DE69738351T2

DE69738351T2 - Verfaheren zur durch rekombinante adeno-assoziierte virus-gerichtete gentherapie

Info

Publication number: DE69738351T2
Application number: DE69738351T
Authority: DE
Inventors: James M. Gladwyne Wilson; Krishna J. New Orleans Fisher
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 2008-11-13
Anticipated expiration: 2017-09-05
Also published as: CA2264483A1; DE69738351D1; DE69739860D1; CA2264483C; EP1696036A1; KR20000068501A; ATE465267T1; ES2344660T3; ATE380037T1; AU723497B2; EP0932418B1; AU4479597A; AU723497C; IL128779A0; EP0932418A2; CN1233291A; JP2001500497A; EP1696036B1; WO1998009657A3; WO1998009657A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Adeno-assoziiertes Virus (AAV) ist ein replikationsdefizientes Parvovirus, dessen Genom eine Länge von etwa 4,6 kb besitzt, einschließlich 145 Nukleotiden invertierter terminaler Sequenzwiederholungen (ITRs). Das einzelsträngige DNA-Genom von AAV enthält Gene, die verantwortlich sind für die Replikation (rep) und die Bildung der Virionen (cap).
Wenn dieses nicht-pathogene Human-Virus eine menschliche Zelle infiziert, so integriert sich das virale Genom in Chromosom 19, was zu einer latenten Infektion der Zelle führt. Die Produktion von infektiösem Virus und die Replikation des Virus erfolgen nicht eher, als bis die Zelle mit einem lytischen Helfervirus, wie etwa einem Adenovirus oder Herpesvirus, co-infiziert wird. Bei der Infektion mit einem Helfervirus wird das AAV-Provirus freigesetzt und amplifiziert, und es werden sowohl AAV als auch Helfervirus produziert.
AAV besitzt einzigartige Merkmale, die es attraktiv als einen Vektor zur Auslieferung von Fremd-DNA an Zellen machen. Verschiedene Gruppen haben die potentielle Verwendung von AAV bei der Behandlung von Krankheitszuständen untersucht.
Studien von rekombinantem AAV (rAAV) in vitro sind aufgrund der niedrigen Transduktionshäufigkeiten enttäuschend gewesen; die Inkubation von Zellen mit rAAV in Abwesenheit von kontaminierendem wildtypischem AAV oder Helferadenovirus ist mit geringer rekombinanter Genexpression assoziiert [D. Russell et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8915–8919 (1994); I. Alexander et al, J. Virol., 68: 8282–8287 (1994); D. Russell et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 5719–5723 (1995); K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996); und F. Ferrari et al, J. Virol., 70: 3227–3234 (1996)]. Weiterhin ist die Integration ineffizient und nicht für Chromosom 19 gerichtet, wenn rep abwesend ist [S. Kumar et al, J. Mol. Biol., 222: 45–57 (1991)]. Die AAV-Transduktion wird in Gegenwart von Adenovirus wesentlich verstärkt, da das einzelsträngige rAAV-Genom in ein nicht-integriertes, doppelsträngiges Zwischenprodukt umgewandelt wird, das transkriptionell aktiv ist [K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996); und F. Ferrari et al, J. Virol., 70: 3227–3234 (1996)]. Adenovirus steigert die rAAV-Transduktion durch die Expression des frühen Genprodukts E4 ORF6 [K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996); und F. Ferrari et al, J. Virol., 70: 3227–3234 (1996)].
Die Leistung von rAAV als ein Vektor für in vivo-Modelle der Gentherapie ist gemischt gewesen. Die vielversprechendsten Ergebnisse gab es im Zentralnervensystem, wo eine stabile Transduktion in postmitotischen Zellen erreicht wurde [M. Kaplitt et al, Nat. Genet., 8: 148–154 (1994)]. Die Inkubation von Knochenmarkszellen ex vivo mit rAAV resultiert in einer gewissen Transduktion, obwohl stabile und effiziente hämatopoetische Transplantierungen bei Transplantatmodellen nicht gezeigt wurden [J. Miller et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10183–10187 (1994); G. Podsakoff et al, J. Virol., 68: 5656–5666 (1994); und C. Walsh et al, J. Clin. Invest., 94: 1440–1448 (1994)]. Die Verabreichung von rAAV in die Atemwege oder ins Blut führt zur Genübertragung in Lungenepithelzellen [K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996); und T. Flotte et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10613–10617 (1993)] bzw. in Hepatozyten [K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996)]; jedoch ist die Transgenexpression als niedrig ermittelt worden, solange Adenovirus nicht anwesend ist [K. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996)].
Was benötigt wird, ist ein Verfahren zur Verbesserung des rAAV-vermittelten Gentransfers.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt die Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) bereit, dieses umfassend eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die für ein Produkt codiert, in funktionsfähiger Verbindung mit Sequenzen, die die Expression hiervon in einer Zelle kontrollieren, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer chronischen Erkrankung, wobei das Medikament in einer Form vorliegt, die angepasst ist für die Auslieferung des rAAV an eine Muskelzelle, die das Produkt exprimiert, und wobei das rAAV von kontaminierendem Helfer-Adenovirus gereinigt wird, sodass das Produkt in Abwesenheit einer schädlichen Immunantwort gegen das Produkt exprimiert wird, und wobei das Medikament angepasst ist für eine Zuführung durch wiederholte Verabreichung, und wobei das Produkt ein Neoantigen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung der Expression eines ausgewählten Gens, das über rekombinantes AAV an ein Tier ausgeliefert wird. Die Erfindung betrifft die Einführung eines rekombinanten AAV-Vektors, umfassend ein gewünschtes Transgen, in eine Muskelzelle in Abwesenheit eines Helfervirus. Der Vektor kann in den Herzmuskel, in glatten Muskel oder, bevorzugt, in Skelettmuskel, verabreicht werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform codiert das von rAAV ausgelieferte Transgen ein sekretierbares und/oder diffusionsfähiges Produkt, welches therapeutisch nützlich ist. Bei dieser Ausführungsform kann das Transgenprodukt therapeutische Wirkung an Stellen haben, die von der Auslieferungsstelle entfernt sind. Bei einer anderen Ausführungsform codiert das Transgen ein nicht sekretierbares Produkt (z. B. ein Dystrophin-Polypeptid), für das die Auslieferung an den Muskel erwünscht ist (z. B. für die Behandlung von Muskeldystrophie).
Bei einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung eines Tieres mit Hämophilie. Die Erfindung betrifft die Verabreichung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, umfassend das Gen, das für Faktor IX codiert, und Sequenzen, die die Expression des Gens regulieren, in den Muskel des Tieres.
Bei wiederum einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Behandlung eines Tieres mit Arteriosklerose. Die Erfindung betrifft die Verabreichung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, umfassend das Gen, das für ApoE codiert, und regulatorische Sequenzen, die zum Exprimieren dieses Gens befähigt sind, in den Muskel des Tieres.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen hiervon weiter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung, die die lineare Anordnung von AAV.CMVLacZ (4883 bp) zeigt. Die relevanten Elemente beinhalten AAV ITRs (ausgefüllte schwarze Kästchen), CMV-Promotor (schraffierter Pfeil), SV40-Intron und Polyadenylierungssignal (offene Kästchen), und lacZ-DNA (getöntes Kästchen). Die Position einer cDNA-Sonde, die verwendet werden kann, um das innere BamHI-Fragment zu detektieren, ebenso wie Vektor voller Länge, sind ebenfalls dargestellt.
2A ist eine schematische Darstellung der linearen Anordnung von AAV.CMVLacZ-Concatamer. Die relevanten Positionen beinhalten AAV ITRs (schraffierte Kästchen), CMV Enhancer/Promoter (ausgefülltes schwarzes Kästchen), SV40-Intron und Polyadenylierungssignal (offene Kästchen), und lacZ-cDNA (getöntes Kästchen). Das AAV.CMVLacZ-Monomer ist gemäß der Anknüpfung über einen direkten End-an-End-Ligationsmechanismus (markiert mit „j") an den ITRs dargestellt. Daher sind in der Zeichnung zwei Kopien des AAV ITR an der Verbindungsstelle vorhanden.
2B ist eine schematische Darstellung, die eine vergrößerte Ansicht der Verbindungsdomäne zeigt. Relevante Positionen sind wie in 3A oben angezeigt. Die horizontalen Pfeile zeigen die Position und Richtung der PCR-Primer an, die verwendet wurden, um über die Provirus-Verbindungsstelle zu amplifizieren. Primer 005 ist ein Sinnstrang-Primer. Die Primer 013 und 017 sind Gegensinnstrang-Primer.
3 ist eine schematische Darstellung, die das vorhergesagte PCR-Produkt zeigt, wobei eine direkte End-an-End-Tandem-Ligation der monomeren AAV.CMVLacZ-Genome angenommen wird. Zwei vollständige ITRs (getöntes Kästchen) mit ihrer entsprechenden "FLOP"- und "FLIP"-Orientierung sind an der Verbindungsstelle (mit „j" markiert) gezeigt. Der CMV-Promotor (ausgefülltes schwarzes Kästchen) und das Polyadenylierungssignal (offenes Kästchen) sind ebenfalls angezeigt. Die PCR-Klonierungsstelle in pCRII ist von EcoRI-Stellen flankiert, wie es gezeigt ist. Die Position der drei SnaBI-Stellen, die sich im PCR-Produkt befinden, ist ebenfalls dargestellt. Die Primer 005 und 013 sind ebenfalls angezeigt.
4A, in Verbindung mit den 4B–4G, veranschaulicht die Struktur von PCR-Produkten, die auf der Kopf-an-Schwanz-Verbindung von AAV.CMVLacZ-Concatameren aus 4A kartieren. 4A zeigt das vorhergesagte PCR-Produkt unter Annahme einer direkten End-an-End-Tandemligation von monomeren AAV.CMVLacZ-Genomen. Zwei vollständige ITRs (getöntes Kästchen) mit ihrer entsprechenden "FLOP"- und "FLIP"-Orientierung sind an der Verbindungsstelle (mit „j" markiert) gezeigt. Der CMV-Promotor (ausgefülltes schwarzes Kästchen) und das Polyadenylierungssignal (offenes Kästchen) sind ebenfalls angezeigt.
4B veranschaulicht die Struktur des PCR-Produkts aus Klon 3.
4C veranschaulicht die Struktur des PCR-Produkts aus Klon 8. Klon 8 ist hinsichtlich der Größe nahezu identisch zu Klon 3, enthält jedoch eine abweichende Umlagerung der ITR-Verbindungsstelle.
4D veranschaulicht die Struktur des PCR-Produkts aus Klon 5.
4E veranschaulicht die Struktur des PCR-Produkts aus Klon 2.
4F veranschaulicht die Struktur des PCR-Produkts aus Klon 6.
4G veranschaulicht die Struktur des PCR-Produkts aus Klon 7.
5A charakterisiert die Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten, die sowohl gegen adenovirales Antigen als auch gegen lacZ gerichtet sind. Dies ist eine Analyse von Lymphozyten, die aus Gruppe 1 von Beispiel 5 geerntet wurden.
5B charakterisiert die Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten, die sowohl gegen adenovirales Antigen als auch gegen lacZ gerichtet sind. Dies ist eine Analyse von Lymphozyten, die aus Gruppe 2 von Beispiel 5 geerntet wurden.
5C charakterisiert die Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten, die sowohl gegen adenovirales Antigen als auch gegen lacZ gerichtet sind. Dies ist eine Analyse von Lymphozyten, die aus Gruppe 3 von Beispiel 5 geerntet wurden.
6A zeigt die Aktivierung von T-Lymphozyten in Reaktion auf verschiedene Antigene, einschließlich β-Galactosidase, gereinigtem AAV oder Adenovirus, für jede der Gruppen 1–4 von Beispiel 5. Die Aktivierung wird durch die Sekretion von IFN-γ, welches die TH1-Untergruppe der T-Zellen repräsentiert, gezeigt.
6B zeigt die Aktivierung von T-Lymphozyten in Reaktion auf verschiedene Antigene, einschließlich β-Galactosidase, gereinigtem AAV oder Adenovirus, für jede der Gruppen 1–4 von Beispiel 5. Die Aktivierung wird durch die Sekretion von IL-10, welches die TH2-Untergruppe der T-Zellen repräsentiert, gezeigt.
7A zeigt Ergebnisse von einem Enzym-gebundenen Immunosorptions-Assay (ELISA), der die Entwicklung von Antikörpern zeigt, die gegen β-Galactosidase gerichtet sind, in den verschiedenen Gruppen von Beispiel 5.
7B zeigt Ergebnisse von einem Enzym-gebundenen Immunosorptions-Assay (ELISA), der die Entwicklung von Antikörpern zeigt, die gegen Adenovirus Typ 5 gerichtet sind, in den verschiedenen Gruppen von Beispiel 5.
8 ist ein Graph der Plasmakonzentration von hF.IX in C57BL/6-Mäusen als eine Funktion der Zeit nach der i.m.-Injektion von 2 × 10¹¹ rAAV-hF.IX-Vektorgenomen/Tier (n = 4).
9 ist ein Graph, der den zirkulierenden Antikörper gegen humanes FIX als ein Ergebnis der i.m.-Injektion von rAAV-hF.IX in C57BL/6-Mäusen zeigt. Der Zeitverlauf der Anti-hF.IX-Antikörper-Konzentration im Plasma nach der Injektion von 2 × 10¹¹ Vektorgenomen/Tier (n = 3) wurde durch ELISA unter Verwendung des Maus-MAb Anti-hF.IX [Boehringer Mannheim] als einem Standard bestimmt. Jede Linie repräsentiert ein einzelnes Tier.
10 zeigt die Plasmakonzentration von hF.IX in drei Mäusen als eine Funktion der Zeit nach der Injektion. Jedes Symbol repräsentiert ein anderes Tier. Das vierte Tier in diesem Versuch starb 5 Wochen nach der Injektion nach traumatischer Phlebotomie.
11 ist ein Graph, der die Plasmakonzentration von hF.IX in vier Rag-1-Mäusen als eine Funktion der Zeit nach der Injektion von rAAV-hF.IX veranschaulicht. Jedes Symbol repräsentiert ein anderes Tier.
12 ist ein schematisches Diagramm eines Kopf-an-Schwanz-Concatamers von rAAV, das in transduzierten Zellen vorliegt.
13 ist ein schematisches Diagramm, das die Konstruktion von AV.CMVApoE veranschaulicht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen durch Adeno-assoziiertes Virus (AAV) vermittelten, auf die Muskeln abzielenden Gentransfer, der eine hohe und stabile Transgenexpression in Abwesenheit von Helfervirus oder exogenen Helfermolekülen bereitstellt. Dies beinhaltet insbesondere das Einführen eines rekombinanten AAV, das das gewünschte Transgen trägt, in eine Muskelzelle. Erstrebenswerter Weise wird der rAAV-Vektor direkt in den Herz-, Skelett- oder glatten Muskel injiziert, und das Transgen codiert ein sekretiertes und/oder diffusionsfähiges therapeutisches Produkt, wie etwa ein Polypeptid oder ein RNA-Molekül. Jedoch ist die Erfindung ähnlich nützlich für die Verabreichung von Nukleinsäuren, die nicht-sekretierte, therapeutisch nützliche Produkte codieren.
Insbesondere haben die Erfinder entdeckt, dass die intramuskuläre Injektion von Helfer-freiem gereinigtem rAAV (d. h. rAAV, das weitgehend frei von Kontamination mit Adenovirus oder wildtypischem AAV ist) zu einer hochgradig effizienten Transduktion von Muskelfasern führt, was zu einer stabilen und verlängerten Expression des Transgens führt. Mit „Helfer-frei" ist weiterhin gemeint, dass das AAV sich in weitgehender Abwesenheit von Helfervirus oder anderen exogenen Helfermolekülen (d. h. Helfermolekülen, die für die Muskelzellen nicht nativ sind oder normalerweise nicht in Muskelzellen vorkommen) befindet. Dies wird ohne signifikante Entzündung oder die Aktivierung von Immunantworten gegenüber dem Transgenprodukt erreicht, trotz der Tatsache, dass das Produkt ein Neoantigen sein kann.
Die Stabilität der Transgen-Expression, die gemäß der Erfindung erzeugt wird, ist besonders beeindruckend. Ohne sich hier theoretisch festlegen zu wollen, nimmt man an, dass diese Stabilität durch die hochgradig ineffiziente Chromosomen-Integration der AAV-Provirus-DNA in Muskelzellen in Abwesenheit von Helfervirus oder anderen exogenen Helfermolekülen bedingt wird. Mehrere Beobachtungen unterstützen diese Hypothese. Wie in den folgenden Beispielen beschrieben, gelang es bei der Analyse von Hirt-Extrakten nicht, eine doppelsträngige episomale Form des viralen Genoms zu detektieren. Die Southern-Analyse der zellulären Gesamt-DNA zeigte eine diskrete Bande, wenn die DNA mit einem Enzym verdaut wurde, das zwei Spaltstellen in dem AAV-Vektor besaß, wogegen keine diskrete Bande beobachtet wurde, wenn die gleiche DNA mit einem Enzym verdaut wurde, das keine Stellen in dem viralen Genom besitzt.
Die weitere DNA-Analyse fokussierte sich auf die Bildung von Concatameren und deren Struktur. Vorherige Studien lytischer AAV-Infektionen haben gezeigt, dass die episomale Replikation von rAAV durch Kopf-an-Kopf- oder Schwanz-an-Schwanz-Concatamere voranschreitet, wogegen latente Infektionen, die in proviraler Integration resultieren, als Kopf-an-Schwanz-Tandem-Anordnungen etabliert werden [K. I. Berns, Microbiol. Rev., 54: 316–329 (1990); J. -D. Tratschin et al, Mol. Cell. Biol., 5: 3251–3260 (1985); N. Muzcyzska, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97–129 (1993); S. K. McLauglin et al, J. Virol., 62: 1963–1973 (1988)]. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass Muskelzellen, die mit rAAV-Vektoren gemäß dieser Erfindung transduziert wurden, Concatamere enthalten, die aus Kopf-an-Schwanz-Tandemanordnungen mit variablen Deletionen beider ITRs bestehen, was mit einem Transduktionsmechanismus konsistent ist, der die Integration von rAAV-Provirus beinhaltet.
Die Sequenzanalyse der Verbindungsstellen, die durch rAAV-Concatamere erzeugt wurden, zeigten konsistente, jedoch variable Deletionen beider ITRs an. Die Analyse durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) war konsistent mit einzelnen Integrationsstellen in etwa 1 von 20 Zellkernen, wogegen die Southern Analyse im Mittel ein provirales Genom pro diploidem Genom der Muskelfaser anzeigte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse an, dass die durchschnittlichen Concatamere minimal zehn provirale Genome umfassen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht in der überraschenden Abwesenheit von Entzündung bei Verabreichen von therapeutischen Dosen des Vektors. Beispielsweise gelang es C57BL/6-Mäusen, denen ein lacZ-AAV-Vektor injiziert worden war, nicht, eine humorale Immunantwort gegen E. coli β-Galactosidase aufzubauen, trotz der Tatsache, dass lebhaft Anti-β-Galactosidase-Antikörper in diesen Tieren ausgelöst wurden, wenn ein lacZ-adenoviraler Vektor in den Skelettmuskel injiziert wurde. Somit, wenn der Helfer-freie AAV-Vektor gemäß der Erfindung verwendet wurde, so wurden Immunantworten gegen das Transgen moduliert. Dies steht in scharfem Gegensatz zu Gentransferverfahren aus dem Stand der Technik, wie etwa solchen, die nackte Plasmid-DNA verwenden [J. A. Wolff et al, Science, 247: 1465-1468 (1990)], oder solchen, die durch Adenovirus vermittelte Gentherapie verwenden [S. K. Tripathy et al, Nat. Med., 2: 545–550 (1996)], die typischerweise starke Immunantworten gegen das Transgen auslösen. Somit stellt die Erfindung einen signifikanten Vorteil gegenüber anderen Genauslieferungssystemen bereit, insbesondere im Hinblick auf die Behandlung chronischer Erkrankungen, die wiederholte Verabreichungen erfordern können.
I. Das rekombinante AAV
Ein rekombinanter AAV-Vektor, der ein ausgewähltes Transgen trägt, wird bei dieser Erfindung verwendet. Zusätzlich zu dem Transgen beinhaltet der Vektor weiterhin regulatorische Sequenzen, die die Expression des Transgens in einer Wirtszelle kontrollieren, z. B. in einer Muskelzelle.
Fachleuten sind zahlreiche rAAV-Vektoren bekannt, und diese Erfindung ist nicht auf irgendwelche bestimmten rAAV-Vektoren beschränkt. Beispiele für geeignete AAV-Vektoren und Verfahren zur Herstellung selbiger sind beschrieben im US-Patent Nr. 5,252,479 , im US-Patent Nr. 5,139,941 , in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 94/13788 und in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 93/24641 . Ein besonders erstrebenswerter Vektor ist unten beschrieben.
A. Die AAV-Sequenzen
Derzeit werden bei einem bevorzugten rAAV alle viralen offenen Leseraster (ORFs) entfernt, sodass dieses nur die in cis wirkenden Sequenzen der 5'- und 3'-ständigen invertierten terminalen Sequenzwiederholungen (ITR) beibehält [siehe z. B. B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", Herausgeber P. Tijsser, CRC Press, S. 155–168 (1990)]. Somit werden die codierenden Sequenzen für die Polypeptide rep und cap deletiert. Die AAV-ITR-Sequenzen haben eine Länge von etwa 143 bp. Obwohl es bevorzugt ist, dass im wesentlichen die gesamten 5'- und 3'-Sequenzen, die die ITRs umfassen, in den Vektoren verwendet werden, wird der begabte Techniker verstehen, dass ein gewisses Maß geringfügiger Modifikation dieser Sequenzen zulässig ist. Die Fähigkeit, diese ITR-Sequenzen zu modifizieren und dabei ihre biologischen Funktionen aufrecht zu erhalten, liegt im Bereich der normalen technischen Fähigkeiten (siehe hierzu z. B. Texte wie Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laborstory Manual.", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, New York (1989)).
Die AAV-ITR-Sequenzen können von jedem bekannten AAV erhalten werden, einschließlich derzeit identifizierter humaner AAV-Typen. Die Auswahl des AAV-Typs wird für die Erfindung nicht als einschränkend betrachtet. Eine Vielzahl von AAV-Typen, einschließlich der Typen 1–4, ist bei der American Type Culture Collection erhältlich oder ist auf Anfrage bei einer Vielzahl kommerzieller und institutioneller Quellen erhältlich. Entsprechend können auch AAVs, von denen bekannt ist, dass sie andere Tiere infizieren, ebenfalls in dem Vektor, der bei der Erfindung zum Einsatz kommt, verwendet werden. In den hier dargestellten Beispielen wird praktischerweise ein AAV-2 verwendet. Spezifisch flankieren die 5'- und 3'-AAV-ITR-Sequenzen von AAV-2 eine ausgewählte Transgensequenz und assoziierte regulatorische Elemente, wie im Folgenden beschrieben.
B. Das Transgen
Die in dem rAAV-Vektor enthaltende Transgensequenz ist eine Nukleinsäuresequenz, heterolog zu der AAV-Sequenz, die eine RNA oder ein Polypeptid von Interesse codiert. Das Transgen ist funktionsfähig mit regulatorischen Komponenten verbunden, in einer Weise, die die Expression des Transgens in Muskelzellen erlaubt.
Die Zusammensetzung der Transgensequenz wird von der Verwendung abhängen, der der resultierende Vektor zugeführt werden wird. Beispielsweise kann ein Typ von Transgensequenz eine Reportersequenz beinhalten, die bei der Expression ein detektierbares Signal erzeugt. Solche Reportersequenzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine E. coli beta-Galactosidase (LacZ) cDNA, ein Gen der alkalischen Phosphatase und ein Gen für ein grünes Fluoreszenzprotein. Diese Sequenzen liefern, wenn sie mit regulatorischen Elementen assoziiert sind, die ihre Expression antreiben, Signale, die durch konventionelle Mittel detektierbar sind, z. B. Extinktion von Ultraviolett-Wellenlängen, Veränderung der sichtbaren Farbe, etc. Die Expression solcher Transgene kann bei Verfahren der Zellquantifizierung, der Zellidentifizierung und dergleichen verwendet werden.
Eine bevorzugtere Transgensequenz beinhaltet ein therapeutisches Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert. Diese therapeutischen Nukleinsäuresequenzen codieren typischerweise Produkte, die, wenn sie einem Patienten in vivo oder ex vivo verabreicht werden, befähigt sind, einen erblichen oder nicht-erblichen Gendefekt zu ersetzen oder zu korrigieren oder eine epigenetische Störung oder Erkrankung zu behandeln.
Die Auslieferung des Transgens an die Muskelzellen ist besonders gut geeignet für die Verwendung in Verbindung mit sekretierten therapeutischen Proteinen, wie etwa Faktor IX, das nützlich für die Behandlung von Hämophilie ist, oder Apolipoprotein (Apo) E, das nützlich für die Behandlung von Arteriosklerose ist. Jedoch können andere therapeutische Genprodukte, insbesondere solche, die sekretiert werden, leicht vom begabten Fachmann ausgewählt werden. Beispiele für Gene, die sekretierte und/oder diffusionsfähige Produkte codieren, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, Differenzierungsfaktoren und dergleichen, z. B. β-Interferon (β-IFN), Erythropoietin (epo), Insulin, Wachstumshormon (GH) und Parathyroidhormon (PTH). Diese Gene sind nützlich für die Behandlung einer Vielzahl von Zuständen, einschließlich multipler Sklerose und Krebs (β-IFN), Anämie (epo), Diabetes (Insulin), Minderwuchs (GH) und Osteoporose (PTH). Die Erfindung ist außerdem nützlich zur Auslieferung von Genen, die nicht-sekretierte Produkte codieren, an den Muskel. Beispielsweise wird die Erfindung als nützlich für die Behandlung von Muskeldystrophien eingeschätzt, indem sie die Auslieferung eines Dystrophingens [siehe z. B. C. C. Lee et al, Nature, 349: 334–336 (1991)] über ein rAAV gemäß dem Verfahren der Erfindung ermöglicht. Die Auswahl des Transgens wird nicht als einschränkend für diese Erfindung angesehen, und eine solche Auswahl liegt im Kenntnisbereich des Fachmanns.
C. Regulatorische Elemente des Vektors
Zusätzlich zu den AAV-ITR-Sequenzen und dem Transgen beinhaltet der Vektor außerdem regulatorische Elemente, die notwendig sind, um die Expression des Transgens in transduzierten Muskelzellen anzutreiben. Somit beinhaltet der Vektor erstrebenswerter Weise einen ausgewählten Promotor und Enhancer (falls gewünscht), der funktionsfähig mit dem Transgen verbunden ist, und der zusammen mit dem Transgen zwischen den AAV-ITR-Sequenzen des Vektors liegt.
Die Auswahl des Promotors, und, wenn gewünscht, des Enhancers, ist eine Routineangelegenheit und keine Einschränkung für den Vektor selbst. Nützliche Promotoren können konstitutive Promotoren oder regulierte (induzierbare) Promotoren sein, die die kontrollierte Expression des Transgens erlauben werden. Beispielsweise ist ein erstrebenswerter Promotor derjenige des sehr frühen Cytomegalievirus-Promotors/Enhancers [siehe z. B. Boshart et al, Cell, 41: 521–530 (1985)]. Andere günstige Promotoren beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, den Rous-Sarkoma-Virus LTR-Promotor/Enhancer und den induzierbaren Maus-Metallothionein-Promoter. Weitere andere Promotor/Enhancer-Sequenzen können vom Fachmann ausgewählt werden.
Die Vektoren werden außerdem erstrebenswerter Weise Nukleinsäuresequenzen beinhalten, die die Transkription oder Translation des Transgens beeinflussen, einschließlich Sequenzen, die Signale bereitstellen, die für eine effiziente Polyadenylierung des Transkripts benötigt werden, und Introns mit funktionellen Spleiß-Donor- und Spleiß-Akzeptorstellen. Eine gebräuchliche Poly(A)-Sequenz, die in den beispielhaften Vektoren dieser Erfindung verwendet wird, ist diejenige, die aus dem Papovavirus SV-40 stammt. Die Poly(A)-Sequenz wird im allgemeinen hinter den Transgensequenzen und vor der 3'-AAV-ITR-Sequenz in den Vektor eingesetzt. Eine gebräuchliche Intronsequenz wird ebenfalls von SV-40 abgeleitet, und diese wird als die SV-40-T-Intron-Sequenz bezeichnet. Die Auswahl dieser und anderer Elemente, die erstrebenswert sind, um die Genexpression zu kontrollieren oder zu verstärken, ist konventionell, und viele derartige Sequenzen sind Fachleuten bekannt [siehe z. B. Sambrook et al, und darin genannte Referenzstellen].
Die Kombination aus Transgen, Promotor/Enhancer und den anderen regulatorischen Elementen wird zur Erleichterung der Bezugnahme hier als „Minigen" bezeichnet. Wie oben dargestellt, wird das Minigen von den 5'- und 3'-AAV-ITR-Sequenzen flankiert. Ausgestattet mit den Lehren dieser Erfindung kann die Erstellung eines solchen Minigens vom begabten Techniker leicht durchgeführt werden.
Ein Beispiel für ein rAAV, d. h. AAV.CMVLacZ, und dessen Verwendung im Verfahren der Erfindung wird in den folgenden Beispielen bereitgestellt. Wie in 1 dargestellt, beinhaltet dieses exemplarische rAAV ein 5'AAV-ITR, einen CMV-Promotor, ein SV-40-Intron, ein LacZ-Transgen, eine SV-40-Poly(A)-Sequenz und ein 3'AAV-ITR. Jedoch ist die Erfindung, wie oben postuliert, nicht auf die Verwendung eines bestimmten rAAV beschränkt.
D. Produktion von rAAV
Die Sequenzen, die bei der Konstruktion des bei der Erfindung verwendeten rAAV benutzten werden, können über kommerzielle oder akademische Quellen, und basierend auf zuvor veröffentlichten und beschriebenen Materialien, erhalten werden. Diese Materialien können auch von einem individuellen Patienten gewonnen werden, oder sie können unter Verwendung von Standardtechniken des rekornbinanten molekularen Klonierens, wie sie Fachleuten bekannt sind und von diesen praktiziert werden, erzeugt und selektiert werden. Jedwede Modifikation bestehender Nukleinsäuresequenzen, die bei der Produktion der rAAV-Vektoren verwendet werden, einschließlich Sequenzdeletionen, Insertionen und anderen Mutationen, können ebenfalls unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt werden.
Der Zusammenbau des rAAV, einschließlich der Sequenzen des AAV, des Transgens und anderer Vektorelemente, kann unter Verwendung konventioneller Techniken durchgeführt werden. Eine besonders erstrebenswerte Technik ist beschrieben in K. J. Fisher et al, J. Virol., 70(1): 520–532 (Januar, 1996). Jedoch beinhalten andere geeignete Techniken cDNA-Klonierung, wie etwa diejenige, die in Texten beschrieben ist [Sambrook et al, oben zitiert], die Verwendung überlappender Oligonukleotidsequenzen des AAV-Genoms, Polymerasekettenreaktion, und jedwedes geeignete Verfahren, das die gewünschte Nukleotidsequenz bereitstellt. Da, wo es passend ist, werden Standardtechniken der Transfektion und Co-Transfektion verwendet, um die rAAV-Viren in Gegenwart von Helferviren zu vermehren, z. B. in Gegenwart von Adenoviren, bei denen E1 deletiert wurde; dies erfolgt unter Verwendung von Techniken, wie etwa CaPO₄-Transfektionstechniken, bei problemloser Selektion durch den begabten Techniker. Andere konventionelle Verfahren, die bei dieser Erfindung verwendet werden können, beinhalten die homologe Rekombination viraler AAV-Genome, Plaque-Erzeugung von Viren im Agar-Overlay, Verfahren zur Messung der Signalerzeugung und dergleichen.
Erstrebenswerter Weise wird das erzeugte rAAV gereinigt, um jedwedes kontaminierende Adenovirus oder wildtypische AAV zu entfernen. Ein besonders erstrebenswertes Reinigungsschema ist in K. J. Fisher et al, J. Virol., 70(1): 520–532 (Januar, 1996) beschrieben. Jedoch kann ein Fachmann problemlos andere geeignete Mittel der Reinigung auswählen.
II. Therapeutische Anwendungen
Sobald ein rAAV, das ein gewünschtes Transgen enthält, erhalten wurde, wird der Vektor direkt in den Muskel eines Tieres verabreicht. Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass der Muskel besonders gut geeignet als Stelle für die Produktion sekretierter therapeutischer Produkte, wie etwa, unter anderen, Faktor IX oder Apolipoprotein (Apo) E, ist. Alternativ wird die Erfindung verwendet, um ein nicht-sekretiertes Genprodukt an die Muskelzellen auszuliefern.
Die rAAV-Vektoren der vorliegenden Erfindung können einem Patienten bevorzugt verabreicht derart verabreicht werden, dass sie in einer biologisch kompatiblen Lösung oder einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Auslieferungsvehikel suspendiert sind. Ein geeignetes Vehikel beinhaltet sterile Saline. Andere wässrige und nicht-wässrige isotonische sterile Injektionslösungen und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, für die bekannt ist, dass sie pharmazeutisch verträgliche Träger sind, und die Fachleuten wohlbekannt sind, können ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
Die rAAV-Vektoren dieser Erfindung werden in hinreichenden Mengen verabreicht, um die Integration und Expression des ausgewählten Transgens bereitzustellen, sodass ein therapeutischer Nutzen ohne unangemessene Nebenwirkungen und mit medizinisch angemessenen physiologischen Wirkungen erhalten werden kann, wobei diese von Fachleuten auf medizinischem Gebiet bestimmt werden können. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das rAAV direkt in den Herz-, Skelett- oder glatten Muskel injiziert. Ein Fachmann wird auch erkennen, dass andere Methoden der Verabreichung, z. B. intravenöse oder intraarterielle Injektion, ebenfalls bei dem Verfahren der Erfindung verwendet werden können, solange das rAAV auf die Muskelzellen abgezielt wird.
Die Dosierungen des rAAV-Vektors werden primär von Faktoren wie etwa dem behandelten Zustand, dem ausgewählten Transgen, dem Alter, Gewicht und Gesundheitszustand des Patienten abhängen, und sie können somit zwischen den Patienten variieren. Eine therapeutisch wirksame Dosis des rAAV der vorliegenden Erfindung liegt, wie angenommen wird, im Bereich von etwa 1 bis etwa 50 ml Salinelösung, die Konzentrationen von etwa 1 × 10⁸ bis 1 × 10¹¹ Partikel/ml des rAAV-Vektors der vorliegenden Erfindung enthält. Erstrebenswerter Weise enthält jede Dosis wenigstens 10⁹ Partikel von rAAV. Eine bevorzugtere Dosierung für den Menschen beträgt etwa 1–20 ml an Salinelösung bei den obigen Konzentrationen. Die Expressionsniveaus des ausgewählten Transgens können mittels Bioassay überwacht werden, um die Verabreichungsroute, -Dosis und -Häufigkeit zu bestimmen. Die Verabreichung von rAAV kann wiederholt werden, falls dies nötig ist.
Die unten dargestellten Beispiele veranschaulichen die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Vektoren und zur Durchführung der Verfahren der Erfindung. Diese Beispiele sind rein veranschaulichend und schränken den Schutzumfang der Erfindung nicht ein.
Beispiel 1 – Produktion von AAV.CMVLacZ
Es wird ein rekombinantes AAV (rAAV) erzeugt, bei dem die Gene rep und cap durch ein Minigen ersetzt wurden, das E. coli β-Galactosidase unter der Kontrolle eines CMV-Promotors exprimiert (AAV.CMVlacZ). AAV.CMVlacZ wurde unter Verwendung des cis-wirkenden Plasmids pAAV.CMVlacZ hergestellt, das von psub201 [R. Samulski et al, J. Virol., 61(10): 3096–3101 (1987)] abgeleitet wurde. Kurz dargestellt, wurde das Plasmid in 293-Zellen, die mit E1-deletiertem Adenovirus [K. J. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996)] infiziert worden waren, transfiziert, und die Funktionen von AAV rep und cap wurden durch ein in trans wirkendes Plasmid, pAAV/Ad [R. Samulski et al, J. Virol., 63: 3822–3826 (1989)], bereitgestellt. Die Produktionsmengen von AAV.CMVLacZ-Vektor wurden, wie beschrieben [Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996)], im Hinblick auf die Genomkopien/ml titriert.
Die 5'-nach-3'-verlaufende Orgahisation des AAV.CMVLacZ-Genoms (4883 bp) beinhaltet:
das 5'AAV-ITR (bp 1–173), erhalten durch PCR unter Verwendung von pAV2 [C. A. Laughlin et al, Gene, 23: 65–73 (1983)] als Matrize [Nukleotidnummern 365–538 von SEQ ID NO: 1];
einen sehr frühen CMV-Enhancer/Promotor [Boshart et al, Cell, 41: 521–530 (1985);
Nukleotidnummern 563–1157 von SEQ ID NO: 1],
ein SV40-Intron (Nukleotidnummern 1178–1179 von SEQ ID NO: 1),
eine E. coli lacZ-cDNA (Nukleotidnummern 1356–4827 von SEQ ID NO: 1),
ein SV40-Polyadenylierungssignal (ein 237 BamHI-BclI-Restriktionsfragment mit den Spalt-/poly(A)-Signalen sowohl aus den frühen als auch aus den späten Transkriptionseinheiten;
Nukleotidnummern 4839–5037 von SEQ ID NO: 1) und
das 3'AAV-ITR, erhalten aus pAV2 als ein SnaBI-BglII-Fragment (Nukleotidnummern 5053–5221 von SEQ ID NO: 1).
Bezugnehmend auf 1 sind zwei BamHI-Stellen in der doppelsträngigen Vektorsequenz vorhanden. Die erste befindet sich im SV40-Intron an der Basenpaar-Position 875, und die zweite liegt zwischen der lacZ-DNA und dem SV40-Polyadenylierungssignal an der Basenpaar-Position 4469. Daher setzt der Verdau der doppelsträngigen Sequenz mit BamHI ein Fragment von 3595 bp Länge frei. Die Position einer cDNA-Sonde, die verwendet werden kann, um das innere BamHI-Fragment zu detektieren, ebenso wie der Vektor voller Länge, sind ebenfalls gezeigt.
Das rAAV.CMVlacZ-Virus wurde unter Verwendung von Standardtechniken [siehe z. B. K. F. Kozarsky et al, J. Biol. Chem., 269: 13695–13702 (1994)] gereinigt. Die in den folgenden Beispielen verwendeten Stammansätze von rAAV wurden wie folgt getestet, um die Abwesenheit von replikationskompetentem wildtypische AAV und E1-deletiertem Helfer-Adenovirus sicherzustellen.
293-Zellen wurden in Kammer-Objektträgern ausgesät und mit wildtypischem Adenovirus und einem Aliquot des rAAV-Vektorstammansatzes co-infiziert. Zwanzig Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und mit einem monoklonalen Mausantikörper gegen AAV-Capsid-Proteine (American Research Products) inkubiert. Der Antigen-Antikörper-Komplex wurde mit einem FITC-konjugierten sekundären Antikörper detektiert. Ein positives Signal wurde als eine infektiöse AAV-Einheit bewertet. Kontaminierendes Helfer-Adenovirus wurde gemessen, indem man 293-Zellen mit einem Aliquot des rAAV-Vektorstammansatzes infizierte und im Hinblick auf die Expression von alkalischem Phosphatase-Reporter anfärbte. Bei dem Helfer-Adenovirus ist E1 deletiert, und es enthält eine aus humaner Plazenta stammende alkalische Phosphatase-cDNA unter der transkriptionellen Kontrolle des CMV-Promotors. Replikationskompetentes wildtypisches AAV oder Adeno-Helfervirus wurde in den hochgradig gereinigten Präparationen von rAAV nicht detektiert.
Beispiel 2 – rAAV bewirkt stabile Transduktion von Skelettmuskeln in vivo
rAAV wurde mit und ohne ein E2a-deletiertes Adenovirus, das dafür vorgesehen war, die Transduktion zu verstärken, verabreicht. Der Ablauf der Tierversuche wurde durch das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Wistar-Instituts genehmigt.
Kurz dargestellt, wurden fünf Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse (Jackson Laborstories, Bar Harbor, Maine) mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (70 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) betäubt, und es wurde nachfolgend ein 1 cm großer Einschnitt an der unteren Extremität vorgenommen.
Proben von rAAV.CMVLacZ (1 × 10⁹ Vektorgenome) in 25 μl HEPES-gepufferter Saline (HBS, pH 7,8) oder rAAV.CMVlacZ, genau vor der Injektion supplementiert mit einer Adenovirus E2a-Mutante, dl802 [S. A. Rice und D. L. Klessig, J. Virol., 56: 767–778 (1985)] (5 × 10¹⁰ A₂₆₀-Partikel_, 1 × 10⁸ pfu), wurden unter Verwendung einer Hamilton-Spritze in den vorderen Schienbeinmuskel jedes Beins injiziert. Die Einschnitte wurden mit 4-0 Vicryl-Nahtmaterial verschlossen. Um die Transgenexpression zu analysieren, wurden die Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion obduziert, und der mit der Injektion versehene Muskel wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten. Das Gewebe wurde auf einem Tropfen an OTC-Einbettungsverbindung positioniert, in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan für sieben Sekunden schockgefroren und unverzüglich danach in flüssigen Stickstoff überführt. Die Gewebeanalyse zu jedem der Zeitpunkte repräsentierte ein Minimum an 6 Injektionsstellen (d. h. zweiseitige Probennahme von mindestens 3 Tieren).
Für die histochemische Analyse wurde der gefrorene Muskel lateral in zwei gleiche Hälften zerteilt, was eine Querschnittsfläche des Gewebes erzeugt. Beide Gewebehälften wurden seriell geschnitten (6 μm). Für die X-Gal-Histochemie wurden die Schnitte in frisch hergestellter 0,5% Glutaraldehyd-Lösung in PBS fixiert und auf die Aktivität von β-Galactosidase hin angefärbt, wie beschrieben [K. J. Fisher et al, J. Virol., 70: 520–532 (1996)]. Die Schnitte wurden in Neutralrotlösung gegengefärbt und aufgelegt.
Wenn Adenovirus als Helfer für das rAAV verwendet wurde, so zeigte die X-Gal-Histochemie-Analyse eine auf hohem Niveau erfolgte Transduktion der Muskelfasern um Tag 17, assoziiert mit erheblicher Entzündung. Überraschender Weise war es jedoch so, dass Tiere, die rAAV in Abwesenheit von Adenovirus-Helfer erhalten hatten, Ausmaße der Transduktion zeigten, die diejenigen überschritten, die sich in Gegenwart von Adenovirus fanden. Diese hohen Spiegel haben ohne ersichtliche Abnahme für 180 Tage angehalten.
Beispiel 3 – Das rAAV-Genom integriert sich mit hoher Effizienz in Form trunkierter Kopf-an-Schwanz-Concatamere
Um den molekularen Zustand des stabilisierten rAAV-Genoms zu charakterisieren, wurde eine Southern-Blot-Analyse von DNA aus dem Skelettmuskel, geerntet aus Mäusen, die Injektionen wie oben erhalten hatten, durchgeführt. Es wurden Modelle in Betracht gezogen, bei denen das rAAV-Genom entweder als ein episomales doppelsträngiges Genom, wie das bei der lytischen Infektion gebildete, oder als ein integriertes Provirus, das der latenten Infektion ähnelt, überdauert.
Kurz dargestellt, wurden DNA mit niedrigem Molekulargewicht (Hirt) (siehe Teil A unten) und genomische DNA mit hohem Molekulargewicht (siehe Teil B unten) zu ausgewählten Zeitpunkten aus dem Mäusemuskel isoliert. Die DNA-Proben wurden auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham) übertragen. Der Blot wurde mit einem aus der lacZ-cDNA isolierten ³²P-dCTP-Zufallsprimer-markierten Restriktionsfragment hybridisiert.
A. Detektion von episomalem doppelsträngigem Genom
Um nicht-integrierte Formen des rAAV-Genoms zu detektieren, wurden Hirt-Extrakte von DNA aus transduziertem Muskel durch Hybridisieren mit einer ³²P-markierten cDNA, die auf der in 1 gezeigten Sondensequenz kartiert, analysiert. Die Hirt-DNA-Proben (15 μl, entsprechend 15 mg Gewebe) wurden aus Muskel extrahiert, der an Tag 8, 17, 30 und 64 nach der Injektion geerntet wurde.
DNA aus einer kultivierten Zelllinie, die mit rAAV in Gegenwart von Adenovirus infiziert worden war, wurde analysiert. Die Analyse der Hirtextrakte aus dieser Zelllinie zeigte die Gegenwart sowohl einzelsträngiger als auch monomerer doppelsträngiger Formen des Virus. Demgegenüber zeigten Hirt-Extrakte aus Muskeln, die mit rAAV alleine transduziert worden waren, das einzelsträngige Genom um Tag 8, das um Tag 64 hin zu nicht mehr detektierbaren Mengenniveaus abnahm. Doppelsträngige Formen von rAAV wurden in den Hirt-Extrakten nie detektiert, selbst wenn die Filter einer Überexposition unterzogen wurden. Dies zeigt an, dass das einzelsträngige rAAV-Genom effizient in die Zeilen von Skelettmuskel transferiert wurde, jedoch wird es nicht zu transkriptionell aktiven episomalen Formen umgesetzt.
B. Detektion und Charakterisierung integrierter proviraler DNA
Um integrierte provirale DNA zu detektieren, wurden zusätzliche Hybridisierungs-Studien mit zellulärer Gesamt-DNA, geerntet aus transduziertem Skelettmuskel 64 Tage nach der Infektion, durchgeführt. Genomische DNA (10 μg, entsprechend 18 μg Gewebe) wurde mit BamHI oder HindIII, einem Restriktionsenzym, das provirale DNA nicht schneidet, verdaut. Wie erwartet resultierte der HindIII-Verdau nach der Gelauftrennung und der Hybridisierung an eine Virus-spezifische Sonde in einem Schmier. Wenn die genomische DNA jedoch mit BamHI verdaut wurde, das zweimal in dem Provirus schneidet, so wurde eine diskrete Bande der vorhergesagten Größe von 3,6 kb mit einer Häufigkeit von etwa 1 proviralen Genom/diploidem Wirtszellgenom detektiert.
Die Struktur des integrierten Provirus wurde unter Verwendung von PCR-Analyse charakterisiert, um die potentiellen Mechanismen des Überdauerns zu skizzieren. Vorherige Studien von Wildtyp und rAAV haben verschiedene Wege der DNA-Replikation in der lytischen und der latenten Phase des viralen Lebenszyklus nahegelegt. Spezifisch betrachtet ist es so, dass AAV in Gegenwart von Helfervirus repliziert, um dimere replikative Zwischenprodukte durch einen Mechanismus auszubilden, der in der Synthese von Kopf-an-Kopf- oder Schwanz-an-Schwanz-Concatameren resultiert. Dies steht im Gegensatz zu latenten Infektionen, bei denen das integrierte provirale Genom durch genomische Kopf-an-Schwanz-Anordnungen gekennzeichnet ist.
Genomische DNA aus dem Skelettmuskel wurde der PCR-Analyse unterzogen, um Verbindungsstellen zwischen genomischen AAV-Concatameren zu amplifizieren. Es wurde ein PCR-Verfahren entwickelt, um integriertes rAAV zu detektieren, basierend auf Daten, die anzeigen, dass integrierte Formen von rAAV typischerweise als Kopf-an-Schwanz-Concatamere zu finden sind. Spezifisch wurden Oligonukleotid-Primer synthetisiert, um eine selektive PCR-Amplifikation über Kopf-an-Schwanz-Verbindungen von zwei Monomeren des AAV.CMVLacZ-Genoms zu ermöglichen. Der Sinnstrang-Primer 005 (5'-ATAAGCTGCAATAAACAAGT-3'; SEQ ID NO: 4) kartierte an der Basenpaar-Position 4584–4603 der SV40-Polyadenylierungs-Signaldomäne. Der Gegensinnstrang-Primer 013 (5'-CATGGTAATAGCGATGACTA-3'; SEQ ID NO: 2) kartierte an der Basenpaar-Position 497–478 des CMV-Promotors, wogegen der Gegensinnstrang-Primer 017 (5'-GCTCTGCTTATATAGACCTC-3'; SEQ ID NO: 3) an der Basenpaar-Position 700–680 des CMV-Promotors kartierte. Wenn die ITRs intakt aufrechterhalten werden, so sollten die Oligos 005 + 013 [SEQ ID NO: 2] ein 797 bp-Fragment amplifizieren, wogegen die Oligos 005 und 017 [SEQ ID NO: 3] ein 1000 bp-Fragment amplifizieren sollten. Es ist wichtig, zu betonen, dass die Größen des vorhergesagten PCR-Produkts auf der Annahme basieren, dass die Provirus-Verbindungsstellen zwei ITR-Kopien enthalten. Die Amplifikation über eine Verbindungsstelle, die weniger als zwei Kopien besitzt, wird daher ein PCR-Produkt erzeugen, das entsprechend kleiner in der Größe ist.
Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 100 ng genomischer DNA-Matrize und Primer-Konzentrationen von 0,5 μM durchgeführt. Das Profil des Thermocyclers war wie folgt: 94° C 1 min, 52° C 1 min, und 72° C 1 min 30 sec für 35 Zyklen; der 94° C Denaturierungsschritt des ersten Zyklus betrug 2 min, während der 72° C Verlängerungsschritt des letzten Zyklus 10 min betrug. Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
Die PCR-Reaktionen wurden an genomischer DNA durchgeführt, die aus mit AAV.CMVLacZ transduziertem Muskel, geerntet an Tag 64 nach der Infektion, wie oben beschrieben, isoliert wurde. Genomische DNA aus Muskel, dem Hepes-gepufferte Saline (HBS) injiziert worden war, wurde als Negativkontrolle für die PCR verwendet. Es wurden keine Amplifikationsprodukte detektiert, wenn Primer verwendet wurden, die eine Kopf-an-Kopf- oder Schwanz-an-Schwanz-Verbindung überspannen sollten (Daten nicht gezeigt). Wenn jedoch DNA aus mit AAV.CMVlacZ transduziertem Muskel mit den Oligonukleotiden 005 und 013 und 005 und 017 analysiert wurde, so wurde ein Schmier detektiert, der mit einer heterogenen Population von Kopf-an-Schwanz-Concatameren konsistent war (2A und 2B).
Die PCR-Reaktionen wurden außerdem mit genomischer DNA aus Zelllinien durchgeführt, die integriertes AAV.CMVLacZ enthalten. Die Provirusstruktur dieser Klone ist durch Southern Blot-Analyse bestimmt worden. Es wurden drei Zelllinien (10-3.AV5, 10-3.AV6, und 10-3.AV18) identifiziert, von denen jede wenigstens zwei Monomerkopien von integriertem AAV.CMVLacZ, in Kopf-an-Schwanz-Anordnung, enthielt. Basierend auf der Größe der PCR-Produkte (ein 720 bp-Produkt unter Verwendung von Primersatz 005–013, und ein 930 bp-Produkt unter Verwendung von Primersatz 005–017), enthalten zwei Klone, 10-3.AV5 und 10-3.AV6, wahrscheinlich 1,5 Kopien von AAV-ITR an des Verbindungsstelle. Ein anderer Klon, 10-3.AV18, weist eine große Deletion auf, die die AAV ITRs umfasst, was ein 320 bp-Produkt ergibt, wenn man den Primersatz 005–013 verwendet, und ein 500 bp-Produkt, wenn man den Primersatz 005–017 verwendet. Eine andere Zelllinie, 10-3.AV9, enthält gemäß Southern Blot eine einzelne Monomerkopie von integriertem AAV.CMVLacZ und scheint durch das Fehlen eines PCR-Produkts bestätigt zu sein.
Somit zeigte die Analyse von DNA aus mit rAAV infizierten Zelllinien, die im Hinblick auf stabile Transduktion ausgewählt wurden, deutlich abgegrenzte Banden, die kleiner waren, als es für ein intaktes Kopf-an-Schwanz-Concatamer vorhergesagt würde.
D. Strukturelle Analyse
Detaillierte strukturelle Analysen der proviralen Verbindungsstellen, die aus Skelettmuskel-DNA gewonnen wurden, wurden durch Subklonieren aus dem PCR-Reaktionsansatz (3), gefolgt von Restriktionsanalyse (4A–4G), durchgeführt. Insbesondere die PCR-Produkte aus einer der Muskelproben, BL.11, die gemäß obiger Beschreibung erhalten wurden, wurden direkt in das kommerziell erhältliche Plasmid pCRII, in dem das Insert von EcoRI-Stellen flankiert wurde, ligiert. Der kommerziell erhältliche kompetente Bakterienstamm TOP10 F' wurde mit den Ligationsansätzen transformiert. In ihrer Folge resultierte diese Prozedur in einer Plasmidbibliothek von PCR-Produkten. Die Bibliothek wurde mit einer solchen Dichte ausplattiert, dass sie gut isolierte Kolonien ergab, und sie wurde durch Auflegen einer Nylonmembran und Hybridisieren mit einem ³²P-markierten Fragment, das dem CMV-Promotor/Enhancer entsprach, durchmustert. Putativ positive Klone wurden über Nacht in kleinen Kulturen (2 ml) herangezüchtet.
Plasmid-DNA aus sechs repräsentativen Klonen wurde aus den Kleinkulturen extrahiert und entweder mit EcoRI zur Freisetzung des gesamten PCR-Produkts oder mit SnaBI als einem diagnostischen Indikator verdaut. Der Verdau mit SnaBI sollte ein 306 bp-Fragment (SnaBI 476 bis SnaBI 782) freisetzen, das den CMV-Promotor überspannt. Die Freisetzung eines zweiten Fragments, das an der ITR-Verbindungsstelle kartiert (SnaBI 142 bis SnaBI 476), ist abhängig von Umlagerungen, die bei der Bildung des Concatamers stattfinden und kann daher hinsichtlich seiner Größe von 334 bp (2 vollständige ITR-Kopien) bis 0 bp reichen, wenn die ITRs deletiert wurden.
Das PCR-Produkt aus der Zelllinie 10-3.AV5, von dem man annahm, dass es 1,5 Kopien von AAV ITR (10-3.AV5) enthielt, wurde ebenfalls in pCRII kloniert und mit dem angezeigten Enzym verdaut. Diese Probe dient als Positivkontrolle für den diagnostischen SnaBI-Verdau. Der Verdau dieser Probe mit EcoRI setzt in korrekter Weise das 730 bp große PCR-Fragment frei, ebenso wie eine sekundäre Dublettbande von etwa 500 bp Größe. Von dieser sekundären Bande nimmt man an, dass sie ein Artefakt ist, erklärt durch Sekundärstrukturen, die sich in den 1,5 Kopien von AAV ITR während der Replikation in Bakterien entwickeln. Der Verdau der Positivkontrolle mit SnaBI setzt das diagnostische 306 bp-Fragment aus dem CMV-Promotor frei, sowie ein 250 bp-Fragment, das an der ITR-Verbindungsstelle kartiert.
Der Verdau der sechs einzelnen Klone mit EcoRI und SnaBI zeigt Deletionen variabler Längen an, die in allen gewonnenen Verbindungsstellen vorhanden und im wesentlichen auf die ITRs an den Verbindungsstellen begrenzt waren. Die Sequenzanalyse zeigte weiterhin an, dass die meisten Deletionen Teile beider ITRs an den Verbindungsstellen überspannten, ohne dabei die damit zusammenhängende virale DNA zu betreffen.
E. Analyse durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH)
FISH wurde an Gefrierschnitten von Skelettmuskel durchgeführt, um die Verteilung proviraler DNA in dem mit der Injektion versehenen Gewebe zu charakterisieren. Kleine, 4–5 mm große Muskelstücke von behandelten Mäusen oder Kontrollmäusen, wurden in OTC eingebettet und rasch in mit flüssigem Stickstoff gekühltem, flüssigem Isopentan gefroren. Es wurden Gefrierschnitte der Dicke 10 μm auf einem Kryomikrotom geschnitten. Die Schnitte wurden aufgelegt, fixiert (Histochoice) und unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls [E. Gussoni et al, Nat. Biotech., 14: 1012–1016 (1996)] für die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung weiter verarbeitet. Angrenzende Schnitte wurden im Hinblick auf β-Galactosidase-Aktivität hin angefärbt, um lacZ-positive Gebiete in den Muskelbündeln zu identifizieren.
Für die Quantifizierung des FISH-Signals wurden lacZ-positive Zonen (wie bestimmt durch Anfärben benachbarter Schnitte hinsichtlich β-Galactosidase-Aktivität) unter einem „Nikon microphot F×A"-Mikroskop, das mit Epifluoreszenz ausgestattet ist, untersucht. Die Gesamtzahl der einzelnen Muskelfasern, die zu einer lacZ-positiven Zone in dem Schnitt gehören, wurde unter Standardphasen-Kontrastmodus ausgezählt. Die gleiche Zone wurde dann unter Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der geeigneten Filterpackung für Rhodamin-Isothiocynat untersucht. Es wurde die Anzahl an Muskelzell-Zellkernen, die eine punktierte Anfärbung zeigen, aufgezeichnet. Jeder positive Zellkern wurde unter Phasenkontrast untersucht, um sicherzustellen, dass er aus einer Muskelfaser stammt. Für die Kontrollen wurden lacZ-negative Zonen (Zonen im selben Schnitt, denen β-Galactosidase-Aktivität fehlt, oder scheintransfizierte Muskelschnitte) untersucht und in ähnlicher Weise quantifiziert.
Für die Konfokalmikroskopie wurden die Schnitte unter einer Ölimmersions-Objektivlinse (100 ×) auf einem Leica Konfokal-Lasermikroskop, ausgestattet mit Krypton-Argon-Laser (Leica Lasertechnik, GmbH), TSC und Voxel View Silicon Graphics Zentralarbeitsstationen betrachtet. Die unter dem Rhodaminkanal betrachteten Bilder wurden nacheinander auch unter Differentialinterferenzkontrast betrachtet, um die Position des Fluoreszenzsignals bei Muskelzell-Zellkernen zu bestätigen. Die Differentialkontrastbilder und Fluoreszenzbilder wurden dann nacheinander auf einer TCS-Zentralarbeitsstation aufeinander gelegt und für die Bildbearbeitung an eine Silicon Graphics Arbeitsstation weitergeleitet. Die prozessierten Bilder wurden gespeichert und unter Verwendung von Photoshop-Software ausgedruckt.
Alternativ wurden serielle Schnitte auf β-Galactosidase-Aktivität hin angefärbt, um Transgen-exprimierende Muskelfasern zu identifizieren, und diese wurden mit einer biotinylierten proviralen Sonde hybridisiert, um die Verteilung des proviralen Genoms zu lokalisieren. Es wurde ein diskretes Fluoreszenzsignal in einigen Zellkernen β-Galactosidase-exprimierender Muskelfasern detektiert. Eine Prüfung von drei seriellen Schnitten zeigte Hybridisierung bei 53/1006 (5,3%) der Zellkerne β-Galactosidaseexprimierender Fasern und bei 0/377 Zellkernen bei Fasern, die keine β-Galactosidase exprimieren. In den Geweben nicht-infizierter Tiere wurde keine Hybridisierung detektiert (Daten nicht gezeigt).
Die Fähigkeit zur Detektion viraler Genome durch FISH fügte der Analyse eine weitere Dimension hinzu. Einzelne Foci der Hybridisierung wurden in 5% aller Zellkerne detektiert, die in den Muskelfasern mit Expression von β-Galactosidase enthalten waren. Es ist möglich, dass dies aufgrund der Begrenztheit der Empfindlichkeit dieser Technik insbesondere für Zielsequenzen mit weniger als 12 kb Größe eine zu geringe Einschätzung der transduzierten Zellkerne darstellt [B. J. Trask, Trends Genet., 7: 149–154 (1991)]. Die Implikationen der FISH-Analyse sind interessant. Die Anwesenheit von 1 proviralem Genom/diploidem Myoblastengenom, wie gemessen durch Southern, zusammen mit dem FISH-Ergebnis, das zeigte, dass 5% der Nukleinsäuren ein AAV-Genom beherbergen, würde vorhersagen, dass das durchschnittliche Concatamer mindestens zehn provirale Genome enthält. Diese Studien zeigen β-Galactosidase-Enzymaktivität, die weit über die Stelle eines mit Vektor transduzierten Zellkerns hinaus reicht, was eine erweiterte nukleäre Domäne von wenigstens 10 μm nahelegt. Dies steht in Übereinstimmung mit vorheriger Arbeit, die erweiterte nukleäre Domänen für zytosolische Proteine dokumentierte [H. M. Blau et al, Adv. Exp. Med. & Biol., 280: 167–172 (1990)]. Eine erweiterte nukleäre Domäne der Transgenexpression in der syncytialen Struktur der Muskelfasern ist aus verschiedenen Gründen wichtig für Anwendungen der Gentherapie. Die Nettoausbeute an rekombinantem Protein aus einem Transduktionsereignis kann in einem Syncytium, wo die Verteilung des Proteins weniger durch Membrangrenzen eingeschränkt wird, höher sein. Weiterhin hat dieses System Vorteile bei Vektorsystemen, die die Expression multipler rekombinanter Proteine, wie etwa solcher mit induzierbaren Promotoren, erfordern [J. R. Howe et al, J. Biol. Chem., 270: 14168–14174 (1995); V. M. Rivera et al, Nat. Med., 2: 1028–1032 (1996)]. Im Muskel erfordert die Co-Expression rekombinanter Proteine aufgrund des ausgedehnten Netzwerks überlappender Domänen keine Co-Transduktion bei einem einzelnen Zellkern.
Beispiel 4 – Gegen das Transgen gerichtete Immunantworten werden minimiert, wenn Helfer-freies rAAV für die auf die Muskeln abzielende Genauslieferung verwendet wird
Die Stabilität der lacZ-Expression in Muskelzellen, die über einen lacZ-enthaltenden rAAV-Vektor erreicht wird, der in Abwesenheit von Helfervirus verabreicht wird, überraschte in Anbetracht vorheriger Arbeiten, die gezeigt hatten, dass zerstörerische Immunantworten gegen β-Galactosidase, die von adenoviralen Vektoren in Muskelfasern exprimiert wurde, aufgebaut wurden. Die Transgen-spezifischen Immunantworten wurden durch Messung der Serumspiegel von Anti-β-Galactosidase-Antikörpern unter Verwendung von Western-Analyse weiter untersucht.
Es wurde Blut bei C57BL/6- und ROSA-26-Mäusen (Jackson Laborstories, Bar Harbor, ME) abgenommen, die an Tag 30 nach der Virusinjektion obduziert wurden, und es wurde Serum gesammelt. ROSA-26 ist eine transgene Linie, die die E. coli β-Galactosidase-cDNA trägt und vor einem 129-Hintergrund entwickelt wurde. Serum wurde außerdem aus C57BL/6-Mäusen geerntet, die eine intramuskuläre Injektion entweder mit einem rekombinanten LacZ-Adenovirus (H5.010CMVLacZ, 5 × 10⁸ pfu in 25 μl HBS) oder mit dem rekombinanten AAV.CMVLacZ (wie oben beschrieben) erhielten. Beide Vektoren exprimieren E. coli β-Galactosidase über ein CMV-gesteuertes Minigen. Aliquots (5 μg) von gereinigter β-Galactosidase aus E. coli (Sigma) wurden auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel (5 mg/Spur) aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran (Hybond-ECL, Amersham) übertragen. Der Blot wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden mit „Blotto" [5% nichtfette Milch, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2 mM CaCl₂, und 0,05% Tween-20] inkubiert, um die verfügbaren Stellen zu blocken. Einzelne Spuren wurden ausgeschnitten und mit Serum (1:200, in Blotto verdünnt) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lokalisierung des Antigen-Antikörperkomplexes erfolgte durch Zugabe von Ziege-anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat, gefolgt von ECL-Detektion (Amersham). Die ausgeschnittenen Spuren wurden auf einem „Mylar"-Blatt neu zusammengesetzt, bevor die Zugabe von ECL-Reagenz und das Dokumentieren des Films erfolgten.
Die intramuskuläre Injektion des E1-deletierten H5.010CMVlacZ-Adenovirus in den Skelettmuskel von C57BL/6-Mäusen resultierte in einer wesentlichen Akkumulation von β-Galactosidase-Antikörper im Serum, die bei MHC-identischen transgenen Tieren, die ein inseriertes LacZ-Gen tragen, und die immuntolerant gegenüber β-Galactosidase sind, nicht erfolgte. Signifikanter Weise entwickelten nach intramuskulärer Injektion von AAV.CMVlacZ weder die C57BL/6- noch die lacZ-transgenen Tiere Antikörper gegen β-Galactosidase.
Beispiel 5 – Vergleichende Studien von adenoviralen Vektoren und AAV-Vektoren in Muskelzellen
Studien der Biologie von auf den Muskel abzielendem Gentransfer, der durch rekombinantes AAV und Adenovirus vermittelt wird, zeigen, dass Adenoviren, nicht jedoch AAV, Antigen-präsentierende Zellen (APCs) infizieren, was eine Kaskade immunologischer Antworten auslöst, die zu zerstörerischer zellulärer und humoraler Immunität führen.
Es wurde ein experimentelles Paradigma konstruiert, um die spezifischen Unterschiede bei Wirtsantworten gegenüber auf Skelettmuskel abzielendem Gentransfer mittels rekombinantem AAV und Adenovirus zu definieren. Das Ziel bestand darin, Unterschiede in der Biologie dieser Vektorsysteme zu skizzieren, die zu bevorzugter immunologischer Aktivierung führen, welche gegen ein Transgenprodukt (d. h. β-Galactosidase) gerichtet ist, wenn dieses über einen rekombinanten adenoviralen Vektor, nicht jedoch über einen AAV-Vektor, exprimiert wird.
Der allgemeine Ansatz bestand darin, ein lacZ-exprimierendes AAV in das rechte Bein einer Maus zu injizieren. Hierfür ist in den obigen Beispielen gezeigt worden, dass dies eine effiziente und stabile Genexpression bereitstellt. Bei den anderen Versuchsgruppen erhalten die Tiere rAAV zusätzlich zu verschiedenen Kombinationen von Vektoren und Zellen, um Komponenten der Immunantwort zu definieren, die gegen Ad gerichtet sind, und die zu zerstörerischer zellulärer und humoraler Immunität führt. Die Auswirkungen dieser experimentellen Manipulationen wurden verfolgt, indem man ihre Auswirkungen auf die Stabilität der mit rAAV-Transplantation versehenen Muskelfasern bestimmte, ebenso wie durch das Messen anderer immunologischer Parameter. Jedwede Intervention, die Immunität gegenüber β-Gal in Muskelfasern auslöst, kann detektiert werden, indem man die Stabilität der Transgenexpression im AAV-transduzierten Muskel und die Entwicklung der Entzündung bestimmt.
Es wurden vier Versuchsgruppen für diese Studie entwickelt, wie unten zusammengefasst ist. Virus wurde unter Verwendung von Techniken in Mäuse injiziert, die den oben in Beispiel 2 beschriebenen weitgehend ähnlich waren, d. h. das Virus wurde in Phosphat-gepufferter Saline suspendiert und direkt in die vorderen Schienbeinmuskel injiziert. Wenn die Tiere obduziert wurden, wurde Muskelgewebe in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan schockgefroren und mit 6 μm Dicke geschnitten, wogegen Serumproben und die ableitenden Inguinallymphknoten für die immunologischen Tests geerntet wurden.
Lymphozyten wurden aus den Inguinallymphknoten geerntet, und ein 6-stündiger Standard-⁵¹Chrom(Cr)-Freisetzungstest wurde, im wesentlichen wie unten beschrieben, durchgeführt, wobei verschiedene Verhältnisse von Effektor- zu Zielzellen (C57SV, H-2^b) in 200 μl DMEM in V-Boden-96-Well-Platten verwendet wurden. Vor dem Mischen mit den Effektorzellen wurden die Zielzellen entweder mit einem Adenovirus, das alkalische Phosphatase exprimiert (AdALP), infiziert, oder sie wurden stabil mit einem lacZ-exprimierenden Retrovirus, pLJ-lacZ, das mit 100 μCi an ⁵¹Cr markiert war, transduziert, wobei 5 × 10³ Zellen/Well verwendet wurden. Nach der Inkubation für 6 Stunden wurden Aliquots von 100 μl Überstand in einem Gammazähler ausgewertet. Die Ergebnisse für die Gruppen 1–3 werden in den 5A–5C bereitgestellt.
Gefrierschnitte (6 μm) wurden in Methanol fixiert und mit Anti-CD4- und Anti-CD8-Antikörpern angefärbt. Es wurde eine morphometrische Analyse durchgeführt, um die Anzahl an CD8+-Zellen und CD4+-Zellen pro Schnitt zu quantifizieren.
Der Test auf Zytokin-Freisetzung wurde im wesentlichen wie folgt durchgeführt. Lymphozyten wurden für 40 Stunden erneut mit β-Galactosidase, gereinigtem AAV oder Adenovirus Typ 5 stimuliert. Zell-freie Überstände (100 μl) wurden auf die Sekretion von IL-10 und IFN-γ hin untersucht. Die Proliferation wurde 72 h später durch einen 8 h ³H-Thymidin (0,50 μCi/Well) Puls gemessen. Die Ergebnisse für die vier Gruppen sind in den 6A und 6B dargestellt.
Der neutralisierende Antikörpertest wurde im wesentlichen wie folgt durchgeführt. Mausserumproben wurden bei 56°C für 30 min inkubiert, um Complement zu inaktivieren, und dann in zweifachen Schritten in DMEM verdünnt, beginnend bei 1:20. Jede Serumverdünnung (100 μl) wurde mit β-Galactosidase oder Adenovirus Typ 5 gemischt. Nach 60 min der Inkubation bei 37°C wurden 100 μl DMEM, enthaltend 20% FBS, zu jedem Well hinzugegeben. Die Zellen wurden am folgenden Tag fixiert und auf β-Galactosidase-Expression hin angefärbt. Alle Zellen färbten sich in Abwesenheit von Serumproben blau. Die Ergebnisse für die vier Gruppen werden in den 6A und 6B bereitgestellt.
Gruppe 1-Mäuse erhielten AAV.CMVlacZ, produziert wie Beispiel 1 beschrieben, ohne weitere Intervention in das rechte Bein. Die Transduktion mit AAV.CMVlacZ alleine führte zu hohen Niveaus an stabiler Genübertragung (erkennbar selbst nach 28 Tagen), ohne eine Infiltration der Lymphozyten. Es wurde weder eine Aktivierung von CD8-T-Zellen detektiert (5), noch wurden Antigen-spezifische CD4⁺-T-Zellen [d. h. viral oder β-Galactosidase (6A und 6B)] detektiert. Es wurden keine Antikörper gegen β-Galactosidase oder Adenovirus erzeugt (7A und 7B).
Mäuse der Gruppe 2 erhielten AAV.CMVlacZ in das rechte Bein, und Adenovirus, das lacZ exprimiert (H5.010CMVlacZ), in das linke Bein. Das Ziel dieser Gruppe bestand darin, zu bestimmen, ob die immunologische Antwort auf die mit Ad infizierten Muskelfasern systemisch war, wie gezeigt durch dessen Auswirkung auf die Biologie des contralateralen, mit AAV.CMVlacZ transduzierten Beins. Offensichtlich induzierte die adenovirale lacZ-Behandlung eine Immunantwort gegen β-Galactosidase, die zur Zerstörung der mit AAV-lacZ transduzierten Fasern führte. Nicht überraschender Weise war dies mit der Infiltration sowohl von CD4- als auch von CD8-T-Zellen in das AAV-transduzierte Bein und der Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten sowohl gegen adenovirale Antigene als auch gegen β-Galactosidase-Antigene assoziiert (8). Aktivierte CD4-T-Zellen, die für AAV-, Ad-, und β-Gal-Antigene spezifisch sind, und Antikörper, die für Adenovirus und β-Galactosidase spezifisch sind, wurden ebenfalls beobachtet.
Tiere der Gruppe 3 erhielten ein Gemisch aus AAV.CMVlacZ und Ad BglII in das rechte Bein. AdBglII ist ein E1-deletiertes Adenovirus, das kein rekombinantes Gen exprimiert. Das Ziel dieser Gruppe bestand darin, zu bestimmen, ob das Adenovirus einen unterstützenden Effekt bereitstellen würde, der Immunität bezüglich AAV bzw. gegenüber lacZ bei dieser Anordnung auslösen würde. Dies führte nicht zu einem Verlust der Transgenexpression, obwohl es eine erhebliche Infiltration von CD8-T-Zellen und eine gewisse Aktivierung von CD4-T-Zellen gegenüber viralen Antigenen, nicht jedoch gegenüber β-Galactosidase (6A–6B) zur Folge hatte. Wie erwartet, wurden Antikörper gegen Adenovirus, nicht jedoch gegen β-Galactosidase erzeugt (7A–7B).
Gruppe 4-Tiere erhielten AAV.CMVlacZ in das rechte Bein und bekamen in annehmender Weise Antigen-präsentierende Zellen übertragen, die aus „naiven" (nicht-immunologisch vorgeprägten) Tieren geerntet und ex vivo mit Adenovirus infiziert worden waren.
Diese Tiere bauten eine kräftige und wirksame Immunantwort gegenüber β-Gal auf, wie gezeigt durch den Verlust der Transgenexpression und die massive Infiltration von CD8- und CD4-T-Zellen. Die CD-4-T-Zellen wurden in diesem Versuch gegenüber β-Gal aktiviert, wie in den 6A–6B gezeigt, und es wurden Anti-β-Galactosidase-Antikörper erzeugt, wie gezeigt in den 7A–7B.
Beispiel 6 – Transduktion eines gereinigten rAAV-Vektors, der Faktor IX enthält, in Skelettmuskelzellen und Expression von Faktor IX auf therapeutisch nützlichen Niveaus und ohne Auslösen einer zytotoxischen Immunantwort
Die in diesem Beispiel bereitgestellten Daten zeigen, dass das Verfahren dieser Erfindung eine verlängerte Expression eines therapeutischen Transgens, Faktor IX, sowohl in immunkompetenten als auch in immuninkompetenten Subjekten in Abwesenheit einer für die transduzierten Zellen zytotoxischen Immunantwort bereitstellt. Weiterhin sind die im Serum immuninkompetenter Tiere erreichten Proteinspiegel angemessen, um eine therapeutische Wirkung zu erreichen. Somit ist die verlängerte Expression von humanem Faktor IX in Muskelzellen über rAAV-Vektoren bei immuninkompetenten Patienten, wie etwa solchen mit Hämophilie B, nützlich, um Faktor IX an Patienten mit dieser Erkrankung auszuliefern.
A. Herstellung von gereinigtem rAAV
Der rAAV-Vektor, der in den folgenden In vivo-Versuchen verwendet wird, trägt eine Expressionskassette, die die humane Faktor IX-cDNA enthält, einschließlich eines Teils von Intron I, und unter transkriptioneller Kontrolle des aus Cytomegalievirus (CMV) stammenden sehr frühen Gen-Promotors/Enhancers und transkriptioneller Terminationssignale von SV40. Der Vektor, der diese durch AAV-ITR-Sequenzen flankierte Expressionskassette enthält, und dem Protein-codierende Sequenzen von AAV vollständig fehlen, wurde wie folgt konstruiert.
Rekombinantes AAV wurde durch Co-Transfektion eines Faktor-IX-cis-Plasmids (pAAV-FIX) und des in trans wirkenden Plasmids pAAV/Ad [A. W. Skulimowski und R. J. Samulski, Method. Mol. Genet., 7: 7–12 (1995)] in mit einem E1-deletierten Adenovirus infizierten humanen embryonalen Nierenzellen (293) erzeugt, wie beschrieben von Fisher et al., J. Virol., 70: 520–532 (1996). pAAV-FIX wurde von psub201 [Skulimowski und Samulski, oben zitiert] abgeleitet und enthält den CMV-Promotor/Enhancer, die codierende Sequenz von humanem Faktor IX einschließlich des 1,4 kb-Fragments aus Intron I [S. Kurachi et al, J. Biol. Chem., 270: 5276–5281 (1995)] und das SV40-Polyadenylierungssignal, flankiert von AAV-ITR-Sequenzen. Die Genfunktionen von AAV rep und cap wurden in trans durch pAAV/Ad bereitgestellt. Das E1-deletierte Adenovirus enthielt ein β-Galactosidase (LacZ)- oder alkalisches Phosphatase (ALP)-Reportergen, um eine potentielle Kontamination der rAAV-Stammansätze mit diesem Helfervirus nachzuverfolgen. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion durch Ultraschallbehandlung lysiert, und die freigesetzten rAAV-Partikel wurden durch vier Runden der CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation, wie beschrieben von Fisher et al. (oben zitiert), gereinigt.
Die resultierenden rAAV-F.IX-Partikel besaßen eine Dichte von 1,37–1,40 g/ml. Der Titer des gereinigten rAAV-F.IX wurde durch Slot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die entweder für den CMV-Promotor oder für die Intron-I-Sequenzen spezifisch ist, sowie Standards der pAAV-F.IX-Plasmid-DNA mit bekannter Konzentration bestimmt. Die Fähigkeit von rAAV-F.IX zum Transduzieren von Zellen in vitro wurde durch das Transduzieren sich teilender HeLa-Zellen und Messen der Konzentration von hF.IX im Kulturüberstand 36 Stunden nach der Infektion mit einem für hF.IX spezifischen ELISA [J. Walter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3056–3061 (1996)] bestätigt. rAAV-F.IX (10¹²-10¹³ Genome/ml) wurde bei –79°C in HEPES-gepufferter Saline, pH 7,8, enthaltend 5% Glycerol, gelagert.
Gereinigtem rAAV-F.IX fehlten routinemäßig detektierbare Mengen an kontaminierendem Adenovirus, wenn dies durch die Transduktion von 293-Zellen, gefolgt durch Anfärben für alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase, wie beschrieben von Fisher et al. (oben zitiert), analysiert wurde. Wildtypisches AAV wurde mit <1 infektiösen Einheit pro 10⁹ Genomen von rAAV-F.IX detektiert. Der Assay für wildtypisches AAV war wie folgt: 293-Zellen, die auf Kammer-Objektträgern vermehrt worden waren, wurden mit Adenovirus und mit Aliquots von gereinigtem rAAV-F.IX co-infiziert und 24 Stunden nach der Infektion für die Immunfluoreszenz-Färbung fixiert. Ein monoklonaler Mausantikörper gegen AAV-Capsid-Proteine (American Research Products, Belmont, MA) diente als primärer Antikörper, und Anti-Maus-IgG (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) in einer Verdünnung von 1:40 diente als sekundärer Antikörper.
B. Einführung von rAAV in den Skelettmuskel
Mausstämme, die für die intramuskuläre Injektion von rAAV ausgewählt wurden, waren C57BL/6 (Charles River Laborstories, Wilmington, MA) und 86, 129, Rag 1 (Jackson Laborstories, Bar Harbor, Maine). Weibliche Mäuse (4–6 Wochen alt) wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (70 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) betäubt, und es wurde ein 1 cm großer, longitudinaler Einschnitt in der unteren Extremität vorgenommen. AAV-F.IX (2 × 10¹¹ oder 1 × 10¹⁰ Vektorgenome/Tier in HEPES-gepufferter Saline, pH 7,8) wurde in den vorderen Schienbeinmuskel (25 μl) und den Quadrizeps-Muskel (50 μl) jedes Beins unter Verwendung einer Hamilton-Spritze injiziert. Die Einschnitte wurden mit 4-0-Vicryl-Nahtmaterial verschlossen. Blutproben wurden in 7-tägigen Intervallen vom retroorbitalen Plexus in Mikro-Hämatokrit-Kapillarröhrchen gesammelt, und das Plasma wurde mittels ELISA auf hF.IX hin untersucht (Teil C unten). Für Immunfluoreszenzfärbung (Teil D unten) und die DNA-Analyse (Teil F unten) wurden die Tiere zu ausgewählten Zeitpunkten getötet, und Muskelgewebe mit und ohne verabreichte Injektion wurde ausgeschnitten. Das Gewebe wurde in OTC-Einbettungsverbindung eingebracht, für sieben Sekunden in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan schockgefroren und unmittelbar danach in flüssigen Stickstoff überführt.
C. Detektion von humanem FIX durch ELISA
Humanes F.IX-Antigen in Mausplasma wurde mittels ELISA bestimmt, wie es von Walter et al. (oben zitiert) beschrieben wurde. Dieser ELISA zeigte keine Kreuzreaktion mit Maus-F.IX. Alle Proben wurden doppelt gemessen. Proteinextrakte aus mit Injektion versehenem Mausmuskel wurden durch Einweichen des Muskels in Phosphat-gepufferter Saline (PBS), enthaltend Leupeptin (0,5 mg/ml), gefolgt von Ultraschallbehandlung, hergestellt. Die Zelltrümmer wurden durch Mikrozentrifugation entfernt, und es wurden 1:10-Verdünnungen der Proteinextrakte mittels ELISA auf hF.IX hin untersucht. Extrakte aus mit rAV.CMVLacZ (siehe Beispiel 1 oben) injiziertem Muskel wurden als Negativkontrollen verwendet. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels BIORAD-Assay (Bio-Rad, Hercules, CA) bestimmt.
D. Immunfluoreszenz-Färbung
Um eine Immunfluoreszenz-Färbung von Gewebeschnitten durchzuführen, wurden Gefrierschnitte von Muskelgewebe (6 μm) für 15 Minuten in 3% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, fixiert, für 5 Minuten mit PBS gespült, für 10 Minuten in Methanol inkubiert, dreimal in PBS gewaschen, und dann für 1 Stunde in PBS/3% Rinderserumalbumin (BSA) geblockt.
Die Schnitte wurden nachfolgend über Nacht mit einem affinitätsgereinigten Ziege-anti-Mensch-F.IX-Antikörper (Affinity Biologicals), der 1:1000 in PBS/1% BSA verdünnt war, inkubiert. Nach drei Waschdurchgängen (jeweils 10 Minuten) in PBS/1% BSA, wurde der sekundäre Antikörper (FITC-konjugierter Kaninchen-anti-Ziege-IgG, DAKO Corporation, verdünnt 1:200 in PBS/1% BSA) für 90 Minuten appliziert. Nach drei weiteren Waschdurchgängen in PBS/1% BSA wurden die Schnitte in destilliertem Wasser gespült, an der Luft getrocknet und mit Fluoromount G-Eindeckmedium (Fisher Scientific) aufgelegt. Alle Inkubationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur, mit Ausnahme der Inkubation mit dem primären Antikörper (4°C). Dasselbe Protokoll wurde angewendet, wenn die Schnitte mit Kaninchen-anti-Mensch-Collagen-IV als primärem Antikörper (Chemicon, Temecula, CA) in einer 1:500-Verdünnung und FITC-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG (DAKO Corporation) als sekundärem Antikörper gefärbt wurden. Für Studien der Co-Lokalisation wurde ein mit FITC konjugierter Ziege-anti-hF.IX-Antikörper (Affinity Biologicals) gleichzeitig mit dem Anti-Collagen-IV-Antikörper appliziert, und ein mit Rhodamin konjugierter Anti-Kaninchen-IgG (Chemicon) wurde verwendet, um Collagen-IV-Antikörper-Komplexe zu detektieren. Die Fluoreszenz-Mikroskopie wurde mit einem Nikon FXA-Mikroskop durchgeführt.
E. Tests auf zirkulierenden Antikörper gegen hF.IX
Plasmaproben von C57BL/6-Mäusen, denen intramuskulär AAV-F.IX injiziert worden war, wurden unter Verwendung von ELISA auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen hF.IX getestet. Mikrotiterplatten wurden mit humanem F.IX (1 μg/ml in 0,1M NaHCO₃, pH 9,2) beschichtet. Verdünnte Plasmaproben (1:16) wurden im Doppel appliziert, und Antikörper gegen hF.IX wurden mittels Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus-IgG (Zymed, San Francisco, CA) in einer Verdünnung von 1:2000 detektiert. Die Pufferbedingungen waren so, wie in Walter et al. (oben zitiert) beschrieben. Die Spiegel an Anti-hF.IX wurden durch Vergleich der Extinktionswerte mit monoklonalem Maus-anti-hF.IX (Boehringer Mannheim), verdünnt auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml, abgeschätzt. Western Blots, um die Anwesenheit von Anti-hF.IX zu zeigen, wurden durchgeführt, wie es in Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1401–1405 (1995) dargestellt ist, mit der Ausnahme, dass ein Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (Boehringer Mannheim) als sekundärer Antikörper verwendet wurde, wodurch die Detektion von hF.IX-Antikörperkomplexen mit ECL-Reagenz (Amersham) ermöglicht wurde. Die Verdünnung des Mausplasmas betrug 1:500.
F. DNA-Analysen
Genomische DNA wurde aus Muskelgewebe, das eine Injektion erhalten halte, isoliert, wie es von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) für Säugergewebe beschrieben wurde. Wie in Beispiel 3 dieser Anmeldung beschrieben, wurden PCR-Reaktionen durchgeführt, um Kopf-an-Schwanz-Verbindungsstücke von rAAV-Tandemwiederholungen zu amplifizieren. Der Vorwärts-Primer 005 [SEQ ID NO: 4] hybridisiert an das SV40-Polyadenylierungssignal (bp-Position 8014–8033), und die Rückwärtsprimer 013 [SEQ ID NO: 2] und 017 [SEQ ID NO: 3] binden an den CMV-Promotor (bp-Position 4625–4606 und 4828–4809). Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 100 ng genomischer DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl, einschließlich 1,5 mM MgCl₂ und 0,5 μM an Primerpaar 005/013 oder 005/017 durchgeführt. Nach einem anfänglichen Denaturierungsschritt (94°C für vier Minuten) wurden 35 Zyklen mit dem folgenden Profil durchgeführt: Denaturierung bei 94°C für vier Minuten, 35 Zyklen mit folgendem Profil: Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Anhybridisieren bei 52°C für 1 Minute, Verlängerung bei 72°C für 90 Sekunden (10 Minuten beim letzten Zyklus). Die PCR-Produkte wurden (für die DNA-Sequenzanalyse) unter Verwendung des T/A-Cloning Kits (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert. Es wurden Southern Blot-Hybridisierungen unter Verwendung von mit ³²P-dCTP-Zufallsprimer-markierten Sonden mit Spezifität für den CMV-Promotor (für die Hybridisierung an PCR-Fragmente) oder mit Spezifität für Intron I aus hF.IX, wie es in rAAV-F.IX vorliegt (für die Hybridisierung an genomische Maus-DNA), durchgeführt.
G. Ergebnisse der Expression von hF.IX in immunkompetenten Mäusen
Immunkompetente C57BL/6-Mäuse erhielten intramuskuläre Injektionen von rAAV-hF.IX, und die Tiere wurden einen Monat nach der Injektion getötet. Ein ELISA an Proteinextrakten aus mit Injektion versehenen Muskeln (vorderes Schienbein und Quadrizeps) zeigte die Gegenwart von 1,8–2,1 ng an hF.IX/mg Gewebe (40–50 ng an hF.IX/mg Protein) an. Die Expression von hF.IX in Muskelgeweben wurde durch Immunfluoreszenzstudien an Gewebeschnitten bestätigt.
Immunkompetente C57BL/6-Mäuse erhielten intramuskuläre Injektionen von rAAV-hF.IX, und die Tiere wurden drei Monate nach der Injektion getötet. Faktor IX wurde in dem nicht mit Injektion versehenen Muskel nicht detektiert. Faktor IX wurde nicht in Muskel detektiert, der eine Injektion mit einer Kontrolle, rAAV-lacZ, erhalten hatte. Die Expression von humanem Faktor IX wurde in Muskelfasern von C57BL/6-Mäusen drei Monate nach der Injektion (3,3 × 10¹⁰ Vektorgenome pro Injektionsstelle; Vergrößerung: 200×) detektiert. Es ist zu beachten, dass F.IX nicht nur in den Muskelfasern selbst anwesend ist, sondern auch in den interstitiellen Räumen zwischen den Fasern, wo er sich anzureichern scheint.
Interessanter Weise war dieses Färbemuster identisch zu demjenigen, das mit einem polyklonalen Antikörper gegen menschliches Collagen IV zu sehen war, und das auch den interstitialen Raum anfärbte. Eine Muskelfärbung einen Monat nach der Infektion mit rAAV-hF.IX (3,3 × 10¹⁰ Genome pro Injektionsstelle) färbte gut mit Antikörper gegen humanes Collagen IV (Daten nicht gezeigt). Collagen IV ist jüngst als ein Bindeprotein für humanen Faktor IX identifiziert worden [W. -F. Cheung et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 93: 11068–11073 (1996)].
Anfängliche Versuche mit immunkompetenten Mäusen zeigten, dass es trotz hoher Niveaus des Gentransfers und stabiler Expression von hF.IX im injizierten Muskel nicht möglich war, mittels ELISA signifikante Mengen von hF.IX im Blutkreislauf zu detektieren (siehe 8). Weitere Versuche zeigten, dass die Tiere hohe Titer an Antikörpern gegen das zirkulierende Fremdprotein entwickelt hatten. Wenn beispielsweise dieselben Plasmaproben auf Antikörper gegen humanen Faktor IX getestet wurden, dies beginnend an Tag 11 nach der Injektion, so war eine starke Antikörperantwort bei allen mit Injektion versehenen Tieren zu sehen (siehe 9). Unter Verwendung von Western Blot-Analyse wurde herausgefunden, dass hohe Mengenniveaus an zirkulierendem Antikörper für die Dauer des Versuchs „überdauert" hatten.
Dieses Ergebnis stand im Widerspruch zu unserer zuvor beschriebenen Erfahrung, nach der eine abweichende Verabreichungsroute, d. h. die intravenöse Injektion, eines andersartigen Vektors, d. h. eines adenoviralen Vektors, der hF.IX exprimiert, eine abweichende Immunantwort bewirkte, d. h. die Bildung neutralisierender Antikörper gegen hF.IX, nicht auslöste (Walter et al., oben zitiert).
Die Mengenniveaus der Proteinexpression, die benötigt werden, um die Antikörperbildung zu induzieren, sind jedoch recht gering. Der Western-Blot-Assay ist etwas weniger empfindlich als ein ELISA, dokumentiert jedoch, was ein ansteigender Antikörpertiter zu sein scheint, der 18 Tage nach der Injektion beginnt. Somit ist es bei den immunkompetenten Tieren so, dass das Fehlen detektierbarer hF.IX-Expression zu anfänglichen Zeitpunkten ein Ergebnis der Biologie der rAAV-Expression im Muskel ist, wogegen das nachfolgende Fehlen von detektierbarem F.IX im Blutkreislauf aus der Produktion von Antikörpern gegen das Fremdprotein resultiert. Nichtsdestoweniger war die Serum-Antikörperantwort nicht mit einer zytotoxischen Immunantwort, die gegen die Transgen-exprimierenden Zellen gerichtet gewesen wäre, assoziiert. Tatsächlich wurden weder Entzündung noch ausgedehnte Gewebeschädigung in irgendeinem der oben diskutierten Gewebeschnitte beobachtet, noch in Schnitten, die durch H&E-Färbung analysiert wurden (Daten nicht gezeigt). Dies steht im Gegensatz zur Immunantwort, die durch Injektion von rekombinantem Adenovirus, welches ein Transgen trägt, in den Skelettmuskel ausgelöst wurde [Dai et al, oben zitiert; Y. Yang et al, Hum. Molec. Genet., 5: 1703–1712 (1996); X. Xiao et al, J. Virol., 70: 8098–8108 (1996)].
H. Expression von hF.IX bei immundefizienten Mäusen
AAV-F.IX wurde an die Muskeln von Rag 1-Mäusen ausgeliefert, die homozygot für eine Mutation im Rekombinase-aktivierenden Gen 1 sind. Diese Tiere sind daher funktionell äquivalent zu Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) und produzieren keine reifen B- oder T-Zellen. Eine Dosis von 2 × 10¹¹ rAAV-hF.IX-Vektorgenomen pro Tier resultierte in der stabilen Expression von hF.IX im Mausplasma (siehe 10). Humaner F.IX war in der zweiten Woche nach der Injektion zum ersten Mal durch ELISA detektierbar und stieg danach graduell an. Die Plasmaspiegel in allen Tieren erreichten ein Plateau der therapeutischen Spiegel von F.IX fünf bis sieben Wochen nach der Injektion von 200 bis 350 ng an hF.IX/ml Mausplasma. Dieses Niveau wurde für die Dauer des Versuchs (vier Monate nach der Injektion) aufrechterhalten. Wenn eine Gesamtheit von 1 × 10¹⁰ rAAV-hF.IX-Vektorgenomen injiziert wurde, so war die Expression drei- bis viermal niedriger, erreichte für einige Tiere aber nach wie vor therapeutische Niveaus (>100 ng/ml) (siehe 11). Diese Spiegel, die 4–7% der normalen zirkulierenden Spiegel im Plasma darstellen, liegen gut in einem therapeutischen Bereich und zeigen, dass das Verfahren dieser Erfindung nutzbar für die Behandlung von Hämophilie, einer mit Immundefizienz assoziierten Erkrankung, ist.
I. Ergebnisse der DNA-Analyse
Genomische DNA aus mit Injektion behandeltem Muskelgewebe wurde sechs bis acht Wochen nach der Injektion isoliert. Die Gegenwart eingeführter Vektor-DNA wurde durch Verdau mit EcoRV gezeigt, der ein 1,8 kb großes Fragment aus dem Vektorkonstrukt freisetzte, einschließlich der gesamten 1,4 kb großen Intron I-Sequenz. Eine für Intron I spezifische Sonde hybridisierte mit diesem Fragment und zeigte keine Kreuzhybridisierung mit Maus-DNA aus einem Tier ohne Injektion. Unverdaute DNA zeigte sich als Hybridisierungssignal bei der DNA mit hohem Molekulargewicht. Weiterhin führten PCR-Primer, die dafür konzipiert waren, um Verbindungsstellensequenzen der Kopf-an-Schwanz-Concatamere von rekombinantem AAV, das in transduzierten Zellen vorlag, zu amplifizieren (12), zu einer erfolgreichen Amplifikation solcher Sequenzen aus Muskel-DNA, welche aus mit AAV-F.IX transduziertem Gewebe (vorderer Schienbeinmuskel und Quadrizeps immundefizienter und immunkompetenter Tiere) isoliert worden war. Die PCR-Produkte wurden mittels Southern Blot-Hybridisierung mit einer für den CMV-Promotor/Enhancer spezifischen Sonde sichtbar gemacht. Das Primerpaar 005–013 erzeugte Fragmente von 1,0 kb und weniger, das Primerpaar 005–017 amplifizierte Fragmente von 1,2 kb und weniger. Erwartungsgemäß resultierten diese PCR-Reaktionen nicht in abgegrenzten Banden der oben angegeben Größen, sondern vielmehr in einer Reihe von Amplifikationsprodukten mit einer Maximalgröße wie vorhergesagt, und zwar aufgrund der ungenauen Verknüpfung der in diesen Tandem-Wiederholungen vorliegenden AAV-Genome [S. K. McLaughlin et al, J. Virol., 62: 1963–1973 (1988)]. Die ungenaue Verknüpfung resultiert aus variablen Deletionen der ITR-Sequenzen an den Verbindungsstellen, wie bestätigt durch DNA-Sequenzierung der klonierten PCR-Produkte (Daten nicht gezeigt).
J. PCR-Studien
Obwohl Kopf-an-Kopf- und Schwanz-an-Schwanz-Anordnungen von AAV-Genomen während der viralen Replikation auftreten können [K. I. Berns, Microbiol. Rev., 54: 316–329 (1990)], sind Kopf-an-Schwanz-Anordnungen in typischerer Weise mit AAV assoziiert, das in die chromosomale DNA der transduzierten Zelle während der latenten Infektion integriert worden ist [S. K. McLaughlin et al, J. Virol., 62: 1963–1973 (1988); J. D. Tratschin et al, Mol. Cell Biol., 5: 3251–3260 (1985); N. Muzcyka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97–129 (1992)].
Die Southern-Blot-Daten unverdauter DNA aus mit rAAV-Injektion behandelten Muskelzellen zeigten, dass die rAAV-DNA, die aus wirtszellgenomischer DNA sechs Wochen nach der Injektion stammte, als eine Hochmolekulargewichts-Spezies vorliegt. Die höhere Signalintensität, die bei der restriktionsverdauten DNA zu sehen ist, resultiert vermutlich aus einem „Demaskierungseffekt", wenn die Fragmente aus der Masse der genomischen DNA abgetrennt werden [X. Xiao et al, J. Virol., 70: 8089-8108 (1996)]. Diese Erkenntnis, die Gegenwart eines Hybridisierungssignals, für Hochmolekulargewichts-DNA, ist, wie die PCR-Daten, konsistent mit integrativen Ereignissen, die während der Transduktion stattfinden. Der in diesem Absatz und in Absatz 1 diskutierte Integrationszustand des rAAV trägt wahrscheinlich auch zur Stabilität und verlängerten Expression des Transgens bei.
Beispiel 7 – Expression von ApoE unter Verwendung von an Skelettmuskelzellen verabreichtem rAAV
Das folgende Beispiel zeigt die verlängerte Expression eines anderen therapeutischen Transgenprodukts, Apolipoprotein E (Apo E), ein Protein, das nützlich bei der Behandlung von Arteriosklerose ist, durch Einführen eines rAAV-Vektors gemäß dieser Erfindung in Skelettmuskel. Wiederum erlaubt das Fehlen einer zerstörerischen CTL-Antwort die verlängerte Expression des Transgenprodukts.
A. Konstruktion des rAAV
Rekombinante AAV-Vektoren, die das sekretierte Protein humanes ApoE codieren, wurden in einer Weise konstruiert, die ähnlich derjenigen war, die oben für F.IX beschrieben wurde. ApoE-cDNA wurde aus einem Plasmid, pAlterApoE3 (zur Verfügung gestellt von Dr. Raders Labor an der University of Pennsylvania), durch Verdau mit XbaI ausgeschnitten, im Bezug auf die Enden geglättet und in ein mit NotI verdautes pCMVLacZ-Rückgrat (siehe Vektorkonstruktion im Diagramm von 13) kloniert. Ein 2062 bp großes SmaI/SacI-Fragment aus dem lacZ-Gen in pCMVLacZ wurde isoliert und als Füllelement in die SalI-Stelle des neuen Plasmids inseriert. Die ApoE-Minigenkassette, die nun den CMV-Promotor, ApoE-cDNA, SV40-Polyadenylierungssequenzen und ein 2062 bp großes Füllelement enthielt, wurde mittels EcoRI/HindIII-Verdau isoliert (Gesamtlänge: 4,3 kb) und dann in ein XbaI-verdautes pSub201-Rückgrat ligiert. Das Endprodukt, bezeichnet als pSubCMVApoE-2062RO, wurde als das cis-Plasmid bei der Herstellung von rAAV.ApoE gemäß der oben für rAAV.F.IX beschriebenen Prozedur verwendet.
B. In vitro-Analyse der ApoE-Expression durch rAAV.ApoE
84-31-Zellen, die in 6-Well-Platten ausgesät worden waren, wurden mit 2 Mikrolitern an CsCl-gereinigtem rAAV-ApoE in 2 ml Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium mit 2% fetalem Rinderserum infiziert. Die Zellen wurden für 48 Stunden auf 37°C gehalten. Ein Aliquot des Überstands wurde dann für eine Western Blot-Analyse von ApoE aus dem Well entnommen. Die Ergebnisse zeigten, dass ApoE-Protein im Überstand von 84–31-Zellen, die mit AAV.ApoE infiziert worden waren, klar detektierbar war.
C. In vivo-Expression von rAAV.ApoE in ApoE-Knockout-Mäusen
2,5 bis 5 × 10¹⁰ Partikel von rAAV.ApoE wurden in den vorderen Schienbeinmuskel und Quadrizeps-Muskel an jeder Seite von ApoE-Knockout-Mäusen injiziert (Gesamtpartikel pro Maus: 5 × 10¹⁰ bis 5 × 10¹¹). Eine verlängerte lokale ApoE-Expression war durch Immunfluoreszenz an Tag 28 und an Tag 120 nach der Injektion selbst in Gegenwart von Plasma-anti-ApoE-Antikörpern detektierbar.
D. Schlussfolgerungen
Dieser Versuch zeigt, dass die intramuskuläre Injektion des Vektors rAAV-ApoE in ApoE-Knockout-Mäuse zur Transduktion von Muskelfasern und zur Sekretion beträchtlicher Mengen des rekombinanten Proteins in den Blutkreislauf führt. Es wurde eine verlängerte Expression des Transgens in der Muskelfaser in Abwesenheit einer zerstörerischen CTL-Immunantwort erreicht, auch wenn humorale Immunität gegen das sekretierte Protein ausgelöst wurde.
Beispiel 8 – Transgenexpression in einem Primaten
Ein Rhesusaffe wurde betäubt, der Unterarm wurde befestigt und antiseptisch vorbereitet, und es wurde ein 0,5 cm großer Einschnitt in der Haut über dem vorderen Schienbeinmuskel angebracht. Die Muskelfaszie wurde identifiziert, und die virale Suspension von rAV.CMVLacZ (beschrieben in Beispiel 1) (175 Mikroliter an 10² Genomen/ml) wurde in 5–7 mm Tiefe in die Muskelfaszie injiziert. Vierzehn Tage später wurde eine Muskelbiopsie entnommen, in OCT eingefroren, geschnitten und in X-Gal angefärbt. Gewebeschnitte wurden unter Verwendung des Leica Z500MC-Bildverarbeitungs- und Analysesystems im Interface mit einem Nikon FXA-Mikroskop quantitativ analysiert. Die X-Gal-Histochemie zeigte ein hohes Maß an β-Galactosidase-Expression in der Mehrzahl der Muskelfasern im Gebiet der Injektionsstelle an. Zwanzig Prozent der Fasern exprimierten β-Galactosidase in einer Fläche von 224 mm² in der Region der Injektionen. Basierend auf den oben beschriebenen Ergebnissen mit ApoE und FIX, wird erwartet, dass die Expression in Abwesenheit einer zytotoxischen Immunantwort verlängert wird. Diese Daten unterstützen, dass die Expression eines Transgens gemäß dieser Erfindung in einem anderen Tier als einer Maus, und insbesondere bei einem Primaten, verdoppelt werden kann. SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV), umfassend eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die für ein Produkt codiert, in funktionsfähiger Verbindung mit Sequenzen, die die Expression hiervon in einer Zelle kontrollieren, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer chronischen Erkrankung, wobei das Medikament in einer Form vorliegt, die angepasst ist für die Auslieferung des rAAV an eine Muskelzelle, die das Produkt exprimiert, und wobei das rAAV von kontaminierendem Helfer-Adenovirus gereinigt wird, sodass das Produkt in Abwesenheit einer schädlichen Immunantwort gegen das Produkt exprimiert wird, und wobei das Medikament angepasst ist für eine Zuführung durch wiederholte Verabreichung, und wobei das Produkt ein Neoantigen ist.
Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) nach Anspruch 1, wobei das rAAV so frei von der Kontamination mit Helfer-Adenovirus ist, wie dies durch vier Runden einer Caesiumchloridgradienten-Zentrifugation erreicht werden kann.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die heterologe Nukleinsäure ein therapeutisches Produkt codiert und das Medikament eine verlängerte Expression des Produkts bereitstellt.
Verwendung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz für ein sekretierbares Protein codiert.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das sekretierbare Protein ausgewählt ist aus Faktor IX, Apolipoprotein E, β-Interferon, Insulin, Erythropoietin, Wachstumshormon und Nebenschilddrüsenhormon.
Verwendung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei das rAAV weiterhin AAV 5' und 3' invertierte terminale Sequenzwiederholungen umfasst, die die heterologe Nukleinsäuresequenz flankieren.
Verwendung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei das rAAV, von 5' nach 3', 5' AAV invertierte terminale Sequenzwiederholungen (ITRs), einen heterologen Promotor, die heterologe Nukleinsäuresequenz, eine Polyadenylierungssequenz und 3'AAV ITRs umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der heterologe Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der konstitutive Promotor ausgewählt ist aus dem sehr frühen ("immediate early") Promotor des Cytomegalievirus und dem Rous-Sarkoma LTR-Promotor.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der heterologe Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
Verwendung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei der Muskel ausgewählt ist aus Skelettmuskel, Herzmuskel und glattem Muskel.
Verwendung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei das Medikament wenigstens 10⁹ Partikel von rAAV umfasst.
Verwendung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei das Medikament 2,5 × 10¹⁰ bis 5 × 10¹⁰ Partikel von rAAV umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Medikament in einer Dosis von 2 × 10¹¹ Vektorgenomen von rAAV in die Muskelzellen injiziert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die chronische Erkrankung Hämophilie ist und das Produkt Faktor IX ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die chronische Erkrankung Arteriosklerose ist und das Produkt Apolipoprotein E ist.