NO327854B1

NO327854B1 - DNA-sekvens, replikerbar ekspresjonsvektor, transformert eukaryot eller prokaryot vertscelle; RAP-2 protein, isoform, fragment, funksjonell analog eller derivater derav samt fremgangsmate for fremstilling og anvendelse derav; farmasoytisk preparat, anvendelse av en rekombinant dyrevirusvektor og en vektor kodende for ribozym sekvens.

Info

Publication number: NO327854B1
Application number: NO20004649A
Authority: NO
Inventors: David Wallach; Andrei Kovalenko; Marshall S Horwitz; Yongan Li
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2009-10-05
Also published as: CN1295614A; CN1232641C; SK285804B6; WO1999047672A1; IL126024A0; HUP0101612A2; KR100748293B1; EE200000538A; EP1062336A1; JP4351389B2; BG65684B1; AU2954599A; DK1062336T3; PL200763B1; BG64990B1; BG109537A; NZ525566A; BR9909659A; ATE318310T1; CA2625284A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA-sekvens, replikerbar ekspresjonsvektor, transformert eukaryot eller prokaryot vertscelle; RAP-2 protein, isoform, fragment, funksjonell analog eller derivater derav samt fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse derav; antistoffer eller aktive fragmenter eller derivater samt anvendelse derav; farmasøytisk preparat, anvendelse av en rekombinant dyrevirusvektor og en vektor kodende for en ribozym sekvens.

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder generelt feltet reseptorer som tilhører TNF/NGF-superfamilien av reseptorer og kontroll av disses biologiske funksjoner. TNF/NGF-superfamilien av reseptorer omfatter reseptorer som p55 og p75 tumor nekrose faktor reseptorer (TNF-R, i det påfølgende betegnet p55-R og p75-R) og FAS ligand reseptoren (også betegnet FAS/APOl eller FAS-R og i det påfølgende betegnet FAS-R) og andre.

RAP-2 bindes til RIP ("reseptor interagerende protein") og kan modulere eller formidle funksjonen av RIP, og er derved også i stand til å modulere eller formidle, direkte eller indirekte, funksjonen til andre proteiner som bindes til RIP direkte eller indirekte. RAP-2-bindende proteiner er modulatorer/formidlere av RAP-2-funksjon.

WO 1996/025941 beskriver modulatorer av regulatoriske intracellulære hendelser mediert av regulatoriske proteiner inneholdende et 'death domain' motiv som kan være proteiner, peptider eller antistoffer eller fragmenter derav eller organiske molekyler. 'Death domain' er en regulatorisk del av de regulatoriske proteinene og modulatoren har evne til å reagere med en eller flere av 'death domain' motivene innbefattet i de regulatoriske proteinene og som påvirker den regulatoriske virkningen av en eller flere av de regulatoriske proteinene. Den beskrevne modulatoren har fortrinnsvis evne til å reagere med 'death domain' motivene innenfor p55-TNF-R, FAS/APOl-R, NGF-R, MORT-1, RIP, TRÅDD eller ankyrin. En metode for produksjon av modulatorene er også beskrevet. Modulatorene er rapportert å være nyttige for modulering av funksjonene mediert i celler av proteiner inneholdende 'death domain'.

WO 1996/36730 beskriver nytt 'Receptor Interacting Protein' betegnet RIP som inneholder en 'death domain' ved dets karboksyterminale ende og en kinase domene ved dets aminoterminale ende. RIP reagerer med Fas/APO-1 intracellulær domene og TNFRl intracellulær domene. Når uttrykt i transformerte vertsceller fremmer rekombinant RIP apoptosen. Patentsøknaden beskriver også DNA molekyler kodende for RIP, anti-RIP antistoffer og screeningsmetoder for detektering av inhibitorer av RIP-avhengig apoptose.

WO 1997/15586 beskriver humant Receptor Interacting Protein (hRIP) som er involvert i tumornekrosefaktortransduksjon og nukleinsyrer som koder for hRIP. Patentsøknaden beskriver også anvendelse av nevnte protein og nukleinsyrer i metoder for screening for oppdagelse av inhibitorer for hRIP-avhengig apoptose. Spesielt vedrører patentsøknaden metoder så som hRIP-basert in vitro bindingsanalyser og fosforyleringsanalyser for screening av kjemiske bibliotek for levende forbindelser for farmakologiske midler.

WO 1997/45542 beskriver at transkripsjonelt regulerte vekst-responsgener spiller en avgjørende rolle for bestemmelse av cellens skjebne. p53 er kjent for å transkripsjonelt regulere gener som er viktige for regulering av potensialt for cellevekst. Ved anvendelse av differensial RT-PCR analyse av rotteembryo-fibroblastceller inneholdende et temperatur-sensitivt p53 allel, så isolerte oppfinnerene transkripter som spesifikt blir oppregulert i celler som inneholder vill-type p53 proteinet. To av disse genene, SM20 og mikrosomal epoksal hydrolase mEH, er tidligere beskrevne gener. To tidligere ukarakteriserte cDNA, cellevekstregulatoriske (CGR)-gener CGR11 og CGR19, ble isolert. De bestemte aminosyresekvensene til disse nye proteinene inneholder kjente motiver; EF-han domener (CGR11) og en ring-finger domene (CGR19) tyder på funksjon. CGR11 og CGR19 var primære responsgener uttrykt i 0,05% og 0,01% av det totale mRNA i vill-type p53 cellene. Både CGR11 og CGR19 samt SM20 og mEH var vist å kunne hemme veksten til flere cellelinjer. Det er beskrevet metoder og midler vedrørende ovennevnte gener for diagnostisering og behandling av sykdommer.

Oppfinnelsens bakgrunn

Tumor nekrose faktor (TNF-a) og lymfotoksin (TNF-B) (i det påfølgende betegnet TNF, som viser til både TNF-a og TNF-B) er multifunksjonelle pro-inflammatoriske cytokiner som hovedsakelig dannes av mononukleære fagocytter og som har mange virkninger på celler (Wallach, D, (1986) i: Interferon 7 (Ion Gresser, red.) s. 83-122, Academic Press, London, og Beutler og Cerami (1987). Både TNF-a og TNF-B innleder sine virkninger ved å bindes til spesifikke celleoverflatereseptorer. Noen av virkningene er sannsynligvis gunstige for organismen, de kan for eksempel ødelegge tumorceller eller virusinfiserte celler og forhøye granulosyttenes antibakterielle aktivitet. På denne måte bidrar TNF til å forsvare organismen mot tumorer og infeksiøse midler, og bidrar til helbredelse etter skader. Således kan TNF benyttes som antitumormiddel, i denne anvendelse bindes TNF til sine reseptorer på overflaten av tumorceller og utløser således de begivenheter som fører til tumorcellenes død. TNF kan også benyttes som antiinfeksiøst middel.

Imidlertid har både TNF-a og TNF-B også skadelige virkninger. Det foreligger bevis for at overproduksjon av TNF-a kan spille en viktig patogen rolle i flere sykdommer. For eksempel er det kjent at virkningene av TNF-a, primært på vaskulaturen, er en hovedårsak til symptomene ved septisk sjokk (Tracey et al., 1986). I visse sykdommer kan TNF forårsake omfattende vekttap (kakeksi) ved å undertrykke adiposyttenes aktiviteter og ved å forårsake anoreksia, og TNF-a ble således kalt kakektin. TNF-a er også beskrevet som en formidler av vevsskaden ved rheumatiske sykdommer (Beutler og Cerami, 1987) og som en hovedformidler av skaden som observeres i "graft-versus-host" -reaksjoner (Piquet et al., 1987). I tillegg er det kjent at TNF deltar i inflammasjonsprosessen og i mange andre sykdommer.

To adskilte, uavhengig uttrykte reseptorer, p55 og p75 TNF-R, som binder både TNF-a og TNF-B spesifikt, utløser og/eller formidler de ovenfor beskrevne biologiske virkninger av TNF. Disse to reseptorer har strukturelt forskjellige intracellulære domener, noe som tyder på at de signaliserer på forskjellig måte (Se Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al, 1990; Leotscher et al., 1990; Nophar et al. 1990; Smith et al., 1990 og Heller et al., 1990). Imidlertid er de cellulære mekanismer, for eksempel de forskjellige proteiner og mulige andre faktorer som deltar i intracellulær signalisering ved p55 og p75 TNF-F ennå ikke utledet. Det er denne intracellulære signalisering, som vanligvis foregår etter binding av liganden, dvs. TNF ( a eller 13), til reseptoren som er ansvarlig for innledningen av den kaskade av reaksjoner som til syvende og sist fører til den observerte respons av cellen overfor TNF.

Når det gjelder den ovenfor nevnte sytosidale virkning av TNF utløses denne virkning i de fleste celler som hittil er undersøkt hovedsakelig av p55 TNF-R. Antistoffer mot det ekstracellulære domenet (det ligandbindende domenet) i p55 TNF-R kan i seg selv utløse den sytosidale virkning (se EP 412486), som korrelerer med hvor effektivt antistoffet kryssbinder reseptorene, hvor kryssbindingen antas å være det første trinn i dannelsen av den intracellulære signalprosess. Videre har mutasjonsundersøkelser (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) vist at den biologiske funksjon av p55 TNF-R avhenger av det intracellulære domenets integritet. Følgelig har det blitt foreslått at igangsettingen av den intracellulære signalisering som fører til den sytosidale virkning av TNF skjer som en følge av assosiasjon mellom to eller flere intracellulære domener i p55 TNF-R. Videre foreligger TNF(cc og 6) som homotrimerer, og har som sådanne blitt foreslått å indusere intracellulær signalisering via p55 TNF-R ved hjelp av sin evne til å bindes til og kryssbinde reseptormolekylene, dvs. å forårsake reseptoraggregering.

Et annet medlem av TNF/NGF-superfamilien av reseptorer er FAS-reseptoren (FAS-R), som også har blitt kalt FAS-antigenet, et celleoverflateprotein som uttrykkes i forskjellige vev og som viser homologi med en rekke celleoverflatereseptorer, innbefattet TNF-R og NGF-R. FAS-R formidler celledød i form av apoptose (Itoh et al., 1991), og synes å fungere som en negativ selektor av autoreaktive T-celler, dvs. at under modningen av T-cellene, formidler FAS-R apoptotisk død av T-celler som gjenkjenner selvantigener. Det er også funnet at mutasjoner i FAS-R-genet (lpr) forårsaker en lymfoproliferasjonsforstyrrelse hos mus som ligner den humane auto-immune sykdom systemisk lupus erytematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Liganden for FAS-R synes å være et celleoverflateassosiert molekyl som bl.a. bæres av dreper-T-celler (eller sytotoksiske T-lymfosytter - CTL), når slike CTL kommer i kontakt med celler som bærer FAS-R er de således i stand til å indusere apoptotisk celledød av de FAS-R-bærende celler. Videre har monoklonale antistoffer som er speisifikke for FAS-R blitt fremstilt, hvor disse monoklonale antistoffer kan indusere apoptotisk celledød i celler som bærer FAS-R, innbefattet museceller transformert med cDNA som koder for human FAS-R (Itoh et al., 1991).

En rekke tilnærminger har blitt utført av søkerne (se for eksempel europeiske patentsøknader nr. EP 186833, EP 308378, EP 398327 og 412486) for å regulere de skadelige virkninger av TNF ved å inhibere binding av TNF til sine reseptorer ved benyttelse av anti-TNF-antistoffer eller ved benyttelse av løselige TNF-reseptorer for å konkurrere med binding av TNF til celleoverflatebundne TNF-R. Videre har, basert på at TNF-binding til reseptorene er nødvendig for de TNF-induserte cellulære virkninger, søkerne gjort forsøk på å modulere TNF-virkningen ved å modulere aktiviteten av TNF-R.

Kort beskrevet gjelder EP 568925 en fremgangsmåte for modulering av signalover-føring og/eller kløyving i TNF-R, hvorved peptider eller andre molekyler kan interagere enten med reseptoren selv eller med effektorproteinet som interagerer med reseptoren, og således modulere den normale funksjon av TNF-R. I EP 568925 beskrives konstruksjon og karakterisering av forskjellige mutante p55 TNF-R med mutasjoner i det ekstracellulære domenet, transmembrandomenet og det intracellulære domenet i p55 TNF-R. På denne måte ble områder i disse domener i p55 TNF-R identifisert som nødvendige for reseptorfunksjonen, dvs. binding av liganden (TNF) og den påfølgende signaloverføring og intracellulære signalisering som til syvende og sist fører til den observerte TNF-virkning på cellene. Videre beskrives en rekke tilnærminger for isolering og identifisering av proteiner, peptider eller andre faktorer som kan bindes til de forskjellige områder i de ovenforbeskrevne TNF-R-domener, hvor disse proteiner, peptider eller andre faktorer kan delta i regulering eller modulering av aktiviteten av TNF-R. En rekke tilnærminger for isolering og kloning av DNA-sekvensene som koder for slike proteiner og peptider, for konstruksjon av ekspresjonsvektorer for fremstilling av proteinene og peptidene, og for fremstilling av antistoffer eller antistoff-fragmenter som interagerer med TNF-R eller med de ovenforbeskrevne proteiner eller peptider som bindes til forskjellige områder i TNF-R, beskrives også i EP 568925. EP 568925 spesifiserer imidlertid ikke de faktiske proteiner og peptider som bindes til de intracellulære domener i TNF-R (for eksempel p55 TNF-R), og beskriver heller ikke tohybrid tilnærmingen i gjær for isolering og identifisering av slike proteiner eller peptider som bindes til de intracellulære domener i TNF-R. Likeså beskrives ikke i EP 568925 proteiner eller peptider som kan bindes til det intracellulære domenet i FAS-R.

Mens det er kjent at tumornekrosefaktor (TNF)-reseptorene og den strukturelt beslektede reseptor FAS-R ved stimulering med leukosytt-fremstilte ligander utløser destruktive aktiviteter i celler som fører til cellenes undergang, er mekanismene for denne utløsning fortsatt lite forstått. Mutasjonsundersøkelser tyder på at signalisering for sytotoksisitet i FAS-R og p55 TNF-reseptoren (p55-R) omfatter separate områder i disses intracellulære domener (Brakebusch et al., 1992: Tartaglia et al., 1993; Itoh og Nagata, 1993). Disse områder (dødsdomene) viser sekvenslikheter. "Dødsdomenene" fra både FAS-R og p55-R har en tendens til selvassosiasjon. Deres selvassosiasjon fremmer tilsynelatende den reseptoraggregering som er nødvendig for igangsetting av signaliseringen (se Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), og kan ved høyt reseptorekspresjonsnivå føre til at liganduavhengig signalisering utløses (Boldin et al., 1995).

I likhet med andre reseptorinduserte virkninger skjer celledødsinduksjon via TNF-reseptorene og FAS-R via en serie med protein-proteininteraksjoner som fører fra ligand-reseptor-binding til den endelige aktivering av enzymatiske effektorfunksjoner, hvor de undersøkelser som er gjort viser ikke-enzymatiske protein-protein-induksjoner som utløser signalisering for celledød: binding av trimere TNF- eller FAS-R-ligand molekyler til reseptorene, påfølgende interaksjoner mellom disses intracellulære domener (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh og Nagata, 1993), forsterket av dødsdomene-motivenes tendens til selv-assosiasjon (Bolding et al., 1995a) og indusert binding av to sytoplasmatiske proteiner (som også kan bindes til hverandre) til reseptorenes intracellulære domener - MORT-1 (eller FADD) til FAS-R (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) og TRÅDD til p55-F (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Tre proteiner som bindes til det intracellulære domenet i FAS-R og p55-R ved "dødsdomene"-området som deltar i celledødsinduksjon ved reseptorene via heteroassosiasjon mellom homologe områder, og som i seg selv også er i stand til å utløse celledød, ble identifisert ved tohybrid-søkemetoden i gjær. Et av disse er proteinet MORT-1 (Boldin et al., 1995b), også kjent som FADD (Chinnaiyan et al., 1995) som spesifikt bindes til FAS-R. Den andre proteinet, TRÅDD (se også Hsu et al., 1995,1996) bindes til p55-R, og det tredje, RIP (se også Stanger et al., 1995), bindes til både FAS-R og p55-R. I tillegg til å bindes til FAS-R og p55-R er disse proteiner også i stand til å bindes til hverandre, noe som tilveiebringer funksjonell "krysstale" mellom FAS-R og p55-R. Disse bindinger skjer via et konservert sekvens-motiv, "dødsdomenemodulen" som er felles for reseptorene og deres assosierte proteiner. Videre, selv om MORT-1 i tohybridanalysen i gjær ble vist å bindes spontant til FAS-R, finner denne binding sted i pattedyrsceller kun etter stimulering av reseptoren, noe som tyder på at MORT-1 deltar i de innledende begivenheter i FAS-R-signaliseringen. MORT-1 inneholder intet sekvensemotiv som er karakteristisk for enzymatisk aktivitet, og proteinets evne til å utløse celledød synes derfor ikke å involvere en iboende aktivitet i MORT-1 selv, men snarere aktivering av et eller flere andre proteiner som bindes til MORT-1 og som virker lenger nedstrøms i signalkaskaden. Cellulær ekspresjon av MORT-1-mutanter som mangler den N-terminale del av molekylet har blitt vist å blokkere induksjon av sytotoksisitet ved FAS/APOl (FAS-R) eller p55-R (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), noe som tyder på at dette N-terminale området overfører signaliseringen for den sytosidale virkning av begge reseptorer via protein-protein interaksjoner.

Således synes "dødsdomene"-motivene i reseptorene p55-R og FAS-R så vel som i deres tre assosierte proteiner MORT-1, RIP og TRÅDD å være seter for protein-protein interaksjoner. De tre proteinene MORT-1, RIP og TRÅDD interagerer med de intracellulære domener i p55-R og FAS-R ved binding av deres dødsdomener til reseptorenes dødsdomener, og for både RIP og TRÅDD vil disse dødsdomener også selvassosiere (selv om MORT-1 avviker i så henseende ved at dets dødsdomene ikke selvassosierer). Videre bindes MORT-1 og TRÅDD differensielt til FAS-R og p55-R og bindes også til hverandre. Videre bindes både MORT-1 og TRÅDD effektivt til RIP. Det ser følgelig ut til at interaksjonen mellom de tre proteinene MORT-1, RIP og TRÅDD er en viktig del av den totale modulering av den intracellulære signalisering som formidles av disse proteiner. Forstyrrelse av interaksjonen mellom disse tre intracellulære proteiner vil føre til modulering av virkningene som skyldes denne interaksjonen. For eksempel kan inhibering av TRADD-binding til MORT-1 tenkes å modulere FAS-R-p55-TNF-R-interaksjonen. Likeså kan inhibering av RIP i tillegg til den ovenforbeskrevne inhibering av TRADD-binding til MORT-1 tenkes å ytterligere modulere FAS-R-p55-TNF-R-interaksjon.

Monoklonale antistoffer rettet mot "dødsdomenet" i p55-R, nærmere bestemt mot bindingssetet eller bindingssetene for TRÅDD og RIP, kan også benyttes for å inhibere eller forhindre binding av disse proteiner og således gi modulering av interaksjonen mellom FAS-R og p55-R.

Det har også nylig blitt funnet at i tillegg til de ovenforbeskrevne cellesytotoksisitets-aktiviteter og modulering av disse, formidlet ved de forskjellige reseptorer og deres bindingsproteiner, innbefatter FAS-R, p55-R, MORT-1, TRÅDD, RIP, MACH, Mch4 og Gl, er en rekke av disse reseptorer og deres bindingsproteiner også involvert i modulering av aktiviteten av kjernetranskripsjonsfaktoren NF-kB, som er en nøkkel-formidler av celleoverlevelse eller levedyktighet idet faktoren er ansvarlig for kontroll av ekspresjonen av mange immunrespons- og inflammasjonsresponsgener. Det har for eksempel blitt funnet at TNF-a faktisk kan stimulere aktivering av NF-kB, og at TNF-a således er i stand til å indusere to typer signaler i celler, et som utløser celledød og et annet som beskytter celler mot dødsinduksjon ved å indusere genekspresjon via NF-kB (se Beg og Baltimore, 1996; Wang et al., 1996; Van Antwerp et al., 1996). En lignende dobbeltvirkning for FAS-R har også blitt rapportert (se referanse til denne virkning som angitt ovenfor i Van Antwerp et al., 1996). Det ser derfor ut til at det foreligger en delikat balanse mellom celledød og celleoverlevelse ved stimulering av forskjellige typer av celler med TNF-a og/eller FAS-R-liganden, hvor det endelige resultat av stimuleringen avhenger av hvilken av de intracellulære reaksjonsveier som stimuleres mest, hvor den ene fører til celledød (vanligvis ved apoptose) og den andre fører til celleoverlevelse via aktivering av NF-kB.

I tillegg har de foreliggende oppfinnere også nylig utredet videre den mulige reaksjonsvei ved hvilken medlemmer av TNF/NGF-reseptorfamilien aktiverer NF-kB (se Malinin et al., 1997 og de forskjellige relevante referanser som beskrives i denne, og oppfinnernes israelske patentsøknader nr. IL 117800 og IL 119133, som ennå ikke er avgjort). Kort beskrevet fremgår det at flere medlemmer av TNF/NGF-reseptorfamilien kan aktivere NF-kB via et felles adaptorprotein, TRAF2. En nylig oppdaget proteinase betegnet NIK (se ovenfor referansen til Malinin et al., 1997 og IL 117800 og IL 119133) kan bindes til TRAF2 og stimulere NF-KB-aktivitet. Det ble faktisk vist (se Malinin et al., og IL-søknadene det er vist til ovenfor) at ekspresjon i celler av NIK-mutanter med manglende kinaseaktivitet fører til at cellene ikke kan stimuleres av NF-kB på en normal, endogen måte, og også til at cellen har en blokkering i induksjonen av NF-KB-aktivitet ved TNF, via en FAS-R, og en blokkering i NF-KB-induksjonen ved TRÅDD, RIP og MORT-1 (som er adaptorproteiner som binder disse p55-R og/eller FAS-R-reseptorene). Alle reseptorene p55-R, p75-R og FAS-R og deres adaptorproteiner MORT-1, TRÅDD og RIP bindes direkte eller indirekte til TRAF2, som ved hjelp av sin evne til å bindes til NIK tilsynelatende modulerer induksjonen av NF-kB.

Av de ovenfor beskrevne modulatbrproteiner som deltar i den fine balanse mellom celledød og overlevelse etter stimulering av FAS-R og/eller p55-R, synes proteinet RIP å spille en viktig rolle. RIP (se Stanger et al., 1995 og også Malinin et al., 1997) har et "dødsdomene" i sitt C-terminale område som tillater proteinet å indusere cellesytotoksisitet på en uavhengig måte, og også ved assosiasjon med dødsdomenene i MORT-1, p55-R, FAS-R og TRÅDD.

RIP har også et proteinkinasedomene i sitt N-terminale område og et intermediært domene som antas å tillate proteinet interaksjon med (binding) til TRAF2 og derved proteinets deltagelse i NF-KB-induksjon. Følgelig beskrives detaljer vedrørende egenskaper og sekvenser (DNA-sekvenser og aminosyresekvenser) for RIP i de ovenforangitte publikasjoner (i særdeleshet Stanger et al., 1995).

TNF er også et av cytokinene som inngår i utløsing og modulering av vertens antivirus-forsvar. På tilsvarende måte har virus utviklet evnen til å uttrykke gener hvis proteiner regulerer sytokinenes aktivitet, og disse sytokinregulerende virusproteiner antas å fremme virusets evne til å forbli i dyreverten. Et av de best undersøkte eksempler på et slikt protein er E3-14.7K fra gruppe C humane adenovirus (Ad) av typene 2 og 5, som fungerer som en kraftig antagonist av TNF-formidlet cytolyse.

Med det mål å isolere molekylære bestanddeler av TNF-signalkaskaden som blir målproteiner for E3-14.7K ved virusinfeksjon ble et humant E3-14.7K-bindende protein nylig isolert ved tohybridsøk (FIP-2 for Fjorten-K-Interagerende Protein, Li. Y. et al., 1998). FIP-2 ble funnet å være ikke-toksisk i seg selv og å reversere den beskyttende virkning av E3-14.7K på sytotoksisitet, indusert ved overekspresjon av TNFR-I eller RIP, uten å bindes til noen av de to ovenfornevnte proteiner. FIP-1 ble funnet å ha en viss homologi med RAP-2, proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse. Graden av totallikhet mellom RAP-2 og FIP-2 er ikke desto mindre temmelig lav, noe som kan ses fra den globale oppstilling av de to aminosyresekvenser (figur 3). Homologien blir imidlertid mer signifikant i spesifikke områder mot proteinenes C-ende og kulminerer med nærmest identitet i de tredve C-terminale aminosyrene. Det er verdt å merke seg at i tillegg til det ovenfornevnte C-terminale domenet er det antatte leusin-zipper motiv i FIP-2 stort sett konservert i RAP-2 (bortsett fra en Ile til Ala-substitusjon).

En lignende sekvens betegnet HYPL - som koder for et protein forbundet med Huntington's sykdom og som synes å være en fjerne homolog av RAP-2 - ble nylig innsendt til GenBank under tittelen "huntingtin interagerende protein, HYPL"

(aksesjonsbetegnelse AF049614). En publikasjon som beskriver proteinets funksjon har imidlertid ennå ikke blitt publisert.

En nylig publikasjon av Yamaoka S. et al. (1998), rapporterer identifisering av en RAP-2-homolog fra mus. Homologen fra mus NEMO (for NF-kB) essensiell modulator) ble identifisert i et søk etter nøkkelmolekylene som regulerer aktivering av NF-kB-signalisering. En flat cellulær variant av HTLV-1 Tax-transformerte rotte fibroblaster ble karakterisert og betegnet 5R, denne cellelinje responderte ikke på noen av de analyserte NF-KB-aktiverende stimuli (LPS, PMA, IL-1, TNF), og utførte sin genetiske komplementering. Som et resultat av denne fremgangsmåte ble et cDNA som koder for NEMO 48kD-proteinet gjenvunnet. Basert på disse resultater sies proteinet å være fraværende i 5R-celler, det er en del av det høymolekylære Ik B-kinase komplekset og er påkrevet for dannelse av dette. In vitro kan NEMO homo-dimerisere og direkte interagere med IKKB.

Israelsk patentskrift nr. 120485 beskriver et RIP-assosiert protein betegnet RAP, som spesifikt bindes til RIP og inhiberer NF-kB-induksjon.

Israelsk patentskrift nr. 123758 og foreliggende søknad gjelder et annet RIP-assosiert protein betegnet RAP-2, som har de samme eller lignende aktiviteter.

RAP-2 ifølge oppfinnelsen betegnes også 303 eller RAP-303 eller RAT-303. For å være konsekvent vil proteinet betegnes RAP-2 heri.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA-sekvens som koder for et RIP-forbundet protein (RAP-2), isoformer, analoger eller fragmenter derav som kan bindes til RIP og modulere eller mediere den intracellulære aktiviteten til RIP, hvor DNA-sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: (a) en DNA-sekvens kodende for et RAP-2 protein som angitt i fig. 3; (b) en DNA-sekvens som vist i SEKV ID NR: 1 eller 2; (c) en DNA-sekvens som kan hybridisere til en sekvens ifølge (a) eller (b) under stringente betingelser og som koder for et biologisk aktivt RAP-2 protein; (d) en DNA-sekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske koden til DNA-sekvensen definert i hvilke som helst av (a) eller (b) og som koder for et biologisk aktivt RAP-2 protein; (e) en DNA-sekvens ifølge (b) kodende for et RAP-2 protein, isoform, analog eller fragment med minst en del av sekvensen som angitt i fig. 3.

Det er videre beskrevet replikerbar ekspresjonsvektor som omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 1, eventuelt operativt sammenkoblet med kontrollsekvenser, promotere eller andre DNA-sekvenser som tillater ekspresjon i korrekt orientering.

Oppfinnelsen vedrører også transformert eukaryot eller prokaryot vertscelle, kjennetegnet ved at den inneholder en replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 2 eller 3.

Det er videre et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et nytt protein, RAP-2, innbefattet alle isoformer, analoger, fragmenter, eller derivater av dette, som er i stand til å bindes til RIP-proteinet (i det påfølgende betegnet "RIP").

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig RAP-2 protein, isoform, fragment, funksjonell analog eller derivater derav, kjennetegnet ved at det blir kodet av en DNA-sekvens ifølge krav 1.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig RAP-protein , isoform, fragment, funksjonell analog eller derivater derav, kjennetegnet ved at det blir kodet av en DNA-sekvens ifølge krav 1. Siden RIP kan interagere direkte eller indirekte med de intracellulære formidlere av inflammasjon, cellesytotoksisitet og celledød, for eksempel p55-R og FAS-R og disses assosierte adaptorproteiner eller modulatorproteiner, for eksempel MORT-1, TRÅDD, MACH, Mch4, Gl og andre, er de nye proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse derfor ved å bindes til RIP i stand til å påvirke den intracellulære signalprosess som innledes ved binding av FAS-liganden til sin reseptor og TNF til sin reseptor (p55-R) og som sådanne er de nye proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse modulatorer av den p55-R og FAS-R-formidlede virkning på celler. RIP er også i stand til å interagere med TRAF2, og kan derved interagere direkte eller indirekte med NIK, og således fungerer RIP som en modulator av inflammasjons- og celleoverlevelsesreaksjonsveier som omfatter NF-KB-induksjon, de nye proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse er således modulatorer av RIP-forbundet inflammasjonsaktivitet og celleoverlevelsesaktivitet. Likeså, siden FAS-R, p55R og deres modulatorproteinet MORT-1 og TRÅDD kan indusere NF-kB og celleoverlevelse enten direkte eller indirekte ved å bindes til RIP eller til TRAF2, til hvilket RIP bindes, kan proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse også være formidlere av celleoverlevelsesprosesser ved å operere via felles eller beslektede intracellulære signalreaksjonsveier i hvilke de forskjellige proteinene angitt ovenfor fungerer, for induksjon av celleoverlevelse. På tilsvarende måte, siden p75-R bindes til TRAF2 til hvilket RIP bindes, kan de nye proteiner ifølge oppfinnelsen også være modulatorer av RIP-relatert formidling av p75-R-formidlet aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av RAP-2 protein, isoform, fragment, analoger eller derivater derav ifølge krav 5, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av de transformerte vertscellene ifølge krav 4 under betingelser som er egnede for ekspresjonen av nevnte protein, analoger, isoformer, fragmenter eller derivater, utføre post-translasjonelle modifiseringer etter behov for oppnåelse av nevnte protein, fragmenter, analoger eller derivater og isolering av nevnte uttrykte proteinfragmenter, analoger eller derivater.

Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe antagonister (for eksempel antistoffer) til de ovenfornevnte, nye RAP-2 proteinene, isoformene, analogene, fragmentene, og derivatene av disse, som kan benyttes for inhibering av signalprosessen eller, mer spesifikt, inflammasjonsprosessen, cellecytotoksisitetsprosessen eller celleoverlevelses-prosessen, dersom dette er ønskelig.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig antistoffer eller aktive fragmenter eller derivater derav, kjennetegnet ved at de spesifikt reagerer med den biologiske aktive RAP-2 proteindelen av et RAP-2 protein, isoform, fragment, analog, derivat ifølge krav 5 eller fremstilt ved fremgangsmåten i krav 6.

Det er videre beskrevet farmasøytisk preparat som omfatter minst et RAP-2 protein ifølge krav 5 eller kan oppnås ved fremgangsmåte ifølge krav 6, dets biologiske aktive fragmenter, analoger, derivater ifølge krav 5 eller blandinger derav, en replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 2 eller 3, en oligonukleotid sekvens kodende for en antisens sekvens av RAP-2 protein DNA-sekvensen ifølge krav 1 eller antistoffer ifølge krav 7 og eventuelt, en farmasøytisk akseptabel bærer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelse av minst et RAP-2 protein ifølge krav 5 eller oppnåbar ved fremgangsmåten ifølge krav 6, dets biologiske aktive fragmenter, analoger, derivater ifølge krav 5 eller blandinger derav, en replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 2 eller 3, en oligonukleotidsekvens kodende for en antisens sekvens av RAP-2 protein DNA-sekvens ifølge krav 1 eller antistoffer ifølge krav 7 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for modulering av inflammasjon, celledød og/eller celleoverlevelse.

Ytterligere et formål med oppfinnelsen er anvendelse av antistoffer eller aktive fragmenter eller derivater derav ifølge krav 7 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for modulering av inflammasjon, celledød og/eller celleoverlevelse, hvori når RAP-2 proteinet eller deler derav av nevnte celler blir eksponert på den ekstracellulære overflaten blir nevnte preparat formulert for ekstracellulær applikasjon, og når nevnte RAP-2 proteiner er intracellulære blir nevnte preparat formulert for intracellulær applikasjon.

Videre er det et formål med foreliggende oppfinnelse anvendelse av en rekombinant dyrevirusvektor som bærer en sekvens kodende for et virusoverflateprotein som er i stand til å bli bundet til en spesifikk tumorcelleoverflatereseptor eller HIV-infisert celleoverflatereseptor og sekvensen kodende for et protein valgt fra RAP-2 protein, isoform, analog, fragment eller derivat ifølge krav 5, eller kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge krav 6, som når uttrykt i nevnte tumor eller HIV-infiserte celler kan forøke den RIP modulerte/medierte direkte eller indirekte dreping av nevnte celle, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av tumorceller eller HIV-infiserte celler, hvori nevnte tumor eller HIV-infiserte celler skal bli infisert med nevnte vektor.

Ytterligere et formål med oppfinnelsen er anvendelse av en vektor kodende for en ribozym sekvens som kan reagere med en cellulær mRNA sekvens kodende for et RAP-2 protein ifølge krav 5, eller som kan oppnås ved fremgangsmåter ifølge krav 6 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for modulering av inflammasjon, celledød og/eller celleoverlevelse, hvori nevnte vektor er i en form som muliggjør ekspresjon av nevnte ribozymsekvens i nevnte celler, og hvor når nevnte ribozymsekvens blir uttrykt i nevnte celler reagerer det med nevnte cellulære mRNA sekvens og spalter nevnte mRNA sekvens som resulterer i inhibisjon av ekspresjonen av nevnte RAP-2 protein i nevnte celler.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av en eller flere RAP-2 proteiner, isoformer, analoger, fragmenter eller derivater ifølge krav 5 eller som kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge krav 6, eller en DNA-sekvens kodende for nevnte en eller flere proteiner, isoformer, analoger, fragmenter eller derivater i form av en vektor som bærer nevnte sekvens, idet nevnte vektor kan tilveiebringe innskudd av nevnte sekvens inn i nevnte celle på en måte slik at nevnte sekvens blir uttrykt i nevnte celle for fremstilling av et farmasøytisk preparat som skal bli introdusert til nevnte celle for behandling av inflammasjon, autoimmun sykdom, septisk sjokk, graft versur host avstøtning eller hepatitt.

Det er også beskrevet et fragment ifølge krav 5 eller som kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge krav 6, kjennetegnet ved at det er et peptid. 1 samsvar med foreliggende oppfinnelse har et nytt protein, RAP-2, blitt isolert. RAP-2 kan bindes til eller interagere med RIP, og er således en modulator eller formidler av den intracellulære aktivitet av RIP. RIP deltar i modulering eller formidling av intracellulære signalreaksjonsveier, for eksempel den cellesytotoksisitets- eller celledødsassosierte reaksjonsvei i hvilken RIP har sytotoksisk aktivitet i seg selv og forbundet med, direkte eller indirekte, en rekke andre celledødsassosierte proteiner, for eksempel, MORT-1, TRÅDD, MACH, Mch4, Gl, p55-R og FAS-R med hvilke RIP kan assosiere eller bindes til på direkte eller indirekte måte via "dødsdomene"-motivet/ modulen som foreligger i RIP og alle de ovenfornevnte proteiner, hvor en annen reaksjonsvei er inflammasjonsreaksjonsveien, celleoverlevelsesreaksjonsveien eller viabilitetsreaksjonsveien i hvilken RIP kan ha en aktiverende rolle, direkte eller indirekte, grunnet forekomsten av et kinasemotiv eller -domene i RIP og evnen til RIP til å bindes til TRAF-2, som kan bindes til NIK som igjen direkte deltar i aktivering av NF-kB, som spiller en sentral rolle i inflammasjon og celleoverlevelse. Videre kan p55-R også interagere med TRÅDD og TRAF2 (via TRÅDD) og deltar også i NF-kB-aktivering og derved i celleoverlevelsesreaksjonsveien, og RIP kan følgelig, grunnet sin evne til å bindes til eller interagere med FAS-R, TRÅDD og p55-R (via TRÅDD) så vel med TRAF2, også delta i modulering av inflammasjonsaktivering og celleoverlevelses-aktivering med disse proteiner. RIP er følgelig en modulator eller formidler av disse reaksjonsveier, og på tilsvarende måte er det nye RAP-2 ifølge foreliggende oppfinnelse, grunnet sin evne til å bindes til RIP, en modulator eller formidler av disse intracellulære reaksjonsveier.

RAP-2 har blitt isolert og klonet ved benyttelse av tohybridsystemet i gjær, sekvensert og karakterisert, og som beskrevet i detalj heri nedenfor synes RAP-2 å være et svært spesifikt RIP-bindende protein og følgelig en spesifikk RIP-modulator/formidler. RAP-2 bindes ikke til TRÅDD, MORT-1, p55-r, p75-R og MACH. Det ser videre ut til at RAP-2 ikke har en karakteristisk dødsdomenemodul eller et dødsdomenemotiv, og dette er i samsvar med det funn at RAP-2 ikke induserer cellesytotoksisitet alene.

Som begrepet benyttes gjennomgående heri er RIP-aktivitet ment å omfatte proteinets aktivitet ved modulering/formidling av inflammasjonsreaksjonsveiene og reaksjonsveiene for celledød/overlevelse. Disse aktiviteter er angitt heri ovenfor og nedenfor, så vel som i alle publikasjoner og patentsøknader nevnt ovenfor, som inkorporeres heri i sin helhet ved referanse. Likeså er RAP-2-aktivitet som benyttet gjennomgående heri ment å omfatte proteinets modulering/formidling av RIP-aktivitet grunnet dets spesifikke binding til RIP, hvor denne modulering/formidling av RIP ved RAP-2 omfatter modulering/formidling av inflammasjon-, celledød- og celleoverlevelses-reaksjonsveiene i hvilke RIP deltar direkte eller indirekte, og som sådan kan RAP-2 betraktes som en indirekte modulator/formidler av alle de ovenfornevnte proteiner, og muligens av en rekke andre proteiner som deltar i inflammasjon, celledød eller celleoverlevelse og til hvilke RIP bindes, eller med hvilke RIP interagerer på en direkte eller indirekte måte.

Benyttelse av fullengde RAP-2-protein som åte i tohybridsøk ga et nytt RAP-2-interagerende protein, betegnet ovenfor og i det påfølgende klon nr. 10 (eller klon nr. 10-kodet protein eller RAT-bindende protein nr. 10 eller RBP-10). Sekvensen av det erholdte cDNA ble videre forlenget ved vanlige sekvenseringsfremgangsmåter som er kjent innen faget mot 5'-enden for rekonstitusjon av en partiell åpen leseramme for proteinet, som imidlertid mangler et startkodon.

Tohybridanalyse av bindingsrepertoaret til klon nr. 10 viste at dette protein ikke bare binder RAP-2, men også viser temmelig kraftig affinitet overfor TRAF2. Klon nr. 10 bindes imidlertid ikke til RIP, TRÅDD, MORT1, MACH, TNFR-1, TIP60 og NIK og heller ikke t il forskjellige kontrollproteiner (for eksempel lamin og syklinD). Det kan imidlertid ikke utelukkes at binding av klon nr. 10 til NIK kan påvises i pattedyrs celler, tatt i betraktning de uvanlige sider ved oppførselen til NIK i gjær. Klon nr. 10 ble vist å bindes til RAP2 via de 200 C-terminale aminosyrer i RAP-2, dvs. et område som ikke nødvendigvis er forbundet med binding av RIP, TIP60, NIK og IKKB. Denne sekvens, om enn unøyaktig, tillot oss å utføre flere runder med søk i genbank med det formål å identifisere homologer av klon nr. 10. Det eneste protein som viste en vesentlig grad av likhet med proteinet som kodes av klon nr. 10 var F40F12.5 - et hypotetisk molekyl far C. Elegans, til hvilket ingen fysiologisk rolle er tilskrevet.

Det er av interesse at F40F12.5 ble funnet å vise en viss likhet med flere medlemmer av den svært konserverte familie av ubikitin-rettede proteaser, Disse enzymer motvirker den destruktive virkning av ubikitineringsmaskineriet, som vites å styre de fleste proteindegraderingsbegivenheter i en celle. Mens ubikitin-ligaser er ansvarlige for å koble poly-ubikitin treet til et protein som er utpekt for degradering forhindrer ubikitin proteaser en effektiv forgrening av det voksende treet. Antagelser vedrørende funksjonen av F40F12.5 basert på likheten med de ovenfornevnte ubikitinrettede proteaser er imidlertid tvilsom, da det ennå ikke er undersøkt hvorvidt dette spesielle protein besitter enzymatisk aktivitet rettet mot ubikitin-polymerer. Videre er det et par punkter som gjør slike antagelser temmelig usannsynlige: a) Aminosyrerester som antas å utgjøre det katalytiske kjerneområdet i begge undergrupper av ubikitin-proteaser er ikke konservert, verken i F40F12.5 eller i klon

nr. 10;

b) Bortsett fra de katalytiske seter viser enzymer fra den ubikitin-rettede proteasefamilie, avledet fra forskjellige arter (fra bakterier til menneske) nær sagt

ingen sekvenslikhet, mens F40F12,5 og klon nr. 10 viser en viss grad av homologi.

Det ser således ut til at RAP-2 er et spesifikt RIP-bindende protein og således en modulator/formidler av den intracellulære aktivitet av RIP. De RAP-2-bindende proteiner har, grunnet deres evne til å bindes til RAP-2, indirekte innvirkning på RIP og er således også modulatorer/formidlere av den intracellulære aktivitet av RIP.

Mens RAP-2 således spiller en rolle i modulering/formidling av inflammasjonsaktiviteter, celleoverlevelsesaktiviteter og/eller celledødsaktiviteter i hvilke RIP deltar direkte eller indirekte, særlig aktiviteter forbundet med sytotoksisitet og inflammasjon forårsaket eller indusert av forskjellige stimuli, innbefattet stimuli overført via reseptorer fra TNF/NGF-reseptorfamilien, og muligens andre også. (For et skjema over deltagelse av RIP i disse intracellulære begivenheter, og følgelig deltagelse av RAP-2, se fig. 1 i Malinin et al., 1997).

RAP-2 kan også fungere som en inhibitor av cellesytotoksisitet og inflammasjon siden det foreligger som del av et kompleks av andre proteiner, for eksempel RIP og proteiner bundet til RIP, og kan således påvirke de sytotoksiske eller inflammatoriske virkninger av disse andre proteinene (for eksempel p55-R, FAS-R, MACH, Mch4, Gl og MORT-1), noe som til syvende og sist fører til inhibering av deres sytotoksiske aktivitet eller deres aktivitet ved inflammasjon.

RAP-2 kan videre også tenkes å fungere som en forsterker av cellesytotoksisitet og inflammasjon, og dette ved å forsterke aktiviteten av andre proteiner, for eksempel RIP og andre proteiner bundet til RIP som bemerket ovenfor, ved å hjelpe til i rekruttering av disse proteiner ved RIP, hvor denne rekruttering bidrar til å forsterke den sytotoksiske aktivitet av de forskjellige proteinene eller å forsterke deres inflammatoriske virkninger.

På analog måte kan RAP-2 likeså tenkes å fungere som en inhibitor eller en forsterker av celleoverlevelsesreaksjonsveien som bemerket ovenfor, grunnet deltagelse av RIP i denne reaksjonsvei.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en DNA-sekvens som koder for et RIP-assosiert protein (RAP-2) og isoformer, analoger eller fragmenter av dette, som kan bindes til RIP og modulere eller formidle den intracellulære aktivitet av RIP, hvor denne intracellulære aktivitet er en modulering/formidling av inflammasjon og/eller celledød og/eller celleoverlevelse.

RAP-2-proteinsekvensen, utledet fra DNA-sekvensene i fig. 1 og 2, er vist i fig. 3. En annen utførelse er enhver isoform av RAP-2-proteinet og analoger, fragmenter og derivater av dette.

Videre tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse replikerbare ekspresjonsvektorer som omfatter det ovenfor beskrevne DNA, hvor disse replikerbare ekspresjonsvektorer kan uttrykkes i egnede eukaryote eller prokaryote vertsceller, transformerte eukaryote eller prokaryote vertsceller som inneholder slike replikerbare ekspresjonsvektorer. Definisjonene ovenfor er ment å omfatte alle isoformer av RAP-2-proteinet.

Isolering av RAP-2-proteiner og identifisering og karakterisering av dem kan utføres ved enhver av de sedvanlige søkerteknikker som benyttes for isolering og identifisering av proteiner, for eksempel tohybridfremgangsmåten i gjær, affinitetskromatografi-metoder og enhver av de andre velkjente standard fremgangsmåter som benyttes for dette formål.

Andre sider ved og utførelser av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes også, som det vil fremgå av den påfølgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen.

Det bør bemerkes at begrepene "modulering/formidling av RIP, eller FAS-ligand, eller TNF-virkning på celler", og ethvert annet begrep vedrørende "Modulering/Formidling" som benyttes i beskrivelsen er ment å omfatte in vitro-behandling så vel som in vivo-behandling, og omfatter også inhibering eller forsterkning/styrking.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 (A, B) (Sekv. Id. nr. 1) viser nukleotidsekvensen til RAP-2 hvor startkodonet og stoppkodonet er understreket. Pilen angir begynnelsen av 1,5 Kb-klonen som erholdes ved tohybridsøk; Figur 2 (A, B) (Sekv. Id. nr. 2) viser nukleotidsekvensen til klon nr. 41072 (se eksempel 1), med start- og stoppkodonet understreket; Figur 3 A (/l, /2), viser de utledede aminosyresekvenser for spleisevariantene fra mennesket (20,4 full og Human shrt) og murin (NEMO full og mus part) av RAP-2 og B (/l, 12), viser den publiserte sekvensen av FIP-2, oppstilt ved benyttelse av programvarepakken tilgjengelig ved BCM Search Launcher (Baylor College of Medicina, Houston, TX). Homologe aminosyrer er innrammet mens identiske aminosyrer er skraverte. Stjerner i (B) angir et mulig leusin-zipper (L,Z)-lignende motiv i FIP-2. Figur 4 beskriver den molekylære karakterisering av RAP-2. IA analyseres Nothern-blothybridisering av Humant MTN blot I (Clontech) med et DNA-fragment fra RAP-2. IB analyseres RAP-2-binding til RIP som beskrevet i detalj i eksempel 3. IC ble NIK-RAP-2-interaksjonen påvist som i (B), bortsett fra at anti-FLAG-antistoffer ble benyttet for Western-blotting, fulgt av immunutfelling med anti-His6. En pil angir posisjonen

for de immunutfelte proteiner.

Figur 5 er en grafisk fremstilling av den kraftige nedregulering av NF-kB og C-Jun-aktivering ved forskjellige stimuli, ved ektopisk ekspresjon av RAP-2 som beskrevet i eksempel 4. HEK-293T-celler ble forbigående transfektert med rapportørplasmidet (HIVLTR-Luc eller CMV-Luc for NF-kB(A) og GAL4-Luc for c-Jun (B) aktiveringsanalyser), og med en ekspresjonsvektor for den angitte induser og enten tom vektor (pcDNA3 - markert alene i figuren) eller et plasmid som koder for fullengde RAP-2 (pcRAP-2 - markert med pluss i figuren). Aktivering av aktiviteten til rapportørgenet Lusiferase er angitt i relative Lusiferaseenheter (R.L.U.). Figur 6 viser at RAP-2 fremviser tilsvarende undertrykkende oppførsel mot NF-kB og c-Jun over et vidt konsentrasjonsområde. TRAF2 ble forbigående uttrykt i HEK-293T-celler sammen med de angitte mengder av enten pcRAP-2 (sense) eller pcRAP-2-a/S (antisense) konstruksjoner. For måling av NF-kB (A)- og c-Jun (B)-aktivering ble rapportørplasmidene pHIVLTR-Luc henholdsvis pGAL4-Luc inkludert. Lusiferase-analysen ble utført som beskrevet for figur 5 i eksempel 4. Figur 7 viser at RAP-2 gir en kraftig forsterkning av signalindusert fosforylering av c-Jun uten å interferere med JNKl/2-aktivitetsnivået.

(A) Totale cellelysater av HEK-293T-celler transfektert med de angitte ekspresjonskonstruksjoner sammen med enten pcDNA3-bærer, angitt i figuren med et minustegn

(-) eller med pcRAP-2 angitt i figuren med et plusstegn (+), ble identifisert ved Western-blotanalyse med anti-fosfo-Jun-antistoffer som beskrevet i eksempel 5. Kontrollmembranen vist i det nedre felt ble analysert på ny med anti-total-c-Jun Abs

(NEB);

(B) Aktivert NJK1/2 fra HEK-293 T-celler transfektert med enten pcDNA3 eller pcRAP-2, behandlet med hrTNFa over økende tidsrom, ble påvist ved Western blotting

av totallysater med antistoffer mot fosfo-JNK, som beskrevet i detalj i eksempel 5.

(C) HEK-293T-celler kotransfektert med tom vektor, pcRAP-2 og pcRJP i forskjellige kombinasjoner, sammen med HA-JNK1-uttrykkende plasmid. NJK1 ble så immunutfelt via den N-terminale HA-merkelapp, og evnen til å fosforylere bakterielt-fremstilt, renset GST-Jun ble bestemt i en in vitro kinase analyse. Reaksjonsproduktene ble analysert ved SDS-PAGE. GST-Jun er angitt med et pilhode. Figur 8 viser at RAP-2 ikke konkurrerer med NF-kB og AP-1 for binding til DNA. HEK-293T transfektert med de angitte proteiner enten alene (-) eller sammen med pcRAP-2 (+). Kjerneekstrakter fremstilt fra cellene ble inkubert med -merkede oligonukleotider som omfatter klassiske gjenkjenningssekvenser for AP-l(A) eller NF-kB (B). Reaksjonsproduktene ble analysert ved ikke-denaturerende PAGE. Figur 9 viser at RAP-2 påvirker basalnivået av NF-kB i HEK-293T- og HeLa-celler forbigående transfektert med varierende mengder av enten RAP-2 (sense)e eller RAP-2-antisense (a/s). Alle manipulasjoner ble utført som beskrevet for figur 6 i eksempel 4. Figur 10 (A, B) (Sekv. Id. nr. 3) viser den partielle nukelotidsekvens for klon nr. 10. Figur 11 viser de funksjonelle egenskaper av seriefortynninger av RAP-2. IA gis en skjematisk fremstilling av de påfølgende C-terminale delesjoner av RAP-2. Alle de avkortede proteiner har den intakte N-ende av RAP-2, mens de C-terminale ender er angitt med pilhoder. Bindingsområdet for RIP, NIK, IKKB og RIP60 er understreket. Tre skraverte bokser tilsvarer de mulige leusin-zipper-lignende motiver. B viser virkningen av overekspresjon av delesjonskonstruksjonene beskrevet i A på NF-kB aktivering i HEK-293T-celler ved RelA, TRAF2 TNF og

NIK ved benyttelse av HIV-LTR lusiferase rapportørplasmidet for NF-kB. Aktivering av aktiviteten til rapportør-genet lusiferase er angitt i relative lusiferase-enheter (R.L.U.)

Figur 12 viser kartlegging av funksjonelle og bindende områder i RAP-2.

(A) Forskjellige delesjoner av RAP-2 ble analysert for evne til å bindes til de angitte proteiner i transfekterte gjærceller (oddetalls kolonner) og HEK-293T-pattedyrsceller (liketalls kolonner). De to kolonnene viser evnen til de samme delesjoner, transfektert i høyt nivå inn i HEK-293 T-celler som beskrevet i detalj i eksempel 9, til å inhibere NF-KB-aktivering og forsterke c-Jun hyperfosforylering (c-Jun) som respons på TNF-a-behandling. Kryssenes tykkelse er proporsjonal med intensiteten av en gitt virkning. Stjerner angir at de observerte virkninger av de merkede konstruksjoner mot Rel-A-stimulering er signifikante (se figur 1 IB). (B) Oppsummering av tabellen som angir lokalisering av bindende (øvre del) og funksjonelle (nedre del) områder i RAP-2 utledet fra delesjonsanalysen vist i (A),

oppstilt langs proteinryggraden. Skraverte områder angir mulig lokalisering av grensene mellom de tilsvarende minimalområder.

Figur 13 viser at ser-148 i RAP-2 er avgjørende for proteinets evne til å indusere c-Jun-hyperfosforylering i ser-63.

Et Western-blot er vist i hvilket wt står for villtype, S48A betyr at ser i posisjon 148 var erstattet med ala, og vektor angir tom kontrollvektor.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I en utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse nye RAP-2-proteiner som kan bindes til RJP-proteinet og derved formidle eller modulere den intracellulære aktivitet av RIP, særlig dersom RIP deltar i modulering eller formidling av reaksjonsveier for inflammasjon, celledød og/eller celleoverlevelse, som beskrevet i detalj heri ovenfor. Således kan RAP-2 inhibere RIP-aktivitet i reaksjonsveiene for celledød/inflammasjon/ overlevelse, RAP-2 kan forsterke RIP-aktiviteten i reaksjonsveiene for inflammasjon eller celledød/overlevelse, eller proteinet kan forsterke RIP-aktiviteten i en av disse reaksjonsveier mens det inhiberer aktiviteten i de andre.

Nærmere bestemt tilveiebringes ifølge foreliggende oppfinnelse et nytt protein, RAP-2. RAP-2 har blitt sekvensert og karakterisert, og det ble funnet at RAP-2 er et RJP-bindende protein med høy spesifisitet for RIP, men at proteinet ikke viser binding overfor en rekke proteiner som vites å inngå i de intracellulære signalreaksjonsveier som fører til inflammasjon, celledød eller celleoverlevelse. RAP-2 har også tilsynelatende ingen av de domener som er felles for proteiner som er aktive i noen av disse reaksjonsveier, dvs. at RAP-2 ikke har et "dødsdomene"-motiv eller en "dødsdomene"-modul, det har intet kinasemotiv eller -domene og intet proteasedomene eller -motiv. Den bestemte RAP-2-sekvens er også en unik sekvens, noe som fremgår av en sammenligning med sekvenser i et antall databaser, innbefattet genbank, det humane genom nivå 1 og "dbest". Som beskrevet i detalj ovenfor (også med referanse til alle angitt publikasjoner og patentsøknader) deltar RIP i de intracellulære reaksjonsveier for inflammasjon, celledød og celleoverlevelse. Således kan regulering eller kontroll av aktiviteten av RIP regulere en, flere eller alle disse reaksjonsveier dersom disse for eksempel utløses ved binding av TNF eller FAS-ligand til sine reseptorer (for TNF fortrinnsvis p55-R). RIP kan spille en nøkkelrolle for å bestemme hvilken reaksjonsvei som aktiveres i størst grad, dette ved hjelp av sin evne til å bindes til en rekke sytotoksiske proteiner med dødsdomener og også til en rekke proteiner med kinaseaktivitet. Følgelig kan proteiner, for eksempel RAP-2-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse, som spesifikt kan bindes til RIP spille en viktig rolle for modulering av RIP-aktiviteten og derved for modulering av omfanget av induksjon av en reaksjonsvei, sammenlignet med de andre. Således representerer RAP-2-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse en viktig intracellulær signalmodulator eller -formidler.

I tillegg til fullengde RAP-2-protein ifølge foreliggende oppfinnelse ble det klonet et kortere cDNA som ble funnet å bestå av sekvens-"blokker" avledet fra flere fjerntliggende områder i "fullengde" cDNA, tilsynelatende som følge av alternativ spleising av det samme gen. Motparten i mus til det humane RAP-2 ble identifisert i et tilsvarende søk i samlingen av EST fra mus. Det partielle cDNA fra mus ble funnet å være nær sagt identisk med det humane motstykket i hele det kodende området.

Den fysiologiske betydning av RIP-RAP-2-interaksjonen ble videre bekreftet i transfekterte HEK-293T-celler. Dannelse av et slikt kompleks førte imidlertid ikke til enzymatisk RIP-aktivitet, vist ved at overuttrykt RIP ikke fosforylerer RAP-2.

Transfeksjonseksperimenter i HEK-293T-celler fra pattedyr førte også til stabil dannelse av et RAP-2-NIK-kompleks.

RAP-2 ser ut til å være et avgjørende element i signaloverføringsreaksjonsveiene for NF-kB og c-Jun siden proteinet binder NIK, IKKfl og TIP60 (en histon astyltransferase) og modulerer NF-kB og c-Jun avhengig transkripsjon. Faktisk fører forhøyet ektopisk ekspresjon av RAP-2 til inhibering av NF-KB-responsen, mens fjerning av RAP-2 fra cellen ved hjelp av en antisenskonstruksjon fører til forhøyet transaktivering ved NF-kB og c-Jun.

RAP-2 ble også funnet å gi en forhøyet c-Jun-hyperfosforylering som ikke ble formidlet ved JNK-aktivitet. RAP-2 inhiberte ikke binding av c-Jun og RelA til det DNA. Bindingsdomenene og de funksjonelle domener i RAP-2 ble identifisert ved sekvens-delesjonsanalyser. Disse undersøkelser tyder på bindingsområdene for RIP, NIK og TIP60 overlapper hverandre og foreligger innenfor aminosyrene 95-264 i RAP-2. Nedstrømsfunksjonelle virkninger formidlet av RAP-2 ble imidlertid lokalisert til proteinets N-terminale domene som omfatter aminosyrene 1-264.

I lys av hva som er beskrevet ovenfor synes RAP-2 å være en avgjørende bestanddel av signalforsterkningskretsen i stressresponsnettverket: ektopisk ekspresjon av den "sens"-kodende konstruksjon inhiberer responsen mens ekspresjon av "antisens"-kodende konstruksjon styrker responsen. Faktisk betegnes RAP-2 i oppfinnerens laboratorium også som RAT (RIP's attenuator), og kan følgelig også heri betegnes RAT og/eller RAT-303 og/eller klon 303.

Forekomsten av flere spleisevarianter tyder på at nettovirkningen av RAP-2, i det minste delvis, under gitte betingelser sannsynligvis avhenger av forekomsten av visse sekvensblokker som er nødvendig for proteinbinding/målstyring/translokasjon/ modifisering i den dominerende isoform. Dersom for eksempel binding av RAP-2 til TJP60 faktisk gir kjernelokalisering av RAP-2 kan man forestille seg at varianter av RAP-2 med utspleisede kjernelokaliseringssignaler (NLS) kan bli inaktiv eller, omvendt, mer aktiv når det gjelder represjon av NF-kB/AP-1. Sekvensanalyse viser at RAP-2 besitter flere ansamlinger av positivt ladede aminosyrer (E, K og R), noe som er karakteristisk for de fleste kjente NLS.

RAP-2-binding til RIP er kartlagt til et område i RAP-2-proteinet som starter mellom aminosyrene 177-218 og slutter ved aminosyrer 264. RIP-bindingsdomenet i RAP-2 overlapper verken bindingssetet for IKKB eller setet for NIK.

Binding til TIP60, et medlem av en familie av kjerneproteiner betegnet histon asetyltransferaser, skjer tilsynelatende innenfor området som ligger mellom aminosyrene 95-264. Området som inngår i homo-dimerisering ble lokalisert til mellom aminosyrene 217-264.

De oppsamlede resultater tyder på at alle funksjonelle virkninger av RAP-2 (nemlig NF-KB-inhibering og induksjon av c-Jun-hyperfosforylering) kan kartlegges til det samme området.

Proteinet som kodes av klon nr. 10 bindes tilsynelatende innenfor et område som begynner mellom aminosyrene 218 og 309 og ender ved aminosyre 416, bindingssetet kan således omfatte områder som overlapper med bindingssetene for RIP, NIK, IKKB og TIP60.

Det er videre mulig at området som er tilstrekkelig for effektiv modulering av signaliseringen ved alle indusere er lokalisert til proteinets N-terminale segment.

Området som ligger mellom aminosyrene 95 og 416 har en virkning, om enn signifikant lavere enn virkningen som gis av fullengdeproteinet, og kan således være en følge av tvunget aggregering av endogent RAP-2.

Videre kan, bortsett fra RelA, alle virkninger som induseres i våre eksperimenter formidles av så få som tilnærmet 100 N-terminale aminosyrer fra RAP-2. Faktisk formidler selv fragmentet som omfatter aminosyrene 1-102 en klar virkning, om enn temmelig moderat.

Derimot kreves undertrykkelse av den RelA-formidlede virkning en mye større del av RAP-2. Hittil har vi kunnet definere grensene for dette området til å ligge mellom aminosyrene 1 og 264, et område som tilsynelatende gir området mellom aminosyrene 157 og 264 visse spesifikke, RelA-assosierte bindingsegenskaper.

I lys av observasjonene ovenfor ser det ut til at:

a) Bortsett fra RelA er binding av RAP-2 til RIP, klon nr. 10 og sannsynligvis til NIK og TIP60 ikke nødvendig for funksjon av proteinet, siden inhibering av

overekspresjonen induserte NF-kB.

b) Virkningen av RAP-2 på RelA-overekspresjonsindusert aktivering formidles åpenbart i det minste delvis av forskjellige bindingsbegivenheter. I det vesentlige

kan alle proteinene nevnt ovenfor tenkes å bidra til den gitte aktivitet, noe som kan utledes fra eksperimentene som hittil er utført.

Grunnet den enestående evne til FAS-R og TNF-reseptorene til å forårsake celledød, så vel som TNF-reseptorenes evne til å utløse forskjellige andre vevsskadende aktiviteter, kan forstyrret funksjon av disse reseptorer være spesielt skadelig for organismen. Faktisk har både overdreven og manglende funksjon av disse reseptorer blitt vist å bidra til de patologiske manifestasjoner av forskjellige sykdommer. Å identifisere molekyler som deltar i signalaktiviteten til disse reseptorer og å finne måter for modulering av disse molekylers funksjon utgjør en mulig vei for nye terapeutiske tilnærminger til disse sykdommer. I lys av den antatt viktige rolle for RIP i FAS-R og p55-R-toksisitet, og følgelig den antatt viktige regulatoriske rolle for RAP-2 for FAS-R og TNF via modulering av RIP, synes det spesielt viktig å utforme medikamenter som kan blokkere den sytotoksiske virkning av RIP, muligens ved å blokkere binding av RAP-2 til RIP eller på annet vis å inhibere interaksjonen mellom RAP-2 og RIP under de betingelser hvor RAP-2 bidrar til å forsterke den RIP-formidlede sytotoksisitet (som angitt ovenfor er RIP sytotoksisk i seg selv og forbindelse med andre proteiner med dødsdomene-områder).

Likeså er det også kjent (se ovenfor) at FAS-R og p55-R inngår i aktivering av NF-kB og derved av celleoverlevelse. Dersom det er ønskelig å drepe celler, for eksempel cancerceller, HIV-infiserte celler og lignende, vil det følgelig være ønskelig å forsterke de sytotoksiske virkninger av FAS-R og p55-R (og disses assosierte proteiner, for eksempel MORT-1, MACH, Mch4, Gl og TRÅDD), og samtidig inhibere deres evne til å indusere NF-kB. Dersom RAP-2-interaksjon med eller -binding til RIP fører til en forsterking av den mulige rolle for RIP i forsterking av NF-KB-induksjonen (muligens via TRAF2 og muligens via kinasedomenet og/eller det intermediære domenet i RIP), vil det følgelig være ønskelig å blokkere denne interaksjon mellom RAP-2 og RIP for å inhibere, eller i det minste å forhindre, forsterkning av NF-KB-aktiveringen og derved forskyve balansen mellom TNF- eller FAS-ligand-induserte virkninger over mot cellesytotoksisitet for endelig å oppnå forhøyet celledød.

I den omvendte situasjon (til den beskrevet ovenfor), hvor binding av RAP-2 til RIP faktisk gir inhibering av de inflammatoriske eller sytotoksiske virkninger av FAS-R og p55-R og det er ønskelig å blokkere disse sytotoksiske virkninger, for eksempel

ved inflammasjon, forskjellige autoimmun sykdommer og lignende, hvor forhøyet celleoverlevelse ønskes, er det på tilsvarende måte viktig å utforme medikamenter som vil forsterke interaksjonen mellom RAP-2 og RIP for å forsterke totalinhiberingen av celledød og forskyve balansen mot celleoverlevelse. I lys av hva som er beskrevet ovenfor følger det også at dersom interaksjonen mellom RAP-2 og RIP fører til inhibering av funksjonen av RIP i forsterkning av NF-KB-aktiveringen er det, dersom celleoverlevelse er ønskelig, nødvendig å blokkere denne interaksjonen mellom RAP-2 og RIP og derved øke aktiviteten av RIP i forsterkning av NF-KB-aktiveringen.

I lys av alt som er nevnt ovenfor fremgår det at RIP har en nøkkelrolle i balansen mellom induksjon eller formidling av reaksjonsveier for inflammasjon, celledød og celleoverlevelse, og at RAP-2 følgelig spiller en like viktig rolle ved å være en modulator av RIP. Ved å påvirke RAP-2-RIP-interaksjonen/-bindingen ved anvendelse av forskjellige medikamenter eller behandlingsformer som angitt ovenfor og nedenfor vil muligens tillate en forskyvning av de intracellulære signalreaksjonsveier fra celledød mot celleoverlevelse eller omvendt, alt etter som hva som er ønskelig.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også DNA-sekvensen som koder for et RAP-2-protein og RAP-2-proteinene som kodes av DNA-sekvensene.

Videre gjelder foreliggende oppfinnelse DNA-sekvensene som koder for biologisk aktive analoger, fragmenter eller derivater av RAP-proteinet samt analogene, fragmentene og derivatene som kodes av disse. Fremstilling av slike analoger, fragmenter og derivater skjer ved standard fremgangsmåter (se for eksempel Sambrook et al., 1989), i hvilke et eller flere kodoner kan fjernes, innsettes eller erstattes med andre i DNA-sekvensene som koder for RAP-2-proteinet for å gi analoger med minst en aminosyrerestendring sammenlignet med det native protein.

Blant de ovenforbeskrevne DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen som koder for et RAP-2-protein eller en isoform, en analog, et fragment eller et derivat av dette, inngår også som en utførelse av oppfinnelsen DNA-sekvenser som kan hybridisere til en cDNA-sekvens avledet fra det kodende området for et nativt RAP-2-protein, dersom hybridiseringen utføres under moderat stringente betingelser og de hybridiserbare DNA-sekvenser koder for et biologisk aktivt RAP-2-protein. Disse hybridiserbare DNA-sekvensene omfatter DNA-sekvenser med relativt høy homologi med den native RAP-2-cDNA-sekvens, og representerer således RAP-2-lignende sekvenser som for eksempel kan være naturlig avledede sekvenser som koder for de forskjellige RAP-2-isoformene eller naturlig forekommende sekvenser som koder for proteiner som tilhører en gruppe av RAP-2-lignende sekvenser og koder for et protein med RAP-2-aktivitet. Videre kan disse sekvenser også for eksempel omfatte ikke-naturlig forekommende, syntetisk fremstilte sekvenser som ligner den native RAP-2-cDNA-sekvens, men som omfatter et antall ønskede modifikasjoner. Slike syntetiske sekvenser omfatter derfor alle de mulige sekvenser som koder for analoger, fragmenter og derivater av RAP-2, som alle har RAP-2-aktivitet.

For erholdelse av de ovenfornevnte, naturlig forekommende RAP-2-lignende sekvenser kan standard fremgangsmåter for søk etter og isolering av naturlig avledede DNA- eller RNA-prøver fra forskjellige vev benyttes, med det naturlige RAP-2-cDNA eller en del av dette som probe (se for eksempel standard fremgangsmåtene beskrevet i Sambrook et al., 1989).

For fremstilling av de ovenfornevnte, forskjellige syntetiske RAP-2-lignende sekvenser som koder for analoger, fragmenter eller derivater av RAP-2 kan på tilsvarende vis en rekke standard fremgangsmåter benyttes, som beskrevet i detalj heri nedenfor vedrørende fremstilling av slike analoger, fragmenter og derivater.

Et polypeptid eller et protein som "i det vesentlige tilsvarer" RAP-2-protein omfatter ikke bare RAP-2-protein, men også polypeptider eller proteiner som er analoger av RAP-2.

Analoger som i det vesentlige tilsvarer RAP-2-protein er polypeptider i hvilke en eller flere aminosyrer i aminosyresekvensen til RAP-2-protein erstattet med en annen aminosyre, er delert og/eller innsatt, forutsatt at det resulterende protein viser i det vesentlige den samme eller høyere biologiske aktivitet enn RAP-2-proteinet det tilsvarer.

For å i det vesentlige tilsvare RAP-2-protein er endringene i sekvensen til RAP-2-proteinene, for eksempel isoformene, generelt relativt små. Selv om antall endringer kan være høyere enn ti er det fortrinnsvis ikke mer enn ti endringer, mer foretrukket ikke mer enn fem, og mest foretrukket ikke mer enn tre slike endringer. Selv om enhver teknikk kan benyttes for å finne mulige biologisk aktive proteiner som i det vesentlige tilsvarer RAP-2-proteiner er en slik teknikk anvendelse av konvensjonelle mutagenese-teknikker på DNA som koder for proteinet og som fører til få modifikasjoner.

Proteinene som uttrykkes av slike kloner kan så analyseres for evne til å bindes til RIP og modulere RIP-aktivitet i modulering/formidling av de intracellulære reaksjonsveier som er beskrevet ovenfor.

"Konservative" endringer er endringer som ikke vil forventes å endre proteinets aktivitet og er vanligvis de første som analyseres, da disse ikke vil forventes i vesentlig grad å endre størrelse, ladning eller konfigurasjon av proteinet, og således ikke vil forventes å endre proteinets biologiske egenskaper.

Konservative substitusjoner i RAP-2-proteiner omfatter en analog hvori minst en aminosyrerest i polypeptidet er konservativt erstattet med en forskjellig aminosyre. Slike substitusjoner utføres fortrinnsvis i samsvar med den påfølgende liste vist i tabell IA, hvor substitusjoner kan bestemmes ved rutinemessig eksperimentering og gi modifiserte strukturelle og funksjonelle egenskaper av et syntetisert polypeptidmolekyl samtidig som den biologiske aktivitet som særpreger RAP-2-protein bibeholdes. Alternativt er en annen gruppe substitusjon i RAP-2-protein subtitusjon i hvilke minst en aminosyrerest i polypeptidet er fjernet og en annen aminosyrerest innsatt i dennes sted, ifølge den påfølgende tabell IB. Typene av substitusjoner som kan innføres i polypeptidet kan være basert på analyse av hyppigheten av aminosyreendringer mellom homologe proteiner fra forskjellige arter, for eksempel dem presentert i tabell 1-2 i Schulz et al., G.E. Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798, og Fig. 3-9 i Creighton, T.E. Proteins; Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Basert på en slik analyse defineres alternative konservative substitusjoner heri som utbytninger innenfor en av følgende frem grupper:

De tre aminosyrerestene i parentes ovenfor spiller spesielle roller i proteinarkitektur. Gly er den eneste aminosyrerest som mangler sidekjede, og gir således fleksibilitet til polypeptidkjeden. Dette bidrar imidlertid til å fremme dannelse av sekundær strukturer forskjellige fra a-heliksstrukturen. Pro vil på grunn av sin uvanlige geometri i stor grad begrense kjedens bevegelsesfrihet, og vil generelt bidra til å fremme B-løkkelignende strukturer, selv om Cys i visse tilfeller kan delta i dannelse av de sulfidbindinger, noe som er viktig for proteinfolding. Bemerk at Schulz et al., supra, vil slå sammen gruppene 1 og 2 ovenfor. Bemerk også at Tyr grunnet sitt hydrogenbindingspotensiale har omfattende slektskap med Ser, og Thr, osv.

Konservative aminosyresubstitusjoner ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel som presentert ovenfor, er kjent innen faget og vil forventes å opprettholde polypeptidets biologiske og strukturelle egenskaper etter aminosyresubstitusjonen. De fleste delesjoner og substitusjoner ifølge foreliggende oppfinnelse er delesjoner og substitusjoner som ikke gir dramatiske endringer i proteinet eller polypeptidmolekylets egenskaper. "Egenskaper" er definert på en ikke-inkluderende måte til å definere både endringer i sekundærstruktur, for eksempel oc-heliks eller 6-plate, så vel som endringer i biologisk aktivitet, for eksempel binding til REP og/eller formidling av virkningen av RE? på celledød.

Eksempler på innføring av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan benyttes for erholdelse av analoger av RAP-2-proteiner for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter trinn fra enhver kjent fremgangsmåte for eksempel som presentert i U.S. patentskrifter RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 og 4,737,462 tildelt Mark et al., 5,116,943 tildelt Koths et al., 4,965,195 tildelt Nåmen et al., 4,879,111 tildelt Chong et al., og 5,017,691 tildelt Lee et al.; og lysin substituerte proteiner, presentert i U.S. patentskrift nr. 4,904,584 (Shaw et al.).

I tillegg til de konservative substitusjoner som er diskutert ovenfor og som ikke i vesentlig grad vil endre RAP-2-proteinets aktivitet er både konservative substitusjoner og mindre konservative og mer tilfeldige endringer som fører til forhøyet biologisk aktivitet av analogene av RAP-2-proteinene ment å ligge innenfor oppfinnelsens område.

Dersom den nøyaktige virkning av substitusjonen eller delesjonen skal bekreftes vil fagfolk forstå at virkningen av substitusjonen(e), delesjonen(e), osv. vil evalueres ved rutinemessige bindingsanalyser og celledødsanalyser. Analyser ved benyttelse av en slik standard analyse medfører ikke omfattende eksperimentering.

Aksepterbare RAP-2-analoger er analoger som bibeholder i det minste evnen til å bindes til RIP og derved, som bemerket ovenfor, formidle aktiviteten av RIP i de intracellulære reaksjonsveier som er beskrevet ovenfor. På en slik måte kan det fremstilles analoger som har en såkalt dominant-negativ virkning, nemlig en analog som er defekt enten når det gjelder binding til RIP eller i påfølgende signalaktivitet eller annen aktivitet som følger etter slik binding. Slike analoger kan for eksempel benyttes til å inhibere virkningen av RD? eller å inhibere den NF-KB-induserende (direkte eller indirekte) virkning av RIP, avhengig av hvilke av disse aktiviteter som er den viktigste som moduleres ved interaksjonen mellom RAP-2 og RIP (se ovenfor), og dette ved hjelp av slike analoger som konkurrerer med naturlig RAP-2 om binding til RIP.

På genetisk nivå fremstilles disse analogene generelt ved setestyrt mutagenese av nukleotider i DNA som koder for RAP-2-proteinet, hvorved det fremstilles DNA som koder for analogen, og deretter syntese av DNA og ekspresjon av polypeptidet i rekombinant cellekultur. Analogene viser typisk den samme eller forhøyet kvalitativ biologisk aktivitet som det naturlig forekommende protein, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Fremstilling av RAP-2-protein i samsvar med dette eller en alternativ nukleotidsekvens som koder for samme polypeptid, men som avviker fra den naturlige sekvens grunnet endringer som tillates av den genetiske kodes kjente degenererthet, kan erholdes ved setestyrt mutagenese av DNA som koder for en tidligere fremstilt analog eller en nativ versjon av et RAP-2-protein. Setestyrt mutagenese tillater fremstilling av analoger ved benyttelse av spesifikke oligonukleotidsekvenser som koder for DNA-sekvensen til den ønskede mutasjon, så vel som et tilstrekkelig antall nabonukleotider, til at det oppnås en primersekvens av tilstrekkelig størrelse og sekvenskompleksitet til at den danner en stabil dupleks på begge sider av delesjonssetet som overspennes. Typisk foretrekkes en primer på tilnærmet 20 til 25 nukleotider med tilnærmet 5 til 10 komplementære nukleotider på hver side av sekvensen som skal endres. Generelt er teknikken for setestyrt mutagenese velkjent innen faget, se for eksempel publikasjoner som Adelman et al., DNA 2:183 (1983).

Det vil forstås at teknikker for setestyrt mutagenese typisk benytter en baketeriofag vektor som foreligger både i enkelttrådet og dobbelttrådet form. Typiske vektorer som er anvendbare i setestyrt mutagenese omfatter vektorer som bakteriofag M13, som for eksempel beskrevet i Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, red. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Disse bakteriofager er lett tilgjengelige kommersielt, og deres anvendelse er generelt velkjent blant fagfolk. Alternativt kan plasmidvektorer som inneholder et replikasjonsorigo fra en enkelttrådet bakteriofag (Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3,1987) benyttes for erholdelse av enkelttrådet DNA.

Generelt utføres setestyrt mutagenese i samsvar med foreliggende oppfinnelse ved først å erholde en enkelttrådet vektor som omfatter i sin sekvens en DNA-sekvens som koder for det relevante polypeptid. En oligonukleotid primer som bærer den ønskede muterte sekvens fremstilles syntetisk ved automatisert DNA/oligonukleotidsyntese. Denne primer hybridiseres så til den enkelttrådede, proteinsekvensholdige vektor og behandles med DNA-polymeriserende enzymer som Klenow-fragmentet av E. coli polymerase I for å fullføre syntesen av den mutasjonsbærende tråd. Således oppstår en mutert sekvens, og annen tråden bærer den ønskede mutasjon. Denne heterodupleksvektor benyttes så for transformasjon av egnede celler, for eksempel E. coli JMlOl-celler, og det selekteres kloner som omfatter rekombinante vektorer som bærer det muterte sekvens arrangement.

Etter seleksjon av en slik klon kan den muterte RAP-2-proteinsekvensen fjernes og plasseres i en egnet vektor, generelt en overføringsvektor eller ekspresjonsvektor av den type som vil benyttes for transfeksjon av en egnet vert.

Følgelig kan gen eller nukleinsyre som koder for et RAP-2-protein også påvises, erholdes og/eller modifiseres in vitro, in situ og/eller in vivo ved benyttelse av kjente DNA- eller RNA-amplifiseringsteknikker, for eksempel PCR og kjemisk oligo-nukleotidsyntese. PCR tillater amplifisering (økt antall) av spesifikke DNA-sekvens ved gjentatte DNA-polymerase reaksjoner. Denne reaksjonen kan benyttes som erstatning for kloning, alt som kreves er kjennskap til nukleinsyreskevensen. For å utføre PCR utformes primere som komplementære til sekvensen av interesse. Primerne fremstilles så ved automatisert DNA-syntese. Siden primere kan utformes slik at de hybridiseres til enhver del av genet kan man benytte betingelser som gjør at mistilpasninger i komplementær baseparring kan tolereres. Amplifisering av disse mistilpassede områder kan føre til syntese at et mutagenisert produkt, noe som fører til dannelse av et peptid med nye egenskaper (dvs. setestyrt mutagenese). Se også for eksempel Ausubel, supra, Kap. 16. Ved å koble komplementær DNA (cDNA)-syntese ved hjelp av revers transkriptase til PCR kan også RNA benyttes som utgangsmateriale for syntese av det ekstracellulære domenet av en prolaktin reseptor uten kloning.

Videre kan PCR-primere utformes slik at de innfører nye restriksjonsseter eller andre egenskaper, for eksempel stoppkodoner, i endene av gensegmentet som skal amplifiseres. Denne plassering av restriksjonsseter i 5' og 3' ende av den amplifiserte gensekvens tillater skreddersying av gensegmenter som koder for RAP-2-protein eller et fragment av dette for ligering til andre sekvenser og/eller til kloningsseter i vektorer.

PCR og andre fremgangsmåter for amplifisering av RNA og/eller DNA er velkjent innen faget og kan benyttes ifølge foreliggende oppfinnelse uten unødig eksperimentering, basert på den lære og de retningslinjer som presenteres heri. Kjente fremgangsmåter for RNA- og DNA-amplifisering omfatter, men er ikke begrenset til, polymerasekjedereaksjonen (PCR) og beslektede amplifiseringsprosesser (se for eksempel U.S. patentskrifter nr. 4,683.195,4,683,202,

4,800,159, 4,965,188 tildelt Mullis et al.; 4,795,699 og 4,921,794 tildelt Tabor et al.,; 5,142,033 tildelt Tunis; 5,122,464 tildelt Wilson et al.; 5,091,310 tildelt Innis; 5,066,584 tildelt Gyllensten et al.; 4,889,818 tildelt Gelfand et al.; 4,994,370 tildelt Silver et al.; 4,766,067 tildelt Biswas; 4,656,134 tildelt Ringold; og Innis et al., red. PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) og RNA-formidlede amplifisering som benytter anti-sens-RNA til målsekvensen som templat for dobbeltrådet DNA-syntese (U.S. patentskrift nr. 5,130,238 tildelt Malek et al., med varemerket NASBA); og irnmun-PCR, som kombinerer anvendelse av DNA-amplifisering med antistoffmerking (Ruzicka et al., Science 260:487 (1993); Sano et al., Science 258:120 (1992), Sano et al., Biotechniques 9:1378 (1991)).

På analog måte kan biologisk aktive fragmenter av RAP-2-proteiner (dvs. fragmenter fra enten RAP-2 eller dets isoformer) fremstilles som bemerket ovenfor når det gjelder analoger av RAP-2-proteiner. Egnede fragmenter av RAP-2-proteiner er fragmenter som bibeholder evnen til RAP-2 og som kan modulere eller formidle den biologiske aktivitet av RIP eller andre proteiner forbundet med RIP, direkte eller indirekte. Følgelig kan det fremstilles RAP-proteinfragmenter som har dominant-negativ eller dominant-positiv virkning, som bemerket ovenfor når det gjelder analoger. Det bør bemerkes at disse fragmenter representerer en spesiell klasse analoger ifølge oppfinnelsen, de er nemlig definerte deler av RAP-2-proteiner avledet fra den fulle RAP-2-proteinsekvens (dvs. fra RAP-2 eller hvilken som helst av dets isoformer), hvor hver slik del eller hvert fragment har hvilken som helst av de ovenforbemerkede, ønskede aktiviteter. Et slikt fragment kan for eksempel være et peptid.

På tilsvarende måte kan derivater fremstilles ved standard modifisering av sidekjeden til en eller flere aminosyrerester i RAP-2-proteinet, dets analoger eller fragmenter, eller ved konjugasjon av RAP-2-proteinet, dets analoger eller fragmenter til et annet molekyl, for eksempel et antistoff, et enzym, en reseptor osv., som velkjent innen faget. Følgelig dekker "derivater" som begrepet benyttet heri, derivater som kan fremstilles fra de funksjonelle grupper som foreligger som sidekjeder i aminosyrerestene eller i N- eller C-terminale grupper ved fremgangsmåter kjent innen faget, og omfattes av oppfinnelsen. Derivater kan ha kjemiske grupper, for eksempel karbohydratrester eller fosfatrester, forutsatt at en slik fraksjon har den samme biologiske aktivitet eller høyere enn RAP-2-proteiner.

Derivater kan for eksempel omfatte alifatiske estere av karboksylgruppene, amider av karboksylgruppene ved reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-asylderivater av frie aminogrupper i aminosyrerestene, dannet med asylgrupper (for eksempel alkanoylgrupper eller karboksyliske aroylgrupper) eller O-asylderivater av frie hydroksylgrupper (for eksempel hydroksylgruppen i seryl- eller treonylrester), dannet med asylerester.

Begrepet "derivater" er ment å omfatte kun de derivater som ikke endrer en aminosyre til en annen av de tyve vanlig forekommende, naturlige aminosyrer.

RAP-2 er et protein eller polypeptid, dvs. en sekvens av aminosyrerester. Et polypeptid som består av en større sekvens som omfatter hele sekvensen til et RAP-2-protein i samsvar med definisjonene heri er ment å omfattes innenfor området av et slikt polypeptid, så lenge addisjonene ikke påvirker de grunnleggende og nye egenskaper ifølge oppfinnelsen, dvs. dersom de enten bibeholder eller forhøyer RAP-2-proteinets biologiske aktivitet eller kan kløyves slik at det dannes et protein eller polypeptid med RAP-2-proteinets biologiske aktivitet. Således er for eksempel foreliggende oppfinnelse ment å omfatte fusjonsproteiner mellom RAP-2-protein og andre aminosyrer eller peptider.

Det nye RAP-2-proteinet og analoger, fragmenter og derivater av dette har en rekke mulige anvendelser, for eksempel: (i) RAP-2-protein, dets analoger, fragmenter og derivater kan benyttes for å modulere funksjonen av RIP i enten inflammasjonsreaksjonsveien, celledødsreaksjonsveien eller celleoverlevelsesreaksjonsveien, som bemerket ovenfor. Dersom for eksempel RAP-2 kan modulere virkningen av RIP på aktivering av NF-kB kan slike RAP-2-virkninger føre til å forsterke en slik RAP-2-RIP-virkning når dette er ønskelig i antitumor-behandling, anti- eller proinflammatorisk behandling, anti-HIV-behandling osv. I dette tilfellet kan RAP-2-proteinet, dets analoger, fragmenter eller derivater som modulerer inflammasjon, forsterker den sytotoksiske virkning eller blokkerer celleoverlevelses-virkningen innføres i cellene ved standard fremgangsmåter som er kjent i seg selv. Dersom for eksempel RAP-2-proteinet er fullstendig intracellulært (noe som mistenkes) og bør innføres kun i de celler hvor FAS-R-liganden eller TNF eller andre sytotoksiske proteinvirkninger formidlet av RE? er ønskelig, er det nødvendig med et system for spesifikk innføring av dette protein i cellene. En måte å gjøre dette på er å danne et rekombinant dyrevirus, for eksempel et avledet fra Vaccinia, i hvis DNA følgende to gener vil innføres: genet som koder for en ligand som bindes til celleoverflateproteiner som spesifikt uttrykkes av cellene, for eksempel ligander som gpl20-protein fra AIDS (HlV)-virus, som spesifikt bindes til visse celler (CD4-lymfosytter og beslektede leukemier), eller enhver annen ligand som bindes spesifikt til celler som bærer FAS-R eller p55-R, slik at den rekombinante virusvektor vil være i stand til å bindes til slike FAS-R eller p55-R-bærende celler; og genet som koder for RAP-2-proteinet. Således vil ekspresjon av det celleoverflatebindende

protein på virusets overflate målstyre viruset spesifikt til tumorcellen eller en annen FAS-R eller p55-R-bærende celle, hvoretter den RAP-2-proteinkodende sekvens vil innføres i cellene ved hjelp av viruset, noe som ved ekspresjon i cellene vil føre til forsterkning av RIP-formidlingen av virkningen av FAS-R-ligand eller TNF, eller uavhengig av RIP. Konstruksjon av et slikt rekombinant dyrevirus skjer ved standard fremgangsmåter (se for eksempel Sambrook et al., 1989). En annen mulighet er å innføre sekvensene for RAP-2-proteinet (dvs.

enten RAP-2 eller enhver av dets isoformer) i form av oligonukleotider som kan absorberes av cellene og uttrykkes i disse.

(ii) De kan benyttes for inhibering av virkningen av FAS-R-ligand eller TNF eller beslektede proteiner, formidlet av RIP eller RIP-uavhengig, for eksempel i tilfeller som vevsskader ved septisk sjokk, "graft-versus-host"-avvisning eller akutt hepatitt, i hvilke det er ønskelig å blokkere intracellulær signalisering via FAS-R-ligand eller TNF-indusert FAS-R eller p55-R, eller en uavhengig RIP-virkning, eller andre former for proteinformidlet signalisering, og samtidig å forsterke celleoverlevelsesreaksjonsveien. I denne situasjon er det for eksempel mulig å innføre i cellene ved standard fremgangsmåter oligonukleotider med antisens-sekvens til RAP-2-proteinets kodende sekvens, noe som effektivt vil blokkere translasjon av mRNA som koder for RAP-2-proteinet og derved blokkere dettes ekspresjon og gi inhibering av virkningen av FAS-R-ligand eller TNF eller RD? eller et annet protein. Slike oligonukleotider kan innføres i cellene ved benyttelse av den ovenforbeskrevne tilnærming med rekombinant virus, hvor den andre sekvens som bæres av viruset er oligonukleotidsekvensen.

Som bemerket ovenfor kan det likeså, avhengig av egenskapene ved RAP-2-RD?-interaksjonen, være mulig ved tilnærming (i) og (ii) ovenfor å forsterke eller inhibere cellulære reaksjonsveier for inflammasjon og overlevelse hvor dette er ønskelig.

En annen mulighet er å benytte antistoffer som er spesifikke for RAP-2-proteinet for å inhibere dettes intracellulære signalaktivitet.

Nok en måte å inhibere de RDP-formidlede virkninger eller en RJP-uavhengig virkning på er ved den nylig utviklede ribozymtilnærming. Ribozymer er katalytiske RNA-molekyler som spesifikt kløyver RNA. Ribozymer kan utformes slik at de kløyver utvalgte mål-RNA, for eksempel mRNA som koder for RAP-2-proteinet ifølge oppfinnelsen. Slike ribozymer vil ha en sekvens som er spesifikk for RAP-2-proteiner og vil være i stand til å interagere med dette (komplementærbinding), fulgt av kløyving av mRNA, noe som fører til redusert (eller fullstendig fjernet) ekspresjon av RAP-2-proteinet, hvor nivået av den reduserte ekspresjon vil avhenge av nivået av ribozym-ekspresjon i målcellen. For innføring av ribozymer i utvalgte celler (for eksempel celler som bærer FAS-R eller p55-R) kan enhver egnet vektor benyttes, for eksempel plasmidvektorer, dyrevirus (retrovirus)-vektorer som vanligvis benyttes for dette formål (se også (i) ovenfor, hvor viruset som andre sekvens har et cDNa som koder for den ønskede ribozymsekvens). (For oversiktsartikler, fremgangsmåter osv. vedrørende ribozymer, se Chen et al., 1992; Zhao og Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph og Burkc, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993, Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 og Koizumi et al., 1993). Denne tilnærming er egnet dersom RAP-2-RJP-interaksjonen forsterker cellesytotoksisiteten i situasjoner hvor det er ønskelig å blokkere denne sytotoksisitet, eller dersom RAP-2-REP-interaksjonen inhiberer NF-kB-aktivering i den samme situasjon hvor det er ønskelig å blokkere denne inhibering for å forsterke slik NF-kB-aktivering, dvs. at det i begge tilfelle er ønskelig å forhøye celle-overlevelsen som i (ii) ovenfor. (iii) RAP-2-proteinet, dets analoger, fragmenter eller derivater kan også benyttes for isolering, identifisering og kloning av andre proteiner fra samme klasse, dvs. proteiner som bindes til RJP eller til funksjonelt beslektede reseptorer eller proteiner som deltar i den intracellulære signalprosess. I denne tilnærming kan det ovenforbeskrevne tohybrid-systemet i gjær benyttes, eller det kan brukes et tidlig utviklet system som benytter ikke-stringent Southern-hybridisering fulgt av PCR-kloning (Wilks et al., 1989). I publikasjonen til Wilks et al., beskrives identifisering og kloning av to antatte protein-tyrosin-kinaser ved anvendelse av ikke-stringent Southern-hybridisering, fulgt av kloning ved PCR basert på den kjente sekvens av kinasemotivet, av en antatt kinase-sekvens. Denne tilnærming kan benyttes i samsvar med foreliggende oppfinnelse ved benyttelse av RAP-2-proteinets sekvens til identifisering og kloning av sekvensene for beslektede RIP-bindende proteiner. (iv) Ytterligere en tilnærming for anvendelse av RAP-2-proteinet eller dets analoger, fragmenter eller derivater ifølge oppfinnelsen er å benytte dem i fremgangsmåter for affinitetskromatografi for isolering og identifisering av andre proteiner eller faktorer til hvilke de kan bindes, for eksempel andre proteiner eller faktorer som inngår i den intracellulære signalprosess. I denne anvendelse kan RAP-2-proteinet, dets analoger, fragmenter eller derivater ifølge foreliggende oppfinnelse hvor for seg kobles til affinitetskromatografistøttemidler og deretter bringes i forbindelse med celleekstrakter eller isolerte proteiner eller faktorer som antas å inngå i den intracellulære signalprosess. Etter affinitetskromatografifremgangsmåten kan de andre proteiner eller faktorer som bindes til RAP-2-proteinet eller dets analoger, fragmenter eller derivater ifølge oppfinnelsen elueres, isoleres og karakteriseres. (v) Som bemerket ovenfor kan RAP-2-proteinet eller dets analoger, fragmenter eller derivater ifølge oppfinnelsen også benyttes som immunogener (antigener) for fremstilling av spesifikke antistoffer rettet mot dem. Disse antistoffer kan også benyttes for rensing av RAP-2-proteinet (for eksempel RAP-2 eller enhver av dets isoformer), enten fra celleekstrakter eller fra transformerte cellelinjer som produserer RAP-2-protein eller dets analoger eller fragmenter. Videre kan disse antistoffer benyttes for diagnostiske formål for identifisering av forstyrrelser forbundet med unormal funksjon av det RJP-2-formidlede FAS-R-ligand- eller TNF-system eller uavhengige RIP-aktiviteter, for eksempel overaktive eller underaktive FAS-R-ligand- eller TNF-induserte cellulære virkninger formidlet av RIP, eller de spesifikke cellulære virkninger av RIP selv. Skulle slike forstyrrelser være forbundet med et feilaktig fungerende intracellulært signalsystem som omfatter RDP-proteinet eller forskjellige andre, ovenfor angitte RIP-bindende proteiner eller RAP-2-proteinet selv, kan slike antistoffer således fungere som et viktig diagnostisk verktøy.

Det bør også bemerkes at isolering, identifisering og karakterisering av RAP-2-proteinet ifølge oppfinnelsen kan utføres ved benyttelse av enhver av de velkjente standard-analysefremgangsmåtene. For eksempel ble en av disse analysefremgangsmåter, tohybridfremgangsmåten i gjær som beskrives heri nedenfor, benyttet for identifisering av REP-proteinet (se Stanger et al., 1995) og deretter de forskjellige RAP-2-proteiner ifølge oppfinnelsen (i tillegg til forskjellige andre nye proteiner ifølge oppfinnernes ovenfor og nedenfor angitte, ennå ikke-avgjorte patentsøknader). Likeså, som angitt ovenfor og nedenfor, kan andre fremgangsmåter benyttes, for eksempel affinitetskromatografi, DNA-hybridiseringsfremgangsmåter osv., som velkjent innen faget, for isolering, identifisering og karakterisering av RAP-2-proteinet ifølge oppfinnelsen, eller for isolering, identifisering og karakterisering av ytterligere proteiner, faktorer, reseptorer osv. som kan bindes til RAP-2-proteinene ifølge oppfinnelsen.

Som beskrevet heri ovenfor kan RAP-2-proteinet benyttes for frembringelse av antistoffer som er spesifikke for RAP-2-proteiner, for eksempel RAP-2 og dets isoformer. Disse antistoffene eller fragmenter av disse kan benyttes som beskrevet i detalj heri nedenfor, idet det vil forstås at antistoffene eller fragmentene av disse i disse anvendelser er slike som er spesifikke for RAP-2-proteiner.

Basert på funnene i samsvar med foreliggende oppfinnelse, at RAP-2 bindes spesifikt til RIP og som sådan er en formidler/modulator av RIP og således kan formidle/modulere aktiviteten av RD? i reaksjonsveier for inflammasjon, celledød eller celleoverlevelse, hvor RD? fungerer uavhengig eller i forbindelse med andre proteiner (for eksempel FAS-R, p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, Gl og TRÅDD i celledødsreaksjonsveier, eller med TRAF2 i celleoverlevelsesreaksjonsveier) er det av viktighet å utforme medikamenter som kan forsterke eller inhibere RAP-2-RIP-interaksjonen etter ønske, og avhengig av hvilke av disse reaksjonsveier som forsterkes/inhiberes av RAP-2-RD?-interaksjonen. Det finnes mange sykdommer hvor slike medikamenter kunne være til stor hjelp. Blant disse er akutt hepatitt, hvor den akutte leverskade synes å reflektere FAS-R-ligandformidlet død av levercellene, autoimmunindusert celledød, for eksempel død av B-Langerhansceller i bukspyttkjertelen som fører til diabetes, celledød i transplantatavvisning (for eksempel nyre, hjerte og lever), død av oligonedrosytter i hjernen ved multipel sklerose, og AIDS-inhibert T-celleselvmord som gir proliferasjon av ADDS-viruset og således sykdommen AIDS.

Det er mulig at RAP-2 eller en eller flere av dets mulige isoformer kan fungere som "naturlige" inhibitorer av RD? i en eller flere av de ovenforbeskrevne reaksjonsveier, og at disse således kan benyttes som de ovenforbemerkede spesifikke inhibitorer av RDP. Likeså kan andre forbindelser, for eksempel peptider, organiske forbindelser, antistoffer osv., analyseres for erholdelse av spesifikke medikamenter som kan inhibere RAP-2-RJP interaksjonen.

Et eksempel på hvordan peptidinhibitorer av RAP-2-RIP-interaksjonen kunne utformes og analyseres er basert på tidligere undersøkelser av peptidinhibitorer av ICE eller ICE-lignende proteaser, substratspesifisiteten til ICE og strategier for epitopanalyse ved benyttelse av peptidsyntesen. Minimumskravet for effektiv peptidkløyving ved ICE ble funnet å omfatte fire aminosyrer til venstre for kløyvingssetet, ved sterk preferanse for asparginsyre i posisjon Pl og med metylamin som tilstrekkelig til høyre for Pl-posisjonen (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). Videre ble det fluorogene substratpeptid (et tetrapeptid), actyl-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metyl-coumaryl-7-amid) forkortet (Ac-DEVD-AMC, tilsvarende en sekvens i poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) som er vist å kløyves i celler kort etter FAS-R-stimulering så vel som i andre apoptotiske prosesser (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994) og som kløyves effektivt av CPP32 (et medlem av CED3/ICE-proteasefamilien) og MACH proteaser (og likeså også muligens av Gl-proteaser - se for eksempel oppfinnernes ikke-avgjorte søknad IL 120367).

Siden Asp i posisjon Pl i substratet synes å være viktig kan tetrapeptider med Asp som fjerde aminosyrerest og forskjellige kombinasjoner av aminosyrer i de første tre aminosyreposisjoner hurtig analyseres for binding til det aktive setet i proteasene, ved for eksempel benyttelse av fremgangsmåten utviklet av Geysen (Geysen, 1985; Geysen et al, 1987) hvori et stort antall peptider på faste støttemedier analyseres for spesifikke interaksjoner med antistoffer. Binding av MACH-proteaser til spesifikke peptider kan påvises ved en rekke velkjente deteksjonsmetoder innenfor teknikkens stand, for eksempel radioaktiv merking av Gl-proteasene osv. Denne Geysen's fremgangsmåte ble vist å kunne analysere minst 4.000 peptider pr. arbeidsdag.

På tilsvarende måte kan det eksakte bindingsområdet eller homologiområdet som bestemmer interaksjonen mellom RAP-2 og RD? utledes, hvoretter peptider som kan bidra til å blokkere denne interaksjonen kan analyseres, for eksempel syntetiserte peptider med en sekvens som ligner på sekvensen i bindingsområdet eller er komplementære med denne, og kan konkurrere med naturlig RAP-2 om binding til RD?.

Medikamenter eller peptidinhibitorer som kan inhibere inflammasjonsaktiviteten eller celledødsaktiviteten til RAP-2 ved å inhibere RAP-2-RD?-interaksjonen kan konjugeres eller inngå i komplekser med molekyler som letter inngang i cellen.

U.S. patentskrift nr. 5,149,782 beskriver konjugering av et molekyl som skal transporteres over cellemembranen til et membransammenblandende middel, for eksempel fusogene polypeptider, jone-kanaldannende polypeptider, andre membran-polypeptider og langkjedede fettsyrer, for eksempel myristinsyre eller palmesyre. Disse membransammenblandende midler innsetter molekylkonjugatene i lipiddobbeltlaget i cellulære membraner og letter deres inngang i sytoplasma.

Low et al., U.S. patenskrift 5,108,921 gir en oversikt over tilgjengelige fremgangsmåter for tilførsel over membranen av molekyler som for eksempel, men ikke begrenset til, proteiner og nukleinsyrer ved en mekanisme som omfatter reseptorformidlet endosytotisk aktivitet. Disse reseptorsystemer omfatter systemer som gjenkjenner galaktose, mannose, mannose 6-fosfat, transferrin, asialoglykoprotein, transkobalamin (vitamin B12), a-2 makroglobuliner, insulin og andre peptivekstfaktorer, for eksempel epidermal vekstfaktor (EGF). Low et al. viser at næringsstoffreseptorer, for eksempel reseptorer for biotin og folat, med fordel kan benyttes for å fremme transport over cellemembranen, grunnet plassering og stort antall av biotinreseptorer og folatreseptorer på membranoverflatene til de fleste celler og de tilhørende, reseptorformidlede trans-membrantransportprosesser. Således settes et kompleks dannet mellom en forbindelse som skal tilføres til sytoplasma og en ligand, for eksempel biotin eller folat, i forbindelse med en cellemembran med biotin- eller folatreseptorer for å utløse mekanismen for reseptorformidlet transmembrantransport, hvorved inngang av den ønskede forbindelse i cellen tillates.

I tillegg er det kjent innen faget at fusjon av en ønsket peptidsekvens til en lederpeptid-sekvens/signalpeptidsekvens slik at det dannes et "kimært peptid" vil gjøre en slikt "kimært peptid" i stand til å transporteres over cellemembranen inn i sytoplasma.

Som fagfolk innen feltet peptider vil forstå er peptidinhibitorene av RAP-2-RD?-interaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse ment å omfatte peptidetterlignende medikamenter eller inhibitorer, som også hurtig kan analyseres for binding til RAP-2/RD? protease for utforming av kanskje mer stabile inhibitorer.

Det vil også forstås at de samme midler som er diskutert ovenfor for letting eller fremming av transport av peptidinhibitorer over cellemembraner også kan benyttes for RAP-2 eller dets isoformer selv, så vel som for andre peptider og proteiner som utøver sin virkning intracellulært.

Når det gjelder antistoffene som er nevnt gjennomgående heri er begrepet "antistoff ment å omfatte polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer (mAb), kimære antistoffer, antiidiotypiske (anti-Id) antistoffer rettet mot antistoffer som kan merkes i løselig eller bundet form, så vel som fragmenter av disse tilveiebragt ved enhver kjent teknikk, for eksempel, men ikke begrenset til, enzymatisk kløyving, peptidsyntese eller rekombinante teknikker.

Polyklonale antistoffer er heterogene populasjoner av antistoffmolekyler avledet fra serum fra dyr immunisert med et antigen. Et monoklonalt antistoff omfatter en i det vesentlige homogen populasjon av antistoffer som er spesifikke for antigener, hvor populasjonen inneholder i det vesentlige like epitopbindingsseter. MAb kan erholdes ved fremgangsmåter kjent innen faget. Se for eksempel Kohler og Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); U.S. Patentskrift nr. 4,376,110; Ausubel et al., red., Harlow og Lane ANTD30DIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory

(1988) og Colligan et al., red. Current Protocols in Immunology, Greene Publishing

Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996). Slike antistoffer kan være av enhver immunglobulinklasse, innbefattet IgG, IgM, IgE, IgA, GLLD og enhver underklasse av disse. En hybridom som produserer et mAb ifølge foreliggende oppfinnelse kan dyrkes in vitro, in situ eller in vivo. Produksjon av høye titere av mAb in vivo eller in situ gjør dette til den for tiden mest foretrukne produksjonsfremgangsmåte.

Kimære antistoffer er molekyler hvor forskjellige deler er avledet fra forskjellige dyre-arter, for eksempel molekyler med et variabelt område avledet fra et mAb fra mus og et konstant område fra humant immunglobulin. Kimære antistoffer benyttes hovedsakelig for å redusere immunogenisiteten ved anvendelse og øke produksjonsutbyttet, for eksempel i tilfeller hvor mAb fra mus gir høyere utbytte fra hybridomer men høyere immunogenisitet hos mennesker, slik at kimære menneske/muse-mAb benyttes. Kimære antistoffer og fremgangsmåter for fremstilling av disse er kjent innen faget (Cabilly et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646

(1984); Cabilly et al., europeisk patentsøknad 125023 (publisert 14. november 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., europeisk patentsøknad 171496 (publisert 19. februar 1985); Morrison et al., europeisk patentsøknad 173494 (publisert 5. mars 1986); Neuberger et al., PCT-søknad WO 8601533 (publisert 13. mars 1986); Kudo et al., europeisk patentsøknad 184187 (publisert 11. juni 1986); Sahagan et al., Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., internasjonal patent-søknad nr. WO 8702671 (publisert 7. mai 1987); Liu et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) og Harlow og Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Et anti-idiotypisk (anti-Id) antistoff er et antistoff som gjenkjenner unike determinanter som generelt er forbundet med antigenbindingssetet i et antistoff. Et Id-antistoff kan fremstilles ved å immunisere et dyr fra samme art og av samme genetiske type (for eksempel musestamme) som kilden for det mAb som et anti-Id fremstilles mot. Det immuniserte dyr vil gjenkjenne og respondere på de idiotypiske determinanter i det immuniserende antistoff ved å produsere et antistoff rettet mot disse idiotypiske determinanter (anti-Id-antistoffet). Se for eksempel U.S. patentskrift nr. 4,699,880.

Anti-Id-antistoffet kan også benyttes som et "immunogen" for induksjon av en immun respons i ytterligere et dyr, noe som gir et såkalt anti-anti-Id-antistoff. Anti-anti-Id kan være epitopisk identisk med det opprinnelige mAb som induserte anti-Id-antistoffet. Ved å benytte antistoffer rettet mot de idiotypiske determinanter i et mAb er det således mulig å identifisere andre kloner som uttrykker antistoffer med identisk spesifisitet.

Følgelig kan mAb rettet mot RAP-2-proteinene, analogene, fragmentene eller derivatene ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes for induksjon av anti-Id-antistoffer i egnede dyr, for eksempel BALB/c-mus. Miltceller fra slike immuniserte mus benyttes for fremstilling av anti-Id-hybridomer som utskiller anti-Id-mAb. Videre kan anti-Id-mAb kobles til et bærestoff, for eksempel "keyhole limpef-hemosyanin (KLH) og benyttes for immunisering av ytterligere BALB/c-mus. Serum fra disse mus vil inneholde anti-anti-Id-antistoffer som har bindingsegenskapene til det opprinnelige mAb, spesifikke for en epitop i det ovenforbeskrevne RAP-2-protein eller dets analoger, fragmenter og derivater.

Anti-Id-mAb har således sine egne idiotypiske epitoper eller "idiotoper", som strukturelt ligner på epitopen som evalueres, for eksempel GRB protein-a.

Begrepet "antistoff er også ment å omfatte både intakte molekyler og fragmenter av disse, for eksempel Fab og F(ab')2, som kan binde antigen. Fab- og F(ab')2 fragmenter mangler Fc-fragmentet i det intakte antistoff, fjernes hurtigere fra sirkulasjonen og kan ha mindre uspesifikk vevsbinding enn et intakt antistoff (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)).

Det vil forstås at Fab og F(ab')2 og andre antistoff-fragmenter som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse kan benyttes for påvisning og kvantitering av RAP-2-proteinet ifølge fremgangsmåtene som beskrives heri for intakte antistoffmolekyler. Slike fragmenter fremstilles typisk ved proteolytisk kløyving, ved benyttelse av enzymer som papain (for fremstilling av Fab-fragmenter) eller pepsin (for fremstilling av F(ab')2-fragmenter).

Et antistoff sies å være "i stand til å binde" et molekyl dersom det kan reagere spesifikt med molekylet slik at molekylet bindes til antistoffet. Begrepet "epitop" er ment å vise til den delen av ethvert molekyl som kan bindes av et antistoff og som også gjenkjennes av dette antistoffet. Epitoper eller "antigen determinanter" består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler, for eksempel aminosyrer eller sukkerside-kjeder, og har spesifikke tredimensjonale strukturegenskaper så vel som spesifikke ladningsegenskaper.

Et "antigen" er et molekyl eller en del av et molekyl som kan bindes av et antistoff og som i tillegg er i stand til å indusere et dyr til å produsere antistoff som kan bindes til en epitop i antigenet. Et antigen kan ha en eller flere epitoper. Den spesifikke reaksjonen det vises til ovenfor er ment å indikere at antigenet vil reagere på en svært selektiv måte med sitt tilsvarende antistoff, og ikke med den store mengde av andre antistoffer som kan utløses av andre antigener.

Antistoffene, innbefattet antistoff-fragmentene, som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse kan benyttes for kvantitativ eller kvalitativ påvisning av RAP-2-proteinet i en prøve eller for å påvise nærvær av celler som uttrykker RAP-2-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette kan oppnås ved immunfluorescensteknikker som benytter et fluorescensmerket antistoff (se nedenfor) koblet til lysmikroskopisk, strømningssytometrisk eller fluorometrisk påvisning.

Antistoffene (eller antistoff-fragmentene) som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse kan benyttes histologisk, for eksempel i immunfluorescensmikroskopi eller immun-elektronmikroskopi, for in situ-påvisning av RAP-2-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse. In situ-deteksjon kan oppnås ved å fjerne en histologisk prøve fra en pasient og tilføre det merkede antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse til prøven. Antistoffet (eller fragmentet) tilføres fortrinnsvis ved å tilsette det merkede antistoff (eller fragment) til en biologisk prøve eller å legge det over prøven. Ved benyttelse av en slik fremgangsmåte er det mulig ikke bare å bestemme nærvær av RAP-2-proteinet, men også proteinets fordeling i det undersøkte vev. Ved benyttelse av foreliggende oppfinnelse vil gjennomsnittsfagfolk lett innse at enhver av et bredt utvalg av histologiske metoder (for eksempel fargemetoder) kan modifiseres for å oppnå slik in situ-påvisning.

Slike analyser for RAP-2-proteinet omfatter typisk inkubering av en biologisk prøve, for eksempel en biologisk væske, et vevsekstrakt, nyhøstede celler som lymfosytter eller leukosytter, eller celler som er inkubert i vevskultur, i nærvær av et påvisbart merket antistoff som er i stand til å identifisere RAP-2-proteinet, og påvisning av antistoffet ved enhver av en rekke teknikker som er velkjent innen faget.

Den biologiske prøve kan behandles med et støttemiddel eller bærestoff i fast fase, for eksempel nitrocellulose, eller andre faste støttemidler eller bærestoffer som kan immobilisere celler, cellepartikler eller løselige proteiner. Støttemidlet eller bærestoffet kan så vaskes med egnede buffere, fulgt av behandling med et påvisbart merket antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, som bemerket ovenfor. Det faste støttemidlet eller bærestoffet kan så vaskes med bufferen nok en gang for å fjerne ubundet antistoff. Mengden bundet merking på det faste støttemiddel eller bærestoff kan så påvises med konvensjonelle midler.

Ved "støttemiddel i fast fase", "bærestoff i fast fase", "fast støttemiddel", "fast bærestoff, "støttemiddel" eller "bærestoff menes ethvert bærestoff eller støttemiddel som kan binde antigen eller antistoffer. Velkjente støttemidler eller bærestoffer omfatter glass, polystyren, polypropylen, polyetylen, dekstran, nylon amylaser, naturlige og modifiserte celluloser, polyakrylamider, gabbro og magnetitt. Fargestoffet kan enten være i en viss grad løselig eller uløselig for foreliggende oppfinnelses formål. Støttematerialet kan ha nær sagt enhver mulig strukturell konfigurasjon, så lenge som det koblede molekyl kan bindes til et antigen eller antistoff. Således kan utformingen av støttemidlet eller bærestoffet være kuleformet som i en kule, sylindrisk som i den indre overflate av et reagensrør eller den ytre overflate av en stav. Alternativt kan overflaten være flat, som i et ark, en analysepinne osv. Foretrukne støttemidler eller bærestoffer omfatter polystyrenkuler. Fagfolk vil kjenne til mange andre egnede bærestoffer for binding av antistoff eller antigen, eller de vil kunne finne slike ved rutinemessig eksperimentering.

Bindingsaktiviteten til en gitt antistoffporsjon ifølge oppfinnelsen som bemerket ovenfor kan bestemmes ifølge velkjente fremgangsmåter. Fagfolk vil kunne bestemme operative og optimale analysebetingelser for hver bestemmelse ved benyttelse av rutinemessig eksperimentering.

Andre trinn som vask, omrøring, omristing, filtrering og lignende kan innføres i analysene ut fra sedvane eller behov i den gitte situasjon.

En måte på hvilken et antistoff i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan merkes påvisbart er ved å koble antistoffet til et enzym og benytte det i en enzymimmunanalyse (EIA). Dette enzymet vil i sin tur, når det senere utsettes for et egnet substrat, reagere med substratet på en slik måte at det dannes en kjemisk gruppe som kan påvises, for eksempel ved spektrofotometriske, fluorometriske eller visuelle midler. Enzymer som kan benyttes for påvisbar merking av antistoffet omfatter, men er ikke begrenset til, malat dehydrogenase, stafylokokk nuklease, delta-5-steroid isomerase, alkohol dehydrogenase fra gjær, alfa-glysserofosfat dehydrogenase, triosefosfatisomerase, pepperrot peroksidase, alkalisk fosfatase, asparaginase oksidase, beta-galaktosidase, ribonuklease, urease, katalase, glukose-6-fosfat dehydrogenase, glukoamylase og asetylkolin-esterase. Påvisningen kan oppnås ved kolorimetriske fremgangsmåter som benytter et kromogent substrat for enzymet. Påvisningen kan også oppnås ved visuell sammenligning av omfanget av en enzymatisk reaksjon av et substrat, sammenlignet med standarder fremstilt på tilsvarende måte.

Påvisningen kan oppnås ved benyttelse av en rekke andre immunanalyser. Ved for eksempel radioaktiv merking av antistoffene eller antistoff-fragmentene er det mulig å påvise R-PTPase ved benyttelse av en radioimmun analyse (RIA). En god beskrivelse av RIA kan finnes i Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, av Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) med spesiell henvisning til kapitlet kalt "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" av Chard, T. Den radioaktive isotop kan påvises ved for eksempel benyttelse av en gamma teller eller en scintillasjonsteller, eller ved autoradiografi.

Det er også mulig å merke et antistoff i samsvar med foreliggende oppfinnelse med en fluorescerende forbindelse. Dersom det fluorescensmerkede antistoff utsettes for lys med korrekt bølgelengde kan dets nærvær påvises grunnet fluorescensen. Blant de mest vanlig benyttede fluorescensmerkede forbindelser er fluorescin isotiosyanat, rhodamin, fykoerytrin, pykosyanin, allofykosyani, o-ftaldehyd og fluoreskamin.

Antistoffet kan også merkes påvisbart ved benyttelse av fluorescensutsendende metaller, for eksempel 152E, eller andre fra lantanidserien. Disse metaller kan kobles til antistoffet ved benyttelse av metallkjelaterende grupper som dietylentriamin penta-eddiksyre (ETPA).

Antistoffet kan også merkes påvisbart ved å koble det til en kjemiluminisens forbindelse. Nærvær av det kjemiluminisensmerkede antistoff kan så påvises ved å påvise nærvær av luminisens som oppstår i løpet av en kjemisk reaksjon. Eksempler på spesielt anvendbare kjemiluminisensmerkede forbindelser er luminol, isoluminol, teromatisk akridiniumester, imidasol, akridinium salt og oksalat ester.

Likeså kan en bioluminiserende forbindelse benyttes for merking av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Bioluminisens er en type kjemiluminisens som finnes i biologiske systemer, hvor et katalytisk protein øker effektiviteten av kjemiluminisens-reaksjonen. Nærvær av et bioluminiserende protein bestemmes ved å påvise nærvær av luminisens. Viktige bioluminiserende forbindelser for merking er lusiferin, lusiferase og aekvorin.

Et antistoff molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilpasses anvendelse i en

immunometrisk analyse, også betegnet en "toseter" analyse eller en "sandwich" analyse. I en typisk immunometrisk analyse bindes en mengde umerket antistoff (eller antistoff - fragment) til et fast støttemiddel eller bærestoff, og en mengde påvisbart merket, løselig antistoff tilsettes for å tillate påvisning og/eller kvantitering av det ternære kompleks som dannes mellom antistoff i fast fase, antigen og merket antistoff.

Typiske og foretrukne immunometriske analyser omfatter "forlengs"-analyser i hvilke antistoffet bundet til den faste fase først settes i forbindelse med prøven som skal analyseres for ekstraksjon av antigenet fra prøven ved dannelse av et binært antistoff-antigenkompleks i fast fase. Etter en passende inkubasjonstid vaskes det faste støtte-middel eller bærestoff for å fjerne rester av væskeprøven, innbefattet ikke-reagert antigen, dersom slikt foreligger, og det settes så i forbindelse med løsningen som inneholder en ukjent mengde merket antistoff (som fungerer som et "rapportør-molekyl"). Etter en andre inkubasjonsperiode som tillater det merkede antistoff og kompleksbindes til antigenet bundet til det faste støttemidlet eller bærestoffet via det umerkede antistoff vaskes det faste støttemiddel eller bærestoff igjen for å fjerne ikke-reagert, merket antistoff.

I en annen type "sandwich"-analyse som også kan være anvendbar med antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes såkalte "samtidige" og "reverse" analyser. En samtidig analyse omfatter et enkelt inkubasjonstrinn, siden antistoffet bundet til det faste støttemiddel eller bærestoff og merket antistoff tilsettes samtidig til prøven som skal analyseres. Etter avsluttet inkubering vaskes det faste støttemiddel eller bærestoff for å fjerne rester av væskeprøven og ikke kompleksbundet, merket antistoff. Nærvær av merket antistoff forbundet med det faste støttemiddel eller bærestoff bestemmes så på samme måte som i en konvensjonell, "forlengs" "sandwich"-analyse.

I den "reverse" analyse benyttes trinnvis tilsetning, først av en løsning av merket antistoff til væskeprøven, fulgt av tilsetning av umerket antistoff bundet til et fast støttemiddel eller bærestoff etter et egnet inkubasjonstidsrom. Etter nok en inkubasjon vaskes den faste fase på konvensjonell måte for å befri den for rester av analyseprøven og løsningen av ikke-reagert, merket antistoff. Bestemmelse av merket antistoff forbundet med et fast støttemiddel eller bærestoff utføres så som i den "samtidige" analyse og "forlengs"-analysen.

RAP-2-proteinene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved enhver standard rekombinant DNA-fremgangsmåte (se for eksempel Sambrook et al., 1989, og Ansabel et al., 1987-1995, supra), i hvilke egnede eukaryote eller prokaryote vertsceller, som er velkjente innen faget, transformeres med egnede eukaryote eller prokaryote vektorer som inneholder sekvensene som koder for proteinene. Følgelig gjelder foreliggende oppfinnelse også slike ekspresjonsvektorer og transformerte verter for fremstilling av proteinene ifølge oppfinnelsen. Som nevnt ovenfor omfatter disse proteiner også de biologisk aktive analoger, fragmenter og derivater, og vektorene som koder for dem omfatter således også vektorer som koder for analoger og fragmenter av disse proteiner, og de transformerte verter omfatter verter som fremstiller slike analoger og fragmenter. Derivatene av disse proteiner, fremstilt av de transformerte verter, er derivater fremstilt ved standard modifisering av proteinene eller deres analoger eller fragmenter.

Farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en tilstrekkelig mengde av den aktive bestanddel til at det påtenkte formål oppnås. I tillegg kan de farmasøytiske preparater inneholde egnede, farmasøytiske aksepterbare bærestoffer, innbefattet eksipienser og tilleggsforbindelser som letter prosessering av de aktive forbindelser til preparater som kan benyttes farmasøytisk og som kan stabilisere slike preparater for tilførsel til individet med behov for dette, som velkjent blant fagfolk.

RAP-2-proteinet og dets isoformer eller isotyper antas å uttrykkes i forskjellige vev i markant forskjellig nivå, og tilsynelatende også med forskjellige mønstre av isotyper, på tilsvarende måte som ved ekspresjon av forskjellige andre proteiner som deltar i de intracellulære signalreaksjonsveier, som vist i oppfinnernes ovenforangitte, ennå ikke avgjorte patentsøknader. Disse forskjeller kan muligens bidra til de vevsspesifikke egenskaper av responsen på Fas/APOl-ligand og TNF. Som for andre CED3/ICE-homologer (Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995) har de foreliggende oppfinnere tidligere vist (i de ovenfornevnte patentsøknader) at MACH-isoformer som inneholder ufullstendige CED3/ICE-regioner (for eksempel MACHa3) har en inhiberende virkning på aktiviteten av samtidig uttrykt MACHod eller MACH-oc2 molekyler; og de synes også å blokkere dødsinduksjon ved Fas/APOl og p55-R. Ekspresjon av slike inhiberende isoformer i celler kan utgjøre en mekanisme for cellulær selvbeskyttelse mot Fas/APOl- og TNF-formidlet sytotoksisitet. En tilsvarende inhiberende virkning av i det minste noen Gl-isoformer antas også (hvor Gl er et nylig isolert, nytt Mch-4-og muligens MACH-bindende protein, og også et MORT-1-bindende protein med MORT-MODULER og et proteasedomene - se oppfinnernes ennå ikke avgjorte patentsøknad EL 120367). Den omfattende heterogenitet av MACH-isoformer, og likeså den antatte, analoge heterogenitet av Gl-isoformer, som i stor grad overskrider heterogeniteten observert for alle andre proteaser i CED3/ICE-familien, bør kunne tillate en spesielt nøyaktig justering av funksjonen av de aktive MACH-isoformer, og analogt med dette også de aktive Gl-isoformer. Som angitt ovenfor kan således RAP-2-proteinene eller mulige isoformer ha varierende virkninger i forskjellige vev når det gjelder interaksjon med RD? og derved deres påvirkning og balansen mellom aktivering av reaksjonsveier for celledød og celleoverlevelse, som beskrevet ovenfor.

Det er også mulig at noen av de mulige RAP-2-isoformer fyller andre funksjoner. For eksempel kan RAP-2 eller visse RAP-2-isoformer også fungere som bindingsseter for molekyler som deltar i andre, ikke-sytotoksiske virkninger av Fas/APOl og TNF-reseptorer via interaksjon med RD?, eller til og med uavhengig av RIP.

Grunnet den enestående evne til Fas/APOl og TNF-reseptorer når det gjelder å gi inflammasjon og celledød, så vel som TNF-reseptorenes evne til å utløse andre vevsskadende aktiviteter, kan avvik i funksjonen av disse reseptorer tenkes å være spesielt skadelige for organismen. Faktisk har både overdreven og manglende funksjon av disse reseptorer blitt vist å bidra til forskjellige sykdommers patologiske uttrykk (Vassalli, 1992; Nagata og Golstein, 1995). Identifisering av de molekyler som deltar i signalaktivtiteten til reseptorene og påvisning av måter på hvilke disse molekylers aktivitet kan moduleres kan lede til nye terapeutiske tilnærminger. Andre sider ved oppfinnelsen vil være åpenbare fra de påfølgende eksempler.

Oppfinnelsen vil nå beskrives i mer detalj i de påfølgende eksempler og de vedlagte figurer.

Det bør også bemerkes at fremgangsmåtene:

i) to-hybridanalyse og to-hybrid B-galaktosidase ekspresjonsanalyse;

ii) indusert ekspresjon, metabolsk merking og immunutfelling av proteiner,

iii) in vitro-binding,

iv) måling av sytotoksisitet, og

v) Northern- og sekvensanalyse (se også Boldin et al., 1995b) 2, 3 (se også Boldin et al., 1996) og 4, nedenfor, når det gjelder MORT-1 og et MORT-1-bindende «protein, (for eksempel MACH), så vel som det nylig isolerte protein Gl (se IL 120367) er like anvendbare (med visse modifikasjoner) for den tilsvarende isolering, kloning og karakterisering av RAP-2 og mulige isoformer av dette ifølge foreliggende oppfinnelse.

Disse fremgangsmåter skal således oppfattes som den fulle beskrivelse av de samme fremgangsmåter benyttet for isolering, kloning og karakterisering av RAP-2 i samsvar med foreliggende oppfinnelse, som beskrevet i detalj i for eksempel samme eller ekvivalent form i oppfinnernes ennå ikke avgjorte israelske patentsøknader nr. 114,615, 114,986,115,319,116588,117,932 og 120367, så vel som i den tilsvarende PCT-søknad nr. PCT/US96/10521. Når det videre gjelder NIK-proteinet og dets rolle ved aktivering avNF-DB og således celleoverlevelse, og rollen som spilles av TRAF2 i denne celleoverlevelsesreaksjonsvei, for eksempel interaksjonen mellom TRAF2 og RD? og andre proteiner, har disse blitt beskrevet i detalj av de

foreliggende oppfinnere i deres ennå ikke avgjorte patentsøknader IL 117800, IL 119133 og Malinin et al., 1997.

Eksempel 1:

Kloning og isolering av RAP-2-proteinet, som bindes til RIP-proteinet To-hybrid analyse, sekvensering og foreløpig analyse

Ved benyttelse av to-hybridanalysen med RD? som åte (se for eksempel Fields og Song, 1989, WO/96/18641) i et B-cellebibliotek ble en klon med størrelse tilnærmet 1,5 Kb isolert. Denne klon på 1,5 Kb (se pil i figurene 1 og 2) ble benyttet for søk i et bakteriofag-cDNA-bibliotek som ga en klon på tilnærmet 2,0 Kb hvis sekvens er vist i fig. 1.

Ved benyttelse av EST-sammenligning med sekvensen til klonen på 1,5 Kb ble det erholdt et EST-fragment som utgjør den 3' ende av I.M.A.G.E.-konsortium-klon nr. 41072 (Research Genetics Institute). For denne klon, som har opphav i et bibliotek fra føtal hjerne, er kun to små sekvensfragmenter i den 3' og 5' ende publisert. Etter erholdelse av klonen ble den sekvensert, og det viste seg at også disse publiserte sekvensfragmenter inneholdt feil. Den sekvenserte klon (fig. 2) ble vist å være identisk med klonen i fig. 1 i det kodende området, men viste forskjeller i det 5'-ikke-kodende området. Det antas derfor at de to cDNA er alternativt spleisede former av samme gen.

Analyse av sekvensen viser at RAP-2-proteinet i likhet med RAP tilsynelatende ikke har et "dødsdomene", det har ingen MORT-MODUL, det har intet proteasedomene tilsvarende proteiner i ICE-familien, det har intet kinasedomene og heller ingen TRAF-domener (se oppfinnernes ovenforangitte, ennå ikke avgjorte patentsøknader og de forskjellige referanser, særlig Malinin et al., 1997 når det gjelder de forskjellige domener som foreligger i de intracellulære signalreaksjonsveier). Ingen betydelige sekvensmotiver ble funnet i den gitte sekvens, bortsett fra tre leusin zipper (LZ)-"lignende" blokker som er jevnt fordelt over det proteinkodende området. Disse betegnes "lignende" siden to av dem inneholder substitusjon av Leu med Val, Met eller Ile. Selv om disse substitusjoner vanligvis anses som konservative er det ikke klart hvorvidt slike endringer i leusinzipperområdet tillater bibeholdelse av proteinets funksjonelle aktivitet, dvs. binding til andre LZ. Bindingsundersøkelser viste at RAP-2 hovedsakelig bindes til RD? og er ute av stand til å bindes til TRÅDD, MORT-1, p55-R, p75-R og MACH (i undersøkelsene utført inntil nå). Disse resultater understøtter det faktum at RAP-2 tilsynelatende mangler "dødsdomener" og MORT-MODULER.

Det ser derfor ut til at RAP-2 er et spesifikt RIP-bindende protein som interagerer med/bindes til RD? på en svært spesifikk måte. RAP-2 ser derfor ut til å være en spesifikk modulator/formidler av den intracellulære aktivitet til RD? med en viktig rolle i modulering/formidling via RIP av reaksjonsveiene for inflammasjon og celledød/ celleoverlevelse.

Kort beskrevet ble en klon av RAP-2 erholdt ved tohybridanalyse av et humant B-celle-cDNA-bibliotek ved benyttelse av fullengde RD?-protein som "åte". RIP-sekvensen var tilgjengelig fra tidligere publikasjoner (for eksempel Stanger et al., 1995) og foreligger i databasen GenBank under aksesjonsbetegnelsen U 25994, som er den humane RD?-sekvens (videre forelå RIP-sekvensen fra mus under aksesjonsbetegnelsen TJ 25995). Ved benyttelse av denne sekvensinformasjonen ble egnede PCR-primere utformet ved hjelp av programvaren "OLIG04", og DNA-fragmentet som tilsvarer den kodende del av RIP ble erholdt ved PCR ved benyttelse av cDNA fra total-RNA-biblioteket fra humane fibroblastceller (ved benyttelse av standard fremgangsmåter). Denne kodende del av RIP ble så klonet i vektoren pGBT-9 (Clontech) og benyttet som åte, som angitt ovenfor, i tohybridanalyse-fremgangsmåten. I dette tohybridsøk ble det erholdt en klon som koder for et RJP-bindende protein som interagerer med RD3.

Som angitt ovenfor ble denne klon benyttet for gjennomsøking av et bakteriofag-cDNA-bibliotek og en EST-database. Det kan ses fra figurene 1 og 2 at de kodende sekvenser i de to kloner er identiske, mens de 5'-ikke-kodende områder avviker fra hverandre. Det dreier seg således sannligvis om alternativt spleisede former. Klonene er på tilnærmet 2,0 Kb med en ORF (åpen leseramme) på tilnærmet 1,5 Kb, som tilsvarer en molekylvekt på tilnærmet 50 Kd for selve proteinet. Det utledede aminosyresekvensen for RAP-2 er vist i fig. 3.

Analyse av de ovenforbeskrevne RAP-2-klonsekvensene og sekvenser i "dbest"-databasen, den humane genomdatabase nivå 1 og databasen GenBank viste at RAP-2-sekvensen var en unik (ny) sekvens, siden ingen kjente sekvenser viste signifikant homologi med denne RAP-2-sekvens. Etter innlevering av IL 123758, som foreliggende søknad krever prioritet fra, rapporterte Yamaoka S. et al., (1998) karakterisering av et muse-cDNA som koder for et protein på 48 kD som ble betegnet NEMO (for NF-kB Essensiell Modulator). (Se bakgrunn).

Ytterligere databasesøk (in silico) identifiserte FIP-2 - et protein med ukjente funksjoner som opprinnelig ble klonet av Li Y. et al., (1998), se bakgrunn).

Som den globale sammenstilling av sekvensene for RAP-2 og FIP-2 viser (figur 3B) er den totale likhetsgrad temmlig lav (det er derfor ikke overraskende at sekvensen ikke ble identifisert ved benyttelse av søk basert på globale algoritmer). Homologien mellom RAP-2 og FIP-2 øker mot proteinenes C-ende og kulminerer i nærmest identitet mellom de 30 C-terminale aminosyrer. Det er verdt å merke seg at i tillegg til dette området er det antatte LZ-motiv i FIP-2 stort sett konservert i RAP-2 (bortsett fra en Ile/Ala-substitusjon).

Ytterligere et kortere RAP-2-cDNA på tilnærmet 0,5 kb ble identifisert. (ID: 1469996) og vil i det påfølgende betegnes Human shrt. Denne variant omfattet kodende sekvens-"blokker" avledet fra forskjellige fjerntliggende områder i fullengde cDNA på 1,5 kB trolig oppstått ved alternativ spleising av det samme gen.

Northern-hybridiseringsanalyse av et Multiple Tissue Northern blot (Clontech) med et 0,9 kb Bglll-fragment fra RAP-2-cDNA, viste et komplekst mønster for RAP-2-mRNA. Minst 5 forskjellige mRNA som varierte i størrelse fra <lkb opp til >7kb ble påvist, med mer eller mindre gjennomgående dominans av variantene på 2,5 kb og 6 kg (figur 4A).

Eksempel 2:

Identifisering av RAP-2 fra mus

Et tilsvarende søk i EST-samlingen fra mus, etablert ved TIGR, ga et partielt cDNA på 1,6 kb (Mouse part, ID:761011, figur 3) som trolig tilsvarer RAP-2 fra mus, siden det er nær sagt identisk (95%) med sin humane motpart gjennom hele det kodende området (se figur 3).

Ikke desto mindre strekker forskjellene mellom RAP-2 fra mus og menneske og NEMO-sekvensen seg utover hva som entydig kan tilskrives en vanlig forskjell mellom arter. Faktisk er en manglende blokk på 7 aminosyrer (posisjon 249 i 20,4) fra RAP-2 fra mus og NEMO-sekvensen og innsetting av 3 aminosyrer (KLE i posisjon 111) i den åpne leseramme for NEMO, sammenlignet med fullengde-varianten fra mennesket og den delvise musesekvens bare de mest bemerkelsesverdige eksempler (figur 3). Disse vil imidlertid trolig føre til funksjonelle konsekvenser for proteinets aktivitet. De funksjonelle egenskaper som er rapportert for NEMO synes faktisk å være de motsatte av egenskapene funnet for humant RAP-2, selv om fraksjoneringsanalysen rapportert for NEMO bekrefter at proteinet er lokalisert til signalsomet.

Eksempel 3:

Binding av RIP til RAP-2 i pattedyrceller

Ytterligere bevis for den fysiologiske betydning av interaksjonen mellom RAP-2 og RIP ble erholdt i transfekterte HEK-293T og HeLA-celler. Disse to proteiner kunne faktisk lett utfelles sammen fra cellelysater fra HEK-293-celler (ATCC nr. CRL 1573) transfektert som angitt nedenfor hvert sport i figur 4B, og immunutfelt med anti-FLAG mAB (Kodak). Immunkompleksene ble så analysert for nærvær av HIS-RAP-2 ved en konvensjonell Western blot fremgangsmåte med anti-His6-mAB (Sigma) (figur 4 B og ikke viste resultater). Dannelse av et slikt kompleks førte imidlertid ikke til enzymatisk RIP-aktivitet: i den grad vi kunne avgjøre dette i en in vitro immunkompleks kinaseanalyse fosforylerte overuttrykt RD? ikke RAP-2 (ikke vist).

Bindingsanalyser ble utført for å fastslå hvorvidt RAP-2 bindes til noen av de andre kjente intracellulære signalproteiner. I disse analysene ble proteinene TRÅDD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH analysert for evnen til å bindes til RAP-2. Det ble imidlertid funnet at RAP-2 ikke kunne bindes til noen av disse proteiner. RAP-2 bandt seg heller ikke til noen av kontrollproteinene, for eksempel lamin og syklin D.

Alle resultatene ovenfor tyder derfor på at det nye RAP-2-protein muligens interagerer med RD? på en svært spesifikk måte, og følgelig representerer en spesifikk modulator/ formidler av RD?.

Eksempel 4:

RAP-2 interagerer med NIK og modulerer NF-kB- og c-Jun-avhengig transkripsjon

Selv om ingen RAP-2-NIK-interaksjon ble påvist i tohybridanalysene i gjær (se ovenfor) tydet transfeksjonseksperimenter av HEK-293T-celler fra pattedyr på stabil dannelse av dette kompleks. NIK-RAP-2-interaksjonen ble påvist som beskrevet i eksempel 3, bortsett fra at anti-FLAG-antistoffer ble benyttet i Western-blottet, fulgt av immunutfelling med anti-His6 (figur 4C). Slike uoverensstemmelser mellom binding i gjær og i pattedyrsceller var ikke overraskende, siden fullengde NIK har en tendens til å miste sine bindingsegenskaper ved ekspresjon i gjær.

I lys av det faktum at både RD? og NIK in vivo antas å være nødvendige formidlere av TNF-indusert NF-KB-aktivering undersøkte vi hvorvidt overekspresjon av RAP-2 i cellekulturer kunne interferere med denne spesielle signalreaksjonsvei. Et innledende sett med eksperimenter ble utført i HEK-293T-celler forbigående transfektert med rapportørplasmider som omfattet lusiferasegenet under kontroll av minimalpromoteren fra HIV-LTR. I tilsvarende eksperimenter ble RAP-2 opprinnelig funnet å nedregulere, nesten ned til basalnivået, rapportøraktivering forårsaket av både overekspresjon av forskjellige kjente NF-KB-indusere som deltar i TNF-signalisering (NIK- TRAF2, RIP osv.), og behandling av cellene med eksterne stimuli (TNF og PMA, Figur 5A). HEK-293T-celler ble forbigående transfektert med rapportørplasmidet (HIVLTR-Luc eller CMV-Luc for NF-kB- (5A) og GAL4-Luc for c-Jun- (5B) aktiveringsanalyser), og med en ekspresjonsvektor for den angitte induser og enten tom vektor (pcDNA3) eller et plasmid som koder for fullengde RAP-2 (pcRAP-2). Bemerkelsesverdig nok tyder det faktum at RAP-2 kan utøve sine virkninger såpass langt ned i signaloverføringsveien som RelA, og at en del av virkningen av dette protein kan være felles for forskjellige, ellers divergerende signalreaksjonsveier (se nedenfor). Samtidig ble KB-uavhengig (drevet av tidlig promoter fra CMV) transkripsjon av lusiferase ikke påvirket (figur 5A), og vi tror således at mulige generiske feilarrangementer av det basale transkripsjons/ translasjonsmaskineri via RAP-2 kan utelukkes. Disse resultater ble senere fullt ut bekreftet i HeLa-celler (ikke vist).

Som videre titreringsanalyser viste var imidlertid dette faktiske fenomen mye mer komplisert. Dersom TRAF2 ble forbigående uttrykt i HEK-293T-celler sammen med de forskjellige mengder av pcRAP-2 angitt i figur 3 endret faktisk RAP-2 på dramatisk måte sin oppførsel i lave konsentrasjoner (tilnærmet 20 ng/10<6> celler), og forsterket TRAF2 NF-KB-indusert transkripsjon (se figur 6A). Ved å erstatte det opprinnelige innskudd med et innskudd i reversorientering ble videre en effektiv RAP-2-antisens uttrykkende vektor utformet, og TRAF2 ble forbigående uttrykt i HEK-293T-celler sammen med de forskjellige angitte mengder av pcRAP-2-a/s (antisens)-konstruksjoner, og virkningen av gradvis fjerning av RAP-2 ble analysert, noe som førte til skissering av et konsentrasjonsavhengig diagram. Totaltendensen for kurven tyder på at cellenes respons stort sett korrelerer invert med mengden transfektert RAP-2-DNA, bortsett fra et karakteristisk område som ligger rundt et "null"-punkt som tilsvarer det nominale, endogene nivå av proteinet (figur 6). Det bør bemerkes at nedregulering av ekspresjonen av et gitt gen ved innføring av en antisenssekvens trolig er en mer raffinert fremgangsmåte enn overekspresjon av sens-sekvens. En antisens-sekvens omfatter faktisk ikke kunstig produksjon av et fremmed protein i cellen og understreker derfor gyldigheten av den inhiberende evne til RAP-2. Deke desto mindre bør det bemerkes at det ovenfornevnte sprang ved lave konsentrasjoner gjenspeiles, ikke redusert, i antisens-delen av diagrammet (figur 6).

For å anslå diversiteten av transkripsjonssystemer hvor RAP-2 kan inngå gikk over til undersøkelser av c-Jun, en kjernefaktor hvis rolle for å etablere og opprettholde en tilstrekkelig stressrespons beviselig er nesten like avgjørende som rollen til NF-kB. Ved benyttelse av bestanddeler fra det kommersielle sett "Path Detecf-systemet (Stratagene) bekreftet vi en tilsvarende tofases virkning av RAP-2 når det gjelder flere anerkjente aktivatorer av AP-1 i HEK-293T- og HeLA-celler (se figurene 5B og 6B).

Eksempel 5:

RAP-2 forsterker c-Jun-hyperfosforylering uten å endre JNK-aktiviteten

For å undersøke mekanismen som ligger bak en slik dyptgripende virkning på transkripsjonen var det avgjørende å bestemme det nøyaktige nivå ved hvilket normal signalisering stanser. Det er anerkjent at transaktiveringsegenskapene til c-Jun reguleres ved at ekstracellulære signaler induserer fosforylering av to serin rester (<63>Ser & <73>Ser) i proteinets aminoterminale aktiveringsdomene. JNK/APK-protein kinasene som er ansvarlige for den ovenfornevnte fosforylering utgjør en temmelig fjernt beslektet undergruppe i MAP-kinase familien og aktiveres selv ved fosforylering av Thr og Tyr formidlet av ytterligere oppstrøms kinaser med dobbelt spesifisitet. Fosforyleringstilstanden for disse seter i c-Jun og JNK kan derfor benyttes som en markør reflekterer proteinets aktiveringstilstand. Western-blot analyse med lysater fra forbigående transfekterte HEK-293T-celler viste at RAP-2 til tross for svekket c-Jun-formidlet transkripsjon i høy grad forsterket fosforylering av endogen c-Jun i 63Ser indusert ved en rekke stimuli (se figur 7A). Totale cellelysater fra HEK-293T-celler transfektert med de angitte ekspresjonskonstruksjoner sammen med enten pcDNA3-vektor angitt i figur 7 med et minustegn (-) eller med pcRAP-2, angitt i samme figur med et plusstegn (+), ble fraksjonert ved SDS-PAGE, overført til ECL-membranen og analysert med anti-fosfo- Ser-c-Jun Abs (NEB). Membranen vist i nedre felt i figur 7A ble analysert på ny med anti-total-c-Jun antistoff som kontroll (NEB).

Den totale mengde av c-Jun forble imidlertid uendret, noe som utelukker forhøyelse av c-Jun-nivået som en mulig årsak til modifiseringen. Antistoffer som er spesifikke for den fosforylerte form av JNK1/2 påviste ingen vesentlig økning i mengden av disse aktiverte kinaser for respons på overekspresjon av RAP-2, noe som tyder på at den økte fosforylering av c-Jun ikke var en følge av en RAP-2-avhengig økning av aktiviteten til JNK (figur 7B). Aktivert JNK1/2 fra HEK-293T-celler transfektert med enten pcDNA3 eller pcRAP-2, behandlet med hrTNFcc i økende tidsrom ble påvist ved Western-blotting av totallysater med fosfo-(<l>83Thr/<l>85Tyr)-JNK antistoffer (NEB) som vist i figur 7.

Som ytterligere støtte for den siste antagelsen ga en kinaseanalyse in vitro med immunutfelt JNK1 og renset GST-c-Jun som substrat i det vesentlige samme resultat (figur 7C). HEK-293T-celler ble kotransfektert med tom vektor, pcRAP-2 og pcRD? i forskjellige kombinasjoner, sammen med HA-JNK1-uttrykkende plasmid. JNK1 ble så immunutfelt via den N-terminale HA-merkelapp, og proteinets evne til å fosforylere bakteriefremstilt, renset GST-Jun ble bestemt ve -P-inkorporering i en kinaseanalyse in vitro. Reaksjonsproduktene ble analysert ved SDS-PAGE som vist i figur 7.

RAP-2 fosforyleres når RAP-2-IKKl-kompleks, immunutfelt fra transfekterte HEK293-celler, inkuberes under in vitro-fosforyleringsbetingelser. Et søk for den funksjonelle rolle for fosforyleringen av RAP-2 viste at mutering av en spesiell serinrest i dette protein (i posisjon 148) fullstendig fjernet proteinets aktivering av jun-fosforylering. Mens overekspresjon av villtype-RAP-2 som vist i figur 13 førte til en massiv økning av jun-fosforyleringen påvirket overekspresjon av RAP-2 (S148A) overhodet ikke jun-fosforyleringen. Virkningen av RAP2 på NF-kB ble imidlertid overhodet ikke påvirket av denne mutasjon. Disse funn tyder på at fosforylering av serin 148 i RAP-2 spesifikt inngår i proteinets virkning på Jun-fosforylering.

Eksempel 6:

RAP-2 inhiberer ikke binding av c-Jun og RelA til DNA

I lys av det faktum at eksperimentene beskrevet i eksempel 5 ikke avslørte det sytosoliske modulasjonsmål for RAP-2-overekspresjon på NF-kB- og AP-l-signal-kaskadene undersøkte vi integriteten av de nukleære prosesser som er nødvendige for transkripsjon. Elektromobilitetsforskyvningsanalyser (EMSA) utført med kjerne-ekstrakt fra transfekterte HEK-293T-celler viste entydig at RAP-2 ikke interfererte med binding av c-Jun og RelA til oligonukleotidene som tilsvarte deres klassiske gjenkjenningssekvenser (figur 8). Faktisk ble en flere gangers forhøyelse av effektiviteten av DNA/AP-1-kompleksdannelsen observert hos RAP-2-transfekterte celler. Videre ble ingen interaksjon observert mellom RAP-2 og c-Jun/Rel A som kunne føre til sterisk blokkering av aktiveringsdomener i disse. Det foreslås at virkningen, om noen, av inngang av RAP-2 i kjernen er rettet mot et punkt nedstrøms for enhanser-bindingsbegivenhetene.

Eksempel 7:

RAP-2 interagerer in vivo med histon acetyltransferase TIP60

TIP60 (GeneBank TJ 74667) tilhører den nylig beskrevne familie av kjerneproteiner som betegnes histon acetyltransferaser (HAT). Enzymaktiviteten til disse proteiner er forbundet med en tilstand hvor kromatinstrukturen foreligger i nukleosomkomplekser. HAT er ofte forbundet med visse elementer av transkripsjonsapparatet og kan modulere transkripsjonshastigheten. HAT virker ved å relaksere en kromatinpakke i nærheten av initieringsseter ved å overføre acetylgrupper til spesifikke lysinrester i histoner og derved fremme forskjellige beslektede faktorers tilgang til DNA. HAT tilhører tilsynelatende gruppen av nukleære hjelperproteiner som antas å lette interaksjoner mellom de enhanserbindende faktorer og RNA polymerase II. Vi undersøkte således hvorvidt TIP60 kunne danne komplekser med RAP-2. Immunutfelling fra HeLa-celler fulgt av tohybridanalyser viste entydig at RAP-2 interagerer kraftig med TIP60 i begge systemer. Deke desto mindre var vi ute av stand til å observere vesentlig endring av den RAP-2-formidlede virkning på NF-kB og c-Jun ved koekspresjon av TIP60 i HEK-293T-celler (ikke vist). Den samme mangel på endringer ble observert i kontroll-eksperimentet, dvs. stimulering ± TIP60 (m/u RAP-2), noe som fører til den konklusjon at analyse etter kort tid (20-30 timer etter transfeksjonen), sannsynligvis ikke gir rapportør-DNA sjansen til å danne kromatin, slik at det ikke er tilstrekkelig tid til at HAT-lignende enzymer kan virke.

Eksempel 8:

Klon nr. 10 - et nytt protein som interagerer med RAP-2

Ved benyttelse av fullengde RAP-2-protein som åte i et tohybridsøk i et cDNA-bibliotek fra B-celler har vi isolert et nytt protein som interagerer med RAP-2 og som i det påfølgende kalles klon nr. 10 eller klon nr. 10-kodet protein eller RAT-bindende protein nr. 10 eller RBP-10 (figur 10). Den opprinnelige klon (tilnærmet 2.2 kb) ble funnet å kode for et antatt polypeptid med tilsynelatende molekylvekt 60 kDa. Det antatt første ATG-kodon mangler imidlertid tilsynelatende i denne sekvens. Trass i den betydelige lengde må det erholdte cDNA derfor utvides ytterligere mot den 5' ende for å rekonstituere hele den åpne leseramme.

Tohybridanalyse av bindingsrepertoaret til klon nr. 10 viste at dette protein i tillegg til RAP-2 har temmelig kraftig affinitet overfor TRAF2. Klon nr. 10 bindes imidlertid ikke til RIP, TRÅDD, MORT1, MACH, TNFR-1, TIP60 og NIK, og heller ikke til flere kontrollproteiner (for eksempel lamin og syklin). Det kan imidlertid ikke utelukkes at binding av klon nr. 10 til NIK kan påvises i pattedyrceller, tatt i betraktning den uvanlige oppførsel av NIK i gjær. Klon nr. 10 ble vist å bindes til RAP-2 via de 200 C-terminale aminosyrene i RAP-2, dvs. et område som ikke nødvendigvis er forbundet med binding av RIP, TIP60, NIK og IKK6.

Koekspresjon av klon nr. 10 og TRAF-2 i 293T-celler fra pattedyr forhindret TRAF2-formidlet aktivering av NF-kB, mens koekspresjon av klon nr. 10 og NIK ga kraftig forhøyet NF-kB-aktivering via NIK. Disse funn kan tyde på at klon nr. 10 har en viktig regulatorisk funksjon. De særpregede moduleringsvirkninger som ble observert kan sannsynligvis tyde på at det foreligger forskjellige, ikke-overlappende seter for proteinets virkning i en celle.

Flere runder med GenBank-søk rettet mot identifisering av nære homologer av RBP-10 førte til identifisering av F40F12,5 (aksesjonsbetegnelse S42834) - et hypotetisk protein fra C. Elegans uten kjent fysiologisk rolle. Det er av interesse at F40F12,5 ble funnet å vise en viss likhet med flere medlemmer av den svært konserverte familie som består av ubikitin-styrte proteaser. Disse enzymer motvirker en destruktiv virkning av ubikitineringsmaskineriet, som er kjent for å styre hovedmengden av proteindegraderingsbegivenheter i en celle. Mens ubikitinligaser er ansvarlige for å koble polyubikitintreet til et protein som skal degraderes forhindrer ubikitin proteaser effektiv forgrening av det voksende treet. Slike antagelser vedrørende funksjonen av F40F12.5, basert på likheten med de ovenfor nevnte ubikitinstyrte proteaser, ser imidlertid ut til å være tvilsom siden det ennå ikke er undersøkt hvorvidt dette spesielle protein besitter enzymatisk aktivitet rettet mot ubikitinpolymerer. Videre er det et par punkter som synes å gjøre dette temmelig usannsynlig: a) Aminosyrerester som antas å utgjøre det katalytiske kjerneområdet i begge undergrupper av ubikitinproteaser er ikke konservert, verken i F40F12.5 eller i

RBP-10;

b) Bortsett fra de katalytiske seter viser enzymer i familien at ubikitinstyrte proteaser avledet fra forskjellige arter (fra bakterier til mennesker) nær sagt ingen

sekvenslikhet, mens F40F12.5 og klon nr. 10 viser en viss grad av homologi.

Eksempel 9:

Klon nr. 84: et RAP-2-interagerende protein

Ytterligere et RAP-2-bindende protein ble identifisert ved å benytte fullengde RAP-2-protein som åte i tohybridsøket i cDNA-biblioteket fra B-celler, og ble betegnet klon nr. 84.

Klon nr. 84 ble funnet å spesifikt bindes til fullengde RAP-2 uten å vise interaksjoner med andre proteiner som ble analysert, innbefattet TRAF2, MORT1, TRÅDD, RIP, NIK, TIP60 og Lamin. Den delvise 5'-sekvens av klon nr. 84 ble vist å være identisk med sekvensen til et tidligere klonet cDNA som koder for cellevekstregulerings-proteinet CGR19, identifisert som et transkript som oppreguleres spesifikt i celler som bærer funksjonelt p53-protein (Madden S. et al. 1996, aksesjonsnr. U66469). Sekvens-analysene av CGR19 førte til identifisering av et C3HC4-Sinkringermotiv (også betegnet en RING-finger) i proteinets C-terminale domene. Ekspresjon av CGR19 ble funnet å undertrykke vekst av forskjellige cellelinjer. Deltagelse av CGR19-protein i NF-kB-regulering ved binding til RAP-2 kan muligens antyde modulering av det cellesyklus-regulerende nettverk ved medlemer av TNF-R-familien.

Eksempel 10:

Struktur-funksjonssammenhenger i RAP-2

A. Bindingsområder

Ved å benytte sammenhengende delesjonsanalyse ble bindingsområdene i RAP-2 kartlagt og domenene for binding av RIP, NIK, TIP60 så vel som domener for selv-assosiasjon ble identifisert (figur 11).

Binding til RD? er kartlagt til et område i RAP-2-proteinet som begynner mellom aminosyrene 177-218 og slutter ved aminosyre 264.

Hittil har verken bindingssetet for IKK6 eller setet for NIK (aminosyrene 95-264 henholdsvis 1-264) blitt funnet å overlappe bindingssetet for RIP i RAP-2 (figur 11). Binding til TIP60 kan tilsynelatende kartlegges innen området som avgrenses av aminosyrene 95-264. Manglende interaksjon med delesjonsfragmentet som omfatter aminosyrene 95-309 kan sannsynligvis være en følge av en spesifikk, forhindrende konformasjon som gjelder denne spesielle delesjon.

Et lignende avvik vedrørende binding til delesjonsfragmentene kan bemerkes når det gjelder binding av klon nr. 10 og selvassosiasjon av RAP-2. I motsetning til TJP60 tyder imidlertid det faktum at fullengde RAP-2 bindes til delesjonsfragmentet som inneholder aminosyrene 218-416 så vel som til delesjonsfragmentet som inneholder aminosyrene 1-264 og at området som deltar i homo-dimerisering ligger mellom aminosyrene 217-264.

Proteinet som kodes av klon nr. 10 bindes, med det unntak som er nevnt ovenfor, tilsynelatende innenfor et område som begynner mellom aminosyrene 218-309 og avsluttes ved aminosyre 416, og bindingssetet kan således omfatte områder som overlapper med bindingssetene for RIP, NIK, IKKB og TIP60 (figur 11).

B. Funksjonelle områder

Ut fra vår nåværende kunnskap ser det ut til at alle de funksjonelle virkninger av RAP-2 (nemlig NF-kB-inhibering og induksjon av c-Jun hyper-fosforylering) kan kartlegges til samme området (figur 11).

Videre er det mulig at området som er tilstrekkelig for effektiv modulering av signalisering ved alle indusere som er benyttet i disse eksperimenter er lokalisert til proteinets N-terminale segment.

Området som omfattes av aminosyrene 95-416 hadde en virkning, om enn signifikant svakere enn virkningen av fullengde-proteinet, og dette kan således være en følge av stimulert aggregering av endogent RAP-2.

Bortsett fra RelA kan videre virkningen av alle indusere som ble benyttet i våre eksperimenter formidles av så få som tilnærmet 100 N-terminale aminosyrer i RAP-2. Faktisk formidler til og med fragmentet som omfatter aminosyrene 1-102 en klar virkning, om enn temmelig moderat (figur 12 B).

På den annen side krever vellykket induksjon av RelA en mye større del av RAP-2-proteinet. Hittil har vi kunnet definere grensene for dette området til å ligge mellom aminosyrene 1 og 264, et område som tilsynelatende omfatter området mellom aminosyrene 157 og 264 som har visse spesifikke, RelA-assosierte bindingsegenskaper.

C. Binding-funksjonssammenheng

Fra resultatene vist i figur 11 og 12 ser det ut til at:

a) Bortsett fra for RelA, RAP-2-binding til RIP, klon nr. 10 og, sannsynligvis, til NIK og TIP60 ikke påkrevet for proteinets funksjon som inhibitor av overekspresjonsindusert NF-kB. b) Virkningen av RAP-2 på RelA-overekspresjonsindusert aktivering formidles åpenbart, i det minste delvis, via forskjellige bindingsbegivenheter. I det vesentlige

kan alle de ovenfornevnte proteiner tenkes å bidra til den gitte aktivitet, ifølge eksperimentene som er utført til nå.

Det eksakte setet for interaksjonen mellom RAP-2 og RD? er fortsatt ikke bestemt, men det ser ut til at dette setet er spesifikt for RD3 og RAP-2 og ikke foreligger i andre proteiner som vites å interagere med RD3, for eksempel MORT-1, TRÅDD, FAS-R og muligens også TRAF2 (se Malinin et al., 1997). Det fremgår også (ut fra sekvens-analyser og sammenligning med sekvenser i forskjellige databaser som angitt ovenfor) at RAP-2 ikke har et "dødsdomene", en MORT-MODUL, et proteasedomene (for eksempel ICE/CED3-motiv), et kinasedomene/motiv eller

TRAF-domener. I tråd med dette viste biologisk aktivitetsanalyse også at RAP-2 tilsynelatende har følgende egenskaper: (i) ved overekspresjon inhibirer RAP-2 kraftig NF-KB-aktivering via TNF eller via overekspresjon av TRÅDD, RIP, TRAF-2, NIK eller p65 NF-kB-subenhet;

(ii) RAP-2 forsterker c-Jun-hyperfosforylering uten å endre JNK-aktiviteten:

(iii) som vist ved delesjonsanalyse krever RAP-2 ikke dødsdomenet i RD? eller kinaseaktiviteten til RD? for å bindes til RD?. (iv) basert på delesjonsanalysen ovenfor kan bindingsområdet i RAP-2 for RD3 innsnevres til et N-terminalt området på tilnærmet 200 aminosyrer;

(v) RAP-2 bindes til NIK i transfekterte pattedyrsceller, men ikke i gjær.

I lys av hva som er nevnt over synes RAP-2 derfor å være et svært spesifikt RIP-bindende protein og følgelig en RIP-modulator/formidler som sannsynligvis deltar i de RIP-formidlede intracellulære signalreaksjonsveier.

I lys av hva som er beskrevet ovenfor ser det ut til at RAP-2 deltar i modulering/ formidling av aktivitetene til RIP. Intracellulært er disse deltagelse av RD? i celleoverlevelsesreaksjonsveien (NF-kB-aktivering, muligens via interaksjon med TRAF2) og deltagelse i reaksjonsveien for inflammasjon og celledød (uavhengig via "dødsdomenet" i RIP eller via interaksjon med andre proteiner som MORT-1, TRÅDD, p55-R, FAS-R og tilhørende proteaser, for eksempel MACH, Mch4, Gl og lignende). De mulige måter på hvilke RAP-2 kan modulere/formidle aktiviteten til RD? er beskrevet i detalj heri ovenfor. For eksempel kan RAP-2-RD?-interaksjonen føre til forsterkelse av reaksjonsveien enten for celledød eller celleoverlevelse, eller den kan føre til inhibering av reaksjonsveiene for enten celledød eller celleoverlevelse, hvor denne forsterking eller inhibering muligens avhenger av de relative aktiviteter til andre medlemmer av disse to mot hverandre virkende intracellulære reaksjonsveier. RAP-2 kan også virke som et bindingsprotein for å oppnå aggregering av et antall RD3-molekyler og andre RD3- eller RAP-2-bindende proteiner, hvor aggregatet så kan virke enten i retning av celledød eller celleoverlevelse (eller til og med begge), avhengig av de relative aktiviteter/mengder av de andre medlemmer av disse reaksjonsveier i cellen.

Eksempel 11:

Fremstilling av polyklonale antistoffer mot RAP-2

I utgangspunktet injiseres kaniner subkutant med 5 ug av et rent preparat av RAP-2 emulgert i komplett Freund's adjuvans. Tre uker senere injiseres de igjen subkutant med 5 ug RAP-2-preparat i ufullstendig Freund's adjuvans. Ytterligere to injeksjoner med RAP-2 som løsning i PBS gis med 10 dagers mellomrom. Blod tappes fra kaninene 10 dager etter siste immunisering. Utviklingen av antistoffnivået følges ved radioimmunanalyse. <125>I-merket RAP-2 blandes med forskjellige fortynninger (1:50, 1:500,1:5.000 og 1:50.000) av kaninserumet. En suspensjon av protein-G-agarosekuler (20 ul, Pharmacia) tilsettes i et totalvolum på 200 ul. Blandingen inkuberes i en time ved romtemperatur, hvoretter kulene vaskes tre ganger og bundet radioaktivitet måles. Kaninantiserum mot humant leptin benyttes som negativ kontroll. Titeret av RAP-2-antiserumet måles, sammenlignet med den negative kontroll.

Eksempel 12:

Fremstilling av monoklonale antistoffer mot RAP-2

Balb/C-hunnmus (3 måneder gamle) injiseres først med 2 ug renset RAP-2 i en emulsjon med komplett Freund's adjuvans, og tre uker senere subkutant i ufullstendig

Freunc<T>s adjuvans. Ytterligere tre injeksjoner gis med 10 dagers mellomrom, subkutant i PBS. Avsluttende forsterkerinjeksjoner gis intraperiotonealt til musen som viser det høyeste bindingstiter, bestemt ved IRIA (se nedenfor), 4 og 3 dager før fusjonen. Fusjonen utføres ved benyttelse av myelomcellelinjen NSO/1 og lymfosytter fremstilt både fra milt og lymfeknuter fra dyret som fusjonspartnere. De fusjonerte celler fordeles i mikrokulturplater og hybridomet selekteres i DMEM tilsatt HAT og 15% hesteserum. Hybridomer som produserer antistoffer mot RAP-2 subklones ved grense-fortynningsfremgangsmåten og injiseres i Balb/C-mus som er forbehandlet med pristan for fremstilling av ascites. Antistoffenes isotyper defineres ved benyttelse av et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett (Amersham, Storbritannia).

Analyse av hybridomer som produserer monoklonale anti-RAP-2-antistoffer utføres som følger: Hybridom supernatanter analyseres for nærvær av anti-RAP-2-antistoffer ved en invertert radioimmunanalyse i fast fase (IRIA). ELISA-plater (Dyntech Laboratories, Alexandria, VA) belegges med Talon-renset IL-18BPa-His6 (10 ug/ml, 100 (il/brønn). Etter inkubering over natten ved 4°C vaskes platene to ganger med PBS tilsatt BSA (0,5%) og Tween 20 (0,05%) og blokkeres med vaskeløsning i minst to timer ved 37°C. Hybridomkultursupernatanter (100 ul/brønn) tilsettes, og platene inkuberes i 4 timer ved 37°C. Platene vaskes 3 ganger, og et konjugat av anti-muse-antistoff fra geit og pepperrot peroksidase (HRP, Jackson Labs, 1:10.000,100 ul/brønn) tilsettes i 2 timer ved romtemperatur. Platene vaskes 4 ganger og fargen utvikles med ABTS (2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-suflonsyre, Sigma) med H2O2 som substrat. Platene avleses i en automatisk ELIS A-plateleser. Prøver som gir en optisk tetthet som er minst 5 ganger høyere enn den negative kontrollverdi anses som positive.

RAP-2-antistoffene kan benyttes for rensing av RAP-2 ved affinitetskromatografi.

Eksempel 13: ELISA-analyse

Mikrotiter plater (Dynatech eller Maxisorb, fra Nunc) belegges med monoklonalt anti-RAP-2-antistoff (immunoglobuliner fra serumfri hybridomsupernatant eller ascitesvæske) over natten ved 4°C. Platene vaskes med PBS tilsatt BSA (0,5%) og Tween 20 (0,05%) og blokkeres i den samme løsning i minst to timer ved 37°C. Prøvene som skal analyseres fortynnes i blokkeringsløsningen og tilsettes til brønnene

(100 ul/brønn) i 4 timer ved 37°C. Platene vaskes så tre ganger med PBS tilsatt Tween 20 (0,05%) fulgt av tilsetning av anti-RAP-2-serum fra kanin (1:1000,100 ul/brønn) for ytterligere inkubering over natten ved 4°C. Platene vaskes tre ganger, og et konjugat av anti-kanin-antistoff fra geit og pepperrotperoksidase (HRP, Jackson Labs, 1:10.000,100 ul/brønn) tilsettes i 2 timer ved romtemperatur. Platene vaskes 4 ganger og fargen

utvikles med ABTS (2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre, Sigma) med H2O2 som substrat. Platene avleses i en automatisk ELISA-plateleser.

REFERANSER

Alnemri, E.S. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:4312-4317.

Barinaga, M. (1993) Science 262:1512-1514.

Beg. A.A. og Baltimore, D. Science 274:782-784.

Beidler, J. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:16526-16528.

Berger, J. et al. (1988) Gene 66:1-10

Beutler, B. og Cerami, C. (1987) Nejm: 316:379-385.

Bigda, J. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:445-460.

Boldin, M.P. et al., (1995a) J. Biol. Chem. 270:337-341

Boldin, M.P. et al., (1995b) J. Biol. Chem. 270:7795-7798.

Boldin, M.P. et al., (1996) Cell 85:803-815.

Brakebusch, C. et al. (1992) EMBO J., 11:943-950.

Brockhaus, M. et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:3127-3131.

Cantor, G.H. et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:10932-6.

Cerreti, D.P. et al. (1992) Science 256:97-100.

Chen, C.J. et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sei. 660:271-3.

Chinnaiyan et al. (1995) Cell 81:505-512.

Chinnaiyan et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4961-4965.

. Cifone M.G. et al. (1995) EMBO J. 14:5859-5868.

Clement, M.V. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:557-567.

Crisell, P. et al. (1993) Nucleic Acids Res. (England) 21 (22):5251-5.

Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. Brent, R., Kingston, R.E. Moore, D.D. Seidman, J.G. Smith, J.A. Struhl, K., Albright, L.M. Coen, D.M. & Varki, A. (red.), (1994) s. 8.1.1-8.1.6 og 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc. og Wiley & Sons, Inc. New York.

Dirks, W., et al., (1993) Gene 128:247-249.

Durfee, T. et al. (1993) Genes Dey, 7:555-569.

Eischen, CM. et al., (1994) J. Immunol. 153:1947-1954.

Ellis, H.M. et al. (1986) Cell 44:817-829.

Enari, M.et al. (1995) Nature 375:78:81.

Engelmann, H. et al. (1990) J.Biol. Chem., 265:1531-1536.

Faucheu, C. et al. (1995) EMBO J. 14:1914-1922.

Fernandes-Alnemri, T. et al., (1994)J. Biol. Chem. 269:30761-30764.

Femandes-Alnemri, T. et al., (1995) Cancer Res. 55:2737-2742. Fernandes-Alnemri, T. et al., (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:7464-7469. Field, J. et al., (1988) Mol. Cell Biol. 8:2159-2165.

Fields, S. og Song, O. (1989) Nature, 340:245-246.

Frangioni, J.V. og Neel, B.G. (1993) Anal. Biochem. 210:179-187.

Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6:364-369.

Geysen, H.M. et al. (1987) J. Immunol. Meth. 102:259-274.

Gossen, M. og Boujard,H. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:5547-5551. Grell, M et al. (1994) Eur. J.Immunol. 24:2563-2566.

Heller, R.A. et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6151-6155.

Henkart, P.A. (1996) Immunity 4:195-201.

Hohmann, H.-P. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:14927-14934.

Howard, A.D. et al. (1991) J. Immunol. 147:2964-2969.

Hsu, H. et al. (1995) Cell 81:495-504.

Hsu, H. et al. (1996) Cell 84:299-308.

Itoh, N. et al. (1991) Cell 66:233.

Itoh, N. og Nagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268:10932-7.

Joseph, S. og Bruke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 268:24515-8.

Kamens, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:15250-15256.

Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49:5870-5878.

Kaufmann, S.H. (1993) Cancer Res. 53:3976-3985.

Kischkel, F.C. et al. (1995) EMBO J. 14:5579-5588.

Koizumi, M. et al. (1993) Biol. Pharm. Bull (Japan) 16 (9):879-83.

Kumar, S, (1995) Trends Biochem Sei. 20:198-202.

Lazebnik, Y.A. et al. (1994) Nature 371:346-347.

Leithauser, F. et al. (1993) Lab Invest 69:415-429.

Li, Y. et al. (1998) Mol Cell Biol. 18:1601-1610.

Loetscher, H. et al. (1990) Cell, 61:351-359.

Los, M. et al. (1995) Nature 375:81-83.

Madden, S.L. et al. (1996) Cancer Res. 56:5384-5390.

Malinin, N.L. et al. (1997) Nature 385:540-544.

Martin, S.J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6425-6428.

Maschima T. et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:907-915.

Miller, B.E. et al. (1995) J. Immunol. 154:1331-1338.

Milligan,C.E. et al. (1995) Neuron 15:385-393

Miura, M. et al. (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:8318-8322.

Munday, N.A. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:15870-15876.

Muranishi, S. et al. (1991) Pharm. Research 8:649.

Musti, A.M. et al. (1997) Science 1997 275:400-402.

Nagata, S. og Golstein, P. (1995) Science 267,1449-1456.

Natoli, G. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272,26079-26082.

Nicholson, D.W. et al. (1995) Nature 376:37-43.

Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J., 9:3269-3278.

Piquet, P.F. et al. (1987) J. Exp. Med., 166:1280-89.

Ray et al. (1992) Cell 69:597-604.

Ruggiero, V. et al. (1987) Cell Immunol. 107:317-325.

Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Schall, T. J. et al. (1990) Cell, 61:361-370.

Schlegel, et al. (1996) J. Biol.Chem. 271:1841-1844.

Schulze-Osthoff, K. et al. (1994) EMBO J.13:4587-4596.

Shimayama, T. et al. (1993) Nucleic Acids Symp.Ser. 29:177-8.

Shore, S.K. et al. (1993) Oncogene 8:3183-8.

Sleath, P.R. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:14526-14528.

Smith, CA. et al. (1990) Science, 248:1019-1023.

Song, H.Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22492-22495.

Srinivasula, S.M. et al. (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:14486-14491.

Stanger, B.Z. et al. (1995) Cell 81:513-523.

Tartaglia, L.A. et al. (1993) Cell, 74:845-853.

Tewari, M.et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:3255-3260.

Tewari et al. (1995a) J. Biol. Chem. 270:18738-18741.

Tewari et al. (1995b) Cell 81:1-20.

Thornberry, N.A. et al. (1992) Nature 356-768-774.

Thornberry, N.A. et al. (1994) Biochemistry 33:3934-3940.

Tracey, J.T. et al.(1987) Nature, 330:662-664.

Van Antwerp, D.J. et al.(1996) Science 274:787-789. Vandenabeele, P. et al. (1995) Trends Cell Biol. 5:392-400. Vassali, P.(1992) Ann. Rev. Immunol. 10:411-452.

Wallach, D.(1984) Immunol. 132:2462-9.

Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, red.) s. 83-122, Academic Press, London.

Wallach, D. et al. (1994) Cytokine 6:556.

Wang, L. et al. (1994) Cell 78:739-750.

Wang, C-Y et al. (1996) Science 274:784-787. Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nature, 356:314-317. Watanabe, F.R. et al., (1992) J. Immunol. 148:1274-1279. Weitzen, M. et al. (1980) J. Immunol. 125:719-724.

Wilks, A.F. et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:1603-1607. Wong et al. (1994) J. Immunol. 152:1751-1755.

Xue, D. et al. (1995) Nature 377:248-251.

Yamoka S. et al. (1998) Cell 93:1231-1240.

Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:1747-1756.

Yuan, J. et al. (1993) Cell 75:641-652.

Zaccharia, S. et al. (1991) Eur. J. Pharmacol. 203:353-357.

Zhao, J.J. og Pick, L. (1993) Nature (England) 365:448-51.

Claims

1. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et REP-forbundet protein (RAP-2), isoformer, analoger eller fragmenter derav som kan bindes til RD? og modulere eller mediere den intracellulære aktiviteten til RD3, hvor DNA-sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: (a) en DNA-sekvens kodende for et RAP-2 protein som angitt i fig. 3; (b) en DNA-sekvens som vist i SEKV DD NR: 1 eller 2; (c) en DNA-sekvens som kan hybridisere til en sekvens ifølge (a) eller (b) under stringente betingelser og som koder for et biologisk aktivt RAP-2 protein; (d) en DNA-sekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske koden til DNA-sekvensen definert i hvilke som helst av (a) eller (b) og som koder for et biologisk aktivt RAP-2 protein; (e) en DNA-sekvens ifølge (b) kodende for et RAP-2 protein, isoform, analog eller fragment med minst en del av sekvensen som angitt i fig. 3.

2. Replikerbar ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 1, eventuelt operativt sammenkoblet med kontrollsekvenser, promotere eller andre DNA-sekvenser som tillater ekspresjon i korrekt orientering.

3. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 2, karakterisert ved at den kan uttrykkes i en eukaryot vertscelle eller en prokaryot vertscelle.

4. Transformert eukaryot eller prokaryot vertscelle, karakterisert ved at den inneholder en replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 2 eller 3.

5. RAP-2 protein, isoform, fragment, funksjonell analog eller derivater derav, karakterisert ved at det blir kodet av en DNA-sekvens ifølge krav 1.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av RAP-2 protein, isoform, fragment, analoger eller derivater derav ifølge krav 5, karakterisert ved at den omfatter dyrking av de transformerte vertscellene ifølge krav 4 under betingelser som er egnede for ekspresjonen av nevnte protein, analoger, isoformer, fragmenter eller derivater, utføre post-translasjonelle modifiseringer etter behov for oppnåelse av nevnte protein, fragmenter, analoger eller derivater og isolering av nevnte uttrykte proteinfragmenter, analoger eller derivater.

7. Antistoffer eller aktive fragmenter eller derivater derav, karakterisert v ed a t de spesifikt reagerer med den biologiske aktive RAP-2 proteindelen av et RAP-2 protein, isoform, fragment, analog, derivat ifølge krav 5 eller fremstilt ved fremgangsmåten i krav 6.

8. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter minst et RAP-2 protein ifølge krav 5 eller kan oppnås ved fremgangsmåte ifølge krav 6, dets biologiske aktive fragmenter, analoger, derivater ifølge krav 5 eller blandinger derav, en replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 2 eller 3, en oligonukleotid sekvens kodende for en antisens sekvens av RAP-2 protein DNA-sekvensen ifølge krav 1 eller antistoffer ifølge krav 7 og eventuelt, en farmasøytisk akseptabel bærer.

9. Anvendelse av minst RAP-2 protein ifølge krav 5 eller oppnåbar ved fremgangsmåten ifølge krav 6, dets biologiske aktive fragmenter, analoger, derivater ifølge krav 5 eller blandinger derav, en replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 2 eller 3, en oligonukleotidsekvens kodende for en antisens sekvens av RAP-2 protein DNA-sekvens ifølge krav 1 eller antistoffer ifølge krav 7 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for modulering av inflammasjon, celledød og/eller celleoverlevelse.

10. Anvendelse av antistoffer eller aktive fragmenter eller derivater derav ifølge krav 7 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for modulering av inflammasjon, celledød og/eller celleoverlevelse, hvori når RAP-2 proteinet eller deler derav av nevnte celler blir eksponert på den ekstracellulære overflaten blir nevnte preparat formulert for ekstracellulær applikasjon, og når nevnte RAP-2 proteiner er intracellulære blir nevnte preparat formulert for intracellulær applikasjon.

11. Anvendelse av en rekombinant dyrevirusvektor som bærer en sekvens kodende for et virusoverflateprotein som er i stand til å bli bundet til en spesifikk tumorcelleoverflatereseptor eller HIV-infisert celleoverflatereseptor og sekvensen kodende for et protein valgt fra RAP-2 protein, isoform, analog, fragment eller derivat ifølge krav 5, eller kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge krav 6, som når uttrykt i nevnte tumor eller HIV-infiserte celler kan forøke den RD? modulerte/medierte direkte eller indirekte dreping av nevnte celle, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av tumorceller eller HIV-infiserte celler, hvori nevnte tumor eller HIV-infiserte celler skal bli infisert med nevnte vektor.

12. Anvendelse av en vektor kodende for en ribozym sekvens som kan reagere med en cellulær mRNA sekvens kodende for et RAP-2 protein ifølge krav 5, eller som kan oppnås ved fremgangsmåter ifølge krav 6 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for modulering av inflammasjon, celledød og/eller celleoverlevelse, hvori nevnte vektor er i en form som muliggjør ekspresjon av nevnte ribozymsekvens i nevnte celler, og hvor når nevnte ribozymsekvens blir uttrykt i nevnte celler reagerer det med nevnte cellulære mRNA sekvens og spalter nevnte mRNA sekvens som resulterer i inhibisjon av ekspresjonen av nevnte RAP-2 protein i nevnte celler.

13. Anvendelse av en eller flere RAP-2 proteiner, isoformer, analoger, fragmenter eller derivater ifølge krav 5 eller som kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge krav 6, eller en DNA-sekvens kodende for nevnte en eller flere proteiner, isoformer, analoger, fragmenter eller derivater i form av en vektor som bærer nevnte sekvens, idet nevnte vektor kan tilveiebringe innskudd av nevnte sekvens inn i nevnte celle på en måte slik at nevnte sekvens blir uttrykt i nevnte celle for fremstilling av et farmasøytisk preparat som skal bli introdusert til nevnte celle for behandling av inflammasjon, autoimmun sykdom, septisk sjokk, graft versur host avstøtning eller hepatitt.

14. Fragment ifølge krav 5 eller som kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge krav 6, karakterisert ved at det er et peptid.