JP2002518001A - Ｇ３ｂｐタンパク質に対するモノクローナル抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｇ３ＢＰタンパク質に対するモノクローナル抗体及びそれらを産生する細胞系に関する。本発明はまた、医薬及び診断用試薬を製造するためのこれらの抗体またはその誘導体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、Ｇ３ＢＰタンパク質に対するモノクローナル抗体及びそれらを産生
する細胞系に関する。本発明はまた、医薬及び診断用試薬を得るためのこれらの
抗体またはその誘導体の使用に関する。

【０００２】 一般的にｐ２１Ｒａｓタンパク質と呼ばれているｒａｓ遺伝子の産生物は、該
産生物の研究に使用されたすべての真核生物中で細胞分裂をコントロールするた
めに極めて重要な機能を果たしている。該タンパク質に特有の幾つかの修飾は該
タンパク質の正常なコントロール機能を喪失させ、タンパク質を癌原性にする。
例えば、多くのヒト腫瘍には修飾されたｒａｓ遺伝子が存在していた。また、ｐ
２１Ｒａｓタンパク質の超発現は細胞の増殖異常を生じさせる。全体としてヒト
の癌の３０％にはｐ２１Ｒａｓタンパク質が関与している。

【０００３】 従って、腫瘍学の分野ではこれらのｐ２１Ｒａｓタンパク質の正確な機能を理
解することが研究の重要な目的の１つとなっている。

【０００４】 現在では、トランスデューサー機能をもつＧタンパク質がｐ２１Ｒａｓタンパ
ク質の機能を解明するモデルとして利用されている。双方のタンパク質が多くの
共通点を有しているからである。ＧＴＰに結合した活性型ｐ２１タンパク質とＧ
ＤＰに結合した不活性型ｐ２１タンパク質とは細胞中で均衡している。Ｒａｓタ
ンパク質が誘発されていない休止細胞中では大部分のＲａｓタンパク質がＧＤＰ
結合型である。細胞が刺激されると、ヌクレオチド交換因子ＧＥＦが活性化され
、ＧＤＰが排泄されてＧＴＰで置換される。ここでＲａｓタンパク質は活性コン
ホメーションになり、そのエフェクターであるＧＡＰタンパク質“ＧＴＰアーゼ
活性化タンパク質”を認識して刺激し得る。次に複合体Ｒａｓ−ＧＴＰ−ＧＡＰ
が１種または複数のタンパク質と相互作用してシグナルを伝達し、細胞の生物学
的応答を引き出すと考えられる。Ｒａｓ−ＧＴＰとＧＡＰとが結合すると、ＧＴ
Ｐの加水分解が生じ、同時に、Ｒａｓタンパク質はＧＤＰに結合した不活性型に
戻る。

【０００５】 癌原性ｐ２１Ｒａｓタンパク質の場合には、該タンパク質が突然変異を有して
おりこの突然変異によって不活性型に戻ることができない。ここで均衡が破れて
活性型のＲａｓが過剰になる。

【０００６】 活性型ｐ２１Ｒａｓと不活性型ｐ２１Ｒａｓとのこのように複雑な均衡は、Ｒ
ａｓタンパク質の生化学的特性に固有の複数の要因（ＧＤＰ及びＧＴＰに対する
相対的親和性、ヌクレオチドの交換速度、など）と、特にＧＡＰタンパク質のよ
うなＲａｓタンパク質の活性を変調する外的要因との双方によってコントロール
される。

【０００７】 ＧＡＰタンパク質は、すべての真核生物体内に存在するサイトゾルタンパク質
であり、正常なｐ２１タンパク質に結合したＧＴＰの加水分解を強力に促進する
能力を有している（Ｔｒａｈｅｙ ｅｔ Ｍｃ Ｃｏｒｍｉｃｋ １９８７）。
ＧＡＰタンパク質は、異なる機能を確保する２つのドメインを有している。ＧＡ
Ｐタンパク質のカルボキシ末端は、Ｒａｓタンパク質と結合してそのＧＴＰアー
ゼ活性を増進する触媒活性を有している。ＧＡＰタンパク質の他端ではアミノ末
端の下流にドメインＳＨ２及びＳＨ３が並列に存在し、これらは別のタンパク質
との相互作用に関与する。

【０００８】 出願人は、Ｒａｓ依存性シグナル伝達カスケード中の補助タンパク質を既に同
定した。即ち、国際出願ＷＯ９６／１６１６９は、ＧＡＰのＳＨ３ドメインに結
合し得るＧ３ＢＰと名付けたタンパク質（“ＧＡＰ−ＳＨ３結合タンパク質”）
の同定、クローニング、配列決定及びキャラクタリゼーションを記載している。
該出願は特に、Ｇ３ＢＰがＧＡＰのエフェクターであること、即ち、Ｒａｓ依存
性シグナル伝達経路に下流で関与する因子であることを示している。また、Ｐａ
ｒｋｅｒらの論文（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（１９９６）２５６１）
は、このタンパク質の配列、そのＧＡＰ結合能力、などを記載している。このタ
ンパク質は抗癌療法の開発に重要な新しいターゲットである。

【０００９】 Ｇ３ＢＰタンパク質は、遍在的に発現される６８ｋＤａのサイトゾルタンパク
質である。Ｇ３ＢＰタンパク質及び対応する遺伝子の配列を配列１及び配列２に
示す。４６６個のアミノ酸から成るこのタンパク質はｈｎＲＮＰ（ヘテロ核ＲＮ
Ｐ）のファミリーに所属し、ＲＮＡに結合するタンパク質に特徴的な複数のドメ
インを含んでいる： −２つのドメイン即ちＲＮＰ２（ａａ３４２−３４７）とＲＮＰ１（ａａ３７８
−３８５）とから成るＲＲＭドメイン（ａａ３４２−３８５）； −アミノ酸のうちのアルギニン及びグリシンに富むドメイン（ａａ４２９−４６
１）； −酸付加ドメイン（ａａ１４４−２２１）。

【００１０】 出願人はここでＧ３ＢＰタンパク質の作用メカニズムに注目した。この観点か
ら出願人は、Ｇ３ＢＰのタンパク質の種々のドメインに対する種々の抗体を作製
し、Ｇ３ＢＰの活性に拮抗する抗体またはＧ３ＢＰのエフェクターを構成する抗
体を研究した。

【００１１】 本発明に導いた一方の根拠は、腫瘍細胞及びヒト腫瘍（結腸腺癌、乳腫瘍）中
でＧ３ＢＰタンパク質の超発現が証明されたことにあり、他方の根拠は、Ｇ３Ｂ
Ｐタンパク質に対する幾つかの抗体がヒト腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発し得
るという意外な知見が得られたことにある。予想外にもこれらの抗体は、Ｇ３Ｂ
Ｐタンパク質が超発現している腫瘍細胞中ではアポトーシスを誘発するが、Ｇ３
ＢＰの発現が少ないヒトの正常細胞中では無毒性であることが証明された。

【００１２】 本発明の第一の目的は、Ｇ３ＢＰタンパク質に対する抗体であって多様な種類
の腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発し得るモノクローナル抗体を提供することで
ある。

【００１３】 より特定的には本発明の目的は、Ｇ３ＢＰタンパク質のＮ末端部に存在するエ
ピトープを認識し得るモノクローナル抗体を提供することである。好ましくはエ
ピトープは、Ｇ３ＢＰタンパク質のアミノ酸位置１−１４４に存在するエピトー
プであり、より好ましくはＧ３ＢＰタンパク質のアミノ酸位置１−７２に存在す
るエピトープである。いっそう好ましくはエピトープは、Ｇ３ＢＰタンパク質の
アミノ酸位置２２−５５に存在するエピトープであり、よりいっそう好ましくは
アミノ酸位置２２−３４から成るエピトープである。

【００１４】 好ましい特定実施態様によれば、本発明はまた、１９９８年６月９日付けでＣ
．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に登録番号Ｉ−２０３８で寄託されたハイブリドーマ細胞系Ｇ３
Ｂ １Ｆ１ １Ｄ１によって分泌されるＭａｂ １Ｆ１と命名された抗体に関す
る。

【００１５】 本発明はまた、上記に定義のモノクローナル抗体から誘導された抗体を包含す
る。本発明の定義によれば、誘導された抗体という表現は、本発明のモノクロー
ナル抗体のイディオタイプ及び特にキメラ抗体、一本鎖抗体及びＦａｂフラグメ
ントを含む任意の分子を意味する。このようなキメラ抗体はＭｏｒｒｉｓｏｎら
，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：８７０（１９８４）；Ｎｅｂｅｒｇｅｒら
，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５）に記載された技術によって作製
され得る。これらの文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする
。本発明抗体のイディオタイプを含むＦａｂフラグメントは当業者に公知の任意
の技術によって作製され得る。このようなフラグメントの非限定例としては、抗
体のペプシン消化によって産生され得るフラグメントであるＦ（ａｂ′）_２フラ
グメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって得られ
るＦａｂ′フラグメント、及び、抗体をパパイン及び還元剤で処理することによ
って産生され得るＦａｂフラグメントがある。

【００１６】 本発明はまた、上記に定義のモノクローナル抗体から誘導された一本鎖抗体Ｓ
ｃＦｖを目的とする。このような一本鎖抗体は米国特許第４，９４６，７７８号
、第５，１３２，４０５号及び第５，４７６，７８６号に記載の技術によって得
られる。

【００１７】 本発明はまた、上記に記載のモノクローナル抗体から誘導された一本鎖抗体を
コードする遺伝子を含む核酸配列に関する。このような配列の作製及び抗体をｉ
ｎ ｖｉｖｏ発現させるための配列の使用は国際特許出願ＷＯ９４／２９４４６
に記載されている。該特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるもの
とする。

【００１８】 本発明はまた、上記に記載のモノクローナル抗体から誘導された一本鎖抗体を
コードする核酸配列を含むウイルスベクターまたはプラスミドベクターを目的と
する。より特定的には、本発明のベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス
、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶウイル
スなどのようなウイルスに由来のベクターである。

【００１９】 本発明はまた、ヒトまたは動物の外科的または内科的治療に使用される医薬組
成物を製造するための、上記ＳｃＦｖをコードする核酸配列または該配列を含む
ベクターの使用に関する。本発明はまた、上記に定義のようなベクター、特にウ
イルスベクター、または、核酸配列を含む任意の医薬組成物に関する。

【００２０】 本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を分泌し得るハイブリドーマ細胞
系を目的とする。

【００２１】 特に、１９９８年６月９日付けでＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ
ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ
．Ｃ．Ｍ．）に登録番号Ｉ−２０３８で寄託されたＭａｂ １Ｆ１抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞系Ｇ３Ｂ １Ｆ１ １Ｄ１が本発明の目的である。

【００２２】 本発明はまた、（１）Ｇ３ＢＰタンパク質またはＮ−末端ドメイン（ａａ １
−１４４）の少なくとも一部を含むそのフラグメントによって免疫感作された動
物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを、ハイブリドーマ形成可能条件下で融合させ
る段階と、（２）上記ハイブリドーマのうちで種々の腫瘍細胞系中でアポトーシ
スを誘発し得るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを検出し単離する
段階とから成る、種々の腫瘍細胞系中でアポトーシスを誘発し得るモノクローナ
ル抗体の産生方法に関する。

【００２３】 本発明はまた、医薬を製造するための上記に定義の抗体の使用に関する。より
特定的には本発明は、異常増殖性疾患を治療または予防する医薬を製造するため
の上記抗体の使用に関する。

【００２４】 本発明はまた、医薬として許容される担体に任意に混合された治療有効量の本
発明の抗体に関する。前記量は腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発し得る治療的に
有効な量である。

【００２５】 本発明の抗体はまた、Ｇ３ＢＰタンパク質を同定または定量するための診断用
試薬として使用され得る。Ｇ３ＢＰタンパク質が腫瘍細胞中で超発現されること
、及び、この超発現が細胞増殖現象のマーカーとなることは実際に確認されてい
る。従ってこれらの抗体は、Ｇ３ＢＰタンパク質の超発現を生じさせる増殖異常
性疾患の診断に特に有効である。

【００２６】 本発明はまた、上記に定義のモノクローナル抗体を診断用試薬として使用する
こと、及び、上記に定義のモノクローナル抗体を含む診断用キットを提供するこ
とを目的とする。

【００２７】 抗体を、色原性、蛍光性、ビオチン系、放射性、などのマーカーに結合させて
もよい。抗体は、免疫標識法、免疫組織化学法、フローサイトメトリー、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）及び任意の種類
の公知の診断用キットに使用され得る。

【００２８】 本発明の抗体はまた、Ｇ３ＢＰタンパク質の機能研究に使用され得る。この機
能研究によって特に、Ｇ３ＢＰタンパク質から誘導されアポトーシス活性を有し
ている新規なペプチドを同定し得る。この観点から本発明はまた、Ｇ３ＢＰタン
パク質から誘導されアポトーシスを誘発し得る新規なペプチドを提供する。好ま
しくは本発明のペプチドはＮ末端フラグメントを含む。より好ましくはこれらの
ポリペプチドはＧ３ＢＰタンパク質の最初の１４個のアミノ酸に対応するドメイ
ンを少なくとも含む。

【００２９】 本発明はまた上記以外の別の特徴及び利点を有しており、これらの別の特徴及
び利点は後述の実施例から明らかにされるであろう。但し、実施例は本発明の代
表例であると理解されるべきであり、本発明の範囲はこれらの実施例の記載に限
定されないことを理解されたい。

【００３０】 （図面の簡単な説明） 図１は、ウェスタンブロット法で同定された抗体Ｍａｂ １Ｆ１によって認識
されるＧ３ＢＰの種々のドメインを表す。

【００３１】 図２ａ及び図２ｂは、種々の細胞系中のＧ３ＢＰタンパク質の発現レベルの比
較を表す。

【００３２】 図３は、ＨＣＴ１１６細胞に対する抗体Ｍａｂ １Ｆ１のマイクロインジェク
ションの効果を示す。

【００３３】 図４は、ヒトのＧ３ＢＰタンパク質とＧ３ＢＰ２タンパク質との配列比較を示
す。Ｎ末端配列を比較すると、トレマ記号で示すような幾つかの相異が観察され
る。

【００３４】 材料及び方法 使用した細胞系 ＨＣＴ１１６：突然変異遺伝子Ｋｉ−ｒａｓとＤＣＣ腫瘍サプレッサー遺伝子
の突然変異とを有しているヒト結腸癌に由来の上皮細胞。所要培養培地：ＤＭＥ
Ｍ，１０％ウシ胎仔血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％グルタミ
ン。

【００３５】 Ｈｋｅ−３及びＨＫ２−６：修飾によってＫｉ−ｒａｓ遺伝子を欠失し、その
結果として腫瘍発生能を喪失したＨＣＴ１１６細胞（Ｓｈｉｒａｓａｗａ，．．
．Ｓａｓａｚｕｋｉ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０，８５−８８参照）
。所要培養培地：ＤＭＥＭ，１０％ウシ胎仔血清，４００μｇ／ｍｌのジェネチ
シン，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％グルタミン。

【００３６】 Ｈ４６０：突然変異遺伝子Ｋｉ−ｒａｓを有しているヒトの非小細胞性肺癌に
由来の上皮細胞。所要培養培地：ＤＭＥＭ，１０％ウシ胎仔血清，１％ペニシリ
ン／ストレプトマイシン，１％グルタミン。

【００３７】 Ｈ１２９９：ＡＴＣＣから入手。突然変異遺伝子Ｎ−ｒａｓとｐ５３遺伝子の
欠失とを有しているヒト肺癌に由来の上皮細胞。所要培養培地：ＤＭＥＭ，１０
％ウシ胎仔血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％グルタミン。

【００３８】 ＨｅＬａ：ｒａｓ遺伝子の突然変異を有していないヒト子宮頚癌に由来の上皮
細胞。所要培養培地：ＤＭＥＭ，１０％ウシ胎仔血清，１％ペニシリン／ストレ
プトマイシン，１％グルタミン。

【００３９】 ＨＴ−２９：ＡＴＣＣから入手。ｐ５３遺伝子の突然変異を有しているがｒａ
ｓ遺伝子の突然変異を有していないヒト結腸癌に由来の上皮細胞。所要培養培地
：ＤＭＥＭ，１０％ウシ胎仔血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％
グルタミン。

【００４０】 ＤＬＤ−１：ＡＴＣＣから入手。Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子とｐ５３遺伝子との突然
変異を有しているヒト結腸癌に由来の上皮細胞。所要培養培地：ＤＭＥＭ，１０
％ウシ胎仔血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％グルタミン。

【００４１】 Ｔ４７：ＡＴＣＣから入手。乳癌患者の胸水から単離した細胞。所要培養培地
：ＲＰＭＩ，１０％ウシ胎仔血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％
グルタミン。

【００４２】 ＢＴ２０：ヒト乳癌に由来の細胞。所要培養培地：ＲＰＭＩ，１０％ウシ胎仔
血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％グルタミン。

【００４３】 ＭＣＦ−７：ヒト乳癌に由来の細胞。所要培養培地：ＲＰＭＩ，１０％ウシ胎
仔血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％グルタミン。

【００４４】 Ｔ２４：ＡＴＣＣから入手。Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の突然変異を有しているヒト
膀胱癌に由来の細胞。所要培養培地：ＲＰＭＩ，１０％ウシ胎仔血清，１％ペニ
シリン／ストレプトマイシン，１％グルタミン。

【００４５】 ＮＨＤＦ：Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手。突然変異遺
伝子を有していない一次培養物中の正常なヒト皮膚線維芽細胞（成人）。製造業
者が要求する培地。

【００４６】 実施例 実施例１：モノクローナル抗体の作製 １．１−Ｇ３ＢＰタンパク質の産生 Ｐａｒｋｅｒら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（１９９６）２５６１）
に記載のプロトコルに従ってＳＦ９細胞の培養物を調製した。バッファＨＮＴＧ
（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトン
Ｘ１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＧＴＡ）中
で、ホスファターゼインヒビター（１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１０ｍＭのＮａ_４Ｐ _２ Ｏ_７、１０ｍＭのＮａＦ）及びプロテアーゼインヒビター（１μｇ／ｍｌのロ
イペプチン、１μｇ／ｍｌのトリプシンインヒビター、１μｇ／ｍｌのペプスタ
チンＡ、２μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのベンズアミジン、１ｍ
Ｍのフェニルメタンスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌのアンチパイン、１μ
ｇ／ｍｌのキモスタチン）の存在下で細胞を溶解する。溶解液を遠心し（１５，
０００ｇ、１５分）、洗浄バッファＨＧ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．５、
１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＧＴＡ、ホスファターゼインヒビター及びプ
ロテアーゼインヒビターの存在下）で５倍に希釈する。次に、ヘパリン−セファ
ロース高速流ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）から成るゲルを１ｍｌのゲル
あたり１５ｍｇのタンパク質の割合で供給しながら溶解液を１２時間インキュベ
ートし、同じバッファ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．０３０ＭのＮａＣｌ、０．
２％のトリトンＸ１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭ
のＥＧＴＡ）に平衡させる。複合体をＰｈａｒｍａｃｉａのＫ２６カラムに移す
。１０倍容の平衡バッファ（５０ｍｌ／時）でカラムを洗浄し、次いでタンパク
質を１００ｍＭのＮａＣｌバッファ、次いで６００ｍＭのＮａＣｌバッファに溶
出させる。ＧＡＰ−ＳＨ３結合の活性を含む画分を集めて、ＨＧバッファで１０
倍に希釈し、アガロース−ポリリボウリジル酸ＡＧＰＯＬＹ（Ｕ）カラム（６型
カラム、１９ｃｍ^２×１ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、１ｍｌのゲルあたり１
．３ｍｇのタンパク質の割合で充填する。カラムを同じバッファ中で５ｍｌ／ｃ
ｍ^２時^−１の流速で予め平衡させる。ＨＮＧバッファ（６０ｍＭのＮａＣｌ）で
洗浄後、２２９ｍｌのバッファを使用し０．０６−０．３２ＭのＮａＣｌの直線
勾配で夾雑タンパク質を溶出させ、０．７ＭのＮａＣｌの存在下でＧ３ＢＰタン
パク質を溶出させる。ＰＯＬＹ（Ｕ）クロマトグラフィー後に得られたＧ３ＢＰ
タンパク質を含有する画分を集めて、プロテアーゼインヒビターを加えた燐酸塩
バッファｐＨ７．５で１２倍に希釈し、６０ｍＭのＮａＣｌを含む同じバッファ
中で３０ｍｌ時^−１の流速で予め平衡させた１ｍｌのＭｏｎｏＳ ＨＲ５／５カ
ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填する。カラムを洗浄した後、４０ｍｌのバッ
ファを使用し０．０６−１ＭのＮａＣｌの直線勾配でタンパク質を溶出させる。
Ｇ３ＢＰタンパク質は０．１５Ｍ ＮａＣｌと０．２Ｍ ＮａＣｌとの間に溶出
する。

【００４７】 １．２−マウスの免疫感作プロトコル ６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに２５μｇのＧ３ＢＰを腹腔内注入し、これ
を免疫感作０日目（Ｄ０）とした。免疫感作１４日目（Ｄ１４）に２回目の腹腔
内注入、次いで４５日目（Ｄ４５）及び８０日目（Ｄ８０）にそれぞれ３回目及
び４回目の注入を行った。５回目の注入（１０μｇのＧ３ＢＰタンパク質）は１
６５日目（Ｄ１６５）に静脈内経路で行い、その３日後に脾臓細胞を抽出して融
合させた。脾臓細胞を、一方ではマウスのミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４
に融合させ、他方ではマウスのミエローマ細胞Ｘ６３Ａｇ８／６５３に融合させ
た。脾臓細胞／ミエローマ細胞の比は５：１である。ポリエチレングリコールＰ
ＥＧ ｐｍ １５００（最終濃度４０％）の存在下でリンパ球ハイブリダイゼー
ションを行う。ウェルあたり１０，０００個のＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内マク
ロファージが存在する１６個の９６ウェルプレートを準備した。脾臓細胞の使用
量はウェルあたり２．５×１０^４−１０^５細胞の範囲である。使用した培地は、
ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ ｅｔ Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ
のグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭのヒポキサンチン、
０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ、２２０％の補
体を除去したウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシンを含む。

【００４８】 融合３日後に最初のクローンが出現する。融合７日後に培地を交換し、最後に
融合１０日後にウェルあたり５０００個のマクロファージを加える。１つのハイ
ブリドーマだけが生じたウェルを同定し、上清を採取してスクリーニングする。

【００４９】 融合によって得られたハイブリドーマの上清をウェスタンブロット法でスクリ
ーニングする。ＥＲ２２細胞及びＨＣＴ１１６細胞の細胞抽出物（５０μｇ）、
組換えＧ３ＢＰタンパク質、対照タンパク質ＳＡＭ６８を７．５％のドデシル硫
酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動に
かけ、次いでポリ二フッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐｏ．）に転移させた。非特異的結合をＥＣＬバッファ（２０ｍＭのトリス，
ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のトゥイーン２０）中の２％ス
キムミルクによって室温で２０分間ブロックする。

【００５０】 次に、ブロッキングバッファで１／５０に希釈した種々の上清と共に膜を４℃
で一夜インキュベートする。ＥＣＬバッファ−０．０５％トゥイーン２０で洗浄
後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウス抗体及び化学発光試薬ＥＣ
Ｌ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ）と共にインキュベー
トすることによって結合タンパク質を検出する。

【００５１】 このスクリーニングによって３つのハイブリドーマを採取した。採取したハイ
ブリドーマをＧ３Ｂ １Ｅ１、Ｇ３Ｂ １Ｆ１ １Ｄ１及びＧ３Ｂ１１Ｈ７と呼
ぶ。

【００５２】 実施例２−Ｍａｂ １Ｆ１抗体によって認識されるエピトープの同定 Ｐａｒｋｅｒら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（１９９６）２５６１）
に記載の技術に従って組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞（ＳＦ９）
の発現系中でＧ３ＢＰタンパク質の種々のフラグメントを産生させた。これらは
フラグメント“１”（ａａ ７２−３５０）、“２”（ａａ ７２−２３５）、
“３”（ａａ １４４−３４１）、“４”（ａａ ２３６−３５０）及び“５”
（ａａ ２９９−４６６）である。バキュロウイルス系で産生させたこれらのフ
ラグメントをウェスタンブロット法で試験した。

【００５３】 ２．１−ウェスタンブロット法によるタンパク質の検出 培養培地を除去した後、増殖細胞を４℃の燐酸塩バッファ中で２回洗浄する。
１ｍｌのＨＮＴＧバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＭｇＣ
ｌ_２、１ｍＭ）＋ホスファターゼインヒビター（１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１０ｍ
ＭのＮａ_４Ｐ_２Ｏ_７、１０ｍＭのＮａＦ）＋プロテアーゼインヒビター（１μｇ
／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのトリプシンインヒビター、１μｇ／ｍｌ
のペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌのベンズアミジン、１ｍＭのフェニルメチル
スルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌのアンチパイン、１μｇ／ｍｌのキモスタ
チン）の存在下で培養容器で直接溶解させる。７．５％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）を含むアクリルアミド電気泳動
ゲルでタンパク質を分離し（１６時間、６０ボルト）、次に半液体転移法によっ
てタンパク質をポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
Ｃｏｒｐ．）に転移させる。２５ｍＭのトリス塩基、グリシン１９２、０．１５
％のＳＤＳ、２０％のメタノールから成る転移バッファ中で６０ボルトの電圧下
、４℃で３時間転移させる。膜をＰＢＳで洗浄し、次いで０．０５％のトゥイー
ン２０と２％のスキムミルクとを加えたＰＢＳ中で室温で２時間飽和させる。膜
を、第一抗体を含むＥＣＬバッファ（２０ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ）＋０．０５％のトゥイーン２０＋２％のスキムミルク中で４℃で
１２時間インキュベートする。ＭＡＢ １Ｆ１抗体を１／１００００に希釈する
。次いでＥＣＬバッファ＋０．０５％トゥイーン２０による室温で１０分間の膜
の洗浄を４回または５回繰り返す。次に第二抗体（抗マウス抗体）をＥＣＬ＋０
．０５％のトゥイーン２０の存在下で室温で４５分間添加する。抗体がペルオキ
シダーゼに結合すると、Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ（ＥＣＬ）法によってタンパク質を検出し得る。膜をＰＢＳバッファ＋０．０
５％トゥイーン２０で４回または５回洗浄し、ＥＣＬ試薬中で１分間インキュベ
ートする。製造業者（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ）の
指示通りの手順で検出する。

【００５４】 結果を図１に示す。結果は、Ｍａｂ １Ｆ１抗体がフラグメント“１”（ａａ
７２−３５０）及び“２”（ａａ ７２−２３５）を検出し得ることを示す。
フラグメント“２”に共通のゾーンを含む中央フラグメント“３”（ａａ １４
４−３４１）は認識されない。フラグメント“４”（ａａ ２３６−３５０）及
び“５”（ａａ ２９９−４６６）も認識されない。

【００５５】 これらの結果は、Ｍａｂ １Ｆ１抗体によって認識されるエピトープがＧ３Ｂ
Ｐタンパク質のＮ末端領域、最初の１４４個のアミノ酸に対応するゾーン、より
特定的にはＧ３ＢＰタンパク質の酸ドメイン（ａａ １４４−２２１）の上流に
位置する最初の１００個のアミノ酸を含むゾーンに局在することを示す。

【００５６】 実施例３：種々の細胞系中のＧ３ＢＰタンパク質の発現レベル ヒト結腸直腸腫瘍及び種々の腫瘍細胞系中のＧ３ＢＰタンパク質の発現レベル
を試験した。

【００５７】 ３．１−種々のヒト細胞系中のＧ３ＢＰの発現レベル この実験では、培養細胞を掻取りによって採取し、２０００ｒｐｍで５分間遠
心して残渣を回収する。次に細胞を１０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ，ｐＨ７．２
、１４０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２％のＮＰ４０及びプロテア
ーゼインヒビター中で４℃で４５分間溶解させる。溶解液を１４０００ｒｐｍで
１０分間遠心し、上清を採取する。タンパク質を定量し、上清をＬａｅｍｍｌｉ
４Ｘバッファで変性し、９５℃で１０分間処理する。

【００５８】 種々の溶解液のタンパク質を、１０％アクリルアミド、１０ウェル、１．５ｍ
ｍ厚のＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘミニゲルに、ウェルあたり５０μｇ均等量
で載せる。

【００５９】 泳動後、ＰＶＤＦ膜に電気転移させ、３％のＢＳＡを含むＴＴＢＳバッファ〔
２０ｍＭのトリス，ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトゥイーン
２０、０．０２％のナトリウムアジド〕中で膜を不動態化する。サンプルをウェ
スタンブロット法で処理する。

【００６０】 ３％のＢＳＡを含むＴＴＢＳバッファ中で０．２μｇ／ｍｌに希釈したＭａｂ
１Ｆ１抗体と共に膜を２時間インキュベートする。次にＴＴＢＳによる１０分
間の膜の洗浄を４回繰り返し、ペルオキシダーゼで標識した抗マウス抗体と共に
１時間インキュベートし、ＴＴＢＳによる１０分間の膜の洗浄を新たに４回繰り
返す。次に、膜をＥＣＬ（化学発光）ＮＥＮ−ＤｕｐｏｎｔキットによってＥＣ
Ｌ Ａｍｅｒｓｈａｍフィルムに現像する。

【００６１】 結果を図２ａに示す。得られたフィルムは、正常な線維芽細胞系ＮＨＤＦに比
較すると全部の被験腫瘍細胞系中でＧ３ＢＰタンパク質が超発現していることを
示す。この超発現のレベルは、細胞系によってばらつきがあるが、細胞系中のｒ
ａｓ遺伝子の活性化状態には依存しない。ＨＣＴ１１６、Ｈ４６０またはＤＬＤ
−１のような突然変異遺伝子Ｋｉ−ｒａｓを有する細胞系はＧ３ＢＰタンパク質
を多少とも強力に発現し、ＨｅＬａ細胞またはＨＴ２９細胞のようなｒａｓ遺伝
子の突然変異を有していない細胞系もまた同様に強力な様々のＧ３ＢＰ発現レベ
ルを有している。

【００６２】 しかしながら、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子が欠失したＨＫｅ−３細胞及びＨＫ２−６
細胞では、起原となる細胞ＨＣＴ１１６に比べてＧ３ＢＰの発現レベルが低下し
ていること、しかしながら発現が消滅してはいないことが確認された。

【００６３】 ヒト生検組織中のＧ３ＢＰの発現レベル 健常組織または腫瘍組織のサンプルをスライドガラスに固定した。各スライド
ガラス上の組織に４０μｌのＨＮＴＧバッファを滴下してサンプルを可溶化する
。抽出物を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を採取する。タンパク質を
定量し、Ｌａｅｍｍｌｉ ４Ｘバッファで９５℃で１０分間熱処理することによ
って変性する。

【００６４】 ２０−３０μｇのタンパク質のサンプルを、７．５％ドデシル硫酸ナトリウム
を含むポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動させ、次いでポ
リ二フッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏ．）に転
移させる。非特異的結合を、ＥＣＬバッファ（２０ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、
１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のトゥイーン２０）中の２％スキムミルクに
よって室温で２時間ブロックする。

【００６５】 次に、ブロッキングバッファで０．２μｇ／ｍｌに希釈したＭａｂ １Ｆ１抗
体と共に膜を４℃で一夜インキュベートする。ＥＣＬバッファ−０．０５％トゥ
イーン２０で洗浄した後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウス抗体
及び化学発光試薬ＥＣＬ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ
）と共にインキュベートすることによって結合タンパク質を検出する。

【００６６】 図２ｂに示す結果は、Ｇ３ＢＰタンパク質が中程度に分化した腺腫中及び高度
に分化した腺腫中で超発現していることを示す。

【００６７】 実施例４：ヒト腫瘍細胞の生存率に対するＭａｂ １Ｆ１抗体のマイクロイン
ジェクションの効果 この実施例は、多様な種類の腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発し得る本発明の
抗体の特性を証明する。

【００６８】 以下に記載のプロトコルに従ってＭａｂ １Ｆ１モノクローナル抗体を注入し
た。注入すべき溶液をＰＢＳに透析し、０．４５μｍのＵｌｔｒａＦｒｅｅ Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過し、遠心（１４０００ｒｐｍで５分間）した
後で、細い針の付いた“マイクロローダ”（Ｒｏｕｃａｉｒｅ）で微小毛細管に
導入する。細胞のサイズに従って、注入時間を０．１−０．３秒に設定し、注入
圧力を５０ｈＰａ−１５０ｈＰａの範囲に設定する。１つの条件毎に約２００個
の細胞に注入を行った。

【００６９】 ＨＣＴ１１６、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、ＨｅＬａまたはＨＫｅ−３細胞に１０
ｍｇ／ｍｌのＭａｂ １Ｆ１モノクローナル抗体を微量注入し、注入後の３日間
をビデオ顕微鏡で撮影し録画する（２画像／分）。注入された細胞の変化（分裂
、細胞死、形態変化）をフィルムの読取りによって観察し、定量（１時間あたり
の分裂細胞または死滅細胞の数）し得る。縮合及び断片化（アポトーシスを生じ
た細胞で観察されるイベント）後に支持体から分離する細胞だけを計数する。

【００７０】 ＨＣＴ１１６細胞にＭａｂ １Ｆ１抗体を注入することによって得られた結果
を図３に示す。Ｍａｂ １Ｆ１抗体注入の１２時間後以降に細胞死が高いパーセ
ンテージで誘発され、２４−４８時間の範囲にピークが存在する。

【００７１】 ＨＣＴ１１６細胞中でＭａｂ １Ｆ１抗体を種々の用量で試験した。１０ｍｇ
／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌの範囲では細胞死の誘発効果は同等である。即ち、Ｍａ
ｂ １Ｆ１抗体は、注入された細胞の少なくとも５０％の細胞死を誘発する。１
ｍｇ／ｍｌの抗体用量では効果が著しく低下する。

【００７２】 対照としてマウスの免疫グロブリンを１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＣＴ１１６細
胞に注入すると、細胞死は全く生じない。注入された細胞は正常な分裂を続ける
。

【００７３】 ＨＣＴ１１６細胞中でＭａｂ １Ｆ１抗体が示したこの毒性作用は、アポトー
シスを開始した細胞のＤＮＡの切れ目を特異的に検出し得る蛍光性“ＴＵＮＥＬ
”法の使用によって確認された。

【００７４】 方眼の付いたカバーガラス（ｃｅｌｌｏｃａｔｅｓ−Ｒｏｕｃａｉｒｅ）に細
胞を播種し、４ウェルプレートに載せる。播種の２日後、これらのカバーガラス
上の細胞にＭａｂ １Ｆ１抗体または対照となるマウスの免疫グロブリンを１０
ｍｇ／ｍｌで注入する。注入後、細胞を定温器に戻して４０時間維持する。細胞
を４％のホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．２％のトリトンＸ−１００で
５分間処理して浸透性にし、燐酸塩バッファで数回洗浄する。次に以下の抗体を
使用して３７℃で１時間二重標識する： −注入された細胞を検出するための１／４００に希釈したテキサスレッドで標
識した抗マウス抗体、 −アポトーシス細胞のＤＮＡの切れ目を特異的に緑色に標識するＢｏｅｒｈｉ
ｎｇｅｒの“Ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出”キット。

【００７５】 次にカバーガラスを固定培地（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ−Ｂｉｏｓｙｓ）中の
スライドガラスに取り付ける。

【００７６】 種々の色を選択するフィルターによって蛍光中で観察すると、一方で注入され
た細胞、他方でアポトーシス細胞を計数し得る。

【００７７】 上記手順で行った独立の３つの実験の結果、４０時間後のＨＣＴ１１６細胞の
アポトーシスによる細胞死は９−１８％である。対照として免疫グロブリンを同
じ条件で注入したＨＣＴ１１６細胞では細胞死が全く生じないことが確認される
。

【００７８】 Ｈ４６０、Ｈ１２９９、ＨｅＬａ及びＨＫｅ−３細胞に対しても同様にＭａｂ
１Ｆ１抗体のマイクロインジェクション後の録画試験を行うと、注入の１２時
間後から６０時間後までに少なくとも５０％の細胞の細胞死が生じた図３のグラ
フに示した結果と同様の結果が得られた。

【００７９】 ＨＣＴ１１６細胞及びＨ４６０細胞で“ＴＵＮＥＬ”標識試験を行うと、同等
の結果が得られた（抗体注入の４０時間後に９−１８％の細胞がアポトーシスを
開始している）。

【００８０】 実施例５：健常なヒト線維芽細胞ＮＨＤＦの生存率及び増殖に対するＭａｂ １Ｆ１抗体のマイクロインジェクションの効果 ５．１−健常なヒト線維芽細胞ＮＨＤＦの生存率に対するＭａｂ １Ｆ１抗体
のマイクロインジェクションの効果 Ｍａｂ １Ｆ１抗体を微量注入した増殖性ＮＨＤＦ細胞の録画試験は、注入後
６０時間は細胞死が全く観察されないこと、及び、正常な細胞分裂が続けられて
いることを示す。

【００８１】 ５．２−健常なヒト線維芽細胞ＮＨＤＦの増殖に対するＭａｂ １Ｆ１抗体の
マイクロインジェクションの効果 培養中の正常細胞には増殖因子が供給される必要がある。細胞から増殖因子が
奪われると、細胞はいわゆる“非増殖”期、即ち休止状態になり、ＤＮＡの複製
をもはや行わない。従って、培養培地に添加したチミジンの類似体であるブロモ
デオキシウリジンを取込むことができない。ブロモデオキシウリジンをＤＮＡに
取込むことができるのは増殖中の細胞だけである。

【００８２】 休止状態のＮＨＤＦ細胞にＭａｂ １Ｆ１抗体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で微量
注入し、これらの細胞を増殖因子とブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）とを含
む培地に戻し、２４時間の接触によって抗−ＢｒｄＵ抗体に固定させて着色する
と、細胞増殖の３３％が阻害されていることが確認される。

【００８３】 この阻害は、Ｍａｂ １Ｆ１抗体を注入した細胞中のＢｒｄＵを取込んだ細胞
のパーセンテージと、マウスの免疫グロブリンを注入した細胞中のＢｒｄＵを取
込んだ細胞（対照）のパーセンテージとを比較することによって計算される。

【００８４】 別の抗Ｇ３ＢＰモノクローナル抗体（１１Ｈ７）を同じ条件でＮＨＤＦ細胞に
注入した。 表１：ＮＨＤＦ細胞の細胞増殖に対するＧ３ＢＰ特異的抗体注入の効果

【００８５】

【表１】

【００８６】 免疫グロブリンは細胞増殖を妨害しないが、１１Ｈ７抗体はＭａｂ １Ｆ１抗
体の効果と同様の効果を有すること、即ち３２−３３％の増殖阻害を生じさせる
ことが確認された。

【００８７】 この阻害の原因は、Ｍａｂ １Ｆ１抗体または１１Ｈ７抗体によって内因性Ｇ
３ＢＰタンパク質がブロックされることにある。この点で、この増殖阻害が正常
なＮＨＤＦ細胞中では一時的でしかなく、いかなる場合にも細胞死を生じさせな
いことに注目されたい。実際、抗体は細胞質中で自然に分解され、（注入の約４
０時間後に）細胞の正常なサイクルが回復する。

【００８８】 実施例４及び５に示した結果は、Ｍａｂ １Ｆ１抗体は、Ｇ３ＢＰが超発現し
ている被験ヒト腫瘍細胞の少なくとも５０％でアポトーシスを誘発するが、Ｇ３
ＢＰの発現が少ない正常なヒト細胞に注入されたときは無毒性であることを証明
する。腫瘍細胞中のこの効果はｒａｓ遺伝子の活性化状態には恐らく無関係であ
ろう。更に、Ｍａｂ １Ｆ１抗体は、休止細胞に注入されたときは正常なＮＨＤ
Ｆ細胞の増殖を一時的に停止または抑制する。

【００８９】 実施例６：ハイブリドーマＧ３Ｂ １Ｆ１ １Ｄ１を出発材料とする細胞内抗
−Ｇ３ＢＰ抗体をコードするＤＮＡ配列のクローニング及び発現 この実施例は、Ｍａｂ １Ｆ１モノクローナル抗体の特性を再現する細胞内抗
体をコードする核酸配列のクローニング及び発現を記載する。

【００９０】 ６．１−ＤＮＡ配列の作製 細胞内抗体をコードするＤＮＡ配列（ＳｃＦｖフラグメント）を米国特許第４
，９４６，７７８号に記載の技術によって調製する。この配列を次に、哺乳類細
胞中で機能プロモーターのコントロール下に配置する。

【００９１】 Ｃｈｉｒｇｕｉｎ Ｓ．Ｈ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，５２９４
（１９７９）によって記載された技術に従ってハイブリドーマＧ３Ｂ １Ｆ１
１Ｄ１の細胞培養物からＲＮＡ ｐｏｌｙ Ａを単離する。任意のヘキサヌクレ
オチドから形成されたマウスのプライマーを用いてこれらのＲＮＡを逆転写反応
させる。得られたｃＤＮＡは２つのＰＣＲ反応のマトリックスとして使用できる
。

【００９２】 第一のＰＣＲ反応はＨ鎖の可変フラグメント（ＶＨ）をＶＨ特異的プライマー
によって増幅させる反応であり、第二のＰＣＲ反応は、マウス配列に由来の１０
個のプライマーの混合物を使用してＶＬフラグメントを得る反応である。

【００９３】 ３４０ｂｐ及び３２５ｂｐの２つのフラグメントをこのようにして作製し、Ｖ
ＨのｃＤＮＡをＶＬ．ＰＣＲのｃＤＮＡの５′に正確に配置し得るリンカーによ
って結合させる（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｍｏｕｓｅ ＳｃＦｖ Ｍｏｄｕｌｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７
−９４００−０１）。

【００９４】 融合した核酸配列ＶＨ−リンカー−ＶＬを次に、細胞内抗体を発現させ得るフ
ァージミドに挿入する。この発現によって、抗原を正しく認識する細胞内抗体が
容易に同定及び選択される。この段階では、Ｇ３ＢＰを認識し得る抗体をＥＬＩ
ＳＡアッセイで選択する（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ，２７−９４０１−０１）。

【００９５】 ６．２−修飾された細胞内抗体の機能評価 修飾された細胞内抗−Ｇ３ＢＰ抗体をコードする配列をファージミドから制限
によって単離し次いでベクターＳＶ２（Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒら，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２５６，８２５−８２７（１９９２））またはｐＣＤＮＡ３（ＩｎＶ
ｉｔｒｏｇｅｎ，Ｖ７９０−２０）に挿入する。このようにして得られたプラス
ミドをｐＳＶ−ＳｃＦｖＧ３ＢＰまたはｐＣＤＮＡ３ＳｃＦｖＧ３ＢＰと命名す
る。以下に記載の試験によって機能を評価する。

【００９６】 （ａ）固定化していない哺乳類ＮＨＤＦ細胞及び形質転換細胞系（ＨＣＴ１１
６、Ｈ４６０、Ｈｋｅ−３、Ｈ１２９９、Ｈｅｌａ）へのマイクロインジェクシ
ョンによる機能評価。従来技術に記載された技術によって形質転換細胞系中のア
ポトーシスを観察し、細胞生存率に対する細胞内抗体の効果をＭａｂ １Ｆ１抗
体の活性との比較によって測定する。

【００９７】 （ｂ）形質転換細胞系及び正常細胞に対するｎｅｏ耐性試験による機能評価。
プラスミドｐＣＤＮＡ３Ｇ３ＢＰを形質転換細胞系（ＨＣＴ１１６、Ｈｋｅ−３
、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｈｅｌａ）及び非形質転換ヒト細胞にトランスフェク
トする。トランスフェクションの３日後に、形質転換細胞をジェネチシンの存在
下で選択する。この試験では、一本鎖抗体を、腫瘍細胞の増殖を阻害するＧ３Ｂ
Ｐフラグメント（このフラグメントに対応する核酸配列を同じ発現ベクターに含
ませる）に比較する。

【００９８】 （ｃ）病巣形成の阻害による機能評価。一本鎖抗体の病巣形成阻害能力を国際
特許ＷＯ９４／２９４４６に記載の技術によって試験する。腫瘍体積の縮小試験
ではＲａｓ以外の癌遺伝子で形質転換させた場合についても試験する。

【００９９】 （ｄ）このＳｃＦｖの発現がＧ３ＢＰ１によるＲＮＡ結合活性及び／またはＲ
ＮＡのエンドヌクレアーゼ切断に与える影響の試験に基づく機能評価。実際、Ｍ
ａｂ １Ｆ１モノクローナル抗体のマイクロインジェクションによって誘発され
るアポトーシスは、特異的タンパク質因子との相互作用の解離、または、ＲＮＡ
結合活性及び／またはエンドリボヌクレアーゼ開裂活性の変化として現れる。得
られたＳｃＦｖ抗体の特性はまた、これらの相互作用を変化させる能力に基づい
て決定され得る。

【０１００】 実施例７：Ｇ３ＢＰ１タンパク質の上のＭａｂ １Ｆ１抗体の別の認識ドメイ
ンの同定。ヒトのＧ３ＢＰタンパク質とＧ３ＢＰ２（またはＧ３ＢＰｈ）タンパ
ク質との配列比較。

【０１０１】 Ｇ３ＢＰタンパク質はタンパク質の１つのファミリーに属しており、このファ
ミリーには、Ｇ３ＢＰにヌクレオチドのレベルで６０．９％、タンパク質のレベ
ルで５８．９％の一致を示す短いＧ３ＢＰ２タンパク質（ＡＦ ０５１３１１、
ＧｅｎＢａｎｋ）と、Ｇ３ＢＰ２配列（短い形態）の７９０に９９ヌクレオチド
のインサートを有している長いＧ３ＢＰ２タンパク質（ＡＢ ０１４５６０、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ）とが存在する。

【０１０２】 Ｇ３ＢＰタンパク質とＧ３ＢＰ２タンパク質とのタンパク質配列を比較すると
、タンパク質の主要ドメインが保存されていることが判明する。即ち： １−Ｍａｂ１Ｆ１モノクローナル抗体のターゲットとなるＮ末端領域（この領域
はＮＴＦ２（核輸送因子２）タンパク質と相同性を有している）； ２−酸領域； ３−タンパク質−タンパク質相互作用に関与するＰＸＸＰモチーフに富む領域； ４−ＲＮＡで認識されるＲＲＭドメイン及び付加モチーフと“ＲＧＧ”（アルギ
ニン、グリシン、グリシン）ボックスとを含む領域。

【０１０３】 ウェスタンブロット試験では意外にも、Ｍａｂ１Ｆ１モノクローナル抗体は組
換えＧ３ＢＰ２タンパク質（短い形態）を認識できない。Ｎ末端配列を比較する
と、図４にトレマ記号で示すような複数の相異が観察される。

【０１０４】 種々の分岐領域をすべて包含するペプチドを使用して、Ｇ３ＢＰタンパク質の
上の抗体認識ドメインの正確な位置を判断する。

【０１０５】 第一段階では、上記のタンパク質の配列比較によって種々のペプチド（Ａ−Ｆ
）を合成した： ペプチドＡ：ＬＬＮＱＡＰＤＭＬＨＲＦＹ Ｇ３ＢＰタンパク質のアミノ酸２２−３４ ペプチドＢ：ＬＬＮＫＡＰＥＹＬＨＲＦＹ Ｇ３ＢＰ２タンパク質のアミノ酸２２−３４ ペプチドＣ：ＨＧＧＬＤＳＮＧＫＰＡＤＡＶ Ｇ３ＢＰタンパク質のアミノ酸４２−５５ ペプチドＤ：ＨＧＧＶＤＡＳＧＫＰＱＥＡＶ Ｇ３ＢＰ２タンパク質のアミノ酸４２−５５ ペプチドＥ：ＬＬＳＮＮＮＱＡＬＲＲＦＭＱ Ｇ３ＢＰタンパク質のアミノ酸９７−１１１ ペプチドＦ：ＨＮＤＩＦＲＹＱＤＥＶＦＧ Ｇ３ＢＰタンパク質のアミノ酸１２７−１３９。

【０１０６】 次にこれらのペプチドについて以下の能力を試験した： （ｉ）ＥＬＩＳＡ試験でＭａｂ１Ｆ１抗体を認識する能力； （ｉｉ）ウェスタンブロット試験でＭａｂ１Ｆ１抗体によるＧ３ＢＰタンパク質
の認識を阻害する能力。

【０１０７】 （ｉ）ＥＬＩＳＡ試験によるペプチドＡ−Ｆの試験 炭酸塩バッファ（０．１Ｍ，ｐＨ９．６）中の１０ｍｇ／ｍｌのペプチドの溶
液を９６ウェルのプレートに４℃で一夜吸着させることによって固定した。ＰＢ
Ｓで１回洗浄した後、ＰＢＳバッファ／１％ＢＳＡ中でウェルを室温で４時間維
持して飽和させた。ＰＢＳ／０．０５％トゥイーンで３回洗浄した後、種々のウ
ェルを次に、ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中の精製Ｍａｂ１Ｆ１抗体の希釈物（１０
ｎｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌまで）に室温で１時間接触させた。ＰＢＳバッファ
／０．０５％トゥイーンで３回洗浄した後、ウェルをペルオキシダーゼに結合し
た抗マウス抗体の希釈物（ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で１
／１０００に希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳバッファ／
０．０５％トゥイーンで３回洗浄した後、１０ｍｌのＨ_２ＯとＯＰＤ錠剤と１０
０ｍｌのメタノールと２５ｍｌのＨ_２Ｏ_２とを混合することによって比色反応を
進行させた。５０ｍｌの４ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４９２ｎｍで分光
光度読取りを行った（標準フィルター６２０ｎｍ）。

【０１０８】 得られた結果によれば、この試験ではペプチドＡが最も反応性であり、ＥＬＩ
ＳＡ試験でＭａｂ１Ｆ１抗体を認識できることが判明する。これらの結果は、Ｍ
ａｂ１Ｆ１抗体によって認識されるエピトープがＧ３ＢＰのアミノ酸２２−３４
によって形成されるドメインに存在することを示す。１Ｅ１抗体で行った同じ実
験でも等しい結果が得られた。

【０１０９】 （ｉｉ）Ｍａｂ１Ｆ１抗体によるＧ３ＢＰタンパク質の認識を阻害するペプチ
ドＡ−Ｆの能力に関するウェスタンブロット試験 ウェスタンブロット法によるタンパク質の検出を実施例２に記載の技術（２．
１：ウェスタンブロット法によるタンパク質の検出）に従って行った。競合のた
めに、抗体を膜に接触させる前にペプチドの希釈物と共に３７℃で２時間プレイ
ンキュベートした。各ペプチドについて、２種類の濃度、即ち抗体に対して１０
倍及び１００倍のモル過剰量で試験した。次いで実施例２．１に記載の手順で検
出した。

【０１１０】 得られた結果は、ペプチドＡ及びＣが（主として１００×のモル過剰量のとき
に）Ｇ３ＢＰタンパク質とＭａｂ１Ｆ１抗体との相互作用に置換し得ることを示
す。

【０１１１】 これらの結果を総合すると、ペプチドＡ（Ｇ３ＢＰのアミノ酸２２−３４）及
びペプチドＣ（Ｇ３ＢＰのアミノ酸４２−５５）がＭａｂ１Ｆ１抗体による認識
に関与するＧ３ＢＰのドメインに対応することが示唆される。

【０１１２】 従って、Ｇ３ＢＰと短い形態Ｇ３ＢＰ２との配列比較によって、種々のペプチ
ドを同定し、Ｇ３ＢＰによるアポトーシスのコントロールに関与するこれらのペ
プチドの役割を解明し得る。これらの結果から、これらのペプチドの種々の用途
が考えられる。特に分子モデルの作製、これらのペプチドまたはこれらのペプチ
ドを取込んだポリペプチドと同じ効果をもつ小分子の作製にこれらのペプチドを
使用し得る。これらのペプチドは更に、Ｇ３ＢＰタンパク質と相互作用する細胞
性因子に置換し得る。タンパク質が二量体を形成できることは証明されているの
で、この細胞性因子はＧ３ＢＰ自体でもよい。この因子はまた公知の因子（Ｒａ
ｓＧＡＰ）でもよく、または新しく同定された因子でもよい。このためには、樹
脂に結合したこれらのペプチドを使用してＧ３ＢＰと相互作用する細胞性因子を
探索し得る。最後にこれらのペプチドの使用によって、タンパク質−タンパク質
相互作用の阻害に基づく治療有効分子の確実なスクリーニングが得られる。

【０１１３】 実施例８：Ｇ３ＢＰ１のフラグメントの構築及びこれらのフラグメントのアポ
トーシス活性 実施例７で得られた結果に基づいて、Ｇ３ＢＰのＮ−末端フラグメントを発現
させ得るプラスミドを構築し、これらのフラグメントのアポトーシス活性を試験
した。このために、フラグメントを以下のプライマーからＰＣＲによって増幅し
た：

【０１１４】

【化１】

【０１１５】 フラグメント（１−１５０）及び（４２−１５０）をＰＣＲによって増幅し（
５０℃で３０サイクル）、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩによって加水分解し、
次いで、市販のベクターｐＣＭＶ／ｃｙｔｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐＳｈｏ
ｏｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ ｍａｎｎｕａｌ ＩＩ，ｖｅｒｓｉｏｎ Ｃ）に挿入
した。

【０１１６】 得られたフラグメントの配列を以下に示す。ベクター由来の翻訳配列を大文字
で示す。Ｇ３ＢＰ ｃＤＮＡの配列を小文字で示す。下線領域はＴａｇ ｍｙｃ
をコードするベクターの配列に対応する。

【０１１７】

【化２】

【０１１８】 対応するポリペプチドを以下に示す。このポリペプチドは、配列１に示す配列
のＧ３ＢＰタンパク質のアミノ酸１−５０に対応するフラグメントを含む。この
フラグメントは以下に太文字で示される。

【０１１９】

【化３】

【０１２０】

【化４】

【０１２１】 対応するポリペプチドを以下に示す。このポリペプチドは、配列１に示す配列
のＧ３ＢＰタンパク質のアミノ酸１５−５０に対応するフラグメントを含む。こ
のフラグメントは以下に太文字で示される。

【０１２２】

【化５】

【０１２３】 Ｇ３ＢＰのヌクレオチド配列のフラグメント１−１５０及び４２−１５０を含
む構築物を形質転換細胞系ＮＩＨ３Ｔ３Ｒａｓ及びＮＩＨ３Ｔ３Ｒａｆにトラン
スフェクトした。これらの細胞系は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を癌遺伝子Ｋｉ−Ｒａｓ
Ｖａｌ１２または癌ウイルスｖ−Ｒａｆの形態によって形質転換させた後に得ら
れた。

【０１２４】 アポトーシスを検出するために、２ｍｇのプラスミドにリポフェクタミン（Ｇ
ｉｂｃｏ−ＢＲＬ）をトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後
にＦＡＣＳ分析によってアポトーシスを測定した。アポトーシスを生じた細胞は
サブＧ１期の細胞に対応する。

【０１２５】 これらの条件で、Ｇ３ＢＰの配列の（アミノ酸１−５０を含むＧ３ＢＰのフラ
グメントをコードしている）フラグメント１−１５０を発現する構築物は、アポ
トーシス（４因子）を誘発し得るが、Ｇ３ＢＰの配列の（アミノ酸１５−５０を
含むＧ３ＢＰのフラグメントをコードしている）フラグメント４２−１５０を発
現する構築物はこの特性を有していない。

【０１２６】 これらの結果は、Ｇ３ＢＰのアミノ酸１−１４に対応するドメインがアポトー
シスの誘発に関与するドメインであることを示す。Ｂ３ＢＰのこのドメインを同
定し、Ｇ３ＢＰのアミノ酸１−１４に対応するドメインを含むポリペプチドがア
ポトーシスのコントロールに果たす役割を証明すれば、これらのポリペプチドが
細胞増殖異常を含む疾患の予防、軽減及び／または治療に使用できると期待し得
る。

【０１２７】 実施例９：ｈｕＧ３ＢＰ１のフラグメントによる融合タンパク質の構築 実施例７で同定したペプチドを発現し得る構築物を作製する。ペプチドに対応
する配列を安定させるためにＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）
タンパク質に融合させる。

【０１２８】 オリゴヌクレオチドの配列： センスオリゴヌクレオチドの各々は、５′端にＮｃｏＩ部位を復元する４個の
ヌクレオチドを有しており、３′端に終止コドン（ＴＡＡ）及びＢａｍＨＩ部位
を形成する１組のヌクレオチドを有している。

【０１２９】

【化６】

【０１３０】 オリゴヌクレオチド対を８０℃から室温に冷却することによってハイブリダイ
ズさせ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によってリン
酸化し、ベクター“ｐＢＣｃｏｌｌＧＳＴｆｕｓｉｏｎ”のＮｃｏＩ部位及びＢ
ａｍＨＩ部位に挿入する。このベクターは真核細胞中でＧＳＴ融合タンパク質を
ＳＶ４０プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｘ７８３１６）から発現させ得る。次
いでプラスミドをヒト腫瘍細胞系Ｈｅｌａ及びＨ１２９９（材料及び方法の項に
記載）にトランスフェクトし、誘発されたアポトーシスを実施例８に記載のよう
にＦＡＣＳで測定する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ウェスタンブロット法で同定された抗体Ｍａｂ １Ｆ１によって認識されるＧ
３ＢＰの種々のドメインを表す。

【図２ａ】 図２ａは、種々の細胞系中のＧ３ＢＰタンパク質の発現レベルの比較を表す。

【図２ｂ】 図２ｂは、種々の細胞系中のＧ３ＢＰタンパク質の発現レベルの比較を表す。

【図３】 ＨＣＴ１１６細胞に対する抗体Ｍａｂ １Ｆ１のマイクロインジェクションの
効果を示す。

【図４】 ヒトのＧ３ＢＰタンパク質とＧ３ＢＰ２タンパク質との配列比較を示す。Ｎ末
端配列を比較すると、トレマ記号で示すような幾つかの相異が観察される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 デユシエーヌ，マルク フランス国、エフ−94370・スシ−アン− ブリ、リユ・ドユ・ジエネラル・ドウ・ラ ルミナ、71 (72)発明者 バルラ，イザベル フランス国、エフ−94510・ラ−ク−アン −ブリ、リユ・ドユ・８・メ・1945、14 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 GA03 4B064 AG27 CA20 CC24 DA03 4B065 AA91X AB05 AC14 CA25 CA44 4C085 AA14 BB36 DD22 DD23 DD32 EE01 EE06 FF24 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 多様な種類の腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発し得るＧ３Ｂ
   Ｐタンパク質に対するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 Ｇ３ＢＰタンパク質のアミノ酸位置１−１４４の間に存在す
   るエピトープを認識し得るモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 Ｇ３ＢＰタンパク質のアミノ酸位置１−７２の間に存在する
   エピトープ、好ましくはＧ３ＢＰタンパク質のアミノ酸位置２２−５５の間に存
   在するエピトープ、より好ましくはアミノ酸位置２２−３４から成るエピトープ
   を認識し得る請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 １９９８年６月９日付けでＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に登録番号Ｉ−
   ２０３８で寄託されたハイブリドーマ細胞系Ｇ３Ｂ １Ｆ１ １Ｄ１によって分
   泌されるモノクローナル抗体Ｍａｂ １Ｆ１であることを特徴とする請求項１か
   ら３のいずれか一項に記載の抗体。
5. 【請求項５】 医薬を製造するための請求項１から４のいずれか一項に記載
   の抗体の使用。
6. 【請求項６】 異常増殖性疾患を治療または予防する医薬を製造するための
   請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
7. 【請求項７】 医薬として許容される担体に任意に混合された治療有効量の
   請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含み、前記量は腫
   瘍細胞中でアポトーシスを誘発する治療的に有効な量であることを特徴とする医
   薬組成物。
8. 【請求項８】 請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体
   を分泌し得るハイブリドーマ細胞系。
9. 【請求項９】 １９９８年６月９日付けでＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に登録番号Ｉ−
   ２０３８で寄託されたハイブリドーマ細胞系Ｇ３Ｂ １Ｆ１ １Ｄ１。
10. 【請求項１０】 （１）Ｇ３ＢＰタンパク質またはＮ−末端ドメイン（ａａ
    １−１４４）の少なくとも一部を含むそのフラグメントによって免疫感作され
    た動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを、ハイブリドーマが形成され得る条件下
    で融合させる段階と、（２）前記ハイブリドーマのうちで種々の腫瘍細胞系中で
    アポトーシスを誘発し得るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを検出
    し単離する段階とから成ることを特徴とする種々の腫瘍細胞系中でアポトーシス
    を誘発し得るモノクローナル抗体の産生方法。
11. 【請求項１１】 診断用試薬とすることを特徴とする請求項１から４のいず
    れか一項に記載の抗体の使用。
12. 【請求項１２】 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体を含むことを
    特徴とする診断用キット。