KR20090028624A

KR20090028624A - 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환 치료용 약제 조성물 및 이의 전달 방법

Info

Publication number: KR20090028624A
Application number: KR1020097000373A
Authority: KR
Inventors: 이승규; 이상규
Original assignee: 포휴먼텍(주)
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2009-03-18
Also published as: JP2009542631A; KR101064914B1; WO2008002107A1; EP2046365A4; US20100173840A1; EP2046365A1

Abstract

본 발명은 Foxp3와 PTD (protein transduction domain)의 컨쥬게이트를 함유하는, 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환을 저해하는 신규한 약제 조성물 및 그 전달방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, Foxp3-PTD는 마우스의 자가 면역 질환 모델에서 T 세포의 활성화를 효과적으로 저해함으로써 자가 면역 질환을 치료 및 억제한다.

Description

자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환 치료용 약제 조성물 및 이의 전달 방법 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING AUTOIMMUNE, ALLERGIC AND INFLAMMATORY DISEASES AND DELIVERY METHOD THEREOF}

본 발명은 Foxp3와 PTD (protein transduction domain)의 컨쥬게이트를 함유하는, 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환을 저해하는 신규한 약제 조성물 및 그 전달방법에 관한 것이다.

Foxp3는 흉선 (thymus)으로부터 유래하는 조절자 T 세포 (Regulatory T cell)에 주로 존재하고 CD4+CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포 분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절자 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉 (cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 행사하는 것으로 밝혀져 있다.

이러한 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포를 인위적으로 제작하고, 또한 이를 임상적으로 응용하기 위하여 레트로바이러스를 이용한 마우스 Foxp3 과발현 T 세포를 마우스의 자가 면역 질환 모델인 EAE (Experimental Autoimmune Encephlaomyelitis), IBD (Inflammatory bowel disease), NOD (Non-Obese Diabetic) 마우스를 이용한 제 1형 당뇨병 모델, 그리고 장기 이식에 있어서의 장기 이식 거부 반응에 이르기까지 다양하게 적용하여 성공한 바 있고 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포 (self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항 CD3, 항 CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다.

Foxp3는 흉선으로부터 분화되어 나오는 조절자 T 세포의 현재까지 알려진 리니지 마커 (lineage marker)로서는 가장 정확한 것으로 알려져 있으며, Foxp3에 존재하는 DNA 결합 부위에 발생한 아미노산의 돌연 변이 및 Foxp3의 류신 지퍼 (leucine zipper) 도메인의 돌연변이는 인간에게 있어서 IPEX (Immune pathology/Polyendocrinopathy/Enteropathy/X-linked) 신드롬을 일으켜, 특히 습진 (eczema) [피부염 (dermatitis)] 및 제 1형 당뇨병이 6-9세 사이의 어린이에 일어나게 하거나 2세 이전에 관련된 유전적 자가 면역 질환으로 인한 사망에 이르게 하는 것으로 알려져 있다. 또한 IPEX 환자의 70％가 이러한 Foxp3의 돌연변이에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다.

한편, 생체 외에서 세포 내로 거대분자를 전달하는 방법에는, 전기충격 (electroporation), 리포좀 (liposome)을 이용한 막 융합, 표면에 DNA가 코팅된 미세 투사체를 이용한 고농도 투사법, 칼슘-인-DNA 침전체를 이용한 배양법, DEAE-덱스트란을 이용한 트렌스펙션 (transfection), 변형된 바이러스 핵산을 이용한 감염, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등이 있다. 또한 최근에는 나노입자 (nanoparticle)를 이용하여 세포 내로 전달하고자 하는 거대분자를 생체 내 및 생체 외에서 세포 내로 전달하기 위해 시도하고 있으나 기술적인 측면 및 임상적인 효과면에서 아직 초기 단계에 있다. 또한, 이러한 방법들은 전형적으로 거대분자를 도입시키고자 하는 전체 세포 중 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 이들을 세포 내로 전달하는 시간 및 효율이 아직 임상적으로 적용할 수 있는 단계에 도달하지 못하고 있다. 또한, 목적세포가 아닌 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 영향을 줄 수 있다.

따라서, 생체 내 및 생체 외 모두에서 세포를 손상시키지 않고 생리활성을 지닌 거대분자를 효과적으로 전달하는 일반적인 방법이 요구되었다 [참고문헌: L.A. Sternson, Ann. N.Y. Acad. Sci., 57, 19-21 (1987)]. 이러한 예로서, 지질 펩타이드의 화학적인 추가 [참고문헌: P. Hoffmann et al. Immunobiol., 177, 158-170(1988)] 또는 폴리라이신이나 폴리아르기닌 같은 염기성 중합체를 사용하는 방법 [참고문헌: W-C. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1872-1876(1978)] 등이 제공된 바 있으나, 이들 방법은 아직 검증되지 않았다. 수송체로서 사용되는 염산 [참고문헌: C.P. Leamon and Low, Proc. Natl. Acd. Sci., USA, 88, 5572-5576(1991)]은 엽산-염 결합체로서 세포 내로 이동된다는 사실이 보고되 었으나, 세포질 안으로까지 전달되는 지는 아직 확인된 바가 없다. 또한, 슈도모나스 외독소 (Pseudomonas Exotoxin)도 수송체의 한 종류로 사용되고 있다 [참고문헌: T.I. Prior et al., Cell, 64, 1017-1023(1991)]. 그러나, 이 시스템에서도 생물학적으로 활성화된 목적하는 물질의 세포 내로의 이동에 관한 효과와 기초 의학적 및 임상적 적용 가능성에 대해서는 명확하지 않다. 따라서, 살아있는 세포의 세포질이나 핵 내로 생물학적으로 활성화된 물질을 보다 더 안전하고 효과적으로 전달할 수 있는 방법이 계속적으로 요구되고 있다.

또한, 단백질과 같은 거대분자 뿐만 아니라, 생체 내부 또는 외부에서 세포 내로의 DNA 및/또는 RNA 전달 역시 생명공학의 기초연구분야 및 의약학적 응용분야에서 매우 중요한 필수기술로 여겨지고 있다. DNA 및/또는 RNA의 세포 내로의 전달은 유전자 치료 및 유전자가 생체 내부 또는 외부에서 생성하는 단백질의 기능을 밝혀내는 기초연구 및 이들을 이용한 새로운 치료제의 개발에 결정적인 역할을 하고 있다. 그러나 DNA 및/또는 RNA 역시 세포막을 효과적으로 통과하지 못하기 때문에 이같은 문제의 해결이 유전자를 이용한 기초 및 임상연구에서 해결해야 할 가장 커다란 과제 중의 하나이다.

이에, 생체 내부 또는 외부에서 DNA 및/또는 RNA의 세포 내 전달을 위하여 리포좀, 나노입자 및 바이러스 벡터 등이 개발되어 그 이용 가능성에 대해 연구되었으나, 이들의 효능 및 부작용에 대하여 개선해야 할 부분이 많이 존재하고 있는 실정이다. 특히, 리포좀을 이용한 경우 세포에 대한 부작용 및 세포독성 (cytotoxicity)의 문제가 심각하여 세포주를 이용한 기초연구에 국한되어 왔으며, 나노입자의 경우 최근 많은 관심이 집중되고 있으나, 생체 내에서 운반입자 (carrier particle)의 분해, 전달 효능 및 이들에 대한 생체 내에서의 면역반응에 대하여 더 많은 연구가 필요한 실정이다. 현재 기초연구 및 임상적 효능면에서 중요한 레트로바이러스 벡터를 이용하는 경우 높은 역가의 바이러스 입자를 만들어 내는 데에 한계가 있고 분열하지 않는 세포에는 감염이 되지 않는다는 단점이 대두되고 있으며, 아데노바이러스 및 아데노부속바이러스 (adeno-associated virus)를 이용하는 경우에도 임상적인 이용이 매우 제한적인 것으로 알려져 있다. 또한, 이들 두 가지의 바이러스 벡터의 경우 잔존하고 있는 바이러스 단백질에 대한 생체 내에서의 면역반응이 유도되어 치료 효과에 의문점이 많이 제시되고 있다. 따라서, 생체 내부 또는 외부에서 DNA 및/또는 RNA를 세포 내로 전달함에 있어 보다 더 효과적이고 부작용이 적은 새로운 세포 내 전달 방법이 계속하여 요구되고 있다.

한편, 생체의 많은 생리적 현상들을 조절하는 의약학적 용도의 단백질들은 대장균 (E. coli)등의 박테리아에서 생산되는 재조합 단백질의 형태로 제작되어 최근 까지 다양한 질병의 치료에 사용되고 있다. 그러나, 박테리아에서 생산된 의약학적 용도의 단백질들은 생체 내의 세포 내에서 생산되는 자연상태의 단백질과 비교하여 그 실질적인 구조 및 기능에 있어 매우 비효율적이기 때문에 이들 단백질들을 효모 (yeast), 곤충 세포 또는 동물 세포에서 생산하거나, 박테리아에서 생산된 재조합 단백질을 리폴딩 (refolding)하여 사용하거나, 유전자전이 동물 (transgenic animal)을 이용하여 생산하려는 연구가 꾸준히 있어 왔다. 그러나, 이같은 새로운 시도는 많은 분자 세포생물학적 중간단계가 필요하고 수율이 매우 낮 으며, 생산비용면에서의 경제성 등이 문제점으로 제기되고 있다. 따라서 박테리아에서 생산된 재조합 의약학단백질을 경제적이고 용이하게 자연상태의 기능과 구조를 지닌 단백질로 변환시키는 것은 질환의 진단, 치료 및 예방을 위한 새로운 단백질 약물의 개발에 결정적인 역할을 할 것으로 생각된다.

이러한 몇 가지 중요한 기초연구 및 임상적 요구에 대한 연구의 결과로서 제시된 것이 PTD (Protein Transduction Domain) 이다. 이 중 가장 많은 연구가 진행된 것은 인간 면역 결핍 바이러스-1 (Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)의 전사인자인 Tat 단백질로서 [참고문헌; Schwarze SR et al, 3:285(5433):1569-1572, 1999 Science], 이 단백질은 세포막을 통과함에 있어 86개의 아미노산으로 구성된 완전한 형태일 때 보다 양전하를 갖는 아미노산들이 집중적으로 분포되어 있는 47번째부터 57번째 아미노산 (YGRKKRRQRRR)으로 구성된 형태일 경우가 더욱 효과적임이 밝혀졌다 [참고문헌: Fawell S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668(1994)]. 이와 같이, PTD로서의 효과가 확인된 다른 예로는 HSV-1 (Herpes Simplex Virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산 [참고문헌: Elliott G. et al. Cell, 88,223-233(1997)], 및 초파리 드로소필라 (Drosophila)의 ANTP (Antennapedia) 단백질의 339번째부터 355번째까지의 아미노산 [참고문헌: Schwarze S.R. et al. Trends Pharmacol Sci. 21, 45-48(2000)] 등이 있다. 상기 PTD들의 아미노산의 서열을 비교하여 보면, 라이신과 아르기닌을 많이 포함하고 있으며, 특히 아르기닌이 세포내 물질전달에 중요한 것으로 생각되었다. 이같은 사실은 전기적으로 양성인 아미노산들을 나열한 인위적인 펩타이드의 경우에도 물질전달효과가 확인됨으로써 증명되었다 [참고문헌: Laus R. et al. Nature Biotechnol. 18, 1269-1272(2000)].

위에서 언급된 기존의 PTD와는 다른 성격을 가진 새로운 PTD인 MTS가 합성, 제작되었으며 [참고문헌:DaeWoong Jo et al., Nat. Biotech. Vol. 19, 2001], 이들의 아미노산의 서열은 FGF (Fibroblast Growth Factor)의 시그날 펩타이드의 아미노산 서열을 기초로 하여 합성되었다.

본 발명자들은 이전의 연구에서 쥐의 단백질전사인자에서 Hph-1-BTM (서열번호: 1) 및 인간의 전사인자에서 Sim-2-BTM (서열번호: 2)를 발견하였으며, 특히 Hph-1-PTD의 경우 인간의 단백질인 Hph-1을 포함한 20여개의 인간단백질에서 이들 아미노산서열이 100％ 보존된 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 T 세포의 활성화를 저해하는 막 단백질인 CTLA-4의 세포질부분과 Hph-1-PTD가 융합된 새로운 단백질신약을 제작하여, 이 융합단백질이 T 세포의 활성화를 효과적으로 저해하며, 기도를 통하여 전달하였을 때 염증성 면역질환인 천식을 매우 효과적으로 치료함을 밝혔다 [참고문헌 : Choi JM, et al, 2006, Nat Med, May;12(5) : 574-579].

이 같은 PTD를 이용한 거대분자의 세포 내 전달 작용 기작으로는 세포 표면의 세포막을 파괴하여 세포 내로 전달한다는 가설과 PTD가 세포 외부에 존재하는 거대분자를 세포막의 일부를 이용하여 세포 내로 새로운 소포 (vesicle)를 형성하여 이동시키고 세포 내에서 방출한다는 두 개의 가설이 존재한다. 또한 거대분자의 세포 내 전달을 가능하게 하는 PTD는 작은 크기의 펩타이드이나 자체 내의 구조적 특성을 가지고 있어 세포막에 새로운 채널을 형성할 수 있다는 가설도 제시되고 있 다 [참고문헌: Becker-Hapak M, et al, 2001, Methods, Jul:24(3):247-256].

기술적 과제

본 발명은 Foxp3와 PTD의 컨쥬게이트를 함유하는 신규한 약제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 신규한 약제 조성물을 사용하여 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환을 효과적으로 저해하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

기술적 해결방법

본 발명자들은 Foxp3 단백질의 효율적인 세포내 전달을 위해, Mph-1-PTD와 Foxp3의 컨쥬게이트를 제조하고, 이를 함유하는 신규한 약제 조성물이 T 세포의 활성화를 효과적으로 저해하고 염증성 면역질환인 천식과 류마티스 관절염의 동물모델에서 우수한 질환치료효과가 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

유리한 효과

본 발명에 따른 Foxp3와 PTD의 컨쥬게이트를 함유하는 약제 조성물은 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환의 발병을 효과적으로 저해할 수 있다.

도 1은 본 발명의 pRSET-B-H2FX3의 벡터구조를 도시한 것이다. pRSET-B 벡터에 Hph-1과 Foxp3를 코딩하는 DNA가 삽입되어 있다.

도 2는 본 발명의 Hph-1-Foxp3 (Hph-1-Hph-1-Foxp3)의 단백질 정제 사진으로, 용출 완충액 (Elution buffer)으로 최종 정제하여 코우마쉬 블루 염색법으로 단백질이 발현되어 나온 것을 확인한 것이다.

도 3은 Hph-1-Foxp3의 세포 내 전달 결과를 도시한 것으로, 각 농도 별로 Foxp3 단백질을 세포에 처리하여 세포 내로 농도에 비례하여 들어가는 것을 확인한 것이다.

도 4는 Hph-1-Foxp3의 저해성 전사인자로서의 효과를 도시한 것으로, Hph-1-Foxp3 단백질의 농도가 증가함에 따라 세포 내에 이전에 트렌스펙션해서 발현시킨 루시퍼라제의 활성이 감소한 것을 확인한 것이다.

도 5는 Hph-1-Foxp3의 IL-2 발현 저해 효과를 도시한 것으로, Hph-1-Foxp3의 농도가 증가함에 따라 IL-2의 발현양이 감소한 것을 ELISA 방법으로 확인한 것이다.

도 6은 Tat-Foxp3의 IL-2 발현 저해 효과를 도시한 것으로, Hph-1-Foxp3의 농도가 증가함에 따라 IL-2의 발현양이 감소한 것을 ELISA 방법으로 확인한 것이다.

도 7은 Hph-1-Foxp3의 주르케트 T 세포분열 저해 효과를 도시한 것으로, 주르케트 T세포에 Hph-1-Foxp3를 처리하여 농도에 따라 세포분열이 저해되는 정도가 커지는 것을 확인한 것이다.

도 8은 Hph-1-Foxp3의 염증억제효과를 도시한 것으로, BAL fluid 에서의 림프구의 수를 나타낸 그래프이다.

도 9는 Hph-1-Foxp3의 염증억제효과를 도시한 것으로, Penh 값으로 측정된 기도 저항성을 나타낸다.

도 10은 Hph-1-Foxp3의 류마티스관절염의 유발된 동물에서의 치료효과를 나타낸 것으로서, 임상스코어(clinical score)를 나타낸다.

도 11은 Hph-1-Foxp3의 류마티스관절염의 유발된 동물에서의 치료효과를 나타낸 것으로서, 병리학적 발견(pathological finding)을 나타낸다.

도 12는 CD4+CD25- T 세포에 Hph-1-Foxp3를 형질도입한 세포의 컨택트 저해(contact inhibition) 효과를 나타낸 것으로서, MACS를 이용한 CD4+CD25- T세포의 분리를 나타낸다.

도 13은 CD4+CD25- T 세포에 Hph-1-Foxp3를 형질도입한 세포의 컨택트 저해(contact inhibition) 효과를 나타낸 것으로서, 류마티스 관절염이 유발된 동물에서 Hph-1-Foxp3가 형질도입된 세포에 의한 임상 스코어 감소 효과를 나타낸다.

도 14는 CD4+CD25- T 세포에 Hph-1-Foxp3를 형질도입한 세포의 컨택트 저해(contact inhibition) 효과를 나타낸 것으로서, 류마티스 관절염이 유발된 동물에서 Hph-1-Foxp3가 형질도입 된 세포에 의한 염증 매개 사이토카인의 억제효과를 나타낸 것이다.

발명의 실시를 위한 형태

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 펩타이드인 PTD (protein transduction domain)와 Foxp3의 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트는 PTD를 코딩하고 있는 뉴클레오타이드 서열과 Foxp3의 유전자를 클로닝으로 융합하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른, Foxp3는 PTD의 세포내 침투 및 전달효과에 의해 용이하게 세포막을 통과하여 병소부위의 세포내로 전달된다. 그 결과 분리된 PTD-Foxp3 융합단백질은 질병의 억제, 치료 및 저해 효과를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 PTD는 단백질, 펩타이드 및 화학화합물 등을 피부, 안구 또는 기도를 통해 체내로 전달하는 특성이 매우 우수하므로, 약물과 컨쥬게이트로서 제공되는 경우 다양한 투여 경로를 통해 이를 체내 국소부위로 전달할 수 있음을 증명하였다.

본 발명에서 PTD는 본 발명자들이 개발하여 특허출원 한 것으로서 하기 서열번호: 1 및 서열번호: 2 의 펩타이드를 고상 합성법에 의해 제작하여 이용하였으나, 목적하는 전달 부위 및 사용하는 링커에 따라 다른 종류의 PTD 가 이용될 수 있음은 물론이다. PTD는 아미노산이 3 내지 30개로 구성되고 아미노산 중 적어도 30％ 이상이 아르기닌인 것이 바람직하다.

Hph-1-BTM:

Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg (서열번호: 1);

Sim-2-BTM:

Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg (서열번호: 2);

HIV-1 TAT:

YGRKKRRQRRR (서열번호: 3);

ANTP:

RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호: 4);

Vp22:

DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (서열번호: 5);

R7:

RRRRRRR (서열번호: 6);

MTS:

AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP (서열번호: 7);

Pep-1:

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (서열번호: 8); 및

Pep-2

KETWFETWFTEWSQPKKKRKV (서열번호: 9).

본 발명에 따른 Foxp3와 PTD의 컨쥬게이트를 함유하는 약제학적 조성물은 크론씨병 (Crohn disease), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 고초열 (hay fever), 아토피 (atopy), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 유육종증 (sarcoidosis), 인슐린 의존형 당뇨병 (insulin dependent diabetes mellitus), 자가면역성 갑상선염 (autoimmune thyroiditis), 강직성 척수염 (ankylosing spondylitis), 경피증 (scleroderma) 등의 자가면역질환; 천식 (Asthma), 접촉성 피부염 (contact dermatitis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 알러지성 기관지염 (allergic bronchitis), 결절성 홍반 (erythema nodosum), 알레르기성 결막염 (allergic conjunctivitis) 등의 알러지성 질환; 및 염증성 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.

실시예 1: Foxp3 를 포함하는 발현벡터 제조

사람의 전사인자인 Hph-1 (GenBank accession no.: NP 004417.2)의 N-말단으로부터 850번째 아미노산인 티로신으로부터 860번째 아미노산인 아르기닌까지의 펩타이드를 코딩하는 염기서열 (5'-TATGCACGTGTTCGGAGGCGTGGACCCCGCCGC-3') (서열 번호: 10) 및 Foxp3 (입수처: Shimon Sakaguchi, Kyoto 대학, GenBank accession no. NM 054039, 서열번호: 13)를 코딩하는 염기서열을 결합시키기 위하여, Hph-1의 N-말단으로부터 850번째 아미노산인 티로신으로부터 860번째 아미노산인 아르기닌까지의 염기 서열을 2번 중복하여 가지고 있는 pRSETB 벡터 (입수처: Invitrogen, cat.＃ V351-20)에 클로닝을 위한 제한효소 EcoRI 에 해당하는 염기서열 (5'-GAATTC-3')과 Foxp3 염기 서열의 5' 말단 (5'-CCCAACCCTAGGCCAGCC-3') (서열 번호: 11), 그리고 Foxp3 염기 서열의 3' 말단에 해당하는 서열 (5'-ACGAGGTTAGGGACGGGAACT-3') (서열 번호: 12)과 클로닝을 위한 제한효소 HindIII에 해당하는 프라이머 (5'-AAGCTT-3')를 합성하고, 단백질의 전체 유전자가 포함되어 있는 pGEX (Shimon Sakaguchi, Kyoto 대학)를 주형으로 하여 pfu turbo DNA 중합효소 (Stratagene, cat.＃ 600252-51)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

PCR에서 수득한 반응생성물을 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단한 후, 퀴아 퀵(Quiaquick) PCR 정제키트 (QIAGEN, cat.＃ 28104)를 사용하여 정제한 다음, 겔 추출 방법으로 정제한 pRSETB (입수처: Invitrogen, Cat.No. V351-20)의 EcoRI/HindIII 위치에 클로닝하여 제조합 발현벡터를 제조하고 이를 pHph-1-Foxp3 이라 명명하였다.

실시예 2: 대장균 형질전환체의 제조 및 융합단백질의 발현 및 정제

실시예 1에서 제조된 발현벡터 pHph-1-Foxp3를 사용하여 대장균 BL21-Star (입수처: Stratagene) 를 열충격 형질전환방법 (heat shock transformation)으로 형질전환시킨 다음, 형질전환된 대장균을 4㎖의 LB 배지 (입수처: BD Biosciences )에 접종하고 14시간 동안 37℃에서 교반하면서 전 배양하였다. 다음, 이를 다시 250㎖의 LB 배지 (1000ml 당 카세인의 팬크리아틱 다이제스트 10g, 이스트 익스트랙트 5g, 염화나트륨 10g 함유)에 접종하고 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 1mM 농도의 IPTG (GibcoBRL cat.＃ 15529-019)를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하여 융합단백질의 발현을 유도하였다. 상기 배양액을 4℃에서 6,000rpm으로 20분간 원심분리하여 펠렛 (pellet)만 남기고 상등액을 제거한 후, 10㎖의 완충용액 1 (100mM NaH₂PO₄, 10mM Tris-Cl, 6M GuHCl, pH 8.0)로 펠렛을 풀어준 다음, 얼음에서, 초음파 분쇄기 (Heat systems, ultrasonic processor XL)를 사용하여 300W의 세기로 6초간 초음파를 주입하고 6초간 냉각하는 과정을 반복하여 누적 초음파 주입시간을 5분으로 하여 펠렛이 완전히 풀려서 용액의 색깔이 투명하게 될 때까지 했다. 용출액을 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리 하여 대장균의 파쇄물을 제거하고 순수한 용출액만을 분리하였다. 분리된 용출액에 0.5㎖의 50％ Ni²⁺-NTA 아가로스 슬러리 (Qiagen, cat＃ 30230)를 넣고 상온에서 200rpm으로 1시간 동안 교반하여 융합단백질과 Ni²⁺-NTA 아가로즈를 결합시키고, 이 혼합액을 크로마토그래피용 0.8 x 4 cm 칼럼 (BioRad, cat.＃ 731-1550)에 넣어 흘려주었다. 10㎖의 완충용액 2 (100mM NaH₂PO_4, 10mM Tris-Cl, 4M GuHCl, pH 6.3)를 사용하여 두 차례 세척을 한 후, 1㎖의 완충용액 3 (100mM NaH₂PO₄, 10mM Tris-Cl, 2M GuHCl, pH 4.5)로 융합단백질을 분획하고, PD-10 염제거 칼럼(아머샴 파마시아 바이오텍 cat.＃ 17-0851-01)으로 염을 제거하였다. 분리정제된 PTD-Foxp3 융합단백질을 SDS-PAGE 실시한 후 코우마쉬 블루 염색법으로 확인하였다 (도 2 및 도 3).

실시예 3: PTD-Foxp3의 저해성 전사인자 (repressive transcriptional factor)로서의 효과

Foxp3의 기능은 Foxp3 내에 존재하는 포크헤드 (forkhead) DNA 결합 도메인이 게놈 내에 존재하는 포크헤드 결합 부위에 결합하여 유전자 전사를 저해하는 역할을 수행하여 일어나는 것으로 알려져 있다. 포크헤드 결합 부위가 3개 연속하여 배열되어 있고 그 뒤로 루시퍼라제 유전자가 코딩된 FKH-luc 리포터 작제물을 트랜스펙션 효율을 표준화하기 위한 레닐라 (Renilla) TK 플라스미드 (Promega)와 함께 트랜스펙션 한 후 PTD-Foxp3를 293 세포에 24시간 동안 100nM로 도입시켰을 때 루시퍼라제 활성이 저해되었다 (도 4).

실시예 4: Hph-1-Foxp3의 마우스 주르케트 T 세포주에서의 IL-2 분비 저해 효과

Foxp3의 기능은 T 세포에서 IL-2 사이토카인의 생성을 저해하는 것으로 알려져 있다. Hph-1-Foxp3가 이러한 역할을 수행할 수 있는지 알아보기 위하여 Hph-1-Foxp3를 마우스의 T 세포주인 EL-4 T cell에 도입한 후 마우스의 T 세포 수용체를 통한 활성화 및 보조 단백질 CD28을 통한 T세포 활성화를 동시에 유도하기 위하여 항-CD3 (eBioscience, Cat No. 16-0031) 및 항-CD28 (eBioscience, Cat No. 16-0281)를 각각 1 mg/ml로 바닥면이 편평한 96 웰 플레이트 (TPP. Cat No.92096)에 코팅한 후 PBS (Phosphate buffered Saline)로 1회 세척한 후, PTD-Foxp3를 각각 10 nM, 25 nM, 100 nM로 도입한 뒤 PBS로 3회 세척된 1 x 10⁵ 의 EL-4 T 세포를 미리 코팅된 플레이트에 넣고 10％의 우혈청 (FBS)가 함유된 RPMI-1640 (Biowhittaker, Cat.No.12-702F)배지를 첨가한 후 24시간 동안 T 세포에 자극을 준 후 세포 및 상등액을 원심분리하여, 이 중 상등액을 얻은 후 IL-2 ELISA (R＆D system, Cat No. M2000)를 실시한 결과를 도 5에 도시하였다. EL-4 T 세포에 Hph-1-Foxp3를 농도별로 (0, 100nM, 500nM, 1μM) 처리하였을 때 농도에 비례해서 IL-2의 농도가 감소된 것이 도 5에 도시된 바와 같이 확인되었다.

실시예 5. Tat-Foxp3 의 주르케트 T 세포주에서의 IL-2 분비저해 효과

다른 종류의 PTD 에서도 동일한 효과가 나타나는지를 확인하기 위하여 가장 많이 연구용으로 사용되고 있는 HIV 유래의 PTD 인 Tat-PTD 를 이용하여 재조합 단 백질을 제조하였다. 발현벡터의 제조공정은 실시예 1과 동일하며, Hph-1 대신에 Tat의 유전자 (서열번호: 3)를 삽입하였고, 재조합 단백질의 발현 및 정제공정은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. Tat-Foxp3의 IL-2 분비 저해효과를 확인하기 위해 Tat-Foxp3 단백질을 농도별로 0, 100nM, 500nM, 1μM 처리하였으며, IL-2 의 ELISA 분석은 실시예 4의 방법에 따랐다. 도 5와 같이 PTD 의 종류에 무관하게 IL-2 분비는 억제되었음을 확인하였다.

실시예 6. Hph-1-Foxp3의 주르케트 T 세포주에서의 세포 분열 저해 효과

Foxp3의 기능은 T 세포의 분열을 생성을 저해하는 것으로 알려져 있다. Hph-1-Foxp3가 이러한 역할을 수행할 수 있는지 알아보기 위하여 Hph-1-Foxp3를 Jurkat T cell에 도입한 후 T세포 수용체를 통한 활성화 및 보조 단백질 CD28을 통한 T세포 활성화를 동시에 유도하기 위하여 항-CD3 (BD Pharmingen, Cat No. 555329) 및 항-CD28 (BD Pharmingen, Cat No. 555725)를 각각 1 g/ml로 바닥면이 편평한 96 웰 플레이트 (TPP. Cat No.92096)에 코팅한 후 PBS (Phosphate buffered Saline)으로 1회 세척한 후, HPH-1-Foxp3를 각각 10 nM, 25 nM, 100 nM로 도입한 뒤 PBS로 3회 세척된 1 x 10⁵ 의 세포를 미리 코팅된 플레이트에 넣고 10％의 우혈청 (FBS)가 함유된 RPMI-1640 (Biowhittaker, Cat.No.12-702F)배지를 첨가한 후 24시간 동안 T세포에 자극을 준 후 CCK-8 (Company, Cat.No.CK04)를 20 l 씩 하나의 96 well에 첨가한 후 2시간 동안 세포 배양 용도의 37℃의 인큐베이터에 방치한 후 420 nm에서 ELISA reader (Molecular Devices, Cat No. BN02423)로흡광도를 측정하여 얻은 결 과를 도 7에 표시하였다. 도 7에서 농도별로 Hph-1-Foxp3를 처리해 준 바와 같이 처리해 주었을 때 농도에 따라서 주르케트 T cell의 세포분열 정도가 감소한 것을 확인할 수 있다.

실시예 7: PTD-Foxp3의 마우스 에서의 천식 저해 효과

천식을 유발시키기 위하여, 6주령의 BALB/C 마우스 (Charles River Technology) 에 1일 및 14일에 aluminum hydroxide (Sigma, 1330-44-5) 20mg에 에멀젼화시킨 OVA (Ovalbumin, Sigma, 9006-59-1) 100 ㎍ 씩을 복강 내로 주사하였다. 또한 15일, 16일, 17일째에 1.5mg OVA를 주사하여 천식을 유발하였다. 천식이 유발된 마우스에 Foxp-3의 효과를 파악하기 위하여 본 실험에서는 마우스의 Foxp-3를 이용한 새로운 재조합 단백질을 제조하였다. 사람 유래의 Foxp-3와 마우스 유래의 Foxp-3는 83％의 적합성을 갖고 있으나, 시험의 정확성을 고려하여 마우스 Hph-1-Foxp3 (마우스, 서열번호: 14, Genbank NM054039)를 제조하였다. 제조 방법은 실시예 1 및 2에 의거하였다. 천식이 유도된 마우스에 Hph-1-Foxp3를 nasal delivery 를 통해 1 ㎍, 10㎍, 25 ㎍ 씩 주 2회 4주간 투여하였으며, 4주후 동물을 희생하여 BAL fluid 에서의 염증매개 세포의 개수(도 8)와 기도 저항성(도 9)을 분석하였다.

실시예 8: 류마티스 관절염모델에서의 Hph-1-Foxp3의 효과

류마티스 관절염을 유발시키기 위하여, DBA/1 마우스 (중앙실험동물)에 타입 II 콜라겐 (Sigma, C1188)을 프로인트 완전 애주번트 (Sigma, F5881)에 에멀젼화 하고, 100㎍씩 시험 개시일 및 2주차에 피하 주사하여 면역화시켰다. 면역화를 시작한지 4주 경과 후부터 Hph-1-Foxp3을 주 2회 4주간 100ng, 1㎍, 10㎍ 씩 투여하 여 임상 스코어 (도 10)와 조직화학염색 (도 11)을 통해 Hph-1-Foxp3의 효과를 검증하였다.

실시예 9: Hph-1-Foxp3가 형질도입된 CD4+CD25- T세포를 이용한 세포 치료 효과

Foxp3를 발현하는 조절자 T 세포는 세포-세포간 접촉 (cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-gamma 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 행사하는 것으로 밝혀져 있다. 이에 마우스의 비장(spleen)으로 부터 분리된 CD4+CD25- T세포에 Hph-1-Foxp3 를 형질도입 하고 Hph-1-Foxp3가 형질도입된 세포를 자가면역질환이 유도된 마우스에 처리함으로써 이식된 세포의 접촉저해(contact inhibition)를 통해 치료효과를 나타낼 수 있다. 본 발명자들은 먼저 DBA/1 마우스 (입수처: 중앙실험동물)의 비장을 분리하고 CD4+CD25+ 단리 키트(Miltenyi Biotec, 130-091-041)를 이용하여MACS (Miltenyi Biotec)로 CD4+CD25(-)(+)를 분리하였다. (도 12) 이와 같이 분리된 CD4+CD25- T세포에 Hph-1-Foxp3를 1 μM 농도로 처리하고, 3 시간 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 1,000 rpm으로 3분간 원심분리하고, PBS(phosphate-buffered Saline, 137 mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄)로 세척하였으며, 이 공정을 3회 반복하였다. 이렇게 준비된 세포를 1x10 세포/100㎕ 의 농도로 PBS에 현탁하여 실시예 8에서와 같이 류마티스 관절염이 유도된 마우스에 세포현탁액 100 ㎕를 꼬리정맥을 통해 1분간 천천히 주사하였다. 세포 현탁액을 1회 주사하고 4주 간 마우스를 모니터링하면서 임상 스코어를 측정 (도 13)하고, 4주 후 혈액 내에서 TNF-α, IL-6를 분석(도 14)하였다. 분석 결과 CD4+CD25- T세포에 Hph-1-Foxp3를 형질도입한 세포는 접촉 억제를 통해 면역억제 세포치료제로서 기능을 할 수 있음을 확인하였다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 Foxp3와 PTD의 컨쥬게이트를 함유하는 약제 조성물은 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환의 발병을 효과적으로 저해할 수 있다.

Claims

자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환을 치료하기 위한, 약제학적 유효량의 Foxp3-PTD 컨쥬게이트를 함유하는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, PTD가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 및 서열번호: 9로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, PTD가 5개 내지 30개의 아미노산으로 구성되고, 구성 아미노산 중 30％ 이상이 아르기닌임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 자가면역질환은 크론씨병 (Crohn disease), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 고초열 (hay fever), 아토피 (atopy), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 유육종증 (sarcoidosis), 인슐린 의존형 당뇨병 (insulin dependent diabetes mellitus), 자가면역성 갑상선염 (autoimmune thyroiditis), 강직성 척수염 (ankylosing spondylitis), 또는 경피증 (scleroderma)임을 특징으 로 하는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 자가면역질환은 크론씨병 (Crohn disease), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 고초열 (hay fever), 아토피 (atopy), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 유육종증 (sarcoidosis), 인슐린 의존형 당뇨병 (insulin dependent diabetes mellitus), 자가면역성 갑상선염 (autoimmune thyroiditis), 강직성 척수염 (ankylosing spondylitis), 또는 경피증 (scleroderma)임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 알러지성 질환은 천식 (Asthma), 접촉성 피부염 (contact dermatitis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 알러지성 기관지염 (allergic bronchitis), 결절성 홍반 (erythema nodosum), 또는 알레르기성 결막염 (allergic conjunctivitis)임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 알러지성 질환은 천식 (Asthma), 접촉성 피부염 (contact dermatitis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 알러지성 기관지염 (allergic bronchitis), 결절성 홍반 (erythema nodosum), 또는 알레르기성 결막염 (allergic conjunctivitis)임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 정맥내주사, 동맥내주사, 근육내주사, 피하내주사, 결막내주사, 경피전달 또는 기도흡입으로 체내 투여 됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
Foxp3-PTD 컨쥬게이트로 구성된 재조합단백질 처리하여 면역억제활성을 갖는 T세포.
Foxp3-PTD 컨쥬게이트로 구성된 재조합단백질 처리하여 면역억제활성을 갖는 T세포를 제조하는 방법.
자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환을 치료하기 위한, 약제학적 유효량의 제 9항의 T세포를 함유하는 약제학적 조성물.