TWI478937B - 改良之哺乳動物表現載體及其用途 - Google Patents

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Description

改良之哺乳動物表現載體及其用途
本申請案主張2008年1月15日申請之美國臨時申請案第61/021282號及2008年10月10日申請之美國臨時申請案第61/104546號之優先權，該等申請案每一者之內容之全文併入本文中。
穩定產生蛋白質(包括生物製品)可藉由以含有編碼該蛋白質之DNA的載體轉染宿主細胞而實現。載體在細胞株中之維持可經由各種方法達成，包括經由游離型複製起點進行染色體外複製。游離型載體含有在序列結合有複製起始因子時促進載體複製之複製起點。游離型載體具有若干優於需要插入宿主基因組中之載體的優點。舉例而言，游離型載體減少細胞中可能由載體整合於宿主基因組中所致之表型改變。亦可使用標準DNA萃取方案自轉染細胞分離游離型載體。
隨著治療性蛋白質(亦即生物製品)愈加重要，必須努力優化蛋白質產生，同時改良整體產生製程之效率。因此，效率改良必須與載體之蛋白質產生能力相權衡。需要提供有效選殖選擇以及高含量所需蛋白質產品之較佳表現系統。減少生物製品(尤其抗體)生產中所包含之選殖步驟數以縮短時間及最小化成本將為有利的。提供對於小規模及大規模細胞培養均提供足夠蛋白質產生之載體亦將有利。本發明藉由提供將由以下實施方式而顯而易見的其他優勢克服了習知載體之侷限性。
重組蛋白(尤其在藥物發現過程期間)可藉由哺乳動物細胞瞬時轉染產生。多種宿主細胞可用於表現蛋白質，包括哺乳動物細胞，諸如COS及人類胚胎腎(HEK)細胞。游離型載體依賴於複製起點與結合該起點之反式作用(trans-acting)複製起始因子。可將複製起始因子，諸如結合愛-巴病毒(Epstein-Barr virus)之OriP的愛-巴病毒核抗原(EBNA)選殖於游離型載體中，或者其可由載體所轉染之宿主細胞表現。因此，游離型載體可對表現活化經由複製起點達成之複製所需之反式作用因子的特定細胞株具有特異性。
本發明消除了對用於重組蛋白表現之不同游離型載體骨架之需要。本發明提供包含至少兩個不同游離型複製起點之游離型載體，該至少兩個不同游離型複製起點使得同一載體可用於不同細胞類型中進行蛋白質表現。不同複製起點使得該載體可用於提供必需的反式作用複製因子且允許該載體複製之不同類型哺乳動物細胞中。藉由消除對再選殖所關注基因以進行蛋白質產生之需要，本發明相關於多種載體改良了效率且降低了成本，而同時維持了蛋白質產生量。本發明之一驚人態樣係在於，向載體添加核苷酸(亦即第二複製起點)不會不利地影響載體產生所需量之蛋白質的能力。
在一較佳實施例中，本發明之載體包含抗體重鏈或輕鏈恆定區。因此，可分別將抗體輕鏈或重鏈可變區選殖於該載體中輕鏈或重鏈恆定區之上游，從而進一步改良該表現系統之效率。游離型載體促進表現SV40 T Ag或愛-巴病毒核抗原之哺乳動物細胞(例如COS7或HEK293-6E細胞)中產生大量蛋白質。
本發明提供用於蛋白質產率、生產效率及成本降低之元件的最佳組合，該等元件均為蛋白質生產之重要元件，尤其在製藥工業及生物蛋白(諸如抗體)生產中。本發明之其他特徵及優勢將描述於以下實施方式及申請專利範圍中。
在一態樣中，本發明提供一種表現載體，其包含：(a)衍生自愛-巴病毒(EBV)之OriP複製起點；(b)SV40複製起點；(c)用於插入所關注基因之插入位點；及(d)編碼抗體重鏈或輕鏈恆定區、與該插入位點操作性連接之核酸序列。在一實施例中，所關注基因為抗體重鏈或輕鏈可變區，例如鼠類、人類化、嵌合或人類抗體重鏈或輕鏈可變區。在一特定實施例中，該抗體重鏈可變區為選自由阿達木單抗(adalimumab)、ABT-325及ABT-874組成之群之抗體的重鏈可變區。在另一特定實施例中，該抗體輕鏈可變區為選自由阿達木單抗、ABT-325及ABT-874組成之群之抗體的輕鏈可變區。該抗體重鏈恆定區為(例如)鼠類、人類化、嵌合或人類抗體重鏈恆定區，且可為選自由γ1、z、a；γ1、z、non-a；γ2、n+；γ2、n-；及γ4組成之群之抗體重鏈恆定區。該γ1、z、non-a抗體重鏈恆定區可另外在重鏈恆定區之234位處包含丙胺酸突變。在另一實施例中，該γ1、z、non-a抗體重鏈恆定區可另外在抗體重鏈恆定區之235位或237位處包含丙胺酸突變。
在一實施例中，抗體輕鏈恆定區為人類κ同型或人類λ同型。在一實施例中，抗體重鏈恆定區為鼠類γ1同型或鼠類γ2a同型。在另一實施例中，抗體輕鏈恆定區為鼠類κ同型。在一實施例中，抗體重鏈恆定區為Fc域。在一實施例中，重鏈或輕鏈抗體可變區為插入位點之5'端。
在一實施例中，該表現載體另外包含與插入位點操作性連接之啟動子，其中該啟動子為EF-1α啟動子或巨細胞病毒(CMV)啟動子。
在一實施例中，表現載體另外包含可選標記，諸如胺苄西林(ampicillin)抗性基因。
在一實施例中，CMV啟動子包含與SEQ ID NO:1之核苷酸1至608至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之核酸序列。在一特定實施例中，CMV啟動子包含SEQ ID NO:1之核苷酸1至608。
在一實施例中，EF-1α啟動子為人類啟動子。在一實施例中，EF-1α啟動子包含與SEQ ID NO:2之核苷酸76至1267至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之核酸序列。在一特定實施例中，EF-1α啟動子包含SEQ ID NO:2之核苷酸76至1267。
在一實施例中，OriP複製起點包含與SEQ ID NO:1之核苷酸1795至3545至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之核酸序列。
在一實施例中，SV40複製起點包含與SEQ ID NO:1之核苷酸5834至6140至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之核酸序列。在一特定實施例中，SV40複製起點包含SEQ ID NO:1之核苷酸5834至6140。
本發明之例示性表現載體包含與選自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31及32組成之群之序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之核酸序列。在特定實施例中，該表現載體包含選自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31及32組成之群之核酸序列。
本發明之表現載體亦提供於圖1、2及14-25中。本發明之其他載體描述於圖8-13中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之載體的哺乳動物宿主細胞。該哺乳動物宿主可為COS細胞，諸如COS 7細胞；或人類胚胎腎(HEK)細胞，諸如HEK-293細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之載體的套組。
在另一態樣中，本發明提供一種產生重組蛋白之方法，其包含將本發明之表現載體引入哺乳動物宿主細胞中，在合適條件下培養該哺乳動物宿主細胞以表現該蛋白，及回收該蛋白。
在另一態樣中，本發明提供一種包含編碼信號肽之核酸序列的表現載體。在一實施例中，所關注基因與編碼信號肽之核酸操作性連接。
在連同隨附圖式閱讀時，根據以下對較佳實施例之描述，將對本發明之前述及其他目的、特徵及優點以及本發明本身有更全面的理解。
I.定義
為使本發明可更易於理解，本文中首先定義某些術語。
如本文中所用之術語"核酸"或"核酸分子"意欲包括DNA、RNA、mRNA、cDNA、基因組DNA及其類似物。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳為雙鏈DNA。可將核酸分離，或整合於另一核酸分子中，該另一核酸分子例如為表現載體或真核宿主細胞之染色體。
"經分離"核酸分子為自存在於該核酸之天然來源中之其他核酸分子分離者。舉例而言，對於基因組DNA，術語"經分離"包括自該基因組DNA天然結合之染色體分離之核酸分子。"經分離"核酸較佳不含在衍生該核酸之生物體之基因組DNA中天然側接該核酸(亦即位於該核酸之5'及3'端之序列)之序列。此外，"經分離"核酸分子(諸如cDNA分子)在藉由重組技術產生時可大體上不含其他細胞物質或培養基，或在化學合成時大體上不含化學前軀物或其他化學品。
術語"重組載體"或"載體"(在本文中可互換使用)係指一種核酸分子，其能夠傳送其已連接之另一核酸。一類載體為"質體"，其係指可接合其他DNA片段之環狀雙鏈DNA環。或者，載體可為線性載體。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA片段可接合於病毒基因組中。某些載體能夠於引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞之後整合於宿主細胞基因組中且由此與宿主基因組一起複製。在一較佳實施例中，本發明之載體為游離型哺乳動物載體。如本文中所用之術語"構築體"亦係指載體。
某些載體能夠引導與其操作性連接之基因的表現。"表現載體"或"重組表現載體"為一種編碼表現於宿主細胞中之基因的核酸分子，且此外，含有控制該基因之表現的必需元件。一般而言，表現載體包含轉錄啟動子、所關注基因及轉錄終止子。基因表現通常在啟動子之控制下進行，且將該基因稱為與該啟動子"操作性連接"。類似地，若調節元件調節核心啟動子之活性，則該調節元件與該核心啟動子操作性連接。在一實施例中，本發明之表現載體包含一個以上複製起點，因此使該載體並不限於一種細胞類型。
如本文中所使用之術語"游離複製載體"或"游離型載體"係指通常且極佳不整合於宿主細胞基因組中但並行存在之載體。如本文中所用之游離複製載體在細胞週期期間複製，且在此複製期間，載體複本視細胞分裂前後所存在之複本數而定統計地分布於所得細胞中。游離複製載體較佳可發生於宿主細胞之細胞核中，且較佳在細胞週期之S期期間複製。此外，游離複製載體在細胞週期之S期期間於宿主細胞之細胞核中複製至少一次，亦即一次或多次。在一極佳實施例中，游離複製載體在細胞週期之S期期間於宿主細胞之細胞核中複製一次。
如本文中所使用之術語"複製起點序列"或"複製起點"(在本文中可互換使用)係指當存在於載體中時起始複製之序列。複製起點可由複製起始因子或由DNA解旋酶辨識。
如本文中所用之"重組"係指一種藉以在兩個核酸分子之間(例如，於一微生物中)交換核酸物質(例如DNA)之方法。如本文中所用之"同源重組"係指一種藉以在兩個核酸分子之間經由具有序列同源性或較佳序列一致性(例如高度序列一致性)之區域或片段交換核酸物質之方法。在例示性實施例中，該核酸物質係位於微生物之染色體或游離體(episome)上。在另一例示性實施例中，該核酸物質係位於染色體外，例如位於質體上。重組可發生於線性及/或環狀DNA分子之間。
如本文中所使用之術語"所關注基因"係指添加至本發明之載體中之外源DNA序列。例如，所關注基因可包含一可由內含子間隔或為編碼開放閱讀框架之cDNA的編碼序列。如本文中所用之"所關注基因"係指添加至本發明之載體中用於最終蛋白質表現的DNA序列。用以選殖所關注基因之載體區域在本文中稱為"插入位點"。所關注基因較佳包含使用本發明之載體表現的抗體或融合蛋白之一部分。舉例而言，將抗體阿達木單抗之重鏈可變區(亦即所關注基因)選殖於本發明之包含重鏈恆定區之載體中。
在本發明之一實施例中，載體包含抗體輕鏈或重鏈恆定區，該恆定區為所關注基因之插入位點之3'端且與該插入位點操作性連接。因此，在一實施例中，所關注基因為與本發明之載體中所編碼之抗體輕鏈或重鏈恆定區操作性連接之抗體輕鏈或重鏈可變區。
核苷酸序列當置於與另一核苷酸序列之功能關係中時為"操作性連接"。舉例而言，若在表現時，所編碼之信號肽與所編碼之蛋白質或多肽同框(in frame)，則編碼該信號肽之DNA與編碼該蛋白質或多肽之DNA係操作性連接。同樣，若蛋白質或多肽之表現得以促進或增強，則啟動子或強化子係與編碼該蛋白質或多肽之核苷酸序列操作性連接。在一實施例中，操作性連接之核苷酸序列係鄰接的(例如在信號序列的情況下)。或者，操作性連接之核苷酸序列可不鄰接(例如在強化子的情況下)。在一實施例中，編碼抗體輕鏈或重鏈恆定區之核酸序列係與所關注基因(例如重鏈或輕鏈可變區)操作性連接。
術語"啟動子"包括足以引導真核細胞中之轉錄的任何核酸序列，其包括誘導型啟動子、抑制型啟動子及組成型啟動子。一般而言，啟動子包括足以使啟動子依賴性基因表現可以細胞類型特異性、組織特異性或瞬時特異性方式控制或可由外部信號或試劑誘導之元件。該等元件可位於特定基因之5'或3'端或內含子序列區域中。一般而言，基因表現為組成型的，儘管需要時可於本發明中使用可調節啟動子。基因表現亦可藉由使用熱、光或金屬之轉錄調節，諸如藉由使用金屬硫蛋白基因或熱休克基因而控制。
"上游"及"下游"為用於描述存在於核苷酸序列或載體中之兩個元件之間的相對方位之術語。為另一元件"上游"之元件位於比另一元件接近該序列之5'端的位置處(亦即，在該分子為線性分子時，更接近具有附著於核糖或脫氧核糖骨架之5'碳之磷酸酯基的分子末端)。當一元件與另一元件相比位於更接近該序列之3'端(亦即，具有附著於線性分子中之核糖或脫氧核糖骨架之3'碳之羥基的分子末端)的位置處時，將該元件稱為處於"下游"。
如本文中所使用之術語"填充序列"係指在5'與3'端均側接有限制酶位點之核酸序列(較佳於載體中)。填充序列係位於載體中編碼所關注基因之核酸的插入位點處。選殖過程期間，使用適當之限制酶將填充序列消化離開載體，且將編碼所關注基因之核酸接合或同源重組於載體中填充序列之先前位置處。填充序列較佳足夠大以在5'與3'限制酶位點之間提供足夠距離以使限制酶可有效切割載體。此外，較佳地，填充序列之長度不同於編碼所關注基因之核酸之尺寸，例如對於編碼所關注基因、具有約350個鹼基對之核酸，可使用具有約300個鹼基對或300個鹼基對以下或者約400個鹼基對或400個鹼基對以上之填充序列。在另一實施例中，填充序列之尺寸為約1kb。
如本文中所用之術語"重組宿主細胞"(或簡稱"宿主細胞")意欲指引入重組表現載體之細胞。應瞭解該等術語意欲不僅指特定個體細胞，且指該細胞之子代。因為繼代中可能由於突變或環境影響而發生某些改變，故該子代實際上可能與親本細胞不相同，但該子代仍包括於如本文中所用之術語"宿主細胞"之範疇內。
如本文中所提及之術語"抗體"包括完整抗體及任何抗原結合片段(亦即"抗原結合部分")或其單鏈。"抗體"係指至少包含由二硫鍵相互連接之兩個重鏈(H)及兩個輕鏈(L)的醣蛋白或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(本文中簡寫為VH )及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含3個域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL )及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL 。VH 及VL 區可進一步再分為稱為互補決定區(CDR)之高變區，其與稱為框架區(FR)之較保守區域交替。各VH 及VL 包含3個CDR及4個FR，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。該等重鏈及輕鏈可變區含有與抗原相互作用之結合域。VH 及VL 組合之六個CDR形成抗原結合位點。在包含兩條H鏈及兩條L鏈之抗體的情況下，該抗體可含有兩個相同抗原結合位點，結合相同抗原之兩個不同抗原結合位點，或結合不同抗原之兩個抗原結合位點。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(Clq)。
如本文中所用之術語抗體之"抗原結合部分"(或簡稱"抗體部分")係指保留與抗原(例如IL-1α、IL-1β)特異性結合之能力的一或多個抗體片段。抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。包涵於術語抗體之"抗原結合部分"內之結合片段的實例包括(i)Fab片段，即由VL 、VH 、CL 及CH1 域組成之單價片段；(ii)F(ab')2 片段，即包含兩個在鉸鏈區由二硫橋連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH 及CH1 域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL 及VH 域組成之Fv片段；(v)由VH 或VL 域組成之dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域(VL 及VH )係由獨立基因編碼，但可使用重組方法藉由合成連接子將其接合，該合成連接子使其能夠形成為其中VL 及VH 區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見(例如)Bird等人(1988)Science 242:423-426；及Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲包涵於術語抗體之"抗原結合部分"內。使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得該等抗體片段，且以與完整抗體相同之方式篩檢該等片段之效用。在本發明之一實施例中，抗體片段係選自由以下抗體片段組成之群：Fab、Fd、Fd'、單鏈Fv(scFv)、scFva 及域抗體(dAb)。
此外，抗體或其抗原結合部分可為較大免疫黏附分子(藉由該抗體或抗體部分與一或多個其他蛋白質或肽共價或非共價結合而形成)之一部分。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區域製成四聚scFv分子(Kipriyanov等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C末端聚組胺酸標籤製成二價且經生物素標記之scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Mol. Immunol. 31:1047-1058)。諸如Fc、Fab及F(ab')2 片段之抗體部分可自完整抗體使用習知技術製備，該等習知技術諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別消化完整抗體。此外，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分及免疫黏附分子。
術語"域"係指獨立於蛋白質之其餘部分而保留其三級結構之摺疊蛋白質結構。一般而言，域決定蛋白質之離散功能特性，且在許多情況下可經添加、移除或轉移至其他蛋白質而不喪失蛋白質剩餘部分之功能及/或該域之功能。單一抗體可變域意謂包含抗體可變域之序列特徵的摺疊多肽域。因此其包括完整抗體可變域及經修飾可變域(例如，其中一或多個環已置換為不為抗體可變域之特徵的序列)，或已截短或包含N末端或C末端擴展之抗體可變域，以及至少部分保留全長域之結合活性及特異性的可變域摺疊片段。
本發明之可變域可經組合以形成域組；例如，可組合互補域，諸如使VL 域與VH 域組合。亦可組合非互補域，例如VH 域與第二VH 域。可以多種方法組合域，包括藉由共價或非共價方式連接域。
"dAb"或"域抗體"係指特異性結合抗原之單一抗體可變域(VH 或VL )多肽。在一實施例中，使用本發明之載體表現dAb。
短語"重組抗體"係指藉由重組方式製備、表現、產生或分離之抗體，諸如使用轉染於宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體，自重組、組合抗體庫分離之抗體，自轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)分離之抗體(參見(例如)Taylor等人(1992)Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)，或藉由任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體，該等其他方式包括將特定免疫球蛋白基因序列(諸如人類免疫球蛋白基因序列)剪接至其他DNA序列。重組抗體之實例包括嵌合抗體、CDR接枝抗體及人類化抗體。
術語"人類抗體"係指具有對應於或衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體，如(例如)Kabat等人(參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)所述。然而，本發明之人類抗體可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變而引入之突變)，例如在CDR且尤其CDR3中。
本發明之重組人類抗體具有可變區，且亦可包括恆定區(衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列)(參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)。然而，在某些實施例中，將該等重組人類抗體進行活體外誘變(或當使用轉殖人類Ig序列之動物時，則為活體內體細胞誘變)且由此重組抗體VH 及VL 區之胺基酸序列為雖衍生自人類生殖系VH 及VL 序列且與人類生殖系VH 及VL 序列相關，但可並非天然存在於活體內人類抗體生殖系譜系內之序列。然而，在某些實施例中，該等重組抗體為選擇性誘變或回復突變或兩者之結果。
術語"回復突變"係指一種將人類抗體之一些或全部體細胞突變胺基酸以同源生殖系抗體序列之相應生殖系殘基置換的方法。將本發明人類抗體之重鏈及輕鏈序列分別與VBASE資料庫中之生殖系序列比對以鑑別具有最高同源性之序列。將本發明人類抗體中之差異藉由使編碼該不同胺基酸之確定核苷酸位置突變而回復為生殖系序列。應對於抗原結合中之直接或間接作用研究由此鑑別為回復突變候選者之各胺基酸之作用，且突變後發現影響人類抗體之任何需要特徵的任何胺基酸不應包括於最終人類抗體中。為使進行回復突變之胺基酸數最小，可保留發現不同於最接近之生殖系序列但與第二生殖系序列中之相應胺基酸一致的彼等胺基酸位置，其限制條件為該第二生殖系序列與本發明人類抗體之序列在所討論胺基酸之兩側有至少10個胺基酸、較佳12個胺基酸一致且共線。回復突變可發生於抗體優化之任何階段。
術語"嵌合抗體"係指包含一物種之重鏈及輕鏈可變區序列及另一物種之恆定區序列的抗體，諸如具有與人類恆定區連接之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語"CDR接枝抗體"係指包含一物種之重鏈及輕鏈可變區序列但其中VH 及/或VL 之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有一或多個鼠類CDR(例如CDR3)經人類CDR序列置換之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語"人類化抗體"係指包含非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中至少一部分VH 及/或VL 序列已經改變而更"似人類"(亦即更類似於人類生殖系可變序列)的抗體。一類人類化抗體為CDR接枝抗體，其中將人類CDR序列引入非人類VH 及VL 序列中以置換相應非人類CDR序列。
如本文中所使用之術語"連接"、"融合"可互換使用。該等術語係指藉由任何方式(包括化學結合或重組方式)將兩個以上元件或組份接合在一起。"同框融合(in-frame fusion)"或"操作性連接"係指以維持初始開放閱讀框架(ORF)之正確閱讀框架的方式接合兩個或兩個以上ORF來形成連續較長ORF。因此，所得重組融合蛋白為含有兩個或兩個以上對應於由初始ORF編碼之多肽的片段(該等片段通常並不天然如此接合)的單一蛋白質。儘管如此製備之閱讀框架在整個融合片段中為連續的，但可藉由(例如)框內連接序列將該等片段物理上或空間上分開。
本文中所使用之術語"Fc區"包括衍生自抗體重鏈恆定區之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc區包括一種包含抗體恆定區但排除第一恆定區免疫球蛋白域之多肽。
Fc區可為Fc區之功能相等類似物。Fc區之功能相等類似物可為變異Fc區，其包含對野生型或天然存在Fc區之一或多個胺基酸修飾。在一些實施例中，變異Fc區與天然存在Fc區具有至少50%同源性，較佳約80%至99%，包括至少約85%同源性，至少約90%同源性，至少約95%同源性，至少約96%同源性，至少約97%同源性，至少98%同源性，或至少約99%同源性。Fc區之功能相等類似物可包含在該蛋白質N端或C端添加或刪除一或多個胺基酸殘基，較佳不超過30個，最佳不超過10個。Fc區之功能相等類似物包括可操作地連接於融合搭配物之Fc區。
本文中所用之術語"Fc融合物"或"Fc融合蛋白"包括一或多種蛋白質、多肽或小分子可操作地連接於Fc區或其衍生物的蛋白質。本文中所用之術語"Fc融合物"意欲與先前技術中所用之諸如"Ig融合物"、"Ig嵌合體"及"受體球蛋白"(有時具有破折號)之術語(Chamow等人，1996,Trends Biotechnol 14:52-60；Ashkenazi等人，1997,Curr Opin Immunol 9:195-200)同義。Fc融合物組合免疫球蛋白之一或多個Fc區或其變異體與一種融合搭配物(其通常可為任何蛋白質、多肽、肽或小分子)。在一些實施例中，Fc融合物之非Fc部分(亦即融合搭配物)之作用可為介導標靶結合，因此其可在功能上類似於抗體之可變區。
在本發明中可使用多種連接子將Fc多肽與融合或結合搭配物共價連接或產生Fc融合物。如本文中所使用之術語"連接子"、"連接序列"、"間隔子"、"連系序列(tethering sequence)"或其相等物係指連接兩個分子且可用以將該兩個分子置於較佳構型之分子或分子群(諸如單體或聚合物)。可使用多個策略將分子共價連接在一起。該等策略包括(但不限於)蛋白質或蛋白質域之N末端與C末端之間的多肽連接，經由二硫鍵連接，及經由化學交聯劑連接。
II.本發明之載體
本發明提供用於在哺乳動物宿主細胞中表現蛋白質之游離型載體。本發明之載體係基於包括兩個游離型複製起點，該兩個游離型複製起點使得該載體可用於含有對於任一複製起點之反式作用複製起始因子的任何細胞株。雖然該載體亦可含有結合複製起點之複製起始因子，但在一較佳實施例中，由宿主細胞提供反式作用複製因子。此外，在一實施例中，本發明之載體提供產生抗體及Fc融合蛋白之切實高效方法，因為該等載體含有與所關注基因操作性連接之重鏈或輕鏈恆定區。本發明載體之實例描述於圖1、2及8至25中。此外，例示性載體之序列提供於SEQ ID NO:1至32中。圖1及圖2(及相應SEQ ID NO:1及2)描述"開放"之載體，亦即不含有抗體重鏈或輕鏈恆定區及所關注基因之本發明載體。圖8-25提供亦包含各種鼠類或人類恆定區以及用於選殖所關注基因之位點的本發明載體的圖譜。
本發明之載體包含至少兩個不同複製起點，例如衍生自愛-巴病毒(EBV)之OriP複製起點及SV40複製起點。複製起點可衍生自DNA病毒，更佳衍生自允許游離型複製之DNA病毒，包括衍生自以下病毒之複製起點：例如愛-巴病毒、疱疹單純型病毒(Herpes simplex virus)、松鼠猴疱疹病毒(Herpesvirus Saimiri)、鼠類γ疱疹病毒68(Murine Gammaherpesvirus 68)、人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus)、鼠巨細胞病毒(Mouse Cytomegalovirus)、偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus)、猿猴病毒40(Simian Virus 40)、多形瘤病毒(Polyoma virus)、人BK病毒、牛乳頭瘤病毒(Bovine Papilloma virus)及腺相關病毒(Adeno-associated virus)。
在一實施例中，複製起點來自愛-巴病毒，例如oriP，或其功能部分(愛-巴功能起點之實例描述於Aiyar等人(1998)EMBO Journal,17:6394中)。愛-巴病毒複製起點(OriP)包含2個主要元件及多個有利於細胞DNA合成之順式作用元件及一病毒維持元件。兩個主要元件中之第一者含有一組重複(FR)，其包含EBNA結合位點(圖1及圖2中所示)。EBNA為經由OriP起始載體複製之複製起始因子(對於EBNA序列參見Genbank寄存編號V01555)。OriP中所含之第二元件含有所謂的二重對稱元件(DS)，且其功能在於充當起點辨識元件。一般而言，DS與FR元件由數個鹼基對(通常1000個bp)間隔。可改變OriP之相對方位，且尤其DS及FR之相對方位，而不會影響OriP功能。可改變OriP且尤其DS及FR相對於定位於本發明之表現載體上之其他元件之方位，而不會影響OriP功能。在複製起點為愛-巴病毒複製起點(OriP)且OriP包含一組重複(FR)及二重對稱元件(DS)之本發明一較佳實施例中，連續順序為DS元件介於所關注基因與FR元件之間。在一實施例中，本發明之載體包含OriP(愛-巴病毒)複製起點，該複製起點包含SEQ ID NO:1之核苷酸1795至3545，或與其80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。
在另一實施例中，載體包含SV40複製起點。SV40(猿猴病毒40)複製起點(例如，在圖1及圖2中描述為"SV40 Ori")需要單一病毒蛋白，該大T抗原用以經由此起點起始載體複製。SV40複製起點可用於游離型載體中以複製及維持該載體(參見Calos(1996)Trends Genetics 12:462；Harrison等人(1994)J Virol 68:1913；Cooper等人(1997)PNAS 94:6450；及Ascenziono等人(1997)Cancer Lett 118:135)。在一實施例中，本發明之載體包含SV40複製起點，該複製起點包含SEQ ID NO:1之核苷酸5834至6140，或與其80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。
本文中所述複製起點之功能變異體亦包涵於本申請案之複製起點之含義中。
除游離型複製起點之外，本發明之載體亦可具有用於在細菌中複製載體之複製起點。如圖1及圖2所示且並非意欲限制本發明之一實例為pMB1 ori，其在大腸桿菌(E. coli)中發揮作用。
本發明之載體亦可包括可選標記。選擇標記可有利於載體序列在原核及真核生物中選殖及擴增。在某些實施例中，選擇標記將賦予對一種化合物或一類化合物(諸如抗生素)之抗性。可與本發明之核酸分子及表現系統一起使用之例示性選擇標記為賦予對嘌呤黴素(puromycin)之抗性者。或者，可使用賦予對以下各物之抗性的選擇標記：潮黴素(hygromycin)、gpt、新黴素(neomycin)、吉歐黴素(zeocin)、烏巴箭毒(ouabain)、保米黴素(blasticidin)、卡那黴素(kanamycin)、遺傳黴素(geneticin)、慶大黴素(gentamicin)、胺苄西林、四環素(tetracycline)、鏈黴素(streptomycin)、大觀黴素(spectinomycin)、萘啶酸(nalidixic acid)、利福平(rifampicin)、氯黴素(chloramphenicol)、吉歐黴素或博萊黴素(bleomycin)，或諸如DHRF、hisD、trpB或麩胺醯胺合成酶之標記。
本發明之載體中亦包括對於所關注基因(以及可選標記)轉錄及轉譯為蛋白質所必需之調節元件。轉錄調節元件通常包含待表現基因序列之5'端啟動子、轉錄起始與終止位點及聚腺苷酸化信號序列。術語"轉錄起始位點"係指構築體中對應於併入初級轉錄物(亦即mRNA前軀物)中之第一核酸的核酸；轉錄起始位點可與啟動子序列重疊。術語"轉錄終止位點"係指通常呈現於所關注基因或待轉錄序列段之3'端處、使RNA聚合酶終止轉錄的核苷酸序列。聚腺苷酸化信號序列或poly-A添加信號提供在真核生物mRNA之3'端特定位點處裂解且在核中轉錄後添加具有約100-200個腺嘌呤核苷酸之序列(polyA尾)至已裂解3'端的信號。聚腺苷酸化信號序列包括位於裂解位點上游約10-30個核苷酸處的序列AATAAA以及一下游序列。
本發明之載體中可包括之調節元件為啟動子。啟動子可為組成型或誘導型。可能需要強化子(亦即作用於啟動子上增加轉錄之順式作用DNA元件)來與啟動子結合起作用而增加由啟動子獨自獲得之表現量，且可作為轉錄調節元件包括在內。一般而言，含有啟動子之聚核苷酸片段將亦包括強化子序列(例如CMV IE P/E；SV40 P/E；MPSV P/E)。若需要則可包括剪接信號以獲得剪接轉錄物。為產生分泌型多肽，所選序列通常包括編碼前導肽之信號序列，該前導肽將新合成之多肽引導至ER膜且穿過ER膜，在該ER膜中該多肽可經運送以供分泌。該前導肽通常但並不普遍位於所分泌蛋白質之胺基末端，且在該蛋白質穿過ER膜之後由信號肽酶裂解掉。所選序列通常但未必包括其自身信號序列。在不存在天然信號序列之情況下，可將異源信號序列融合至所選序列。諸多信號序列為此項技術中已知且可得自序列資料庫，諸如GenBank及EMBL。轉譯調節元件對於待表現之各個別多肽包括轉譯起始位點(AUG)、終止密碼子及poly A信號。一些構築體中包括內部核糖體進入位點(IRES)。
適用於本發明之啟動子包括病毒、哺乳動物及酵母啟動子，例如鼠類β血球蛋白啟動子、泛素啟動子、多瘤病毒啟動子、哺乳動物巨細胞病毒(CMV)啟動子、酵母醇氧化酶、磷酸甘油激酶啟動子、乳糖誘導型啟動子、半乳糖苷酶啟動子、腺相關病毒啟動子、痘病毒啟動子、反轉錄病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)啟動子、腺病毒啟動子、SV40啟動子、羥基甲基戊二醯基輔酶A啟動子、胸苷激酶啟動子、H5R痘病毒啟動子、腺病毒型2MPC晚期啟動子(adenovirus type 2MPC late promoter)、α-抗胰蛋白酶啟動子、fox IX啟動子(fox IX promoter)、免疫球蛋白啟動子、CFTR表面活性蛋白啟動子(CFTR surfactant promoter)、白蛋白啟動子及轉鐵蛋白啟動子。所選與本發明之核酸及表現載體一起使用之啟動子可提供(1)高表現量，例如在驅動所關注基因表現時，或(2)減少之表現量(在藉由修飾削弱之後)，例如在驅動可選標記基因表現時。驅動所關注基因之啟動子較佳為強啟動子，例如泛素、CMV、EF-1α及SRα啟動子以提高所關注產物之表現且促進所關注產物之正確剪接。
在一實施例中，本發明之載體包括CMV啟動子以驅動所關注基因之表現。CMV啟動子之用途描述於美國專利第5,385,839號及第5,849,522號中，該等專利係以引用的方式併入本文中。在一實施例中，本發明之載體中所用之CMV啟動子與所關注基因及SEQ ID NO:1之核苷酸1至608操作性連接。本發明之範疇中亦包括與SEQ ID NO:1之核苷酸1至608 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之CMV啟動子序列。
本發明之載體中可使用之另一啟動子為來自延長因子-1α(EF-1α)(例如人類EF-1α)之啟動子。人類EF-1α啟動子之序列可見於GenBank寄存編號NM_001402。在一實施例中，本發明之載體包含SEQ ID NO:2之核苷酸76至1267。本發明之範疇中亦包括與SEQ ID NO:1之核苷酸1至608 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之EF-1α啟動子序列。
在一實施例中，載體包含用於選殖目的之SwaI限制性位點。
一般而言，基因(例如可選標記及GOI)係夾在啟動子與聚腺苷酸化位點之間。所用poly A序列可來自所關注基因(亦即可使用天然poly A序列)，或可使用異源poly A序列(亦即來自不同於GOI之基因)，例如BGH poly A及SV40 poly A。自啟動子轉錄mRNA且藉由位於編碼區3'端之聚腺苷酸化信號加以穩定。Poly A信號為此項技術中所熟知，且可基於與本發明中所用之載體及宿主細胞一起使用之適合性選擇。可用poly A信號之實例包括人類BGH poly A、SV40 poly A、人類β肌動蛋白polyA、兔β血球蛋白polyA及免疫球蛋白κ polyA。
本發明之載體包括所關注基因，其中該載體作為在細胞培養中表現該關注基因之工具。所關注基因可編碼功能性核酸分子(例如RNA，諸如反義RNA分子)，或更通常，編碼需要提高產量之肽、多肽或蛋白質。本發明之載體可具有所關注基因，該所關注基因插入插入位點處以使所關注基因與使該所關注基因表現之調節核酸序列操作性連接。在一實施例中，本發明之載體可用於表現基本上任何所關注基因，尤其編碼具有治療有用活性或其他商業上相關應用之重組蛋白的基因。
所關注基因之非限制性實例包括激素、趨化激素、細胞激素、淋巴激素、抗體、受體、黏附分子及酶。所需產物之非詳盡列表包括(例如)人類生長激素、牛生長激素、副甲狀腺素、甲狀腺刺激性激素、濾泡刺激性生長激素、促黃體激素；激素釋放因子；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；前胰島素(proinsulin)；降鈣素(calcitonin)；升糖素(glucagon)；諸如腎素之分子；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及溫韋伯氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，諸如蛋白質C、心房利尿鈉因子、肺表面活性蛋白；纖維蛋白溶酶原活化劑，諸如尿激酶或人類尿或組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾素(bombesin)；凝血酶(thrombin)；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；腦啡肽酶(enkephalinase)；RANTES(調節正常T細胞活化後表現及分泌因子，regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；人類巨噬細胞發炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；苗勒(mullerian)抑制物；鬆弛素A或B鏈；前鬆弛素(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相關肽；DNase；抑制素；活化素；激素或生長因子之受體；整合素；蛋白質A或D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨衍生神經營養因子(BDNF)，神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5或神經營養蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，生長因子，包括血管內皮生長因子(VEGF)，諸如NGF-β之神經生長因子；血小板衍生生長因子(PDGF)；纖維母細胞生長因子，諸如aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5、FGF-6；表皮生長因子(EGF)；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II(IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白質，諸如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19；紅血球生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態生成蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；介白素(IL)，例如IL-1至IL-33；超氧化歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白，例如HER2；衰變加速因子；病毒抗原，諸如AIDS包膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；生長因子、細胞激素、趨化激素及淋巴激素之受體；調節蛋白；抗體；嵌合蛋白，諸如免疫黏附素，及上列多肽中任一者之片段。細菌多肽或蛋白質之實例包括鹼性磷酸酶及β-內醯胺酶。
在本發明之一態樣中，載體包含與插入位點操作性連接之抗體重鏈或輕鏈區域。包含兩個游離型複製起點及一抗體輕鏈或重鏈恆定區之載體之實例可見於SEQ ID NO:3-32。
本發明之一實施例包括可用於表現完整抗體之載體(亦即一恆定區與重鏈或輕鏈之可變區連接)。因此，所關注基因可編碼抗體重鏈或輕鏈可變區，該抗體重鏈或輕鏈可變區可具有任何抗體類型，例如鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體。編碼重鏈或輕鏈可變區之所關注基因可包括全長可變區，或者，可僅編碼重鏈或輕鏈之片段，例如抗原結合部分區域。在一實施例中，所關注基因編碼鼠類或人類抗體可變區。在該情況下，恆定區可與可變區之物種相配(SEQ ID NO:3-8、27及28編碼鼠類恆定區，而SEQ ID NO:9-26及29-32編碼人類恆定區)。
在一實施例中，本發明之載體包括編碼具有特定同型及/或同種異型特徵之抗體重鏈恆定區的核酸序列。該重鏈恆定區可(例如)為γ同型(IgG)，諸如γ1、γ2、γ3或γ4。在一實施例中，重鏈γ1恆定區為特定同種異型，包括(但不限於)同種異型z、a及z、non-a。z、a同種異型亦稱為G1m17及G1m1同種異型，且對應於IGHG1，其中Lys位於位置214(於CH1內)處，Asp位於356(CH3)處，且Leu位於358(CH3)處(根據EU數字系統編號)。z、non-a同種異型，亦稱為G1m17及G1m1同種異型，對應於IGHG1，其中Lya位於位置214(於CH1內)處，Glu位於356(CH3)處，且Met位於358(CH3)處(根據EU數字系統編號)。
在另一實施例中，重鏈γ2恆定區(hcG2)為特定同種異型，包括(但不限於)n-或n+。hcG2之n+同種異型，亦稱為G2m(n)或G2m(23)，對應於IGHG2，其中Thr位於CH1中之位置189處，且Met位於位置282處(根據EU數字系統編號)。hcG2之n-同種異型，亦稱為G2m(n-)，對應於IGHG2，其中Pro位於CH1中之位置189處，且Val位於位置282處(根據EU數字系統編號)。n+及n-同種異型之其他詳情描述於Hougs等人(2001)Immunogenetics 52:242及Brusco等人(1995)Immunogenetics 42:414中。
在其他實施例中，重鏈恆定區可為IgM、IgA(IgA1或IgA2)、IgD或IgE同型。
在一實施例中，重鏈恆定區可具有以下人類同型及同種異型特徵：γ1、z、a；γ1、z、non-a；γ2、n+；γ2、n-；或γ4。在一實施例中，同型/同種異型γ1、z、non-a可在重鏈恆定區之位置234處包括突變。在另一實施例中，同型/同種異型γ1、z、non-a可在重鏈恆定區之位置234及235或234及237處包括突變。該等載體之實例提供於圖8至25中。
在另一實例中，本發明之載體中所編碼之輕鏈恆定區可包含κ同型或λ同型。
由本發明之載體編碼之恆定區並不限於人類恆定區，而可替代包括鼠類或其他物種之恆定區。在一實施例中，本發明之表現載體包含編碼為鼠類γ1同型或鼠類γ2a同型之重鏈恆定區或為鼠類κ同型之輕鏈恆定區的核酸。
本發明之兩個載體pHybC及pHybE為並不含有恆定區之空載體，且可用於選殖所關注基因。下文提供pHybC及pHybE之描述，且該等載體之圖譜可見於圖1及圖2中。
pHybC 　pHybC載體(空)含有兩個病毒複製起點，使得該載體可在不同細胞株中複製。pHybC含有以下元件：SV40複製起點("SV40 Ori")，其使得載體質體可在表現SV40大T抗原蛋白之細胞(例如COS7細胞)中複製；與所關注基因之插入位點操作性連接之CMV啟動子("pCMV")；三聯前導序列(TPL)；剪接供體位點(SD)；腺病毒主要晚期強化子元件(enh MLP)；剪接受體位點(SA)；後面為poly A信號(pA)之所關注基因之開放閱讀框架(ORF)區；二重對稱元件(DS)；愛巴病毒衍生真核複製起點(OriP)，其使得載體質體可在表現病毒EBNA-1蛋白之細胞(例如HEK-293-6E細胞)中複製；重複區(FR)；胺苄西林抗性標記(AmpR)；及細菌複製起點(pMB1ori)。pHybC載體使用pCMV啟動子，該啟動子為可獲得之最強啟動子元件之一。pHybC(空)載體圖譜描述於圖1中。pHybC載體之核酸序列闡述於SEQ ID NO:1中。
pHybE 　pHybE載體(空)含有兩個複製起點，使得該載體可在不同細胞株中複製。pHybE含有以下元件：SV40複製起點("SV40 Ori")，其使得載體質體可在表現SV40大T抗原蛋白之細胞(例如COS7細胞)中複製；與所關注基因之插入位點操作性連接之EF-1α真核啟動子；後面為poly A信號(pA)之所關注基因之開放閱讀框架(ORF)區；二重對稱元件(DS)；愛巴病毒衍生真核複製起點(OriP)；重複區(FR)；胺苄西林抗性標記(AmpR)；及細菌複製起點(pMBlori)。pHybE(空)載體圖譜描述於圖2中。pHybE在以下方面不同於pHybC：pHybE含有與所關注基因之插入位點操作性連接之EF-1α啟動子，而pHybC含有CMV啟動子。pHybE載體之核酸序列闡述於SEQ ID NO:1中。
以下所提及之載體係基於pHybE或pHybC，且另外含有免疫球蛋白重鏈或輕鏈恆定區。如同pHybE及pHybC一般，以下載體具有可用於插入所關注基因(例如免疫球蛋白可變區或其抗原結合部分之編碼序列)之選殖位點。在各種情況下，所關注基因之選殖位點與載體中所含之恆定區的編碼序列鄰接。因此，以下載體可用於表現含有特定恆定區及特定可變區之抗體輕鏈或重鏈。如同pHybC及pHybE一般，以下所提及之本發明之載體中之每一者均含有多個複製起點，使得可使用相同載體於不同細胞株中表現該抗體輕鏈或重鏈。本發明之其他載體之描述如下所述(亦參見圖8至25中所提供之載體圖譜)。應注意，描述為型式1(V1)之pHyb載體在Srf I限制性位點上游具有一額外Swa I位點，而描述為型式2(V2)之pHyb載體並不具有該額外Swa I位點。
本發明之包含鼠類恆定區之載體
pHybC-mCg2a 　載體pHybC-mCg2a係基於pHybC載體(因此含有以上對於pHybC所述之全部元件)。該載體亦包含γ2a重鏈恆定區之鼠類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybC-mCg2a載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區(或其部分)及鼠類γ2重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybC-mCg2可用於表現與γ2重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。圖8展示包含鼠類BR3蛋白之胞外域(ECD)的編碼序列作為所關注基因之pHybC-mBR3-mCg2a的圖譜。pHybC-mBR3-mCg2a之核酸序列闡述於SEQ ID NO:27中。
pHybE-mCk 　載體pHybE-mCk係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。pHybE-mCk亦包含κ輕鏈恆定區之鼠類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-mCk載體可用於表現包含免疫球蛋白輕鏈可變區及鼠類κ輕鏈恆定區的抗體輕鏈。或者，pHybE-mCk可用於表現與鼠類κ輕鏈恆定區融合之所關注基因。pHybE-mCk V2之載體圖譜提供於圖25中。pHybE-mCk V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:3中，且pHybE-mCk V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:4中。
pHybE-mCg1 　pHybE-mCg1係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ1重鏈恆定區之鼠類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-mCg1載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及鼠類γ1重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-mCg1可用於表現與鼠類γ1重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-mCg1 V2之載體圖譜提供於圖21中。pHybE-mCg1 V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:5中，且pHybE-mCg1 V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:6中。
pHybE-mCg2a pHybE-mCg2a係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ2a重鏈恆定區之鼠類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-mCg2a載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及鼠類γ2重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-mCg2a可用於表現與γ2重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-mCg2a V2之載體圖譜提供於圖22中。pHybE-mCg2a V1之核酸序列闡述為SEQ ID NO:7，且pHybE-mCg2a V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:8中。作為pHybE-mCg2a可如何使用之一實施例的實例，圖9展示pHybE-mBR3-mCg2a之圖譜。圖9中所述之載體含有鼠類BR3蛋白之胞外域(ECD)的編碼序列。pHybE-mBR3-mCg2a之核酸序列闡述於SEQ ID NO:28中。
本發明之包含人類恆定區之載體
pHybC-E7-hCk pHybC-E7-hCk係基於pHybC載體(因此含有以上對於pHybC所述之全部元件)。該載體亦包含κ輕鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。此外，pHybC-E7-hCk含有阿達木單抗輕鏈可變區的編碼序列(亦稱為"E7")。pHybC-E7-hCk之載體圖譜提供於圖10中，且pHybC-E7-hCk之核酸序列闡述於SEQ ID NO:29中。
pHybC-D2-hCg1,z,a pHybC-D2-hCg1,z,a係基於pHybC載體(因此含有以上對於pHybC所述之全部元件)。該載體亦包含γ1,z,a重鏈恆定區之編碼序列。此外，pHybC-D2-hCg1,z,a含有阿達木單抗重鏈可變區之編碼序列(亦稱為"D2")。pHybC-D2-hCg1,z,a之載體圖譜提供於圖11中。pHybC-D2-hCg1,z,a之核酸序列闡述於SEQ ID NO:30中。
pHybE-hCk 　pHybE-hCk係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含κ輕鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，例如，pHybE-hCk載體可用於表現包含免疫球蛋白輕鏈可變區及人類κ輕鏈恆定區之抗體輕鏈。或者，pHybE-hCk可用於表現與κ輕鏈恆定區融合之所關注基因。pHybE-hCk V2之載體圖譜提供於圖23中。pHybE-hCk V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:9中，且pHybE-hCk V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:10中。pHybE-E7-hCk之載體圖譜亦提供於圖13中。除pHybE-hCk載體之上述全部元件之外，pHybE-E7-hCk還含有阿達木單抗輕鏈可變區之編碼序列(亦稱為"E7")。pHybE-E7-hCk之核酸序列闡述於SEQ ID NO:32中。
pHybE-hC1 　pHybE-hCl係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含λ輕鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCl載體可用於表現包含免疫球蛋白輕鏈可變區及人類λ輕鏈恆定區之抗體輕鏈。或者，pHybE-hCl可用於表現與λ輕鏈恆定區融合之所關注基因。pHybE-hCl V2之載體圖譜提供於圖24中。pHybE-hCl V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:11中，且pHybE-hCl V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:12中。
pHybE-hCg1,z,a 　pHybE-hCg1,z,a係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ1,z，a重鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCg1,z,a載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及人類γ1,z,a重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-hCg1,z,a可用於表現與γ1,z,a重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1,z,a之載體圖譜提供於圖14中。pHybE-hCg1,z,a V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:13中，且pHybE-hCg1,z,a V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:14中。pHybE-D2-hCg1,z,a之載體圖譜提供於圖12中。除pHybE-hCg1,z,a之上述元件之外，pHybE-D2-hCg1,z,a還含有阿達木單抗重鏈可變區之編碼序列(亦稱為"D2")。pHybE-D2-hCg1,z,a之核酸序列闡述於SEQ ID NO:31中。
pHybE-hCg1,z,non-a 　pHybE-hCg1,z,non-a係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ1,z,non-a重鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCg1,z,non-a載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及人類γ1,z,non-a重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-hCg1,z,non-a可用於表現與γ1,z,non-a重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1,z,non-a V2之載體圖譜提供於圖15中。pHybE-hCg1,z,non-a V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:15中，且pHybE-hCg1,z,non-a V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:16中。
pHybE-hCg1 ,z,non-a,mut(234,235) 　pHybE-hCgl,Z,non-a,mut(234,235)係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ1,z,nOn-a,mut(234,235)重鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCg1,z,nOn-a,mut(234,235)載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及人類γ1,z,non-a,mut(234,235)重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235)可用於表現與γ1,z,non-a,mut(234,235)重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1,z，non-a,mut(234,235)V2之載體圖譜提供於圖16中。pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235)V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:17中，且pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235)V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:18中。
pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234 ,237) 　pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ1,z,non-a,mut(234,237)重鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及人類γ1,z,non-a,mut(234,237)重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)可用於表現與γ1,z,non-a,mut(234,237)重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)V2之載體圖譜提供於圖17中。pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:19中，且pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:20中。
pHybE-hCg2,n- 　pHybE-hCg2，n-係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ2,n-重鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCg2,n-載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及人類γ2,n-重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-hCg2,n-可用於表現與γ2,n-重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg2,n-V2之載體圖譜提供於圖19中。pHybE-hCg2,n-V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:21中，且pHybE-hCg2,n-V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:22中。
pHybE-hCg2,n+ 　pHybE-hCg2,n+係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ2,n+重鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCg2,n+載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及人類γ2,n+重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-hCg2,n+可用於表現與γ2,n+重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg2,n+之載體圖譜提供於圖18中。pHybE-hCg2,n+V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO:23中，且pHybE-hCg2,n+V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO:24中。
pHybE-hCg4 　pHybE-hCg4係基於pHybE載體(因此含有以上對於pHybE所述之全部元件)。該載體亦包含γ4重鏈恆定區之人類免疫球蛋白編碼序列。因此，在一實施例中，pHybE-hCg4載體可用於表現包含免疫球蛋白重鏈可變區及人類γ4重鏈恆定區之抗體重鏈。或者，pHybE-hCg4可用於表現與γ4重鏈恆定區融合之所關注基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg4之載體圖譜提供於圖20中。pHybE-hCg4V1之核酸序列闡述於SEQ ID NO：25中，且pHybE-hCg4 V2之核酸序列闡述於SEQ ID NO：26中。
本發明載體之序列提供於SEQ ID NO：1-32中。在一實施例中，本發明之載體包含闡述於SEQ ID NO：1-32之任一者中之序列，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
本發明可用於產生人類及/或人類化抗體，該等抗體免疫特異性地辨識特定細胞標靶，例如任一上述蛋白質，人類EGF受體、her-2/neu抗原、CEA抗原、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD5、CD11a、CD18、NGF、CD20、CD45、CD52、Ep-cam、其他癌細胞表面分子、TNF-α、TGF-b1、VEGF、其他細胞激素、α4β7整合素、IgEs、病毒蛋白(例如巨細胞病毒)。可使用本發明之組合物及方法產生之抗體之實例包括(但不限於)抗TNFα抗體、抗IL-12抗體、抗IL-18抗體及抗EPO受體(EPO-R)抗體。在一個實施例中，抗TNFα抗體為完全人類抗TNFα抗體，例如阿達木單抗/D2E7(參見美國專利第6,090,382號，以引用的方式併入本文中；;Abbott Laboratories)。在一個實施例中，抗IL-12抗體為完全人類抗IL-12抗體，例如ABT-874(Abbott Laboratories；參見美國專利第6,914,128號，以引用的方式併入本文中)。在一個實施例中，抗IL-18抗體為完全人類IL-18抗體(例如ABT-325)，例如亦參見US20050147610 A1中所述之抗體，以引用的方式併入本文中。在一個實施例中，抗EPO/R(亦稱為ABT-007)抗體為完全人類抗體，如美國專利公開案第US 20060018902 A1號中所述者，以引用的方式併入本文中。
此外，載體中所編碼之恆定區亦可用於將一個恆定區(例如Fc域)可操作地連接至一種蛋白質以形成融合蛋白，例如Fc融合蛋白。因此，可使用本發明之方法及組合物產生之蛋白質類型之另一實例包括融合蛋白。該等融合蛋白之實例包括表現為與免疫球蛋白分子之一部分融合的蛋白質，表現為與拉鏈部分融合的蛋白質，及新穎多功能蛋白質，諸如細胞激素與生長因子之融合蛋白(亦即GM-CSF與IL-3、MGF與IL-3)。WO 93/08207及WO 96/40918描述稱為CD40L之分子之各種可溶性寡聚形式(分別包括免疫球蛋白融合蛋白及拉鏈融合蛋白)之製備；其中所述之技術適用於其他蛋白質。另一融合蛋白為重組TNFR:Fc，亦稱為依那西普(entanercept)。依那西普(或；Amgen/Wyeth)為p75 TNFα受體胞外部分之兩個分子的二聚體，各分子由一種與人類IgGl之232個胺基酸的Fc部分融合之235個胺基酸的TNFR衍生多肽組成。實際上，任何分子均可表現為融合蛋白，該分子包括(但不限於)細胞受體分子之胞外域、酶、激素、細胞激素、免疫球蛋白分子之一部分、拉鏈域及抗原決定基。
測定核酸及胺基酸"序列一致性"之技術亦為此項技術中已知。一般而言，該等技術包括測定基因之mRNA的核苷酸序列且/或測定由此編碼之胺基酸序列，及將該等序列與第二核苷酸或胺基酸序列對比。一般而言，"一致性"係指兩個聚核苷酸或多肽序列各自之核苷酸與核苷酸或胺基酸與胺基酸確切對應性。兩個或兩個以上序列(聚核苷酸或胺基酸)可藉由測定其"一致性百分比"加以對比。兩個序列(無論為核酸或為胺基酸序列)之一致性百分比為兩個比對序列之間的確切匹配數除以較短序列之長度且乘以100。核酸序列之近似比對由Smith及Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)之局部同源算法(local homology algorithm)提供。該算法可藉由使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure,M. O. Dayhoff編，5(增刊)，3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA開發且由Gribskov,Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763(1986)標準化之記分矩陣(scoring matrix)而應用於胺基酸序列。Genetics Computer Group(Madison,Wis)在"BestFit"實用性(utility application)中提供該算法測定序列之一致性百分比的例示性實施例。該方法之預設參數描述於Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，第8版(1995)(可購自Genetics Computer Group,Madison,Wis)中。在本發明之上下文中確定一致性百分比之較佳方法為使用愛丁堡大學(University of Edinburgh)擁有版權、由John F. Collins及Shane S. Sturrok開發且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,Calif)經銷的MPSRCH程式包。根據該套程式包，可採用Smith Waterman算法，其中將預設參數用於記分表(例如，間隙空位罰分12分，間隙擴展罰分1分，而一間隙為6分)。根據所產生之數據，"匹配"值反映"序列一致性"。用於計算序列之間的一致性或類似性百分比之其他合適程式通常為此項技術中所已知。
如本文所述，認為兩個核酸片段可"選擇性雜交"。兩個核酸分子之間的序列一致性程度影響該等分子之間的雜交事件之效率及強度。部分一致之核酸序列將會至少部分抑制完全一致之序列與標靶分子雜交。對完全一致序列雜交之抑制可使用此項技術中所熟知之雜交檢定法(例如南方墨點法(Southern blot)、北方墨點法(Northern blot)、溶液雜交法或其類似方法，參見Sambrook等人，1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York；或Ausubel等人(編)，Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1997))評定。該等檢定可使用不同選擇性程度進行，例如使用自低嚴格度至高嚴格度不等之條件。若採用低嚴格度條件，則可使用甚至缺乏部分序列一致性程度的第二探針(例如，與標靶分子具有小於約30%序列一致性的探針)來評定是否存在非特異性結合，使得在不存在非特異性結合事件的情況下，第二探針不會與標靶雜交。
若使用基於雜交之偵測系統，則選擇與標靶核酸序列互補之核酸探針，且隨後藉由選擇適當的條件使該探針與標靶序列彼此"選擇性雜交"或結合以形成雜交分子。能夠在"中等嚴格度"下與標靶序列選擇性雜交之核酸分子通常在使得可偵測長度為至少約10-14個核苷酸、與所選核酸探針之序列具有至少約70%序列一致性之標靶核酸序列的條件下雜交。嚴格雜交條件通常使得可偵測長度為至少約10-14個核苷酸、與所選核酸探針序列具有大於約90-95%序列一致性的標靶核酸序列。適用於探針與標靶具有特定序列一致性程度的探針/標靶雜交之雜交條件可如此項技術中所已知(參見(例如)Nucleic Acid Hybridization： A Practical Approach,B. D. Hames及S. J. Higgins編，(1985)Oxford； Washington, D. C. ； IRL Press)進行確定。
對於雜交之嚴格度條件，在此項技術中眾所周知，可藉由改變(例如)以下因素：探針及標靶序列之長度及性質、各種序列之鹼基組成、鹽及其他雜交溶液組份之濃度、雜交溶液中阻斷劑或清潔劑之存在與否(例如甲醯胺、硫酸葡聚糖及聚乙二醇及十二烷基硫酸鈉)、雜交反應溫度及時間參數，以及不同洗滌條件，而採用諸多相等條件來建立特定嚴格度。特定雜交條件組之選擇係根據此項技術中之標準方法(參見(例如)，Sambrook等人，前述，或Ausubel等人，前述)選擇。第一聚核苷酸若與第二聚核苷酸、其cDNA、其互補序列之區域具有相同或大體上相同之鹼基對序列，或若其呈現上述序列一致性，則係"衍生自"該第二聚核苷酸。第一多肽若(i)由衍生自第二聚核苷酸之第一聚核苷酸編碼，或(ii)與第二多肽呈現上述序列一致性，則係"衍生自"該第二多肽。
本發明亦提供一種在合適容器(諸如小瓶)中含有本發明之一或多個載體的套組。該等表現載體可含有至少一個選殖位點以用於插入所選關注序列，或可具有已存在於載體中的特定所關注基因。該載體可以脫水或凍乾形式或水溶液形式提供。該套組可包括將脫水聚核苷酸復水之緩衝液。套組中可包括其他試劑，例如反應緩衝液、用於對比之陽性及陰性對照載體。一般而言，套組亦包括使用其中之試劑的說明書。
III.本發明載體之用途
本發明包括使用本文所述之載體表現蛋白質之方法。因此，本發明包括一種產生重組蛋白之方法，其包含將本發明之表現載體引入哺乳動物宿主細胞中，在合適條件下培養該哺乳動物宿主細胞以表現該蛋白，及回收該蛋白。本發明之載體的優點在於其使用哺乳動物細胞培養系統提供高蛋白質產量。
能夠經由本發明之核酸或表現載體基因表現之任何細胞類型均可用於本發明中作為宿主細胞。術語"宿主細胞"係指已以使用重組DNA技術建構之載體轉型之細胞。
一般熟習此項技術者可選擇最適合於經由本發明之載體表現GOI及可選標記基因的特定宿主細胞株。可用於本發明之細胞包括哺乳動物細胞及細胞株及由此衍生之細胞培養物。哺乳動物細胞(例如生殖細胞或體細胞)可來源於哺乳動物，諸如小鼠、大鼠或其他齧齒動物，或來源於靈長類，諸如人類或猴。應瞭解，原代細胞培養物或永生化細胞可用於執行本發明之技術。
在特定實施例中，細胞類型之來源為哺乳動物，包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)(例如DG44及DUXB11；Urlaub等人，Som. Cell Molec. Genet. 12:555,1986；Haynes等人，Nuc. Acid. Res. 11:687-706,1983；Lau等人，Mol. Cell. Biol. 4:1469-1475,1984；Methods in Enzymology,1991，第185卷，第537-566頁。Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.)、中國倉鼠纖維母細胞(例如R1610)、人類宮頸癌(例如HELA)、猴腎臟細胞株(例如CVI及COS)、鼠類纖維母細胞(例如BALBc/3T3)、鼠類骨髓瘤(P3×63-Ag3.653；NS0；SP2/O)、倉鼠腎臟細胞株(例如HAK)、鼠類L細胞(例如L-929)、人類淋巴細胞(例如RAJI)、人類腎臟(例如293及293T)。宿主細胞株通常可自市面購得(例如自BD Biosciences,Lexington,Ky.;Promega,Madison,Wis.;Life Technologies,Gaithersburg,Md)或可得自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,Va.)。
在一較佳實施例中，本發明中所用之宿主細胞提供對應於本發明之載體中所包括之至少一個複製起點的反式(intrans)複製起始因子。舉例而言，若載體包含相當於SV40起點及OriP起點之兩個複製起點，則可使用表現大T抗原或EBNA蛋白之任何細胞株，較佳為哺乳動物細胞株。在一實施例中，將載體轉型至COS細胞或人類胚胎腎(HEK)細胞中。舉例而言，COS7細胞衍生自由SV40之起點缺陷型突變體(Sigma-Aldrich)轉型之CV-1猿猴細胞。可(例如)藉由使用HEK-293-6E細胞提供EBNA。
基因組內具有穩定整合之複製起始因子的細胞株具有穩定長期表現複製起始因子及持久支持含複製起點之質體之複製及維持的優點。表現EBNA-1之市售細胞株之實例為ATCC：293HEK-EBNA1及CV1-EBNA1。過表現至少一個複製起始因子，較佳EBNA1蛋白或SV40大T抗原之特定細胞株可藉由轉染及選擇穩定細胞純系而產生。
可藉由此項技術中所熟知之各種技術(參見(例如)Ridgway,1973,Vectors:Mammalian Expression Vectors，第24.2章，第470-472頁，Rodriguez及Denhardt編，Butterworths,Boston,Mass.；Graham等人，1973,Virology 52:456；Sambrook等人，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York；Davis等人，1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；及Chu等人，1981,Gene 13:197)將核酸及表現載體引入或轉型至適當的宿主細胞中。術語"轉型"與"轉染"及其合乎語法之變體在本文中可互換使用,且係指細胞藉由任何可行方式吸收外來DNA。當外源核酸已引入細胞膜之內時，細胞已經"轉型"。無論實現吸收之方式為何，對核酸之吸收產生穩定轉染物，該吸收方式可包括轉染(包括電穿孔)、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、以包膜DNA進行細胞融合、顯微注射及以完整病毒感染。甚至大於正常量之瞬時表現亦適用於功能研究或適用於產生及回收所關注蛋白質。使轉型細胞在適合於產生所關注蛋白質(例如在一實施例中，為抗體重鏈及/或輕鏈)之條件下生長，且執行檢定以鑑別經編碼之所關注多肽。鑑別及定量基因產物之例示性檢定技術包括酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)或螢光活化細胞分選分析(FACS)、免疫組織化學及其類似技術。
本發明中所用之細胞可根據標準細胞培養技術培養，例如可將其固定於固體表面或以懸浮形式生長於適當的營養培養基中。
本發明亦涵蓋包含本文所述之載體的哺乳動物宿主細胞。
除非另有所述，否則本發明之實踐使用分子生物學及其類似領域之習知技術，該等技術屬於此項技術之技能範疇內。該等技術在文獻中充分說明。參見(例如)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(J. Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Current Protocols in Molecular Biology(F. Ausubel等人編，1987年修訂)；Essential Molecular Biology(T. Brown編，IRL Press 1991)；Gene Expression Technology(Goeddel編，Academic Press 1991)；Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(A. Bothwell等人編，Bartlett Publ. 1990)；Gene Transfer and Expression(M. Kriegler, Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology(R. Wu等人編，Academic Press 1989)；PCR:A Practical Approach(M. McPherson等人，IRL Press at Oxford University Press 1991)；Oligonucleotide Synthesis(M. Gait編，1984)；Cell Culture for Biochemists(R. Adams編，Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. Miller及M. Calos編，1987)；Mammalian Cell Biotechnology(M. Butler編，1991)；Animal Cell Culture (J. Pollard等人編，Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells,2(增刊版)(R. Freshney等人編，Alan R. Liss 1987)；Flow Cytometry and sorting(M. Melamed等人編，Wiley-Liss 1990)；the series Methods in Enzymology (Academic Press,Inc.)；及Animal Cell Culture(R. Freshney編，IRL Press 1987)；及Wirth M.與Hauser H.(1993)Genetic Engineering of Animal Cells,Biotechnology第2卷Puhler A(編)VCH,Weinhcim 663-744。
例證
以下實例說明消除為不同哺乳動物宿主細胞(例如COS7及HEK-293-6E細胞)建構獨立載體之需要的創新解決方案。以下實例亦提供含有編碼抗體恆定區之核酸的載體，以用於表現抗體之完整輕鏈或重鏈或表現Fc融合蛋白。
藉由組合來自各種其他載體(亦即pBOS及pTT3載體)的所選特徵建構兩個稱為pHyb-C及pHyb-E之新載體骨架(參見美國臨時申請案第60/878,165號、2007年12月28日申請之題為"DUAL-SPECIFIC IL-1A/IL-1b ANTIBODIES"之國際申請案第PCT/US2007/26482號及USSN 12/006,068，該等案全部係以引用的方式併入本文中)。對照載體pBOS含有與所關注基因之插入位點操作性連接之EF-1α啟動子，且帶有SV40複製起點。對照載體pTT3含有與所關注基因之插入位點操作性連接之CMV啟動子，及EBNA複製起點(OriP)。
藉由評估小鼠BR3-Fc融合物與人類抗體(阿達木單抗)在COS7與HEK-293-6E細胞中之蛋白質表現測試本發明之載體。COS7及HEK-293-6E細胞中成功之蛋白質表現展示用於在兩種細胞類型中重組表現之統一載體系統。
實例1：載體pHybC及pHybE之建構
圖1及圖2提供新載體之圖譜，該等載體各含有兩個複製起點。圖1及圖2呈現"空"型式載體，亦即該等載體不含有所關注基因或抗體恆定區之核酸(以下在實例4中進行更詳細描述)。pHybC含有與所關注基因之插入位點操作性連接之CMV啟動子，而pHybE含有EF-1α啟動子。
為建構pHybC-mBR3-Fc("mBR3"係指鼠類型式之第三BLyS受體，且如本文中所用特別指mBR3蛋白之胞外域(ECD)部分的編碼序列)，以在擴增DNA片段之5'及3'端處引入PspX I限制性位點的引子PCR擴增pEF-BOS載體之SV40複製起點區。隨後以PspX I消化此插入片段。將CMV啟動子上游具有Sal I限制性位點之pTT3-mBR3-Fc構築體以Sal I消化。隨後，將Psp X I消化之插入片段接合至pTT3-mBR3-Fc之Sal I位點以產生pHybC-mBR3-Fc載體。
藉由首先經由mBR3胞外域PCR擴增含有SV40複製起點區之5'端PspX I修飾DNA片段來產生pHybE-mBR3-Fc構築體。隨後將該產物在5'端由PspX I消化且在3'端由Bsp68 I消化，其在mBR3胞外域序列上游之前導序列中具有一位點。隨後將該消化片段次選殖於經Sal I及Bsp68 I消化之pTT3-mBR3-Fc構築體中以產生pHybE-mBR3-Fc構築體。
pHybC-mBR3-Fc及pHybE-mBR3-Fc(其各自表現受體-Fc融合蛋白mBR3-Fc)之圖譜可見於圖8及圖9中。
將表現D2E7抗體(阿達木單抗)之輕鏈蛋白的pHybC-E7載體類似地建構為pHybC-mBR3-Fc，亦即藉由將於產生pHybC-mBR3-Fc(上述)期間所分離及消化之相同的PspX I消化SV40 Ori區接合於以Sal I預消化的先前建構之pTT3-E7載體中。
為建構pHybE-E7載體，藉由以Hind III及BSiW I限制酶消化預先存在之pBOS-E7載體而產生插入片段。隨後將該插入片段接合至以相同酶預消化之pHybC-E7載體中以產生pHybE-E7而用於表現D2E7輕鏈蛋白。
為建構pHybC-D2及pHybE-D2載體，藉由以Bsp68 I及Not I限制酶消化預先存在之pTT3-D2載體而產生由D2E7抗體(阿達木單抗)之重鏈可變區及恆定區之編碼區組成的插入片段(亦即D2重鏈編碼序列)。將該插入片段接合至以相同酶預消化之pHybC-mBR3-Fc及pHybE-mBR3-Fc載體中以分別產生pHybC-D2及pHybE-D2而用於表現D2E7抗體(阿達木單抗)之重鏈蛋白。
實例2：蛋白質產率之對比
為判定隨添加兩個複製起點而引起載體尺寸增加是否影響載體產生蛋白質，將上述pHyb-E及pHyb-C載體與各自僅含有一個複製起點之對照載體pBOS及pTT3對比。為對比pBOS、pTT3、pHyb-C及pHyb-E所達成之表現，將小鼠BAFF受體-人類Fc融合蛋白構築體(mBR3-Fc)次選殖於四種載體骨架中且藉由無內毒素DNA製備套組(endo-free DNA prep kit)並行製備。
將含有mBR3-Fc序列之四種載體電穿孔於COS細胞中或轉染於HEK-293-6E細胞中(下述方案)。將細胞培育五或七日。採集培養基樣品且量測培養基中mBR3-Fc分泌之蛋白質之濃度。對於COS7細胞5日之後，而對於HEK-293-6E細胞7日之後，自條件化培養基(conditioned media)藉由IgG ELISA測定力價，且藉由IgG蛋白標準與mBR3-Fc蛋白之間的分子量差異進行調整。需要進行該力價調整以防止由於在ELISA中使用大得多之人類IgG蛋白作為標準而高估mBR3-Fc蛋白力價。
293轉染
實驗中所用之293瞬時轉染程序為Durocher等人(2002);Nucleic Acids Research 30(2):E9及Pham等人(2005);Biotechnology Bioengineering 90(3):332-44中所公開方法之改良。轉染中所用之試劑包括：
˙HEK 293-6E細胞(穩定表現EBNA1之人類胚胎腎細胞株；獲自National Research Council Canada)，係培養於設為130rpm、37℃及5% CO2 之濕潤恆溫箱中之拋棄式錐形瓶中。
˙培養基：FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen 12338-018)外加25μg/mL遺傳黴素(G418)(Invitrogen 10131-027)及0.1%泊洛尼克F-68(Pluronic F-68，Invitrogen 24040-032)。
˙轉染培養基：FreeStyle 293表現培養基外加10 mM HEPES(Invitrogen 15630-080)。
˙聚伸乙基亞胺(PEI)儲備液：1mg/mL無菌儲備溶液(pH 7.0)，係以線性25kDa PEI(Polysciences)製備且儲存於-15℃以下。
˙胰化蛋白補料培養基：5% w/v於FreeStyle 293表現培養基中之胰化蛋白N1(organotechnie,19554)無菌儲備液。
用於轉染之細胞製備：在轉染之前約2-4小時，藉由離心收集HEK 293-6E細胞且將其以每毫升約1百萬個活細胞之細胞密度再懸浮於培養基中。對於各轉染，將40mL細胞懸浮液轉移於拋棄式250mL錐形瓶中且培育2-4小時。
轉染：將轉染培養基及PEI儲備液預熱至室溫(RT)。對於各轉染，將25μg質體DNA及50μg聚伸乙基亞胺(PEI)組合於5mL轉染培養基中且在室溫下培育15-20分鐘以使得形成DNA:PEI複合物。對於BR3-Ig轉染，每次轉染使用25μg BR3-Ig質體。將每一5mL DNA:PEI複合混合物添加至40mL先前製備之培養物中且返回設為130rpm、37℃及5% CO2 之濕潤恆溫箱中。20-28小時之後，將5mL胰化蛋白補料培養基添加至各轉染物中且繼續培養六日。
COS7細胞轉染
如下使用標準電穿孔條件以每個構築體轉染兩個COS7 150mm平板。為進行COS7轉染實驗，將COS細胞培養於DMEM+10% FBS+1倍麩胺醯胺中。將一長滿細胞之(confluent)T-150燒瓶中的細胞用於電穿孔。將細胞胰蛋白酶化，且在加有血清之培養基中離心以使血清失活。隨後在1倍PBS中洗滌細胞。
對於各T-150，將顆粒(pellet)再懸浮於0.8ml電穿孔緩衝液中。COS電穿孔緩衝液包括20mM Hepes(或P3緩衝液)、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na2 HPO4 及6mM右旋糖。將電穿孔緩衝液調節至pH值為7.0且過濾滅菌。每一電穿孔使用60微克DNA(30μg各重鏈及輕鏈質體DNA或在Fc融合蛋白之情況下為60μg DNA)。將0.8ml細胞/緩衝液/DNA混合至各比色管(0.4cm之比色管(cuvette)-Biorad)。此外，一比色管僅提供緩衝液以用作空白。將比色管置於冰上。在250V及950μF下將細胞電穿孔15至25毫秒。隨後將比色管返回至冰上。將2個比色管之內容物轉移至一50ml含有20ml融合瘤SFM之錐形瓶中。使用10ml吸管打散團塊，且將其轉移至兩個150mm、各另外含有20ml培養基之組織培養皿中。於是各培養皿中之總培養基體積為30ml。隨後將培養皿在37℃、5% CO2 下培育三日。
將COS細胞條件化培養基(上清液)收集於50ml錐形管中且離心。離心之後，使用2微米(μm)過濾器過濾上清液。移出樣品進行ELISA分析。5日之後收集上清液且以標準IgG ELISA分析以測定其各自蛋白質產率。
分別在mBR3及阿達木單抗(D2E7)實驗中測試pBOS、pTT3、pHybC及pHybE型式之載體。
蛋白質測試
轉染後5日(COS7細胞)或7日(293-6E細胞)，使用ELISA及/或Poros A測試培養物上清液中之mBR3-Fc融合蛋白濃度。
結果
顯示對照及實驗轉染之蛋白質表現量的數據展示於圖3(COS細胞)及圖4(HEK-293細胞)中。圖3中之數據顯示pHybC與pHybE均在COS細胞中有效產生融合蛋白，其中兩種載體之表現量均高於對照載體pTT3。圖4中所示之數據顯示以pHyb-E轉染之HEK細胞的表現量超過以其他三個載體轉染所見之表現量，而pHyb-C蛋白質產生量與對照相當。因此，若pHyb-C與pHyb-E並不優於對照載體pTT3及pBOS，至少能夠與其一樣表現mBr3-Fc融合蛋白。
實例3：需要共轉染兩個DNA構築體之蛋白質產率的對比
將TNFα之人類IgGl/κ單株抗體(阿達木單抗)/D2E7次選殖於四種載體骨架中且藉由無內毒素DNA製備套組並行製備。
將含有表現阿達木單抗之序列的四種載體電穿孔於COS細胞中；使用聚(伸乙基亞胺)(PEI)轉染HEK-293-6E細胞。
所用293瞬時轉染程序與實例3中所述之程序相同，阿達木單抗轉染除外，其中每一轉染使用10μg D2E7重鏈(稱為"D2")質體及15μg D2E7輕鏈(稱為"E7")質體。
如上所述執行COS7轉染實驗，其例外為每一平板轉染使用30μg之各重鏈及輕鏈載體。
轉染後7日使用ELISA及/或Poros A測試培養物上清液中之阿達木單抗抗體濃度。對於COS7細胞5日之後而對於HEK-293-6E細胞7日之後，自條件化培養基藉由IgG ELISA測定力價。
顯示對照及實驗轉染之蛋白質表現量的數據展示於圖5(HEK-293細胞)及圖6(COS細胞)中。圖5中之數據顯示pHybC與pHybE骨架載體均能夠產生多於對照載體pBOS之阿達木單抗，且能夠產生與對照載體pTT3相當(pHybC)或更大(pHybE)之量(Durocher,Y.等人Nucleic Acids Res. 30:E9(2002))。類似地，圖6中之數據顯示pHybC與pHybE骨架載體均能夠產生多於對照載體pTT3之蛋白質，且能夠產生與對照載體pBOS相當量之蛋白質。
實例4：pHyb-E抗體恆定區載體之建構
為有利於產生可用於使用新pHyb-E載體骨架產生抗體之載體，產生一組12種不同重鏈及輕鏈載體(表2及表3中提供概述)。建構12種使得人類IgG與小鼠IgG均可表現之母模板pHybE載體。
為產生圖14-25中所述之載體，將6123bp之SrfI/NotI片段自pHybE-填充片段-hCg1,Z,a(pJP167)分離，且與pBOS載體之由信號肽編碼區、λ填充片段及恆定區編碼區組成之SrfI/NotI限制片段接合。為產生SrfI/NotI限制片段，執行SrfI/NotI限制消化以產生由信號肽編碼區、λ填充片段及恆定區編碼區(對於恆定區序列，參見表1)組成之插入片段。該等片段係衍生自己建構為pEF-BOS質體DNA之pBOS母模板(參見Mizushima,S.及Nagata,S. Nucleic Acids Res. 18:5322(1990)；亦描述於美國臨時申請案第60/878165號、2007年12月28日申請之題為"DUAL-SPECIFIC IL-1A/IL-1b ANTIBODIES"的國際申請案第PCT/US2007/026482號及USSN 12/006,068中，該等案係以引用的方式併入本文中)。pHybE-hCl構築體之插入片段首先藉由重疊PCR修飾，以在J區之3'端處產生AfeI限制性位點而有利於選殖於該載體中。將所有插入片段接合至以SrfI及NotI預消化之先前驗證序列之pHyBE構築體中以產生以下載體。
隨後將含恆定區之新載體對小鼠及人類抗體恆定區進行序列確認(參見SEQ ID NO:3-32)。
表2及表3中所述之載體均具有可由可變區序列換出之(λ噬菌體DNA的)約1kb"填充片段"序列。該等新母載體亦恰在Srf I位點上游含有一新Swa I限制性位點。該新SwaI位點適用於將pHyb-E之抗體開放閱讀框架轉移至亦使用Swa I位點用於選殖目的之其他表現載體(諸如CHO表現載體)中。除替代性選殖位點之靈活性以外，該等載體亦與現有pBOS、pTT3及CHO載體反向相容(backward compatible)。
如圖7中所示，COS7細胞中之初步轉染數據顯示當與無該額外Swa I位點之構築體(v2載體)相比時，該額外Swa I位點(v1載體)對阿達木單抗表現量無顯著影響。
總結：
實例1-4中所述之先前實驗顯示pHyb-C及pHyb-E載體在一種以上細胞株中發揮功能，同時提供通常超過使用原有pBOS及pTT3載體可見之表現量的大量蛋白質表現。該升高之表現在使用pHyb-E載體在HEK-293-6E細胞中表現低產mBR3-Fc融合蛋白時尤其顯著。如由該等數據所示，pHyb-C及pHyb-E載體在載體技術方面呈現優於先前所用載體之顯著進步。
相等物
熟習此項技術者將會認識到或者能夠僅僅使用常規實驗確定本文所述之本發明之特定實施例的多種相等物。該等相等物意欲由以下申請專利範圍包涵。
以引用的方式併入
在整個本申請案中可能引用之所有所引用參考文獻(包括參考文獻、專利、專利申請案及網站)以及其中所引用之參考文獻之內容的全文係以引用的方式出於任何目的明確地併入本文中。除非另有所述，否則本發明之實踐將使用免疫學、分子生物學、細胞生物學及藥物製備及傳遞之習知技術，該等技術為此項技術中所熟知。該等技術包括(但不限於)以下公開案中所述之技術：
圖1展示空pHyb-C載體之圖譜。特徵包括SV40真核複製起點、巨細胞病毒真核表現啟動子(pCMV)、三聯前導序列(TPL)、剪接供體位點(SD)、腺病毒主要晚期強化子元件(enh MLP)、剪接受體位點(SA)、後面為poly A信號(pA)之所關注基因之開放閱讀框架(ORF)區、二重對稱元件(DS)、愛巴病毒衍生真核複製起點(OriP)、重複區(FR)、胺苄西林抗性標記(AmpR)及細菌複製起點(pMBlori)。
圖2展示空pHyb-E載體之圖譜。特徵包括SV-40真核複製起點、EF-1a真核啟動子、後面為poly A信號(pA)之所關注基因之開放閱讀框架(ORF)區、二重對稱元件(DS)、愛巴病毒衍生真核複製起點(OriP)、重複區(FR)、胺苄西林抗性標記(AmpR)及細菌複製起點(pMB1ori)。
圖3展示經由以pBOS、pTT3、pHybC及pHybE載體電穿孔轉染之COS細胞所產生的重組Fc融合蛋白力價。
圖4展示使用PEI以pBOS、pTT3、pHybC及pHybE載體轉染之HEK-293-6E細胞所產生的重組Fc融合蛋白力價。
圖5展示使用PEI以經建構以表現IgG抗體之pBOS、pTT3、pHybC及pHybE載體轉染的HEK-293-6E細胞所產生的抗體力價。
圖6展示經由以經建構以表現IgG抗體之pBOS、pTT3、pHybC及pHybE載體電穿孔轉染的COS所產生的抗體力價。
圖7展示經由以表現IgG抗體之pHyb-E-SwaI(v1)或pHyb-E(v2)載體構築體電穿孔轉染的COS所產生的抗體力價。
圖8展示pHybC-mBR3-mCg2a載體(亦稱為"pHybC-mBR3-Fc")之圖譜。
圖9展示pHybE-mBR3-mCg2a載體(亦稱為"pHybE-mBR3-Fc")之圖譜。
圖10展示pHybC-E7-hCk載體(亦稱為"pHybC-E7")之圖譜。
圖11展示pHybC-D2-hCgl,z,a載體(亦稱為"pHybC-D2")之圖譜。
圖12展示pHybE-D2-hCgl,z,a載體(亦稱為"pHybE-D2")之圖譜。
圖13展示pHybE-E7-hCk載體(亦稱為"pHybE-E7")之圖譜。
圖14展示pHybE-hCg1,z，a V2(亦稱為"pJP182")之圖譜。
圖15展示pHybE-hCg1,z,non-a V2(亦稱為"pJP183")之圖譜。
圖16展示pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235)V2(亦稱為"pJP184")之圖譜。
圖17展示pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)V2(亦稱為"pJP185")之圖譜。
圖18展示pHybE-hCg2,n+V2(亦稱為"pJP186")之圖譜。
圖19展示pHybE-hCg2,n-V2(亦稱為"pJP187")之圖譜。
圖20展示pHybE-hCg4 V2(亦稱為"pJP188")之圖譜。
圖21展示pHybE-mCg1 V2(亦稱為"pJP189")之圖譜。
圖22展示pHybE-mCg2a V2(亦稱為"pJP190")之圖譜。
圖23展示pHybE-hCk V2(亦稱為"pJP191")之圖譜。
圖24展示pHybE-hC1 V2(亦稱為"pJP192")之圖譜。
圖25展示pHybE-mCk V2(亦稱為"pJP193")之圖譜。
(無元件符號說明)

Claims (30)

  1. 一種表現載體，其包含：(a)衍生自愛-巴病毒(Epstein-Barr virus,EBV)之OriP複製起點；(b)SV40複製起點；(c)用於插入所關注基因之插入位點；(d)包含與該插入位點操作性連接之SEQ ID NO：2之核苷酸76至1267的EF-1α啟動子；及視情況包含(e)編碼抗體重鏈或輕鏈恆定區之核酸序列，其操作性地連接於該插入位點，其中該OriP複製起點經非為該表現載體所編碼的反式作用(trans-acting)EBNA1複製起始因子所結合。
  2. 一種表現載體，其包含：(a)衍生自愛-巴病毒(Epstein-Barr virus,EBV)之OriP複製起點；(b)SV40複製起點；(c)用於插入所關注基因之插入位點；(d)包含與該插入位點操作性連接之SEQ ID NO：1之核苷酸1至608的巨細胞病毒(CMV)啟動子；及視情況包含(e)編碼抗體重鏈或輕鏈恆定區之核酸序列，其操作性地連接於該插入位點；其中該OriP複製起點經非為該表現載體所編碼的反式作用EBNA1複製起始因子所結合，或該SV40複製起點經非 為該表現載體所編碼的反式作用SV40T抗原所結合。
  3. 如請求項1或2之表現載體，其中該關注基因為抗體重鏈或輕鏈可變區。
  4. 如請求項3之表現載體，其中該抗體重鏈或輕鏈可變區係選自由鼠類、人類化、嵌合及人類者組成之群。
  5. 如請求項3之表現載體，其中該抗體重鏈可變區為選自由抗TNF-α抗體、抗IL-18抗體及抗IL-12抗體組成之群的抗體之重鏈可變區。
  6. 如請求項3之表現載體，其中該抗體輕鏈可變區為選自由抗TNF-α抗體、抗IL-18抗體及抗IL-12抗體組成之群的抗體之輕鏈可變區。
  7. 如請求項1或2之表現載體，其中該抗體重鏈恆定區為鼠類或人類者。
  8. 如請求項1或2之表現載體，其中該抗體重鏈恆定區係選自由γ1、z、a；γ1、z、non-a；γ2、n+；γ2、n-；及γ4組成之群。
  9. 如請求項8之表現載體，其中該γ1、z、non-a抗體重鏈恆定區另外在該重鏈恆定區之位置234(EU編碼系統)包含丙胺酸取代。
  10. 如請求項9之表現載體，其另外在該抗體重鏈恆定區之位置235或237(EU編碼系統)包含丙胺酸取代。
  11. 如請求項1或2之表現載體，其中該抗體輕鏈恆定區為人類κ同型或人類λ同型。
  12. 如請求項1或2之表現載體，其中該抗體重鏈恆定區為鼠 類γ1同型或鼠類γ2a同型。
  13. 如請求項1或2之表現載體，其中該抗體輕鏈恆定區為鼠類κ同型。
  14. 如請求項1或2之表現載體，其中該抗體重鏈恆定區為Fc域。
  15. 如請求項3之表現載體，其中該重鏈或輕鏈抗體可變區為該插入位點之5'端。
  16. 如請求項1或2之表現載體，其另外包含可選標記。
  17. 如請求項16之表現載體，其中該可選標記為胺苄西林(ampicillin)抗性基因。
  18. 如請求項1之表現載體，其中該EF-1α啟動子為人類者。
  19. 如請求項1或2之表現載體，其中該OriP複製起點包含SEQ ID NO：1之核苷酸1795至3545。
  20. 如請求項1或2之表現載體，其中該SV40複製起點包含SEQ ID NO：1之核苷酸5834至6140。
  21. 如請求項1之表現載體，其中該表現載體包含選自由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、31及32組成之群的核酸序列。
  22. 如請求項1之表現載體，其中該表現載體包含SEQ ID NO：2之核酸序列。
  23. 如請求項2之表現載體，其中該表現載體包含選自由SEQ ID NO：1、27、29及30組成之群的核酸序列。
  24. 如請求項2之表現載體，其中該表現載體包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
  25. 如請求項1或2之表現載體，其另外包含編碼信號肽之核酸序列。
  26. 一種套組，其包含如請求項1至25中任一項之表現載體。
  27. 一種經分離的哺乳動物宿主細胞，其包含如請求項1至25中任一項之表現載體。
  28. 如請求項27之經分離的哺乳動物宿主細胞，其為COS細胞或人類胚胎腎(HEK)細胞。
  29. 如請求項28之經分離的哺乳動物宿主細胞，其為COS7細胞或HEK-293-6E細胞。
  30. 一種產生重組蛋白之方法，其包含將如請求項1至25中任一項之表現載體引入經分離的哺乳動物宿主細胞中，該哺乳動物宿主細胞在適合條件下培養以表現該蛋白，及回收該蛋白。
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