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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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I. ADENO-ASSOZIIERTES
VIRUS
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Adeno-assoziiertes
Virus (AAV) ist ein defektes Parvovirus, dessen Genom als ein einzelsträngiges DNA-Molekül enkapsidiert
ist. Stränge
mit Plus- und Minuspolarität
werden mit gleicher Effizienz, jedoch in separaten Viruspartikeln
verpackt. Effiziente Replikation von AAV erfordert im Allgemeinen
Co-Infektion mit einem Helfervirus aus der Herpesvirus- oder Adenovirusfamilie,
obschon AAV unter besonderen Umständen auch in Abwesenheit eines
Helfervirus replizieren kann.
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Ist
kein Helfervirus vorhanden, so entwickelt AAV eine latente Infektion,
worin das virale Genom als ein integriertes Provirus in der Wirtszelle
existiert. Integration des Virus erfolgt am menschlichen Chromosom
19. Wird eine latent infizierte Zelllinie später mit einem geeigneten Helfervirus
superinfiziert, so wird das AAV-Provirus im Allgemeinen ausgeschnitten,
und das AAV-Virus tritt in die "produktive" Phase ein.
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AAV-Isolate
wurden aus Menschen und Affen gewonnen. Der Wirtbereich für lytisches
Wachstum von AAV ist groß.
Zelllinien aus praktisch jeder getesteten Säugetierspezies, einschließlich zahlreiche
verschiedene humane, simiane, canine, bovine und Nagetier-Zelllinien,
können
produktiv mit AAV infiziert werden, vorausgesetzt, ein geeignetes
Helfervirus wird verwendet (z.B. canines Adenovirus in Zellen von
Caninen). Weder in menschlichen noch in anderen tierischen Populationen
wurde jedoch bisher eine Krankheit mit AAV assoziiert.
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AAV
wurde als ein nicht pathogenes, co-infizierendes Mittel aus Fäkal-, Okular-
und Atmungs-Proben während
akuter Adenovirusinfektion isoliert, jedoch nicht während anderen
Erkrankungen. Latente AAV-Infektionen wurden sowohl in menschlichen
als auch in nicht menschlichen Zellen identifiziert. Allgemein gesprochen
scheint Virusintegration keine eindeutige Wirkung auf Zellwachstum oder
Zellmorphologie zu haben, siehe Samulski, Curr. Op. Gen. Devel.
3, 74–80
(1993).
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Es
gibt zahlreiche AAVs, einschließlich AAV-1,
AAV-2, AAV-3, AAV-4 und AAV-5. Das Genom von AAV-2 ist 4.679 Basen
lang (Genbank Nr. AF043303) und enthält invertierte terminate Wiederholungssequenzen
mit jeweils 145 Basen. Von den Wiederholungen wird angenommen, dass
sie als DNA-Replikationsursprünge
dienen. Das AAV-3-Genom weist eine Länge von 4.726 Basen und eine 82%ige
Gesamtsequenzhomologie zu AAV-2 auf, siehe Muramatsu, Virology 221,
208–217
(1996). Wie bei AAV-2 bestehen beide Enden des AAV3-Genoms aus invertierten
Wiederholungen, wobei jedoch die Palindrome eine Größe von 146
by aufweisen. Bestimmte Abschnitte der AAV-2- und AAV-3-Genome sind
hoch konserviert, beispielsweise gibt es zwei Stellen in der Haarnadel,
an denen nur eine einzige Basenpaarsubstitution zwischen AAV-2 und
AAV-3 vorhanden ist.
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Das
AAV-Genom hat zwei Haupt-ORFs (offene Leseraster). Der linke Raster
kodiert für
zumindest vier nicht-strukturelle Proteine (die Rep-Gruppe). Es gibt
zwei Promotoren, P5 und P19, die Expression dieser Proteine steuern.
Aufgrund von differenziellem Spleißen steuert der P5-Promotor
die Produktion der Proteine Rep 78 und Rep 68 und der P19-Promotor jene
der Proteine Rep 52 und Rep 40. Von den Rep-Proteinen wird angenommen, dass sie
in virale DNA-Replikation, trans-Aktivierung von Transkription aus
den viralen Promotoren, Repression von heterologen Enhancern und
Promotoren sowie in ortspezifische Integration eingebunden sind.
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Der
rechte ORF, gesteuert durch den P40-Promotor, kodiert für die Capsidproteine,
Vp1 (91 kDa), Vp2 (72 kDa) und Vp3 (60 kDa). Vp3 umfasst 80 % der
Virionstruktur, während
Vp1 und Vp2 die Nebenbestandteile sind. An der Karteneinheit 95 ist
eine Polyadenylierungsstelle vorhanden. Bezüglich der vollständigen Sequenz
des AAV-2-Genoms siehe
Strivastava et al., J. Virol. 45, 555–564 (1983).
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McLaughlin
et al., J. Virol. 62, 1963–1973 (1988),
stellten zwei AAV-Vektoren her: dl 52–91, der die AAV-rep-Gene beibehält, und
dl 3-94, in dem alle AAV-Kodiersequenzen deletiert sind. dl 3-94
behält jedoch
die zwei 145 Basen umfassenden, terminalen Wiederholungen und weitere
139 Basen, die das AAV-Polyadenylierungssignal enthalten, bei. Ein Fremdgen,
das für
Neomycinresistenz kodiert, wurde in den Vek tor insertiert. Virus-Ausgangsmaterial
wurde durch Komplementierung mit einem rekombinanten AAV-Genom hergestellt,
das die fehlenden AAV-Genprodukte in trans bereitstellte, selbst
jedoch zu groß war,
um verpackt zu werden. Leider war das Virus-Ausgangsmaterial mit
Wildtyp-AAV (10 % im Fall von dl 3-94) verunreinigt, wahrscheinlich
als Resultat von homologer Rekombination zwischen den defekten und
den komplementierenden Viren.
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Samulski
et al., J. Virol. 63, 3822–3828 (1989),
entwickelten ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten AAV-Ausgangsmaterialien
ohne nachweisbares Wildtyp-Helfer-AAV.
Der AAV-Vektor behielt nur die terminalen 191 Basen des AAV-Chromosoms bei. Im
AAV-Helferplasmid (pAAV/Ad) wurden die terminalen 191 Basen des
AAV-Chromosoms durch terminale Adenovirussequenzen ersetzt. Da Sequenzhomologie
zwischen dem Vektor und dem Helfer-AAV somit im Wesentlichen eliminiert
war, wurde kein nachweisbares Wildtyp-AAV durch homologe Rekombination
gebildet. Darüber
hinaus wurde die Helfer-DNA selbst nicht repliziert und eingekapselt,
da die AAV-Termini für
diesen Prozess erforderlich sind. Somit konnte im AAV-System, im
Unterschied zum HSV-System, Helfervirus vollständig eliminiert werden, woraus
ein helferfreies AAV-Vektor-Ausgangsmaterial resultierte.
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Rekombinante
AAV- (rAAV-) Vektoren wurden bereits zur Expression von Genprodukten
in Tieren verwendet, siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 5.193.941
und die WO 94/13788. Andere Patente und Publikationen beschreiben
AAV-Vektoren und Verwendungen, worin sich die Verwendungen im Allgemeinen
auf die Expression von Genprodukten entweder in vitro (üblicherweise
in Gewebekulturen) oder in vivo (üblicherweise in den Lungen
oder der Mundschleimhaut, also den normalen AAV-Infektionsstellen,
wobei jedoch auch Expression in anderen Geweben, wie beispielsweise
im Zentralnervensystem und im Herzgewebe, beobachtet wurde) beziehen.
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Transduktion
von rAAV-Vektoren, die das Bakterien-β-Galactosidasegen in sich tragen,
durch einfache Injektion in den Quadrizeps von Mäusen zeigte, dass Expression
langfristig aufrechterhalten wurde und dass die Expression während dieser
Zeit nicht wesentlich absank (Xiao et al., J. Virol. 70, 8098–8108 (1996)).
Andere Targets, die erfolgreich mit rAAV-Vektoren transduziert wurden,
umfassen: T-Lymphozyten und B-Lymphozyten, menschliche Erythroleukämiezellen,
verschiedene Regionen des Rattengehirns, das Striatum des Rattengehirns
in einem Parkinson-Krankheit-Modell mit dem Tyrosinhydroxylasegen,
Herz von Schwein und Ratte mit dem LacZ-Gen, das periphere Gehörsystem
von Meerschweinchen und Bronchialepithelien von Kaninchen und Affe.
Weiters läuft
derzeit ein klinischer Versuch der Phase I an Menschen im Zusammenhang
mit der Zufuhr eines rAAV-CFTR-Vektors.
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AAVs,
die das menschliche Faktor-IX-Gen in sich tragen, wurden in die
Pfortader von erwachsenen, immunkompetenten Mäusen infundiert, und langfristige
Genexpression wurde erzielt (Snyder et al., Nat. Genet. 16, 270–276 (1997)).
Die Vektoren wurden als in das murine Genom integriert erkannt (Miao
et al., Nat. Genet. 19, 13–15
(1998)).
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II. HÄMOPHILIE
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Hämophilie
A ist eine mit dem X-Chromosom verbundene Blutungsstörung, die
aus einem Mangel an oder einer Anomalie von Faktor VIII (FVIII oder fVIII),
einer Komponente der Blutgerinnungskaskade, resultiert. Die menschliche
FVIII-cDNA wurde bereits kloniert. FVIII wird als ein 2.351 Aminosäurereste umfassender,
einkettiger Vorläufer,
der sich aus einem 19 Aminosäuren
umfassenden Signalpeptid und sechs einzelnen Domänen zusammensetzt, synthetisiert.
Die Domänen
sind in der Reihenfolge A1-A2-B-A3-C1-C2 angeordnet (Toole et al.,
Nature 312, 342–347
(1984); Vehar et al., Nature 312, 337–342 (1984)). Eine A-Domäne enthält etwa
330 Aminosäuren
und ist in drei Kopien vorhanden. Eine C-Domäne enthält etwa 150 Aminosäuren und
ist in zwei Kopien vorhanden. Die B-Domäne enthält etwa 909 Aminosäuren und
ist äußerst reich
an potenziellen N-gebundenen Glykosylierungsstellen.
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Das
Translationsprodukt des FVIII-Gens wird zuerst zwischen der B-Domäne und der
A3-Domäne gespalten.
Dann wird die B-Domäne
an mehreren Stellen Proteolyse unterzogen, wodurch FVIII als ein mit
zweiwertigen Metallionen verbundener Komplex zurückbleibt, der aus der schweren
Kette (H-Kette) mit 90–200
kDa und der leichten Kette (L-Kette) mit 80 kDa besteht (Vehar et
al. (1984), s.o.; Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
2979–2983 (1986)).
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Die
minimale Funktionseinheit von FVIII ist das Heterodimer, das aus
der 90 kDa umfassenden H-Kette und der 80 kDa umfassenden L-Kette
besteht. Somit ist die B-Domäne für prokoagulierende Aktivität erlässlich (Eaton
et al., Biochemistry 25, 8343–8347
(1986); Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5939–5942 (1986)).
Zirkulierender FVIII im Blut ist mit dem von-Willebrand-Faktor (vWF)
assoziiert, der ein großes
multimeres multifunktionelles Produkt ist (Brinkhous et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752–8756
(1985)).
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Hämophilie-A-Patienten
sind dem Risiko ausgesetzt, sich übertragbare Infektionskrankheiten von
aus Plasma stammendem FVIII, der in Behandlungen verwendet wird,
zuzuziehen. Somit ist ein rekombinantes Produkt eine wünschenswerte
Alternative. Die komplizierte Verarbeitung und die große Größe von FVIII
behinderten bisher jedoch die Produktion von FVIII in Prokaryoten
oder niedereren Eukaryoten.
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Über Expression
von FVIII-cDNA voller Länge
in Säugetierzellen
wurde bereits von mehreren Forschungsteams berichtet, doch die Expressionsniveaus
waren sehr gering und für
eine wirtschaftliche Produktion von rekombinantem FVIII (rFVIII)
nicht ausreichend.
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Um
die Expressionseffizienz zu verbessern, wurden modifizierte FVIII-cDNAs
hergestellt, denen fast die ganze B-Domäne fehlte (Eaton et al. (1986), s.o.,
Toole et al. (1986), s.o.; Sarver et al., Behring Inst. Mitt. 82,
16–25
(1988); Meulien et al., Protein Engng. 2, 301–306 (1988); Tajima et al.,
Proc. 6th Int. Symp. II.T, 51–63
(1990)), und für
die resultierenden Produkte wurden gezeigt, das sie funktionelle
Aktivitäten
von FVIII beibehalten.
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Tajima
et al. (1990), s.o., fusionierten die Kodiersequenzen der H- und
L-Ketten. Obwohl dieses Konstrukt etwa 10fach höher exprimiert wurde als ein Volllängen- FVIII-cDNA-Konstrukt,
wurden 20 % des Produkts nicht zu den H- und L-Ketten gespalten oder
nicht korrekt gespalten. Eaton et al. (1987), s.o., insertierten
ein Verbindungspeptid, das aus der B-Domäne stammte, zwischen die H-
und der L-Kette. Das Verbindungspeptid verblieb jedoch am C-Terminus
der H-Kette. Solche Fusionsmoleküle
weisen antigene Eigenschaften auf (Esmon et al., Blood 76, 1593–1600 (1990)),
die aufgrund der konstanten Aussetzung des Wirts gegenüber jenen
Antigenen während
der langen Dauer der Behandlung schwerwiegende Nebenwirkungen hervorrufen
können.
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Burke
et al. (J. Biol. Chem. 261, 12574–12578 (1986)) exprimierten
die H-Kette (Ala1-Arg740) und die L-Kette (Glu1649-Tyr2332) als separate
Proteine in COS-Zellen
und beobachteten die Sekretion von funktionell aktivem FVIII. Doch
die Expressionsniveaus waren sogar niedriger als jene des Volllängenkonstrukts.
Yonemura et al. (Prot. Engng. 6, 669–674 (1993)) verdoppelten im
Wesentlichen diese Bemühungen
unter Verwendung von Plasmiden in CHO-Zellen.
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Eine
andere Schwierigkeit der Erkrankung zeigte sich durch die Beobachtung,
dass das Ausmaß der
Neigung zu Blutungen unter den Patienten variiert und mit der Konzentration
von funktionellen Blutgerinnungsfaktoren zusammenhängen kann.
Individuen können
an einer leichten Form von Hämophilie
erkrankt sein, die möglicherweise
erst im Erwachsenenalter oder nach einem schweren Trauma oder einem
massiven chirurgischen Eingriff erkannt wird; siehe beispielsweise
Reiner & Davie, "Introduction to hemostasis
and the vitamin K-dependent coagulation factors" in: The Metabolic Basis of Inherited Disease,
Scriver et al. (Hrsg.), Bd. 3, 3181–3221, McGraw Hill, New York
(1995).
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III. Therapie
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Adenovirusvektoren
können
sich nicht teilende Zellen infizieren und können daher direkt in reifes Gewebe
wie Muskel eingeführt
werden. Die durch Adenovirusvektoren zugeführten Transgene sind jedoch
aus zahlreichen verschiedenen Gründen
für langfristige
Expression nicht geeignet. Erstens halten Adenovirusvektoren die
meis ten der Virusgene zurück
und stellen somit ein potenzielles Problem, d.h. bezüglich der
Sicherheit, dar. Expression der Adenovirusgene kann das Immunsystem
dazu führen,
die die Vektoren enthaltenden Zellen zu zerstören (siehe beispielsweise Yang
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 4407–4411 (1994)). Da Adenovirus
kein Integrationsvirus ist, wird der Vektor schließlich in
den Zellen verdünnt
oder abgebaut. Auch können
Adenovirusvektoren aufgrund der Immunantwort nicht wiederholt zugeführt werden.
Dies ist vor allem für
lebenslange Erkrankung, wie z.B. die verschiedenen Arten von Hämophilie,
relevant, was eine zentrale Einschränkung darstellt.
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Bezüglich Retrovirusvektoren
ist, obwohl stabile Integration in die Wirtschromosomen erreicht werden
kann, deren Verwendung limitiert, da zur Zeit verwendete Vektoren
nur sich teilende Zellen infizieren können, jedoch eine große Mehrzahl
der Targetzellen sich nicht teilende Zellen sind.
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AAV-Vektoren
weisen bestimmte Vorteile gegenüber
den oben erwähnten
Vektorsystemen auf. Erstens infiziert, wie Adenovirus, AAV sich
nicht teilende Zellen. Zweitens werden alle AAV-Virusgene im Vektor
eliminiert. Da die durch Virusgenexpression induzierte Immunantwort
somit weiters kein Problem mehr darstellt, sind AAV-Vektoren sicherer
als Adenovirusvektoren. Da AAV ein Integrationsvirus ist, wird das
Transgen durch Integration in das Wirtschromosom in den Zellen erhalten.
AAV ist ein äußerst stabiles
Virus, das gegenüber
zahlreichen Detergenzien, pH-Veränderungen
und Hitze (stabil bei 56 °C
etwa 1 h lang) resistent ist. AAV kann lyophilisiert und neuerlich
aufgelöst
werden, ohne signifikante Aktivität zu verlieren. Schließlich löst AAV keine bekannten
Erkrankungen oder pathogenen Symptome in Menschen aus. Daher ist
AAV ein vielversprechendes Zufuhrvehikel für Gentherapie.
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Zwei
erst jüngst
veröffentlichte Übersichtsartikel
liefern einen Überblick
zum aktuellen Status der Verwendung von AAV-Vektoren und umfassen
eine Sammlung an zusätzlichen
aktuellen wissenschaftlichen Publikationen auf dem Gebiet der Erfindung:
Samulski, "Adeno-associated
Viral Vectors",
Kap. 3, in "Viruses
in Human Gene Therapy",
Vos et al. (Hrsg.), Chapman & Hall
(1994); und Samulski, "Adeno-associated Virus-based
Vectors for Human Gene Therapy",
Kap. 11, in "Gene
Therapy: From Laboratory to the Clinic", Hui et al. (Hrsg.), World Scientific (1994).
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Da
für AAV
in der Vergangenheit gezeigt wurde, dass es einen breiten Bereich
umfasst; dass es auf zahlreichen Wegen, einschließlich intramuskulärer Injektion,
verabreicht werden kann; und dass es in verschiedenen Zelltypen,
wie Leber, Retina, Neuronen und dergleichen, operabel ist; gibt
es für
den Wirt, in dem die hierin beschriebenen Zufuhrverfahren durchgeführt werden
können,
insbesondere in z.B. Säugetieren
und Vögeln,
besonders in domestizierten Säugetieren
und Vögeln,
wie Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden, Hunden, Katzen, Hühnern und
Truthähnen,
keine bekannten Einschränkungen. Sowohl
Verwendungen an Menschen als auch an Tieren werden besonders bevorzugt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt rekombinante AAV-Vektoren zur wirksamen
Expression eines Proteins mit Faktor-VIII-Funktion zur Behandlung
von Hämophilie
A und homologen Erkrankungen bereit. Die hierin beschriebenen rekombinanten
AAV-Vektoren liefern
eine maßgebliche
Entwicklung auf dem Gebiet der Gentherapie mit rekombinanten AAV-Vektoren.
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Die
rAAV-Vektoren der Erfindung können
als Viruspartikel alleine verwendet werden. Alternativ dazu können die
rAAV-Vektorviruspartikel in Verbindung mit zusätzlichen Behandlungen verwendet
werden, einschließlich
partieller Hepatektomie oder Behandlung mit sekundären Mitteln,
die Transduktion steigern, unabhängig
davon, ob mit In-vivo- oder Ex-vivo-Therapien assoziiert. Beispiele
für sekundäre Mittel
umfassen γ-Strahlung,
UV-Strahlung, tritiierte Nucleotide wie Thymidin, Cisplatin, Etoposid,
Hydroxyharnstoff, Aphidicolin und Adenovirus.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Darstellung von menschlichem rAAV-RSV-Faktor-VIII-Vektor. ITR: invertierte
terminate Wiederholung von AAV; RSV: Rous-Sarkom-Virus-Promotor; α-gb IVS: mRNA-Spleißdonor/Spleißakzeptor
aus menschlichem α-Globin;
menschlicher Faktor FVIIIΔB
SQ: menschliches Faktor-VIII-Gen; ATG (Kozak): optimierte Initiationsstelle;
syn pA: synthetische Polyadenylierungsstelle.
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2 ist
eine schematische Darstellung von menschlichem rAAV-RSV-U-Faktor-VIII-Vektor. ITR: invertierte
terminale Wiederholung von AAV; RSV: Rous-Sarkom-Virus-Promotor; CMV UTR:
untranslatierte Region aus Zytomegalie-Virus; α-gb IVS: mRNA-Spleißdonor/Spleißakzeptor
aus menschlichem α-Globin;
menschlicher Faktor FVIIIΔB
SQ: menschliches Faktor-VIII-Gen; ATG (Kozak): optimierte Initiationsstelle;
syn pA: synthetische Polyadenylierungsstelle.
-
3 ist
eine schematische Darstellung von menschlichem rAAV-FIX-Faktor-VIII-Vektor. ITR: invertierte
terminale Wiederholung von AAV; hFIX: menschlicher Faktor-IX-Promotor; α-gb IVS: mRNA-Spleißdonor/Spleißakzeptor
aus menschlichem α-Globin; menschlicher
Faktor FVIIIΔB
SQ: menschliches Faktor-VIII-Gen; ATG (Kozak): optimierte Initiationsstelle;
syn pA: synthetische Polyadenylierungsstelle.
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4 ist
eine schematische Darstellung von menschlichem rAAV-FIX-U-Faktor-VIII-Vektor. ITR: invertierte
terminale Wiederholung von AAV; hFIX: menschlicher Faktor-IX-Promotor; CMV
UTR: untranslatierte Region aus Zytomegalie-Virus; α-gb IVS:
mRNA-Spleißdonor/Spleißakzeptor
aus menschlichem α-Globin;
menschlicher Faktor FVIIIΔB
SQ: menschliches Faktor-VIII-Gen; ATG (Kozak): optimierte Initiationsstelle;
syn pA: synthetische Polyadenylierungsstelle.
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5 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass funktioneller Faktor VIII nach Transfektion
von 293-Zellen mit pMFGΔBVIII-
(Dwarki et al., PNAS 92, 1023–1027
(1995)), pAAV-RSV-U-hVIII-
und pAAV-RSV-hVIII-Vektoren hergestellt wird. Zwei separate Versu che
sind dargestellt, in denen Faktor-VIII-Aktivität durch COATest gemessen wurde,
und die Gegenwart von Faktor-VIII-Protein wurde unter Verwendung
eines ELISA-Tests
an der leichten Kette (LC) nachgewiesen.
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6 ist
eine schematische Darstellung der proteolytischen Verarbeitung von
Faktor VIII zur Herstellung des aktiven Proteins.
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7 ist
eine schematische Darstellung der Deletion der SQ-B-Domäne (Lind
et al., Eur. J. Biochem. 232, 19–27 (1995), und die
EP 0 786 474 ).
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8 ist
eine mittels Computer erstellte Darstellung einer Analyse, um zu
zeigen, dass das Faktor-VIII-Protein nach Transfektion von 293-Zellen
mit pMFGΔBVIII- (Dwarki et al.,
PNAS 92, 1023–1027 (1995)),
pAAV-RSV-U-hVIII- und pAAV-RSV-hVIII-Vektoren
korrekt proteolytisch gespalten wird. Zwei separate Versuche sind
dargestellt. Die Gegenwart von Faktor-VIII-Protein wird durch Immunblotting
mit einem Anti-Faktor-VIII-Antikörper
nachgewiesen. Die Migration der nicht bearbeiteten, 170 kd umfassenden
und der bearbeiteten, 90 kd umfassenden schweren Kette (HC) aus
FVIII ist angegeben. pAAV-CMV-GFP ist ein Plasmidvektor, der das
von Zolotukhin et al. (J. Virol. 70, 4646–4653) beschriebene grün fluoreszierende
Protein exprimiert und als eine negative Kontrolle diente. "hFactor VIII conc." (konz. hFaktor VIII)
ist eine positive Kontrolle.
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9 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass funktioneller Faktor VIII nach Infektion
von 293-Zellen in der Gegenwart oder Abwesenheit von Adenovirus mit
der angegebenen Anzahl an Partikeln aus rAAV-RSV-hFVIII-Virus hergestellt
wird. Faktor-VIII-Aktivität wurde
mittels COATest gemessen.
-
10 ist
ein Diagramm, das zeigt, dass funktioneller Faktor VIII nach Infektion
von 293-Zellen in der Gegenwart oder Abwesenheit von Adenovirus
mit der angegebenen Anzahl an Partikeln aus rAAV-RSV-U-hFVIII-Virus
hergestellt wird. Faktor-VIII-Aktivität wurde
mittels COATest gemessen.
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11 ist
ein Diagramm von pAAV-RSV-hFVIII-Vektor.
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12 ist
ein Diagramm von pAAV-RSV-U-hFVIII-Vektor.
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13 ist
ein Diagramm von pAAV-FIX-hFVIII-Vektor.
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14 ist
ein Diagramm von pAAV-FIX-U-hFVIII-Vektor.
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BESCHREIBUNG
SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
rAAV-Vektoren der vorliegenden Erfindung sind Derivate des Adeno-assoziierten
Virus, in den Faktor-VIII-Sequenzen eingeführt wurden, von denen verschiedene
Sequenzen modifiziert wurden.
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Wenn
das Adeno-assoziierte Wildtypvirus auch keinen Helfervirus für lytische
Infektion requirieren kann, gibt es doch die Möglichkeit, dass das Individuum,
dem der Vektor zugeführt
wird, eine Herpesvirus- oder Adenovirusinfektion in sich trägt, die
die rAAV-Vektoren komplementieren und zur Produktion von rAAV-Vektoren
führen
kann. Um vor dieser Möglichkeit
zu schützen,
werden die rAAV-Vektoren modifiziert, um die Möglichkeit eines Rescues zu
reduzieren. Theoretisch können
solche Modifikationen in Form von Punktmutationen eines oder mehrerer
Virusgene vorgenommen werden, wobei die Mutationen entweder Expression
des Gens insgesamt unterbinden oder zur Expression eines modifizierten
Genprodukts führen,
das nicht funktionell ist. Punktmutationen können jedoch reversibel sein.
Folglich ist es vorzuziehen, dass jedes unerwünschte, Adeno-assoziierte Virusgen
einfach deletiert wird, was den zusätzlichen Vorteil mit sich bringt,
dass mehr Raum innerhalb der Viruspackung für größere Fremd-Nucleinsäuren wie
das Faktor-VIII-Gen und assoziierte Regulationselemente geschaffen
wird.
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Es
wird bevorzugt, dass alle Virusgene aus den rAAV-Vektoren deletiert
oder in anderer Weise deaktiviert werden, wie dies im bekannten
AAV-Vektor dl 3-94 der Fall ist; siehe z.B. McLaughlin, J. Virol. 62,
1963–1973
(1988). Es gilt jedoch zu verste hen, dass ein rAAV-Vektor, der ein
oder mehrere AAV-Gene zurückbehält, wie
beispielsweise der bekannte AAV-Vektor dl 52-91, dennoch für Genzufuhr
nützlich sein
kann, auch wenn er im Vergleich zu einem bevorzugten Vektor, der
keine funktionalen AAV-Gene enthält,
möglicherweise
minderwertig ist; siehe Hermonat, J. Virol. 51, 329–339 (1984).
Vorzugsweise behalten die rAAV-Vektoren aus AAV im Wesentlichen
nur die Erkennungssignale für
Replikation und Packung (ITR) bei.
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Die
exakte Beschaffenheit von Regulationsregionen, die für Genexpression
erforderlich sind, können
von Organismus zu Organismus variieren, umfassen jedoch im Allgemeinen
einen Promotor, der den Beginn von RNA-Transkription in der Zelle von
Interesse steuert. Solche Regionen können jene nicht kodierenden
5'-Sequenzen umfassen,
die in Transkriptionsstart eingebunden sind, wie beispielsweise
die TATA-Box. Der
Promotor kann konstitutiv oder reguliert sein. Konstitutive Promotoren
sind jene, die die Expression eines operabel gebundenen Gens im
Wesentlichen zu jeder Zeit verursachen. Regulierte Promotoren sind
jene, die aktiviert oder deaktiviert werden können. Regulierte Promotoren
umfassen induzierbare Promotoren, die üblicherweise "abgeschaltet" sind, jedoch induziert
werden können,
um "angeschaltet" zu werden, und "reprimierbare" Promotoren, die üblicherweise "angeschaltet" sind, aber auch "abgeschaltet" werden können. Zahlreiche
verschiedene Regulatoren sind bekannt, einschließlich Temperatur, Hormone,
Cytokine, Schwermetalle und Regulationsproteine. Die Unterscheidungen
sind nicht absolut; ein konstitutiver Promotor kann zu einem bestimmten
Grad ebenfalls reguliert werden.
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Die
Regulation eines Promotors kann mit einem bestimmten genetischen
Element assoziiert sein, das häufig
als "Operator" bezeichnet wird,
an den sich ein Induktor oder Repressor bindet. Der Operator kann
modifiziert sein, sodass seine Regulation verändert ist. Hybridpromotoren
können
konstruiert werden, in denen der Operator eines Promotors in einen
anderen transferiert wird.
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Der
Promotor kann ein "ubiquitärer" Promotor sein, der
im Wesentlichen in allen Zellen des Wirtsorganismus aktiv ist (z.B.
die β-Actin-
oder Zytomegalie-Virus-Promotoren),
oder er kann ein Promotor sein, der für die Targetzellen mehr oder
we niger spezifische Expression zeigt (Albuminpromotor). Vorzugsweise
sind die gewebespezifischen Promotoren im Wesentlichen außerhalb
beispielsweise des hepatischen Systems nicht aktiv, und die Aktivität des Promotors
kann gegebenenfalls in manchen Komponenten des hepatischen Systems
höher als
in anderen sein.
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Somit
kann der Promotor einer sein, der primär im hepatischen System aktiv
ist. Die Spezifität kann
absolut oder relativ sein. In ähnlicher
Weise kann der Promotor für
bestimmte Zelltypen, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, Hepatozyten, Kupffer-Zellen oder Endothelzellen, spezifisch sein.
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Im
Allgemeinen wird, um einen gewebespezifischen Promotor zu lokalisieren,
ein Gen identifiziert, das nur (oder primär) in diesem Gewebe exprimiert
wird, und dann wird das Gen, das für jenes Protein kodiert, isoliert.
(Das Gen kann ein normales Zellgen oder ein Virusgen eines Virus,
das diese Zelle infiziert, sein.) Der Promotor dieses Gens behält wahrscheinlich
die erwünschte
gewebespezifische Aktivität
bei, wenn er an ein anderes Gen gebunden wird. Die Gewebespezifität eines
Promotors kann mit einem bestimmten genetischen Element assoziiert sein,
das modifiziert oder in einen zweiten Promotor transferiert werden
kann.
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Fachleuten
wird bekannt sein, dass ein gewebespezifischer Promotor zur Verwendung
in einem AAV-Vektor beliebig aus den bekannten, leberspezifischen
Promotoren und Enhancern, umfassend Albuminpromotor; Alphafetoproteinpromotor
(Genbank Zugriffs-Nr. L34019); Alphafetoproteinenhancer; menschlichen
Apolipoprotein-E-
(ApoE-) Genpromotor und seine assoziierten leberspezifischen Enhancer
HCR-1 und HCR-2 (Nguyen et al., Oncogene 12(10), 2109–2119 (1996),
und Allen et al., J. Biol. Chem. 270(44), 26278–26281 (1995)); den Faktor-VIII-Promotor
(GenBank Nr. M14113); den Faktor-IX-Promotor (Salier et al. (1990),
s.o.); den vWF-Promotor (Gnatenko et al., Blood 90, Beilage, Teil
1 von 2, 119a (1997)); den leberspezifischen Enhancer von Apolipoprotein
Al (Malik et al., Mol. Cell. Biol. 16(4), 1824–1831 (1996)) und den leberspezifischen
menschlichen α1-Antitrypsinpromotor
(Wu et al., Hum. Gene Therapy 7(2), 159–171 (1996), und Hafenrichter
et al., Blood 84(10), 3394–3404
(1994)), ausgewählt
sein kann.
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Es
gibt auch andere bekannte starke Promotoren, die gewöhnliche
Verwendung finden, um hohe Expressionsniveaus von rekombinantem
Protein zu erzielen. Herpes-Simplex-Thymidinkinasepromotor, SV40-Promotor
und LTRs fanden beispielsweise umfassend Verwendung als starke Promotoren.
Ein Beispiel ist die LTR, die aus Moloney-Leukämieretrovirus gewonnen wird.
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Eine
zentrale Eigenschaft ist die Größe des Promotors.
Aufgrund der Größe der Faktor-VIII-Kodiersequenz
müssen
die Größen der
Regulationselemente angesichts der Größeneinschränkung von AAV, damit Einkapselung
eintreten kann, berücksichtigt
werden.
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Geeignete
Promotoren zur Expression eines Proteins mit Faktor-VIII-Aktivität in Zellen
hepatischen Ursprungs sind der Rous-Sarkom-Virus-Promotor und der
Promotor von menschlichem Faktor IX. Im Allgemeinen darf der Promotor
nicht länger
als etwa 800 bp sein. Ein Punkt, den es zu berücksichtigen gibt, ist die Größe sowie
die Aktivität
des Promotors. Im Allgemeinen wird ein eher kleinerer Promotor bevorzugt.
Somit weisen manche der Promotoren, die hierin verwendet werden,
eine Größe von etwa 250
bp auf. Fachleute können
die Größe und Aktivität eines
Promotors unter Durchführung
der hierin erläuterten
Verfahren optimieren.
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Damit
das Gen exprimiert werden kann, muss die Kodiersequenz operabel
an eine Promotorsequenz gebunden sein, die in der Targetzelle funktional
ist. Eine Promotorregion ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden,
wenn der Promotor so angeordnet ist, dass, wenn der Promotor aktiviert
wird, die Kodiersequenz transkribiert wird. Die Kodiersequenzen
sind operabel gebunden, wenn die Bindung keinen Fehler beim Lesen
der Stromab-Sequenz verursacht. "Operabel
gebunden" zu sein,
bedeutet nicht notwendigerweise, dass zwei Sequenzen unmittelbar nebeneinander
liegen.
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Die
rAAV-Vektoren können
ferner eine oder mehrere Restriktionsstellen umfassen, in die Polynucleotide,
die eine FVIII-Domäne
oder -Domänen
tragen, kloniert werden können,
ohne Packung und Replikation zu stören. Vorzugsweise wird zumindest eine
einmalige Restriktionsstelle bereitgestellt.
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Bezüglich optionaler
mRNA-Spleißdonor/Spleißakzeptor-Sequenzen,
die mit Intronen assoziiert sind, ist zu sagen, dass jede beliebige
solcher Donor/Akzeptor-Sequenzen, die mit AAV kompatibel und in
AAV operabel ist, verwendet werden kann. Besondere, nicht einschränkende Beispiele
für geeignete
Donor/Akzeptor-Stellen werden hierin gelehrt und sind auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt. Das α-Globin-Intron
wird in manchen der nachstehenden Beispiele bereitgestellt. McCullough & Berget, Mol. Cell.
Biol. 17, 4562–4571,
lehren ein anderes Beispiel für
ein geeignetes Intron. Wie hierin zuvor erläutert, können Fachleute andere solche
Sequenzen verwenden, solange die erwünschten Expressionsniveaus
erzielt werden und die Gesamtgröße des Inserts
im AAV mit Einkapselung vereinbar ist.
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Bezüglich Polyadenylierungsstellen
ist zu sagen, dass jede beliebige Polyadenylierungsstelle, die mit
AAV kompatibel und in AAV operabel ist, verwendet werden kann. Besondere,
nicht einschränkende
Beispiele für
geeignete Polyadenylierungsstellen werden hierin erläutert und
sind alle auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispielsweise die
Poly-A-Sequenz von Levitt et al., s.u., sowie synthetische Derivate
davon können
verwendet werden. Goodwin (JBC 267, 16330–16334 (1992)), Bohnlein (J.
Virol. 63, 421–424
(1989)) und Fitzgerald & Shenk (Cell
24, 251–260
(1981)) lehren andere geeignete Poly-A-Stellen und synthetische
Derivate davon. Fachleute können
jegliche Poly-A-Stelle verwenden, solange Expression optimiert wird,
und die Größe davon
ist so beschaffen, dass Einkapselung nicht behindert wird.
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Sofern
erwünscht,
kann die nicht-kodierende Region 3' zur Gensequenz, die für das erwünschte RNA-Produkt
kodiert, gewonnen werden. Die Region kann aufgrund ihrer Transkriptionsterminationsregulationssequenzen,
wie jene, die für
Termination und Polyadenylierung sorgen, zurückgehalten werden. Somit können durch
Zurückhalten
der 3'-Region, die mit
der Kodiersequenz auf natürliche
Weise zusammenhängt,
die Transkriptionsterminationssignale bereitgestellt werden. Sind
die Transkriptionster minationssignale, die mit der Kodiersequenz
nativ assoziiert sind, nicht zufriedenstellend funktional in der
Expressionswirtszelle, so kann eine andere 3'-Region, die in der Wirtszelle funktional
ist, eingesetzt werden.
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Kozak
(1987), s.u., lehrt optimierte Initiationsstellen, und Fachleute
können
die Sequenzen, die ATG flankieren, modifizieren, um optimierte Expression
des Polypeptids mit FVIII-Aktivität zu erzielen. Im Allgemeinen
sind die Änderungen
Substitutionen, doch auch Insertionen können akzeptiert werden, wenn
es zu keinen wesentlichen Anstieg der Größe des Polynucleotids, das
durch die ITRs eingerahmt ist, kommt. Kozak (J. Cell. Biol. 108,
229–241 (1989))
lehrt auch Änderungen,
die Initiation fördern.
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Der
Vektor von Interesse kann auch einen Abstandhalter umfassen, der
als eine untranslatierte Region (UTR) identifiziert ist, die zwischen
dem 3'-Ende des
Promotors und dem Startcodon von Faktor-VIII-Polypeptid angeordnet
ist. Die Größe der untranslatierten
Region muss wiederum die Größe des Polynucleotids,
das durch die ITRs flankiert ist, und die optimale Aktivität berücksichtigen.
Ein solcher geeigneter Abstandhalter ist die 5'-UTR von Zytomegalie-Virus.
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Bezüglich der
invertierten terminalen Wiederholungen von AAV gilt anzumerken,
dass jegliche solcher ITRs oder Derivate davon, die Nucleotidsubstitutionen,
Deletionen und Inversionen und/oder Insertionen enthalten und dennoch
die erforderlichen biologischen Aktivitäten, die ein AAV-Vektor, der
ein Fremdgen trägt,
benötigt,
beibehalten, verwendet werden können.
Auch können
ITRs aus verschiedenen AAV-Serotypen
verwendet werden.
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Ein
anderes Element, das zur korrekten Expression von FVIII beiträgt, ist
eine Signalsequenz. Eine geeignete Signalsequenz ist jene von nativem FVIII.
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Es
ist nicht erforderlich, dass die von AAV abstammenden Sequenzen
den Wildtyp-AAV-Prototypen
exakt entsprechen. Die rAAV-Vektoren der vorliegenden Erfindung
beispielsweise können
modifizierte invertierte terminate Wiederholungen und andere Sequenzen
aufweisen, vorausgesetzt, dass die rAAV-Vektoren replizieren und
mit der Unterstützung von
Helfervirus verpackt werden können
und eine nicht pathogene, latente Infektion in Targetzellen hervorrufen.
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Typischerweise
können
aufgrund der Packungseinschränkungen
von AAV die für
FVIII-Domänensequenzen
kodierenden Polynucleotide und die Regulationselemente eine Länge von
bis zu etwa 5.500 Basen aufweisen.
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Das
von AAV abstammende Helfervirus oder Helferplasmid kann jedes beliebige
Virus oder Plasmid sein, das in der Lage ist, bei Expression der AAV-Gene,
die es trägt,
Proteine bereitzustellen, die für
die Replikation und Packung des rAAV-Vektors in einer geeigneten
Wirtszelle zur Produktion von rAAV-Vektor-Ausgangsmaterial erforderlich
sind.
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Darüber hinaus
ist das Helfervirus oder Helferplasmid in einer bevorzugten Ausführungsform
eines, das gentechnisch so verändert
wurde, dass es das Risiko von Rekombination zwischen der AAV-Helfer-DNA
und der rAAV-Vektor-DNA reduziert. Noch wünschenswerter besteht nur sehr
eingeschränkte
oder keine Sequenzhomologie zwischen den AAV-Sequenzen der Vektor-DNA
und den AAV-Sequenzen der Helfer-DNA. Die Helfer-DNA kann beispielsweise
eine AAV-Sequenz sein, in der die invertierten terminalen Wiederholungen
von AAV durch die entsprechenden Sequenzen aus einem anderen Virus,
wie beispielsweise Adenovirus (z.B. Adenovirus-Typ-5-DNA), siehe Samulski
et al. (1989), s.o., ersetzt sind.
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Das
Nicht-AAV-Helfervirus ist im Allgemeinen eines, in dem ein für Replikation
erforderliches Gen defekt gemacht wird. Beispielsweise ein Adenovirus-Ausgangsmaterial,
in dem ein Gen davon, beispielsweise das E1A-Gen, unbrauchbar gemacht
ist.
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Nicht-AAV-Helfervirus
kann durch Hitzeinaktivierung bei etwa 56 °C, etwa 30–45 min lang, entfernt oder
physikalisch durch jedes beliebige aus zahlreichen verschiedenen Verfahren,
einschließlich einfacher
oder mehrfacher Zentrifugierdurchgänge in einem Cäsiumchloridgradienten,
von gepackten rAAV-Vektoren getrennt werden.
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Zur
Propagation der rAAV-Vektoren in vitro werden anfällige Zellen
mit einer aus AAV stammenden Vektor-DNA und einem geeigneten, aus
AAV stammenden Helfervirus oder -plasmid, das das AAV-rep-Gen, AAV-cap-Gen
oder beide in sich trägt, co-transfiziert
und durch ein Helfervirus, umfassend Herpesvirus, Adenovirus oder
ein geeignetes Nicht-AAV-Helferplasmid, infiziert. Das bestimmte Verfahren
zur Herstellung von Viruspartikeln ist für die Erfindung nicht maßgeblich.
Jegliches Verfahren zur Herstellung der rAAV-Viruspartikel kann
verwendet werden, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt auf,
jenes Verfahren, das in Samulski et al. (1989), s.o., beschrieben
wird, solange geeignete Konzentrationen von Viruspartikeln, die
in der Lage sind, Zellen in vivo und ex vivo zu transduzieren, erhalten
werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass jegliches verwendete
Reinigungsverfahren infektiöse
Viruspartikel bilden sollte, die in der Lage sind, hepatische Zellen
in vivo oder ex vivo zu transduzieren.
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Aufgrund
der Größeneinschränkungen
zur Bildung eines AAV-Partikels ist die Sequenz, die für ein Polypeptid
mit Faktor-VIII-Aktivität
kodiert, eine, in der die meisten Sequenzen, die für Faktor-VIII-Aktivität nicht
erforderlich sind, entfernt werden. Somit sind zumindest die 90
kD aufweisende schwere Kette und die leichte Kette, ohne B-Domäne, in einem
Vektor von Interesse vorhanden. Verschiedene weitere Modifikationen
hieran, wie die Entfernung weiterer Sequenzen, können toleriert werden, solange
die erwünschten
Niveaus an Faktor-VIII-Aktivität
und Enkapsidierungseffizienz nicht gefährdet werden.
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Grundlegende
Verfahren zur Konstruktion von rekombinanten DNA- und RNA-Moleküle gemäß der vorliegenden
Erfindung sind in zahlreichen Publikationen offenbart, einschließlich Sambrook
et al., in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), das hierin durch
Verweis aufgenommen ist.
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Die
vorliegende Erfindung kann im Rahmen von Gentherapie von mit Faktor-VIII-assoziierten Erkrankungen
wie Hämophilie
A verwendet werden. Ein Individuum kann einer Gentherapie bedürfen, da, aufgrund
von einer oder mehreren Mutationen in der Regulationsregion und/oder
der Kodiersequenz des Faktor-VIII-Gens, Faktor VIII nicht geeignet
exprimiert wird, z.B. eine inkorrekte Aminosäuresequenz aufweist, oder in
den falschen Geweben oder zu den falschen Zeitpunkten exprimiert
wird, zu schwach oder zu stark exprimiert wird.
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Die
Targetzellen der Vektoren der vorliegenden Erfindung sind Zellen,
die in der Lage sind, Polypeptide mit FVIII-Aktivität zu exprimieren,
wie beispielsweise jene des hepatischen Systems eines Säugetiers,
Endothelzellen und andere Zellen mit dem geeigneten Mechanismus,
um den Vorläufer
zu verarbeiten, um Protein mit Faktor-VIII-Aktivität zu erhalten. In einer Ausführungsform
sind die Zellen normale Zellen, die in vitro kultiviert werden.
Die Targetzellen können
menschliche Zellen oder Zellen anderer Säugetiere, insbesondere nichtmenschlicher
Primaten und Säugetiere
der Art Rodenta (Mäuse,
Ratten, Kaninchen und Hamster), Carnivora (Katzen und Hunde) und
Arteriodactyla (Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen und Pferde), sein.
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In
einer anderen Ausführungsform
sind die Zellen Teil eines lebenden Säugetiers zum Zeitpunkt, zu
dem die rAAV-Vektoren der Zelle zugeführt werden. Das Säugetier
kann sich zum Zeitpunkt der Zufuhr in jeder Entwicklungsphase befinden,
z.B. im embryonalen, fötalen,
kindlichen, jugendlichen oder erwachsenen Stadium. Darüber hinaus
können
die Zellen gesund oder erkrankt sein.
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Um
die Vektoren spezifisch einer bestimmten Region beispielsweise der
Leber zuzuführen, können sie
durch Injektion in die Pfortader verabreicht werden. Da die AAV-Vektoren in den Targetzellen
stabil aufrechterhalten werden und keine Viruspartikel produzieren,
wird die darauf folgende Ausbreitung des Vektors gering und hauptsächlich eine Funktion
von passiver Diffusion aus der Injektionsstelle sein. Der Diffusionsgrad
kann durch Einstellen des Verhältnisses
von rAAV-Vektoren zu Flüssigträger gesteuert
werden.
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In
bestimmten Ausführungsformen
werden die Vektoren auf intravaskulärem Weg verabreicht. Die Vektoren
können
beispielsweise intraarteriell verabreicht werden. Natürlich muss
das Rezipientensäugetier
sowohl bei intravenöser
als -auch bei intraportaler Zufuhr in der Lage sein, die mögliche Zufuhr
von Vektoren in Zellen, die nicht jene des hepatischen Systems sind,
zu tolerieren.
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Zum
Richten der Vektoren auf einen bestimmten Zelltyp, z.B. auf Hepatozyten,
kann es von Vorteil sein, den Vektor mit einem homing-Mittel, das sich
spezifisch an einen Oberflächenrezeptor
der Zelle bindet, zu assoziieren. Somit können die Vektoren an einen
Liganden (z.B. Galactose) konjugiert werden, für den bestimmte Zellen des
hepatischen Systems Rezeptoren aufweisen. Die Konjugation kann kovalent,
z.B. mit einem Vernetzer wie Vernetzungsmittel (z.B. Glutaraldehyd),
oder nicht kovalent, z.B. durch die Bindung eines avidinierten Liganden an
einen biotinylierten Vektor, erfolgen. Eine andere Form von kovalenter
Konjugation wird durch das gentechnische Verändern des AAV-Helferplasmids
bereitgestellt, das verwendet wird, um das Vektor-Ausgangsmaterial
herzustellen, sodass eines oder mehrere der kodierten Hüllproteine
ein Hybrid aus einem nativen AAV-Hüllprotein und einem Peptid-
oder Proteinliganden ist, sodass der Ligand an der Oberfläche des
Viruspartikels zugänglich
ist.
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Welche
Form von Konjugation auch vorliegt, sie darf weder die Produktion
noch die Transduktion der rAAV-Vektoren wesentlich stören.
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Die
rAAV-Vektoren können
als Viruspartikel alleine verabreicht werden, entweder in Form einer direkten
In-vivo-Zufuhr in das Pfortgefäßsystem
oder in Form einer Ex-vivo-Behandlung,
umfassend das Verabreichen der rAAV-Vektorviruspartikel in vitro
an Zellen aus dem behandelten Tier, gefolgt von der Einführung der
transduzierten Zellen zurück
in den Donor. Alternativ dazu können
die rAAV-Vektorvirusteilchen verwendet werden, um Zellen in Verbindung
mit sekundären
Mitteln, die dafür
bekannt sind, die Transduktionseffizienz zu steigern, zu transduzieren; siehe
z.B. die WO 95/33824 für
zahlreiche verschiedene sekundäre
Mittel. Sekundäre
Mittel, die zur Steigerung von Transduktionseffizienz nützlich sind, umfassen
radioaktive Moleküle,
einschließlich
tritiierter Nucleotide, Ultraviolettstrahlung, γ-Strahlung, Cisplatin, Hydroxyharnstoff,
Etoposid, Camptothecin, Aphidicolin und Adenovirus, siehe z.B. Ferrari
et al., J. Virol. 70, 3227–3234
(1996).
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Vor
der Verabreichung an einen Wirt ist es nützlich, die Reinheit des rekombinanten
AAV-Präparats,
d.h. des das Transgen enthaltenden AAV-Vektors, zu bestimmen. Wenn
auch beispielsweise keine Erkrankungen mit AAV-Infektion assoziiert
sind, so ist die Kenntnis des Grades an Wildtyp-AAV-Verunreinigung
in einem rekombinanten Viruspräparat
doch wünschenswert.
Wildtypvirus kann durch Crossover zwischen beispielsweise dem AAV-Helferplasmid und
dem AAV-Plasmid, das das Transgen in sich trägt, gebildet werden.
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Die
Gegenwart von verunreinigendem Wildtyp-AAV kann beispielsweise durch
einen Nucleinsäureamplifikationstest,
wie PCR oder RNA-basiertes Amplifikationsverfahren wie 3SR (Gingeras
et al., Ann. Biol. Clin. 48, 498–501 (1990)) und NASBA (van der
Vleit et al., J. Gen. Micro. 139, 2423–2429 (1993)), bestimmt werden.
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So
wird im Fall von PCR AAV-Nucleinsäure hergestellt und zusammen
mit positiven und negativen Kontrollen einer PCR-Reaktion unterzogen.
Die strategische Identifikation bestimmter PCR-Primer ermöglicht das
Unterscheiden zwischen Wildtyp- und rekombinantem Virus auf rasche
und effiziente Weise. Somit werden Primer selektiert, die für Wildtyp-AAV
oder für
Wildtyp-AAV, das durch Rekombination der Helfer- und Vektorplasmide hergeleitet wurde,
spezifisch sind.
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AAV-Vektoren,
die aus pSub201 stammen (Samulski et al., J. Virol. 61, 3096–3101 (1987)),
oder andere Vektoren, die so angepasst wurden, dass sie charakteristische
Sequenzen im linken und rechten Arm des Vektors aufweisen, ermöglichen
die Unterscheidung zwischen Wildtypvirus und Wildtypvirus, das durch
Rekombination entstanden ist. Unter linker und rechter Arm werden
jene Abschnitte des Vektors verstanden, die die Klonierstelle flankieren,
die das Transgen enthält.
Somit ist im Fall von pSub201 der linke Arm jener Teil links von
der XbaI-Seite und der rechte Arm jener Teil rechts von der XbaI-Stelle.
Die Arme enthalten die Haarnadelstrukturen.
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Unter
Verweis auf das Beispiel des pSub201-Vektors zur Erklärung des
Verfahrens wird angemerkt, dass der pSub201 Sequenzen aufweist, die
normalerweise am rechten Arm von AAV zu finden sind, hier jedoch
auf beiden Seiten des Transgens vorhanden sind. Somit sind Sequenzen,
die normalerweise am rechten Arm zu finden sind, ebenfalls am linken
Arm vorhanden, wobei die linken Sequenzen deletiert wurden.
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Folglich
können
Primer konfiguriert werden, worin die Gegenwart oder Abwesenheit
von linken Sequenzen oder die Gegenwart rechter Sequenzen auf beiden
Seiten des Virus verwendet werden kann, um zwischen Wildtyp-AAV,
das die normalerweise auftretenden linken Sequenzen enthält, und
jeglichem Wildtyp-AAV, das durch Rekombination zwischen den Helfer-
und Vektorplasmiden gebildet wird und rechte Sequenzen auf beiden
Seiten des Transgens enthält,
zu unterschieden.
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Bei
der Verwendung eines pSub201-Vektors oder eines entsprechenden Vektors,
der Sequenzen des rechten Arms an beiden Armen enthält, können beispielsweise
die Primer, die an Sequenzen in der AAV-ITR im AAV-rep-Gen; in der
AAV-Spleißregion; und
im AAV-cap-Gen hybridisieren, diagnostisch verwendet werden.
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Bezüglich der
Primer ist sicherlich bekannt, dass, nachdem geeignete Stellen in
den zwei Genomen lokalisiert wurden, die für Wildtyp- und mittels Crossover
gebildetes Wildtypvirus als diagnostisch erkannt wurden, die exakte
Nucleotidsequenz und -länge
von jeglichem Primer variiert werden können, ohne vom Ziel des diagnostischen
Tests abzuweichen. Die Einschränkungen
für die
Variationen an Primern hängen
beispielsweise von den Reaktionsbedingungen der PCR ab, um Hybridisierung
des Primers an das Target sicherzustellen.
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Im
Fall von NASBA oder 3SR können
im Wesentlichen dieselben Primer verwendet werden, die so konfiguriert
sind, dass sie einen geeigneten RNA-Polymerasepromotor enthalten.
Ein anderer Primer zur Synthese des doppelsträngigen Zwischenprodukts kann
beispielsweise auf der Verwendung der Cap2- oder AAV2S2-Primer beruhen.
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Die
Anmeldung offenbart auch einen pharmazeutischen Eingriff in vivo
oder ex vivo zur Behandlung von FVIII-assoziierten Erkrankungen.
Die rAAV-Vektoren, die die rAAV-Vektoren (einschließlich der
ITRs) gepackt in Viruspartikel umfassen, werden einem menschlichen
Patienten in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die erwünschte Faktor-VIII-Aktivität in Serum
zu erzielen. Die Verabreichung kann in jeder beliebigen Weise erfolgen,
bei der die therapeutischen Polypeptide zu den erwünschten Targetzellen
zugeführt
werden. Hierbei werden sowohl In-vivo- als auch Ex-vivo-Verfahren
in Betracht gezogen. Intravenöse
Injektion von rAAV-Vektor in die Pfortader ist ein bevorzugtes Verabreichungsverfahren
zur Transduktion von Leberzellen. Andere In-vivo-Verfahren umfassen
beispielsweise direkte Injektion in die Leberlappen oder den Gallengang und
intravenöse
Injektion distal zur Leber. Ex-vivo-Verabreichungsverfahren umfassen die
Transduktion in vitro von entfernten Hepatozyten oder anderen Zellen
der Leber mit den rAAV-Vektoren, gefolgt von Infusion der transduzierten,
entfernten Hepatozyten zurück
in das Pfortgefäßsystem
oder die Gallengänge
des menschlichen Patienten; siehe z.B. Grossman et al., Nature Genetics
6, 335–341
(1994).
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Unabhängig davon,
ob die Transduktion von Leberzellen in vivo oder ex vivo auftritt,
können
die rAAV-Vektorviruspartikel entweder alleine oder in Verbindung
mit einer partiellen Hepatektomie, einem Helfervirus (einschließlich beispielsweise
Adenovirus, CMV oder HSV-1) oder einem sekundären Mittel zur Steigerung der
Transduktionseffizienz zugeführt werden.
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Die
wirksame Menge an zu verabreichenden rAAV-Vektoren variiert von
Patient zu Patient. Folglich werden wirksame Mengen am besten vom
Arzt selbst, der die rAAV-Vektoren
verabreicht, bestimmt, und geeignete Dosierungen können von
durchschnittlichen Fachleuten leicht bestimmt werden. Eine nützliche
Anfangsmenge zur Verabreichung kann im Bereich von 109 bis
1020 Partikeln für einen Erwachsenen mit 70
kg Körpergewicht
liegen. Nach ausreichend langem Zulassen von Expression der rAAV-Vektoren
(typischerweise 4–15
Tage beispielsweise) bestimmen eine Analyse des Niveaus von Faktor-VIII-Aktivität in Serum
oder anderen Geweben und ein Ver gleich mit dem anfänglichen
Niveau vor der Verabreichung, ob die verabreichte Menge zu gering,
im passenden Bereich oder zu hoch war.
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Geeignete
Behandlungspläne
für anfängliche
und nachfolgende Verabreichungen können auch variieren, ein typisches
Beispiel wäre
jedoch eine anfängliche
Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Verabreichungen, sofern
erforderlich. Nachfolgende Verabreichungen können in variablen Intervallen
verabreicht werden, die im Bereich von täglichen bis jährlichen
Intervallen bis zu Intervallen von mehreren Jahren liegen. Fachleuten
wird bekannt sein, dass geeignete Immunsuppressionsverfahren empfohlen
werden können,
um Hemmung oder Blockierung der Transduktion durch Immunsuppression der
rAAV-Virusvektoren zu vermeiden; siehe z.B. Vilquin et al., Human
Gene Ther. 6, 1391–1401
(1995).
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Formulierungen
sowohl für
Ex-vivo- als auch für
In-vivo-Verabreichungen umfassen Suspensionen in flüssigen oder
emulgierten Flüssigkeiten.
Der aktive Bestandteil (rAAV-Vektor) wird häufig mit Arzneimittelträgern vermischt,
die pharmazeutisch annehmbar und mit dem Wirkstoff kompatibel sind.
Geeignete Arzneimittelträger
umfassen beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol
und dergleichen sowie Kombinationen davon. Weiters kann die Zusammensetzung
geringe Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie beispielsweise Netzmittel
oder Emulgatoren, pH-Puffer, Stabilisatoren oder andere Mittel,
die die Wirksamkeit der pharmazeutischen Zusammensetzung erhöhen.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen können
als injizierbare Formulierungen zur Verabreichung, wie auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt, hergestellt werden, einschließlich der
Verwendung implantierbarer Pumpen (die Fachleuten bekannt sind und
beispielsweise im US-Patent Nr. 5.474.552 beschrieben sind). Zahlreiche
Formulierungen zur oralen oder parenteralen Verabreichung sind bekannt
und können
im Rahmen der Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Vektoren können mit
jedem beliebigen pharmazeutisch annehmbaren Träger zur Erleichterung von Verabreichung
und Handhabung verwendet werden.
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Bei
parenteraler Verabreichung können
Lösungen
in einem Adjuvans wie Sesam- oder
Erdnussöl
oder in wässrigem
Propylenglykol sowie sterile wässrige
Lösungen
verwendet werden. Solche wässrigen
Lösungen
können,
sofern erwünscht,
gepuffert sein, und das flüssige
Verdünnungsmittel kann
zuerst mit Kochsalzlösung
oder Glucose isotonisch gestellt werden. Lösungen des AAV-Vektors in Form
einer freien Säure
(DNA enthält
saure Phosphatgruppen) oder eines pharmakologisch annehmbaren Salzes
können
in Wasser, das in geeigneter Weise mit einem Tensid wie Hydroxypropylcellulose vermischt
ist, hergestellt werden. Eine Dispersion von AAV-Viruspartikeln kann auch in Glycerin,
flüssigen
Polyethylenglykolen und Gemischen davon sowie in Ölen hergestellt
werden. Unter üblichen
Lagerungs- und Einsatzbedingungen enthalten die Präparate ein
Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu unterbinden.
Die verwendeten sterilen wässrigen
Medien sind mittels herkömmlicher
Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, erhältlich.
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Die
pharmazeutischen Formen, die für
parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder
Dispersionen und sterile Pulver für die spontane Herstellung
steriler injizierbarer Lösungen
oder Dispersionen. In allen Fällen
muss die Form steril sein und muss so weit fluid sein, dass parenterale
Verabreichung möglich
ist. Die Formulierung muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen
stabil sein und muss gegen die verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen
wie Bakterien und Pilze geschützt
werden. Der Träger
kann ein Lösungsmittel
oder ein Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol,
Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol
und dergleichen), geeignete Gemische davon und Pflanzenöle enthält. Die
geeignete Fluidität kann
beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin,
durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall
einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden aufrechterhalten
werden. Die Prävention
der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene bakterien-
und pilzbekämpfende
Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal
und dergleichen, erzielt werden. In zahlreichen Fällen wird
bevorzugt, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker und Natriumchlorid,
einzubinden. Verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung
von Mitteln, die Ab sorption verzögern,
beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, erzielt werden.
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Sterile
parenterale Formulierungen werden durch Inkorporation des AAV-Vektors
in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel, zusammen mit verschiedenen
der anderen, oben aufgezählten
Bestandteile, je nach Bedarf, gefolgt von filtrierter Sterilisation,
hergestellt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Inkorporation
des sterilisierten Wirkstoffs in ein steriles Vehikel, das das grundlegende
Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile, ausgewählt aus
den oben genannten, enthält,
hergestellt. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen
injizierbaren Lösungen
sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknen und
Gefriertrocknen, die ein Pulver des Wirkstoffs plus jeglicher zusätzlicher erwünschter
Bestandteile aus der davor steril-filtrierten Lösung davon ergeben.
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Die
vorliegenden rekombinanten Vektoren können auch oral verabreicht
werden. Solche Präparate
können
wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt formuliert werden und können beispielsweise Geschmackstoffe,
Duftstoffe, Farbstoffe und dergleichen umfassen, um die Einnahme
angenehmer zu gestalten.
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Nachdem
die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie unter Bezugnahme
auf die folgenden Beispiele sicherlich noch besser verstanden werden,
die ausschließlich
zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung der Erfindung bereitgestellt
werden.
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BEISPIELE
-
Beispiel 1
-
Vektorkonstruktion
-
pAAV-RSV-hFVIII:
-
Der
Vektor wurde durch Insertieren der menschlichen Faktor-VIII-cDNA-Sequenz in pTRUF5 RSV
NSS.3 hergestellt. pTRUF5 RSV NSS.3 wurde mit SstI und SstII verdaut,
um ein 3.624 bp umfassendes isoliertes Fragment zu ergeben. pKS+F8ΔΔNcoTGA wurde
mit SstI und SstII verdaut, um ein 4.253 bp umfassendes isoliertes
Fragment zu ergeben. pKS+3'F8 wurde mit XbaI
und SstII verdaut, um ein 126 bp umfassendes isoliertes Fragment
zu ergeben, und alle drei Stücke
wurden miteinander ligiert.
-
pTRUF5 RSV NSS.3:
-
Der
Vektor wurde entworfen, um die Ersetzung der menschlichen FIX-cDNA
in pTRUF5 RSV hF9.3 durch die menschliche Faktor-VIII-cDNA-Sequenz zu unterstützen. pTRUF5
RSV hF9.2 wurde mit HindIII und SstII verdaut, und das 3.228 bp
umfassende Vektorfragment wurde isoliert. SSV9 RSV hF9.3 wurde mit
HindIII und MluI verdaut, um ein 241 bp umfassendes isoliertes Fragment
zu ergeben. SSV9 RSV X.2 wurde mit MluI und NcoI verdaut, um ein
144 bp umfassendes isoliertes Fragment zu ergeben. Die 3 Fragmente
wurden an einen Oligonucleotidlinker ligiert, der NcoI- und SstII-Enden,
die ersten 15 Nucleotide der menschlichen Faktor-VIII-cDNA-Sequenz
und eine innere ApaI-Stelle (5'-CATGGAAATAGAGCTCGGGCCCCCGC-3' (Seq.-ID Nr. 1) und
5'-GGGGGCCCGAGCTCTATTTC-3' (Seq.-ID Nr. 2))
enthielt.
-
pTRUF5 RSV hF9.3:
-
Die
AAV-ITR-Sequenzen von SSV9 RSV hF9.3 wurden durch die kürzeren AAV-ITR-Sequenzen
von pTRUF5 ersetzt. pTRUF5 wurde mit BglII verdaut, um ein 3.167
bp umfassendes isoliertes Fragment zu ergeben. SSV9 RSV hF9.3 wurde
mit BglII verdaut, um ein 1.840 bp umfassendes isoliertes Fragment
zu ergeben. Die zwei Teile wurden miteinander ligiert, und Klone
wurden auf jene selektiert, die die Promotorregion neben der linken
ITR ausrichteten.
-
SSV9 RSV hF9.3:
-
Die
verbleibenden MMLV-LTR- und -Intronsequenzen in SSV9 RSV hF9.1 wurden
durch das zweite menschliche α-Globin-Intron
ersetzt (McCullough et al., Mol. Cell. Biochem. 17(8), 4562–4571 (1997)).
SSV9 RSV hF9.1 wurde mit HindIII und BamHI verdaut, um ein 5.460
bp umfassendes Fragment zu ergeben. SSV9 RSV hF9.1 wurde auch mit HinPI
und BamHI verdaut, um ein 1.384 bp umfassendes isoliertes Fragment
zu ergeben. pIK6.1RSV wurde mit HindIII und XbaI ver daut, und eine
235 bp umfassende Bande, die den RSV-Promotor enthielt, wurde isoliert.
(pIK6.1RSV wurde wie in der WO 97/07225 beschrieben konstruiert,
wobei der bekannte RSV-Promotor in den pIK-Vektor kloniert wird.)
Die 3 Fragmente wurden an einen Oligonucleotidlinker ligiert, der
in 4 Teilen mit einer Überlappung von
6 Basen im Zentrum und SstII- und HinPI-Stellen an den Enden synthetisiert
wurde.
#1-5'CTAGTACGCGTAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGAT GGCGCCTTCCTCTCAGGGCA3' (SEQ.-ID Nr.:3);
#2-5'GAGGATCACGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCC TCTTCTCTGCACAGCCGCCACCATGCAG3' (SEQ-ID.Nr.:4)
"3-5'CGCTGCATGGTGGCGGCTGTGCAGAGAAGAGGGTCAGTGCGGCCCAGGCCCGC AGCCGCCGCCTGCGCTACACCGTGATCCTCTGCCCT3' (SEQ.-ID Nr.:5);
#4-5'GAGAGGAAGGCGCCATCTCGCCCCTCGACCCAGATCGCTCCCGGCCCGCCGCT CACCTTACGCGTA3' (SEQ-ID Nr.:6)
-
Um
eine einmalige XbaI-Stelle im Vektor beizubehalten, trunkierte der
Oligonucleotidlinker die XbaI-Stelle, in die er eintrat. Weiters
umfasst der Oligonucleotidlinker eine MluI-Stelle am 5'-Ende, um zukünftige Klonierschritte
zu unterstützen.
-
SSV9 RSV hF9.1:
-
Eine
synthetische Polyadenylierungssequenz wurde zu SSV9 RSV hF9 intA
hinzugefügt.
Die Poly-A-Sequenz wurde von Levitt et al. (Genes Develop. 3, 1019–1025) adaptiert
und in die Vektoren wie folgt kloniert. SSV9 RSV hF9 intA wurde
mit NgoMI und SstII verdaut, und das 6.323 bp umfassende Fragment
wurde isoliert. SSV9 RSV hF9 intA wurde auch mit NheI und NgoMI
verdaut, und das 736 bp umfassende Fragment wurde isoliert. Ein
Oligonucleotidlinker wurde in 4 Teilen mit einer Überlappung
von 8 Basen im Zentrum synthetisiert.
#1-5'GGAATAAAATTTATTTATTTTCATTATT3'(SEQ.-ID Nr.:7);
#2-5'TATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAGATCTTCTAGAG3'(SEQ.-ID Nr.:8);
#3-5'CTAGCTCTAGAAGATCTCACACAAAAAACCAA3'(SEQ.-ID Nr.:9);
#4,5'CACACATAAATAATGAAAATAAATAAATTTTATTCCGC3' (SEQ.-ID Nr.:10).
-
Die
SstII- und NheI-Enden des Linkers schlossen die Konstruktion ab.
-
pAAV-RSV-U-hFVIII:
-
Der
Vektor wurde hergestellt, um die menschliche Faktor-VIII-cDNA-Sequenz in pTRUF5 RSV
NSS.2 zu insertieren. pTRUF5 RSV NSS.2 wurde mit NcoI und SstII
verdaut, und ein 3.679 bp umfassendes Fragment wurde isoliert. pKS+F8ΔΔNcoTGA wurde
mit NcoI und SstII verdaut, ein 4.376 bp umfassendes Fragment wurde
isoliert, und die Fragmente wurden aneinander ligiert.
-
pTRUF5 RSV NSS.2:
-
Der
Vektor wurde entworfen, um die Ersetzung der menschlichen FIX-cDNA
in pTRUF5 RSV hF9.2 durch die menschliche Faktor-VIII-cDNA-Sequenz zu unterstützen. pTRUF5
RSV hF9.2 wurde mit HindIII und SstII verdaut, und das 3.228 bp
umfassende Vektorfragment wurde isoliert. SSV9 RSV X.2 wurde mit
HindIII und NcoI verdaut, um ein 451 bp umfassendes isoliertes Fragment
zu ergeben. Die 2 Fragmente wurden zu einem Oligonucleotidlinker
ligiert, der NcoI- und SstII-Enden, die ersten 15 Nucleotide der
menschlichen Faktor-VIII-cDNA-Sequenz und eine innere ApaI-Stelle
(5'-CATGGAAATAGAGCTCGGGCCCCCGC-3' (Seq.-ID Nr. 1) und 5'-GGGGGCCCGAGCTCTATTTC-3' (Seq.-ID Nr. 2)) enthielt.
-
pTRUF5 RSV hF9.2:
-
Die
AAV-ITR-Sequenzen von SSV9 RSV hF9.2 wurden durch die kürzeren AAV-ITR-Sequenzen
von pTRUF5 ersetzt (Zolotukhin et al., J. Virol. 70, 4646–4654).
pTRUF5 wurde mit BglII verdaut, um ein 3.167 bp umfassendes isoliertes
Fragment zu ergeben. SSV9 RSV hF9.2 wurde mit BglII verdaut, um ein
1.909 bp umfassendes isoliertes Fragment zu ergeben. Die zwei Teile
wurden miteinander ligiert, und Klone wurden auf jene selektiert,
die die Promotorregion neben der linken ITR ausgerichtet hatten.
-
SSV9 RSV hF9.2:
-
Die
verbleibenden MMLV-LTR- und -Intronsequenzen in SSV9 RSV hF9.1 wurden
durch das zweite menschliche α-Globin-Intron
(McCullough et al., (1997), s.o.) ersetzt. SSV9 RSV hF9.1 wurde
mit HindIII und BamHI verdaut, um ein 5.460 bp umfassendes isoliertes
Fragment zu ergeben. SSV9 RSV hF9.1 wurde auch mit HinPI und BamHI
verdaut, um ein 1.384 bp umfassendes isoliertes Frag ment zu ergeben.
pIK6.1RSV wurde mit HindIII und SstII verdaut, und eine 303 bp umfassende
Bande, die den RSV-Promotor enthielt, wurde isoliert, und die 5'-untranslatierte Region von CMV-IE-Promotor
wurde isoliert. Die 3 Fragmente wurden an einen Oligonucleotidlinker
ligiert, der in 4 Teilen mit einer Überlappung von 6 Basen im Zentrum
und SstII- und HinPI-Stellen an den Enden synthetisiert wurde.
#1-5'ACGCGTAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGG CGCCTTCCTCTCAGGGCA3' (SEQ.-ID Nr.:11)
#2-5'GAGGATCACGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCC TCTTCTCTGCACAGCCGCCACCATGCAG3'(SEQ.-ID Nr.:4)
#3-5'CGCTGCATGGTGGCGGCTGTGCAGAGAAGAGGGTCAGTGCGGCCCAGGCCCGC AGCCGCCGCCTGCGCTACACCGTGATCCTCTGCCCT3'(SEQ.-ID Nr.:5)
#4-5'GAGAGGAAGGCGCCATCTCGCCCCTCGACCCAGATCGCTCCCGGCCCGCCGCT CACCTTACGCGTGC3' (SEQ.-ID Nr.:12)
-
Um
eine einmalige SstII-Stelle im Vektor beizubehalten, trunkierte
der Oligonucleotidlinker die SstII-Stelle, in die er eintrat. Weiters
umfasste der Oligonucleotidlinker eine MluI-Stelle am 5'-Ende, um zukünftige Klonierschritte
zu unterstützen.
-
SSV9 RSV hF9 intA:
-
Der
Vektor wurde entwickelt, um die Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungsstelle
aus SSV9 RSV hF9 zu deletieren und durch einen Oligonucleotidlinker
zu ersetzen, der das Klonieren von zukünftigen Generationen von Vektoren
erleichterte. Der Vektor SSV9 RSV hF9 wurde mit BamHI und SalI verdaut,
und ein 7.047 bp umfassendes Fragment wurde isoliert. Ein Oligonucleotidlinker,
der durch die BamHI- und SalI-Stellen flankiert war und innere SstII-
und NheI-Stellen (5'-GATCCCCGCGGCTAGCG-3' (Seq.-ID Nr. 13)
und 5'-TCGACGCTAGCCGCGGG-3' (Seq.-ID Nr. 14))
umfasste, wurde in den Vektor ligiert.
-
SSV9 RSV hF9:
-
Der
Vektor wurde so konstruiert, dass die MMLV-LTR-Enhancer/Promotor-Region von pSSV9 MFGS
hF9 (Snyder et al., Nature Genetics 16, 270–276) durch den RSV-Enhancer/Promotor
ersetzt wurde. Der RSV-Enhancer/Promotor
aus der U3-Region von RSV, Nucleotide 1–234 (Haseltine et al., PNAS
74(3), 989–993
(1997)), wurde aus pRTD43.RSV an einem 266-bp-HindIII→Asp718-Fragment genommen. MMLV
R, U5 und Intron wurden aus pSSV9 MFGS hF9 an einem 1.031-bp-Asp718→BglII-Fragment
(Dranoff, PNAS 90, 3539-3543
(1993)) genommen. Die für
Faktor IX kodierende Sequenz, BGH-Poly-A-Stelle und beide AAV-ITRs
wurden aus pSSV9 MFGS hF9 an einem 5.969-bp-NheI→BglII-Fragment genommen. Die Konstruktion
wurde mit einem Oligonucleotidlinker von NheI bis HindIII, der eine
innere BglII-Stelle (5'-CTAGCAGATCTA-3' (Seq.-ID Nr. 15)
und 5'-AGCTTAGATCTG-3' (Seq.-ID Nr. 16))
umfasste, abgeschlossen.
-
SSV9 RSV X.2:
-
Der
Vektor wurde entworfen, um die Ersetzung der menschlichen FIX-cDNA
in SSV9 RSV hF9.2 durch die menschliche Faktor-VIII-cDNA-Sequenz
zu unterstützen.
SSV9 RSV hF9.2 wurde mit EcoRI und SstII verdaut, um die FIX-cDNA
zu entfernen, und das 4.274 bp umfassende Vektorfragment wurde isoliert.
SSV9 RSV hF9.2 wurde auch mit EcoRI und NlaIII verdaut, um ein 271
bp umfassendes isoliertes Fragment zu ergeben. Die 2 Fragmente wurden
an einen Oligonucleotidlinker ligiert, der NlaIII- und SstII-Enden
und eine innere NcoI-Stelle (5'-GTTATTACCGC-3' (Seq.-ID Nr. 17)
und 5'-GGTAATAACCATG-3' (Seq.-ID Nr. 18))
enthielt.
-
SSV9 RSV NSS.2:
-
Der
Vektor wurde entworfen, um die Einbindung der menschlichen Faktor-VIII-cDNA-Sequenz in
SSV9 RSV X.2 zu unterstützen.
SSV9 RSV X.2 wurde mit NcoI und SstII entworfen, um ein 4.544 bp umfassendes
isoliertes Fragment zu ergeben. Ein Oligonucleotidlinker, der NcoI-
und SstII-Enden, die ersten 15 Nucleotide der menschlichen Faktor-VIII-cDNA-Sequenz
und eine innere ApaI-Stelle (5'-CATGGAAATAGAGCTCGGGCCCCCGC-3' (Seq.-ID Nr. 1)
und 5-GGGGGCCCGAGCTCTATTTC-3' (Seq.-ID Nr. 2))
enthielt, wurde in den Vektor ligiert.
-
pAAV-FIX-hFVIII:
-
Der
RSV-Promotor in pAAV-RSV-hFVIII wurde durch den menschlichen Faktor-IX-Promotor
aus dem pSVSPORT-FIX-po-Vektor ersetzt.
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pAAV-FIX-U-hFVIII:
-
Der
RSV-Promotor in pAAV-RSV-U-hFVIII wurde durch den menschlichen Faktor-IX-Promotor aus
dem pSVSPORT-FIX-po-Vektor ersetzt.
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pSVSPORT FIX po:
-
PCR-Primer
wurden so entworfen, dass sie Sequenzen von –220 bis +20 bezogen auf die FIX-Transkriptionsinitiationsstelle
amplifizierten (Salier et al., JBC 265(12), 7062–7068 (1990)). Die zur Amplifikation
der Promotorsequenzen verwendete Matrix war ein bakterielles künstliches
Chromosom, B88, das für
das gesamte FIX-Gen an einer 40-kb-Kassette kodierte. Die Vorwärtsprimersequenz lautete
5'-GGGAAGCTTCAGACTAACTGGACCACTCAT-3' (Seq.-ID Nr. 19).
Die Rückwärtsprimersequenz
lautete 5'-GGGACGCGTGGTGATTATTAAATTTCACCTC-3' (Seq.-ID Nr. 20).
Der Vorwärtsprimer
wurde gentechnisch verändert,
um eine HindIII-Stelle
am 5'-Ende des Promotors
zu umfassen, und der Rückwärtsprimer
wurde gentechnisch verändert,
um eine MluI-Stelle am 3'-Ende
des Promotors zu umfassen. Darüber
hinaus mutierte der Rückwärtsprimer
das 'G'-Nucleotid an Position
+18 zu 'C', um einen offenen
Leseraster in der FIX- (Faktor-IX-) 5'-untranslatierten Region zu entfernen.
Nach PCR-Amplifikation wurde das Produkt mit HindIII und MluI verdaut
und Elektrophorese unterzogen. Das 252 bp umfassende FIX-Promotorfragment
wurde isoliert und in den 3.150 bp umfassenden, HindIII- und MluI-verdauten
Shuttlevektor pSVSPORT (Gibco/BRL) ligiert.
-
pKS+F8ΔΔNcoTGA
ist
ein Vektor, der eine SQ-B-Domänendeletion
(Lind et al., Eur. J. Biochem. 232, 19–27 (1995)) in der Human-Faktor-VIII-cDNA
enthält,
in der die das Initiatormethionin umgebende Sequenz so verändert wurde, dass
sie effiziente Translation fördert
(Kozak, J. Mol. Biol. 196, 947–950
(1987)), das Gln an Position 2 der Leadersequenz zu Glu geändert wurde
und untranslatierte Sequenzen 3' vom
Translationsstoppcodon entfernt wurden. pKS+F8ΔΔNcoTGA wurde durch Ligieren
eines 1,8 kb umfassenden NgoMI-PflMI-Fragments aus pKS+F83'SQ mit einem 3 kb
umfassenden SacI-PflMI-Fragment aus pKS+F8ΔSQΔIntron und
einem 2,5 kb umfassenden SacI-NgoMI-Fragment aus pKS+NcoInt
gebildet.
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pKS+F83'SQ
wurde
durch Ligieren eines 755 bp umfassenden HindIII-PflMI-Fragments aus pKS+F8ΔSQ
mit einem 1,2 kb umfassenden PflMI-XbaI-Fragment aus pKS+F8 und einem 3 kb umfassenden XbaI-HindIII-Fragment aus
pKS+3'F8
gebildet.
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pKS+F8ΔSQΔIntron
wurde
durch Ligieren eines 1,35 kb umfassenden BglII-PflMI-Fragments aus pKS+F8ΔSQ
mit einem 7,1 kb umfassenden PflMI-BglII-Fragment aus pKS+F8ΔIntron
gebildet.
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pKS+NcoInt
kodiert für die ersten vier Aminosäuren von
F8, sodass das ATG in einer NcoI-Stelle enthalten ist, und ändert Gln
an Position 2 der Leadersequenz zu Glu. pKS+NcoInt
wurde durch Insertieren eines XhoI-SacI-Linkers, der aus synthetischen
Oligos 5'-TCGAGCCATGGAAATAGAGCT-3' (Seq.-ID Nr. 21)
und 5'-CTATTTCCATGGA-3' (Seq.-ID Nr. 22)
besteht, in pKS+, verdaut mit XhoI und SacI, gebildet.
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Um
pKS+F8ΔSQ
zu
bilden, wurde die für
die Aminosäuren
Gln 744 bis Ser 1637 (Lind et al. (1995), s.o.) kodierende Sequenz
durch Loop-out-Mutagenese unter Verwendung von pKS+F8 als Matrix
und Oligonucleotid 5'-AGCTTCTCCCAGAATCCACCAGTCTTGAAA-3' (Seq.-ID Nr. 23)
als Primer deletiert, um pKS+F8ΔSQ zu bilden.
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pKS+F8ΔIntron
wurde
durch Ersetzen des 638 bp umfassenden SacI-AflII-Fragments von pKS+F8, das ein trunkiertes F8-Intron enthielt,
durch ein 309 bp umfassendes SacI-AflII-Fragment, das durch PCR
unter Verwendung von menschlicher Leber-cDNA (Clontech) als Matrix mit Primer
5'-CCATGGATGCAAATAGAGCTCTCCACC-3' (Seq.-ID Nr. 24) und Primer 5'-TCCAGTAGGATACACCAACAGC-3' (Seq.-ID Nr. 25),
gefolgt von Verdau mit SacI und AflII, gebildet wurde, gebildet.
-
pKS+3'F8,
das
die 3'-105-bp-Kodiersequenzen
von FVIII, gefolgt von einer eingeführten SacII-Stelle, enthält, wurde
durch Insertieren eines 113 bp umfassenden SacII-XbaI-Fragments (gebildet durch PCR unter
Verwendung von pKS+F8 als Matrix mit Oligonucleotidprimer
5'-AGACTCCTTCACACCTGTGGT-3' (Seq.-ID Nr. 26)
und Oligopnmer 5'-GAATTCCCGCGGTCAGTAGAGGTCCTGTGCCT-3' (Seq.-ID Nr. 27),
gefolgt von Verdau mit SacII und XbaI) in das 2,9 kb umfassende-
XbaI-SacII-Fragment
von pKS+ gebildet.
-
pKS+F8
wurde durch Insertieren eines 5
kb umfassenden SacI-SalI-Fragments aus pUC19AdRSVF8 (Richard Morgan,
National Institutes of Health, Clinical Gene Therapy Branch) in
das 2,9 kb umfassende SacI-SalI-Fragment aus pKS+ (Stratagene)
gebildet.
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Beispiel 2
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rAAV-Vektorherstellung
-
Die
rekombinanten AAV-Vektoren wurden wie von Snyder et al., "Production of recombinant adeno-associated
viral vectors",
in: Current Protocols in Human Genetics, N. Dracopoli et al. (Hrsg.),
John Wiley & Sons,
New York, 12.1.1–12.1.24
(1996), beschrieben, jedoch mit Modifikationen, gepackt. Kurz zusammengefasst
wurden subkonfluente 293-Zellen mit dem Vektorplasmid co-transfiziert,
und das AAV-Helferplasmid
pUC19.ACG wurde verwendet, um AAV-rep- und -cap-Funktionen bereitzustellen. Das
pUC19.ACG-Konstrukt trägt
ein XbaI-Fragment von pACG2-1 in sich, wie es von Li et al. (J.
Virol. 71, 7236–5243
(1997)) beschrieben wird, das durch PCR isoliert wurde, um die 5'-XbaI-Stelle zu HindIII
und die 3'-XbaI-Stelle
zu BamHI zu ändern.
Das Fragment wurde in die HindIII- und BamHI-Stellen in pUC-19 insertiert
und trägt
keine Adenovirus-terminalen Wiederholungen in sich. Zellen wurden
dann mit Adenovirus Ad5dl312 (einer E1A-Mutante) bei einer Infektionsmultiplizität von 2
infiziert, und die Infektion wurde 72 h lang laufen gelassen. Zellen
wurden geerntet, und drei Frier/Auftau-Zyklen wurden durchgeführt, um
die Zellen zu lysieren. Die Nucleinsäure im Lysat wurde mit 250
Einheiten/ml Benzonase (Nycomed) bei 37 °C 10 min lang verdaut und anschließend bei 1.500
g zentrifugiert, um die Zelltrümmer
zu pelletieren. Das Zelllysat wurde dann durch Ammoniumsulfatfällung fraktioniert,
und die rAAV-Virionen wurden an zwei sequenziellen isopyknischen
CsCl-Gradienten
gereinigt, die in einem Beckman-NVT65-Rotor bei 60.000 U/min mind. 6
h lang jeweils gebildet worden sind. Fraktionen wurden unter Verwendung
eines "Beckman Fraction
Recovery System" (Nr. 343890)
abgenommen. Nach CsCl-Banding
wurden die Fraktionen, die rAAV enthielten, gegen PBS (JRH Biosciences,
Nr. 5930078P) dialysiert. Die Proben wurden dann 45 min lang auf
56 °C erhitzt
und bei –80 °C gelagert.
-
Beispiel 3
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Virusinfektionen
-
293-Zellen
wurden bei insgesamt 1 × 106 Zellen pro Well einer 6-Well-Gewebekulturplatte überimpft
und über
Nacht bei 37 °C
inkubiert. Das Medium wurde aus den Wells entfernt und durch IMDM,
das 10 % hitzeinaktiviertes fötales
Rinderserum, 1 % antibiotische/antimykotische Lösung mit 10 mM MgCl2 enthielt, ersetzt, und anschließend wurden
die Platten wieder 1–2
h lang in den Inkubator gegeben. Die Zellen wurden mit rAAV durch
den Zusatz des Virus direkt in das Gewebekulturmedium infiziert.
Typischerweise ergibt eine Dosis von 1 × 1010 Partikeln
pro 1 × 106 überimpfte
Zellen nachweisbare Konzentrationen von menschlichem Faktor VIII.
Die Zellen wurden mit Ad5 d1309 bei einer Infektionsmultiplizität von 2
co-infiziert und anschließend
bei 37 °C inkubiert.
Nach 48 h wurde das Zellkulturmedium aus der Gewebekulturplatte
entfernt und auf menschliche Faktor-VIII-Aktivität analysiert.
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Beispiel 4
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Plasmidtransfektion
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293-Zellen
wurden in 10-cm-Schalen bei 4,5 × 106 Zellen/Schale überimpft
und 24 h später
durch das Calciumphosphatverfahren (Snyder (1996), s.o.) transfiziert.
10 μg von
den pMFGΔBVIII-
(Dwarki et al., PNAS 92, 1023–1027),
pAAV-RSV-U-hFVIII- und pAAV-RSV-hFVIII-Vektoren
wurden bei der Transfektion verwendet. Nach 5 Stunden wurden die
Medien gegen 7,5 ml IMDM + 10 % hitzeinaktivierte FBS + 20 mM MgCl2 getauscht. Überstände wurden nach 48 h für ELISA
und FVIII-Aktivitätstests
abgenommen.
-
Beispiel 5
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FVIII-Bestimmung
-
FVIII-Funktion
wurde durch einen chromogenen Test bestimmt, der FVIII-abhängige Bildung
von Faktor Xa aus Faktor X (Carlebjork et al., Throm. Res. 47, 5–14 (1987);
Rosen, Scand. J. Haemot. Suppl. 40, 139–145 (1984)) unter Verwendung
eines im Handel erhältlichen
Sets (Coatest, Kabivitrum, Stockholm) misst.
-
FVIII
wurde in einer ELISA unter Verwendung von im Handel erhältlichen
Reagenzien, wie mAbs, die gegen die H-Kette oder L-Kette gerichtet sind,
und geeigneten Reporterreagenzien unter Durchführung bekannter Verfahren quantifiziert.
-
Faktor-VIII-Aktivität wurde
beobachtet.
-
Alle
in der vorliegenden Beschreibung genannten Quellen sind hierin durch
Verweis aufgenommen.
-
Nachdem
die Erfindung nun vollständig
beschrieben wurde, wird durchschnittlichen Fachleuten ersichtlich
sein, dass zahlreiche Änderungen
und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne von der Idee oder
dem Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche abzuweichen.