EA004062B1 - Модуляторы функций рецепторов семейства рецепторов tnf/ngf и других белков - Google Patents

Abstract

Представляется новый белок, способный модулировать или опосредовать внутриклеточную активность белка RIP, проявляемую в отношении механизмов воспалений, выживания клеток и гибели клеток. Также представляются ДНК, его кодирующие, и способ его получения и его применения.

Description

Настоящее изобретение в целом касается рецепторов, относящихся к суперсемейству рецепторов ΤΝΕ/Ν6Ε, и контроля их биологических функций. Надсемейство рецепторов ΤΝΕ/Ν6Ε включает рецепторы, такие как рецепторы р55 и р75 факторов некроза опухолей (ΤΝΕ-К: здесь и далее они обозначаются как р55-К и р75-К) и рецепторы ΕΑδ-лигандов (также обозначаемые как ЕЛ8/ЛР01 или ΕΑ8-Κ: здесь и далее будет обозначаться как ΕΑδ-К) и другие. Конкретно настоящее изобретение касается новых белков, которые связываются с другими белками, которые сами по себе связываются напрямую или опосредованно с членами рецепторного семейства ΤΝΕ/Ν6Ε и другими внутриклеточными белками-модуляторами.

Более конкретно, оно касается одного такого белка, здесь и далее обозначаемого как КАР-2 (что соответствует К1Р-ассоциированному белку-2), и его изоформ, фрагментов, производных, равно как и белков, связывающихся с белком КАР-2.

Белок КАР-2 связывается с белком К1Р («взаимодействующий с рецепторами белок») и обладает способностью модулировать или опосредовать функции К1Р, тем самым будучи способным модулировать или опосредовать, как напрямую, так и косвенно, функции других белков, которые связываются с К1Р прямо или опосредованно. Связывающиеся с КАР-2 белки являются модуляторам/медиаторами функций КАР-2.

Предпосылки изобретения

Фактор некроза опухолей (ΤΝΕ-α) и лимфотоксин (ΤΝΕ-β) (здесь и далее аббревиатура ΤΝΕ относится и к ΤΝΕ-α, и к ΤΝΕ-β) являются многофункциональными провоспалительными цитокинами, в основном, вырабатываемыми мононуклеарными фагоцитами, которые характеризуются многосторонним влиянием на клетки (Ό. ЧаИасй, 1986, Ιη «1п1сгГсгоп 7», еб. I. Сгеккег, Асаб. Ргекк, Ьопбоп, рр. 83-122; ВеиНет & Сегат1, 1987) . И ΤΝΕ-α, и ΤΝΕ-β проявляют свою активность путем связывания на специфических поверхностно-клеточных рецепторах. Некоторые из их эффектов, по-видимому, являются ценными для организма: например, они могут разрушать опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки и способствовать противобактериальной активности гранулоцитов. В этом смысле ΤΝΕ участвует в защите организма против опухолей и инфекционных агентов, а также играет роль в восстановлении после повреждений. Следовательно, ΤΝΕ может быть использован в качестве противоопухолевого агента, при применении которого он связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток, тем самым инициируя процессы, приводящие к гибели этих опухолевых клеток. Также ΤΝΕ может быть использован в качестве противоинфекционного агента.

Однако, кроме того и ΤΝΕ-α, и ΤΝΕ-β проявляют и отрицательные эффекты. Имеется подтверждение того, что избыточная выработка ΤΝΕ-α может играть существенную патогенную роль в патогенезе некоторых заболеваний. Например, известно, что влияние ΤΝΕ-α, в первую очередь, на сосудистую систему организма является основной причиной симптомов септического шока (Τπ^ν е1 а1., 1986). При некоторых заболеваниях ΤΝΕ может обусловливать черезмерное снижение массы тела (кахексию) в результате подавления активности адипоцитов и вследствие обусловливания анорексии, из-за чего ΤΝΕ-α также называют кахектином. Также он был описан как медиатор повреждения тканей при ревматоидных заболеваниях (ВеиЙет & Сетатц 1987) и как основной медиатор повреждений, выявляемых при реакции «трансплантат против хозяина» (Рк|ие1 е1 а1., 1987). Кроме того, ΤΝΕ известен как участник воспалительных процессов и многих других заболеваний.

Два дифференцированных и независимо друг от друга экспрессируемых рецептора - р55 и р75 ΤΝΕ-К, причем оба связывающиеся с ΤΝΕ-α и ΤΝΕ-β, - инициируют и (или) опосредуют упоминавшиеся выше биологические активности ΤΝΕ. Эти два рецептора характеризуются наличием структурно разных внутриклеточных доменов, что подтверждает дифференцировку обслуживающих их сигнальных систем (см. Нойтапп е1 а1., 1989, Епде1тапп е1 а1., 1990; Вгоскйаик е1 а1., 1990; Ьеоксйет е1 а1., 1990; 8сйа11 е1 а1., 1990; №рйаг е1 а1., 1990; 8тйй е1 а1., 1990; Не11ег е1 а1., 1990). Однако, клеточные механизмы, например, различные белки и возможные иные факторы, которые вовлечены во внутриклеточную передачу сигналов ΤΝΕ-рецепторам р55 и р75, пока не установлены. Это тот внутриклеточный сигнальный механизм, который имеет место обычно после связывания лиганда, т.е. ΤΝΕ (α и β), на его рецепторе, который отвечает за включение каскада реакций, неизбежно приводящий к выявляемой реакции клетки на данный ΤΝΕ.

Что касается упоминавшегося выше цитоцидного действия ΤΝΕ, то в большинстве исследованных к настоящему времени клеток такой эффект в основном опосредуется рецептором ΤΝΕ-К р55. Антитела, специфичные в отношении внеклеточного домена (т.е. лигандсвязываюшего домена) рецептора ΤΝΕ-К р55, сами могут опосредовать цитоцидный эффект (см. европейскую патентную заявку 412486), что коррелирует с эффективностью перекрестного сшивания этих рецепторов антителами, что, как считается, является первым этапом в формировании внутриклеточного сигнального каскада. Далее, мутационный анализ (ВгакеЬиксй е1 а1., 1992; Τа^ιад1^а е1 а1., 1993) показал, что биологические функции ΤΝΕ-Κ р55 зависят от целостности его внутриклеточного домена. Соответственно, было подтверждено, что инициация внутриклеточного сигнала ведет к цитоцидному проявлению рецептора ΤΝΕ-Κ р55. Более того, ΤΝΕ (α и β) встречается в виде гомотримера, а раз так, то было подтверждено, что он индуцирует внутриклеточные сигналы через ΤΝΕ-К р55 за счет его способности связываться молекулами рецепторов и образовывать с ними перекрестные сшивки, т.е. приводить к агрегации этих рецепторов.

Другим представителем надсемейства рецепторов ΤΝΕ/ΝΟΕ является ΕΑδ-рецептор (ΕΑ8-Κ), который также называют ΕΑδ-антигеном, являющийся поверхностно-клеточным белком, экпрессированным в различных тканях и характеризующийся гомологией с рядом поверхностно-клеточных рецепторов, включая ΤΝΕ-К и ΝΟΕ-К. Рецептор ΕΑ8-Κ опосредует гибель клеток в процессе апоптоза (Ной е! а1., 1991) и, по-видимому, является негативным селективным фактором аутореактивных Тлимфоцитов: т.е. в процессе созревания Тлимфоцитов ΕΑ8-Κ опосредует апоптотическую гибель Т-клеток, распознающих собственные антигены. Также было установлено, что мутации в гене ΕΑ8-Κ (мутации 1рг) обусловливают лимфопролиферативные синдромы у мышей, которые сходны с системной красной волчанкой, являющейся аутоиммунным заболеванием человека (Λναίαιτ^-Ειιίαιηαβα е! а1., 1992). Лигандом рецептора ΕΑ8-Κ, по-видимому, является ассоциируемая с клеточными поверхностями молекула, находящаяся, помимо других клеток, на Т-киллерах (или цитотоксических Тлимфоцитах - С1Ъ): следовательно, когда такие клетки СТЬ контактируют с клетками, несущими ΕΑ8-Κ, они оказываются способными индуцировать апоптотическую гибель клеток, несущих рецептор ΕΑ8-Κ. Кроме того, были сформированы моноклональные антитела, которые специфичны по отношению к ΕΑ8-Κ, при том, что такие моноклональные антитела способны индуцировать гибель клеток, несущих ΕΑ8-Κ, по механизму апоптоза, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, включающей ген ΕΑ8-Κ человека (Ной е! а1., 1991).

Заявителями был предпринят ряд попыток (см., например, европейские патентные заявки №№ 186833, 308378, 398327 и 412486) проконтролировать нежелательные эффекты ΤΝΕ за счет подавления связывания ΤΝΕ с их рецепторами, используя для этой цели антитела к ΤΝΕ или цитоплазматические рецепторы ΤΝΕ с целью обеспечения конкуренции по связыванию ΤΝΕ с поверхностно-клеточными рецепторами ΤΝΕ-Κ. Кроме того, с учетом того, что связывание ΤΝΕ с их рецепторами является необходимым для проявления ΤΝΕ-индуцируемых клеточных эффектов, заявители пытались (см., например, европейскую патентную заявку 568925) обеспечить модуляцию влияния ΤΝΕ путем изменения активности рецепторов ΤΝΕ-Κ.

Вкратце, заявка ЕР 568925 касается способа модулирования передачи сигнала и (или) отщепления от ΤΝΕ-Κ таким образом, чтобы пептиды или иные молекулы могли взаимодействовать с рецептором либо сами, либо опосредованно через эффекторные пептиды, взаимодействующие с этим рецептором, что тем самым должно модулировать нормальные функции ΤΝΕ-Κ. В заявке ЕР 568925 описывается конструкция и дана характеристика различных мутантных рецепторов ΤΝΕ-Κ р55, несущих мутации во внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменах ΤΝΕ-Κ р55. В этом случае в упомянутых выше доменах были идентифицированы сегменты, которые являются ключевыми в обеспечении функций рецептора ΤΝΕ-Κ р55, т. е. функций связывания с лигандом и последующей передачи сигнала и включения внутриклеточного сигнального пути, что обеспечивает в конечном счете наблюдаемые эффекты действия ΤΝΕ на данные клетки. Кроме того, также описывается ряд подходов к выделению и идентификации белков, пептидов или других факторов, которые способны связываться с различными участками упомянутых выше доменов ΤΝΕ-Κ, при том, что эти белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модулировании активности ΤΝΕ-Κ. Также в заявку ЕР 568925 включен ряд подходов к выделению и клонированию последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды; к конструированию экспрессирующих векторов, необходимых для выработки данных белков и пептидов; и к формированию антител или их фрагментов, которые бы взаимодействовали с ΤΝΕ-Κ или с упомянутыми выше белками и пептидами, которые связываются с различными участками ΤΝΕ-Κ. Однако в заявке ЕР 568925 не конкретизируются реальные белки и пептиды, которые бы связывались с внутриклеточными доменами рецептора ΤΝΕ-Κ (например ΤΝΕ-Κ р55), а также не описан «двухгибридный подход» к выделению и идентификации таких белков или пептидов, которые связываются с внутриклеточными доменами ΤΝΕ-Κ. Также в заявке ЕР 568925 не представлены белки или пептиды, способные связываться с внутриклеточным доменом ΕΑ8-Κ.

Хотя и известно, что рецепторы фактора некроза опухолей (ΤΝΕ) и структурно родственный им рецептор ΕΑ8-Κ обусловливают в клетках путём стимуляции вырабатываемых лейкоцитами лигандов деструктивную активность, приводящую к их собственной гибели, тем не менее механизмы такого опосредования пока понятны не до конца. Мутационный анализ показывает, что сигнальные пути рецепторов ΕΑ8Κ и ΤΝΕ-Κ р55, направленный на цитотоксичность, вовлекают различные участки их внутриклеточных доменов (ВтакеЬиксй е! а1., 1992;

Тайадйа е! а1., 1993, Ной & Ыада1а, 1993). Эти участки (т.н. «гибельные домены») характеризуются сходством аминокислотных последовательностей. Имеется тенденция к самоассоциируемости «гибельных доменов» у РЛ8-К и р55К. Такая самоассоциируемость, по-видимому, обусловливает агрегацию рецепторов, являющуюся необходимой для инициации сигнального пути (см. 8 ο пд е! а1., 1994; \Уа11ас11 е! а1., 1994; Βοϊάίη е! а1., 1995), а при интенсивной экспрессии этих рецепторов она может приводить к обусловливанию не зависящих от лигандов сигналов (Βο1άίη е! а1., 1995).

Как и при других эффектах, обусловливаемых рецепторами, индукция клеточной гибели рецепторами ΤΝΤ и РЛ8-К обеспечивается рядом межбелковых взаимодействий, простирающихся от связывания лиганда на рецепторе до заключительной активации каталитических эффекторных функций, которые в анализируемом случае определяют некаталитические межбелковые взаимодействия, которые инициируют сигнал гибели клеток: связывание тримерных молекул ΤΝΕ или лиганда РЛ8-К с соответствующими рецепторами, последующие взаимодействия с другими внутриклеточными доменами (ВгакеЬикей е! а1., 1992; Тайадйа е! а1., 1993; Ной & №1да1а. 1993), определяемые способностью последовательностей «доменов гибели» к самоассоциированию (Βο1άίη е! а1., 1995а), и индукция связывания двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами этих рецепторов - белка МОКТ-1 (или ΤΆΌΌ) с РЛ8К (Βο1άίη е! а1., 1995Ь; СЫппщуап е! а1., 1995; К18сйке1 е! а1., 1995) и белка ТКЛОЭ с р55-К (Нки е! а1., 1995; Нки е! а1., 1996). Три белка, которые связываются с внутриклеточным доменом РЛ8-К и р55-К по их участку «гибельного домена», вовлеченному в индукцию гибели клеток под влиянием этих рецепторов в результате гетерологической ассоциации гомологичных участков, и которые также способны опосредовать клеточную гибель, были идентифицированы в процедуре скрининга, называемой «двойной гибридизацией дрожжей». Один из этих белков МОКТ-1 (Βο^ω е! а1., 1995Ь) - также известен как белок ΕΆΌΌ (СЫппшуап е! а1., 1995), который специфически связывается с рецептором РЛ8-К. Другой белок - ТКЛОЭ (см. также Нки е! а1., 1995, 1996) -связывается с рецептором р55-К, третий белок - К1Р (см. также 81апдег е! а1., 1995) - связывается и с РЛ8-К, и с р55-К. Помимо связывания с РЛ8-К и р55-К, эти белки также способны связываться друг с другом, что обеспечивается функциональный «обмен» между РЛ8-К и р55-К. Такое связывание происходит по консервативному участку последовательности - «модулю домена гибели», - являющемуся общим для этих рецепторов и связываемых с ними белков. Более того, хотя в двухгибридном дрожжевом тесте было показано, что белок МОКТ-1 связывается с РЛ8-К спонтанно, в клетках млекопитающих такое связывание имеет место только после стимуляции данного рецептора: это подтверждает, что МОКТ-1 участвует в начальном событии сигнального пути РЛ8-К. Белок МОКТ-1 не включает каких-либо мотивов, характерных для проявления каталитической активности: следовательно, его способность опосредовать гибель клеток, как предполагается, не основана на собственной активности МОКТ-1, а скорее всего связана с активацией другого(их) белка(ов), которые связываются с МОКТ-1 и действуют по следующим этапам этого сигнального каскада. При клеточной экспрессии мутантного МОКТ-1, лишенного Νконцевой части молекулы, как было показано, происходит блокировка индукции цитотоксичности под действием РЛ8/ЛРО1 (РЛ8-К) или р55-К (Нки е! а1., 1996; СЫппщуап е! а1., 1996): это указывает на то, что этот Ν-концевой участок передает сигналы о цитоцидном влиянии обоих этих рецепторов через некие белокбелковые взаимодействия.

Таким образом, мотивы «доменов гибели» в составе рецепторов р55-К и РЛ8-К, равно как и три ассоциированных с ними белка МОКТ-1, К1Р и ТКЛОЭ, по-видимому, являются сайтами таких межбелковых взаимодействий. Три белка МОКТ-1, К1Р и ТКЛОЭ взаимодействуют с внутри-клеточными доменами рецепторов р55К и РЛ8-К за счёт связывания их «доменов гибели» с таковыми же в составе рецепторов, а «гибельные домены» и К1Р, и ТКЛОЭ самоассоциируются (хотя в этом отношении белок МОКТ-1 отличается тем, что его «гибельный домен» в самоассоциациях не участвует). Более того, белки МОКТ-1 и ТКЛОЭ дифференцированно связываются с р55-К и РЛ8-К и также связываются друг с другом. Более того, и МОКТ-1, и ТКЛОЭ эффективно связываются с К1Р. Следовательно, можно предположить, что взаимодействие между тремя белками МОКТ-1, К1Р и ТКЛОЭ является важным компонентом общего процесса модуляции внутриклеточного сигнала, опосредуемого этими белками. Нарушение взаимодействия между этими тремя внутриклеточными белками будет обусловливать модуляцию эффектов, определяемых таким взаимодействием. Например, подавление связывания белка ТКЛОЭ с МОКТ-1 может модулировать взаимодействие РЛ8-К-р55 Т№-К. Таким же образом, подавление К1Р дополнительно к упомянутому выше подавлению связывания ТКЛЭЭ с МОКТ-1 может дополнительно изменить взаимодействие РЛ8-К-р55 Т№-К.

Моноклональные антитела, против «домена гибели» р55-К, в частности, в отношении связывающего сайта ТКЛОЭ и К1Р, также могут быть использованы для подавления или предотвращения связывания этих белков, тем самым обусловливая модуляцию взаимодействия между РЛ8-К и р55-К.

Ί

Также недавно было установлено, что, помимо упоминавшейся выше активности по индукции гибели клеток и ее модуляции, опосредуемых различными рецепторами и связывающимися с ними белками, включая ЕЛ8-Я, р55-К, МОЯТ-1, ΤΚΆΌΌ, ΚΙΡ. МАСН, Мсй4 и 61, ряд этих рецепторов и связывающихся с ними белков также вовлечены в модуляцию активности ядерного транскрипционного фактора ΝΡ-κΒ, который является ключевым медиатором жизнеспособности или выживания клеток, будучи ответственным за контроль экспрессии значительного числа генов, связанных с иммунитетом и воспалительными процессами. Например, было установлено, что ΤΝΡ-α может эффективно стимулировать активацию фактора ΝΡ-κΒ: тем самым ΤΝΡ-α способен индуцировать два типа сигналов в клетках - один из них опосредует гибель клеток, а другой защищает клетки от индукции гибели за счет включения экспрессии генов под контролем ΝΡ-κΒ (см. Вед & ВаШтоге, 1996; ^аид е! а1., 1996; Уап Ап1\тегр е! а1., 1996). Сходный двойной эффект также был описан и для рецептора РА8-К. (см. отсылки к такому эффекту в упомянутой выше статье Уап Ап!тетр е! а1., 1996). Следовательно, можно предположить существование тонкого баланса между гибелью клеток и выживанием клеток в результате стимуляции различных типов клеток действием ΤΝΡ-α и (или) лиганда РА8-Я, при том, что конечный результат стимуляции зависит от того, по какому внутриклеточному механизму имела место более сильная стимуляция, в результате чего в итоге либо имеет место гибель клетки (обычно по типу апоптоза), либо сохраняется жизнеспособность клетки благодаря активации фактора ΝΡ-κΒ.

Кроме того, недавно заявителями настоящего изобретения был дополнительно установлен вероятный механизм, по которому члены семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ активируют ΝΡ-κΒ (см. Ма1шш е! а1., 1997 и различные библиографические ссылки, имеющиеся в этой публикации, а также тематически связанные заявки на патент Израиля №№ 1Ь-117800 и 1Ь119133). Вкратце, было установлено, что некоторые члены семейства рецепторов ΤΝΡ/Ν6Ρ способны активировать ΝΡ-κΒ опосредованно через общий белок-адаптер - ΤΚΆΡ2. Впервые установленная протеинкиназа, обозначенная как ΝΙΚ (см. цитировавшиеся выше МаПшп е! а1., 1997 и заявки ΙΚ-117800 и ΙΚ-119133), способна связываться с белком ΤКАΡ2 и стимулировать активность фактора ΝΡ-κΒ. Действительно, было показано (см. упоминавшиеся публикацию Ма1шш е! а1. и израильские заявки), что экспрессия в клетках дефицитных по киназе ΝΙΚ мутантов обусловливает неспособность этих клеток обусловливать стимуляцию ΝΡ-κΒ по нормальному эндогенному механизму, а также блокировку в этих клетках индукции активно сти ΝΡ-κΒ под действием ΤΝΡ через ΡΛ8-Β и блокировку индукции ΝΡ-κΒ белками ΤКΛ^^, К1Р и МОКГИ (которые являются белкамиадаптерами, связывающимися с этими рецепторами р55-К и/или ΡА§-Я). Все рецепторы р55-К, р75-К, ΡА§-Я и их адаптерные белки МОКТИ, Τ^ΩΩ и К1Р связываются с белком ΤКΛΡ2 напрямую или опосредованно, а он, в свою очередь, благодаря способности связываться с киназой ΝΙΚ модулирует индукцию ΝΡ-хВ.

Среди упоминавшихся выше белковадаптеров, вовлеченных в поддержание тонкого баланса между гибелью клеток и выживанием клеток после стимуляции ΡА§-К и (или) р55-К, белок КРР, как представляется, играет наиболее важную роль. В С-концевой части белка КРР (см. §!апдет е! а1., 1955; также Ма1шш е! а1., 1997) имеется участок, который обеспечивает индукцию цитотоксичности независимым образом, а также за счет ассоциации с «гибельными доменами» МОКТИ, р55-К, ΡА§-К и Τ^ΩΩ. Также белок КРР включает протеинкиназный домен в своей Ν-концевой части, а также промежуточный домен, который, как считается, обеспечивает «пересечение» (связывание) с белком ΤКАΡ2, тем самым включая его в индукцию ΝΡ-κΒ. Соответственно подробности, касающиеся параметров и последовательностей (нуклеотидной и аминокислотной) КРР были включены в упоминавшиеся выше публикации (в частности, Мапдег е! а1., 1992), которые включены здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Также ΤΝΡ является одним из цитокинов, участвующих в инициации и модуляции антивирусной активности организма-хозяина. Сходным образом в эволюции вирусов сформировалась экспрессия генов, белковые продукты которых регулируют активность таких цитокинов, и эти цитокин-регулирующие вирусные белки, как считается, обеспечивают проникновение данного вируса в организм животногореципиента. Одним из наиболее хорошо изученных примеров таких белков является белок Е3-14.7-кД, представляющий аденовирусы-С человека типов 2 и 3, который активен как мощный антагонист цитолиза, опосредованного ΤΝΡ.

С целью выделения молекулярных компонентов сигнального каскада ΤΝΡ, который становится мишенью белка Е3-17,4-кД в процессе вирусной инфекции, недавно с помощью двухгибридного скрининга был выделен белок Е317,4-кД человека (белок ΡΙΡ-2 - «четырнадцать килодальнон/взаимодействующий/белок»: «ЕоиПееп-К ЩетасЕпд Рто!еш: Υ. Ы е! а1., 1988). Было установлено, что белок ΡΙ Р-2 сам по себе не является токсичным, и, в противоположность защитному эффекту Е-14,7-кД в отношении цитотоксичности, индуцируется сверхэкспрессией ΤΝΡΚ-Ι или ИГР вне связывания с любым из двух вышеупомянутых белков. Было установлено, что белок ΕΙΡ-2 характеризуется определённым уровнем гомологии с ΚΑΡ-2 - белком по настоящему изобретению. Общий уровень сходства между Κ.ΆΡ-2 и ΕΙΡ2 весьма низок, на что указывает полное сопоставление аминокислотных последовательностей (фиг. 3). Однако гомология становится более существенной по конкретным участкам по направлению к Сконцевым частям этих белков, достигая почти полной идентичности для 30 С-концевых аминокислот. Также заслуживает внимания тот факт, что, помимо вышеупомянутого Сконцевого домена, предполагаемый мотив типа «лейциновая молния» в последовательности ΕΙΡ-2 в существенной степени консервативен для Κ.ΆΡ-2 (за исключением замены изолейцина на аланин).

Сходная последовательность, обозначенная ΗΥΡΕ, кодирующая белок, связанный с болезнью Гентингтона, который предположительно является обособленным гомологом Κ.ΆΡ-2, недавно была внесена в базу данных СспВапк под названием «белок, взаимодействующий с гентингтином» - ΗΥΡΕ (депозитарный №

ΆΡΌ49614). Однако сообщений о функциях этого белка пока нет.

В недавней статье Ямаоки с соавт. (8. Уатаока с1 а1., 1998) сообщается об идентификации гомолога ΡΛΡ-2 мыши. Мышиный гомолог ΝΕΜΟ (ключевой модулятор фактора ΝΕ-κΒ) был идентифицирован при поиске молекул, которые бы регулировали активацию сигнального пути ΝΕ-κΒ. Был охарактеризован клеточный вариант НТЬУ-1 Тах-трансформированных фибробластов крысы, обозначенный как 5Я, который не реагировал ни на один из испытанных стимулов, активирующих ΝΕ-κΒ (ΕΡ8, РМА, 1Ь-1, ΤΝΕ), и протестирован по его генетической комплементируемости. В результате этой процедуры была выделена кДНК, кодирующая белок ΝΕΜΟ с молекулярной массой 48 кД. Основываясь на этих данных, было установлено отсутствие данного белка в клетках 5Я и его вхождение в высокомолекулярный 1кВкиназный комплекс, необходимый для его формирования. В модели ίη νίίτο белок ΝΕΜΟ способен образовывать гомодимеры и напрямую взаимодействовать с ΙΚΚβ.

В израильской патентной заявке № 120485 представляется ΚΙΡ-ассоциированный белок, обозначенный ΚΑΡ, который специфически связывается с белком Κ.ΙΡ и подавляет индукцию ΝΕ-кВ.

Израильская патентная заявка № 123758 и настоящая заявка касаются другого Κ.ΙΡассоциированного белка, обозначенного как

ΚΑΡ-2, который характеризуется такими же или сходными активностями.

В соответствии с настоящим изобретением белок ΚΑΡ-2 также обозначается как 303, или

ΚΑΡ-303, или ΚΑ.Τ-303. Для удобства далее здесь он будет обозначаться как ΚΑΡ-2.

Сущность изобретения

Объектом настоящего изобретения является представление белка ΚΑΡ-2, включая все его изоформы, аналоги, фрагменты и производные, способные связываться с белком Κ.ΙΡ (здесь и далее обозначаемым просто «Κ.ΙΡ»). Поскольку Κ.ΙΡ способен напрямую или опосредованно взаимодействовать с внутриклеточными медиаторами воспаления, цитотоксичности и (или) гибели клеток, такими как р55-Я и ΕΑ8-Κ, и с их адаптерными или модуляторными белками, такими как, например, ΜΟΚ.Τ-1, ΤΚΑΌΌ, Мсй4, ΜΑСΗ, С1 и другими, то новые белки по настоящему изобретению за счет связывания с Κ.ΙΡ таким образом оказываются способны подавлять внутриклеточный сигнальный каскад, инициируемый связыванием ΕΑ8-лиганда со своим рецептором, а ΤΝΕ со своим рецептором (р55Я), а раз так, то новые белки по настоящему изобретению являются модуляторами опосредованного р55-Я и ΕΑ8-Ρ влияния на клетки. Также способен взаимодействовать с белком ΤЯΑΕ2, тем самым будучи способен взаимодействовать напрямую или косвенно с ΝΙΚ, а, поскольку ЯГЕ активен как модулятор воспалительного процесса и механизмов клеточной жизнеспособности, вовлекаемых в индукцию фактора ΝΕ-κΒ, то новые белки по настоящему изобретению являются модуляторами ΡΙΡассоциированного воспаления и активности по выживанию клеток. Таким же образом за счёт способности рецепторов РЛ8-Я р55-Я и их модуляторных белков МОЯТ-1 и ΤΡΑΩΟ индуцировать ΝΕ-κΒ и выживание клеток напрямую или опосредованно в результате связывания с ΕΙΡ или связывания с ΤЯЛΕ2, с которым связывается Ε^Ρ, белки по настоящему изобретению также могут являться медиаторами процессов поддержания жизнеспособности клеток за счет активности в том же или близкородственном внутриклеточном сигнальном каскаде, в составе которого некоторые из упомянутых выше белков активны по обеспечению выживания клеток. Сходным образом, поскольку р75-Я связывается с ΤЯΑΕ2, с которым связывается ЯIΡ, новые белки по настоящему изобретению также могут быть модуляторами ЯIΡ-связанного опосредования активности, обусловливаемой рецептором р75-Я.

Другим объектом настоящего изобретения является представление антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений или даже некоторых изоформ) упомянутых выше новых белков ЯЛΡ-2, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных, которые могут быть использованы для подавления сигнальных путей или, что более конкретно, воспалительной цитотоксичности или механизмов выживания клеток, если это является желательным.

Еще одним объектом настоящего изобретения является применение упомянутых выше белков КАР-2, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных с целью выделения и охарактеризования дополнительных белков или факторов, которые могут быть вовлечены в регуляцию рецепторной активности, например, других белков, которые связываются с белками КАР-2 и влияют на их активность, и (или) с целью выделения и идентификации других рецепторов, расположенных выше или ниже по сигнальной цепочке, в которой участвуют данные белки, их аналоги, фрагменты и производные, а, следовательно, в функционирование которых они также вовлечены.

Также настоящее изобретение представляет КАР2-связывающиеся белки, которые способны модулировать/опосредовать функции КАР-2.

Еще одним объектом настоящего изобретения является представление ингибиторов, которые могут быть внесены в клетки с целью связывания или взаимодействия с КАР-2 и вероятными изоформами КАР-2, при том, что эти ингибиторы могут подавлять К1Рассоциированную активность в процессах цитотоксичности, а, следовательно, когда это является желательным, повышать жизнеспособность клеток, или которые могут подавлять К1Рассоциированную активность в процессах обеспечения выживания клеток, следовательно, тем самым, если это желательно, повышая уровень цитотоксичности.

Более того, объектом настоящего изобретения является применение упомянутых выше новых белков КАР-2, их изоформ и аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для получения поликлональных и (или) моноклональных антител к ним. Эти антитела, в свою очередь, могут быть использованы, например, для очистки новых белков из различных источников, таких как клеточные экстракты или линии трансформированных клеток.

Далее, данные антитела могут быть использованы для целей диагностики, например, для идентификации заболеваний, связанных с аномальным функционированием клеточных процессов, опосредуемых р55-К, ЕА8-К и другими родственными рецепторами.

Другим объектом настоящего изобретения является представление фармацевтических композиций, содержащих упомянутые выше белки КАР-2, их изоформы или аналоги, фрагменты или производные, равно как и фармацевтические композиции, содержащие упомянутые выше антитела или другие антагонисты.

В соответствии с настоящим изобретением был выделен новый белок КАР-2. КАР-2 способен связываться с К1Р или взаимодействовать с ним, а, следовательно, он является модулятором или медиатором внутри-клеточной активности белка К1Р. К1Р вовлечен в модуляцию или опосредование внутриклеточных сигнальных механизмов, например, механизмов, ассоциированных с цитотоксичностью или гибелью клеток, в которых К1Р обладает собственной цитотоксичностью и в связи, прямой или опосредованной, с рядом других белков гибели клеток, такими как, например, МОКТ-1, ТКАЭЭ. МАСН, Мсй4, 61, р55-К и р75-К, с которыми К1Р может связываться или иначе ассоциироваться напрямую или косвенно через мотив «домена гибели», присутствующий в последовательности К1Р и в составе всех других вышеперечисленных белков; другим механизмом является механизм воспаления, клеточной жизнеспособности или выживания, в которых К1Р может принадлежать роль прямого или косвенного активатора благодаря наличию киназного мотива или домена в составе последовательности К1Р и способности К1Р связываться с белком ТКАР2, который может связываться с киназой ΝΙΚ, которая, в свою очередь, напрямую вовлечена в активацию транскрипционного фактора ΝΡ-κΒ, который играет ключевую роль в воспалениях и выживаемости клеток. Кроме того, рецептор р55-К также способен взаимодействовать с ТКАЭЭ и ТКАР2 (через ТВАОЭ) и также вовлечен в активацию ΝΡ-κΒ, тем самым участвуя в механизме выживания, а, следовательно, К1Р за счет способности связываться или взаимодействовать с ЕА8-К, ТКАЭЭ и р55-г (через ТКАПЭ), равно как и с ТКАР2, также может быть вовлечен в модуляцию воспаления и активации выживания клеток с участием этих белков. Соответственно К1Р является модулятором или медиатором этих механизмов и сходным образом новый белок КАР-2 по настоящему изобретению за счет связывания с К1Р является модулятором или медиатором упомянутых внутриклеточных механизмов.

КАР-2 был выделен и клонирован с использованием двухгибридной дрожжевой системы, секвенирован и охарактеризован: в соответствии с подробно описанным ниже, КАР-2 рассматривается как высокоспецифичный К1Рсвязывающийся белок, следовательно, являющийся модулятором/медиатором К1Р. КАР-2 не связывается с ТКАПЭ, МОКТ-1, р55-К, р75-К и МАСН. Кроме того, предполагается, что КАР-2 не включает характерного модуля или мотива «гибельный домен», что соответствует тому, что сам по себе КАР-2 не обусловаливает цитотоксичности.

По использованию на протяжении дальнейшего текста понятие «К1Р-активность» призвано включить его активность по модуляции/опосредованию воспалений и механизмов гибели и выживания клеток. Эти активности определяются здесь выше и здесь ниже, равно как и во всех цитировавшихся публикациях и патентных заявках, полное содержание которых включено для сведения в виде библиографиче13 ских ссылок. Подобным образом по использованию в данном тексте понятие «активность КЛР-2» призвано включить в себя модуляцию/опосредование активности К1Р за счет специфического связывания с К1Р, при том, что такая модуляция/опосредование К1Р действием КАР-2 включает модуляцию/опосредование механизмов воспалений, гибели клеток и выживания клеток, в которые К1Р вовлечен напрямую или косвенно, а раз так, то такой КАР-2 может рассматриваться в качестве непрямого модулятора/медиатора всех перечисленных выше белков, а, по-видимому, и ряда других факторов, участвующих в воспалениях, гибели клеток или выживании клеток, с которыми связывается К1Р, или с которыми К1Р взаимодействует напрямую или опосредованно.

Также настоящее изобретение представляет два новых КАР2-связывающихся белка, идентифицированных в двухгибридной дрожжевой системе с использованием в качестве «наживки» полноразмерной аминокислотной последовательности белка КАР-2.

Применяя полноразмерный белок КАР-2 в качестве «наживки» в двухгибридной системе, был выявлен новый КАР2-взаимодействующий белок, обозначаемый в данном тексте как клон № 10 (или №10-кодируемый белок, или КАТсвязывающийся белок № 10, или КВР-10). Последовательность выделенной кДНК была далее определена с помощью стандартных методов секвенирования, известных в данной области техники, в сторону 5' с выделением частичной открытой кодирующей рамки данного белка, лишенной, однако, старт-кодона.

Анализ в двухгибридной системе репертуара связывания клона № 10 показал, что этот белок не только связывается с КАР-2, но также проявляет достаточно мощную аффинность в отношении ТКАР2. Однако клон № 10 не связывается с К1Р, ТКАЭО, МОКТ-1, МАСН, ТЛРК-1, Т1Р60 и ΝΙΚ, равно как и с некоторыми контрольными белками (например, ламином и циклином-Ό). Однако нельзя исключать, что связывание клона № 10 с киназой ΝΙΚ может быть обнаружено в клетках млекопитающих, исходя из параметров ΝΙΚ в клетках дрожжей. Как было показано, клон № 10 связывается с КАР-2 в пределах С-концевых 200 аминокислот последовательности последнего, т.е. участка, необязательно связывающегося с К1Р, Т1Р60, ΝΙΚ и ΙΚΚβ. Эта последовательность, однако, неточна, что привело к необходимости проведения нескольких кругов поиска базы данных Оеи-Вапк с целью идентификации гомологов клона № 10. Единственным белком, проявившим существенную степень сходства с белком, кодируемым клоном № 10, оказался белок Е40Е12.5 -гипотетическая молекула нематоды С.е1едап8, для которой точная физиологическая роль пока не установлена.

Интересно, что Е40Е12.5, как было установлено, характеризуется определенным сходством с некоторыми представителями высококонсервативного семейства контролируемых убиквитином протеаз. Эти ферменты уравновешивают деструктивные последствия активности убиквитиновой системы, которая, как известно, «руководит» большинством клеточных процессов разрушения белков. При том, что убиквитинлигазы обеспечивают прикрепление полиубиквитиновой структуры к предназначенному к разрушению белку, убиквитинпротеазы предотвращают эффективное «разветвление» этой структуры. Такое предположение о функциях Е40Е12.5, основанное на сходстве упоминавшихся выше контролируемых убиквитином протеаз, однако остается под вопросом, потому что не было исследовано возможное проявление этим белком какой-либо каталитической активности по отношению к полиубиквитину. Более того, ряд положений делают данное совпадение маловероятным:

(а) аминокислотные остатки, которые, как считается, составляют основу каталитического участка в любом из подклассов убиквитинпротеаз, не являются консервативными ни в Е40Е12.5, ни в клоне № 10;

(б) за исключением их каталитических сайтов, ферменты, относящиеся к контролируемым убиквитином протеазам, происходящие от разных видов (от бактерий до человека), не проявляют сколько-нибудь существенного сходства последовательностей, в то время как Е40Е12.5 и клон № 10 характеризуются наличием определенного уровня гомологии.

Таким образом, предполагается, что КАР-2 является специфичным К1Р-связывающимся белком и, следовательно, модулятором/медиатором внутриклеточной активности К1Р. КАР2связывающиеся белки, благодаря их способности связываться с КАР-2, проявляют непрямое влияние на К1Р и таким путем также являются модуляторами/медиаторами внутриклеточной активности К1Р.

Таким образом, КАР-2 предположительно играет роль модулятора/медиатора активностей по воспалениям, выживанию клеток и (или) гибели клеток, в которые К1Р вовлечен напрямую или косвенно, особенно тех, которые связаны с цитотоксичностью и воспалительными процессами, обусловливаемыми или индуцируемыми различными стимулами, включая те, которые передаются рецепторами семейства рецепторов Т№ЖОЕ, а также, возможно, и другими (по схеме участия К1Р в таких внутриклеточных процессах, а, следовательно, участия КАР-2, см. фиг. 1 в публикации Майшп е! а1., 1997).

Также КАР-2 может служить ингибитором цитотоксичности и воспалений за счет его присутствия в качестве части комплекса с другими белками, например, К1Р, и белками, связывающимися с К1Р, а раз так, то он может нарушать цитотоксичность или воспалительные проявления этих других белков (например, р55-В, ЕА8В, МАСН, Ме114. 61 и ΜΘΒΤ-1), что в конечном счете обусловливает подавление их цитотоксической активности или их воспалительной активности.

Также ВАР-2 может служить в качестве усилителя или индуктора цитотоксичности и воспаления, что обеспечивается активностью других белков, например, В1Р и других связывающихся с В1Р белков в соответствии с указанным выше, имеющей целью рекрутинг этих белков с участием В1Р, при том, что такой рекрутинг служит для обеспечения цитотоксической активности с участием различных белков или для обеспечения их воспалительной активности.

Также аналогичным образом ВАР-2 может служить в качестве ингибитора или индуктора механизма выживания клеток в соответствии с отмеченным выше за счёт вовлечения В1Р в работу этого механизма.

Соответственно настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, кодирующую В1Р-ассоциированный белок (ВАР-2), его изоформы, аналоги или фрагменты, способные связываться с В1Р и модулировать или опосредовать внутриклеточную активность В1Р, при том, что упомянутая внутриклеточная активность связана с модулированием/опосредованием воспалений и (или) гибели клеток, и (или) выживания клеток.

В частности, настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, выбираемую из группы, которая включает:

(а) последовательность кДНК, производную от кодирующего участка нативного белка ВАР-2;

(б) последовательности ДНК, способные гибридизоваться с последовательностью (а) в условиях средней степени жесткости, которые кодируют биологически активный белок ВАР-2; и (в) последовательности ДНК, которые отличаются в результате вырожденности генетического кода от последовательностей ДНК, определенных в (а) и (б), которые кодируют биологически активный белок ВАР-2.

Другим конкретным вариантом вышеупомянутой последовательности ДНК по настоящему изобретению является последовательность ДНК, включающая по крайней мере часть последовательности, кодирующей по крайней мере одну изоформу белка ВАР-2. В другом варианте вышеупомянутой последовательностью ДНК является последовательность гена белка ВАР-2 в соответствии с показанным на фиг. 1. Еще в одном варианте представляется последовательность ДНК, показанная на фиг. 2.

Настоящее изобретение представляет белки ВАР-2, а также их аналоги, фрагменты или производные, кодируемые любой из вышеуказанных последовательностей по настоящему изобретению, при том, что упомянутые белки, аналоги, фрагменты и производные способны связываться с В1Р и модулировать/опосредовать его биологическую активность в отношении внутриклеточных механизмов гибели клеток и (или) выживания клеток.

Конкретный вариант настоящего изобретения представляет белки ВАР-2 и их аналоги, фрагменты и производные. Аминокислотная последовательность белка ВАР-2, расшифрованная по последовательностям ДНК, показанным на фиг. 1 и 2, показана на фиг. 3. В другом варианте представлена любая изоформа белка ВАР-2, ее аналоги, фрагменты и производные.

Также настоящим изобретением представляются компетентные по репликации экспрессионные системы, включающие упомянутую выше ДНК, при том, что эти компетентные по репликации экспрессионные системы способны экспрессироваться в подходящих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах; а также способ выработки белка ВАР-2 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению путем культивирования трансформированных клеток-хозяев в условиях, благоприятных для экспрессии упомянутых белка, его аналогов, фрагментов или производных, для осуществления посттрансляционных модификаций упомянутого белка, если это необходимо для получения упомянутого белка, и для экстрагирования упомянутого экспрессированного белка, его аналогов, фрагментов или производных из культуральной среды упомянутых трансформированных клеток или из экстрактов упомянутых трансформированных клеток. Приведенные выше определения призваны включить все изоформы белка ВАР-2.

В другом аспекте настоящее изобретение также представляет антитела или их активные производные или фрагменты, специфичные в отношении белка ВАР-2, его аналогов, фрагментов и производных по настоящему изобретению.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения представляются различные пути применения упомянутых выше последовательностей ДНК или белков, которые они кодируют в соответствии с настоящим изобретением, при том, что, помимо других, могут быть такие пути применения:

(1) Способ модулирования внутриклеточных механизмов воспаления, гибели клеток и (или) выживания клеток, модулируемых или опосредуемых белком В1Р, В1Р- модулирования внутриклеточных механизмов воспаления, гибели клеток ВАР-2, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных, способных связываться с В1Р, при том, что упомянутая обработка упомянутых клеток включает внесение в упомянутые клетки упомянутых одного или нескольких белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для проникновения их внутрь клетки, или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК, кодирующей упомянутые один или несколько белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных, в форме подходящего вектора, включающего упомянутую последовательность, при том, что указанный вектор способен обеспечивать встраивание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким путем, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках.

(2) Способ модулирования механизмов воспаления, гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых лигандами семейства ΤΝΡ за счёт влияния на клетки через воздействие на белок К1Р в соответствии с п. (1), при том, что упомянутая обработка клеток включает внесение в упомянутые клетки упомянутых белка КАР-2 или его изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для проникновения внутрь клетки, или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК, кодирующей указанный белок КАР-2 или его изоформы, аналоги, фрагменты или производные, при том, что указанный вектор способен обеспечивать встраивание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким путём, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках.

(3) Способ,описанный в (2), где упомянутая обработка упомянутых клеток осуществляется путем трансфекции упомянутых клеток рекомбинантным вектором на основе вируса животного, включающий следующие этапы:

(a) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, включающего последовательность, кодирующую поверхностный вирусный белок (лиганд), который способен связываться на специфичном поверхностноклеточном рецепторе на поверхности клетки, несущей рецептор РА8-К или р55-К, а также вторую последовательность, кодирующую белок, выбираемый из белка К.ЛР-2 и его изоформ, аналогов, фрагментов и производных, который, в случае экспрессии в упомянутых клетках, способен модулировать/опосредовать внутриклеточные механизмы воспалений, гибели клеток и (или) выживания клеток; и (b) инфицирование упомянутых клеток упомянутым в (а) вектором.

(4) Способ модулирования механизмов воспаления, гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых влиянием лигандов семейства ΤΝΡ на клетки через воздействие на белок К1Р, включающий обработку упомянутых клеток антителами или их активными фрагментами или производными в соответствии с настоящим изобретением, при том, что упомянутая обработка осуществляется с помощью подходящей композиции, содержащей упомянутые антитела, их активные фрагменты или произ водные, в отношении упомянутых клеток, при том, что, когда по крайней мере часть белка КАР-2 попадает на внешнюю поверхность клетки, упомянутая композиция формируется для внеклеточного применения, а когда упомянутые белки КАР-2 являются полностью внутриклеточными, то упомянутая композиция формируется для внутриклеточного применения.

(5) Способ модулирования механизмов воспаления, гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых влиянием лигандов семейства ΤΝΡ на клетки через воздействие на белок К1Р, включающий обработку упомянутых клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по отношению по крайней мере к части последовательности белка КАР-2 по настоящему изобретению, при том, что упомянутая олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка КАР-2.

(6) Способ, описанный (2), предназначенный для обработки опухолевых клеток или ВИЧ-инфицированных клеток, или больных клеток другого типа, включающий:

(а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, включающего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок, способный связываться на специфичном рецепторе поверхности опухолевых клеток или на рецепторе поверхности ВИЧ-инфицированных клеток, или на рецепторе, находящемся на других больных клетках, а также последовательность, кодирующую белок, выбираемый из белка КАР-2, его аналогов, фрагментов и производных по настоящему изобретению, который, будучи экспрессирован в упомянутых опухолевых, ВИЧинфицированных или иных больных клетках, способен уничтожать упомянутую клетку через взаимодействие с белком К1Р; и (б) инфицирование упомянутых опухолевых или ВИЧ-инфицированных клеток или иных больных клеток упомянутым в (а) вектором.

(7) Способ модулирования механизмов гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых влиянием лигандов семейства ΤΝΡ на клетки через белок К1Р, включающий применение рибозимной процедуры, в которой вектор, кодирующий рибозимную последовательность, способную взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, которая кодирует белок КАР-2 по настоящему изобретению, вносят в упомянутые клетки в форме, которая обеспечивает экспрессию упомянутой рибозимной последовательности в упомянутых клетках, при том, что, когда упомянутая рибозимная последовательность экспрессируется в упомянутых клетках, она взаимодействует с упомянутой клеточной последовательностью мРНК и расщепляет упомянутую последовательность мРНК, в результате чего происходит подавление экспрессии упомянутого белка КАР-2 в упомянутых клетках.

(8) Способ, выбираемый из перечисленных выше способов по настоящему изобретению, при том, что упомянутая кодирующая последовательность белка КАР-2 включает по крайней мере любую одну из изоформ, аналогов, фрагментов и производных КАР-2 в соответствии с настоящим изобретением, которая способна связываться с К1Р.

(9) Способы выделения и идентификации белков в соответствии с настоящим изобретением, способных связываться с белком К1Р, включающих применение двухгибридной дрожжевой системы, в которой последовательность, кодирующая указанный белок К1Р входит в состав одного гибридного вектора, а последовательность из библиотеки кДНК или геномной клонотеки входит в состав второго гибридного вектора, при том, что эти векторы затем используются для трансформации дрожжевых клетокхозяев с выделением позитивно трансформированных клеток и последующей экстракцией упомянутого второго гибридного вектора для выделения последовательности, кодирующей белок, который связывается с упомянутым белком К1Р.

(10) Способ в соответствии с любым из перечисленных выше пп. (1)-(9), при том, что упомянутым белком КАР-2 являются любая из изоформ КАР-2, любой из его аналогов, фрагментов и производных.

(11) Способ в соответствии с любым из перечисленных выше (1)-(10), при том, что белок КАР-2 или любая из его изоформ, аналогов, фрагментов или производных вовлечены в модуляцию клеточного проявления, опосредуемого или модулируемого с участием любого другого медиатора или индуктора, с которым упомянутые белок КАР-2, его изоформа, аналог, фрагмент или производное способны связываться напрямую или опосредованно.

Настоящее изобретение также представляет фармацевтическую композицию, предназначенную для модулирования механизмов воспалений, гибели клеток и (или) выживания клеток, опосредуемых влиянием белков семейства ΤΝΡ на клетки через воздействие на белок К1Р или влиянием любого иного медиатора или индуктора на клетки в соответствии с указывавшимся выше, содержащую в качестве активного компонента одно из следующего:

(1) белок КАР-2 в соответствии с настоящим изобретением и биологически активные фрагменты, аналоги, производные и их смеси;

(2) рекомбинантный вектор на основе вируса животного, кодирующий белок, способный связываться на поверхностно-клеточном рецепторе, и кодирующий белок КАР-2 или биологические активные фрагменты или аналоги по настоящему изобретению;

(3) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность последовательности белка КАР-2 по настоящему изобретению, при том, что указанный олигонуклеотид может являться второй последовательностью в составе вышеупомянутого (2) рекомбинантного вектора на основе вируса животного.

Также настоящее изобретение представляет:

I. Способ модулирования воспаления, внутриклеточных механизмов гибели клеток и (или) выживания клеток, модулируемых/опосредуемых белком К1Р, или влияния на клетки любого другого медиатора или индуктора, или любого иного индуктора или ингибитора транскрипционного фактора ΝΡ-κΒ, включающий обработку упомянутых клеток в соответствии со способом по любому из приведенных выше пп.(1)-(10) белками КАР-2, его изоформами, аналогами, фрагментами или производными или последовательностями, кодирующими белки КАР-2, его изоформы, аналоги или фрагменты, при том, что упомянутая обработка обусловливает усиление или подавление упомянутого К1Р-опосредованного эффекта, а тем самым и эффекта, опосредованного РА8-К или р55-К, или упомянутым другим медиатором или индуктором, или иным индуктором или ингибитором ΝΡ-κΒ.

II. Способ, такой же как указанный выше, при том, что упомянутые белок КАР-2, его аналог, фрагмент или производное являются той частью белка КАР-2, которая специфически вовлечена в связывание с К1Р или с упомянутым другим медиатором или индуктором, или иным индуктором или ингибитором ΝΡ-κΒ, или упомянутая последовательность белка КАР-2 кодирует ту часть белка КАР-2, которая специфически вовлечена в связывание с К1Р или с упомянутым другим медиатором или индуктором, или иным индуктором или ингибитором ΝΡ-κΒ.

III. Способ, такой же как указанный выше, при том, что указанный белок КАР-2 представлен любой из изоформ КАР-2, при том, что упомянутые изоформы способны усиливать эффект действия К!Р.

IV. Способ, такой же как указанный выше, при том, что указанный белок КАР-2 является любой из изоформ КАР-2, при том, что упомянутые изоформы способны подавлять действие К!Р или действие на клетки другого медиатора или индуктора, тем самым также подавляя действие РА8-К или р55-К на клетки или действие на клетки иного цитотоксического медиатора или индуктора.

V. Способ, такой же как указанный выше, при том, что упомянутые белок КАР-2, его изоформа, аналог, фрагмент или производное способны усиливать или подавлять К!Рассоциированное влияние на воспаление и ме21 ханизм выживания клеток за счет прямого или опосредованного подавления ΝΡ-κΒ или прямой или косвенной активации киназы 1ΝΚ и р38.

Выделение белков КАР-2, их идентификация и охарактеризование могут быть осуществлены с применением любой из стандартных процедур, используемых для выделения и идентификации белков, например, двухгибридной дрожжевой системы, методов аффинной хроматографии и любых других хорошо известных стандартных процедур, применяемых для подобных целей.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения сам по себе белок КАР-2 или его изоформа, фрагмент или производное применяются в качестве «приманки» в двухгибридной дрожжевой системе для поиска белков, с ними связывающихся.

Белки, которые связываются с КАР-2, его изоформами, фрагментами или производными, также входят в объем настоящего изобретения.

Другие аспекты и варианты настоящего изобретения также представляются с учётом изложенного в нижеследующем подробном описании настоящего изобретения.

Необходимо отметить, что при использовании на протяжении данного текста термины «модуляция/опосредование К1Р, или ЕА8лиганда, или влияние ΤΝΡ на клетки», а также любые другие, например «модуляция/опосредование», используемые в описании, призваны охватить как обработку ίη νίίτο, так и ίη νίνο, а также, помимо того, подавление или усиление/обусловливание.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 (А, В) (8ЕО ΙΌ N0 1) показана нуклеотидная последовательность гена КАР-2: старт- и стоп-кодоны подчеркнуты. Стрелка указывает на начало 1500-нуклеотидного клона, полученного при двухгибридном скрининге.

На фиг. 2 (А, В) (8Е0 ΙΌ N0 2) показана нуклеотидная последовательность клона № 41072 (см. пример 1): старт- и стоп-кодоны подчеркнуты.

На фиг. 3 А (/1, /2) показаны расшифрованные аминокислотные последовательности сплайсинговых вариантов человека (полный 20.4 и Нитап кйй) и мыши (полный ΝΕΜ0 и Мойке рай) КАР-2, а В (/1, /2) показывает опубликованную последовательность Е1Р-1, сопоставленную на основе программы, полученной от ВСМ 8еатсй Баипсйег (Вау1ог Со1. Мей., Ноикίοη, ΝΧ). Гомологичные аминокислоты обведены, идентичные аминокислоты затенены. Звездочки (В) обозначают предполагаемый мотив типа «лейциновой молнии» в последовательности Е1Р-2.

На фиг. 4 проиллюстрирована молекулярная характеристика КАР-2. На А показаны данные Нозерн-блоттинга ΜΤΝ Β1οΐ I (С1оп1ес11) человека с ДНК-фрагментом КАР-2. На В отображен анализ связывания КАР-2 с К1Р, подробно описанный в примере 3. На С определено взаимодействие NIΚ/-КАР-2, как и на В, за исключением того, что антитела анти-ЕЬАС были использованы в методе Вестерн-блоттинга с последующей иммунопреципитацией с антителом к гексагистидину. Стрелка обозначает положение иммунопреципитированных белков.

На фиг. 5 показан график негативной регуляции активации ΝΡ-κΒ и с-1ип действием различных стимулов под влиянием эктопической экспрессии КАР-2 в соответствии с описанным в примере 4. Клетки линии НЕК-293Т были трансфицированы по перемежающемуся типу репортерной плазмидой (ШУСТК-Ьис или СМУ-Ьис для варианта с ΝΡ-ΚΒ и САЕ4-Еис для варианта с с-1ип [В] тестов на активацию), экспрессирующим вектором для соответствующего индуктора и либо пустой плазмидой ^ΩΝΛ3 помечена на фигуре отдельно), либо плазмидой, кодирующей полноразмерный КАР-2 (рсКАР-2 помечена на фигуре плюсом). Уровень активации репортерного люциферазного гена выражали в «относительных люциферазных единицах» (К.Ь.И.).

На фиг. 6 показано, что КАР-2 проявляет сходную репрессивную активность в отношении ΝΡ-κΒ и с-1ип в широком диапазоне концентраций. Белок ТКАР2 был экспрессирован по перемежающемуся типу в клетках НЕК-293Т наряду с различными указанными количествами конструкций либо рсКАР-2 (смысловая), либо рсКАР2-а/к (антисмысловая). Для оценки активации ΝΡ-κΒ (А) и с-1ип (В) включали репортерные плазмиды, соответственно, рШУЕТК-Ьис и рСΛ^4-^ис. Люциферазный тест проводили в соответствии с описанным для фиг. 5 в примере 4.

На фиг. 7 показано, что КАР-2 обладает мощным потенциалом по сигналу к фосфорилированию с-1ип без нарушения уровня активации киназы 1ΝΚ1/2.

(А) Тотальные лизаты клеток НЕК-293Т, трансфицированных указанными экспрессирующими конструкциями либо с рсОХА3носителем, обозначенной на фигуре знаком «минус» (-), либо рсКАР-2, обозначенной на фигуре знаком «плюс» (+), были идентифицированы с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител к фосфорилированному 1ип в соответствии с описанным в примере 5. Контроль, показанный на нижнем рисунке, был повторно гибридизован с антителами к общему антигену с-1ип (ΝΕΒ).

(Β) Активированную 1ΝΚ1/2 из клеток НЕК-293Т, трансфицированных либо рсВНА^!. либо рсКАР-2, обработанных ΗτΤΝΡ-α с целью увеличения периода времени, выявляли с помощью Вестерн-блоттинга тотальных лизатов с использованием антител к фосфорилированной киназе 1ΝΚ, что подробно описано в примере 5.

(С) Клетки НЕК-293Т были котрансфицированы пустым вектором, ροΌΝΆ3 и рсК1Р в различных сочетаниях вместе с плазмидой, экспрессирующей ΗΆ-ΊΝΚ1. Затем ΊΝΚ1 иммунопреципитировали по его Ν-концевому маркеру НА, а ее способность фосфорилировать бактериальный очищенный химерный антиген С8Тίιιη определяли в киназном тесте ίη νίίτο. Продукты этой реакции анализировали методом электрофореза в 808-ПААГ. Стрелкой отмечен О8Т-1ип.

На фиг. 8 показано, что КАР-2 не конкурирует с ΝΕ-κΒ и АР-1 за связывание с ДНК. Клетки НЕК-293Т были трансфицированы указанными белками либо по отдельности (-), либо вместе с рсКАР-2 (+). Ядерные экстракты, полученные из этих клеток, инкубировали с ³²Рпомеченными олигонуклеотидами, включающими классические распознавательные последовательности для АР-1 (А) или для ΝΕ-κΒ (В). Продукты реакции анализировали электрофоретически в неденатурирующем ПААГ.

На фиг. 9 показано, что КАР-2 подавляет исходный уровень ΝΕ-κΒ в клетках НЕК-293Т и НеЬа, непостоянно трансфицированных различным количеством либо КАР-2 (смысловая), либо КАР-2-аА (антисмысловая). Все манипуляции были осуществлены в соответствии с описанным для фиг. 6 в примере 4.

На фиг. 10 (А, В) (8ЕО ΙΌ ΝΟ 3) показано частичная нуклеотидная последовательность клона № 10.

На фиг. 11 отображены функциональные свойства последовательных делеций КАР-2. На А дано схематическое представление последовательных С-концевых делеций в КАР-2. Все варианты укорочения сохраняют полностью Νконцевую часть КАР-2, в то время как их Сконцевые участки обозначены стрелками. Участки связывания К1Р, ΝΙΚ, ΙΚΚβ и Т1Р60 подчеркнуты. Три заштрихованных области соответствуют предполагаемым мотивами типа «лейциновой молнии». На В показан эффект сверхэкспрессии делеционных конструкций, описанных в А, на активацию ΝΕ-κΒ в клетках НЕК-293 Т под действием Ке1А, ТКАЕ2, ΤΝΕ и ΝΙΚ с использованием для ΝΕ-κΒ репортерной люциферазной плазмиды ШУ-ЕТК-Ьис. Уровень активации репортерного люциферазного гена выражали в «относительных люциферазных единицах» (К.Ь.И.).

На фиг. 12 показано картирование функциональных и связывающих участков в КАР-2:

(А) Различные делеции в составе КАР-2 были протестированы по их способности связывать указанные белки в трансфицированных клетках дрожжей (нечетные столбцы) и клетках млекопитающего НЕК-293Т (четные столбцы). В двух расположенных с правого края столбцах показана способность одних и тех же делеций, трансфицированных в клетки НЕК-293Т в большом объеме, что подробно описано в примере 9, подавлять активацию ΝΕ-κΒ и обусловливать гиперфосфорилирование с-ίυη в ответ на обработку Т\Е-а, Выпуклость перекрестий пропорциональна интенсивности данного эффекта. Стрелки указывают на то, что наблюдаемые эффекты помеченных конструкций в отношении стимуляции Ке1А дифференцированы (см. фиг. 11В).

(В) Обобщающая схема, представляющая расположение связывающих (верхняя часть) и функциональных (нижняя часть) участков КАР2 в соответствии с данными делеционного анализа, показанного на (А), на протяжении осевой структуры данного белка. Заштрихованные участки указывают на возможное положение границ соответствующих минимальных сегментов.

На фиг. 13 показано, что остаток серина148 в последовательности КАР-2 существен для его способности индуцировать гиперфосфорилирование по остатку серина-63.

Показан Вестерн-блот, в котором «\\1» обозначает дикий тип, 8148Ε обозначает замену серина на аланин в 148-м положении, а «\^гес1ог» соответствует контрольному («пустому») вектору.

Подробное описание изобретения

В одном из своих аспектов настоящее изобретение касается новых белков КАР-2, которые способны связываться с белком К1Р, тем самым опосредуя или модулируя внутриклеточную активность К1Р, особенно тогда, когда К1Р вовлечен в модуляцию или опосредование механизмов воспалений, гибели клеток и (или) выживания клеток, что подробно было описано выше. Таким образом, КАР-2 может подавлять активность К1Р в механизмах гибели клеток, воспалений и выживания клеток, КАР-2 может усиливать активность К1Р в механизмах воспалений, гибели или выживания клеток, или же он усиливает активность К1Р в одном из этих механизмов, подавляя его в других механизмах.

Более конкретно, в соответствии с настоящим изобретением представляется новый белок КАР-2. Белок КАР-2 был секвенирован и охарактеризован, и было установлено, что КАР-2 является К1Р-связывающимся белком, характеризующимся специфичностью в отношении К1Р, но не проявляет свойств связывания в отношении ряда белков, для которых известно участие во внутриклеточных сигнальных механизмах, которые связаны с воспалительными процессами, гибелью клеток или выживанием клеток. Также КАР-2, по-видимому, не имеет в своём составе доменов, обычных для белков, которые активны в каком-либо из этих механизмов, т.е. КАР-2 не включает мотива или модуля «домена гибели», он не включает киназного мотива или домена и он не включает протеазного мотива или домена. Установленная последовательность КАР-2 также является уникальной последовательностью в отношении использовавшихся для сравнения последовательностей из ряда баз данных, включая СспсВапк и базы данных Нитап Се по те 1еуе1 1 и «бЬеР». Как уточнялось выше (также со ссылкой на все упоминавшиеся публикации и патентные заявки) К1Р вовлечен во внутриклеточные механизмы воспаления, гибели клеток и выживания клеток. Следовательно, регуляция или контроль активности К1Р могут влиять на любой из этих механизмов или на все эти механизмы тогда, когда они инициируются, например, в ответ на связывание ΤΝΒ или РЛ8-лиганда на своих рецепторах (в частности, на р55-К, как рецепторе ΤΝΓ). К1Р может играть ключевую роль в определении того, какой механизм активируется в большей степени, что определяется способностью к связыванию с рядом цитотоксических белков, включающих в своей последовательности «гибельные домены», а также с рядом белков, обладающих киназной активностью. Соответственно, такие белки как белок КАР-2 по настоящему изобретению, которые могут специфически связываться с К1Р, могут играть важную роль в модулировании активности К1Р, тем самым модулируя степень индукции одного из указанных механизмов по сравнению с другими. Следовательно, белок К.ЛР-2 по настоящему изобретению представляет собой важнейший модулятор или медиатор внутриклеточных сигнальных путей.

В дополнение к полноразмерному белку КАР-2 по настоящему изобретению были клонированы более короткие кДНК, для которых было установлено наличие «блоков» последовательностей, производных от некоторых взаимоудалённых участков «полной» кДНК, причиной чего может являться альтернативный сплайсинг того же самого гена. Мышиный гомолог гена КАР-2 человека был идентифицирован в аналогичном скрининге пула маркёров Ε8Τ мыши. Как было установлено, частичная последовательность кДНК мыши по сути идентична своему гомологу человека на участке кодирующей рамки.

Физиологическое значение взаимодействия К1Р/КАР-2 было дополнительно подтверждено при трансфицировании клеток линий НЕК-293Т и НеЬа. Однако образование такого комплекса не приводило к каталитической активности К1Р, на что указывало отсутствие фосфорилирования КАР-2 при сверхэкспрессии К1Р.

Эксперименты по трансфекции в клетках НЕК-293Т млекопитающего также подтвердили образование стабильного комплекса белков КАР-2/ΝΙΚ.

КАР-2, по-видимому, является ключевым элементом передачи сигналов в цепи факторов

ΝΡ-ΚΒ и с-Рш поскольку он связывается с ΝΙΚ,

ΙΚΚβ и Т1Р60 (ацилтрансфераза гистонов) и модулирует транскрипцию, зависимую от ΝΡκΒ и с-Рш Действительно, усиленная эктопическая экспрессия КАР-2 обусловливает подавление связанного с ΝΡ-κΒ ответа, в то время как удаление этого белка из клетки с применением антисмысловой конструкции обусловливает усиление трансактивации ΝΡ-κΒ и с-Рш

Также было установлено, что КАР-2 обладает потенциалом по гиперфосфорилированию е-Р.11'1. которое не опосредуется активностью киназы ΡΝΚ. КАР-2 не подавляет связывание сР1П и Ке1А с ДНК. Связывающие и функциональные домены в составе КАР-2 были идентифицированы при секвенировании делеционных вариантов. Эти исследования позволили установить, что участки связывания К1Р, ΝΙΚ и Т1Р60 перекрываются и находятся в районе аминокислотных остатков 95-264 последовательности КАР-2. Последующие функциональные эффекты, опосредуемые белком КАР-2, однако, как было выяснено, связаны с Ν-концевым доменом данного белка, охватываемого аминокислотами 1-264.

С точки зрения высказанного выше, КАР2, по-видимому, является ключевым элементом процессов регуляции сигналов в механизме реакции на стрессы: эктопическая экспрессия смысловой конструкции подавляет ответ, в то время как антисмысловая конструкция усиливает такой ответ. Действительно, КАР-2 также известен в лаборатории, в которой работают заявители, как белок КАТ (белок-аттенюатор К1Р): поэтому в данном тексте он также обозначается как КАТ и (или) КАТ-303, и (или) клон 303.

Существование множественных сплайсинговых вариантов указывает на то, что, по крайней мере отчасти, «разветвленный» эффект действия КАР-2 при конкретных условиях, повидимому, определяется присутствием нескольких «блоков последовательностей», которые являются необходимыми для связывания, мечения, перемещения и модификации данного белка в виде его преобладающей изоформы. Например, если, действительно, связывание КАР-2 с Т1Р60 определяется ядерной локализацией КАР-2, то можно предположить, что варианты КАР-2 с утраченным при сплайсинге сигнале ядерной локализации (ΝΕ8) могут превращаться в дефектные, или, с другой стороны, чрезвычайно активные в подавлении ΝΡ-κΒ/ΆΓ-1 варианты. Проведенное секвенирование не показало того, что КАР-2 включает несколько кластеров положительно заряженных аминокислот (глутаминовая кислота, лизин и аргинин), характерных для большинства известных сигнальных мотивов ΝΕ8.

Связывание КАР-2 с К1Р было установлено по тому участку белка КАР-2, который начинается на аминокислотах 177-218 и заканчивается на 264-й аминокислоте. К1Р-связывающий домен в составе КАР-2 не перекрывается ни с сай27 том связывания ΙΚΚβ, ни с сайтом связывания ΝΙΚ.

Связывание с ΤΙΡ60, являющимся членом семейства ядерных белков, определяемых как ацетилтрансферазы гистонов, картируется на участке, соответствующем аминокислотам 95264. Участок, вовлеченный в гомодимеризацию, был установлен на аминокислотах 217-264.

Накопленные данные подтверждают, что все функциональные проявления ΒΑΡ-2 (а именно подавление ΝΕ-κΒ и индукция гиперфосфорилирования с-1ии) картируются на одном и том же участке.

Белок, кодируемый клоном № 10, повидимому, связывается на участке, начинающемся между аминокислотами 218-309 и заканчивающемся на аминокислоте 416, а, следовательно, его связывающий сайт может включать перекрывающиеся участки сайтов связывания с ΒΙΡ, ΝΙΚ, ΙΚΚβ и ΤΙΡ60.

Далее, возможно, что участок, существенный в связи с эффективной модуляцией сигналов, обусловливаемых всеми индукторами, находится в Ν-концевом участке данного белка.

Участок, покрываемый аминокислотами 95-416, обладает некоторым эффектом, который, однако, существенно слабее по сравнению с тем, который обусловливается полноразмерным белком, что, следовательно, может определяться усиленной агрегацией эндогенного белка ΒΑΡ-2.

Более того, за исключением Ве1А, все индуцированные в проведённых заявителями экспериментах эффекты могут быть вызваны по минимуму приблизительно сотней Ν-концевых аминокислот последовательности белка ΒΑΡ-2. Действительно, даже фрагмент с аминокислотами 1-102 обусловливает отчетливый эффект, хотя и весьма средний по силе.

С другой стороны, подавление Ве1Аопосредованного эффекта требует присутствия большей части белка ΒΑΡ-2. В связи с этим заявителями были определены границы такого участка в составе аминокислот 1-264, который, повидимому, придает аминокислотам участка 157264 некоторые специфичные связывающие свойства, ассоциированные с фактором Ве1А.

С точки зрения описанных выше наблюдений предполагается следующее:

(а) за исключением Ве1А, связывание ΒΑΡ2 с ΒΙΡ, клоном № 10 и, что наиболее вероятно, с ΝΙΚ и ΤΙΡ60 не является обязательным для функционирования данного белка в качестве ингибитора сверхэкспрессии, индуцируемой фактором ΝΕ-κΒ;

(б) влияние ΒΑΡ-2 на индуцируемую сверхэкспрессией Κ^1Α активацию, очевидно, по крайней мере отчасти, обусловливается отличающимися событиями связывания. По сути все упоминавшиеся выше белки могут определяться как факторы данной активности, на что указы вают данные экспериментов, проведённых к настоящему времени.

Благодаря уникальной способности ΕΑ8-Β и рецепторов ΤΝΕ обусловливать гибель клеток, равно как и способности рецепторов ΤΝΕ опосредовать различные тканеповреждающие эффекты, нарушение функций этих рецепторов может быть вредным для организма. Действительно, и избыточная, и недостаточная функция таких рецепторов, как было установлено, обусловливает патологические проявления при различных заболеваниях. Идентификация молекул, которые участвуют в сигнальных путях этих рецепторов, и обнаружение механизмов модулирования функций этих молекул представляет возможный ключ к новых терапевтическим приемам в отношении таких заболеваний. С точки зрения предполагаемой важной роли ΒΙΡ в проявлении токсичности рецепторами ΕΑ8-Β и ρ55-Β и, следовательно, важной регуляторной роли ΒΑΡ-2 рецепторов ΕΑ8-Β и ρ55-Β через модуляцию ΒΙΡ, представляется важным создать лекарственные средства, которые бы могли блокировать цитотоксические функции ΒΙΡ, возможно, за счет блокировки связывания ΒΑΡ-2 с ΒΙΡ или подавления каким-либо иным путём взаимодействия между ΒΑΡ-2 и ΒΙΡ при тех условиях, при которых ΒΑΡ-2 выступает в качестве усилителя ΒΙΡ-опосредованной цитотоксичности (как отмечалось выше, Κ1Ρ является цитотоксичным сам по себе и в сочетании с другими белками, в последовательности которых имеются «гибельные домены»).

Подобным же образом известно (см. выше), что рецепторы ΕΑ8-Β и ρ55-Β вовлечены в активацию транскрипционного фактора ΝΕ-κΒ и тем самым в обеспечение жизнеспособности (выживание) клеток. Следовательно, когда желательным является уничтожение клеток, например, опухолевых клеток, ВИЧинфицированных клеток и подобного, то желательным должно быть усиление цитотоксического действия ΕΑ8-Β и ρ55-Β (и ассоциированных с ними белков, таких, как, например, ΜΟΒΤ-1, ΜΑ0Η, Мс114. С1, ΤΒΑΌΌ), в то же время связанное с подавлением их способность индуцировать ΝΕ-κΒ. Следовательно, когда взаимодействие или связывание ΒΑΡ-2 с ΒΙΡ обусловливает способствование вероятной функции ΒΙΡ в усилении индукции ΝΕ-κΒ (возможно, через белок ΤΒΑΕ2 и, по-видимому, через киназный домен и/или промежуточный домен белка ΒΙΡ), то желательной может быть блокировка такого взаимодействия между ΒΑΡ2 и ΒΙΡ с целью подавления или, по крайней мере, для предотвращения способствования активации ΝΕ-κΒ, тем самым добиваясь сдвига в балансе эффектов, индуцируемых ΤΝΕ или лигандом ΕΑ8 в сторону проявления цитотоксичности, которые в конечном счёте приводили бы к гибели клеток.

Сходным образом при противоположной ситуации (по отношению к описанному выше), когда связывание ВАР-2 с В1Р реально обусловливает подавление воспалительных или цитотоксических эффектов РА8-В и р55-В и когда желательным является заблокировать их цитотоксическое действие, например, при воспалениях, различных аутоиммунных заболеваниях и при подобном, при которых нужна повышенная жизнеспособность клеток, то важным является создание лекарственных средств, которые бы усиливали взаимодействие между ВАР-2 и В1Р с целью усиления общего уровня подавления гибели клеток и сдвига в балансе в сторону выживания клеток. Также ясно, в свете сказанного выше, что при том, что взаимодействие ВАР-2 с В1Р обусловливает подавление функций В1Р в отношении активации ΝΡ-κΒ, то, когда желательным является сохранение жизнеспособности клеток, необходимой является блокировка данного взаимодействия между ВАР-2 и В1Р, что тем самым усиливает активность В1Р по способствованию активации ΝΡ-κΒ.

В связи со всем сказанным выше, можно заключить, что В1Р характеризуется ключевой ролью в поддержании баланса между индукцией и опосредованием механизмов воспаления, гибели клеток или выживания клеток: следовательно, ВАР-2 обладает аналогично важной ролью, будучи модулятором белка В1Р. Воздействие на взаимодействие/связывание ВАР-2/В1Р с использованием различных лекарственных средств или приемов в соответствии с описываемым выше и далее обеспечит возможность сдвига во внутриклеточных сигнальных механизмах от гибели клеток к выживанию клеток, и наоборот, если это представляется желательным.

Также настоящее изобретение касается последовательности ДНК, кодирующей белок ВАР-2, а также белков ВАР-2, кодируемых такими последовательностями ДНК.

Более того, настоящее изобретение дополнительно касается последовательностей ДНК, кодирующих биологически активные аналоги, фрагменты и производные белка ВАР-2, а также сами аналоги, фрагменты и производные, ими кодируемые. Получение таких аналогов, фрагментов и производных осуществляется стандартными методами (см., например, руководство 8атЬтоок е1 а1., 1989), в которых в последовательности ДНК, кодирующей белок ВАР-2, один или большее число кодонов могут быть делетированы, добавлены или заменены другими с получением аналогов, характеризующихся, по крайней мере, заменой одного аминокислотного остатка по сравнению с нативным белком.

Среди названных выше последовательностей ДНК по настоящему изобретению, которые кодируют белок ВАР-2, его изоформу, аналог, фрагмент или производное, также, как вариант настоящего изобретения, включаются последовательности ДНК, способные гибридизоваться с последовательностью кДНК, производной от кодирующего сегмента нативного гена белка ВАР-2, при том, что такую гибридизацию проводят в условиях средней степени жёсткости, а гибридизуемые последовательности ДНК кодируют биологически активный белок ВАР-2. Такие гибридизуемые последовательности ДНК, следовательно, включают последовательности ДНК, которые характеризуются относительно высоким уровнем гомологии с нативной последовательностью кДНК ВАР-2, а раз так, то представляют собой ВАР2-подобные последовательности, которые могут являться, например, естественно производными последовательностями, кодирующими различные изоформы ВАР-2, или нативными последовательностями, кодирующими белки, относящиеся к группе ВАР2-подобных последовательностей, кодирующих белок, обладающий активностью белка ВАР-2. Кроме того, эти последовательности могут включать, например, ненативные синтезированные искусственным путём последовательности, которые сходны с нативной последовательностью кДНК ВАР-2, но при этом включают ряд желательных модификаций. Такие синтетические последовательности, следовательно, включают все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные ВАР-2, при том, что все они обладают активностью белка ВАР-2.

Для получения различных вышеупомянутых естественно встречающихся ВАР2подобных последовательностей стандартные процедуры скрининга и выделения нативных образцов ДНК или РНК из различных тканей могут быть применены с использованием нативной кДНК ВАР-2 или ее фрагментов в качестве зонда (см. примеры стандартных процедур, описанных у 8атЬтоок е! а1., 1989).

Таким же образом для получения упоминавшихся выше различных синтетических ВАР2-подобных последовательностей, кодирующих аналоги, фрагменты или производные ВАР-2 ряд стандартных методов может быть использован в соответствии с подробно описанным здесь ниже с целью получения таких аналогов, фрагментов и производных.

Полипептид или белок, который «в существенной степени соответствует» белку ВАР-2, включает не только сам белок ВАР-2, но также и полипептиды или белки, которые являются аналогами ВАР-2.

Аналоги, которые в существенной степени соответствуют белку ВАР-2, являются теми полипептидами, в составе которых одна или большее число аминокислот нативной аминокислотной последовательности белка ВАР-2 заменены на другие аминокислоты, делетированы и (или) добавлены, в результате чего получающийся в результате белок проявляет по сути такую же или более высокую биологическую активность белка КАР-2, которому они соответствуют.

С целью достижения существенного соответствия белку КАР-2 изменения в составе последовательности белков КАР-2, таких как его изоформы, должны быть, в принципе, небольшими. Хотя число таких изменений может превышать десять, предпочтительно, чтобы таких изменений было менее десяти, более предпочтительно - не более пяти, а наиболее предпочтительно - не более трех таких изменений. При том, что любой метод может быть применен для поиска потенциально биологически активных белков, которые бы соответствовали белкам КАР-2, одним из таких методов является применение стандартных приемов мутагенеза в отношении ДНК, кодирующей данный белок, с получением в результате небольших модификаций. Эти белки, экспрессируемые такими клонами, затем могут быть подвергнуты скринингу по их способности связываться с К1Р и модулировать активность К1Р в отношении модулирования/опосредования внутриклеточных механизмов, описывавшихся выше.

«Консервативными» заменами являются такие изменения, которые в связи с ожидаемыми последствиями не приведут к изменениям активности данного белка и которые обычно первыми подвергаются проверке потому, что они не обусловливают существенных изменений в размере, заряде или конНа Фигуреции данного белка, что, следовательно, как ожидается, не приведет к изменению его биологических свойств.

Консервативные замены белков КАР-2 включают аналог, при том, что по крайней мере один аминокислотный остаток в составе полипептида был по консервативному типу заменен на отличающуюся аминокислоту. Такие замены предпочтительно выполняют в соответствии со следующим перечнем, показанным в табл. 1А, при том, что замены могут быть определены в рутинных опытах с целью обеспечения структурных и функциональных свойств синтезированной полипептидной молекулы с сохранением той биологической активности, которая характерна для белка КАР-2.

Таблица 1А

Исходный остаток	Пример замены
аланин	глицин, серин
аргинин	лизин
аспарагин	глутамин, гистидин
аспарагиновая кислота	глутаминовая кислота
цистеин	серин
глутамин	аспарагин
глутаминовая кислота	аспарагиновая кислота
глицин	аланин, пролин
гистидин	аспарагин, глутамин
изолейцин	лейцин, валин
лейцин	изолейцин, валин
лизин	аргинин, глутамин, глутаминовая кислота

метионин	лейцин, тирозин, изолейцин
фенилаланин	метионин, лейцин, тирозин
серин	треонин
треонин	серин
триптофан	тирозин
тирозин	триптофан, фенилаланин
валин	изолейцин, лейцин

С другой стороны, иная группа замен в белке КАР-2 представлена теми заменами, в результате которых по крайней мере один аминокислотный остаток в данном полипептиде удаляется, а отличающийся остаток встраивается на его место в соответствии с табл. 1В. Типы замен, которые могут быть произведены в составе данного полипептида, могут быть основаны на анализе частот аминокислотных замен при сравнении гомологичных белков у разных видов, таких, как те, которые показаны в табл. 1-2 у О.Е.ЗсЬиЬ е1 а1., 1978, «Рг1пс1р1ек οί Рго1еш 81гис1иге», 8ргтдег-Уег1ад, Ыете Уогк, ΝΥ и на фиг. 3-9 у Т.Е. Сге1дЙоп, 1983, «Ргсйенъ: 81гис1иге апб Мо1еси1аг Ргорегбек», XV.Н. Ргеешап & Со., 8ап Ргапсксо, СА. Основываясь на подобном анализе, альтернативные консервативные замены определены здесь как замены в пределах одной из 5 групп.

Таблица 1В

1.	Небольшие алифатические, неполярные или слабополярные остатки: аланин, серин, треонин (пролин, глицин)
2.	Нолярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: аспарагин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глутамин
3.	Полярные, положительно заряженные остатки: гистидин, аргинин, лизин
4.	Крупные алифатические неполярные остатки: метионин, лейцин, изолейцин, валин (цистеин)
5.	Крупные ароматические остатки: фенилаланин, тирозин, триптофан

Три аминокислотных остатка, заключенные в приведенной выше таблице в скобки, играют специфическую роль в архитектуре белка. Глицин является единственным остатком, не имеющим боковой цепи и поэтому обеспечивающим гибкость цепочке. Это, однако, обусловливает тенденцию образования иной вторичной структуры, нежели α-спиральной. Пролин, благодаря своей необычной геометрии, значительно уплотняет цепочку, обусловливая тенденцию образования структур типа βизгибов, хотя в некоторых случаях цистеин может быть способен участвовать в формировании дисульфидных связей, которые играют важную роль в укладке и поддержании пространственной структуры белка (в его «фолдинге») . Надо заметить, что в цитировавшейся выше публикации 8с1ш1х е1 а1. приведенные выше группы 1 и 2 объединены. Также надо заметить, что тирозин за счет его способности образовывать водородные связи характеризуется существенным сходством с серином и треонином и т. д.

Консервативные аминокислотные замены в соответствии с настоящим изобретением, например, так, как отмечалось выше, известны в данной области техники, поэтому можно ожидать, что будут сохранены биологические и структурные свойства данного полипептида после такой аминокислотной замены. Большинство делеций или замен в соответствии с настоящим изобретением являются такими, которые не приводят к резким изменениям в параметрах данного белка или полипептидной молекулы. Эти «параметры» определяются таким образом, чтобы учесть и изменения во вторичной структуре, например, таких как α-спирали или β-плоскости, и изменения в биологической активности, например, в связывании с К1Р и (или) опосредовании влияния К1Р на гибель клеток.

Примерами произведения аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения аналогов белков КАР-2 с целью их использования в соответствии с настоящим изобретением, включают любые известные методы, такие как представленные в патентах США №№ КЕ-33653, 4959314,

4588585 и 4737462, выданные Мегк е! а1., 5116943, выданный Ко!кв е! а1., 4965195, выданный №ипеп е! а1., 4879111, выданный Скоид е! а1., и 5017691, выданный Ьее е! а1.; а также замещенные по лизину белки, представленные патентом США № 4904584 (выдан 81ιη\ν е! а1.).

Помимо консервативных замен, обсуждавшихся выше, которые в существенной степени не изменяют активности белка КАР-2, также либо консервативные замены, либо менее консервативные и в большей степени случайные замены, которые приводят к усилению биологической активности аналогов белков КАР-2, входят в масштаб настоящего изобретения.

После того, как точный эффект замены или делеции подтверждён, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что такой эффект замены (замен), делеции (делеций) и т.п. должен быть оценен с применением рутинных тестов на связывание и гибель клеток. Скрининг на основе стандартного теста не будут включать каких-либо незапланированных дополнительных экспериментов.

Приемлемыми аналогами КАР-2 являются такие аналоги, которые сохраняют, по крайней мере, способность связываться с К1Р, тем самым, как отмечалось выше, опосредуя активность К1Р в отношении внутриклеточных механизмов, описывавшихся выше. В этом смысле могут быть получены аналоги, которые будут обладать т.н. «доминантно-негативным проявлением», а именно такой аналог будет дефектным либо по связыванию с К1Р, либо по последующей выработке сигнала, либо по любой другой активности, являющейся следствием такого связывания. Такие аналоги могут быть исполь зованы например, для подавления проявлений К1Р или для подавления индукции ΝΡ-κΒ (прямой или опосредованной), обусловливаемой К1Р, что зависит от того, какая из этих активностей является основной из опосредуемых взаимодействием КАР-2 и К1Р (см. выше), что будет обусловливаться такими аналогами за счет их конкуренции с нативным КАР-2 за связывание с К1Р.

На генетическом уровне такие аналоги обычно получают с применением метода направленного мутагенеза в отношении нуклеотидов в составе ДНК, кодирующей белок КАР-2, тем самым образуя ДНК, которая кодирует аналог, после чего синтезируют такую ДНК и экспрессируют полипептид в рекомбинантной клеточной культуре. Обычно такие аналоги проявляют такую же или повышенную биологическую активность по сравнению с нативным белком: Аи8иЬе1 е! а1., 1987/1995, «Сштеи! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду» Сгееие РиЬ1. & \УПеу 1и!ег8С1., №\ν Уогк, ΝΥ; 8атЬгоок е! а1., 1989, «Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1», Со1б 8рг1ид НагЬог ЬаЬ., Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ.

Получение белка КАР-2 в соответствии с изложенным здесь или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей такой же полипептид, но отличающейся от нативной последовательности из-за изменений, определяемых известной вырожденностью генетического кода, может быть осуществлено с применением метода направленного (сайтспецифичного) мутагенеза той ДНК, которая кодирует ранее полученный аналог или нативный вариант белка КАР-2. Метод направленного мутагенеза позволяет получать аналоги путем использования специфичных олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК, включающую желательную мутацию, равно как и достаточное количество соседних с ней нуклеотидов, с целью получения последовательности затравки необходимой длины и состава для получения стабильного дуплекса по обе стороны от имеющегося делеционного стыка. Обычно предпочтительными являются затравки, состоящие примерно из 20-25 нуклеотидов, при том, что по 510 комплементарных нуклеотидов на каждой стороне последовательности изменены. В целом, метод направленного мутагенеза хорошо известен в науке, примером чему может служить публикация Абе1таи е! а1., 1983, ΟΝΛ. 2, 183, содержание которой включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки.

Как должно быть понятно, метод направленного мутагенеза обычно основан на использовании фагового вектора, который существует и в одноцепочечной, и в двухцепочечной формах. Обычными векторами, применяемыми в методе направленного мутагенеза, являются такие векторы, как фаг М13, например, в соответствии с изложенным у Меззтд е! а1., 1981, 1и «36 С1еуе1апб 8утр. Масгото1еси1е§ & КесотЬтап! ΩΝΛ». еб. А. \Уа11оп. ЕГеОег. Атйегбат, содержание которой включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Этот фаг легко доступен на коммерческой основе и его использование, в принципе, хорошо известно специалистам в данной области техники. С другой стороны, плазмидные векторы, которые включают одноцепочечный сайт начала репликации ^епа е! а1., 1987, Ме!1. ЕпгутоЕ, 153, 3), могут быть использованы для получения одноцепочечной ДНК.

В целом, метод направленного мутагенеза в связи с описываемым в данном тексте осуществляют изначально путем получения одноцепочечного вектора, который включает в своей последовательности последовательность ДНК, которая кодирует искомый полипептид. Олигонуклеотидную затравку, несущую желательным образом мутировавшую последовательность, получают синтетическим путем с помощью автоматического полинуклеотидного синтеза. Затем эту затравку отжигают на одноцепочечный вектор, включающий кодирующую белок последовательность, и обрабатывают ферментами с ДНК-полимеразной активностью, такими как фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I Е.сой, с целью завершения синтеза цепи, включающей мутацию. Таким образом, мутантная последовательность и вторая цепь несут желательную мутацию. Такой гетеродуплексный вектор затем используют для трансформации подходящих клеток, таких как клетки Е.со11 штамма 6М101, а после этого отбирают те клоны, которые несут рекомбинантные векторы, включающие желательную мутантную последовательность.

После отбора такого клона мутантная последовательность белка КАР-2 может быть выделена и встроена в состав подходящего вектора - обычно трансферного или экспрессирующего вектора такого типа, который может быть использован для трансфекции подходящего организма-хозяина.

Таким образом, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие белок КАР-2, также может быть детектирован, получен и (или) модифицирован ίη уйго, ίη 8Йи и (или) ίη у1уо с применением известных методов амплификации ДНК или РНК, таких как ПЦР и химический синтез олигонуклеотидов. ПЦР обеспечивает амплификацию (увеличение в количестве) конкретных последовательностей ДНК за счет повторяющихся реакций полимеризации ДНК. Эта реакция может быть использована вместо клонирования: единственно что для этого требуется, это установление нуклеотидной последовательности. С целью осуществления ПЦР затравки конструируют таким образом, чтобы они были комплементарны представляющей интерес последовательности. Затем затравки получают путем автоматического синтеза ДНК. Поскольку затравки могут быть выстроены таким образом, чтобы гибридизовать с любым участком данного гена, то могут быть выбраны такие условия, что могут возникать ошибки при спаривании комплементарных оснований. Амплификация этих ошибочных участков может приводить к синтезу мутантного продукта, в результате чего будет образовываться пептид, характеризующийся новыми свойствами (т.е. это и будет направленный мутагенез): см. также, например, Аи8иЬе1, цит. выше, глава 16. Также путем сочетательного синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы в ПЦР в качестве исходного материала может быть использована РНК для целей синтеза внутриклеточного домена рецептора пролактина без клонирования.

Более того, ПЦР-затравки могут быть сконструированы таким образом, чтобы включать новые рестрикционные сайты или другие элементы, такие как стоп-кодоны, по концам генного сегмента, который будет амплифицироваться. Такое внесение рестрикционных сайтов по 5'- и 3'-концам амплифицированной генной последовательности обеспечит генному сегменту, кодирующему белок КАР-2 или его фрагмент, возможность лигирования на другие последовательности и (или) по сайтам клонирования в составе векторов.

ПЦР и другие методы амплификации РНК и (или) ДНК хорошо известны в науке и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без дополнительных экспериментов, основываясь на представленной здесь информации. Известные методы амплификации ДНК и РНК включают, тем самым не ограничиваясь, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и сходные амплификационные процессы (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, выданные МиШ§ е! а1., 4795699 и 4921794, выданные ТаЬог е! а1., 5142033, выданный ШпИ, 5122464, выданный ХУШоп е! а1., 5091310, выданный ЬтЕ, 5066584, выданный Су11еп51еп е! а1., 4889818, выданный Сейапб е! а1., 4994370, выданный 811уег е! а1., 4766067, выданный Βί5\ν35, 4656134, выданный К1пдо1б, а также [ηηίκ е! а1., (еб§.), «РСК Рго!осок: А Сшбе !о Ме11юб апб АррНсайопк») и опосредованную РНК амплификацию, в которой в качестве матрицы используется РНК, являющаяся антисмысловой по отношению последовательности-мишени, для целей синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238, выданный Ма1ек е! а1.: торговая марка способа NΛ8ΒΛ). и иммуно-ПЦР, в которой сочетается использование амплификации ДНК с мечением антител (Ки/юка е! а1., 1993, 8аепсе, 260, 487; 8апо е! а1., 1992, 8аепсе, 258, 120; 8апо е! а1., 1991, Β^о!есЬη^^ие8, 9, 1378), при том, что полное содержание этих патентов и научных публикаций включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Аналогичным образом биологически активные фрагменты белков КАР-2 (например, любых КАР-2 или его изоформ) могут быть получены в соответствии с описанным выше в отношении аналогов белков КАР-2. Подходящими фрагментами белков КАР-2 являются те фрагменты, которые сохраняют активность КАР-2 и которые могут модулировать или опосредовать биологическую активность К1Р или других белков, ассоциирующихся с К1Р напрямую или косвенно. Соответственно, могут быть получены такие фрагменты белков КАР-2, которые будут проявлять доминантно-негативный или доминантно-позитивный эффект так же, как было отмечено выше для аналогов. Необходимо отметить, что эти фрагменты представляют отдельный класс аналогов по настоящему изобретению, а именно они определяются как участки белков КАР-2, производные от полноразмерной последовательности белка КАР-2 (например, последовательности любого КАР-2 или их изоформ), при том, что каждый участок или фрагмент обладает любой из описывавшихся выше активностей. Такой фрагмент может быть, например, пептидом.

Сходным образом производные могут быть получены с помощью стандартных модификаций боковых цепей одного или большего числа аминокислотных остатков в составе белка КАР-2, его аналогов или фрагментов или путём соединения белка КАР-2, его аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.п., что хорошо известно в данной области техники. Соответственно, по использованию в данном тексте термин «производные» охватывает производные, которые могут быть получены на основе функциональных групп, которые имеются в составе боковых цепей остатков, находящихся на Ν- или С-концах, с применением известных в науке методов, и эти производные также попадают в объем настоящего изобретения. Производные могут являться химическими составляющими, такими как остатки углеводов и фосфатов, образуя фракцию, которая будет обладать такой же или более высокой биологической активностью по сравнению с белками КАР-2.

Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп за счет реакции с аммонийной группой с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные или свободные аминогруппы аминокислотных остатков, образуемые ацильными составляющими (например, алканоильными или карбоциклоароильными группами), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, у остатков серина или треонина), образуемые ацильными составляющими.

Термин «производные» призван включить только те производные, в которых не происходит замен одной аминокислоты на другую аминокислоту в пределах двадцати встречающихся в естественных условиях аминокислот.

КАР-2 является белком или полипептидом, например, последовательностью, составленной остатками аминокислот. Полипептид, включающий более крупные последовательности, которыми является полная последовательность белка КАР-2 в соответствии с данными здесь определениями, попадает в объем настоящего изобретения, если длина такого полипептида за счет имеющихся вставок не обусловливает нарушения основных и новых параметров по настоящему изобретению, т.е. если он либо сохраняет, либо усиливает биологическую активность белка КАР-2, или же он может быть расщеплён с образованием белка или полипептида, обладающего биологической активностью белка КАР-2. Таким образом, например, настоящее изобретение представляет химерные белки, включающие белок КАР-2 и другие аминокислоты или пептиды.

Новый белок КАР-2, его аналоги, фрагменты и производные могут характеризоваться рядом путей использования, например:

(1) белок КАР-2, его аналоги, фрагменты и производные могут быть использованы для модулирования функций белка К1Р в отношении механизмов либо воспалений, либо гибели клеток, либо выживания клеток в соответствии с описанным выше. Например, если КАР-2 может модулировать влияние К1Р на активацию транскрипционного фактора ΝΡ-κΒ, ΊΝΚ (киназы Чип) и киназы р38, то такие эффекты КАР-2 будут приводить к усилению такого взаимодействия КАР-2/К1Р, когда желательным будет использовать это в противоопухолевых, противо- и провоспалительных целях, против ВИЧ-инфекций и т. п. В этом случае белок КАР-2, его аналоги, фрагменты или производные, которые способны модулировать воспаления, усиливать цитотоксичность или блокировать эффект по поддержанию жизнеспособности клеток, могут быть внесены в клетки с помощью известных стандартных приемов. Например, когда белок КАР-2 является внутриклеточным (как предполагается) и должен быть внесен только внутрь тех клеток, на которые через К1Р влияют РА8-лиганд или ΊΝΕ, или другие цитотоксичные белки, то необходимо использовать систему специфического внесения такого белка в такие клетки. Одним из путей решения этой проблемы является создание рекомбинантного вируса животного, например, производного от вируса коровьей оспы, к ДНК которого должны быть присоединены два следующих гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается поверхностно-клеточными белками, специфически экспрессируемыми этими клетками, например, такой как белок др 120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), который специфически связывается на некоторых клетках (СП4-позитивные лимфоциты и родственные лейкозы), или любой иной лиганд, кото39 рый специфически связывается с клетками, несущими рецепторы РА8-К или р55-К, в результате чего рекомбинантный вирусный вектор будет способен связываться на таких клетках, несущих рецепторы РА8-К или р55-К; и ген, кодирующий белок КАР-2. Таким образом, экспрессия связывающегося на клеточной поверхности белка обеспечит вирусу специфичность в отношении опухолевой клетки или другой клетки, несущей рецепторы РА8-К или р55-К, как мишени, после чего последовательность, кодирующая белок КАР-2, будет внесена в клетки с помощью данного вируса, а после экспрессии в этих клетках произойдет усиление опосредованного белком К1Р влияния лиганда РА8-К или Т№ или независимого от К1Р такого влияния. Конструирование такого рекомбинантного вируса животных основывается на стандартных процедурах (см., например, 8атЬгоок е! а1., 1989). Другая возможность основана на внесении последовательностей белка КАР-2 (например, любого белка КАР-2 или их изоформ) в форме олигонуклеотидов, которые могут быть адсорбированы этими клетками с последующей их экспрессией внутри них.

(2) Они могут быть использованы для подавления влияния лиганда РА8-К, Т№ или родственного белка, опосредуемого белком К1Р или независимого от К1Р их влияния, например, в случаях повреждения тканей при септическом шоке, отторжении тканей при реакции «трансплантат против хозяина» или остром гепатите, при которых желательной является блокировка индуцируемых лигандом РА8-К или ΊΝΕ сигналов через рецепторы РА8-К или р55-К, или их независимого от К1Р влияния, или опосредуемого другими белками влияния при одновременном усилении механизма выживания клеток. В такой ситуации возможным является, например, внесение в клетки с помощью стандартных процедур олигонуклеотидов, включающих антисмысловые кодирующие последовательности белка КАР-2, которые бы эффективно заблокировали трансляцию мРНК, кодирующих белок КАР-2, тем самым блокируя его экспрессию и приводя к подавлению влияния лиганда РА8-К, ΈΝΕ, К1Р или других белков. Такие олигонуклеотиды могут быть внесены в клетки с использованием описанного выше подхода, основанного на рекомбинантных вирусах, при том, что второй последовательностью, включаемой в такой вирус, является данная олигонуклеотидная последовательность.

Подобно описанному выше образом, в зависимости от природы взаимодействия между КАР-2 и К1Р, с применением описанных выше подходов (1) и (2) возможным может быть усилить или подавить клеточные механизмы воспаления и выживания, если это является желательным.

Другая возможность определяется использованием антител, специфичных в отношении белка КАР-2, с целью подавления его внутриклеточной сигнальной активности.

Ещё одним путём подавления К1Ропосредованных проявлений или независимых от К1Р эффектов является применение недавно открытого рибозимного подхода. Рибозимы это каталитически активные молекулы РНК, которые специфически расщепляют другие РНК. Рибозимы могут быть выстроены искусственно так, чтобы расщеплять РНК-мишени по выбору, например, мРНК, кодирующие белок КАР-2 по настоящему изобретению. Такие рибозимы должны характеризоваться последовательностью, специфичной в отношении мРНК белка КАР-2, и должны быть способны взаимодействовать с ней (путём комплементарного связывания) с последующим расщеплением этой мРНК, в результате чего будет уменьшаться (или полностью утрачиваться) экспрессия белка КАР-2, при том, что степень такого уменьшения экспрессии будет зависеть от уровня экспрессии рибозима в клетке-мишени. Для внесения рибозимов в выбранные клетки (например, клетки, несущие рецепторы РА8-К или р55-К) может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмида, векторы на основе вирусов животных (ретровирусов), которые обычно используются для этих целей (см. также описанный выше п.(1), в котором вирус в качестве второй последовательности будет включать кДНК, кодирующую данную выбранную рибозимную последовательность). (В качестве обзоров, описывающих рибозимные методы, см. СНеп е! а1., 1992; 2Нао & Р1ск, 1993; 8 Ноге е! а1., 1993; 1о8ерй & Вигке, 1993; 8Ытауата е! а1., 1993; Сап!ог е! а1., 1993; Ваппада, 1993; С.’п5е11 е! а1., 1993; 1<о1/ит1 е! а1., 1993). Такой подход применим тогда, когда взаимодействие КАР-2/ШР усиливает цитотоксичность в ситуациях, когда желательным является заблокировать эту цитотоксичность, или когда взаимодействие КАР-2/К1Р подавляет активацию ΝΡ-кВ в такой же ситуации желательности блокировки такого подавления с целью интенсификации активации ΝΡ-ΚΒ, т.е. в обоих случаях желательным является повышение выживания клеток, как это описывалось в п.(2).

(3) Белок КАР-2, его аналоги, фрагменты или производные также могут быть использованы для целей выделения, идентификации и клонирования других белков того же самого класса, т. е. тех белков, которые связываются с белком К1Р или на функционально родственных рецепторах или белках, участвующих во внутриклеточных сигнальных механизмах. В таком применении может быть использована упоминавшаяся выше двухгибридная дрожжевая система, или может быть использована недавно разработанная система, основанная на нежестких условиях Саузерн-блот-гибридизации с последующим ПЦР-клонированием (^11к§ е! а1., 1989). В публикации Уилкса с соавт. описывается иден41 тификация и клонирование двух предполагаемых тирозинкиназ с применением нежесткой гибридизации по Саузерну с последующим клонированием на базе ПЦР, основанных на известной последовательности киназного мотива т.е. «заданной киназной последовательности». Такой подход может быть использован в соответствии с настоящим изобретением с использованием последовательности белка ΚΑΡ-2 с целью идентификации и клонирования родственных ΚΙΡ-связывающихся белков.

(4) Еще один подход к использованию белка ΚΑΡ-2 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению связан с их использованием в методах аффинной хроматографии, нацеленных на выделение и идентификацию других белков или факторов, с которыми они способны связываться, например, других белков или факторов, вовлеченных во внутриклеточные сигнальные механизмы. В таком применении белок ΚΑΡ-2, его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению могут быть по отдельности присоединены к матрицам для аффинной хроматографии и затем проконтактированы с клеточными экстрактами или изолированными белками или факторами, которые предположительно вовлечены во внутриклеточные сигнальные механизмы. По завершении процедуры аффинной хроматографии другие белки или факторы, которые связываются с белком ΚΑΡ-2 или с его аналогами, фрагментами или производными по настоящему изобретению, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы.

(5) Как отмечалось выше, белок ΚΑΡ-2, его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению также могут быть использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для целей получения специфичных в отношении них антител. Такие антитела могут быть использованы для целей очистки белка ΚΑΡ-2 (например самого ΚΑΡ-2 или его изоформ) либо из клеточных экстрактов, либо из трансформированных клеточных линий, вырабатывающих белок ΚΑΡ-2 или его аналоги или фрагменты. Далее, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей в идентификации заболеваний, связанных с аномальным функционированием ΚΙΡ-опосредованных систем лиганда ΕΑ8-Κ или ΤΝΕ или не зависящих от ΚΙΡ активностей, например, пониженных или повышенных клеточных эффектов, индуцируемых лигандом ΕΑ8-Κ или ΤΝΕ, опосредуемых белком ΚΙΡ или собственного влияния ΚΙΡ на клетки. Таким образом, если такие заболевания связаны с нарушениями функционирования внутриклеточных сигнальных путей, вовлекающих белок ΚΙΡ или различные другие упоминавшиеся выше ΚΙΡ-связывающиеся белки или собственно белок ΚΑΡ-2, то такие антитела будут служить в качестве эффективного диагностического средства.

Необходимо также отметить, что выделение, идентификация и охарактеризование белка ΚΑΡ-2 по настоящему изобретению могут быть осуществлены с использованием любой из известных в данной области техники стандартных процедур. Например, одна из таких процедур скрининга, а именно процедура на основе двухгибридной дрожжевой системы, подробно описанная ниже, была использована для идентификации белка ΚΙΡ (см. §1апдег е! а1., 1995) и затем - различных белков ΚΑΡ-2 по настоящему изобретению (помимо ряда других новых белков, заявляемых упоминаемыми здесь выше и далее тематически связанными патентными заявками). Так же, как это описывалось выше и будет рассмотрено далее, другие процедуры, такие как аффинная хроматография, методы гибридизации ДНК и т.п., хорошо известные в данной области техники, могут быть применены для выделения, идентификации и охарактеризования белка ΚΑΡ-2 по настоящему изобретению или для выделения, идентификации и охарактеризования дополнительных белков, факторов, рецепторов и т.п., которые способны связываться с белками ΚΑΡ-2 по настоящему изобретению.

Как указывалось в данном тексте выше, белок ΚΑΡ-2 может быть использован для получения антител, специфичных в отношении белков ΚΑΡ-2, например, самого ΚΑΡ-2 и его изоформ. Такие антитела или их фрагменты могут быть использованы в соответствии с подробно описанным здесь далее, и должно быть понятно, что в таких применениях антитела или их фрагменты - те, которые специфичны в отношении белков ΚΑΡ-2.

Основываясь на информации, полученной в соответствии с настоящим изобретением о том, что ΚΑΡ-2 специфически связывается с ΚΙΡ и вследствие этого является медиатором/модулятором ΚΙΡ, а, следовательно, может опосредовать/модулировать активность белка ΚΙΡ в отношении механизмов воспалений, гибели клеток или выживания клеток, при том, что ΚΙΡ функционирует сам по себе или во взаимодействии с другими белками (например, ΕΑ8-Κ, ρ55-Κ, ΜΟΚΤ-1, МЛСН, Мсй4, 61 и ΤΚΑΌΌ в механизмах гибели клеток или с ΤΚΑΕ2 в механизмах выживания клеток), важным является создание лекарственных средств, которые могут усиливать или подавлять взаимодействие ΚΑΡ2/ΚΙΡ в соответствии с желаемым, в зависимости от того, какие из этих механизмов усиливаются/подавляются взаимодействием ΚΑΡ-2/ΚΙΡ. Известно много заболеваний, при которых такие лекарства могут оказать существенную помощь. Среди других заболеваний это острый гепатит, при котором острые поражения ткани печени, как представляется, отражают гибель печеночных клеток, опосредуемую лигандом рецептора ΕΑ8-Κ; индуцируемая аутоиммунитетом гибель клеток, такая как гибель β-клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе, как фак тор диабета; гибель клеток при отторжении трансплантатов (например, пересаживаемых почек, сердца и печени); гибель олигодендроцитов в головном мозге при рассеянном склерозе; и подавляемая СПИДом Т-клеточная суицидальность, которая обусловливает воспроизведение вируса СПИД, а, следовательно, и сам синдром приобретенного иммунодефицита.

Возможно, что белок КАР-2 или одна или несколько его изоформ могут служить в качестве «естественных» ингибиторов белка К1Р в одном или нескольких упоминавшихся выше механизмов, а это, следовательно, можно использовать для специфического подавления К1Р, о котором говорилось выше. Таким же образом другие субстанции, такие как пептиды, органические соединения, антитела и т. п., могут быть подвергнуты скринингу с целью получения специфических лекарственных средств, которые бы были способны подавлять взаимодействие КАР2/К1Р.

Не являющийся в чем-либо ограничивающим пример того, как пептидные ингибиторы взаимодействия КАР-2/К1Р могут быть сконструированы и протестированы, основан на проведенных исследованиях пептидных ингибиторов 1СЕ или 1СЕ-подобных протеаз, субстратной специфичности 1СЕ и стратегий анализа эпитопов с использованием методов пептидного синтеза. Минимально необходимым для эффективного расщепления пептида под действием протеазы 1СЕ было нахождение в нем четырех аминокислот от сайта такого расщепления при жестком предпочтении остатка аспарагиновой кислоты в положении Р1 и при достаточности наличия метиламина справа от сайта Р1 (81еа!й е! а1., 1990; Нокагб е! а1., 1991; ^отЬеггу е! а1., 1992). Более того, флуорогенный пептидный субстрат, являющийся тетрапептидом, - ацетилАкр-С1и-Уа1-Акр-а-(4-метилкумарил-7-амид), сокращенно обозначаемый как Ас-ЭЕУЭ-АМС, - соответствует последовательности поли-АДФрибозополимеразы (ПРАП), расщепление которой обнаруживается в клетках вскоре после стимуляции рецептора ΕА8-К наряду с другими процессами апоптоза (КаиГтапп, 1989; КаиГтапп е! а1., 1993; Ьа/еЬшк е! а1., 1994), при том, что это расщепление эффективно осуществляется с участием СРР32 (представитель семейства протеаз СЕЭ3/1СЕ) и протеаз МАСН (а также, по-видимому, и протеаз С1 - см., например, тематически связанную израильскую патентную заявку 1Ь 120367).

С учетом того, что положение Р1 должно быть занято остатком аспарагиновой кислоты, тетрапептиды, включающие в 4-м положении аспарагиновую кислоту и различные сочетания аминокислот в первых трех положениях, могут быть подвергнуты оперативному тестированию на связывание с активным сайтом протеаз с применением, например, метода, разработанного Гейзеном (Сеукеп, 1985; Сеукеп е! а1., 1987), в котором большое число пептидов на твёрдых подложках анализируют по специфическим взаимодействиям с антителами. Связывание протеаз МАСН со специфичными пептидами может быть выявлено с помощью различных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как радиоактивное мечение протеаз С1 и т.п. В данном методе Гейзена, как было показано, возможно протестировать по крайней мере 4 тысячи пептидов за один рабочий день.

Сходным образом точное положение участка связывания или участка гомологии, который определяет взаимодействие между КАР-2 и К1Р, может быть установлено, после чего эти пептиды могут быть протестированы на потенциальную блокировку такого взаимодействия, например, пептиды, которые синтезированы таким образом, чтобы их последовательность характеризовалась сходством с участком связывания или была ему комплементарна, так, чтобы обеспечить конкуренцию нативному КАР-2 по связыванию с белком К1Р.

Лекарства или пептидные ингибиторы, которые способны подавлять воспалительную активность или активность КАР-2 по гибели клеток за счет подавления взаимодействия между КАР-2 и К1Р, могут быть соединены или включены в комплексы с молекулами, которые облегчают проникновение внутрь клеток.

В патенте США № 5149782 заявляется соединение молекулы, которая предназначена для переноса через клеточную мембрану, с мембрано-проникающим агентом, таким как фузогенные полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды и жирные кислоты с длинными цепями, например, миристиновая кислота и пальмитиновая кислота. Эти мембрано-проникающие агенты вносят молекулярный конъюгат в липидный бислой клеточных мембран и облегчают тем самым его попадание в цитоплазму.

В патенте США № 5108921, выданном Ьок е! а1., обобщены доступные способы трансмембранной доставки молекул, таких как, тем самым не исчерпываясь, белки и нуклеиновые кислоты, по механизму опосредованного рецепторами эндоцитоза. Такие рецепторные системы включают рецепторы, распознающие галактозу, маннозу, маннозо-6-фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин В₁₂) , α₂-макроглобулины, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕСР). Авторами данного патента указывается на то, что пищевые рецепторы, такие как рецепторы биотина и фолатов, могут быть преимущественно использованы для интенсификации транспорта через клеточную мембрану, благодаря наличию и многочисленности биотиновых и фолатных рецепторов на поверхности плазмалеммы большинства типов клеток и существованием связанных с этими рецепторами трансмембранных транспортных процессов. Таким образом, комплекс, образованный соединением, которое предназначено для доставки в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, контактируют с клеточной мембраной, несущей биотиновые или фолатные рецепторы с целью инициации опосредованного этими рецепторами механизма трансмембранного переноса, тем самым обеспечивая проникновение желательного соединения внутрь такой клетки.

Кроме того, в науке известно, что соединение желательной пептидной последовательности с лидером (сигнальным сегментом последовательности) с получением «химерного пептида» сделает возможным транспортировку такого «химерного пептида» через клеточную мембрану с попаданием в цитоплазму.

Как должно быть понятно специалисту в данной области техники, пептидные ингибиторы взаимодействия ЯΑΡ-2/ЯIΡ в соответствии с настоящим изобретением включают в себя лекарства-пептидомиметики или ингибиторы, которые также могут быть оперативно протестированы по их связыванию с протеазой ЯΑΡ2/ΡΙΡ с целью получения по возможности наиболее стабильных ингибиторов.

Также должно быть понятно, что аналогичный способ облегчения или повышения эффективности переноса пептидных ингибиторов через клеточные мембраны в соответствии с обсуждавшимся выше, также применим в отношении самих белка ЯЛΡ-2 или его изоформ, равно как и других пептидов и белков, которые проявляют свое действие внутри клеток.

Что касается антител, упоминающихся в настоящей заявке, то термин «антитело» призван включить в себя поликлональные антитела, моноклональные антитела (ΜΑΤ), химерные антитела, антиидиотипические антитела к антителам, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, равно как и их фрагменты, полученные с применением любого метода, такого как, тем самым не ограничиваясь, каталитического расщепления, пептидного синтеза или рекомбинантных методологий.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул иммуноглобулинов, производных от сыворотки животных, иммунизованных антигеном. Моноклональное антитело включает в существенной степени гомогенную популяцию антигенспецифичных антител, при том, что эта популяция несет в существенной степени сходные сайты связывания эпитопа. Моноклональные антитела могут быть получены с применением методов, известных специалистам в данной области техники: см., например, КоЫег & М115(е1п, 1975, №Шге, 256, 495-497; патент США № 4376110; Αι^ιι^Ι еί а1., цит. выше; Наг1оте & Ьапе (ебк.), 1988, «ΑηΙίόο^δ: Α ЬаЬогаЮгу Мапиа1», Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬ., Со1б 8ргтд НагЬог, ΝΥ; Со1

Ндап еί а1. (ебк.), 1992-1996, «Сиггеп: ГгоЮсоМ ίη Iттиηο1οду», Сгеепе ΡιιΝ. Α55οс. апб Абеу Ιη1ег5Ск, ΝΥ: их полное содержание включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок. Такие антитела могут быть представлены иммуноглобулинами любого класса, включая ЦС, ΙβΜ, Ι§Ε, ЦС, СШЭ или любого их подкласса. Гибридома, вырабатывающая тΑЬ по настоящему изобретению, может культивироваться ш νίΙΐΌ, ш δίΐιι или ш νί\Ό. Выработка высоких титров тΑЬ ш νί\Ό или т δίΐιι делает эти варианты предпочтительными способами их получения.

Химерные антитела - это молекулы, у которых различные сегменты являются производными от различных видов животных, такие как антитела, включающие вариабельные домены, производные от мышиных ΜΑΤ, и константный домен иммуноглобулина человека. Химерные антитела, в первую очередь, используются с целью снижения иммуногенности в ответ на их применение и с целью повышения уровня их выработки, например, тогда, когда мышиные ΜΑΤ МАТ-стантный домен иммуноглобулина человека. Химерные антитела, в первую очередь, используются с целью снижения иммуногенности в ответ «мышино-человеческие» моноклональные антитела. Химерные антитела и способы их получения известны в науке (СаЬ111у е: а1., 1984, Йос. ЫаЙ. Αсаб. 8сР υ8Α, 81, 32733277; Моггйоп е: а1., 1984, ΡΐΌα №111. Αсаб. 8с1. υ8Α, 81, 6851-6855; Βοи1^аηηе е: а1., 1984, Ыа:иге, 312, 643-646; СаЬ111у е: а1., европейская патентная заявка № 125023, опубликованная 14 ноября 1984 г.; №иЬегдег е1 а1., 1985, ΝιΦιν, 314, 268-270; ΤιΜ^^Μ е: а1., европейская патентная заявка № 171496, опубликованная 19 февраля 1985г.: Моггйоп е: а1., европейская патентная заявка № 173494, опубликованная 5 марта 1986г.; №иЬегдег е: а1., патентная заявка РСТ 184187, опубликованная 13 марта 1986г.; Кибо е: а1., европейская патентная заявка № 184187, опубликованная 11 июня 1986г.; 8аЬадап е: а1., 1986, 1. ^типоР, 137, 1066-1074; ЯоЬткоп е: а1., международная патентная заявка № АО 87/02671, опубликованная 7 мая 1987г.; Ьш е: а1., 1987, Ρι-ос. №111. Αсаб. 8α υ8Α, 84, 3439-3443; 8ип е: а1., 1987, Ργό^ №ι11. Αсаб. 8сР υ8Α, 84, 214-218; Βе::е^ е: а1., 1988, 8с1епсе, 240, 1041-1043; Наг1оте & Ыпе, «Αη:^Ьοб^е5: Α ЬаЬога:огу Мапиа1», цит. выше). Полное содержание этих публикаций включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Антиидиотипическое антитело - антитело, которое распознает уникальные эпитопы, в принципе, ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Антиидиотипическое антитело может быть получено путем иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, инбредной линии мышей) по отношению к источнику данного моноклонального антитела, к которому должно быть получено антиидиотипическое антитело. Иммунизованное животное будет распознавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизующего антитела с выработкой антитела, специфичного в отношении этих идиотипов (т. е. антиидиотипическое антитело): см., например, патент США № 4699880, который включён здесь для сведения в виде библиографической ссылки.

Само антиидиотипическое антитело может быть использовано в качестве «иммуногена» с целью индукции иммунного ответа еще у одного животного с получением т.н. «анти-антиидиотипического антитела». Анти-антиидиотипическое антитело может быть по эпитопам идентично исходному МАТ, которое являлось индуктором антиидиотипического антитела. Следовательно, с использованием антител к идиотипическим детерминантам МАТ возможным становится идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела, характеризующиеся идентичной специфичностью.

Таким образом, моноклональные антитела, сформированные к белкам КАР-2, его аналогам, фрагментам или производным по настоящему изобретению, могут быть использованы для индукции антиидиотипических антител в подходящих животных, таких как мыши линии ВАЬВ/с. Клетки селезенки таких иммунизованных мышей используются для выработки антиидиотипических гибридом, секретирующих антиидиотипические МАТ. Далее, антиидиотипические моноклональные антитела могут быть соединены с носителем, таким как гемоцианин молюска (КЬН), и использованы для иммунизации мышей ВАЬВ/с дополнительно. Сыворотка таких мышей будут содержать антиантиидиотипические антитела, которые характеризуются связывающими свойствами с исходными МАТ, специфичными в отношении эпитопа названных выше белка КАР-2 или его аналогов, фрагментов и производных.

Таким образом, антиидиотипические моноклональные антитела имеют свои собственные идиотипические эпитопы - «идиотопы», структурно сходные с оцениваемым эпитопом, таким как СКВ белка-А.

Термин «антитело» также призван включить и интактные молекулы, и их фрагменты, такие как, например, ЕаЬ и Е(аЬ')₂, которые способны связывать антиген. Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')₂ лишены Ес-фрагмента из состава интактного антитела, легче выделяются из кровотока и могут проявлять меньший уровень неспецифического связывания по сравнению с интактным антителом (^аЫ е! а1., 1983, I. №с1. Мей., 24, 316-325).

Должно быть понятно, что ЕаЬ и Е(аЬ')₂, и другие фрагменты антител, применимые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для детекции и количественного анализа белка КАР-2 в соответствии с методами, заявленными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают путем протеолитического расщепления с применением таких ферментов, как папаин (для получения фрагментов ЕаЬ) или пепсин (для получения фрагментов Е(аЬ')2).

Про антитело говорится, что оно «способно связываться» с молекулой тогда, когда оно способно специфическим образом реагировать с данной молекулой так, чтобы связывать эту молекулу и это антитело. Термин «эпитоп» обозначает тот участок любой молекулы, который может быть связан антителом и который также может быть распознан таким антителом. Эпитопы, также называемые «антигенными детерминантами», обычно включают химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислот или боковых цепей углеводов, и характеризуются специфической пространственной структурой, равно как характерными параметрами электрического заряда.

Термин «антиген» - это молекула или часть молекулы, способная быть связанной антителом, которая дополнительно способна индуцировать выработку у животного антитела, способного связываться с эпитопом данного антигена. Антиген может включать один или более одного эпитопа. В связи с названным выше «специфическое реагирование» обозначает то, что антиген будет реагировать в высокоизбирательной манере с соответствующим антителом, но не со множеством других антител, которые могут быть инициированы другими антигенами.

Антитела, включая фрагменты антител, применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы для качественной или количественной детекции белка КАР-2 в образце или для выявления присутствия клеток, которые экспрессируют белок КАР-2 по настоящему изобретению. Это может быть осуществлено с применением иммунофлуоресцентных методов, основанных на флуоресцентном мечении антител (см. далее) и методах детекции на световом микроскопе, с помощью проточной цитометрии или флуорометрии.

Антитела или их фрагменты, применимые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы гистологически при проведении иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии для детекции ίη δίΐιι белка КАР-2 по настоящему изобретению. Детекция ίη δίΐιι может быть осуществлена путём взятия гистологической пробы от пациента и наложения на полученный образец помеченного антитела по настоящему изобретению. Антитело (или фрагмент) предпочтительно наносят путём накрытия биологического образца помеченным антителом (или фрагментом). С помощью использования такой процедуры возможным является определить не только присутствие белка КАР-2, но и его распределение в анализи49 руемой ткани. На основании настоящего изобретения специалист в данной области техники легко сможет понять, что любой из широкого круга гистологических методов (таких как процедуры окрашивания) могут быть модифицированы с целью обеспечения данной детекции ш κίΐιι.

Данные тесты на выявление белка КАР-2 по настоящему изобретению обычно включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были проинкубированы в культуре, в присутствие выявляемо помеченного антитела, способного идентифицировать белок КАР-2, с последующим выявлением данного антитела с применением любого из методов, хорошо известных в данной области техники.

Биологический образец может быть обработан твердофазной подложкой или носителем, такими как нитроцеллюлоза, или другими твёрдыми подложками или носителями, которые способны иммобилизовать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Подложка или носитель могут затем быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой выявляемо помеченным антителом в соответствии с настоящим изобретением, как это отмечалось выше. Твердофазная подложка или носитель могут быть затем промыты буфером во второй раз с целью удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки на упомянутой твердой подложке или носителе затем может быть определено с применением стандартных методов.

Под «твердофазной подложкой», «твердофазным носителем», «твердой подложкой», «твердым носителем», «подложкой» или «носителем» понимается любая подложка или носитель, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирен, полипропилен, полиэтилен, декстран, нилонамилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. По своей природе такой носитель может быть растворимым в некоторой степени или нерастворимым вовсе, исходя из целей настоящего изобретения. Материал подложки виртуально может характеризоваться любой структурной конфигурацией, лишь бы связанная на нём молекула была способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, форма подложки или носителя может быть сферической, как у шарика, цилиндрической, как внутренняя поверхность пробирки или внешняя поверхность палочки. С другой стороны, поверхность может быть плоской, такой как у пластинки, тест-полоски и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистироловые шарики. Специалисту в данной области техники должны быть известны и другие подходящие носители для связывания на них антитела или антигена или они могут подобрать их с помощью рутинных экспериментов.

Активность по связыванию данного набора антител по настоящему изобретению, как они описывались выше, может быть определена в соответствии с хорошо известными процедурами. Специалисты в данной области техники смогут определить оперативный и оптимальный тест для каждого такого тестирования с применением рутинного экспериментирования.

Другие этапы, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрование и подобное могут быть включены в данные тесты в зависимости от желательности или необходимости исходя из конкретной ситуации.

Одним из путей, по которому антитело по настоящему изобретению может быть выявляемо помечено, является связывание его с ферментом с применением его в ферментном иммунотестировании (Е1А). В свою очередь, данный фермент, после того как он будет обработан соответствующим субстратом, будет реагировать с этим субстратом таким образом, что образуется химическая составляющая, которая может быть детектирована, например, спектрометрически, флуорометрически или визуально. Ферментами, которые могут быть использованы для выявляемого мечения антител, являются, тем самым не исчерпываясь, малатдегидрогеназа, нуклеаза стафилококка, изомераза Δ5стероидов, алкогольдегидрогеназа дрожжей, αглицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозоксидаза, βгалактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза. Детекция может быть осуществлена с помощью колориметрических методов, в которых для данного фермента используется хромогенный субстрат. Также детекция может быть осуществлена путем визуального сравнения степени каталитической реакции субстрата в сравнении со стандартами, приготовленными аналогичным образом.

Детекция может быть осуществлена с использованием любого из других иммунологических тестов. Например, с помощью радиоактивного мечения антител или фрагментов антител возможным является выявление КРТР-азы путем использования радиоиммунотестирования (К1А). Подробное описание метода К1А может быть найдено в лаборатории ЬаЬога1огу Тесйтциек & Β^οсйет^κΐ^у т Мо1еси1аг Β^ο1οду, выполненное Т.8. Аогк е! а1., 1978, №г111 Но11апй РиЬ1. Со. с конкретной отсылкой к главе «Ап 1п1гойис1юп !о Кайюштипе Аккау апй Ке1а!ей Тесйп1циек», написанной Т. Сйагй: включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Радиоактивный изотоп может быть детектирован с помощью таких способов, как использование счетчика сцинтилляций, или авторадиографически.

Также возможным является мечение антитела в соответствии с настоящим изобретением с использованием флуоресцентного соединения. Когда флуоресцентно помеченное антитело облучают при необходимой длине волны, то его присутствие определяется благодаря флуоресценции. Среди наиболее часто применяемых флуоресцентных метящих соединений - флуоресцеина изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фталевый альдегид и флуорескамин.

Также антитело может быть выявляемо помечено с использованием эмиттирующих ме125тталлов, таких как изотоп Е или другие лантаноиды. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с помощью групп-хелаторов таких металлов, таких как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА).

Также антитело может быть помечено путем его соединения с хемолюминесцентным соединением. Присутствие хемолюминесцентно помеченного антитела затем определяют по выявлению присутствия люминесценции, которая наблюдается в ходе химической реакции. Примерами конкретно применимых хемюминесцирующих метящих соединений являются люминол, изолюминол, тероматический эфир акридиния, имидазол, соли акридиния и щавелевый эфир.

Также биолюминесцентное соединение может быть использовано для мечения антитела по настоящему изобретению. Биолюминесценция - это форма хемолюминесценции, имеющей место в биологических системах, в которых обладающие каталитическими свойствами белки повышают эффективность реакции хемолюминесценции. Присутствие биолюминесцентного белка определяется путём выявления присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями, пригодными для целей мечения, являются люциферин, люцифераза и экворин.

Молекула антитела по настоящему изобретению может быть адаптирована для применения в иммунометрическом тесте, также известном как «двухсайтовый тест» или «сэндвичтест». В типичном иммунометрическом тесте некое количество непомеченного антитела (или фрагмента антитела) связывается с твердой подложкой или носителем, а некое количество выявляемого помеченного растворимого антитела добавляется так, чтобы обеспечить выявление и (или) количественное определение тройного комплекса, образуемого твёрдофазным антителом, антигеном и помеченным антителом.

Обычные и в то же время предпочтительные иммунометрические тесты включают «форвард-тесты», в которых антитело, связанное на твердой подложке, вначале контактируют с образцом, тестируемым на предмет экстракции антигена из данного образца путем образования двойного комплекса «антиген-антитело» в твердой фазе. После подходящего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкого образца, включающего непрореагировавший антиген, если он там есть, и затем контактируют с раствором, содержащем неизвестное количество помеченного антитела (которое является «репортерной молекулой»). После второго периода инкубации, необходимого для соединения помеченного антитела с комплексом с антигеном, связанным на твердой подложке или носителе через непомеченное антитело, твердую подложку или носитель промывают во второй раз с целью удаления непрореагировавшего помеченного антитела.

В другом варианте «сэндвич-теста», который также может быть применён с в отношении антигенов по настоящему изобретению, используются так называемые «одновременные» и «реверсные» тесты. «Одновременный тест» включает единый этап инкубации, в котором антитело, связанное на твердой подложке или носителе, и помеченное антитело добавляют к образцу, который должен быть протестирован, в одно и то же время. По завершении инкубации твердую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкого образца и не вошедшего в комплекс помеченного антитела. Присутствие помеченного антитела, ассоциированного с твердой подложкой или носителем, затем определяют, как и в обычном «форвардсэндвич-тесте».

В «реверсном тесте» применяется последовательное добавление сначала раствора помеченного антитела к жидкому образцу с последующим добавлением непомеченного антитела, связанного с твердой подложкой или носителем после подходящего времени инкубации. После второй инкубации твёрдую фазу промывают стандартным образом для освобождения ее от остатка тестируемого образца и раствора непрореагировавего помеченного антитела. Затем определение помеченного антитела, ассоциированного с твердой подложкой или носителем, проводят так же, как в «одновременном» и «форвард» тестах.

Белки ВАР-2 по настоящему изобретению могут быть получены с помощью любой стандартной методики рекомбинантной ДНК (см., например, 8атЬтоок е! а1., 1989 и АикиЬе1 е! а1., 1987-1995, цит. выше), в которых подходящие эукариотические или прокариотические клеткихозяева, хорошо известные в данной области техники, трансформируют с использованием подходящих эукариотических или прокариотических векторов, включающих последовательности, кодирующие белки. Соответственно, настоящее изобретение также касается таких экспрессирующих векторов и трансформированных организмов-хозяев для целей выработки белков по настоящему изобретению. Как отмечалось выше, эти белки также включают биологически активные аналоги, фрагменты и производные, а, следовательно, векторы, их кодирующие, также включают векторы, кодирующие аналоги и фрагменты данных белков, а трансформированные организмы-хозяева включают тех, которые вырабатывают такие аналоги и фрагменты. Производные этих белков, вырабатываемых данными трансформированными организмамихозяевами, являются производными, получаемыми с помощью стандартных модификаций белков или их аналогов или фрагментов.

Также настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих рекомбинантные векторы на основе вирусов животных, кодирующие белки КАР-2, при том, что такой вектор также кодирует поверхностный вирусный белок, способный связываться со специфическими поверхностными белками клетки-мишени (например, опухолевых клеток), что обеспечивает внесение последовательностей белка КАР-2 внутрь этих клеток. Дополнительно фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат в качестве активного компонента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность по отношению к последовательности гена КАР-2, или (Ь) лекарственные средства, которые блокируют взаимодействие КАР2/КР.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат количество активного компонента, достаточное для достижения поставленной задачи. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включая наполнители и добавки, которые облегчают преобразование активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически, и которые могут стабилизировать такие препараты с точки зрения их введения пациенту в случае необходимости в этом, что хорошо известно специалистам в данной области техники.

Белок КАР-2 и его изоформы или изотипы, как предполагается, экспрессируются в различных тканях на отчетливо различающемся уровне и, по-видимому, также с различным составом изотипов по аналогии с параметрами экспрессии различных других белков, участвующих во внутриклеточных сигнальных механизмах, что обсуждается в называвшихся выше тематически связанных патентных заявках. Эти различия, как предполагается, могут определять различия в ответах разных тканей на лиганд Ρа8/ΛΡО1 и ΤΝΡ. Как и в случае с другими ί.ΈΩ3/Κ.Έгомологами (^апд е! а1., 1994; А1петп е! а1., 1995), заявители настоящего изобретения ранее показали (в упоминавшихся выше патентных заявках), что изоформы МАСН, которые вклю чают сегменты неполной гомологии с ί.ΈΩ3/Κ'.Έ (например, МАСНа3), как было показано, обладают ингибиторным влиянием на активность одновременно экспрессируемых молекул МАСНа1 или МАСНа2; также они блокируют гибель клеток, индуцируемую рецепторами Ρа8/-АΡО1 и р55-К. Экспрессия таких изоформингибиторов в клетках может участвовать в механизме клеточной самозащиты от цитотоксичности, опосредуемой Ρа8/ΛΡО1 и ΤΝΡ. Сходный эффект ингибирования по крайней мере некоторых изоформ протеазы 61 также предполагается (61 - недавно выделенный новый Мс114- и предположительно МАСН-связывающийся белок, а также МОКП-связывающийся белок, в составе которого имеется «МОКΤ-домен» и протеазный домен: см. тематически связанную израильскую патентную заявку ΙΕ 120367). Значительная разнородность изоформ МАСН, а также предполагаемая столь же существенная гетерогенность изоформ 61, которые в значительной степени превосходят таковые, известные для других представителей протеазного семейства 6ΕΌ3/Ι6Ε, должна обеспечивать тонкую настройку функций активных изоформ МАСН, а по аналогии - и активных изоформ 61. Следовательно, как отмечалось выше, белки КАР-2 и его вероятные изоформы могут обладать дифференцированными эффектами в различных тканях с точки зрения их взаимодействия с белком ШР и тем самым влиянием на баланс между механизмами активации гибели клеток или выживания клеток, о которых говорилось выше.

Также является возможным, что некоторые из вероятных изоформ КАР-2 выполняют отличающиеся функции. Например, сам белок КАР2 или некоторые изоформы КАР-2 также могут выполнять роль «депо»-сайтов для молекул, которые участвуют в других, не связанных с цитотоксичностью, проявлениях рецепторов Ρа8/ΛΡО1 и ΤΝΡ через взаимодействие с белком КР или даже независимо от ИР.

Благодаря уникальной способности рецепторов Ρа8/ΛΡО1 и ΤΝΡ обусловливать воспаления, гибель клеток, равно как и способности рецепторов ΤΝΡ обусловливать другие активности по повреждению тканей, нарушение функций этих рецепторов может, в частности, иметь отрицательные последствия для организма. Действительно, и избыточные, и дефектные функции этих рецепторов, как было показано, участвуют в патогенезе различных заболеваний (УаккаШ, 1992; №да!а & 6о1к!ет, 1995). Идентификация молекул, которые участвуют в сигнальной активности рецепторов и обнаружение путей модулирования активности таких молекул может позволить найти новые терапевтические подходы. Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из нижеследующих примеров.

Теперь настоящее изобретение будет более подробно охарактеризовано с помощью ниже55 следующих, не являющихся в чем-либо ограничивающими примеров и сопровождающих чертежей.

Необходимо отметить, что следующие процедуры:

(1) двухгибридный скрининг и двухгибридный тест на экспрессию β-галактозидазы; (2) индуцированная экспрессия, метаболическое мечение и иммунопреципитация белков; (3) связывание ίη νίίΓο; (4) оценка цитотоксичности; и (5) Нозерн-блоттинг и секвенирование (см. также Βοϊάίη е! а1., 1995Б) 2, 3 (см. также Βοϊάίη е! а1., 1996) и 4, см. ниже, по отношению к МОКТ1 и МОКТ1-связывающему белку (например, белку МАСН), равно как и нового выделенного белка 01 (см. заявку 1Ь 120367), - в одинаковой степени применимы (с небольшими модификациями) для соответствующего выделения, клонирования и охарактризования белка КАР-2 и его вероятных изоформ по настоящему изобретению. Следовательно, эти процедуры могут быть истолкованы, как полное представление таких процедур, используемых для выделения, клонирования и охарактеризования КАР-2 в соответствии с настоящим изобретением, что подробно описано, например, в такой же или эквивалентной формах в тематически связанных израильских патентных заявках №№ 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 и 120367, равно как и соответствующей заявке РСТ № РСТ/ϋδ 96/10521. Далее, что касается белка ΝΙΚ и его роли в активации фактора ΝΡ-κΒ, а, следовательно, и выживания клеток, а также роли ТКАР2 в этом механизме выживания клеток, например, за счёт взаимодействия между ТКАР2 и К1Р и другими белками, то они подробно описаны заявителями настоящего изобретения в тематически связанных израильских патентных заявках 1Ь 117800 и 1Ь 119133 и у МаЛшп е! а1., 1997.

Пример 1. Клонирование и выделение белка КАР-2, который связывается с белком К1Р. Двухгибридный скрининг, секвенирование и предварительный анализ.

С применением двухгибридного скрининга с использованием в качестве «наживки» белка К1Р (см., например. Р1е1б8 & 8опд, 1989, международная патентная заявка \¥О 96/18641) в библиотеке В-лимфоцитов был выделен клон размером примерно 1500 пар нуклеотидов. Этот 1500-нуклеотидный клон (см. стрелку на фиг. 1 и 2) использовали для скрининга фаговой библиотеки кДНК, получив в результате клон длиной примерно 2000 пар нуклеотидов, нуклеотидная последовательность которого показана на фиг. 1.

Путем сопоставления Е8Т-маркеров с последовательностью 1500-нуклеотидного клона был выделен Е8Т-фрагмент, который представлял 3'-конец элемент РМ.А.О.Е. клона № 41072 (КекеагсР Оепе!. Ιη§!.). Из состава этого клона, происходящего из библиотеки плодного головного мозга, были опубликованы ранее только небольшие 3'- и 5'-концевые фрагменты последовательностей. После выделения этого клона он был секвенирован, и было выяснено, что даже небольшие опубликованные участки включали содержали ошибки. Как было установлено, секвенированный клон (фиг. 2) был идентичен клону, показанному на фиг. 1, по его кодирующему участку, но характеризовался отличиями по 5'-некодирующему сегменту. Таким образом, было предположено, что обе эти кДНК представляют собой продукты альтернативного сплайсинга транскрипта одного и того же гена.

Анализ данной нуклеотидной последовательности показывает, что, как и белок КАР, белок КАР-2, по-видимому, не имеет «домена гибели» в своём составе, не имеет т. н. «МОКТмодуля», не имеет протеазного домена, характерного для членов семейства Ι0Έ, не имеет киназного домена, а также не включает «ТКАРдоменов» (см. приводившиеся выше тематически родственные патентные заявки и различные библиографические ссылки, в частности, на работу МаЛшп е! а1., 1997, в связи с ролью различных доменов во внутриклеточных сигнальных механизмах). В составе данной последовательности не было выявлено сколько-нибудь значимых доменов, за исключением трёх мотивов типа «лейциновой молнии» - подобные блоки равномерно распределены по длине кодирующей белок последовательности. Эти домены названы «подобными» «лейциновым молниям» потому, что в двух из них имеются замены лейцина на валин, метионин или изолейцин. Поскольку обычно эти домены высококонсервативны, пока неясно, сохраняют ли белку такие изменения в составе «лейциновых молний» его функциональную активность, а именно связывание с другими «лейциновыми молниями». Анализ на связывание показал, что КАР-2 в существенной степени связывается с КГР, но КАР2 не способен связываться с белками ТКАОИ, МОКТ-1, р55-К, р74-К и МАСН (в объеме исследований, проведенных к настоящему времени). Полученные результаты подтверждают тот факт, что КАР-2, по-видимому, лишен «доменов гибели» и «МОКТ-модулей».

Следовательно, считается, что КАР-2 является узкоспецифичным КГР-связывающим белком, который взаимодействует/связывается с белком КРР очень специфическим образом. Таким образом, КАР-2, по-видимому, является специфичным модулятором/медиатором внутриклеточной активности КРР, играющим важную роль в модуляции/опосредовании с участием К1Р механизмов воспалений, гибели клеток и выживания клеток.

Вкратце, клон КАР-2 был получен в процедуре двухгибридного скрининга библиотеки кДНК В-клеток человека с использованием в качестве «наживки» полноразмерного белка

ΒΙΡ. Последовательность ΒΙΡ была взята из предыдущих публикаций (например, 81апдег е1 а1., 1995), как депонированная в базу данных СепΒ;·ιη1< под № И-25994, которая является последовательностью ΒΙΡ человека (также под № И25995 присутствует последовательность белка ΒΙΡ мыши). На основании этой информации о последовательностях затравки для ПЦР были сконструированы с помощью программного продукта 0ЫС04™, а фрагмент ДНК, соответствующий кодирующей части гена ΒΙΡ, был получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной на материале тотальной РНК библиотеки фибробластов человека (с помощью стандартных процедур). Этот кодирующий участок ΒΙΡ затем был клонирован в состав вектора ρСΒΤ-9 (С1оп1ес11) и использован в качестве «наживки» в соответствии с отмечавшимся выше для двухгибридной тест-процедуры. При таком двухгибридном скрининге был выделен клон, кодирующий ΒΙΡсвязывающийся белок, который взаимодействует с ΒΙΡ.

Этот клон, как отмечено выше, был использован для скрининга фаговой библиотеки кДНК и базы данных по маркерам Ε8Τ. Как можно видеть из фиг. 1 и 2, кодирующие последовательности двух клонов идентичны, в то время как 5'-некодирующие участки различаются. Таким образом, предполагается, что они являются формами, образующимися в результате альтернативного сплайсинга. Длина клонов составляет примерно 2000 пар нуклеотидов, на долю ΟΒΕ (открытой кодирующей рамки) приходится примерно 1500 пар нуклеотидов, а расчетная молекулярная масса кодируемого ими белка составляет примерно 50 кД. Расшифрованная аминокислотная последовательность белка ΒΑΡ-2 показана на фиг. 3.

Анализ указанных выше последовательностей клона ΒΑΡ-2 и последовательностей в базе данных «бЬек!», базе данных проекта «Геном человека» (1еуе1 1) и базе данных СепБапк показал, что последовательность ΒΑΡ-2 является уникальной (новой) последовательностью, потому что ни одна из известных последовательностей не проявила сколько-нибудь существенной гомологии с этой последовательностью ΒΑΡ-2. После подачи израильской патентной заявки ΙΌ 123758, приоритет которой поддерживается настоящей заявкой, Ямаокой с соавт. (Уатаока е1 а1., 1998) было сообщено о характеристике мышиной кДНК, кодирующей белок с молекулярной массой 48 кД, который был обозначен как ΝΕΜΟ (функциональный модулятор фактора ΝΕ-κΒ) (см. раздел «Предпосылки для изобретения»).

Дополнительные поиски в базах данных (ίη

8111со) позволили идентифицировать белок ΕΙΡ-2

- белок с неизвестными функциями, исходно клонированный Ли с соавт. (Υ. Ь1 е1 а1., 1998:

см. раздел «Предпосылки для изобретения»).

Как можно видеть из полноразмерного сопоставления последовательностей ΒΑΡ-2 и ΕΙΡ2 (фиг. 3В), степень общего сходства весьма низка (поэтому неудивительно, что эта последовательность не была найдена при использовании общих алгоритмов такого скрининга). Гомология между ΒΑΡ-2 и ΕΙΡ-2 возрастает по направлению к С-концевой части этих белков, достигая виртуальной идентичности по С-концевым 30 аминокислотам. Заслуживает внимания и то, что, помимо, последнего участка, предполагаемый мотив типа «лейциновой молнии» в составе ΕΙΡ-2 в существенной степени консервативен и в ΒΑΡ-2 (за исключением аминокислотной замены изолейцина на аланин).

Дополнительно также была идентифицирована более короткая кДНК ΒΑΡ-2 длиной 500 пар нуклеотидов (ГО 1469996), которая была обозначена как Нитап κΙιγΙ. Этот вариант включал в себя «блоки» кодирующей последовательности, происходящие от разных разобщённых участков «полной» кДНК длиной 1500 пар нуклеотидов, механизм возникновения которых, повидимому, связан с альтернативным сплайсингном одного и того же гена.

Анализ методом Нозерн-блоттинга с реактивами Μι.ι11ίρΚ ГОккие ЛоПНегп Ыо1 (С1оп1есН) с Бд1II-фрагментом длиной 900 пар нуклеотидов кДНК ΒΑΡ-2 подтвердил комплексный характер мРНК ΒΑΡ-2. По крайней мере 5 дифференцированных мРНК длиной от менее 1000 нуклеотидов до более 7 тысяч нуклеотидов были выявлены при более или менее постоянном доминировании вариантов длиной 2500 и 6500 нуклеотидов (фиг. 4А).

Пример 2. Идентификация ΒΑΡ-2 мыши.

Сходный поиск в коллекции маркеров Ε8Τ, сформированной в ΤΙΟΚ, позволил выделить частичную кДНК длиной 1600 нуклеотидов (Мойке цаП, ΙΌ 761011; фиг. 3), которая предположительно соответствует ΒΑΡ-2 мыши, поскольку она виртуально идентична (95%) гомологичной последовательности человека по кодирующему сегменту (см. фиг. 3).

Тем не менее различия между последовательностями ΒΑΡ-2 и ΝΕΜΟ человека и мыши превышают тот уровень, который может быть принят для нормальной межвидовой дифференцировки. Действительно, промежуточный блок из 7 аминокислот (249-е положение в 20.4) в последовательности ΒΑΡ-2 мыши и в последовательности ΝΕΜΟ и вставка 3 аминокислот (ΚΌΕ в 111-м положении) в кодирующей рамке последовательности ΝΕΜΟ по сравнению с полноразмерным вариантом человека и с частичной последовательностью мыши являются лишь наиболее отчетливыми примерами различий (фиг. 3). Однако это может быть результатом отражений функциональных активностей данного белка. Функциональные свойства, действительно подтвержденные для белка ΝΕΜΟ, по-видимому, противоположны таковым у ΒΑΡ59 человека, хотя сообщенные результаты фракционного анализа ΝΕΜΟ подтверждают его локализацию в связи с «сигналосомой».

Пример 3. Связывание ΚΙΡ с ΚΑΡ-2 в клетках млекопитающих.

Дальнейшее подтверждение физиологического значения взаимодействия ΚΑΡ-2/ΚΙΡ было получено в трансфицированных клетках линий НЕК-293Т и НеЬа. Действительно, эти два белка могут быть легко копреципитированы из клеточных лизатов клеток НЕК-293Т (АТСС № СЕБ-1573). трансфицированных так, как это указано ниже каждой дорожки на фиг. 4В, и иммунопреципитированных с анти-ЕБ-ЛС моноклональным антителом (Кобак). Затем иммунокомплексы анализировали по присутствию в них ΗΙ8/ΚΑΡ-2 с применением стандартного Вестерн-блоттинга с использованием антитела к гексагистидину (81дта) (фиг. 4В, а также данные не включены). Однако образование такого комплекса не обусловливает каталитической активности ΚΙΡ: в той степени, в какой можно судить по данным теста на киназную активность иммунокомплексов ίη νίίτο, сверх-экспрессия ΚΙΡ не приводит к фосфорилированию белка ΚΑΡ-2 (данные не показаны).

Тесты на связывание были проведены с целью определения того, связывается ли ΚΑΡ-2 с любым из других известных внутриклеточных сигнальных белков. В этих тестах белки ΤΚΑΌΌ, ΜΟΚΤ-1, ρ55-Κ, ρ75-Κ, ΜΑ№ были протестированы по их способности связываться с белком ΚΑΡ-2. Однако было установлено, что ΚΑΡ-2 не способен связываться ни с одним из этих белков. Также ΚΑΡ-2 не связывается с любым из тестированных контрольных белков, например, с ламином и циклином-Ό.

Все приведенные выше результаты, таким образом, указывают на то, что новый белок ΚΑΡ-2, по-видимому, взаимодействует с ΚΙΡ по высокоспецифичному типу, а раз так, то он является высокоспецифичным модулятором/медиатором ΚΙΡ.

Пример 4. Взаимодействие ΚΑΡ-2 с ΝΙΚ и модуляция им транскрипции, контролируемой ΝΕ-κΒ и с-ίιιη.

Хотя при проведении двухгибридных дрожжевых тестов не было взаимодействия ΚΑΡ-2/ΝΙΚ (см. выше), эксперименты по трансфекции клеток НЕК-293Т млекопитающего показали стабильное образование такого комплекса. Взаимодействие ΚΑΡ-2/ΝΙΚ было выявлено в соответствии с описанным в примере 3, за исключением того, что анти-Ε^ΑС антитела были использованы в методе Вестерн-блоттинге с последующей иммунопреципитацией с антителами к гексагистидину (фиг. 4С). Такое несоответствие между параметрами связывания в дрожжевых клетках и клетках млекопитающего не было удивительным, поскольку полноразмерная ΝΙΚ имеет тенденцию терять свои свя зывающие свойства в случае экспрессирования в клетках дрожжей.

С точки зрения того факта, что ίη νίνο и ΚΙΡ, и ΝΙΚ, как предполагается, являются обязательными медиаторами ΤΝΕ-индуцируемой активации транскрипционного фактора ΝΕ-κΒ, заявители изучали то, способна ли избыточная экспрессия ΚΑΡ-2 в клеточной культуре взаимодействовать с этим конкретным сигнальным механизмом. Исходный набор экспериментов был проведён на клетках НЕК-293Т, по непостоянному типу трансфицированных репортерными плазмидами, включающими ген люциферазы, находящийся под контролем минимального промотора ΗΙν-ΕΤΚ. В близком наборе, в котором было установлено, что ΚΑΡ-2 подвергается негативной регуляции, который возвращается почти на исходный уровень, активация репортера обусловливалась и сверхэкспрессией различных известных индукторов ΝΕ-κΒ, вовлечённых в сигнальный путь ΤΝΕ (ΝΙΚ, ΤΚΑΕ2, ΚΙΡ и др.), и обработкой клеток внешними стимулами (ΤΝΕ и РМА: фиг. 5А). Клетки НЕК-293Т были по непостоянному типу трансфицированы репортерной плазмидой (активационные тесты с ΗΙν-ΕΤΚ-Бис или ΟΜν-Бис для ΝΕ-ΚΒ - 5А; и 6ΑΕ4-Ε^ для с-ίιιη - 5В) и экспрессирующим вектором для конкретного индуктора, а также либо пустым носителем ^ΌΝΑ3), либо плазмидой, кодирующей полноразмерный белок ΚΑΡ-2 ^ΚΑΡ-2). Нужно отметить, что тот факт, что ΚΑΡ-2 способен проявлять свои эффекты на таком далёком этапе сигнального пути, как фактор ^1Α, свидетельствует о том, что по крайней мере отчасти активность данного белка должна быть общей для разных, другими словами дивергировавших, сигнальных механизмов (см. далее). В то же время κΒ-независимая (контролируемая ранним промотором СаΜV) транскрипция люциферазы не нарушается (фиг. 5 А): следовательно, можно считать подтверждённой общую несогласованность базового механизма транскрипции/трансляции с участием ΚΑΡ-2. Эти результаты были после этого подтверждены в анализе на клетках линии НеБа (данные не включены).

Однако, в ходе проведения дальнейших тестов было установлено, что данное явление оказывается ещё более сложным. Действительно, когда ΤΚΑΕ2 был по перемежающемуся типу экспрессирован в клетках НЕК-293Т наряду с различным количеством ρсΚΑΡ-2, что отображено на фиг. 6, активность ΚΑΡ-2 резко изменялась при его низких концентрациях (примерно 20 нг на 1 млн. клеток), усиливая эффект ΤΚΑΕ2/-NΕ-κΒ-индукции транскрипции (см. фиг. 6А). Более того, путем замены исходной вставки на вставку в противоположной ориентации был получен эффективный носитель, экспрессирующий антисмысловую последовательность ΚΑΡ-2, и ΤΚΑΕ2 по перемежающемуся типу трансфицировали в клетки НЕК-293Т наряду с различными конкретными количествами конструкции рсКАР-2-а/δ (антисмысловая): был проанализирован эффект прогрессирующего исчезновения КАР-2, на основании чего была выстроена диаграмма зависимости от концентрации. Общая тенденция данного графика указывает на то, что уровень реакции клеток, в целом, обратно пропорционален количеству трансфицируемой ДНК КАР-2, за исключением характерного участка, который находится в своеобразной «нулевой точке», соответствующей номинальному (базовому) эндогенному уровню данного белка (фиг. 6). Нужно отметить, что негативная регуляция экспрессии данного гена путём внесения антисмысловой последовательности предположительно является более тонкой, в противоположность смысловой сверхэкспрессии. Действительно, антисмысловая конструкция не обусловливает искусственную выработку какого-либо чужеродного белка в данной клетке, а, следовательно, обеспечивает отчетливый недоучет ингибиторной способности КАР-2, Тем не менее, необходимо отметить, что упоминавшийся выше «скачок» низких концентраций отражен, не будучи развернутым, в «антисмысловой половине» графике (фиг. 6).

Для оценки разнообразия транскрипционных систем, в которые может быть вовлечен КАР-2, был проведен анализ фактора с-1ип ядерного фактора, роль которого в обеспечении и поддержании адекватной реакции на стрессы, как подтверждается, оказывается такой же, как и роль ΝΕ-κΒ. С использованием компонентов коммерческой системы «Ра!й Эе1ес1» (8!га!адепе) была подтверждена аналогична «двухфазовость» КАР-2 в отношении некоторых распознавательных активаторов АР-1 в клетках НЕК293Т и НеЬа (см. фиг. 5В и 6В).

Пример 5. Обусловливание белком КАР-2 гиперфосфорилирования с-1ип без изменения активности ΡΝΚ.

Для анализа механизма, определяющего данное существенное влияние на транскрипцию важным было определить точный уровень, на котором нормальный сигнальный путь прерывается. Известно, что трансактивационный потенциал с-1ип регулируется внеклеточным, индуцируемым сигналом фосфорилированием по двум остаткам серина (в положениях 63 и 73) в составе его Ν-концевого активаторного домена. Протеинкиназы 1ΝΚ/8ΑΓΚ, отвечающие за отмечавшееся выше фосфорилирование, представляют обособленную группу семейства МАР-киназ, которые способны самоактивироваться в результате фосфорилирования по треонину-183 и тирозину-185, опосредуемому дополнительными бифункциональными по специфичности киназами. Следовательно, наличие фосфорилирования по соответствующим сайтам в последовательностях с-1ип и ΡΝΚ может быть использовано в качестве маркера, который от ражает активированный статус данного белка. Анализ методом Вестерн-блоттинга лизатов клеток НЕК-293Т, трансфицированных по непостоянному типу, показал, что, несмотря на нарушение с1ип-опосредуемой транскрипции, КАР-2 в существенной степени способен обеспечивать фосфорилирование эндогенной киназы с-1ип по серину-63, индуцируемое рядом стимулов (см. фиг. 7А). Общие клеточные лизаты клеток НЕК-293Т, трансфицированных указанными экспрессионными конструкциями наряду либо с плазмидой рсЭНА3. отмеченной на фиг. 7 «минусом» (-), либо с плазмидой рсКАР-2, отмеченной на той же фигуре «плюсом» (+), были протестированы методом электрофореза в δΌδПААГ, перенесены на ЕСЬ-мембраны и прогибридизованы с антителами (ΝΕΒ), специфичными в отношении фосфорилированной по серину63 с-1ип. Полученная мембрана изображена на нижней части фиг. 7А - её повторно гибридизовали с антителами к общей с-1ип, что служило контролем (ΝΕΒ).

Однако общее количество с-1ип остается неизменным, за исключением повышения уровней с-1ип в качестве возможного источника модификаций. Антитела, специфичные в отношении фосфорилированной формы ΡΝΚ1/2, не позволяют выявить сколько-нибудь существенного увеличения количества этих активированных киназ в ответ на сверхэкспрессию белка КАР-2: это указывает на то, что дополнительное фосфорилирование с-1ип не обусловливалось КАР2зависимым бустингом активности киназ ΡΝΚ (фиг. 7В). Активированная ΡΝΚ1/2 из клеток НЕК-293Т, трансфицированных либо рсЭНА3, либо рсКАР-2, обработанных йгТНР α с целью повышения периода времени реакции, была выявлена в методе Вестерн-блоттинга при анализе полных лизатов с использованием антител к ΡΝΚ, фосфорилированной по Тйг-183/Туг-185 (ΝΕΌ), что показано на фиг. 7.

Для дальнейшего подтверждения последнего факта киназный тест ш νίίτο с иммунопреципитированной ΡΝΚ1 и очищенной химерой С8Т/с-1ип в качестве субстрата позволил получить принципиально такие же результаты (фиг. 7С). Клетки НЕК-293Т были котрансфицированы «пустым» вектором, плазмидами рсКАР-2 и рсКРР в различных сочетаниях наряду с плазмидой, экспрессирующей химеру НА/ΡΝΚΡ Затем ΡΝΚ1 иммунопреципитировали на основе ее Νконцевой НА-метки, а ее способность фосфорилировать выработанный бактериями очищенный С8Т-1ип определяли по включению ³²Р в киназном тесте ш νί!Γο. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в δΌδ-ПААГ, что показано на фиг. 7.

Белок КАР-2 становится фосфорилированным тогда, когда иммунопреципитируемый из трансфицированных клеток НЕК-293Т комплекс КАР-2/1КК1 инкубируется в условиях фосфорилирования ш νίΙΐΌ. Анализ функциональной ро ли фосфорилирования белка КАР-2 показал, что мутирование одного конкретного остатка серина (в 148-м положении) полностью предотвращает активацию контролируемого им фосфорилирования Чип. Как показано на фиг. 13, хотя избыточная экспрессия КАР-2 дикого типа обусловливала резкое возрастание фосфорилирования Чип, избыточная экспрессия мутантного КАР2 (8148А) не подавляет фосфорилирование Чип вообще. Однако, влияние КАР-2 на ΝΡ-κΒ не нарушалось этой мутацией вовсе. Эти данные показывают, что фосфорилирование по серину148 в последовательности КАР-2 специфическим образом вовлечено во влияние этого белка на фосфорилирование Чип.

Пример 6. Отсутствие ингибирования белком КАР-2 связывания с-1ип и Ке1А с ДНК.

С точки зрения того факта, что описанные в примере 5 эксперименты не позволили установить цитоплазматической модуляции мишени сверхэкспрессии КАР-2 в сигнальных каскадах факторов ΝΡ-κΒ и АР-1, заявители проанализировали целостность ядерных процессов, необходимых для осуществления транскрипции. Тест на сдвиг в величине электрической подвижности (ЕМ8А) был осуществлен на материале ядерного экстракта трансфицированных клеток НЕК-293Т: он однозначно продемонстрировал, что КАР-2 не нарушает связывания сЧип и Ке1А с олигонуклеотидами, соответствующими классическим сайтам узнавания этих факторов (фиг. 8). Действительно, было выявлено усиление в несколько раз эффективности образования комплекса ДНК с АР-1 в клетках, трансфицированных белком КАР-2. Более того, не было выявлено взаимодействия между КАР-2 и с-1ип/Ке1А, что может быть обусловлено пространственным нарушением структуры активационных доменов последних факторов. Было подтверждено, что, если и он существует, то эффект проникновения КАР-2 внутрь ядра опосредуется на несколько этапов позже этапов связывания энхансеров.

Пример 7. Взаимодействие КАР-2 ш νίνο с ацетилтрансферазой гистонов Т1Р60.

МР60 (6епеБапк: № И-74667) относится к недавно описанному семейству ядерных белков, называемых ацетилтрансферазами гистонов (НАТ). Каталитическая активность этих белков ассоциирована с определенной организацией хроматина в нуклеосомах. Часто ферменты НАТ ассоциированы с некоторыми элементами транскрипционного аппарата и способны модулировать скорость транскрипции. НАТ действуют путем ослабления упакованности хроматина вблизи сайтов инициации за счет переноса ацильных групп на конкретные остатки лизина в последовательностях гистонов, тем самым обусловливая избыточность различных ДНКсвязывающихся факторов. По-видимому, он является одним из тех вспомогательных ядер ных белков, которые призваны обеспечить связь между энхансер-связывающими факторами и РНК-полимеразой II. В связи с этим заявители исследовали, может ли Т1Р60 образовывать комплекс с КАР-2. Иммунопреципитация из клеток НеЬа с последующими двухгибридными тестами отчётливо подтвердила, что КАР-2 интенсивно взаимодействует с Т1Р60 в обеих системах. Тем не менее не удалось выявить сколько-нибудь существенных изменений в опосредуемом белком КАР-2 влиянии на ΝΡ-κΒ и с-1ип после коэкспрессии Т1Р60 в клетках НЕК-293Т (данные не включены). Такое же отсутствие изменений было установлено в контрольном эксперименте, т.е. при стимуляции ± Т1Р60 без КАР-2, на основании чего делается заключение о том, что наличие достаточно короткого времени (20-30 ч после трансфекции) не дает шанса репортерной ДНК конденсироваться, не оставляя достаточного времени для активности НАТподобных ферментов.

Пример 8. Клон № 10 - новый белок, взаимодействующий с КАР-2.

Применяя полноразмерный белок КАР-2 в качестве «наживки» в двухгибридном скрининге библиотеки кДНК В-лимфоцитов, был выделен новый белок, взаимодействующий с КАР-2, который в данном тексте обозначен как «клон № 10» или «кодируемый клоном № 10 белок», или «КАТ-связывающийся белок № 10», или «КБР-10» (фиг. 10). Исходный клон (длиной примерно 2200 пар нуклеотидов), как было установлено, кодирует предполагаемый полипептид с молекулярной массой 60 кД. Однако предполагаемый старт-кодон АТ6, повидимому, в этой последовательности отсутствует. Несмотря на достаточно значительную длину, выделенная кДНК, по-видимому, должна простираться дальше в 5'-направлении до завершения полной кодирующей рамки.

В двухгибридном тесте на репертуар связывания клона № 10 было установлено, что этот белок, помимо КАР-2, обладает весьма существенным сродством в отношении белка ТКАЕ2. Однако клон № 10 не связывается с К1Р, ТЕЛОЭ, МОКТ1, МАСН, 'ΓΝΕ^-Τ, Т1Р60 и ΝΙΚ, равно как и с некоторыми контрольными белками (например, с ламином и циклином). Однако нельзя исключать, что связывание клона № 10 с ΝΙΚ может быть обнаружено в клетках млекопитающих, с учетом свойств ΝΙΚ, проявляемых в клетках дрожжей. Как было показано, клон № 10 связывается с КАР-2 на 200-аминокислотном С-концевом участке ΝΙΚ, т.е. на участке, не обязательно ассоциированном со связыванием К1Р, Т1Р60, ΝΙΚ и 1ККв.

Коэксперессия клона № 10 и ТКАГ2 в клетках НЕК-293Т млекопитающего предотвращает опосредованную белком ТКАР2 активацию фактора ΝΡ-κΒ, в то время как коэкспрессия клона № 10 с ΝΙΚ в существенной сте65 пени усиливает активацию ΝΕ-κΒ последней. Эти данные могут указывать на важную регуляторную функцию клона № 10. Выявленные дифференцированные модулирующие эффекты, по-видимому, свидетельствуют о существовании различных неперекрывающихся сайтов, на которые направлено действие данного белка в клетке.

Несколько раундов поиска в СепВапк, предпринятых с целью идентификации гомологов клона № 10, привели к выявлению Е40Е12.5 (депозитарный № 8-42834) - гипотетического белка нематоды С.е1едап§, для которого физиологическая роль пока не установлена. Интересно, что для белка Е404Е12.5 было установлено определённое сходство с некоторыми представителями в значительной степени консервативного семейства контролируемых убиквитином протеаз. Эти ферменты противодействуют деструктивных механизмам, обеспечиваемым убиквитином, который, как известно, участвует в большинстве процессов разрушения белков в клетке. При том, что лигазы убиквитина связаны с прикреплением полиубиквитиновых молекул к предназначенному для разрушения белку, протеазы убиквитина предотвращают эффективное разветвление растущей молекулы («дерева») полиубиквитина. Такое предположение, касающееся функций белка Е40Е12.5, основывается на сходстве упоминавшихся выше контролируемых убиквитином протеаз, однако, оно попрежнему остается под вопросом, т. к. пока не было проведено исследований того, обусловливает ли данный конкретный белок какую-либо каталитическую активность в отношении полиубиквитинов. Более того, ряд моментов, как представляется, делает данное предположение весьма маловероятным:

(а) аминокислотные остатки, которые, как считаются, составляют основу каталитического участка в любом из подклассов убиквитинпротеаз, не являются консервативными ни в Е40Е12.5, ни в клоне № 10;

(б) за исключением их каталитических сайтов, ферменты, относящиеся к контролируемым убиквитином протеазам, происходящие от разных видов (от бактерий до человека), не проявляют сколько-нибудь существенного сходства последовательностей, в то время как Е40Е12.5 и клон № 10 характеризуются наличием определенного уровня гомологии.

Пример 9. Клон № 84 - белок, взаимодействующий с КАР-2.

Дополнительный КАР2-связывающий белок был идентифицирован путем использования полноразмерного белка КАР-2 в качестве «наживки» в двухгибридной процедуре в отношении библиотеки кДНК В-лимфоцитов: он был обозначен как «клон № 84».

Было установлено, что клон № 84 специфически связывается с полноразмерным КАР-2, в то время как не проявляет взаимодействия с любым из других исследованных белков, включая ТКАЕ2, МОКТ-1, ТКАОО, К1Р, ΝΙΚ, Т1Р60 и ламин. Частичная 5'-последовательность клона № 84, как было показано, идентична последовательности ранее клонированной кДНК, кодирующей белок «регуляции клеточного роста» (ССК19), идентифицированный в качестве транскрипта, который специфически позитивно регулируется в клетках, накапливающих функциональный белок р53 (8.Маббеп е! а1., 1996; депозитарный № И-66469). Секвенирование ССК19 позволило идентифицировать мотив «цинковые пальцы» -цистеин₃-гистидинцистеин₃ (также обозначаемый как «ΚΙΝΟпалец») - в составе его С-концевого домена. Экспрессия ССК19, как было выяснено, подавляет рост некоторых клеточных линий.

Вовлечение белка С6К19 в регуляцию ΝΕкВ за счет связывания с КАР-2, по-видимому, указывает на модуляцию механизмов регуляции клеточных циклов членами семейства Т№рецепторов.

Пример 10. Структурно-функциональные отношения КАР-2.

А. Участки связывания.

С применением анализа последовательных делеций в последовательности КАР-2 были картированы сайты связывания и были идентифицированы домены связывания К1Р, ΝΙΚ и Т1Р60, равно как и домены самоассоциирования (фиг. 11).

Сайт связывания с К1Р был определен на участке белка КАР-2, который начинается между аминокислотами 177-218 и заканчивается на аминокислоте 264.

Не было установлено перекрывания сайта связывания с К1Р в последовательности КАР-2 ни с сайтом связывания с ΙΚΚβ, ни с сайтом связывания ΝΙΚ (соответственно, аминокислоты 95-264 и аминокислоты 1-264) (фиг. 11).

Сайт связывания с Т1Р60, по-видимому, находится на участке аминокислот 95-264. Отсутствие взаимодействия с делеционным фрагментом, включающим аминокислоты 95-309, наиболее вероятно обусловливается специфическим нарушением конформации белка, к которому приводит данная конкретная деления.

Сходное несоответствие в связывании с делеционными фрагментами может быть отмечено по связыванию клона № 10 и для самоассоциации белка КАР-2. В противоположность белку Т1Р60, однако, тот факт, что полноразмерный КАР-2 связывается с делеционным фрагментом, включающим аминокислоты 218416, равно как и с делеционным фрагментом, включающим аминокислоты 1-264, указывает на то, что участок, вовлеченный в процесс гомодимеризации, находится между аминокислотами 217-264.

Белок, кодируемый клоном № 10, с учетом упомянутого выше исключения, по-видимому, связывается в сайте, начинающемся на участке аминокислот 218-309 и заканчивающемся на участке аминокислоты 416, причем его сайт связывания может перекрываться с сайгами связывания К1Р, ΝΙΚ, ΙΚΚβ и ЛР60 (фиг. 11).

Б. Функциональные участки.

В той степени, в какой это было изучено к настоящему моменту, все функциональные проявления белка КАР-2 (а именно подавление ΝΚкВ и индукция гиперфосфорилирования с-1ип) картируются в один и тот же участок (фиг. 11).

Более того, возможно, что этот участок, существенный с точки зрения эффективной модуляции передачи сигнала всеми индукторами, использовавшимися в проведенных экспериментах, находится в Ν-концевом сегменте данного белка.

Участок аминокислот 95-416 характеризуется определенным проявлением, хотя оно оказывается существенно более слабым по сравнению тем проявлением, которое характерно для полноразмерного белка: следовательно, он может быть следствием усиленной агрегации эндогенного КАР-2.

Более того, за исключением Ке1А, влияние всех индукторов, использовавшихся в проведённых экспериментах, может быть опосредовано, как минимум, примерно 100 Ν-концевыми аминокислотами последовательности КАР-2. Действительно, даже фрагмент, состоящий из аминокислот 1-102, опосредует отчетливый эффект, хотя и весьма средний по силе (фиг. 12В).

С другой стороны, успешная индукция Ке1А требует участия более длинного фрагмента белка КАР-2. Пока имеется возможность определить границы этого участка между аминокислотами 1 и 264 в котором, по-видимому, находится участок между аминокислотами 157 и 264, обладающий в определенной степени специфичными связывающими свойствами, ассоциированными с Ке1А.

В. Соотношение функций и связывания.

Основываясь на данных, показанных на фиг. 11 и 12, предполагается, что:

(a) за исключением Ке1А, связывание КАР2 с К1Р, клоном № 10 и, наиболее вероятно, с ΝΙΚ и ΤΙΓ60 не зависит от собственно функций данного белка, связанных с подавлением сверхэкспрессии, индуцированной ΝΚ-кВ;

(b) влияние КАР-2 на индуцированную сверхэкспрессией Ке1А активацию, очевидно, опосредуется, по крайней мере отчасти, различными процессами связывания. Существенно то, что все упоминавшиеся выше белки, как можно видеть, участвуют в обеспечении такой активности, на что указывают данные проведенных к настоящему времени экспериментов.

Точный сайт взаимодействия между КАР-2 и К1Р пока точно не определен, однако, представляется, что этот сайт является специфичным для К1Р и КАР-2 и отсутствует в других белках, для которых известно взаимодействие с К1Р, таких как МΟКΤ-1, ТСАОВ, ЕА8-К и, повидимому, также ΤКАΕ2 (см. Майшп е! а1., 1997). Также становится ясным (исходя из данных секвенирования и сравнения последовательностей различных баз данных, отмечавшихся выше), что КАР-2 в своем составе не имеет «гибельного домена», «МΟКΤ-модуля», протеазного домена (например, мотива, характерного для протеаз 1СЕ/СЕП3), киназного домена или мотива или ΤКАΕ-доменов. В связи с этим анализ биологической активности также подтвердил, что КАР-2, по-видимому, характеризуется следующим:

(1) в случае сверхэкспрессии КАР-2 жестко подавляет активацию ΝΚ-кВ, обусловливаемую ΤΝΕ или сверхэкспрессией ΤКА^^, К1Р, ΤКАΕ-2, ΝΙΚ или р65-субъединицей ΝΚкВ;

(2) КАР-2 способен обеспечивать гиперфосфорилирование с-йш без изменения активности киназы ΊΝΚ;

(3) КАР-2, как было установлено в делеционном анализе, не зависит ни от «домена гибели» ШР, ни от киназной активности ШР с точки зрения связывания с ШР;

(4) основываясь на упомянутом выше делеционном анализе, сайт связывания КАР-2 с ШР был сужен до Ν-концевого участка длиной примерно в 200 аминокислот;

(5) КАР-2 связывается с ΝΙΚ в трансфицированных клетках млекопитающих, но не дрожжей.

Таким образом, с точки зрения перечисленного выше КАР-2, по-видимому, является высокоспецифичным ШР-связывающимся белком, а, следовательно, и модулятором/медиатором ШР, поэтому он, весьма вероятно, вовлечен в опосредованные фактором КГР внутриклеточные сигнальные механизмы.

В свете сказанного выше представляется, что КАР-2 участвует в модуляции/опосредовании активностей КГР. Внутри клеток это связано с участием КГР в механизме контроля выживаемости клеток (активация ΝΚ-кВ, возможно через взаимодействие с ΤΡΛΕ2) и с механизмах гибели клеток и воспалений (независимо через «гибельный домен» этого белка или через взаимодействие с другими белками, такими как ΜΘΒΤ-1, Τ^ΩΩ, р55-К, РА^-К и связанными с ними протеазами, такими как МАСН, Мсй4, С1 и подобными). Вероятные пути, по которым КАР-2 способен модулировать/опосредовать активность КГР, подробно обсуждались в данном тексте выше. Например, взаимодействие КАР^/ШР может обусловливать усиление механизмов либо гибели клеток, либо выживания клеток, или же оно может обусловливать подавление механизмов либо гибели клеток, либо выживания клеток, при том, что такое усиление или подавление, по-видимому, зависит от относительных уровней активности других участников этих двух противоположных по действию клеточных механизмов. Также КАР-2 способен выполнять функции «депо»белка, обеспечивая агрегации группы молекул К1Р и других К1Р-или КАР2-связывающихся белков, при том, что такая агрегация затем может функционировать либо в направлении гибели клеток, либо выживания клеток (или в обоих направлениях) в зависимости от соотношения количества и (или) активностей других участников этих клеточных механизмов.

Пример 11. Получение поликлональных антител к КАР-2.

Исходно кроликам подкожно инъецировали по 5 мкг чистого препарата КАР-2, эмульгированного в полном адъюванте Фройнда. Спустя 3 недели инъекции повторяли, вводя подкожно по 5 мкг препарата КАР-2 в неполном адъюванте Фройнда. Две дополнительные инъекции КАР-2 в виде раствора в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) проводили с 10-дневным интервалом. Через 10 дней после последней иммунизации у кроликов брали кровь. Уровень формирующихся антител определяли в радиоиммунологическом тесте. КАР-2, помеченный ¹²⁵1, смешивали в различных разведениях (1:50, 1:500, 1:5000 и 1:50000) с кроличьей сывороткой. Суспензию шариков из агарозы с белком-С (20 мкл: Рйагтас1а) добавляли при общем объеме в 200 мкл. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем шарики трижды промывали и подсчитывали связанную с ними радиоактивность. В качестве негативного контроля использовали кроличью антисыворотку к лептину человека. Титр антисыворотки КАР-2 определяли, сравнивая с показателем негативного контроля.

Пример 12. Получение моноклональных антител к КАР-2.

Вначале самок мышей линии ВАЬВ/с (в возрасте 3 месяцев) инъецировали 2 мкг очищенного КАР-2 в виде эмульсии в полном адъюванте Фройнда, а спустя 3 недели вводили его подкожно в неполном адъюванте Фройнда. С 10-дневным интервалом проводили три дополнительные инъекции - подкожно в ФСБ. Окончательный бустинг осуществляли путем внутрибрюшинных инъекций за 3-4 дня до слияния клеток той мыши, которая характеризовалась наивысшим титром, исходя из данных 1К1А (см. ниже). Слияние клеток осуществляли между миеломными клетками N80/1 и лимфоцитами, приготовленными на материале тканей селезенки и лимфатических узлов животного. Гибридизовавшие клетки распределяли на микротитровальных планшетах и полученные гибридомы отбирали в культуральной среде ОМЕМ, дополненной селективной смесью НАΤ и 15% кобыльей сыворотки. Гибридомы, для которых устанавливалась выработка антител, специфичных в отношении КАР-2, субклонировали при ограничивающем разведении и инъецировали мышам линии ВАЬВ/с, которым предварительно вводили пристан с целью индукции выработки асцитной жидкости. Изотипы получаемых антител определяли с использованием доступного на коммерческой основе набора реактивов для ТИФА - ЕЫ8А кй (Атегайат, Англия).

Скрининг гибридом, вырабатывающих моноклональные антитела к КАР-2, осуществляли следующим образом. Гибридомные надосадочные фракции тестировали на присутствие в них антител, специфичных к КАР-2, с помощью обращенного твердофазного радиоиммунологического теста (1К1А). Планшеты для ТИФА (Ьуиа!еск ЬаЬ., А1ехаибпа, УА) покрывали очищенным в Τа1οи 1Ь-18ВРа-Н1§₆ (10 мкг/мл, 100 мкл на лунку). После инкубации в течение ночи при 4°С планшеты промывали 2 раза в ФСБ, содержащем бычий сывороточный альбумин (0,5%) и Твин-20 (0,05%) и блокировали в промывающем растворе в течение по крайней мере 2ч при 37°С. Добавляли надосадочные фракции гибридомных культур (100 мкл на 1 лунку) и планшеты инкубировали в течение 4 ч при 37°С. Планшеты затем трижды промывали и добавляли конъюгат козьих антимышиных антител с пероксидазой хрена (НРК: Шсккои ЬаЬ; разведение 1:10000, 100 мкл на лунку) на 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 4 раза и индуцировали окрашивание добавлением в качестве субстрата 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (81дта) с перекисью водорода. Для считывания планшетов использовали автоматический сканер для ТИФА. Образцы, оптическая плотность которых была по крайней мере в 5 раз выше по сравнению с негативным контролем, рассматривались как позитивные.

Антитела к КАР-2 могут быть использованы для целей очистки КАР-2 в методе аффинной хроматографии.

Пример 13. Тест ТИФА.

Микротитровальные планшеты (Пуиа!есй или МахйогЬ; Мшс) покрывали моноклональным антителом, специфичным в отношении КАР-2 (иммуноглобулины из бессывороточной гибридомной надосадочной фракции или асцитной жидкости) в течение ночи при 4°С. Планшеты затем промывали в ФСБ с добавлением бычьего сывороточного альбумина (0,5%) и Твин-20 (0,05%) и блокировали тем же самым раствором в течение по крайней мере 2 ч при 37°С. Анализируемые образцы разводили в блокирующем растворе и добавляли в лунки (по 100 мкл на лунку) в течение 4 ч при 37°С. Затем планшеты трижды промывали в ФСБ, содержащем Твин-20 (0,05%) с последующим добавлением кроличьей анти-КАР2 сыворотки (1:1000, 100 мкл на лунку) для дальнейшей инкубации в течение ночи при 4°С. После этого планшеты трижды промывали и добавляли конъюгат козьих антимышиных антител с пероксидазой хрена (НРВ: 1асккоп ЬаЬ; разведение 1:10000, 100 мкл на лунку) на 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 4 раза и индуцировали окрашивание добавлением в качестве субстрата 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6сульфоновой кислоты) (81дта) с перекисью водорода. Для считывания планшетов использовали автоматический сканер для ТИФА.

Имея теперь полное описание настоящего изобретения, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что то же самое может быть осуществлено в широком круге эквивалентных параметров, концентраций и условий без отклонения от духа и буквы настоящего изобретения и без проведения дополнительных посторонних экспериментов.

Поскольку настоящее изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами, то должно быть ясно, что в него могут быть внесены дополнительные модификации. Данная заявка призвана охватить любые изменения, применения или адаптирования настоящего изобретения с учётом принципиальных аспектов настоящего изобретения, а также включая такие отклонения от настоящей заявки, которые могут проявиться на практике в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, и оно может быть применено в связи с его базовыми параметрами, описанными, в частности, в нижеследующей формуле изобретения.

Все цитировавшиеся в данном тексте источники, включая журнальные статьи или тезисы, опубликованные или поданные заявки на американские или зарубежные патенты, выданные патенты США или других стран, или любые иные источники в полном свое объеме включены здесь только для сведения в виде библиографических ссылок, включая все их, таблицы, фигуры и цитаты, входящие в данные цитируемые источники. Кроме того, полное содержание цитируемых источников также приводится здесь исключительно для сведения.

Обращение к известным методическим этапам, элементам стандартных методов, известным методам или стандартным методам ни в какой степени не является допущением того, что любые из аспектов, описаний или вариантов настоящего изобретения были уже заявлены, представлены или подтверждены в данной области техники ранее.

Предыдущее описание конкретных вариантов в полном своем объеме призвано лишь осветить общий смысл настоящего изобретения, которое с применением известного специалистам в данной области техники (включая информацию из различных печатных источников, цитировавшихся в данном тесте) может быть легко модифицировано и (или) адаптировано для целей различных путей использования его конкретных вариантов, не проводя при этом дополнительных экспериментов, без отклонения от базовой концепции настоящего изобретения.

Следовательно, такое адаптирование и такие модификации попадают в круг эквивалентов заявленных здесь вариантов, основываясь на сделанных здесь описаниях и руководствах. Также должно быть понятно, что терминология, использовавшаяся здесь, учитывали цели настоящего описания и не служила для какоголибо ограничения, т.е. такая терминология данной заявки должна интерпретироваться специалистами в данной области техники в свете описаний и руководств, представленных данной заявкой в сочетании с тем, что известно специалистам в данной области техники.

Библиография

А1петп, Е.8. е! а1. (1995) 1. Вю1. Сйет. 270:4312-4317.

Ваппада, М. (1993) 8с1епсе 262:1512-1514.

Вед, А.А. апй ВаШтоге, Ό. 8с1епсе 274:782-784.

Ве1й1ег, 1. е! а1., (1995) 1. Вю1. Сйет. 270:16526-16528.

Вегдег, 1. е! а1., (1988) 6епе 66:1-10.

ВеиЙег, В. апй Сегатд С. (1987) ΝΕΙΜ: 316:379-385.

В1дйа, 1. е! а1. (1994) 1. Ехр. Мей. 180:445460.

Во1йш, М.Р. е! а1. (1995а) 1. Вю1. Сйет. 270:337-341.

Во1йш, М.Р. е! а1. (1995Ь) 1. Вю1. Сйет. 270:7795-7798.

Во1йш, М.Р. е! а1. (1996) Се11 85:803-815.

ВгакеЬиксй, С. е! а1. (1992) ЕМВО 1., 11:943-950.

Вгоскйаик, М. е! а1. (1990) Ргос. №!1. Асай. 8οΐ. И8А, 87:3127-3131.

Сап!ог, 6.Н. е! а1. (1993) Ргос. №!1. Асай. 8οΐ. И8А 90:10932-6.

Сеггей, И.Р. е! а1. (1992) 8с1епсе 256:97100.

Сйеп, С.1. е! а1. (1992) Апп. Ν.Υ. Асай. 8с1. 660:271-3.

СЫппауап е! а1. (1995) Се11 81:505-512.

СЫппауап е! а1. (1996) 1. Вю1. Сйет. 271:4961-4965.

Скопе, М.С. е! а1. (1995) ЕМВО 1. 14:58595868.

С1етеп!, М.У. е! а1. (1994) 1. Ехр. Мей. 180:557-567.

Сг1ке11, Р. е! а1., (1993) ШсЮс Аайк Век. (Епд1апй) 21 (22):5251-5.

Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду (АикиЬе1, Р.М., Вгеп!, В., Кшдк!оп, В.Е., Мооге, Ό.Ό., 8е1йтап, 1.6., 8тИй, 1.А.. 8!гиЫ, К., А1ЬпдЫ, Ь.М., Соеп, И.М. & Уагкд А., ейк.), (1994) рр. 8.1.1-8.1.6 апй 16.7-16.7.8, Сгеепе РиЬНкЫпд Аккос1а!ек, 1пс. апй \УПеу & 8опк, 1пс., Νονν Υо^к.

Όπ-кк, №., е! а1., (1993) Сепе 128:247-249.

Иикее, Τ. е! а1. (1993) Сепек Эеу. 7:555569.

Е1ксйеп, С.М. е! а1. (1994) 1. 1ттипо1. 153:1947-1954.

ЕШк, Н.М. е! а1. (1986) Се11 44:817-829.

Епап, М. е! а1. (1995) №!иге 375:78-81.

Епде1тапп, Н. е! а1. (1990) I. Вю1. Скет., 265:1531-1536.

Еаискеи, С. е! а1. (1995) ЕМВО I. 14:19141922.

Еетапйек-А1петп, Т. е! а1. (1994) I. В1о1. Скет. 269:30761-30764.

Еетапйек-А1петп, Т. е! а1. (1995) Сапсег Кек. 55:2737-2742.

Еетапйек-А1петп, Т. е! а1. (1996) Ргос. №!1. Асай. δοΐ. И8А 93:7464-7469.

Е1е1й, I. е! а1. (1988) Мо1. Се11 Вю1. 8:21592165.

Е1е1йк, 8. апй 8опд. О. (1989) №!иге, 340:245-246.

Егапдюш, ЬУ. апй №е1, В.С. (1993) Апа1. Вюскет. 210:179-187.

Сеукеп, Н.М. (1985) 1ттипо1. Тойау 6:364369.

Сеукеп, Н.М. е! а1. (1987) I. 1ттипо1. Ме!к. 102:259-274.

Соккеп, М. апй Вогуагй, Н. (1992) Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А, 89:5547-5551.

Сге11, М. е! а1. (1994) Еиг. I. 1ттипо1. 24:2563-2566.

Не11ег, К.А. е! а1. (1990) Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А, 87:6151-6155.

Непкай, Р.А. (1996) 1ттипку 4:195-201.

Ноктапп, Н.-Р. е! а1. (1989) I. Вю1. Скет., 264:14927-14934.

Но\\'агй. ΛΌ. е! а1. (1991) I. 1ттипо1. 147:2964-2969.

Нки, Н. е! а1. (1995) Се11 81:495-504.

Нки, Н. е! а1. (1996) Се11 84:299-308.

1!ок, Ν. е! а1. (1991) Се11 66:233.

1!ок, Ν. апй №да!а, 8. (1993) I. Вю1. Скет., 268:10932-7.

.Токерк, 8. апй Вигке, !М. (1993) I. Вю1. Скет. 268:24515-8.

Катепк, I. е! а1. (1995) I. Вю1. Скет. 270:15250-15256.

Каийтапп, 8.Н. (1989) Сапсег Кек. 49:58705878.

Каийтапп, 8.Н. (1993) Сапсег Кек. 53:39763985.

К1кскке1, Е.С. е! а1. (1995) ЕМВО к 14:5579-5588.

КА/итк М. е! а1. (1993) Вю1. Ркагт. Ви11 (1арап) 16 (9):879-83.

Китаг, 8. е! а1. (1994) Сепек Эе\'. 8:16131626.

Китаг, 8. (1995) Тгепйк Вюскет 8ск 20:198-202.

Ьа/еЬшк, У.А. е! а1. (1994) №11иге 371:346347.

Ьеккаикег, Е. е! а1. (1993) ЬаЬ !пуек1. 69:415-429.

Ь1, Υ. е! а1. (1998) Мо1. Се11 Вю1. 18:16011610

Ьое!кскег, Н. е! а1. (1990) Се11, 61:351-359.

Ьок. М. е! а1. (1995) №!иге 375:81-83.

Маййеп, 8.Ь. е! а1. (1996) Сапсег Кек 56:5384-5390.

МаИшп, КЬ. е! а1. (1997) №!иге 385:540544.

Магйп, 8.1. е! а1. (1995) I. Вю1. Скет. 270:6425-6428.

МакЫта, Т. е! а1. (1995) Вюскет. Вюркуз. Кек. Соттип. 209:907-915.

Мй1ег, В.Е. е! а1. (1995) I. 1ттипо1. 154:1331-1338.

Мйкдап, С.Е. е! а1. (1995) №игоп 15:385393.

Мшга, М. е! а1. (1995) Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А 92:8318-8322.

Мипйау, ΝΑ. е! а1. (1995) I. Вю1. Скет. 270:15870-15876.

МигашкЫ, 8. е! а1. (1991) Ркагт. Кекеагск 8:649.

Микй А.М., е! а1. (1997) 8с1епсе 1997 275:400-402 №дака, 8. апй Со1к!ет, Р. (1995) 8с1епсе 267.1449-1456.

№!ок, С. е! а1. (1997) I. Вю1. Скет. 272.26079-26082.

№ско1коп, Ό.№. е! а1. (1995) №!иге 376:3743.

Νорка г, Υ. е! а1. (1990) ЕМВО I, 9:32693278.

Рк|ие1 Р.Е. е! а1. (1987) I. Ехр. Мей., 166:1280-89.

Кау е! а1. (1992) Се11 69:597-604.

Кидд1его, У. е! а1. (1987) Се11 1ттипо1. 107:317-325.

8атЬгоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1й 8рппд НагЬог, ΝΥ.

8ска11, Т.к е! а1. (1990) Се11, 61:361-370.

8ск1еде1, е! а1. (1996) I. Вю1. Скет., 271:1841-1844.

8ски1/е-Окккой, К. е! а1. (1994) ЕМВО к 13:4587-4596.

8к1тауата, Т. е! а1., (1993) №с1ею Ас1йк 8утр. 8ег. 29:177-8.

8коге, 8.К. е! а1. (1993) Опсодепе 8:3183-8.

81еа!к, Р.К. е! а1. (1990) к Вю1. Скет. 265:14526-14528.

8ткк, С.А. е! а1. (1990) 8аепсе, 248:10191023.

8опд, НА. е! а1. (1994) I. Вю1. Скет. 269:22492-22495.

8гшКаки1а, 8.М. е! а1. (1996) Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А 93:14486-14491.

8капдег, В.2. е! а1. (1995) Се11 81:513-523.

Тайадка, Ь.А. е! а1. (1993) Се11, 74:845-853.

Те^ап, М. е! а1. (1995) I. Вю1. Скет. 270:3255-3260.

Те^ап, М. е! а1. (1995а) I. Вю1. Скет. 270:18738-18741.

Те^ап, М. е! а1. (1995Ь) Се11 81:1-20.

ТкотЬеггу, КА. е! а1. (1992) №11иге 356:768-774.

ТйотЬеггу, КА. е! а1. (1994) ВюсНетШгу 33:3934-3940.

Тгасеу, ТТ. е! а1. (1987) Книге, 330:662664.

Уап АпЩегр, Ό.Τ е! а1. (1996) 8с1епсе 274:787-789.

УапйепаЬее1е, Р. е! а1. (1995) Тгепйк Се11 Вю1. 5:392-400.

УаккаШ, Р. (1992) Апп. Кеу. 1ттипо1. 10:411-452.

Уа11асЬ, Ό. (1984) 1. 1ттипо1. 132:2464-9.

\Уа11ас1н Ό. (1986) 1п: 1п1егГегоп 7 (1оп Сгеккег, ей.). рр. 83-122. Асайетк Ргекк, Ьопйоп.

\Уа11ас1н Ό. е! а1. (1994) Су!окше 6:556.

Книд, Ь. е! а1. (1994) Се11 78:739-750.

Уапд, С.-Υ. е! а1. (1996) 8скпсе 274:784787.

Уа!апаЬе-Рикцпада, К. е! а1. (1992) Книге, 356:314-317.

Уа!апаЬе, Р.К. е! а1. (1992) 1. 1ттипо1. 148:1274-1279.

ХУеЦхеп, М. е! а1. (1980) 1. 1ттипо1. 125:719-724.

ХУПкк, А.Р. е! а1. (1989) Ргос. №!1. Асай. δοΐ. И8А, 86: 1603-1607.

Уопд е! а1. (1994) 1. 1ттипо1. 152:17511755.

Хие, Ό. е! а1. (1995) Книге 377:248-251.

Υатаока, 8, е! а1. (1998) Се11 93:1231-1240. Υо пека га, 8. е! а1. (1989) 1. Ехр. Мей. 169:1747-1756.

Υ^π, 1. е! а1. (1993) Се11 75:641-652.

2ассйапа, 8. е! а1. (1991) Еиг. 1. РЬагтасо1. 203:353-357.

211ао, 1.1. апй Р1ск, Ь. (1993) Книге (Епд1апй) 365:448-51.

Список последовательностей <110> ХУА1.1.АС11 Эау|й

ΚΟΛΆΙ .ΕΝΚΟ Апйге1

Υейа Кек. & Эеуе1ор. Со. Ь!й.

<120> Модуляторы функций рецепторов семейства рецепторов Т№ЖСР и других белков <130> рецепторы Т№ЖСР <140>

<141>

<150> 123758 <151> 19 марта 1998г.

<150> 126024 <151> 1 сентября 1998г.

<160> 3 <170> Ра!епйп Уегк. 2.0 <210> 1 <211> 2009 <212> ДНК <213> человек <400> 1

даадаЕЕсса	ЕХдЕдддссЕ	дздаддссЕа	дсаадддсдд	ассдсдааас	гдддасхЕЛЕ	60
ЕЕсддадсдс	сддддсссЕа	ссадсдЕЕса	садЕседссд	схсесасссЕ	хсЕсасдхсЕ	120
дасддасЕсЕ	дсхдасадсс	сЕЕдсссЕдЕ	сддаЕдааЕг	ддсассхсхд	даададссаа	180
СЕдЕдСдадв	ЕддЕдсадсс	садхддЕддс	ссддсадсвд	ахсвддаедЕ	асгдддсдаа	240
дадЕСЕсссс	Еддддаадсс	азссахдссд	сассЕдссЕЕ	садаасаддд	сдсЕссЕдад	300
ассссссадс	дсъдссгдда	дзадаагсаа	дадсЕссдад	ахдсеахссд	дсададсаас	360
садаЕЕСЕдс	дддадсдсгд	сдаддадсЕЕ	СЕдсаЕХЕСС	аадссадсса	дадддаддад	420
ааддадххсс	Есасдхдсаа	дгхссаддад	дссаддааас	сддхддадад	асхсддссхд	4В0
дадаадсЕсд	аЕСЕдаадад	дсадааддвд	саддсЕсЕдс	дддаддхдда	дсассхдаад	540
адаЕдссадс	адсадахддс	ъдаддасаад	дссЕСЕдхда	аадссеаддх	даедхссххд	600
сЕсддддадс	Едсаддадад	сгададЕсдс	ЕЕддаддсЕд	ссасхгадда	аЕдссаддсх	660
сгддадддгс	дддсссдддс	ддссвдсдад	саддсдсддс	адсЕддадад	Едадсдсдад	720
дедсЕдсадс	адсадсасад	сдЕдсвддЕд	дассадсгдс	дсасдсаддд	ссададсдхд	7Θ0
даддссдсдс	ЕссдсаЕдда	дсдссаддее	дссхсддадд	адаададдаа	дссддсссад	840
схдсаддЕдд	ССЕВЕсасСё	дсЕСТЕссеа	даагасдаса	ассасагсаа	дадсадсдхд	900
дгдддсадЕд	адсддавдсд	аддваХдсад	сЕддаадаЕс	Есааасадса	дехсеадсад	960
дссдаддадд	сссЕддЕдде	сааеседдад	дЕдахсдата	адсхдаадда	ддаддссдад	1020
садсасаада	ЕЕдЕдаЕдда	двесдхЕссд	дхдсхдаадд	сесаддсдда	саХсхасаад	1080
дсддасЕЕсс	аддсхдадад	дсаддсссдд	дадаадсхдд	ссдадаадаа	ддадеьссЕд	1140

саддадсадс хддадсадсх дсададддад хасадсааас хдааддссад схдЕсаддад 1200 хсддссадда ссдаддаааС даддаадсдд саЕдхсдадд хсхсесаддс ссссхЕдсес 1260 сссдссссхд ссЕассхсхс схсЕссссхд дсссхдессв дссададдвд дадссссссс 1320 даддадссас схдасСхсхд схдхсссаад хдссадЕахс аддссссЕда ЕаЕддэсасс 1380 сЕдсадаЕас аЕдХсахдда дхдсасЕдад хадддседдс зэдедсаадд ссаеЕдссхд 1440 седаддасдЕ дсссдддасс дсдсадхсхд сдсЕЕЕссхс хсссдссхдс дсадсссадд 1500 аЕдаадддсЕ дддСддссас аасЕдддаЕд ссассЕддад ссссасссад двдсгддссд 1560 сддсассхха сдсххсадсх дхЕдахтссд «ддсссссъ сЕЕЕЕддддх адахдсддсс 1620 ссдаЕсаддс сЕдасХсдсЕ дсЕсЕххеХд ххсссЕхеЕд ссхдсссдаа ссасххдссЕ 1680 сдддсхааЕс ссхсссЕсЕС сссссасссд дсасЕдддда адхсаадааЕ ддддссЕддд 1740 дсхсЕсаддд адаасхдсхЕ ссссхддсад адсхдддхдд садсесххсс хсссассдда 1800 саесдаессд сссдсхдсхд Хдссссддда дСдсхдсссЕ сххаесаЕдс асасдддсдс 1860 ЕСЕссЕЕХЕд ддсхдеаЕдс ЕЭЕЕссаЕЕЕ Едсадссада ссдаЕдЕдха ЕЕЕаассадЕ 1920 сасЕаЕЕдаЕ ддасахххдд дЕЕдЕСЕссс ассССЕЕЕдЕ сассаЕтааг агЕддслхад 19ΘΟ акааааахсс ЕСдЕдсаЕЕа ааааааааа 2009 <210>2 <211> 2034 <212> ДНК <213> человек <400> 2

ЕХсЕасЕссХ сссХссЕссх сасЕдедддд ЕсЕдасссЕа СЕССХЕдЕдх даддасЕссЕ 60 сЕадЕЕсада даеасаЕЕСЕ дЕЕсассааа сЕЕдасхдсд схсхахсдад дЕсдххааах 120 ЕссЕсддааа хдссЕсасах ахадхйЕддс адсхадсссЕ ЕдсссЕдЕЕд даЕдаахадд 180 сассЕсЕдда ададссаасЕ дхдЕдадахд дхдсадссса дхддхддссс ддсадсадаг 240 саддасдЕас Едддсдаадэ дЕсЕссЕссд дддаадссад ссаЕдсЕдса ссгдсссЕса 300 даасадддсд ехссЕдадас ссЕссадсдс хдссЕдддад дадаахсаад адсЕссдада 360 Едссахссдд садЕадсаас садасЕсЕЕд сдддадсЕдс сдаадддадс ЕЕЕссдсаЕЕ 420

ххссаадсса	дссададдда	ддадааддад	ЕхссхсаЕдЕ	дсаадххсса	ддаддссадд	480
ваасхддхдд	ададасхсдд	ссЕддадаад	схсдахсхда	ададдсадаа	ддадсаддсх	540
схдсдддадд	ЕддадсаесЕ	даададасдс	садсэдсадв	ЕддсЕдадда	сааддссЕех	600
дхдааадссс	аддгдасдхс	схЕдеЕсддд	дадсЕдсадд	вдадссадад	ХсдсЕЕддад	660
дссдссасЕа	аддаахдсса	ддсЕСЕддад	ддЕсдддссс	дддсддссад	сдэдсаддсд	720
сддсадсхдд	ададЕдадсд	сдаддсдсхд	садеадсадс	аеадсдЕдса	ддХддассад	780
схдсдсаЕдс	адддссадад	сдхддаддсс	дсдскссдса	хададсдсса	ддссдссхсд	840
дгддадаада	ддаадсЕддс	есадЕсдсад	дЕддссгвЕС	ассадсхсхх	ссаадаасас	900
дасаасеаса	Есаададсад	сдЕддхдддс	адедадсдда	адсдаддаах	дсадссддаа	960
дахсхсааас	адсадсхсса	деаддссдад	даддссссдд	Еддссаааса	ддаддхдахс	1020
дахаадсхда	аддаддаддс	сдадсадсас	аадаХЕдЕда	хддадассдх	Ессддхдехд	1080
ааддессадд	еддахехсха	сааддсддас	ЕЕссаддегд	ададдсаддс	ссдддадаад	1140
схддссдада	адааддадсг	ссЕдсаддад	садсЕддадс	гдсхдсадад	ддадсасадс	1200
ааасХдаадд	ссадсЕдхса	ддадгсддсс	аддаЕсдадд	асвЕдаддаа	дсддсахдхс	1260
даддхехсес	аддсссссхх	десссссдсс	ссхдссхасе	ХССССЕСХСС	ссЕддсссЕд	1320
сесадссада	ддаддадссс	ссссдвддад	ссассхдасх	хсгдсхдссс	еаадхдссад	1380
Еахсаддссс	сгдаЕахдда	сасссЕдсад	ахасахдЕса	ЕддгдсдсаЕ	Едгдхадддс	1440
сддсеадхдс	ваддссаегд	сехдссдадд	асдгдсссдд	дассдгдсад	ЕсЕдсдсЕЕЕ	1500
ссЕсгсесдс	сЕдссЕадсс	саддасдаад	ддесдддЕдд	ссасаасхдд	даЕдссассх	1560
ддадссссас	ссаддадсхд	дссдсддсас	сгхасдсЕЕс	адссдхсдаЕ	Ессдехддхс	1620
СССХСЕЕЕЕд	дддЕадаЕдс	ддссссдахс	аддсссдасС	едехдсксЕЕ	ЕЕСдЕЕсссе	1680
ЕсЕдЕСЕдСЕ	сдаассасЕЕ	дссСсдддсЕ	авЕсссХссс	ЕСЕХССЕССа	сссддсасЕд	1740
дддаадесаа	даахддддсс	ЕддддсЕсЕС	адддадаасх	дсЕЕссссхд	дсададсЕдд	1800
дхддсадсЕс	ЕЕссЕсесас	сддаеаееда	сссдсссдсЕ	дсхдхдсссЕ	дддадЕдсхд	1860
сссЕсЕхасс	ахдсасасдд	дЕдсЕсгссх	ЕЕЕдддсЕдс	аХдсЕаХХСС	айЕххдсадс	1920
садассдаЕд	ЕдхахЕЕвас	садгсасЕаЕ	ЕдаЕддасах	ЕХдддЕЕдЕЕ	ЕСССаЕсЕЕЕ	1980
ЕЕдЕсассаЕ	лааЕагЕддс	тхадакаааа	вЕссХХдхдс	аЕХааааааа	аааа	2034

<210> 3 <211> 2116 <212> ДНК <213> человек <400> 3 дссасдаадд ессадасЕХЕ дассдЕЕсЕЕ сассассасЕ есадссхссх ссЕдЕдаасЕ 60 сасЕдассас сдадаасада ЕЕссасЕСЕЕ Еассаххсад ссЕсассаад ахдсссааха 120 ссааЕддаад саЕЕддссас адЕссасЕЕЕ схсЕдЕсадс ссадЕетдха аЕддаададс 180 ЕааасасЕдс асссдхссаа дададхссас ссЕЕддссаЕ дссЕссЕддд аасЕсасахд 240 дЕсЕадаадЕ дддсЕсаЕЕд дсХдаадЕЕа аддадаассе ессееесеэе ддддЕаахсс 300 дЕЕддаЕсдд ссадссассв ддасгдаайд аадЕдсЕсдс еддасЕддаа сЕддаадагд 360 адЕдЕдсадд сЕдЕасддаЕ ддаассхЕса даддсасЕсд дсаЕЕЕсасс хдхдсссхда 420 адааддсдсЕ дХЕХдЕдааа сЕдаададсЕ дсаддсссда сЕеЕаддЕЕЕ дсахсахедс 480 адссддхххс саахсаадаЕ ЕдадсдсЕдЕ аасЕсЕЕЕад сатххддадд сЕастхаадЕ 540 даадЕадхда адааааЕзсс ссассааааа Еддаааавда агдсЕЕддад аЕааедаххд 600 дддааадаад аааддсаЕсс аадддхсахх асааЕЕССЕд кЕасЕЕадас ЕсаассгЕаЕ 660 ЕсЕкдсЕЕах ЕЕкдсЕЕтга дЕЕсЕдЕЕСЕ пддасасхдд ЕдЕЕасхЕЕа дассссааад 720

ΊΊ

Ί8 азааадааас дахдххадаа хасхиснкмд тыпасссаада дсСасХдадд асадааасхд 780 гхааХесгсХ дадааЪахах ддакаХдхдх дхдссасваа аасхахдавв скдаддаааа 840 гасХХдаааа ддхддаддсХ дсахсаддвъ ххассхсхда адааааадах ссхдаддаах 900 хеххдаахас хсгдхсхсах сахеххехва дддхэдаасс хххдсхаааа ахаадахсад 960 саддхсаааа ддхасаадах ЕдХСасСХсХ аесаааХХХС хасддавааа аахдадааад 1020 схддсдххсс сасааххсад садххдхХад ааеддхсххх хахсаасадх аассгдаааХ 1080 ххдеададдс ассахсахдх схдаххаЕСс адахдесхсд аСХСддаааа дасеххааас 1140 сасххааааа асххсхссхс сХСХддааХХ адахахааса двСххасххд аадасасссс 1200 адасадсдсс ддахахдхдд адддсххдеа ахдхасдадх дсаадааХдс сасдасдахс 1260 сддасассад сХддааааас аадсадхххх дсаааассхд саасэсхсаа дгссассгсс 1320 асссдаадад дсхдаехсас аааХвХаасс садхдхсасх хсссааадас схассссдас 1380 хдддадасхд дадасасдде Едсахсссхх дссадгахах ддадххаххх дсСдгхсЕсЕ 1440 деахадааас аадссгсхах дссдесЕЕХд сдаадхаХдд дааддасдаХ СсЕдссгддс 1500 ссЕХсхххдд асадсахддс сдаХссддда хддхддхсад гахддсхсаа саххссссса 1560 адйстссспх дзсссадаад хаддададха сххддаадах дхсхссхдда адасссхдаа 1620 ихуссххдда схсссадоад аахсссаадд схдхдсэсда адасхдсхгх дхдахдсеас 1680 ахахдсдсса сдсасссгда дхссаасаах дадхххдхас ааахаасхдд дддгсахсдд 1Ή0 даааддсааа даагехддаа ддсададхсс скаасдххдс вхсххаххсд дадсхддеад 1800 ххехдххсас ддхссаххдс сддсаахдда гдхсхгхдхд дсдахдахсс ххсадьааад 1860 дахдссхсхд ххгаааааса ааххдсхххх дхдхсссхда аахахххаах аадаадсахх 1920 ХХдсасхсса дааадхахдх ххдхдхсддх ххсгхаадаа дхсхааахда адххаххаас 1980 ассхдаадсх ххаадххаад ХдсаххдаЕс ахахдахахх хххддаадса хасааххххэ 2040 аххдхддаад ххсааадссх сххххадхсс аххдадаахд хааахааахд ХдссХкссХХ 2100 асддаааааа аааааа 2116

Claims (26)

1. Последовательность ДНК, кодирующая ШР-ассоциированный белок (КАР-2), его изоформы, фрагменты или аналоги, включающая последовательность, показанную на фиг. 1, причем указанные белок КАР-2, его изоформы, фрагменты или аналоги способны связываться с белком КГР или способны модулировать или опосредовать внутриклеточную активность КГР.

2. Последовательность ДНК по п.1, включающая последовательность, показанную на фиг. 2.

3. Последовательность ДНК по п.2, кодирующая КАР-2, его изоформы, фрагменты или аналоги, содержащие по крайней мере часть последовательности, показанной на фиг. 3.

4. Компетентный по репликации экспрессирующий вектор, включающий последовательность ДНК, охарактеризованную в любом из пп.1-3, необязательно функционально соединённый с регуляторными последовательностями, промоторами или другими последовательностями ДНК, обеспечивающими экспрессию, в правильной ориентации.

5. Компетентный по репликации экспрессирующий вектор по п.4, способный экспрессироваться в эукариотической клетке-хозяине.

6. Компетентный по репликации экспрессирующий вектор по п.4, способный экспрессироваться в прокариотической клетке-хозяине.

7. Трансформированные эукариотические или прокариотические клетки-хозяева, содержащие реплицируемый экспрессирующий вектор, охарактеризованный в любом из пп.4-6.

8. Белок КАР-2, его изоформа, фрагмент, функциональные аналоги или производные, кодируемые последовательностью ДНК, охарактеризованной в любом из пп.1-3, причем указанные белок, его изоформа, фрагмент, аналоги и производные способны связываться с ШР.

9. Белок КАР-2 по п.8, способный модулировать или опосредовать внутриклеточную активность РТР в механизмах воспаления, выживания клеток или гибели клеток, в которых РТР участвует напрямую или опосредованно через связывание с другими внутриклеточными модуляторами или медиаторами этих механизмов.

10. Белок КАР-2, его изоформа, фрагмент, аналоги и производные по п.8, причем указанные белок, изоформа, аналоги, фрагменты и производные содержат по крайней мере часть аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 3.

11. Способ получения белка КАР-2, его изоформы, фрагмента, аналогов или производных, охарактеризованных в любом из пп.8-10, включающий культивирование трансформированных клеток-хозяев, охарактеризованных в п.6, в условиях, благоприятных для экспрессии указанных белка, изоформы, аналога, фрагмента или производного, осуществление необходимых посттрансляционных модификаций с целью получения указанных белка, фрагментов, аналогов или производных и выделение указанных экспрессированных белка, фрагментов, аналогов или производных.

12. Антитела или их активные фрагменты или производные, специфичные в отношении белка КАР-2, его изоформы, фрагмента, аналога или производного, охарактеризованных в любом из пп.8-10.

13. Способ модулирования или опосредования модулируемых или опосредуемых белком ШР внутриклеточных эффектов на механизмы воспаления, гибели клеток или выживания клеток, в которых ШР участвует напрямую или опосредованно через другие модуляторы/медиаторы этих механизмов, включающий обработку указанных клеток одним или несколькими белками КАР-2, изоформами, аналогами, фрагментами или производными в соответствии с любым из пп.8-10, способными связываться с ШР и модулировать или опосредовать указанную внутриклеточную активность ШР, причем указанная обработка указанных клеток включает внесение в указанные клетки одного или нескольких указанных белков, изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для их проникновения внутрь клеток, или внесение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанные один или несколько белков, изоформ, аналогов, фрагментов или производных, в форме подходящего вектора, включающего указанную последовательность, причем указанный вектор способен эффективно вносить указанную последовательность в указанные клетки таким образом, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках.

14. Способ модулирования модулируемого/опосредуемого белком РТР влияния на клетки по п.13, причем указанная обработка клеток включает внесение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанные белок КАР-2, изоформы, аналоги, фрагменты или производные, в форме подходящего вектора, включающего указанную последовательность, причем указанный вектор способен обеспечивать эффективное внесение указанной последовательности в указанные клетки таким образом, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках.

15. Способ по п.13 или 14, причем указанная обработка указанных клеток осуществляется путем трансфекции указанных клеток рекомбинантным вектором на основе вируса животного, включающий следующие стадии:

(а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, включающего последовательность, кодирующую поверхностный вирусный белок (лиганд), который способен связываться со специфическим поверхностно-клеточным рецептором на поверхности указанных клеток, обработка которых проводится, и вторую последовательность, кодирующую белок, выбранный из белка КАР-2, изоформ, аналогов, фрагментов и производных, охарактеризованных в любом из пп.11-13, так, чтобы в случае экспрессии в указанных клетках он был способен модулировать/опосредовать активность К1Р; и (б) инфицирование указанных клеток указанным вектором по (а).

16. Способ модулирования модулируемого/опосредуемого белком К1Р влияния на клетки, включающий обработку указанных клеток антителами или их активными фрагментами или производными, охарактеризованных в п.12, причем указанная обработка осуществляется путем применения подходящей композиции, содержащей указанные антитела, их активные фрагменты или производные, в отношении указанных клеток, причем, когда белок КАР-2 или его участки попадает на внешнюю поверхность указанных клеток, то указанная композиция приготавливается для внеклеточного применения, а когда указанные белки КАР-2 являются внутриклеточными, то указанная композиция приготавливается для внутриклеточного применения.

17. Способ модулирования модулируемого/опосредуемого белком К1Р влияния на клетки, включающий обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по отношению по крайней мере к части последовательности ДНК, кодирующей белок КАР-2, охарактеризованных в любом из пп.1-3, причем указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка КАР-2.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанная олигонуклеотидная последовательность вводится в клетки с помощью вируса, полученного способом по п.15.

19. Способ обработки опухолевых клеток или ВИЧ-инфицированных клеток или других больных клеток, включающий (а) конструирование рекомбинантного вектора на основе вируса животного, включающего последовательность, кодирующую поверхностный вирусный белок, способный связываться со специфическим рецептором на поверхности опухолевых клеток, или рецептором на поверхности ВИЧ-инфицированных клеток, или рецептором других больных клеток, и последовательность, кодирующую белок, выбранный из белка КАР-2, изоформы, аналогов, фрагментов и производных, охарактеризованных в любом из пп.8-10, таким образом, чтобы в случае экспрессии в указанных опухолевых, ВИЧинфицированных или другого типа больных клетках он был способен модулировать/опосредовать активность К1Р по прямому или опосредованному уничтожению указанной клетки; и (б) инфицирование указанных опухолевых или ВИЧ-инфицированных клеток или других больных клеток указанным вектором по (а).

20. Способ модулирования влияния К1Р на клетки, включающий применение рибозимной процедуры, в которой вектор, кодирующий рибозимную последовательность, способную взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, кодирующей белок КАР-2, охарактеризованных в любом из пп.8-10, вносят в указанные клетки в форме, которая обеспечивает экспрессию указанной рибозимной последовательности в указанных клетках, причем, когда указанная рибозимная последовательность экспрессируется в указанных клетках, то она взаимодействует с указанной клеточной последовательностью мРНК и расщепляет указанную последовательность мРНК, в результате чего происходит подавление экспрессии указанного белка КАР-2 в указанных клетках.

21. Способ по любому из пп.13-20, причем указанный белок является по крайней мере одной из изоформ КАР-2, ее аналогом, фрагментом или производным.

22. Фармацевтическая композиция, предназначенная для модулирования влияния К1Р на клетки, содержащая в качестве компонента по крайней мере один белок КАР-2, охарактеризованных в любом из пп.8-10, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их смеси.

23. Фармацевтическая композиция, предназначенная для модулирования влияния К1Р на клетки, содержащая в качестве компонента рекомбинантный вектор на основе вируса животного, кодирующий белок, способный к связыванию поверхностно-клеточного рецептора и кодированию по крайней мере одного белка КАР2, изоформу, активные фрагменты или аналоги, охарактеризованных в любом из пп.8-10.

24. Фармацевтическая композиция, предназначенная для модулирования влияния К1Р на клетки, содержащая в качестве компонента олигонуклеотидную последовательность, коди рующую антисмысловую последовательность по отношению к последовательности ДНК белка КАР-2, охарактеризованных в любом из пп.1-3.

25. Способ модулирования процессов, прямо или косвенно модулируемых/опосредуемых белком КР, включающий обработку клеток одним или несколькими белками КАР-2, изоформами, аналогами, фрагментами или производными, охарактеризованными в любом из пп.8-10, способными связываться с КР, причем указанная обработка указанных клеток включает внесение в указанные клетки одного или нескольких указанных белков, изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, благоприятной для их проникновения внутрь клеток, или внесение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанные один или несколько белков, изоформ, аналогов, фрагментов или производных, в форме подходящего вектора, включающего указанную последовательность, причем указанный вектор способен обеспечивать эффективное внесение указанной последовательности в указанные клетки таким образом, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках.

26. Способ модулирования процессов, прямо или косвенно модулируемых/опосредуемых белком ШР, среди которых подавление ΝΡ-κΒ и активация киназ ΡΝΚ и р38, включающий обработку клеток одним или несколькими белками КАР-2, изоформами, аналогами, фрагментами или производными, охарактеризованными в любом из пп.8-10, причем указанная обработка клеток включает внесение в указанные клетки одного или нескольких указанных белков, изоформ, аналогов, фрагментов или производных в форме, благоприятной для их попадания внутрь клеток, или внесение в указанные клетки последовательности ДНК, кодирующей указанные один или несколько белков, изоформ, аналогов, фрагментов или производных, в форме подходящего вектора, включающего указанную последовательность, причем указанный вектор способен обеспечивать эффективное внесение указанной последовательности в указанные клетки таким образом, чтобы указанная последовательность экспрессировалась в указанных клетках.