｉｉ）パッケージングシグナルを欠く
かまたはパッケージされ得ないようにするに十分なさらなるヌクレオチドを含む
かのいずれかであるアデノウイルスゲノム全長を有する、アデノプラスミドアク
セサリー構築物を導入して、形質転換された宿主細胞を産生する工程；ｂ．この形質転換した宿主細胞を培養して、この異種遺伝子を有する複製欠損
組換えＡＡＶビリオンを産生する工程；ｃ．この培養された宿主細胞を溶解して、野生型ＡＡＶおよびアデノウイルス
粒子が実質的にない複製欠損組換えＡＡＶビリオンを得る工程；ｄ．工程（ｃ）の溶解物をスルホン化したセルロースを含むカラムに適用する
工程；ならびにｅ．宿主細胞タンパク質および宿主細胞の破片が実質的にない、精製された複
製欠損組換えＡＡＶビリオンを回収する工程、を包含する。

【０００９】あるいは、工程（ｃ）からの溶解物は、塩化セシウム平衡勾配遠心分離に供さ
れ、そして精製された、異種遺伝子を含む複製欠損ｒＡＡＶビリオンが回収され
る。ＡＡＶベクター、複製欠損ＡＡＶヘルパー構築物およびアデノプラスミドア
クセサリー構築物は、同時にかまたは逐次的にかのいずれかで組み合わせられる
。

【００１０】本発明の方法において利用される３連（ｔｒｉｐｌｅ）トランスフェクション
プロトコールの利点は、ＣｓＣｌ勾配精製の後の有意な純度のｒＡＡＶ調製物で
ある。ウェスタンブロット分析は、３連トランスフェクション法が、最初の溶解
物と最終の精製された製品との両方において、標準的なトランスフェクション／
感染プロトコールと当量のｒＡＡＶ粒子を産生しながら、ずっと低いアデノウイ
ルスタンパク質産生を生じることを示す。このことは、３連トランスフェクショ
ンプロトコールの、標準的な先行技術のトランスフェクション／感染プロトコー
ルより優れた利点を示し、ここで、培養物中でのアデノウイルスの有意な増幅お
よび強いアデノウイルス遺伝子発現が存在する。さらに、この実施例の方法にお
いて使用されるアデノプラスミドアクセサリー構築物は、パッケージングシグナ
ルを欠くので、精製された材料にはアデノウイルス粒子が存在しない。このプロ
トコールはまた、生存アデノウイルスの使用により引き起こされる健康および安
全の懸念を排除し、そして安全な様式でｒＡＡＶ粒子を産生することを可能にす
る。重要なことには、この方法は、下流の精製プロセスを単純化し、これによっ
て、比較的効率的かつ経済的な大規模の製造を可能にする。

【００１１】（発明の詳細な説明）第一の局面において、本発明は、野生型ＡＡＶおよびヘルパーアデノウイルス
を実質的に含まない、複製欠損組換えＡＡＶビリオンを産生するための方法に関
し、この方法は、以下：ａ．適切な宿主細胞に、（ｉ）ＡＡＶコード配列がなく、かつ２つのＡＡＶ
ＩＴＲの間に操作可能に位置される異種遺伝子を含む、ＡＡＶベクター、（ｉｉ
）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する、複
製欠損ＡＡＶヘルパー構築物、および（ｉｉｉ）パッケージングシグナルを欠く
かまたはパッケージされ得ないようにするに十分なさらなるヌクレオチドを含む
かのいずれかであるアデノウイルスゲノム全長を有する、アデノプラスミドアク
セサリー構築物を導入して、形質転換された宿主細胞を産生する工程；ｂ．この形質転換した宿主細胞を培養して、この異種遺伝子を有する複製欠損
組換えＡＡＶビリオンを産生する工程；ならびにｃ．この培養された宿主細胞を溶解して、野生型ＡＡＶおよびアデノウイルス
粒子が実質的にない複製欠損組換えＡＡＶビリオンを得る工程、を包含する。

【００１２】上記方法が、さらに以下の工程を含むことは、本発明の範囲内である：ｄ．工程（ｃ）の溶解物をスルホン化したセルロースを含むカラムに適用する
工程；ならびにｅ．宿主細胞タンパク質および宿主細胞の破片が実質的にない、精製された複
製欠損組換えＡＡＶビリオンを回収する工程。

【００１３】本発明の方法における使用に適した宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞であり、好
ましくは、ヒト宿主細胞である。

【００１４】本発明の方法の工程（ａ）の、ＡＡＶベクター、複製欠損ＡＡＶヘルパー構築
物およびアデノプラスミドアクセサリー構築物は、ウイルス学、分子生物学、微
生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用して、調製される。このよう
な技術は周知であり、そして例えば以下を含む文献に、十分に説明されている：
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＭａｎｕａｌ（現在の版）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔ
ｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（現在の版、Ｎ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（現在の版、Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ
．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎ（現在の版、Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；ＣＲＣ
ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ編
）；ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄ
ｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，第１巻（Ｎ．Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ編）。これ
らの刊行物および本明細書全体にわたって参照される他の全ての刊行物は、明白
に、本明細書中に参考として援用される。

【００１５】遺伝子移入、遺伝子治療または遺伝子送達とは、宿主細胞に異種もしくは外来
のＤＮＡまたは通常は発現されないＤＮＡを確実に挿入するための、方法、技術
またはシステムをいう。生じる挿入は、宿主細胞ゲノムＤＮＡへの移入された遺
伝物質の取り込み、移入されたレプリコンの染色体外複製および発現、または取
り込まれない様式により得る。

【００１６】ベクターとは、適切なコントロールエレメントと会合する場合に複製し得、そ
して細胞間でＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を移動させ得る、任意の遺伝エレメン
トを意味する。例としては、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド
、染色体、ウイルス、およびビリオンが挙げられ、クローニングビヒクルおよび
発現ビヒクルならびにウイルスベクターを含む。

【００１７】本発明の方法によって産生される、複製欠損ＡＡＶビリオンは、一対のアデノ
随伴ウイルス逆方向末端反復（「ＡＡＶＩＴＲ」）間に作動可能に位置する治
療タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含む。ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ
ゲノムの各末端において見出される、当該分野で認識された領域であり、これら
は、ＤＮＡ複製のためおよびＡＡＶコートにＡＡＶベクターをパッケージングす
るための認識シグナルとして、シスで一緒に機能する。種々のＡＡＶ血清型（す
なわち、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−７）に対するＡＡＶＩＴＲ領域のヌクレオチド
配列は、当該分野において公知であり、そして血清型とともに大きさが変動する
。代表的に、ＡＡＶＩＴＲは、大きさが約１２５〜１４５ｂｐの範囲である。
例えば、Ｋｏｔｉｎ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５（１９９４）
６９３−８０１およびＢｅｒｎｓ「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅａｎｄｔｈｅ
ｉｒＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，
第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。本
明細書中において使用される場合に、本出願人らの組換え複製欠損レトロウイル
スのＡＡＶＩＴＲは、ネイティブな、すなわち野生型の配列のヌクレオチド配
列と同一である必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更
され得る。さらに、２つのＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶの血清型の任意のもの（例
えば、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ５およびＡＡ
Ｖ−７）に由来し得、そしてＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合
に、これらがレシピエント細胞ゲノムへの目的の異種配列の組み込みを可能にす
る限り、同一である必要も同じ血清型に由来する必要もない。

【００１８】ＡＡＶｒｅｐコード領域は、ウイルスゲノムの複製および潜在性感染の間の
宿主ゲノムへのウイルスゲノムの挿入のために必要とされるタンパク質をコード
する、ＡＡＶゲノムの当該分野において認識されている領域である。ｒｅｐコー
ド領域は、２つの長い形態のｒｅｐ（ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８）ならびに２
つの短い形態のｒｅｐ（ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０）をコードする、少なくと
も４つの遺伝子を含む。より詳細には、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５８（１９９２）９７−１
２９およびＫｏｔｉｎ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５（１９９４
）７９３−８０１を参照のこと。ｒｅｐコード領域は、任意のＡＡＶ血清型また
は機能的ホモログ（例えば、ヒトヘルペスウイルス６ｒｅｐ遺伝子）に由来し得
る。この領域は、適切なレシピエント細胞において発現される場合に存在する配
列が十分な取り込みを提供する限り、ネイティブな配列の全てを含む必要はなく
、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、変更され得る。好ましくは、
本発明において利用されるＡＡＶベクターおよびビリオンは、１つ以上のｒｅｐ
タンパク質を欠き、これによって複製欠損にする。より好ましくは、本発明のＡ
ＡＶベクターは、４つ全てのｒｅｐタンパク質を欠く。

【００１９】ＡＡＶｃａｐコード領域は、ウイルスゲノムをパッケージするカプシドまた
はコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする、ＡＡＶゲノム
の当該分野において認識された領域である。より詳細には、例えば、Ｍｕｚｙｃ
ｚｋａ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５８（
１９９２）９７−１２９およびＫｏｔｉｎ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａ
ｐｙ５（１９９４）７９３−８０１を参照のこと。ｃａｐコード領域は、任意
のＡＡＶ血清型または機能的ホモログに由来し得る。ｃａｐコード領域は、適切
なレシピエント細胞において発現される場合に存在する配列が十分な取り込みを
提供する限り、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、変更され得る。
ｃａｐコード領域は、好ましくは、本発明において使用されるＡＡＶベクターお
よび複製欠損ＡＡＶビリオンに含まれないが、ＩＴＲおよびこれらの間に位置す
る遺伝子を認識およびパッケージするパッケージング細胞において発現される、
ヘルパーベクターに含まれる必要がある。

【００２０】従って、本明細書中で使用される場合、用語「ＡＡＶベクター」とは、アデノ
随伴ウイルス血清型由来のベクターを意味し、このベクターは、少なくとも、複
製およびパッケージングのためにシスに（ｉｎｃｉｓ）必要とされる配列（例
えば、異種（すなわち、非ＡＡＶ）ヌクレオチド配列に隣接する、機能的ＩＴＲ
対）を含む。この基準内では、任意の血清型の任意のＡＡＶが、本発明の方法に
おいて使用され得る。本発明における使用のためのベクターの例は、ＡＡＶ−２
ベースのベクター（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０９２３
９に開示される）または単にＡＡＶ−７ＩＴＲの対（これは、その間に１つ以
上の遺伝子が作動可能に配置される）である。

【００２１】本発明のベクターおよびビリオンにおいて使用されるＡＡＶＩＴＲは、ネイ
ティブ（野生型）ＡＡＶＩＴＲであり得るか、またはそれらは、改変され得る
。ＩＴＲが改変されている場合、これらは、好ましくは、そのＤ配列で改変され
る。ＡＡＶＩＴＲのネイティブＤ配列は、ＨＰ形成において関与しない各ＡＡ
ＶＩＴＲにおける２０個連続するヌクレオチドの配列（すなわち、各末端に１
つの配列が存在する）である。ＩＴＲのＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって
改変され得、その結果、５〜１８個のネイティブヌクレオチド、好ましくは、１
０〜１８個のネイティブヌクレオチド、最も好ましくは、１０個のネイティブヌ
クレオチドが保持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドは、欠失されるかま
たは非ネイティブ（すなわち、外因性）ヌクレオチドで置換される。保持される
５ネイティブヌクレオチドの好ましい配列の１つは、５’ＣＴＣＣＡ３’であ
る。外因性または非ネイティブの置換ヌクレオチドは、その同じ位置でネイティ
ブＤ配列に見い出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。例
えば、ネイティブＤ配列ヌクレオチドＣに対する適切な置換ヌクレオチドは、Ａ
、ＴおよびＧであり、そしてネイティブＤ配列ヌクレオチドＡに対する適切な置
換ヌクレオチドは、Ｔ、ＧおよびＣである。４つのこのようなＡＡＶベクターの
構築が、米国特許出願番号０８／９２１，４６７（１９９７年９月２日出願）に
開示される。他の使用可能な例示的なベクターは、ｐＷＰ−１９およびｐＷＮ−
１であり、これらは両方とも、Ｎａｈｒｅｉｎｉ、Ｇｅｎｅ１２４（１９９３
）２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕ
ｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）３０９６に開
示される）である。

【００２２】他の適切なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−ＤＩＴＲベクターである。Ｄ
ｏｕｂｌｅ−ＤＩＴＲベクターを作製するための方法は、米国特許第５，４７
８，７４５号に開示される。さらに他の適切なＡＡＶベクターは、米国特許第４
，７９７，３６８号（Ｃａｒｔｅｒ）、米国特許第５，１３９，９４１号（Ｍｕ
ｚｙｃｚｋａ）、米国特許第５，４７４，９３５号（Ｃｈａｒｔｅｊｅｅ）およ
びＰＣＴとっきょしゅつがんＷＯ９４／２８１５７（Ｋｏｔｉｎ）に開示される
ＡＡＶベクターである。本発明の方法において使用可能なＡＡＶベクターのなお
さらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、α−フェトプロテ
イン（ＡＦＰ）エンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓
において優性に単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の発現を指向する
。その構造および作製するための方法は、Ｓｕ、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅ
ｒａｐｙ７（１９９６）４６３−４７０に開示される。

【００２３】複製欠損ＡＡＶベクターは、本発明の方法において使用される複製欠損ＡＡＶ
ビリオンヘルパーウイルスを産生するために、空のＡＡＶカプシド内にパッケー
ジングされる。代表的に１以上の遺伝子がＩＴＲの対の間に配置されている、複
製欠損ＡＡＶベクターをパッケージングするために、ＡＡＶ複製を可能にするよ
うにトランスで（ｉｎｔｒａｎｓ）機能するＡＡＶ由来コード配列を有しそし
てＡＡＶｒｅｐ配列およびｃａｐ配列を含む、ヘルパー構築物またはヘルパー
ウイルスを使用する。このヘルパーウイルスは、ＡＡＶコード配列を有するが、
ＡＡＶＩＴＲを欠失し、従って、産生されるカプシドにパッケージングされな
い。次いで、このヘルパーウイルスは、このＡＡＶベクターに存在しないＡＡＶ
ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供する。例示的ＡＡＶヘ
ルパー構築物を含む、さらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９）３８２２−２８；ＭｃＣａｒｔｙ，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ６５（１９９１）２９３６−４５および米国特許第５，１３９，９４１を
参照のこと。１つのこのようなＡＡＶヘルパー構築物としては、ｐＫＳｒｅｐ
／ｃａｐが挙げられ、これは、ＡＡＶ−２のｒｅｐおよびｃａｐポリペプチド配
列をコードする遺伝子を含む。使用され得るヘルパーウイルス、ヘルパー構築物
およびヘルパー機能のさらなる例としては、プラスミドｐＡＡＶ／Ａｄおよびｐ
ＩＭ２９＋４５（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１９８９）３８２
２−２８およびＭｃＣａｒｔｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６５（１９９１）２９３６−
４５を参照のこと）および米国特許第５，６２２，８５６号に開示されるものが
挙げられる。

【００２４】アクセサリー機能およびアクセサリー機能ベクターは、非ＡＡＶ由来の機能お
よびベクターであり、これらは、ＡＡＶがその複製のために依存するような機能
をコードする配列を含む。このようなアクセサリー機能は、任意の公知のヘルパ
ーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイル
ス１型を除く）およびワクシニアウイルス）から誘導または獲得され得、そして
、遺伝子転写の活性化、ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成およびカプシド構築
に関与する部分および／または配列を含む。例えば、Ｃａｒｔｅｒ、「Ａｄｅｎ
ｏ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＨｅｐｌｅｒＦｕｎｃｔｉｏｎｓ」
、ＣＲＣｈａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、第Ｉ巻（１９
９０）（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐ
ｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５８（１９９２）９７−１２９；Ｊａｎ
ｉｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ７８（１９８１）１９２５−２
９；Ｙｏｕｎｇ，Ｐｒｏｇ．ＭｅｄＶｉｒｏｌ．２５（１９７９）１２１３お
よびＳｃｈｌｅｈｏｆｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５２（１９８６）１１０−１
７を参照のこと。

【００２５】本発明の方法において使用されるアデノプラスミドアクセサリー構築物として
は、アデノウイルス粒子内にパッケージングされることを不可能にされた、アデ
ノウイルスプラスミドＤＮＡが挙げられ、例えば、このアデノプラスミドアクセ
サリー構築物は、感染性アデノウイルス粒子の産生に必要とされるアデノウイル
スパッケージングシグナルを欠失するが、ｒＡＡＶビリオン産生に必要されるア
デノウイルス遺伝子を含む。あるいは、アデノプラスミドアクセサリー構築物は
、さらなる異種配列、プラスミドまたは他の構築物によって、パッケージングさ
れないような大きさにされる。このようなアデノプラスミドアクセサリー構築物
の使用は、先行技術の方法と比較して、類似の感染活性およびパッケージング効
率を有するｒＡＡＶビリオンの生成を生じる。

【００２６】１つのこのような構築物としては、血清型５アデノウイルスのＤＮＡ配列の全
てを含むが、塩基対１９４〜３９８との間にある血清型５パッケージングシグナ
ルを欠失する、アデノウイルス５型プラスミドが挙げられる。Ｈｅａｒｉｎｇお
よびＳｈｅｎｋ、Ｃｅｌｌ３３（１９８３）６９５−７０３；Ｈｅａｒｉｎｇ
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）２５５５−５８；ＧｒａｂｌｅおよびＨｅ
ａｒｉｎｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（１９９０）２０４７−５６；Ｇｒａｂｌｅ
およびＨｅａｒｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（１９９０）７２３−３１を参照
のこと。代替的な構築物としては、血清型２アデノウイルスのＤＮＡ配列の全て
を含むが、類似の位置にある血清型２パッケージングシグナルを欠失する、アデ
ノウイルス２型プラスミドが挙げられる。同様に、任意の他のアデノウイルス血
清型を含む構築物が、そのパッケージングシグナルが除去されている限り、使用
され得る。使用され得る例示的な血清型としては、血清型Ａｄ１、Ａｄ６、Ａｄ
８、Ａｄ９、Ａｄ１０、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、
Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａ
ｄ２７、Ａｄ２８、Ａｄ２９、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６７、Ａ
ｄ３７、Ａｄ３８、Ａｄ３９、Ａｄ４０、Ａｄ４１およびＡｄ４２が挙げられる
。ＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ，２（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ編）１
９９０を参照のこと。

【００２７】別のこのような構築物としては、異種配列を含み、この異種配列がプラスミド
を大きくしてパッケージングされなくする、アデノウイルス５プラスミドが挙げ
られる。例えば、アデノウイルス５配列における塩基対（ｂｐ）１３３９（３．
７ｍｕ）でのプラスミドｐＢＲ３２２またはその誘導体のうちの１つの挿入は、
この得られるウイルスゲノムを大きくしてパッケージングされなくする。Ｂｅｔ
ｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）８８０２−０６
およびＭｃＧｒｏｒｙ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６３（１９８８）６１４−１７を
参照のこと。代替的な構築物としては、血清型２アデノウイルスのＤＮＡ配列の
全てを含むが、類似の位置でｐＢＲ３２２の挿入を含む、アデノウイルス２型プ
ラスミドが挙げられる。同様に、任意の他のアデノウイルス血清型を含む構築物
が、その構築物がパッケージングされないような大きさにされる限り、使用され
得る。使用され得る例示的な血清型としては、Ａｄ１、Ａｄ６、Ａｄ８、Ａｄ９
、Ａｄ１０、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、
Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２７、Ａ
ｄ２８、Ａｄ２９、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６７、Ａｄ３７、Ａ
ｄ３８、Ａｄ３９、Ａｄ４０、Ａｄ４１およびＡｄ４２が挙げられる。Ｆｉｅｌ
ｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ，２（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ編）１９９０を参
照のこと。

【００２８】アデノプラスミドアクセサリー構築物は、代替的に、ネイティブアデノウイル
ス配列を置換する、そのネイティブ配列と実質的に同一の機能を有する１以上の
ポリヌクレオチド相同体を含み得る。このような相同体は、異なるアデノウイル
ス血清型に由来し得るか（なぜなら、アデノウイルス５型ゲノムのヌクレオチド
配列は、アデノウイルス２型ゲノムに９９％相同であると考えられるからである
）、別のアクセサリーウイルスまたは別の適切な供給源に由来し得る。

【００２９】アデノプラスミドは、適切な制御エレメントと結合された場合に複製可能であ
りかつ宿主細胞中で転写および発現され得る、環状または直線状のＤＮＡフラグ
メントの形態であり得る。これは、従来の組換え技術を使用して操作され得る。
例えば、アデノプラスミドは、アクセサリー機能を有するアデノウイルスヌクレ
オチド配列（これは、アデノウイルスゲノムに由来するか、アデノウイルスベク
ターに由来するか、または化学合成されたかのいずれかである）を、任意の所望
の順序でベクター構築物に挿入する（例えば、ポリリンカーオリゴヌクレオチド
を使用して、このプラスミドに制限フラグメントを連結させることによって）こ
とによって、構築され得る。次いで、この配列は、当該分野で周知の技術を使用
して、ベクターから切り出され得、そして適切な発現プラスミドに挿入され得る
。本実施例で使用されるこのような１つの構築物としては、プラスミドｐＢＨＧ
１０が挙げられ、これは、２９３細胞のトランスフェクションに際して感染性ウ
イルスを産生するのに必要とされるＡｄ５配列を含むが、ウイルスＤＮＡをカプ
シド化するのに必要とされるパッケージングシグナル（塩基対１９４〜３５８）
を欠失する（なぜなら、これは、塩基対１８８〜塩基対１３３９（０．５から３
．７ｍｕ）のＡｄ５配列を欠失しているからである）、細菌プラスミドである。
アンピシリン耐性遺伝子および細菌の複製起点は、その欠失されたＡｄ５配列に
置き換わり、そしてこのプラスミドはまた、Ａｄ５Ｅ３領域（７８．３から８
５．８地図単位（ｍｕ））を欠失する。この構造およびこの構築の詳細は、Ｂｅ
ｔｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）８８０２−０
６に記載される。これは、ＭｉｃｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．
，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手可能である。

【００３０】利用され得る他のアデノプラスミド構築物には、プラスミドｐＢＧ１１が含ま
れ、これは、２９３細胞にトランスフェクトされた場合、非感染性である。なぜ
なら、それは、ｐＢＨＧ１０と、Ａｄ５パッケージングシグナル配列の同じ欠失
を含むが、７７．５から８６．２ｍｕのＡｄ５Ｅ３領域を欠失するからである
。その構造およびその構築物の詳細は、Ｂｅｔｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）８８０２−０６に記載される。本発明において使
用を意図される別の例示的なアデノプラスミド構築物は、ｐＪＭ１７である。構
築物ｐｊＭ１７は、そのアデノウイルス５配列における塩基対（ｂｐ）１３３９
（３．７ｍｕ）でプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体のインサートを含有し、これ
は、得られるウイルスゲノムを、パッケージングのためには大きすぎるものにす
る。Ｂｅｔｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）８８
０２−０６およびＭｃＧｒｏｒｙ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６３（１９８８）６１
４−１７を参照のこと。構築物ｐＪＭ１７は、ｐＦＧ１４０（Ｇｒａｈａｍ、Ｅ
ＭＢＯＪ３（１９８４）２９１７−２２）に由来し、その結果、ｐＪＭ１７
を用いて生成したベクターはまた、ベクターｄｌ３０９に存在するように、その
Ａｄ５配列のＥ３領域に存在する同じ欠失（単数または複数）および置換（単数
または複数）を含有する（Ｊｏｎｅｓ、Ｃｅｌｌ１７（１９７９）６８３−８
９を参照のこと）。

【００３１】アデノプラスミドにおけるアデノウイルス遺伝子領域は、その転写または発現
を指向する制御配列に作動可能に連結している。このような制御配列は、野生型
アデノウイルス遺伝子の遺伝子領域と結合したアデノウイルス制御配列を含み得
るか、または哺乳動物またはウイルス遺伝子に由来する異種プロモーターのよう
な異種制御配列を含み得る。例示的な異種プロモーターには、相同なアデノウイ
ルスからの（すなわち、異なるアデノウイルス血清型からの）アデノウイルスプ
ロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＲＴプロモータ
ー；アデノウイルス主要後期プロモーター；単純ヘルペスウイルスプロモーター
、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、合成
プロモーターもしくはハイブリッドプロモーターが含まれる。このようなプロモ
ーターは、市販されている。

【００３２】アデノプラスミドアクセサリー構築物はまた、１つ以上の選択マーカーを含み
得る。適切なマーカーは、適切な選択培地において増殖した場合、抗生物質耐性
または感受性を付与するか、色を与えるか、またはトランスフェクト細胞の抗原
性特性を変化させる配列である。例示的な選択マーカーには、ハイグロマイシン
Ｂ耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子が含ま
れる。他の適切なマーカーは、当該分野で周知である。

【００３３】あるいは、適切な宿主細胞は、必要なアクセサリー機能の１つ以上を提供し得
る。例えば、ヒト２９３細胞株は、それがアデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺
伝子を発現するように、５型アデノウイルスＤＮＡフラグメントで形質転換され
ているヒト胎児腎臓細胞株である。したがって、１つの実施形態において、パッ
ケージングシグナルならびにＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子領域を欠失するアデノプ
ラスミドが提供される。２９３宿主細胞へのトランスフェクションの際に、アデ
ノプラスミドは、感染性のアデノウイルス粒子の形成なしに、ｒＡＡＶビリオン
産生を支持するアクセサリー機能を提供する。

【００３４】本発明のアデノプラスミドは、ｒＡＡＶビリオンの産生のための方法に利用さ
れ得る。１つのこのような方法は、適切な宿主細胞に、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ
ヘルパー構築物およびアデノプラスミドアクセサリー構築物を、宿主細胞に導入
する工程を包含する。アデノプラスミドアクセサリープラスミドは、パッケージ
ングシグナル配列を欠くアデノウイルスプラスミドＤＮＡから構成される。宿主
細胞は、粗ｒＡＡＶビリオンを生成しそして溶解するために培養される。得られ
る細胞溶解物を、クロマトグラフィーカラムにかけるか、または塩化セシウム密
度勾配にかけ、そして精製したｒＡＡＶビリオンをカラムから回収する。

【００３５】本発明の複製欠損ＡＡＶベクターおよびビリオンに挿入された異種ヌクレオチ
ド配列は、治療タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＲＮＡもしくはリボザ
イムまたはそれらの組み合わせを含む１つ以上の治療剤をコードする。代表的に
は、ベクターもしくはビリオンは、レシピエント細胞に対して天然または非天然
であるが、所望の生物学的もしくは治療的効果を有する１つから２つまでの治療
剤を含有する。

【００３６】上記のように、本発明の複製欠損ＡＡＶベクターおよびビリオンに導入された
異種ヌクレオチド配列は、治療タンパク質もしくはポリペプチド、好ましくは、
ヒトタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を含む。本発明の方法に
おける発現のために適切な治療的タンパク質およびポリペプチドの例には、ＬＤ
Ｌレセプター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フェニルアラニンヒドロキシラー
ゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、またはα１アンチトリプシン；サイト
カイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−
４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−
１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３．ＩＬ−１４、およびＩＬ−１５、αインターフ
ェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、腫瘍壊死因子ＣＤ３、ＩＣ
ＡＭ−１、ＬＦＡ−１、またはＬＦＡ−３、ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ１αまた
はＭＩＰ−１β（Ｃｏｃｃｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ７０（１９９６）を参照）を含
む））；コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭ−Ｃ
ＳＦ）；成長因子（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）；ヒトホルモン（例えば、成
長ホルモン、インスリン、カルシトニン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、黄
体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、または甲状腺刺激ホルモン）；肝炎遺
伝子のうちの任意のもの；トロンボポエチン、エリスロポエチン、またはレプチ
ン、あるいは上記の組み合わせが含まれる。これらのタンパク質およびポリペプ
チドのヌクレオチドコード配列は、すでに当該分野で公知である。本発明の方法
および組成物において発現可能なさらに多くの配列には、プロテインＳおよびＧ
ａｓ６、トロンビン、Ｘａ凝固因子、酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、
塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＴＧＦ、血
小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈ
ＧＦ）、およびＨＧＦ活性化因子、ＰＳＡ、神経細胞増殖因子（ＮＣＧＦ）、グ
リア細胞由来神経成長因子（ＧＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ａｒ
ｇバソプレシン、甲状腺ホルモンアゾキシメタン（ｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏ
ｎｅｓａｓｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ）、トリオドサイロニン（ｔｒｉｏｄｏｔｈ
ｙｒｏｎｉｎｅ）、ＬＩＦ、アンフィレグリン、可溶性トロンボモジュリン、肝
細胞因子、骨形成タンパク質１、骨形態形成タンパク質、ＭＦＧ、ＭＧＳＡ、ヘ
レグリン、およびメラノトロピンが含まれる。好ましいタンパク質には、エリス
ロポエチン、トロンボポエチン（Ｇ−ＣＳＦ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、
第Ｘａ因子、ヒト成長ホルモン、レプチン、およびＩＬ−２が含まれるが、これ
らに限定されず、これらのＤＮＡ配列、特にヒトＤＮＡ配列は、当該分野ですべ
て公知である。

【００３７】ＡＡＶベクターはまた、プロモーターおよびポリアデニル化部位のような制御
配列、選択マーカー、レポーター遺伝子、エンハンサーおよび転写の誘導および
／または選択を可能にするその他の制御エレメントを含み得る。このようなＡＡ
Ｖベクターは、当該分野で周知の技術を使用して構築し得る。

【００３８】複製欠損ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶビリオンの産生に必要である遺伝子
（特に、ｃａｐ構造遺伝子）を提供することによってＡＡＶベクターを相補する
ために使用される。相補的な機能を有する適切なヘルパー構築物は、当該分野で
周知である。

【００３９】ＡＡＶベクター、複製欠損ＡＡＶヘルパー構築物、およびアデノプラスミドア
クセサリー構築物は、同時にかまたは逐次的に、任意の周知の当該分野で認識さ
れたトランスフェクション技術を使用して（例えば、リン酸カルシウム共沈によ
り）、宿主細胞中に導入される。培養条件には、３５〜４０℃の範囲で、約４８
〜１２０時間、インキュベートすることを含む。その細胞を収集し、そして溶解
物を、３回の凍結解凍サイクルおよび／または超音波処理を使用して生成する。
次いで、その溶解物を遠心分離して、細胞破片を除去し、そしてｒＡＡＶビリオ
ンを塩化セシウム平衡勾配遠心分離によって精製する。任意の残渣のアデノウイ
ルス粒子を、精製ｒＡＡＶ調製物を少なくとも５６℃まで２０〜３０分間加熱す
ることによって不活化する。あるいは、ｒＡＡＶビリオンは、Ｔａｍａｙｏｓｅ
、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７（１９９６）５０７−５１３に記
載されるプロトコールに従って、スルホン化セルロースカラムクロマトグラフィ
ーによって精製し得る。

【００４０】上記に提供される記載の実施例は、以下に提供される。

【００４１】（実施例１：ＡＡＶベクターｐＣＭＶＡＡＶ−ｌａｃＺ、ヘルパープラスミド
ＰＫＳｒｅｐ／ｃａｐおよびアデノウイルスプラスミドｐＪＭ１７、ｐＢＨＧ１
０およびｐＢＨＧ１１の構築）ベクターｐＫｍ２０１ＣＭＶは、ＣＭＶ最初期エンハンサー、プロモーターお
よびイントロンを含む発現カセットならびにウシ成長ホルモンポリアデニル化部
位がＡＡＶ−２ＩＴＲに隣接されるクローニングベクターである。ｐＫｍ２０
１ＣＭＶは、改変されたＡＡＶベクタープラスミドであるｐＫｍ２０１由来であ
って、ここでｐＥＭＢＬ−ＡＡＶ−ＩＴＲ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９８９）
）のアンピシリン耐性遺伝子がカナマイシン耐性についての遺伝子と置換された
。ｐＣＭＶ６ｃ（Ｃｈａｐｍａｎ（１９９１））の誘導体であるｐＣＭＶｌｉｎ
ｋ由来の発現カセット（ここで、ｂＧＨポリＡ部位はＳＶ４０終止部位に置換さ
れた）を、ｐＫｍ２０１のＩＴＲの間に挿入してｐＫｍ２０１ＣＭＶＬＩＮＫを
作製した。ｐＣＭＶＡＡＶ−ｌａｃＺを構築するために、ｌａｃＺｃＤＮＡ配
列を、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏＣＡ）
から切除してｐＫｍ２０１ＣＭＶＬＩＮＫに挿入した。プラスミドｐＫｍ２０１
ＣＭＶＬＩＮＫは、ＡＴＣＣに（受託番号９８３３５として）寄託されたベクタ
ーｐＡＡＶ−ＴＫ−ＭＣＳＦａに同一の骨格を有する。

【００４２】ＡＡＶヘルパープラスミドであるｐＫＳｒｅｐ／ｃａｐを、ＩＴＲを伴わない
ＡＡＶ−２ゲノムをクローニングすることによって（すなわち、ＡＡＶ−２のヌ
クレオチド１９２〜４４９３（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５（
１９８３）５５５−６４を参照のこと）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋
（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）に）構築した。

【００４３】アデノウイルスプラスミドｐＪＭ１７、ｐＢＨＧ１０およびｐＢＨＧ１１は、
Ｂｅｔｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）８８０２
−０６に記載される。プラスミドｐＪＭ１７は、ヒト胚性腎細胞（２９３細胞）
にトランスフェクトした場合、非感染性（複製欠損）であるアデノウイルスプラ
スミドである。なぜなら、これは、そのアデノウイルス−５配列に塩基対（ｂｐ
）１３３９（３．７ｍｕ）において、生じるウイルスゲノムをパッケージするに
は大きすぎるようにするプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体の挿入を含むからであ
る。プラスミドｐＢＨＧ１０は、２９３細胞にトランスフェクトした場合に非感
染性である、アデノウイルス−５プラスミドである。なぜなら、これは、ｂｐ１
８８〜ｂｐ１３３９（０．５〜３．７ｍｕ）のアデノウイルス５型（Ａｄ５）配
列の欠失（これは、アデノウイルスＤＮＡをカプシド化するに必要なパッケージ
ングシグナル（ｐｓｉ）を除去する）を含むからである。アンピシリン耐性遺伝
子（Ａｐ）および細菌性複製起点（Ｏｒｉ）は、欠失した（ｂｐ１８８〜ｂｐ１
３３９）Ａｄ５配列を代用する。このプラスミドはまた、Ａｄ５Ｅ３領域（７
８．３〜８５．８ｍｕ）を欠失する。プラスミドｐＢＨＧ１１は、２９３細胞に
トランスフェクトした場合に感染性である、Ａｄ５プラスミドである。なぜなら
、これは、ｂｐ１８８〜ｂｐ１３３９（０．５〜３．７ｍｕ）のＡｄ５配列の欠
失（これは、アデノウイルスＤＮＡをカプシド化するに必要なパッケージングシ
グナル（ｐｓｉ）を除去する）を含むからである。アンピシリン耐性遺伝子（Ａ
ｍｐ’）および細菌性複製起点（Ｏｒｉ）は、欠失したＡｄ５配列を代用する。
このプラスミドはまた、Ａｄ５Ｅ３領域（７７．５〜８６．２ｍｕ）を欠失す
る。

【００４４】（実施例２：３連トランスフェクションによるｒＡＡＶ粒子の作製）本発明の３連トランスフェクション法による複製欠損ｒＡＡＶ粒子（ビリオン
）の作製について、Ｚｈｏｕ（１９９４）に開示されるプラスミドの一過性のト
ランスフェクションプロトコールを、一部改変して従った。受託番号ＣＲＬ１５
７３でＡＴＣＣから入手可能なヒト胚性腎細胞（２９３細胞）（またＧｒａｈａ
ｍ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（ｄａｔｅ）５９−７２を参照のこと）を、
１０％ウシ胎仔血清を含む、滅菌したＩＭＤＭ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ
，ＭＡ）中で、３７℃にて５％ＣＯ₂中で増殖した。一旦、細胞が、１５ｃｍデ
ィッシュ上で６０〜７０％コンフルエントに達したら、これらの細胞をＡＡＶベ
クター、複製欠損ＡＡＶヘルパープラスミドおよびアデノウイルスプラスミドを
含む混合物で、リン酸カルシウム同時沈降法によって、３連トランスフェクトし
た。特に、１０μｇのＡＡＶベクタープラスミドの混合物、１０μｇの複製欠損
ＡＡＶヘルパープラスミドおよび２０μｇのアデノプラスミドｐＢＨＧ１０を、
２．５ｍｌの２５０ｍＭＣａＣｌ₂に添加して、そして２．５ｍｌの２×ＨＢ
Ｓ（Ｊｏｒｄａｎ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４（１９９６）５
９６−６０１）と混合した。沈殿物を、８時間細胞上に放置し、そして１０％ウ
シ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む新鮮なＩＭＤＭ培地と置換した。トランスフェクシ
ョンの２４、４８、７２、９６および１２０時間後、細胞を、Ｈｅｐｅｓ緩衝液
（２．５ｍｌ／ディッシュ）で収集し、そして３回の凍結融解サイクルによって
溶解した。この細胞溶解物を、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞破
片を除去した。パッケージングされたＡＡＶ粒子を、２回の塩化セシウム平衡勾
配遠心分離を通じて精製し、そして残存したアデノウイルス粒子を、５６℃で３
０分間の熱処理によって不活性化した。あるいは、パッケージされたＡＡＶ粒子
を、Ｔａｍａｙｏｓｅ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７（１９９６
）５０７−１３に記載されるように、スルホン化セルロースカラムクロマトグラ
フィーによって精製する。

【００４５】別のセットのトランスフェクションは、アデノプラスミドＤＮＡを使用しない
ことを除いて同一のプロトコールに関し；代わりに、トランスフェクションの８
時間後に、細胞を、感染の多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）（ＭＯＩ）が２
であるアデノウイルスｄｌ３１２で、感染した。アデノウイルスｄｌ３１２は
、Ｅ１ａ遺伝子において欠失を有し、そしてアデノウイルス配列の左末端（ｌｅ
ｆｔ−ｅｎｄ）で形質転換された２９３細胞において増殖される。これは、Ｅ１
ａ転写物およびＥ１ｂ転写物を発現する。ＭｏｒａｎＣｅｌｌ４８（１９８
７）１７７−７８を参照のこと。形質転換された細胞を、感染７２時間後に収集
し、そして上記のように精製した。

【００４６】産生されたベクター粒子の総数の概数について、精製されたベクターストック
を、ＤＮＡｓｅＩで処理して、そしてカプシド化したＤＮＡを、フェノール−
クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿し、そしてＮａｈｒｅｉｎｉおよびＳ
ｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｉｏｌｏｇｙ３０（１９８９）７４−
８５に記載されるように、ドットブロット分析に供した。次いで、２９３細胞を
、ベクターストックの連続希釈物で感染した。陽性細胞を計数し、そして機能的
な力価を評価した。野生型ＡＡＶ試験について、ｒＡＡＶストックを、連続的に
希釈し、そして２９３細胞（２×１０⁵）を、ＭＯＩ２でのＡｄとともに感染し
た。３日後に、細胞を収集し、３回の凍結融解サイクルで溶解し、そして細胞破
片を遠心分離によって除去した。上清を、１０分間にわたって熱不活性化し、新
鮮な２９３細胞（６×１０⁶）を、ＭＯＩ２でのＡｄの存在下で感染した。感染
の４８時間後、低分子量ＤＮＡを、Ｈｉｒｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（１
９６７）３６５−６９の方法に従って単離し、アガロースゲル上に分画し、そし
てナイロン膜に転写した。ブロットを、ＡＡＶカプシド領域に特異的なビオチン
化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。ＡＡＶカプシドＤＮＡに
ついて陽性シグナルを示すベクターストックの最大希釈に基づいて、力価を報告
した。

【００４７】調製物中のアデノタンパク質およびＡＡＶタンパク質の量をウエスタンブロッ
ト分析によって可視化するために、粗製溶解物および最終調製物（５μｌ（総量
の０．００８％）の凍結融解溶解物および５μｌ（総量の０．５％）の最終調製
物）からのアリコートを、１０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上で電気泳動し、そしてニトロセルロース上に電気的にブ
ロットした。これらのブロットを、ＡＡＶカプシドタンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体（ＡＲＰＩｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＭＡ）およびヤギ抗マウスＩ
ｇＧＨＲＰ結合体（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍ
ｏｎｄ，ＣＡ）か、アデノウイルス５型に対するポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ
，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧＨＲＰ結合体かのいずれかでプ
ローブした。シグナルを、化学発光検出キット（ＥＣＴＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，
Ｂｕｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ）を使用して検出
した。

【００４８】アデノウイルスタンパク質のウエスタンブロット分析の結果は、以下である。
レーン１、これは、標準的プロトコールからの粗製調製物（総量の０．００８％
）を含み、約２９ｋＤ〜１４０ｋＤを超えて広がる広範囲のタンパク質のスミア
を示した。同様の試験条件下で、レーン２、これは、３連トランスフェクション
プロトコールからの粗製調製物（０．００８％）を含み、非常に低いレベルのア
デノタンパク質を示した。アデノウイルスタンパク質夾雑物について分析した場
合、精製されたＡＡＶ産物は、標準プロトコールにおいてなおいくつかのアデノ
タンパク質夾雑物を示した（レーン３）が、本発明の３連トランスフェクション
プロトコールは、検出可能なアデノタンパク質の夾雑物を有さなかった（レーン
４）。アデノウイルス夾雑物試験について、サンプルを希釈して、そして５０％
コンフルエントな２９３細胞（１×１０⁵細胞で１２ウェルディッシュ上に播か
れた）に添加した。これらの培養物を、少なくとも３週間にわたってか、または
これらの培養物が細胞変性効果を示すまでパッセージした。コントロールは、既
知の量のアデノウイルスストックで感染された２９３細胞を含んだ。このアッセ
イにおける検出の限界は、１００ｐｆｕ／ｍｌであった。これらの結果は、３連
トランスフェクションプロトコールがアデノウイルス夾雑物を導かないことを示
した。

【００４９】複製欠損アデノプラスミドアクセサリー構築物を複製コンピテントな（ヘルパ
ー）アデノウイルスの代わりに使用してＡＡＶビリオン産生を阻害するか否かを
決定するために、本発明者らは、先行技術の標準的プロトコールと本発明の３連
トランスフェクションプロトコールとについて、１０ｃｍ培養ディッシュ当たり
の凍結融解溶解物から得られた「合計」のｒＡＡＶビリオンの数と「機能的」な
ｒＡＡＶビリオンの数とを比較した。粒子の合計を、ドットブロット分析によっ
て決定した。機能的粒子を、Ｘ−ｇａｌ活性についての染色および陽性細胞の計
数によって決定した。

【００５０】

【表１】表１からのデータは、産生性（複製コンピテント）なアデノウイルス感染の不存
在下でさえ、ｒＡＡＶ粒子のカプシド化を、アデノプラスミドアクセサリー構築
物からのアデノウイルスＤＮＡを提供される、ヒト２９３細胞において効率的に
得ることを示す。この実験はまた、アデノプラスミドアクセサリーエレメントで
形質転換された細胞が、７２〜１２０時間の間に同様の数の総ウイルス粒子を有
したこと、および７２時間時において、両方の方法によって作製された粒子の総
数は比較可能であり、かつディッシュ当たりの細胞数は類似したことを示す。

【００５１】（実施例３：３連トランスフェクション法の拡大）大規模トランスフェクションを、実施例２に記載されるように実施した。目的
の遺伝子をコードするがＡＡＶタンパク質についてのコード配列がない、複製欠
損ＡＡＶ粒子（ビリオン）を、２０個の１５ｃｍディッシュから回収し、そして
ＣｓＣｌ勾配上で精製した。総粒子および機能的粒子を、実施例２に記載される
ように評価した。結果を以下に示す。

【００５２】

【表２】ＣｓＣｌ勾配精製の後に、アデノウイルスタンパク質夾雑物は、３連トランス
フェクションプロトコールによって調製されたｒＡＡＶ調製物において、ウエス
タンブロット技術によって検出不可能であった。

【００５３】本明細書中に言及される全ての特許、特許公開、特許出願および科学論文は、
本明細書中に参考として援用される。本発明は、完全に記載され、多くの変化お
よび改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなさ
れ得ることは、当業者には明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 7/04 Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者エスコベド，ジェイミーアメリカ合衆国カリフォルニア 94507，アラモ，ラボルナロード 1470 (72)発明者チョウ，シャン−チェンアメリカ合衆国カリフォルニア 94502，アラメダ，ファンドベイ 125 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA03 BA27 BA30 BA32 CA02 DA03 EA02 HA17 4B065 AA93X AA93Y AA95Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA06 AA13 CA53 CA56 DA14 DB22 DB56 NA20 4C087 AA03 BB64 BB65 BC83 CA12 NA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】野生型ＡＡＶおよびヘルパーアデノウイルスを実質的に含ま
ない、複製欠損組換えＡＡＶビリオンを産生するための方法であって、該方法は
以下の工程：ａ．適切な宿主細胞に、（ｉ）ＡＡＶコード配列がなく、かつ２つのＡＡＶ
ＩＴＲの間に操作可能に位置される異種遺伝子を含む、ＡＡＶベクター、（ｉｉ
）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する、Ａ
ＡＶヘルパー構築物、および（ｉｉｉ）パッケージングシグナルを欠くかまたは
パッケージされ得ないようにするに十分なさらなるヌクレオチドを含むかのいず
れかであるアデノウイルスゲノム全長を有する、アデノプラスミドアクセサリー
構築物を導入して、形質転換された宿主細胞を産生する工程；ｂ．該形質転換した宿主細胞を培養して、該異種遺伝子を有する複製欠損組換
えＡＡＶビリオンを産生する工程；ならびにｃ．該培養された宿主細胞を溶解して、野生型ＡＡＶおよびアデノウイルス粒
子が実質的にない該複製欠損組換えＡＡＶビリオンを得る工程、を包含する、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、前記アデノプラスミドアク
セサリー構築物が、パッケージングシグナルを欠くアデノウイルスゲノム全長を
有する、方法。
【請求項３】請求項１に記載の方法であって、前記アデノプラスミドアク
セサリー構築物が、パッケージされ得ないようにするに十分なさらなるヌクレオ
チドを含むアデノウイルスゲノム全長を有する、方法。
【請求項４】請求項１に記載の方法であって、前記異種遺伝子がヒトタン
パク質をコードする、方法。
【請求項５】請求項４に記載の方法であって、前記ヒトタンパク質が、エ
リスロポエチン、トロンボポエチン（Ｇ−ＣＳＦ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因
子、第Ｘａ因子、ヒト成長ホルモン、レプチンまたはＩＬ−２である、方法。
【請求項６】請求項１に記載の方法であって、前記アデノプラスミドアク
セサリー構築物が、ｐＪＭ１７、ｐＢＨＧ１０またはｐＢＨＧ１１である、方法
。
【請求項７】請求項１に記載の方法であって、以下の工程：ｄ．工程（ｃ）の溶解物をスルホン化したセルロースを含むカラムに適用する
工程；ならびにｅ．宿主細胞タンパク質および宿主細胞の破片が実質的にない、精製された複
製欠損組換えＡＡＶビリオンを回収する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項８】請求項２に記載の方法であって、前記異種遺伝子がヒトタン
パク質をコードする、方法。
【請求項９】請求項８に記載の方法であって、前記ヒトタンパク質が、エ
リスロポエチン、トロンボポエチン（Ｇ−ＣＳＦ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因
子、第Ｘａ因子、ヒト成長ホルモン、レプチンまたはＩＬ−２である、方法。
【請求項１０】請求項２に記載の方法であって、前記アデノプラスミドア
クセサリー構築物が、ｐＪＭ１７、ｐＢＨＧ１０またはｐＢＨＧ１１である、方
法。
【請求項１１】請求項２に記載の方法であって、以下の工程：ｄ．工程（ｃ）の溶解物をスルホン化したセルロースを含むカラムに適用する
工程；ならびにｅ．宿主細胞タンパク質および宿主細胞の破片が実質的にない、精製された複
製欠損組換えＡＡＶビリオンを回収する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１２】請求項３に記載の方法であって、前記異種遺伝子がヒトタ
ンパク質をコードする、方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の方法であって、前記ヒトタンパク質が
、エリスロポエチン、トロンボポエチン（Ｇ−ＣＳＦ）、第ＶＩＩＩ因子、第Ｉ
Ｘ因子、第Ｘａ因子、ヒト成長ホルモン、レプチンまたはＩＬ−２である、方法
。
【請求項１４】請求項３に記載の方法であって、前記アデノプラスミドア
クセサリー構築物が、ｐＪＭ１７、ｐＢＨＧ１０またはｐＢＨＧ１１である、方
法。
【請求項１５】請求項３に記載の方法であって、以下の工程：ｄ．工程（ｃ）の溶解物をスルホン化したセファロースを含むカラムに適用す
る工程；ならびにｅ．宿主細胞タンパク質および宿主細胞の破片が実質的にない、精製された複
製欠損組換えＡＡＶビリオンを回収する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１６】請求項１に記載の方法であって、前記２つのＡＡＶＩＴ
Ｒが野生型である、方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、前記２つのＡＡＶＩ
ＴＲがＡＡＶ−２ＩＴＲである、方法。