KR20230094067A - 척추관절염 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비트로넥틴 유래 생리활성 펩타이드의 척추관절염의 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 척추관절염의 진행을 억제하는 활성을 보유함으로써 척추관절염의 치료제의 활성성분으로 개발될 수 있다.
Description
본 발명은 비트로넥틴(vitronectin) 유래 기능성 펩타이드의 척추관절염 치료, 예방 또는 개선 용도에 관한 것이다.
척추관절염(SpA, Spondyloarthritis)은 인구의 약 0.2 내지 1.61%에 영향을 미치는 염증성 관절염이다. 척추관절염(SpA)는 축형 척추관절염(axial SpA, axSpA)와 말초 척추관절염(peripheral SpA)의 두 가지 하위 유형으로 나눌 수 있다. 축형 척추관절염은 축방향 관절 염증을 유도하고 결국 척추 모서리에서 새로운 뼈 형성을 유도하는데, 이를 syndesmophyte 형성이라고도 한다. 축형 척추관절염(axSpA)의 치료는 염증반응을 감소시키고 축 관절의 비정상적인 뼈 가교를 억제하는 것을 목표로 한다. 축형 척추관졀염의 치료 가이드라인은 축형 척추관절염 및 활성 관절염 증상이 있는 환자의 1차 치료법으로 비스테로이드성 항염증제(NSAID)가 권장되고 있다. 인터루킨(IL)-17은 축형 척추관절염에서 염증과 비정상적인 골과골증(hyperosteosis)을 매개하는데, 축형 척추관절염 환자의 다양한 면역 세포는 IL-17을 발현하며(J.A. Smith, R.A. Colbert, Review: The interleukin-23/interleukin-17 axis in spondyloarthritis pathogenesis: Th17 and beyond, Arthritis & rheumatology (Hoboken, N.J.) 66(2) (2014) 231-41.), Th17 세포(type 17 helper T cell)는 축형 척추관절염의 주요 IL-17 발현 세포 중 하나이다. Th17 세포는 축형 척추관절염 환자의 말초 혈액에서 상향 조절되고, 순환하는 Th17 수준과 조절 T 세포(Treg) 풍부성은 각각 축형 척추관절염 질환 활성도와 양의 상관관계 및 음의 상관관계가 있다. 따라서, Th17/Treg 불균형을 표적으로 하는 것은 축형 척추관절염에 대한 치료 가능성을 가질 수 있다.
현재 여러 척추관절염(SpA) 동물 모델이 보고되었으며, curdlan 유도 SKG 마우스가 그 중 하나이다. SKG 마우스는 ZAP-70W163C 돌연변이를 가지고 있으며, curdlan 면역은 척추의 강직, 장 염증, 포도막염 및 건선 유사 피부 병변을 포함한 여러가지의 척추관절염 특징을 유도한다. ZAP-70W163C 돌연변이는 흉선 T 세포 선택에 중요한 역할을 하므로 이 마우스 모델은 축 관절의 구조적 손상뿐만 아니라 척추 관절염 발병의 T 세포 분화를 평가하는 데 적합하다.
비트로넥틴(vitronectin) 유래 기능성 펩타이드 VnP-16는 최근 골다공증 치료제로 개발된 활성 펩타이드이다. VnP-16은 β1 인테그린-FAK 신호전달을 통해 조골세포 분화를 강화하고, JNK-c-Fos-NFATc1 및 αvβ3 인테그린-c-Src-PYK2 신호전달을 통해 각각 파골세포 분화 및 흡수 활성을 억제한다. 그러나, VnP-16의 척추관절염(SpA) 동물 모델에서의 항염증 효과는 보고되지 않았다.
M. Ruutu, G et al., β-glucan triggers spondylarthritis and Crohn's disease-like ileitis in SKG mice, Arthritis and rheumatism 64(7) (2012) 2211-22.
본 발명자들은 척추관절염의 치료 활성이 있는 물질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 비트로넥틴(vitronectin) 유래 생리 활성 펩타이드가 척추관절염(SpA) 동물 모델에서 Th17 세포 및 Treg 세포의 수준을 조절하는 작용을 통해 척추관절염의 진행을 효과적으로 억제할 수 있음을 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 척추관절염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 2의 아미노산 서열내의 서열번호 1의 아미노산 서열(RVYFFKGKQYWE)을 포함하는 연속하는 12개 내지 173개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "펩타이드"는 2개 이상의 아미노산이 펩타이드 결합으로 연결된 중합체 화합물을 의미한다.
본 발명에서 척추관절염의 치료 또는 예방 용도로 사용되는 펩타이드는 비트로넥틴(vitronectin) 유래 생리활성 펩타이드로서, 서열번호 2의 아미노산 서열내의 서열번호 1의 아미노산 서열(RVYFFKGKQYWE)을 포함하는 연속하는 12개 내지 173개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는 비트로넥틴 유래의 활성 펩타이드로서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 생물학적 활성 펩타이드 모티프(motif)가 유래된 펩타이드로서 상기 펩타이드 모티프를 포함하므로, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열(RVYFFKGKQYWE)을 포함하는 펩타이드가 갖는 활성을 동등하게 보유한다.
본 발명에서 척추관절염의 치료 또는 예방 용도로 사용되는 펩타이드는 비트로넥틴(vitronectin) 유래 생리활성 펩타이드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열 "RVYFFKGKQYWE" 을 포함하는 펩타이드이다.
상기 펩타이드는 상기 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드를 포함할 수 있으며, 또는 동일한 기능을 가지는 단백질 단편의 형태일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하면서 이의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는, 단백질 및 펩타이드 수준에서의 아미노산 변형은 본 발명의 기술분야에 공지되어 있으며, 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열뿐만 아니라 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체를 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지는 서열을 포함하면서 동일한 활성을 가지는 펩타이드라면 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하면서, 척추관절염의 치료, 예방, 개선 활성을 나타내는 20개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 20개 이하, 18개 이하, 15개 이하 또는 12개의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드일 수 있다. 본 명세서에서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는"VnP-16 펩타이드"로도 지칭되면서 설명된다.
본 발명의 상기 펩타이드는 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있으나, 이의 제조방법에 의해 한정되는 것은 아니다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 척추관절염(spondyloarthritis)의 진행을 억제하는 활성을 가지므로, 척추관절염의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
일 구현에에서, 상기 척추관절염은 축형 척추관절염(axial spondyloarthritis) 또는 말초 척추관절염(peripheral spondyloarthritis)일 수 있으며, 구체적으로는 축형 척추관절염일 수 있다.
본 발명에서 치료대상 질환인 "척추관절염"은 "강직성 척추염(ankylosing spondylitis)으로도 지칭될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 본 명세서 구체적인 실시예의 실험결과로 증명되는 바와 같이, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 IL-17으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 본 명세서 구체적인 실시예의 실험결과로 증명되는 바와 같이, Th17 세포 (type 17 helper T cell)의 수준을 하향 조절할 수 있다. 상기 Th17 세포는 CD4+ IL-17+ 세포 또는 CD4+ IL-22+ IL-17+ 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 Treg 세포(regulatory T cell)의 수준을 상향 조절할 수 있다. 상기 Treg 세포는 CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 pSTAT3 s727 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로서 상술한 펩타이드 이외에 비스테로이드성 항염증제를 더 포함할 수 있다.
상기 비스테로이드성 항염증제는 시클로옥시게나아제(COX)의 생성을 차단하거나 이의 활성을 억제하는 약물을 포함한다. 상기 약물은 예를 들어 살리실산, 아스피린, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 나프록센, 페노프로펜, 케토프로펜, 덱스케토프로펜, 플루비오프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 톨메틴, 술리닥, 에토돌락, 케토록락, 디클로페낙, 아세클로페낙, 또는 세레콕시브를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 펩타이드 뿐만 아니라, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 사슬모양으로 길게 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)이며, 일정한 길이 이상의 DNA 핵산 분자 또는 RNA 핵산 분자로서, 본 발명의 펩타이드를 암호화(코딩)하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 펩타이드를 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 재조합 벡터는 세포 내에 도입하여 본 발명의 펩타이드를 안정적으로 발현시키기 위한 수단의 발현 컨스트럭트를 의미하며, 예를 들어 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등 공지의 발현벡터를 포함하며, 이러한 재조합 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 (i) 상술한 본 발명의 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 치료학적 유효량(therapeutically effective amount); 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담쳬를 포함한다.
상기 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 척추관절염의 치료 또는 예방 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 척추관절염을 치료하기 위한 적합한 모든 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10,000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 사용되는 용어 "예방"은 척추관절염 또는 이 질환으로 인한 증상 또는 이 질환의 합병증으로 인한 증상의 발생의 억제 또는 지연을 의미하며, 용어 "치료"는 척추관절염 또는 이 질환의 합병증으로 인한 증상의 경감, 호전, 이롭게 변경 또는 완전한 제거를 의미한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 2의 아미노산 서열내의 서열번호 1의 아미노산 서열(RVYFFKGKQYWE)을 포함하는 연속하는 12개 내지 173개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 치료학적 유효량을 척추관절염 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 척추관절염의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 대상체는 인간 또는 인간을 제외한 포유 동물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 치료학적 유효량을 척추관절염의 치료가 필요한 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 척추관절염의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 대상체는 인간 또는 인간을 제외한 포유 동물을 포함할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 척추관절염의 진행을 억제하는 활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-17A를 생성을 억제하며, Th17 세포(type 17 helper T cell)의 수준을 하향 조절하고, 조절 T 세포(Treg)의 수준은 상향 조절하며, pSTAT3 s727의 발현을 억제한다. 이와 같은 활성을 갖는 본 발명의 펩타이드는 척추관절염의 치료제로 개발될 수 있다.
도 1은 척추관절염(SpA) 마우스에서 비트로넥틴 유래 생리활성 펩타이드 VnP-16의 항관절염 효과를 보여준다. 패널 A는 12주 동안의 주간 평균 임상 점수이다(그룹 당 N=10). 패널 B는 Curdlan 주사 12주 후 SpA 마우스에서 분리된 발목 관절의 hematoxylin and eosin(H&E)/safranin O 염색 이미지이다. 막대 그래프는 관절염 점수를 보여준다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 평균의 표준오차(SEM)이다. *P< 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 2는 VnP-16가 SpA 마우스의 척추염 점수를 감소시킨 결과를 보여준다. curdlan 주입 12주 후 비히클 처리 그룹, celecoxib 처리 그룹, VnP-16 단일 처리 그룹 및 VnP-16 + celecoxib 동시 처리 그룹에서 척추 조직을 수득하고, H&E 및 Safranin O로 염색하였다. 흑색 화살표는 염증 세포 침윤을 나타낸다. 막대 그래프는 척추염 점수를 보여준다. *P< 0.05. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 3은 VnP-16가 척추관절염(SpA)이 있는 마우스의 수핵(nucleus pulposus)에서 염증성 사이토카인 발현을 감소시킨 결과를 보여준다. IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-17A를 발현하는 세포를 수핵에서 면역조직화학 염색으로 계수하였다. *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 4는 VnP-16가 척추관절염(SpA)이 있는 마우스의 연골 종판(cartilaginous end plate)에서 염증성 사이토카인 발현을 감소시킨 결과를 보여준다. 연골 종판에서 IL-1
, IL-6, TNF-α 및 IL-17A의 면역조직화학 염색 결과이다. 데이터는 평균±SEM을 의미한다. *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 5a 내지 도 5c는 VnP-16가 척추관절염(SpA)이 있는 마우스의 섬유륜(annulus fibrosus)에서 Th17 세포(type 17 helper T cell) 및 조절 T 세포(Treg) 집단(population)을 조절하는 결과를 보여준다. 척추 조직을 CD4-FITC, IL-17-PE, CD25-APC, Foxp3-PE로 염색하여 각각 Th17 집단(도 5a), IL-22+ Th17 집단(도 5b) 및 Treg 집단(도 5c)을 평가하였다. 이중 양성 세포(double positive cell)은 막대 그래프에 표시하였다. 데이터는 평균±SEM을 의미한다. *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001. P 값은 비히클 투여 그룹과 비교하여 얻었다.
도 6은 VnP-16이 척추관절염(SpA) 마우스의 비장에서 Th17(type 17 helper T cell) 및 조절 T 세포(Treg) 분화를 조절하는 결과를 보여준다. 비장 조직은 Th17 및 Treg 집단을 결정하기 위해, IL-17A, CD4, CD25 및 Foxp3에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석을 실시하였다. 데이터는 평균±SEM을 의미한다. **P< 0.01. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 7은 VnP-16이 비장세포의 pSTAT3 s727 발현을 억제하는 결과를 보여준다. BALB/c 마우스로부터 채취한 비장세포를 비히클 또는 VnP-16으로 자극하고, 웨스턴 블롯으로 총(total) STAT3, pSTAT3 s727, GAPDH의 발현을 측정하였다. 데이터는 평균±SEM을 의미한다. *P< 0.05. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 2는 VnP-16가 SpA 마우스의 척추염 점수를 감소시킨 결과를 보여준다. curdlan 주입 12주 후 비히클 처리 그룹, celecoxib 처리 그룹, VnP-16 단일 처리 그룹 및 VnP-16 + celecoxib 동시 처리 그룹에서 척추 조직을 수득하고, H&E 및 Safranin O로 염색하였다. 흑색 화살표는 염증 세포 침윤을 나타낸다. 막대 그래프는 척추염 점수를 보여준다. *P< 0.05. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 3은 VnP-16가 척추관절염(SpA)이 있는 마우스의 수핵(nucleus pulposus)에서 염증성 사이토카인 발현을 감소시킨 결과를 보여준다. IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-17A를 발현하는 세포를 수핵에서 면역조직화학 염색으로 계수하였다. *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 4는 VnP-16가 척추관절염(SpA)이 있는 마우스의 연골 종판(cartilaginous end plate)에서 염증성 사이토카인 발현을 감소시킨 결과를 보여준다. 연골 종판에서 IL-1
도 5a 내지 도 5c는 VnP-16가 척추관절염(SpA)이 있는 마우스의 섬유륜(annulus fibrosus)에서 Th17 세포(type 17 helper T cell) 및 조절 T 세포(Treg) 집단(population)을 조절하는 결과를 보여준다. 척추 조직을 CD4-FITC, IL-17-PE, CD25-APC, Foxp3-PE로 염색하여 각각 Th17 집단(도 5a), IL-22+ Th17 집단(도 5b) 및 Treg 집단(도 5c)을 평가하였다. 이중 양성 세포(double positive cell)은 막대 그래프에 표시하였다. 데이터는 평균±SEM을 의미한다. *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001. P 값은 비히클 투여 그룹과 비교하여 얻었다.
도 6은 VnP-16이 척추관절염(SpA) 마우스의 비장에서 Th17(type 17 helper T cell) 및 조절 T 세포(Treg) 분화를 조절하는 결과를 보여준다. 비장 조직은 Th17 및 Treg 집단을 결정하기 위해, IL-17A, CD4, CD25 및 Foxp3에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석을 실시하였다. 데이터는 평균±SEM을 의미한다. **P< 0.01. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
도 7은 VnP-16이 비장세포의 pSTAT3 s727 발현을 억제하는 결과를 보여준다. BALB/c 마우스로부터 채취한 비장세포를 비히클 또는 VnP-16으로 자극하고, 웨스턴 블롯으로 총(total) STAT3, pSTAT3 s727, GAPDH의 발현을 측정하였다. 데이터는 평균±SEM을 의미한다. *P< 0.05. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 얻었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 실험동물
8-10 주령의, ZAP-70W163C 돌연변이가 있는 BALB/c 백그라운드 암컷 SKG 마우스를 Saeronbio, Inc.(Uiwang, South Korea)에서 구입하였다. 마우스를 특정 병원체가 없는 조건하에서 사육하고 표준 마우스 먹이(Ralston Purina, St. Louis, MO)와 물을 임의로 섭취시켰다. 실험은 의과대학 기관동물관리이용위원회와 가톨릭대학교 동물연구윤리위원회의 평가 및 승인을 받았으며, 실험동물복지법 및 관리 및 실험동물이용지침에 따라 수행하였다(No. CUMC-2019-0298-02).
실시예 2. 척추관절염의 유도 및 약물 투여
Curdlan(3 mg/kg)을 8-10 주령 SKG 마우스에 복강 내(IP) 주사하였다. VnP-16 펩타이드는 Pioneer Peptide 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 C-말단 아미드를 사용한 9-플루오레닐메톡시카르보닐 기반 고체상 방법을 통해 합성하였다. 합성한 펩타이드는 펩트론사(Peptron, 대전, 한국)에서 정제하고 그 특성 분석을 행하였다. 실험에 사용된 펩타이드는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 95% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다. NSAID인 celecoxib는 한림약품에서 구입하였다. 마우스를 다음의 4개 그룹으로 나누었다(N=10/그룹): 1) 비히클(인산염 완충 식염수) 투여 그룹, 2) celecoxib 10 mg/일(day) 경구 투여 그룹, 3) VnP-16 600 μg/일(day) 피하 주사 그룹, 4) celecoxib 10 mg/일(day) 경구 투여 및 VnP-16 600 μg/일(day)의 피하 주사 그룹. 치료는 Curdlan 주사 1주 후에 시작하여, 11주 동안 계속 진행하였다. 임상 점수(clinical score)는 종전 연구 문헌(M. Ruutu, G. et al., Arthritis and rheumatism 64(7) (2012) 2211-2222.)에 기재된 바에 따라, 12주 동안 매주 측정하였고, 영향을 받은 관절의 점수는 각 마우스에 대해 합산하였다.
실시예 3. 조직병리학적 분석
말초 관절 및 척추로부터 얻은 조직 샘플을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후에, 7μm 두께로 절편하였다. 절편(section)들은 자일렌(xylene)을 사용하여 탈랍하고, 알코올 구배에서 탈수하였으며, 헤마톡실린 및 에오신(H&E, hematoxylin and eosin)으로 염색하고 사프라닌 O(Safranin O)로 염색하였다. 이어서, 염증에 대해 평가하여 점수로 기록하였다. 말초 관절과 척추의 조직학적 점수는 종래 문헌(M. Ruutu, G. et al., Arthritis and rheumatism 64(7) (2012) 2211-2222.)에서 설명된 바에 따라 계산하였다. 조직병리학적 분석은 맹검 방식으로 3명의 실험자가 채점하였으며, 염색된 조직을 현미경으로 관찰하였다(Olympus, Tokyo, Japan, 배율 : 40Х, 200Х).
실시예 4. 면역조직화학
면역조직화학 분석은 Dako REAL?? Envision?? 검출 시스템 키트(DAKO, Glostrup, Denmark, #5007)를 사용하여 수행하였다. 조직은 먼저 IL-1
, IL-6, IL-17A 및 종양괴사인자(TNF)-α에 대한 1차 항체(모두 Abcam, Cambridge, UK에서 구입)와 함께 4℃에서 하룻밤 처리한 다음, Dako REAL?? Envision??/HRP와 함께 30분 동안 배양하였다. 최종의 착색 산물은 디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 발색체를 사용하여 현상하였다. 3명의 독립적인 맹검 관찰자가 모든 조직학적 점수를 평가하였다. 이미지는 BX41 현미경(Olympus)에 부착된 DP71 디지털 카메라(Olympus, Center Valley, PA)를 사용하여 촬영하였다. Adobe Photoshop 소프트웨어를 사용하여 양성 세포(positive cell)를 계수하고(배율 400x) 조직 절편당 무작위로 선택된 3개의 필드에서 평균을 산출하였다.
실시예 5. 공초점 현미경 관찰
Curdlan 주사 후 12주 째에 마우스의 척추를 제거하고, Th17 세포와 Treg의 분화를 평가하기 위해 척추 조직을 CD4-fluorescein isothiocyanate (FITC), IL-17-phycoerythrin (PE), CD25-allophycocyanin 및 forkhead box P3 (Foxp3)-PE에 대한 항체(모두 eBioscience에서 구입, San Diego, CA)와 반응시켰다. 염색된 조직 절편은 공초점 현미경(LSM 700 Meta; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 시각화하였다. 이중 또는 삼중 양성 세포(positive cell)는 절편당 3개의 고배율 필드(배율 400x)에서 계수하였다.
실시예 6. 유세포 분석
세포 펠렛을 비장 조직으로부터 준비하고, 항-마우스 CD4-페리딘 클로로필 단백질(perCP, CD4-peridin chlorophyll protein) 및 항-마우스 CD25-알로피코시아닌(APC, allophycocyanin)(eBioscience)을 사용하여 조절 T 세포 집단을 조사한 후, 제조사 지침에 따라 Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer 세트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포를 고정화 및 투과화시켰다. Th17 세포 분석을 위해, FAC 염색 전에, 세포를 25 ng/mL의 phosphomolybdic acid(Sigma-Aldrich), 250 ng/mL의 ionomycin(Sigma-Aldrich) 및 Golgi Stop(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)으로 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 자극하였다. 세포를 항-마우스 CD4 PerCP 항체로 염색한 다음, 항-마우스 IL-17 FITC(eBioscience, San Diego, CA, USA) 항체로 염색한 후에, 제조사 지침에 따라, Cytofix/Cytoperm Plus Kit(BD Biosciences)를 사용하여 고정화 및 투과화시켰다. 샘플은 FACSCalibur 기기(BD Pharmingen, BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
실시예 7. 웨스턴 블롯 (Western blotting)
p-STAT3(s727)(cat: #9134, 100kDa, cell signaling, USA), 총 STAT3(cat: #9189, 100kDa, cell signaling, USA) 및 GAPDH(#ab181602, Abcam, UK)의 단백질 수준을 웨스턴 블롯 시스템(SNAP id Protein Detection System, Merck Millipore, Danvers, MD, USA)을 사용하여 측정하였다. BALB/c 마우스로부터 비장세포를 채취한 다음, VnP-16(100μg/mL) 또는 비히클로 2시간 동안 자극한 후에, IL-6(10ng/ml)로 1시간 동안 자극하였다. 이어서, 전체 세포 용해물을 준비하였다. 단백질 농도는 BCA 분석 방법(#23235, thermo, USA)을 사용하여 측정하였고, 시료는 4-12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)을 사용하여 분리한 후에, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)으로 옮겼다. 다음 단백질들에 대한 1차 항체들[p-STAT3 s727(cat: #9134, 100kDa, cell signaling, USA), total STAT3(cat: #9189, 100kDa, cell signaling), GAPDH(cat: ab181602, 36kDa, abcam, UK)]들을 Tris-buffered saline Tween-20의 0.1% 탈지유에서 희석하고, 상온에서 20분 동안 배양하였다. 멤브레인을 세척하고 호오스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 밴드 밀도는 이미지 캡처 농도 측정법으로 산출하였다.
실시예 8. 통계 분석
연속 변수는 평균±평균의 표준오차(SEM)로 표시하고, 그룹 간의 차이는 Kruskall Wallis 테스트를 사용하여 분석하였다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. Windows용 SPSS 20.0(IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
실시예 9. VnP-16은 척추관절염(SpA)의 진행을 억제하였다.
임상 점수를 Curdlan 주입 후 매주 평가하였다(그룹 당 N = 10). VnP-16 + celecoxib 투여 그룹의 임상 점수는 Curdlan 주입 4주 후부터 안락사 시점까지 유의하게 약화되었다(도 1의 패널 A). VnP-16 단독 투여 그룹 및 VnP-16 + celecoxib 투여 그룹의 관절염 점수는 비히클 그룹보다 유의하게 낮게 나타났다(도 1의 패널 B). 또한, VnP-16 단독 투여 그룹 및 VnP-16 + celecoxib 투여 그룹은 비히클 그룹보다 척추염 점수가 더 낮았다(도 2). VnP-16 단독 투여 그룹과 VnP-16 + celecoxib 투여 그룹이 비히클 그룹 보다 면역세포 침윤과 척추 연골 파괴가 덜 심각하였다.
실시예 10. VnP-16은 염증성 사이토카인 발현을 억제하였다.
IL-1β, IL-6, TNF-α 및 IL-17의 발현 수준은 척추 모서리의 수핵(NP, necleus pulposus) 및 연골종판(CEP, cartilaginous end plate)에서 면역조직화학(IHC)에 의해 평가하였다. 척추 모서리의 수핵(NP)에서는, VnP-16 + celecoxib 투여 그룹이 비히클 그룹에 비해 IL-1β 및 TNF-α 발현이 유의하게 억제되었다. 반면, IL-6 및 IL-17A 발현은 VnP-16 단독 투여 그룹 및 VnP-16 + celecoxib 투여 그룹에서 유의하게 억제되었다(도 3). CEP에서는, 4가지 염증성 사이토카인의 발현이 VnP-16 단독 투여 그룹과 VnP-16 + celecoxib 투여 그룹에서 억제되었다(도 4). 흥미롭게도, celecoxib 단독 투여 그룹은 척추관절염의 진행을 억제하지 못한 반면, VnP-16 단독 그룹은 말초 관절/척추의 조직학 점수와 척추에서 친염증성 사이토카인의 발현을 유의성 있게 감소시켰다.
실시예 11. VnP-16는 헬퍼 T 세포(helper T cell) 분화에서 면역 조절 역할을 보였다.
비히클 투여 그룹과 비교하여 VnP-16 단독 투여 그룹 및 VnP-16 + celecoxib 투여 그룹에서, 섬유륜 영역(annulus fibrosus area)에서의 CD4+ IL-17+ 세포 및 CD4+ IL-22+ IL-17+ 세포는 하향 조절되었고, CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포는 상향 조절되었다(도 5). 유세포 분석 결과, CD4+ CD25+ Foxp3+ T 세포는 비히클 투여 그룹과 비교하여, VnP-16 + celecoxib 투여 그룹에서 상향 조절되었음을 보여주었다(도 6). Th17 집단(CD4+ IL-17+ T 세포)은 비히클 투여 그룹에 비해, VnP-16 + celecoxib 투여 그룹에서 감소하는 경향을 보였다. 또한, pSTAT3 s727 발현은 VnP-16 100μg/mL에 의해 유의하게 억제되었는데(도 7), 이러한 결과는 VnP-16의 Th17/Treg 조절 메커니즘을 입증하는 것이다.
상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
The Catholic University of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Composition For Treating Spondyloarthritis
<130> 2021-DPA-4419
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vitronectin Derived Peptide
<400> 1
Arg Val Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Gln Tyr Trp Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 173
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vitronectin Derived Peptide
<400> 2
Pro Ala Glu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Lys Pro Phe Asp Ala Phe Thr
1 5 10 15
Asp Leu Lys Asn Gly Ser Leu Phe Ala Phe Arg Gly Gln Tyr Cys Tyr
20 25 30
Glu Leu Asp Glu Lys Ala Val Arg Pro Gly Tyr Pro Lys Leu Ile Arg
35 40 45
Asp Val Trp Gly Ile Glu Gly Pro Ile Asp Ala Ala Phe Thr Arg Ile
50 55 60
Asn Cys Gln Gly Lys Thr Tyr Leu Phe Lys Gly Ser Gln Tyr Trp Arg
65 70 75 80
Phe Glu Asp Gly Val Leu Asp Pro Asp Tyr Pro Arg Asn Ile Ser Asp
85 90 95
Gly Phe Asp Gly Ile Pro Asp Asn Val Asp Ala Ala Leu Ala Leu Pro
100 105 110
Ala His Ser Tyr Ser Gly Arg Glu Arg Val Tyr Phe Phe Lys Gly Lys
115 120 125
Gln Tyr Trp Glu Tyr Gln Phe Gln His Gln Pro Ser Gln Glu Glu Cys
130 135 140
Glu Gly Ser Ser Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met Met Gln
145 150 155 160
Arg Asp Ser Trp Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp
165 170
Claims (8)
- 서열번호 2의 아미노산 서열내의 서열번호 1의 아미노산 서열(RVYFFKGKQYWE)을 포함하는 연속하는 12개 내지 173개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서,
유효성분으로서 비스테로이드성 항염증제를 더 포함하는, 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서,
상기 척추관절염은 축형 척추관절염(axial spondyloarthritis) 또는 말초 척추관절염(peripheral spondyloarthritis)인 것인, 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서,
상기 펩타이드는 IL-1β, IL-6, TNF-α 및 IL-17으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것인, 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서,
상기 펩타이드는 Th17 세포의 수준을 하향 조절하는 것인, 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서,
상기 펩타이드는 Treg 세포의 수준을 상향 조절하는 것인, 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 청구항 2에 있어서,
상기 펩타이드는 pSTAT3 s727 발현을 억제하는 것인, 척추관절염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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| M. Ruutu, G et al., β-glucan triggers spondylarthritis and Crohn's disease-like ileitis in SKG mice, Arthritis and rheumatism 64(7) (2012) 2211-22. |
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| Publication number | Publication date |
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|---|---|---|---|
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