KR20150038556A - ＴＮＦ-α 결합 단백질 - Google Patents

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tnf
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binding protein
antibody
human
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KR1020157005483A
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로렌조 베나투일
타리크 가유르
캐리 엘. 구드로
피터 씨. 아이작슨
요헨 잘펠트
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애브비 인코포레이티드
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Abstract

종양 괴사 인자-알파(TNF-α)(예, 사람 TNF-α)와 결합하는 분리된 결합 단백질(예, 항체 또는 이의 항원 결합 부분) 및 연관된 항체-기본 조성물 및 분자가 제공된다. 또한, 상기 항체를 포함한 약제학적 조성물뿐만 아니라 이 항체를 이용한 치료 및 진단 방법이 제공된다.

Description

ＴＮＦ-α 결합 단백질{TNF-α BINDING PROTEINS}
본원은 2010년 4월 7일에 출원된 미국가특허원 제61/321,633호에 대한 우선권을 주장하며, 이에 의해 이는 임의의 목적으로 이의 전체 내용이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 TNF-α 결합 단백질에 관한 것이고, 또한 본 발명은 급성 및 만성 면역 질환 (예, 류마티스성 관절염, 골 관절염, 건선, 다발성 경화증) 및 다른 자가 면역 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서의 TNF-α 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 분야에서는 TNF-α (종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자-알파, 종양 괴사 인자-α, TNF 및 카케틴으로도 명명된다)와 결합할 수 있는 개선된 항체를 필요로 한다. 한 실시형태에서, 항체는 TNF-α를 중화시킬 수 있다. 본 발명은 TNF-α와 결합할 수 있고, 고친화성으로 TNF-α와 결합할 수 있으며, TNF-α와 결합 및 중화시킬 수 있는 새로운 계열의 결합 단백질, CDR 접목 항체, 사람화 항체 및 이들의 단편을 제공한다.
본 발명은 TNF-α 결합 단백질, 특히 TNF-α와 결합하는 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 한 실시형태에서, TNF-α와 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 22 내지 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 사람 TNF-α와 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하는 사람화 결합 단백질을 제공하며, 상기 항원 결합 도메인은 서열번호 22의 잔기 31 내지 35; 서열번호 22의 잔기 50 내지 65; 서열번호 22의 98 내지 106; 서열번호 23의 잔기 24 내지 34; 서열번호 23의 잔기 50 내지 56; 및 서열번호 23의 잔기 89 내지 97로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함하고, 여기서 상기 결합 단백질은 사람 수용체 골격을 포함한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은 3개 이상의 CDR들을 포함하며, 예를 들어 (a) 서열번호 22의 잔기 31 내지 35; 서열번호 22의 잔기 50 내지 65; 및 서열번호 22의 잔기 98 내지 106; 및 (b) 서열번호 23의 잔기 24 내지 34; 서열번호 23의 잔기 50 내지 56; 및 서열번호 23의 잔기 89 내지 97로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 도메인 CDR 세트를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 22의 잔기 31 내지 35; 서열번호 22의 잔기 50 내지 65; 서열번호 22의 잔기 98 내지 106; 서열번호 23의 잔기 24 내지 34; 서열번호 23의 잔기 50 내지 56; 및 서열번호 23의 잔기 89 내지 97을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 예를 들어 서열번호 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 예를 들어 서열번호 26, 27, 34, 35 및 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 VH 영역과 VL 영역을 포함하며, 예를 들면, 여기서 VH 영역은 서열번호 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호 26, 27, 34, 35 및 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 사람 수용체 골격은 서열번호 6 내지 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 수용체 골격은 서열번호 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 사람 수용체 골격은 하나 이상의 골격 영역 아미노산 치환을 포함하며, 상기 골격의 상기 아미노산 서열은 사람 수용체 골격의 서열과 65% 이상 동일하고 사람 수용체 골격과 동일한 70개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 실시형태에서, 사람 수용체 골격은 핵심 잔기에서 하나 이상의 골격 영역 아미노산 치환을 포함하며, 상기 핵심 잔기는 CDR에 인접한 잔기; 당화 부위 잔기; 희귀 잔기; 사람 TNF-α와 상호작용할 수 있는 잔기; CDR과 상호작용할 수 있는 잔기; 정규 잔기; 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기, 버니어 구역내 잔기; 및 초티아-정의된 가변 중쇄 CDR1 또는 캐뱃-정의된 제1중쇄 골격 사이의 중첩 영역의 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 핵심 잔기는 H1, H12, H24, H27, H29, H37, H48, H49, H67, H71, H73, H76, H78, L13, L43, L58, L70 및 L80으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, VH 돌연변이는 Q1E, I12V, A24V, G27F, I29L, V29F, F29L, I37V, I48L, V48L, S49G, V67L, F67L, V71K, R71K, T73N, N76S, L78I, 및 F78I로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, VL 돌연변이는 V13L, A43S, I58V, E70D, 및 S80P로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은 2개의 가변 도메인을 포함하며, 이들 2개의 가변 도메인은 서열번호 24와 서열번호 26; 서열번호 24와 서열번호 27; 서열번호 25와 서열번호 26; 및 서열번호 25와 서열번호 27로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시형태에서, 결합 단백질은 TNF-α와 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 TNF-α의 생물학적 기능을 조절한다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 TNF-α를 중화시킨다. 또 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 TNF-α가 이의 수용체와 결합하는 능력을 감소시키고, 예를 들면, 결합 단백질은 사람 TNF-α, 성숙-사람 TNF-α, 또는 절두된-사람 TNF-α가 이의 수용체와 결합하는 능력을 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 TNF-의존성 사이토카인 생성; TNF-의존성 세포 살해; TNF-의존성 염증, TNF-의존성 골 침식; 및 TNF-의존성 연골 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 TNF-α 생물학적 활성을 감소시킨다.
한 실시형태에서, 결합 단백질은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바 약 102M-1s-1 이상; 약 103M-1s-1 이상; 약 104M-1s-1 이상; 약 105M-1s-1 이상; 및 약 106M-1s-1 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 정반응 상수(Kon)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바 약 10-3s-1 이하; 약 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하; 및 약 10-6s-1 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택된 역반응 상수 (Koff)를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 약 10-7 M 이하; 약 10-8 M 이하; 약 10-9 M 이하; 약 10-10 M 이하; 약 10-11 M 이하; 약 10-12 M 이하; 및 약 10-13 M 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택된 해리 상수 (KD)를 갖는다.
한 실시형태에서, 결합 단백질은 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgA 불변 도메인, 및 사람 IgE 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄 면역글로불린 불변 영역 도메인은 사람 IgG1 불변 도메인이다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 추가로 사람 Ig 카파 불변 도메인 및 사람 Ig 람다 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 결합 도메인은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 IgG1 불변 도메인은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 경쇄 면역글로불린 불변 영역 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 사람 Ig 카파 불변 도메인이다. 또 다른 실시형태에서, 경쇄 면역글로불린 불변 영역 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 사람 Ig 람다 불변 도메인이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Ig 불변 중쇄 영역; 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Ig 불변 경쇄 영역; 서열번호 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Ig 가변 중쇄 영역; 및 서열번호 26, 27, 34, 35 및 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Ig 가변 경쇄 영역을 포함하는, 사람 TNF-α와 결합할 수 있는 결합 단백질을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 면역글로불린 분자, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, 모노클로날 항체, scFv, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, CDR-접목 (grafted) 항체, 디아바디 (diabody), 사람화 항체, 다중 특이적 항체, Fab, 이중 특이적 항체, Fab' 단편, 이특이적 항체, F(ab')2 단편, DVD-IgTM, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편, VH와 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, dAb 단편, 분리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 단일쇄 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 결합 단백질을 포함하는 결정화된 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질이 결정 형태인 결정화된 결합 단백질을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 결정은 담체-비함유 약제학적 제어 방출 결정이다. 다른 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 상기 결합 단백질의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 생물학적 활성을 유지한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 결정화된 결합 단백질과 성분 (ingredient)을 포함하는 제형; 및 (b) 적어도 하나의 고분자 담체를 포함하는, TNF-α 결합 단백질의 방출을 위한 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 고분자 담체는 폴리아크릴산, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리아미노산, 폴리무수물, 폴리뎁시펩타이드, 폴리에스테르, 폴리락트산, 폴리락트산-코-글리콜산, 폴리b-하이드록시부티레이트, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리에틸렌글리콜, 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리오르가노포스파젠, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 말레산 무수물-알킬비닐에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알우론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화폴리사카라이드, 및 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체이다. 다른 실시형태에서, 상기 성분은 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌글리콜 및 폴리에티렌글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 TNF-α 결합 단백질, 및 링커와 면역글로불린 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함하는 TNF-α 결합 단백질 작제물을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 사람 당화 패턴을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 결합 단백질 작제물은 결정화된 TNF-α 결합 단백질 작제물이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 결정화된 TNF-α 결합 단백질 작제물은 담체-비함유 약제학적 제어 방출 TNF-α 결합 단백질 작제물이다. 특정 실시형태에서, 상기 TNF-α 결합 단백질 작제물은 상기 결합 단백질 작제물의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질 작제물은 생물학적 활성을 유지한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 TNF-α 결합 단백질 작제물을 포함하고 추가로 면역흡착 분자, 조영제, 치료제 및 세포독성제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제 (agent)를 포함하는, TNF-α 결합 단백질 접합체를 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 방사성 표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생체 발광 표지, 자성 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조영제이다. 한 실시형태에서, 조영제는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방사성 표지이다. 다른 실시형태에서, 상기 제제는 항대사물, 알킬화제, 항생물질, 성장 인자, 사이토카인, 혈관 생성 억제제, 유사분열 억제제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스 유발제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료제 또는 세포독성제이다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 결합 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시형태에서, 벡터는 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, 및 pBJ로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 (예, 이. 콜라이)이다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 세포 (예, 원생동물 세포), 동물 세포, 식물 세포 또는 진균 세포이다. 다른 실시형태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 동물 세포이다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, 효모 세포 (예, 사카로마이세스 세레비지애), 또는 곤충 Sf9 세포이다.
다른 양상에서, 본 발명은 TNF-α와 결합하는 결합 단백질을 생성하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, TNF-α와 결합하는 단백질을 제조하는 방법뿐만 아니라 상기 방법에 의해 생성된 TNF-α 결합 단백질을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 유용한 보조제로서 기능한다. 다른 실시형태에서, 보조제는 하이알루로니다제이다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물을 추가로 TNF-α 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어 치료제, 조영제, 세포독성제, 혈관형성 억제제, 키나제 억제제, 동시-투여 분자 차단제, 흡착 분자 차단제, 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 표지, 검출가능한 리포터, TNF-α 길항제, 항류머티즘제, 근육 이완제, 최면제 (narcotic), 비-스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제, 항우울제, 항정신병제, 각성제, 천식 의약, 베타 효능제, 스테로이드 흡입제, 스테로이드 경구제, 에피네프린 또는 이의 유사체, 사이토카인 및 사이토카인 길항제를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 포유동물에게 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 사람 TNF-α를 본 발명의 결합 단백질과 접촉시켜 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 사람 대상체에게 본 발명의 결합 단백질을 투여하여 사람 대상체의 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, TNF-α 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 사람 대상체에서 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 결합 단백질을 투여하여 치료를 달성하는 단계를 포함하는, TNF-α 활성이 유해한 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 사람 IL-12와 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RAGE; 히스타민; 히스타민 수용체 차단제; 브라디키닌; IL-1 알파; IL-1 베타; VEGF; PLGF; 메토트렉세이트; 코르티코스테로이드; 글루코코르티코이드 수용체 조절제; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 비스테로이드성 소염제; 및 스클레로스틴으로 이루어진 그룹중에서 선택된 제2 제제의 투여 전에, 이러한 투여와 동시에 또는 이러한 투여 이후에 본 발명의 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, TNF-α가 유해한 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 장애는 호흡기 장애; 천식; 알레르기성 및 비알레르기성 천식; 감염으로 인한 천식; 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)의 감염으로 인한 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD); 기도 염증성 병태; 호산구 증가증; 섬유증 및 점액 과생성증; 낭포성 섬유증; 폐 섬유증; 아토피성 장애; 아토피성 피부염; 두드러기; 습진; 알레르기성 비염; 알레르기성 위장염; 피부 염증 및/또는 피부 자가면역 병태; 위장 기관의 염증 및/또는 자가면역 병태; 염증성 장 질환 (IBD); 궤양성 대장염; 크론병; 간의 염증 및/또는 자가면역 병태; 간경화; 간 섬유증; B형 및/또는 C형 간염 바이러스에 의해 유발된 간 섬유증; 강피증; 종양 또는 암; 간세포 암종; 교모세포종; 림프종; 호지킨 림프종; 바이러스 감염; 세균 감염; 기생충 감염; HTLV-1 감염; 1차 방어 면역 반응의 발현 억제 및 백신접종 동안 1차 방어 면역 반응의 발현억제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 장애는 류마티스성 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 강피증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 죽상 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 질환, 제I형 다분비선 결핍증 및 제II형 다분비선 결핍증, 슈미트 증후군, 성인성 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 장병증성 활막염, 클라미디아증, 여시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽상 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리 (Royal Free) 질환, 만성 피부 점막 칸디다증, 거대세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증 (공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유화 폐포염, 후-염증성 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 복합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 미만성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염 (전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염 (항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능 저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발성 백혈구 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판상 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증 (모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증, 굿 파스튜어 증후군, 결절성 다발 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종증 자가면역 갑상선 기능 저하증 (하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알콜성 간경변, 알콜-유도 간 손상, 담즙 울혈 (choleostatis), 특이체질성 간 질환, 약물-유도 간염, 비-알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, B 그룹 스트렙토코씨 (streptococci) (GBS) 감염, 정신 장애 (예를 들어, 우울증 및 정신분열증), Th2 형 및 Th1 형 매개 질환, 급성 및 만성 통증 (상이한 형태의 통증), 및 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암 및 조혈 악성 종양 (백혈병 및 림프종), A베타 지단백혈증, 말단 청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병 (AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전증, 선암종, 공기 이소성 박동, AIDS 치매 합병증, 알콜-유도된 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-1-안티트립신 결핍, 근위축성 측색 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 변성, 항-CD3 치료요법, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 대동맥 및 말초 결찰증, 대동맥 해부, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥 누공, 운동실조증, 심방 세동 (지연 또는 발작성), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 각 차단 (bundle branch block), 버키트 림프종, 화상, 심장성 부정맥, 심장성 기절 증후군, 심장 종양, 심근증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼란 또는 다소성 심방 빈맥, 화학치료요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 알콜증, 만성 염증 병리, 만성 림프성 백혈병 (CLL), 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐심증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양 음성 패혈증, 낭 섬유증, 사이토킨 치료요법 관련 장애, 권투 선수 치매 (Dementia pugilistica), 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부염, 피부학적 병태, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환 (diabetic ateriosclerotic disease), 미만성 루이체 질환, 확장성 울혈성 심근증, 기저핵 장애, 중년 다운 증후군, CNS 도파민 수용체 차단 약물에 의해 유도된 약물-유도 운동 장애, 약물 감수성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 피부 홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드라이히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 장애, 진균류 패혈증, 가스 괴저병, 위궤양, 사구체신염, 임의의 기관 또는 조직의 이식편 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할러포르덴-스파츠 질환 (Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액 투석, 용혈성 요독 증후군/혈전성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, 간염 (A), 히스 다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환, 운동과다 운동장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동부족 운동장애, 시상하부-뇌하수체-부신축 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥의 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈 뇌졸중, 연소성 류마티스 관절염 (JRA), 연소성 척추 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라, 레슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 지방 부종, 간 이식 거부, 림프 부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌수막염, 수막염 균혈증, 대사성/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다중 시스템 장애, 복합 결합 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 변성 (멘첼 데제린-토마스, 샤이-드레거 및 마차도-요셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 아비움 감염증, 마이코박테리움 결핵, 골수 이형성 증후군, 심근 경색, 심근 허혈 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근육 위축증, 호중구 감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 지류 폐색, 폐색성 동맥 질환, OKT3® 치료요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관 복원 과정, 장기 비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부수종양성 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증 질환, 다년성 비염, 심막 질환, 말초 죽상 동맥경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 (다발 신경병증, 장기비대, 내분비병, 모노클로날 감마글로불린병증, 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 자간전증, 전진적 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료요법, 레이노드 현상 및 질환, 레이노드 질환, 레프섬 질환, 일반 협소 QRS 빈맥, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 강피증, 노인 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상 적혈구 빈혈, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수 운동실조, 척수소뇌 변성증, 스트렙토코커스 근염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 과민증, 전신 염증성 반응 증후군, 전신 개시 연소성 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관 확장증, 폐색성 혈전 혈관염, 혈소판 감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정 협심증, 요독증, 요로 패혈증, 두드러기, 심장 판막 질환, 하지 정맥, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균류 감염, 바이러스 뇌염/무균성 수막염, 바이러스-연관 혈구탐식 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군, 윌슨 질환, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식편 거부, 급성 관상 증후군, 급성 특발성 다발 신경염, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병증, 급성 허혈, 성인 스틸스 질환, 원형 탈모증, 과민증, 항-인지질 항체 증후군, 재생불량성 빈혈, 동맥경화증, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가면역 피부염, 스트렙토코커스 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가면역 장병증, 자가면역 청력 손실, 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS), 자가면역 심근염, 자가면역 미성숙 난소 부전증, 안건염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 재해성 항인지질 증후군, 셀리악 질환 (celiac disease), 경추 척추증, 만성 허혈, 반흔성 유천포창, 다발성 경화증에 대한 위험을 갖는 임상적으로 분리된 증후군 (CIS), 결막염, 유년기 개시형 정신 장애, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨 망막병증, 진성 당뇨병, 추간판 탈출증 (herniation), 추간판 내장증 (prolapse), 약물 유도 면역 용혈성 빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 상공막염, 다형 탈출 홍반, 중증 다형 홍반, 임신성 유천포창, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) (GBS), 건초열, 휴즈 증후군 (Hughes syndrome), 특발성 파킨슨 질환, 특발성 간질성 폐렴, IgE-매개 알레르기, 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염, 감염성 안구 염증 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 신장 질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성 각결막염, 쿠스마울 질환 또는 쿠스마울-마이어 질환, 란드리 마비, 랑게르한스 세포 조직구증, 망상 피반 (livedo reticularis), 황반 변성, 현미경적 혈관염, 강직성 척추염, 운동 뉴런 장애, 점막 유천포창, 다발성 기관 부전증, 중증 근무력증, 골수 이형성증, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비-A 비-B 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절 JRA, 말초 동맥 폐색성 질환 (PAOD), 말초 혈관 질환 (PVD), 말초 동맥 질환 (PAD), 정맥염, 결절성 다발 동맥염 (또는 결절성 동맥주위염), 다발 연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다수관절 JRA, 다발성 내분비 결핍 증후군, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통 (PMR), 펌프 후 증후군, 1차 파킨슨병, 전립선 및 직장암 및 조혈 악성 암종 (백혈병 및 림프종), 전립선염, 순수적혈구 무형성증, 1차 부신 부전증, 재발성 시신경 척수염, 재협착증, 류마티스성 심장 질환, 사포 (활막염, 여드름, 농포증, 과골증 및 골염), 강피증, 2차 아밀로이드증, 쇼크 폐, 공막염, 좌골신경통, 2차 부신 부전증, 실리콘 관련 결합 조직 질환, 스네돈-윌킨슨 (sneddon-wilkinson) 피부증, 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군 (SJS), 전신 염증 반응 증후군, 측두 동맥염, 톡소플라스마 망막염, 독성 표피 괴사용해, 횡단 척수염, TRAPS (종양 괴사 인자 수용체 관련 주기성 증후군), 1형 알레르기 반응, II형 당뇨병, 두드러기, 통상의 간질성 폐렴 (UIP), 혈관염, 춘계 결막염, 바이러스 망막염, 보그트-고야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군 (VKH 증후군), 습윤 황반 변성, 상처 치료, 여시니아 (yersinia) 및 살모넬라와 연관된 관절증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 TNF-α가 유해한 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 스테로이드 흡입제; 베타-효능제; 단기-작용성 또는 장기-작용성 베타-효능제; 류코트리엔 또는 류코트리엔 수용체의 길항제; ADVAIR; IgE 억제제; 항-IgE 항체; XOLAIR; 포스포디에스테라제 억제제; PDE4 억제제; 크산틴; 항콜린성 약물; 비만세포-안정화제; 크로몰린; IL-4 억제제; IL-5 억제제; 에오탁신/CCR3 억제제; 히스타민 또는 이의 수용체 (H1, H2, H3 및 H4 포함)의 길항제; 프로스타글란딘 D 또는 이의 수용체 DP1 및 CRTH2의 길항제; TNF 길항제; TNF 수용체의 가용성 단편; ENBREL; TNF 효소 길항제; TNF 전환 효소 (TACE) 억제제; 무스카린성 수용체 길항제; TGF-베타 길항제; 인터페론 감마; 페르페니돈; 화학치료요법제, 메토트렉세이트; 레플루노미드; 시롤리무스 (라파마이신) 또는 이의 유사체, CCI-779; COX2 또는 cPLA2 억제제; NSAID; 면역조절제; p38 억제제; TPL-2, MK-2 및 NFkB 억제제; 부데노시드; 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린; 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 산화방지제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1β 항체; 항-IL-6 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF 또는 PDGF의 항체 또는 작용제; CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이의 리간드의 항체; FK506; 라파마이신; 마이코페놀레이트 모페틸; 이부프로펜; 프레드니솔론; 포스포디에스테라제 억제제; 아데노신 작용제; 항혈전제; 보체 억제제; 교감신경 흥분제; IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제; IL-1β 전환효소 억제제; TNF-α 전환효소 억제제; T-세포 신호전달 억제제; 메탈로프로테이나제 억제제; 6-머캅토퓨린; 안지오텐신 전환효소 억제제; 가용성 사이토카인 수용체; 가용성 p55 TNF 수용체; 가용성 p75 TNF 수용체; sIL-1RI; sIL-1RII; sIL-6R; 소염성 사이토카인; IL-4; IL-10; IL-11; 및 TNF-β로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 물질의 투여 전에, 이러한 투여와 동시에 또는 이러한 투여 이후에 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉강내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 경구 점막, 설하, 비내 및 경피로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 방식에 의해 대상체에게 투여된다.
본 발명은 TNF-α (즉, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자-알파, 종양 괴사 인자-α, TNF, 카케틴)와 결합하는 TNF-α 결합 단백질, 특히 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 본 발명의 각종 양상은 항체 및 항체 단편, 및 이의 약제학적 조성물뿐만 아니라 이러한 항체 및 단편을 제조하기 위한 핵산, 재조합체 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 항체를 사용하여 사람 TNF-α를 검출하고, 사람 TNF-α를 시험관내 또는 생체내에서 억제하며, 유전자 발현 또는 TNF-α 관련된 기능을 조절하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이와 같은 항체를 사용하는 방법이 또한 기술된다.
본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본원에 달리 정의되지 않는 한 본 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의해 공통적으로 이해되는 의미를 갖는다. 그러나, 용어의 의미 및 범위는 임의의 잠재적 모호함이 발생할 수 있기 때문에 명확해야하며, 본원에 제공된 정의는 사전이나 외부에서 임의로 규정된 정의에 우선한다. 또한, 단수 표현의 용어들은 문맥상 특별히 규정하지 않는 한 복수 표현을 포함하고 복수 표현의 용어들은 단수 표현을 포함한다. 본원에서 용어 "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 용어의 다른 형태의 사용은 한정되는 것은 아니다. 또한 "요소" 또는 "성분"과 같은 용어들은 달리 특정하게 언급하지 않는 한 하나의 단위를 포함하는 요소 및 성분과 한 이상의 단위를 포함하는 요소 및 성분 둘 다를 내포한다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 병리학, 종양학, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학 및 하이브리드화와 연관되어 사용된 명명법은 본 분야에 널리 알려져 있고 공통적으로 사용되는 것들이다. 일반적으로 본 발명의 방법 및 기술은 본 분야에 잘 알려져 있고 달리 특정되지 않는 한 본원 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 특정적인 참조문헌에 기술된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 본 분야에서 흔히 달성되거나 본원에 기술된 바와 같이 제조사의 설명서에 따라 실시된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 실험 절차 및 기술들은 본 분야에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제학적 제제, 제형 및 전달 및 환자 치료에 표준 기술이 사용된다.
본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 일부 특정 용어들을 아래에 정의한다.
용어 "폴리펩타이드"는 아미노산의 임의의 중합쇄를 가리킨다. 용어 "펩타이드"와 "단백질"은 용어 폴리펩타이드와 함께 상호교환적으로 사용되며, 또한 아미노산의 중합쇄를 가리킨다. 용어 "폴리펩타이드"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체이거나 중합체일 수 있다.
용어 "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"는 이의 유도 기원 또는 근원으로 인하여 천연 상태에서 이를 동반하는 천연적으로 결합된 성분들과 결합되어 있지 않거나, 동일한 종의 다른 단백질로부터 실질적으로 유리되어 있거나, 다른 종의 세포에 의해 발현되거나, 천연 상태에서 존재하지 않는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 천연적으로 기원하는 세포와 상이한 세포계에서 합성되는 폴리펩타이드는 이의 천연적으로 결합된 성분들과 "분리된" 상태이다. 또한, 단백질은 본 분야에 잘 알려진 단백질 정제 기술을 이용하여 분리에 의해 천연적으로 결합된 성분들로부터 실질적으로 유리시킬 수 있다.
용어 "회수"는 폴리펩타이드와 같은 화학 종을 분리에 의해, 예를 들어 본 분야에 잘 알려진 단백질 정제 기술을 사용하여 천연적으로 결합된 성분으로부터 실질적으로 유리되도록 하는 과정을 가리킨다.
용어 "사람 TNF-α" (본원에서 hTNF-α로 약칭)는 삼량체 사이토카인 단백질을 포함한다. 이 용어는 3개의 17.5 kD TNF-α 단백질을 포함하는 동종 삼량체 단백질을 포함한다. 이 동종 삼량체 단백질은 "TNF-α 단백질"이라고 한다. 용어 사람 "TNF-α"는 표준 재조합체 발현 방법에 의해 제조될 수 있는 재조합체 사람 TNF-α (rhTNF-α)를 포함하는 것으로 의도된다. 사람 TNF-α의 서열은 표 1에 나타나 있다.
Figure pat00001
"생물학적 활성"은 사이토카인의 모든 고유의 생물학적 특성을 가리킨다. TNF-α의 생물학적 특성은 이로써 한정되는 것은 아니지만 TNF 수용체에 결합하는 것을 포함한다.
항체, 단백질, 또는 펩타이드와 제2 화학 종의 상호작용과 관련하여 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 그 상호작용이 화학 종의 특정 구조 (예, 항원 결정 인자 또는 에피토프)의 존재에 좌우됨을 의미하고; 예를 들어, 항체는 단백질을 일반적으로 인식하고 결합하기보다 특이적 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 만일 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 표지된 "A"와 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A를 함유한 분자의 존재 (또는 비함유, 비표지된 A)는 항체에 결합되는 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "항체"는 광범위하게는 4개의 폴리펩타이드 쇄 (중쇄 (H) 2개와 경쇄 (L) 2개)로 구성된 모든 면역글로불린 (Ig) 분자 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 유지하는 Ig 분자의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체를 가리킨다. 이와 같은 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체로서의 항체 형태는 본 분야에 잘 알려져 있다. 아래에서 이에 대한 비제한적 실시형태가 기술된다.
전장 항체에 있어서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭한다) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭한다) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. 추가로 VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 고도 가변 영역으로 분할될 수 있고, 이들 영역은 보다 보전적이며 골격 영역 (FR)이라고 하는 영역과 반복배열되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음의 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형 (예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 아부류일 수 있다.
용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예, hTNF-α)과 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 가리킨다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 이러한 항체 실시형태는 또한 둘 이상의 상이한 항원과 특이적으로 결합하는 이특이적, 이중 특이적 또는 다-특이적 형태를 가질 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"내에 내포된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가의 단편인 Fab 단편; (ii) 2개의 Fab 단편이 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 결합되어 있는 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., PCT 공개번호 WO90/05144 A1); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, 비록 Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루도록 하여 1가의 분자 (단일쇄 Fv (ScFv)로 공지; 참조예 Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)를 형성하는 단일 단백질로서 만들 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 내포되는 것으로 의도된다. 또한, 디아바디와 같은 단일쇄 항체의 다른 형태가 포함된다. 디아바디는 2가의 이특이적 항체로서 VH와 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄에서 발현되지만 사용된 링커가 너무 짧아 동일한 쇄상에서 두 도메인 사이의 쌍을 이루지 못함으로써 강제로 두 도메인이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 두개의 항원 결합 부위가 생성된다 (참조예: Holliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, et al. (1994) Structure 2:1121-1123). 이러한 항체 결합 부분은 본 분야 공지되어 있다 (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)).
용어 "항체 작제물"은 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 연결된 본 발명의 항원-결합 부분 하나 이상을 포함한 폴리펩타이드를 가리킨다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 하나 이상의 항원-결합 부분을 연결시키는데 사용된다. 이와 같은 링커 폴리펩타이드는 본 분야에 잘 알려져 있다 (참조예: Holliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, et al. (1994) Structure 2:1121-1123). 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 가리킨다. 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 본 분야 공지된 것으로 표 2에 나타나 있다.
Figure pat00002
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분이 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 보다 큰 면역흡착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역흡착 분자의 예는 스트렙트아비딘 코어 영역을 사용하여 사량체 scFv 분자를 제조하고 (Kipriyanov, et al. (1995) Hum. Antibod. Hybridomas 6:93-101), 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 2가의 및 비오티닐화 scFv 분자를 제조하는 (Kipriyanov, et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058) 것을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 통상적인 기술을 사용하여, 예를 들어, 완전한 항체의 파파인 또는 펩신 소화에 의해 완전한 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역흡착 분자는 본원에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
"분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체로부터 실질적으로 유리되어 있는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 가리킨다 (예를 들어, hTNF-α와 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hTNF-α 이외의 다른 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 유리되어 있다). 그러나, hTNF-α와 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 hTNF-α 분자와 같은 다른 항원과 교차반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질로부터 실질적으로 유리될 수 있다.
용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들어 CDR 및 특히 CDR3에서 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "사람 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 골격 서열에 접목된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "재조합체 사람 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 사람 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어 숙주 세포내로 형질감염된 재조합체 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합체 결합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 (Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol . 15:62-70; Azzazy and Highsmith (2002) Clin . Biochem . 35:425-445; Gavilondo and Larrick (2000) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol . Today 21:371-378), 사람 면역글로불린 유전자에 대해 형질감염된 동물 (예, 마우스)로부터 분리된 항체 (Taylor et al. (1992) Nucl . Acids Res . 20:6287-6295; Kellermann and Green (2002) Current Opin . Biotechnol . 13:593-597; Little et al. (2000) Immunol . Today 21:364-370) 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱시키는 것을 포함한 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다. 이와 같은 재조합체 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합체 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 사람 Ig 서열에 대해 형질감염된 동물이 사용되는 경우 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용시키며, 이에 따라 재조합체 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 배선 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이와 관련된 한편 생체내 사람 항체 배선 레퍼토리내에서 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
용어 "키메라 항체"는 한 종 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열과 다른 종 유래의 불변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어 사람 불변 영역에 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 결합된 항체를 가리킨다.
용어 "CDR-접목 항체"는 한 종 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어 사람 CDR (예, CDR3) 중 하나 이상이 뮤린 CDR 서열로 대체된 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 가리킨다.
"사람화 항체"란 용어는 비사람 종 (예컨대, 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더 "사람-유사성", 즉 사람 배선 가변 서열과 더 유사한 서열로 변경된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 의미한다. 사람화 항체의 한 유형은 비사람 CDR 서열이 사람 VH 및 VL 골격내로 도입된 CDR-접목 항체이다.
용어 "캐뱃 번호매김", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지"는 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 당해 분야에서 인지되며, 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기 보다 더 가변성 (즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 번호를 매기는 체계를 의미한다[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad . Sci. 190: 382-391 및 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 예를 들면, Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), Chapter 31, 특히 페이지 432-433을 참조한다. 중쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1의 경우 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 65, 및 CDR3의 경우 아미노산 위치 95 내지 106의 범위에 해당한다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1의 경우 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 56 및 CDR3의 경우 아미노산 89 내지 97의 범위이다.
용어 "수용체" 및 "수용체 항체"는 하나 이상의 골격 영역의 아미노산 서열의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공 또는 암호화하는 항체 또는 핵산 서열을 가리킨다. 일부 실시형태에서, 용어 "수용체"는 불변 영역(들)을 제공 또는 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 가리킨다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 골격 영역 및 불변 영역(들)을 제공 또는 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 가리킨다. 특정 실시형태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 골격 영역의 아미노산 서열의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공 또는 암호화하는 사람 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 가리킨다. 이 실시형태에 따르면, 수용체는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에 발생하지 않는 아미노산 잔기 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 10개 이상을 함유할 수 있다. 수용체 골격 영역 및/또는 수용체 불변 영역(들)은 예를 들면 배선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능성 항체 (예, 본 분야에 잘 알려진 항체, 개발 중인 항체 또는 시판 중인 항체)로부터 유도되거나 수득될 수 있다.
용어 "CDR"은 항체 가변 서열내 상보성 결정 영역을 가리킨다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역에는 3개의 CDR이 있고, 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 명명된다. 용어 "CDR 세트"는 항원과 결합할 수 있는 단일 가변 영역내 발생하는 3개의 CDR들의 그룹을 나타낸다. 이들 CDR의 정확한 경계선은 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 캐뱃에 의해 기재된 시스템 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR들을 한정하는 정확한 잔기 경계선을 제공한다. 이들 CDR은 캐뱃 CDR로서 언급될 수 있다. 초티아 및 그의 동료들 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol. 196: 901-917 및 Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883))은 아미노산 서열의 수준에서 다양성이 크다 할지라도 캐뱃 CDR내에 특정 아-위치는 거의 동일한 펩타이드 골격 입체구조를 취하고 있음을 밝혔다. 이들 아-위치는 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 명명되었고, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 초티아 CDR로서 언급될 수 있고, 이는 캐뱃 CDR과 중복되는 경계선을 갖는다. 캐뱃 CDR과 중복되는 CDR을 규정하는 또 다른 경계선은 문헌[Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139 및 MacCallum (1996) J. Mol . Biol. 262(5): 732-745]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계선 규정은 상기 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지는 않지만, 이들이, 특정 잔기 또는 잔기들의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의적으로 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 측면에서 단축되거나 연장될 수 있더라도, 캐뱃 CDR과 중복된다. 비록 특정 실시형태는 캐뱃 또는 초티아 정의된 CDR을 사용하지만, 본원에 사용된 방법은 당해 시스템 중 어느 하나에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정규" 잔기는 Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917; Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799-817에서 정의된 바와 같이 특정한 정규 CDR 구조를 정의하는 CDR 또는 골격의 잔기를 가리킨다. Chothia 등에 따르면, 많은 항체의 CDR의 중요한 부분은 아미노산 서열의 수준에서 상당한 다양성을 나타내지만 거의 동일한 펩타이드 골격 입체구조를 갖는다. 각 정규 구조는 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연속 절편에 대해 한 세트의 펩타이드 골격 비틀림각을 주로 지정한다.
용어 "공여체" 및 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 가리킨다. 특정 실시형태로서, 공여 항체는 골격 영역의 공급원 또는 파생원인 항체와 상이한 종에서 유래한 항체이다. 사람화 항체와 관련하여, 용어 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비사람 항체를 가리킨다.
용어 "골격" 또는 "골격 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 언급한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 체계에 의해 결정될 수 있기 때문에, 골격 서열의 의미는 상응하는 다른 해석에 의해 좌우된다. 6개의 CDR들 (경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 또는 중쇄상의 골격 영역을 각 쇄상에 4개의 서브-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고, 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하며, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정 서브-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 지정하지 않으면서, 다르게 지칭된 골격 영역은 단일의 천연 발생 면역글로불린 쇄의 가변 영역내에 조합된 FR을 나타낸다. FR은 4개의 서브-영역 중 하나를 나타내고, FR들은 골격 영역을 구성하는 4개의 서브-영역 중 2개 이상을 나타낸다.
사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 본 분야에 알려져 있다. 본 발명의 한 실시형태에서 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 V-베이스 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 또는 IMGT® (international ImMunoGeneTics information system®)에 수록된 서열로부터 선택된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 아래 표 3 및 표 4에 기술된 서열로부터 선택된다.
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Figure pat00004
용어 "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전학적 재배열 및 돌연변이를 유발하는 성숙 과정을 거치지 않는 비-림프구 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 가리킨다[예를 들면, Shapiro et al. (2002) Crit . Rev . Immunol. 22(3): 183-200; Marchalonis et al. (2001) Adv . Exp. Med . Biol. 484:13-30]. 본 발명의 다양한 실시형태에 의해 제공되는 이점 중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙 항체 유전자보다 종내의 개체마다 특징이 되는 필수 아미노산 서열 구조를 보존할 가능성이 높음에 따라 당해 종에서 치료학적으로 사용되는 경우 외래 물질로서 인지될 가능성이 낮다는 사실에 기인한다.
용어 "핵심" 잔기는 항체, 특히 사람화 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 보다 더 영향을 미치는 가변 영역내의 특정 잔기를 가리킨다. 핵심 잔기는 이로써 한정되는 것은 아니지만, 다음의 것 중 하나 이상을 포함한다: CDR에 인접한 잔기, 잠재적 당화 부위 (예를 들면, N- 또는 O-당화 부위), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 정규 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기, 버니어 구역내의 잔기 및 초티아-정의된 가변 중쇄 CDR1과 캐뱃-정의된 제1 중쇄 골격 영역 사이에 중첩하는 영역내의 잔기.
용어 "사람화 항체"는 목적하는 항원과 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 골격 (FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이 유도체, 유사체 또는 단편이다. CDR과 관련된 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 가리킨다. 사람화 항체는 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) 전부를 포함하고, 여기서, CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비-사람 면역글로불린 (즉, 공여 항체)의 CDR 영역에 상응하고 골격 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 CDR 영역이다. 특정 실시형태에서, 사람화 항체는 또한 사람 면역글로불린의 전형적인 영역인 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부분 또는 그 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 사람화 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인뿐만 아니라 경쇄 둘 다를 함유한다. 당해 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 사람화 항체는 사람화 경쇄만을 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 사람화 항체는 사람화 중쇄만을 함유한다. 특정 실시형태에서, 사람화 항체는 경쇄 및/또는 사람화 중쇄의 사람화 가변 도메인만을 함유한다.
사람화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함한 면역글로불린의 모든 클래스 및 이로써 한정되는 것은 아니지만 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 모든 아이소타입으로부터 선택될 수 있다. 사람화 항체는 하나 이상의 클래스 또는 아이소타입의 서열을 포함할 수 있으며, 본 분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 목적하는 효과기 기능을 최적화하기 위해 특정 불변 도메인을 선택할 수 있다.
사람화 항체의 골격 및 CDR 영역은 모 서열과 정확하게 일치할 필요는 없고, 예를 들어, 공여 항체 CDR 또는 컨센서스 골격은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이될 수 있으며, 이에 따라 그 위치의 CDR 또는 골격 잔기는 공여 항체 또는 컨센서스 골격과 일치하지 않는다. 특정 실시형태에서, 이와 같은 돌연변이는 흔한 것은 아니다. 보통, 사람화 항체 잔기의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상은 모 FR 및 CDR 서열의 잔기와 일치할 것이다. 용어 "컨센서스 골격"은 컨센서스 면역글로불린 서열내의 골격 영역을 가리킨다. 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 연관된 면역글로불린 서열의 한 계열에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산 (또는 뉴클레오타이드)으로부터 형성된 서열을 가리킨다 (참조예: Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1987)). 면역글로불린의 한 계열에서, 컨센서스 서열의 각 위치는 그 계열의 그 위치에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산에 의해 점유된다. 만일 두 아미노산이 동일한 빈도로 발생하는 경우, 어느 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 "버니어" 구역은 Foote and Winter (1992) J. Mol . Biol., 224: 487-499에 기술된 바와 같이 CDR 구조를 조절하고 항원에 맞도록 미세하게 조정할 수 있는 골격 잔기의 아세트를 가리킨다. 버니어 구역 잔기는 CDR의 기초를 이루는 층을 형성하며 CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 미칠 수 있다.
용어 "다가 결합 단백질"은 본 명세서에서 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 지칭한다. 다가 결합 단백질은 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 작제될 수 있고, 일반적으로 천연 발생 항체가 아니다. 용어 "다중 특이적 결합 단백질"은 2개 이상의 관련 또는 비관련 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 가리킨다. 본원에 사용된 이원 가변 도메인 (DVD) 결합 단백질 또는 면역글로불린 (DVD-Ig)은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고 4가 또는 다가의 결합 단백질인 결합 단백질이다. 이러한 DVD-Ig는 단일 특이적 (즉, 1개의 항원과 결합할 수 있다)이거나 다중 특이적 (즉, 2개 이상의 항원과 결합할 수 있다)일 수 있다. 2개의 중쇄 DVD-Ig 폴리펩타이드와 2개의 경쇄 DVD-Ig 폴리펩타이드를 포함하는 DVD-Ig 결합 단백질은 DVD-Ig로 언급된다. DVD-Ig의 각 반쪽은 중쇄 DVD-Ig 폴리펩타이드와 경쇄 DVD-Ig 폴리펩타이드 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각 결합 부위는 항원 결합 부위 당 항원 결합에 연루된 총 6개의 CDR과 함께 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. DVD 결합 단백질 및 DVD 결합 단백질의 제조 방법은 미국특허 제7,612,181호에 기술되어 있다.
본 발명의 한 양상은 TNF-α와 결합할 수 있는 결합 단백질을 포함하는 DVD 결합 단백질에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, DVD 결합 단백질은 TNF-α 및 제2 표적과 결합할 수 있다.
용어 "중화"는 결합 단백질이 사이토카인과 특이적으로 결합할 때 사이토카인의 생물학적 활성을 중화시킴을 의미한다. 특정 실시형태에서, 중화 결합 단백질은 TNF-α와 결합하여 hTNF-α의 생물학적 활성을 억제시키는 중화 항체이고, 예를 들어, 중화 결합 단백질은 hTNF-α와 결합하고, hTNF-α의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85% 또는 그 이상까지 감소시킨다. 중화 결합 단백질에 의한 hTNF-α의 생물학적 활성의 억제는 본 분야에 잘 알려진 hTNF-α 생물학적 활성의 지시제 하나 이상을 측정함으로써 평가할 수 있다. 예를 들면, L929 세포에 대한 TNF-α의 세포독성의 중화.
다른 실시형태에서, 용어 "효능 (agonizing)"은 결합 단백질이 TNF-α (예, hTNF-α)와 특이적으로 결합하는 경우 TNF-α의 생물학적 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 효능 결합 단백질은 TNF-α와 결합하여 TNF-α의 생물학적 활성을 증가시키는 효능성 항체이다. 특정 실시형태에서, 효능성 결합 단백질은 TNF-α와 결합하고 TNF-α의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%까지 증가시킨다. 효능성 결합 단백질에 의한 TNF-α의 생물학적 활성의 억제는 본 분야에 잘 알려진 TNF-α 생물학적 활성의 하나 이상의 지표를 측정함으로써 평가할 수 있다.
용어 "활성"은 항원에 대한 항체 (예, TNF-α 항원과 결합하는 항-hTNF-α 항체)의 결합 특이성/친화성 및/또는 항체 (예, hTNF-α와 결합하여 hTNF-α의 생물학적 활성을 억제하는 항-hTNF-α 항체)의 중화 효능 (또는 효능성 효율) (예, L929 세포에 대한 TNF-α의 세포독성의 중화)과 같은 활성을 포함한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정 인자"는 면역글로불린 (예, 항체) 또는 T-세포 수용체가 결합하는 항원 상의 부위를 가리킨다. 특정 실시형태에서, 에피토프 결정 인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하며, 특정 실시형태에서 특이적 삼차원 구조 특징 및/또는 특이적 하전 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 특정 실시형태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 표적 항원을 우선적으로 인식한 경우 이 항원과 특이적으로 결합한다고 말한다. 에피토프는 단백질의 삼차원 폴딩에 의해 배치되는 연속 아미노산 또는 비연속 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프가 변성 용매에 노출시 전형적으로 유지되는 반면, 삼차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리될 때 전형적으로 유실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 독특한 공간 입체구조로 포함한다. 어떠한 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지를 결정하는 방법 (예, 에피토프 맵핑)은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 예로는 면역블롯팅 및 면역침강 검사법을 들 수 있고, 여기서 TNF-α와 중첩하거나 연속하는 펩타이드는 주어진 항-TNF-α 항체와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간 입체구조를 결정하는 방법은 본 분야의 기술 및 본원에 기재된 기술, 예를 들어 X-선 결정분석 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다 (참조예: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
또한, 본 발명은 본원에 기술된 특정 항체에 의해 인식된 에피토프의 전체 또는 일부 (예, 동일하거나 중첩되는 영역 또는 이 영역의 사이 또는 폭에 해당하는 영역)를 포함하는 TNF-α상의 에피토프와 결합하는 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 동일한 에피토프와 결합하는 항체 및/또는 TNF-α (예, 사람 TNF-α)와의 결합에 대해 본원에 기술된 항체와 경쟁하는 항체를 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하거나 결합에 대해 경쟁하는 항체는 통상적인 기술을 이용하여 동정할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 하나의 항체가 표적 항원과 결합하는 것을 다른 항체가 차단하는 능력을 보여주는 면역검사법, 즉 경쟁 결합 검사법을 포함한다. 경쟁 결합은 피검 면역글로불린이 hTNF-α와 같은 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 것에 대한 검사로 결정된다. 많은 유형의 경쟁 결합 검사법이 공지되어 있으며, 예로는 고체상 직접 또는 간접 방사선면역검사 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검사 (EIA), 샌드위치 경쟁 검사 (Stahli et al. (1983) Methods in Enzymol. 9:242); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614); 고체상 직접 표지 검사, 고체상 직접 표지 샌드위치 검사 (Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); I-125 표지를 이용한 고체상 직접 표지 RIA (Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25(1):7); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al (1990) Virol. 176:546); 및 직접 표지 RIA (Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77)를 들 수 있다. 전형적으로, 이와 같은 검사법은 비표지된 피검 면역글로불린과 표지된 참조 면역글로불린 중 어느 하나를 갖는 고체 표면 또는 세포에 결합되는 정제 항원의 사용을 포함한다. 경쟁 억제는 피검 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합되는 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통 피검 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 보통, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때 이 항체는 참조 항체가 공통 항원과 특이적으로 결합하는 것을 적어도 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75% 또는 그 이상까지 억제할 것이다.
다른 기술은 예를 들어 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X-선 분석과 같은 에피토프 맵핑 방법을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편에 항체의 결합을 모니터링하거나, 항원 서열내 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합 유실이 흔히 에피토프 성분의 지표로 여겨지는 항원의 돌연변이를 모니터링한다. 추가로, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법도 사용될 수 있다. 이들 방법은 해당 항체가 조합 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리로부터 짧은 특이적 펩타이드를 친화성으로 분리하는 능력에 의존한다. 이어서, 이러한 펩타이드는 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위해 사용된 항체에 상응하는 에피토프의 정의를 위한 후보물질로 간주된다. 또한, 에피토프의 맵핑를 위해, 입체구조적 불연속 에피토프를 맵핑하기 위한 것으로 제시된 컴퓨터 알고리즘이 개발되었다.
용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들어, BIAcore 시스템 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 생체특이적 상호작용을 실시간 분석할 수 있는 광학 현상을 의미한다. 이에 대한 상세한 설명은 문헌[Jonsson et al. (1993) Ann . Biol . Clin. 51: 19-26; Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson et al. (1995) J. Mol . Recognit . 8: 125-131; 및 Johnnson et al. (1991) Anal . Biochem ., 198: 268-277)]을 참조한다.
용어 "Kon"는 당업계에 공지된 바와 같이 항원에 결합 단백질 (예, 항체)이 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하는 정반응 속도 상수 (on rate constant)를 가리킨다. "Kon"은 또한 용어 "결합 속도 상수" 또는 "ka"로 알려져 있으며 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 값은 표적 항원에 대한 항체의 결합 속도 또는 항체와 항원간의 복합체 형성 속도를 가리키며, 하기 등식으로 나타낸다:
항체 ("Ab") + 항원 ("Ag") → Ab-Ag.
용어 "Koff"는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 항체/항원 복합체로부터 결합 단백질 (예, 항체)의 해리에 대한 역반응 속도 상수 또는 "해리 속도 상수"를 가리킨다. 이 값은 아래 등식에 나타낸 바와 같이 시간이 경과하면서 항체가 이의 표적 항원으로부터 해리되거나 Ab-Ag 복합체가 유리 항체 및 항원으로 분리되는 속도를 가리킨다:
Ab + Ag ← Ab-Ag.
용어 "KD"는 "평형 해리 상수"를 가리키며, 평형 상태에서 얻은 적정 측정값 또는 해리 속도 상수 (Koff)를 결합 속도 상수 (Kon)로 나눈 값을 가리킨다. 결합 속도 상수, 해리 속도 상수 및 평형 해리 상수는 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 나타내는데 사용된다. 결합 및 해리 속도 상수를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 형광-기반 기술의 사용은 고도의 민감성 및 평형 상태에서 생리학적 완충액 중의 시료를 조사하는 능력을 제공한다. 다른 실험 접근법 및 장비, 예를 들어, BIAcore® (생분자 상호작용 분석) 검사를 사용할 수 있다 (예를 들어, 제조사 BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden으로부터 구입가능한 장비). 추가로, KinExA® (Kinetic Exclusion Assay) (제조사 Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)로부터 구입) 검사도 사용할 수 있다.
용어 "표지된 결합 단백질"은 결합 단백질의 동정을 위해 제공된 표지가 혼입되어 있는 단백질을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 당해 표지는 검출 마커로서, 예로는 방사선표지된 아미노산의 삽입 또는 표시된 아비딘 (예, 광학적 또는 비색 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩타이드로의 부착을 들 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예로는 이들에 한정되는 것은 아니지만 방사선동위원소 또는 방사선핵종 (예, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm); 형광 표지 (예, FITC, 로다민 및 란타니드 인), 효소 표지 (예, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오티닐 그룹; 2차 리포터 (예, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 예정된 폴리펩타이드 에피토프; 및 자성 물질 (예, 가돌리늄 킬레이트)을 포함한다.
용어 "항체 접합체"는 제2 화학적 모이어티 (예, 치료제 또는 세포독성제)에 화학적으로 결합된 항체와 같은 결합 단백질을 가리킨다. 용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 의미한다. 특정 실시형태에서, 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체가 포함되나, 이들에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "결정" 또는 "결정화"는 결정 형태로 존재하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 의미한다. 결정은 물질의 고체 상태 중 한 형태로서, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 구분된다. 결정은 원자, 이온, 분자 (예, 항체와 같은 단백질) 또는 분자 응집체 (예, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 3-차원 배열로 구성된다. 이러한 삼-차원 배열은 본 분야에서 잘 이해되고 있는 특수한 수학 관계에 따라 배열된다. 결정 중에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 유니트라고 칭한다. 소정의 뚜렷한 결정학적 대칭과 일치하는 배열내 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적 해독에 의한 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다. Giege et al., Chapter 1, In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins , a Practical Approach, 2nd ed., (Ducruix and Giege, eds.) (Oxford University Press, New York, 1999), pp. 1-16을 참조한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 의미하는 것으로서, 리보뉴클레오타이드 (RNA)이거나 데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA) 또는 이들 뉴클레오타이드 중 어느 한 유형의 변형된 형태이다. 이 용어는 DNA의 단일가닥 및 이중가닥 형태를 포함하지만, 특정 실시형태는 이중가닥 DNA이다.
용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드 (예, 게놈, cDNA 또는 합성 기원 또는 이들의 일부 조합의 폴리뉴클레오타이드)로서 그 기원에 따라서, 자연에서 함께 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 결합되어 있지 않거나, 자연에서 결합되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합되어 있거나, 더 큰 서열의 일부로서 자연에 발생하지 않는다.
용어 "벡터"는 이에 결합되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이것은 원형의 이중가닥 DNA 루프로서 이의 내부로 추가적인 DNA 절편이 삽입되어 연결될 수 있다. 다른 형태의 벡터는 바이러스 벡터이며, 이 경우는 추가적인 DNA 절편이 바이러스 게놈내로 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (예, 세균 복제원을 보유한 세균 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예, 비에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이에 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")라 한다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본 명세서에 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명은 대등한 기능을 담당하는 바이러스 벡터 (예, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "작동적으로 결합된"은 해당 구성원들이 의도한 방식대로 기능할 수 있는 관계에 놓여 있는 병렬 배치를 의미한다. 암호 서열에 "작동적으로 결합된" 제어 서열은 암호 서열의 발현이 제어 서열과 양립하는 조건 하에서 달성되도록 하는 방식으로 연결되어 있다. "작동적으로 결합된" 서열은 해당 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 트랜스 또는 해당 유전자를 제어하는 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다. "발현 제어 서열"이란 용어는 이들이 결합되어 있는 암호 서열의 발현과 프로세싱을 수행하는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 증강시키는 서열 (즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 및 필요한 경우 단백질 분비를 증강시키는 서열을 포함한다. 이러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르고; 원핵생물인 경우, 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵생물인 경우, 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "제어 서열"이란 용어는 발현 및 프로세싱에 필수적으로 존재하는 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 존재가 유리할 수 있는 추가의 성분 (예, 리더 서열 및 융합 파트너 서열)을 포함할 수도 있다.
"형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포로 유입되는 임의의 공정을 의미한다. 형질전환은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여 천연 또는 인공 조건 하에서 실시될 수 있다. 형질전환은 이종 핵산 서열을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 따라 달라질 수 있다. 이러한 방법은 형질전환되는 숙주 세포에 따라 선택되는데, 이로써 한정되는 것은 아니지만 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션 및 유전자 총이 포함된다. 이러한 "형질전환" 세포는 삽입된 DNA가 자가 복제성 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제될 수 있는 안정적으로 형질전환된 세포를 포함한다. 또한, 이들 세포는 삽입된 DNA 또는 RNA를 한정된 시간 동안 일시적으로 발현하는 세포도 포함한다.
용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 외인성 DNA가 도입된 세포를 가리킨다. 이러한 용어는 특정 해당 세포뿐만 아니라 이 세포의 후손도 의미하는 것으로 의도된다. 후대에 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 후손은 사실상 모세포와 동일하지 않지만 본원에서 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에는 포함된다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 임의의 생물계에서 선택되는 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함한다. 진핵생물 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 이로써 한정되는 것은 아니지만 원핵생물 세포주 이.콜라이; 포유동물 세포주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균세포 사카로마이세스 세레비지애를 포함한다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양 및 형질전환 (예, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술이 사용될 수 있다. 효소 반응과 정제 기술은 제조사의 지침에 따라 수행하거나 당업계에서 일반적으로 수행하는 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 상기 기술 및 절차들은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 또는 본 명세서에서 인용되고 논의된 각종 일반 문헌 및 특정 문헌들에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행할 수 있다. 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)을 참조한다.
"형질전환 유기체"란 전이유전자를 포함하는 세포를 가진 유기체를 의미하는 것으로서, 유기체 (또는 이 유기체의 선조)에 도입된 전이유전자는 그 유기체에서 자연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "전이유전자"는 형질전환 유기체가 발생하는 세포의 게놈내로 안정적이고 작동적으로 통합되어, 형질전환 유기체의 하나 이상의 세포 유형 또는 조직에서 암호화된 유전자 산물의 발현을 유도하는 DNA 작제물이다.
용어 "조절하다" 및 "조정하다"는 당해 분자의 활성 (예, hTNF-α의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경하는 것을 의미한다. 조정은 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 세기가 증가 또는 감소되는 것일 수 있다. 분자의 활성 및 기능의 예로는 이로써 한정되는 것은 아니지만 결합 특징, 효소 활성, 세포 수용체 활성화 및 신호 전달을 들 수 있다.
이와 마찬가지로, 용어 "조정인자"는 당해 분자의 활성 또는 기능 (예, hTNF-α의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들어, 조정인자는 이 조정인자의 부재시 관찰된 한 분자의 특정 활성 또는 기능의 세기에 비해 그 분자의 상응하는 활성 또는 기능의 세기가 증가 또는 감소되도록 유도할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조정인자는 한 분자의 하나 이상의 활성 또는 기능의 세기를 감소시키는 억제제이다. 억제제의 예로는 이로써 한정되는 것은 아니지만 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디 (peptibody), 탄수화물 또는 유기 소분자를 들 수 있다. 펩티바디는 예를 들어 국제 PCT 공개번호 WO 01/83525에 기술되어 있다.
용어 "효능제 (agonist)"는 목적하는 분자와 접촉했을 때 효능제의 부재시 관찰된 활성 또는 기능의 세기에 비해 그 분자의 특정 활성 또는 기능의 세기가 증가하도록 유도할 수 있는 조정인자를 의미한다. 목적하는 특정 효능제의 예로는 이로써 한정되는 것은 아니지만 hTNF-α 폴리펩타이드 또는 플로펩타이드, 및 hTNF-α와 결합하는 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자를 들 수 있다.
용어 "길항제" 또는 "억제제"는 목적하는 분자와 접촉했을 때, 길항제의 부재 시 관찰된 활성 또는 기능의 세기에 비해 이 분자의 특정 활성 또는 기능의 세기가 감소하도록 유도할 수 있는 조정인자를 의미한다. 목적하는 특정 길항제는 TNF-α (예, hTNF-α)의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단 또는 조정하는 물질을 포함한다. hTNF-α의 길항제 및 억제제는 이에 국한되는 것은 아니지만 hTNF-α와 결합하는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상에 있어서 중증도 및/또는 기간을 경감 또는 완화시키거나, 장애의 진행을 예방하거나, 장애의 퇴행을 유발하거나, 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 재발, 발전, 개시 또는 진행을 예방하거나, 다른 치료요법 (예, 예방제 또는 치료제)의 예방 또는 치료 효과(들)를 증진 또는 개선시키는데 충분한 치료요법의 양을 가리킨다.
용어 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용되고 있다. "생물학적 시료"는 살아있는 생물 또는 죽은 생물에서 유래하는 임의의 양의 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 생물에는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 물질에는 혈액, 혈청, 뇨, 활액, 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장이 있으나, 이에 국한되지 않는다.
I. 사람 TNF -α와 결합하는 항체
본 발명의 한 양상은 고 친화성, 저 역반응 속도 및 고 중화능으로 TNF-α와 결합하는 분리된 뮤린 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 본 발명의 제2 양상은 TNF-α와 결합하는 키메라 항체를 제공한다. 본 발명의 제3 양상은 TNF-α와 결합하는 CDR 접목 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 본 발명의 제4 양상은 TNF-α와 결합하는 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 부분은 분리된 항체이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 사람 항-TNF-α를 중화시키거나 TNF-α 기능을 조절하는 것이다.
A. 항- TNF -α 항체의 제조 방법
본 발명의 항체는 본 분야에 공지된 많은 기술 중 어느 것으로도 제조할 수 있다.
1. 하이브리도마 기술을 이용한 항- TNF -α 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기술의 사용을 포함하여 본 분야에 알려진 아주 다양한 기술 또는 이의 조합을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 분야에 공지된 것을 포함한 하이브리도마 기술, 예를 들면 Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., eds., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas", In Research Monographs in Immunology, vol.3 (J.L. Turk, General Editor) (Elsevier, New York, 1981), pp. 563-587에 공지된 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 제조된 항체에 한정되는 것은 아니다. 용어 "모노클로날 항체"는 진핵, 원핵 또는 파이지 클론을 포함한 단일 클론으로부터 유도된 항체를 가리키며 이를 생성하는 방법이 아니다.
하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체를 제조하고 선별하는 방법은 통상적인 것이고 본 분야에 잘 알려져 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포, 바람직하게는 본 발명의 항원으로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장세포를 골수종 세포와 융합시켜 생성된 하이브리도마 세포를 배양한 다음 본 발명의 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 상기 융합으로부터 생성된 하이브리도마를 선별하는 것을 포함한 모노클로날 항체의 제조 방법뿐만 아니라 이 방법에 의해 생성된 항체를 제공한다. 요약하면, 마우스가 TNF-α 항원으로 면역화될 수 있다. 특정 실시형태에서, TNF-α 항원은 면역 반응을 자극하는 보조제와 함께 투여된다. 이와 같은 보조제는 완전 또는 불완전 프로인트 보조제, RIBI (뮤라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM (면역자극 복합체)을 포함한다. 이러한 보조제는 폴리펩타이드를 국소 침전물내로 봉쇄함으로써 폴리펩타이드가 급속하게 분산되는 것을 방지할 수 있거나, 또는 보조제는 숙주가 면역체계의 대식세포 및 기타 구성원에 대해 화학주성인 인자를 분비하도록 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드가 투여되는 경우, 면역화 일정은 폴리펩타이드의 2회 이상의 투여를 포함하며, 수주에 걸쳐 퍼진다.
동물을 TNF-α 항원으로 면역화 후 동물로부터 항체 및/또는 항체-생성 세포를 수득할 수 있다. 동물로부터 채혈하거나 동물을 사멸시킴으로써 항-TNF-α 항체-함유 혈청을 수득한다. 혈청은 동물로부터 채취한 그대로 사용하거나, 혈청으로부터 면역글로불린 분획을 수득하거나, 혈청으로부터 항-TNF-α 항체를 정제할 수 있다. 이러한 방법으로 수득된 혈청 또는 면역글로불린은 폴리클로날이며, 따라서 이종 배열의 특성을 갖는다.
일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어 항원 TNF-α에 대해 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 마우스 비장을 적출하고 비장세포를 분리한다. 이어서, 잘 알려진 기술에 의해 비장 세포를 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, Manassas, Virginia, US)으로부터 입수가능한 세포주 SP20의 세포에 융합시킨다. 하이브리도마는 한계 희석에 의해 선택 및 클로닝한다. 이어서, 본 분야에 알려진 방법에 의해 하이브리도마 클론을 TNF-α와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 검사한다. 양성 하이브리도마 클론으로 마우스를 면역화함으로써 일반적으로 고 수준의 항체를 함유하는 복수액을 생성할 수 있다.
다른 실시형태에서, 면역화 동물로부터 항체-생성 불멸화 하이브리도마를 제조할 수 있다. 면역화 후 동물을 사멸시키고 비장 B 세포를 본 분야에 잘 알려진 바와 같이 불멸화 골수종 세포에 융합시킨다. 예를 들면, 상기 Harlow and Lane을 참조한다. 바람직한 실시형태에서, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩타이드를 분비하지 않는다 (비-분비 세포주). 융합 및 항생제 선택 후, TNF-α 또는 이의 부분 또는 TNF-α 발현 세포를 사용하여 하이브리도마를 선별한다. 특정 실시형태에서, 초기 선별은 효소-결합된 면역 검사 (ELISA) 또는 방사선 면역 검사 (RIA), 또는 ELISA를 사용하여 실시한다. ELISA 선별의 예는 국제 PCT 공개번호 WO 00/37504에 기술되어 있다.
항-TNF-α 항체-생성 하이브로마는 아래에 논의된 바와 같이 왕성한 하이브리도마 성장, 고도의 항체 생성 및 목적하는 항체 특징을 포함한 목적하는 특징에 대해 선택, 클로닝 및 추가 선별된다. 하이브리도마는 동계 동물, 면역 체계가 결핍된 동물 (예, 누드 마우스)의 생체내에서 배양 및 증식되거나 시험관내 세포 배양으로 배양 및 증식될 수 있다. 하이브리도마를 선택, 클로닝 및 증식하는 방법은 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다.
특정 실시형태에서, 하이브리도마는 상기된 바와 같은 마우스 하이브리도마이다. 다른 특정 실시형태에서, 하이브리도마는 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비-사람, 비-마우스 종에서 생성된다. 다른 실시형태에서, 하이브리도마는 사람 비분비 골수종이 항-TNF-α 항체를 발현하는 사람 세포와 융합된 사람 하이브리도마이다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 효소 (예, Fab 단편을 생성하는 파파인 또는 F(ab')2 단편을 생성하는 펩신)를 이용한 면역글로불린 분자의 단백질분해성 절단에 의해 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CHI 도메인을 함유한다.
2. SLAM 을 사용한 항- TNF -α 모노클로날 항체
본 발명의 다른 양상에서, 미국특허 제5,627,052; PCT 공개번호 WO 92/02551 및 Babcook et al. (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 7843-7848에 기술되어 있는 바와 같이, 선택된 림프구 항체 방법 (SLAM)으로서 당업계에서 지칭되는 절차를 사용하여 단일의 분리된 림프구로부터 재조합 항체를 생성한다. 이 방법에서, 목적하는 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들어 상기 섹션 1에 기술된 면역화 동물 중 임의의 하나로부터 유도된 림프구를 항원-특이적 용혈 플라그 검사를 이용하여 선별하고, 여기서 항원 TNF-α, TNF-α의 아단위 또는 이의 단편이 비오틴과 같은 링커를 이용하여 양 적혈 세포에 커플링되고, TNF-α에 대해 특이성을 갖는 항체를 분비하는 단일 세포를 동정하는데 사용된다. 목적하는 항체-분비 세포의 동정 후, 역전사효소-PCR (RT-PCR)에 의해 세포로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 추출한 다음 이들 가변 영역을 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 적절한 면역글로불린 불변 영역 (예, 사람 불변 영역)과 관련하여 발현시킬 수 있다. 이어서, 생체내 선택된 림프구로부터 유도된 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포를 예를 들어 패닝하여 TNF-α에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리함으로써 이들 형질감염 숙주 세포를 추가로 시험관내 분석하고 선택할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 추가로 시험관내에서, 예를 들면 PCT 공개번호 WO 97/29131 및 PCT 공개번호 WO 00/56772에 기재된 바와 같이 시험관내 친화성 성숙 방법에 의해 조작할 수 있다.
3. 형질전환 동물을 이용한 항- TNF -α 모노클로날 항체
본 발명의 다른 실시형태에서, 사람 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함한 비-사람 동물을 TNF-α 항원으로 면역화함으로써 항체를 생성한다. 특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 XENOMOUSE 형질전환 마우스이며, 이 형질전환 마우스는 사람 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편을 포함하고 마우스 항체 생성이 결핍된 조작된 마우스 스트레인이다. 예를 들면, Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13-21; 및 미국특허 제5,916,771호, 제5,939,598호, 제5,985,615호, 제5,998,209호, 제6,075,181호, 제6,091,001호, 제6,114,598호 및 제6,130,364호를 참조한다. 또한, PCT 공개번호 WO 91/10741 (1991년 7월 25일 공개), WO 94/02602 (1994년 2월 3일 공개), WO 96/34096 및 WO 96/33735 (둘 다 1996년 10월 31일 공개), WO 98/16654 (1998년 4월 23일 공개), WO 98/24893 (1998년 6월 11일 공개), WO 98/50433 (1998년 11월 12일 공개), WO 99/45031 (1999년 9월 10일 공개), WO 99/53049 (1999년 10월 21일 공개), WO 00/09560 (2000년 2월 24일 공개) 및 WO 00/037504 (2000년 6월 29일 공개)를 참조한다. XENOMOUSE 형질전환 마우스는 완전한 사람 항체의 성숙-유사 사람 레퍼토리를 생산하고, 항원-특이적 사람 Mab를 생성한다. XENOMOUSE 형질전환 마우스는 사람 중쇄 유전자좌 및 x 경쇄 유전자좌의 메가염기 크기의 배선 입체구조 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 약 80%를 함유한다. Mendez et al. (1997) Nature Genet . 15:146-156; Green and Jakobovits (1998) J. Exp . Med . 188: 483-495를 참조한다.
4. 재조합 항체 라이브러리를 이용한 항- TNF -α 모노클로날 항체
또한, 본 발명의 항체 제조에는 시험관내 방법도 사용할 수 있는데, 이 경우 항체 라이브러리를 선별하여 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체를 동정한다. 재조합 항체 라이브러리를 선별하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 미국 특허 제5,223,409호, PCT 공개번호 WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690 및 WO 97/29131, Fuchs et al. (1991) Bio / Technology 9:1369-1372, Hay et al. (1992) Hum . Antibod . Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734, Hawkins et al. (1992) J. Mol . Biol. 226:889-896, Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628, Gram et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:3576-3580, Garrad et al. (1991) Bio / Technology 9:1373-1377, Hoogenboom et al. (1991) Nucl . Acids Res. 19:4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:7978-7982 및 미국 특허원 공개 제2003.0186374에 기술된 방법을 포함한다.
재조합 항체 라이브러리는 TNF-α 또는 이 TNF-α의 부분으로 면역화된 대상체로부터 유래된 것일 수 있다. 대안으로서, 재조합 항체 라이브러리는 선천적 대상체, 즉 TNF-α로 면역화되지 않은 대상체로부터 유래된 것일 수 있으며, 예로서 사람 TNF-α로 면역화되지 않은 사람 대상체로부터 유래된 사람 항체 라이브러리를 들 수 있다. 본 발명의 항체의 선택은 재조합 항체 라이브러리를 사람 TNF-α를 포함한 펩타이드로 선별하여 TNF-α를 인식하는 항체를 선택함으로써 달성된다. 이러한 선별 및 선택을 실시하는 방법은 상기 단락에서 언급된 참조문헌에 기술된 바와 같이 본 분야에서 잘 알려져 있다. 특정한 Koff 속도 상수로 사람 TNF-α로부터 해리되는 항체와 같은 TNF-α에 대해 특정 결합 친화성을 갖는 본 발명의 항체를 선택하기 위해, 본 분야에 공지된 표면 플라스몬 공명 방법을 사용하여 목적하는 Koff 속도 상수를 갖는 항체를 선택할 수 있다. 특정한 IC50을 갖는 항체와 같은 TNF-α에 대해 특정 중화 활성을 갖는 본 발명의 항체를 선택하기 위해, TNF-α 활성의 억제를 평가하기 위한 것으로 본 분야에 알려져 있는 표준 방법을 사용할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 TNF-α (예, 사람 TNF-α)와 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 항체는 중화 항체이다. 여러 가지 실시형태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다.
예를 들면, 본 발명의 항체는 또한 본 분야에 공지된 여러 가지 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 파아지 입자의 표면상에 디스플레이된다. 특히, 이와 같은 파아지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리 (예, 사람 또는 뮤린)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 사용될 수 있다. 목적하는 항원과 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 항원, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합 또는 포획된 항원을 이용하여 선택 또는 동정할 수 있다. 이들 방법에서 사용된 파아지는 전형적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인과 함께 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함한 사상 파아지이다. 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용할 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman et al. (1995) J. Immunol . Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol . Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur . J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene, 187:9-18 (1997); Burton et al. (1994) Adv . Immunol ., 57:191-280; PCT 공개번호 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047(PCT 출원 번호 제 PCT/GB91/01134); WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 미국특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 기재된 것들을 포함한다.
상기 문헌에 기재된 바와 같이, 파아지 선택 후, 파아지로부터 항체 암호화 영역을 분리하고 이들 영역은 사람 항체 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하는데 사용할 수 있으며, 아래에 상세히 예시된 바와 같이 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 임의의 바람직한 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합으로 생성하는 기술은 또한 PCT 공개번호 WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869; 및 Sawai et al. (1995) Am . J. Reprod . Immunol., 34:26-34; 및 Better et al. (1998) Science , 240:1041-1043에 기재된 방법과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 이용할 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생성하는데 사용할 수 있는 기술의 예는 미국특허 제4,946,778호 및 제5,258, 498호; Huston et al. (1991) Methods Enzymol . 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 90:7995-7999; 및 Skerra et al. (1998) Science , 240:1038-1041에 기재된 방법을 포함한다.
파아지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 선별에 대한 대안으로서, 대규모 조합 라이브러리 선별에 대해 당업계에 공지된 다른 방법을 본 발명의 이중 특이성 항체를 동정하는데 응용할 수 있다. 대안으로서의 발현 시스템 중 한 유형은 PCT 공개번호 WO 98/31700 및 Roberts and Szostak (1997) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 94:12297-12302에 기재된 바와 같이 재조합 항체 라이브러리가 RNA-단백질 융합체로서 발현되는 것이다. 이 시스템에서, 3' 말단에 푸로마이신 (펩티딜 수용체 항생제)를 갖는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해, mRNA와 이에 의해 암호화된 펩타이드 또는 단백질 사이에 공유 융합이 생성된다. 따라서, 암호화된 펩타이드 또는 단백질 (예, 항체 또는 이의 부분)의 특성, 예를 들면 이중 특이성 항원에 항체 또는 이의 부분의 결합을 기초로 하여 mRNA의 복합 혼합물 (예, 조합 라이브러리)로부터 특정 mRNA가 증식될 수 있다. 이러한 라이브러리의 선별로부터 회수된 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 서열은 상기된 바와 같은 (예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서) 재조합 수단에 의해 발현될 수 있고, 게다가, 처음 선택된 서열(들)내로 돌연변이가 도입된 mRNA-펩타이드 융합체를 추가로 여러 회에 걸쳐 선별함으로써 또는 재조합 항체의 친화성 성숙을 위한 상기된 기타 방법을 수행함으로써 친화성 성숙이 추가로 이루어질 수 있다.
또 다른 접근법으로서, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 효모 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 효모 디스플레이 방법의 경우, 유전학적 방법을 사용하여 항체 도메인을 효모 세포벽에 부착시키고 이들을 효모의 표면상에 디스플레이한다. 특히, 이와 같은 효모를 사용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리 (예, 사람 또는 뮤린)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이 할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 Wittrup 등의 미국특허 제6,699,658호 및 Frenken 등의 미국특허 제6,114,147호에 기재된 방법을 포함한다.
B. 재조합 TNF -α 항체의 제조
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 많은 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포로부터 발현시키는 것인데, 이 경우, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 외인성 DNA를 도입시키는데 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵생물 숙주 세포 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있지만, 진핵생물 세포에서 항체를 발현시키는 것이 고려되며, 예를 들면 포유동물 숙주 세포에서 발현시키며, 그 이유는 이러한 진핵생물 세포 (및 특히 포유동물 세포)가 원핵생물 세포보다 적절히 폴딩되어 면역학적으로 활성인 항체를 보다 더 조합하고 분비하기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들면, Kaufman and Sharp (1982) J. Mol . Biol., 159:601-621에 기술된 바와 같은 DHFR 선택성 마커와 함께 사용된, Urlaub and Chasin (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216-4220에 기술된 dhfr-CHO 세포를 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, 항체는 숙주 세포에서 항체가 발현되기에 또는 특히 숙주 세포가 성장되는 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
또한, 숙주 세포를 사용하여 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같은 기능성 항체 단편을 제조할 수 있다. 상기 제조 과정에서의 변형들은 본 발명의 범위에 속한다는 것은 이해될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여 목적하는 항원과 결합하는데 필요하지 않은 경쇄와 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이와 같은 절두된 DNA 분자로부터 발현된 분자들 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 추가로, 표준 화학적 가교 방법에 의해 본 발명의 항체를 제2 항체에 1개의 중쇄와 1개의 경쇄가 본 발명의 항체이며 다른 중쇄와 경쇄는 목적하는 항원이 아닌 다른 항원에 대해 특이적인 이기능성 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 재조합 발현을 위한 예시적인 시스템으로서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼슘-매개 형질감염에 의해 dhfr CHO 세포내로 도입한다. 재조합 발현 벡터내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 결합되어 이들 유전자의 높은 전사 수준을 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 보유하며, 이 유전자는 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 상기 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선택할 수 있게 해준다. 선택된 형질전환 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 있도록 배양하고, 이러한 배양 배지로부터 완전한 항체를 회수한다. 재조합 발현 벡터 제조, 숙주 세포 형질감염, 형질전환체 선택, 숙주 세포 배양 및 배양 배지로부터의 항체의 회수에는 표준 분자 생물학 기술을 사용한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적당한 배양 배지에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 추가로 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
1. 항- hTNF -α 항체
표 5는 본 발명의 항-hTNF-α 항체의 VH 및 VL 영역 (굵은체의 CDR 서열)의 아미노산 서열의 목록이다.
Figure pat00005
2. 항- hTNF -α 키메라 항체
키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 다른 동물 종으로부터 유도된 분자이며, 예를 들면 뮤린 모노클로날 항체로부터 유도된 가변 영역과 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며 실시예 2.1에 상세히 설명되어 있다. 예를 들면, Morrison (1985) Science 229:1202; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214-221; Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호를 참조한다. 추가로, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자 유래의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 사람 항체 분자 유래의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 제조하기 위해 개발된 기술들이 사용될 수 있다 (Morrison et al. (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454).
한 실시형태에서, 본 발명의 키메라 항체는 섹션 1에 기술된 뮤린 모노클로날 항 사람 TNF-α 항체의 중쇄 불변 영역을 사람 IgG1 불변 영역으로 대체시킴으로써 제조한다.
3. 항- TNF -α CDR -접목 항체
본 발명의 CDR-접목 항체는 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상이 본 발명의 뮤린 항체의 CDR 서열로 대체된 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 임의의 사람 항체 유래의 골격 서열은 CDR 접목을 위한 주형으로 작용할 수 있다. 그러나, 이와 같은 골격 상에의 직쇄 대체는 흔히 항원에 대한 결합 친화성에서 일부 손실을 초래한다. 사람 항체가 최초의 뮤린 항체에 더욱 더 상동성을 나타낼수록, 사람 골격과 뮤린 CDR의 결합이 친화성을 감소시킬 수 있는 CDR의 뒤틀림을 유발할 가능성은 낮아진다. 따라서, 한 실시형태에서, CDR을 제외하고 뮤린 가변 골격을 대체하는 것으로 선택된 사람 가변 골격은 뮤린 항체 가변 영역 골격과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, CDR을 제외하고 사람과 뮤린 가변 영역은 70% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, CDR을 제외하고 사람과 뮤린 가변 영역은 75% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, CDR을 제외하고 사람과 뮤린 가변 영역은 80% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 키메라 항체의 제조 방법은 분 분야 공지되어 있으며 실시예 2.2에 상세히 설명되어 있다 (참조예: 유럽특허 제0 239 400호; PCT 공개번호 WO 91/09967; 미국특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호, 비니어링 또는 리서페이싱 (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Eng. 7(6):805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973) 및 쇄 셔플링 (미국특허 제5,565,352호)).
특정 실시형태에서 본 발명은 표 6에 기술된 바와 같이 VH 및/또는 VL 쇄를 포함한 CDR 접목 항체를 제공한다.
Figure pat00006
4. 항- hTNF -α 사람화 항체
사람화 항체는 비사람 종 기원의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 사람 면역글로불린 분자 기원의 골격 영역을 갖는 목적하는 항원과 결합하는 비사람 종 항체 기원의 항체 분자이다. 공지된 사람 Ig 서열은 다음에 공개되어 있다: 예를 들면, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www. mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology-/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m -ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com/; www.pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www. nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www. icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; www.baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www. recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/frroducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). 이와 같은 입수된 서열을 사용하여 당업계에 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나 결합, 친화성, 정반응 속도, 역반응 속도, 결합가, 특이성, 반감기 또는 임의의 기타 적합한 특징을 감소, 증진 또는 변형시킬 수 있다.
사람 골격 영역내의 골격 잔기는 CDR 공여체 항체 기원의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 변경, 향상시킬 수 있다. 이들 골격 치환은 분 분야에 잘 알려진 방법에 의해 동정되며, 예를 들어, CDR과 골격 잔기의 상호작용에 대해 모델링하여 항원 결합에 중요한 골격 잔기를 동정하고 서열을 비교하여 특정 위치에서의 특이한 골격 잔기를 동정함으로써 달성된다 (참조예: 미국특허 제5,585,089호; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327). 3-차원 면역글로불린 모델이 흔히 이용되고 있으며 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체구조를 묘사하고 보여주는 컴퓨터 프로그램이 이용되고 있다. 이들 디스플레이를 검사함으로써 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서의 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있고, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, 컨센서스 서열 및 유입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합하여 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화성과 같은 목적하는 항체 특성을 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 연루되어 있다. 항체는 본 분야에 공지된 여러 기술을 이용하여 사람화할 수 있고, 이로써 한정되는 것은 아니지만 Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; Sims et al. (1993) J. Immunol . 151:2296-2308; Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol. 196:901-917; Carter et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:4285-4289; Presta et al. (1993) J. Immunol . 151:2623-2632; Padlan (1991) Mol . Immunol . 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Engineering, 7(6):805-814; Roguska. et al. (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 91:969-973; PCT 공개번호 WO 91/09967, WO 99/06834 (국제특허원 PCT/US98/16280), WO 97/20032 (국제특허원 PCT/US96/18978), WO 92/11272 (국제특허원 PCT/US91/09630), WO 92/03461 (국제특허원 PCT/US91/05939), WO 94/18219 (국제특허원 PCT/US94/01234), WO 92/01047 (국제특허원 PCT/GB91/01134), WO 93/06213 (국제특허원 PCT/GB92/01755), WO 90/14443, WO 90/14424 및 WO 90/14430; 유럽특허 공개번호 EP 0 592 106, EP 0 519 596, 및 EP 0 239 400; 미국특허 제5,565,332호, 제5,723,323호, 제5,976,862호, 제5,824,514호, 제5,817,483호, 제5,814,476호, 제5,763,192호, 제5,723,323호, 제5,766,886호, 제5,714,352호, 제6,204,023호, 제6,180,370호, 제5,693,762호, 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,225,539호 및 제4,816,567호를 포함한다.
C. 항체 및 항체-생성 세포주의 제조
한 실시형태에서, 본 발명의 항-TNF-α 항체는 예를 들어 본 분야에 알려진 몇 가지 시험관내 및 생체내 검사 중 어느 하나에 의해 평가된 것으로 TNF-α 활성을 감소 또는 중화시키는 고도의 능력을 나타낸다. 다르게는, 본 발명의 항-TNF-α 항체는 또한 TNF-α 활성을 증가시키거나 효능화하는 고도의 능력을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 사람 TNF-α와 결합하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바 약 0.1s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNF-α로부터 해리되거나 약 1 x 10-6M 이하의 IC50으로 사람 TNF-α 활성을 억제한다. 다르게는, 당해 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바 약 1 x 10-2s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNF-α로부터 해리되거나 약 1 x 10-7M 이하의 IC50으로 사람 TNF-α 활성을 억제할 수 있다. 또 다르게는, 당해 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바 약 1 x 10-3s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNF-α로부터 해리되거나 약 1 x 10-8M 이하의 IC50으로 사람 TNF-α 활성을 억제할 수 있다. 또 다르게는, 당해 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바 약 1 x 10-4s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNF-α로부터 해리되거나 약 1 x 10-9M 미만의 IC50으로 사람 TNF-α 활성을 억제할 수 있다. 또 다르게는, 당해 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바 약 1 x 10-5s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNF-α로부터 해리되거나 약 1 x 10-10M 이하의 IC50으로 사람 TNF-α 활성을 억제할 수 있다. 또 다르게는, 당해 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바 약 1 x 10-5s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNF-α로부터 해리되거나 약 1 x 10-11M 이하의 IC50으로 사람 TNF-α 활성을 억제할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역과 같은 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 게다가, 당해 항체는 경쇄 불변 영역인 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 당해 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 대안으로서, 당해 항체 부분은 예를 들어 Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다.
항체의 효과기 기능을 변경시키기 위해 Fc 부분 내의 아미노산 잔기를 대체하는 것은 당업계에 공지되어 있다 (참조: 미국 특허 제5,648,260호 및 제5,624,821호). 항체의 Fc 부분은 몇 가지 중요한 효과기 기능, 예컨대 사이토카인 유도, ADCC, 식세포작용, 보체 의존적 세포독성 (CDC) 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/제거율 등을 조정한다. 일부 경우에서 이러한 효과기 기능은 치료 항체에 필요하지만, 다른 경우에는 치료 목적에 따라서 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다. 특정한 사람 IgG 아이소타입, 특히 IgG1 및 IgG3은 각각 FcγR 및 보체 C1q와의 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 조정한다. 신생 Fc 수용체 (FcRn)는 항체의 혈행 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 항체의 불변 영역, 예컨대 항체의 Fc 영역에서 대체되어 항체의 효과기 기능이 변경된다.
한 실시형태는 본 발명의 항체 또는 항체 일부가 유도체화되거나 다른 기능성 분자 (예, 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합된 표지된 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 표지된 결합 단백질은 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 (화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해) 하나 이상의 다른 분자, 예컨대 다른 항체 (예, 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 세포독성제, 약제학적 제제 및/또는 다른 분자와 당해 항체 또는 항체 부분의 결합을 조정할 수 있는 단백질 또는 펩타이드 (예, 스트렙트아비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)에 기능적으로 연결시켜 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분을 유도체화할 수 있는 유용한 검출가능한 제제는 형광 화합물을 포함한다. 형광의 검출가능한 제제의 예는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함한다. 또한, 항체는 검출가능한 효소 (예, 알칼리성 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등)에 의해 유도체화될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 유도체화되는 경우에는, 이 항체는 검출가능한 반응 생성물을 생성하기 위해 효소를 사용하는 추가 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어, 검출가능한 제제 서양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 발색 반응 생성물을 유도한다. 항체는 또한 비오틴으로 유도체화될 수 있고, 이 경우 아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출한다.
본 발명의 실시형태는 결정화된 결합 단백질을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 완전한 항-TNF-α 항체, 및 이의 단편의 결정, 및 이와 같은 결정을 포함한 제형 및 조성물에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 결정화된 결합 단백질은 결합 단백질의 용해성 대응물보다 생체내 반감기가 더 크다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 유지한다.
본 발명의 결정화된 결합 단백질은 본 분야에 공지된 방법 및 PCT 공개번호 WO 02/72636에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 당화 결합 단백질을 제공한다. 초기의 생체내 단백질 생성은 해독 후 변형으로 알려진 추가의 프로세싱을 거칠 수 있다. 특히, 당 (글리코실) 잔기가 효소적으로 첨가될 수 있으며, 이 과정은 당화로 알려져 있다. 공유결합된 올리고사카라이드 측쇄를 갖는 얻어진 단백질은 당화 단백질 또는 당단백질로 알려져 있다. 단백질 당화는 해당 단백질의 아미노산 서열뿐만 아니라 해당 단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 좌우된다. 다른 유기체는 다른 당화 효소 (예, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생성할 수 있으며, 이용가능한 다른 기질 (뉴클레오타이드 당)도 갖는다. 이와 같은 요인으로 인해, 단백질 당화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질을 발현하는 숙주 시스템에 따라 다를 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 이로써 한정되는 것은 아니지만 글루코스, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 당화 결합 단백질은 당화 패턴이 사람인 글리코실 잔기를 포함한다.
상이한 단백질 당화가 상이한 단백질 특성을 초래할 수 있음은 본 분야의 전문가에게는 잘 알려져 있다. 예를 들면, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생성되어 효모 내인성 경로를 이용하여 당화된 치료 단백질의 효능은 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포에서 발현된 동일한 단백질의 효능에 비해 감소될 수 있다. 또한, 이와 같은 당단백질은 사람에게 면역원성일 수 있으며 투여 후 생체내 반감기의 감소를 나타낼 수 있다. 사람 및 다른 동물에서 특정 수용체들은 특정 글리코실 잔기를 인식하고 혈류로부터 해당 단백질의 급속한 제거를 촉진할 수 있다. 다른 부작용으로는 단백질의 폴딩, 용해성, 프로테아제에 대한 민감성, 운송 대사, 이송, 구획화, 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식, 항원성 또는 알레르기유발성에서의 변화가 포함될 수 있다. 따라서, 의사는 당화의 특정 조성 및 패턴, 예를 들면 사람 세포에서 또는 의도된 대상 동물의 종-특이적 세포에서 생성된 것과 동일하거나 적어도 유사한 당화 조성 및 패턴을 갖는 치료 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포의 것과 다른 당화 단백질의 발현은 숙주 세포를 유전학적으로 변형시켜 이종 당화 효소를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 본 분야에 알려진 기술을 사용하여 의사는 사람 단백질 당화를 나타내는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생성할 수 있다. 예를 들면, 효모 균주가 비천연 발생 당화 효소를 발현하도록 유전학적으로 변형되어 이들 효모 균주에서 생성된 당화 단백질 (당단백질)이 동물 세포, 특히 사람 세포의 것과 동일한 단백질 당화를 나타낸다 (미국특허 제7,449,308호 및 제7,029,872호).
또한, 다양한 당화 효소를 발현하도록 유전자 조작되어, 라이브러리의 구성 숙주 세포가 변형된 당화 패턴을 갖는 목적하는 단백질을 생성하는 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여 목적하는 단백질을 발현시킬 수 있음은 본 분야의 전문가는 이해할 것이다. 이어서, 의사는 새로운 특정 당화 패턴을 갖는 목적하는 단백질을 선택하고 분리할 수 있다. 한 실시형태에서, 특정적으로 선택된 새로운 당화 패턴을 갖는 단백질은 향상된 또는 변화된 생물학적 특성을 나타낸다.
D. 항- TNF -α 항체의 용도
본 발명의 사람 TNF-α, 예를 들면 항-사람 TNF-α 항체 또는 이의 부분과의 결합 능력으로 인해, 통상의 면역검정, 예컨대 효소 결합된 면역흡착 검사 (ELISA), 방사선 면역검사 (RIA) 또는 조직 면역조직화학을 이용하여 시료 (예, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 시료) 중의 TNF-α를 검출하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 생물학적 시료를 본 발명의 항체 또는 항체 부분과 접촉시키고 TNF-α에 결합된 항체 (또는 항체 부분) 또는 미결합된 항체 (또는 항체 부분)을 검출하여 생물학적 시료 중의 TNF-α를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 시료 중의 TNF-α를 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 물질로 표지되어 결합 또는 미결합된 항체의 검출을 촉진한다. 적합한 검출 물질은 각종 효소, 보결분자 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예로는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고; 적합한 보결분자 그룹 복합체의 예로는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되며; 적합한 방사활성 물질의 예로는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm이 포함된다.
항체를 표지하는 것의 대안으로서, 검출가능한 물질로 표지된 rh TNF-α 표준물과 미표지된 항-사람 TNF-α 항체를 이용한 경쟁 면역검사에 의해 생물학적 유액 중에서 사람 TNF-α를 검사할 수 있다. 이 검사에서, 생물학적 시료, 표지된 rhTNF-α 표준물 및 항-사람 TNF-α 항체를 배합하고 미표지된 항체에 결합된 표지된 rhTNF-α 표준물의 양을 결정한다. 생물학적 시료 중의 사람 TNF-α의 양은 항-TNF-α 항체에 결합된 표지된 rhTNF-α 표준물의 양과 반비례한다. 유사하게, 검출가능한 물질로 표지된 rhTNF-α 표준물과 미표지된 항-사람 TNF-α 항체를 이용한 경쟁 면역검사에 의해 생물학적 유액 중에서 사람 TNF-α를 검사할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 시험관내 및 생체내 모두에서 TNF-α 활성 (예, 사람 TNF-α 활성)을 중화시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 TNF-α 활성 (예, 사람 TNF-α 활성)을 증가시키거나 효능화시킬 수 있다. 따라서, 이와 같은 본 발명의 항체 및 항체 부분은 예를 들어 hTNF-α를 함유한 세포 배양물에서, 사람 대상체에게서 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 TNF-α를 갖는 다른 포유동물 대상체에게서 hTNF-α 활성을 억제시키거나 증가시키는데 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 hTNF-α를 본 발명의 항체 또는 항체 부분과 접촉시켜 hTNF-α 활성을 억제 또는 증가시키는 것을 포함하는, hTNF-α 활성을 억제 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들면, hTNF-α를 함유하는 또는 함유하는 것으로 의심되는 세포 배양물에서, 배양 배지에 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 첨가하여 배양물 중의 hTNF-α 활성을 억제 또는 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체로부터, 유리하게는 TNF-α 활성이 유해한 다르게는 유익한 작용을 하는 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자로부터 hTNF-α 활성을 감소 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 이러한 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에게 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 투여하여 대상체로부터 TNF-α 활성을 감소 또는 증가시키는 것을 포함하는, 상기 대상체로부터 TNF-α 활성을 감소 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, TNF-α는 사람 TNF-α이며, 대상체는 사람이다. 다르게는, 대상체는 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 TNF-α를 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 대상체는 TNF-α가 도입된, 예를 들어 TNF-α의 투여에 의해 또는 TNF-α 전이유전자의 발현에 의해 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적으로 사람 대상체에게 투여될 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체는 이 항체가 결합할 수 있는 TNF-α를 발현하는 비사람 포유동물에 수의 목적으로 또는 사람 질환의 동물 모델로서 투여될 수 있다. 후자의 목적과 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가 (예, 투여의 용량 및 투여 시간 횟수에 대한 시험)에 유용할 수 있다.
용어 "TNF-α 활성이 유해한 장애"는 이와 같은 장애를 앓고 있는 대상체에서의 TNF-α 활성의 존재가 이 장애의 병태생리의 직접적인 원인이 되거나 원인이 되는 것으로 의심되는 또는 이 장애를 악화시키는 요인이거나 요인인 것으로 의심되는 질환 및 기타 장애를 포함한다. 따라서, TNF-α 활성이 유해한 장애는 TNF-α 활성의 감소가 이 장애의 증상 및/또는 발전을 경감시켜 줄 것으로 기대되는 장애이다. 이러한 장애는 예를 들어 그 장애를 앓고 있는 대상체의 생물학적 유액에 TNF-α의 농도가 증가되는 것 (예, 대상체의 혈청, 혈장, 활액 등에서 TNF-α의 농도가 증가되는 것)에 의해 증명될 수 있으며, 그와 같은 농도 증가는 예를 들어 상기된 바와 같이 항-TNF-α 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 장애의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 본 발명의 항체의 약제학적 조성물과 관련하여 아래의 단락에서 논의된 장애가 포함된다.
대안으로, 용어 "TNF-α 활성이 유익한 장애"는 이와 같은 장애를 앓고 있는 대상체에게 TNF-α 활성의 존재가 이 장애의 병태생리를 치료하는데 유익한 것으로 제시되었거나 그럴 것으로 기대되거나, 또는 그 장애를 치료하는데 기여하는 요인으로 제시되었거나 요인인 것으로 기대되는 장애를 포함한다. 따라서, TNF-α 활성이 유익한 장애는 TNF-α 활성의 증가가 이 장애의 증상 및/또는 발전을 경감시켜 줄 것으로 기대되는 장애이다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 장애의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 본 발명에 따른 항체의 약제학적 조성물과 관련하여 아래의 단락에서 논의된 장애가 포함된다.
E. 약제학적 조성물
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함한 약제학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 장애의 진단, 검출 또는 모니터링, 장애 또는 이 장애의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 완화 및/또는 연구에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 항체를 하나 이상 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 하나 이상 및 TNF-α 활성이 유해한 장애의 치료를 위한 본 발명의 항체가 아닌 다른 예방제 또는 치료제 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 완화시키는데 유용한 것 알려져 있거나 현재 사용되고 있는 것으로 알려져 있는 것들이다. 이들 실시형태에 따르면, 조성물은 추가로 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체-부분은 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물내로 혼입될 수 있다. 전형적으로는, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 부분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 혼화가능한 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상뿐만 아니라 이들의 배합물도 포함된다. 많은 경우에 있어서, 조성물에 당, 폴리알코올 (예, 만니톨), 솔비톨 또는 염화나트륨과 같은 등장화제가 함유될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 이의 항체 부분의 수명 또는 효능을 증가시켜 주는 습윤제, 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 항체 또는 본 발명의 하나 이상의 항체 배합물 및 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 또는 완화시키는데 유용한 예방제 및 치료제를 투여하기 위한 다양한 전달 시스템들이 알려져 있고 사용될 수 있으며, 리포좀내 캡슐화제, 미세입자, 미세캡슐제, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내이입[예를 들면, Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem . 262:4429-4432 참조], 레트로바이러스 또는 기타 벡터 등의 일부로서 핵산의 작제를 예로 들 수 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여 (예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 뇌척수 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여 (예를 들어, 비내 및 경구 경로)를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 또한, 흡입기 또는 분무기 및 분무제를 갖는 제형을 사용하는 폐 투여가 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 및 제5,290,540호; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903을 참조한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체, 병용 치료요법 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술 (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 사용하여 투여한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구적으로, 비내, 폐 또는 피하로 투여된다. 예방제 또는 치료제는 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막 내층 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장내 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 영역에 본 발명의 예방제 또는 치료제를 국소적으로 투여하는 것이 요구될 수 있고; 이것은 예를 들어, 비제한적으로, 국소 주입, 주사 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있고, 당해 임플란트는 막 및 매트릭스, 예를 들어, 시알라스틱 막, 중합체, 섬유성 매트릭스 (예를 들어, Tissuel®) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함하는 다공성 또는 비-다공성 물질로 이루어진다. 한 실시형태에서, 본 발명의 길항제인 유효량의 하나 이상의 항체는 질환 또는 이의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 완화시키기 위해 환자의 환부에 국소적으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 유효량의 하나 이상의 항체는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 완화시키기 위해 본 발명의 항체가 아닌 다른 유효량의 하나 이상의 치료요법 (예, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)와 병용하여 대상체의 환부에 국소적으로 투여된다.
다른 실시형태에서, 예방제 또는 치료제는 제어된 방출 또는 지연된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시형태에서, 펌프를 사용하여 제어되거나 지연된 방출을 달성할 수 있다 (참조: 상기 Langer; Sefton (1987) CRC Crit . Rev . Biomed. Eng., 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Surgery 88: 507-516; Saudek et al. (1989) N. Engl . J. Med. 321: 574-579). 다른 실시형태에서, 중합체 물질을 사용하여 본 발명의 치료요법의 제어 또는 지연된 방출을 달성할 수 있다[참조예: Goodson, J.M., Chapter 6, In Medical Applications of Controlled Release , Vol. II . Applications and Evaluations (Langer and Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984), pp. 115-138; Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, (Smolen and Ball, eds.) (Wiley, New York, 1984); Langer and Peppas (1983) J., Macromol . Sci . Rev . Macromol . Chem . Phys. C23(1): 61-126; 또한 Levy et al. (1985) Science, 228: 190-192; During et al. (1989) Ann . Neurol., 25: 351-356; Howard et al. (1989) J. Neurosurg., 71: 105-112); 미국특허 제5,679,377호, 제5,916,597호, 제5,912,015호, 제5,989,463호 및 제5,128,326호; PCT 공개번호 WO 99/15154 및 WO 99/20253]. 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 다가 무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드 (PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 누출가능한 불순물이 없고, 저장시 안정하고, 멸균의 생체분해성이다. 또 다른 실시형태에서, 제어된 방출 또는 지연된 방출 시스템은 예방제 또는 치료제와 근접하게 위치됨에 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다 (참조예: Goodson, In Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, supra, pp. 115-138 (1984)).
제어된 방출 시스템은 문헌[Langer (1990, Science, 249: 1527-1533)]에서 논의되어 있다. 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지연된 방출 제형을 제조할 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제4,526,938호, PCT 공개번호 WO 91/05548, PCT 공개번호 WO 96/20698, Ning et al. (1996) Radiotherapy Oncol . 39:179-189; Song et al. (1996) PDA J. Pharm . Sci. Techol . 50:372-377; Cleek et al. (1997) Proceed Int'l . Symp . Control . Rel. Bioact . Matter. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) Proceed . Int'l . Symp . Control Rel . Bioact . Matter.: 24:759-760을 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물이 예방제 또는 치료제를 암호화하는 핵산인 경우, 핵산을 적합한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고 이것을 투여하여 세포내로 도입시킴으로써 암호화된 예방제 또는 치료제가 생체내에서 발현되도록 할 수 있으며, 이의 예로는, 레트로바이러스 벡터를 사용하거나 (미국특허 제4,980,286호), 직접 주사하거나, 미세입자 충격을 이용하거나 (예, 유전자 총; Biolistic, DuPont), 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로 피복시키거나, 핵으로 진입하는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩타이드에 연결시키는 것 (참조예: Joliot et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:1864-1868)을 들 수 있다. 대안으로, 핵산은 상동 재조합에 의한 발현을 위해 세포내로 도입하여 숙주 세포 DNA 내로 통합시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로에 부합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 이로써 한정되는 것은 아니지만, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비내 (예, 흡입), 경피 (예, 국소), 경점막 및 직장 투여와 같은 비경구를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 통상적인 절차에 따라 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비내 또는 국소로 투여하기 위한 약제학적 조성물로서 제형화한다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리그노캠과 같은 국소 마취제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물이 국소 투여되는 경우, 조성물은 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 젤, 샴푸, 분무제, 에어로졸 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms , 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)을 참조한다. 비분무성 국소 용량 형태의 경우, 국소 적용에 적합할 수 있는 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 물 보다 큰 역학 점도를 갖는 점성제 내지 반고형제 또는 고형제가 사용되는 것이 전형적이다. 적합한 제형은 이로써 한정되는 것은 아니지만 액제, 현탁제, 유제, 크림, 연고, 산제, 도찰제, 고약 등을 포함하고 경우에 따라 이들은 예를 들어, 삼투압과 같은 다양한 성질에 영향을 미치기 위해 보조제 (예, 방부제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)과 함께 멸균되거나 혼합된다. 기타 적합한 국소 용량 형태는 임의로 고체 또는 액체 불활성 담체와 배합된 활성 성분이 가압된 휘발성 물질 (예, 가스 추진제, 예를 들어, FREON®)과의 혼합물 또는 압착병에 팩키징된 분무 가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 수분화제 또는 보습제가 또한 경우에 따라 약제학적 조성물 및 용량 형태에 첨가될 수 있다. 이와 같은 추가의 성분의 예는 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비내 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 에어로졸 형태, 분무, 연무 또는 적하 형태로 제형될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 간편하게 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공 형태로 적합한 추진제 (예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스)의 사용과 함께 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양이 전달되도록 밸브를 설치하여 측정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐제 및 카트릿지 (예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 정제, 캡슐제, 샤쉐제, 젤캡, 용액, 현탁제의 형태로 경구적으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캡슐제는 결합제 (예를 들어, 예비 겔화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예를 들어, 락토스, 미세결정 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤화제 (예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상적인 수단으로 제조될 수 있다. 정제는 당업자에게 널리 공지된 방법으로 피복될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 제한 없이 용액, 시럽 또는 현탁제 형태를 취할 수 있거나 이들은 사용전에 물 또는 기타 적합한 비히클과의 구성을 위해 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 당해 액상 제제는 현탁화제 (예를 들어, 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예를 들어, 아몬드유, 오일 에스테르, 에틸 알콜 또는 분획화된 식물성 오일) 및 방부제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 사용한 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 당해 제제는 또한 적절하게 완충염, 향미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 적합하게 예방제 또는 치료제(들)의 서방출성, 제어된 방출성 또는 지연된 방출성으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 사용함에 의해 분무화제로 제형화된 조성물을 폐 투여함을 포함할 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 및 제5,290,540호; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903을 참조한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체, 병용 치료요법 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술 (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass. US)을 사용하여 투여된다.
본 발명의 방법은 주사 (예, 볼루스 주사 또는 연속 주입)에 의해 비경구 투여용으로 제형화된 조성물을 투여함을 포함할 수 있다. 주사용 제형은 방부제 첨가와 함께 단위 용량 형태 (예, 앰플 또는 다용량 용기)로 제공될 수 있다. 당해 조성물은 현탁제, 용액 또는 유제와 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 사용전에 적합한 비히클 (예, 무발열원 멸균수)과 구성되는 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 방법은 추가로 데포제로서 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 이와 같은 장기 작용성 제형은 이식 (예, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당해 조성물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예, 허용되는 오일 중 유제로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화되거나 난용성 유도체 (예, 난용성 염)로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 또는 염 형태로서 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같은 음이온과 함께 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들과 같은 양이온과 함께 형성된 것들을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분은 예를 들어, 활성 제제의 양이 표기된 앰플 또는 샤쉐와 같은 밀폐 용기에서 무수 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서, 개별적으로 공급되거나 단위 용량 형태로 함께 혼합되어 공급된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 염수가 함유된 주입 병에 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 멸균 주사용수 또는 염수의 앰플을 제공하여 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있다.
특히, 본 발명은 또한 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물중 하나 이상이 제제의 양이 표기된 앰플 또는 샤쉐와 같은 밀폐 용기에 팩키지된 것을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상이 밀폐 용기에 무수 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로 공급되고 대상체에 투여하기에 적당한 농도로 재구성 (예, 물 또는 염수 이용)될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 밀폐 용기에 무수 멸균 동결건조 분말로서 제공되고 단위 용량은 5 mg 이상, 10 mg 이상, 15 mg 이상, 25 mg 이상, 35 mg 이상, 45 mg 이상, 50 mg 이상, 75 mg 이상 또는 100 mg 이상이다. 본 발명의 동결건조된 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 2℃ 내지 8℃하에서 그의 최초 용기 중에 저장되어야만 하고 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 재구성된 후 1주 이내, 5일 이내, 72시간 이내, 48시간 이내, 24시간 이내, 12시간 이내, 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 1시간 이내에 투여되어야만 한다. 대안의 실시형태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 제제의 양 및 농도가 표시된 밀폐 용기에서 액체 형태로 공급된다. 한 실시형태에서, 투여된 조성물의 액체 형태는 밀폐 용기에 0.25 mg/ml 이상, 0.5 mg/ml 이상, 1 mg/ml 이상, 2.5 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 50 mg/ml 이상, 75 mg/ml 이상 또는 100 mg/ml 이상으로 공급된다. 액체 형태는 2℃ 내지 8℃하에서 그의 최초 용기 중에 저장되어야만 한다.
본 발명의 항체 및 항체-부분은 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 한 실시형태에서, 항체 또는 항체-부분은 0.1 내지 250 mg/ml의 항체를 포함하는 주사가능한 용액으로 제조될 것이다. 주사가능한 용액은 플린트 또는 앰버 바이알, 앰플 또는 사전-충진 주사기에 액체 또는 동결건조 용량 형태로 포함될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0 (최적으로는 pH 6.0)에 L-히스티딘 (1 내지 50 mM, 최적으로는 5 내지 10 mM)일 수 있다. 다른 적합한 완충액으로는 석신산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨이 있으나, 이들에 국한되지 않는다. 염화나트륨이 0 내지 300 mM (액체 용량 형태인 경우 최적으로는 150 mM)의 농도로 용액의 독성을 개질하는데 사용될 수 있다. 동결건조 용량 형태에는 동결방지제, 주로 0 내지 10% 슈크로스 (최적으로는 0.5 내지 1.0%)가 첨가될 수 있다. 다른 적합한 동결방지제에는 트레할로스 및 락토스가 포함된다. 동결건조 용량 형태에는 벌크화제 (Bulking agent)가 포함될 수 있으며, 주로 1 내지 10% 만니톨 (최적으로는 2 내지 4%)이다. 안정화제가 액체 및 동결건조 용량 형태에 사용될 수 있으며, 주로 1 내지 50 mM L-메티오닌 (최적으로는 5 내지 10 mM)이다. 다른 적합한 벌크화제에는 글리신 및 아르기닌이 있으며, 이는 0 내지 0.05% 폴리솔베이트-80 (최적으로는 0.005 내지 0.01%)으로서 포함될 수 있다. 추가의 계면활성제로는 이로써 한정되는 것은 아니지만 폴리솔베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 포함된다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이러한 형태에는 예컨대 액체, 반고체 및 고체 용량 형태가 포함되며, 예를 들면 액제 (예, 주사가능한 용액 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제 등이 있다. 특정 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료 용도마다 다르다. 전형적인 조성물은 주사가능한 용액 또는 주입가능한 용액 형태, 예컨대 다른 항체로 사람을 수동 면역화하는데 사용되는 조성물과 유사한 조성물이다. 투여 방식은 비경구 (예, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 다른 특정 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균 상태이어야 하고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 절대량의 활성 화합물 (즉, 항체 또는 항체 부분)을, 필요에 따라 앞에서 열거한 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적당한 용매에 혼입한 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 필요에 따라 상술한 것들 유래의 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입하여 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 동결건조 분말의 경우에, 제조방법은 전술한 멸균-여과 용액으로부터 활성 성분과 임의의 필요한 추가 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 분무-건조를 포함한다. 용액의 적당한 유체성은 예컨대 레시틴과 같은 피복제의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 지속적 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함하여 제공될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체-부분은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 많은 치료학적 응용에서 예를 들면, 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 실시형태에서, 활성 화합물은 이 화합물이 신속 방출되지 않게 하는 담체와 함께 조제될 수 있으며, 그 예에는 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어된 방출 제형이 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체혼화성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 예컨대 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 이러한 화합물 (및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나, 정제로 압착되거나 또는 환자의 음식물에 직접 혼입될 수도 있다. 경구 치료 투여용인 경우, 상기 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취성 정제, 구강정, 트로키, 캡슐, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 다른 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는 화합물을 불활성화 방지용 물질로 피복하거나 또는 상기 방지용 물질과 함께 동시-투여할 필요가 있을 수 있다.
또한, 보조적인 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수도 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 TNF-α 활성이 유해한 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 동시-제형화되고/되거나 동시-투여된다. 예를 들어, 본 발명의 항-hTNF-α 항체 또는 항체 부분은 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 항체 (예컨대, 다른 사이토카인에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)와 동시-제형화되고/되거나 동시-투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 중 2종 이상과 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 병용 치료요법은 투여되는 치료제를 보다 낮은 용량으로 사용할 수 있게 하여 각종 단독 치료요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있으므로 유리할 수 있다.
특정 실시형태에서, TNF-α에 대한 항체 또는 이의 단편은 당업계에 공지된 반감기 연장 비히클에 연결된다. 이러한 비히클에는 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란이 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 예를 들어 미국특허 제6,660,843호에 기술되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 다른 예방제 또는 치료제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산 서열이 유전자 치료요법의 방법에 의해 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 관리 또는 완화시키기 위해 투여된다. 유전자 치료요법은 발현된 핵산 또는 발현 가능한 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행되는 치료요법을 가리킨다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 이들의 암호화된 본 발명의 항체 또는 예방제 또는 치료제를 생성한다.
당업계에서 이용되고 있는 유전자 치료요법 중 어떠한 방법도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유전자 치료요법에 대해 전반적인 검토를 위해 다음의 문헌을 참조할 수 있다: Goldspiel et al. (1993) Clin . Pharm ., 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy , 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol . 32:573-596; Mulligan (1993) Science, 260: 926-932; Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev . Biochem., 62:191-217; Robinson (1993) Trends Biotechnol. 11(5):155. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 관해 당업계에 일반적으로 공지된 방법은 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에 기재되어 있다. 다양한 유전자 치료요법에 대한 상세한 설명은 미국특허공고 제2009/0297514에 기재되어 있다.
TNF-α는 면역 및 염증 요소와 관련된 각종 질환과 관련된 병리학에서 중요한 역할을 한다. 이들 질환으로는 이들에 한정되는 것은 아니지만, 후천성 면역 결핍 질환 증후군; 후천성 면역 결핍 관련 질환; 후천성 악성 빈혈; 급성 관상동맥 증후군; 급성 및 만성 통증 (통증의 다른 유형); 급성 특발성 다발성 신경염; 기관 이식 관련 급성 면역 질환; 기관 이식 관련 급성 또는 만성 면역 질환; 급성 염증 탈수초성 다발성 신경근병증; 급성 허혈; 급성 간 질환; 급성 류마티스성 발열; 급성 횡단 척수염; 애디슨 질환; 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군; 성인 스틸스 질환; 알콜성 간 경변; 과민증; 강직성 척추염; 폐 질환 관련 강직성 척추염; 항-인지질 항체 증후군; 재생불량성 빈혈; 동맥경화증; 관절증; 천식; 죽상 질환/동맥경화증; 동맥경화증; 아토피성 알레르기; 아토피성 습진; 아토피성 피부염; 위축성 자가면역 갑상선 기능 저하증; 자가면역 수포성 질환; 자가면역 피부염; 자가면역 당뇨병; 스트렙토코커스 감염과 관련된 자가면역 장애; 자가면역 장병증; 자가면역 용혈성 빈혈; 자가면역 간염; 자가면역 청력 손실; 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS); 자가면역 매개된 저혈당증; 자가면역 심근염; 자가면역 호중구 감소증; 자가면역 미성숙 난소 부전증; 자가면역 혈소판 감소증 (AITP); 자가면역 갑상선 질환; 자가면역 포도막염; 폐색성 기관지염; 베체트 질환; 안건염; 기관지 확장증; 수포성 유천포창; 악액질; 심혈관 질환; 재해성 항인지질 증후군; 셀리악 질환 (celiac disease); 경추 척추증, 클라미디아증; 담즙 울혈; 만성 활성 간염; 만성 호산구성 폐렴; 만성 피로 증후군; 기관 이식 관련 만성 면역 질환; 만성 허혈; 만성 간 질환; 만성 피부 점막 칸디다증; 반흔성 유천포창; 다발성 경화증에 대한 위험을 갖는 임상적으로 분리된 증후군 (CIS); 공통 가변성 면역결핍증 (공통 가변성 저감마글로불린혈증); 간질성 폐 질환 관련 결합 조직 질환; 결막염; 쿰스 양성 용혈성 빈혈; 유년기 개시형 정신 장애; 만성 폐색성 폐 질환 (COPD); 크론 질환; 잠복성 자가면역 간염; 잠복성 섬유화 폐포염; 누낭염; 우울증; 강피증; 피부근염; 폐 질환 관련 피부근염/다발성 근염; 당뇨 망막병증; 진성 당뇨병; 확장형 심근증; 원판상 홍반성 낭창; 추간판 탈출증 (herniation); 추간판 내장증 (prolapse); 파종성 혈관내 응고; 약물-유도된 간염; 약물-유도된 간질성 폐 질환; 약물 유도된 면역 용혈성 빈혈; 심내막염; 자궁내막증; 내안구염; 장병증성 활막염; 상공막염; 다형 홍반; 중증 다형 홍반; 여성 불임; 섬유증; 섬유성 폐 질환; 임신성 유천포창; 거대세포 동맥염 (GCA); 사구체신염; 갑상선 자가면역 갑상선 기능 저하증 (하시모토 병); 굿 파스튜어 증후군; 통풍성 관절염; 이식편 대 숙주 질환 (GVHD); 그레이브스 질환; B 그룹 스트렙토코커스 (GBS) 감염; 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) (GBS); 폐 질환 관련 혈철증; 건초열; 심부전; 용혈성 빈혈; 헤노흐-쇤라인 자반증; B형 간염; C형 간염; 휴즈 증후군 (Hughes syndrome); 헌팅턴 무도증; 갑상선 기능 항진증; 부갑상선 기능 저하증; 특발성 백혈구 감소증; 특발성 혈소판 감소증; 특발성 파킨슨 질환; 특발성 간질성 폐렴; 특이체질성 간 질환; IgE-매개 알레르기; 면역 용혈성 빈혈; 봉입체 근염; 감염성 질환; 감염성 안구 염증 질환; 염증성 장 질환; 염증성 탈수초성 질환; 염증성 심장 질환; 염증성 신장 질환; 인슐린 의존성 진성 당뇨병; 간질성 폐렴; IPF/UIP; 홍채염; 연소성 만성 관절염; 연소성 악성 빈혈; 연소성 류마티스 관절염; 가와사키 병; 각막염; 건성 각결막염; 쿠스마울 질환 또는 쿠스마울-마이어 질환; 란드리 마비; 랑게르한스 세포 조직구증; 선상 IgA 질환; 망상 피반, 라임 관절염; 림프구 침윤성 폐 질환; 황반 변성; 남성 불임 특발성 또는 NOS; 악성 암종; 신장의 현미경적 혈관염; 현미경적 다발성 혈관염; 폐 질환 관련 복합 결합 조직 질환; 강직성 척추염; 운동 뉴런 장애; 점막 유천포창; 다발성 경화증 (모든 아형: 1차 진행성, 2차 진행성, 재발 완화성 등); 다발성 기관 부전증; 근통성 뇌염/로얄 프리 (Royal Free) 질환; 중증 근무력증; 골수 이형성 증후군; 심근 경색; 심근염; 신 증후군; 신경근 장애; 신경병증; 비-알콜성 지방간염; 비-A 비-B 간염; 시신경염; 기관 이식 거부; 골 관절염; 골 용해; 난소암; 난소 부전; 췌장염; 기생충 질환; 파킨슨 질환; 소수관절 JRA; 유천포창; 낙엽성 천포창; 심상성 천포창; 말초 동맥 폐색성 질환 (PAOD); 말초 혈관 질환 (PVD); 말초 동맥 질환 (PAD); 수정체성 포도막염; 정맥염; 결절성 다발 동맥염 (또는 결절성 동맥주위염); 다발 연골염; 류마티스성 다발성 근육통; 백모증; 다수관절 JRA; 다발성 내분비 결핍 증후군; 다발성 근염; 제I형 다분비선 결핍증 및 제II형 다분비선 결핍증; 류마티스성 다발성 근육통 (PMR); 감염 후 간질성 폐 질환; 후-감염성 간질성 폐 질환; 펌프 후 증후군; 미성숙 난소 부전증; 원발성 담즙성 경화증; 원발성 점액수종; 1차 파킨슨병; 원발성 경화성 담관염; 원발성 경화성 간염; 원발성 혈관염; 전립선 및 직장암 및 조혈 악성 암종 (백혈병 및 림프종); 전립선염; 건선; 1형 건선; 2형 건선; 건선성 관절염; 건선성 관절병증; 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증; 결절성 다발 동맥염의 폐 징후; 순수적혈구 무형성증; 1차 부신 부전증; 방사선 섬유증; 반응성 관절염; 라이터 질환; 재발성 시신경 척수염; 신장 질환 NOS; 재협착증; 류마티스 관절염; 간질성 폐 질환 관련 류마티스 관절염; 류마티스성 심장 질환; 사포 (활막염, 여드름, 농포증, 과골증, 및 골염); 유육종증; 정신병증; 슈미트 증후군; 강피증; 2차 아밀로이드증; 쇼크 폐; 혈청 음성 관절병증; 실리콘 관련 결합 조직 질환; 폐 질환 관련 쇼그렌 질환; 쇼그렌 증후군; 스네돈-윌킨슨 (sneddon-wilkinson) 피부증; 정자 자가면역; 척추 관절증; 강직성 척추염; 스티븐스-존슨 증후군 (SJS); 스틸스 질환; 뇌졸중; 교감성 안염; 전신 염증 반응 증후군; 전신 홍반성 낭창; 폐 질환 관련 전신 홍반성 낭창; 전신 경화증; 간질성 폐 질환 관련 전신 경화증; 타카야스 질환/동맥염; 측두 동맥염; Th2 형 및 Th1형 매개 질환; 갑상선염; 독성 쇼크 증후군; 톡소플라스마 망막염; 독성 표피 괴사용해; 횡단 척수염; TRAPS (종양 괴사 인자 수용체 1형 (TNFR)-관련 주기성 증후군); 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 저항성; 1형 알레르기 반응; 1형 자가면역 간염 (전형적인 자가면역 또는 루포이드 간염); 2형 자가면역 간염 (항-LKM 항체 간염); II형 당뇨병; 궤양성 대장염성 관절증; 궤양성 대장염; 두드러기; 통상의 간질성 폐렴 (UIP); 포도막염; 혈관성 미만성 폐 질환; 혈관염; 춘계 결막염; 바이러스 망막염; 보그트-고야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군 (VKH 증후군); 베게너 육아종증; 습윤 황반 변성; 상처 치료; 여시니아 및 살모넬라와 연관된 관절증이 포함된다.
본 발명의 항체는 자가면역 질환을 앓고 있는 사람, 특히 염증과 연관된 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 다발성 경화증 및 다른 자가면역 질환을 앓고 있는 사람을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항체 부분은 또한 자가면역 및 염증 질환의 치료에 유용한 한 가지 이상의 추가의 치료제와 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 이러한 질환을 치료하는데 단독으로 또는 조합적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단독으로 사용하거나 전문의가 의도한 목적에 맞게 선택한 추가의 물질 (예, 치료제)과 배합하여 사용할 수 있음은 이해되어야 한다. 예를 들면, 추가의 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 것으로 본 분야에 인정되고 있는 치료제일 수 있다. 또한, 추가의 제제는 치료학적 조성물에 유익한 속성을 제공하는 물질 (예, 조성물의 점도에 영향을 미치는 물질)일 수 있다.
추가로, 본 발명에 속하는 배합물은 이들의 목적상 유용한 배합물임을 이해하여야 한다. 하기 제제들은 목적에 맞게 예시된 것이며 이로써 한정되는 것이 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체 및 아래 목록 중에서 선택된 하나 이상의 추가 물질일 수 있다. 또한 배합물은 이의 조성물이 의도한 작용을 수행할 수 있는 한 하나 이상의 추가 물질 (예, 두 가지 또는 세 가지의 추가 물질)을 포함할 수 있다.
특정 배합물은 이부프로펜과 같은 약물을 포함하는 비스테로이드성 소염 약물 (NSAIDS)(들)이다. 다른 배합물은 프레드니솔론을 포함한 코르티코스테로이드이고; 스테로이드 사용에 대해 잘 알려진 부작용은 본 발명의 항 TNFα 항체와 병용하여 환자를 치료할 때 필요한 스테로이드 용량을 조금씩 줄임으로써 경감될 수 있거나 심지어 제거될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분과 배합될 수 있는 것으로 류마티스성 관절염 치료제의 비제한적 예는 다음의 것을 포함한다: 사이토카인 억제성 소염 약물 (CSAID)(들); 다른 사람 사이토카인 또는 성장 인자 (예, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, 인터페론, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF)에 대한 항체 또는 그들의 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA 또는 이들의 리간드 (CD154 (gp39 또는 CD40L)을 포함)와 같은 세표 표면 분자에 대한 항체와 배합될 수 있다.
치료제의 특정 배합은 자가면역 및 이후의 염증 과정 중 상이한 지점을 차단할 수 있고; 특정 예로는 키메라, 사람화 또는 사람 TNF 항체, D2E7 (PCT 공개번호 WO 97/29131), (CA2(RemicadeTM), CDP 571, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체 (p75TNFRIgG (EnbrelTM) 또는 p55TNFRIgG (Lenercept) 및 TNF-α 전환 효소 (TACE) 억제제와 같은 TNF 길항제가 포함되며; 유사하게 동일한 이유로 IL-1 억제제 (인터류킨-1-전환 효소 억제제, IL-1RA 등)가 효과적일 수 있다. 다른 배합물로는 인터류킨 11과의 배합물이 포함된다. 또 다른 배합물로는 TNF-α 기능과 독립적으로, 종속적으로 또는 조합적으로 작용할 수 있는 자가면역반응의 다른 핵심 물질과의 배합물이 포함된다. 또 다른 배합물로는 비고갈성 항-CD4 억제제와의 배합물이 포함된다. 또 다른 배합물로는 항체, 가용성 수용체 또는 길항성 리간드를 포함한 보조자극 경로 CD80 (B7.1) 또는 CD86 (B7.2)의 길항제와의 배합물이 포함된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로티오말레이트 (근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드 (경구, 흡입 및 국소 주사), 베타-2 아드레날린수용체 효능제 (살부타몰, 터부탈린, 살메테랄), 크산틴 (테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, 전염증성 사이토카인, 예컨대 TNFα 또는 IL-1에 의한 시그날 전달을 방해하는 제제 (예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제, TNF-α 전환효소 (TACE) 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제 (예: 키나제 억제제), 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체 (예, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG (Enbrel™ 및 p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), 소염성 사이토카인 (예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 셀레콕시브, 엽산, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 로페콕시브, 에타너셉트, 인플릭시마브, 나프록센, 발데콕시브, 설파살라진, 메틸프레드니솔론, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 골드 나트륨 티오말레이트, 아스피린, 트리암시놀론 아세토나이드, 프로폭시펜 나프실레이트/apap, 폴레이트, 나부메톤, 디클로페낙, 피록시캄, 에토돌락, 디클로페낙 나트륨, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 펜타닐, 아나킨라, 사람 재조합체, 트라마돌 hcl, 살살레이트, 설린닥, 시아노코발라민/fa/피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트 나트륨, 프레드니솔론, 몰핀 설페이트, 리도카인 하이드로클로라이드, 인도메타신, 글루코사민 설프/콘드로이틴, 아미트립틸린 hcl, 설파디아진, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 올로파타딘 hcl, 미소프로스톨, 나프록센 나트륨, 오메프라졸, 시클로포스파미드, 리툭시마브, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18BP, 항-IL-18, 항-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, 로플루밀라스트, IC-485, CDC-801 및 메소프람 등의 물질과도 배합될 수 있다. 특정 배합물은 메토트렉세이트 또는 레플루노미드를 포함하며, 증세가 중간 또는 중증인 류마티스성 관절염 증례에는 사이클로스포린을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 부분의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"이란 용어는 필요 용량에서 및 필요 기간 동안에 목적하는 치료 결과를 달성하기 위해 유효한 양을 의미한다. 항체 또는 항체 부분의 치료학적 유효량은 당업자라면 결정할 수 있는 것으로서, 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중뿐만 아니라 항체 또는 항체 부분이 환자에게 목적하는 반응을 유도할 수 있는 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 치료학적 유익 효과가 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 필요 투여량에서 및 필요 기간 동안에 목적하는 예방학적 결과를 달성하기 위해 유효한 양을 의미한다. 전형적으로는, 예방학적 용량은 질병의 발생전이나 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적은 양일 것이다.
투약 용법은 최적의 목적하는 반응 (예, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 1회 일시 주사로 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며 또는 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소 또는 증가된 용량을 투여할 수도 있다. 특히, 투여 용이성과 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 단위 용량 형태는 치료받을 포유동물 대상체에 대하여 일회 투여량이 함유되어 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 따라서, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 단위용량형에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료학적 또는 예방학적 효과 및 (b) 대상체들의 민감한 치료로 인해 활성 화합물의 배합에 관한 기술 고유의 제약에 의해 결정되고 직접적으로 좌우된다.
용량 값은 완화시키고자 하는 병태의 유형 및 중증도에 따라 다양할 수 있음을 주지해야 한다. 또한, 특정 대상체의 경우에서, 특정 투여 용법은 각자의 요건 및 조성물의 투여자 또는 관리자의 전문적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 용량 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님을 명심해야 한다.
본 발명의 방법이 기타 적합하게 변형되고 적용될 수 있고 본 발명의 범위 또는 본원에 기재된 실시형태로부터 벗어나지 않고서도 적합한 등가물을 사용하여 변형되고 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 현재 본 발명을 상세하게 설명했고 이와 동일하게 하기의 실시예를 참조로 보다 명백하게 이해될 수 있을 것이고 당해 실시예는 설명을 목적으로 포함된 것이지 본 발명을 제한하고자 한 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 항-사람 TNF -α 항체
실시예 1.1: 재조합 키메라 항-사람 TNF -α 항체의 작제 및 발현
세균내에서의 동종 재조합에 의해 쥐 항-사람 TNF-α 모노클로날 항체 MAK 195의 중쇄 불변 영역을 암호화한 DNA를 두 개의 힌지-영역 아미노산 돌연변이를 함유한 사람 IgG1 불변 영역을 암호화한 cDNA 단편으로 치환시켰다. 이들 돌연변이는 위치 234 (EU 번호지정)의 루이신이 알라닌으로 및 위치 235의 루이신이 알라닌으로 변이된 것이다 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657-2662). 이들 항체 각각의 경쇄 불변 영역은 사람 카파 불변 영역으로 치환되었다. pHybE 발현 플라스미드에 결합된 키메라 중쇄 및 경쇄 cDNA의 동시형질감염에 의해 HEK 293 세포에서 완전한 키메라 항체가 일시적으로 발현되었다. 재조합 키메라 항체를 함유한 세포 상청액을 단백질 A 세파로즈 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체는 산 완충액의 첨가에 의해 용출시켰다. 항체를 PBS로 중화 및 투석하였다.
이어서, 정제된 키메라 항-사람 TNF-α 모노클로날 항체가 hTNF-α 단백질과 결합하는 능력에 대해 ELISA로 시험하여 항원 결합을 검증하였다.
실시예 1.2: CDR 접목 항-사람 TNF -α 항체의 작제
본 분야에 잘 알려진 표준 방법을 응용함으로써 모노클로날 항체 MAK195의 VH 및 VL 쇄의 CDR 서열 (상기 표 5 참조)을 상이한 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열에 접목하였다.
본 발명의 모노클로날 항체 MAK195의 서열 VH 및 VL 서열과의 VH 및 VL 서열 배열을 기초로 하여 다음의 공지된 사람 서열을 선택하였다:
a) 중쇄 수용체 서열의 작제를 위한 VH4-59 (IGHV4-59) 및 VH3-53 (IGHV3-53) 뿐만 아니라 연결 서열 hJH4
b) 경쇄 수용체 서열의 작제를 위한 1-39/O12 및 3-15/L2 뿐만 아니라 hJK2.
MAK195의 상응하는 VH 및 VL CDR을 상기 수용체 서열에 접목시킴으로써 CDR-접목 사람화 변형 VH 및 VL 서열을 제조하였다 (상기 표 6 참조).
실시예 1.3: CDR -접목 항체의 골격 복귀 돌연변이의 작제
사람화 항체 골격 복귀 돌연변이를 생성하기 위해, 가변 도메인의 신생 합성 및/또는 돌연변이유발 프라이머 및 PCR 및 본 분야에 잘 알려진 방법을 사용함으로써 실시예 1.2에 따라 제조된 CDR-접목 항체 서열에 돌연변이를 도입하였다 (참조예: WO 2007/042261; WO 99/54440; Traunecker et al. (1987) EMBO J., 10(12):3655-9 및 Lanzavecchia and Scheidegger (1987) Eur. J. Immunol., 17(1):105-11).
CDR 접목체 각각에 대해 복귀 돌연변이 및 다른 돌연변이의 상이한 조합을 다음과 같이 작제하였다. 각 사람화 항체의 제시된 디자인 버젼이 아래에 요약되어 있다. 이들 돌연변이에 대한 잔기 번호는 캐뱃 번호지정 시스템에 따른 것이다.
중쇄 hMAK195VH.1z의 경우, 다음의 버니어 및 VH/VL 공유 잔기가 다음과 같이 복귀 돌연변이되었다: G27→F, I29→L, I37→V, I48→L, V67→L, V71→K, T73→N, N76→S 및 F78→I.
추가의 돌연변이로 다음의 것이 포함된다: Q1→E.
중쇄 hMAK195VH.2z의 경우, 다음의 버니어 및 VH/VL 공유 잔기가 다음과 같이 복귀 돌연변이되었다: A24→V, F29→I, V48→L, F67→L, R71→K, S49→G, N76→S 및 L78→I.
추가의 돌연변이로 다음의 것이 포함된다: Q1→E, I12→V 및 V29→F.
경쇄 hMAK195Vk.1의 경우, 다음의 버니어 및 VH/VL 공유 잔기가 다음과 같이 복귀 돌연변이되었다: A43→S.
경쇄 hMAK195Vk.2의 경우, 다음의 버니어 및 VH/VL 공유 잔기가 다음과 같이 복귀 돌연변이되었다: A43→S, I58→V.
추가의 돌연변이로 다음의 것이 포함된다: V13→L, E70→D 및 S80→P.
실시예 1.4: 골격 복귀 돌연변이를 포함한 사람화 항- hTNF -α 중쇄 및 경쇄
Figure pat00007

실시예 1.5: 사람화 항- hTNF -α hMAK195 항체 VH / VL 쌍
Figure pat00008
실시예 1.6: BIACORE 기술을 이용한 친화성 결정
Figure pat00009
BIACORE 방법:
BIACORE 검정 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ)은 정반응 속도 상수 및 역반응 속도 상수의 역학적 측정에 의해 항체의 친화성을 결정한다. 표적 항원 (예, 정제된 재조합 표적 항원)에 항체의 결합은 25℃에서 실행 완충액 HBS-EPB (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)을 사용하는 Biacore® 1000 또는 3000 장비 (Biacore® AB, Uppsala, Sweden)로 표면 플라스몬 공명-기본 측정에 의해 결정한다. 모든 화학물질은 Biacore® AB (Uppsala, Sweden)에서 입수하거나 본 명세서에 기술된 다른 출처로부터 입수한다. 예를 들면, 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5)중에 희석된 약 5000 RU의 염소 항-마우스 IgG (Fcγ) 단편 특이적 폴리클로날 항체 (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, Ill, US)를 25 ㎍/ml로 제조사의 지침 및 절차에 따라 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 CM5 연구용 바이오센서 칩에 직접적으로 고정시킨다. 바이오센서 표면상에 미반응된 잔기는 에탄올아미노으로 차단시킨다. 플루오셀 2 및 4에서 변형된 카르복시메틸 덱스트란 표면이 반응 표면으로서 사용된다. 플로우셀 1 및 3에서 염소 항-마우스 IgG가 없이 미변형된 카르복시메틸 덱스트란이 참조 표면으로서 사용된다. 반응역학 분석을 위해, Biaevaluation 4.0.1 소프트웨어를 사용하여 모든 8개 주사액의 결합 및 해리 단계에 1:1 Langmuir 결합 모델로부터 파생된 속도 등식을 동시에 접합시킨다 (포괄 접합 분석). 정제돤 항체는 염소 항-마우스 IgG 특이적 반응 표면을 따라 포획용 실행 완충액에 희석한다. 리간드로서 포획될 항체 (25 ㎍/ml)는 5 ㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스상에 주입한다. 결합 및 분리 속도 상수 Kon (M-1s-1) 및 Koff (s-1)은 25 ㎕/분의 연속 유속에서 결정한다. 속도 상수는 10 - 200 nM 범위의 상이한 항원 농도에서 결합 속도 측정을 실시함으로써 획득한다. 이어서, 항체와 표적 항원사이의 반응에 대한 평형 해리 상수 (M)를 반응 속도 상수로부터 다음의 등식에 의해 계산한다: KD = Koff/Kon. 결합은 시간과 반응 속도 상수의 함수를 계산하여 기록한다. 이 검정에서 정반응 속도가 106M-1s-1 보다 빠르고 역반응 속도가 10-6s-1 보다 느린 것으로 측정될 수 있다.
Figure pat00010
바이아코어 분석에 의해 특징적으로 나타난 모든 사람화 작제물의 결합은 유지되었고 쥐의 모 항체의 것과 유사하였다.
실시예 1.7: 사람 TNF-α의 중화
0.25% 트립신 (Gibco#25300)을 사용하여 L929 세포를 반단층 밀도로 성장시키고 수확하였다. 세포를 PBS로 세척하고 계수한 다음 4 ㎍/mL 액티노마이신 D가함유된 검정 배지중에 1E6 세포/ml로 현탁시켰다. 항체와 대조 IgG를 검정 배지중에 4X 농도로 희석시키고 일련의 1:4 희석을 수행하였다. huTNF-α를 검정 배지중에 400 pg/mL로 희석시켰다. 항체 시료 (200 μL)를 huTNF-α (200 μL)에 1:2 희석비로 첨가하고 실온에 0.5시간 배양하였다.
항체/사람 TNF-α를 100 pg/mL huTNF-α 및 150 nM-0.0001 nM 항체의 최종 농도를 위해 100 μL로 평판 세포에 첨가하였다. 평판을 37℃, 5% CO2에서 20시간 배양하였다. 생존력을 정량하기 위해 웰에서 100 μL를 제거하고 WST-1 시약 (Rochecat# 11644807001) 10 μL를 첨가하였다. 평판을 검정 조건하에서 3.5시간 배양하였다. Spectromax 190 ELISA 평판 리더기에서 OD 420-600 nm로 평판을 판독하였다. 수회 검정의 평균 EC50이 표 9에 기재되어 있다.
Figure pat00011
모든 항-hTNF-α 항체는 TNF-α 중화 검정에서 중화를 나타냈다.
실시예 1.8: 사람화 모노클로날 항체의 생리화학 및 시험관내 안정성 분석
크기별 배제 크로마토그래피
물로 항체를 2.5 mg/mL로 희석시키고 TSK 겔 G3000SWXL 컬럼(TOSOH Bioscience, 카달로그 번호 k5539-05k)을 사용하여 Shimadzu HPLC 시스템에서 20 mL를 분석하였. 211 mM 황산나트륨, 92 mM 인산나트륨 (pH 7.0)으로 컬럼으로부터 시료를 0.3 mL/분의 유속으로 용출시켰다. HPLC 시스템의 작동 조건은 다음과 같았다:
이동상: 211 mM Na2SO4, 92 mM Na2HPO4*7H2O, pH7.0이다.
구배: 등용매용출
유속: 0.3 mL/분
검출기 파장: 280 nm
자동시료처리기 온도: 4℃
컬럼 오븐 온도: 주변온도
가동 시간은 50분.
표 10은 상기 프로토콜에 따라 결정된 값으로서 단량체 비율 (예상 분자량의 미응집 단백질)로서 표시된 항체 작제물의 순도 데이터를 보여준다.
Figure pat00012
항-hTNF-α 항체는 대부분 >95%의 단량체를 보이면서 우수한 SEC 프로필을 나타냈다.
나트륨 도데실 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ( SDS - PAGE )
항체는 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석한다. Adalimumab lot AFP04C를 대조군으로서 사용한다. 환원 조건의 경우, 시료를 1:1로 2X 트리스 글라이신 SDS-PAGE 시료 완충액(Invitrogen, cat# LC2676, lot# 1323208) 및 100 mM DTT와 함께 혼합하고, 30분동안 60℃로 가열한다. 비환원 조건의 경우는, 샘플를 시료 완충액과 1:1로 혼합하고 5분동안 100℃로 가열한다. 환원된 시료(레인당 10mg)는 12% 프리캐스트 트리스-글라이신 겔(Invitrogen, cat# EC6005box, lot# 6111021)상에 로딩하고, 비환원된 시료(레인당 10 mg)는 8%-16% 프리캐스트 트리스-글라이신 겔(Invitrogen, cat# EC6045box, lot# 6111021)상에 로딩한다. SeeBlue Plus 2 (Invitrogen, cat#LC5925, lot# 1351542)를 분자량 마커로서 사용한다. 겔을 XCeIl SureLock 소형 세포 겔 박스(Invitrogen, cat# EIOOOl)내에서 전개하고 단백질은 먼저 75 전압을 적용하여 시료를 겔에 첨가하고 이어서 선행 염료가 겔의 바닥에 도달할때까지 125의 정전압을 걸어 분리한다. 사용된 전개 완충액은 10 x 트리스 글라이신 SDS 완충액(ABC, MPS-79-080106)으로부터 제조된 1 x 트리스 글라이신 SDS 완충액이다. 겔은 콜로이드 블루 염료 (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016)을 사용하여 밤새 염색시키고 배경이 청명해질때까지 Milli-Q 물을 탈염색시킨다. 염색된 겔을 이어서 Epson Expression 스캐너 (model 1680, S/N DASX003641)를 사용하여 스캐닝한다.
침강 속도 분석
항체는 3개의 표준 2-섹터 카본 에폰 센터피스의 샘플 챔버로 로딩한다. 이들 센터피스는 1.2cm 광학 경로 길이를 갖고 사파이어 윈도우로 구성된다. PBS는 기준 완충액으로 사용하고 각각의 챔버는 140 μL를 함유한다. 모든 시료는 Beckman ProteomeLab XL-I 분석 초원심분리(serial # PL106C01)에서 4-구멍(AN-60Ti)를 사용하여 동시에 조사한다.
수행 조건은 프로그램화되어 있고 원심분리 조절은 ProteomeLab (v5.6)를 사용하여 수행한다. 시료 및 로터는 분석전에 1시간동안 열이 균질해지도록 한다 (20.0 ± 0.1℃). 적당한 셀 로딩의 확인은 3000rpm에서 수행하고 단일 스캔은 각각의 셀에 대해 기록한다. 침강 속도 조건은 하기와 같다:
시료 셀 용적: 420 mL
기준 셀 용적: 420 mL
온도: 20℃
로터 속도: 35,000 rpm
시간: 8 시간
UV 파장: 280nm
반경방향 스텝 크기: 0.003cm
데이터 수집: 시그날 평균화 없이 단계 마다 원 데이터 포인트
총 스캔 횟수: 100
완전한 항체의 LC - MS 분자량 측정
완전한 항체의 분자량은 LC-MS에 의해 분석한다. 각각의 항체는 물을 사용하여 대략 1mg/ml로 희석시킨다. 단백질 마이크로트랩(Michrom Bioresources, Inc, cat# 004/25109/03)을 사용한 1100 HPLC (Agilent) 시스템을 사용하여 탈염시키고 5mg의 시료를 API Qstar 펄서 i 질량 분광측정기 (Applied Biosystems)에 도입한다. 짧은 농도 구배를 사용하여 시료를 용출시킨다. 농도 구배는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 물중의 0.08% FA, 0.02% TFA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.08% FA 및 0.02% TFA)를 사용하여 수행한다. 질량 분광측정기는 질량 대 전하 비율이 2000 내지 3500인 스캔 범위로 4.5 k볼트 분무 전압으로 수행한다.
항체 경쇄 및 중쇄의 LC - MS 분자량 측정
항체 경쇄(LC), 중쇄(HC) 및 탈당화된 HC의 분자량 측정은 LC-MS에 의해 분석한다. 항체는 물을 사용하여 1 mg/mL로 희석시키고 시료는 37℃에서 30분동안 10mM DTT의 최농 농도로 LC 및 HC로 감소시킨다. 항체 탈당화시키기 위해, 100 mg의 항체를 37℃에서 총 용적 100ml중에서 밤새 2 mL의 PNGase F, 5 mL의 10% N-옥틸글루코사이드로 항온처리한다. 탈글루코실화 후 시료는 37℃에서 30분동안 10mM DTT의 최종 농도로 감소한다. C4 칼럼(Vydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069)을 갖는 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 시료 (5mg)을 탈염시키고 API Qstar 펄서 i 질량 분광측정기(Applied Biosystems)에 도입한다. 짧은 농도 구배를 사용하여 시료를 용출시킨다. 농도 구배는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 물중의 0.08% FA, 0.02% TFA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.08% FA 및 0.02% TFA)를 사용하여 수행한다. 질량 분광측정기는 질량 대 전하 비율이 800 내지 3500인 스캔 범위로 4.5 k볼트 분무 전압으로 수행한다.
펩타이드 맵핑
항체를 실온에서 15분동안 75mM의 중탄산암모늄중의 6M 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도로 변성시킨다. 변성된 시료를 60분동안 37℃에서 10mM DTT의 최종 농도로 감소시킨 후 이어서 30분동안 37℃에서 암실에서 50mM 요오도아세트산(IAA)를 사용하여 알킬화한다. 알킬화 후, 시료를 4℃에서 4리터의 10mM 중탄산암모늄에 대해 밤새 투석시킨다. 투석된 시료를 10mM 중탄산암모늄, pH 7.8을 사용하여 1mg/ml로 희석시키고 100 mg의 항체를 4시간동안 37℃에서 트립신/Lys-C:항체 1:20(w/w) 비율에서 트립신 (Promega, cat# V5111) 또는 Lys-C (Roche, cat# 11 047 825 001)로 분해시킨다. 분해물을 1 mL의 1 N HCl로 급랭시킨다. 질량 분광측정기 검출을 사용한 펩타이드 맵핑을 위해 40ml의 분해물을, Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용한 C18 칼럼상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RPHPLC)에 의해 분리한다(Vydac, cat# 218TP51, S/N NE 9606 10.3.5). 펩타이드 분리는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 물중의 0.02% TFA, 0.08% FA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.02% TFA 및 0.08% FA)를 사용하여 수행한다. API QSTAR 펄서 i 질량 분광측정기를 4.5k볼트 분무 전압 및 질량 대 하전비가 800 내지 2500인 스캔 범위에서 양성 모드로 작동시킨다.
디설파이드 결합 맵핑
항체를 변성시키기 위해, 100 mL의 항체를 100mM의 중탄산암모늄 중의 300ml의 8M 구아니딘과 혼합한다. pH가 7 내지 8이 되도록 조사하고 시료를 6M 구아니딘 HCl의 최종 농도에서 실온에서 15분동안 변성시킨다. 변성된 시료의 일부(100mL)를 Milli-Q 물로 600ml로 희석시켜 최종 구아니딘-HCl 농도가 1M이 되게한다. 시료(220 mg)을 대략 16시간동안 37℃에서 1:50 트립신 또는 1:50 Lys-C: 항체(w/w) 비율(4.4mg 효소: 220mg 시료)에서 트립신(Promega, cat # V5111, lot# 22265901) 또는 Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lot# 12808000)를 사용하여 분해시킨다. 추가 5mg의 트립신 또는 Lys-C를 시료에 첨가하고 37℃에서 추가로 2시간동안 분해가 진행되도록 한다. 분해는 1mg의 TFA를 각각의 시료에 첨가함에 의해 종료시킨다. 분해된 시료는 Agilent HPLC 시스템상에서 C18 칼럼을 사용하는 RPHPLC(Vydac, cat# 218TP51 S/N NE020630-4-1A)에 의해 분리한다. 당해 분리는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 등급 물중의 0.02% TFA, 0.08% FA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.02% TFA 및 0.08% FA)를 사용하는 펩타이드 맵핑을 위해 사용되는 동일한 농도 구배로 수행한다. HPLC 작동 조건은 펩타이드 맵핑을 위해 사용되는 것들과 동일하다. API QSTAR 펄서 i 질량 분광측정기는 4.5k볼트 분무 전압 및 800 내지 2500 질량 대 하전 비율의 스캔 범위에서 양성 모드로 작동시킨다. 디설파이드 결합은 페타이드의 관찰된 MW와 디설파이드 결합에 의해 결합된 트립신 또는 Lys-C 펩타이드의 예측된 MW를 일치시켜 할당한다.
유리된 설프하이드릴 측정
항체에서 유리된 시스테인을 정량하기 위해 사용되는 방법은 특징적인 발색단 생성물, 5-티오-(2-니트로벤조산) (TNB)을 유발하는 설프하이드릴 그룹(SH)과 엘만 시약, 5,5￠-디티오-비스(2-니트로벤조산) (DTNB)의 반응을 기초로 한다. 반응은 하기 식으로 나타난다:
DTNB + RSH → RS-TNB + TNB- + H+
TNB-의 흡광도는 Cary 50 분광측정기를 사용하여 412nm에서 측정한다. 흡광도 곡선은 유리된 SH 표준물로서 2 머캅토에탄올(b-ME)의 희석물을 사용하여 플롯팅하고 단백질내 유리된 설프하이드릴 그룹의 농도는 샘플의 412nm에서의 흡광도로부터 측정한다.
β-ME 표준 원액은 HPLC 등급의 물로 14.2M b-ME를 최종 농도 0.142mM로 연속 희석시켜 제조한다. 이어서 각각의 농도에 대해 3회 표준물을 제조한다. 항체는 아미콘 울트라 10,000 MWCO 원심분리 여과기(Millipore, cat# UFC801096, lot# L3KN5251 )를 사용하여 10mg/ml로 농축시키고 완충액을 아달리무마브용 제제 완충액(5.57 mM 1염기성 인산나트륨, 8.69 mM 2염기성 인산나트륨, 106.69 mM NaCl, 1.07 mM 나트륨 시트레이트, 6.45 mM 시트르산, 66.68 mM 만니톨, pH 5.2, 0.1% (w/v) Tween)으로 대체시킨다. 시료를 20분동안 실온에서 진탕기상에서 혼합한다. 이어서 180 mL의 100 mM Tris 완충액, pH 8.1을 각각의 시료 및 표준물에 첨가하고 이어서 10mM 인산 완충액(pH 8.1)중의 2mM DTNB의 300ml를 첨가한다. 완전히 혼합한 후, 시료 및 표준물을 Cary 50 분광측정기상의 412nm에서의 흡광도에 대해 측정한다. 표준 곡선은 β-ME 표준물의 유리된 SH의 양 및 OD412을 플롯팅함에 의해 수득한다. 시료의 유리된 SH 함량은 블랭크 공제 후 당해 곡선을 기준으로 계산한다.
약 양이온 교환 크로마토그래피
항체는 10 mM 인산나트륨, pH 6.0을 사용하여 0.1mg/ml로 희석시킨다. 하전 이종성은 WCX-10 ProPac 분석 칼럼(Dionex, cat# 054993, S/N 02722)을 갖는 시마쯔 HPLC 시스템을 사용하여 분석한다. 시료는 80% 이동상 A(10mM 인산나트륨, pH 6.0) 및 20% 이동상 B(10mM 인산나트륨, 500mM NaCl, pH 6.0)중에서 칼럼상으로 로딩하고 분당 1.0ml의 유속으로 용출시킨다.
올리고사카라이드 프로파일링
항체의 PNGase F 처리 후 방출된 올리고사카라이드는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB) 표지화 시약을 사용하여 유도체화한다. 형광 표지된 올리고사카라이드를 정상의 고성능 액체 크로마토그래피(NPHPLC)로 분리하고 상이한 형태의 올리고사카라이드를 공지된 표준물과의 체류시간 비교를 기초로 특징 분석한다.
항체를 먼저 PNGaseF로 분해시켜 중쇄의 Fc 부분으로부터 N-연결된 올리고사카라이드를 절단한다. 항체(200 mg)를 2 mL의 PNGase F 및 3 mL의 10% N-옥틸글루코시드와 함께 500mL의 에펜도르프 튜브에 첨가한다. 인산 완충식염수를 첨가하여 최종 용적이 60ml이 되게한다. 시료를 700RPM으로 설정된 에펜도르프 열혼합기중에서 37℃에서 밤새 항온처리한다. 아달리무마브 로트 AFP04C는 또한 대조군으로서 PNGase F로 분해시킨다.
PNGase F 처리 후, 시료는 750RPM으로 설정된 에펜도르프 열혼합기에서 5분동안 95℃에서 항온처리하고 단백질을 침출시킴에 이어서 시료를 2분동안 10,000 RPM에서 에펜도르프 원심분리기에 놓고 침전된 단백질을 침강시킨다. 올리고사카라이드를 함유하는 상등액을 500ml 에펜도르프 튜브로 옮기고 65℃에서 스피드-백에서 건조시킨다.
올리고사카라이드를 제조원(Prozyme (cat# GKK-404, lot# 132026))으로부터 구입한 2AB 표지화 키트를 사용하여 2AB로 표지시킨다. 표지 시약은 제조업자의 지침에 따라 제조한다. 아세트산(150 mL, 키트로 제공됨)을 DMSO 바이엘(키트로 제공됨)에 첨가하고 용액을 피펫팅으로 수회 상승 하강시켜 혼합한다. 아세트산/DMSO 혼합물(100 mL)을 사용 직전에 2-AB 염료 바이알에 옮기고 염료가 완전히 용해될때까지 혼합한다. 이어서 염료 용액을 환원제의 바이알(키트로 제공됨)에 첨가하고 잘 혼합한다(표지화 시약). 표지화 시약(5 mL)을 각각의 건조된 올리고사카라이드 시료 바이알에 첨가하고 완전히 혼합한다. 반응 바이알을 반응 2시간동안 65℃에서 및 700 내지 800 RPM으로 설정된 에펜도르프 열혼합기에 놓는다.
표지화 반응 후, 과량의 형광 염료를 제조원(Prozyme (cat# GKI -4726))으로부터 글리코클린 에스 카트릿지를 사용하여 제거한다. 시료를 첨가하기 전에, 카트릿지를 1 m의 밀리-Q 물로 세척하고 이어서 1ml의 30% 아세트산 용액으로 5회 세척한다. 시료를 첨가하기 직전에, 1 mL의 아세토니트릴(Burdick and Jackson, cat# AHO15-4)을 카트릿지에 첨가한다.
모든 아세토니트릴이 카트릿지를 통과한 후, 시료를 새로이 세척된 디스크 의 중앙에 점적하고 10분동안 디스크상으로 흡수되도록 한다. 디스크를 1ml의 아세토니트릴로 세척함에 이어서 96% 아세토니트릴 1ml로 5회 세척한다. 카트릿지를 1.5mL 에펜도르프 튜브상에 놓고 2-AB 표지된 올리고사카라이드를 밀리 Q 물로 3회 세척(각 세척당 400ml)으로 용출시킨다.
올리고사카라이드를 시마즈(Shimadzu) HPLC 시스템에 연결된 Glycosep N HPLC (cat# GKI-4728) 칼럼을 사용하여 분리한다. 시마즈 HPLC 시스템은 시스템 조절자, 탈기 장치, 이원 펌프, 샘플 냉각기가 있는 자동샘플채취기 및 형광 검출기로 이루어진다.
승온에서의 안정성
항체의 최종 농도는 적당한 완충액, 계면활성제, 안정화제 및/또는 당으로 2 mg/mL로 조정한다. 항체 용액은 이어서 여과 멸균하고 0.25 mL의 적정액을 멸균 조건하에 제조한다. 적정액을 1, 2 또는 3주동안 -80℃, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 방치한다. 항온처리 기간 말기에, 시료는 크기별 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE로 분석한다.
안정성 시료는 환원 및 비환원 조건하에 SDS-PAGE로 분석한다. 사용되는 과정은 본원에 기재된 바와 동일하다. 겔은 콜로이드성 블루 염료(Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016)으로 염색시키고 배경이 청명해질때까지 Milli-Q 물로 탈염색시킨다. 염색된 겔을 이어서 Epson Expression 스캐너(model 1680, S/N DASX003641)를 사용하여 스캔한다. 보다 높은 민감성을 수득하기 위해, 동일한 겔을 실버 염색 키트 (Owl Scientific, Gel Company, San Francisco, Calif, US)를 사용하여 염색하고 제조업자에 의해 추천된 과정을 사용한다.
실시예 1.9: HEK 293-6E 세포에서의 형질감염 및 발현
단백질 제조를 위해 항-hTNF-α 항체 벡터 작제물로 293 세포를 형질감염시켰다. 사용된 293 일시적 형질감염 방법은 Durocher et al. (2002) Nucl. Acids Res. 30(2e9):1-9 및 Pham et al. (2005) Biotech. Bioeng. 90(3):332-44에서 공개된 것의 변형 방법이다. 이 형질감염에서 사용된 시약은 다음과 같다:
- 130 rpm, 37℃ 및 5% CO2로 설정된 가습배양기내 일회용 삼각플라스크에서 배양된 HEK 293-6E 세포 (National Research Council Canada로부터 입수한 것으로 EBNA1을 안정하게 발현하는 사람 배아 신장 세포주).
- 배양 배지: FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen 12338-018) + 25 ㎍/mL 제네티신 (G418)(Invitrogen 10131-027) 및 0.1% 플루로닉 F-68 (Invitrogen 24040-032).
- 형질감염 배지: FreeStyle 293 발현 배지 + 10 mM HEPES (Invitrogen 15630-080).
- 폴리에틸렌이민 (PEI) 원액: 선형 25 kDa PEI (Polysciences)으로 제조되고 -15℃ 미만에 저장된 1 mg/mL 멸균 원액, pH 7.0.
- 트립톤 공급 배지: FreeStyle 293 발현 배지중의 트립톤 N1 (Organotechnie, 19554)의 5% w/v 멸균 원액.
형질감염을 위한 세포 준비: 형질 감염 약 2-4 시간 전에 HEK 293-6E 세포를 원심분리로 수집하고 배양 배지에 mL 당 약 1백만 생세포의 밀도로 재현탁하였다. 각각의 형질감염에서 40 mL의 세포 현탁액을 일회용 250-mL 삼각 플라스크에 넣고 2-4시간 배양하였다.
형질감염: 형질감염 배지 및 PEI 원액을 실온 (RT)으로 가온하였다. 각각의 형질감염에서, 25 ㎍의 플라스미드 DNA 및 50 ㎍의 폴리에틸렌이민 (PEI)을 5 mL의 형질감염 배지에 배합하고 실온에서 15-20분 배양하여 DNA:PEI 복합체가 형성되도록 하였다. BR3-Ig 형질감염을 위해 형질감염 마다 25 ㎍의 BR3-Ig 플라스미드를 사용하였다. 각각의 5-mL DNA:PEI 복합체 혼합물을 미리 준비해 둔 40-mL 배양액에 첨가하고 130 rpm, 37℃ 및 5% CO2로 설정된 가습배양기에 넣었다. 20-28 시간 후, 각 형질감염에 5 mL의 트립톤 공급 배지를 첨가하고 6일간 계속 배양하였다.
표 11은 HEK 293-6E 세포에 발현된 모 항체의 수득량 데이터 (mg/L)를 포함한다.
Figure pat00013
모든 항체는 HEK 293-6E 세포에서 잘 발현되었다. 대부분의 증례에서 >50 mg/L의 정제된 항체를 HEK 293-6E 세포 상청액으로부터 용이하게 수득할 수 있었다.
본 발명은 분자생물학 및 약물 전달 분야에서 잘 알려져 있는 기술들을 참조로 인용한다. 이들 기술은 이로써 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 공개 문헌에 기술된 기술을 포함한다:
Figure pat00014
Figure pat00015
본원에 인용된 모든 참조 문헌 (학술발표 문헌, 특허, 특허원 및 웹사이트를 포함)의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 인용된다. 본 발명의 실시는 달리 언급하지 않는 한 본 분야에 잘 알려진 면역학, 분자 생물학 및 세포 생물학의 통상적인 기술을 이용한다.
균등론
본 발명은 이의 정신 또는 핵심적인 특징에서 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 양태들은 본원에 기술된 본 발명의 모든 관점을 제한하는 것이 아니라 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 이에 본 발명의 범위는 상기된 상세한 설명으로 규정되는 것이 아니라 첨부된 특허청구범위로 규정되며, 특허청구범위와의 균등한 의미 및 범위에 속하는 모든 변화는 본 발명에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE INC. <120> TNF-α BINDING PROTEINS <130> 10426WOO1 <150> 61/321,633 <151> 2010-04-07 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Asp Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 5 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 25 30 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser 20 25 30 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Asn Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 24 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Thr Ile Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (76)

  1. 사람 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)와 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하는 사람화 결합 단백질로서,
    상기 항원 결합 도메인이 서열번호 22의 잔기 31 내지 35; 서열번호 22의 잔기 50 내지 65; 서열번호 22의 잔기 98 내지 106; 서열번호 23의 잔기 24 내지 34; 서열번호 23의 잔기 50 내지 56; 또는 서열번호 23의 잔기 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함하고,
    여기서 상기 결합 단백질이 사람 수용체 골격을 포함하는, 사람화 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이 3개 이상의 CDR들을 포함하는, 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 3개 이상의 CDR들이, (a) 서열번호 22의 잔기 31 내지 35; 서열번호 22의 잔기 50 내지 65 및 서열번호 22의 잔기 98 내지 106 및 (b) 서열번호 23의 잔기 24 내지 34; 서열번호 23의 잔기 50 내지 56; 또는 서열번호 23의 잔기 89 내지 97인 가변 도메인 CDR 세트를 포함하는, 결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 서열번호 22의 잔기 31 내지 35; 서열번호 22의 잔기 50 내지 65; 서열번호 22의 잔기 98 내지 106; 서열번호 23의 잔기 24 내지 34; 서열번호 23의 잔기 50 내지 56; 및 서열번호 23의 잔기 89 내지 97을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 VH 영역을 포함하는, 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 VH 영역이 서열번호 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 VL 영역을 포함하는, 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VL 영역 아미노산 서열이 서열번호 26, 27, 34, 35, 또는 36인, 결합 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는, 결합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 VH 영역이 서열번호 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 영역이 서열번호 26, 27, 34, 35, 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 사람 수용체 골격이 서열번호 6 내지 21의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 사람 수용체 골격이 서열번호 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 사람 수용체 골격이 하나 이상의 골격 영역 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 골격의 상기 아미노산 서열이 사람 수용체 골격의 서열과 65% 이상 동일하며, 사람 수용체 골격과 동일한 70개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 사람 수용체 골격이 CDR에 인접한 잔기; 당화 부위 잔기; 희귀 잔기; 사람 TNF-α와 상호작용할 수 있는 잔기; CDR과 상호작용할 수 있는 잔기; 정규 잔기; 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기, 버니어 구역내 잔기; 및 초티아-정의된 가변 중쇄 CDR1 또는 캐뱃-정의된 제1중쇄 골격 사이의 중첩 영역의 잔기인 핵심 잔기에서 하나 이상의 골격 영역 아미노산 치환을 포함하는, 결합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 핵심 잔기가 H1, H12, H24, H27, H29, H37, H48, H49, H67, H71, H73, H76, H78, L13, L43, L58, L70, 또는 L80인, 결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 VH 돌연변이가 Q1E, I12V, A24V, G27F, I29L, V29F, F29L, I37V, I48L, V48L, S49G, V67L, F67L, V71K, R71K, T73N, N76S, L78I 또는 F78I인, 결합 단백질.
  17. 제15항에 있어서, 상기 VL 돌연변이가 V13L, A43S, I58V, E70D 또는 S80P인, 결합 단백질.
  18. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 서열번호 24와 서열번호 26; 서열번호 24와 서열번호 27; 서열번호 25와 서열번호 26; 또는 서열번호 25와 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 2개의 가변 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  19. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이 TNF-α의 생물학적 기능을 조절하는, 결합 단백질.
  20. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이 TNF-α를 중화시키는, 결합 단백질.
  21. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이, TNF-α가 이의 수용체와 결합하는 능력을 감소시키는, 결합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 프로-사람 TNF-α, 성숙-사람 TNF-α, 또는 절삭된-사람 TNF-α가 이의 수용체와 결합하는 능력을 감소시키는, 결합 단백질.
  23. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이, TNF-의존성 사이토카인 생성; TNF-의존성 세포 살해; TNF-의존성 염증, TNF-의존성 골 침식; 및 TNF-의존성 연골 손상 중 하나 이상을 감소시키는, 결합 단백질.
  24. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바 약 102M-1s-1 이상; 약 103M-1s-1 이상; 약 104M-1s-1 이상; 약 105M-1s-1 이상; 또는 약 106M-1s-1 이상의 정반응 상수(Kon)를 갖는, 결합 단백질.
  25. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바 약 10-3s-1 이하; 약 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하; 또는 약 10-6s-1 이하의 역반응 상수(Koff)를 갖는, 결합 단백질.
  26. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 약 10-7 M 이하; 약 10-8 M 이하; 약 10-9 M 이하; 약 10-10 M 이하; 약 10-11 M 이하; 약 10-12 M 이하; 또는 약 10-13 M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는, 결합 단백질.
  27. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgA 불변 도메인, 또는 사람 IgE 불변 도메인인 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 중쇄 면역글로불린 불변 영역 도메인이 사람 IgG1 불변 도메인인, 결합 단백질.
  29. 제1항 또는 제27항에 있어서, 상기 결합 단백질이 사람 Ig 카파 불변 도메인 또는 사람 Ig 람다 불변 도메인을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  30. 제28항에 있어서, 상기 사람 IgG1 불변 도메인이 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  31. 제29항에 있어서, 경쇄 면역글로불린 불변 영역 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 사람 Ig 카파 불변 도메인 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 사람 Ig 람다 불변 도메인인, 결합 단백질.
  32. 사람 TNF-α와 결합할 수 있는 결합 단백질로서,
    상기 결합 단백질이
    서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 Ig 불변 중쇄 영역;
    서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 Ig 불변 경쇄 영역;
    서열번호 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 Ig 가변 중쇄 영역; 및
    서열번호 26, 27, 34, 35, 또는 36의 아미노산 서열을 갖는 Ig 가변 경쇄 영역을 포함하는, 사람 TNF-α와 결합할 수 있는 결합 단백질.
  33. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질이 면역글로불린 분자, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, 모노클로날 항체, scFv, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, CDR-접목 항체, 디아바디(diabody), 사람화 항체, 다중 특이적 항체, Fab, 이중 특이적 항체, Fab' 단편, 이특이적 항체, F(ab')2 단편, DVD-IgTM, 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편, VH와 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, dAb 단편, 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 단일쇄 항체인, 결합 단백질.
  34. 제1항의 결합 단백질을 포함하는 결정화된 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질이 결정 형태인, 결합 단백질.
  35. 제34항에 있어서, 상기 결정이 담체-불포함 약제학적 제어 방출 결정인, 결정화된 결합 단백질.
  36. 제34항에 있어서, 상기 결합 단백질이 상기 결합 단백질의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 갖는, 결정화된 결합 단백질.
  37. TNF-α 결합 단백질의 방출을 위한 조성물로서,
    (a) 제1항 또는 제34항의 결합 단백질과 성분(an ingredient)을 포함하는 제형; 및 (b) 하나 이상의 고분자 담체를 포함하는, TNF-α 결합 단백질의 방출을 위한 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 성분이 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌글리콜 및 폴리에티렌글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 상기 고분자 담체가 폴리아크릴산, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리아미노산, 폴리무수물, 폴리뎁시펩타이드, 폴리에스테르, 폴리락트산, 폴리락트산-코-글리콜산, 폴리b-하이드록시부티레이트, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리에틸렌글리콜, 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리오르가노포스파젠, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 말레산 무수물-알킬비닐에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알우론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화폴리사카라이드, 및 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체인, 조성물.
  40. 제1항의 결합 단백질 및 링커 또는 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, TNF-α 결합 단백질 작제물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 결합 단백질이 사람 당화 패턴을 보유하는, TNF-α 결합 단백질 작제물.
  42. 제40항에 있어서, 상기 결합 단백질 작제물이 결정화된 TNF-α 결합 단백질 작제물인, TNF-α 결합 단백질 작제물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 결정화된 TNF-α 결합 단백질 작제물이 담체-불포함 약제학적 제어 방출 결정화된 TNF-α 결합 단백질 작제물인, TNF-α 결합 단백질 작제물.
  44. 제40항에 있어서, 상기 결합 단백질 작제물이 상기 결합 단백질 작제물의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 갖는, TNF-α 결합 단백질 작제물.
  45. 제40항의 TNF-α 결합 단백질 작제물을 포함하는 TNF-α 결합 단백질 접합체로서,
    상기 TNF-α 결합 단백질 접합체가 추가로 면역흡착 분자, 조영제, 치료제 및 세포독성제인 제제(agent)를 포함하는, TNF-α 결합 단백질 접합체.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제제가 방사성 표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생체 발광 표지, 자성 표지 또는 비오틴인 조영제인, TNF-α 결합 단백질 접합체.
  47. 제46항에 있어서, 방사성 표지가 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm인, TNF-α 결합 단백질 접합체.
  48. 제47항에 있어서, 상기 제제가 항대사물, 알킬화제, 항생물질, 성장 인자, 사이토카인, 혈관 생성 억제제, 유사분열 억제제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스 유발제인 치료제 또는 세포독성제인, TNF-α 결합 단백질 접합체.
  49. 제1항의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질을 암호화하는 분리된 핵산.
  50. 제40항의 아미노산 서열을 포함하는 TNF-α 결합 단백질 작제물을 암호화하는 분리된 핵산.
  51. 제49항 또는 제50항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  52. 제51항에 있어서, 상기 벡터가 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, 및 pBJ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  53. 제51항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  54. 제53항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵 세포인, 숙주 세포.
  55. 제53항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 세포인, 숙주 세포.
  56. 제55항에 있어서, 상기 진핵 세포가 원생동물 세포, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포 또는 곤충 세포인, 숙주 세포.
  57. 제55항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 세포, COS 세포 또는 사카로마이세스 세레비지애 세포인, 숙주 세포.
  58. 제53항의 숙주 세포를 TNF-α와 결합하는 결합 단백질을 생성하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, TNF-α와 결합하는 단백질을 제조하는 방법.
  59. 제58항의 방법에 의해 생성된 TNF-α 결합 단백질.
  60. 제1항의 결합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 보조제로서 기능하는, 약제학적 조성물.
  62. 제601항에 있어서, 상기 보조제가 하이알루로니다제인, 약제학적 조성물.
  63. 제60항에 있어서, TNF-α 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 추가 제제가 치료제, 조영제, 세포독성제, 혈관형성 억제제, 키나제 억제제, 동시-투여 분자 차단제, 흡착 분자 차단제, 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 표지, 검출가능한 리포터, TNF-α 길항제, 항류머티즘제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제, 항우울제, 항정신병제, 각성제, 천식 의약, 베타 효능제, 스테로이드 흡입제, 스테로이드 경구제, 에피네프린 또는 이의 유사체, 사이토카인 또는 사이토카인 길항제인, 약제학적 조성물.
  65. 제60항의 약제학적 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 치료 방법.
  66. 제1항의 결합 단백질과 사람 TNF-α를 접촉시켜 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 방법.
  67. TNF-α 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 사람 대상체에서의 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 방법으로서,
    제1항의 결합 단백질을 사람 대상체에게 투여하여 사람 대상체의 사람 TNF-α 활성을 감소시키고/시키거나 치료를 달성하는 단계를 포함하는, 사람 TNF-α 활성을 감소시키는 방법.
  68. TNF-α가 유해한 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    제1항의 결합 단백질을, 사람 IL-12와 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RAGE; 히스타민; 히스타민 수용체 차단제; 브라디키닌; IL-1 알파; IL-1 베타; VEGF; PLGF; 메토트렉세이트; 코르티코스테로이드; 글루코코르티코이드 수용체 조절제; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 또는 비스테로이드성 소염제인 제2 제제의 투여 전에, 이러한 투여와 동시에 또는 이러한 투여 이후에 투여하는 단계를 포함하는, TNF-α가 유해한 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 장애가 호흡기 장애; 천식; 알레르기성 및 비알레르기성 천식; 감염으로 인한 천식; 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV)에 의한 감염으로 인한 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD); 기도 염증성 병태; 호산구 증가증; 섬유증 및 점액 과생성증; 낭포성 섬유증; 폐 섬유증; 아토피성 장애; 아토피성 피부염; 두드러기; 습진; 알레르기성 비염; 알레르기성 위장염; 피부 염증 및/또는 피부 자가면역 병태; 위장 기관의 염증 및/또는 자가면역 병태; 염증성 장 질환(IBD); 궤양성 대장염; 크론병; 간의 염증 및/또는 자가면역 병태; 간경화; 간 섬유증; B형 및/또는 C형 간염 바이러스에 의해 유발된 간 섬유증; 강피증; 종양 또는 암; 간세포 암종; 교모세포종; 림프종; 호지킨 림프종; 바이러스 감염; 세균 감염; 기생충 감염; HTLV-1 감염; 1차 방어 면역 반응의 발현 억제 및 백신접종 동안 1차 방어 면역 반응의 발현억제인, 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 장애가 류마티스성 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 강피증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 죽상 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 질환, 제I형 다분비선 결핍증 및 제II형 다분비선 결핍증, 슈미트 증후군, 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 장병증성 활막염, 클라미디아증, 여시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽상 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질환, 만성 피부 점막 칸디다증, 거대세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유화 폐포염, 후-염증성 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 복합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 미만성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능 저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발성 백혈구 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판상 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증, 굿 파스튜어 증후군, 결절성 다발 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종증 자가면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알콜성 간경변, 알콜-유도 간 손상, 담즙 울혈(choleostatis), 특이체질성 간 질환, 약물-유도 간염, 비-알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, B 그룹 스트렙토코씨(streptococci)(GBS) 감염, 정신 장애(예를 들어, 우울증 및 정신분열증), Th2 형 및 Th1 형 매개 질환, 급성 및 만성 통증(상이한 형태의 통증), 및 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), A베타 지단백혈증, 말단 청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전증, 선암종, 공기 이소성 박동, AIDS 치매 합병증, 알콜-유도된 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-1-안티트립신 결핍, 근위축성 측색 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 변성, 항-CD3 치료요법, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 대동맥 및 말초 결찰증, 대동맥 해부, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥 누공, 운동실조증, 심방 세동(지연 또는 발작성), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 각 차단(bundle branch block), 버키트 림프종, 화상, 심장성 부정맥, 심장성 기절 증후군, 심장 종양, 심근증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼란 또는 다소성 심방 빈맥, 화학치료요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알콜증, 만성 염증 병리, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐심증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양 음성 패혈증, 낭 섬유증, 사이토킨 치료요법 관련 장애, 권투 선수 치매(Dementia pugilistica), 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부염, 피부학적 병태, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환(diabetic ateriosclerotic disease), 미만성 루이체 질환, 확장성 울혈성 심근증, 기저핵 장애, 중년 다운 증후군, CNS 도파민 수용체 차단 약물에 의해 유도된 약물-유도 운동 장애, 약물 감수성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 피부 홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드라이히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 장애, 진균류 패혈증, 가스 괴저병, 위궤양, 사구체신염, 임의의 기관 또는 조직의 이식편 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할러포르덴-스파츠 질환(Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액 투석, 용혈성 요독 증후군/혈전성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, 간염(A), 히스 다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환, 운동과다 운동장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동부족 운동장애, 시상하부-뇌하수체-부신축 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥의 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈 뇌졸중, 연소성 류마티스 관절염(JRA), 연소성 척추 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라, 레슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 지방 부종, 간 이식 거부, 림프 부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌수막염, 수막염 균혈증, 대사성/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다중 시스템 장애, 복합 결합 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 변성(멘첼 데제린-토마스, 샤이-드레거 및 마차도-요셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 아비움 감염증, 마이코박테리움 결핵, 골수 이형성 증후군, 심근 경색, 심근 허혈 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근육 위축증, 호중구 감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 지류 폐색, 폐색성 동맥 질환, OKT3® 치료요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관 복원 과정, 장기 비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부수종양성 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증 질환, 다년성 비염, 심막 질환, 말초 죽상 동맥경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발 신경병증, 장기비대, 내분비병, 모노클로날 감마글로불린병증, 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 자간전증, 전진적 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료요법, 레이노드 현상 및 질환, 레이노드 질환, 레프섬 질환, 일반 협소 QRS 빈맥, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 강피증, 노인 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상 적혈구 빈혈, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수 운동실조, 척수소뇌 변성증, 스트렙토코커스 근염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 과민증, 전신 염증성 반응 증후군, 전신 개시 연소성 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관 확장증, 폐색성 혈전 혈관염, 혈소판 감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정 협심증, 요독증, 요로 패혈증, 두드러기, 심장 판막 질환, 하지 정맥, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균류 감염, 바이러스 뇌염/무균성 수막염, 바이러스-연관 혈구탐식 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군, 윌슨 질환, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식편 거부, 급성 관상 증후군, 급성 특발성 다발 신경염, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병증, 급성 허혈, 성인 스틸스 질환, 원형 탈모증, 과민증, 항-인지질 항체 증후군, 재생불량성 빈혈, 동맥경화증, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가면역 피부염, 스트렙토코커스 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가면역 장병증, 자가면역 청력 손실, 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 심근염, 자가면역 미성숙 난소 부전증, 안건염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 재해성 항인지질 증후군, 셀리악 질환(celiac disease), 경추 척추증, 만성 허혈, 반흔성 유천포창, 다발성 경화증에 대한 위험을 갖는 임상적으로 분리된 증후군(CIS), 결막염, 유년기 개시형 정신 장애, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨 망막병증, 진성 당뇨병, 추간판 탈출증(herniation), 추간판 내장증(prolapse), 약물 유도 면역 용혈성 빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 상공막염, 다형 탈출 홍반, 중증 다형 홍반, 임신성 유천포창, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)(GBS), 건초열, 휴즈 증후군(Hughes syndrome), 특발성 파킨슨 질환, 특발성 간질성 폐렴, IgE-매개 알레르기, 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염, 감염성 안구 염증 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 신장 질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성 각결막염, 쿠스마울 질환 또는 쿠스마울-마이어 질환, 란드리 마비, 랑게르한스 세포 조직구증, 망상 피반(livedo reticularis), 황반 변성, 현미경적 혈관염, 강직성 척추염, 운동 뉴런 장애, 점막 유천포창, 다발성 기관 부전증, 중증 근무력증, 골수 이형성증, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비-A 비-B 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절 JRA, 말초 동맥 폐색성 질환(PAOD), 말초 혈관 질환(PVD), 말초 동맥 질환(PAD), 정맥염, 결절성 다발 동맥염(또는 결절성 동맥주위염), 다발 연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다수관절 JRA, 다발성 내분비 결핍 증후군, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 펌프 후 증후군, 1차 파킨슨병, 전립선 및 직장암 및 조혈 악성 암종(백혈병 및 림프종), 전립선염, 순수적혈구 무형성증, 1차 부신 부전증, 재발성 시신경 척수염, 재협착증, 류마티스성 심장 질환, 사포(활막염, 여드름, 농포증, 과골증, 및 골염), 강피증, 2차 아밀로이드증, 쇼크 폐, 공막염, 좌골신경통, 2차 부신 부전증, 실리콘 관련 결합 조직 질환, 스네돈-윌킨슨(sneddon-wilkinson) 피부증, 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 전신 염증 반응 증후군, 측두 동맥염, 톡소플라스마 망막염, 독성 표피 괴사용해, 횡단 척수염, TRAPS(종양 괴사 인자 수용체 관련 주기성 증후군), 1형 알레르기 반응, II형 당뇨병, 두드러기, 통상의 간질성 폐렴(UIP), 혈관염, 춘계 결막염, 바이러스 망막염, 보그트-고야나기-하라다(Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군(VKH 증후군), 습윤 황반 변성, 상처 치료, 여시니아(yersinia) 및 살모넬라와 연관된 관절증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  71. TNF-α가 유해한 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    제1항의 결합 단백질을, 스테로이드 흡입제; 베타-효능제; 단기-작용성 또는 장기-작용성 베타-효능제; 류코트리엔 또는 류코트리엔 수용체의 길항제; ADVAIR; IgE 억제제; 항-IgE 항체; XOLAIR; 포스포디에스테라제 억제제; PDE4 억제제; 크산틴; 항콜린성 약물; 비만세포-안정화제; 크로몰린; IL-4 억제제; IL-5 억제제; 에오탁신/CCR3 억제제; 히스타민 또는 이의 수용체(H1, H2, H3 및 H4 포함)의 길항제; 프로스타글란딘 D 또는 이의 수용체 DP1 및 CRTH2의 길항제; TNF 길항제; TNF 수용체의 가용성 단편; ENBREL; TNF 효소 길항제; TNF 전환 효소(TACE) 억제제; 무스카린성 수용체 길항제; TGF-베타 길항제; 인터페론 감마; 페르페니돈; 화학치료요법제, 메토트렉세이트; 레플루노미드; 시롤리무스(라파마이신) 또는 이의 유사체, CCI-779; COX2 또는 cPLA2 억제제; NSAID; 면역조절제; p38 억제제; TPL-2, MK-2 및 NFkB 억제제; 부데노시드; 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린; 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 산화방지제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1β 항체; 항-IL-6 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF 또는 PDGF의 항체 또는 작용제; CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이들의 리간드의 항체; FK506; 라파마이신; 마이코페놀레이트 모페틸; 이부프로펜; 프레드니솔론; 포스포디에스테라제 억제제; 아데노신 작용제; 항혈전제; 보체 억제제; 교감신경 흥분제; IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제; IL-1β 전환효소 억제제; TNF-α 전환효소 억제제; T-세포 신호전달 억제제; 메탈로프로테이나제 억제제; 6-머캅토퓨린; 안지오텐신 전환효소 억제제; 가용성 사이토카인 수용체; 가용성 p55 TNF 수용체; 가용성 p75 TNF 수용체; sIL-1RI; sIL-1RII; sIL-6R; 소염성 사이토카인; IL-4; IL-10; IL-11; 또는 TNF-β인 제2 제제의 투여 전에, 이러한 투여와 동시에 또는 이러한 투여 이후에 투여하는 단계를 포함하는, TNF-α가 유해한 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  72. 제67항에 있어서, 대상체에게의 투여가 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉강내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 경구 점막, 설하, 비내 및 경피 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 방식인, 방법.
  73. 면역검사에 의해 피검 시료 중의 TNF-α 또는 이의 단편의 존재를 측정하는 방법으로서,
    상기 면역검사가, 피검 시료를 제1항에 따른 하나 이상의 결합 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 검출 표지와 접촉시키는 것을 포함하는, 면역검사에 의해 피검 시료 중의 TNF-α 또는 이의 단편의 존재를 측정하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 방법이
    (i) 피검 시료를, 상기 TNF-α 또는 이의 단편 상의 에피토프와 결합하는 상기 하나 이상의 결합 단백질 또는 이의 단편과 접촉시켜 제1 복합체를 형성하는 단계;
    (ii) 상기 제1 복합체를, 상기 제1 복합체 상의, 또는 상기 결합 단백질 또는 이의 단편에 의해 결합되지 않은 TNF-α 또는 이의 단편 상의 에피토프와 결합하는 상기 하나 이상의 검출가능한 표지와 접촉시켜 제2 복합체를 형성하는 단계;
    (iii) 상기 제2 복합체 중의 상기 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 근거하여, 상기 피검 시료 중의 TNF-α 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 단계(여기서, 상기 TNF-α 또는 이의 단편의 존재는 상기 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호와 직접적으로 상호연관이 있다)를 추가로 포함하는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 방법이
    (i) 피검 시료를, 상기 TNF-α 또는 이의 단편 상의 에피토프와 결합하는 상기 하나 이상의 결합 단백질 또는 이의 단편과 접촉시켜 제1 복합체를 형성하는 단계;
    (ii) 상기 제1 복합체를, 상기 결합 단백질 또는 이의 단편과의 결합을 위해 상기 TNF-α 또는 이의 단편과 경쟁하는 상기 하나 이상의 검출가능한 표지와 접촉시켜 제2 복합체를 형성하는 단계;
    (iii) 상기 제2 복합체 중의 상기 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 근거하여, 상기 피검 시료 중의 TNF-α 또는 이의 단편의 존재를 검출하는 단계(여기서, 상기 TNF-α 또는 이의 단편의 존재는 상기 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호와 간접적으로 상호연관이 있다)를 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단, 예측 또는 평가하는 단계를 임의로 추가로 포함하는, 방법.
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