JP2003525590A

JP2003525590A - Ａａｖ粒子中に組換えベクターをキャプシド形成するための方法、組成物、および細胞

Info

Publication number: JP2003525590A
Application number: JP2000614375A
Authority: JP
Inventors: ダラエイチ．ロッカート，; カーメルエム．リンチ，
Original assignee: ターゲティッドジェネティクスコーポレイション
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2003-09-02
Also published as: AU4805800A; CA2370541A1; US20060166318A1; US6893865B1; EP1173596A2; AU780273B2; WO2000065038A2; WO2000065038A3

Abstract

(57)【要約】ＡＡＶ粒子への包囲を促進する要素を含む単離された組換えポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチドを含むパッケージング細胞、およびそれらの使用のための方法が、本発明に提供される。これらの単離された組換えポリヌクレオチドは、キャプシド形成される１つ以上の異種遺伝子に作動可能に連結されたＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメント（例えば、ヒト第１９染色体のＡＡＶＳ１組込み部位内に位置するＰ１配列）を含む。構築物が、哺乳動物細胞ゲノム内に組み込まれ得るか、エピソームに維持されるか、または一過的に提供されるかの、いずれかである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本出願は、米国仮出願第６０／１３５，１１９号（米国シリアル番号０９／３
０１，５１４から転換）（１９９９年４月２８日出願）、および２０００年４月
２７日に出願された米国出願（シリアル番号はまた割りあてられていない）に優
先権を主張する。これらは、その全体が参考として援用される。

【０００２】（連邦政府後援の研究下でなされた発明に対する権利の陳述）（該当なし）（発明の分野）本発明は、遺伝子送達のための組換えＤＮＡ構築物の範囲である。より詳細に
は、本発明は、遺伝子送達のための組換えＤＮＡベクターの産生における使用の
ための組換えＤＮＡ構築物の分野にある。

【０００３】（背景技術）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターは、遺伝子送達に有用性を有
すると考えられているが、重要な障害は、そのようなベクターをヒト遺伝子治療
適用に対して臨床的に有用な量で産生することの困難さであった。これは、肺へ
の直接的な送達のようなインビボ適用に対して特に問題である。本明細書中でよ
り詳細に議論される、遺伝子治療背景における別の重要な目的は、複製コンピテ
ントビリオンが実質的にないベクター調製物の産生である。以下の説明は、アデ
ノ随伴ウイルスおよびＡＡＶベクターに関する研究を簡単に要約し、次いで、遺
伝子治療における使用に適した高力価の組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）調製
物を効率的に産生するのに有用な、本発明に従う多くの新規な改善を記載する。

【０００４】アデノ随伴ウイルスは、特定の機能がヘルパーウイルスの同時感染によって提
供される細胞中でのみ増殖する、欠損パボウイルスである。ＡＡＶの一般的な概
説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．Ｉ，１６９−２２８頁およびＢｅｒｎｓ，１９９０，
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７４３−１７６４頁，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）中に見いだされ得る。ＡＡＶの増殖および複製に対して補助機能を提
供する同時感染ウイルスの例は、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよび、い
くつかの場合ワクシニアのようなポックスウイルスである。ヘルパー機能の性質
は、完全に知られてはないが、ヘルパーウイルスが間接的に、細胞をＡＡＶ複製
に対して許容するようである。この意見は、細胞が遺伝子毒性であるかまたは細
胞周期を破壊するかのいずれかの因子を用いて処理される場合に、ＡＡＶ複製が
、ヘルパーウイルス同時感染の非存在下では低効率で生じ得るという知見によっ
て支持される。

【０００５】ＡＡＶは、ヘルパーウイルスの非存在（上記のような条件）下、限定された範
囲で複製し得るが、より一般的には、ヘルパー機能の非存在下でのＡＡＶを用い
た細胞の感染は、宿主細胞ゲノムへのプロウイルスＡＡＶゲノムの組込みを生じ
る。他のウイルス（例えば、多くのレトロウイルス）とは異なり、ＡＡＶは、一
般的にヒトゲノムの特有の位置に組み込まれるようである。従って、ヒト細胞に
おいて、ＡＡＶが、１９番染色体に位置する特有の位置（「ＡＡＶ組込み部位」
といわれる）に組み込まれることが報告されている。例えば、Ｗｅｉｔｚｍａｎ
ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５８０
８−５８１２を参照のこと。組み込まれたＡＡＶを有する宿主細胞がアデノウイ
ルスのようなヘルパーウイルスを用いて引続いて重感染される場合、組み込まれ
たＡＡＶゲノムは、レスキューされ、かつ複製され得、感染された子孫のＡＡＶ
粒子の破裂を生じる。「Ｐ１」といわれるＡＡＶ組込み部位における配列は、Ａ
ＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と限定された相同性を共有し、細胞を含まな
い複製系においてＲｅｐ結合活性を示し、そしてＡＡＶの挿入およびレスキュー
の両方に関与すると考えられる。例えば、Ｗｅｉｔｚｍａｎら、同上、Ｋｏｔｉ
ｎら（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：５０７１−５０７８、およびＵｒｃｅｌ
ａｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２０３８−２０４６を参照のこと。ＡＡＶの組
込みが効率的かつ部位特異的なようであるという事実は、ＡＡＶをヒト遺伝子治
療のような用途のための遺伝子の細胞への誘導に有用なベクターにする。

【０００６】ＡＡＶは、任意の明らかな種または組織特異性を伴わずに非常に広い宿主範囲
を有し、実質的に任意のヒト、サルまたはげっし類起源の細胞株において複製し
得る。ただし、適切なヘルパーが存在する。ＡＡＶはまた、相対的に遍在し、そ
してほとんどの哺乳動物およびいくつかの鳥類種を含む広範な種々の動物種から
単離される。

【０００７】ＡＡＶは、いずれの疾患の原因とも関連していない。ＡＡＶは、形質転換ウイ
ルスでも癌性ウイルスでもなく、そしてヒト細胞の遺伝子物質へのＡＡＶの組込
みは、一般的に、宿主細胞の増殖特性または形態学的特徴の有意な変化を生じな
い。ＡＡＶのこれらの特性はまた、強力に有用なヒト遺伝子治療ベクターとして
ＡＡＶを推薦する。なぜなら、この適用に関して提案される他のウイルス系（例
えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイ
ルス）のほとんどは、疾患を引き起こすからである。

【０００８】ＡＡＶの種々の血清型が存在することは公知であるが、これらは、機能的、構
造的そして遺伝子レベルで全て密接して関連している（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏ
ｗ，１９８８，１６５−１７４頁、ＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＨｕｍ
ａｎＤｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ（編）；およびＲｏｓｅ，１
９７４，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＶｉｒｏｌｏｇｙ３：１−６１を参照
のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同性ｒｅｐ遺伝子によって媒介さ
れる非常に類似した複製特性を明らかに示し；そして全ては、ＡＡＶ２で発現さ
れるキャプシドタンパク質のような３つの関連するキャプシドタンパク質を保有
する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿う血清型の間の広範囲のクロスハイブ
リダイゼーションを明らかにするヘテロ二量鎖分析；そして逆方向末端反復（Ｉ
ＴＲ）に対応する末端における相同性自己アニーリングセグメントの存在によっ
てさらに示唆される。同様の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能
が同様の調節制御下であることを示唆する。従って、ＡＡＶ２血清型は実施例に
示される本発明の種々の例に使用されるが、本明細書中のＡＡＶに対する一般的
な参照は、全てのＡＡＶ血清型を含み、そして本明細書中に開示される方法およ
び組成物が、全てのＡＡＶ血清型に対して適用可能であることが、完全に予想さ
れる。

【０００９】ＡＡＶ粒子は、３つのキャプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ
３を有するタンパク質様キャプシドを含み、これは、ＤＮＡゲノムを含む。例え
ば、ＡＡＶ２ＤＮＡゲノムは、約１．５×１０⁶ダルトンの分子量および約５
ｋｂの長さを有する直線一本鎖ＤＮＡ分子である。個々の粒子は、１つのＤＮＡ
分子鎖のみをパッケージングするが、これは、「プラス」または「マイナス」鎖
のいずれかであり得る。いずれかの鎖を含む粒子は、感染性である。そして複製
は、親の感染一本鎖の二重鎖形態への変換、および子孫の一本鎖が置換されキャ
プシドにパッケージングされる二重鎖分子の大きなプールの引き続く増幅、によ
って生じる。ＡＡＶゲノムの二本鎖コピーまたは一本鎖コピーは、細菌プラスミ
ドまたはファージミドに挿入され、そしてアデノウイルス感染細胞にトランスフ
ェクトされ得；これらの技術は、ＡＡＶ遺伝学の研究およびＡＡＶベクターの発
展を容易にしてきた。

【００１０】タンパク質媒介複製およびウイルスＤＮＡのキャプシド形成をコードするＡＡ
Ｖゲノムは、一般的に、逆方向末端反復（ＩＴＲ）の２つのコピーの側に配置さ
れる。例えば、ＡＡＶ２の場合、ＩＴＲは、各々１４５ヌクレオチド長であり、
ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子に関する２つの主要なオープンリーディングフレーム
を含む約４４７０ヌクレオチドの特有な配列領域に隣接する（Ｓｒｉｖａｓｔｉ
ｖａら、１９８３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４；Ｈｅｒｍｏｎａ
ｔら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：３２９−３３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ
ら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５１：６１１−６１９）。ＡＡＶ２の特有の
領域は、３つの転写プロモーターｐ５、ｐ１９およびｐ４０を含み（Ｌａｕｇｈ
ｌｉｎら、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：
５５６７−５５７１）、これは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するために使
用される。ＩＴＲ配列は、ｃｉｓで必要とされ、そして機能的複製起点（ｏｒｉ
）、細胞ゲノムの組込みに必要とされるシグナル、ならびに宿主細胞染色体また
は組換えプラスミドからの効率的な切除およびレスキューを与えるに十分である
。また、ＩＴＲが、ＡＡＶベクターで直接的に転写プロモーターとして機能し得
ることが示された。Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，５８７，３０８号を参照の
こと。

【００１１】ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子残物は、トランスに必要とされ、そしてそれぞれ、
ウイルスゲノム中の複製およびキャプシド形成に対する機能を提供する。また、
例示目的のためにＡＡＶ２を使用して、ｒｅｐ遺伝子は、ｐ５およびｐ１９の２
つのプロモーターから発現され、そして４つのタンパク質を産生する。ｐ５から
の転写によって、第１のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８）をコードするスプライ
スされていない４．２ｋｂのｍＲＮＡおよび第２のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ６
８）をコードするスプライスされた３．９ｋｂのｍＲＮＡを生じる。ｐ１９から
の転写によって、第３のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２）をコードするスプライ
スされていないｍＲＮＡ、および第４のＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ４０）をコー
ドするスプライスされた３．３ｋｂのｍＲＮＡを生じる。従って、４つのＲｅｐ
タンパク質全ては、共通の内部領域配列を含むが、そのアミノ末端領域およびカ
ルボキシ末端領域において異なる。大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ
７８およびＲｅｐ６８）のみがＡＡＶ二本鎖ＤＮＡ複製に必要であるが、小さな
Ｒｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）は、子孫および一
本鎖ＤＮＡ蓄積に必要とされるようである（ＣｈｅｊａｎｏｖｓｋｙおよびＣａ
ｒｔｅｒ，１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７３：１２０−１２８）。Ｒｅｐ６
８およびＲｅｐ７８は、ＡＡＶＩＴＲのヘアピン構造に特異的に結合し、ＡＡ
Ｖ末端における複製の分解に必要とされるいくつかの酵素活性を保持する。Ｒｅ
ｐ５２およびＲｅｐ４０は、これらの特性を有さない。Ｃ．Ｈｏｌｓｃｈｅｒら
による報告（１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：７１６９−７１７７；および１
９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６８８０−６８８５）は、Ｒｅｐ７８またはＲ
ｅｐ６８の発現がいくつかの状況において感染性粒子形成に十分であり得ること
を示唆している。

【００１２】Ｒｅｐタンパク質、主にＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８はまた、ＡＡＶ遺伝子の
正の調節および負の調節ならびにいくつかの異種プロモーターからの発現を含む
多面発現性調節活性、そして細胞増殖に対する阻害効果を示す（Ｔｒａｔｓｃｈ
ｉｎら、１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８８４−２８９４；Ｌ
ａｂｏｗら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１３２０−１３２
５；Ｋｈｌｅｉｆら、１９９１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１：７３８−７４１）
。ＡＡＶｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８によって負に自己
調節される（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８６）。ｒｅｐ発現の細胞増殖に対す
る阻害効果に起因して、細胞株におけるｒｅｐの連続的な発現は、容易に達成さ
れていない。例えば、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら（１９８８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１
６６：１５４−１６５）は、ＡＡＶゲノムの安定な組込み後、特定の細胞株にお
いていくつかのＲｅｐタンパク質の非常に低い発現を報告した。

【００１３】キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、共通の重複配列を共有
するが、ＶＰ１およびＶＰ２は、さらなるアミノ末端配列を含む。全ての３つの
タンパク質は、ｐ４０プロモーターから転写されるスプライスされた２．３ｋｂ
ｍＲＮＡから典型的に発現される、いくつかのｃａｐ遺伝子リーディングフレ
ームによってコードされる。ＶＰ２およびＶＰ３は、選択的開始コドンの使用に
よってこのｍＲＮＡから産生され得る。一般的に、ｐ４０からの転写によって、
選択的部位でスプライスされ、約２．３ｋｂの２つの異なる転写物を生じ得る、
２．６ｋｂの前駆体ｍＲＮＡが生じる。ＶＰ２およびＶＰ３は、（２つの開始コ
ドンのいずれかを用いて）いずれかの転写物によってコードされ得るが、ＶＰ１
は、１つの転写物によってのみコードされる。ＶＰ３は、主要なキャプシドタン
パク質であり、代表的に、全ビリオンタンパク質の約９０％に寄与する。ＶＰ１
は、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする主要なｍＲＮＡに使用される３’ドナーか
ら３０ヌクレオチド上流である３’ドナー部位を使用して、微量のｍＲＮＡから
コードされる。３つの全てタンパク質は、効率的なキャプシド産生に必要である
。３つの全てタンパク質を排除する変異（Ｃａｐネガティブ）は、一本鎖の子孫
のＡＡＶＤＮＡの蓄積を予防する。これに対して、ＶＰ１アミノ末端における
変異（「Ｌｉｐネガティブ」または「Ｉｎｆネガティブ」）は、一本鎖ＤＮＡの
粒子へのアセンブリを許容し得るが、感染力価は大きく減少する。

【００１４】上記のＡＡＶの遺伝子分析は、細菌プラスミドにクローン化されたＡＡＶゲノ
ムの変異分析に大きく基づく。初期の研究において、ＡＡＶの感染性ゲノムの分
子クローンは、ＧＣテーリングのような手順（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：２０７７−２０８１）
、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉ
ｎら、１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）、または直接的な平滑末端連結
（ＳｅｎａｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２５９：４６６１−４６６６）によって、ＡＡＶ二本鎖分子のプラスミドへ
の挿入によって構築された。適切なヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス
）によってもまた感染される哺乳動物細胞へのそのようなＡＡＶ組換えプラスミ
ドのトランスフェクトによって、いずれのプラスミド配列も含まないＡＡＶゲノ
ムのレスキューおよび切除、レスキューされたゲノムの複製、そして子孫の感染
性ＡＡＶ粒子の産生が生じる。これにより、上記に要約される、ＡＡＶの遺伝子
分析の実施に関する基礎が提供され、そしてＡＡＶ形質転換ベクターの構築が可
能になる。

【００１５】ヒト遺伝子治療における使用のために設計された任意のＡＡＶベクターの少な
くとも２つの望ましい特徴が存在する。第１は、形質転換ベクターが、送達系と
して実施可能であるに十分な高さの力価で産生されることである。これは、ベク
ターのインビボ送達を目的とする遺伝子治療戦略において特に重要である。例え
ば、気道への直接的なインビボ送達による嚢胞性腺維症の処置ようなＡＡＶベク
ターの多くの好ましい適用に対して、所望の用量の形質転換ベクターは、１０⁸
〜１０¹⁰であり得るか、またはいくつかの場合、１０¹⁰粒子より過剰であり得る
。第２に、ベクター調製物は、好ましくは基本的に野生型ＡＡＶベクター（また
は任意の複製競合的ＡＡＶ）がない。高力価のＡＡＶベクターの達成は、野生型
ＡＡＶゲノム（これが存在するかまたは組換えによって産生される場合）の優先
的なキャプシド形成、および野生型ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子によって提供され
るような機能を十分に相補する機能の産生における困難さ、を含むいくつかの理
由によって困難であった。そのような相補的機能を発現する有用な細胞株は、産
生することが特に困難であった。これは、ある程度、ｒｅｐ遺伝子産物と関連す
る多面発現性阻害機能が原因である。従って、ｒｅｐ遺伝子が組み込まれ発現さ
れる細胞株は、ゆっくりと増殖し得るか、またはｒｅｐを非常に低レベルで発現
する。

【００１６】上記の遺伝子分析に基づいて、ＡＡＶベクター構築物の一般的な原理が記載さ
れている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎ
ｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋ
ａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９を参照のこと。ＡＡＶベクターは、一
般的に、ＡＡＶコード配列の部分を外来ＤＮＡと置換して組換えＡＡＶ（ｒＡＡ
Ｖ）ベクターまたは「プロベクター（ｐｒｏ−ｖｅｃｔｏｒ）」を産生すること
によって、ＡＡＶ組換えプラスミドに構築される。このベクターにおいて、ＡＡ
Ｖ配列の末端（ＩＴＲ）部分がインタクトに保持されなければならないことが、
ＡＡＶの文献で十分に確立されている。なぜなら、これらの領域が、トランスフ
ェクト後のプラスミドからの切除、ベクターゲノムの複製および組込み、ならび
に宿主細胞ゲノムからのレスキューを含むいくつかの機能に関して、シスで必要
とされるからである。いくつかの状況において、単一のＩＴＲの提供は、２つの
野生型ＩＴＲと正常に関連する機能を実施するに十分であり得る（例えば、Ｓａ
ｍｕｌｓｋｉら、ＷＯ９４／１３７８８（１９９４年６月２３日公開）を参照の
こと）。

【００１７】当該分野で記載されるように、ＡＡＶＩＴＲは、一般的にパリンドロームヘ
アピン（ＨＰ）構造および２０ヌクレオチド領域（ＨＰ形成に関与しないＤ配列
と命名される）からなる。Ｗａｎｇらは、ＡＡＶゲノムのレスキュー、複製およ
びキャプシド形成に必要とされるＡＡＶＩＴＲ配列を同定した（Ｗａｎｇら、
１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１６６８−１６７７）。Ｗａｎｇら（１９９
６）は、以下を報告した：（ｉ）２つのＨＰ構造および１つのＤ配列が、ＡＡＶ
ＤＮＡの効率的なレスキューおよび優先的な複製に十分である、（ｉｉ）２つ
のＨＰ構造単独は、ＡＡＶＤＮＡの低レベルのレスキューおよび複製を可能に
するが、ＡＡＶベクターＤＮＡ配列のレスキューおよび複製はまた、Ｄ配列の非
存在下で生じる；（ｉｉｉ）１つのＨＰ構造および２つのＤ配列（１つのＨＰ構
造および１つのＤ配列ではない）はまた、ＡＡＶならびにベクターＤＮＡ配列の
レスキューおよび複製を可能にする、（ｉｖ）１つのＨＰ構造単独または２つの
Ｄ配列（１つのＤ配列単独ではない）は、全長プラスミドＤＮＡの複製を可能に
するが、ＡＡＶゲノムのレスキューは生じない、（ｖ）ＨＰ構造およびＤ配列の
非存在下ではレスキュー−複製は生じない、（ｖｉ）Ｄ配列の非存在下、ＨＰ構
造は、ＡＡＶゲノムのキャプシド形成の成功に不十分である、そして（ｖｉｉ）
１つのＩＴＲ構造のみを含むＡＡＶゲノムは、生物学的に活性なビリオンにパッ
ケージングされ得る。従って、Ｗａｎｇらは、Ｄ配列が、ＡＡＶゲノムの効率的
なレスキューおよび選択的複製およびキャプシド形成に重要な役割を果たすと結
論した。このグループより公開された後の研究により、ＩＴＲのヘアピン構造に
近接するＤ配列の最初の１０ヌクレオチドが、ＡＡＶゲノムの最適なレスキュー
および複製に、必要かつ十分であることが示唆された（Ｗａｎｇら、１９９７、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０７７−３０８２）。従って、この研究は、Ｄ配列を
ＡＡＶゲノムのパッケージングに必要であると確認した。

【００１８】次いで、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの適切なヘルパーウイル
スによって感染される細胞へのベクターのトランスフェクトによって、このベク
ターはＡＡＶ粒子にパッケージングされ、ＡＡＶ形質転換ウイルスを産生し得；
ただし、ＡＡＶ粒子へのベクターゲノムの複製およびキャプシド形成を達成する
ために、このベクターは、一般的に、ベクターの構築において欠失された、トラ
ンスで必要とされる任意ＡＡＶ機能に相補的（特に、ｒｅｐおよびｃａｐ）でな
ければならない。

【００１９】そのようなＡＡＶベクターは、少数の組換えウイルスベクター系の間であり、
この系は、インビボ遺伝子移入因子として有用性を有することが示され（Ｃａｒ
ｔｅｒ，１９９２；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２に概説される）、従って、ヒト
遺伝子治療に対して潜在的に非常に重要なベクターである。ＡＡＶベクターは、
種々の細胞（嚢胞性線維症（ＣＦ）の気管支および鼻の上皮細胞（例えば、Ｆｌ
ｏｔｔｅら、１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ
．７：３４９−３５６；Ｅｇａｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５８：５８１
−５８４；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３ａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３
７８１−３７９０；およびＦｌｏｔｔｅら、１９９３ｂ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１０１６３−１０１６７を参照のこと）；ヒ
ト骨髄由来の赤白血球（例えば、Ｗａｌｓｈら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７２５７−７２６１を参照のこと）；なら
びに脳細胞、目細胞および筋細胞を含む）における高頻度の形質導入および発現
をし得る。ＡＡＶは、レトロウイルスに対して、別の明確な利点である形質導入
および発現のための活性な細胞分裂を、特に、ほとんどの細胞が末期的に分化さ
れかつ非分裂であるヒトの気道上皮のような組織で、必要とし得ない。

【００２０】ＡＡＶ粒子（これは、基本的に野生型ＡＡＶまたは他の複製コンピテントＡＡ
Ｖがない）にキャプシド形成される組換えベクターを効率的に産生するために使
用され得る方法に対する、重要な必要性；およびこれに対応した、そのような組
換えベクターを効率的に産生するために使用され得る細胞株に対する必要性が存
在する。本発明は、高力価のＡＡＶ粒子キャプシド形成の組換えベクター調製物
を産生するための、方法、組成物および細胞を提供する。

【００２１】本明細書中に引用される全ての刊行物および特許出願は、本明細書によってそ
の全体が参考として援用される。

【００２２】（発明の要旨）本発明は、異種遺伝子にシスで作動可能に連結される場合、その異種遺伝子の
ＡＡＶ粒子内へのキャプシド形成を促進する組成物および方法を提供し、ここで
、シスキャプシド形成機能は、ＡＡＶＩＴＲ以外の、または好ましくは、ＡＡ
ＶＩＴＲのＤ配列以外のポリヌクレオチド（すなわち、キャプシド形成エレメ
ント）によって提供される。特に、本発明者らは、異種遺伝子と作動可能な連結
にある１以上のＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメントを使用するこ
とによって、そしてさらにＡＡＶＩＴＲｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を提供
することによって、ＡＡＶ粒子中に異種遺伝子のキャプシド形成を得ることが可
能であることを見出した。本明細書中に記載され、そして例示されるように、Ａ
ＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメントと作動可能な連結にある異種遺
伝子配列は、ヒト細胞の染色体に組み込まれ得るか、またはエピソームとして染
色体外に維持され得る。本発明の方法および組成物を使用して、安定なプロデュ
ーサー細胞を作製し得、この細胞は、適切なヘルパーウイルス（例えば、アデノ
ウイルス）での感染、またはヘルパー機能の提供の際に、組換えベクター（組換
えポリヌクレオチド）を含むＡＡＶ粒子の非常に大きなバーストの生成を支持し
得る。

【００２３】従って、１つの実施形態において、本発明は、単離された組換えポリヌクレオ
チド配列を提供し、このポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶＩＴＲまたはＡＡＶ
ＩＴＲのＤ配列以外のキャプシド形成エレメントに作動可能に連結された異種
遺伝子を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、キャプシド形成エレメン
トは、本明細書中に記載されるような、Ｐ１エレメントである。

【００２４】さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞を提供することによって
ＡＡＶ粒子中にキャピシド形成された外来遺伝子を含む組換えベクターの高力価
ストック（ｓｔｏｃｋ）を産生するための方法を提供する。この哺乳動物細胞は
、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を産生し、そしてＡＡＶＩＴＲ以外、
または好ましくは、ＡＡＶＩＴＲのＤ配列以外のキャプシド形成エレメントに
作動可能に連結された異種遺伝子を含む組換えベクターを含む。

【００２５】本発明はまた、細胞株を作製するための組成物および方法（この細胞株は、組
換えベクターを含み、この組換えベクターは、ＡＡＶＩＴＲまたはＡＡＶＩ
ＴＲのＤ配列以外のキャプシド形成エレメントに作動可能に連結した異種遺伝子
を含み、この細胞株はＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を合成し、そして
ＡＡＶ粒子中に組換えベクターをキャプシド形成する）；それによって産生され
た細胞および細胞株；異種遺伝子を含む組換えベクターの高効率パッケージング
のための組成物および方法；ならびに本発明の方法に従ってパッケージングされ
た組換えベクターを提供する。

【００２６】（発明を実施するための様式）遺伝子治療の分野における基本的な挑戦は、インビボで細胞および組織への効
率的な遺伝子送達のためのストラテジーの開発である。１つのストラテジーは、
ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成された組換えベクターの使用を含む。組換えＡＡ
Ｖ粒子をパックしたベクターは、ベクターパッキングのためにシスで必要とされ
る配列を、目的のタンパク質または機能をコードする異種ポリヌクレオチドとと
もに含む組換え構築物である。ＡＡＶ粒子にパッキングされた組換えベクターは
、ヒト遺伝子治療のための潜在的に強力なツールであり、そして一般に、細胞に
ポリヌクレオチドを導入するために有用である。

【００２７】ＡＡＶ粒子にパッキングされた組換えベクターは、例えば、気道においてイン
ビボ遺伝子送達をし得るが、このようなベクターの高い力価は、十分に高い多様
性のベクターを最小容積で送達することを可能にする。結果的に、最適なパッキ
ング方法論が、ＡＡＶ媒介遺伝子治療アプローチのために非常に重要である。組
換えベクターのＡＡＶ粒子へのパッキングは、部分的に、以下の２つのＡＡＶ遺
伝子の産物によって媒介される：ｒｅｐ（複製タンパク質）およびｃａｐ（キャ
プシドタンパク質）（これらは、トランスで別々に提供され得る）。以前、トラ
ンスで提供されるｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物に加えて、ＩＴＲがシスでキャ
プシド形成機能を提供するために必要であると考えられていた。さらに、ＡＡＶ
ＩＴＲの２０−ヌクレオチド部分（「Ｄ配列」として公知である）は、ＡＡＶ
ゲノムの効率的なレスキューおよび選択的な複製およびキャプシド形成において
重要な役割を果たすことが知られている（Ｗａｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７０：１６６８−１６７７）。本発明の発明者らは、ＡＡＶＩＴＲまたは
ＡＡＶＩＴＲのＤ配列以外の配列が、シスでキャピシド形成機能を提供し得る
という驚くべき発見をした。

【００２８】本発明の発明者らは、（共同に係る国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１
９３８（この内容が、本明細書中で参考として援用される）において）Ｐ１また
はＰ１様エレメントが、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子に増幅可能に
連結したＰ１またはＰ１様エレメントを含むＤＮＡの制御された増幅を提供し、
それによって、ＡＡＶパッキングタンパク質の合成のための増加したテンプレー
トレベルを提供することを以前に示した。Ｐ１またはＰ１様エレメントは、作動
可能に連結されたポリヌクレオチドのキャプシド形成を促進し得ることが発見さ
れている。

【００２９】本発明は、ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成された組換えベクターのストックを
作製ために方法、ポリヌクレオチドおよびパッキング細胞を提供する。異種ポリ
ヌクレオチドは、ＡＡＶＩＴＲまたはＡＡＶＩＴＲのＤ配列以外のキャプシ
ド形成要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、活性化エレ
メントは、ベクター産生を開始することが所望される場合、使用者によって、好
ましくはヘルパーウイルスでの感染またはヘルパー機能の提供によって、直接的
または間接的に誘発される。ヒト第１９染色体のＰ１配列の使用は、これらの観
点の例示である。

【００３０】理論に束縛されることを望まないが、感染またはヘルパー機能の提供に際に、
ｐ５プロモーターは、ある度合いに、スイッチが入り、あるＲｅｐタンパク質の
合成を生じ、次いで、このことは、キャプシド形成エレメントを介して作用する
ことによって、キャプシド形成事象を誘発し、連結された遺伝子は、キャプシド
形成事象によって、ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成されるようである。Ｐ１によ
って例示されるキャプシド形成エレメントは、従って、それが連結される遺伝子
（単数または複数）のキャプシド形成を促進する。

【００３１】本発明はまた、ＡＡＶＩＴＲまたはＡＡＶＩＴＲのＤ配列以外のキャプシ
ド形成エレメントに作動可能に連結された異種遺伝子を含む組換えベクターを提
供する。好ましくは、異種遺伝子を含む組換えベクターは、ＡＡＶ粒子へパッキ
ングされるためのサイズ上限以下のサイズを有し、これには、約５ｋｂのサイズ
を含むが、これに限定されない。ＡＡＮ粒子にキャプシド形成される場合、これ
らのベクターは、異種遺伝子を細胞に導入するために有用である。

【００３２】（一般的方法）本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ
、および免疫学の従来技術を使用し、これらは、当該分野の技術内にある。この
ような技術は、文献に完全に例示される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ａｎ
ｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編，１９８
７）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓ
ｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ
．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃ
ｋｗｅｌｌ，編）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ
．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．
Ｓｍｉｔｈ，およびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ，編，１９８７，および最新版）；ならび
にＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ
．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ
，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，編，１９９１）を参照の
こと。

【００３３】本明細書中で言及された全ての特許、特許出願、および出版物（前出および後
出の両方）は、本明細書中で参考として援用される。

【００３４】（定義）明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ
」および「ｔｈｅ」は、さもなければ内容が明確に支持しない限り、複数形の参
照も含む。例えば、「細胞（ａｃｅｌｌ）」は、複数の細胞を含み、それらの
混合物を含む。

【００３５】用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さの
アミノ酸のポリマーをいうために、互換可能に使用される。これらの用語はまた
、グリコシル化、アセチル化およびホスホリル化を含むがこれらに限定されない
、反応を通して翻訳後に改変されるタンパク質を含む。

【００３６】「ポリヌクオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいい、リ
ボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらのアナログの
いずれかをいう。この用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、二本鎖およ
び単一鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および単一鎖ＲＮＡを含む。これはまた、メチ
ル化またはキャップされたポリヌクレオチドのような改変ポリヌクレオチドを含
む。

【００３７】ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（あるいはポリペプチドまたは
ポリペプチド領域）は、別の配列に対して、特定のパーセント（例えば、８０％
、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有し、これは、整列され
た場合、そのパーセントの塩基（またはアミノ酸）が、２つの配列を比較する際
に同じであることを意味する。この整列および％相同性または配列同一性は、当
該分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定され得、例えば、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（
Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，１９８７）補遺３０，７．７．１８節，表７．
７．１に記載されるプログラムである。好ましくは、デフォルトパラメータは、
整列のために使用される。好ましい整列プログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフ
ォルトパラメータを使用する。特に、好ましいプログラムは、BLASTNおよびBLAS
TPであり、以下のデフォルトパラメータを使用する：Ｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅ
＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕ
ｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔｂｙ＝ＨＩＧＨ
ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎ
ｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。このプログ
ラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴに見出され得る。

【００３８】「遺伝子」は、転写および翻訳された後、特定のタンパク質をコードし得る少
なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。

【００３９】本明細書中で使用される場合、「ＡＡＶＩＴＲまたはＡＡＶＩＴＲのＤ配
列以外のキャプシド形成エレメント」は、「ＡＡＶＩＴＲまたはＡＡＶＩＴ
ＲのＤ配列以外のパッキングシグナル」および「ＡＡＶＩＴＲではないキャプ
シド形成エレメント」と本明細書中で互換可能に使用され、ＡＡＶｒｅｐおよ
びｃａｐ遺伝子産物がトランスで提供される場合、ポリヌクレオチド配列を意図
し、このポリヌクレオチド配列は、シスで作動可能に連結される場合、ＡＡＶ粒
子への異種遺伝子のキャプシド形成を促進する（または増強するか、または増加
させる）。本発明の目的について、キャプシド形成エレメントは、ＡＡＶＩＴ
ＲまたはＡＡＶＩＴＲのＤ配列ではない。ＡＡＶＩＴＲおよびそれらのＤ配
列は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に提供されるガイダンスが与え
れらると、当業者は、所定のチャプシド形成エレメントが、ＡＡＶＩＴＲであ
るか、またはＡＡＶＩＴＲ配列であるか、またはＡＡＶＩＴＲではないキャ
プシド形成エレメントである否かを容易に決定し得る。

【００４０】本明細書中で使用される場合、用語「キャプシド形成エレメントに作動可能に
連結された異種遺伝子」、「キャプシド形成エレメントに作動可能に連結された
異種ポリヌクレオチド」は、本明細書中で互換可能に使用され、天然では所定の
キャプシド形成エレメントと通常会合していないポリヌクレオチド配列をいう。

【００４１】異種遺伝子とキャプシド形成エレメントの間の物理的な連結の文脈において、
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中で使用される場合、異種遺伝子お
よびキャピシド形成エレメントの物理的および／または機能的配置を意図し、こ
の配置は、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物の存在下で、ＡＡＶ粒子中に
異種遺伝子をキャプシド形成するために、キャプシド形成エレメントが、シスで
機能すること可能にする。所定のキャプシドエレメントが、所定の異種遺伝子に
「作動可能に連結された」か否かを決定する方法は、当該分野で公知であり、そ
して本明細書中に記載され、そして例えば、ハイブリダイゼーションによって決
定されるように、異種遺伝子を含むＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の数を測定す
ることを含むが、これらに限定されない。

【００４２】用語「ＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムのどちらかの末端における逆方向末端反復をいう。一般に、ＡＡＶＩＴＲは、約１４５ヌクレオチド長である。ＩＴＲの
最初の１２５塩基は、Ｔ字型のヘアピン構造を形成し得、この構造は、より大き
なパリンドールに隣接する２つの小さな内部パリンドールからなる（Ｍｕｚｙｃ
ｓｋａら、１９９２）。ＩＴＲは、原核生物プラスミドからのＡＡＶＤＮＡ複
製およびレスキュー、または除去に関係すると同定されている（Ｓａｍｕｌｓｋ
ｉら、１９８３、Ｃｅｌｌ３３：１３５−１４３、Ｓａｍｕｋｓｋｉら、１９
８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１１；Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９
８４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１−２０；ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＭｕ
ｚｙｃｚｋａ、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２５１３−２５２
２）。

【００４３】本明細書中で使用される場合、用語「ＡＡＶＩＴＲのＤ配列」は、ＡＡＶ
ＩＴＲ内の特定の配列エレメントをいい、このエレメントは、例えば、Ｗａｎｇ
ら、１９９６およびＷａｎｇら、１９９７に記載されるように、ＡＡＶゲノムの
レスキュー、選択的複製およびキャプシド形成において役割を果たすと同定され
ている。ＡＡＶ２ＩＴＲＤ配列は図２に示され、そして本明細書中で使用され
る場合、「ＡＡＶＩＴＲのＤ配列は、ＡＡＶ２ＩＴＲのＤ配列および他のＡ
ＡＶ血清型のＩＴＲのＤ配列をいう。

【００４４】本明細書中で使用される場合、「転写調節配列」は、遺伝子またはコード配列
の転写を制御するヌクレオチド配列をいい、このヌクレオチドは、遺伝子または
コード配列に作動可能に連結されている。本発明において転写調節配列の使用は
、一般に、少なくとも１つの転写プロモーターを含み、そして１以上のエンハン
サーおよび／または転写のターミネーターを含み得る。

【００４５】本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、遺伝子またはコード配列
の転写を指向するヌクレオチド配列をいい、このヌクレオチド配列は、遺伝子ま
たはコード配列に作動可能に連結される。

【００４６】「作動可能に連結された」は、２つ以上の成分の配置をいい、ここで、そのよ
うに記載された成分は、それらが協調的な様式で機能することを可能にする関係
にある。例示の目的で、転写調節配列またはプロモーターは、転写調節配列また
はプロモーターが、コード配列の転写を促進する場合、コード配列に作動可能に
連結される。作動可能に連結された転写調節配列は、一般にコード配列とシスで
つながれるが、コード配列に直接隣接する必要はない。

【００４７】「組換え体」は、一般に天然に見出される遺伝的実体から区別される遺伝的実
体をいう。ポリヌクレオチドまたは遺伝子に適用される場合、このことは、ポリ
ヌクレオチドが、クローニング、制限および／またはライゲーションの工程、お
よび天然に見出されるポリヌクレオチドから区別される構築物を生じる手順の種
々の組み合わせの産物であることを意味する。

【００４８】「異種（の）」は、それが比較される実体の残りの実体から遺伝子型的に区別
される実体から誘導されることを意味する。例えば、遺伝工学技術によって、異
なる細胞型に導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そ
して、発現される場合、異種ポリヌクレオチドをコードし得る）。同様に、その
ネイティブのコード配列から除去され、そして異なるコード配列に作動可能に連
結される転写調節配列またはプロモーターは、異種転写調節配列またはプロモー
ターである。

【００４９】本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、インビトロまたはインビボの
いずれかで、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドま
たはウイルスをいう。送達されるポリヌクレオチド（ときどき、「標的ポリヌク
レオチド」、「導入遺伝子」または「目的の遺伝子」といわれる）は、遺伝子治
療における目的のコード配列（例えば、治療目的のタンパク質をコードする遺伝
子）および／または選択マーカーまたは検出マーカーを含み得る。

【００５０】「レプリコン」は、適切な宿主細胞においてポリヌクレオチドの複製を可能に
する複製起点を含むポリヌクレオチドをいう。レプリコンの例には、エピソーム
（プラスミドを含む）、ならびに染色体（例えば、核染色体またはミトコンドリ
ア染色体）が挙げられる。

【００５１】「起点」、「複製起点」、「複製起点様配列（ｏｒｉ−ｌｉｋｅｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ）」または「複製起点エレメント」は、ＤＮＡ複製の開始の１以上の局面
（例えば、複製開始因子の結合、ＤＮＡ二重鎖の巻き戻し、プライマー形成、お
よび／または相補鎖のテンプレート指向合成）に関連するヌクレオチド配列であ
る。本明細書中および当該分野で詳細に議論されるように、複製起点様配列は、
一般に、天然に複製される任意のポリヌクレオチドにおいて見出され得、プラス
ミドおよびウイルス、ならびに原核生物ゲノム、ミトコンドリアゲノム、および
葉緑体ゲノムならびに真核生物染色体を含む。このような複製起点様配列は、当
該分野で公知のように、遺伝的に（すなわち、複製欠損変異体、ａｒｓ配列）ま
たは機能的に（生化学アッセイ、電子顕微鏡などを介して）同定され得る。

【００５２】ポリヌクレオチドの細胞への「安定な組込み」は、ポリヌクレオチドが、細胞
中に安定に維持される傾向にあるレプリコンへ組み込まれていることを意味する
。プラスミドのようなエピソームは、しばしば、多くの世代で維持され得るが、
エピソームに保持される遺伝的物質は、一般に、染色体組込み物質より欠損に対
して感受性である。しかし、ポリヌクレオチドの維持は、しばしば、選択マーカ
ーをポリヌクレオチドへの組込むか、またはポリヌクレオチドに隣接させること
、次いで、選択圧下でポリヌクレオチドを保有する細胞を維持することによって
、行われ得る。いくつかの場合において、配列は、それらが染色体に組込まれた
状態になるまで、有効に、安定に維持され得ない；そして、従って、選択マーカ
ーを含む配列の維持のための選択は、マーカーが染色体に安定に組込まれる細胞
の選択を生じ得る。抗生物質耐性遺伝子は、当該分野で公知のように、このよう
な選択マーカーとして、好都合に使用され得る。典型的に、安定に組込まれたポ
リヌクレオチドは、平均して、少なくとも約２０世代、好ましくは少なくとも１
００世代、なおさらに好ましくは、永久に維持されることが期待される。真核生
物染色体のクロマチン構造はまた、組込みポリヌクレオチドの発現のレベルに影
響し得る。安定に維持されたエピトーム上に保有される遺伝子を有することは、
特定の遺伝子の複数の安定に維持されたコピーを有することが所望される場合に
、特に有用である。本発明の文脈において特に所望される特性を有する安定な細
胞株の選択は、以下に記載され、そして例示される。

【００５３】「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、特定の機
能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞においてのみ増殖する欠
損パルボウイルスである。ＡＡＶの一般的な概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１
９８９，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐ
ｐ．１６９−２２８，およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．
１７４３−１７６４，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，（ＮｅｗＹｏｒｋ）に見出さ
れ得る。ＡＡＶ２血清型は、実施例に記載される本発明の例示のうちのいくつか
において使用された。しかし、これらの同じ原理が他のＡＡＶ血清型に適用可能
であることが十分に予期される。なぜなら、種々の血清型が（機能的および構造
的の両方、遺伝的レベルでさえ）非常に密接に関連していることが現在公知であ
るからである（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅ
ｓａｎｄＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ（編）の
ｐｐ．１６５−１７４；およびＲｏｓｅ，１９７４，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖ
ｅＶｉｒｏｌｏｇｙ３：１−６１を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血
清型は、明かに、相同性のｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製
性質を示し；そしてすべてがＡＡＶ２において発現されるような３つの関連した
キャプシドタンパク質を保有する。関連性の程度は、さらに、ゲノムの長さに沿
った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明かにするヘテロ二本鎖
分析；および逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する末端における類似した自己ア
ニーリングセグメントの存在によって示唆される。類似の感染パターンもまた、
それぞれの血清型における複製機能が、類似の調節制御化にあることを示唆する
。

【００５４】「組換えＡＡＶベクター」（または「ｒＡＡＶベクター」）は、１つ以上の目
的のポリヌクレオチド配列、目的の遺伝子またはＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ
）によって隣接される「導入遺伝子」を含むベクターを示す。このようなｒＡＡ
Ｖベクターは、複製され得、そして、適切なヘルパーウイルスを用いて感染され
ており、かつＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶＲｅ
ｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、感染性
ウイルス粒子にパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌ
クレオチドに（例えば、染色体中またはクローニングまたはトランスフェクショ
ンに使用されるプラスミドのような別のベクターに）組み込まれる場合、ｒＡＡ
Ｖベクターは、典型的には、「プロベクター」と呼ばれ、これは、ＡＡＶパッケ
ージング機能および必要なヘルパー機能の存在下で、複製およびキャプシド形成
によって、「レスキュー」され得る。

【００５５】本明細書中で使用される場合、ＡＡＶ粒子にパッケージングされる（キャプシ
ド形成される）組換えベクターは、１つ以上の異種ポリヌクレオチド配列、異種
遺伝子またはＡＡＶＩＴＲまたはＡＡＶＩＴＲのＤ配列以外のキャプシド形
成エレメントに作動可能に連結される「導入遺伝子」を含むベクターを意図する
。このような組換えベクターは、複製され得、そして、適切なヘルパーウイルス
を用いて感染されて（またはヘルパー機能を提供されて）おり、かつＡＡＶのｒ
ｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶＲｅｐおよびＣａｐタンパク
質）を合成する宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子にパッケージン
グされ得る。

【００５６】ＡＡＶについての「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（これは、「欠損」パルボ
ウイルスである）が宿主細胞によって複製され得、そしてパッケージングされ得
るウイルスを示す。多くのこのようなヘルパーウイルスが同定されており、これ
には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス（例えば、
ワクシニア）が挙げられる。アデノウイルスは、多くの異なるサブグループを含
むが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用され
る。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多くのアデノウイルスが公知であり
、ＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイル
スには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウ
イルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病
ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、これらもまた、ＡＴＣＣのような寄託機関から
入手可能である。「ヘルパー機能」は、ＡＡＶゲノムの複製およびパッケージン
グを可能にするヘルパーウイルスによって提供される活性または任意の等価な活
性を示す。ヘルパー機能はまた、いくつかのＡＡＶプロモーター（ｐ５を含む）
の転写を刺激すると考えられ、ヘルパー機能が発現される細胞中での複製の進化
性を高め得る。

【００５７】本明細書中で使用される場合、「パッケージング」は、ＡＡＶＩＴＲおよび
／またはＡＡＶＩＴＲＤ配列以外の１つ以上のキャプシド形成エレメントを
含む組換えベクターの全てまたは一部の組み立ておよびキャプシド形成を生じる
細胞以下の一連の事象を示す。従って、組換えベクターがＡＡＶＩＴＲまたは
そのＤ配列以外のキャプシド形成エレメントを含む組換えベクターが、パッケー
ジング細胞、またはパッケージング細胞株に、適切な条件下で導入される場合、
これは、ウイルス粒子に組み立てられ得る。ウイルスベクター、特にＡＡＶベク
ターのパッケージングと関連する機能は、本明細書中および当該分野で記載され
る。

【００５８】ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、複製およびキャプシド形成タン
パク質をそれぞれコードする遺伝子である。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
は、試験された全てのＡＡＶ血清型において見出され、そして本明細書中および
引用した参考文献において記載される。野生型ＡＡＶにおいて、ｒｅｐおよびｃ
ａｐ遺伝子は、一般的にウイルスゲノムにおいて互いに隣接して見出され（すな
わち、このｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、隣接するまたは重なる転写ユニットと
して一緒に「連結（ｃｏｕｐｌｅ）」される）、そしてこのｒｅｐおよびｃａｐ
遺伝子は、一般的にＡＡＶ血清型の間で保存される。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａ
ｐ遺伝子はまた、本明細書中において、「ＡＡＶパッケージング遺伝子」として
個々にそして集合的に呼ばれる。欠失変異または点変異によって改変されている
ＡＡＶパッケージング遺伝子、または組換えによって再び結合され得る成分に細
分されているＡＡＶパッケージング遺伝子（例えば、共同所有する国際特許出願
番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２３２４７に記載され、この開示は、本明細書によって
、参考として援用される）もまた、本発明に使用され得る。ＡＡＶパッケージン
グ遺伝子はまた、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化（「ポリ
Ａ」）配列（このさらなる転写調節配列はまた、異種であり得る）を含む他の転
写調節配列に作動可能に連結され得る。「ＡＡＶパッケージングカセット」は、
一つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子を含む組換え構築物である。

【００５９】「効率」は、細胞株を記載する際に使用される場合、株の特定の有用な特質（
特に、増殖速度、および（パッケージング細胞株について）細胞当たりの産生さ
れるウイルス粒子の数）を示す。パッケージング細胞株の「効果的な増殖」は、
匹敵し得る親型の細胞（すなわち、導入されたＡＡＶパッケージング遺伝子を保
有しない細胞）に関連する、パッケージング細胞の効果的な増殖速度を示す。好
ましくは、相対的な増殖速度は、親型の少なくとも２０％、より好ましくは、４
０％、より好ましくは、８０％、なおより好ましくは９０％、そしてもっとも好
ましくは、１００％である。「高い効率のパッケージング」は、細胞当たり少な
くとも約１００個のウイルス粒子、より好ましくは、細胞当たり少なくとも約１
０００個のウイルス粒子、なおより好ましくは、細胞当たり少なくとも約１０，
０００個のウイルス粒子の産生を示す。「高度に安全なパッケージング」は、産
生される組換えＡＡＶ粒子のうち、１０⁶個のうち約１個未満が、複製コンピテ
ントＡＡＶウイルス粒子であり、好ましくは、１０⁸個のうち約１個未満が、複
製コンピテントＡＡＶウイルス粒子であり、より好ましくは、１０¹⁰個のうち約
１個未満が、複製コンピテントＡＡＶウイルス粒子であり、なおより好ましくは
、１０¹²個のうち約１個未満が、複製コンピテントＡＡＶウイルス粒子であり、
最も好ましくは、複製コンピテントＡＡＶウイルス粒子が無いことを示す。本発
明の好ましいパッケージング細胞は、このような高い効率および高い安全性の組
み合わせを示す。

【００６０】「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」およ
び他のこのような用語は、本発明において有用な、より高等な真核生物細胞を、
好ましくは、哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞を示す。これらの細胞は、
組換えベクター、ウイルス、または他の移入ポリヌクレオチドのためのレシピエ
ントとして使用され得、形質導入された元の細胞の子孫を含む。単一の細胞の子
孫は、元の親の細胞と（形態学またはゲノム補体において）必ずしも完全に同一
でなくてもよい。

【００６１】「治療的遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「目的の遺
伝子」、「異種遺伝子」、「異種ポリヌクレオチド」などは、一般的にベクター
を使用して移入される遺伝子を示す。典型的には、本発明に文脈において、この
ような遺伝子は、ＡＡＶ粒子におけるパッケージングのために組換えベクター（
このベクターは、異種遺伝子、およびＡＡＶＩＴＲまたはそのＤ配列以外の一
つ以上のキャプシド形成エレメントを含む）内に位置する。標的ポリヌクレオチ
ドは、本発明において、多くの異なる用途のための組換えベクターを生成するた
めに使用され得る。このようなポリヌクレオチドには、以下が挙げられるが、こ
れらには限定されない：（ｉ）構造タンパク質または酵素の欠けた（ｍｉｓｓｉ
ｎｇ）、欠損した、または最適より低いレベルによって引き起こされる欠陥を軽
減するために遺伝子治療の他の形態において有用なタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉ
ｉｉ）転写因子または翻訳因子に結合するおとり（ｄｅｃｏｙ）に転写されるポ
リヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードす
るポリヌクレオチド；（ｖ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような
特定の薬物に感受性のレシピエント細胞を作製し得るポリヌクレオチド；（ｖｉ
）種々の癌の処置のためのＥ１Ａ腫瘍サプレッサー遺伝子またはｐ５３腫瘍サプ
レッサー遺伝子のような癌治療のためのポリヌクレオチド、（ｖｉｉ）抗原また
は抗体をコードするポリヌクレオチドおよび（ｖｉｉｉ）ＡＡＶＲｅｐおよび
Ｃａｐタンパク質を含むが、これに限定されないウイルスタンパク質をコードす
るポリヌクレオチド。レシピエント宿主細胞において導入遺伝子の発現を行うた
めに、これは、好ましくは、それ自身または異種プロモーターのいずれかで、プ
ロモーターまたは他のこのような転写調節配列に作動可能に連結される。大多数
の適切なプロモーターが当該分野において公知であり、その選択は、標的ポリヌ
クレオチドの発現の所望のレベルに依存し；構成的発現、誘導的発現、細胞特異
的または組織特異的発現などを望むか否かに依存する。組換えベクターはまた、
選択マーカーを含み得る。

【００６２】「活性化エレメント」は、増幅可能に連結される場所で増幅する（すなわち、
配列を複製する）ことによって活性化シグナルの存在に対して応答する配列であ
る。好ましい活性化エレメントは、Ｐ１エレメントであり、好ましい活性化シグ
ナルには、ＡＡＶヘルパー機能（アデノウイルスＥ１Ａ機能によって例示される
）またはそれらの等価物が挙げられる。本明細書中で使用される場合、二つの配
列（これのうちの１つが活性化エレメントである）は、それらが、活性化エレメ
ントから開始する複製が他の配列の増幅（すなわち増加したコピー数）を生じる
のに十分互いに近接している場合、「増幅可能に連結」される。好ましくは、増
幅配列のコピー数は、２倍以上、より好ましくは１０倍以上、なおより好ましく
は２０倍以上増幅する。活性化エレメントの、増幅可能に連結される配列を増幅
する能力は、活性化エレメントから開始する複製の進化の程度によって影響され
る。従って、複製の進化を高める因子は、活性化エレメントに増幅可能に連結す
る配列の増幅の効果的なレベルを増加する傾向がある。本発明の文脈において、
アデノウイルスを用いた感染または等価なヘルパー機能の準備（ｐｒｏｖｉｓｉ
ｏｎ）は、複製の進化ならびに開始増幅を高め得る。

【００６３】（組換えベクター、パッケージング細胞および本発明の方法における使用のた
めのキャプシド形成エレメント）本発明は、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を合成する哺乳動物におい
て一つ以上の異種遺伝子に作動可能に連結される場合、Ｐ１配列のようなＡＡＶ
ＩＴＲではないキャプシド形成エレメント（ヒト第１９染色体において通常見
出される）が、ＡＡＶ粒子への連結された異種遺伝子のキャプシド形成を促進し
得ることを発見した。特に、異種遺伝子に作動可能に連結されるキャプシド形成
エレメントを含む本発明の組換えベクターが、ヘルパーウイルスまたはヘルパー
機能の準備を含む適切な条件下で、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を合
成する哺乳動物細胞において提供される場合、組換えベクターを含むＡＡＶ粒子
の高い力価（ｔｉｔｅｒ）が、宿主細胞によって産生される。Ｐ１は、他の性質
もあるが、活性化可能キャプシド形成機能を保有するキャプシド形成エレメント
のクラスを例示し、これは、ＡＡＶ粒子中でキャプシド形成される生成組換えベ
クターにおいて有用である。

【００６４】従って、本発明の方法および組成物は、異種遺伝子が一つ以上のキャプシド形
成エレメントに作動可能に連結される組換えＤＮＡ構築物を利用する。本発明の
好ましいキャプシド形成エレメントは、ＡＡＶＩＴＲと通常関連するキャプシ
ド形成機能に関連する機能的性質を示すＰ１およびＰ１様エレメントによって例
示される。ヘルパー機能誘導可能キャプシド形成エレメントとして作用するエレ
メントがもっとも好ましい。

【００６５】Ｐ１エレメントが、少なくとも２つの別個の配列モチーフ、Ｒｅｐタンパク質
が結合し得る部位であって、「Ｒｅｐ結合モチーフ」（または「Ｒｅｐ結合部位
」または「ＲＢ部位」）として公知の部位、および末端分解部位（「ｔｒｓ」）
（ここで、結合Ｒｅｐタンパク質がＤＮＡをニックし得る（図２を参照のこと）
を含む。ＡＡＶ複製の間、Ｒｅｐタンパク質がＡＡＶ逆方向末端反復内で結合し
、（末端分解部位における）ニックの形成を触媒し、Ｒｅｐタンパク質の新規に
生成する５’末端への共有結合を生じることが考えられる。ニックの３’末端は
、ＡＡＶＤＮＡ合成のためのプライマーとして役立つ。続いて、作動可能に連
結されたポリヌクレオチドは、一方向でキャプシド形成される。さらに、実施例
３に示されるように、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖のいずれかは、キャプ
シド形成され得る。実施例において、所与のポリヌクレオチドのＡＡＶ粒子への
キャプシド形成は、ＤＮＡｓｅ耐性粒子を測定することによって、さらにこのポ
リヌクレオチドに対して相補性の標識されたプローブを用いたハイブリダイゼー
ションによってＤＲＰのポリヌクレオチド含有量を決定することによって決定さ
れる。これらの方法は、さらなるキャプシド形成エレメントを同定するためのア
ッセイとして使用され得る。

【００６６】Ｗｅｉｔｚｍａｎら（（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ９１：５８０８−５８１２）は、ヒトゲノムへのＡＡＶ組込み部位のＰ
１と指定される、１０９−塩基対ＳｍａＩフラグメント（図１）がＲｅｐ６８お
よびＲｅｐ７８タンパク質に特異的に結合することを報告する。本発明における
使用のためのＰ１エレメントは、この１０９ｂｐフラグメントを含み得る。しか
し、以下に議論されるように、この１０９ｂｐフラグメントの部分は、作動可能
に連結されたポリヌクレオチドをキャプシド形成するために機能し得る。さらに
、このＰ１エレメントを含むＡＡＶ組込み由来のより長いフラグメントもまた、
使用され得る。さらに、この配列の改変体は、作動可能に連結されたポリヌクレ
オチド配列のキャプシド形成を促進するために使用され得る。

【００６７】図２に示されるように、６２−ヌクレオチドキャプシド形成エレメント（上記
の１０９−ｂｐＰ１エレメントのサブフラグメントである）は、ヌクレオチド
１４５〜７９のＡＡＶ２ＩＴＲ（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）と整列させた
場合、約４７％のヌクレオチド配列同一性を共有し、ここで、５−ヌクレオチド
ギャップが、図２に示されるＰ１エレメントのヌクレオチド３２と３３の間に導
入される。

【００６８】ＡＡＶ２ＩＴＲ配列を用いてなされたので、他のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ
配列もまた、６２−ヌクレオチドＰ１キャプシド形成エレメントと整列している
（図３）。ＡＡＶＩＴＲ配列は、Ｘｉａｏら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７
３：３９９４−４００３；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
２２１：２０８−２１７；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
７１：６８２３−６８３３およびＣｈｉｏｒｉｎｉら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７３：４２９３−４２９８から取られた。図３に示されるように、Ｐ１エレ
メントは、ＡＡＶ１ＩＴＲと整列させた場合、約４２％のヌクレオチド配列同
一性を共有し、Ｐ１エレメントは、ＡＡＶ３ＩＴＲと整列させた場合、約４４
％のヌクレオチド配列同一性を共有し、Ｐ１エレメントは、ＡＡＶ４ＩＴＲと
整列させた場合、約４５％のヌクレオチド配列同一性を共有し、Ｐ１エレメント
は、ＡＡＶ５ＩＴＲと整列させた場合、約５３％のヌクレオチド配列同一性を
共有し、そしてＰ１エレメントは、ＡＡＶ６ＩＴＲと整列させた場合、約３９
％のヌクレオチド配列同一性を共有する。

【００６９】いくつかの実施形態において、ＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメ
ントは、図２に示される６２−ヌクレオチドＰ１エレメントと、少なくとも約２
５〜約３０％、より好ましくは少なくとも約３０〜４０％、より好ましくは、少
なくとも約４０〜約４５％、より好ましくは、少なくとも約４５〜約４７％、よ
り好ましくは、少なくとも約４７〜約５３％、より好ましくは、少なくとも約５
３〜約６０％、より好ましくは、少なくとも約６０〜約７０％、より好ましくは
、少なくとも約７０〜約８０％、より好ましくは、少なくとも約８０〜約９０％
、なおより好ましくは、少なくとも約９０％以上の配列同一性を共有する。いく
つかの実施形態において、本発明の組換えベクターは、一つ以上のＰ１エレメン
トを含み、それらのうちの１つまたは両方が、図２に示されるＰ１エレメントの
配列を有する。

【００７０】いくつかの実施形態において、ＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメ
ントが、ＡＡＶＲｅｐ６８／Ｒｅｐ７８タンパク質に対する結合部位を含む。
これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、Ｒｅｐ６８／Ｒｅｐ７８結合部位
は、ヌクレオチド配列５’ＧＣＸＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＸを有し、ここで、
Ｘが任意のヌクレオチドである。他の実施形態において、ＡＡＶＩＴＲではな
いキャプシド形成エレメントは、末端分解部位を含む。これらの実施形態のうち
のいくつかにおいて、末端分解部位は、ヌクレオチド配列ＧＧＴＴＧＧを有する
。他の実施形態において、ＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメントは
、Ｒｅｐ６８／Ｒｅｐ７８結合部位と末端分解部位との両方を含む。これらの実
施形態のいくつかにおいて、ＡＡＶＩＴＲではないは、ヌクレオチド配列ＧＧ
ＴＴＧＧ（Ｘ）ｎＧＣＸＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＸを含み、ここで、Ｘが任意
のヌクレオチドであり、そしてｎが、１〜約１００、好ましくは約５０、より好
ましくは約２０、より好ましくは約１０の数である。

【００７１】本発明における使用のためのＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメン
トは、作動可能に連結される異種遺伝子のＡＡＶ粒子へのキャプシド形成を促進
する（または増加する、または高める）。当業者は、容易に、所与のヌクレオチ
ド配列が、キャプシド形成フラグメントとして機能するか否かを決定し得る。当
業者に公知の種々の方法のいずれかが、この決定のために使用され得、これには
、ＤＲＰ（すなわち、キャプシド形成された組換えベクター）の数の測定、およ
び実施例２に記載されるような、ハイブリダイゼーション分析へのＤＲＰの供与
が挙げられる。本発明における使用のためのＡＡＶＩＴＲではないキャプシド
形成エレメントは、作動可能に連結される異種遺伝子のキャプシド形成を促進し
、その結果、ベクターが、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を合成する哺
乳動物細胞（この哺乳動物細胞にヘルパーウイルス機能が提供される）において
提供される場合、１ミリリットル当たり異種遺伝子を含む、少なくとも約１０²
、より好ましくは少なくとも約１０⁴、より好ましくは少なくとも約１０⁶、より
好ましくは少なくとも約１０⁷、より好ましくは少なくとも約１０⁸、より好まし
くは少なくとも約１０⁹、なおより好ましくは少なくとも約１０¹⁰以上のＤＲＰ
が生成される。

【００７２】（ＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメントに作動可能に連結される
異種遺伝子を含む単離された組換えポリヌクレオチド）Ｕｒｃｅｌａｙら（（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２０３８−２０４６
）は、プラスミドｐＭＡＴ５０を記載し、これは、Ｐ１エレメントおよびｌａｃ
Ｚ遺伝子およびＡＡＶＩＴＲを含む。キャプシド形成機能は、このＰ１エレメ
ントに起因しなかった。本発明は、異種遺伝子に作動可能に連結されるＡＡＶ
ＩＴＲではないキャプシド形成エレメントを含む単離された組換えポリヌクレオ
チド（本明細書中において、単離された組換えベクターとも呼ばれる）を提供し
、ここで、キャプシド形成エレメントが、キャプシド形成に許容な条件下で、作
動可能に連結される異種遺伝子のＡＡＶ粒子へのキャプシド形成を促進し、そし
ここで、単離された組換えベクターがｐＭＡＴ５０ではない。キャプシド形成に
許容な条件は、単離された組換えポリヌクレオチドが、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃ
ａｐ遺伝子産物を合成し、ヘルパーウイルス機能を提供される哺乳動物細胞内で
ある場合に提供される。これらの実施形態において、単離された組換えポリヌク
レオチドは、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を合成する哺乳動物細胞に
導入される。ヘルパーウイルス機能がさらに提供される場合、単離された組換え
ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成される。

【００７３】本発明者らは、Ｐ１配列によって例示されるように、キャプシド形成エレメン
トを異種遺伝子（例えば、ｃａｐ遺伝子）の近くに配置することで、ＡＡＶ粒子
において異種遺伝子の有効なパッケージングを生じることを観察した。実際、以
下で示されるように、ＤＨＦＲ配列から５．２ｋｂの距離に配置されるＰ１エレ
メントは、例えば、１ミリリットルあたりおよそ１０¹⁰ＤＰＲの産生で異種遺伝
子の有効なパッケージングを生じる。これは、ＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲ媒
介パッケージングについて報告されるキャプシド形成効率に都合良く匹敵する。
ＡＡＶパッケージング遺伝子からさらに離れてキャプシド形成エレメントを配置
することは（例えば、５〜１０ｋｂまたはそれ以上）、いくらか低いレベルのキ
ャプシド形成を生じ得るが、キャプシド形成エレメントと作動可能に連結された
異種遺伝子との間のより長い距離は、ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成される単離
された組換えポリヌクレオチドの産生に十分なキャプシド形成の程度を提供する
ことがさらに期待される。従って、いくつかの実施形態において、ＡＡＶＩＴ
Ｒではないキャプシド形成エレメントは、ＡＡＶ粒子中にパッケージされる異種
遺伝子を含む単離された組換えポリヌクレオチドから（すなわち、このポリヌク
レオチドからキャプシド形成の方向で）、約１０ｋｂより小さい、より好ましく
は約５ｋｂより小さい、より好ましくは約４ｋｂより小さい、より好ましくは約
３ｋｂより小さい、より好ましくは約２ｋｂより小さい、より好ましくは約１ｋ
ｂより小さい、より好ましくは約０．５ｋｂより小さい。

【００７４】いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、選択マ
ーカーをさらに含む。一旦、この組換えポリヌクレオチドが哺乳動物細胞中に導
入されると、細胞は、選択マーカーに適した選択に供され得る。哺乳動物細胞に
おける使用のために適切な種々の選択マーカー、および選択の様式は当該分野で
公知であり、そして本明細書中で詳細に記載される必要はない。任意のこのよう
な選択マーカーは、本発明の単離された組換えポリヌクレオチドにおける使用に
適切である。選択マーカーを含む単離された組換えポリヌクレオチドを含み、選
択マーカーに適した選択に供される哺乳動物細胞は、細胞のゲノムに安定に組み
込まれる組換えポリヌクレオチドを含む細胞を産生し得る（実施例に記載される
ように）。このような細胞が、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物およびＡＡＶｃａｐ
遺伝子産物を合成し、そしてヘルパーウイルスを示めすか、またはヘルパーウイ
ルス機能を提供される場合、組換えポリヌクレオチドはレスキューされ得、そし
てＡＡＶ粒子中にキャプシド形成され得る。

【００７５】ヘルパーウイルス感染に対する応答で、組み込まれて、作動可能に連結された
異種遺伝子のコピーをキャプシド形成することにおいて、Ｐ１エレメントは、一
方向にキャプシド形成を指向するようである。理論により束縛されることを望ま
ないが、Ｒｅｐ結合モチーフとＲｅｐの相互作用の後に、以下で例示されるよう
に、末端分解部位（ＴＲＳ）における２つのＴ残基との間にニックを入れると考
えられる。引き続き、複製がニックの３’ヒドロキシ末端から開始し得、そして
Ｒｅｐ結合モチーフに向かって進行し得る。従って、いくつかの実施形態におい
て、一方向のキャプシド形成エレメント（例えば、Ｐ１）は、キャプシド形成エ
レメントから、結合された（すなわち、作動可能に連結された）異種遺伝子に向
かって一方向の複製が進行するように方向付けられる。

【００７６】あるいは、異種遺伝子は、各エレメントで開始される複製が、異種遺伝子に向
かって「内向きに」進行するように方向付けられるキャプシド形成エレメントに
隣接され得る。

【００７７】キャプシド形成エレメントおよび異種遺伝子を含むポリヌクレオチドは組み込
まれ得るが、それらはまた、エピソーム状態でも存在し得る。

【００７８】いくつかの実施形態において、本発明の単離された組換えポリヌクレオチドは
、ＡＡＶ粒子中のパッケージングに対する上限のサイズと同じサイズを有する。
これらの実施形態のいくつかにおいて、本発明の単離された組換えポリヌクレオ
チドは、約５ｋｂより大きいサイズを有する。これらの実施形態のいくつかにお
いて、本発明の単離された組換えポリヌクレオチドは、約５ｋｂより小さいサイ
ズを有する。これらの実施形態のいくつかにおいて、単離された組換えポリヌク
レオチドのサイズは、約４．７ｋｂ以下である。ＡＡＶ粒子中にパッケージ可能
な組換えポリヌクレオチドのサイズの例は、Ｄｏｎｇら、１９９６、Ｈｕｍａｎ
ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：２１０１−２１１２で例示されるサイズを含むがこ
れらに限定されない。

【００７９】（異種遺伝子を含むＡＡＶ粒子の産生）遺伝子治療のような目的、または細胞中に導入遺伝子を導入するために有用な
組換えＡＡＶ粒子を生成するために、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺
伝子産物を合成するパッケージング細胞、またはパッケージ細胞株は、ＡＡＶ
ＩＴＲまたはＡＡＶＩＴＲのＤ配列以外のキャプシド形成エレメントに作動可
能に連結される異種遺伝子を含む組換えベクターを供給され、その結果、組換え
ベクターが細胞に入り、そしてヘルパーウイルス機能の存在下で、ＡＡＶ粒子中
にパッケージされる。ベクターは、任意の公知の手段（エレクトロポレーション
およびリポフェクションが挙げられるがこれらに限定されない）によりパッケー
ジング細胞中に導入され得る。パッケージング細胞は、ＡＡＶｒｅｐおよびｃ
ａｐ機能を提供し、このＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ機能は、安定にゲノムに組
み込まれるか、またはパッケージング細胞中にエピソームで維持されるか、また
はベクター（例えば、プラスミドベクター）を用いて細胞に一時的にトランスフ
ェクトすることにより産生される、ポリヌクレオチドによりコードされ得、この
ポリヌクレオチドは、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物およびＡＡＶｃａｐ遺伝子産
物をコードする配列を含む。ヘルパー機能は、組換えベクターを細胞に提供する
前、間、または後に、ヘルパーウイルスを用いてパッケージング細胞に感染する
ことにより提供され得る。あるいは、へルパーウイルス機能をコードするヌクレ
オチド配列を含むベクターが、組換えベクターを細胞に提供する前、間、または
後に、細胞に提供され得る。いくつかの実施形態において、組換えベクターは、
一時的に細胞に提供される。他の実施形態において、組換えベクターは、選択マ
ーカーを含み、そしてパッケージング細胞が、選択マーカーに基づいて選択され
、その結果、組換えベクターが、パッケージング細胞のゲノム中に安定に組み込
まれる。他の実施形態において、組換えベクターは、選択マーカーの必要なしに
、パッケージング細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。

【００８０】（異種ポリヌクレオチド）異種ポリヌクレオチドが、発現されるよう意図される場合、一般に、プロモー
ター（それ自体または異種プロモーターのいずれか）に作動可能に連結される。
多数の適切なプロモーターは、当該分野で公知であり、このプロモーターの選択
は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル（構成的発現、誘導性発現、細
胞特異的発現または組織特異的発現などを欲するか否か）に依存する。組換えベ
クターはまた、組換えベクターにより感染された細胞の選択を可能にするための
陽性選択マーカー；および／または陰性選択マーカー（必要または望まれるべき
それらの同じ細胞に対して選択する手段として）を含み得る；例えば、Ｓ．Ｄ．
Ｌｕｐｔｏｎ、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６
０１を参照のこと。

【００８１】例として、組換えベクターが構築され得、この組換えベクターは、プロモータ
ーに作動可能に連結される機能的な嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節ポリ
ペプチド（ＣＦＴＲ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるキ
ャプシド形成エレメントを含む。当該分野で現在公知であるので、嚢胞性線維症
患者由来の細胞においてＣＦＴＲ活性を再構成可能な種々のＣＦＴＲポリペプチ
ドが存在する。例えば、Ｃａｒｔｅｒらは、機能的ＣＦＴＲタンパク質をコード
するＣＦＴＲ遺伝子の短縮改変体を記載している（例えば、米国特許第５，８６
６，６９６号を参照のこと）。また、Ｒｉｃｈら（１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５３：２０５−２０７）（塩化物を輸送可能であり、そして天然に存在するＣ
ＦＴＲ欠損を修正可能である、アミノ酸残基７０８〜８３５を欠失したＣＦＴＲ
誘導体を記載している）、およびＥｇａｎら（１９９３）（正常なＣＦＴＲの電
気生理学的特徴を回復することが可能でもある、別のＣＦＴＲ誘導体（残基１１
９においてネイティブなＣＦＴＲ開始の配列が後に続く、無関係のタンパク質か
ら約２５アミノ酸を含む）を記載した）を参照のこと。２つのさらなる実施例を
とるため、Ａｒｉｓｐｅら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ
８９：１５３９−１５４３）は、残基４３３〜５８６を含むＣＦＴＲフラグメ
ントが、脂質二重層における正確な塩化物チャネルを再構築するのに十分である
ことを示し；そしてＳｈｅｐｐａｒｄら（１９９４、Ｃｅｌｌ７６：１０９１
−１０９８）は、残基８３６において、長さが約半分にまで短縮されたＣＦＴＲ
ポリペプチドは、調節された塩化物チャネルを構築することがなお可能であった
。従って、ネイティブなＣＦＴＲタンパク質、ならびにその変異体およびフラグ
メントの全てが、本発明の実施において有用であるＣＦＴＲポリペプチドを構成
する。

【００８２】他の有用な標的ポリヌクレオチドは、本発明に使用され、多数の異なる適用の
ための組換えベクターを生成し得る。このようなポリヌクレオチドとしては以下
が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）構造的なタンパク質または酵素
の損失（ｍｉｓｓｉｎｇ）レベル、欠陥（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）レベルまたは準
最適（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）レベルにより引き起こされる相対的欠損に対す
る遺伝子治療の他の形態に有用であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
；（ｉｉ）抗センス分子中に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写物ま
たは翻訳因子に結合するおとり（ｄｅｃｏｙ）中に転写されるポリヌクレオチド
；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオ
チド；（ｖ）レシピエント細胞を、特定の薬物に対して感受性にさせ得るポリヌ
クレオチドオチド（例えば、疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子）；および（
ｖｉ）癌治療のためのポリヌクレオチド（例えば、ヒト癌（肺、胸、前立腺およ
び結腸の癌を含む）の５０％以上に関連する損失または損傷したｐ５３の置換の
ための野生型ｐ５３腫瘍サプレッサーｃＤＮＡ）。

【００８３】（哺乳動物パッケージング細胞）本発明は、ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成される組換えポリヌクレオチドのス
トックを産生するために哺乳動物パッケージング細胞を提供し、ここで組換えポ
リヌクレオチドは、ＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメントに作動可
能に連結される異種遺伝子を含み、このエレメントは、ＡＡＶ粒子中に作動可能
に連結される異種遺伝子のキャプシド形成を促進する。

【００８４】ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成される組換えポリヌクレオチドの産生のために
、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物を合成する哺乳動物細胞（
すなわち、パッケージング細胞）が使用される。ここで組換えポリヌクレオチド
は、ＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成エレメントに作動可能に連結される
異種遺伝子、および好ましくはＡＡＶＩＴＲではないＤ配列キャプシド形成
エレメントに作動可能に連結される異種遺伝子を含む。ＡＡＶｒｅｐ遺伝子産
物およびｃａｐ遺伝子産物が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子および
ｃａｐ遺伝子によりコードされ得るか、または組換えベクターの導入前、間、ま
たは後に細胞中に導入されるベクターに含まれるポリヌクレオチドによりコード
され得る。さらに、安定な細胞株が生成され得、この細胞株は、細胞のゲノムに
安定に組み込まれる組換えベクターを含む。

【００８５】得られた組換えベクターの治療的特性は、導入されるプラスミドにより決定さ
れるので、同じパッケージング細胞株は、これらの適用のいずれかにより使用さ
れ得る。特異的な標的ポリヌクレオチドを含むプラスミドが、任意の公知の方法
（エレクトロポレーションが挙げられるがこれに限定されない）によりＡＡＶベ
クターの産生のためにパッケージング細胞中に導入される。

【００８６】安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子および／またはｒｅｐ遺伝子を含む
多くのパッケージング細胞が、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載
される組換えベクターをパッケージングするために使用され得る。例えば、Ｔ．
Ｆｌｏｔｔｅら、ＷＯ９５／１３３６５（ＴａｒｇｅｔｅｄＧｅｎｅｔｉｃ
ｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ）、および対応する米国特許第５，６５８，７７６号；Ｊ．Ｔｒｅｍｐ
ｅら、ＷＯ９５／１３３９２（ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＯｈ
ｉｏ）、および対応する米国特許第５，８３７，４８４号；およびＪ．Ａｌｌｅ
ｎ、ＷＯ９６／１７９４７（ＴａｒｇｅｔｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）を参照のこと。

【００８７】このようなパッケージング細胞としては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：プロモーターに作動可能に連結された安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ
遺伝子および異種プロモーターに作動可能に連結された安定に組み込まれたＡＡ
Ｖｒｅｐ遺伝子を含むパッケージング細胞ＡＡＶｒｅｐ遺伝子（例えば、Ａ
ｌｌｅｎ（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１５８９２）に記載のように）
；異種プロモーターに作動可能に連結され得るＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含むパッ
ケージング細胞；プロモーターに作動可能に連結されるＡＡＶｃａｐ遺伝子を
含むパッケージング細胞。安定に組み込まれる、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝
子を含むパッケージング細胞が使用される場合、キャプシド形成エレメントに作
動可能に連結される異種遺伝子を含む組換えベクターが、細胞中に導入され、そ
して、ヘルパーウイルス機能の存在下で、組換えベクターがＡＡＶ粒子中にパッ
ケージングされる。安定に組み込まれるＡＡＶｒｅｐ遺伝子またはＡＡＶｃ
ａｐ遺伝子含むパッケージング細胞が使用される場合、代表的には、組換えベク
ターの導入の前、同時、または後に導入されるプラスミドベクターにおいて、ト
ランス産物における損失が補充さえる。

【００８８】他の実施形態において、パッケージング細胞は、キャプシド形成エレメントに
作動可能に連結される異種遺伝子を含む組換えベクターの導入前に、同時に、ま
たは後に、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物およびＡＡＶｃａｐ遺伝子産物について
のコード配列を含むベクターを細胞中に導入することにより、ＡＡＶｒｅｐ遺
伝子産物およびＡＡＶｃａｐ遺伝子産物の両方が提供される。プラスミドにコ
ードされるＡＡＶｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子は、必要に応じて
、エピソーマルで維持され得る。

【００８９】他の実施形態において、以下の実施例においてもまた例示される組換えベクタ
ーは、パッケージング細胞株中にそれ自体安定に組み込まれる。このように安定
な、ベクター含有パッケージング株はまた、必要に応じて、ＡＡＶｃａｐ遺伝
子および／またはｒｅｐ遺伝子の安定な染色体のコピーまたはエピソームのコピ
ーを含む。上記のような細胞株は、使用のための準備まで増殖され得、そして保
管され得る。Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を含む細胞において、Ａ
ＡＶ粒子中にパッケージされる組換えベクターの産生を誘導するために、使用者
は、簡単に、細胞にヘルパーウイルスを感染させるか、または任意の方法により
導入されたプラスミドにおけるヘルパー機能を提供し、そしてＡＡＶの複製およ
びパッケージングに適切な条件下で、細胞を培養する（以下に記載されるように
）。

【００９０】（ヘルパーウイルス機能）ヘルパーウイルスは、組換えベクターの導入の前、間または後に導入され得る
。例えば、プラスミドは、ヘルパーウイルスと共に培養物中に同時感染され得る
。次いで、細胞が、適切な期間（代表的には２〜５日）、当該分野で公知の、複
製およびパッケージングに適切な条件で培養される（上記の参考文献および以下
の実施例を参照のこと）。溶解産物が調製され、そして組換えＡＡＶベクター粒
子が、公知の技術により精製される。あるいは、ヘルパーウイルス機能は、プラ
スミドのような組換えベクターにおいて細胞に提供される。

【００９１】（組換えベクターの精製）この方法を用いて調製されるＡＡＶ粒子中にキャプシド形成される組換えベク
ターおよび本発明の組成物は、当該分野で公知の技術に従って精製され得る（例
えば、上記で引用される種々のＡＡＶの参考文献を参照のこと）。あるいは、改
良された精製技術が使用され得る（例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎら、国際特許出願
番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００により記載される技術）。

【００９２】（本発明のキャプシド形成された組換えベクターを用いた、細胞中への異種遺
伝子の導入）ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成される組換えベクターが、本明細書中および当
該分野で引用される参考文献に記載されるように使用され、ポリヌクレオチドを
送達し、インビトロ、インビボ、またはエキソビボのいずれかで細胞を標的化し
得る。インビボの送達のために、ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成される組換えベ
クターは、代表的に、生殖不能性、安定性および／または活性を促進する１つ以
上の成分を必要に応じて含み得る生理学的に適切な緩衝溶液中に含まれる。本体
内の所望の位置にベクター調製物を導入するのに都合のいい任意の手段（例えば
、以下を含む：静脈内注射または局在化された注射により、カテーテルからの注
入によりまたはエーロゾル送達により）が、使用され得る。

【００９３】以下に提示される実施例は、当該分野の実施者に対するさらなるガイドとして
提供され、そして任意の方法における限定であることを意味しない。

【００９４】（実施例）（実施例１）（異種遺伝子に作動可能に連結されたＡＡＶＩＴＲではないキャプシド形成
エレメントを含む組換えベクター構築物、およびそのベクターを含む細胞）（１．例示的キャプシド形成エレメントとしてのＰ１を用いた組換えベクター
の構築）本発明者らがキャプシド形成エレメントの供給源として使用した、例示的Ｐ１
配列が、ＡＡＶＳ１座のヌクレオチド３５４−４６８を含む（Ｋｅｌｍａｎら
（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４：１８５−１９５；
Ｗｅｉｔｚｍａｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１
：５８０８−５８１７）。Ｐ１キャプシド形成エレメントのヌクレオチド配列（
配列番号１および２）は、以下に示され、以下を含む：配列番号１のヌクレオチ
ド１９−２４（すなわち、ＡＡＶＳ１座のヌクレオチド３７２−３７７）にお
ける推定末端消化部位（ＴＲＳ）、および配列番号１のヌクレオチド３３−４８
（すなわち、ＡＡＶＳ１座のヌクレオチド３８６−４０１）における推定ｒｅ
ｐ結合モチーフ（ｒｅｐ結合部位またはＲＢＳとしてもまた公知のＲＢモチーフ
）。ＴＲＳのチミジンとの間に位置される推定ｒｅｐ切断がまた示される（下方
を示す矢印により）。

【００９５】

【化１】（２．ｐ５ｒｅｐｃａｐの構築）本発明者らは、Ｐ１エレメント（上記のような）を、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子お
よびＡＡＶｃａｐ遺伝子に連結し、それらが、ネイティブなＡＡＶプロモーター
に作動可能に連結されるのを維持した。そのプロセスにおける最初の工程として
、ネイティブなｐ５、ｐ１９およびｐ４０プロモーターに転写性で連結される配
列をコードするＡＡＶｒｅｐおよびＡＡＶｃａｐを含み、そしてＡＡＶ２ポ
リアデニル化シグナルにつながれたＡＡＶパッケージカセット（ｐ５ｒｅｐｃａ
ｐ）を、以下のように構築した。簡単には、ヌクレオチド１９３〜３７９を含む
ｐＡＶ２からのフラグメント（Ｓｉｒｖａｓｔｉｖａら（１９８３）Ｊ．ｖｉｒ
ｏｌ．４５：５５５−５６４）を、ＰＣＲ増幅により得た。ＰＣＲプライマーの
設計は、増幅されたフラグメントの５’末端のＢｇｌＩＩ部位および３’末端の
近くに包含されたＰｐｕＭＩ部位（ＡＡＶ−２ヌクレオチド３５０において）の
付加を生じた。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡを、ＢｇｌＩＩおよびＰｐｕＭＩを用い
て設計し、ＡＡＶ−２ヌクレオチド１９３−３５０を含む制限フラグメントを生
成した。ｐＡＶ２のヌクレオチド３５１−４４９８を含む制限フラグメントを、
ＰｐｕＭＩおよびＳｎａＢＩを用いた設計によりｐＡＶから単離した。これらの
２つのフラグメント（ｐＡＶ２のヌクレオチド１９３−４４９８を表す）を、４
方向連結（ｆｏｕｒ−ｗａｙｌｉｇａｔｉｏｎ）において、ｔｇＬＳ（＋）Ｈ
ｙＴＫレトロウイルスベクター（Ｓ．Ｄ．Ｌｕｐｔｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１：３３７４−３３７８、１９
９１）中に連結した。４方向連結はまた、ｔｇＬＳ（＋）ＨｙＴＫのＳｔｕＩ−
ＢｓｔＥＩＩフラグメントおよびｔｇＬＳ（＋）ＨｙＴＫのＢｓｔＥＩ−Ｓｔｕ
Ｉフラグメントを含み、これらに、ＢｇｌＩＩリンカーがＳｔｕＩ末端に結合さ
れた。この連結は、ｔｇＬＳ（＋）ＨｙＴＫ−ｒｅｐｃａｐを生成した。引き続
き、ｔｇＬＳ（＋）ＨｙＴＫ−ｒｅｐｃａｐからのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩフラグ
メント（ネイティブな、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０プロモーターに転写性で連結
され、そしてＡＡＶ２ポリアデニル化シグナルが続く、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およ
びＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む）を単離し、そしてｐＳＲ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）
のＢａｍＨＩおよびＣｌａＩ部位中にクローン化した。

【００９６】（３．ｐ５ｒｅｐｃａｐＤＨＦＲの構築）発現プラスミドｐ５ｒｅｐｃａｐＤＨＦＲを、構築物ｐ５ｒｅｐｃａｐ（実施
例１、第２節）および選択マーカーとして改変型ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（
ＤＨＦＲ）を含む、組み込みパッケージング細胞株を生成する目的で、構築した
。詳細には、ｐ５ｒｅｐｃａｐ（実施例１、第２節）を、ｒｅｐ遺伝子のすぐ上
流に位置するＰｖｕＩＩ部位で線状化し、そしてｐＦＲ４００（Ｓｉｍｏｎｓｅ
ｎら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２４
９５〜２４９９）の１．８ｋｂフラグメントに平滑末端連結した。このｐＦＲ４
００フラグメントは、ＳＶ４０初期プロモーターに転写により連結される改変型
ＤＨＦＲ遺伝子（メトトレキサート（Ｍｔｘ）について親和性が減少している）
を含み、その後にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原遺伝子由来のポリアデニ
ル化部位を含む。このｐＦＲ４００フラグメントを、まずＳａｌＩで消化し、続
いて４塩基対を充填し（平滑末端を生成し）、その後ＰｖｕＩＩ消化およびゲル
精製を行って調製した。生じた構築物ｐ５ｒｅｐｃａｐＤＨＦＲ（図４）は、上
流のＳＶ４０初期プロモーターおよび下流のＢ型肝炎ウイルスポリアデニル化部
位により転写が調節されている、ＤＨＦＲ遺伝子を含む。このＤＨＦＲ翻訳カセ
ットのすぐ下流に、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が存在し、その後
に、ＡＡＶポリアデニル化部位が続く。

【００９７】（４．ｒｅｐｃａｐ含有プラスミドへのＰ１の付加：Ｐ１ＲＣＤの構築）次いで、Ｐ１エレメント（実施例１、第１節）を発現プラスミドｐ５ｒｅｐｃ
ａｐＤＨＦＲ（実施例１、第３節）中に組み込んだ。このパッケージングカセッ
トを含むプラスミド「Ｐ１ＲＣＤ」の構築において、Ｐ１エレメントを、ｐ５ｒ
ｅｐｃａｐＤＨＦＲ中のＡＡＶポリアデニル化シグナルの下流に挿入して、Ｐ１
エレメントから開始する複製がまずｃａｐ遺伝子へと進行し、次いでｒｅｐ遺伝
子へと進行する（すなわち、複製が、アンチセンス鎖上のＴＲＳの３’−ＯＨで
開始し、そして５’から３’への方向でｃａｐ遺伝子へと進行する）ような方向
にした。ｐ５ｒｅｐｃａｐＤＨＦＲへのＰ１エレメントの挿入を容易にするため
に、１対のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドは、Ｂｇｌ
ＩＩ制限部位と適合する末端に隣接するＰ１配列を含む（下記の配列、配列番号
３および４を参照のこと）。この対をアニールさせ、次いでＡＡＶポリアデニル
化部位のすぐ下流に位置するＢｇｌＩＩ部位（実施例１、第３節、ヌクレオチド
６２１７）で事前に線状化したｐ５ｒｅｐｃａｐＤＨＦＲに連結した。Ｐ１ＲＣ
Ｄと称するクローンを選択した。このクローンは、Ｐ１で開始した複製がｃａｐ
遺伝子およびｒｅｐ遺伝子の方向で進行するような方向で、Ｐ１インサートを含
む（図５）。このベクターは、ＡＡＶＩＴＲ配列を含まない。

【００９８】

【化２】（５．ｒＡＡＶベクターＡＣＡＰＳＮの構築）プラスミドＡＣＡＰＳＮを、以下のように、Ｌｙｎｃｈら（１９９７）Ｃｉｒ
ｃ．Ｒｅｓ．８０：４９７〜５０５およびＰＣＴ公開ＷＯ９７／３２９９０に
従って構築した。そのＩＴＲ配列およびプラスミド骨格は、ＡＡＶ−ＣＦＴＲ（
Ａｆｉｏｎｅら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３２３５〜３２４１）に由
来した。簡単に述べると、そのＡＡＶ−ＣＦＴＲベクターをＸｈｏＩおよびＳｎ
ａＢＩで消化し、そしてそのＩＴＲおよびプラスミド骨格をゲルで単離した。Ｃ
ＭＶプロモーターの一部を含むＸｈｏＩ〜ＳｎａＢＩフラグメント（ヌクレオチ
ド−６７１〜−４６４）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ４１：５２１
〜５３０（１９８５）を参照のこと］をゲルで単離し、そしてＡＡＶ−ＣＦＴＲ
由来のＩＴＲプラスミド骨格フラグメントに連結して、「ｐＡＡＶ−ＣＭＶ（Ｓ
ｎａＢＩ）」を作製した。次いで、合成ポリアデニル化シグナルを含むＳｐｅＩ
〜ＳｎａＢＩフラグメントを、ＳｐｅＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＡＡＶ−ＣＭＶ
（ＳｎａＢＩ）に挿入して、「ｐＡＡＶ−ＣＭＶ（ＳｐｅＩ）−ｓｐＡ」を作製
した。このｐＡＡＶ−ＣＭＶ（ＳｐｅＩ）−ｓｐＡベクターは、ＣＭＶプロモー
ターのヌクレオチド−６７１〜−５８４を含む。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉネオマイ
シン遺伝子を分けるシミアンウイルス４０プロモーターに連結されたヒト胎盤ア
ルカリホスファターゼｃＤＮＡ配列を、ＬＡＰＳＮ［例えば、Ｃｌｏｗｅｓら、
１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４〜６５１を参照のこと］
からＳｐｅＩ〜ＮｈｅＩフラグメントとして単離し、そしてｐＡＡＶ−ＣＭＶ（
ＳｐｅＩ）−ｓｐＡ（ＳｐｅＩで線状化した）に挿入して、「ｐＡＡＶ−ＡＰＳ
Ｎ」を作製した。ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド−５８５〜＋７１を含むＳ
ｐｅＩ〜ＮｈｅＩフラグメントをＳｐｅＩで線状化したｐＡＡＶ−ＡＰＳＮに挿
入して、ベクター「ＡＣＡＰＳＮ」を作製した。

【００９９】（６．Ｐ１ＲＣＤを含むパッケージング細胞株の作製）Ｐ１エレメント（Ｐ１ＲＣＤ）を含む組み込みＡＡＶパッケージングカセット
を有するポリクローナル細胞株を、ＨｅＬａ細胞のエレクトロポレーションによ
って作製した。詳細には、４×１０⁶個のＨｅＬａ細胞を、ＰｖｕＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼで線状化した１２μｇのＤＮＡ（Ｐ１ＲＣＤ）でエレクトロポレ
ーションした。このＰｖｕＩＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＳＶ４０プロモータ
ー−ＤＨＦＲ遺伝子カセットのすぐ上流で切断する。この細胞を、ＢｉｏＲａｄ
ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを０．２５ボルトおよび９６０μＦにて使用して、無
血清ＤＭＥＭ中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、
細胞をダルベッコ改変イーグル培地、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリンおよ
びストレプトマイシン（ＤＭＥＭ完全）中に再懸濁し、そして１０％ＣＯ₂の
加湿空気中で３７℃で回復させた。２４時間後、細胞を、５００ｎＭメトトレキ
サートを含む完全培地における選択に供した。

【０１００】（７．Ｐ１ＲＣＤクローン細胞株の作製）Ｐ１ＲＣＤポリクローナル細胞を、１０％の透析済みウシ胎仔血清、１％ペニ
シリン、ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミン＋５００ｎＭメトトレキサ
ートを含むＤＭＥＭ中の密度１細胞／ウェル、０．３細胞／ウェルおよび０．１
細胞／ウェルにて、９６ウェルプレートにプレーティングした。ウェルを細胞増
殖および単コロニーの存在について視察した。１ウェルあたりポジティブなウェ
ルが１５個以下である９６ウェルプレート由来でありかつ単コロニーを含むウェ
ル由来のクローンを、増殖させた。細胞を、１０％の透析済み血清を含むＤＭＥ
Ｍ中の５００ｎＭメトトレキサートの選択下に、個々のクローンを凍結するまで
維持した。クローンをＰ１ＲＣＤ構築物の存在についてスクリーニングした。ポ
ジティブなクローン細胞株を液体窒素中で凍結および保存した。Ｐ１ＲＣＤ構築
物を含むＣ２９クローン細胞株を、後の実験のために選択した。

【０１０１】（８．プロデューサー細胞株Ｐ１／ＡＣＡＰＳＮおよびＰ１／ＡＬｉｎＢｇの
作製）プロデューサー細胞株Ｐ１／ＡＣＡＰＳＮを、上記のＰ１ＲＣＤパッケージン
グ株と同様の様式で、Ｐ１ＲＣＤＣ２９パッケージング細胞をエレクトロポレ
ーションすることによって作製した。詳細には、４×１０⁶個のＰ１ＲＣＤＣ
２９細胞を、ＸｍｎＩエンドヌクレアーゼで線状化した１０μｇのｔｇＡＣＰ
ＳＮＤＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション条件は、
実施例１、第６節に記載されている。エレクトロポレーション後、細胞をＤＭＥ
Ｍ完全中に再懸濁し、そして３７℃で２４時間回復させた。次いで、細胞を、１
ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含む完全培地中での選択に供した。Ｐ１／ＡＣＡＰＳＮ
のクローンを、上記（実施例１、第７節）の様式で１ｍｇ／ｍｌＧ４１８を選
択培地として使用して選択し、そして増殖させた。Ｐ１／ＡＣＡＰＳＮＣ１９
細胞株を、後の実験のために選択した。クローンを、実施例２に従って、ＡＣＡ
ＰＳＮビリオンを生成する能力についてスクリーニングした。

【０１０２】Ｐ１／ＡＬｉｎＢｇクローンを、Ｐ１ＲＣＤＣ２９細胞をＡＬｉｎＢｇＤ
ＮＡでエレクトロポレーションすることによって、同様の様式で作製した。

【０１０３】（実施例２）（Ｐ１エレメントは、ＡＡＶ粒子への作動可能に連結された遺伝子のキャプシ
ド形成を促進する）（１．ビリオンの作製）Ｃ２９細胞（実施例１、第７節）を、Ｔ２２５ｃｍ²フラスコ中に密度５×１
０⁶細胞で播種し、１日後にアデノウイルス（Ａｄ）に感染させた。４連のフラ
スコに播種した。２４時間後、１フラスコの細胞をトリプシンで処理し、そして
細胞数を計数した。残りの３つのフラスコの細胞を、感染多重度１０でＡｄに感
染させた。７２時間後、細胞を遠心分離により収集し、そして５０ｍＭＴＲＩ
Ｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール（
ＴＭＥＧ）中に濃度５×１０⁶細胞／ウェルになるように再懸濁した。細胞を、
凍結／融解（−７０℃／３７℃）サイクルおよび超音波処理（４×１５秒バース
ト）反復に供した。９５％を超える細胞が溶解したのを確認した後、細胞破片を
低速遠心分離により除去した。生じた清澄化した溶解物を、キャプシド形成した
Ｐ１ＲＣＤＤＮＡ配列の存在について試験した。

【０１０４】（２．ＤＲＰスロットブロット分析）キャプシド形成したＤＮＡ配列を、清澄化した溶解物のＤＮａｓｅ処理後のＤ
ＮＡハイブリダイゼーションによって試験した。多数の放射能標識プローブを作
製した。これらのプローブ（ｃａｐ；ｒｅｐ−ｃａｐ；ＤＨＦＲ＃１（ＤＨＦＲ
遺伝子およびＢ型肝炎ポリアデニル化シグナル）；ならびにＤＨＦＲ＃２（ＤＨ
ＦＲコード配列のみ））は、Ｐ１ＲＣＤ構築物にまたがった。ＤＮａｓｅ耐性粒
子（ＤＲＰ）の数を、各スロットブロットに関して含まれた標準曲線との比較に
よって定量した。Ｐ１ＲＣＤプラスミドＤＮＡを使用して、スタンダードを作成
した。

【０１０５】ＤＮａｓｅ耐性（すなわち、キャプシド形成した）ＤＮＡ配列を、Ｃ２９細胞
から作製した清澄化した溶解物にて、Ｐ１ＲＣＤプローブの各々を用いて、以下
の表１に示されるように検出した。一般的に、ＤＮａｓｅ耐性粒子の数は、ほぼ
１×１０¹⁰／ｍＬ程度であった。このレベルのキャプシド形成は、ＡＡＶベクタ
ーゲノムのＩＴＲ媒介性パッケージングにて代表的に観察されるレベルに匹敵す
る。

【０１０６】表１

【０１０７】

【表１】（実施例３）（Ｐ１キャプシド形成エレメントの特徴付け）（１．Ｐ１キャプシド形成エレメントは、キャプシド形成ＤＮＡに含まれる）ＤＮａｓｅ耐性（すなわち、キャプシド形成した）ＤＮＡ配列を、Ｐ１プロー
ブを使用してＣ２９細胞から作製した清澄化した溶解物にて検出した。Ｐ１エレ
メントを含むオリゴヌクレオチドを合成し、アニールさせ、そして末端標識した
。ｒｅｐ−ｃａｐプローブ、ｃａｐプローブ、およびＤＨＦＲプローブで以前に
検出したのと同様の数のビリオンを、Ｐ１プローブ（２×１０¹⁰ＤＲＰ／ｍＬ）
を用いて検出した。このことは、Ｐ１キャプシド形成エレメントが、このキャプ
シド形成されたＤＮＡ配列中に含まれることを示す。

【０１０８】（２．Ｐ１キャプシド形成エレメントは、等比のセンスＤＮＡ鎖およびアンチ
センスＤＮＡ鎖のキャプシド形成を促進する）ＤＮａｓｅ処理したＣ２９の清澄化溶解物の２連のスロットブロットに、Ｐ１
エレメントの５’から３’への配列を示すオリゴヌクレオチドプローブおよび３
’から５’への配列を示すオリゴヌクレオチドプローブで、個々にハイブリダイ
ズさせた。このセンスＰ１プローブおよびアンチセンスＰ１プローブを用いて観
察されるＤＲＰの力価は、それぞれ、２．６×１０¹⁰ ＤＲＰ／ｍＬおよび１．
３×１０¹⁰ＤＲＰ／ｍＬであった。Ｐ１キャプシド形成エレメントは、等頻度で
いずれかの極性のＤＮＡ鎖のキャプシド形成を指示するようである。

【０１０９】（３．Ｐ１キャプシド形成エレメントは、ＩＴＲ配列の存在下でのベクタープ
ロデューサー細胞株におけるパッケージングを促進する）ＤＮａｓｅ処理したＰ１／ＡＣＡＰＳＮＣ１９の清澄化溶解物のスロットブ
ロットに、上記の実施例２、第２節に記載されるｃａｐプローブ、ＤＨＦＲ＃１
プローブおよびＤＨＦＲ＃２プローブでハイブリダイズさせた。存在するＡＣＡ
ＰＳＮベクター粒子の数もまた、ＣＭＶプローブを使用して決定した。結果を表
２に示す。「ＮＡ」は、「適用できない」を示す。

【０１１０】表２

【０１１１】

【表２】ＤＮＡ配列のＩＴＲ促進性キャプシド形成およびＰ１促進性キャプシド形成の
両方は、Ｐ１／ＡＣＡＰＳＮＣ１９の清澄化溶解物にて観察された。Ｐ１に作
動可能に連結された組換えポリヌクレオチドを含む粒子の力価（すなわち、Ｐ１
指示性キャプシド形成）は、Ｃ２９クローン細胞株（ＩＴＲに隣接するＡＣＡＰ
ＳＮベクターカセットを欠く）にて以前に観察されるより１／２ｌｏｇ低かっ
た。これらのデータは、このＰ１エレメントが、真正な（ｂｏｎａｆｉｄａ）
ＡＡＶＩＴＲパッケージングシグナルの存在下でさえ、パッケージングシグナ
ルとして機能し得ることを示す。

【０１１２】（４．Ｐ１エレメントを含むＨｅＬａ細胞由来の精製組換えベクター調製物に
おけるキャプシド形成したＤＮＡ配列）大スケールのベクター調製物を、Ｐ１／ＡＣＡＰＳＮＣ１９細胞株から作製
し、そしてＣｓＣｌ超遠心分離およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製
した。２つの別個のロット（ｌｏｔ）のベクターを作製した。ＡＣＡＰＳＮベク
ター粒子に加えて、その精製調製物は、Ｐ１に作動可能に連結された組換えポリ
ヌクレオチドを含む、キャプシド形成したＤＮａｓｅ耐性粒子を含んだ。

【０１１３】別のＰ１プロデューサー細胞株を、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を
保有するＡＡＶベクター（ＡＬｉｎＢｇ）から独立して作製した。Ｐ１／Ａｌｉ
ｎＢｇプロデューサー細胞株から作製したベクター調製物はまた、ＡＬｉｎＢｇ
ベクター粒子に加えて、Ｐ１に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドを
含む、ＤＮａｓｅ耐性粒子を含んだ。

【０１１４】（サザン分析）Ｐ１−キャプシド形成ＤＮＡを、サザンブロット分析により試験した。Ｐ１／
ＡＣＡＰＳＮ細胞株およびＰ１／ＡＬｉＮＢｇ細胞株由来の精製ビリオンを溶解
し、そしてアルカリゲルにおける電気泳動により、そのキャプシド形成ＤＮＡを
分画した。図６に示されるように、ｒｅｐ−ｃａｐプローブでハイブリダイズし
た場合に、サイズが約４．７ｋｂの顕著なバンドが、すべてのベクターのロット
にて観察された。このことは、Ｐ１パッケージングシグナルを使用してパッケー
ジされた優勢なＤＮＡ種が、野生型ＡＡＶゲノムの長さとサイズが同様であるこ
と（すなわち、正常なＡＡＶパッケージング能力）を示唆する。

【０１１５】従って、２つの別個のＡＡＶベクターおよびＣ２９パッケージング細胞株に独
立して由来する２つのプロデューサー細胞株を使用して、本発明者らは、シス連
結した配列のＰ１促進性キャプシド形成を観察した。さらに、Ｐ１促進性パッケ
ージングが、組換えＡＡＶベクターのＩＴＲ媒介性キャプシド形成の存在下で生
じた。このＰ１によりパッケージされた配列を、ＣｓＣｌ等密度超遠心分離によ
りｒＡＡＶビリオンと同時精製した。これは、ＤＮａｓｅでの処理および５４℃
まで１０分間の加熱に生き残った。このことは、Ｐ１が、丈夫でありかつ組換え
ＡＡＶベクターに使用される方法により精製され得るＡＡＶ粒子へのキャプシド
形成を促進することを示す。

【０１１６】（実施例４）（ＣＦＴＲのコード配列に作動可能に連結されたＰ１エレメントを含む組換え
ポリヌクレオチドの構築およびキャプシド形成）ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む領域を、ＢｇｌＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼ消化によってＰ１ＲＣＤから切り出し、そしてＰ１エレメントお
よびＤＨＦＲ遺伝子を含むフラグメントを、単離する。ＣＦＴＲをコードしかつ
Ｐ１含有フラグメントにかかる適合性制限エンドヌクレアーゼを有する、ＤＮＡ
フラグメントを単離する。このＰ１含有フラグメントを、ＣＦＴＲをコードする
ＤＮＡフラグメントに連結して、Ｐ１エレメントがＣＦＴＲをコードする配列に
作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドを作製する。

【０１１７】この組換えポリヌクレオチドを、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝
子産物を生成する哺乳動物細胞株に導入し、その後その細胞株をＡｄヘルパーウ
イルスに感染させる。

【０１１８】細胞を、上記のように溶解し、そして清澄化した溶解物にてＤＲＰを測定し、
次いで、Ｐ１エレメントにハイブリダイスするプローブおよびＣＦＴＲコード領
域にハイブリダイズするプローブを用いるスロットブロットハイブリダイゼーシ
ョンによって分析する。

【０１１９】上記の発明は、理解を明確にするために例示および例によっていくらか詳細に
記載されているが、特定の変更および改変が実施されることは、当業者に明らか
である。従って、この説明および実施例は、本発明の範囲の限定すると解釈され
るべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって描写される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｐ１エレメントを含むＳｍａＩフラグメントのヌクレオチド配列を示
す。ＳｍａＩには、下線が引かれている。

【図２】図２は、６２−ヌクレオチドＰ１キャプシド形成エレメント（上のライン）と
ＡＡＶ２ＩＴＲのヌクレオチド１４５〜７９（下のライン）との間のヌクレオ
チド配列整列を示す。末端分解部位には下線が引かれ、Ｒｅｐ６８／Ｒｅｐ７８
結合部位が太字で示され、そしてＡＡＶ２ＩＴＲの２０ヌクレオチドＤ配列は
斜字体で太字である。垂直な線は、ヌクレオチド同一性を示す。点線によって示
される、５つのヌクレオチドのギャップは、最適な整列のためにＰ１配列に導入
された。

【図３】図３は、６２−ヌクレオチドＰ１キャプシド形成エレメント（上のライン）と
種々のＡＡＶ血清型のＩＴＲのヌクレオチド（下のライン）との間のヌクレオチ
ド配列整列を示す。末端分解部位には下線が引かれ、Ｒｅｐ６８／Ｒｅｐ７８結
合部位が太字で示され、そして垂直な線は、ヌクレオチド同一性を示す。図２に
示されるＡＡＶ２ＩＴＲとの整列と同様に、点線によって示されるギャップは
、最適な整列のためにＰ１配列に導入された。

【図４】図４は、ｐ５ｒｅｐｃａｐＤＨＦＲプラスミドのマップを示す。

【図５】図５は、Ｐ１ＲＣＤプラスミドのマップを示す。

【図６】図６は、実施例３に記載される、ＡＡＶ粒子中にキャプシド形成された組換え
ベクターのサイズを決定するために実施された実験結果を示すオートラジオグラ
フを示す。左側にある数は、キロ塩基でのＤＮＡのサイズである。レーン１、プ
ラスミドＰ１ＲＣＤからのＮａｅＩフラグメントに対する４．８ｋｂＢｇｌ
ＩＩ；レーン２、Ｃ２９細胞由来の溶解産物の１０⁸ＤＲＰ；レーン３、ＤＮ
ａｓｅで処理したＣ２９細胞由来の溶解産物の１０⁸ＤＲＰ；レーン４、Ｐ１／
ＡＣＡＰＳＮ由来のロット１精製ビリオンの１０⁹ＤＲＰ；レーン５、Ｐ１／Ａ
ＣＡＰＳＮ由来のロット１精製ビリオンの１０⁸ＤＲＰ；レーン６、Ｐ１／ＡＣ
ＡＰＳＮ由来のロット２精製ビリオンの１０⁹ＤＲＰ；レーン７、Ｐ１／ＡＣＡ
ＰＳＮ由来のロット２精製ビリオンの１０⁸ＤＲＰ；レーン８、Ｐ１／ＡＬｉｎ
Ｂｇ由来のロット１精製ビリオンの１０⁸ＤＲＰ；レーン９、Ｐ１／ＡＬｉｎＢ
ｇ由来のロット２精製ビリオンの１０⁸ＤＲＰ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リンチ，カーメルエム．アメリカ合衆国ワシントン 98028，ケンモア，エヌ．イー．， 78ティーエイチアベニュー 15016 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA02 CA03 DA02 EA02 GA11 HA17 4B065 AA90X AA95Y BA02 BA03 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子においてキャプシド形成
された組換えポリヌクレオチドを生成するための方法であって、該方法は、ＡＡ
Ｖｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を産生する哺乳動物細胞を提供する工程を包
含し、ここで、該哺乳動物細胞は該ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチ
ドは、キャプシド形成エレメントに作動可能に連結された異種遺伝子を含み、該
キャプシド形成エレメントは、該異種遺伝子のＡＡＶ粒子内へのキャプシド形成
を促進し、そしてここで、該キャプシド形成エレメントはＡＡＶ逆方向末端反復
（ＩＴＲ）またはそのＤ配列以外である、方法。
【請求項２】前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１と少なくとも
約３０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１と少なくとも
約４７％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項
１に記載の方法。
【請求項４】前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列の少なくとも約３５個連続したヌクレオチドを含む、請求項１に
記載の方法。
【請求項５】前記キャプシド形成エレメントが、末端分解部位を含む、請
求項１に記載の方法。
【請求項６】前記キャプシド形成エレメントが、ＡＡＶＲｅｐ６８およ
びＲｅｐ７８タンパク質に対する結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記キャプシド形成エレメントが、末端分解部位ならびにＡ
ＡＶＲｅｐ６８およびＲｅｐ７８タンパク質に対する結合部位を含む、請求項
１に記載の方法。
【請求項８】請求項１に記載の方法であって、前記キャプシド形成エレメ
ントは、ヌクレオチド配列ＧＧＴＴＧＧ（Ｘ）ｎＧＣＸＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣ
ＴＸを含み、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、そしてｎは、１〜約２
０の整数である、方法。
【請求項９】前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１のヌクレオチ
ド１９〜４８の配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１に示される
ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記キャプシド形成エレメントのキャプシド形成活性が、
ヘルパー機能によって活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記ヘルパー機能が、アデノウイルスよって提供される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】請求項１に記載の方法であって、前記哺乳動物細胞によっ
て産生される前記ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物が、該細胞のゲノム内
に安定に組み込まれている、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子によってコード
される、方法。
【請求項１４】前記ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物が、染色体外
ポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】単離された組換えポリヌクレオチド配列であって、該配列
は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはＡＡＶＩ
ＴＲＤ配列以外のキャプシド形成エレメントによって隣接される異種遺伝子を
含み、ここで、該キャプシド形成エレメントが、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺
伝子産物ならびにヘルパーウイルス機能の存在下で、該異種遺伝子のキャプシド
形成を促進する、単離された組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチドで
って、ここで、前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１と少なくとも約３
０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレ
オチド。
【請求項１７】請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチドで
って、ここで、前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１と少なくとも約４
７％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレ
オチド。
【請求項１８】請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチドで
あって、前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１に示されるヌクレオチド
配列の少なくとも約３５個連続したヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１９】前記キャプシド形成エレメントが、末端分解部位を含む、
請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項２０】前記キャプシド形成エレメントが、ＡＡＶＲｅｐ６８お
よびＲｅｐ７８タンパク質に対する結合部位を含む、請求項１５に記載の単離さ
れた組換えポリヌクレオチド。
【請求項２１】前記キャプシド形成エレメントが、末端分解部位ならびに
ＡＡＶＲｅｐ６８およびＲｅｐ７８タンパク質に対する結合部位を含む、請求
項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項２２】請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチドで
あって、前記キャプシド形成エレメントが、ヌクレオチド配列ＧＧＴＴＧＧ（Ｘ
）ｎＧＣＸＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＸを含み、ここで、Ｘは、任意のヌクレオ
チドであり、そしてｎは、１〜約２０の整数である、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１のヌクレオ
チド１９〜４８の配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の単
離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項２４】前記キャプシド形成エレメントが、配列番号１に示される
ヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオ
チド。
【請求項２５】前記キャプシド形成エレメントのキャプシド形成活性が、
ヘルパー機能によって活性化される、請求項１５に記載の単離された組換えポリ
ヌクレオチド。
【請求項２６】前記ヘルパー機能が、アデノウイルスよって提供される、
請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項２７】請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチドで
あって、前記哺乳動物細胞によって産生された前記ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ
遺伝子産物が、該細胞のゲノム内に安定に組み込まれている、ＡＡＶｒｅｐお
よびｃａｐ遺伝子によってコードされる、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】前記ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物が、染色体外
ポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１５に記載の単離された組換え
ポリヌクレオチド。
【請求項２９】前記異種遺伝子が、機能的ＣＦＴＲポリペプチドをコード
する、請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項３０】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にキャプシド形成さ
れた異種遺伝子を含む組換えポリヌクレオチドのストックを産生し得るパッケー
ジング細胞を作製するための方法であって、該方法は、ＡＡＶｒｅｐおよびｃ
ａｐ遺伝子産物を産生する哺乳動物細胞を該組換えポリヌクレオチドでトランス
フェクトし、ここで、該組換えポリヌクレオチドは、ＡＡＶ逆方向末端反復（Ｉ
ＴＲ）またはＡＡＶＩＴＲＤ配列以外のキャプシド形成エレメントに作動可
能に連結された異種遺伝子を含み、ここで、該キャプシド形成エレメントが、該
異種遺伝子のＡＡＶ粒子内へのキャプシド形成を促進する、方法。
【請求項３１】請求項３０に記載の方法であって、前記哺乳動物細胞によ
って産生される前記ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物が、該細胞のゲノム
内に安定に組み込まれている、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子によってコー
ドされる、方法。
【請求項３２】前記ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物が、染色体外
ポリヌクレオチドによってコードされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】前記組換えポリヌクレオチドが、選択マーカーをさらに含
む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】前記組換えポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノム内に組
み込まれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】請求項１８に方法によって産生されるパッケージング細胞
。
【請求項３６】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にキャプシド形成さ
れた異種遺伝子を含む組換えポリヌクレオチドのストックを産生するための哺乳
動物パッケージング細胞であって、該パッケージング細胞は、該組換えポリヌク
レオチドを含み、ここで、該細胞は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐおよ
びｃａｐ遺伝子産物を産生し、そしてここで、該組換えポリヌクレオチドは、Ａ
ＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはＡＡＶＩＴＲＤ配列以外のキャプシド
形成エレメントに作動可能に連結された異種遺伝子を含み、ここで、該キャプシ
ド形成エレメントが、該異種遺伝子のキャプシド形成を促進する、細胞。
【請求項３７】前記ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物が、前記細胞のゲノム
内に安定に組み込まれている遺伝子によってコードされる、請求項３６に記載の
哺乳動物パッケージング細胞。
【請求項３８】前記ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物が、染色体外遺伝子に
よってコードされる、請求項３６に記載の哺乳動物パッケージング細胞。
【請求項３９】前記組換えベクターが、エピソーム的に維持される、請求
項３６に記載の哺乳動物パッケージング細胞。