DE69918090T2

DE69918090T2 - Rekombinanter adeno-assoziierter viraler vektor, der alpha-1 antitrypsin kodiert, zur gentherapie

Info

Publication number: DE69918090T2
Application number: DE69918090T
Authority: DE
Inventors: R. Terence FLOTTE; Sihong Song; J. Barry BYRNE; Michael Morgan
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2019-04-24
Also published as: CA2326327C; WO1999055564A9; US20030082162A1; CA2326327A1; US20090186002A1; PT1071806E; EP1071806A2; AU3663699A; US20030095949A1; NZ507308A; EP1071806B1; DK1071806T3; ATE269412T1; ES2219011T3; DE69918090D1; HK1035205A1; WO1999055564A1; US6461606B1; WO1999055564A8

Description

Hintergrund der Erfindung
Alpha-1-Antitrypsin (AAT) Mangel ist die zweit häufigste monogenetische Lungenerkrankung des Menschen, die für 3% aller frühen Tode aufgrund chronischer Emphysembronchitis verantwortlich ist. Das AAT-Protein wird normalerweise in der Leber erzeugt, in das Serum sekretiert und zur Lunge zirkuliert, wo es das feine unterstützende Netzwerk der Elastinfasern vor dem Abbau durch neutrophile Elastase schützt. Die gegenwärtige Therapie für den AAT-Mangel umfaßt das Vermeiden der Exposition gegenüber Zigarettenrauch und die wöchentliche intravenöse Infusion rekombinanten humanen AAT-Proteins (hAAT). Versuche gentherapeutische Strategien zu entwickeln, um das AAT entweder in der Lunge selbst oder innerhalb einer Anzahl anderer Gewebe, die zur AAT-Sekretion in der Lage sind, zu ersetzten, sind durch die kurze Dauer der Expression von einigen der Vektoren und durch die relativ hohen zirkulierenden Mengen des AATs, die für die therapeutische Wirkung erforderlich sind, beschränkt worden. Verfahren der Gentherapie sind im U.S. Patent Nr. 5,399,346 beschrieben.
Es ist kürzlich gezeigt worden, daß Adeno-assoziierter Virus-(AAV)-Vektoren zur stabilen in vivo Expression in der Lage sind und weniger immunogen sein können als andere virale Vektoren (Flotte et al., 1996; Xiao et al., 1996; Kessler et al., 1996; Jooss et al., 1998). AAV ist ein nicht-pathogener humaner Parvovirus, dessen Lebenszyklus natürlicherweise einen Mechanismus für eine langfristige Latenz umfaßt. Im Falle von Wildtyp AAV (wtAAV) beruht diese Beständigkeit auf der Orts-spezifischen Integration an einer Stelle des humanen Chromosoms 19 (die AAVSI-Stelle) in der Mehrzahl der Zellen (Kotin et al., 1990) während die Beständigkeit rekombinanter AAV-(rAAV)-Vektoren auf der Kombination einer episomalen Beständigkeit und der Integration an nicht-Chromosom 19 Orten zu beruhen scheint (Afione et al., 1996; Kearns et al., 1996). Die Latenz des rekombinanten AAVs unterscheidet sich von der von wtAAV dadurch, daß wtAAV in Abwesenheit eines Helfervirus (z. B. Adenovirus) rasch in doppelsträngige DNA umgewandelt wird, während für rAAV die Synthese des Führungsstrangs in Abwesenheit des Helfervirus verzögert ist (Fisher et al., 1996; Ferrari et al., 1996). U.S. Patent Nr. 5,658,785 beschreibt einen Adeno-assoziierten Virusvektor und Verfahren für den Gentransfer in Zellen.
Kessler et al. (1996) zeigt, daß Mäuseskelettmuskelfasern, die durch einen rAAV Vektor transduziert waren zu einer beständigen Sekretion biologisch aktiven humanen Erithropoietin (hEpo) in der Lage waren scheinbar ohne eine bedeutende Immunantwort gegen das sekretier tierte hEpo auszulösen. Siehe auch U.S. Patent Nr. 5,858,351, daß an Podsakoff et al. erteilt worden ist. Gleichermaßen haben Murphy et al. (1997) die Expression und Sekretion beständiger Mengen Leptins ob/ob Mäusen nach AAV-Muskeltransduktion beobachtet. Brantly et al. (U.S. Patent Nr. 5,439,824) offenbart Verfahren für die Erhöhung von AAT unter Verwendung von Vektoren, die das Intron II des humanen AAT-Gens umfassen. Die Menge der beobachteten Leptin-Expression war jedoch nur im Bereich von 2 bis 5 ng/ml. Die Therapie von AAT-Mangel erfordert jedoch Serummengen von mindestens 800 μg/ml. Daher verbleibt ein Bedürfnis im Stand der Technik für Mittel, um therapeutisch nützliche Mengen eines Proteins an eine Person, die einer solchen Behandlung bedarf, zur Verfügung zu stellen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Verwendungen davon für die Gentherapie. Ein Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, die verwendet werden können, um eine genetische Therapie in Tieren oder Menschen zur Verfügung zu stellen, die eine genetische Erkrankung aufweisen, bei der relativ hohe Expressionsmengen eines Proteins erforderlich sind, um die Erkrankung zu behandeln. Die Vektoren der Erfindung beruhen auf Adeno-assoziierten Virus (AAV). Die Vektoren sind entworfen worden, um hohe Mengen der im Vektor enthaltenen heterologen DNA zur Verfügung zu stellen. In einer Ausführungsform umfassen die Vektoren umgekehrte AAV-terminale Wiederholungssequenzen und konstitutive oder regulierbare Promotoren, um hohe Mengen der Genexpression zu steuern. Die vorliegende Erfindung offenbart auch Verfahren für die Behandlung von Tieren oder Menschen, die einer Gentherapie bedürfen z. B. um eine genetische Mangelerkrankung zu krrigieren.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Adenoassoziierter viraler Vektor zur Verfügung gestellt, der ein Polynukleotid umfaßt, das für ein α-1-Antitrypsin-Polypeptid oder ein biologisch wirksames Fragment oder eine Variante davon kodiert, das wirksam mit einem Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem CMV-Promotor, einem β-Aktin-Promotor, einem hybriden CMV-Enhancer/β-Promotor, einem EF1-Promotor, einem U1a-Promotor, einem U1b-Promotor, einem Tet-induzierbaren Promotor und einem VP16-LexA-Promotor verknüpft ist, der das Polynukleotid exprimiert, um das α-1-Αntitrypsin-Polypeptid, das Fragment oder die Variante in einer Säugetierwirtszelle herzustellen.
In einem zweiten Aspekt wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die den rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor, ein virales Partikel oder die Wirtszelle für die Verwendung in der Therapie umfaßt.
In einem dritten Aspekt wird die Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektors, des viralen Partikels, der viralen Wirtszelle oder der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines α-1-Antitrypsinmangels oder -defekts in einem Säugetier zur Verfügung gestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt rAAV-AAT-Vektorkassetten, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die A-AT- und B-AT-Konstrukte enthalten Promotoren von den kleinen nukleären RNA-Genen, U1a bzw. U1b. Das C-AT-Konstrukt enthält den CMV-Promotor während der E-AT-Vektor den human Elongationsfaktor 1-α-Promotor verwendet (ELF in der Figur). ITR bezeichnet die AAV-umgekehrte endständige Wiederholung; An bezeichnet das polyA-Signal; Tk bezeichnet den HSV-Thymidinkinase-Promotor; neo bezeichnet das Tn5 Neomycinphosphotransferase-Gen.
2 zeigt die hAAT Sekretionsraten in vitro in der transient transfizierten Mäuse C2C12-Myoblastenzellinie unter Verwendung von Expressionsvektoren gemäß dem Gegenstand der Erfindung. C-AT weicht nicht wesentlich von E-AT ab, beide unterscheiden sich von A-AT und B-AT (p < 0,05). Die AAT-Expression wurde unter Verwendung eines ELISA-Testverfahrens, das spezifisch für humanes AAT ist, nachgewiesen.
3 zeigt die hAAT-Sekretionsmenge in vitro in einer stabilen transduzierten Mäuse C2C12-Myoblasten-Zellinie unter Verwendung viraler Partikel, die Expressionsvektoren gemäß dem Gegenstand der Erfindung umfassen. Die Durchschnittsraten der Sekretion aus G418-resistenten Kulturen 1 Mo. nach der Transduktion mit entweder verpackten E-AT-Vektor oder verpackten C-AT-Vektor sind gezeigt. In jedem Fall wurde eine Transduktion "niedriger" Multiplizität (4 × 10⁵ Partikel/Zelle) und eine Transduktion hoher Multiplizität (4 × 10⁶ Partikel/Zelle) durchgeführt. E-AT "niedrig" und "hoch" sind größer als die "hohe" Multiplizität C-AT (P = 0,02) sind aber nicht deutlich voneinander unterschiedlich (n = 3).
Die AAT-Expression wurde unter Verwendung eines ELISA-Testverfahrens, das spezifisch für humanes AAT ist, nachgewiesen.
4 zeigt weitere Konstrukte, die auf ihre AAT-Expression hin getestet wurden. Die Mäusemyoblastenzellen C2C12 wurden in 35 mm Vertiefungen mit etwa 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung wachsen gelassen und wurden mit 5 μg der jeweiligen Plasmid-DNA unter Verwendung von Superfect Transfektion (Qiagen Inc., CA) transfiziert. Die Sekretion von hAAT in das Medium wurde zwei Tage nach der Transfektion unter Verwendung eines Antigen-Fänger-ELISA bewertet. Jeder Balken stellt den Mittelwert der Ergebnisse aus drei Experimenten (dreifach Bestimmung in jedem Experiment) dar.
Daten aus den Transfektionsexperimenten deuten daraufhin, daß die Expression von p43CB-AT in vitro mindestens dreimal höher war als die von C-AT.
5A und 5B zeigen die anhaltende Sekretion therapeutischer Mengen des hAATs unter Verwendung von entweder dem C-AT-Vektor oder dem E-AT-Vektor in entweder SCID- oder C57BL-Mäusen. Die 5A zeigt den Mittelwert der Gesamtserummengen, der in Gruppen von entweder SCID- (Rechtecke) oder C57BL-Mäusen (Kreise) beobachtet wurde, die entweder einfache Injektionen einer niedrigen Dosis (5 × 10¹¹ Partikel) (offene Symbole) oder eine hohe Dosis (1,4 × 10¹³) (gefüllte Symbole) des C-AT-Vektors in den Muskel erhielten, gemessen an Zeitpunkten, die von 1 bis 16 Wochen nach der Injektion reichten. Für jeden Stamm unterscheidet sich die hoch-Dosiskurve deutlich von der niedrig-Dosiskurve (P = 0,009 für SCID, P = 0,02 für C57BL) aber die Stämme unterschieden sich nicht voneinander. Die 5B zeigt analoge Daten für den E-AT-Vektor. Keiner dieser Unterschiede war besonders bedeutsam.
5C zeigt die langfristige Sekretion von hAAT aus Mäusemuskeln, die mit C-AT transduziert sind. C57B1/6 oder C57B1/6-SCID-Mäuse erhielten 3,5 × 10¹⁰ IE, 1,4 × 10¹³ Partikel/Maus. Ein Jahr nach der Injektion betragen die Serum-hAAT-Mengen immer noch 400 μg/ml in C57B1/6-SCID und 200 μg/ml in C57B1/6. Diese Mengen sind vergleichbar mit den beobachteten Spitzen mengen 800 bzw. 400 μl).
6 zeigt ein Immunoblot mit Serum, das von mehreren der C-AT-Vektor behandelten Mäuse 11 Wochen nach der Vektorverabreichung entnommen wurde. Zehn Mikroliter einer 1 : 100 Verdünnung des Serums wurde mit 10% SDS/PAGE elektrophoriert, geblottet und mit einer 1 : 1.500 Verdünnung eines Ziegen anti-hAAT-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats (Cappel/ICN) inkubiert. Proben aus drei Hochdosis-SCID (h1–h3), einer Hochdosis C57BL (h3) und drei Niedrigdosis C57BL (lo1–lo3) wurden zusammen mit einem negativen Kontrollserum (Salzlösung injiziert – sal) aufgenommen, um die Menge der Reaktivität mit endogenem mAAT aufzuzeigen. Als Standard wurde hAAT entweder zur negativen Kontroll-C57BL-Serum (erste hAAT-Spur) oder zu PBS (zweite hAAT-Spur) bis zu einer endgültigen äquivalenten Serumkonzentration von 100 μg/ml hinzugefügt.
7A und 7B zeigen das einige BALB/c-Mäuse humorale Immunantworten gegen hAAT aufbauen, die mit niedrigeren Serummengen aber nicht mit einer beobachtbaren Toxizität korreliert. Die 7A zeigt die Serum-hAAT-Mengen und 7B zeigt die Serum-anti-hAAT-Antikörper-Mengen, die durch ELISA bestimmt wurde, der an Serum, welches Mäusen, die mit 1 × 10¹¹ Partikeln des C-AT-Vektors injiziert waren, entnommen wurde, durchgeführt wurde. Jede Symbolgruppe stellt ein einzelnes Tier dar (☐, Nr. 1; Δ, Nr. 2; o, Nr. 3). Bemerke die umgekehrte Korrelation zwischen der Gegenwart des Antikörpers und der Gegenwart zirkulierenden hAATs.
8 zeigt die Beständigkeit der rAAV-AAT-Vektor-DNA in hochmolekulargewichtiger Form. Die PCR-Produkte wurden aus DNA amplifiziert, die durch eine Hirt-Extraktion aus drei SCID-Mäusen, die 16 Wochen früher mit 5 × 10¹¹ resistenten Partikeln des C-ATs injiziert waren, und durch Southern-Blot analysiert. Der hochmolekulargewichtige Hirt-Niederschlag (genomische DNA-Spuren) und der niedermolekulargewichtige Überstand (episomale DNA-Spuren) wurden getrennt analysiert. Die Kontrollspuren enthielten eine Probe, in der ein hAAT cDNA-Plasmid die Vorlagen-DNA (+) war und eine Kontrolle, in der Wasser die Vorlage war (–). In dieser internen PCR-Reaktion wird ein 500 bp Produkt erwartet, unabhängig davon, ob das Vektorgenom integriert ist oder nicht.
9 zeigt Serum hAAT in C57B1/6-Mäusen, die mit C-AT und p43CB-AT transduziert sind. Die C57B1/6-Mäuse wurden in den Muskel mit C-AT (3,5 × 10¹⁰ IE/Maus, 1 × 10¹² Partikel/Maus) oder p43CB-AT (6 × 10⁹ IE, 1 × 10¹² Partikel/Maus) injiziert. Die Menge des hAAts von p43CB-AT wurde auf einer Schätzung der äquivalenten Dosierung (infektiöse Einheit) des C-ATs beruhend vorhergesagt.
10 zeigt die Verstärkung der CMV-Promotoraktivität durch einen synthetischen Enhancer in C2C12-Zellen. Die Mäusemyoblasten C2C12-Zellen wurden in 35 mm Vertiefungen von ungefähr 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung wachsen gelassen und wurden mit 5 μg p.43rmsENC-AT Vektor-DNA unter Verwendung von SUPERFECT-Transfektion (Qiagen Inc, CA) transfiziert. Die Sekretion von hAAT in das Medium wurde zwei Tage nach der Transfektion unter Verwendung eines Antigen-Fänger ELISAs bewertet. Jeder Balken stellt den Mittelwert der Ergebnisse aus einem Experiment (dreifach) dar.
11 zeigt die Sekretion von hAAT aus Mäuseleberzellen (HO15), die mit verschiedenen Konstrukten transfiziert waren. Die Mäuseleberzellen (HO15) wurden in 35 mm Vertiefung mit etwa 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung wachsen gelassen und wurden mit 5 μg der Plasmid-DNA unter Verwendung der LIPOFECTAMIN-Reagenzien (Life Technologies Inc, MD) transfiziert. Die Sekretion des hAATs in das Medium wurde zwei Tage nach der Transfektion unter Verwendung eines Antigen-Fänger-ELISAs bewertet. Jeder Balken stellt den Mittelwert der Ergebnisse zweier Experimente (dreifach) dar.
12 zeigt die Sekretion von hAAT aus Mäuseleberzellen (HO15), die unter Verwendung verschiedener Verfahren transfiziert wurden. Die Mäuseleberzellen (HO15) wurden in 35 mm Vertiefung mit ungefähr 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung wachsen gelassen und wurden mit 5 μg des p43CB-AT-Vektors unter Verwendung von Superfect-(Qiagen Inc., CA), FuGENE (Boehringer Mannheim Co, IN), Lipofectin-, LipofectAMINE-(Life Technologies Inc., MD) Reagenzien und der Kalzium-Phosphat-Transfektion (CAPO4) transfiziert. Die Sekretion des hAATs in das Medium wurde zwei Tage nach der Transfektion unter Verwendung eines Antigen-Fänger-ELISAs bewertet. Jeder Balken stellt den Mittelwert der Ergebnisse aus einem Experiment (dreifach) dar.
13 zeigt die hAAT-Sekretion aus Mäuseleber, die mit rAAV transfiziert ist. C57B1/6-Mäuse wurden entweder mit p43CB-AT, C-AT oder E-AT-Vektor entweder über die Pfortader oder durch Schwanzveneninjektion injiziert. PA = Pfortaderinjektion. SV = Schwanzveneninjektion.
14 zeigt die Serum hAAT-Mengen in C57B1/6-Mäusen nach intratrachialer (IT) Injektion von C-AT oder p43CB-AT-Vektoren. Die Mäuse erhielten entweder 10⁹ IE des C-AT (offene Kreise), 10⁹ IE des p43CB-AT (offene Dreiecke) oder 10¹⁰ IE des p43CB-AT (offene Quadrate).
15 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als C-AT bezeichnet wird.
16 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als E-AT bezeichnet wird.
17 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als dE-AT bezeichnet wird.
18 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als p43C-AT bezeichnet wird.
19 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als p43C-AT-IN bezeichnet wird. Dieser Vektor umfaßt das Intron II aus dem human AAT-Gen, um die Transkription zu verstärken.
20 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als p43CB-AT bezeichnet wird.
21 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als C-AT2 bezeichnet wird.
22 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als p43msENC-AT bezeichnet wird. Dieser Vektor ist zu p43C-AT ähnlich umfaßt aber auch Enhancer-Sequenzen stromaufwärts vom CMV-Promotor.
23 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als p43rmsENC-AT bezeichnet wird. Dieser Vektor ist der gleiche, wie der p43msENC-AT-Vektor mit dem Unterschied, daß sich die Enhancer-Sequenz in einer entgegengesetzten Orientierung befindet.
24 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als p43msENCB-AT bezeichnet wird. Dieser Vektor ist zu p43CB-AT ähnlich aber umfaßt auch eine Enhancer-Sequenz stromaufwärts des CMV-Promotors.
25 zeigt eine Karte und eine Nukleotidsequenz für den Vektor der vorliegenden Erfindung, der als p43rmsENCB-AT bezeichnet wird. Dieser Vektor ist der gleiche, wie p43msENCB-AT mit dem Unterschied, daß die Enhancer-Sequenz sich in einer umgekehrten Orientierung findet.
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Materialien und Verwendungen davon, um einem Säugetier oder einem Menschen, der einen Zustand oder eine Erkrankung wie eine genetische Mangelerkrankungen aufweist, bei dem (der) hohe Expressionsmengen eines Proteins erforderlich sind, um die Erkrankung oder den Zustand zu behandeln, eine Gentherapie zur Verfügung zu stellen. In einem offenbarten Verfahren wird ein viraler Vektor in Zellen eines Tieres eingeführt, wobei ein therapeutisches Protein hergestellt wird, wodurch dem Tier eine genetische Therapie zur Verfügung gestellt wird. In einer Ausführungsform umfaßt ein offenbartes Verfahren, das Einführen einer wirksamen Menge viraler Partikel oder eines Vektors, der ein rekombinantes Genom umfaßt, welches heterologe Polynukleotide, die für ein bei der Gentherapie nützliches Protein kodieren und das durch die Zelle oder das Gewebe exprimiert werden kann, in eine Tierzelle oder Gewebe. Die Expression des heterologen Polynukleotids führt zur Erzeugung des Proteins. Vorzugsweise ist das therapcutische Protein, das durch das heterologe Polynukleotid kodiert wird, ein Serumprotein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Vektormaterial, das das heterologe Polynukleotid umfaßt, in ein Chromosom der Zelle oder des Wirtstiers integriert.
In einer Ausführungsform ist ein rekombinanter Polynukleotid-Vektor der vorliegenden Erfindung vom Adeno-assoziierten Virus (AAV) abgeleitet und umfaßt einen konstitutiven oder regulierbaren Promotor, der dazu in der Lage ist, ausreichende Mengen der Expression der heterologen DNA in dem viralen Vektor zu steuern. Vorzugsweise umfaßt ein rekombinanter Vektor der Erfindung umgekehrte terminale Wiederholungssequenzen des AAVs wie die, die in WO 93/24641 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Vektor der vorliegenden Erfindung Polynukleotidsequenzen des pTR-UF5-Plasmids. Das pTR-UF5- Plasmid ist eine modifizierte Version der pTR_BS-UF/UF1/UF2/UFB-Plasmidserien (Zolotukhin et al., 1996). Das pTR-UF5-Plasmid enthält Modifikationen der Sequenz, die für das Grünfluoreszierendeprotein (GFP) kodieren.
Promotoren, die im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen beispielsweise den Zytomegalovirus "immediate early" Promotor (CMV), den human Elongationsfaktor 1-alpha-Promotor (EF1), die kleinen nukleären RNA-Promotoren (U1a und U1b), den α-Myosin schwere Ketten-Promotor, den Simian virus 40-Promotor (SV40), den Rous sarcoma virus-Promotor (RSV), den Adenovirus "major late" Promotor, den β-Aktin-Promotor und hybride Regulatinselemente, die einen CMV-Enhancer/β-Aktin-Promotor umfassen. Für diese Promotoren ist es gezeigt worden, daß sie in einer großen Auswahl von Säugetierzellen eine Aktivität aufweisen. Zusätzlich zu den oben beschriebenen natürlichen Promotoren können synthetische Promotoren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise ein synthetischer Enhancer, der beliebig aus Spc5-12-abgeleiteten Elementen, der Muskel-spezifische Elemente, Serum response factor Bindungselemente (SRE), Myozyten-spezifischen Enhancer-Faktor-1 (MEF-1), Myozyten-spezifischen Enhancer-Faktor-2 (MEF-2), Transkriptions-Enhancer Faktor-1 (TEF-1) und SP-1 umfaßt (Li et al., 1999; Deshpande et al., 1997; Stewart et al., 1996; Mitchell et al., 1989; Briggs et al., 1986; Pitluk et al., 1991) können in den Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Promotoren sind wirksam mit heterologer DNA verknüpft, die für das interessierende Protein kodiert. Mit "wirksam verknüpft" ist beabsichtigt, daß das Promotorelement relativ zu der kodierenden Sequenz positioniert ist, um in der Lage zu sein die Expression der kodierer, den Sequenz zu bewirken.
Promotoren, die besonders für die Expression von Proteinen in Muskelzellen nützlich sind, umfassen beispielsweise hybride CMV/β-Aktin-Promotoren, CMV-Promotoren, synthetische Promotoren und EF1-Promotor. Die für die Expression eines Proteins in Leberzellen besonders nützlichen Promotoren umfassen beispielsweise hybride CMV/β-Aktin-Promotoren und EF1-Promotoren.
Für die Verwendung mit den Vektoren der vorliegenden Erfindung werden auch induzierbare und zelltypspezifische Promotoren erwogen. Beispielsweise können Tet-induzierbare Pro motoren (Clontech, Palo Alto, CA) und VP16-LexA-Promotoren (Nettelbeck et al., 1998) in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Vektoren können auch Introns umfassen, die in die Polynukleotidsequenz des Vektors als Mittel für die Erhöhung der Expression der heterologen DNA, die für ein interessierendes Protein kodiert, eingeführt sind. Beispielsweise kann ein Intron zwischen einer Promotorsequenz und der Region, die auf den Vektor für das interessierende Protein kodiert, eingeführt werden. Introns können auch in die kodierende Region eingeführt werden. Transkriptionelle Enhancer-Elemente, die dadurch wirken können, daß sie die Mengen der Transkription von einem gegebenen Promotor erhöhen, können auch von Vektoren der Erfindung umfaßt sein. Enhancer können im Allgemeinen im Hinblick auf die Promotorsequenzen entweder in 3' oder 5' Orientierung gesetzt werden.
Heterologe Polynukleotide in den rekombinanten Vektor können beispielsweise Polynukleotide umfassen, die für normale funktionelle Proteine kodieren, die den therapeutischen Ersatz normaler biologischer Funktionen in Tieren zur Verfügung stellen, die von genetischen Erkrankungen betroffen sind, welche das Tier dazu bringen ein defektes Protein oder unnatürliche oder verringerte Mengen des Proteins herzustellen. Die Proteine und die Polynukleotidsequenzen, die sie kodieren, die durch Gentherapie unter Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Antiproteasen, Enzyme, strukturelle Proteine, koagulierende Faktoren, Interleukine, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Interferone und Lymphokine. In einer beispielhaften Ausführungsform kodiert die heterologe DNA in einem rekombinanten AAV-Vektor das humane alpha-1-Antitrypsin-Protein.
Die Gentherapieverfahren der vorliegenden Erfindung können durch ex vivo oder in vivo Behandlung der Patientenzellen oder des Gewebes durchgeführt werden. Die Zellen und Gewebe, die im Umfang der Erfindung erwogen werden, umfassen beispielsweise Muskel, Leber, Haut und andere Zellen und Gewebe, die dazu in der Lage sind Serumproteine zu produzieren und zu sekretieren. Die Vektoren der Erfindung können in geeignete Zellen, Zellinien oder Gewebe unter Verwendung vom im Stand der Technik bekannten Verfahren eingeführt werden. Die viralen Partikel und Vektoren können in vitro oder in vivo in die Zellen oder Gewebe eingeführt werden. Dafür erwogene Verfahren umfassen Transfektion, Transduktion, Injektion und Inhalation. Beispielsweise können Vektoren in Zellen unter Verwendung von Liposo men, die die betreffenden Vektoren enthalten, durch direkte Transfektion mit dem Vektor allein, durch Elektroporation oder durch Partikelbombardierung eingeführt werden. In einer beispielhaften Ausführungsform werden Muskelzellen in vivo durch Injektion viraler Partikel, die den rekombinanten Vektor umfassen, in das Muskelgewebe eines Tiers injiziert. In einer anderen Ausführungsform werden Leberzellen in vivo durch Injektion des rekombinanten Virus in entweder die Pfortader oder in periphere Venen injiziert.
Die Materialien der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine genetische Therapie für jeden Zustand oder Erkrankung zur Verfügung zu stellen, der (die) durch Protein oder Zytokininfusion, wie beispielsweise der α-1-Antitrypsin-Mangel, die Hämophilie, der Adenosindeaminasemangel und die Diabetes behandelbar ist, zur Verfügung zu stellen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um eine genetische Therapie für die Behandlung von Zuständen, wie beispielsweise Krebs, Autoimmunerkrankungen, neurologische Erkrankungen, Immunschwächeerkrankungen und bakterielle und virale Infektionen zur Verfügung zu stellen. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um eine genetische Therapie einem Patienten zur Verfügung zu stellen, bei dem die Zellen des Patienten transformiert werden, um Interleukine, wie Interleukin-2 zu exprimieren und herzustellen.
Tiere, die mit den Materialien der Erfindung behandelt werden können, umfassen Säugetiere wie Rind-, Schwein-, Pferd-, Schaf-, Katze- und Hund-Säugetiere. Vorzugsweise sind die Säugetiere Primaten wie Schimpansen und Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen, die rekombinante Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Zellen können beispielsweise Tierzellen, wie Säugetierzellen sein. Vorzugsweise sind die Zellen menschliche Zellen. Am meisten bevorzugt sind die Zellen menschliche Muskelfasern oder Myoblasten, Hepatozyten oder Lungenzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein rekombinanter Vektor der vorliegenden Erfindung stabil in das Wirtszellgenom integriert. Die Zellinien, die den rekombinanten Vektor enthalten, sind auch im Umfang dieser Erfindung enthalten.
In einer beispielhaften Ausführungsform wurden rekombinante AAV-Vektoren, die das humane AAT-Gen (hAAT) umfassen, entweder unter Verwendung des CMV-Promotors (AAV-C-AT) oder des humanen Elongationsfaktor 1-alpha-Promotors (EF1) (AAV-E-AT), um die Expression zu steuern, konstruiert und unter Verwendung von Standardverfahren verpackt. Eine Mäusemyoblastenzellinie C2C12 wurde mit jedem Vektor transduziert und die Expression von hAAT in das Medium wurde mit einem ELISA gemessen. In vitro führte das EF1-Promotorkonstrukt zu einer 10-fach höheren hAAT-Expression als das CMV-Promotorkonstrukt. Die in vivo Transduktion wurde durch die Injektion von Dosen mit bis zu 1,4 × 10¹³ DNase-resistenten Partikeln jedes Vektors in Skelettmuskeln einer Vielzahl verschiedene Mäusestämme (umfassend C57B1/6, Balb/c und SCID) durchgeführt. In vivo führten die CMV-Promotorkonstrukte zu höheren Expressionsmengen mit anhaltenden Serummengen von bis zu 800 μg/ml in SCID-Mäusen, ungefähr 10 000-fach höher als die, die vorher von AAV-Vektoren in Muskel sekretierten Proteinen beobachtet worden ist. Bei niedrigeren Dosen war sowohl in C57B1/6 und in SCID-Mäusen die Expression für mehrere Wochen verzögert, aber verblieb für über 10 Wochen ohne ein Absinken. Somit stellte eine Erhöhung der Dosierung des AAV-Vektors bei Transduktion des Skelettmuskels ein Mittel für den Ersatz von AAT oder anderer Serumproteine zur Verfügung.
Die Transduktion von Muskel unter Verwendung der Vektoren der vorliegenden Erfindung bietet mehrere Vorteile dadurch, daß sie stabil, nicht toxisch und relativ wenig immunogen ist. Des weiteren ist es für bestimmte Transkriptionspromotoren wie den CMV-Promotor, der in anderen Zusammenhängen deutlich runterreguliert zu sein scheint, gefunden worden, daß sie, wenn wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, über den Zeitablauf aktiv blieben. Unter Verwendung der Materialien und Verfahren der vorliegenden Erfindung können Mikrogramm/ml Serrummengen eines therapeutischen Proteins erreicht werden. In einer beispielhaften Ausführungsform stellen die Mengen der erreichten in vivo Proteinexpressionen eine 10.000-fach oder größere Erhöhung im Vergleich zu vorher publizierten Ergebnissen dar. Zusätzlich war eine Dosis-Wirkungszusammenhang über einen Bereich verwendeter Dosen nachweisbar, was eine weitere Erhöhung der Expressionsmengen zur Verfügung stellt, wenn die Vektordosis erhöht wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurden rekombinante AAV-Vektoren, d. h. C-AT, p43C-AT, p43CB-AT, E-AT und dE-AT die das humane AAT-Gen (hAAT) umfaßen, konstruiert und unter Verwendung von Standardtechniken verpackt. Eine Mäuseleberzellinie HO15 wurde mit jedem Vektor transfiziert und die Expression von hAAT in das Medium wurde durch ELISA gemessen. Die in vitro Transduktion mit p43CB-AT-Vektor zeigte die größten Mengen der hAAT-Expression. In vivo ergab der p43CB-AT-Vektor auch höhere Mengen der Expression. Die Pfortaderverabreichung schien die wirksamere Verabreichungsroute zu sein, da Mäuse, die in dieser Weise injiziert wurden, höhere Expressionsmengen zeigten, als die, die periphere Veneninjektion erhielten. Die Transduktion der Leber stellt dieselben Vorteile wie Muskel zur Verfügung, aber Hepatozyten können bei der Sekretion von Proteinen effizienter sein.
Die Dosierung des rekombinanten Vektors oder des Virus, der an ein Tier verabreicht wird, das einer solchen Handlung bedarf, kann durch den Durchschnittskliniker beruhend auf verschiedene Parametern wie dem Weg der Verabreichung, dem Stadium der betroffenen Krankheit oder des Zustandes und ähnlichem, bestimmt werden. Typischerweise wird der rekombinante Virus der Erfindung in Dosen zwischen 10⁵ und 10¹⁴ infektiösen Einheiten verabreicht. Die rekombinanten Vektoren und Viren der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Verfahren und Materialien der Formulierung, die im Stand der Technik bekannt sind, zubereitet werden. Eine Vielzahl von Formulierungen können in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Ausgabe (1975) gefunden werden.
Materialien und Methoden
Herstellung der rAAV-Plasmide. Die rAAV-AAT-Vektorplasmide, die für diese Experimente verwendet worden sind, sind diagrammartig wiedergegeben (1). In Kürze: das Plasmid pN2FAT (Garver et al., 1987) wurde mit XhoI verdaut, um ein 1,8-kb-Fragment freizusetzen, das die humane AAT cDNA zusammen mit dem SV40-Promotor und einem Polyadenylierungssignal enthält. Dieses Fragment wurde in einem Plasmid, pBlucScript (Stratagene) subkloniert und nach der Entfernung des SV40-Promotors durch Hind III-Verdau und Rückligation wurde die hAAT cDNA mit ihrem polyA-Signal durch XbaI- und XhoI-Verdau freigesetzt. Dieses 1,4-kb XbaI-XhoI-Fragment wurde dann in das pTR-UF5-Plasmid (ein Vektor, der ein AAV-umgekehrte terminale Wiederholung enthält) (Zolotukhin et al., 1996) zwischen die XbaI-Stelle 3' zum Promotor und der XhoI-Stelle 5' zu der Polyomavirus Enhancer/HSV-Thymidin-Kinase Promotorkassette, die das neo-Konstrukt steuert, kloniert. Dies führte zu den pAAV-CMV-AAT-Konstrukt (C-AT). Analoge Konstrukte unter Verwendung des Promotors für kleine nukleäre RNA-Proteine, U1a und U1b (um die A-AT bzw. B-AT-Konstrukte zu ergeben) und des humanen Elongationsfaktor 1-alpha-Promotors (EF1) (um das E-AT-Konstrukt zu ergeben) wurden dadurch konstruiert, daß jede dieser Promotorkassetten an Stelle des CMV-Promotors zwischen den KpnI- und den XbaI-Stellen ersetzt wurde.
Das Konstrukt dE-AT, ist von E-AT durch Deletion des Silencers (352 bp) durch SacII-Schnitt (Wakabayashi-Ito et al., 1994) abgeleitet. C-AT2 ist zu C-AT ähnlich mit dem Unterschied, daß SV40-Introns und poly(A)-Sequenzen die cDNA des hAATs flankieren. Das p43C-AT wurde durch Einfügen der hAAT cDNA in ein AAV-Vektor-Plasmid (p43), das den CMV-Promotor, Intron- und poly(A)-Sequenzen aufweist, hergestellt. Das p43CB-AT wird durch das Ersetzen des CMV-Promotors durch den CMV-Enhancer und die Huhn-β-Aktin-Promotorsequenzen abgeleitet. Der p43C-AT-IN ist vom p43C-AT durch das Einfügen der Intron II-Sequenzen des hAAT-Gens in die hAAT cDNA abgeleitet (Brantly et al., 1995).
Verpackung der rAAV-Vektoren. Die Vektoren wurden unter Verwendung einer Modifikation des von Ferrari et al. (1997) beschriebenen Verfahrens verpackt. In Kürze: wurden Plasmide, die die AAV rep und cap-Gene enthielten (Li et al., 1997) und die die Ad-Gene (E2a, E4 und VA-RNA) enthielten, wurden zusammen mit geeigneten AAV-AAT-Vektorplasmiden in 293-Zellen, die in Cell Factories (Nunc) wachsen gelassen wurden, transfiziert. Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und durch Gefrier-Tau-Lyse zerstört, um die Vektorvirionen freizusetzen, die dann durch Iodixanol gradienten Ultrazentrifugation gereinigt wurden gefolgt von einer Heparinsepharose-Affinitäts-Säulenreinigung. Alternativ kann der rekombinante Virus gemäß der Verfahren, die in Zolotukhin et al. (1999) beschrieben sind, zubereitet werden.
Die physikalischen Titer der Vektorzubereitungen wurden durch quantitative kompetitive PCR bewertete und ihre bialogischen Titer durch das Infektionszentrumtestverfahren. Die Gegenwart von Wildtyp-AAV wurde auch unter Verwendung derselben Testverfahren mit geeigneten internen AAV-Proben bestimmt. Die C-AT-Stammlösung hoher Dosierung hatte einen Partikel-Titer von 2,0 × 10¹⁴ Partikel/ml und einen Infektionstiter von 5,0 × 10¹¹ infektiösen Einheiten (i. e.)/ml (Partikel zu i. e. Verhältnis = 400 : 1). Das C-AT niedriger Dosierung zeigte 8 × 10¹² Partikel/ml und 1,2 × 10¹⁰ i. e./ml (Partikel zu i. e. = 667 : 1). Für die E-AT Experimente waren die Titer 1 × 10¹³ Partikel/ml und 2,5 × 10¹⁰ i. e./ml (Partikel zu i. e. = 400 : 1). Die C-AT-Stocklösung niedriger Dosierung hatte ein wt-ähnlichen AAV-Partikeltiter (d. h. positive AAV-Genom-PCR) entsprechen dem 0,1-fachen des rekombinanten Titers aber keinen nachweisbaren infektiösen wtAAV. Die anderen zwei Zubereitungen wiesen einen wtähnlichen AAV-Partikeltiter < 10^–5-fach des rekombinanten Titers und keinen nachweisbaren infektiösen wtAAV auf.
In vitro Transfektions- und Transduktionsexperimente. Die Mäuse C2C12-Myoblastenlinie wurde für die in vitro Transfektions- und Transduktionsexperimente verwendet. Die Zellen wurden in 35 mm Vertiefungen mit ungefähr 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung wachsen gelassen und mit 5 μg jeder Plasmid-DNA unter Verwendung von Superfect (Qiagen Corp.) transfiziert. Die Sekretion von hAAT in das Medium wurde 2 Tage nach der Transfektion unter Verwendung eines Antigen-Fänger-ELISA-Testverfahrens mit Standards bewertet (Brantly et al., 1991). Ein SV40-Promotor-Luziferase-Expressionsplasmid pGL2 (Promega) wurde als interne Kontrolle verwendet. Für die Transduktionsexperimente wurden Zellen unter ähnlichen Bedingungen wachsen gelassen und mit Vektor mit einer Überinfektionsrate die von 4 × 10⁵ bis 4 × 10⁶ Partikeln pro Zelle reichte, transduziert. Die Zellen wurden in Gegenwart von Genitizinsulfat (350 μg/ml) passagiert und Genitizin-resistente Klone wurden für die hAAT-Sekretionsstudien isoliert.
In vivo Injektionen von AAV-C-AT und AAV-E-AT-Vektoren in Mäusemuskel. Die Mäusestämme (C57B1/6, SCID, und Balb/c) wurden vom Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) erhalten und unter speziellen Pathogen-freien Bedingungen gemäß einem durch das University of Florida Institutional Animal Care and Use Commitee bestätigtem Protokoll behandelt. Die Tiere wurden durch Metaphan-Inhalation anästhesiert und Teilmengen des Vektors wurden perkutan in den Quatrizeps femoris-Muskel beider hinterer Gliedmaßen injiziert. Das Volumen des Vektors reicht von 50 bis 100 μl pro Injektionsstelle und die Gesamtmenge des pro Tier injezierten Vektors reichte von 5 × 10¹⁰ bis 1,4 × 10¹³ DNase-resistente Partikel.
Antigen-Fänger-ELISA-Testverfahren für die hAAT Expression. Mikrotiterplatten (Immulon 4, Dynex Technologies, Chantilly, VA) wurden mit 100 μl einer 1 : 200 Verdünnung von Ziegen anti-Mensch AAT (CAPPEL/ICN) in Vollers-Puffer (Na₂CO₃ = 2,76 g, NaHCO₃ = 1,916 g, NaN₃ = 0,2 g, d·H₂O = 1 Liter, anpassen des pH = 9,6) über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dem Waschen wurden Standards und unbekannte Proben, die hAAT enthielten, in den Platten bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Blockieren mit 3% BSA in PBS-Tween 20 bei 37°C für 1 Stunde wurde ein zweiten Antikörper (1 : 1 000 Verdünnung des Kaninchen anti-Mensch-AAT, Boehringer Mannheim) mit dem Fängerantigen bei 37°C für 1 Stunde reagiert. Die Detektion wurde unter Verwendung einer dritten Antikörperinkubation (1 : 800 Verdünnung eines Ziegen anti-Kaninchen IgG-Peroxidase-Konjugats, 37°C) durchgeführt, gefolgt von dem Nachweis von o-Phenylendiamin (OPD, Sigma) und dem Messen der Absorption bei 490 nm.
ELISA-Testverfahren für anti-hAAT und anti-AAV VP3-Antikörper. Die Vertiefungen wurden mit Antigen (1 μg des hAAT oder 100 ng des VP3) bei 4°C über Nacht beschichtet, mit 3% BSA blockiert und dann mit Verdünnungen von entweder Testserum oder mit positiven Kontrollantikörpern bei 37°C für 1 Stunde reagiert. Nach dem Waschen wurde ein Ziegen anti-Maus IgG-Peroxidasekonjugat als Zweitantikörper (1 : 1500-Verdünnung) verwendet, um gebundenen anti-AAT-Antikörper unter Verwendung einer Standard OPD-Reaktion, wie oben beschrieben nachzuweisen. Die Antikörpermengen wurden durch Vergleich mit einer Standardkurve, die durch die Reaktion von Verdünnung eines bekannten positiven monoklonalen Antikörpers gegen VP3 und hAAT erzeugt wurde, verglichen.
Lymphozytenproliferationstestverfahren um eine Zell-vermittelte Immunantworten nachzuweisen. Lymphozytenproliferationstestverfahren wurden durchgeführt, um die T-Zell-Antworten auf die hAAT- und VP3-Antikörpergene nachzuweisen. Frisch isolierte Splenozyten wurden in Primärkultur in 96 Vertiefungsplatten wachsen gelassen, die mit 0, 0,1, 1 und 10 μg von entweder hAAT oder VP3 in RPMI-C+medium beschichtet waren. Am dritten Tag wurde ein ³H-Thymidinpuls hinzugefügt und die Zellen wurden am vierten Tag für die Lyse und die Scintillationszählung geerntet. Phytohemagglutinin (PHA) wurde als Mitogen für die positiven Kontrollvertiefungen verwendet. Ein Stimulationsindex wurde für jede Antigendosierungsmenge durch das Teilen der Zählung pro Minute (cpm) des ³H-Thymidins, das in die Antigen-stimulierten Zeilen eingebaut wurde, durch die cpm in einer Kontrollvertiefung (unstimuliert) berechnet.
Es folgen Beispiele, die die Verfahren für die Durchführung der Erfindung illustrieren. Diese Beispiele sollten nicht als beschränkend interpretiert werden. Alle Prozentzahlen sind, wenn nicht anders bemerkt nach Gewicht und alle Lösungsgemischanteile nach Volumen.
Beispiel 1 – In vitro Studie in Mäuse C2C12-Myoblasten
Um die relative Stärke einer Anzahl konstitutiv aktiver Promotoren im Zusammenhang der AAV-AAT-Vektoren zu bestimmen, wurden verpackbare AAV-AAT-Expressionsvektoren, die einen der CMV, EF1, U1a oder U1b-Promotoren enthielten (1), konstruiert. Jedes der Konstrukte wurde in die Mäuse C2C12-Myoblastenzellinie transfiziert. Sowohl der EF1- und der CMV-Promotor waren hinsichtlich der AAT-Expression aktiv, wobei das EF1-Konstrukt (AAV-E-AT) 850 ng/10⁵ Zellen/Tag exprimierte und das CMV-Konstrukt (AAV-C-AT) ungefähr 670 ng/10⁵ Zellen/Tag exprimierte, wie durch humanspezifische ELISA-Testverfahren für AAT (2) gemessen wurde. Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant. Die Mengen der Expression von den U1a- und U1b-Konstrukten waren nicht nachweisbar.
Um die Menge und das Andauern der Expression im Zusammenhang der Vektor-Transduktion zu charakterisieren, wurden Kulturen der C2C12-Zellen mit entweder AAV-E-AT oder mit AAV-C-AT mit einer Überinfektionsrate, die von 4 × 10⁵ bis 4 × 10⁶ DNaseresistenten Partikeln pro Zelle reichte, infiziert. Die Zellen wurden auf die Expression des neo-Gens (das in jedem der AAV-Konstrukte vorhanden war) durch Wachstum in G418-enthaltenen Medium selektiert. Mehrere Zellklone und zusammengeführte Zellpopulationen wurden unabhängig voneinander 4 Wochen nach der Transduktion auf ihre AAT-Expression hin untersucht (3). Es gab eine klare Tendenz in Richtung auf höhere Expression bei einer höheren Rate der Überinfektion und das E-AT-Konstrukt exprimierte in diesen langfristigen Kulturen unter allen Bedingungen mindestens 10-fach größere Mengen. Der am meisten aktive E-AT-Klon exprimierte hAAT in einer Menge von über 1400 ng/10⁵ Zellen/Tag.
Beispeil 2 – in vivo Expression von hAAT in Mäuseskelettmuskel
Um zu bestimmen, ob die AAV-AAT-Konstrukte in vivo in Skelettmuskel aktiv sein würden, wurden Dosen des Vektors in den Quatrizeps femoris-Muskel der Mäuse injiziert. Die zirkulierenden Serummengen des hAATs wurden dann für 11 bis 15 Wochen nach der anfänglichen Injektion gemessen. Vier Salzlösungen-injizierte Tiere jedes Mäusestamms dienten als Kontrollen. Im Falle des C-AT-Vektors (5A) waren die Expressionsmengen ausreichend, um Serummengen über 800 μg/ml in SCID-Mäusen nach einer einzigen Injektion von 1,4 × 10¹³ Partikeln zu erreichen. Eine Dosis-Wirkungsbeziehungskurve wurde beobachtet, wobei die Expressionsmengen in SCID mindestens 20-fach niedriger bei der 5 × 10¹¹ Partikeldosierung waren. Die Mengen der Expression stiegen über die ersten Wochen nach der Injektion an und waren danach bis zum Zeitpunkt des Opferns stabil. Da hAAT eine Halbwertzeit von weniger als eine Woche aufweist, deutete dies auf eine fortwährende Expression hin. Die Mengen in C57B1/6-Mäusen waren vergleichbar und erreichten auch Werte, die dem therapeutischen Bereich nahe waren. In ähnlichen Studien exprimierten zwei von drei Balb/c-Mäusen die mit 1 × 10¹¹ Partikeln des C-AT-Vektors injiziert waren keine nachweisbaren Mengen des hAATs. Für beide wurde gefunden, daß sie hohe Mengen von anti-hAAT-Antikörpern entwickelt hatten. Überraschenderweise waren die Expressionsmengen vom AAV-E-AT-Vektor in vivo nach der Injektion leicht niedriger als die, die für den C-AT-Vektor beobachtet wurden (5B) wobei die maximalen Mengen bei ungefähr 250 ng/ml bei einer Dosierung von 5 × 10¹¹ nach 7 Wochen und darüber hinaus in SCID-Mäusen betrug. Wenn diese Dosis weiter auf 1 × 10¹² Partikel erhöht wurde, wurden Mengen von etwa 1 200 ng/ml beobachtet. Diese Mengen waren für 1 Jahr nach der Injektion stabil (5C). Die in SCID und immunkompetenten C57B1/6-Mäusen beobachteten Mengen waren ähnlich.
Beispiel 3 – Immunologische Studien
In Studien in Balb/c-Mäusen waren die Antikörpermengen gegen hAAT in zwei von drei injizierten Tieren hoch. Das eine, das keine zirkulierenden anti-hAATs aufwies, war das einzige Tier mit hAAT-Expressionsmengen, die den in den C57B1/6- und SCID-Gruppen ähnlich waren. Die Hochdosis C57-C-AT Injektionsgruppe hatte nachweisbare Mengen des gegen VP3 gerichteten Antikörpers aber nicht gegen hAAT.
Um zu bestimmen, ob irgendeine Zell-vermittelte Immunantwort aufgebaut wurde, wurden Lymphozytenproliferationstestverfahren entweder unter Verwendung von hAAT oder AAV-VP3 zur Antikörperstimulation von primären Milzlymphozyten, die zum Zeitpunkt der Opferung des Tieres 16 Wochen nach der Vektorinjektion gesammelt wurden, durchgeführt. Unter Verwendung dieses Verfahrens waren keine Immunantworten in irgendeiner der Mäuse nachweisbar.
Beispiel 4 – Fehlen der Toxizität auf Grund der direkten Vektorinjektion
Um zu bestimmen, ob irgendeine direkte Toxizität, Inflammation oder eine neoplastische Veränderung mit der Vektorinjektion assoziiert war, wurden die Tiere einer vollständigen Leichenschau unterzogen. Die histopathalogische Untersuchung wurde an 5 μm Schnitten durchgeführt, die von der Stelle der Vektorinjektion und einer Reihe anderer Organe, umfassend das Gehirn, Herz, Lungen, Luftröhre, Pankreas, Milz, Leber, Niere und Jejunum entnommen wurden. Es wurden keine histologischen Abnormalitäten an irgendeiner dieser Stel len selbst bei den Mäusen, die humane Immunantworten gegen hAAT entwickelten, beobachtet.
Beispiel 5 – Molekulare Hinweise auf die Beständigkeit des AAV-AAT-Vektors
Um die Gegenwart der Vektor-DNA zu bestätigen, wurde eine vektorspezifische PCR (neo Primer 5'-TATGGGATCGGCCATTGAAC-3', und 5'-CCTGATGCTCTTC-GTCCAGA-3') an DNA durchgeführt, die aus 3 SCID-Mäusen 16 Wochen nach der Injektion mit C-AT-Vektor extrahiert wurde und die PCR-Produkte wurden durch Southern-Blot Analyse mit einer ³²P-markierten vektorspezifischen Sonde (8) analysiert. Das Stadium der Vektor-DNA wurde unter Verwendung des Hirt-Verfahrens (Carter et al., 1983) analysiert, um die niedermolekulargewichtige episomale DNA von der hochmolekulargewichtigen Fraktion abzutrennen, die die integrierten Formen und große Concatemere enthalten würde. Im jeden Fall war Vektor-DNA in der hochmolekulargewichtigen DNA-Fraktion vorhanden, wobei nur in einem der Tiere ein Signal in der Episomalen-Fraktion vorhanden war. Das Ergebnis zeigt auf, das nach 16 Wochen der Großteil der Vektor-DNA in unseren Tieren entweder integriert oder in großen Concatemeren vorlag.
Beispiel 6 – In vivo Expression von hAAT in Mäuseleber
Die Pfortader- oder Schwanzveneninjektionen wurden an 18 weiblichen 8–10 Wochen alten C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Das Injektionsvolumen betrug 100 μl pro Maus.
Jede Gruppe wies die folgenden Parameter auf:

1. Gruppe 1: 100 μl PBS n = 4.
2. Gruppe 2: 100 μl p43CB-AT (3 × 10¹⁰ IE/Tier) n = 3.
3. Gruppe 3: 100 μl p43CB-AT (4 × 10⁹ IE/Tier) n = 4.
4. Gruppe 4: 100 μl C-AT (4 × 10⁹ IE/Tier) n = 2.
5. Gruppe 5: 100 μl E-AT (4 × 10⁹ IE/Tier) n = 4.
6. Gruppe 6: EATM TV = 100 μl über Schwanzveneninjektion von E-AT (4 × 10⁹ IE/Tier) n = 3.
7. Gruppe 0: 100 μl PBS über Schwanzveneninjektion n = 2.

Eine Gesamtzahl von 22 Tieren wurden in dieser Studie verwendet.
Alle Tiere wurden mit 2-2-2-Tribromethanol (Avertin) unter Verwendung einer Arbeitslösung von 20 mg/ml mit einer Dosierung von 0,5 mg/g IP anästhesiert. Einen 2 cm Einschnitt entlang der ventralen abdominalen Mittellinie wurde von der pubischen Symphyse kranial bis zum xyphoiden Fortsatz durch die Haut- und Muskelschichten gemacht. Die Pfortader wurde durch das Zurückziehen der Gedärme und des angehefteten Mesenteriums zur linken Seite des Tiers offengelegt. Zusätzlich wurde der quadratische und der rechte mediale Lappen der Leber kranial zurückgezogen. Die Innereien und der Peritonealraum wurden beständig mit 0,9% NaCl gespült.
Virus oder PBS wurde in die Pfortader unter Verwendung einer 30 g Nadel, die an einer 100 μl Kapilar-Pipette befestigt war unter Verwendung einer Mundverabreichung über einen Gummischlauch und einen selbstverschließenden doppellagigen 0,8 μm Drummond-Filter verabreicht. Ein kleines Stück Gel-Schaum (0,5 × 0,5 cm) wurde auf die Injektionsstelle aufgetragen, bevor die Nadel aus der Pfortader entfernt wurde. Die Nadel wurde unter dem Gel-Schaum hervorgezogen und das Stück wurde mit einer Pinzette am Platz gehalten während die Innereien wieder in den Peritonalraum gebracht wurden.
Der Muskel und die Haut wurde in einer Schicht unter Verwendung von zwei einfachen unterbrochenen 3-0 Nylonwundnähten mit einer FS-1 Schneidenadel geschlossen. Die Operationen wurden auf einem temperaturgeregelten Operationstisch durchgeführt, der entworfen war, um eine Temperatur von 37 Grad zu halten. Für die Erholung von der Anästhesie wurden die Tiere unter eine Wärmelampe gesetzt, die eingestellt war, um eine Umgebungstemperatur von etwa 37 Grad zu bewahren und subkutane Flüssigkeit wurde gegeben wenn ein deutlicher Blutverlust während des chirurgischen Eingriffs aufgetreten war.
Die Serummengen des hAATs in den Mäusen wurden 2 Wochen nach der Injektion gemessen. Serummengen von etwa 200–150 μg/ml hAAT wurden in Mäusen gemessen, die p43CB-AT-Vektor erhielten (13). Studien, die den E-AT-Vektor verwendeten, zeigten, daß die Injektion des Vektors über die Pfortader zu größeren Mengen der hAAT-Sekretion im Vergleich zu E-AT, das über Schwanzveneninjektion verabreicht wurde, führte.
Beispiel 7 – In vivo Expression des hAATs in Mäuselunge
Mäuse wurden intratracheal entweder mit C-AT oder p43CB-AT-Vektor injiziert. Die Serummengen des hAATs in den Mäusen wurden am Tag 3, 14 und 31 nach der Injektion gemessen (14). Der p43CB-AT-Vektor vermittelte hohe Expressionsmengen des hAATs in der Lunge.
Es sollte verstanden werden, daß die hierin beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen lediglich illustrativen Zwecken dienen, und daß verschiedene Modifikationen und Änderungen im Lichte davon dem Fachmann nahe gelegt werden und vom Bereich dieser Anmeldung und dem Umfang der angefügten Ansprüche umfaßt sind.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Rekombinanter Adeno-assoziierter viraler Vektor umfassend ein Polynukleotid kodierend für ein α-1-Antitrypsin-Polypeptid oder ein biologisch aktives Teil oder eine Variante davon wirksam verknüpft mit einem Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem CMV-Promotor, einem β-Aktin Promotor, einem hybriden CMV-Enhancer/β-Aktin Promotor, einem EF-1 Promotor, einem U1a-Promotor, einem U1b-Promotor, einem Tet-induzierbaren Promotor und einem VP16-LexA-Promotor, der das Polynukleotid exprimiert, um das α-1-Antitrypsin-Polypeptid, das Fragment oder die Variante in einer Säugetierwirtszelle herzustellen.
Viraler Vektor gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor des weiteren einen Enhancer umfaßt.
Viraler Vektor gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein β-Aktin Promotor ist.
Viraler Vektor gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Promotor des weiteren einen CMV-Enhancer, einen synthetischen Enhancer oder einen muskelspezifischen Enhancer umfaßt.
Viraler Vektor gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Vektor des weiteren eine Intron-Sequenz umfaßt.
Viraler Vektor gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Vektor p43C-AT-IN ist.
Viraler Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei der Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dE-AT, E-AT, C-AT, C-AT2, p43C-AT, p43CB-AT, p43msENC-AT, p43rmsENC-AT, p43msENCB-AT und p43rmsENCB-AT.
Viraler Vektor gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Polynukleotid für ein humanes α-1-Antitrypsin-Polypeptid oder ein biologisch wirksames Fragment oder eine Variante davon kodiert.
Viraler Vektor gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, der innerhalb eines pharmazeutischen Trägers umfaßt ist.
Viraler Vektor gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, der für die Verabreichung an einen Menschen formuliert ist.
Adeno-assoziiertes virales Partikel, das den rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt.
Virales Partikel gemäß Anspruch 11, das innerhalb eines pharmazeutischen Träg umfaßt ist.
Wirtszelle, die den rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder das virale Partikel nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 umfaßt.
Wirtszelle gemäß Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine menschliche Zelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Wirtszelle eine menschliche Muskelfaser-, Myoblasten-, Hepatozyten- oder Lungenzelle ist.
Zusammensetzung umfassend den rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das virale Partikel nach Anspruch 11 oder 12, oder die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 15 für die Verwendung in der Therapie.
Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 10, des viralen Partikels nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, der Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 oder der Zusammensetzung gemäß Anspruch 16 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines α-1-Antitrypsinmangels oder Defekts in einem Säugetier.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Vektor, das Partikel, die Wirtszelle oder die Zusammensetzung geeignet ist, um dem Säugetier durch Injektion, Infektion oder Inhalation verabreicht zu werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 18, wobei das Säugetier ein Mensch ist.